KR102484190B1 - 디펜신 유래 10량체 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
디펜신 유래 10량체 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 디펜신(defensin) 유래 10량체 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디펜신 유래 10량체 펩타이드인 Pro10-1 또는 Pro10-1D를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 Pro10-1 또는 Pro10-1D의 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 확인하였다. 특히, N-말단에 아르기닌(Arg) 및 D-아미노산 전환이 추가된 Pro10-1D는 양이온성이 증가하고 소수성이 감소하여, 독성이 낮아지고, 음으로 하전된 박테리아 막에 대한 투과성이 향상되었으며, 우수한 항균 활성, 단백질 분해 효소에 대한 내성, 내독소 중화/제거 및 바이오필름 형성 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
나아가, Pro10-1D는 TLR4 다운스트림을 억제함으로써 현저한 항염증 효과를 보이는 것을 확인하였으며, 패혈증 마우스 모델에서의 염증성 상태(inflammatory insult)를 개선하고 패혈증 마우스의 장기 기능 장애에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 Pro10-1 또는 Pro10-1D은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 효과적인 치료를 위한 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 적용할 수 있다.
본 발명에서는 Pro10-1 또는 Pro10-1D의 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 확인하였다. 특히, N-말단에 아르기닌(Arg) 및 D-아미노산 전환이 추가된 Pro10-1D는 양이온성이 증가하고 소수성이 감소하여, 독성이 낮아지고, 음으로 하전된 박테리아 막에 대한 투과성이 향상되었으며, 우수한 항균 활성, 단백질 분해 효소에 대한 내성, 내독소 중화/제거 및 바이오필름 형성 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
나아가, Pro10-1D는 TLR4 다운스트림을 억제함으로써 현저한 항염증 효과를 보이는 것을 확인하였으며, 패혈증 마우스 모델에서의 염증성 상태(inflammatory insult)를 개선하고 패혈증 마우스의 장기 기능 장애에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 Pro10-1 또는 Pro10-1D은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 효과적인 치료를 위한 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 디펜신(defensin) 유래 10량체 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디펜신 유래 10량체 펩타이드인 Pro10-1 또는 Pro10-1D를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
병원성 자극(pathogenic stimuli)은 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)에 대한 숙주 면역 반응의 진행으로 이어질수 있으며, 감염의 중증도를 증가시키고 궁극적으로는 패혈증의 병리학적 과정을 유도할 수 있다.
패혈증은 세균 감염에 대한 면역 반응의 이상으로 인해 발생하는 다각적인 증후군으로, 과도한 염증, 장기 기능 장애 등이 발생하며 심할 경우 사망에까지 이르게 된다 (Van Der Poll T. et al., Nat. Rev. Immunol., 17:407-420, 2017; Rudd K.E. et al., Crit. Care, 22:1-11, 2018).
전국 코호트 연구에 따르면 한국에서 패혈증 발병률이 증가하여, 10만명당 약 233.6명이 발명되었으며, 2016년 22.6%의 사망률을 기록하였다. 특히, 그람 음성 박테리아에 의한 감염은 세균의 외부 세포막이 지질다당류(LPS)로 구성되어 있어 염증 반응의 비정상적인 단계를 유발할 뿐만 아니라, 내성 감염에 대한 새로운 항생제 개발을 방해하기 때문에 시급한 해결책이 요구되고 있다 (Delcour A.H., Biophys. Acta (BBA) Proteins Proteom, 1794:808-816, 2009; Tucureanu M.M. et al., Int. J. Nanomed, 13:63-76, 2017).
종래의 연구에 따르면, 병원균 또는 LPS, Pam2CSK4 또는 Pam3CSK와 같은 병원성 분자 침범에 의한 TLR(toll-like receptor)의 불균형적인 활성화가 패혈증 발명에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다 (Cohen J, Nature, 420:885-891, 2002). 패혈증 병태 생리학 및 치료절차의 극적인 발전에도 불구하고 그람 음성 패혈증에 대한 치료제는 현재까지 승인된 바 없다. 따라서 패혈증과 관련된 증상을 극복할 수 있는 새로운 종류의 항생제에 대한 연구가 요구되고 있다.
다양한 유기체에서 추출한 수많은 생물 활성 천연 펩타이드는 항균 및 면역 조절 활동을 포함하여 인간 생리학에서 직간접적으로 유익한 역할을 한다. 모든 생명체에서 항균 펩타이드(antimicrobial peptide; AMP)는 타고난 면역 방어의 구성 요소를 형성하며, AMP는 저분자 항생제로서 광범위한 스펙트럼 잠재력을 보여주며, 40년이 넘은 펩타이드 연구를 통해 AMP는 자연적으로 발생하는 항생제의 대체 물질로 부각되고 있다. 또한, AMP는 광범위한 항균활동과 함께 다양한 구조와 작용 모드를 가지고 있기 때문에 새로운 AMP의 개발은 다중 약물 내성 박테리아를 퇴치하기 위한 유망한 전략으로 연구되고 있다 (Wimley W.C. et al., J. Membr. Boil., 239:27-34, 2011; Narayana J.L. et al., Peptides, 72:88-94, 2015; Hollmann A. et al., Front. Chem., 6:204, 2018).
현재까지 약 3000개 이상의 AMP가 확인되었지만 FDA 승인된 AMP는 7개뿐이며, 여기에는 콜리스틴(colistin), 그래미시딘 D(gramicidin D), 답토마이신(daptomycin), 반코마이신(vancomycin), 오리타반신(oritavancin), 달바반신(dalbavancin) 및 텔라반신(telavancin)이 포함되어 있으며, 이들은 현재 시판 중이거나 임상 개발 중이다 (Steckbeck J.D. et al., Boil. Ther., 14:11-14, 2013; Wang G., Li X. et al., Nucleic Acids Res., 44:D1087-D1093, 2015). 이들은 다른 구조와 서열 모티프를 가지고 있지만 광범위한 항생제 작용을 공유하며, AMP의 항균 활성에 대한 자세한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만 막 횡단 기공 형성 또는 세포 내 살해와 관련된 것으로 확인되었다.
콜리스틴은 항균 고리형 펩타이드로, 외막의 음전하 LPS 층에 결합하여 세포 사멸을 유발함으로써 그람 음성 박테리아를 표적하며, 항균 특성외에도 콜리스틴은 LPS 분해 및 면역 조절 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나 콜리스틴의 사용은 부작용 때문에 사용이 제한적인 단점이 있다.
카텔리시딘(Cathelicidins)은 세균 감염에 반응하여 단백질 분해를 활성화하는 또 다른 유형의 AMP로, 박테리아 막의 투과성에 영향을 미치고 살균 효과를 나타낸다. 카텔리시딘 유래 LL-37 펩타이드는 LPS 중화와 식균 작용을 촉진 할 수 있으며 대식세포 분화를 전염증 표현형으로 왜곡함으로써 면역 조절 효과를 나타낼 수 있다. 더욱이 LL-37 단편의 단백질 분해 절단은 추가적인 염증성 장애를 유발할 수 있다.
따라서, 선택성 제어, 안정성 개선 및 세포 독성 매개 부작용을 줄이는 것이 강력한 AMP의 개발이 요구되고 있으며, 항균 활성이 높은 천연 AMP를 기반으로 설계된 짧은 펩타이드 유사체는 생산 비용을 줄일 수 있으며 낮은 면역원성을 유발할 수 있으므로, 치료 응용 분야를 위한 신규 후보로 개발할 수 있다.
천연 AMP 중에서, 디펜신(defensin)은 양이온성 아르기닌을 많이 가지고 있는 그람 양성균과 그람 음성균 모두에 대해 항균 활성을 나타내는 항균펩타이드이다. 이중 프로태티아마이신(Protaetiamycine)은 딱정벌레인 흰점박이꽃무지 유래 43개의 아미노산으로 구성된 곤충 디펜신이다 (Hwang J. et al., Int. J. Ind. Entomol., 17: 131-135, 2008). 짧은 AMP를 설계하기 위해, 본 발명자들은 이전의 연구에서 펩타이드의 소수성과 양이온성 사이의 균형을 최적화하여, 프로태티아마이 유래 RLWLAIGRG-NH2의 시퀀스를 기반으로 9Pbw2(RLWLAIKRR-NH2), 9Pbw3(RLWLAIWRR-NH2) 및 9Pbw4 (RLWLAWKRR-NH2)의 9량체 펩타이드 유사체를 설계한바 있으며, 두개의 트립토판(Trp) 아미노산을 포함하는 9Pbw3(본 발명에서는 "Pro9-3"으로 표기하였음)와 이의 거울상 이성질체(Pro9-3D)는 포유류 세포에 대한 독성효과와 함께 강력한 항균 활성을 보이는 것으로 나타났다 (Shin S. et al., J. Pept. Sci., 15:559-568, 2009; Lee, E. et al., J. Pept. Sci., 17, 675-682, 2011; 대한민국등록특허 제10-1193398호; 대한민국등록특허 제10-1247350호; 대한민국등록특허 제10-1420849호; 대한민국등록특허 제10-1599587호).
본 발명에서는 보다 강력한 항균 활성을 가진 AMP를 설계하기 위해, Pro9-3의 N-말단에 아르기닌(Arg) 잔기를 추가하여, 그람 음성 병원체 및 박테리아 세포 선택성에 대한 펩타이드의 효능을 증가시킨 두 가지 새로운 10량체 펩타이드(Pro10-1 및 이의 거울상 이성질체 Pro10-1D)를 설계하였다. 본 발명에서는 그람 음성 패혈증의 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo) 모델을 사용하여 Pro10-1 및 Pro10-1D의 항균 및 항염증 활성을 평가하였으며, Pro10-1D가 MDR 그람 음성 박테리아로 인한 패혈증에 대한 유망한 펩타이드 항생제로 적용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 곤충의 디펜신 유래 10량체 펩타이드인 Pro10-1 또는 Pro10-1D를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 신규한 10량체 펩타이드(Pro10-1) 또는 이의 거울상 이성질체(Pro10-1D)의 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 확인하였다. 특히, N-말단에 아르기닌(Arg) 및 D-형 아미노산 전환이 추가된 Pro10-1D는 양이온성이 증가하고 소수성이 감소하여, 독성이 낮아지고, 음으로 하전된 박테리아 막에 대한 투과성이 향상되었으며, 우수한 항균 활성, 단백질 분해 효소에 대한 내성, 내독소 중화/제거 및 바이오필름 형성 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
나아가, Pro10-1D는 TLR4 다운스트림을 억제함으로써 현저한 항염증 효과를 보이는 것을 확인하였으며, 패혈증 마우스 모델에서의 염증성 상태(inflammatory insult)를 개선하고 패혈증 마우스의 장기 기능 장애에 대한 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 Pro10-1 또는 Pro10-1D은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 효과적인 치료를 위한 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은 HeliQuest 온라인 툴(HeliQuest online tool)을 사용하여 분석한 (A) Pro9-3 및 (B) Pro10-1의 헬리컬-휠 다이어그램(Helical-wheel diagram)을 나타낸 도면이다. 양전하를 띤 아미노산 잔기는 파란색으로, 음전하를 띤 잔기는 빨간색으로, 소수성 잔기는 노란색으로, 알라닌은 회색 A로 표시하였으며, 화살표는 나선형 소수성 모멘트를 의미한다.
도 2는 Pro9-3 및 그 유사체의 세포 독성 효과를 나타낸 도면이다.
(A) 펩타이드에 의해 유도된 양 적혈구(sRBC) 용혈에 대한 용량-반응 곡선(dose-response curve) 및 (B) 24시간 동안 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 대한 펩타이드 용량 의존적(0 ~ 50 μM) 세포독성을 나타낸 그래프이다. 대조군으로 멜리틴을 사용하였으며, 실험 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 3은 (A) 수용액 및 (B) 50mM 도데실포스포콜린(DPC) 미셀에서 100 μM 농도의 Pro9-3 및 그 유사체에 대한 원형이색성 스펙트럼을 10 회 스캔한 도면이다. 도 3에서 205 및 220 nm에서 이중 음의 최대값(Double negative maxima)은 α- 나선 구조의 특징이다.
도 4는 도데실포스포콜린(DPC)에 의해 유도된 9 : 1(v/v) H2O/D2O에서 298K 1H NMR 스펙트럼의 NH 영역에서 화학적 이동 섭동(Chemical shift perturbation)을 나타낸 도면이다.
(A) Pro9-3의 1 차원 1H NMR 스펙트럼은 9 가지 다른 농도의 DPC에 대해 10 ~ 11ppm로 기록되었으며, (B) Pro9-3 및 (C) Pro10-1의 1D 1H NMR 스펙트럼은 6가지 다른 농도의 DPC에 대해 7 ~ 11ppm로 기록되었다. DPC 첨가에 따른 펩타이드 스펙트럼의 화학적 이동 및 라인 확장의 변화는 DPC와의 구조적 변화 및 상호 작용을 나타낸다.
도 5는 펩타이드의 항균 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 5A는 EYPE(egg yolk L-α-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidylglycerol)(7 : 3, w/w)로 제조된 LUV(large unilamellar vesicle)를 이용한 칼세인 누출(calcein leakage)의 용량 반응 곡선으로, 농도 의존적인 염료 방출은 펩타이드의 막 투과능력을 의미하며, 대조군으로 멜리틴을 사용하였다.
도 5B는 펩타이드 및 폴리믹신 B(polymyxin B, 양성 대조군)의 LPS(Lipopolysaccharide)에 대한 중화 효과를 나타낸 데이터로, 억제율은 펩타이드의 LPS 중화능을 의미한다.
도 5C는 4 시간 동안 최소억제농도(MIC)의 1 배(1×MIC) 및 2 배(2×MIC)의 펩타이드로 처리된 E. coli(KCTC 1682)의 주사전자현미경사진으로, E. coli의 외막에 대한 미세 구조 변화는 펩타이드에 의한 막손상을 의미하며, 스케일바는 100 μm를 의미한다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 6은 액체배지미량희석법(broth microdilution method)을 사용하여 평가한 트립신 및 키모트립신 존재에 따른 펩타이드의 항균 활성 억제 정도를 나타낸 도면이다.
각각의 최소억제농도의 펩타이드를 트립신 및 키모트립신과 함께 6 시간 동안 배양한 다음, (A) E. coli 및 (B) A. baumannii 각각에 대한 펩타이드 항균 활성을 확인하였다. 억제된 박테리아 성장은 펩타이드의 단백질 단백질 분해 효소에 대한 안정성을 의미한다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 7은 Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D의 박테리아 바이오필름 형성 억제 효과를 나타낸 도면이다. 펩타이드의 바이오필름 분해 특성은 용량 의존 방법으로 (A) E. coli, (B) A. baumannii, (C) MDREC 1229 및 (D) MDRAB 12010에 대해 측정하였다. 대조군으로 멜리틴을 사용하였으며, 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 8은 MDREC 1229에 대한 Pro10-1D의 항생제 효과를 나타내는 광학현미경 이미지이다.
MDREC 1229 세포는 배양 플레이트의 폴리스티렌 표면에 부착되도록 배양한 다음 Pro10-1D (0 ~ 16 μM)에 16 시간 동안 노출되었다. 균주는 MH(Mueller-Hinton) 배지에서 배양되었으며 바이오필름 형성은 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하였으며, 스케일바는 100 μm를 의미한다.
도 9는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 Pro10-1D의 염증 반응 억제 효과에 대한 도면이다.
LPS(20 ng/mL)로 16시간 동안 자극된 RAW264.7 세포에서 (A) 아질산 생성 및 염증성 사이토카인인 (B) TNF-α 및 (C) IL-6 생성에 대한 펩타이드(0 ~ 50 μM)의 농도 의존적 억제 효과를 나타낸다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 10은 TLR4 표적으로서의 Pro10-1D 및 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 Pro10-1D에 의한 MAPK 및 NF-κB 신호전달 조절에 대한 도면이다.
(A) 면역 블랏 분석을 통해 펩타이드(20 μM) 및 LPS (50 ng / mL)로 처리된 RAW264.7 세포에서 LPS 매개 TLR4, total/phospho-JNK, total/phospho-ERK, 및 NF-κB의 인산화, 인산화된 NF-κB의 핵으로 이동을 통한 TLR4 매개 염증 반응 신호전달에 미치는 영향을 확인하였다.
(B) (A) 도면의 각 단백질의 발현량 정량화된 분석을 나타낸다.
도 11은 Pro10-1D의 생체내에서 무독성 효과를 나타낸 도면이다. Pro10-1D(1mg/kg 및 5mg/Kg)로 24시간 동안 처리한 마우스의 (A) AST, (B) ALT 및 (C) BUN 수준을 확인하였으며, 대조군 마우스는 PBS 용액만 복강주사하였다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 12는 Pro10-1D에 의해 E. coli K1에 감염된 마우스에서 패혈성 쇼크 완화 효과를 확인한 도면이다.
(A) 패혈증 마우스의 폐, 간 및 신장 조직에서 Pro10-1D에 의한 세균 성장 억제, (B) Pro10-1D에 의한 패혈증 마우스의 혈청에서 순환 내독소(LPS) 수준 감소 효과, 패혈증 마우스의 (C) 혈청 및 (D) 폐 조직에서 Pro10-1D에 의한 TNF-α 및 IL-6 수준 감소 효과, (E) Pro10-1D에 의한 패혈증 마우스의 혈청 속 AST, ALT 및 BUN 농도 감소 효과를 확인하였다. 그래프는 평균 ± SEM(5 마리 마우스/그룹)으로 나타내었다.
도 13은 Pro10-1D 치료에 의한 E. coli K1에 감염된 마우스에서 폐 침윤 억제 효과를 나타낸 도면이다.
(A) 대조군의 폐 조직의 H&E 염색, (B) 대장균 K1 감염 마우스(6 × 106 CFU/마우스, 복강 내 주사(I.P.))의 경우 심각한 폐 손상 관련 호중구 침윤 관찰, (C) Pro10-1D(1 mg/Kg, I.P.) 처리된 대조군 마우스에서의 폐조직 관찰, 및 (D) Pro10-1D 전처리에 따른 E. coli K1 감염에 의해 유발된 비정상적인 변화 관찰을 수행하였다 (× 20 배율, 스케일 바: 100 μm).
도 2는 Pro9-3 및 그 유사체의 세포 독성 효과를 나타낸 도면이다.
(A) 펩타이드에 의해 유도된 양 적혈구(sRBC) 용혈에 대한 용량-반응 곡선(dose-response curve) 및 (B) 24시간 동안 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 대한 펩타이드 용량 의존적(0 ~ 50 μM) 세포독성을 나타낸 그래프이다. 대조군으로 멜리틴을 사용하였으며, 실험 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 3은 (A) 수용액 및 (B) 50mM 도데실포스포콜린(DPC) 미셀에서 100 μM 농도의 Pro9-3 및 그 유사체에 대한 원형이색성 스펙트럼을 10 회 스캔한 도면이다. 도 3에서 205 및 220 nm에서 이중 음의 최대값(Double negative maxima)은 α- 나선 구조의 특징이다.
도 4는 도데실포스포콜린(DPC)에 의해 유도된 9 : 1(v/v) H2O/D2O에서 298K 1H NMR 스펙트럼의 NH 영역에서 화학적 이동 섭동(Chemical shift perturbation)을 나타낸 도면이다.
(A) Pro9-3의 1 차원 1H NMR 스펙트럼은 9 가지 다른 농도의 DPC에 대해 10 ~ 11ppm로 기록되었으며, (B) Pro9-3 및 (C) Pro10-1의 1D 1H NMR 스펙트럼은 6가지 다른 농도의 DPC에 대해 7 ~ 11ppm로 기록되었다. DPC 첨가에 따른 펩타이드 스펙트럼의 화학적 이동 및 라인 확장의 변화는 DPC와의 구조적 변화 및 상호 작용을 나타낸다.
도 5는 펩타이드의 항균 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 5A는 EYPE(egg yolk L-α-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidylglycerol)(7 : 3, w/w)로 제조된 LUV(large unilamellar vesicle)를 이용한 칼세인 누출(calcein leakage)의 용량 반응 곡선으로, 농도 의존적인 염료 방출은 펩타이드의 막 투과능력을 의미하며, 대조군으로 멜리틴을 사용하였다.
도 5B는 펩타이드 및 폴리믹신 B(polymyxin B, 양성 대조군)의 LPS(Lipopolysaccharide)에 대한 중화 효과를 나타낸 데이터로, 억제율은 펩타이드의 LPS 중화능을 의미한다.
도 5C는 4 시간 동안 최소억제농도(MIC)의 1 배(1×MIC) 및 2 배(2×MIC)의 펩타이드로 처리된 E. coli(KCTC 1682)의 주사전자현미경사진으로, E. coli의 외막에 대한 미세 구조 변화는 펩타이드에 의한 막손상을 의미하며, 스케일바는 100 μm를 의미한다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 6은 액체배지미량희석법(broth microdilution method)을 사용하여 평가한 트립신 및 키모트립신 존재에 따른 펩타이드의 항균 활성 억제 정도를 나타낸 도면이다.
각각의 최소억제농도의 펩타이드를 트립신 및 키모트립신과 함께 6 시간 동안 배양한 다음, (A) E. coli 및 (B) A. baumannii 각각에 대한 펩타이드 항균 활성을 확인하였다. 억제된 박테리아 성장은 펩타이드의 단백질 단백질 분해 효소에 대한 안정성을 의미한다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 7은 Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D의 박테리아 바이오필름 형성 억제 효과를 나타낸 도면이다. 펩타이드의 바이오필름 분해 특성은 용량 의존 방법으로 (A) E. coli, (B) A. baumannii, (C) MDREC 1229 및 (D) MDRAB 12010에 대해 측정하였다. 대조군으로 멜리틴을 사용하였으며, 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 8은 MDREC 1229에 대한 Pro10-1D의 항생제 효과를 나타내는 광학현미경 이미지이다.
MDREC 1229 세포는 배양 플레이트의 폴리스티렌 표면에 부착되도록 배양한 다음 Pro10-1D (0 ~ 16 μM)에 16 시간 동안 노출되었다. 균주는 MH(Mueller-Hinton) 배지에서 배양되었으며 바이오필름 형성은 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하였으며, 스케일바는 100 μm를 의미한다.
도 9는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 Pro10-1D의 염증 반응 억제 효과에 대한 도면이다.
LPS(20 ng/mL)로 16시간 동안 자극된 RAW264.7 세포에서 (A) 아질산 생성 및 염증성 사이토카인인 (B) TNF-α 및 (C) IL-6 생성에 대한 펩타이드(0 ~ 50 μM)의 농도 의존적 억제 효과를 나타낸다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 10은 TLR4 표적으로서의 Pro10-1D 및 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 Pro10-1D에 의한 MAPK 및 NF-κB 신호전달 조절에 대한 도면이다.
(A) 면역 블랏 분석을 통해 펩타이드(20 μM) 및 LPS (50 ng / mL)로 처리된 RAW264.7 세포에서 LPS 매개 TLR4, total/phospho-JNK, total/phospho-ERK, 및 NF-κB의 인산화, 인산화된 NF-κB의 핵으로 이동을 통한 TLR4 매개 염증 반응 신호전달에 미치는 영향을 확인하였다.
(B) (A) 도면의 각 단백질의 발현량 정량화된 분석을 나타낸다.
도 11은 Pro10-1D의 생체내에서 무독성 효과를 나타낸 도면이다. Pro10-1D(1mg/kg 및 5mg/Kg)로 24시간 동안 처리한 마우스의 (A) AST, (B) ALT 및 (C) BUN 수준을 확인하였으며, 대조군 마우스는 PBS 용액만 복강주사하였다. 데이터는 3회 반복 수행하여 평균 ± SEM로 나타내었다.
도 12는 Pro10-1D에 의해 E. coli K1에 감염된 마우스에서 패혈성 쇼크 완화 효과를 확인한 도면이다.
(A) 패혈증 마우스의 폐, 간 및 신장 조직에서 Pro10-1D에 의한 세균 성장 억제, (B) Pro10-1D에 의한 패혈증 마우스의 혈청에서 순환 내독소(LPS) 수준 감소 효과, 패혈증 마우스의 (C) 혈청 및 (D) 폐 조직에서 Pro10-1D에 의한 TNF-α 및 IL-6 수준 감소 효과, (E) Pro10-1D에 의한 패혈증 마우스의 혈청 속 AST, ALT 및 BUN 농도 감소 효과를 확인하였다. 그래프는 평균 ± SEM(5 마리 마우스/그룹)으로 나타내었다.
도 13은 Pro10-1D 치료에 의한 E. coli K1에 감염된 마우스에서 폐 침윤 억제 효과를 나타낸 도면이다.
(A) 대조군의 폐 조직의 H&E 염색, (B) 대장균 K1 감염 마우스(6 × 106 CFU/마우스, 복강 내 주사(I.P.))의 경우 심각한 폐 손상 관련 호중구 침윤 관찰, (C) Pro10-1D(1 mg/Kg, I.P.) 처리된 대조군 마우스에서의 폐조직 관찰, 및 (D) Pro10-1D 전처리에 따른 E. coli K1 감염에 의해 유발된 비정상적인 변화 관찰을 수행하였다 (× 20 배율, 스케일 바: 100 μm).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.
본 발명은 일관점에서, 본 발명은 서열번호 1(RRLWLAIWRR-NH2)의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 9량체 펩타이드(RLWLAIWRR-NH2)의 N-말단에 아르기닌(Arg)을 추가하여 양이온성을 증가시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 거울상 이성질체는 서열번호 1의 아미노산 서열이 모두 D형 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발명자들은 이전의 연구에서 43-mer의 곤충 디펜신인 프로태티아마이신(protaetiamycine)으로부터 4개의 9-meric 펩타이드(Ala22 ~ Gly30)를 설계한 바 있다. 4개의 펩타이드 중 세 번째 유사체인 Pro9-3(RLWLAIWRR-NH2, 서열번호 3)과 거울상 이성질체 펩타이드인 Pro9-3D가 강력한 항박테리아 활성과 항염증 활성을 보였지만, 이들은 포유류 세포에 대해서도 높은 세포 독성을 나타내었다 (Shin S. et al., J. Pept. Sci., 15:559-568, 2009; Lee E. et al., J. Pept. Sci., 17:675-682, 2011).
본 발명에서는 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 높이고 박테리아 세포 선택성을 개선하기 위해 Pro9-3의 N-말단에 아르기닌(Arg)을 하나 더 추가하여 양이온성을 높인 10량체 펩타이드(10-meric peptide)를 제작하였으며, 이를 "Pro10-1"로 명명하였다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 Pro10-1의 아미노산을 D형 아미노산으로 치환한 "Pro10-1D"를 추가로 합성하였다 (표 1).
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 모펩타이드인 Pro9-3와 Pro10-1에 대한 헬리컬-휠 다이어그램(Helical-wheel diagram) 분석을 수행하였다. 도 1A에 나타난 바와 같이, 모펩타이드인 Pro9-3의 헬리컬-휠 다이어그램(Helical-wheel diagram)은 아래쪽의 소수성면이 위쪽의 친수성면에 비해 훨씬 더 크지만 양친매성을 보이는 것을 확인하였다. 5 개의 연속 소수성 잔기인 "LWLAIW"는 Pro9-3에 비해 높은 소수성(0.776)을 나타내며, 이와는 대조적으로 새롭게 설계된 두 개의 10량체 펩타이드(Pro10-1 및 Pro10-1D)의 소수성은 하나 이상의 아르기닌을 추가함으로써 0.776에서 0.597로 감소하였다. 또한 도 1B에 나타난 바와 같이, N-말단에 아르기닌이 추가된 Pro10-1의 헬리컬-휠에서 소수성면이 감소하여 α-나선의 양친매성을 측정하는 소수성 모멘트가 0.692에서 0.584로 감소하였다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 그람 음성 박테리아 또는 MDR(multidrug-resistant) 그람 음성 박테리아에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는 Pro10-1 및 Pro10-1D의 항균 활성을 측정하였다. 대표적인 그람 음성 박테리아 및 MDR 그람 음성 박테리아 균주에 대한 Pro9-3, Pro9-3D, Pro10-1 및 Pro10-1D의 항균 활성을 측정한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 강력한 펩타이드 항생제로 알려진 멜리틴(melittin)과 유사한 항균 활성을 나타내었다. Pro10-1D는 Pro10-1 및 9랑체 펩타이드(Pro9-3, Pro9-3D)와 비교하였을때, 모든 표준 그람 음성 박테리아 및 모든 그람 음성 MDR 박테리아에 우수한 사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, Pro10-1D는 그람 음성 박테리아에 대해 더 높은 상대 선택 지수를 보였으며, Pro9-3D, Pro10-1 및 Pro9-3(각각 41.18, 31.82, 13.46 및 10.94) 순으로 상대적 선택 지수가 높은 것으로 확인되었다. 따라서 Pro10-1D는 다른 펩타이드들 보다 더 우수한 박테리아 선택성을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 용어, "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 "항박테리아 또는 항세균(anti-bacterial)"을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, MDR(multidrug-resistant) 그람 음성 박테리아 (또는 내성균)는 임의의 질환 및 이의 합병증 또는 임의의 박테리아성 장애 및 이의 합병증을 치료 또는 예방하기 위하여 약물을 지속적으로 사용한 결과, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 의미한다. 상기 항생제의 예로는 반코마이신, 세팔로스포린, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, 페니실린, 베타 락타마제 억제제, 카르베페넴, 모노박탐, 마크롤리드 및 린코사민, 글리코펩타이드, 리팜핀, 옥사졸리디논, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 스트렙토그라민 및 술폰아미드 등이 있으며, 항생제 내성균은 상기 열거된 항생제를 처리하는 경우에도 저항성을 나타내어 개체에서 지속적으로 질환이 유지된다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 진핵세포에 대한 세포 독성이 감소된 것일 수 있다.
상기 진핵세포는 바람직하게 동물 또는 사람 세포일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 펩타이드가 세포 독성 효과를 유도하는지를 확인한 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, Pro9-3 및 Pro9-3D 펩타이드는 sRBC에 대해 2% 용혈을 유도한 반면, Pro10-1D 및 Pro10-1 펩타이드에서는 용혈 활성이 관찰되지 않았다. 반면, 멜리틴은 25 μM 농도에서 100% 용혈을 나타내었다.
또한, RAW264.7(murine macrophage cell line)에 대한 펩타이드들의 세포 독성을 확인한결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, Pro9-3D를 제외한 다른 모든 펩타이드는 25 μM 농도에서 85% 생존율을 나타내었다. 즉, 소수성이 높은 Pro9-3D는 MDR 그람 음성 박테리아에 대해 높은 항균 활성을 보였지만 포유류 세포에 대한 독성이 매우 높으므로, 효과적인 펩타이드 항생제로 사용할 수 없는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 박테리아 막 투과를 통해 항균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, CD 스펙트럼을 분석하여 수용액과 막과 같은 환경에서 펩타이드의 2차 구조를 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 수용액에서 정렬되지 않은 구조를 보였지만 도데실포스포콜린(dodecylphosphocholine, DPC) 미셀에서 구조적 변화를 나타내었다.
DPC의 추가에 따른 Pro9-3 및 Pro10-1의 1D1H 핵자기공명(NMR) 스펙트럼의 화학적 이동 및 라인 확장의 변화를 조사한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 수용액에서, 자유 형태의 모든 펩타이드는 10.2 ppm에서 두 개의 트립토판(Trp)의 인돌 고리에 대해 두 개의 분해된 피크를 나타내었다. Pro10-1은 Pro9-3에 비해 Arg가 하나 더 있지만 화학적 이동 변화의 전체 패턴은 두 경우 모두 매우 유사하였으며, 모든 D-아미노산을 포함하는 Pro10-1의 거울상 이성질체인 Pro10-1D는 DPC를 첨가했을 때 Pro10-1과 거의 동일한 NMR 스펙트럼 변화를 나타내었다. 또한, 모든 펩타이드에 대해 아미드 양성자와 방향족 고리 영역의 큰 화학적 이동 섭동이 관찰되었다 (도 4B 및 도 4C). 이러한 변화는 펩타이드가 수용액에서 무작위 구조를 갖는 반면, 미셀 환경에서는 CD 스펙트럼과 잘 일치하는 더 정렬된 구조를 형성한다는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, Pro10-1 및 Pro10-1D의 모델 인지질막과 대장균에 침투하는 능력을 측정하였다. 형광 칼세인(fluorescent calcein)의 방출을 모니터링함으로써 펩타이드의 막 투과 능력을 측정한 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드들은 음전하를 띤 EYPE/EYPG LUV에 대해 상당한 염료 방출을 유도하였으며, 이는 펩타이드가 박테리아 세포 구성 요소막에 강력하게 침투하였다는 것을 의미한다. 특히 Pro10-1과 Pro10-1D 펩타이드는 4 μM에서도 80% 이상의 누출을 보였고, Pro9-3은 4 μM에서 64.7% 누출을 보이는 것으로 나타났다. 상기 결과는, 펩타이드들의 강력한 항균 활성이 박테리아 세포막의 투과성에 때문일 수 있음을 시사한다.
즉, 본 발명의 신규 펩타이드인 Pro10-1 및 Pro10-1D는 양이온성이 높아 멜리틴과 유사한 높은 항균 활성을 유지할 수 있으며, 박테리아 세포막과 효과적으로 상호작용하여 박테리아에 치명적인 손상을 주어 항균 활성을 향상 시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 생체 외(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 내독소 중화능 또는 내독소 제거능을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, LPS를 중화하는 펩타이드의 능력을 확인한 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드들은 농도 의존적으로 LPS와 크게 상호작용하는 것을 확인하였다. 양성 대조군인 폴리믹신 B에 비해 Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D 펩타이드의 LPS의 활성화을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 펩타이드와 박테리아의 상호작용을 확인하기 위해, 펩타이드 처리에 따른 대장균의 형태(morphology)를 관찰한 결과, 도 5C에 나타난 바와 같이, 펩타이드 처리에 의해 유도된 막손상이 명확하게 시각화 되었으며, 본 발명의 펩타이드가 효과적으로 박테리아 막을 투과하여 E. coli에 심각한 손상을 입힌다는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드의 거울상 이성질체는 프로테아제에 대한 내성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현에에서, Pro10-1 및 Pro10-1D의 내인성 프로테아제에 대한 안정성을 확인한 결과, 도 6A 및 도 6C에 나타난 바와 같이, 프로테아제의 존재하에 Pro9-3 및 Pro10-1는 박테리아 성장을 억제시키지 못한 반면, 거울상 이성질체인 Pro10-1D는 프로테아제의 존재와는 상관 없이 항균 활성을 유지하였으며, 프로테아제가 없는 경우와 유사하게 E. coli와 A. baumannii의 성장을 억제시켰다. 상기 결과는, Pro10-1D가 트립신과 키모 트립신에 대해 실질적인 프로테아제 저항성을 나타냄을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 박테리아의 바이오필름 형성을 억제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D의 바이오필름 억제 효과를 확인한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 농도 의존적으로 바이오필름 형성을 억제하는 것을 확인하였다. 특히, Pro10-1D는 멜리틴을 포함한 다른 펩타이드에 비해 E. coli, A. baumannii 및 MDR 균주에 의한 바이오필름 형성을 가장 효과적으로 억제하였다.
Pro10-1D는 세 가지 펩타이드 중 바이오필름 형성을 가장 효과적으로 억제하였기 때문에, 본 발명에서는 추가적으로 광학현미경을 통해 MDREC 1229에 대한 Pro10-1D의 바이오필름 형성 역제 효능을 확인한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Pro10-1D가 첨가된 경우, 농도 의존적으로 박테리아 콜로니 수가 적은 것으로 나타났으며, 파괴된 바이오필름 매트릭스가 관찰되었다. 즉, 본 발명에서는 Pro10-1D가 펩타이드 항생제로 사용될 수 있는 잠재력을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 LPS에 의한 염증 및 TLR4 신호 전달을 억제할 수 있다.
병원체에서 방출된 LPS는 대식세포 및 섬유 아세포와 같은 숙주 면역 세포를 자극하여, 패혈증 관련 질병을 유발할 수있는 사이토 카인을 생성한다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 펩타이드에 의한 항염증 효능을 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Pro10-1 및 Pro10-1D를 처리한 경우 효과적으로 NO, TNF-α 및 IL-6 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, Pro10-1에 비해 Pro10-1D가 보다 효과적으로 NO, TNF-α 및 IL-6 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며, 이는 Pro10-1D가 LPS 유도 사이토카인 수준을 효율적으로 하향 조절할 수 있음을 의미한다.
또한, 그람 음성 감염에 의해 생성된 LPS는 TLR4 수용체에 의해 인식되며, 여러 가지 염증성 질환의 병인에 기여하는 NF-κB를 포함한 여러 다운 스트림 전사 인자의 생성을 유도한다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 신규한 펩타이드가 TLR4 조절에 미치는 영향을 조사한 결과, Pro10-1 및 Pro10-D를 20 μM 농도로 처리하였을 때, LPS로 유도된 TLR4 발현이 효과적으로 억제되었으며, MAPK 및 NF-κB 단백질 인산화 역시 감소하는 것을 확인하였다. 또한, Pro10-1에 비해 Pro10-1D가 보다 효과적으로 MAPK 및 NF-κB 단백질 인산화를 억제하였으며, 이는 Pro10-D가 TLR4 매개 캐스케이드(cascade)를 억제함으로써 염증신호에 영향을 미친다고 볼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 패혈증/패혈증 쇼크의 예방 또는 치료 효과가 있으며, 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선할 수 있다.
본 발명에서는 Pro10-1 및 Pro10-1D가 우수한 항균 활성을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 특히 Pro10-1에 비해 Pro10-1D가 항균 활성, 단백질 분해 효소에 대한 내성, 내독소 중화/제거 및 바이오필름 형성 억제 효능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, Pro10-D의 생체내 패혈증 치료 효능을 확인하기 위해 마우스에서 Pro10-D의 안전성을 조사한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 1mg/kg 및 5mg/kg Pro10-D 모두에서 AST, ALT 및 BUN 상승의 임상적 중요성이 관찰되지 않았으므로, 본 발명에서는 Pro10-1D가 고용량에서도 안전하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, E. coli K1을 사용하여 확립된 패혈성 쇼크 마우스 모델에서 펩타이드 항생제로서 Pro10-1D의 효능을 확인하였다. 도 12A에 나타난 바와 같이, Pro10-1D는 마우스 폐, 간 및 신장의 박테리아 수를 감소시킨 것을 확인되었다. 이는 Pro10-1D가 E. coli K1에 감염된 마우스의 내장 기관에서 세균 성장을 효과적으로 억제하는 것을 나타낸다.
또한, 도 12B에 나타난 바와 같이, 혈청내 독소 측정을 수행한 결과, Pro10-1D로 전처리한 경우, 내독소 수준이 효과적으로 감소한 것을 확인하였다.
패혈증 쇼크 마우스 모델에서 Pro10-1D 펩타이드의 다형핵 림프구(Polymorphonuclear Lymphocyte; PMN) 침윤 억제 효능 확인을 확인한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, Pro10-1D 전처리된 패혈증 마우스의 폐 조직을 확인한 결과, Pro10-1D에 의해 E. coli K1에 의해 유발된 병리학적 변화가 효과적으로 완화된 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서는 Pro10-1D 펩타이드가 E. coli K1에 감염된 마우스에서 패혈증 관련 염증을 예방하는 새로운 펩타이드 항생제 역할을 수행할 수 있는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 Pro10-1 또는 Pro10-1D은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 효과적인 치료를 위한 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 동물 및 사람에 대한 세포 독성이 거의 없으므로, 식품 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 그람 음성 박테리아에 의한 패혈증, 패혈증성 쇼크 유발 전/동시/후에 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 (solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있으며 (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)), 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드들은, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 건강기능식품은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 펩타이드를 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
통계분석
모든 통계 분석은 GraphPad Prism 8 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., La Jolla, 미국)을 사용하여 수행하였으며, 모든 실험 데이터는 3회 반복값의 평균±SEM으로 표시하였다. 용혈 및 염료 누출에 대한 통계 분석은 비선형 회귀 곡선 맞춤으로 분석하였으며, 다른 생화학적 및 단백질 발현 수준의 경우 단방향 ANOVA(one-way ANOVA)을 수행한 다음, HSD(Tukey's honestly significant difference) 사후 테스트를 수행하였다. 값은 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001에서 통계적으로 유의함을 나타내며, ns는 유의하지 않은 값을 나타낸다.
펩타이드 설계
본 발명의 발명자들은 이전의 연구에서 합성한 Pro9-3(RLWLAIWRR-NH2, 서열번호 3) 및 이의 이성질체(서열번호 4)의 항균 활성을 높이고 박테리아 세포 선택성을 개선하기 위해, Pro9-3의 N-말단에 아르기닌(Arg)을 하나 더 추가한 10량체 펩타이드를 제조하였으며, 이를 "Pro10-1"로 명명하였다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 Pro10-1의 모든 아미노산을 D형 아미노산으로 치환시킨 거울상 이성질체 펩타이드를 합성하였으며, 이를 "Pro10-1D"로 명명하였다 (표 1).
모든 펩타이드는 N-(9-플루오렌일)메톡시카르보닐(N-(9-fluorenyl) methoxycarbonyl) 고체상 합성 기법을 사용하여 고체상 합성으로 합성하고, 역상 제조용 고성능 액체 크로마토 그래피로 정제하였다 (Lee E. et al., Sci. Rep., 5:12048, 2015). 분석용 C18 컬럼으로 펩타이드 순도가 95% 이상인 것을 확인하였으며, 한국 기초과학연구원의 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser-desorption ionization-time-of-flight, MALDI-TOF) 질량 분석기로 펩타이드의 분자량을 확인하였다.
| 펩타이드 | 서열 a | 길이 | 분자량 | 순전하 | 소수성 모멘트 <μH> b |
소수성 <H> b | 서열 번호 |
| Pro10-1 | RRLWLAIWRR-NH2 | 10 | 1424 | +4 | 0.584 | 0.597 | 1 |
| Pro10-1D | rrlwlaiwrr-NH2 | 10 | 1424 | +4 | 0.584 | 0.597 | 2 |
| Pro9-3 | RLWLAIWRR-NH2 | 9 | 1269 | +3 | 0.692 | 0.776 | 3 |
| Pro9-3D | rlwlaiwrr-NH2 | 9 | 1269 | +3 | 0.692 | 0.776 | 4 |
a) 소문자는 D-아미노산을 의미한다. b) HeliQuest 온라인 툴로 계산된 소수성 모멘트<μH> 및 소수성 <H>을 의미한다.
펩타이드의 항균 활성 측정
Pro9-3, Pro9-3D, Pro10-1 및 Pro10-1D의 항균 활성은 마이크로 브로스 희석 방법(micro broth dilution method)을 사용하여 대표적인 그람 음성 박테리아 및 MDR 그람 음성 박테리아 균주 세트에 대해 조사하였다.
그람 음성 박테리아의 두 가지 균주, 즉 대장균(E. coli, KCTC 1682) 및 아시네토박터 바우마니(A. baumannii, KCCM 40203)는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국) 및 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms, 한국)으로부터 수득하였다. E. coli K1 균주 RS218 (O18:K1:H7)는 강원대학교 윤장원 교수님으로부터 수득하였다. 다제내성 그람 음성 박테리아인 E. coli CCARM 1229, E. coli CCARM 1238, A. baumannii CCARM 12010, A. baumannii CCARM 12220은 CCARM(Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes, 한국)으로부터 수득하였다.
펩타이드의 항균 활성은 최소저지농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentration) 분석을 통해 측정하였다.
구체적으로, MH(Mueller-Hinton) 배지에 각 펩타이드의 2배 연속 희석액을 마이크로플레이트에 첨가한 다음, 로그단계 배양(log-phase culture)된 E. Coli, E. coli K1 및 A. baumannii와 MDREC 1229, MDREC 1238, MDRAB 12010 및 MDRAB 12220를 포함하는 MDR 균주의 현탁액(2 x 105 CFU/mL)을 각각 마이크로플레이트에 접종하였다. 그 다음, 37℃에서 16시간 동안 배양한 다음, 마이크로플레이트 리더 SpectraMAX(Molecular Devices, 미국)를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
a) 기하학적 평균(GM)은 모든 박테리아 균주의 평균 최소억제농도(MIC) 값이며, 평균 MIC는 3회 반복 수행을 통해 계산되었다.
b) HC10은 체외에서 헤파린화된 양 적혈구의 10% 용혈을 유도하는 펩타이드 농도를 의미한다. 100 μM에서 검출 가능한 용혈이 관찰되지 않은 경우, 200 μM을 사용하여 상대선택 지수(Relative selective index)를 계산하였다.
c) 상대선택지수는 MIC(μM)/HC10의 GM을 사용하여 계산되었으며, 더 높은 값은 더 높은 셀 선택성을 의미한다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 강력한 펩타이드 항생제로 알려진 멜리틴(melittin)과 유사한 항균 활성을 나타내었다. Pro10-1은 Pro9-3에 비해 약간 더 높은 항균 활성을 보였는데, 이는 양이온성의 증가가 펩타이드와 박테리아 막 사이의 상호작용을 촉진할 수 있음을 의미한다.
Pro10-1D는 Pro10-1 및 9-meric 펩타이드와 비교하여 모든 표준 그람 음성 박테리아에 대해 훨씬 더 우수한 항균 활성을 보이는 것으로 나타났으며, 특히 Pro10-1D 처리는 다른 펩타이드 및 멜리틴과 비교하였을 때, 모든 그람 음성 MDR 박테리아에 대해 우수한 사멸효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 표 2에 나타난 바와 같이, Pro10-1D는 그람 음성 박테리아에 대해 더 높은 상대적 선택 지수를 보였으며, Pro9-3D, Pro10-1 및 Pro9-3(각각 41.18, 31.82, 13.46 및 10.94) 순으로 상대적 선택 지수가 높은 것으로 확인되었다. 따라서 Pro10-1D는 다른 펩타이드들 보다 더 우수한 박테리아 선택성을 보이는 것을 확인하였다.
생체외 및 생체내에서 펩타이드의 세포 독성 확인
3-1 : 용혈활성 확인
본 발명의 신규 펩타이드가 박테리아가 아닌 일반 진핵세포에 독성을 보이는지 확인하기 위해, 먼저 양 적혈구(sheep red blood cell; sRBC)에 대한 Pro9-3, Pro9-3D, Pro10-1 및 Pro10-1D의 용혈 활성을 분석하였다.
모든 펩타이드의 용혈활성은 이전에 공개된 방법에 따라 양 적혈구(sRBC)를 사용하여 측정하였다 (Lee E. et al., Sci. Rep., 5:12048, 2015).
간략하게, 신선한 sRBC를 PBS로 3회 세척한 다음, 4℃2500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. PBS에 포함된 펩타이드(0.2 μM ~ 100 μM)를 37℃에서 1시간 동안 4% (v/v) sRBC와 함께 배양한 다음, 1000 x g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액의 405 nm에서 흡광도를 용혈의 척도로 사용하였으며, 3회 반복하여 평균값을 측정하였다. 대조군으로는 멜리틴을 sRBC에 처리하였으며, 100% 용혈을 보이는 것을 확인하였다.
그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 100 μM Pro9-3 및 Pro9-3D 펩타이드와 sRBC의 인큐베이션은 2% 용혈을 유도한 반면, Pro10-1D 및 Pro10-1 펩타이드에서는 용혈 활성이 관찰되지 않았다. 반면, 멜리틴은 25 μM 농도에서 100% 용혈을 나타내었다.
3-2 : RAW264.7 세포에 대한 세포 독성 확인
본 발명에서는 다음으로, 뮤린 대식세포주(murine macrophage cell line)인 RAW264.7에 대한 펩타이드들의 세포 독성을 확인하였다.
쥐과 동물(Murine) 유래 RAW264.7 대식세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다.
RAW264.7 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토 마이신이 첨가된 DMEM 배지(Thermo Fischer Scientific Inc., 미국)를 이용하여 37℃ 가습상태의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
RAW264.7 세포에 대한 펩타이드 세포 독성은 WST-8 Cell Proliferation Assay Kit(Biomax Co., Ltd, 한국)를 사용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포(1 × 105 개)를 96웰-플레이트 각 웰에 접종안 다음, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 μM 농도의 각 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 10 μL의 WST-8 시약을 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 색상강도를 측정하였다.
RAW264.7 세포의 생존율을 확인한 결과, 25 및 50 μM 농도에서 대조군인 멜리틴은 각각 12% 및 11.2%의 생존율을 보인 반면, Pro9-3은 각각 95% 및 94% 생존율을 보이는 것을 확인하였다. Pro9-3D의 경우에는 25 및 50 μM 농도에서 각각 68% 및 51.8% 생존율로, 치명적인 효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 2B).
대조적으로, 다른 펩타이드보다 더 높은 항균 활성을 보인 Pro10-1D는 25 및 50 μM 농도에서 각각 89% 및 73% 생존율 나타냈으며, Pro10-1는 각각 90% 및 87% 생존율을 나타내었다. 특히, Pro9-3D를 제외한 다른 모든 펩타이드는 25 μM 농도에서 85% 생존율을 나타내었다.
소수성이 높은 Pro9-3D는 MDR 그람 음성 박테리아에 대해 높은 항균 활성을 보였지만 포유류 세포에 대한 독성이 매우 높으므로, 효과적인 펩타이드 항생제로 사용할 수 없으며, 본 발명에서는 모 펩타이드인 Pro9-3과 새로 설계된 펩타이드 Pro10-1 및 Pro10-1D에 대해 추가실험을 수행하였다.
막 환경에서 펩타이드 구조의 원이색법(Circular Dichroism, CD) 측정
본 발명에서는 CD 스펙트럼을 분석하여 수용액과 막과 같은 환경에서 펩타이드의 2차 구조를 분석하였다.
모든 CD 실험은 25℃에서 1mm 경로 길이 셀(1-mm path length cell)을 사용하는 J-810 분광 편광계 (Jasco, 일본)를 사용하여 수행하였다. 100 μM에서 펩타이드의 CD 스펙트럼은 190 ~ 250 nm에서 0.1 nm 간격으로 기록되었으며, 막 환경에 의해 유도된 형태 변화를 조사하기 위해 수용액과 50 mM DPC 미셀에서 CD 실험을 수행하였다 (Kim J.-K. et al., J. Boil. Chem., 286:41296-41311, 2011). 10회 스캔 데이터는 J-810을 사용하여 각 스펙트럼에 대해 평균 및 평활화(smoothed) 하였으며, CD 데이터는 deg · cm2 · dmol-1의 평균 잔류 타원도(θ)로 표시하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 수용액에서 정렬되지 않은 구조를 보였지만 도데실포스포콜린(dodecylphosphocholine, DPC) 미셀에서 구조적 변화를 나타내었다. 본 발명의 펩타이드는 2 개의 트립토판(Trp) 잔기가 있기 때문에 트립토판(Trp) 발색단 측쇄는 220 ~ 230 nm 영역의 CD 스펙트럼에 기여할 수 있다. 그러나, 220 nm 영역에서 DPC 미셀의 모든 펩타이드 CD 스펙트럼은 205 nm 및 220 nm에서 이중 음의 최대값(double negative maxima) 또는 최소값(double negative minima)이 명확하게 나타났으며, 이는 DPC 미셀에서 α- 나선 구조로 상당히 접힐 수 있음을 의미한다. 또한, Pro10-1D는 Pro10-1의 거울상 이성질체이므로 CD 스펙트럼은 모 펩타이드의 거울 이미지이다.
막 환경에서 화학적 이동 섭동에 의한 펩타이드의 구조적 변화 확인
본 발명에서는 DPC의 추가에 따라 9:1 (v/v) H2O/D2O 용액 및 298 K 조건에서 Pro9-3 및 Pro10-1의 1D1H 핵자기공명(NMR) 스펙트럼의 화학적 이동 및 라인 확장의 변화를 조사하였다
각 펩타이드는 0.45 mL의 9:1 (v/v)H2O/D2O(pH = 6.0) 용액으로 용해시킨 다음, Perdeuterated DPC를 펩타이드에 첨가하였다. 0 내지 100mM의 상이한 농도의 DPC를 첨가하였을 때, 펩타이드의 1D1H NMR 스펙트럼 세트를 기록하였으며, 화학적 이동은 0 ppm에서 4,4-디메틸-4-실라펜탄-1-설포네이트(4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonate) 신호에 상대적으로 표현되었다.
모든 NMR 실험은 한국기초과학연구원에있는 Bruker 700 Avance 분광기(Bruker Corporation, 미국)를 이용하여 수행하였다. 128 스캔의 데이터는 각 1D-1H NMR 스펙트럼에 대해 평균화되었으며, NMR 스펙트럼은 Bruker Topspin 3.6.0 소프트웨어(Bruker Corporation, 미국) 및 NMRPipe로 처리하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 수용액에서 자유 형태의 모든 펩타이드는 10.2 ppm에서 두 개의 트립토판(Trp)의 인돌 고리에 대해 두 개의 분해된 피크를 나타내었다.
Pro9-3의 NMR 스펙트럼(도 4A)에서 볼 수 있듯이, 다른 농도의 DPC를 추가에 의해 트립토판(Trp)의 인돌 양성자가 10ppm에서 11ppm 영역으로 다운 필드 이동(downfield shift)이 발생하였다. 물 속의 펩타이드에 DPC를 추가하면 DPC와의 상호 작용으로 인해 펩타이드의 형태 변화가 발생하여 라인 확장과 다운 필드 이동이 발생하였으며, 10mM DPC에서 NMR 스펙트럼은 느린교환(slow exchange)에서 두가지 형태(자유형태 및 결합 형태)에 대해 두 개의 넓은 피크를 명확하게 보여주었다.
그러나, 15mM DPC에서 결합된 형태에 대한 다운 필드에서, 인돌 양성자 피크는 DPC의 양이 더 적은 경우에 비해 더 날카로워졌으며 자유 형태의 피크는 강도가 감소하였다. 30mM DPC를 추가한 후 화학적 이동과 라인 확장은 변경되지 않았으며, 이는 펩타이드가 DPC 미셀에 안정적으로 결합되었음을 의미한다 (도 4B 및 도 4C).
Pro10-1은 Pro9-3에 비해 Arg가 하나 더 있지만 화학적 이동 변화의 전체 패턴은 두 경우 모두 매우 유사하였으며, 모든 D-아미노산을 포함하는 Pro10-1의 거울상 이성질체인 Pro10-1D는 DPC를 첨가했을 때 Pro10-1과 거의 동일한 NMR 스펙트럼 변화를 나타내었다. 또한, 모든 펩타이드에 대해 아미드 양성자와 방향족 고리 영역의 큰 화학적 이동 섭동이 관찰되었다. 이러한 변화는 펩타이드가 수용액에서 무작위 구조를 갖는 반면, 미셀 환경에서는 CD 스펙트럼과 잘 일치하는 더 정렬된 구조를 형성한다는 것을 의미한다 (도 3).
그람 음성 박테리아에 대한 펩타이드의 항균 작용 기전 확인
본 발명에서는 펩타이드의 작용방식을 조사하기 위해, 모델 인지질막과 대장균에 침투하는 능력을 측정하였으며, 다양한 조성물의 리포좀으로부터 형광 칼세인(fluorescent calcein)의 방출을 모니터링함으로써 펩타이드의 막 투과 능력을 측정하였다.
본 발명에서는 그람 음성 박테리아 세포를 모방하기 위해 EYPE(egg yolk phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk phosphatidylglycerol) (7:3, w/w)로 구성된, 칼세인-포집된 LUV(Calcein-entrapped LUV)는 공지된 방법에 따라 염료 완충액 용액(70mM 칼세인, 10mM Tris, 150mM NaCl 및 0.1mM EDTA, pH 7.4)에서 건조된 지질을 볼텍싱(vortexing)하여 제조하였다.
LUV로부터의 칼세인 누출은 RF-5301PC 분광 광도계(Shimadzu, 일본)을 사용하여 여기파장 490 nm 및 방출파장 520 nm에서 형광 강도를 측정하여 모니터링하였으며, 100% 염료방출을 결정하기 위해 Tris-완충액(20 μL) 중 10% Triton-X100을 첨가하여 리포좀을 용해시켰다.
실험은 세 번 반복 수행하였으며, 펩타이드에의한 염료 누출은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
염료누출 (%) = 100 × (F-F0)/(Ft-F0),
상기에서, F는 펩타이드가 나타내는 형광 강도이고 F0는 펩타이트가 존재하지 않을 때, Ft는 Triton X-100이 첨가되었을 때 형광 강도이다.
펩타이드 노출 3 분 후 칼세인 누출 비율을 사용하여 막을 투과하는 능력을 측정하였으며, 도 5A에 펩타이드 유도 칼세인 방출의 용량-반응 관계를 나타내었다. 모든 펩타이드들은 음전하를 띤 EYPE/EYPG LUV에 대해 상당한 염료 방출을 유도하였으며, 이는 펩타이드가 박테리아 세포 구성 요소막에 강력하게 침투하였다는 것을 의미한다.
특히 Pro10-1과 Pro10-1D 펩타이드는 4 μM에서도 80% 이상의 누출을 보였고, Pro9-3은 4 μM에서 64.7% 누출을 보이는 것으로 나타났다. 상기 결과는, 펩타이드들의 강력한 항균 활성이 박테리아 세포막의 투과성에 때문일 수 있음을 시사한다.
즉, 본 발명의 신규 펩타이드인 Pro10-1 및 Pro10-1D는 양이온성이 높아 멜리틴과 유사한 높은 항균 활성을 유지할 수 있으며, 박테리아 세포막과 효과적으로 상호작용하여 세균 세포에 치명적인 손상을 주어 항균 활성을 향상 시킬 수 있다.
펩타이드의 LPS-중화 활성 측정
본 발명의 펩타이드 LPS 중화 활성은 LAL 발색성 내독소 정량 키트(Pierce LAL chromogenic endotoxin quantitation kit, ThermoFisher Scientific, 미국)를 사용하여 측정하였다.
다양한 농도(내독소가 없는 물에서 3.12, 6.25, 12.5, 25 및 50 μM 농도)의 표준 물질(Polymixin B)을 포함하는 모든 펩타이드를 96웰-플레이트에 첨가한 다음, 20 ng/mL의 LPS와 결합하도록 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 동일한 부피(10 μL)의 LAL 시약을 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 20 μL의 LAL 발색기질을 첨가하였다. 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 25% 아세트산을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음, 기질로 인한 황색 형성 감소 정도 측정하기 위해, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3번 반복 수행하였으며, 펩타이드-LPS 상호작용으로 인한 흡광도 변화는 LPS 중화 퍼센트로 표시하였다.
도 5B에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드들은 농도 의존적으로 LPS와 크게 상호작용하는 것을 확인하였다. 양성 대조군인 폴리믹신 B(polymyxin B, 67.4%)와 비교하였을 때, Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D 펩타이드는 50 μM 농도에서 LPS의 활성화를 각각 93.6%, 58.6% 및 58.45%로 현저하게 억제하는 것을 확인하였으며, Pro9-3는 LPS에 대해 훨씬 더 큰 친화성을 나타내었다.
펩타이드와 박테리아의 상호작용 확인
본 발명에서는 펩타이드와 박테리아의 상호작용을 확인하기 위해, FE-SEM(field emission scanning electron microscopy)를 이용하여 펩타이드 처리에 따른 대장균의 형태(morphology)를 관찰하였다.
E. coli(KCTC 1682)의 막 손상 정도를 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscope)으로 시각화하여 펩타이드가 박테리아 막을 표적으로 한다는 것을 확인하고자 하였다.
1x MIC 및 2x MIC의 펩타이드를 E. coli에 처리한 다음, OD600값이 0.2가 되도록 10mM PBS로 희석한 후, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 E. coli를 고정 및 탈수 시킨 다음 FE-SEM(SU8020; Hitachi, 일본)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5C에 나타난 바와 같이, 펩타이드 처리에 의해 유도된 막손상이 명확하게 시각화되었다. 1 x MIC 펩타이드로 4시간 동안 처리된 E. coli 세포는 주름진 것으로 확인된 반면, 펩타이드가 처리되지 않은 대조군 세포는 정상적인 타원형 모양이 관찰되었다. 또한, 2 x MIC 펩타이드로 처리된 E. coli 세포는 훨씬 더 구겨지고 심하게 수축된 것으로 확인되었다. 즉, 펩타이드가 효과적으로 박테리아 막을 투과하여 E. coli에 심각한 손상을 입힌다는 것을 확인하였다.
프로테아제에 대한 펩타이드의 내성 확인
본 발명에서는 Pro10-1 및 Pro10-1D의 안정성을 테스트하기 위해 프로테아제인 트립신(trypsin) 및 키모트립신(chymotrypsin)으로 각각 전처리 펩타이드를 대장균(E. coli) 및 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii; A.baumannii)를 처리하여 상대적인 생존율을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 안정성 분석을 위해 MIC 조건의 모든 펩타이드와 트립신 및 키모트립신를 10,000 : 1 (펩타이드-효소) 비율로 37℃에서 6시간 동안 함께 배양하였다. 배양 후, 100 μL의 펩타이드-프로테아제 혼합물을 100 μL 박테리아 현탁액(E. coli 및 A. baumannii, 2 x 105 CFU/mL)에 첨가하고 37℃에서 16 시간 동안 추가로 배양하였다. 멜리틴을 표준 펩타이드로 사용하였으며, 펩타이드와 프로테아제가없는 박테리아 현탁액을 대조군으로 사용하였다. 실험은 3회 반복 수행하였으며, 박테리아 성장 정도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 600nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 6A 및 도 6C에 나타난 바와 같이, 프로테아제의 존재하에 Pro9-3 및 Pro10-1는 박테리아 성장을 억제시키지 못한 반면, 거울상 이성질체인 Pro10-1D는 프로테아제의 존재와는 상관 없이 항균 활성을 유지하였으며, 프로테아제가 없는 경우와 유사하게 E. coli와 A. baumannii의 성장을 억제시켰다. 상기 결과는, Pro10-1D가 트립신과 키모 트립신에 대해 실질적인 프로테아제 저항성을 나타냄을 의미한다.
바이오필름 억제에 대한 펩타이드 효과 확인
본 발명에서는 Pro9-3, Pro10-1 및 Pro10-1D의 항생제로서의 잠재력을 조사하기 위해, 크리스탈 바이올렛 염색(crystal violet staining)을 이용하여 바이오필름 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 펩타이드의 바이오필름 형성 억제 효능을 확인하기 위해, E. coli, A. baumannii 및 MDR 균주(MDREC1299 및 MDRAB 12010)에 대한 막 억제 효능(antibiofilm activity)을 확인하였다.
박테리아 현탁액(2 x 105 CFU/mL)을 0.2% 포도당이 보충된 MH(Mueller-Hinton) 배지가 포함된 96 웰 플레이트에서 성장시킨 다음, 펩타이드 및 멜리틴의 농도가 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32 및 64 μM가 되도록 처리하고 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다.
배양 후, 각 웰의 상등액을 제거하고, 100% 메탄올을 이용하여 15분 동안 박테리아를 고정시킨 다음, 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛(crystal violet)이 첨가된 0.25% (v/v) 아세트산 용액으로 1시간 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 염료를 증류수를 이용하여 세척 및 건조시킨 다음, 95% (v/v) 에탄올을 이용하여 용해시킨 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 595 nm에서 OD를 측정하여 바이오필름 질량의 정도를 정량화하였다. 실험은 3회 반복 수행하였으며, 바이오필름 형성 억제 효능은 펩타이드가 처리되지 않은 대조군에 비해 형성된 바이오필름 의 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 모든 펩타이드는 농도 의존적으로 바이오필름 형성을 억제하는 것을 확인하였다. 특히, Pro10-1D는 멜리틴을 포함한 다른 펩타이드에 비해 E. coli, A. baumannii 및 MDR 균주에 의한 바이오필름 형성을 가장 효과적으로 억제하였다. 또한, Pro10-1D는 상기 표 2에 나타난 바와 같이, MH 배지에서 4 μM 농도일 때, MDREC 1229의 성장을 완전히 억제하는 것으로 확인되었다. 폴리스티렌 플레이트(polystyrene plate) 표면에서 MDREC 1229의 바이오필름 형성을 유도하기 위해 포도당(0.2%)을 첨가했을 때 Pro10-1D는 4 μM 농도에서 58%로 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 나타났으나, 16 μM 농도에서는 99%까지 바이오필름 형성을 억제하는 것을 확인되었다.
Pro10-1D는 세 가지 펩타이드 중 바이오필름 형성을 가장 효과적으로 억제하였기 때문에, 본 발명에서는 추가적으로 광학현미경을 통해 MDREC 1229에 대한 Pro10-1D의 바이오필름 형성 역제 효능을 확인하였다.
현미경 분석을 위해 MDREC 1299 균주를 6 웰 플레이트(polystyrene)에서 0.2% 포도당을 포함하는 MH 배지를 이용하여 성장시키고, Pro10-1D(0-16 μM)를 첨가한 후 37℃에서 16시간 동안 배양 하였다. 배양 후 상등액을 제거하고, 상기와 같은 방법으로 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 박테리아를 염색한 다음, 광학 현미경(Eclipse Ni; Nikon, 일본)을 이용하여 바이오필름 형성 억제 정도를 확인하였다.
MH 배지에 포도당을 첨가하여 MDREC 1229의 바이오필름 형성을 유도한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, MDREC 1229에서 고밀도의 고분자 매트릭스층이 관찰되었다. 대조적으로, Pro10-1D가 첨가된 세포는 농도 의존적으로 박테리아 콜로니가 적었으며, 파괴된 바이오필름 매트릭스가 관찰되었다.
펩타이드에 의한 염증성 사이토카인 생성 억제 효능 확인
본 발명에서는 Pro9-3보다 더 높은 항균 및 항-바이오필름 활성이 확인된 Pro10-1 및 Pro10-1D는 에 대한 항염증 활성을 추가적으로 확인하였다.
본 발명에서는 펩타이드의 산화질소(NO) 생성 억제 효과를 확인 한 후, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 인터루킨 6(Interleukin 6; IL-6)을 포함하는 사이토카인 수준을 ELISA를 이용하여 측정하였다.
배양 배지에서 아질산염(nitrite; NO)의 생성 정도는 Griess 분석방법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포가 1 x 105 개/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 각 조건별로 3웰씩 접종한 다음, 펩타이드 농도가 1, 5, 25 및 50 μM이 되도록 첨가하고 1시간 동안 전처리하였다. 그 후, E. coli O111:B4 (Sigma-Aldrich, 미국)으로부터 정제한 LPS를 20 ng/mL로 첨가하고 16시간 동안 배양하였다. 배양 후, 동일한 부피의 배양 배지와 Griess 시약을 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아질산염 농도는 아질산 나트륨을 이용한 표준곡선을 사용하여 측정하였다.
또한, 배양배지에서 TNF-α 및 IL-6을 포함한 염증성 사이토 카인의 정량화는 ELISA 키트(R&D Systems, 미국)를 사용하여 메뉴얼에 따라 수행하였다. 분석은 3회 반복 수행하였으며, TNF-α와 IL-6의 농도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서는 NO, TNF-α 및 IL-6 수준이 증가한 반면, Pro10-1 및 Pro10-1D를 처리한 경우 효과적으로 NO, TNF-α 및 IL-6 수준이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, Pro10-1에 비해 Pro10-1D가 보다 효과적으로 NO, TNF-α 및 IL-6 생성을 억제하는 것으로 확인되었으며, 이는 Pro10-1D가 LPS-유도 사이토카인 수준을 효율적으로 하향 조절할 수 있음을 의미한다.
Pro10-1D에 의한 TLR4 다운스트림 신호전달 억제 효능 확인
본 발명의 신규한 펩타이드가 TLR4 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 실시예 11의 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 TLR4, JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 ERK(Extracellular signal-regulated kinase)를 포함하는 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 및 NK-κB 핵 전좌의 발현을 분석하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포의 단백질은 단백질분해효소(protease) 및 인산화효소(phosphatase) 억제제가 포함된 RIPA 버퍼(radio immunoprecipitation buffer)를 사용하여 추출한 다음, 4℃에서 20분 동안 12,000 x g로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액은 사용전까지 -80℃에서 보관하였다.
또한 세포질 및 핵 분획은 NE-PER Nuclear 및 Cytoplasmic Extraction Reagents kit (ThermoFisher Scientific, 미국)을 사용하여 메뉴얼에 따라 추출하였다.
단백질 함량은 BCA (bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)를 사용하여 정량하였으며, 30μg의 단백질을 SDS-PAGE(10% (w/v) 폴리아크릴아미드)를 이용하여 전기영동하였다. 전기영동을 수행한 겔을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼한 다음, 5% (w/v) 무지방 밀크를 사용하여 블로킹하였다. 그 다음, 멤브레인을 1차 항체(1 : 1000 희석)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 실온에서 1시간동안 각각의 2차항체와 반응시켰다.
항원-항체 복합체는 iBright ™CL1000 Imaging System(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국) 및 WestGlowTM Chemiluminescent Substrate(Biomax Co., Ltd, 한국)를 사용하여 측정하였으며, 단백질 밴드는 Image J 소프트웨어(Version 1.52)를 사용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, LPS 처리는 TLR4의 발현을 증가시켰으며, RAW264.7 세포에서 MAPK 및 NF-κB 전위의 상당한 인산화가 관찰되었다. 반면, Pro10-1 및 Pro10-D를 20 μM 농도로 처리하였을 때, LPS로 유도된 TLR4 발현이 효과적으로 억제되었으며, MAPK 및 NF-κB 단백질 인산화 역시 감소하는 것을 확인하였다. 또한, Pro10-1에 비해 Pro10-1D가 보다 효과적으로 MAPK 및 NF-κB 단백질 인산화를 억제하였으며, 이는 Pro10-D가 TLR4 매개 캐스케이드(cascade)를 억제함으로써 염증을 억제함을 알 수 있다.
펩타이드의 패혈증 치료 효능 확인
13-1 : Pro10-1D의 생체내 안정성 확인
본 발명에서 Pro10-D가 가장 높은 항균, 항균막활성 및 항염증 활성을 보이는 것으로 확인되었으므로, Pro10-D의 생체내 패혈증 치료 효능을 확인하였다. 먼저, 그람 음성 패혈증에 대한 치료적 적용에 대한 효능을 조사하기 위해, 마우스에서 Pro10-D의 안전성을 조사하였다.
동물실험을 위한 마우스는 ICR(Female Institute of Cancer Research) 마우스(4주령, 24 ~ 25g)를 오리엔트(Orient, 한국)으로부터 구입하였으며, 모든 마우스는 온도 및 습도 제어환경에서 특정 병원균이 없는 조건에서 사육되었다. 모든 절차는 대한민국 서울 건국 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행하였다 (IACUC number: KU19197-1).
ICR 마우스에 대한 Pro10-1 및 Pro10-1D의 세포독성을 확인하기 위해 예비 독성 연구를 수행하였다. 4주령 마우스(n = 5)에 24시간 동안 펩타이드(각각 각각 1mg/Kg 및 5mg/Kg)를 복강내 주사한 다음, 혈액을 채취하고, 혈액으로부터 혈청을 채취하였다. 그 다음 공지된 방법에 따라 마우스 혈청에서 AST(aspartate aminotransfera) 및 ALT(alanine aminotransferase)를 포함하는 간 효소 마커 및 BUN(blood urea nitrogen)을 포함하는 신장 효소 마커의 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 1mg/kg 및 5mg/kg 용량 모두에서 AST, ALT 및 BUN 상승의 임상적 중요성이 관찰되지 않았으므로, 본 발명에서는 Pro10-1D가 고용량에서도 안전하다는 것을 확인하였다. 이후, 패혈증 실험에서는 1mg/kg 용량의 Pro10-1D를 이용하였다.
13-2 : 패혈증 쇼크 마우스 모델에서 Pro10-1D 펩타이드의 항균 효과 확인
본 발명에서는 다음으로 E. coli K1을 사용하여 확립된 패혈성 쇼크 마우스 모델을 사용하여 펩타이드 항생제로서 Pro10-1D의 효능을 확인하였다.
패혈증 모델은 감염 균주로 E. coli K1을 사용하여 제조하였으며(Jang M. et al., Int. J. Mol. Sci., 20:4895, 2019), 마우스를 무작위로 선별하여 5마리씩 6개 그룹으로 분류하였다. 대조군으로 일반 마우스에 PBS(pH7.4)를 복강내 주사하였으며, Pro10-1 및 Pro10-1D는 각각 1mg/Kg씩 복강내 주사하였다.
항균 활성 측정을 위해, 각 그룹별 마우스에 pro10-1 및 Pro10-1D를 각각 1시간 동안 전처리한 다음, E. coli K1(6 × 106 CFU/mouse, I.P.)로 감염시켰다. 패혈증 대조군으로는 펩타이드를 전처리하지 않은 E. coli K1(6 × 106 CFU/mouse, I.P.)에 감염 마우스를 사용하였다. 16시간 후, 과량의 에테르로 마취하에 마우스를 안락사시킨 후, 혈액샘플, 폐, 간 및 신장조직을 채취하고 생화학 및 조직학적 분석을 수행하였다.
구체적으로, 차가운 PBS에서 상기에서 채취한 폐, 간 및 신장 조직의 용해물을 박테리아 콜로니수로 평가하였다. 혈청의 내독소 수준은 Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 제품 매뉴얼에 따라 정량화하였다. 혈청 내 AST, ALT 및 BUN의 수준과 혈청 또는 폐 조직에서 염증성 사이토카인 수준은 상기에서 설명한 방법대로 정량화하였다.
그 결과, 도 12A에 나타난 바와 같이, Pro10-1D는 마우스 폐, 간 및 신장의 박테리아 수를 각각 약 73%, 87% 및 71%로 감소시켰으며, 이는 Pro10-1D가 E. coli K1에 감염된 마우스의 내장 기관에서 세균 성장을 효과적으로 억제하는 것을 나타낸다.
또한, 도 12B에 나타난 바와 같이, LAL 테스트에 의한 혈청내 독소 측정을 수행한 결과, E. coli K1에 감염된 마우스가 100% 내독소 활성화를 나타내는 반면, Pro10-1D로 전처리한 경우, 내독소 수준이 33% 이상 효과적으로 감소한 것을 확인하였다.
나아가, 본 발명에서는 패혈증에서 Pro10-1D의 효능을 확인하기 위해 상기 실시예 11과 같이 ELISA를 사용하여 TNF-α 및 IL-6)를 포함하는 염증성 사이토 카인의 수준을 정량화 하였다.
그 결과, 도 12C 및 도 12D에 나타난 바와 같이, E. coli K1에 감염된 마우스는 대조군과 비교하여 TNF-α 및 IL-6 발현이 현저하게 상향 조절된 반면, Pro10-1D를 투여한 마우스는 TNF-α 및 IL-6 수준이 혈청에서 각각 45% 및 56%, 폐조직에서 각각 51% 및 62%까지 억제된 것을 확인하였다.
또한, 도 12E에 나타난 바와 같이, E. coli K1에 감염된 마우스는 대조군에 비해 AST, ALT 및 BUN 수준이 100% 향상된 것으로 확인된 반면, Pro10-1D로 전처리한 마우스는 AST의 경우 26%, ALT의 경우 48%, BUN의 경우 37%로 효소 수준이 현저하게 감소한 것으로 확인되었다.
Pro10-1D 펩타이드의 다형핵 림프구(Polymorphonuclear Lymphocyte; PMN) 침윤 억제 효능 확인
본 발명에서는 모세혈관-폐포 장벽 기능 장애와 관련되어 폐혈증 동안 치사율 및 이환율을 높이는 다형핵 림프구(polymorphonuclear lymphocytes, PMNs)의 폐 침윤(infiltration)을 Pro10-1D가 억제하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 13의 대조군과 펩타이드 처리군의 마우스 폐조직을 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 조직학적 분석을 수행하였다.
구체적으로, 6mm 두께의 폐 조직 절편을 자일렌으로 탈파라민화하고 에탄올로 재수화시킨 다음 H&E 염색을 수행하였다. 염색된 부분을 광학현미경(Eclipse Ni; Nikon, 일본)으로 관찰하여 호중구 침윤 및 기타 병적 변화에 대해 조사하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, E. coli K1에 감염된 폐조직의 조직학적 패턴은 폐에 침윤된 PMN과 함께 심각한 부종, 폐 울혈 및 폐포 출혈이 관찰되었다. 이러한 미세 해부학적 특징은 증가된 PMN이 폐손상과 관련되어 E. coli K1 감염시 패혈증 중증도를 유발한다는 것을 의미한다. 반면, Pro10-1D 전처리된 패혈증 마우스의 폐 조직을 확인한 결과, Pro10-1D에 의해 E. coli K1에 의해 유발된 병리학적 변화가 효과적으로 완화된 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서는 Pro10-1D 펩타이드가 E. coli K1에 감염된 마우스에서 패혈증 관련 염증을 예방하는 새로운 펩타이드 항생제 역할을 수행할 수 있는 것을 확인하였다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP
<120> Composition comprising a defensin derived 10 meric peptide for
preventing or treating sepsis
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<220>
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro9-3D
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> D-form amino acid
<400> 4
Arg Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg
1 5 10
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드(10-meric peptide) 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하고,
상기 거울상 이성질체는 서열번호 1의 아미노산 서열이 모두 D형 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 서열번호 3의 서열로 표시되는 9량체 펩타이드의 N-말단에 아르기닌이 추가되어 양이온성이 증가한 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 그람 음성 박테리아 또는 MDR(multidrug-resistant) 그람 음성 박테리아에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 진핵세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 박테리아의 바이오필름 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 내독소 중화능 또는 내독소 제거능을 가지는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 LPS에 의해 유도된 염증 활성 억제 또는 TLR4 신호 전달을 억제하는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 10량체 펩타이드 또는 이의 거울상 이성질체는 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선시키는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 10량체 펩타이드(10-meric peptide) 또는 이의 거울상 이성질체를 유효성분으로 포함하고,
상기 거울상 이성질체는 서열번호 1의 아미노산 서열이 모두 D형 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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