KR20220013612A - Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 내독소혈증 또는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ps 펩타이드 유도체의 패혈증 또는 내독소혈증 예방 또는 치료 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Ps 펩타이드 유도체는 기존의 수딘(pseudin-2, Ps)의 우수한 항균 활성은 유지하면서, 진핵세포에 대한 세포독성을 현저히 감소시켰으며, 특히, TLR4-매개 NF-κB 신호전달 경로를 통해 선천적 방어를 활성화시킴으로써 박테리아 및 이의 내독소를 생체 내에서 제거하고, 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선함으로써 내독소혈증을 개선하며, 더 나아가 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 효과가 있다.

Description

Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 내독소혈증 또는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING PSEUDIN-2 DERIVATIVE FOR PREVENTING OR TREATING ENDOTOXEMIA OR SEPSIS}

본 발명은 Ps 펩타이드 유도체의 내독소혈증, 패혈증 패혈증성 쇼크 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

넓은 의미로서 면역반응으로 불리는 항원 항체 반응은 인간을 포함한 무척추 동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충이나 양서류는 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충, 양서류뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 항균 펩타이드(Antimicrobial peptides, AMPs)를 획득한다는 것이다. 최근 들어 항생제 내성문제가 심각해지면서 이러한 항균 펩타이드를 이용한 새로운 신약 후보 물질에 관심이 늘어나고 있다. 항균 펩타이드는 세균의 막을 타겟으로 하여 항균활성을 가지므로 기존 항생제에 내성을 가진 균주에 대해서도 활성을 유지하는 특징을 가지는 것으로 보여진다. 그러므로 다양한 천연 유래한 항균 펩타이드는 내성 균주의 출연으로 위협받고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 개념의 항생제 탐색에 중요한 생물자원으로 각광받고 있다. 양서류의 피부 추출물 및/또는 피부 분비물로부터 다양한 형태의 항균 펩타이드들이 분리되었다 (Peptides from frog skin. Bevins CL, Zasloff M.Annu Rev Biochem. 1990;59:395-414. doi: 10.1146/annurev.bi.59.070190.002143. Frog Skin Innate Immune Defences: Sensing and Surviving Pathogens. Varga JFA, Bui-Marinos MP, Katzenback BA. Front Immunol. 2019 Jan 14;9:3128. doi: 10.3389/fimmu.2018.03128. eCollection 2018. Antimicrobial Peptides: Amphibian Host Defense Peptides. Patocka J, Nepovimova E, Klimova B, Wu Q, Kuca K. Curr Med Chem. 2019;26(32):5924-5946. doi: 10.2174/0929867325666180713125314.). 대표적인 양서류 유래 항균 펩타드들은 개구리 African clawed frog(Xenopus laevis)의 피부에서 분리된 메가이닌(Magainin), 개구리 Pseudis paradoxa (Pseudidae)의 피부에서 분리된 수딘1-4 등이 있으며 이들은 강력한 항균활성을 보인다 (Zasloff, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5449-53 (1987). Olson, L., Soto, A. M., Knoop, F. C. & Conlon, J. M. Pseudin-2: An Antimicrobial Peptide with Low Hemolytic Activity from the Skin of the Paradoxical Frog. Biochem. Biophys. Res. Commun. 288, 1001-1005 (2001). 이 중, 수딘2(Pseudin-2, Ps)는 4가지의 수딘 중 가장 강력한 항박테리아 활성을 가지며 강한 세포 독성을 나타낸다.

쇼크는 불충분한 조직 관류 (perfusion) 및 불안, 혼동 (confusion), 의식불명, 호흡항진 (hyperventilation), 핍뇨증 (oliguria), 무뇨증 (anuria), 저혈압 (hypotension), 혈관수축 (vasoconstriction) 및 혈관확장 (vasodilation)과 같은 여러 임상적 증상에 의하여 특징지워지는 임상적 증상이다. 상기 증상들은 중증이어서 높은 빈도의 사망률을 초래한다 (Beal A. 등, JAMA, 1990, 271: 226∼233). 40 세 이하의 건강한 개체에서 내독소성 쇼크가 발생하는 것은 적으나, 당뇨병, 내시경 수술, 만성 간장애 (hepatopathy), 혈액 질환 (blood dyscrasia), 및 코티코스테로이드 및 사이클로스포린 A와 같은 면역억제 약물의 지속적 사용에 의하여 그 발생 빈도가 높아질 수 있다. 현재까지, 내독소성 쇼크의 치료를 위한 치료학적 접근법은 없다.

특히, 패혈증(sepsis)은 출혈 및 심근경색증((myocardial infarct)에 야기되는 쇼크의 3번째로 잦은 원인이다. 특히, 곰팡이, 리케치아 및 바이러스에 의한 감염도 중요한 역할을 하지만, 그람-음성 박테리아가 패혈성 쇼크의 주요 원인이다 (Beal A. 등, JAMA, 1990, 271: 226∼233). 패혈증은 주로 면역억제를 유도하는 치료제의 투여 및 화상 또는 내장 파열 등으로 세균이 혈관 또는 세포의 내부로 침투하여 일어나며 (Cohen J. 등, Nature. 2002; 420: 885-91.), 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균에 의해서 유도될 수 있다. 그람 양성 패혈증의 경우 세균이 계속 생존하면서 세포 내부에서 증식하는 것과는 달리, 그람 음성 패혈증은 그람 음성 세균 또는 그의 세포벽 구성성분의 일종인 내독소가 1차의 감염소에서 혈중에 과도하게 침입하여 순환기계를 통해 전신으로 퍼짐으로써 발생하게 된다. 혈류로 침입한 내독소는 우선 내독소 접착단백질(endotoxin binding protein)과 결합한 다음, 생체내의 대식세포, 호중구, 임파구 등의 염증세포 및 혈관내피세포를 자극하여 종양괴사인자(tumor necrosis factor)를 포함하는 다양한 염증성 사이토카인을 생성한다. 그람 음성 패혈증의 임상적 발현으로는 현저한 사이토카인의 증가로 인해서 다장기장애(multiple organ dysfunction syndrome: MODS)를 일으키고 그 결과 사망을 초래하게 된다. 특히, 그람 음성 세균에 의한 패혈증(Gram-negative sepsis)은 병원의 중환자실에서의 주된 사망 원인중의 하나이며, 그 빈도가 세계적으로 계속 증가하는데 이는 침투경로의 빈도증가와 면역억제로 이어지는 치료에 기인된다. 흔히 패혈증은 패혈성 쇼크(Septic shock)로 발전하게 되는데 이는 감염을 동반하는 전신성 염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome)으로 정의된다 (Bone RC. The pathogenesis of sepsis. Ann. Intern. Med. 1991; 115: 457.). 패혈증 쇼크는 치사율이 45%에 이르러 중환자실에 입원한 환자들의 생명을 위협하는 가장 흔한 원인이 되기도 한다. 패혈성 쇼크 환자들은 발열, 혈압저하, 심근 억제, 탈수, 급성 신부전증 및 호흡정지 등의 증상을 동반한다. 패혈증으로 수반되는 높은 이환율 및 치사율은 대식세포 및 단핵세포로부터 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines) 인자 분비를 자극하는 세균성 내독소에 의하여 부분적으로 기인하다. 그람 음성 세균 외막의 리포폴리사카리드(Lipopolysaccharide; LPS)은 대식세포를 활성화시키고 내독성 쇼크 (endotoxic shock) 도중에 상당한 양의 전염증성 사이토카인 및 일산화질소(NO) 자유 라디칼 (free radical)의 일련의 분비를 촉진시킨다. 패혈증은 발견되는 시기에 따라서 그 사망률이 23%에서 46%까지 보고되는 심각한 질환이며 많은 경제적 부담을 증가시키는 질환으로 보건정책의 난제로 알려져 있다 (Dellinger RP:Cardiovascular management of septic shock. Crit Care Med 2003; 31: 946-55; Osborn TM, Tracy JK, Dunne JR, Pasquale \M, Napolitano LM: Crit Care Med 2004; 32: 2234-40; Angus DC, Linde-Zwirble WT. Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR: Crit Care Med 2001; 29: 1303-10). 패혈증은 비 심혈관계 중환자실 사망의 가장 흔한 원인으로 미국에서는 최소한 연평균 75만 명의 새로운 환자가 발생하며, 그 중 50%가 패혈성 쇼크로 진행되고 그 절반 정도인 20만명이 사망한다 (Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M: N Engl J Med 2003; 348: 1546-54.).

의학기술의 발전에도 불구하고, 최근 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차로 증가하는 현상과 관련하여, 패혈증의 치료가 매우 중요한 문제로 대두되고 있다. 특히, 항생제 내성을 가지는 그람음성균 감염이 급증하면서 항생제만으로는 효과적인 치료를 할 수 없어 새로운 패혈증 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 내독소혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 내독소혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Ps(pseudin-2) 펩타이드 유도체 (Ps-K18)는 기존의 수딘(pseudin-2, Ps)의 우수한 항균 활성은 유지하면서, 진핵세포에 대한 세포독성을 현저히 감소시켰으며, 특히, TLR4-매개 NF-κB 신호전달 경로를 통해 선천적 방어를 활성화시킴으로써 박테리아 및 이의 내독소를 생체 내에서 제거하고, 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선함으로써 내독소혈증을 개선하며, 더 나아가 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 효과가 있다.

도 1은 Ps (A) 및 Ps-K18 (B)의 Helical-wheel diagrams을 나타낸 도이다:
파란색: 양으로 하전된 잔기;
빨강: 음으로 하전된 잔기; 및
노랑: 소수성 잔기.
도 2는 Ps 또는 Ps-K18를 처리한 E. coli의 콘포칼 현미경 및 FE-SEM으로 확인한 도이다.
도 3은 Ps 및 Ps-K18의 in vitro 및 in vivo 세포 독성을 확인한 도이다.
도 4는 TLRs 및 TLRs-특이적 작용제에 대한 Ps-K18의 특이성, 및 Ps-K18의 항-염증 활성을 확인한 도이다.
도 5는 LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델에서의 Ps-K18의 효과를 확인한 도이다.
도 6은 E. coli K1으로 유도된 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 Ps-K18의 효과를 확인한 도이다.
도 7은 LPS 또는 E. coli K1으로 유도된 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 Ps-K18의 호중구 침윤 억제 효과를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:

알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps(pseudin-2) 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 Ps 펩타이드에 비해 양친매성 및 양이온성을 높을 수 있다.

일 구현예에서, 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크는 대장균 또는 LPS에 의해 유발된 패혈증 또는 패혈증성 쇼크일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 박테리아에 대하여 항균활성을 가질 수 있으며, 그람-음성 박테리아에 대해 항균활성을 가질 수 있고, MDR(multidrug-resistant) 그람-음성 박테리아에 대해 항균활성을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 Ps 펩타이드에 비해 진핵세포에 대한 세포독성이 감소된 펩타이드일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps 펩타이드 유도체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Ps(pseudin-2)의 18번째 아미노산 잔기 류신을 리신으로 치환함으로써 박테리아에 대한 항균 효과는 유지하고 진핵세포 (특히, 포유동물 세포)에 대한 세포독성이 현저히 감소되는 효과가 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 박테리아를 사멸시켜 그 수를 감소시키고, 내독소를 제거하며, 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선함으로써 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 치료할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 "항박테리아 또는 항세균(anti-bacterial)"을 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, MDR(multidrug-resistant) 그람-음성 박테리아 (또는 내성균)는 임의의 질환 및 이의 합병증 또는 임의의 박테리아성 장애 및 이의 합병증을 치료 또는 예방하기 위하여 약물을 지속적으로 사용한 결과, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 의미한다. 상기 항생제의 예로는 반코마이신, 세팔로스포린, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, 페니실린, 베타 락타마제 억제제, 카르베페넴, 모노박탐, 마크롤리드 및 린코사민, 글리코펩타이드, 리팜핀, 옥사졸리디논, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 스트렙토그라민 및 술폰아미드 등이 있으며, 항생제 내성균은 상기 열거된 항생제를 처리하는 경우에도 저항성을 나타내어 개체에서 지속적으로 질환이 유지된다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 펩타이드의 아미노 말단 및 카르복시 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호시킬 수 있으며, 그 예로 C-말단이 아미드화된 것일 수 있다.

상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다. 또한, 상기 변형된 펩타이드는 보호기로 인해 우수한 열안정성을 나타내며, 또한 산과 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성을 우수하다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 장기 보존성이 뛰어나게 변형될 수 있으므로, 의약품, 의약외품, 화장품 및 구강용품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형(또는 변이 또는 돌연변이)은 본 발명의 펩타이드 안정성을 크게 개선하는 작용을 하고, 본 발명에서 언급되는 용어 "안정성"은 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명에서 '특정 서열번호로 구성되는/이루어진 펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 발명에서, 펩타이드 서열의 변형은 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형된 것일 수 있다. 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다. 상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.

본 발명에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 (solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있으며 (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)), 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.

구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드들은, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:

(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는

(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는

(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는

(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.

보다 구체적인 예로, 유전자 조작을 통하여, 본 발명의 Ps 펩타이드 유도체를 코딩하는 유전자를 제조하고 이를 숙주 세포에 형질전환시킨 후, 단백질 형태로 발현하여 원하는 본 발명의 펩타이드를 생산할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 내독소혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 Ps 펩타이드에 비해 양친매성 및 양이온성을 높을 수 있다.

일 구현예에서, 상기 내독소혈증은 대장균 또는 LPS에 의해 유발된 내독소혈증일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 내독소혈증은 리포폴리사카라이드(LPS)-유도성일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 박테리아에 대하여 항균활성을 가질 수 있으며, 그람-음성 박테리아에 대해 항균활성을 가질 수 있고, MDR(multidrug-resistant) 그람-음성 박테리아에 대해 항균활성을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 Ps 펩타이드에 비해 진핵세포에 대한 세포독성이 감소된 펩타이드일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps 펩타이드 유도체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Ps(pseudin-2)의 18번째 아미노산 잔기 류신을 리신으로 치환함으로써 박테리아에 대한 항균 효과는 유지하고 진핵세포 (특히, 포유동물 세포)에 대한 세포독성이 현저히 감소되는 효과가 있다.

일 구현예에서, 상기 Ps 펩타이드 유도체는 박테리아를 사멸시켜 그 수를 감소시키고, 내독소를 제거하며, 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선함으로써 내독소혈증을 치료할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 그람 음성 박테리아에 의한 패혈증, 패혈증성 쇼크, 내독소혈증 또는 내독소 쇼크 유발 전/동시/후에 투여될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 패혈증, 패혈증성 쇼크 또는 내독소혈증의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 패혈증, 패혈증성 쇼크 또는 내독소혈증, 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 Ps 펩타이드 유도체는 동물에 대한 독성이 거의 없으므로, 식품 조성물로 이용이 가능하다.

본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 Ps 펩타이드 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 건강기능식품은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 Ps 펩타이드 유도체를 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드 Ps-K18 제작

N-(9-플루오레닐)메톡시카르보닐 고체-상 합성 기술을 이용하여 Ps(pseudin-2) 및 이의 18번째 류신(Leu)을 리신(Lys)으로 치환한 변이체 Ps-K18를 합성한 뒤, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phase preparative high-performance liquid chromatography)로 정제하였다 (표 1). 정제된 펩타이드의 순도는 분석(analytical) C 18 컬럼으로 측정하였다. 펩티드의 분자량은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser-desorption ionization-time-of-flight) 질량분석기로 결정하였다.

펩타이드	서열	분자량	순전하	소수성 <H>	서열번호
Ps	GLNALKKVFQGIHEAIKLINNHVQ	2685	+2	0.407	2
Ps-K18	GLNALKKVFQGIHEAIKKINNHVQ	2702	+3	0.295	1

실시예 2. Ps-K18의 특성

대부분의 AMPs(Antimicrobial peptides)는 박테리아의 세포막을 투과하여 기능을 상실시키기 때문에, 박테리아의 세포막과 상호작용을 포함하는 항균 활성에 순전하(net charge), 헬리시티(helicity), 소수성(hydrophobicity) 및 양친매성(amphipathicity)과 같은 구조적 특징이 중요하므로, Ps-K18의 이들 특성을 Ps와 비교하여 확인하였다 (표 1). HeliQuest (http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/)로 분석한 결과, Ps는 Leu²부터 Glu²⁴ 잔기까지의 선형 α-헬릭스 및 +2 순전하를 가진 친수성 측면과 소수성 측면의 양친매성 구조를 가지는 것으로 나타났으며 (도 1A), 이와 같은 Ps의 구조적 특성은 박테리아뿐 아니라 포유동물 세포에도 강한 세포독성을 가진다. 반면, Ps-K18는 Ps의 양친매성 α-헬릭스에서 친수성 측면과 소수성 측면 사이의 Leu¹⁸을 Lys 잔기로 치환함으로써 양이온성(cationicity)을 +3으로 증가시킴으로써 (표 1 및 도 1B), Ps의 항균 활성은 유지하면서 세포독성을 낮추었다. 즉, Ps-K18는 Ps의 Leu¹⁸을 Lys 잔기로 치환함으로써 α-헬릭스 구조의 양친매성 및 양이온성이 증가하여 진핵세포 (포유동물)에 대한 세포 독성을 감소시키고자 하였다.

실시예 3. Ps-K18의 항균 활성(Antibacterial Activity) 확인

1% 펩톤 배지를 이용한 배지 미량희석법(broth microdilution assay)으로 MIC( minimum inhibitory concentration)를 확인함으로써 MDR(multidrug-resistant) Gram-음성 박테리아 E. coli CCARM 1229, P. aeruginosa CCARM 2003 및 A. baumannii CCARM 12010 (CCARM), E. coli KCTC 1682, P. aeruginosa KCCM 11328 및 A. baumannii KCCM (KCTC, Taejon, Korea 및 KCCM, Seoul, Korea), 및 E. coli K1 strain RS218 (O18:K1:H7) (Jang-Won Yoon of Kangwon National University,Gangwon-do, Korea)에 대한 Ps-K18의 항균 활성을 확인하였다. 여기에서, 높은 항균 활성 및 독성을 가지는 멜리틴(Melittin)을 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, Ps-K18가 Ps의 활성과 유사한 항균 활성을 가지는 것으로 나타났다 (표 2). 이를 통해, Ps-K18가 Ps만큼 그람 음성 박테리아들, 특히, MDR 균주에 강한 항균력을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. Ps-K18 펩티드의 항균기전 확인

E. coli KCTC 1682가 mid-log phage가 되었을 때, 이를 세척하고 10 mM PBS 버퍼로 희석하였다. 박테리아 현탁액 (1 × 10⁷ CFU/mL)을 1 × MIC의 Ps-K18 또는 Ps와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 10 mM PBS 버퍼로 3회 세척하고 콘포칼 현미경(confocal laser scanning microscope) (LSM 800; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였다. 또한, 항균 작용에 의한 E. coli KCTC 1682의 막 손상을 확인하기 위해, 1 × MIC의 Ps-K18 또는 Ps 펩타이드를 처리한 E. coli KCTC 1682를 OD 600 값이 0.2가 되도록 10 mM PBS 버퍼로 희석한 뒤, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 고정 및 탈수 단계 후, 세포들을 a FE-SEM (SU8020; Hitachi, Tokyo, Japan)로 확인하였다.

FITC-표지된 Ps 또는 Ps-K18과 E. coli 간의 상호작용을 확인한 결과, Ps는 E. coli 막 표면에 주로 위치하였고, 세포 내부에서는 형광이 발견되지 않아, Ps 및 Ps-K18가 박테리아 막의 표면에 부착되어 E. coli 막의 파괴를 일으키는 것을 알 수 있었으며 (도 2A), 이들이 박테리아의 막을 표적으로 하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Ps 또는 Ps-K18에 의한 박테리아의 막 파괴를 FE-SEM로 확인한 결과, 펩타이드를 처리한 대장균(E. coli)은 주름지고 수축된 반면, 대조군 세포는 정상의 타원형 모양을 나타내 (도 2B), Ps와 유사한 높은 항균 활성을 유지한 Ps-K18가 박테리아의 세포막과 효과적으로 파괴함으로써 박테리아에 치명적인 손상을 야기하는 항균기전을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 5. Ps-K18의 세포 독성 확인

5-1. In Vitro

고활성인 Ps의 독성이 치료적 적용에 문제였기 때문에, Ps-K18 펩타이드의 포유동물 세포에 대한 독성을 확인하고 Ps와 비교하였다. 이를 위해, Cell Counting Kit-8 (Abbkine Scientific, Wuhan, China)를 이용하여 Ps 또는 Ps-K18 펩타이드의 세포독성을 RAW264.7 세포 및 HEK-293 세포 (Korean cell line bank, Seoul, Korea)에서 확인하였다. 그 결과, 양성 대조군인 멜라틴이 낮은 농도에서 매우 높은 세포 독성을 나타냈고, 50 μM 농도에서 Ps는 RAW264.7 세포 및 HEK-293 세포 각각에 대해 18% 및 31%의 생존율을 나타낸 반면, Ps-K18는 각각 82% 및 84%의 생존율을 나타내 (도 3), Ps-K18의 세포 독성이 Ps에 비해 현저히 낮은 것으로 확인되었다.

5-2. In Vivo

상기에서 확인한 세포독성을 In vivo에서도 확인하기 위해, 마우스에 PBS (대조군), Ps 또는 Ps-K18를 1, 10 또는 20 mg/kg로 주사하고 16시간 후 마우스의 혈청에서 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 BUN(blood urea nitrogen) 수준을 표준 키트 (Asan pharmaceutical, Seoul, Korea)로 측정하여 간 손상 및 신장 손상을 확인하였다. 그 결과, Ps를 투여한 마우스에서는 AST, ALT 및 BUN의 수준이 높은 농도로 증가한 반면, Ps-K18를 투여한 마우스는 AST 및 BUN 수치가 증가하지 않았고, 고용량인 20 mg/kg에서만 ALT 수준이 미소하게 증가하였으나, Ps보다 현저히 낮은 수준으로 나타났다 (도 3). 이를 통해, Ps-K18이 높은 항 박테리아 활성을 유지하면서 Ps보다 독성이 적으므로 치료제로서 개선되었음을 알 수 있다.

실시예 6. Ps-K18의 염증 반응 억제 효과

6-1. TLRs 특이적 염증 반응 억제 효과

선천성 면역 시스템에서 중요한 역할을 하는 TLRs(Toll-like receptors)에 대한 Ps-K18 펩타이드의 특이성을 확인하기 위해, 서로 상이한 TLRs들을 활성화시킨 후 RAW264.7 세포에서 질산염(nitrate) 생성을 측정하였다. 구체적으로, Ps 또는 Ps-K18 펩타이드로 세포를 1시간 동안 전처리한 후, TLR-특이적 작용제(Agonist)로, TLR2/6 신호 전달을 활성화하는 Pam2CSK4 (200 ng/mL), TLR2/1 염증 반응을 활성화하는 Pam3CSK4 (200 ng/mL), TLR3을 활성화시키는 Poly(I:C)(Polyinosinic:polycytidylic acid) (2 μ g/mL), TLR4 염증 신호를 활성화시키는 LPS (20 ng/mL), TLR9를 활성화시키는 ODN1826 (20 μ g/mL) (Invivogen, San Diego, CA, USA) 및 TLR7를 활성화시키는 Imiquimod (1 μ g/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 TLRs들을 활성화시킨 후 질산염 생성을 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 그 결과, Ps-K18가 10 μM 및 20 μM에서 LPS로 유도된 TLR4-매개 신호 전달을 각각 15% 및 43%로 현저하게 억제하는 것으로 나타나 (도 4A), Ps-K18가 LPS-유도된 TLR4 신호 전달을 선택적으로 조절하는 것을 확인할 수 있었다.

6-2. 염증 반응 억제 기전 확인

Ps-K18의 항염증 활성의 기전을 확인하기 위해, SEAP(secreted alkaline phosphatase reporter) 유전자 분석을 수행하였다. 구체적으로, NF-κB 프로모터의 하류에 SEAP 유전자를 포함하고 TLR4를 발현하여, LPS에 의해 세포가 자극되었을 때 TLR4-매개 리포터 활성화가 초래되는 HEK-Blue^TM hTLR4 세포 (InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 2.5 ×10⁴ cells/well로 분주하고 Ps-K18를 포함한 HEK-Blue 검출 배지 (InvivoGen, San Diego, CA, USA)에서 배양하였다. 1시간 배양 후 20 ng/mL LPS로 자극한 뒤 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. SEAP 활성은 630 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 그 결과, Ps-K18가 10, 20 및 40 μM 농도에서 SEAP 활성을 각각 19%, 27% 및 40% 억제하는 것으로 나타났다 (도 4B).

또한, Ps-K18가 LPS에 의해 활성화된 TLR4가 NF-κB의 인산화를 유도하고, 인산화된 NF-κB가 핵으로 이동하여 염증성 사이토카인 유전자 전자를 활성화시키는 TLR4 매개 염증 반응 신호전달에 미치는 영향을 확인하고자, RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, Ps-K18의 농도가 증가함에 따라, TLR4 및 NF-κB 유전자 발현이 현저하게 억제되었으며 (도 4C), 이의 정도를 ImageJ 소프트웨어로 확인한 결과 Ps-K18의 농도가 20 μM일 때 각각 약 83% 및 85% 억제되었다. 이를 통해, Ps-K18가 LPS-유도된 TLR4-매개 신호전달을 억제함으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 이에, 염증성 사이토카인인 mTNF-α, mIL-6 및 mIL-1α의 생성을 ELISA 분석으로 확인한 결과, Ps-K18가 농도 의존적으로 이들의 생성을 현저히 억제하는 것으로 나타났으며, 20 μM 농도에서 mTNF-α를 49%, mIL-6를 87% 및 mIL-1α를 88% 억제하는 것으로 나타났다 (도 4D). 이를 통해, Ps-K18가 낮은 세포독성으로 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있는 높은 항-염증 활성을 가지는 것을 알 수 있다.

실시예 7. Ps-K18의 항내독소혈증(Anti-endotoxemia) 효과 확인

Ps-K18가 In vitro에서 높은 항박테리아(항균) 및 항염증 활성을 나타냈기 때문에, 생체 내 패혈증의 치료 효과가 있는지 확인하기 위해, LPS에 의해 유도된 내독소혈증 마우스 모델을 이용하여 Ps-K18의 항-염증 활성을 확인하였다. 구체적으로, 암컷 BALB/c 마우스 (6주령) (Orient, Daejeon, Korea)를 PBS 투여군 (대조군), LPS 15 mg/kg 투여군, Ps-K18 1 mg/kg 투여군 및 LPS + Ps-K18 투여군 (LPS 15 mg/kg 투여 1시간 전 Ps-K18 1 mg/kg 투여)으로 나눠, 각각 복강으로 주사하였다(i.p.). 각 약물 투여 16시간 후 각 군의 마우스의 혈청 또는 폐 파쇄물에서 사이토카인 수준을 ELISA kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 확인하였다. 또한, LAL kit (Lonza Group Ltd., Allendale, NJ, USA)를 이용하여 내독소 LPS에 대한 Ps-K18의 억제 효과를 확인하였다. 아울러, 혈청 AST, ALT 및 BUN의 수준을 확인하여 LPS에 의한 손상된 기관에 대한 Ps-K18의 회복능을 확인하였다.

그 결과, Ps-K18만을 주사한 군은 대조군과 유사한 결과를 나타냈고, LPS만을 주사한 군에서는 높은 수준의 염증성 사이토카인 발현이 관찰되었으나, LPS + Ps-K18 투여군의 경우 Ps-K18 처리로 인해 염증성 사이토카인인 mTNF-α 및 mIL-6가 현저하게 감소되었다 (도 5). 혈청에서 Ps-K18가 mTNF-α를 65%, mIL-6를 57% 감소시켰으며 (도 5A), 폐에서도 각각 64% 및 56% 감소시켰다 (도 5B). 또한, Ps-K18가 LPS 내독소를 제거할 수 있는지 확인한 결과에서도, Ps-K18가 내독소를 53% 감소시켰다. 아울러, Ps-K18가 AST, ALT 및 BUN의 수준을 각각 18%, 19% 및 49% 감소시켜 (도 5C), Ps-K18가 내독소 LPS에 의해 손상된 기관의 기능을 개선할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 8. Ps-K18의 항패혈증(Anti-sepsis) 효과 확인

암컷 BALB/c 마우스 (6주령)을 PBS 투여군 (대조군), E. coli K1 투여군 (1 × 10⁶ CFU/mouse), Ps-K18 1 mg/kg 투여군 및 E. coli + Ps-K18 투여군 (E. coli K1 1 × 10⁶ CFU/mouse 투여 한시간 전 Ps-K18 1 mg/kg 투여)으로 나눠, 각각 복강으로 주사하였다. 여기서, E. coli K1은 박테리아를 면역 공격으로부터 보호하는 필수 독성 결정 요인(essential virulence determinant)인 K1 캡슐 다당류 항원(capsular polysaccharide antigen)을 보유하고 있다. 투여 16시간 후, 상기 실시예 7에서와 같이, 각 군의 마우스의 혈청 또는 폐 파쇄물에서의 사이토카인 수준, 내독소 LPS 수준, 및 혈청 AST, ALT 및 BUN의 수준을 확인하였으며, Ps-K18가 생체 내에서 박테리아의 성장을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 폐, 간 및 신장 조직에서 박테리아의 수를 계수하였다.

그 결과, Ps-K18가 폐, 간 및 신장 조직에서 박테리아의 수를 각각 약 73%, 87% 및 71% 감소시켰다 (도 6A). 또한, 혈청에서 mTNF-α 수준을 45% 및 mIL-6 수준을 43% 감소시켰으며 (도 6B), 폐에서 mTNF-α 수준을 51% 및 mIL-6 수준을 41% 감소시켰다 (도 6C). 또한, Ps-K18가 E. coli K1에 의한 내독소를 61% 감소시켰고 (도 6D), AST, ALT 및 BUN 수준을 각각 35%, 69% 및 45% 감소시켰다 (도 6E). 이를 통해, Ps-K18가 박테리아의 성장을 억제하고 박테리아 감염에 의해 손상된 간 및 신장 기능을 회복시킴으로써 패혈증을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 9. Ps-K18의 다형핵 림프구(Polymorphonuclear Lymphocyte) 폐 침윤(Infiltration) 억제 효과 확인

모세혈관-폐포 장벽 기능 장애(Capillary-alveolar barrier dysfunction)와 관련되어 폐혈증 동안 치사율 및 이환율을 높이는 다형핵 림프구(polymorphonuclear lymphocytes, PMNs)의 폐 침윤(infiltration)을 Ps-K18가 억제하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 7 및 8의 LPS로 유도된 내독소혈증 마우스 모델 및 E. coli K1-유도된 패혈증 마우스 모델에서 각각 폐 조직을 적출한 뒤 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하고 탈수시켜 파라핀 블록을 제작한 뒤, 이를 절단하여 조직 슬라이드를 제작하고 파라핀을 제거한 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 현미경 (Eclipse Ni; Nikon, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. 그 결과, 정상적인 폐 형태를 가진 대조군 마우스과 달리 LPS 또는 E. coli K1가 주사된 마우스에서는 폐의 형태적 변화와 PMN 침윤이 관찰되었다 (도 7A 내지 D). 그러나, PMN 침윤이 Ps-K18 투여에 의해 현저하게 억제되었으며, 폐 형태를 대조군과 유사한 정도로 개선시켰다 (도 7E 및 F). 이를 통해, Ps-K18가 생체 내 패혈증의 치료에 효과적임을 알 수 있다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION COMPRISING PSEUDIN-2 DERIVATIVE FOR PREVENTING OR TREATING SEPSIS OR ENDOTOXEMIA <130> 2020-I275 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ps-K18 <400> 1 Gly Leu Asn Ala Leu Lys Lys Val Phe Gln Gly Ile His Glu Ala Ile 1 5 10 15 Lys Lys Ile Asn Asn His Val Gln 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Pseudis paradoxa <400> 2 Gly Leu Asn Ala Leu Lys Lys Val Phe Gln Gly Ile His Glu Ala Ile 1 5 10 15 Lys Leu Ile Asn Asn His Val Gln 20

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps(pseudin-2) 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 Ps 펩타이드에 비해 진핵세포에 대한 세포독성이 감소된, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 그람-음성 박테리아에 대하여 항균활성을 가지는, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 MDR(multidrug-resistant) 그람-음성 박테리아에 대하여 항균활성을 가지는, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 생체 내 내독소를 제거하는, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 내독소에 의해 손상된 기관의 기능을 개선하는, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제 1항에 있어서, Ps 펩타이드 유도체는 TLR4 신호 전달을 억제하는, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 내독소혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Ps 펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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