CZ159298A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití peptidů s antimikrobiálním účinkem pro léčení nebo prevenci zánětů ústní sliznice. Předkládaný 5 vynález se zvláště týká použití protegrinových peptidů a jejich příbuzných peptidů k léčení zánětů ústní sliznice u živočichů včetně lidí.

Dosavadní stav techniky io Tato přihláška navazuje na US patentovou přihlášku No.

08/960,921 z 1. 8. 1996, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/649,811 ze 17. 5. 1996, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/562,346 z 22. 11. 1995, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/499,523 ze 7. 7. 1995, která navazuje na 15 US patentovou přihlášku No. 08/451,832 z 26. 5. 1995, která má prioritu z PCT/US94/08305 (WO 95/03325), a která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/243,879 ze 17. 5. 1994, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/182,483 z 13. 1. 1994, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/095,769 z 26. 7. 1993, 2o která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/093,926 z 20. 7.

1993. Je nárokován přínos vzhledem k US patentové přihlášce No. 08/960,921, 08/649,811 a 08/562,346.

Záněty ústní sliznice představují významný vedlejší účinek léčení rakoviny a transplantace kostní dřeně, který není dosud 25 zvládnut na potřebné úrovni obvyklými postupy (Sonis, 1993a, „Oral Complications“, v: Cancer Medicine. str. 2381 - 2388, Holland a další, red., Lea and Febiger, Philadelphia; Sonis, 1993b, „Oral Complications in Cancer Therapy“, v: Principles and Practice of • · • · · · · · · · · · • ··· · · · · · ·· • ··· ·· · · · · · · • · ··· ··· ··· ··· ·· · ·· ··

- 2 Oncology, str. 2385 - 2394, DeVitta a další, red., J. B. Lippincott, Philadelphia). Záněty ústní sliznice se nacházejí u téměř 100 % pacientů s chemoterapií a radioterapií pro tumory hlavy a krku a u přibližně 90 % dětí s leukémií. Přibližně 40 % pacientů 5 s chemoterapií z důvodů jiných tumorů trpí problémy v ústní dutině při každém styku s chemoterapeutickým prostředkem (Sonis, 1993b, výše). Navíc se záněty ústní sliznice vyvíjejí přibližně u 75 % pacientů po transplantaci kostní dřeně, jak autologní tak i allogenní (Woo a další, 1993, Cancer 72 1612 - 1617). V současnosti se odhaduje, že io pouze ve spojených státech trpí záněty ústní sliznice ročně přibližně

400 tisíc pacientů (Graham a další, 1993, Cancer Nursinq 16: 117 122). Za předpokladu, že pacienti jsou často léčeni chemoterapeuticky a/nebo radioterapeuticky ve více cyklech, odhaduje se ročně ve Spojených státech výskyt přibližně 1 milionu zánětů ústní sliznice.

Výskyt zánětů ústní sliznice kolísá v závislosti na typu tumoru, věku pacienta a zdravotním stavu ústní dutiny. Způsoby terapie používané při těchto různých tumorech jsou také důležitým faktorem spolu se způsoby léčení velmi agresivními chemoterapeutickými látkami používanými při transplantaci kostní dřeně a přispívají 20 k vysokému výskytu zánětů ústní sliznice. U mladších pacientů je pozorován vyšší výskyt, který může být způsoben jejich rychlejší obměnou epiteliálních buněk a tím větší vnímavostí k cytotoxickým léčivům (Sonis, 1993a, výše).

Výskyt je také spojen s výběrem chemoterapeutického 25 prostředku, přičemž léčiva jako karmustin (BCNU), chlorambucil (Leukeran), cisplatina (Platinol), Cytarabine, doxorubicin (Adriamycin), fluorouracil (5-FU), methoxetrát (Mexate) a plicamycin (Mithracin) jsou známa pro svůj přímý stomatotoxický potenciál (Sonis, 1993b, výše) a tím výskyt zánětů ústní sliznice. Se stoupajícím výskytem zánětů 3o ústní sliznice je také spojeno stoupající využití agresivních infuzních postupů.

• · · ·

• · · · · · · • · · · · · · • · · · ···· · • · · · · · • · · · · · ·

Zánět ústní sliznice je iniciován cytotoxickými účinky chemoterapie a/nebo radioterapie na rychle se dělící epiteliální buňky sliznice úst a hltanu a je zhoršován infekcí jak endogenní ústní flórou, tak i příležitostnými bakteriálními a houbovými patogeny. Komplikace 5 spojené se záněty ústní sliznice se liší v závislosti na různých postižených populacích pacientů, ale patří mezi ně bolest, špatný příjem potravy ústy s následnou dehydratací a úbytkem hmotnosti a systémové infekce organismu vycházející z ústní dutiny (Sonis, 1993b, výše). Bolest spojená se záněty ústní sliznice může být tak 10 vážná, že vyžaduje narkotická analgetika a nesnadné přijímání potravy může vést u pacientů k nutnosti celkové parenterální výživy. Poškozený epitel ústní dutiny a poruchy imunologických odpovědí nalezené často u těchto pacientů poskytují snadnou cestu pro vstup organismů z úst do systémového oběhu. Největší znepokojení 15 způsobuje možnost sepse a proto se podávají injekčním způsobem antibiotika, jestliže se pozorují známky systémové infekce. Z důvodů těchto komplikací může být zánět ústní dutiny činitel omezující dávku díky toxicitě radiačního nebo chemoterapeutického ošetření, což vede k nedostatečnému léčení rakoviny.

S omezeným úspěchem byla testována řada postupů pro léčení zánětů ústní sliznice a s nimi spojenými infekcemi ústní dutiny. Udává se například, že ke zlepšení zánětů ústní sliznice vedly v předběžných studiích výplachy úst allopurinolem, podávání kaše sukralfátu a pentoxifylin. V následujících náhodných a kontrolovaných studiích 25 se však nepodařilo prospěšný účinek léčení těmito prostředky prokázat (Loprinzi a další, 1995, Sem. Oncol. 22 Supple. 3): 95 - 97; Epstein & Wong, 1994, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 28: 693 - 698; Verdi a další, 1995, Oral Surq. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endoc. 80: 36 - 42).

3o Další způsoby léčení se zaměřovaly na snížení množství ústní flóry a míry infekce ústních ulcerací. Bylo ukázáno, že systémové

ošetření G- a GM-CSF vede ke sníženému výskytu zánětů ústní sliznice, pravděpodobně umožněním rychlejšího zotavení neutrofilů a tím zlepšené schopnosti potlačovat infekci, ačkoliv byl rovněž vysloven předpoklad, že CSF mohou mít také přímější účinek na ústní 5 sliznici (Chi a další, 1995, J. Clin. Oncol. 13: 2620 - 2628). V jedné studii bylo zjištěno, že GM-CSF může vyvolat nové vzplanutí zánětu ústní sliznice (Cartee a další, 1994, Cytokine 7: 471 - 477). U pacientů s radiační terapií a také u pacientů s nitrožilní terapií byl studován benzydamin hydrochlorid, nesteroidní léčivo s analgetickými a io antimikrobiálními vlastnostmi (Epstein a další, 1986, Oral Suro, Oral

Med. Oral Pathol. 62: 145 - 148; Epstein a další, 1989, Int. J. Radiation Oncoloqy Biol. Phys. 16: 1571 - 1575).

Pro léčení a prevenci zánětu ústní dutiny byl také intenzívně používán antimikrobiální prostředek chlorhexidin ve formě výplachů 15 úst (Ferretti a další, 1990, Bone Marrow Transplan. 3: 483 - 493; Weisdorf a další, 1989, Bone Marrow Transplan. 4: 89 - 95). Uvádí se však, že účinnost chlorhexidinu je podstatně snižována slinami a tak je tato sloučenina relativně neúčinná proti gramnegativním bakteriím, které mají sklony k osídlení ústní dutiny u pacientů s radiační terapií 2o (Spijkervet a další, 1990, Oral Surq. Oral Med. Oral Pathol. 69: 444 449). Navíc se alespoň v jedné studii ukázalo, že použití chlorhexidinu může být škodlivé a vede k vyššímu výskytu zánětů ústní sliznice (Foote a další, 1994, J. Clin. Oncol. 12: 2630 - 2633). V několika studiích se ukázalo, že snížení výskytu zánětu ústní sliznice a sepse 25 způsobené alfa hemolytickými streptokoky bylo dosaženo použitím pasty vankomycinu a antibiotických pastilek obsahujících polymyxin B, tobramycin a amfotericin B (Barker a další, 1995, J. Ped, Hem. Oncol. 17: 151 - 155; Spijkervet a další, 1991, v: Irradiation Mucositis, Munksgaard Press, str. 43 - 50). Přes zřejmou potřebu terapeutických 3o prostředků pro léčbu zánětů ústní sliznice nejsou v současnosti schváleny pro tuto indikaci žádná léčiva. Výsledkem je, že neexistuje žádné standardní ošetření tohoto onemocnění.

• · ·

• · -β-···

Místní podávání prostředků použitých pro léčení onemocnění ústní dutiny jako je zánět ústní sliznice představuje samo o sobě problém. Například v důsledku slinění a/nebo přijímání potravy nebo kapalin je často extrémně obtížné zachovat dostatečnou adhezi ke 5 sliznici ústní dutiny a dobu zdržení v ústech pro dosažení účinnosti prostředku. Místní podávání peptidů je ještě problematičtější, protože peptidy musí být stabilní vůči proteolytickým enzymům přítomným ve slinách. Další nesnáze spojené s místním ústním podáním léčiv představuje odbarvení zubů a vyhovování pacientům. Orální 10 prostředky, které by poskytovaly dobrou adhezi ke sliznici ústní dutiny, měly přijatelnou dobu zdržení v ústech a současně ve velké míře vyhovovaly pacientovi, nejsou snadno dostupné.

Proto jsou vysoce žádoucí prostředky a způsoby pro léčení zánětů ústní sliznice, které mají široké spektrum antimikrobiálního 15 prostředku, dobrou stabilitu, adhezi ke sliznici a dobu zdržení v ústech, a které ve velké míře vyhovují pacientovi; tyto prostředky jsou právě předmětem předkládaného vynálezu.

Podstata vynálezu

2o V předkládaném vynálezu jsou poskytovány tyto a další předměty, které se v jednom hledisku týkají způsobu léčení a/nebo prevence zánětů ústní sliznice antimikrobiálními peptidy. Způsoby obvykle zahrnují podávání živočichu při potřebě léčby takového množství antimikrobiálního peptidů, které je účinné pro léčení nebo 25 prevenci zánětu ústní dutiny. Obecně jsou antimikrobiální peptidy použitelné při provedení způsobů podle vynálezu protegrinové peptidy a/nebo jim příbuzné látky. Může však být stejně použito další široké spektrum antimikrobiálních peptidů jako jsou magaininy, dermaseptiny, peptidy PGLa nebo XPF, adrenoreguliny, protein a peptidy BPI, ceruleiny, perforiny, hmyzí defensiny nebo sapeciny, • · králičí nebo lidské kationtové antimikrobiální peptidy (CAP-18), prasečí myeloidní antibakteriální peptidy (PMAP), aibelliny, aceriny, breveniny, eskulentiny, laktoferiny, hybridy cekropin-mellitin (peptidy

CEMA), bombeniny, tachyplesiny, polyfemusiny a defensiny.

V jednom ilustrativním provedení vynálezu jsou protegrinové peptidy použitelné pro léčení nebo prevenci zánětu ústní dutiny peptidy vzorce:

(I) XlX2X3^-X4“X5^-C6X7^-C8^-X9Xl0“Xl1Xl2^_Cl3“Xl4-Cl5-Xl6“Xl7^-Xl8 nebo jejich farmaceutické soli, kde:

každá z aminokyselin C₈ a C₁₃ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, je každá nezávisle cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

každá z aminokyselin C₆ a C15 je nezávisle cysteinu podobná, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní aminokyselina;

každá z aminokyselin Xt - X₅ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna, každá je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

každá z aminokyselin X₇ a X₁₄ je nezávisle hydrofobní nebo malá aminokyselina;

každá z aminokyselin X₉ a X₁₂ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna;

aminokyseliny X₉ - Χ_Ί2 brány společně jsou schopny, jestliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) vytvořit reverzní otáčku, a alespoň jedna z aminokyselin X₉ - X₁₂ musí být bazická 25 aminokyselina;

každá z aminokyselin X₁₆ - X₁₈ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna každá je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

• · a kde alespoň přibližně 15 až přibližně 50 % aminokyselin tvořících uvedený antimikrobiální peptid jsou bazické aminokyseliny, takže uvedený antimikrobiální peptid má čistý celkový náboj při fyziologickém pH alespoň + 1.

Předpokládá se také použití na N-konci acylovaných a/nebo na C-konci amidovaných nebo esterifikovaných forem peptidu vzorce (I), stejně jako přímých nebo disulfidickými můstky přemostěných forem.

V dalším hledisku je předkládaný vynález zaměřen na farmaceutický prostředek vhodný pro místní aplikaci antimikrobiálních prostředků do ústní dutiny živočichů včetně člověka. Farmaceutický prostředek podle vynálezu obecně obsahuje antimikrobiální sloučeninu ve směsi s gelovitým nosičem. Gelovitý nosič obvykle obsahuje směs ve vodě rozpustných gelujících prostředků a smáčedlo a může popřípadě obsahovat další složky jako jsou sladidla, ochranné látky apod. Gelovitý prostředek poskytuje vynikající adhezi ke sliznici a dobu zdržení v ústech a má výhodné zvlhčující a chuťové vlastnosti a tím ve velké míře vyhovuje pacientům. Gelový prostředek je zvláště vhodný pro použití v rámci zde popisovaných způsobů.

Předkládaný vynález se tedy týká prostředků a způsobů léčení nebo prevence zánětů ústní dutiny u živočichů včetně lidí. Jak již bylo uvedeno, záněty ústní dutiny se vytvářejí u velké části pacientů s rakovinou a transplantací kostní dřeně léčených chemoterapeuticky a/nebo radioterapeuticky.

Komplikace spojené se zánětem ústní sliznice se u různých populací postižených pacientů liší, ale patří mezi ně bolest, špatný příjem potravy ústy s následnou dehydratací a úbytkem hmotnosti a systémové infekce organismy pocházejícími z ústní dutiny (Sonis, 1993b). Bolest spojená se zánětem ústní dutiny může být tak vážná, že vyžaduje narkotická analgetika a nesnáze při přijímání potravy vedou u pacientů k celkové parenterální výživě. Poškozený ústní epitel a špatně fungující imunologická odpověď, které se často • «··· ·· ···· ·· ·· •· · ·· · ···· • ··· · · · · · ·· • ··· · · · ·«·· · • · · · · ··* £·....... ·· ·· vyskytují u těchto pacientů, poskytují připravenou cestu pro vstup organismů z úst do systémového oběhu. Zejména je třeba obávat se možnosti sepse, a proto se podávají injekčně antibiotika, pokud se pozorují známky systémové infekce. V důsledku těchto komplikací může být toxicita při radiační terapii nebo chemoterapii způsobující zánět ústní dutiny činitelem omezujícím dávku a tím vedoucím k nedostatečné terapii rakoviny.

Ústní dutina je osídlena řadou organismů včetně a a nehemolytických streptokoků skupiny D, rodem Corynebacteríum, stafylokoky, laktobacily, rodem Neisseria, Branhamella catarrhalis, Hemophilus parainfluenzae, Hemophilus influenzae, rodem Acinetobacter, rodem Mycoplasma a spirochetami. Byly také zjištěny anaerobní organismy. V normální mikroflóře úst byly také identifikovány důležité potenciální patogeny, jako S. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, N. meningitidis a Próteus mirabilis (Loesche, 1994, Ecology of the Oral Flora“, v: Oral Microbioloqy and Immunoloqy, R. J. Nisengard a M. G. Newman, red., W. B. Saunders Co., Philadelphia, str. 307 - 315). U pacientů s rakovinou bylo pozorováno, že mají v ústní dutině zvýšený počet mikroorganismů, pravděpodobně v důsledku zhoršené ústní hygieny a suchosti ústní sliznice. Ukázalo se také, že tito pacienti mají posun orální flóry od převážně grampozitivních organismů k převážně gramnegativním organismům (Sonis, 1993, „Oral Complications“, v: Cancer Medicine, 3. vydání, J. L. Holland a další, red., Lea and Febiger, Philadelphia, str. 2381 - 2388; Spijkervet a další, 1991, „Effect od Selective Elimination of the Oral Flora on Mucositis in Irradiated Head and Neck Cancer Patients“, J, Surq. Oncol. 46: 167 173). Všechny tyto organismy stejně jako viry a houby se mohou zánětu ústní sliznice účastnit.

Prostředky použitelné pro léčení zánětu ústní sliznice musí tedy vykazovat široké spektrum antimikrobiálního účinku, zvláště proti • · · · · · ···· · · · · · · ♦ • · · · · · · · · · · · • ···· · · · •φ «··· · · · ·« ·· gramnegativním mikroorganismům (Sonis, 1993, „Oral Complications of Cancer Therapy“, v: Principles and Practice of Oncology, V. DeVitta a další, red., J. B. Lippincott, Philadelphia). Další výhodné vlastnosti prostředků pro léčení zánětu ústní sliznice je rychlá kinetika usmrcování mikroorganismů a nízká frekvence mikrobiální rezistence.

Uznávanou třídou v přírodě se vyskytujících antimikrobiálních peptidů, které vykazují široké spektrum antimikrobiálniho účinku proti grampozitivním a gramnegativním bateriím, kvasinkám, houbám a některým virům jsou protegrinové peptidy (přehled vlastností protegrinových peptidů je možno nalézt v: US patent No. 5,464,823 a WO 95/03325 a tam uvedené reference). Dosud bylo identifikováno pět rozdílných v přírodě se vyskytujících protegrinových peptidů, označovaných PG-1 až PG-5, které mají následující sekvence aminokyselin:

(PG-1) RGGRLCYCRRRFCVCVGR (PG-2) RGGRCLYCRRRFCICV (PG-3) RGGGLCYCRRRFCVCVGR (PG-4) RGGRLCYCRGEICFCVGR (PG-5) RGGLCYCRPRFCVCVGR

Protegriny PG-1 až PG-5 jsou amidovány na C-konci a mají dvě disulfidové vazby; jednu mezi C₆ a C₁₅ a další mezi C₈ a C₁₃.

V poslední době byla navržena celá řada peptidů příbuzných protegrinům (viz US patentové přihlášky No. 08/451,832, 08/499,523, 08/562,346, 08/649,811 a 08/960,921). Tyto protegriny vykazují podobně jako v přírodě se vyskytující protegriny široké spektrum antimikrobiální účinnosti.

Zcela neočekávaně bylo zjištěno, že antimikrobiální peptidy, jako jsou protegrinové peptidy, jsou schopny vykazovat široké spektrum antimikrobiálniho účinku proti normální ústní flóře živočichů, • · · · • · · · · · · · ·· • 999 9 9 9 9 999

999 99 9 99 9 99

9 9 9 9 9 99

-ΎΟ·-·........

stejně jako proti příležitostným patogenům spojeným se záněty ústní sliznice. Důležité je, že tento antimikrobiální účinek se uskutečňuje v přirozeném prostředí ústní dutiny, zvláště ve slinách. Navíc bylo neočekávaně zjištěno, že léčení protegriny může zabránit nástupu 5 zánětu ústní sliznice. Na základě těchto překvapujících objevů se předpokládalo, že by mohly být tyto peptidy účinné pro léčení nebo prevenci infekcí ústní dutiny, jako jsou záněty ústní sliznice.

Léčení zánětů ústní sliznice protegriny, a zvláště prostředky podle vynálezu, poskytuje před jinými způsoby léčení celou řadu io výhod. Protegriny mají antimikrobiální účinek proti patogenům a příležitostným infekcím spojeným se zánětem ústní dutiny, zvláště proti gramnegativním bakteriím pozorovaným u pacientů s rakovinou. Narozdíl od vankomycinu a jiných antibiotik usmrcují protegriny orální patogeny v době několika minut na rozdíl od několika hodin 15 u antibiotik, čímž jsou ideálně vhodné pro místní použití v ústech, kde je nesnadné dosáhnout dlouhé doby zdržení nutné pro dosažení účinku jiných způsobů léčení.

Prostředky podle vynálezu rovněž poskytují velkou řadu výhod. Prostředky mají vynikající adhezi k ústní sliznici, což dovoluje dlouhou 2o dobu přetrvání aktivní složky ve styku se sliznici. Navíc v důsledku použití smáčedla působí tyto prostředky zvlhčujícím účinkem na sliznici, takže lépe vyhovují pacientům. Smáčedlo působí rovněž jako bariéra pro vodu, což zabraňuje omytí léčebného prostředku slinami nebo jinými tekutinami. Nosič má rovněž příjemnou chuť, což je 25 důležitým faktorem pro dosažení dobrého přijímání pacienty.

Sloučeniny

Antimikrobiální peptidy použité pro léčení nebo prevenci zánětu ústní sliznice podle vynálezu zahrnují ve skutečnosti jakékoliv široké 3o spektrum antimikrobiálních peptidů, které účinkuje proti patogenům spojeným s ústní sliznici v prostředí ústní dutiny léčeného pacienta.

9 9 99 9

99 9

99

999

99 9

9 9 99

9 999

9 99999

9 99

9 999

Tyto antimikrobiální peptidy bez omezení zahrnují kationtové amfipatické peptidy jako jsou dermaseptiny nebo jejich deriváty nebo analogy (Mor a další, 1991, Biochemistry 30: 8824; Mor a další, 1991, Biochemistry 33: 6642; Mor a další, 1994, Eur. J. Biochem. 219: 145);

magaininové peptidy nebo jejich deriváty nebo analogy (Zasloff, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5449); peptidy PGLa nebo XPF nebo jejich deriváty nebo analogy (Hoffman a další, 1983, EMBO J. 2: 711; Andreu a další, 1985, Biochem. J. 149: 531; Gibson a další, 1986, J. Biol. Chem. 261: 5341; Giovannini a další, 1987, Biochem. J. 243:

io 113); CPF peptidy (Richter a další, 1986, J. Biol. Chem. 261: 3676; US patent No. 5,073,542); adrenoreguliny nebo jejich deriváty nebo analogy (Donly a další, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10960; Amiche a další, 1993, Biochem, Biophys. Res. Commun. 191: 983); perforiny nebo jejich deriváty nebo analogy (Henkart a další, 1984, 1

Exp. Med. 160: 695); caerulein nebo jeho deriváty nebo analogy (Richter a další, 1988, J. Biol. Chem. 261: 3676 - 3680; a Gibson a další, 1986, J. Biol. Chem. 261: 5341 - 5349); permeabilitu bakterií zvyšující protein Bacterial/Permeability-lncreasing Protein (BPI) nebo jeho peptidové deriváty nebo analogy (Ooi a další, 1987, J, Biol.

Chem, 262: 14891 - 14898; Qi a další, 1994, Biochem. J. 298: 771 718; Gray a Haseman, 1994, Infection and Immunitv 62: 2732 - 2739;

Little a další, 1994, J. Biol. Chem. 269: 1865 - 1872; a US patent No. 5,348,942); hmyzí defensiny (nazývané také sapeciny) nebo jejich analogy nebo deriváty (Alvarez-Bravo a další, 1994, Biochem. J. 302:

535 - 538; Yamada a Natori, 1994, Biochem. J, 298: 623 - 628; Kum a další, 1994, FEBS Letters 342: 189 - 192; Shimoda a další, 1994, FEBS Letters 339: 59 - 62; Yamada a Natori, 1993, Biochem, J. 291: 275 - 279; Homma a další, 1992, Biochem. J, 288: 281 - 284; Hanzawa a další, 1990, FEBS Letters 269: 413 - 420; Kuzuhara a

3o další, 1990, Biochem, J, 107: 514 - 518; Matsuyama a Natori, 1990, Biochem J, 108: 128 - 132; US patent No. 5,107,486; evropský patent No. 303,859; evropský patent No. 280,859; US patent No. 5,008,371;

·· ·· • · · · · • · · · · • · 9999· •· · · • · ·· r

US patent No. 5,106,735; a US patent No. 5,118,789); králičí nebo lidský FALL-39/Cap-18 (Cationic Antimicrobial Protein) nebo jejich analogy nebo deriváty (PCT přihláška WO 94/02589 a tam uvedené odkazy; Agerberth a další, 1995, Proč. Nati. Acad. Sci USA 92: 195 199; Larrick a další, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 170

- 175; Hirata a další, 1990, Endotoxin: Advances in Experimental Medicine and Biology (Herman Friedman, T. W. Klein, Masayasu Nakano, a Alois Nowotny, red.); Tossi a další, 1994, FEBS Letters 339: 108 - 112; Larrick a další, 1994, J, Immunol. 152: 231 - 249; Hirata a další, 1994, Infection and Immunitv 62: 1421 - 1426; a Larrick a další, 1993, Antimicrobial Aqents and Chemotherapy 37: 2534 2539; PMAP (Porcine Myeloid Antibacterial Peptide) nebo jeho analogy nebo deriváty (Zanetti a další, 1994, J. Biol, Chem. 269: 7855

- 7858; Storici a další, 1994, FEBS Letters 37: 303 - 307; a Tossi a další, 1995, Eur. J. Biochem. 228: 941 - 948); aibellin nebo jeho analogy nebo deriváty (Hino a další, 1994, J. Dairy Sci, 77: 3426 3461; Kumazawa a další, 1994, J. Antibiot. 47: 1136 - 1144; a Hino a další, 1993, J. Dairy Sci, 76: 2213 - 2221); caerin nebo jeho analogy nebo deriváty (Stone a další, 1992, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1_: 3173 - 3178; a PCT WO 92/13881, zveřejněná 20. 8. 1992); bombinin nebo jeho analogy nebo deriváty (Simmaco a další, 1991, Eur. J. Biochem. 199: 217 - 222 a Gibson a další, 1991, J, Biol. Chem. 266: 23103 - 23111); brevenin nebo jeho analogy nebo deriváty (Morikawa a další, 1992, Biochem. Biophys. Res, Commun. 189: 184 - 190; a japonská patentová přihláška No. 6,080,695A); esculetin nebo jeho analogy nebo deriváty (Simmaco a další, 1993, FEBS letters 324: 159

- 161; a Simmaco a další, 1994, J. Biol, Chem. 269: 11956 - 11961); lactoferrin nebo jeho analogy nebo deriváty (US patent No. 5, 317,084; US patent No. 5,304,633; evropská patentová přihláška No. 519,726 A2; evropská patentová přihláška No. 503,939 A1; PCT přihláška WO 93/22348, zveřejněná 11. 11. 1993; PCT přihláška WO 90/13642; a Tomita a další, v: Lactoferrin Structure and Function, ···· • ···· ·· · · · • ··· · · · ♦ · · • · · · ·· ··

•	• ·	•	•
•	• ·		• ·
•	• ···	•		•
•	•	•		•
•			·*

Hutchens, T. W. a další, red., Plenům Pres, NY, 1994, str. 209 - 218); CEMA peptidy nebo jejich analogy nebo deriváty (PCT přihláška WO 94/04688, publikovaná 3. 3. 1994); tachyplesiny a analogy tachyplesinů, jako jsou polyphemusiny (Nakamura a další, 1°988, J. Biol. Chem. 263: 16709 - 16713; Miyata a další, 1989, J.Biochem. 106: 663 - 668), defensiny (Lehrer a další, 1991, Cell 64: 229 - 230; Lehrer a další, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 105 - 128; US patent No. 4,705,777; US patent No. 4,659,692; US patent No. 4,543,252); βdefensiny (Selsted a další, 1993, J, Biol. Chem. 288: 6641 - 6648; Diamond a další, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3952 - 3958) a protegriny (Kokryakov a další, 1993, FEBS 337: 231 - 236; Zhao a další, 1994, FEBS Letters 346: 285 - 288; Migorodskaya a další, 1993, FEBS 330: 339 - 342; Storici a další, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun 196: 1363 - 1367; Zhao a další, 1994, FEBS Lett. 346: 285 288; Manzoni a další, 1996, FEBS Lett. 383: 93 - 98; US patent No. 5,464,823).

Zvláště výhodné peptidy jsou protegrinové peptidy, jako peptidy popisované v US patent No. 5,464,823, WO 95/03325, a US patentové přihlášce No. 08/451,832, 08/499,523, 08/562,346,

08/649,811 a 08/960,921. Peptidy vhodné pro použití v předkládaném vynálezu jsou buď odborníkům v oboru známé, nebo mohou být snadno identifikovány pomocí testů, které se běžně v oboru používají, jako jsou testy uváděné v příkladech. Obecně budou mít antimikrobiálni peptidy použitelné v rámci vynálezu minimální inhibiční koncentrace (MIC) proti grampozitivním a gremnegativním bakteriím menší než přibližně 128 pg/ml, s výhodou menší než přibližně 64 pg/ml a nejvýhodněji menší než přibližně 32 pg/ml, měřeno s použitím testů uváděných v příkladech. Alternativně nebo navíc budou vykazovat použitelné peptidy snížení počtu životaschopných mikroorganismů (colony forming units, CFU) ve slinách po 15 min při koncentraci peptidů přibližně 0,001 % hmotnostních do 5 % hmotnostních alespoň o dva řády.

V jednom ilustrativním provedení vynálezu jsou protegrinové peptidy použitelné pro léčení nebo prevenci zánětů ústní sliznice peptidy vzorce:

(I) • · · · • · · ·

Xl -X2X3X4X5^_C6^-X7^-C8^-X9Xl 0Xl 1 Xl2^_C 13Xl 4C 15-X1 6^-Xl 7“Xl 8 a jejich definované modifikované formy.

Označení X_n ve všech případech představuje aminokyselinu ve specifikované poloze v peptidů. Podobně označení C_n představuje aminokyselinu v určité poloze a dále představuje ty polohy peptidů vzorce (I), které mohou popřípadě obsahovat zbytky aminokyselin io schopné vytvářet disulfidické můstky.

Zbytky aminokyselin označené X_n nebo C_n mohou být geneticky kódované L-aminokyseliny, v přírodě se vyskytující L-aminokyseliny, které nejsou geneticky kódovány, syntetické L-aminokyseliny nebo Denantiomery všech výše uvedených typů. V následující tabulce je 15 uvedeno označení aminokyselin používané v předkládané přihlášce pro dvacet geneticky kódovaných L-aminokyselin a běžné nekódované aminokyseliny:

Aminokyselina	Jednopísmenový symbol	Běžná zkratka
Alanin	A	Ala
Arginin	R	Arg
Asparagin	N	Asn
Kyselina asparagová	D	Asp
Cystein	C	Cys
Glutamin	Q	Gin
Kyselina glutamová	E	Glu
Glycin	G	Gly

• · · · • · • 9

Histidin	H	His
Izoleucin	1	Ile
Leucin	L	Leu
Lyzin	K	Lys
Methionin	M	Met
Fenylalanin	F	Phe
Prolin	P	Pro
Serin	S	Ser
Threonin	T	Thr
Tryptofan	W	Trp
Tyrozin	Y	Tyr
Valin	V	Val
Ornithin	0	Orn
β-alanin		bAla
Kyselina 2,3-diaminopropionová		Dpr
Kyselina a-aminoizomáselná		Aib
N-methylglycin (sarkosin)		MeGly
Citrulin		Cit
t-butylalanin		t-BuA
t-butylglycin		t-BuG
N-methylizoleucin		Melle
Fenylglycin		Phg
Cyklohexylalanin		Cha
Norleucin		Nle

• · · · · • · · · • ·

1-naftylalanin		1-Nal
2-naftylalanin		2-Nal
4-chlorfenylalanin		Phe(4-CI)
2-fluorofenylalanin		Phe(2-F)
3-fluorfenylalanin		Phe(3-F)
4-fluorfenylalanin		Phe(4-F)
Penicilamin		Pen
Kyselina 1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-kyrboaxylová		Tic
β-2-thienylalanin		Thi
Methioninsulfoxid		Mso
Homoarginin		Har
N-acetyllyzin		AcLys
Kyselina 2,4-diaminomáselná		Dbu
p-aminofenylalanin		Phe(pNH2)
N-methylvalin		MeVal
Homocystein		hCys
Homoserin		hSer
Kyselina ε-aminohexanová		Aha
Kyselina δ-aminovalerová		Ava
Kyselina 2,3-diaminomáselná		Dba

Ilustrativní sloučeniny použitelné v předkládaném vynálezu jsou peptidy, které jsou částečně definovány prostřednictvím zbytků • · • «··· ·· · · · ·· · ♦ · · · · ···· ···· · · *· · • · φ · ·· · · · · ·· • 9 9 9 9 9 99 ······ 9· 9 ····

-17aminokyselin označených tříd. Zbytky aminokyselin mohou být obecně dále tříděny do hlavních podtříd jak je uvedeno dále:

Kyselé: Zbytek má negativní náboj v důsledku ztráty iontu H⁺ při fyziologickém pH a je přitahován vodným roztokem, takže vyhledává ve vodném médiu při fyziologickém pH v konformaci peptidu, ve kterém je obsažen, polohy na povrchu.

Bazické: Zbytek má pozitivní náboj v důsledku spojování s iontem H⁺ při fyziologickém pH a je přitahován vodným roztokem, takže vyhledává ve vodném médiu při fyziologickém pH v konformaci peptidu, ve kterém je obsažen, polohy na povrchu.

Hydrofobní: Zbytky nejsou při fyziologickém pH nabity a jsou vodným roztokem odpuzovány, a jestliže je peptid ve vodném prostředí, vyhledávají zbytky vnitřní polohy v konformaci peptidu, ve které jsou obsaženy.

Polární/velké: Zbytky nejsou při fyziologickém pH nabity, ale zbytek není vodnými roztoky dostatečně odpuzován, aby nutně vyhledával vnitřní polohu v konformaci peptidu, ve které je obsažen, jestliže je peptid ve vodném médiu. V závislosti na podmínkách a zbývajících aminokyselinách v sekvenci se může zbytek vyskytovat buď ve vnitřním prostoru nebo na povrchu proteinu.

Podobné cysteinu: Zbytky obsahující postranní řetězec schopný vytvářen disulfidickou vazbu. Cysteinu podobné aminokyseliny (aminokyseliny cysteinového typu) tedy obecně mají postranní řetězec obsahující alespoň jednu thiolovou skupinu (SH), jako je cystein, homocystein, penicilamin apod.

Malé: Některé neutrální aminokyseliny, které nemají dostatečně velké postranní řetězce, aby bylo dosaženo hydrofobičnosti, i když neobsahují polární skupiny. „Malé“ aminokyseliny jsou takové aminokyseliny, které mají čtyři atomy uhlíku nebo méně jestliže je na postranním řetězce alespoň jedna polární skupina a tři atomy uhlíku • ···· ·· ···· ·· ·· ··· · · · · · · · • · · · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · • · · · · ··· ······ ·· · · · ♦ ·

- 18nebo méně, jestliže na postranním řetězci polární skupina není přítomna.

Geneticky kódovaná sekundární aminokyselina prolin (stejně jako prolinu podobné aminokyseliny jako je 3-hydroxyprolin a 45 hydroxyprolin) je zvláštním případem v důsledku jeho známých účinků na sekundární konformaci peptidových řetězců, a není tedy ve skupině zahrnut.

Samozřejmě se rozumí, že ve statistickém souboru jednotlivých molekul zbytků budou některé molekuly nabité a jiné ne, a bude se tak io ve větší nebo menší míře vyskytovat přitahování nebo odpuzování vzhledem k vodnému prostředí. Pro splnění definice „nabitý“ je nabito při fyziologickém pH významné procento (alespoň přibližně 25 %) jednotlivých molekul. Stupeň přitahování nebo odpuzování požadovaný pro klasifikaci na polární nebo nepolární je arbitrární, a 15 proto aminokyseliny specificky uvažované ve vynálezu, byly tříděny do jedné nebo druhé skupiny. Většina aminokyselin, které nebyly specificky uvedeny může být tříděna na základě jejich známého chování.

Zbytky aminokyselin mohou být dále tříděny jako cyklické nebo 2o necyklické a aromatické nebo nearomatické, přičemž toto tříděni s ohledem na substituenty postranních řetězců zbytků není třeba dále vysvětlovat.

Některé běžné aminokyseliny, které nejsou geneticky kódovány a ze kterých mohou být složeny peptidy podle vynálezu bez omezení 25 zahrnují β-alanin (b-Ala) a další omega-aminokyseliny, jako kyselina 3-aminopropionová, kyselina 2,3-diaminopropionová (Dpr), kyselina 4diaminomáselná apod.; kyselina α-aminoizomáselná (Aib); kyselina εaminohexanová (Aha); kyselina δ-aminovalerová (Ava); Nmethylglycin nebo sarkosin (MeGly); ornithin (Orn); citrulin (Cit); t3o butylalanin (t-BuA); t-butylglycin (t-BuG); N-methylizoleucin (Melle); fenylglycin (Phg); cyklohexylalanin (Cha); norleucin (Nle); 1• · · · · · · ·· · «··· · · · · · · · • · · · · · · ···· · • · · · · · · · ······ ·· · ·· ♦ ·

- 19naftylalanin (1-Nal); 2-naftylalanin (2-Nal); 4-chlorfenylalanin (Phe(4Cl); 2-fluorfenylalanin (Phe(2-F); 3-fluorfenylalanin (Phe(3-F); 4fluorfenylalanin (Phe(4-F); penicilamin (Pen); kyselina 1,2,3,4tetrahydroizochinolin-3-karboxylová (Tic); β-2-thienylalanin (Thi);

methioninsulfoxid (MSO); homoarginin (Har); N-acetyllyzin (AcLys); kyselina 2,3-diaminomáselná (Dab); kyselina 2,4-diaminomáselná (Dbu); p-aminofenylalanin (Phe(pNH₂); N-methylvalin (MeVal); homocystein (hCys) a homoserin (hSer). Tyto aminokyseliny je možno rovněž pohodlně zatřídit do výše uvedených kategorií.

io Třídění výše popisovaných geneticky kódovaných i geneticky nekódovaných aminokyselin jsou shrnuta v tabulce 1 níže. Je třeba rozumět, že tabulka 1 slouží pouze pro ilustrativní účely a nemá být vyčerpávajícím seznamem zbytků aminokyselin, které mohou peptidy pro ilustraci popsané dále obsahovat.

Tabulka 1

Třídění aminokyselin

Třída	Geneticky kódované	Geneticky nekódované
Hydrofobni	Y, V, I, L, M, F, W	Phg, 1-Nal, 2-Nal, Thi, Tic, Phe(4-CI), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), t-BuA, t-BuG, Melle, Nle, MeVal, Cha
Kyselá	D, E
Bazická	Η, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), Dbu, Dab
Polární/velká	Q, N	Cit,m AcLys, MSO
Malá	G, S, A, T	bAla, MeGly, Aib, hSer
Typu cysteinu	C	Pen, hCys

-20V peptidech vzorce I symbol mezi zbytky aminokyselin X_n a/nebo C_n obvykle označuje vazbu na kostře. Symbol tedy obvykle označuje amidovou vazbu (-C(O)-NH-). Je však třeba rozumět, že 5 v řadě peptidů použitelných v předkládaném vynálezu může být jedna nebo více amidových vazeb popřípadě nahrazena vazbou jinou než amidovou. Tyto vazby zahrnují bez omezení -CH₂NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis a trans), -C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂ a -CH₂SO-.

Peptidy s těmito vazbami a způsoby výroby těchto peptidů jsou 10 v oboru dobře známy (viz např. Spatola, 1983, Vega Data 1(3) (přehledný článek); Spatola, 1983, „Peptide Backbone Modifications“ v: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Weinstein, vyd.), Marcel Dekker, New York, str. 267 (přehl. článku); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1: 463 - 468; Hudson a další, 1979, 15 Int. J. Prot. Res. 14: 177 - 185 (-CH₂NH-, -CH₂CH₂); Spatola a další, 1986, Life Sci. 38: 1243 - 1249 (-Ch₂-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1: 307 - 314 (-CH=CH-, cis a trans); Almquist a další, 1080, J, Med. Chem. 23: 1392 - 1398 (-COCH₂); Jennings-White a další, Tetrahedron Lett. 23: 2533 (-COCH₂); evropská patentová 20 přihláška EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (,CH(OH)CH₂); Holladay a další, 1983, Tetrahedron Lett. 24: 4401 - 4404 (-C(OH)CH₂); a Hrubý, 1982. Life Sci. 31: 189 - 199 (-CH₂-S-).

Peptidy podle vynálezu jsou charakterizovány strukturou obsahující dva hlavní prvky nebo motivy: Oblastí s reverzní otáčkou 25 obklopenou dvěma řetězci, které vytvářejí antiparalelní β-zřasenou strukturu. Aniž by bylo zamýšleno vázat se teorií, předpokládá se, že antimikrobiální účinek těchto sloučenin vzorce (I) je částečně spojen s touto strukturou jádra. Oblast β-zřasené struktury peptidů obsahuje Nřetězec (zbytky Xi-C₈) a C-řetězec (zbytky C13-X18). N-řetězec a C30 řetězec jsou vzájemně uspořádány antiparalelně a jsou spolu nekovalentně spojeny vodíkovými vazbami kostra-kostra (detailní ···· ·· · · · · · • · · · · · · ···· · • · · · · ·«· ··· ··· ·· · ·♦ ··

-21 popis struktury β-zřasených strukturu je možno nalézt v Creighton, 1993, Protein Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., NY, a tam uvedených odkazech). Aniž by bylo třeba vázat se teorií, předpokládá se, že většina důležitých zbytků uspořádání β5 zřasené struktury jsou X₅-C₈ a Ci₃-Xi₆. S výhodou je oblast β-zřasené struktury peptidů amfifilní, tj. jeden povrch β-zřasené struktury má čistě hydrofobní charakter a druhý povrch má čistě hydrofilní charakter. S odkazem na strukturu β-zřasené struktury zobrazenou na obr. 7 postranní řetězce L-aminokyselinových zbytků vzájemně io sousedí vnitrořetězcově (zbytky nm n+1, n+2, atd.) a ukazují v opačných směrech tak, aby byly umístěny na opačných površích βzřasené struktury. Postranní řetězce zbytků aminokyselin vzájemně přiléhající vnitrořetězcově (zbytky n a c, n+1 ac+1, atd.) ukazují stejným směrem, tak aby byly umístěny na stejném povrchu β15 struktury. S použitím tohoto obecného strukturního motivu se získá volbou aminokyselin v poloze každého zbytku tak, aby vznikl βzřasená struktura s hydrofobními postranními řetězci umístěnými na jednom povrchu β-struktury a hydrofilními postranními řetězci umístěnými na druhém povrchu struktury, amfifilní antiparalelní β20 zřasená struktura.

Samozřejmě se předpokládá, že protože povrchy amfifilní oblasti antiparalelního β-struktury musí mít pouze celkový sumární hydrofobní nebo celkový hydrofilní charakter, nemusí být všechny řetězce obsažené v příslušném povrchu hydrofobní nebo hydrofilní.

Povrchy mohou obsahovat postranní řetězce, které významněji neovlivňují celkový charakter povrchu. Jak hydrofobní tak hydrofilní povrchy mohou například obsahovat postranní řetězce malých kyselin, protože tyto postranní řetězce výrazněji nepřispívají k výslednému charakteru povrchu.

Oblast β-struktury peptidů vzorce I může obsahovat od jedné do čtyř aminokyselin cysteinového typu, označené C₆. C₈, C13 a Cis, které « · · · • · · ·· · · · * · ···· · · · · · · · • ♦ · · · · · »·· · · • »··· · · · ·····« · · < «· φφ

-22se mohou účastnit meziřetězcových disulfidických vazeb. Peptidy obsahující alespoň dva zbytky aminokyselin cysteinového typu mohou být ve formě přímého řetězce nebo v cyklické formě v závislosti na rozsahu tvorby disulfidických vazeb. Cyklické formy jsou výsledkem vytváření disulfidických vazeb mezi všemi nebo některými ze čtyř přítomných aminokyselin cysteinového typu. Cyklické formy vynálezu zahrnují všechny možné permutace tvorby disulfidických vazeb. Formy přímého řetězce je možno převést do cyklických forem a naopak. Způsoby vytváření disulfidických vazeb pro vytvoření cyklických peptidů jsou dobře známy v oboru stejně jako způsoby redukce disulfidů za vytvoření lineárních sloučenin.

Nativní formy protegrinů obsahují dvě disulfidické vazby; jednu mezi cysteiny C₆-C₁₅ a další mezi cysteiny C₈-Ci₃ (Harwig a další, 1995, J, Peptide Sci. 3: 207). V provedeních vynálezu obsahujících dvě disulfidické vazby je tedy forma C₆-C₁₅ a C₈-C₁₃ výhodná. Tyto peptidy se označují jako „nativní“ formy. Bylo však zjištěno, že formy protegrinů obsahujících pouze jednu disulfidickou vazbu jsou také aktivní a je možno je snadno vyrobit. Mezi provedeními obsahujícími pouze jednu disulfidickou vazbu jsou výhodná ta, která jsou charakterizována spojením pouze C₆-C₁₅ a pouze C₈-C₁₃.

Formy obsahující jako jedinou disulfidickou vazbu disulfid C₆-C₁₅ se obvykle označují jako formy „bullet“ protegrinů; formy, ve kterých je jedinou disulfidickou vazbou spojení C₈-Ci₃ se označují jako formy „kite“. Formy „bullet“ a „kite“ mohou být nejpohodlněji připraveny náhradou všech zbytků podobných cysteinu v polohách, které se neúčastní disulfidické vazby aminokyselinami, které disulfidické vazby nevytvářejí, s výhodou malými aminokyselinami jako je glycin, serin, alanin nebo threonin. Alternativně může být aminokyselina C₈ a/nebo C₁₃ nepřítomna. Protože přímé formy nebo formy „snake“ nativních polypeptidů mají cenné účinky, peptidy podle vynálezu zahrnují linearizované formy, kde jsou sulfhydrylové (SH) skupiny chemicky φ φφφ φφφ · · ·Φ φ φφφ φφ · φφφφ · φ φφφφ φφφ • ΦΦ φφφ φφ φ φφ φφ

-23 stabilizovány vhodnými činidly. Jak je zde definováno, „SHstabilizované“ formy peptidu podle vynálezu obsahují sulfhydrylové skupiny, které byly vystaveny reakci se standardními činidly pro zabránění znovuvytvoření disulfidických vazeb nebo formy, ve kterých 5 byly aminokyseliny cysteinového typu nahrazeny jinými aminokyselinami, jak bylo uvedeno dříve. Je výhodné, jestliže jsou SH-stabilizovány nebo nahrazeny všechny čtyři zbytky aminokyselin cysteinového typu, aby byla minimalizována pravděpodobnost vytváření mezimolekulových disulfidických vazeb.

Atomy síry účastnící se vnitrořetězcového disulfidického můstku v β-struktuře nejsou umístěny v rovině definované vnitrořetězcovými vodíkovými vazbami kostra-kostra; atomy síry jsou vzhledem k βuhlíkům přemostěných zbytků aminokyselin v určitém úhlu, aby mohly být umístěny na povrchu β-struktury. Je třeba rozumět, že v peptidech vzorce I má specificky spadat do rámce definice amfifilní antiparalelní struktury jak se zde popisuje oblast β-struktury, definovaná následujícím vzorcem:

C₆ X7 - Ce

II II

C15 - X14 - C13 kde C₆, C₈, C13 a C15 jsou každá nezávisle na sobě aminokyselina cysteinového typu, X₇ a X₁₄ jsou každá nezávisle hydrofobní nebo malá aminokyselina a || znamenají disulfidickou vazbu. Ve zvláště výhodném provedení jsou zbytky C₆, C₈, C13 a C₁₅ 25 vždy cystein a X₇ a X₁₄ jsou vždy nezávisle hydrofobní aminokyseliny.

Sekundární zřasená struktura β-struktury ukázaná na obr. 7 je složena výlučně z L-aminokyselin. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že náhrada L-aminokyseliny jí odpovídajícím D-enantiomerem v konkrétní poloze zbytku může rozrušit strukturní stabilitu nebo 30 amfifilnost amfifilní antiparalelní oblasti β-struktury. Stupeň, do kterého jakákoliv daná substituce enantiomeru poruší strukturní

-24stabilitu nebo amfifilnost závisí zčásti na velikosti postranního řetězce aminokyseliny a poloze zbytku uvnitř β-struktury. S výhodou bude obsahovat oblast β-struktury peptidů vzorce I směsi L- a Daminokyselin, která výrazně neovlivňuje stabilitu nebo amfifilnost oblasti β-struktury ve srovnání s peptidy obsahujícími odpovídající všechny D- nebo všechny L-enantiomerní formy β-struktury. Enantiomerní substituce, které podstatně neovlivňují stabilitu nebo amfifilnost v oblasti β-struktury budou odborníkům v oboru zřejmé.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou hydrofobní, bazické, polární/velké a cysteinu podobné aminokyseliny tvořící oblast βstruktury buď vždy typu L-enantiomerů nebo vždy typu D-enantiomerů.

Oblast zpětné otáčky peptidů vzorce I (zbytky X₉-Xi₀-Xn-Xi2 brány společně) tvoří řetězce antiparalelní β-struktury. Oblast reverzní otáčky tedy zahrnuje strukturu, která obrací směs polypeptidového řetězce, aby tak umožnila oblasti peptidu přijmout antiparalelní sekundární strukturu β-struktury.

Oblast reverzní otáčky molekuly obvykle obsahuje 2, 3 nebo 4 aminokyselinové zbytky (zbytek X₉ a/nebo X₁₂ nemusí být přítomen). Důležitým rysem ilustrativních protegrinových peptidů popisovaných v předkládané přihlášce je přítomnost pozitivního náboje v otáčející se oblasti molekuly. Jedna z aminokyselin X₉-Xi₂ s výhodou dvě aminokyseliny z oblasti X₉-Xi₂ musí tedy být bazické aminokyseliny. Takové dvoj, troj nebo čtyřaminokyselinové segmenty schopné uskutečnit otočení v peptidu jsou dobře známy a odborníkům v oboru budou zřejmé.

Ve výhodném provedení vynálezu je reverzní otáčkou gamaotáčka obsahující tři zbytky aminokyselin. Ve skutečnosti může být použita v popisovaných peptidech jakákoliv gama-otáčková sekvence známá v oboru, včetně sekvencí popisovaných například v Rose a další, 1985, Adv, Protein Chem. 37: 1- 109; Wilmer-White a další, • ····

4·· 9 9 · · 9 9 · • ··· ·· 9 9 9 99 • ·«:··· ··«··· • 9 9 9 9 9 9 9 • 99 999 99 9 ·· ··

-251987, Trends biochem. Sci. 12: 189 - 192; Wilmot a další, 1988, J, Mol. Biol. 203: 221 - 232; Sibanda a další, 1989, J. Mol, Biol, 206: 759 - 777; a Tramontano a další, 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet, 6: 382 - 394.

V dalším výhodném provedení je reverzní otáčkou β-otáčka obsahující čtyřaminokyselinový zbytek. V těchto strukturách se obvykle dva vnitřní zbytky aminokyselin otáčky neúčastní vodíkové vazby antiparalelní β-struktury; tyto dva aminokyselinové zbytky na obou stranách vnitřních zbytků jsou obvykle zahrnuty ve vodíkových vazbách β-struktury. Aniž by bylo třeba vázat se teorií, předpokládá se, že takové vodíkové vazby pomohou stabilizovat oblast β-struktury v molekule.

Konformace a sekvence mnoha peptidových β-otáček byly v oboru již dobře popsány a zahrnují například bez omezení typ-l, typ-l’, typ-ll, typ-ll’, typ-lll, typ-ΙΙΓ, typ-IV, typ-V, typ-V’, typ-Vla, typVlb, typ-VII a typ-VIII (viz Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34: 167 - 339; Rose a další, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1 - 109; Wilmot a další, 1988, J. Mol. Biol. 203: 221 - 232; Sibanda a další, 1989, J. Mol. Biol. 206: 759 - 777; Tramontano a další, 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382 - 394). Všechny tyto typy struktur βotáček peptidu a jejich odpovídající sekvence stejně jako později objevené struktury β-otáčky peptidu a jejich sekvence jsou vynálezem uvažovány.

Specifické konformace krátkých peptidových otáček jako jsou βotáčky závisí primárně na polohách určitých zbytků aminokyselin v otáčce (obvykle Gly, Asn nebo Pro).

Obvykle je β-otáčka typu I kompatibilní s jakýmkoliv zbytkem aminokyseliny v polohách X₉ až X₁₂ kromě toho, že se v poloze 11 nemůže vyskytovat Pro. V poloze X₁₂ převažuje Gly a v poloze X₁₀ otáček typu I i typu II převažuje Pro. Zbytky Asp, Asn, Ser a Cys se ··· • ···· ·· · ·· · · · · 1 · · ♦ ··· ♦ · · * · ·· • · · · · · 9 ♦ · · ·· • · · · · 9 99

999 999 99 9 9999

-26 v pozici X₉ vyskytují často, přičemž jejich postranní řetězce jsou v této poloze často svázány vodíkovou vazbou se skupinou NH zbytku Xn.

V otáčkách typu II se zbytky Gly a Asn vyskytují nejčastěji v poloze Xn, protože nejsnadněji přijímají požadované úhly kostry.

V ideálním případě mají otáčky typu Γ Gly v polohách X₁₀ a Xn a otáčky typu II’ mají Gly v poloze X₁₀. Otáčky typu III mohou obecně obsahovat většinu aminokyselinových zbytků, ale otáčky typu III’ obvykle vyžadují přítomnost Gly v polohách X₁₀ a Xn.

Otáčky typu Via a Vlb obvykle mají cis peptidovou vazbu a jako io vnitřní zbytek obsahují Pro. Přehled různých typů a sekvencí β-otáček v proteinech a peptidech je možno nalézt v článku Willmot a další, 1988. J, Mol. Biol. 203: 221 - 232.

S výhodou obsahují sekvence β-otáček takové sekvence, kde X₉ je bazická aminokyselina (s výhodou R, K, Orn nebo Dab) nebo 15 hydrofobní aminokyselina (s výhodou W, F, Y nebo Cha); X₁₀ je bazická aminokyselina (s výhodou R), malá aminokyselina (s výhodou MeGly) nebo prolin; Xn je bazická aminokyselina (s výhodou R, K, Orn nebo Dab) nebo hydrofobní aminokyselina (s výhodou W, F, Y nebo Cha); a X₁₂ je hydrofobní aminokyselina (s výhodou W, F, Y, I 20 nebo Cha).

Protegrinové peptidy použitelné v rámci vynálezu jsou obvykle bazické, tj. mají celkový pozitivní náboj za podmínek fyziologického pH. Aniž by bylo třeba vázat se teorií, předpokládá se, že přítomnost pozitivně nabitých zbytků aminokyselin, zvláště v oblasti otáčky 25 molekuly, je důležitá pro antimikrobiální účinnost.

Rozumí se, že ve statistickém souboru jednotlivých zbytků aminokyselin ve struktuře jako je peptid budou některé aminokyselinové zbytky nabity pozitivně, některé negativně a některé budou bez náboje. Některé z peptidů tedy budou mít náboj a některé 30 ne. Aby peptid vyhovoval definici bazického peptidů při fyziologických ··«· • · ··· ·

-27hodnotách pH je většina zbytků aminokyselin v molekule peptidu nabita pozitivně. Přibližně 15 % ale ne více než až přibližně 50 % aminokyselin musí být bazické aminokyseliny a sloučeniny musí mít při fyziologických hodnotých pH celkový součet náboje alespoň +1.

Ilustrativní peptidy budou mít s výhodou celkový náboj při fyziologickém pH alespoň + 3.

Pro taková provedení, která mají pouze například deset aminokyselin může být přítomen pouze jeden zbytek bazické aminokyseliny; výhodné jsou však alespoň dva bazické zbytky, i když io se jedná o takto krátký řetězec. Jestliže protegrinový peptid obsahuje již patnáct zbytků aminokyselin, jsou nutné dva bazické zbytky. Je výhodné, jestliže je alespoň 20 % aminokyselin v sekvenci bazických, přičemž zvláště výhodná je přítomnost 30 % bazických aminokyselin. Aminokonec ilustrativních peptidů může být ve volné aminové formě 15 nebo může být acylován skupinou vzorce RCO-, kde R znamená hydrokarbylovou skupinu s 1 až 25 atomy uhlíku, s výhodou 1 až 10 atomy uhlíku, nejvýhodněji 1 až 8 atomy uhlíku. Hydrokarbylová skupina může být nasycená nebo nenasycená, může mít přímý nebo rozvětvený řetězec nebo může být cyklická a atypicky je jí například 20 methyl, ethyl, izopropyl, t-butyl, n-pentyl, cyklohexyl, cyklohexen-2-yl, hexen-3-yl, hexin-4-yl, oktyl, decyl, eikanosyl apod.

Alternativně může být aminový konec substituován aromatickými skupinami jako je naftyl apod. Tyto peptidy mohou být vhodně připraveny zavedením příslušné aminokyseliny, jako je 1-naftylalanin 25 a 2-naftylalanin na N-konec peptidu.

Aminový konec peptidů může být také substituován, aby mohl využívat transmembránové kanály specifické pro rozpouštědla pro umožnění svého vstupu do periplazmatického prostoru bakterie. Peptidy mohou být například výhodně modifikovány na N-konci 3o katecholem s použitím katechol-NHS aktivovaného esteru.

·· ···· • · ··· · • · ·

• · · ·· ··

-28 C-konec peptidů použitelných v rámci předkládaného vynálezu může být ve formě nederivatizované karboxylové skupiny, buď jako volná kyselina nebo přijatelná sůl, jako je draselná, sodná, vápenatá, hořečnatá nebo jiná sůl anorganického iontu nebo organického iontu jako je kofein. Karboxylový konec může také být derivatizován vytvořením esteru s alkoholem vzorce ROH, nebo může být amidován aminem vzorce NH₃ nebo RNH₂ nebo R₂NH, kde každé R je nezávisle hydrokarbyl s 1 až 25 atomy uhlíku, jak již bylo definováno u výhodných provedení výše. Výhodné jsou amidované formy peptidů, ve kterých má C-konec vzorec CONH₂.

Ilustrativními protegrinovými peptidy použitelnými v rámci předkládaného vynálezu jsou tedy peptidy vzorce:

(I)

nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli a jejich definované modifikované formy, kde:

každá z aminokyselin C₈ a Cj₃ je nezávisle na sobě přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, je každá nezávisle na sobě aminokyselina cysteinového typu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní aminokyselina;

každá z aminokyselin C₆ a Ci₅ je nezávisle cysteinového typu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní aminokyselina;

každá z aminokyselin Xj - X₅ je nezávisle na sobě přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, každá je nezávisle bazická, hydrofóbní, polární/velká nebo malá aminokyselina;

Každá aminokyselina X₇ a X₁₄ je nezávisle hydrofóbní nebo malá aminokyselina;

každá z aminokyselin X₉ a X₁₂ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna;

X₉-Xi₂ brány společně jsou schopny vytvořit reverzní otáčku, jestliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I) • · · φ · ·

-29a alespoň jedna z aminokyselin X₉ - X₁₂ musí být bazická aminokyselina;

každá z aminokyselin X₁₆ - X_i8 je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, každá je nezávisle bazická, 5 hydrofóbní, polátní/velká nebo malá aminokyselina;

a kde alespoň přibližně 15 až přibližně 50 % aminokyselin tvořících uvedený antimikrobiální peptid jsou bazické aminokyseliny, takže antimikrobiální peptid má celkový náboj při fyziologickém pH alespoň + 1.

io Ve výhodném provedení mají ilustrativní peptidy vzorec:

(I) Xi-X2“X3^_X4X5^-C6“X7“Cg-X9-Xi0“Xl1^_Xl2“Cl3-Xl4^_Ci5-Xi6^-Xl7“Xl8 nebo se jedná o jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde:

Xi je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu;

aminokyselina X₂ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou bazickou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

aminokyselina X₃ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

aminokyselina X₄ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je 2o přítomna, jde o malou, bazickou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

aminokyselina X₅ je malá, bazická nebo hydrofóbní aminokyselina;

aminokyselina C₆ je aminokyselina cysteinového typu;

aminokyselina X₇ je malá nebo hydrofóbní aminokyselina;

aminokyselina C₈ je cysteinového typu, malá, bazická nebo hydrofóbní aminokyselina;

aminokyselina X₉ je bazická nebo hydrofóbní aminokyselina;

- 30 aminokyselina X₁₀ je malá nebo bazická aminokyselina nebo prolin;

aminokyselina Xn je bazická nebo hydrofóbní kyselina;

aminokyselina X₁₂je hydrofóbní aminokyselina;

aminokyselina C_í3 je aminokyselina cysteinového typu nebo malá bazická nebo hydrofóbní;

aminokyselina Χ_Ί4 je malá nebo hydrofóbní aminokyselina;

aminokyselina C15 je aminokyselina cysteinového typu;

aminokyselina X₁₆ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o hydrofóbní aminokyselinu;

aminokyselina X_t7 je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou aminokyselinu; a aminokyselina X₁₈ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu.

Zvláště výhodné peptidy jsou takové, kde Χχ znamená R; X₂ není přitom o nebo znamená R, G nebo L; X₃ není přítomno nebo znamená G, L, W nebo Cha; X₄ není přítomno nebo znamená R, G nebo W; X₅ je R, G, A, L, V, W nebo Cha; C₆ je C; X₇ je A, Y, F nebo Cha; C₈ je C, K, A nebo T; X₉ je R, F, W, Y nebo L; X₁₀ je R, G, MeGly nebo P; Xn je R, W, F nebo Cha; X₁₂ je F, I, Y, W nebo Cha; C₁₃ je C, K, A nebo T; Χ_Ί4 je G, A, V nebo F; X15 je C; Xw není přítomno nebo znamená V, F; Χ_Ί7 není přítomno nebo znamená G; a Xi₈ není přítomno nebo znamená R.

V dalším zvláště výhodném provedení vynálezu je peptid vzorce (I) zvolen ze skupiny:

. (OM-1) RGGRLCYCRRRFCVCVGR . (OM-2) RGGRLCYCRRRFCVCVGR* (OM-3) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No. 1) (SEQ ID No. 2) (SEQ ID No. 3)

(OM-4)	RLLRACYCRXRFCVCVGR	(X=MeGly)	(SEQ ID No. 4)
(OM-5)	RGGRLCYCRPRFCVCVGR		(SEQ ID No. 5)
(OM-6)	RGGGLCYKRGWIKFCVGR		(SEQ ID No. 6)
(OM-7)	RGWGLCYCRPRFCVCVGR		(SEQ ID No. 7)
(OM-8)	RLCYCRPRFCVCVGR		(SEQ ID No. 8)
(OM-9)	RGGGLCYTRPRFTVCVGR		(SEQ ID No. 9)
(OM-10)	LCYCRGRFCVCVGR		(SEQ ID No.10)
(OM-11)	RWRLCYCRPRFCVCV		(SEQ ID No.11)
(OM-12)	RGWRLCYCRPRFCVCVGR		(SEQ ID No.12)
(OM-13)	RGWRACYCRPRFCACVGR		(SEQ ID No.13)
(OM-14)	GWRLCYCRPRFCVCVGR		(SEQ ID No.14)
(OM-15)	XCYCRRRFCVCV	(X=Cha)	(SEQ ID No.15)
(OM-16)	WLCYCRRRFCVCV*		(SEQ ID No.16)
(OM-17)	RLCYCRXRFCVCV	(X=MeGly)	(SEQ ID No.17)
(OM-18)	RLCYCRPRFCVCVGR*		(SEQ ID No.18)
(OM-19)	RGGGLCYCRPRFCVCVGR*		(SEQ ID No.19)
(OM-20)	RXCFCRPRFCVCV	(X=Cha)	(SEQ ID No.20)
(OM-21)	RWCFCRPRFCVCV		(SEQ ID No.21)
(OM-22)	LCXCRRRXCVCV	(X=Cha)	(SEQ ID No.22)
(OM-23)	RGGRLCYCRRRFCVC		(SEQ ID No.23)
(OM-24)	LCYTRRRFTVCV		(SEQ ID No.24)
(OM-25)	RRCYCRRRFCVCVGR		(SEQ ID No.25)
(OM-26)	RLCYCRRRFCVCV*		(SEQ ID No.26)
(OM-27)	RXRLCYCRZRFCVCV	(X=Cha)	(SEQ ID No.27)

(Z=MeGly) • v · · · ♦ ··« · • ·· ·····

	• ··· • · • · ··· ··· - 32 -	• · · • a · · · • · · ·· ·	• · ·· • 4 · · · • · · ·· ··
(OM-28)	RGWRLCYCRGRXCVCV	(X=Cha)	(SEQ ID No.28)
(OM-29)	RGLRXCYCRGRFCVCVGR	(X=Cha)	(SEQ ID No.29)
(OM-30)	RGWRGCYKRGRFKGCVGR		(SEQ ID No.30)
(OM-31)	RGWRGCYCRXRFCGC	(X=MeGly)	(SEQ ID No.31)
(OM-32)	RGGLCYCRGRFCVCVGR		(SEQ ID No.32)
(OM-33)	RLLRLCYCRXRFCVCVGR	(X=MeGly)	(SEQ ID No.33)
(OM-34)	RGGRLCYCRGRFCVCVGR*		(SEQ ID No.34)
(OM-35)	RGWRLCYCRGRFCVCVGR		(SEQ ID No.35)
(OM-36)	RGGRLCYCRGRFCVCVGR		(SEQ ID No.36)
(OM-37)	RGGRVCYCRGRFCVCVGR		(SEQ ID No.37)
(OM-38)	RGGRVCYCRGRFCVCV		(SEQ ID No.38)
(OM-39)	RGGRVCYCRGRFCVCV*		(SEQ ID No.39)
(OM-40)	WLCYCRRRFCVCV		(SEQ ID No.40)
(OM-41)	RGGGLCYARGWIAFCVCVGR	(SEQ ID No.41)
(OM-42)	LCYCRRRFCVCVF		(SEQ ID No.42)
(OM-43)	RLCYCRPRFCVCV		(SEQ ID No.43)
(OM-44)	RLCACRGRACVCV		(SEQ ID No.44)

kde peptidy označené * jsou ve formě kyseliny a všechny ostatní jsou ve formě amidu.

Způsoby výroby

Určité peptidy použitelné v rámci vynálezu, jako jsou přírodně se vyskytující PG-1 až PG-5 mohou být izolovány z prasečích leukocytů, jak se popisuje v US patentu No. 5,464,823. Všechny tyto 25 peptidy mohou být chemicky syntetizovány s použitím v oboru známých postupů. Jejich N- a/nebo C-konec může být derivatizován,

·· ··

444 4 4 opět s použitím obvyklých chemických postupů. Sloučeniny podle vynálezu mohou popřípadě obsahovat na aminovém konci acylovou skupinu, s výhodou acetylovou skupinu. Způsoby acetylace nebo obecněji acylace volné aminoskupiny na N-konci jsou obecně známé v oboru; navíc může být N-koncová aminokyselina pro syntézu dodána v acylované formě.

Na karboxylovém konci může být samozřejmě přítomna karboxylová skupina ve formě soli; v případě farmaceutických prostředků půjde o farmaceuticky přijatelnou sůl, jak bylo popsáno dříve. Karboxylový konec může být také esterifikován s použitím alkoholů vzorce ROH, kde R je hydrokarbyl (1-6C) jak je uvedeno výše. Podobně může být karboxylový konec amidován tak, aby měl vzorec -CONH₂, -CONHR, nebo -CONR₂, kde každé R je nezávisle hydrokarbyl s jedním až šesti atomy uhlíku, jak bylo uvedeno výše. Způsoby esterifikace a amidace stejně jako neutralizace v přítomnosti báze za vytvoření solí jsou všechny standardně známé technologie organické chemie.

Výhodné způsoby syntézy peptidů, které mají na C-konci amidovou skupinu jsou uvedeny v příkladech.

Vytváření disulfidických vazeb se v případě potřeby provádí v přítomnosti mírných oxidačních činidel. Je možno použít chemických oxidačních činidel, nebo mohou být sloučeniny jednoduše vystaveny pro uskutečnění těchto vazeb vzdušnému kyslíku, takže vyhledává ve vodném médiu při fyziologickém pH v konformaci peptidů, ve kterém je obsažen, polohy na povrchu.

V oboru je známa řada metod. Postupy použitelné při vytváření disulfidických vazeb byly popsány v Tam, J. P. a další, Synthesis (1979) 955 - 957; Stewart, J. M. a další, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vyd., Pierce Chemical Company Rockford, IL (1984); Ahmed A. K. a další, J. Biol. Chem. (1975) 250: 8477 - 8482 a Pennington M. W. a další, Peptides 1990, E. Giralt a další, ESCOM

- 34 Leiden, Holandsko (1991) 164 - 166. Další alternativa se popisuje v:

Kamber, B. a další, Helv. Chim. Acta (1980) 63: 899 - 915. Metoda používající pevných nosičů se popisuje v: Albericio Int. J. Pept.

Protein Res. (1985) 26: 92 - 97. Zvláště výhodným způsobem je 5 oxidace roztoku s použitím molekulárního kyslíku, jak se popisuje v příkladech.

Alternativně mohou být sulfhydrylové skupiny aminokyselin cysteinového typu stabilizovány reakcí s alkylačními činidly s použitím známých metod.

io Jestliže se peptidová kostra skládá výlučně z geneticky kódovaných aminokyselin, nebo jestliže je takto složena alespoň část kostry, peptid z příslušné části může být také syntetizován s použitím technik rekombinantní DNA. DNA kódující peptidy podle vynálezu může být sama syntetizována pomocí komerčně dostupného vybavení.

Výběr kodónů může být integrován do syntézy v závislosti na povaze hostitele.

Rekombinantně vytvářené formy protegrinů mohou vyžadovat následnou derivatizaci pro modifikaci N- a/nebo C-konce a v závislosti na způsobu izolace pro dosažení vytvoření disulfidických můstků jak 20 bylo popsáno výše. V závislosti na použitém hostitelském organismu pro výrobu rekombinantního proteinu a živočišného zdroje, ze kterého je tento protein izolován, mohou již být některé nebo všechny tyto přeměny uskutečněny.

Pro rekombinantní produkci je obsažena DNA kódující 25 protegriny podle vynálezu v expresním systému, který umisťuje tyto kódující sekvence pod kontrolu vhodného promotoru a jiných řídících sekvencí kompatibilních se zamýšlenou hostitelskou buňkou. Rozpětí typů dostupných hostitelských buněk se pohybuje téměř v celém rozsahu rostlinné a živošišné říše. Protegriny podle vynálezu by mohly 3o tedy být produkovány v bakteriích nebo kvasinkách (do té míry, že mohou být produkovány v netoxické nebo štěpitelné formě nebo

- 35 využívat rezistentních kmenů), nebo mohou být produkovány v živočišných buňkách, hmyzích buňkách a rostlinných buňkách. Modifikované rostlinné buňky mohou být samozřejmě použity pro regeneraci rostlin obsahujících příslušné expresní systémy, takže 5 výsledná transgenní rostlina je schopna pomocí těchto systémů chránit sama sebe.

Vhodné rekombinantní metody a expresní systémy budou odborníkům v oboru zřejmé.

¹⁰ Podávání

Způsoby podle vynálezu obvykle zahrnují místní podávání množství antimikrobiálního protegrinového peptidu účinného pro léčení nebo prevenci zánětu ústní sliznice do ústní dutiny léčeného pacienta. Terapeuticky účinná dávka označuje takové množství 15 protegrinového peptidu, které je dostatečné pro odstranění symptomů spojených se zánětem ústní sliznice a/nebo snížení počtu životaschopných organismů (CFU) mikroflóry spojené se zánětem ústní sliznice ve srovnání s počtem CFU pozorovaným před léčením v ústech pacienta. Typicky je snížení počtu životaschopných 20 mikroorganismů o tři až čtyři řády považováno za terapeuticky účinné, avšak i snížení o jeden až dva řády může poskytnout výrazné zmírnění příznaků a tím terapeutický prospěch.

Bylo zjištěno, že navíc k poskytování terapeutického účinku u pacientů trpících zánětem ústní sliznice jsou protegriny zvláště 25 účinné při preventivním používání. Terapeuticky účinná dávka tedy také označuje množství protegrinového peptidu dostatečné pro prevenci nástupu zánětu ústní sliznice. Důležitým hlediskem předkládaného vynálezu je tedy profylaktické použití protegrinových peptidu u pacientů s rizikem vyvinují zánětu ústní sliznice, jako jsou 30 pacienti s chemoterapií nebo radioterapií.

Pro jakýkoli protegrinový peptid může být na počátku terapeuticky účinná dávka odhadnuta z testů in vitro, jako je například kinetika usmrcování mikroorganismů ve slinách. Počáteční dávky mohou být také stanoveny z dat in vivo, například u živočišných 5 modelů, přičemž se používají způsoby dobře známé v oboru. Zvláště účinný předklinický zvířecí model pro odhad účinných dávek pro léčení nebo prevenci zánětů ústní dutiny je model křečka (Sonis a další, 1990, Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 69: 437 - 443; Sonis a další, 1995, Oral oncol. Eur. J. Cancer 31B: 261 - 266). Odborník s běžnou io znalostí v oboru by mohl v závislosti na zvířecích datech snadno optimalizovat podávání člověku, zvláště na základě zde uváděného detailního popisu.

Obecně budou protegrinové peptidy nejprospěšnější, jestliže se budou aplikovat do ústní dutiny před výskytem zánětu ústní sliznice.

Tak bude například léčení obecně začínat tehdy, jestliže se u pacienta předpokládá vysoké riziko vývoje zánětu ústní sliznice. Zda a kdy bude pacient pokládán za rizikového bude samozřejmě záviset na faktorech jako je věk pacienta, agresivita chemoterapie nebo radioterapie, typ léčeného tumoru nebo rakoviny a použitý

2o chemoterapeutický prostředek. Případné riziko vývoje zánětu ústní sliznice bude moci snadno určit ošetřující lékař. Protegrinové peptidy však mohou být použity, jakmile pacient začíná cítit zánět v ústech, nebo po objevení poškození.

Jak bude diskutováno podrobněji níže, protegriny se budou 25 typicky podávat ve formě místního orálního prostředku. Tyto prostředky budou obecně obsahovat přibližně 0,001 % hmotnostních až 2,5 % hmotnostních aktivní složky; očekává se však účinnost rozmezí koncentrací například 0,005 % hmotnostních až 0,75 % hmotnostních nebo dokonce 0,03 % hmotnostních až 0,3 % 3o hmotnostních.

• ♦ ··· ·· · ···· • ··· · · · · · ·· • ··· ·· · ···· · • · · · t ··· ··· ·«· ·· I ·· ·®

-37Protegriny mohou být aplikovány místně několikrát za den v závislosti zčásti na koncentraci použité dávky a na frekvenci přijímání potravy a tekutin pacientem. Protegriny mohou být tedy v závislosti na konkrétních okolnostech aplikovány 2, 3, 4 nebo dokonce až 6 x za den. Výplach fyziologickým roztokem před každým použitím a omezení jídla a pití alespoň 30 min po aplikaci až přibližně několik hodin po aplikaci může účinnost ošetření zvýšit. S výhodou se bude provádět léčení protegriny po dobu přibližně 1 až 6 týdnů, ale terapeutický prospěch mohou také přinést ošetřovací režimy o délce pouze tří až čtyř dnů. V některých případech může být žádoucí ošetřovat pacienta po celou dobu, kdy pacient přijímá chemoterapeutické prostředky a/nebo radioterapii.

Skutečné množství podávaného antimikrobiálního peptidu stejně jako dávkovači schéma podávaného peptidu bude samozřejmě záviset na takových faktorech, jako je věk pacienta, vážnost postižení, agresivita použité chemoterapie nebo radioterapie a samozřejmě na úsudku ošetřujícího lékaře.

Protegriny je možno podávat samostatně nebo ve směsi s jinými protegriny nebo antimikrobiálními peptidy nebo jinými prostředky, včetně například prostředků zmírňujících bolest (lidokain apod.) nebo protizánětlivých prostředků.

Složení farmaceutických prostředků

Typicky se peptidy používají v ústní dutině ve formě místního farmaceutického prostředku. Prostředky vhodné pro místní podání v ústech jsou ústní emulze, emulze, gely, vody, pastilky, pasty, krémy, ústní roztoky, gumy apod., které jsou v oboru dobře známy. Ve spojení s předkládaným vynálezem mohou být použity jakékoli z těchto místních orálních nosičů. Přesné složení prostředků stejně jako způsoby jejich přípravy budou odborníkům v oboru zřejmé (viz například Ansel a další, 1995, Pharmaceutical Dosaqe Forms and

-38Druq Deliverv. Williams & Wilkins, Malvern, PA; Remingtorťs Pharmaceutical Sciences, poslední vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA). Ve výhodném provedení vynálezu se peptidy podávají v místních gelovitých prostředcích obsahujících přibližně 0,001 % hmotnostních až přibližně 2,5 % hmotnostních, s výhodou přibližně 0,005 % hmotnostních až přibližně 0,75 % hmotnostních, výhodněji přibližně 0,03 % hmotnostních až 0,3 % hmotnostních a nejvýhodněji přibližně 0,025 % hmotnostních až přibližně 0,15 % hmotnostních aktivního peptidu nebo aktivních peptidů ve směsi s gelovitým nosičem. Gelovitý nosič obvykle obsahuje ve vodě rozpustný gelující prostředek, zvlhčovadlo a vodu a má viskozitu přibližně 0,5 až 100 Pas, s výhodou přibližně 10 až 50 Pas, výhodněji přibližně 15 až 30 Pas a nejvýhodněji přibližně 20 až 25 Pas, měřeno Brookfieldovým viskozimetrem při teplotě přibližně 25 °C. Gelující prostředek poskytuje farmaceutickému prostředku dobrou adhezi na sliznici; zvlhčovadlo potom dobré zvlhčení a bariéru pro vlhkost. Mezi gelující prostředky vhodné pro použití v nosičích podle vynálezu patří například agar, bentonit, karbomer (např. karbopol), ve vodě rozpustné celulózové polymery (např. karboxyalakylcelulóza, hydroxyalkylcelulóza, alkylcelulóza, hydroxyalkylalkylcelulóza), povidon, kaolin, tragakant a veegum, s hydroxyalkylalkylcelulózami jako je hydroxypropylmethylcelulóza ve výhodných provedeních.

Zvlhčovadla vhodná pro použití v gelovitých nosičích podle vynálezu jsou například glycerol, propylenglykol a sorbitol, přičemž výhodný je sorbitol.

Obecně obsahuje nosič přibližně 0,1 % hmotnostních až 10 % hmotnostních ve vodě rozpustného gelujícího prostředku, přičemž výhodné je množství přibližně 0,25 % hmotnostních až 5 % hmotnostních a nejvýhodnější je množství přibližně 0,1 % hmotnostních až 20 % hmotnostních. Protože má však viskozita gelovitého nosiče značnou důležitost, rozumí se, že výše uvedené

-39 rozmezí koncentrací slouží pouze jako vodítko. Skutečné koncentrace gelujících prostředků budou záviset zčásti za zvoleném polymeru, dodavateli a konkrétním číslu šarže. Skutečné koncentrace dalších složek budou podobně ovlivňovat viskozitu gelovitého prostředku. Volba vhodných koncentrací pro získání gelovitého prostředku s požadovanou viskozitou a jinými vlastnostmi popisovaná výše, patří mezi znalosti zkušeného odborníka.

Gelovité nosiče podle vynálezu mohou obsahovat antimikrobiální ochranné látky. Antimikrobiální ochranné látky použitelné v prostředcích podle vynálezu zahrnují bez omezení antifungální ochranné látky jako je kyselina benzoová, alkylparabeny, benzoát sodný a propionát sodný; a antimikrobiální ochranné látky jako je benzalkoniumchlorid, benzethoniumchlorid, benzylalkohol, cetylpyridiniumchlorid, chlorbutanol, fenol, fenylethylalkohol, dusičnan fenyl rtuťnatý a thimerosal, přičemž výhodné jsou alkylparabeny jako methylparaben, propylparaben a jejich směsi.

Množství antimikrobiální ochranné látky (ochranných látek) účinných pro použití v prostředcích podle vynálezu bude odborníkovi v oboru zřejmé a bude zčásti záviset na použitém antimikrobiálním prostředku (prostředcích). Typické koncentrace se pohybují od přibližně 0,01 % hmotnostních do přibližně 2 % hmotnostních.

Prostředek podle vynálezu může také obsahovat od přibližně 1 % hmotnostního do 10 % hmotnostních sladidla jako je aspartam, dextróza, glycerol, malitol, mannitol, sacharin ve formě sodné soli, sorbitol, sacharóza a xylitol. O těchto sladidlech se předpokládá, že vyhovují požadavkům pacientů.

pH prostředku bude samozřejmě záviset na aktivní složce (složkách) obsažených v prostředku. Odborníku v oboru bude určení optimálního pH pro stabilitu a účinnost prostředku zřejmé.

Další případné složky, které mohou být použity bez nepříznivého ovlivnění a v některých případech dokonce za zvýšení účinnosti • ·· · « ·

-40 prostředku podle vynálezu zahrnují bez omezení okyselující prostředky jako je kyselina octová, citrónová, fumarová, chlorovodíková, mléčná a dusičná; alkalizační prostředky jako je roztok amoniaku, uhličitan amonný, diethanolamin, monoethanolamin, hydroxid draselný, boritan sodný, uhličitan sodný, hydroxid sodný, triethanolamin a trolamin; pufrující prostředky, jako je metafosforečnan draselný, fosforečnan draselný, octan sodný a citran sodný; antioxidanty jako je kyselina askorbová, askorbyl palmitát, butylovaný hydroxyanisol, butylovaný hydroxytoluen, kyselina fosforná, monothioglycerid, propylgalát, askorbát sodný, kyselý siřičitan sodný, formaldehydsulfoxylát sodný a disiřičitan sodný; chelatační činidla jako je edetát dvojsodný a kyselina edetová; barviva jako je FD&C Red No. 3, FD&C Red No. 20, FD&C Yellow No. 6, FD&C Blue No. 2, D&C Green No. 5, D&C Orange No. 5, karamel a oxid železitý, červený; a ochucovací látky jako je anýzový olej, skořicový olej, kakao, mentol, pomerančový olej, mátový olej a vanilin. Vodné koncentrace pro použití budou odborníkům v oboru zřejmé. Další případné složky stejně jako jejich vhodné koncentrace pro použití je možno například nalézt v knize Reminqton’s Pharmaceutical Sciences, poslední vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je grafické znázornění vlivu peptidu OM-3 (SEQ ID No. 3) na počet životaschopných mikroorganismů (CFU) mikroflóry ve vzorcích normálních lidských slin;

obr. 2 je grafické znázornění účinku peptidu OM-3 (SEQ ID No. 3) na snížení orální mikroflóry u křečků obr. 3 je grafické znázornění účinku peptidu PG-1 (SEQ ID No. 1) použitého pro léčení zánětu ústní sliznice u křečků;

• · · ·

-41 obr. 4 je grafické znázornění vlivu léčení peptidem PG-1 (SEQ ID No. 1) na tělesnou hmotnost křečků s experimentálně indukovaným zánětem ústní sliznice;

obr. 5 je grafické znázornění účinku léčení peptidem OM-3 (SEQ ID No. 3) na zánět ústní sliznice u křečků;

obr. 6 je grafické znázornění účinku léčení peptidem OM-3 (SEQ ID No. 3) na zánět ústní sliznice křečků;

obr. 6 je grafické znázornění účinku léčení peptidem OM-3 (SEQ ID No. 3) na tělesnou hmotnost křečků s experimentálně indukovaným zánětem ústní sliznice; a obr. 7 je znázornění struktury β-struktury peptidu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza peptidů PG-1 a OM-3

Tento příklad popisuje výhodné způsoby syntézy peptidů podle vynálezu s C-koncovým amidem.

1.1 Syntéza lineárního peptidu

Lineární amidované formy peptidů PG-1 a OM-3 byly syntetizovány na nosiči Fmoc Rink amide solid support resin (Bachem) použitím mechanismu Fmoc na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433 (ABD, Perkin Elmer, Foster City, CA) podle standardních protokolů výrobce. Štěpení surového produktu z pryskyřice bylo prováděno roztokem 10 ml thioanisol:EDT:TFA (1:1:9) po dobu dvou hodin při pokojové teplotě. Surový odštěpený produkt byl srážen t-butylmethyletherem, zfiltrován a sušen.

• · · · · · • «···· ♦····· • ···♦ 9 9 9

999 999 99 9 . ·· ··

- 42 1.2 Vytváření disulfidických vazeb

Surový lineární peptid byl rozpuštěn v TMSO a přidán k 20 mM octanu amonnému, pH 7. Konečná koncentrace peptidů byla přibližně 1 - 8 mg/ml, pH se pohybovalo v rozmezí od 7,0 do 7,2 a koncentrace DMSO byla od přibližně 5 do 20 %. Roztok byl přes noc míchán při pokojové teplotě a pH roztoku bylo nastaveno koncentrovanou kyselinou octovou na 5.

Oxidovaný peptid byl nanesen na preparativní kolonu HPLC s reverzní fází (Vydac C18, 2,2 cm x 25 cm, Cat. No. 218TP101522), kolona abyla promyta pufrem (10 % objemových acetonitrilu, 0,1 % objemových TFA ve vodě), dokud absorbance efluentu (měřená při 235 nm) nedosáhla základní hodnoty, a čistý produkt byl eluován při 10 ml/min s použitím následujících pufrů a gradientu.

Gradient

Čas (min)	Pufr A (%)	Pufr B (%)	Gradient
0	90	10	lineární
10	82	18	lineární
80	68	32	lineární
95	5	95	lineární

Pufr A = 0,10 % objemových vodná TFA;

Pufr B = 0,08 % objemových TFA v acetonitrilu.

Frakce byly analyzovány analytickou HPLC. Frakce obsahující peptid s požadovanými disulfidickými můstky byl oddělen, acetonitril odpařen a výsledný vodný roztok lyofilizován dosucha. Sekvence peptidů s disulfidickými můstky byla potvrzena hmotnostní spektrometrií.

-43 Příklad 2: Výroba prostředku s hvdroxypropvlmethvlcelulózovým (HPMC) gelem

Tento příklad poskytuje výhodné způsoby výroby výhodných místních prostředků podle vynálezu. Gel určený pro místní podávání obsahující peptid OM-3 a následující složky byl připraven následovně:

Složka	% hmotnostní
OM-3	1,0
Roztok sorbitolu (70 %) USP	10,0
Xylitol NF	3,0
Hydroxypropylmethylcelulóza USP	2,0
Kyselina mléčná USP	0,1
Methylparaben NF	0,18
Propylparaben NF	0,02
Čištěná voda USP Pro doplnění do	100
1N hydroxid sodný nebo	pH 4,2 ±0,2
1N kyselina chlorovodíková pro úpravu na

Methylparaben a propylparaben byly rozpuštěny v horkém pufru s vodným roztokem laktátu (pH 4,2). Hydraoxypropylmethylcelulóza io (HPMC) byla v tomto horkém roztoku dispergována a potom byl přidán sorbitol, xylitol a vodný roztok OM-3. Směs byla ochlazena na pokojovou teplotu, přičemž po ochlazení se stala viskózní.

Příklad 3: Testy antimikrobiálního účinku in vitro

Příklad popisuje výhodné testy pro identifikaci protegrinových peptidů použitelných při způsobech podle vynálezu. Pokud není ···· ♦· ····

·· · φ φ φφ • · • · • Φ φ φ · φ -44 uvedeno jinak, všechna data testů in vitro byla získána s použitím níže popsaných metod. V následujících testech se používá následujícího vybavení, reagencií, zásobních roztoků a kultur.

Mikroorganismus: Escherichia coli ML-35p a vankomycin5 rezistentní Enterococcus faecium (VREF) byly získány od: Dr. Robert Lehrer (UCLA, viz také Lehrer a další, 1988. J. Immunol. Methods 108: 153) a Dr. Gary Schoolnik (Stanford). Mikroorganismy

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Candida albicans (ATCC 1023), S. aureus citlivý na methicillin (ATCC 19636), K. pneumoniae io (ATCC 9997), S. marcescens (ATCC 13880), S. salivarius (ATCC 31067), a Staphylococcus aureus rezistentní na methicillin (ATCC 33591) byly získány z: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD. P. mirabilis byl izolovaný kmen získaný z lícního vaku křečka.

Mikroorganismy z jiných zdrojů, jako například klinické izoláty, 15 mohou být v těchto popisovaných testech používány zaměnitělně s výše popisovanými mikroorganismy.

Média a reagencie:

Trypticase Sov Agar (TSA; Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, BBL # 4311768): rozpustit 40 g v 1 L deionizované vody, autoklávovat 20 20 min při 121 °C.

Trypticase Sov Broth (TSB; Beckton-Dickinson, Cockeysville, MD, BBL # 4311768): rozpustit 30 g v 1 I deionizované vody, autoklávovat 20 min při 121 °C a skladovat při pokojové teplotě.

2X Trypticase Sov Broth (2X TSB): rozpustit 60 g v 1 I 25 deionizované vody, autoklávovat 20 min při 121 °C a skladovat při pokojové teplotě.

Glycerol (20 % objemových): smísit 20 ml glycerolu s 80 ml deionizované vody, sterilizovat filtrací filtrem 0,20 pm a skladovat při pokojové teplotě.

- 45 Monobazickv fosfátový pufr (100 mM): rozpustit 13,7 g monobazického fosforečnanu sodného (Fisher # S368-500) v 1 I deionizované vody. Filtrovat sterilizací filtrem 0,20 pm a skladovat při pokojové teplotě.

Dibazickv fosfátový pufr (10é mM): rozpustit 14,2 g dibazického fosforečnanu sodného (Fisher # S374-500) v 1 I deionizované vody. Sterilizovat filtrací filtrem 0,45 pm a skladovat při pokojové teplotě.

Fyziologicky roztok pufrovaný fosfátem (PBS; 10 mM fosfát, 100 mM NaCl, pH 7,4): smísit 15 ml dibazického fosfátového pufru (100 mM), 5 ml monobazického fosfátového pufru (100 mM), 4 ml NaCl (5 M) a 176 ml deionizované vody. V případě potřeby nastavit pH, sterilizovat filtrací filtrem 0,45 pm a skladovat při pokojové teplotě.

Fosfátový pufr (100 mM, pH 6,5): smísit 40 ml dibazického fosfátového pufru (100 mM) se 160 ml monobazického fosfátového pufru (100 mM). V případě potřeby nastavit pH, sterilizovat filtrací filtrem 0,45 pm a skladovat při pokojové teplotě.

Tekuté testovací médium (LTM): asepticky spojit následující sterilní složky: 10 ml fosfátového pufru (100 mM, pH 6,5), 1,0 ml TSB, 2 ml NaCl (5 M) a 87 ml deionizované vody. Skladovat při pokojové teplotě.

Kyselina octová (0,01 % objemových): smísit 10 pl kyseliny octové se 100 ml sterilní deionizované vody.

Aqaróza: smísit 1 g agarózy (Sigma # S6013) v 80 ml deionizované vody, autoklávovat 20 min při 121 °C.

Agarózové podložně médium: spojit 10 ml fosfátrového pufru (100 mM, pH 6,5), 1,0 ml TSB, 2 ml NaCl (5 M) a 7 ml deionizované vody s 80 ml agarózy zahřáté na 50 °C).

x TSB agarózové vrchní médium: rozpustit 60 g TSB a 10 g agarózy v 1 I deionizované vody, rozplnit v alikvotech 100 ml na • ·· · • · · ·· · · · · · • ··· · · · » · ·· i · . · · · ♦ ··· ♦ ♦ • · w · · · ♦ ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

-46 láhev, autoklávovat 20 min při 121 °C a skladovat při pokojové teplotě.

Příprava šikmých aqarů s mikroorganismy: Každý kmen byl kultivován na TSA. Izolované kolonie byly přeneseny do TSB (10 ml ve sterilních Erlenmeyerových baňkách 50 ml) s použitím sterilní jednorázové kličky a baňky byly inkubovány při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) za třepání (200 min'¹) po dobu 16 až 18 hod.

Kultury byly zředěny v poměru 1 : 1 20 % sterilním glycerolem a skladovány jako alikvoty 1,0 ml při - 80 °C. Pro denní inokulum byla tekutina přenesena z rozmražené lahvičky s použitím sterilní kličky a rozetřena na povrch šikmých agarů TSA. Zkumavky uzavřené šroubovacím uzávěrem byly inkubovány přes noc a skladovány při 4 °C až po dobu 1 měsíce.

Příprava inokula

1. Odstranit uzávěr ze zkumavky a lehce se dotknout sterilní kličkou oblasti s hustým nárůstem na šikmém agaru TSA.

2. Zaočkovat 10 ml TSB (50 ml baňka) a inkubovat baňku na třepačce 18 hod (přes noc) při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) při 200 min'¹.

3. Zředit v kyvětě 50 pl kultury rostoucí přes noc v poměru 1 : 20 TSB a měřit absorbanci při 600 nm (A₆oo) s použitím TSB jako reference. Hodnota A₆oo zředěné kultury by měla být mezi 0,1 až 0,4.

4. V 250 ml Erlenmeyerově baňce zředit 50 μΙ kultury rostoucí přes noc 1 : 1000 TSB (bakterie) nebo 1 : 100 TSB (kvasinky).

5. Inkubovat baňku na vodní třepačce při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) při 200 min'¹ po dobu přibližně 2 až 3 hod až do φ φφ φ ·· 9999 • φ Φ φ · Φ Φ Φ Φ Φ Φ 9 • Φ φφ· · · ·

ΦΦΦ ΦΦΦ ·· ♦ ·· *’

- 47 dosažení logaritmické fáze, tj. až do dosažení hodnoty A₆oo v kultuře mezi 0,200 a 0,400 bez dalšího ředění.

6. Převést 25 ml kultury v logaritmické fázi do sterilní centrifugační kyvety a centrifugovat při 2000 ot/min a teplotě 4 °C

10 min. Odlít supernatant, přidat 25 ml sterilního PBS a resuspendovat centrifugát roztřepáním.

7. Centrifugovat suspenzi při 2000 ot/min a 4 °C po dobu 10 min. Odlít supernatant a centrifugán resuspendovat s 5 ml sterilního PBS.

io 8. Měřit A₆oo neředěné suspenze. Jestliže je absorbance přibližně 0,5, zředit sterilním PBS až do dosažení absorbance mezi 0,100 a 0,500.

9. Stanovit počet životaschopných organismů na ml suspenze (CFU/ml) připravením desetinásobných sériových ředění ve 15 fyziologickém roztoku (0,87 %) rozetřením 100 pl ředění 10⁴, 10⁵ a 10⁶ násobných na plotny TSA, vždy jedno ředění na plotnu. Inkubovat přes noc, počítat počet kolonií a stanovit CFU/ml (dostatečně přesné určení vyžaduje přibližně 30 až 300 kolonií na plotnu).

Příprava zásobních roztoků peptidů

1. Odvážit přibližně 1,0 mg každého testovaného peptidu do sterilní polypropylenové kryozkumavky (1,8 ml).

2. Přidat dostatečné množství kyseliny octové (0,01 %) pro vytvoření zásobního roztoku o koncentraci 1280 pg/ml. Rozplnit zásobní roztok do několika zkumavek, vždy 100 μΙ do zkumavky a skladovat v těsně uzavřeném stavu při - 80 °C.

··«· •9 ···· ·· ·· • · · · · · · · · ♦ • ··· « · · ♦ · ·· • ··· ♦ · · ···· · • · · · · ··· ····*· ·· · ·· ·*

-48 3.1 Test s použitím radiální difúze (MCZ)

Test MCZ používá pro stanovení citlivosti mikroorganismů na různé antimikrobiálni sloučeniny minimální množství testovaných materiálů. Buňky se ponechají narůst do přibližně střední logaritmické fáze a resuspendují se v pufrované agaróze s minimálním obsahem živin. Agaróza (ne agar) se používá v tomto gelu pro zabránění elektrostatickým interakcím mezi antimikrobiálními peptidy a polyaniontovými složkami standardního agaru. Peptidy snadno difundují do gelů z malých jamek a průměr zóny inhibice růstu je úměrný koncentraci peptidů v roztoku (Lehrer a další, 1988, J. Immunol. Methods 108: 153).

Příprava testovacích ploten MCZ

1. Pro každou nalévanou Petriho misku se rozplní 10 ml temperovaného (50 °C) agarózového podložního média do sterilní polypropylénové zkumavky (15 ml). Přidá se 4 x 10⁶ CFU požadovaného kmene do každé zkumavky. Obsah se důkladně promísí trojnásobným převrácením zkumavky. Roztavená agaróza se ihned nalije do Petriho misek.

2. Po ztuhnutí agarózy se použije sterilní jehly (vnitřní průměr 3 mm) pro vyříznutí 16 jamek do agarózy (síť 4x4 náhodně rozmístěná na misce). Pasteurovou pipetou se odstraní agarózové zátky a agaróza se zachytí v láhvi s postranním vývodem připojeným na vakuum.

3. Ze zásobního roztoku peptidů se připraví sériová dvojnásobná ředění (od 128 pg/ml do 0,06 pg/ml) s použitím kyseliny octové (0,01 %) jako diluentu, nebo v případě koncentrací peptidů nižších než 50 pg/ml octanu sodného (10 mM, pH 5) obsahujícího lidský sérový albumin (HSA; 0,1 % hmotnost/objem) jako diluentu.

·· ····

4. Rozplní se 5 μΙ každého sériového ředění do agarózových jamek, jedno sériové ředění na jamku.

5. Rozplní se jako negativní kontroly do jamek diluenty a jako pozitivní kontroly protegrin-1 (US patent No. 5,464,823; 32 pg/ml,

8 pg/ml a 2 pg/ml).

6. Plotny se inkubují při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) po dobu tří hodin.

7. Na povrch každé plotny se rozplní dvakrát TSB agarózové vrchní médium (10 ml), agar se ponechá ztuhnout a plotny se inkubují io v převrácené poloze při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) po dobu 16 až 18 hod.

8. Plotny se prohlížejí a měří se (v mm) průměr zóny inhibice růstu (oblast vyjasnění v okolí každé jamky).

9. Vynese se průměr zóny inhibice růstu (osa Y) proti 15 koncentraci peptidů v jamce (osa X) a získá se nejlépe vyhovující přímka s použitím analýzy lineární regresí. Průsečík přímky proložené body s osou X je minimální koncentrace pro zónu inhibice růstu (MCZ) pro každou koncentraci peptidů.

3.2 Test mikroředěním půdy (Microbroth Dilution (MCB)

Tento test pracuje s velkým počtem vzorků a je ho možno snadněji automatizovat než test MCZ a analýza dat je přímá a jednoduchá. Klíčovým krokem v tomto testu je kombinace mikroorganismů a peptidů v definovaném minimálním systému živného 25 pufru, který minimalizuje interference s biologickými účinky peptidů.

Navíc přítomnost lidského sérového albuminu (HSA) v koncentraci 0,1 % hmotnost/objem k diluentu pro peptid minimalizuje adsorbci peptidů na nádobku.

···· ·· ···· • · ·· • · · · · · · , · · · · · ·· ; · · · ·· · ···· · • 9 9 9 9 · · · ··· ··· ·· * ·· **

- 50 Příprava ploten pro test MCB

1. Rozplní se 100 μΙ buněk v logaritmické fázi (4 χ 10⁵ CFU/ml) v LTM do každé jamky sterilní 96 jamkové mikrotitrační destičky.

2. Ze zásobního roztoku peptidů se připraví sériová 5 dvojnásobná ředění (od 1280 pg/ml do 0,625 pg/ml) s použitím kyseliny octové (0,01 %) jako diluentu, nebo pro koncentraci peptidů nižší než 50 pg/ml, octanu sodného (10 mM, pH 5) obsahujícího lidský sérový albumin (HSA; 0,1 % hmotnost/objem).

3. V triplikátech se rozplní alikvoty (11 μΙ) každého sériového io dvojnásobného ředění do jamek mikrotitrační destičky.

4. Destičky se inkubují při teplotě 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) po dobu 3 hodin.

5. Do každé jamky se přidá 100 μΙ 2 x TSB, obsah se zamíchá a inkubuje se při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) dalších 16 až

18 hodin.

6. Provede se odečtení destiček a vyhodnocení každé destičky na zákal (růst buněk). Často se MRSA oddělí a vytvoří na dně jamky usazeninu. MRSA je možno vyhodnotit umístěním mikrotitrační destičky na stojan a vyšetřením dna jamek s použitím nakloněného

2o zrcadla.

7. Minimální koncentrace potřebná pro inhibici růstu v růstovém médiu (MCB) se definuje jako nejnižší koncentrace peptidů, která inhibuje veškerý viditelný růst. Jestliže se hodnoty MCB pro každý z triplikátů vzorků liší, vypočte se MCB průměrem z výsledků těchto tří vzorků.

8. Minimální koncentrace peptidů vykazující 100 % biocidní účinnost se určí inkubací 10 μΙ alikvotu z každé jamky na destičce TSA po dobu 24 hod při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) (1,5 ml TSA v každé jamce 24-jamkové destičky minimalizuje křížovou

3o kontaminaci).

» ·· · • · · « · ·

- 51 3.3 Test na minimální inhibiční koncentraci (MIC) modifikovanou metodou NCCLS

Výbor The National Committee for Clinical Standards (NCCLS) vyžaduje, aby byly testované sloučeniny připraveny jako zásobní roztoky v půdě Mueller-Hinton Broth („MHB“) při koncentraci 512 pg/ml. Zásobní roztoky se sériově ředí (2 x) v médiu a každé sériové ředění se přidá v poměru 1:1 k médiu obsahujícímu 1 x 10® CFU/ml bakterií (National Commitee on Clinical Laboratory Standards, prosinec 1994), „Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing“, NCCLS Document M100-S5 díl 14, No. 16; Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically, 3. vyd., Approved Standard M7-A3, National Commitee for Clinical Standards, Villanova, PA).

Bylo zjištěno, že protegrinové peptidy se sráží v MHB v koncentracích větších než 128 pg/ml. Podle protokolu NCCLS by byla tedy získána sériová dvojnásobná ředění obsahující méně peptidu než je vypočteno, čímž by došlo k získání chybných vysokých hodnot MIC.

Aby se předešlo tomuto problému, používá se pro určování MIC protegrinových peptidů s výhodou následující modifikované metody NCCLS. Při této metodě se zabrání srážení přípravou koncentrovaných (10 x) zásobních roztoků testovaného peptidu v pufru, který je vhodný pro peptid a který nemá škodlivé účinky na mikroorganismy (0,01 % objemových kyselina octová, 0,1 % hmotnost/objem HSA) a tento zásobní roztok se ředí 1:10 do MHB obsahující mikroorganismy.

• Φ φφφφ ···· φφ φφ φ φ φ φφφφ φφφ φ φ ·· • φ φ φ φφφ φ * φφφ φφφ φφ φ ·· ··

-52 Příprava testovacích destiček MIC

1. Připraví se čerstvá kultura kultivovaná přes noc testovacích organismů v Meuller-Hintonově půdě (MHB); Becton-Dickinson, Cockysville, MD, BB2 #11443).

2. Kultura se zředí na koncentraci přibližně 4 x 10⁵ CFU/ml čerstvým MHB a rozplní se alikvoty po 100 μΙ do každé jamky sterilní 96-jamkové mikrotitrační destičky.

3. Ze zásovního roztoku peptidu se připraví sériová dvojnásobná ředění (z 1280 pg/ml na 0,625 pg/ml) s použitím kyseliny io octové (0,01 %) jako diluentu, nebo pro koncentrace peptidu nižší než pg/ml se použije jako diluentu octan sodný (10 mM, pH 5) obsahující lidský sérový albumin (HSA) nebo bovinní sérový albumin (BSA) v koncentraci 0,1 až 0,2 % hmotnost/objem.

4. Rozplní se triplikáty po 11 pl každého sériového ředění do jamek mikrotitrační destičky.

5. Destičky se inkubují 16 až 18 hodin bez aerace při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky).

6. Destičky se vyšetřují a každá jamka se vyhodnotí na zákal (růst buněk). Často se vysráží MRSA a vytváří na dně jamky usazeninu. MRSA může být vyhodnocena umístěním mikrotitrační destičky na stojan a prohlédnutím dna jamek s použitím šikmého zrcadla.

7. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) je definována jako nejnižší koncentrace peptidu, která inhibuje veškerý viditelný růst.

Jestliže se hodnoty MIC pro každý z triplikátů liší, získá se hodnota MIC vypočtením průměrů výsledků těchto tří vzorků.

8. Minimální koncentrace peptidu se 100 % biocidní aktivitou se určí inkubací alikvotu 10 pl z každé jamky na destičce TSA po dobu hodin při 37 °C (bakterie) nebo 30 °C (kvasinky) (1,5 ml TSA

v každé jamce 24-jamkové destičky minimalizuje křížovou kontaminaci).

99999

99

9999 •·

9 9 99 ·· 9999 •·

99.

·· • · • · ·· ·· · ·· • ·· ·· ··

3.4 Kineticky test na baktericidní účinek

Pro určení rychlosti, jakou protegrinový peptid usmrcuje cílový mikroorganismu stejně jako pro určení, jestli je daný peptid baktericidní nebo bakteriostatický, se používá následujícího testu.

Protokol testu io 1. Do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky se rozplní roztok 200 μΙ buněk v logaritmické fázi v LTM (4 x 10⁵ CFU/ml).

2. V čase T = 0 se přidá 22 μΙ peptidu s koncentrací 1280 pg/ml k jamce A1 a obsah se zamíchá.

3. Po 30 s se přidá 22 μΙ druhé koncentrace peptidu do další 15 jamky (A2) a opět se důkladně zamíchá.

4. Postup se opakuje s přídavkem peptidu vždy v odstupu 30 s, dokud nejsou přidány všechny koncentrace peptidu. Typicky se získá dobrá srovnávací křivka usmrcování mikroorganismů čtyřnásobným sériovým ředěním zásobního peptidu (tj. 1280, 320, 80, 20 a 5 pg/ml

2o peptidu zředěného 1:10 do každé jamky). Do jedné jamky se přidá 22 μΙ 0,01 % kyseliny octové jako kontrola.

5. V čase T = 15 min se jamka A1 trojnásobným nasátím rozmíchá a 20 μΙ se převede do prázdné sterilní Petriho misky (100 mm x 15 mm).

6. Rychle se přidá 20 ml temperovaného (50 °C) TSA a plotna se mírně naklání pro zamíchání.

7. Kroky 5 - 6 se opakují, dokud nejsou vysety všechny koncentrace peptidů.

-54·· ···· •·

9· • 999

9 9 99

9 999

9 999 99

9 99

9999

8. Pro kontrolní jamku se zředí vzorek 1:100 LTM a vyseje se 50 μΙ ředění pro získání přesných stanovení počtu CFU.

9. Po ztuhnutí agaru se plotny převrátí a inkubují při 37 °C (bakterie), 30 °C (kvasinky) po dobu 18-24 hodin.

10. Kroky 5 až 9 se opakují pro všechny koncentrace peptidů a kontrolní vzorky v časech T = 30, 60, 120 a 240 min.

11. Spočítá se počt CFU na plotnu a odhadne se snížení CFU pro každou koncentraci peptidu. Aby bylo možno vyhodnotit účinek s použitím tohoto testu, peptid musí snížit CFU alespoň o jeden řád (tj.

io alespoň 800 CFU na plotnu). Ačkoliv tyto počty jsou vyšší než se doporučuje z hlediska přesnosti (30 - 300 CFU/plotnu), řádové změny v získatelných CFU naznačují výrazný baktericidní účinek.

12. Pro získání srovnávacích křivek usmrcování se vynese logaritmus částečného přežití proti koncentraci peptidu.

Příklad 4

Antimikrobiálni účinnost PG-1 (SEQ ID No. 1) in vitro

Antimikrobiálni účinnost PG-1 (stejně jako jiných protegrinů) se popisuje ve WO 95/03325 (zveřejněná 2. 2. 1995). Stručně, PG-1 má 2o široké spektrum antimikrobiálni účinnosti, přičemž extrémně účinná je proti L. monocytogenes, kmen EGD, C. albicans, S. aureus, K. pneumoniae 270, P. aeruginosa, S. typhimurium, H. capsulatum, Mycobacteríum avium-intracellulare a Mycobacterium tuberculosis. Pozorování antimikrobiálního účinku se provádí v přítomnosti 90 % 25 fetálního telecího séra.

• ·

-55 Příklad 5

Antimikrobiální účinnost OM-3 (SEQ ID No. 3) proti patoqenům spojeným se zánětem ústní sliznice

Tento příklad ukazuje antimikrobiální účinnost nativní formy 5 výhodného peptidů OM-3 proti patogenům spojeným se zánětem ústní sliznice. Ačkoliv z ústní dutiny a hrtanu bylo izolováno více než 200 druhů mikroorganismů, u jednotlivců převažují na povrchu ústní dutiny specifické podskupiny (Liljemark a další, 1994, v: Oral mícrobioloqy and Immunoloqy, str. 120 - 128, Nisengard and Newman, io red., Saunders Co., Philadelphia). Ve slinách a na ústní sliznici nejvíce převažují a a nehemolytické streptokoky. (Loeshe, 1994, v: Oral microbioloqy and Immunoloqy, str. 307 - 315, Nisengard and Newman, red., Saunders Co., Philadelphia). Reprezentativní druh v této skupině, S. salivarius, byl testován testem radiální difúze 15 popsaným výše (s tím rozdílem, že k vrchní půdě bylo přidáno v koncentraci 10 % fetální telecí sérum) pro určení vnímavosti k peptidů OM-3.

Zatímco nejběžnější flórou ústní dutiny jsou grampozitivní bakterie, jsou také přítomna malá množství gramnegativních bakterií 20 a hub. Pro určení účinnosti OM-3 proti širokému rozmezí potenciálních patogenů byly určovány s použitím modifikované metody NCCLS popsané výše MIC (s a bez HSA nebo BSA) peptidů proti řadě patogenů, včetně methicillin senzitivních a rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (MSSA popřípadě MRSA), vankomycin 25 rezistentních E. faecium (VREP), P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, Serratia marcescens, Próteus mirabilis a C. albicans.

• ···· ·· ···· ·· ·· ··· · · · ···· ···· · · · · · · · • · <· · O 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

999 999 99 9 99 99

5.1 Výsledky

Lineární regresní analýza zóny inhibice růstu pro S. salivarius vynesená proti koncentraci OM-3 ukázala, že minimální koncentrace pro inhibici růstu (MCZ) pro OM-3 je 0,38 pg/ml.

MIC získané pro OM-3 se uvádějí v tabulkách 4 a 5 níže.

V tabulce 4 představují hodnoty MIC průměr ze tří stanovení koncentrace v první jamce bez růstu. V tabulce 5 představují data průměr ze tří stanovení pro každý jednotlivý testovaný kmen. Obecně byly hodnoty MIC získané pro každý organismus stejně jako minimální io baktericidní koncentrace (MBC) pozorované pro stejné organismy (hodnoty nejsou uvedeny.

Tabulka 4

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) OM-3 s použitím HSA nebo BSA

Mikroorganismus	MIC (pg/ml
MSSA	1
MRSA	4
VREF	0,25
P. aeruginosa	1,3
E. coli	0,25
K. pneumoniae	1
S. marcescens	16
P. mirabilis	128
C. albicans

• ·· ·

-57 Tabulka 5

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) OM-3

Testovací médium	Typ organism u	Rod - druh	Počet kmenů	MIC nízká	(pg/ml vysoká
Mueller	Gram-	Enterococcus	1	2
Hinton Broth	pozitivní	faecalis VSE
		Enterococcus	2	2	4
		faecalis VSE
		Enterococcus	3	0,25	0,5
		faecium VRE
		Staphylococcus	16	1	4
		aureus MSSA
		Staphylococcus	3	1	2
		aureus MRSA
		Staphylococcus	14	0,13	0,8
		epidermidis MSSE Staphylococcus epidermidis MRŠE	2	1
		Staphylococcus	2	0,2	1
		salivarius
	Gram-	Acinetobacter	4	0,06	2
	negativní	calcoaceticus
		Escherichia coli	5	0,25	1
		Klebsiella	4	1	5
		pneumoniae
		Pseudomonas	18	1	8
		aeruginosa
		Serratia	16	16	>256

marcescens

Mueller Hin-	Gram-	Corynebacterium	1	0,25
ton Broth s	pozitivní	minutissimum
2% lyžované
koňské krve *		Corynebacterium pseudodiphtheriae	1	0,25
		Corynebacterium	1	0,25
		striatum Corynebacterium skupina G1	1	0,25
		Corynebacterium	16	1,3	16
		skupina G2 Streptococcus pneumoniae	2	16	27
		Streptococcus mitis (10 pro test) Streptococcus sanguis	14	4	64
	Gram-	Haemophilus	15	1	8
	negativní	influenzae
		Moraxella sp.	12	0,2	0,8
		Neisseria	1	8
		meningitidis
Mueller		Candida albicans	1	8

Hinton Broth *Hodnoty MIC v půdě Mueller Hinton Broth obsahující lyžovanou koňskou krev jsou při stanovení MIC pro MRSA přibližně 4 - 8 x vyšší v důsledku intererence pocházející ze složek krve: 4 v MHB; 16 v MHB + LHB.

• ·

- 59 Příklad 6

Baktericidní účinnost OM-3 proti přirozené flóře lidských slin

Tento příklad ukazuje schopnost výhodného peptidů OM-3 snižovat počty CFU bakterií nalézaných ve vzorcích normálních lidských slin.

6.1 Experimentální protokol

Peptid OM-3 (20 mM octan sodný, pH 5) nebo placebo (vehikulum) bylo smíseno v poměru 1:1 se slinami. V čase 1, 2, 4, 8 a 16 min po smísení byly alikvoty vysety na pevnou půdu Trypticase Soy Agar obsahující 10 % fetálního bovinního séra a plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C.

6.2 Výsledky

Výsledky experimentu jsou ukázány na obr. 1. Data jasně ukazují, že peptid OM-3 usmrcuje orální mikroflóru v průběhu 2 minut, v závislosti na jeho koncentraci. Protože sliny obsahují mnoho negativně nabitých glykoproteinů jako je mucin, které mohou peptid vázat (Bansil a další, 1995, Annu. Rev. Physiol. 57: 635 - 57), pro účinné snížení přirozené mikroflóry byly v těchto experimentech vyžadovány vyšší koncentrace OM-3 než v experimentech popsaných v příkladu 5. Placebo ve formě vehikula nemělo na CFU žádný vliv.

-60 Příklad 7

Vliv slin na antimiklrobiální účinnost

Tento příklad ukazuje vliv slin na antimikrobiální účinnost různých protegrinových peptidu, kde jako měřítko byla použita radiální 5 difúze a snížení počtu CFU.

7.1 Protokol experimentu

Pro experiment s radiální difúzí bylo použito testu radiální difúze podle Qu, X-D a další, Infect. Immun. (1996) 6: 1240 - 1245 s tím io rozdílem, že médium v podložním agaru obsahovalo fosfátový pufr v koncentraci 10 mM, pH 6,5, 100 mM NaCl, 1 % TSB a 1 % agarózu. Médium ve vrchní vrstvě obsahuje 10 mM fosfátový pufr pH 6,5, 100 mM NaCl, 2 x TSB a 1 % agarózu. Peptidy byly zředěny ze zásobního roztoku 10 x připraveného v 0,01 % kyselině octové buď 15 10 mM acetátovým pufrem (pH 5) nebo slinami.

Pro test snížení CFU Obsahovalo počáteční inokulum přibližně 4x 10⁷ CFU/ml slin. Peptidy (320 pg/ml) byly rozpuštěny v 0,01 % kyselině octové a přidány v množství 1/10 objemu ke slinám.

2o 7.2 Výsledky

Pro test radiální difúzí jsou výsledky uváděny jako minimální koncentrace požadovaná pro vytvoření detekovatelné zóny vyjasnění, nebo MCZ - tj. hodnoty extrapolované k ose X, kde koncentrace peptidu se vynáší proti průměru zóny. Výsledky testu radiální difúze 25 jsou ukázány v tabulce 6; snížení počtu CFU je uvedeno v tabulce 7. Velký počet testovaných peptidů ukázal v přítomnosti slin srovnatelnou nebo dokonce zvýšenou účinnost. Mnoho testovaných peptidů poskytovalo snížení CFU v ústech větší než dva řády dokonce i při nízké koncentraci 320 pg/ml (0,032 % hmotnostních.

• ·

Tabulka 6

Vliv diluentu na MCZ (ul/ml) proti E. coli 004

Sekvence	Acetátový pufr	Sliny
RGGRLCYCRRRFCVCVGR	0,48	1,14
RGGGLCYARGWIAFCVGR	4,16	38,30
RGGGLCYKRGWIKFCVGR	2,71	0,56
RGWGLCYCRPRFCVCVGR	0,39	12,60
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*	0,59	1,45
LCYCRRRFCVCF	4,14	6,11
RLCYCRPRFCVCV	3,36	6,83
LCYCRGRFCVCVGR	2,37	5,68
RLCYCRPRFCVCVGR	1,60	6,86
RWRLCYCRPRFCVCV	1,04	39,00
RGWRACYCRPRFCACVGR	0,71	1,84
GWRLCYCRPRFCVCVGR	0,86	47,50
RLCACRGRACVCV	13,70	9,76
WLCYCRRRFCVCV*	5,05	36.00
RLCYCRXRFCVCV (X=Gly)	2,43	2,54
RLCYCRPRFCVCVGR*	3,65	12,80
RGGGLCYCRPRFCVCVGR*	3,51	11,90
RRCYCRRRFCVCVGR	3,02	8,07

Peptidy označené * jsou ve formě kyseliny a všechny ostatní jsou ve formě amidu.

• ·

Tabulka 7

Snížení CFU endogenní flóry ve slinách po 15 min expozici peptidů (320 iig/ml ··· • «* · · • ·

Sekvence	Snížení CFU
RGGRLCYCRRRFCVCVGR		1,80
RGGRLCYCRPRFCVCVGR		2,04
RGGGLCYKRGWIKFCVGR		1,09
RGWGLCYCRPRFCVCVGR		0,53
RLCYCRPRFCVCVGR		0,53
RGGGLCYTRPRFTVCVGR		1,05
RGGRLCYCRRRFCVCVGR*		1,25
LCYCRGRFCVCVGR		1,02
RWRLCYCRPRFCVCV		0,22
RGWRLCYCRPRFCVCVGR		0,38
RGWRACYCRPRFCACVGR		0,28
GWRLCYCRPRFCVCVGR		0,26
XCYCRRRFCVCV	(X=Cha)	0,25
WLCYCRRRFCVCV*		0,16
RLCYCRXRFCVCV	(X=MeGly)	3,43
RLCYCRPRFCVCVGR*		0,66
RGGGLCYCRPRFCVCVGR*		1,51
RXCFCRPRFCVCV	(X=Cha)	0,71
RWCFCRPRFCVCV		0,52
LCXCRRRXCVCV	(X=Cha)	0,23
RGGRLCYCRRRFCVC		0,86
LCYTRRRFTVCV		0,64
RRCYCRRRFCVCVGR		0,98
RLCYCRRRFCVCV*		0,21
RXRLCYCRZRFCVCV	(X=Cha) (Z=MeGly)	<0,6
RGWRLCYCRGRXCVCV	(X=Cha)	<0,6

-63 Tabulka 7 - pokračování

Snížení CFU

Sekvence

RGLRXCYCRGRFCVCVGR	(X=Cha)	1,65
RGWRGCYKRGRFKGCVGR		<0,97
RGWRGCYCRXRFCGC	(X=MeGly)	<0,6

RGGLCYCRGRFCVCVGR

2,52

RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) 0,65

Peptidy označené * jsou ve formě kyseliny a všechny ostatní jsou ve formě amidu.

Příklad 8

Účinek amidovaného OM-3 na snížení orální mikroflóry u křečků

Tento příklad ukazuje účinnost výhodného peptidu OM-3 při sníženi CFU přirozené ústní mikroflóry v lícních vacích křečků.

8.1 Protokol experimentu

Peptid OM-3 (1 mg/ml nebo 5 mg/ml ve vodném prostředku obsahujícím hydroxypropylmethylcelulózu) byl vložen do lícního vaku křečků v množství 0,5 ml 3 x denně po dobu čtyř dnů. Skupiny se stejnou dávkou se vždy skládaly ze čtyř křečků. Na počátku druhého dne dávkování byly provedeny výtěry vaků přibližně 4 nebo 15 hod po ošetření. Výtěry byly vloženy do kultivačních zkumavek obsahujících 1 ml 0,87 % (hmotnost/objem) NaCl a 0,1 % (hmotnost/objem) Tween80 a vychlazeny. Všechny kultivační zkumavky byly do 24 hodin od odběru důkladně zamíchány. Po míchání bylo rozetřeno na standardní plotny s krevním agarem vždy 0,1 ml nezředěného vzorku a 0,1 ml alikvoty dvou stonásobných sériových ředění. Po inkubaci při 37 °C po dobu alespoň 24 hod bylo spočítáno množství CFU na plotnu.

8.2 Výsledky

Výsledky experimentu jsou uvedeny v obr. 2. V obr. 2 představují prázdné čtverečky ošetření koncentrací peptidu 1 mg/ml;

plné čtverečky ošetření koncentrací 5 mg/ml. Šipky na ose X označené „Rx“ označují doby, ve kterých byl aplikován peptid.

Původně je množství CFU u neošetřených křečků obvykle mezi 10⁶ a 10⁷ na stěr. Ve srovnání s původními kontrolními hodnotami bylo vždy přítomno 1000 až 10 000 násobné snížení (3 - 4 řády) počtu orálních CFU 4 hodiny po aplikaci OM-3. 15 hodin po ošetření došlo k očekávanému novému nárůstu ústní flóry. S látkou PG-1 byly získány podobné výsledky.

Příklad 9

Vliv PG-1 na zánět ústní sliznice u křečků

Model křečka pro testování léčebných postupů účinných proti zánětu ústní sliznice byl vyvinut autory : (Sonis a další, 1990, Oral Surq. Oral Med. Oral Pathol. 69: 437 - 443; Sonis a další, 1995, Oral Oncol. Eur. J. Cancer 31B: 261 - 266). V tomto modelu se poškození ústní sliznice vytvářejí podáváním chemoterapeutického prostředku 5fluoruracilu (5-FU) zvířatům a následující mechanickou abrazí lícního vaku. Vzhled a časový průběh vzniklých poškození ústní sliznice křečků těsně napodobují změny pozorované v klinických situacích u lidí. Tento experiment ukazuje schopnost nativního PG-1 snižovat vážnost příznaků zánětu ústní sliznice v tomto modelu.

9,1 Experimentální protokol

Třiceti samcům křečků bylo ve dnech 1 a 3 intraperitoneálně podáváno 60 mg/kg 5-FU a v den 5 byla potom provedena povrchová abraze levého lícního vaku. Křečci byli potom náhodně rozděleni do • ···· ·· ·· · · · ····· • ··· · · · * · ·· • · · · · · · ··· · · • · · i · · · · ···«·· ·· · · · · ·

-65 dvou skupin a počínaje dnem 6 byli léčeni přímou aplikací 0,5 ml vehikula jako placeba (2 % methocel K4M, 10 % propylenglykol, 10 % glycerol, 10 mM acetátový pufr) nebo prostředku obsahujícího PG-1 (koncentrace 2 mg/ml ve stejném vehikulu) na sliznici levého vaku, 6 x denně po dobu 11 dnů. Hodnocení zánětu bylo provedeno odstupňováním kódovaných fotografií lícního vaku křečka s použitím standardizované desetibodové škály vážnosti onemocnění (Sonis a další, 1995, výše).

9.2 Výsledky

Výsledky experimentu jsou uvedeny v obr. 3 a 4; hodnocení zánětu jsou uvedena v obr. 3; procenta změny tělesné hmotnosti v obr. 4; na obr. 3 a 4 označují prázdné čtverečky ošetření s použitím vehikula jako placeba; plné čtverečky označují ošetření PG-1. Hvězdičky v obrázcích označují statistickou významnost (p<0,05).

Jak je vidět v obr. 3 nejvyšší hodnoty vážnosti onemocnění byly ve skupině ošetřené PG-1 sníženy. Navíc léčení PG-1 umožnilo zvířatům, normálně přibírat na váze oproti kontrolním zvířatům, která váhu ztrácela, pravděpodobně v důsledku těžkých poškození ústní sliznice inhibujících příjem potravy (obr. 4).

Počet CFU získaný po 2, 6 a 10 dnech léčení se uvádí v tabulce 8 níže. Orální kultury odebírané po 2, 6 a 10 dnech léčení PG-1 ukázaly alespoň stonásobné snížení (dva řády) CFU ústní mikroflóry proti kontrolám s vehikulem. Tato studie s PG-1 ukazuje korelaci mezi snížením počtu CFU v ústech a klinickým zlepšením.

·· ····

-66 Tabulka 8

Snížení počtu životaschopných mikroorganismů v ústech (Colonv Forminq Units)

Den ošetření	CFU vehikula	PG-1 CFU	Snížení CFU
2	9,33 x 105	8,9 x 103	2,02
6	6,457 x 106	2,9 x 104	2,33
10	4,786 x 106	3,2 x 104	2,18

Příklad 10

Účinek OM-3 na zánět ústní sliznice u křečků

Tento příklad ukazuje schopnost OM-3 snižovat vážnost zánětu ústní sliznice u křečků v předklinickém modelu.

io 10.1 Protokol experimentu

Postup zánětu ústní sliznice v lícním vaku křečků byl vyhodnocován po místním podání vehikula jako placeba nebo prostředku s OM-3. Pro porovnání byl podáván glukonát chlorhexidinu, což je prostředek, který byl používán pro léčení zánětů 15 ústní sliznice.

Samci zlatých syrských křečků byli náhodně rozděleni do čtyř skupin po dvaceti zvířatech, která byla různě ošetřována. Zánět ústní sliznice byl indukován podáváním 80 mg/kg 5-FU intraperitoneálně křečkům ve dnech 1 a 4 a povrchovým podrážděním sliznice v den 5. 2o Křečkům bylo podáváno 0,5 ml testovaného prostředku místním podáním do levého lícního vaku 6 x za den ve dnech 5 až 10 a 5 x v den 11. Testovacími prostředky byly gel HPMC jako placebo (skupina 1; kontroly s vehikulem), gel HPMC s 0,5 nebo 2,0 mg/ml OM-3 (skupiny 3, popřípadě 4), nebo 1,2 mg/ml chlorhexidinglukonátu ····

-67(skupina 2). Dávky OM-3 byly 0,25 a 1,0 mg/aplikaci; dávka chlorhexidinu byla 0,6 mg/aplikaci. Levý lícní vak každého křečka byl obrácen ven a fotografován ve dnech 6, 8, 10, 11, 12, 13 a 15. V závěru období pozorování byly fotografie zakódovány a nezávisle vyhodnoceny pod kódovým označením třemi vyškolenými osobami. Tělesné hmotnosti byly denně zaznamenávány ode dne 5 až do dne 18. Ve třetím a sedmém dnu ošetření byly prováděny výtěry levého lícního vaku pěti křečků ve skupině aplikátorem s bavlněným koncem pro získání vzorků pro kultivaci. CFU byly určeny suspendováním kultur ve fyziologickém roztoku a vysetím suspenzí na standardní plotny s krevním agarem. Zvířata, která přežila, byla usmrcena v den 18.

10.2 Výsledky

Výsledky experimentů jsou uvedeny v obr. 5 a 6. Obr. 5 je grafické znázornění postupu zánětu ústní sliznice u každé ze čtyř ošetřovaných skupin. Obr. 6 je grafické znázornění změny tělesné hmotnosti u každé z těchto čtyř skupin. U obou těchto obrázků znamenají trojúhelníčky ošetření vehikulem jako placebem; čtverečky znamenají ošetření chlorhexidinem, kosočtverce znamenají 0,25 mg OM-3 na aplikaci a kroužky 1,0 mg OM-3 na aplikaci. Hvězdičky označují statistickou významnost (p<0,05). CFU stanovené třetí a sedmý den ošetření u každé ze čtyř skupin jsou uvedeny v tabulce 9 níže.

-68 Tabulka 9

CFU v ústech křečka se zánětem ústní sliznice

Ošetření	Ošetření den 3	Ošetření den 7
	(prům. CFU/agar)	prům. CFU/agar
Vehikulum	4,07 x 10* 5 6 * * * io * * * * 15	8,85 x 105
Chlorhexidin	2,48x103	6,32 x 104
OM-3 (0,25 mg)	7,29 x 103	3,78 x 103
OM-3 (1,0 mg)	3,37 x 102	4,76 x 102

Na počátku studie v den 11a poslední den pozorování (den 15) bylo hodnocení zánětu výrazně nižší (p<0,05) u křečků ošetřovaných

OM-3 ve srovnání se skupinou ošetřovanou vehikulem. Nebyly žádné zřejmé rozdíly v průměrném hodnocení mezi zvířaty, která dostávala

0,25 nebo 1,0 mg OM-3 na podání (0,5, popř. 2,0 mg/ml). U křečků, kterým byl podáván chlorhexidin směřovalo hodnocení zánětu ústní io sliznice k nižším hodnotám než u kontrol s vehikulem ve dnech 11, 12 a 13; žádné z rozdílů však nebyly statisticky významné. Přírůstek střední tělesné hmotnosti u křečků, kterým bylo podáváno 0,25 mg

OM-3 na aplikaci směřoval k vyšším hodnotám než u zvířat, kterým byly podávány kontroly ve dnech 9 až 18. Rozdíly byly statisticky významné ve dnech 10, 16, 17 a 18.

Počty CFU v ústní dutině zvířat léčených OM-3 byly obecně sníženy v závislosti na koncentraci podávané látky. Přežívání bylo obecně porovnatelné u všech ošetřovaných skupin.

• · ··♦· • ··· · · · · · ·· • · < · · · ♦ ♦·· * · • ···· · · · ·♦· ··· ·· 9 99 99

- 69 Příklad 11

Účinek OM-3 na zánět ústní sliznice u křečků v závislosti na podané dávce

Tento příklad ukazuje účinek OM-3 (SEQ ID No. 3) použitého při léčení zánětu ústní sliznice v preklinickém testu na modelu křečka v závislosti na podané dávce.

11.1 Protokol experimentu

Samci zlatých syrských křečků byli náhodně rozdělení do čtyř skupin s různým ošetřením vždy po 20 zvířatech.

Zánět ústní sliznice byl u křečků indukován intraperitoneální dávkou 5-fluoruracilu (5-FU) ve dnech 1 a 3 následovanou povrchovým podrážděním sliznice ve dnech 5 a 6. Křečkům bylo podáváno 0,5 ml testovaného prostředku místní aplikací do levého lícního vaku 6 x denně počínaje dnem 5 až do dne 12. Vehikulum a prostředky obsahující 0,12, 0,5 a 2,0 mg OM-3 na ml byly podávány v dávkách 0 (vehikulum), 0,06, 0,25 a 1,0 mg OM-3 na jedno podání. Levý lícní vak každého křečka byl obrácen ven a fotografován ve dnech 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15 a 17 pro hodnocení zánětu. Tělesné hmotnosti byly zaznamenávány denně počínaje dnem 5 až do dne 17. Vzorky pro kultivaci získané 1 a 3 hodiny po podání dávky 4. a 7. den ošetření byly použity pro stanovení počtu bakterií na sliznici. Zvířata, která přežila, byla usmrcena v den 17.

11.2 Výsledky

Ošetření křečků OM-3 mělo za následek snížení vážnosti a trvání zánětu ústní sliznice v závislosti na podané dávce. Vzhledem ke kontrolám s vehikulem byly výsledky hodnocení mukositidy podstatně nižší (p<0,05) u všech skupin ošetřených OM-3 v den 6, « ··· · · · · · ·· • · · · · · · ··· · · • ···♦ ·»· ······ ·« * · · ··

- 70 tedy jeden den po začátku léčení. Výsledky hodnocení zánětu ústní sliznice byly také výrazně nižší v den 8 u křečků, kterým bylo podáno 0,25 mg OM-3 na jedno podání a byly významně nižší ve dnech 8 a 9 u křečků, kterým bylo podáno 1,0 mg OM-3 na podání. U křečků, kterým bylo podáno 1,0 mg OM-3 na jedno podání, byl přírůstek tělesné hmotnosti výrazně vyšší než u kontrol s vehikulem ve dnech 11, 13, 14 a 16. Počet životaschopných mikroorganismů (CFU) v ústech zvířat, kterým bylo podáno 0,06 až 0,25 mg OM-3 na jedno podání, byl snížen v závislosti na podané dávce. Porovnatelné snížení v počtu CFU v ústech bylo přítomno u zvířat se střední a vysokou dávkou. Ve čtvrtém dnu léčení byly střední počty bakterií u kontroly s vehikulem, u nízké dávky, střední dávky a vysoké dávky 3,4 x 10⁵, 9,4 x 10², 1,6 x 10¹ a 2,3 x 10¹ v době 1 hod po podání dávky a 1,4 x 10⁶, 6,8 x 10³, 8,8 x 10¹ a 3,3 x 10¹ 3 hod po podání dávky. Podobné výsledky pro OM-3 při snížení CFU byly pozorovány v den 7 ošetřování, 1 a 3 hodiny po podání dávky. Ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem bylo přežívání obecně vyšší ve skupinách ošetřovaných OM-3.

Předkládaný vynález nemá být omezován rozsahem provedení uvedených v příkladech, která jsou zamýšlena pouze jako ilustrace jednotlivých hledisek vynálezu. Odborníkům v oboru budou samozřejmě z předcházejícího popisu a odpovídajících obrázků zřejmé různé modifikace vynálezu navíc k popisovaným provedením. Také tyto modifikace mají spadat do rámce přiložených nároků.

Zastupuje:

·· ·· · · · · · · · ···· ··· ···· • · · · · · ·· ·♦ ···· · • · · · · · · · · • · · · ····· · · · ·

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek pro místní orální podávání antimikrobiálního peptidů, vyznačující se tím, ž e jako účinnou složku obsahuje terapeuticky účinné množství antimikrobiálního peptidů pro léčení nebo prevenci zánětu ústní sliznice u živočichů.

   io 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným antimikrobiálním peptidem je protegrinový peptid nebo s ním příbuzný peptid.

   3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedený peptid má vzorec (I) X^Xz-Xa^-Xs-Ce-Xz-Ce-Xe-Xw-Xn-X^-Cn-Xu-Cis-Xw-XiyXl8

   2o nebo je ve formě farmaceuticky přijatelné soli nebo na N-konci acylované nebo na C-konci amidované nebo esterifikované formě, kde:

   každá z aminokyselin C₈ a Ci₃ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, je každá nezávisle typu 25 cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní;

   každá z aminokyselin C₆ a C15 je nezávisle typu cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofóbní;

   • · každá z aminokyselin Xj - X₅ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna, každá je nezávisle bazická, hydrofóbní, polární/velká nebo malá;

   každá z aminokyselin X₇ a X14 je nezávisle hydrofóbní nebo 5 malá;

   každá z aminokyselin X₉ a X₁₂ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna;

   aminokyseliny X₉ - Xi₂ brány společně jsou schopny, jestliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I), vytvořit 10 reverzní otáčku, a alespoň jedna z aminokyselin X₉ - Χ_ή2 musí být bazická;

   každá z aminokyselin X₁₆ - Xi₈ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna každá je nezávisle bazická, hydrofóbní, polární/velká nebo malá;

   a kde alespoň přibližně 15 až přibližně 50 % aminokyselin tvořících uvedený antimikrobiální peptid jsou bazické aminokyseliny, takže uvedený antimikrobiální peptid má čistý celkový náboj při fyziologickém pH alespoň + 1.

   4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že

   Xi je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu;

   aminokyselina X₂ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže 25 je přítomna, jde o malou, bazickou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

   aminokyselina X₃ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

   • *

   - 73aminokyselina X₄ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou, bazickou nebo hydrofóbní aminokyselinu;

   aminokyselina X₅ je malá, bazická nebo hydrofóbní;

   aminokyselina Ce je aminokyselina cysteinového typu;

   aminokyselina X₇ je malá nebo hydrofóbní;

   aminokyselina C₈ je cysteinového typu, malá, bazická nebo hydrofóbní;

   aminokyselina X₉ je bazická nebo hydrofóbní;

   aminokyselina X₁₀ je malá nebo bazická aminokyselina nebo prolin;

   aminokyselina Xn je bazická nebo hydrofóbní;

   aminokyselina Xi₂je hydrofóbní;

   aminokyselina C₁₃ je aminokyselina cysteinového typu nebo malá, bazická nebo hydrofóbní;

   aminokyselina X_i4 je malá nebo hydrofóbní;

   aminokyselina C₁₅ je aminokyselina cysteinového typu;

   aminokyselina X₁₆ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o hydrofóbní aminokyselinu;

   aminokyselina X₁₇ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou aminokyselinu; a aminokyselina X₁₈ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu.

   5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že ·· ·· to · * toto to · • toto· · · · · · · · « • to · to to · · · to to to • · 4» · · to to · to · ··· to to ·· to ··· ··· ·· ·· «···· ·· ··

   - 74Xi znamená R; X₂ není přítomna nebo znamená R, G nebo L;

   X₃ není přítomna nebo znamená G, L, W nebo Cha; X₄ není přítomna nebo znamená R, G nebo W; X₅ je R, G, A, L, V, W nebo Cha; C₆ je C; X₇ je A, Y, F nebo Cha; C₈ je C, K, A nebo

   T; Xg je R, F, W, Y nebo L; X₁₀ je R, G, MeGly nebo P; Xn je R,

   W, F nebo Cha; X₁₂ je F, I, Y, W nebo Cha; C13 je C, K, A nebo

   T; X₁₄ je G, A, V nebo F; X₁₅ je C; X₁₆ není přítomna nebo znamená V, F; X₁₇ není přítomna nebo znamená G; a X₁₈ není přítomna nebo znamená R.

   6. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedený peptid je zvolený ze skupiny: (OM-1) RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID No. 1) 15 (OM-2) RGGRLCYCRRRFCVCVGR* (SEQ ID No. 2) (OM-3) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No. 3) (OM-4) RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID No. 4) (OM-5) RGGRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID No. 5) (OM-6) RGGGLCYKRGWIKFCVGR (SEQ ID No. 6) 20 (OM-7) RGWGLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID No. 7) (OM-8) RLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID No. 8) (OM-9) RGGGLCYTRPRFTVCVGR (SEQ ID No. 9) (OM-10) LCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.10) (OM-11) RWRLCYCRPRFCVCV (SEQ ID No.11) 25 (OM-12) RGWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID No.12) (OM-13) RGWRACYCRPRFCACVGR (SEQ ID No.13) (OM-14) GWRLCYCRPRFCVCVGR (SEQ ID No.14) (OM-15) XCYCRRRFCVCV (X=CHa) (SEQ ID No.15) (OM-16) WLCYCRRRFCVCV* (SEQ ID No.16) 30 (OM-17) RLCYCRXRFCVCV (X=MeGly) (SEQ ID No.17) (OM-18) RLCYCRPRFCVCVGR* (SEQ ID No.18)

   • · •· •· •· •· • » ·· • · · • ·

   - 75(OM-19) RGGGLCYCRPRFCVCVGR* (OM-20) RXCFCRPRFCVCV (OM-21) RWCFCRPRFCVCV (OM-22) LCXCRRRXCVCV (OM-23) RGGRLCYCRRRFCVC (OM-24) LCYTRRRFTVCV (OM-25) RRCYCRRRFCVCVGR (OM-26) RLCYCRRRFCVCV* (OM-27) RXRLCYCRZRFCVCV (X=Cha) (X=Cha) (X=Cha) (Z=MeGly) (X=Cha) (OM-28) RGWRLCYCRGRXCVCV (OM-29) RGLRXCYCRGRFCVCVGR(X=Cha) (SEQ ID No.29) (OM-30) RGWRGCYKRGRFKGCVGR (SEQ ID No.30) (OM-31) RGWRGCYCRXRFCGC (X=MeGly) (SEQ ID No.31) (OM-32) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.32) (OM-33) RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID No.33) (OM-34) RGGRLCYCRGRFCVCVGR* (SEQ ID No.34) (OM-35) RGWRLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.35) (OM-36) RGGRLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.36) (OM-37) RGGRVCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.37) (OM-38) RGGRVCYCRGRFCVCV (SEQ ID No.38) (OM-39) RGGRVCYCRGRFCVCV* (SEQ ID No.39) (OM-40) WLCYCRRRFCVCV (SEQ ID No.40) (OM-41) RGGGLCYARGWIAFCVCVGR (SEQ ID No.41) (OM-42) LCYCRRRFCVCVF (SEQ ID No.42) (OM-43) RLCYCRPRFCVCV (SEQ ID No.43) (OM-44) RLCACRGRACVCV (SEQ ID No.44) kde peptidy označené * jsou v kyselé formě a všechny ostatní jsou ve formě amidové.

   • ·

   - 767. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, nativní formě.

   podle nároku 6, ž e uvedený peptid je v

   8. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antimikrobiálni peptid v koncentraci přibližně 0,001 až 2,5 % hmotnostních.

   9. Farmaceutický prostředek podle nároku

   1, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený antimikrobiálni peptid v koncentraci přibližně 0,005 až přibližně 0,75 % hmotnostních.

   10. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje uvedenou antimikrobiálni sloučeninu v koncentraci přibližně 0,03 až přibližně 0,3 % hmotnostních.

   11. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje uvedený antimikrobiálni peptid ve formě gelovitého prostředku, který obsahuje přibližně 0,005 až 2,5 % hmotnostních antimikrobiálního peptidu, přibližně 0,1 až 10 % hmotnostních ve vodě rozpustného gelujícího prostředku a přibližně 0,1 až % látky vážící vlhkost.

   - 7712. Farmaceutický prostředek

   9999

   9 9 99

   9 99

   9 9999

   99

   999 ♦·

   9999

   9 9 99

   9 999

   9 999 99

   9 99

   9999 podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje přibližně 0,1 až 10 % hmotnostních sladidla.

   13. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje přibližně 0,1 až 2 % hmotnostní antimikrobiální ochranné látky.

   14. Farmaceutický prostředek pro místní orální podávání io antimikrobiálniho peptidů, vyznačující se tím, ž e obsahuje přibližně 0,001 až 2,5 % hmotnostních antimikrobiálniho peptidů, přibližně 0,1 až 10 % hmotnostních ve vodě rozpustného gelujícího prostředku, přibližně 0,1 až 20 % hmotnostních látky vážící vlhkost a přibližně 0,1 % až 10 % 15 hmotnostních sladidla.

   15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedeným antimikrobiálním peptidem je protegrinový nebo s ním příbuzný

   2o peptid.

   16. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje přibližně 0,01 až 2 % hmotnostní antimikrobiální ochranné látky.

   17. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedeným ve vodě rozpustným gelujícím prostředkem je celulózový materiál.

   φφ φφ φ φ φ φ • φ φφ φφφφ · φ · · φφ φφ • ·

   - 7818. Farmaceutický prostředek podle . nároku 17, vyznačující se tím, že uvedeným celulózovým materiálem je hydroxypropylmethylcelulóza.

   φφ·· • · · ·φ • · φφ • φ φφφ φ φ φφ φφ φφφ • ··

   19. Farmaceutický prostředek podle nároku

   14, vyznačující se tím, ž e uvedenou látkou vázající vlhkost je sorbitol.

   20. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedenou antimikrobiální ochrannou látkou je methylparaben nebo propylparaben nebo jejich směs.

   21. Použití antimikrobiálního peptidu pro výrobu farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 20 pro léčení nebo prevenci zánětu ústní sliznice u živočichů upraveného pro místní orální podávání v terapeuticky účinném množství do ústní dutiny živočicha.

   22. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e uvedeným antimikrobiálním peptidem je protegrinový peptid nebo s ním příbuzný peptid.

   23. Použití podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že uvedený peptid má vzorec (I) Xi-X2-X3X4“X5^_C6X7^_Ca^-X9^-Xl0“Xl1^-Xl2Cl3Xl4Cl5“Xl6^-Xl7

   Xl8 ·· ·· • ·· · • ·· · • · 9999 a ·· ·· ·· ·· · 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 99

   9 9 9 999 9 9

   9 9 9 9 9

   999 99 φφ »· nebo je ve formě farmaceuticky přijatelné soli nebo na N-konci acylované nebo na C-konci amidované nebo esterifikované formě, kde:

   každá z aminokyselin C₈ a C13 je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, je každá nezávisle typu cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní;

   každá z aminokyselin C₆ a C₁₅ je nezávisle typu cysteinu, bazická, malá, polární/velká nebo hydrofobní;

   každá z aminokyselin Χ_Ί - X₅ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna, každá je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá;

   každá z aminokyselin X₇ a X₁₄ je nezávisle hydrofobní nebo malá;

   každá z aminokyselin X₉ a X₁₂ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna;

   aminokyseliny X₉ - X₁₂ brány společně jsou schopny, jestliže jsou obsaženy v aminokyselinové sekvenci vzorce (I), vytvořit reverzní otáčku, a alespoň jedna z aminokyselin X₉ - Χ_Ί2 musí být bazická;

   každá z aminokyselin X_w - X₁₈ je nezávisle přítomna nebo nepřítomna, a pokud je přítomna každá je nezávisle bazická, hydrofobní, polární/velká nebo malá;

   a kde alespoň přibližně 15 až přibližně 50 % aminokyselin tvořících uvedený antimikrobiální peptid jsou bazické aminokyseliny, takže uvedený antimikrobiální peptid má čistý celkový náboj při fyziologickém pH alespoň + 1.

   24. Použití podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e ·· ♦· · ·· ·♦ φφ φ φ · φ φφ φ φ φ φ φ φ • · φ φ ··· φ φ φφ • · ·♦· 9 99 99 999 9 φ

   9 · ΦΦΦ 999

   99 999 99 99 99

   Χι je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu;

   aminokyselina X₂ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou, bazickou nebo hydrofobní aminokyselinu;

   aminokyselina X₃ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou nebo hydrofobní aminokyselinu;

   aminokyselina X₄ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou, bazickou nebo hydrofobní aminokyselinu;

   aminokyselina X₅ je malá, bazická nebo hydrofobní;

   aminokyselina C₆ je aminokyselina cysteinového typu;

   aminokyselina X₇ je malá nebo hydrofobní;

   aminokyselina C₈ je cysteinového typu, malá, bazická nebo hydrofobní;

   aminokyselina X₉ je bazická nebo hydrofobní;

   aminokyselina X₁₀ je malá nebo bazická aminokyselina nebo prolin;

   aminokyselina X₄₁ je bazická nebo hydrofobní;

   aminokyselina Xi₂je hydrofobní;

   aminokyselina C13 je aminokyselina cysteinového typu nebo malá, bazická nebo hydrofobní;

   aminokyselina X₁₄ je malá nebo hydrofobní;

   aminokyselina C15 je aminokyselina cysteinového typu;

   aminokyselina X₁₆ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o hydrofobní aminokyselinu;

   - 81aminokyselina X₁₇ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o malou aminokyselinu; a aminokyselina X₁₈ je buď přítomna nebo nepřítomna, a jestliže je přítomna, jde o bazickou aminokyselinu.

   25. Použití podle nároku 24, vyznačující se tím, ž e

   Xi znamená R; X₂ není přítomna nebo znamená R, G nebo L; X₃ není přítomna nebo znamená G, L, W nebo Cha; X₄ není io přítomna nebo znamená R, G nebo W; X₅ je R, G, A, L, V, W nebo Cha; C₆ je C; X₇ je A, Y, F nebo Cha; C₈ je C, K, A nebo

   T; X₉ je R, F, W, Y nebo L; X₁₀ je R, G, MeGly nebo P; X_1x je R, W, F nebo Cha; X₁₂ je F, I, Y, W nebo Cha; C₁₃ je C, K, A nebo

   T; X₁₄ je G, A, V nebo F; X₁₅ je C; X₁₆ není přítomna nebo znamená V, F; Xi₇ není přítomna nebo znamená G; a Xi₈ není přítomna nebo znamená R.

   26. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e uvedený peptid je zvolený ze skupiny:

   (OM-1) RGGRLCYCRRRFCVCVGR (SEQ ID No. 1) (OM-2) RGGRLCYCRRRFCVCVGR* (SEQ ID No. 2) (OM-3) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No. 3) (OM-4) RLLRACYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID No. 4) (OM-5) RGGRLCYCRPRFCVCVGR (OM-6) RGGGLCYKRGWIKFCVGR (OM-7) RGWGLCYCRPRFCVCVGR (OM-8) RLCYCRPRFCVCVGR (OM-9) RGGGLCYTRPRFTVCVGR (OM-10) LCYCRGRFCVCVGR (OM-11) RWRLCYCRPRFCVCV (SEQ ID No. 5) (SEQ ID No. 6) (SEQ ID No. 7) (SEQ ID No. 8) (SEQ ID No. 9) (SEQ ID No. 10) (SEQ ID No.11) • · ···

   - 82(X=CHa) (OM-12) RGWRLCYCRPRFCVCVGR (OM-13) RGWRACYCRPRFCACVGR (OM-14) GWRLCYCRPRFCVCVGR (OM-15) XCYCRRRFCVCV (OM-16) WLCYCRRRFCVCV* (OM-17) RLCYCRXRFCVCV (OM-18) RLCYCRPRFCVCVGR* (OM-19) RGGGLCYCRPRFCVCVGR* (OM-20) RXCFCRPRFCVCV (OM-21) RWCFCRPRFCVCV (OM-22) LCXCRRRXCVCV (OM-23) RGGRLCYCRRRFCVC (OM-24) LCYTRRRFTVCV (OM-25) RRCYCRRRFCVCVGR (OM-26) RLCYCRRRFCVCV* (OM-27) RXRLCYCRZRFCVCV (X=MeGly) (X=Cha) (X=Cha) (X=Cha) (Z=MeGly) (X=Cha) (OM-28) RGWRLCYCRGRXCVCV (OM-29) RGLRXCYCRGRFCVCVGR(X=Cha) (OM-30) RGWRGCYKRGRFKGCVGR (OM-31) RGWRGCYCRXRFCGC (OM-32) RGGLCYCRGRFCVCVGR (SEQ ID No.12) (SEQ ID No.13) (SEQ ID No.14) (SEQ ID No.15) (SEQ ID No.16) (SEQ ID No.17) (SEQ ID No.18) (SEQ ID No.19) (SEQ ID No.20) (SEQ ID No.21) (SEQ ID No.22) (SEQ ID No.23) (SEQ ID No.24) (SEQ ID No.25) (SEQ ID No.26) (X=MeGly) (SEQ ID No.31) (SEQ ID No.32) (OM-33) RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X=MeGly) (SEQ ID No.33) (OM-34) RGGRLCYCRGRFCVCVGR* (OM-35) RGWRLCYCRGRFCVCVGR (OM-36) RGGRLCYCRGRFCVCVGR (OM-37) RGGRVCYCRGRFCVCVGR (OM-38) RGGRVCYCRGRFCVCV (OM-39) RGGRVCYCRGRFCVCV* (OM-40) WLCYCRRRFCVCV (OM-41) RGGGLCYARGWIAFCVCVGR (OM-42) LCYCRRRFCVCVF (SEQ ID No.34) (SEQ ID No.35) (SEQ ID No.36) (SEQ ID No.37) (SEQ ID No.38) (SEQ ID No.39) (SEQ ID No.40) (SEQ ID No.41) (SEQ ID No.42)

   - 83·· ·« · ·· ·· ·· • ·· · 99 9 9 9 9 9· • 9 9 9 9 9 9 9 999

   9 999 9 9999 999 99

   9 9 9 9 9 9 99

   99 999 99 9999

   (OM-43) RLCYCRPRFCVCV (OM-44) RLCACRGRACVCV (SEQ ID No.43) (SEQ ID No.44)

   kde peptidy označené * jsou v kyselé formě a všechny ostatní jsou ve formě amidové.

   27. Použití podle nároku 26, vyznačující se tím, ž e uvedený peptid je v nativní formě.

   28. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, io že koncentrace antimikrobiálního peptidů je přibližně 0,001 až 2,5 % hmotnostních.

   29. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e koncentrace uvedeného antimikrobiálního peptidů je přibližně 0,005 až přibližně 0,75 % hmotnostních.

   30. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e koncentrace uvedené antimikrobiálni sloučeniny je přibližně 0,03 až přibližně 0,3 % hmotnostních.

   31. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e uvedený antimikrobiálni peptid je obsažen ve formě gelovitého prostředku, který obsahuje přibližně 0,005 až 2,5 % hmotnostních antimikrobiálního peptidů, přibližně 0,1 až 10 % hmotnostních ve vodě rozpustného gelujícího prostředku a přibližně 0,1 až 20 % látky vážící vlhkost.

   ···· • · ·· • · ·· ♦ · ··· · • ·· • 9·· • · ·* ·· * · ·· « · * · *· ·· • · · ··« ·9 • · · e· • ·· ·· *·

   32. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e dále je přítomno přibližně 0,1 až 10 % hmotnostních sladidla.

   33. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, ž e dále je přítomno přibližně 0,1 až 2 % hmotnostní antimikrobiálni ochranné látky.

   Zastupuje:

   'W —— q>\J • ···· ·· ···· ·· ·· ··· · · · · · · · ···· ·· · · · · · • ··· · · · · · · · · • ···· ··· ······ ·· · · · · ·

   1/7