JP4707911B2 - 治療ペプチドベースの構築物 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許出願第09/344,219号および同第09/344,827号(各々1999年6月25日出願)の一部継続出願であり、各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、一般に、8〜15アミノ酸部分を有する低分子ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)に関する。これらの構築物の配列を設計し、そして殺菌性/透過性増大タンパク質(BPI)のドメインIIから同定し、かつ選択されたアミノ酸の逆部分配列(99〜85)に基づいて調製する。本発明はさらに、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害および/または血管新生の阻害(例えば、慢性炎症性疾患状態および転移性腫瘍のモデルにおける新生血管形成を含むインビボ新生血管形成の阻害)に起因したこのような構築物の治療的使用に関する。
【0003】
(発明の背景)
殺菌性/透過性増大タンパク質(BPI)は、哺乳動物多形核白血球(PMNまたは好中球)(これは、侵襲性微生物に対して哺乳動物を防御する際に必要な血球である)の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトBPIは、イオン交換クロマトグラフィー[Elsbach,J.Biol.Chem.,254:11000(1979)]またはE.coliアフィニティークロマトグラフィー[Weissら、Blood,69:652(1987)]のいずれかと組合せた酸抽出によって、PMNから単離され、そしてグラム陰性細菌に対して生物学的活性を有する。ヒトBPIの分子量は、約55,000ダルトン(55kD)である。ヒトBPIタンパク質全体のアミノ酸配列およびBPIをコードするDNAの核酸配列は、Grayら、J.Biol.Chem.,264:9505(1989)(Grayらにおける図1を参照のこと)に報告されている。このGrayらのDNA配列およびアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号27および28に示される。
【0004】
BPIの殺菌効果は、もともと、感受性グラム陰性種に高度に特異的であることが報告されていた。BPIがグラム陰性細菌を殺傷する正確な機構は、未だ未知であるが、BPIが、第一に感受性(susceptible)グラム陰性細菌の表面に結合するはずであると考えられている。BPIの細菌とのこの最初の結合は、塩基性(すなわち、正に荷電している)タンパク質であるBPIとリポポリサッカリド(LPS)上の負に荷電した部位との間の静電的相互作用を含む。LPSは、それが刺激する強力な炎症性応答に起因して、「エンドトキシン」とも呼ばれている。LPSは、最終的に不可逆的なエンドトキシン性ショックを生じ得る、宿主炎症性細胞による媒介物の放出を誘導する。BPIは、LPSの最も毒性でかつ最も生物学的に活性な成分である、リピドAに結合する。
【0005】
BPIはまた、LPS(BPIが結合する)のエンドトキシン特性を中和し得る。そのグラム陰性細菌特性、およびLPSに結合しかつこれを中和する能力のために、BPIは、細菌が宿主外部から感染するか、または細菌が宿主内部から感染する(すなわち、腸管由来)かに拘わらず、グラム陰性細菌に感染することにより開始された疾患および状態(菌血症、エンドトキシン血症および敗血症の状態を含む)に罹患した哺乳動物の処置に利用され得る。BPIのこれらの特性により、BPIがこのような治療投与のために特に有用かつ有利になる。
【0006】
ヒトBPIのアミノ末端部分に対応するタンパク質分解性フラグメントは、LPS結合活性およびLPS中和活性、ならびにBPIホロタンパク質(holoprotein)の抗菌活性を有する。単離されたヒトBPIのアミノ末端部分とは対称的に、そのカルボキシル末端領域は、ごくわずかに検出可能な抗菌活性およびいくらかのエンドトキシン中和活性を示す(Ooiら,1991,J.Exp.Med.174:649)。1つのBPIアミノ末端フラグメント(「rBPI23」といわれる)(Gazzano−Santoroら,1992,Infect.Immun.60:4754−4761を参照のこと)は、23kDタンパク質として組換え手段により生成され、そして151位のバリンがGTCではなくGTGにより特定され、そして残基185がリジンではなく(AAGにより特定される)グルタミン酸(GAGにより特定される)であることを除いて、Grayら(前出)から引用したヒトBPIホロタンパク質の最初の199アミノ酸残基をコードするDNAの発現産物を含む。組換えホロタンパク質(rBPIともいわれる)がまた生成され、これらのホロタンパク質は、米国特許第5,198,541号にもまた示されるrBPI23についての記載を除いて、Grayら(前出)から引用した配列番号27および28に示される配列を有する。rBPI21またはrBPI21ΔcysまたはrBPI(1〜193)ala132と命名されたN末端フラグメントアナログは、共有に係る米国特許第5,420,019号および対応の国際公開WO94/18323(PCT/US94/01235)(全て本明細書中に参考として援用される)に記載されている。このアナログは、配列番号27および28に記載されるBPIホロタンパク質最初の193アミノ酸(しかし、ここで残基番号132のシステインは、アラニンで置換され、そしてrBPI23についての記載は除かれる)を含む。rBPI23ならびにrBPI21と命名されたシステイン置換アナログは、ヒト臨床試験に導入された。rBPI23を、エンドトキシンでチャレンジしたヒトに投与した場合に、エンドトキシンに対する前炎症応答が有意に改善された(例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第5,643,875号および同第5,753,620号ならびに対応の国際公開WO95/19784(PCT/US95/01151)を参照のこと)。さらにrBPI21を、髄膜炎菌血症および外傷に起因する出血に罹患したヒトに投与した(例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,888,977号および対応の国際公開WO97/42966(PCT/US97/08016)ならびに米国特許第5,756,464号および対応の国際公開WO97/44056(PCT/US97/08941)を参照のこと)。
【0007】
他のエンドトキシンを結合し、そして中和するタンパク質およびペプチドは、当該分野で公知である。1つの例は、カブトガニアメーバ様細胞に由来するLimulus抗リポポリサッカリド因子(LALF)(Warrenら,1992,Infect.Immunol.60:2506−2513)である。別の例は、Bacillus polymyxaに由来する環状カチオン性リポペプチド(ポリミキシンBlといわれる)である。ポリミキシンB1は、6つのα,γ−ジアミノ酪酸残基、1つのD−フェニルアラニン、1つのロイシン、1つのスレオニンおよび6−メチルオクタノイル部分から構成され(Morrison and Jacobs,1976,Immunochem.13:813−818)、そしてこれはまた殺菌性である。脂肪酸部分を欠いたポリミキシンアナログもまた公知であり、このアナログは、LPS結合能力を保持するが、評価できるほどの殺菌活性はない(Dannerら,1989,Antimicrob.Agents Chemother.33:1428−1434)。同様の特性はまた、合成環化ポリミキシンアナログで見出された(Rusticiら,1993,Science 259:361−365)。
【0008】
公知の抗菌ペプチドとしては、セクロピンおよびマガイニンが挙げられる。セクロピンは、鱗翅目昆虫の血リンパにおいて見出された抗菌ペプチドのファミリーであり(Wadeら,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4761−4765)、そしてマガイニンは、Xenopus皮膚および胃粘膜において見出された抗菌ペプチドのファミリーである(Zasloffら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:910−913)。これらのペプチドは直鎖状であり、そして約20〜約40アミノ酸長の範囲である。ブタ腸粘膜セクロピンP1由来のあまり活性でない哺乳動物セクロピンが報告された(Bomanら,1993,Infect.Immun.61:2978−2984)。これらのセクロピンは、一般に、殺菌活性がマゲイニンより強力であり、かつ哺乳動物細胞傷害性をあまり有しないことが報告されている。セクロピンおよびマガイニンは、連続する両親媒性のαらせん領域(殺菌活性に必要である)により特徴付けられる。今日までに同定されたセクロピンのうち、最も有効なものは、セクロピンAである。セクロピンAの最初の10アミノ酸の配列は、BPIアミノ酸配列90〜99といくらかの相同性を有するが、BPIアミノ酸配列90〜99により特定される荷電アミノ酸および非荷電アミノ酸のモチーフを共有しない。さらに、セクロピンAの他の27アミノ酸は、最大殺菌活性に必要であり、そしてこれらの27アミノ酸は、BPIと相同性がない。マガイニンは、BPIアミノ酸90〜99と最小の相同性を有する。
【0009】
本出願の目的であることは、BPIおよびアニオン性化合物を含む組成物に関するPCT国際出願PCT/US91/05758[WO92/03535]の開示である。この組成物は、(1)殺菌活性がない、および(2)エンドトキシン中和活性を示すといわれる。アニオン性化合物は、好ましくは、血清アルブミンのようなタンパク質であるが、ヘパリンのようなポリサッカリドでもあり得る。さらに、Weissら,1975,J Clin.Invest.55:33−42は、ヘパリン硫酸およびLPSが、BPIの透過性増大活性の発現をブロックすることを開示する。しかし、どの参考文献も、BPIが実際にヘパリンに結合し、そして/またはヘパリンの生物学的活性を中和することを開示していない。ヘパリン結合は、ヘパリン中和を必ずしも示さない。例えば、ヘパリン結合増殖因子(HBGF)のファミリーは、生物学的応答を誘発する補因子としてヘパリンを必要とする。HBGFファミリーの例としては、以下が挙げられる:線維芽細胞増殖因子(FGF−1、FGF−2)および内皮細胞増殖因子(ECGF−1、ECGF−2)。凝固カスケードのプロテアーゼの抗トロンビンIII阻害は、活性のためにヘパリンを必要とするヘパリン結合タンパク質の別の例であり、そして明らかにヘパリンを中和しない。ヘパリンを中和しないヘパリン結合タンパク質(例えば、血小板因子IV、プロタミンおよびトロンボスポンジン)は、一般に、補因子としてヘパリンを用いるヘパリン結合タンパク質により誘導される活性を抑制する。
【0010】
本出願に対して特に目的であるものは、BPIタンパク質産物のヘパリン関連活性である、具体的には、BPIタンパク質産物は、全てが本明細書中に参考として援用される、同一人に譲渡された米国特許第5,348,942号;同第5,639,727号;同第5,807,818号;同第5,837,678号;同第5,854,214号および対応の国際公開WO94/20128(PCT/US94/02401)においてヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性を有することが示された。例えば、rBPI23は、ヘパリンに対して高親和性を有することが示され(Littleら,1994,J Biol.Chem.269:1865−1872もまた参照のこと)、そしてヘパリンを中和するためにヒトに投与された(例えば、本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,348,942号を参照のこと)。BPIタンパク質産物のこれらのヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性は、ヘパリンの現在の臨床的使用の重要性に起因して重要である。ヘパリンは、外科的手順(例えば、心肺バイパス、心臓カテーテル法および血液透析手順)の間の血液凝固を防止するために、このような手順の間に400U/kgまでの用量で同時に投与される。ヘパリンが外科手術の間に抗凝固効果のために投与される場合、通常の凝固機能が回復され得るようにヘパリンの効果が適切に中和されることは、術後治療の重要な局面である。現在、プロタミンを用いて、ヘパリンを中和している。プロタミンは、アルギニンリッチの強塩基性である単純な低分子量タンパク質のクラスである。単独で投与される場合、プロタミン(通常、硫酸プロタミンの形態)は、抗凝固効果を有する。ヘパリンの存在下で投与される場合、安定な複合体を形成し、そして両方の薬物の抗凝固活性が失われる。しかし、プロタミンの重大な低血圧効果およびアナフィラキシー様効果により、その臨床的利用が制限されている。従って、そのヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性に起因して、BPIタンパク質産物は、プロタミンの有用性が制限されている有害な副作用なしで、臨床的状況において、ヘパリン中和におけるプロタミンの基質として潜在的利用性を有する。このようなBPIタンパク質産物のさらなる抗菌効果および抗エンドトキシン効果はまた、プロタミンと比較して、術後のヘパリン中和において有用かつ有利である。
【0011】
さらに特に目的であることは、ヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性に一部起因する血管新生を阻害するBPIタンパク質産物の活性である(例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第5,807,818号および同第5,837,678号ならびに対応の国際公開WO94/20128(PCT/US94/02401)を参照のこと)。血管新生、すなわち、新たな血管の増殖(新生血管形成)は、増殖因子が関与し、その大部分が補因子としてヘパリンを有する複雑な現象である。成人において、脈管形成増殖因子は、血管外傷(創傷治癒)、免疫刺激(自己免疫疾患)、炎症性メディエーター(プロスタグランジン)の結果としてまたは腫瘍細胞から放出される。これらの因子は、ヘパリン依存性レセプター結合機構(Yayonら,1991,Cell 64:841−848を参照のこと)を介して内皮細胞の増殖(これは、血管新生に必要である)を誘導する。血管新生はまた、多くの他の病理状態と関連し、これらの病理状態としては、種々の腫瘍の成長、増殖、および転移;糖尿病性網膜症、黄斑変性、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、乾癬、血管線維腫、免疫および非免疫炎症(慢性関節リウマチを含む)、アテローム硬化斑内の毛細管増殖、血管腫、子宮内膜症およびカポージ肉腫が挙げられる。従って、これらおよび他の例において血管新生を阻害することが望ましく、そしてBPIタンパク質産物のヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性(BPIに由来するかまたはBPIに基づくペプチドを含む)はこの目的に有用である。
【0012】
ヘパリン結合タンパク質は、少なくとも2つのクラスに入る。第1のクラスは、特異的応答を誘発する際に補因子としてヘパリンを利用するタンパク質からなる。これらのタンパク質としては、ヘパリン依存性増殖因子(例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子;酸性線維芽細胞増殖因子および血管内皮細胞増殖因子)が挙げられる。これらのタンパク質は、血管新生において主要な役割を果たす。第2のクラスは、ヘパリン依存性応答を中和するタンパク質を含む。BPIタンパク質産物(BPIに由来するペプチドを含む)は、ヘパリン中和剤および抗血管新生薬剤として同定された。いくつかの他のヘパリン中和タンパク質はまた、血管新生を阻害することが公知である。例えば、プロタミンは、腫瘍関連血管新生、その後の腫瘍増殖を阻害することが公知である[Folkmanら,1992,Inflammation:Basic Principeles and Clinical Correlates,2d ed,(Galinら,eds.,Review Press,N.Y.), Ch. 40, pp. 821−839]。第2のヘパリン中和タンパク質である血小板因子IVはまた、血管新生を阻害する(すなわち、血管増殖抑制(angiostatic))。別の公知の血管新生インヒビターであるトロンボスポンジンは、塩基性アミノ酸モチーフの代わりに、反復セリン/トリプトファンモチーフに対してヘパリンに結合する(Guoら,1992,J Biol.Chem.267:19349−19355を参照のこと)。マウスエンドスタチンはまた、ヘパリンを結合し、そして血管新生を阻害することが報告されている(例えば、Hohenesterら,1998,Embo J.17:1656−1664;O’Reillyら,1997,Cell 88:277−285)。
【0013】
BPIタンパク質産物の別の利用性は、通常血管新生が付随する慢性炎症に関連する病理状態を含む(例えば、本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第5,639,727号を参照のこと)。慢性炎症状態に関連するヒト疾患の1つの例は、末梢関節の炎症を含む関節炎である。慢性関節リウマチにおいて、炎症は自己免疫であるが、反応性関節炎(reactive arthritis)においては、炎症は、化膿性細菌または他の感染因子での滑膜組織の初期感染、続いて感受性個体における無菌慢性炎症(aseptic chronic inflammation)と関連すると仮定される。Folkmanら,1992(前出)は、関節における炎症性侵襲により左右される段階から血管新生パンヌスが血管に侵襲し、そして軟骨を破壊し始める後期まで多くの型の関節炎が進行することを記載した。関節における血管新生が疾患または副現象の原因要素であるか否かは明らかでないが、血管新生が慢性関節リウマチにおける滑膜の維持に必要であるという証拠は存在する。1つの公知の血管新生インヒビターであるAGM1470は、関節炎の発症を予防し、そしてコラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて確立された関節炎を阻害することが示された(Peacockら,1992,J.Exp.Med.175:1135−1138)。非ステロイド抗炎症薬物であるコルチコステロイドおよび他の治療は、関節炎の軽減のための処置改善を提供したが、関節炎および他の炎症性疾患についてのより有効な治療は当該分野で未だに必要である。
【0014】
BPIタンパク質産物(rBPI23およびrBPI21を含む)の多くのさらなる有用性は、これらの産物の広範な種々の生物学的活性に起因して記載される。例えば、BPIタンパク質産物は、全てが本明細書中で参考として援用される、米国特許第5,198,541号および同第5,523,288号において記載されるように、グラム陰性細菌に対して殺菌性である。国際公開WO94/20130(本明細書中に参考として援用される)は、グラム陰性細菌属であるHelicobacter由来の種での感染(例えば、胃腸)に罹患した被験体をBPIタンパク質産物を用いて処置するための方法を提唱する。BPIタンパク質産物はまた、全て参考として援用される、米国特許第5,523,288号および国際公開WO95/08344(PCT/US94/11255)に記載されるように、グラム陰性細菌感染における抗生物質治療の有効性を増強する。BPIタンパク質産物はまた、グラム陽性細菌およびマイコプラズマに対して殺菌性であり、そして全て本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,578,572号;同第5,783,561号および同第6,054,431号、ならびに国際公開WO95/19180(PCT/US95/00656)に記載されるように、グラム陽性細菌感染における抗生物質の有用性を増強する。BPIタンパク質産物は、抗真菌活性を示し、そして米国特許第5,627,153号および国際公開WO95/19179(PCT/US95/00498)に記載されるように、他の抗真菌剤の活性を増強し、そして米国特許第5,858,974号(全て本明細書中に参考として援用される、米国特許出願第08/504,841号の一部継続出願であり、対応の国際公開WO 96/08509(PCT/US95/09262)およびWO97/04008 (PCT/US96/03845)である)において抗真菌ペプチドについてさらに記載される。BPIタンパク質産物は、全て参考として援用される、米国特許第5,646,114号および同第6,013,629号ならびに国際公開WO96/01647(PCT/US95/08624)に記載されるように、抗原生動物活性を示す。BPIタンパク質産物は、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第5,888,973号およびWO98/06415(PCT/US97/13810)に記載されるように、抗クラミジア活性を示す。最後に、BPIタンパク質産物は、全て参考として援用される、共有に係る同時係属中の米国特許出願第08/626,646号(これは、米国特許出願第08/285,803号の継続出願であり、この継続出願は、同第08/031,145号の一部継続出願である)および対応の国際公開WO94/20129(PCT/US94/02463)に記載されるように、抗ミコバクテリア活性を示す。
【0015】
循環中のエンドトキシンに対するヒトにおけるBPIタンパク質産物の効果(TNF、IL−6およびエンドトキシンに対する効果を含む)は、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,643,875号;同第5,573,620号および同第5,952,302号ならびに対応の国際公開WO95/19784(PCT/US95/01151)に記載される。
【0016】
BPIタンパク質産物はまた、例えば、ヒトにおける髄膜炎菌血症(共有に係る米国特許出願第08/644,287号ならびに米国特許第5,888,977号および同第5,990,086号、ならびに国際公開WO97/42966(PCT/US97/08016)に記載される)、ヒトにおける出血性外傷(米国特許第5,756,464号および同第5,945,399号、ならびに米国特許出願第09/293,107号ならびに対応の国際公開WO97/44056(PCT/US97/08941)に記載される)、熱傷(米国特許第5,494,896号に記載される)、虚血/再灌流傷害(米国特許第5,578,568号および同第6,017,881号、ならびに米国特許出願第09/416,828号に記載される)および肝臓切除(全てが参考として援用される、共有に係る同時係属中の米国特許出願第09/466,412号(これは、米国特許出願第08/582,230号の継続出願であり、この出願は、米国特許出願第08/318,357号の継続出願であり、この継続出願は、米国特許出願第08/132,510号の一部継続出願である)および対応の国際公開WO95/10297(PCT/US94/11404)に記載される)のような特定の疾患状態の処置に有用である。
【0017】
BPIタンパク質産物はまた、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,741,779号および米国特許出願第09/299,319号、ならびに対応の国際公開WO97/42967(PCT/US7/08017)に記載されるように、抗血栓方法において有用である。
【0018】
BPIタンパク質産物の1つ以上の生物学的活性を有する新たな産物、特に、ヘパリン結合剤およびヘパリン中和剤として使用するための産物、ならびに内皮細胞増殖の阻害および血管新生(通常または病理的)の阻害のための産物が依然として必要である。ペプチドベースの有利な治療産物は、理想的には、血清安定性である小さな活性配列を含む。
【0019】
(発明の要旨)
本発明は、必要に応じて疎水性部分で誘導体化され、8〜15個の長さのアミノ酸部分である小さなペプチドベースの構築物の化合物および組成物を提供し、このアミノ酸部分は、BPIの機能的ドメインII(アミノ酸65〜99)から同定されそして選択される逆部分配列から誘導されるかまたは逆部分配列に基づく配列を有し、そしてBPIのヘパリン関連生物学的活性(例えば、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害および/または血管新生の阻害)の少なくとも1つを有する。逆(またはレトロ)配列は、元の配列から反転される(例えば、元の配列がA−B−Cの場合、反転した配列は、C−B−Aである)。本明細書中の配列は、従来の様式で(すなわち、N末端からC末端へ(左から右へ))書かれる。本発明に従う、誘導体化された構築物を含むこのようなペプチドベースの構築物は、BPIのアミノ酸99〜92由来のアミノ酸モチーフに基づく最小コア配列からなる逆部分配列を有する。好ましい実施形態において、逆部分配列は、置換された配列(例えば、アミノ酸99〜92、99〜91、99〜90、99〜89、99〜88、99〜87、99〜86、または99〜85であり、ここで置換は95および91である)である。さらに好ましいのは、1つ以上のD−アミノ酸部分を有する8〜15個のアミノ酸部分配列であり;最も好ましい配列においてアミノ酸部分の各々または全ては、D異性体である。
【0020】
本発明に従う構築物(または組成物)は、BPIのヘパリン関連生物学的活性(例えば、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成特性)の少なくとも1つを有する長さ8〜15個の部分である構築物を含み、そして(i)式:α−χ−χ−α−χ−β−χ−α−Rを有する配列または(ii)式:R1−α−χ−χ−α−χ−β−χ−α−Rを有する誘導体化した配列を含む。
【0021】
Rは、−χ、−χ−α、−χ−α−χ、χ−α−χ−β、−χ−α−χ−β−χ、−χ−α−χ−β−χ−α、−χ−α−χ−β−χ−α−χ、−χ−α−χ−χ−α−χ、−NH2、−χ−NH2、−χ−α−NH2、−χ−α−χ−NH2、−χ−α−χ−β−NH2、−χ−α−χ−β−χ−NH2、−χ−α−χ−β−χ−α−NH2、−χ−α−χ−β−χ−α−χ−NH2、または−χ−α−χ−χ−α−χ−NH2のいずれか1つである部分である。
【0022】
配列(i)または(ii)において、本明細書中の他の箇所で使用されるように、αは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、シトルリン、またはp−アミノフェニルアラニンのいずれか1つである親水性の塩基性アミノ酸部分であり;βは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシプロリン、または7−ヒドロキシ−テトラヒドロイソキノリンカルボン酸のいずれか1つである親水性の中性アミノ酸部分であり;χは、アラニン、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、シクロヘキシルアラニン、アミノ−イソ酪酸、ノルバリン(norvaline)、ノルロイシン、tert−ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、2,2−ジエチルグリシン、1−アミノ−1−シクロペンタンカルボン酸、1−アミノ−1−シクロヘキサンカルボン酸、アミノ−安息香酸、アミノ−ナフトエ酸(amino−naphthoic acid)、γ−アミノ酪酸、β−アラニン、ジフルオロフェニルアラニン、フルオロフェニルアラニン、ニペコチン酸、α−アミノ酪酸、チエニル−アラニン、またはt−ブチルグリシンのいずれか1つである疎水性アミノ酸部分である。
【0023】
R1は、R2−CH2−、R2−CH2−CO−、R2−CO−、R2−SOy−、またはR2−POz−のいずれか1つであり;
ここで、y=0〜3;
z=1〜4であり;
R2は、少なくとも3個の炭素原子を有する環式分子、少なくとも3個の原子を有する複素環式分子、少なくとも3個の炭素原子を有する官能基化した環式分子、または少なくとも3個の原子を有する官能基化した複素環式分子である疎水性部分である。
【0024】
本明細書中で使用される場合、R2は、(a)3〜8個、好ましくは5個または6個の炭素原子を含む、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、必要に応じて置換された炭素環式環;(b)3〜8個、好ましくは5個または6個の原子を含む、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、必要に応じて置換された複素環式環であって、ここで、少なくとも1個の原子が、酸素、窒素、または硫黄のいずれか1つであるヘテロ原子である、複素環式環;または(c)必要に応じて置換された以下の二環式環であって:
【0025】
【化2】
【0026】
ここで縮合環AおよびBは、独立して、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の5員環または6員環であり、そして炭素原子および必要に応じて、酸素、硫黄、または窒素から選択される1〜3個のヘテロ原子を含み、ここで1個より多くのヘテロ原子が存在し、各々が同じであってもよいし、異なっていてもよい、二環式環のいずれか1つである疎水性部分である。
【0027】
本明細書中で使用されるように、置換基R2は、単環式環または二環式環であり得、炭素環または複素環のいずれかである。二環式R2基は、2個の脂肪族環、2個の芳香族環、または1個の脂肪族環および1個の芳香族環を含み得る。複素環は、酸素、窒素、または硫黄からなる群から選択される、少なくとも1個でかつ3個までの原子を含み;ここで、1個より多くのヘテロ原子が存在し、各ヘテロ原子は同じであってもよいし、異なっていてもよい。R2置換基は、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の脂肪族(すなわち、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルキレニル)であり得るか、または芳香族(すなわち、アリールまたはヘテロアリール)であり得る。R2置換基は、必要に応じて、1〜3個の部分(例えば、C1 〜 6アルキル、ハロ、C1 〜 6アルコキシ、アセチル、ヒドロキシなど)で置換され;ここで、1個より多くのヘテロ原子が存在し、各へテロ原子は同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0028】
本明細書中で使用されるように、そして当該分野で通常使用されるように、用語「アリール」は、単環式または二環式の芳香族基(例えば、フェニルまたはナフチル)として定義され、これは無置換であるかまたは置換され得る。同様に、用語「ヘテロアリール」は、本明細書中で、1個または2個の芳香族環および少なくとも1個の窒素、酸素、または硫黄原子を含む単環式または二環式の環系として定義される。1個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は同じであっても異なっていてもよい。ヘテロアリールは、無置換であるかまたは例えば、1個以上、特に1〜3個の置換基で置換され得る。1個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。ヘテロアリール基の例として、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、またはチアジアゾリルが挙げられる。
【0029】
本明細書中で使用されるように、そして当該分野で通常使用されるように、用語「シクロアルキル」は、環式C3〜C8炭化水素基(例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、またはシクロペンチル)として定義される。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環が少なくとも1個、好ましくは1〜3個のヘテロ原子を含むことを除いて、同様に定義される。1個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。ヘテロシクロアルキル環の非限定的例として、1,3−ジオキソラン、2−ピラゾリン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、2H−ピラン、4H−ピラン、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、1,4−ジチアン、および1,4−ジオキサンが挙げられる。用語「シクロアルケニル」および「ヘテロシクロアルケニル」は、環が不飽和であることを除いて、同様に定義される。
【0030】
例示的な実施形態において、R2は、ビオチン、2−ビフェニレン、2−アントラキノン、2−ベンゾフラン、2−インドール、1−イソキノリン、ヒドロキシフェニル、2−キノリン、1−[3−(3,4−ジヒドロキシシンナモイル)−1,3,4,5−テトラヒドロキシシクロヘキシル]、1−(3,5−ジクロロ−2−ヒドロキシフェニル)、1−(3,5−ジヨード−2−ヒドロキシフェニル)、1−(3,5−ジニトロ−2−ヒドロキシフェニル)、1−(4−アジド−2−ヒドロキシフェニル)、4−ビフェニル、2−ビフェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、3−アミノ−2−ナフチル、3−クロロ−2−ニトロフェニル、3,4−ジヒドロキシフェニル、3,4,5−トリヒドロキシフェニル、2−クロロ−3−ニトロフェニル、5−アジド−2−ニトロフェニル、3−アミノ−2−ピラジル、2−ベンジルオキシカルボニル−エチル、2−チエニル、2−(3,4−ジヒドロキシフェニル)エチレン、5−ブロモ−3−インドールメチレン、2−(4−ヒドロキシ−3−メトキシフェニル)エチレン、2−(3−クロロフェニル)エチレン、2−ピラジル、4−イミダゾリル、2−イミノ−1−イミダゾリジル、ピリジル、3−ピペリジル、4−ピペリジル、フルオロセイン、2−(4−アミノ−3,5,6−トリクロロ−ピリジル)、3−(2−クロロ−6−フルオロフェニル)−5−メチルイソキサゾリル、または4−アジド−フェニルのいずれか1個である疎水性部分であり得る。
【0031】
本発明はまた、ペプチド結合によって連続的に結合された8〜15個のアミノ酸部分の組成物を提供し、この組成物は、1個以上のヘパリン結合特性を有し、(i)式KLFR(naph−A)QAR3を有する配列または(ii)式R1KLFR(naph−A)QAR3の誘導体化された配列を含み、
ここで、R1は、上記の通りであり;そして
ここで、R3は、K、K(naph−A)、K(naph−A)K、K(naph−A)KG、K(naph−A)KGS、K(naph−A)KGSI、K(naph−A)KGSIKまたはK(naph−A)KGSIKIのいずれか1つであり;
ここで、カルボニル末端基は、アミド化されるかまたはアミド化されず、
そして、必要に応じて、アミノ酸部分の少なくとも1個の保存的置換を含む。好ましくは、組成物は、アミノ酸部分の2個以上の保存的置換を含む。
【0032】
本発明の構築物または組成物(誘導体化された構築物または組成物を含む)は、好ましくは、第1の2個のアミノ末端アミノ酸部分がD−アミノ酸部分であり、そして最後の2個のカルボキシル末端アミノ酸部分がD−アミノ酸部分である構築物または組成物を含む。
【0033】
外因性ヘパリン化合物(ヘパリンまたは低分子量ヘパリンのようなヘパリノイド物質を含む)が投与された哺乳動物においてヘパリンを中和する方法であって、外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するのに有効な量の本発明の組成物を、好ましくは上記哺乳動物の凝固時間を正常に戻すのに有効な量の本発明の組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する、方法;内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を上記哺乳動物に投与することによって、それを必要とする哺乳動物の内皮細胞増殖を阻害する方法;血管新生(眼の血管新生を含む)を阻害するのに有効な量のこのような組成物を上記哺乳動物に投与することによって、それを必要とする哺乳動物の血管新生を阻害する方法;血管新生に関する障害(慢性関節リウマチまたは反応性関節炎のような慢性炎症性疾患、および腫瘍細胞の成長、増殖または転移を含む)を羅患する哺乳動物を処置する方法もまた、提供される。
【0034】
このような構築物または組成物(本発明に従って誘導体化された構築物または組成物を含む)のさらなる特性または活性は、LPS結合、LPS中和、および/または抗菌活性および/またはBPIタンパク質産物の任意の他の以前に公知の活性または特性を含み得る。BPIの3つの機能性ドメインが以前に報告され、そして以下:約アミノ酸17から約アミノ酸45までのBPIのアミノ酸配列を包含するドメインI;約アミノ酸65から約アミノ酸99までのBPIのアミノ酸配列を包含するドメインII;約アミノ酸142から約アミノ酸169までのBPIのアミノ酸配列を包含するドメインIIIを含むが、生物学的に活性な逆(またはレトロ)配列は、以前にドメインIIの部分配列に基づいて報告されていない。従って、本発明に従うこのようなペプチドベースの逆(レトロ)配列構築物(これらは、好ましくは選択されたD−アミノ酸部分を含む)は、特に治療用薬剤として有用である。
【0035】
本発明の別の局面は、生物学的活性および少なくとも0.001%の上皮吸収を有する殺菌性/透過性増大タンパク質(BPI)のドメインIIから同定かつ選択された配列から誘導されるかまたはこの配列に基づいた誘導体化されたペプチド配列を同定するための方法を提供し、上記方法は、以下:
(a)N末端、C末端または上記ペプチド配列内の疎水性部分(単数または複数)の共有結合を通してBPIのドメインIIの配列、部分配列、逆配列または逆部分配列に基づくペプチド配列を誘導体化する工程;
(b)工程(a)で得られた上記誘導体化されたペプチド配列の活性を測定する工程であって、ここで、活性がヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか1つ以上である、工程;
(c)工程(a)で得られた上記誘導体化されたペプチド配列の上皮吸収を測定する工程、
を包含する。
【0036】
特に工程(a)における誘導体化に適切なペプチド配列は、生物学的活性を保持するのに必要な最小長さのペプチド(例えば、8〜15個のアミノ酸部分)である。
【0037】
このような方法は、少なくとも0.001%の上皮吸収を有するBPIまたはそのフラグメントから同定されるかまたは選択されたペプチド配列から誘導されるかまたはそのペプチドに基づいた生物学的に活性な誘導体化されたペプチドベースの配列、予防薬剤または治療用薬剤を設計および同定するための方法を包含し、上記方法は、以下:
(a)インビトロまたはインビボで活性を示すBPIまたはそのフラグメントのポリペプチド配列から誘導されるかまたはそのポリペプチド配列に基づいた標的ペプチド配列を同定する工程であって、ここで、この活性が、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか1つ以上である、工程;
(b)上記標的ペプチド配列内のアミノ酸部分を置換または欠失することによって、最小長さの活性保持ペプチド配列(MinLARPS)のライブラリーを構築する工程;
(c)上記標的ポリペプチド配列の活性の少なくとも1%の活性を保持するのに必要な最小数の残基を決定するために上記MinLARPSの活性を測定する工程であって、ここで、この活性が、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか1つ以上である、工程;
(d)どのMinLARPSが少なくとも0.001%の上皮吸収を保持するかを同定するためにインビボアッセイまたはインビトロアッセイで上記MinLARPSの上皮吸収を測定する工程;
(e)N末端、C末端または上記MinLARPSの配列内で結合した疎水性部分の共有結合を通して、上記MinLARPSを化学的に改変することによって誘導体化されたMinLARPSを合成する工程;
(f)上記誘導体化されたMinLARPSを用いて工程(c)および(d)を繰り返す工程、
を包含する。
【0038】
本発明のさらなる局面は、治療における使用のため、および外因性のまたは治療学的に投与されたヘパリン化合物を結合するための医薬の製造のための構築物または組成物の使用のため、またはヘパリン関連もしくはヘパリン媒介状態もしくは疾患を処置するための、本発明の構築物または組成物(本発明に従って誘導体化された構築物または組成物を含む)を含む。
【0039】
本発明の構築物または組成物、および薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む薬学的組成物もまた、本発明によって考慮される。
【0040】
(詳細な説明)
本発明は、8〜15アミノ酸部分の長さであり、BPIの機能的ドメインIIから同定および選択された逆方向の部分配列に由来するかまたはそれに基づく配列を有する、生物学的に活性な新規な化合物(または組成物)を提供する。構築物は、非誘導体化配列および疎水性部分の共有結合によって誘導体化された配列を含む。D−アミノ酸部分を含む配列を有する構築物が好ましい。D−アミノ酸部分が、配列の最初の2つのアミノ末端部分および最後の2つのカルボキシ末端部分として配置される配列を有する構築物が最も好ましい。このような構築物は、ヘパリン関連またはヘパリン媒介の障害、疾患、または状態の処置のために特に有用である。本明細書中で使用される場合、「処置」とは、予防的処置および治療的処置の両方を含む。哺乳動物(ヒトを含む)の処置が意図される。
【0041】
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸部分」とは、代表的なアミノ酸化合物および代表的ではないアミノ酸化合物(誘導体化されたアミノ酸およびアミノ酸アナログを含む)を含む。別のアミノ酸への1つのアミノ酸の「保存的」置換は、類似の構造的特性および/または化学的特性を有するアミノ酸の置換であり、そして一般的には、関与する残基の極性、電荷、疎水性、親水性、および/または両親媒性の性質における類似性に基づく。疎水性、極性中性、および極性塩基性のアミノ酸は、α、β、およびχについての上記のアミノ酸を含む。極性酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。一般的規則として、置換されたアミノ酸間の類似性が減少するにつれて、その置換が活性に影響を与える可能性は増大する。
【0042】
本発明の目的のために、用語「機能的ドメイン」は、BPIの1つ以上の生物学的活性を示すBPIのアミノ酸配列の領域を指定することが意図される。BPIのこれらの機能的ドメインは、15マーペプチドおよび他の合成ペプチドと重複する、タンパク質切断フラグメントの活性によって定義された。ドメインIは、およそアミノ酸17〜およそアミノ酸45を含むBPIのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、LPS−誘導されたLAL活性の阻害およびヘパリン結合アッセイの両方において中程度に活性であり、そして有意な抗細菌活性を示さなかった。ドメインIIは、およそアミノ酸65〜およそアミノ酸99を含むBPIのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、高いLPSおよびヘパリン結合能力を示し、そして有意な抗細菌活性を示した。ドメインIIIは、およそアミノ酸142〜およそアミノ酸169を含むBPIのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、高いLPSおよびヘパリン結合活性を示し、そして驚くべき抗微生物活性(抗真菌活性および抗細菌(例えば、抗グラム陽性および抗グラム陰性を含む)活性を含む)を示した。
【0043】
本発明の目的のために、用語「BPIの生物学的活性」は、ヒト殺菌性/透過性増大(BPI)タンパク質産物の1つ以上の生物学的活性または特性を含むが、それらに限定されないことが意図され、これらのタンパク質産物には、例えば、組換えBPIホロタンパク質(例えば、rBPI(配列番号28))、BPIのアミノ末端フラグメント(例えば、rBPI23)、および変異を有するBPIのアミノ末端フラグメント(例えば、rBP21ΔcysまたはrBPI(10−193)C132A(rBPI(10−193)ala132とも呼ばれる)であり、そして上記のBPIタンパク質産物の既知の活性の任意の1以上を含むアナログが含まれる。BPIの活性およびBPIの対応する機能的ドメインを含む対応するペプチドの活性の0.1倍〜10倍である、本発明の任意のペプチドに基づく構築物の生物学的活性が特に含まれる。用語「BPIの生物学的活性」は、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害、または脈管形成の阻害(例えば、インビボ新生血管形成(転移性腫瘍および慢性炎症疾患状態と関連するような新生血管形成)の阻害)の活性を含むことを意図するがそれらに限定されない。「BPIの生物学的活性」の定義には、LPS結合の活性、LPS中和、または抗微生物活性もまた、含まれる。「BPIの生物学的活性」のこの定義には、BPIまたはBPIの対応するドメイン全体を含む対応するペプチドの活性とは定性的に異なる生物学的活性(例えば、抗微生物活性)もまた、特に含まれる。例えば、このような定性的な差異は、このペプチドがBPIの対応する機能的ドメインのアミノ酸配列と比較して有効である、細菌または他の微生物のスペクトルの差異を含む。従って、この定義は、抗微生物活性(例えば、抗細菌活性(例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、マイコバクテリア、およびクラミジアに対して)および抗真菌活性(例えば、Candida、Aspergillus、Cryptococcus、Histoplasma、Coccidioides、Blastomyces、Basidiobolus、Conidiobolus、Rhizophus、Rhizomucor、Mucor、Absidia、Mortierella、Cunninghamella、Saksenaea、Fusarium、Trichophyton、Trichosporon、Microsporum、Epidermophyton、Scytalidium、Malassezia、Actinomyceies、Sporothrix、およびPenicilliumに対して))、ならびに抗原生動物活性を含む。
【0044】
本発明の目的のために、用語「誘導体化された」は、「誘導体化された構築物」または「誘導体化された組成物」の文脈において、疎水性部分に共有結合された配列を含む、ペプチドに基づく構築物または組成物をいう。好ましくは、疎水性部分は、配列のN末端に共有結合している。好ましくは、その疎水性部分は、本明細書中で規定されような、R2である。
【0045】
誘導体化に適した構築物を含む、ペプチドに基づく構築物は、ヒトBPIの機能的ドメインIIからの逆方向の置換部分配列(例えば、アミノ酸99〜92、99〜91、99〜89、99〜90、99〜88、99〜87、99〜86、または99〜85、ここで置換は75および91にある)、好ましくは、D−アミノ酸部分の配列に由来するか、その配列に基づく配列を含む。本発明に従うこのような構築物の実施形態は、以下の典型的な構築物を含む(アミノ酸についての1文字の略号は、G.Zubay,Biochemistry(第2版),1988(MacMillen Publishing:N.Y.)、33頁において見出され得る):
【0046】
【化3】
【0047】
本明細書中で使用される場合、「BPIタンパク質産物」は、天然で産生されるかまたは組換え的に産生されたBPIタンパク質;天然の、合成の、および組換え的な、BPIタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドフラグメント;BPIタンパク質またはそのフラグメントの生物学的に活性なポリペプチド改変体(ハイブリッド融合タンパク質およびダイマーを含む);BPIタンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体の生物学的に活性なポリペプチドアナログ(システイン置換アナログを含む);およびBPI−誘導体化ペプチドを含む。BPIタンパク質産物は、当該分野で公知の任意の手段によって生成および/または単離され得る。米国特許第5,198,541号は、組換えBPIホロタンパク質(rBPIおよびBPIの組換えフラグメントともいわれる)を含むBPIタンパク質をコードする組換え遺伝子、およびこのタンパク質の発現のための方法を開示する。米国特許第5,439,807号および対応する国際公開番号WO 93/23540(PCT/US93/04752)(これらはすべて、本明細書中に参考として援用される)は、培養中の遺伝的に形質転換された哺乳動物宿主細胞中で発現され、そしてそこから分泌される組換えBPIタンパク質産物の精製のための新規な方法を開示し、そして安定な、均一な薬学的調製物への取り込みのために適切な大量の組換えBPI産物をいかにして精製し得るかを開示する。
【0048】
BPIの生物学的に活性なフラグメント(BPIフラグメント)は、このフラグメント分子が、ハロタンパク質のアミノ末端のアミノ酸、内部のアミノ酸、および/またはカルボキシ末端のアミノ酸を、BPIの1つ以上の生物学的活性または免疫学的特性を喪失することなく欠いていること以外は、天然のヒトBPIハロタンパク質と同じかまたは類似のアミノ酸配列を有する生物学的に活性な分子を含む。このようなフラグメントの非限定的な例には、Ooiら、1991、J.Exp.Med.174:649によって記載された約25kDの天然のヒトBPIのN末端フラグメント、およびGazzano−Santoroら、1992、Infect.Immun.60:4754−4761において記載され、そしてrBPI23ともいわれる、天然ヒトBPIの1〜およそ193〜199のN末端アミノ酸をコードするDNAの組換え発現産物が含まれる。この公報においては、発現ベクターは、151位のバリンはGTCではなくGTGで特定され、そして残基185は、リジン(AAGによって特定される)ではなくグルタミン酸(GAGによって特定される)であること以外は、Grayら、前出の図1に示されるように、31残基のシグナル配列および成熟ヒトBPIのN末端の最初の199アミノ酸を有する組換え発現産物(rBPI23)をコードするDNAの供給源として使用されていた。組換えホロタンパク質(rBPI)はまた産生され、このタンパク質は、rBPI23についての例外、および残基417がバリン(GTTによって特定される)ではなくアラニン(GCTによって特定される)という例外を伴って、Grayら、前出の図1に示されるような配列(配列番号27および28)を有する。BPIの残基10〜193からなるN末端フラグメントのアナログは、米国特許第6,013,631号および対応する国際公開番号WO 99/66044(PCT/US99/13860)に記載され、これらは、本明細書中に参考として援用される。他の例には、米国特許第5,447,913号および対応する国際公開番号WO 95/24209(PCT/US95/03125)に記載されるような、BPIフラグメントのダイマー形態が含まれ、これらは本明細書中に参考として援用される。
【0049】
BPIの生物学的に活性な改変体(BPI改変体)には、組換えハイブリッド融合タンパク質(このタンパク質には、BPIホロタンパク質または生物学的に活性なそのフラグメント、および少なくとも1つの他のポリペプチドの少なくとも一部分が含まれる)、ならびにBPI改変体のダイマー形態が含まれるがこれに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質およびダイマー形態の例は、米国特許第5,643,570号および対応する国際公開番号WO 93/23434(PCT/US93/04754)に記載され(これらはすべて本明細書中に参考として援用される)、そしてアミノ末端においてBPIタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントを、およびカルボキシ末端において免疫グロブリン重鎖またはその対立遺伝子改変体の少なくとも1つの定常ドメインを含む、ハイブリッド融合タンパク質を含む。
【0050】
BPIの生物学的に活性なアナログ(BPIアナログ)には、1以上のアミノ酸残基が、BPIの1以上の生物学的活性または免疫学的特性の喪失を伴わずに異なるアミノ酸によって置換されているBPIタンパク質産物が含まれるがこれに限定されない。例えば、米国特許第5,420,019号および対応する国際公開番号WO 94/18323(PCT/US94/01235)(これらは、すべて本明細書中で参考として援用される)は、BPIおよびBPIのフラグメントのポリペプチドアナログを開示し、ここで、システイン残基が、異なるアミノ酸によって置換されている。本願によって記載される安定なBPIタンパク質産物は、BPIホロタンパク質のN末端アミノ酸のアミノ酸1〜およそ193または199をコードするDNAの発現産物であるが、ここで、残基番号132のシステインは、アラニンで置換されており、そしてこれは、rBPI21ΔcysまたはrBPI21と呼ばれる。BPIのこのN末端アナログ、rBPI21の産生は、Horwitzら、1996、Protein Exression Purification、8:28−40において記載されている。同様に、132位のシステインがアラニンで置換されているBPIの残基10〜193からなるフラグメント(「rBPI(10−193)C132A」または「rBPI(10−193)ala132」と呼ばれる)は、米国特許第6,013,631号および対応する国際公開番号WO 99/66044(PCT/US99/13860)に記載され、これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。他の例には、BPIアナログのダイマー形態が含まれる;例えば、米国特許第5,447,913号および対応する国際公開番号WO 95/24209(PCT/US95/03125)に記載され、これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。
【0051】
他のBPIタンパク質産物は、合成的手段または組換え的手段によって産生されるBPIに由来するか、またはこのBPIに基づくペプチド(BPI由来ペプチド)である。これらは、例えば、以下に記載されているものである:国際公開番号WO 97/04008(PCT/US96/03845)(これは、米国特許第5,858,974号に対応する)、および国際公開番号WO 96/08509(PCT/US95/09262)(これは、米国特許出願番号09/365,539に対応する)、および国際公開番号WO 95/19372(PCT/US94/10427)(これは、米国特許第5,652,332号および同第5,856,438号に対応する)、および国際公開番号WO 94/20532(PCT/US94/02465)(これは、米国特許第5,763,567号に対応し、米国特許第5,763,567号は、米国特許第5,733,873号の継続出願であり、米国特許第5,733,873号は、米国出願番号08/183,222の一部継続出願であり、米国出願番号08/183,222は、米国出願番号08/093,202の一部継続出願であり(国際公開番号WO 94/20128(PCT/US94/02401に対応する)、米国出願番号08/093,202は、米国特許第5,348,942号の一部継続出願である)、ならびに、国際公開番号WO 97/35009(PCT/US97/05287)(これは、米国特許第5,851,802号に対応する)。これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。
【0052】
本発明は、新規なペプチドに基づく構築物を定義し、この構築物には、誘導体構築物が含まれ、これは、BPIタンパク質産物の定義の中に含まれ得る。
【0053】
BPIタンパク質産物の投与は、好ましくは、BPIタンパク質産物および薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、またはキャリアを含む、薬学的組成物を用いて達成され得る。BPIタンパク質産物は、既知の界面活性剤または他の治療剤なしで、またはそれらと共に投与され得る。BPIタンパク質産物(例えば、rBPI23)を含む安定な薬学的組成物は、クエン酸緩衝化生理食塩水(5または20mM クエン酸、150mM NaCl、pH 5.0)中に1mg/mlの濃度でBPIタンパク質産物を含み、このクエン酸緩衝化生理食塩水には、0.1%重量のポロキサマー188(poloxamer 188)(PLURONIC(登録商標)F−68、BASF Wyandotte,Parsippany,NJ)および0.002%重量のポリソルベート80(polysorbate 80)(TWEEN(登録商標)80,ICI Americas Inc.,Wilmington,DE)が含まれる。BPIタンパク質産物(例えば、rBPI21)を含む別の安定な薬学的組成物は、5mM クエン酸、150mM NaCl、0.2% ポロキサマー 188および0.002% ポリソルベート 80中に2mg/mlの濃度でBPIタンパク質産物を含む。このような好ましい組み合わせは、米国特許第5,488,034号;同第5,696,090号;同第5,932,544号;同第5,955,427号;同第6,066,620号、および同第6,057,293号ならびに対応する国際公開番号WO 94/17819(PCT/US94/01239)(これらはすべて本明細書中で参考として援用される)において記載されている。米国特許第5,912,228号(米国特許第5,912,228号は、今度は、米国出願番号08/530,599の一部継続出願であり、米国出願番号08/530,599は、今度は、米国出願番号08/372,104の一部継続出願である)、および対応する国際公開番号WO 96/21436(PCT/US96/01095)(これらのすべては、本明細書中に参考として援用される)において記載されているように、増強された活性を有するBPIタンパク質産物の他のポロキサマー処方物が使用され得る。ペプチドに基づく構築物は、他のBPIタンパク質産物と同様に処方され得るか、あるいは生理食塩水または生理学的緩衝液中で処方され得る。
【0054】
BPIタンパク質産物を含む治療組成物(ペプチドに基づく構築物(誘導体化構築物を含む)またはこのような本発明の構築物を含む組成物を含む)は、全身的または局所的に投与され得る。投与の全身的経路には、経口、静脈内、筋肉内、または皮下注射(長期間放出のためのデポーを含む)、眼内および眼球後、鞘内、腹腔内(例えば、腹腔内洗浄)、肺内(粉末薬剤を使用して、またはエーロゾル投与または噴霧する薬剤溶液)、または経皮的を含む。局所的投与には、軟膏、点眼薬、点耳薬、または洗浄液(例えば、創傷の洗浄のための)の形態での投与が含まれる。
【0055】
非経口的に与えられた場合、BPIタンパク質産物組成物は、一般的に、1日あたり1μg/kg〜100mg/kgの範囲の用量、好ましくは1日あたり0.1mg/kg〜20mg/kgの範囲の用量で注射される。処置は、例えば、1〜3日間の間、1日あたりの同じ用量、減少された用量または増加された用量で、そしてさらに、処置する医師によって決定されるように、連続的な注入または断続的な注射もしくは注入によって継続され得る。
【0056】
当業者は、良好な医学的な実施および個々の被験体の臨床的状態によって決定されるように、BPIタンパク質産物(本発明の構築物または組成物を含む)を含む治療組成物についての有効な投薬量および投与レジメンを容易に最適化し得る。
【0057】
本発明の構築物(誘導体化された構築物を含む)またはこのような構築物を含む組成物は、BPI産物が有効であることが公知である治療的用途(上記の用途を含む)のいずれかにおいて使用され得、これらは、少なくとも約0.001%以上、好ましくは少なくとも約0.01%、0.1%、1%、10%、または20%以上の上皮細胞吸収を有することが予想される。本発明の構築物および組成物(特に誘導体化されたもの)は、必要に応じて、当該分野で公知の任意のアッセイ(実施例6、7、または8に記載されている経口吸収または輸送スクリーニングアッセイを含む)によってそれらの上皮吸収特性について試験され得る。この構築物は、外因性のヘパリンを結合および中和するための方法、内皮細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖と関連する障害を処置するための方法、血管形成を阻害して、そして血管形成に関連するか血管形成を含む障害を処置するための方法において特に有用であるが、BPIの他の生物学的活性に起因して処置可能な他の疾患または状態(内毒素に関連する感染および障害を含み、本明細書中に記載されているか、またはBPIタンパク質産物に関連する、当該分野で公知の任意の疾患または状態を特に含む)についてもまた有用であり得る。
【0058】
外因性のヘパリン化合物は、抗凝固が必要とされる外科的処置(例えば、心肺バイパス、心臓カテーテル手術、または血管形成術、および血液透析)の間に一般的に投与される。外因性ヘパリン化合物はまた、血栓症の危険があるか、または血栓症に罹患している患者(例えば、深部静脈血栓症、急性心筋梗塞、発作、または肺動脈塞栓症を罹患している患者)に投与される。
【0059】
血管形成関連障害は、血管形成が疾患の開始または進行において役割を果たす障害である。血管形成は、以下に例証するように多数の状態に関与し、そして血管形成の阻害は、これらの状態のいずれかを処置する(疾患の進行の阻害ならびに疾患の徴候および症状の改善を含む)ために有効であると予想されている。
【0060】
これらの治療的用途のいずれかのための医薬の調製における、本発明の構築物および組成物の使用(本発明に従って誘導されるものを含む)もまた、意図される。
【0061】
新しい脈管の産生が、癌細胞の急速な増殖を支持するために必要であるので、血管新生は、癌状態において非常に重要である。従って、血管新生の阻害は、以下の腫瘍の増殖の低減を含む、成人および小児の腫瘍学における腫瘍退行を促進し得る:固形腫瘍/悪性腫瘍(malignancies)、局所的に進行した腫瘍、転移性癌、ヒト軟組織肉腫、リンパ転移を含む癌転移、血球悪性腫瘍、滲出リンパ腫(腹腔ベースのリンパ腫)、肺癌(小細胞癌を含む)、非小細胞癌、乳癌(小細胞癌および腺管癌を含む)、胃腸の癌(胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新形成に関連するポリープ)、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器の癌(膀胱癌、前立腺癌を含む)、女性生殖器管の悪性腫瘍(卵巣癌、子宮内膜癌、および卵胞における固形腫瘍を含む)、腎臓癌(腎細胞癌を含む)、脳の癌(内在(intrinsic)脳腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠星状細胞性脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤を含む)、骨の癌(骨腫を含む)、皮膚癌(悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、および扁平上皮癌を含む)、血管周囲細胞腫ならびにカポージ肉腫。
【0062】
血管新生は、以下を含む慢性炎症において役割を果たす:膵臓炎、慢性炎症を伴う皮膚病(乾癬を含む)、肝硬変、ぜん息、多発性硬化症、関節炎(慢性関節リウマチ、反応性関節炎および慢性炎症性関節炎を含む)、自己免疫障害(脈管炎,糸球体腎炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)を含む)、狼瘡、重症筋無力症、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、血液透析に付随する慢性炎症、顆粒球輸血関連症候群;同種移植および異種移植後の拒絶反応(対宿主性移植片病を含む);ならびに他の慢性炎症性障害。
【0063】
眼における血管新生は、以下に関与する:眼の新生血管形成、増殖性網膜症、水晶体後線維増殖、黄斑変性、血管新生緑内障および糖尿病性の眼の疾患(特に、糖尿病性虹彩新生血管形成および網膜症。
【0064】
冠状動脈アテロームは、脆弱な毛細管ネットワークにより高度に血管化されており、そして高い脈管内圧に曝される場合に、これらの新しく形成された毛細管の破裂は、出血を生じてアテローム硬化性斑および冠状動脈閉塞を引き起こす。従って、血管新生の阻害は、アテローム硬化性斑の増殖を低減し得、そして以下の処置において有用であり得る:アテローム性動脈硬化症、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、冠状心臓疾患、再狭窄、特にその後のバルーン血管造影、新内膜(neointimal)過形成、脈管内皮における細胞間接合部の分裂、高血圧、血管損傷、動脈虚血、動脈狭窄、末梢血管疾患、発作。
【0065】
血管新生はまた、女性の生殖周期の間に起こり、そして女性の生殖周期の間の子宮内膜症、子宮フィブロイド、脈管増殖(子宮内微小血管増殖を含む)不全に付随する他の状態に関与する。
【0066】
血管新生はまた、異常血管増殖(脳動静脈奇形(AVM)、血管線維腫(angiofiblona)、および血管腫(hemangiona)を含む)に関与する。
【0067】
処置される状態に適切な他の治療剤(例えば、血管新生を阻害する他の薬剤または示された場合は癌治療剤)の同時投与もまた意図される。
【0068】
「共(concurrent)投与」または「同時投与(co−administration)」は、本明細書中で使用される場合、共にもしくは組み合わせて、一緒に、または互いに前後して、薬剤を投与することを含む。このBPIタンパク質産物および第2薬剤は、異なる経路により投与され得る。例えば、第2薬剤が、静脈内で、筋肉内で、皮下で、経口で、または腹腔内で投与される一方で、このBPIタンパク質産物は、静脈内で投与され得る。このBPIタンパク質産物および第2薬剤は、同じ静脈内ラインで連続的に与えられ得るし、または異なる静脈内ラインで与えられ得る。あるいは、第2薬剤が、例えば経口で投与される一方、このBPIタンパク質産物は、胃内送達のための特別な形態で投与され得る。処方されたBPIタンパク質産物および第2薬剤は、全ての薬剤が作用の部位で有効な濃度を達成することを可能にするために十分な様式でそれらが与えられる限り、同時にでもまたは連続的にでも投与され得る。
【0069】
本発明の他の局面および利点は、以下の例示的実施例を考慮して理解される。ここで、実施例1は、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の調製および精製を扱う;実施例2は、内皮細胞増殖アッセイにおけるペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビトロ活性を扱う;実施例3は、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の抗血管新生活性のインビボ試験を扱う;実施例4は、慢性炎症疾患状態のモデルにおける、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビボ試験を扱う;実施例5は、悪性黒色腫転移モデルにおける、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の試験を扱う;実施例6は、経口吸収スクリーニングアッセイにおける、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビトロ試験を扱う;実施例7は、経口吸収についての、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビボ試験を扱う;実施例8は、経口活性についての、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビボ試験を扱う;実施例9は、網膜新生血管形成モデルにおける、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビトロおよびインビボでの試験を扱う;実施例10は、ヘパリン中和についてのペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の試験を扱う;そして実施例11は、BPIタンパク質産物についてのさらなる活性アッセイにおける、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の試験を扱う。
【0070】
(実施例1)
(ペプチドベース構築物の調製および精製)
この実施例は、本発明に従う、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の調製および精製を扱う。
【0071】
ペプチドベースの構築物は、種々の合成手順に従って調製され得る。例えば、BPI由来のペプチドは、Applied Biosystems,Inc.Model 432ペプチド合成機を使用して、Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149およびMerrifield et al.,1966,Anal.Chem.,38:1905−1914の方法に従って、同一人に譲渡された米国特許出願第08/183,222号および米国特許第5,733,872号に記載されるように、固相ペプチド合成により調製されている。
【0072】
あるいは、BPI−誘導ペプチドは、米国特許第5,858,974号に記載されるように、N,N−ジイソプロピルカルボジイミド(DICまたはDIPCDI)/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)および2−(1−H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサ−フルオロホスフェート(HBTU)/HOBt/ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を使用する二重カップリング手順で、1−フルオレニルメチル−オキシカルボニル(Fmoc)保護ストラテジーを利用して、Advanced Chemtech(ACT−Model 357 MPS)合成機での固相ペプチド合成を使用して大規模で合成されている。
【0073】
本発明のペプチドベース構築物の合成において使用される固体支持体は、1%のジビニルベンゼン(DVB)架橋および0.56ミリモル/グラムの置換率を有する4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシ(Fmoc−Rinkアミド)リンカーを含むポリスチレン樹脂であった。0.1グラムと5グラムとの間の出発樹脂のスケールを使用し、そしてこのスケールは、本明細書中に記載される合成ペプチドベース構築物については概して0.25グラムであった。
【0074】
このような合成には、ジメチルホルムアミド(DMF)が主な溶媒であり、ピペリジン/DMFの50/50溶液は、それぞれ1分、5分および10分の3つの連続的な処理におけるFmoc脱保護のために使用された。二重カップリング手順を、各カップリングにおいて4:1のアミノ酸対ペプチド比を使用して、各サイクルで使用した。アミノ酸を0.5MのHOBtのN−メチルピロリジノン(NMP)溶液に、また0.5Mの濃度で溶解した。第1のカップリングについては、(アミノ酸に対して)等モル量の、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)のNMP0.5M溶液を使用し、そして45分間反応させた。第2のカップリングは、等容積のDIEAのNMP1M溶液(2:1、DIEA:アミノ酸)と共に、(アミノ酸に対して)等容積のHBTUのDMF0.5M溶液を30分間使用した。
【0075】
合成が完了すると、この樹脂をMeOHで処理し、減圧下で乾燥し、次いで36:2:1:1の比(容積は樹脂の量に依存する)のトリフルオロ酢酸(TFA):チオアニソール:エタンジチオール(EDT):水から構成されるカクテルを使用して2時間(最短で2時間を使用し、各アルギニンについてさらに30分間を使用するが、3時間は超えない)で切断し、最初の15分間は氷浴中であった。次いでこれらの溶液を、10%TFA水溶液に溶解し、メチルt−ブチルエーテル(MTBE)で3回洗浄し、凍結乾燥した。
【0076】
選択されたペプチドベースの構築物のアミノ末端は、上記のようなN−末端Fmoc保護ストラテジーを使用する固相での合成後に無水酢酸または他の有機カルボン酸で誘導体化され得る。ピペリジンでのFmoc除去後かつTFAでのペプチド切断前に、樹脂上のペプチドを、ジメチルホルムアミド中1時間で、2倍モル過剰のジイソプロピルエチルアミンと共に、10倍モル過剰の無水酢酸または4倍モル過剰の他の有機カルボン酸を用いて誘導体化し得るか、あるいはN,N−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)またはCIPCDI/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)および2−(1−H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサ−フルオロホスフェート(HBTU)/HOBt/ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を使用する二重カップリング手順を用いて誘導体化し得、そして種々のビルディングブロックのうちの1つを誘導体化のために使用し得た。次いでペプチドを、上記のようなTFA切断カクテルで樹脂から切断し、そして下記のように精製した。精製されたペプチドの誘導体化(N−末端アセチル化を含む)を質量分析により評価した。
【0077】
表Iに記載されるペプチドベース構築物の収率は、4.8%〜57.8%の範囲であった。全てのHPLC純度は、概して90%より高く、そして質量を質量分析により解釈した。
【0078】
それぞれの新しく合成したペプチドベース構築物の純度分析のために、凍結乾燥したペプチドベース構築物の希釈溶液を調製し、そして150mm×1mm、5μ粒子、300ÅポアのC−8Zorbaxカラムを備えたMichrom Ultrafast Microprotein Analyzerで分析した。カラムオーブンを40℃に設定し、流速は100μL/分であり、そして注入容積は、代表的には5〜10μLであった。HPLCを、移動相Aとして水中の5%アセトニトリル/0.1%TFA、そして移動相Bとして80%アセトニトリル/0.065%TFAを使用して行った。溶離液を、分光光度測定法により214nmでモニタリングした。パーセント純度を個々のペプチド構築物のピーク面積から算出した。
【0079】
選択された構築物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、40×10mmガードカートリッジおよび40×100mm Prep PakからなるDelta Pak C−18、15μm、300Åカートリッジカラムを備えたWaters Prep LC 2000 Preparative Chromatography System (Water Corp.,Milord,MA)を使用して精製した。このカラムを、25%緩衝液Bで平衡化した(ここでA=5%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸、そしてB=80%アセトニトリル/0.065%トリフルオロ酢酸)。このようなペプチドベース構築物を緩衝液A中約20mg/mLまで溶解し、そして200〜800mgを、8〜17mL/分で作動するLCポンプを通してカラムにアプライした。結合した物質を、30分あたり経験的に決定した緩衝液Bの勾配(例えば、25〜35%の緩衝液B)を用いて、8〜17mL/分で溶出した。(いくつかの構築物を、23〜43%の緩衝液B/30分の勾配で精製し;他の構築物を、種々の勾配(例えば、25〜45%、0〜60%、30〜70%、25〜75%、30〜60%または35〜75%の緩衝液B/30分)で精製した)。溶離液を、Waters 490E Programmable Multiwavelength Detectorで220nmおよび/または280nmおよび300nmでモニタリングした。フラクションを集め、そして目的の構築物について、40℃に維持されたZorbax C−8、150×1mm、5μm、300Åを備えたUltrafast Micoprotein Analyzer(Michrom BioResources,Inc.,Pleasanton,CA)でアッセイした。90%以上の純度で目的の構築物を含むフラクションをプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥した。回収した物質の純度を、分析用逆相HPLCで決定した。
【0080】
【表1】
【0081】
(a)慣例により、小文字で書かれた(例えば、lys)のアミノ酸部分は、D−アミノ酸部分を表し、そして大文字で書かれた(例えば、LYS)アミノ酸部分は、L−アミノ酸部分を表す;1つの形態のグリシンしか存在せず(D,Lは無い)、GLYもしくはGか、またはglyもしくはgとして表され得る。
【0082】
(実施例2)
(インビトロHUVECアッセイ)
この実施例は、内皮細胞増殖のインビトロアッセイにおけるペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の活性に関する。
【0083】
手短にいえば、ヒト臍静脈上皮細胞(HUVEC)を、EGM−2培地(Clonetics Corp.,San Diego,CA)中で培養し、収集し、そして96ウェル培養プレート上にプレートした。24時間静止させた後、細胞を増殖因子の存在下で種々のペプチドベースの構築物と72時間同時培養し、それらの活性を試験した。細胞増殖を、トリチウム化チミジンのDNAへの組み込みによって定量化し、そして1分あたりの数(cpm)において表した。
【0084】
実験手順の詳細は、以下の通りであった:HUVEC細胞を、Clonetics Corp.(Bio Whittaker,Inc.,San Diego,CAの子会社)からのEGM−2培地[EGM−2は、増殖因子(hFGF−B、VEGF、IGF−1、hEGF)、アルコルビン酸、ヘパリン、GA−1000および2% FBSを補充した内皮細胞基本培地−2(EMB−2)である]中、コンフルエントになるまで(約4〜7日)T75フラスコ中で培養した。細胞を0.025%のトリプシン/EDTAを用いて5分間トリプシン処理することによって収集した。反応を止めるために、2〜5%のFBSを添加した。細胞を遠心分離し、そしてハンクス平衡塩類溶液(HBSS)またはダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水D−PBSを用いて3回洗浄した。次いで、ペレットを、0.1%のFBSを補充したEBM−2中に再懸濁し、そしてGA−1000を使用した。細胞を計数し、そして細胞懸濁液を0.1%のFBSを有するEBM−2中に2×105/mLにて調製した;細胞を、96ウェルの平底培養プレート中に0.1mL/ウェルにて分配した(総量:0.1% FBS−EMB−2中に約20,000細胞/ウェル)。インキュベーションを、5% CO2中で37℃にて20〜24時間続けた。次の日、ペプチドベースの構築物を、96ウェルプレート中での試験のために調製した。上清を細胞−ウェルから吸引し、20μL/ウェルにてEBM−2または試験試薬で置換した。次いで、180μL/ウェルの1.12%のFBS−GFSを添加して、EBM−2中に1% FBS−GFSの最終濃度にした。この吸引および添加を、ウェル毎に行った。3H−チミジン(100μCi/mL)を、10μL/ウェル(1μCi/ウェル、最終)にて添加した。インキュベーションを、37℃で5% CO2下にて72時間続けた。プレートを収集するために、上清を細胞−ウェルから吸引し、次いで、75μL〜100μL/ウェルの0.025%のトリプシン−EDTAを添加した。フード中で室温にて8〜10分間インキュベーションした後、細胞をチェックし、そして100μL/ウェルの2〜5%のFBS−PBSを添加して反応を止めた。次いで、プレートを収集し、乾燥し、そしてInotech細胞収穫器(Inotech Biosystems,INB−384,Sample Processing and Filter Counting System,Lansing,MI)を用いて計数した。
【0085】
このようなHUVEC増殖アッセイの結果を表II中に示す。粗形態(純度>73%)中で試験するかまたは精製することによって、本発明に従うペプチドベースの構築物は、HUVEC増殖を阻害した。
【0086】
【表2】
【0087】
9−アミノ酸構築物(XMP.629)を用いる阻害活性は、15−アミノ酸親構築物(XMP.394)の阻害活性に類似した。繰り返しの実験(全8回)において、XMP.679は、3と10との間の範囲(3<x<10)で一貫してIC50値を示した。精製されたXMP.624、XMP.625、XMP.626、XMP.627、XMP.629、およびXMP.630を用いるさらなるアッセイにおいて、IC50値は、表II(それぞれ、4.9±0.5、1<x<3(7実験)、3<x<10(2実験)、3<x<10(3実験)、3<x<10および>50)中に示される値に相当した。
【0088】
(実施例3)
(インビボMATRIGEL(登録商標)血管新生アッセイ)
この実施例は、Matrigel(登録商標)を用いる血管新生のインビボアッセイにおけるペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の活性に関する。
【0089】
これらの実験について、本発明に従うペプチドベースの構築物を、ヘパリンで誘導した血管新生をマウスにおいてインビボで阻害するためのそれらの能力についてアッセイした。基底膜マトリックス(Matrigel(登録商標)、Becton Dickinson Labware,Mountain View,CA)を、解凍しかつ4℃に維持し、そして血管新生因子を、Passanitiら、1992、Lab.Invest.67:519−528に記載される通りに、概して液体状態のゲルに添加した。ヘパリンナトリウム(Sigma,St.Louis,MO)を、無菌PBS中で1,250〜10,000U/mLの範囲の種々の濃度に溶解し、そして8,000U/mLにてこの実験において使用した。ヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF;Sigma)を、PBS中の1% BSA中に25μg/mLに再構成した。2.5μLの溶解したヘパリン溶液および4.0μLの組み換えbFGFの1容量を、マウス1注入あたり0.5mLのMatrigel(登録商標)混合物に添加した。ペプチドベースの構築物を、このMatrigel(登録商標)混合物に、実験動物あたり10μL/0.5mLのMatrigel(登録商標)のアリコート中に0.5〜50μg/mL(最終濃度)の範囲の濃度変化で添加した。10μLの無菌PBSを、コントロール動物に注入されたMatrigel(登録商標)アリコートにおいてペプチドベースの構築物の代わりに置換した。
【0090】
6〜8週齢の(NIH手引きの下で維持した)雌C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory,Bar Barbor,ME)に、上記の通りに調製されたMatrigel(登録商標)の0.5mLのアリコートを背面正中線の下方で皮下注射した。注射の10日後、Matrigel(登録商標)ゲルを切除し、そしてドラブキン試薬(Sigma)中に置いた。総タンパクおよびヘモグロビン含量を、ゲルの機械的ホモジナイズ化の後、ドラブキン試薬中に貯蔵したゲルについて決定した。ヘモグロビン濃度を、Sigma手順#525およびこの手順に使用される試薬(Sigma(St.Louis,MO)によって供給される)を用いて測定した。所望される場合、総タンパク質レベルを、キット(DCタンパク質アッセイ,Bio−Rad,Richmond,CA)において商業上体系化されたマイクロプレートアッセイを用いて決定した。
【0091】
組織学的染色のために使用されるゲルを、ドラブキン試薬中に置くよりむしろ動物からの切除の後すぐにホルマリン固定化する。ホルマリン固定化したゲルを、凍結切片化のためにTissue−Tek O.C.T.化合物(Miles,Inc.,Elkhart,IN)中に包埋する。凍結切片のスライドを、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する(Humason,1979,Animal Tissue Techniques,第4版、W.H.Feeman & Co.,San Francisco,CA,第9章、111〜131頁に記載されるように)。ペプチドの効果を、添加されたペプチドなしで調製したMatrigel(登録商標)ゲルスライスに対する血管新生の阻害について、凍結染色された切片の鏡検によって決定する。血管新生阻害の程度を、BPIペプチド含有スライス中に見出された基準量のヘモグロビンを用いて定量化する。
【0092】
ゲルあたり10μgのペプチド構築物を用いるMatrigel(登録商標)アッセイの結果を、表III中に示す。データを、1グループあたり10匹のマウスを用いて、摘出したゲル(ISEM)からのヘモグロビン濃度の3連の測定の平均として表す。
【0093】
【表3】
【0094】
ペプチドベースの構築物は、bFGFで誘導した血管新生を阻害した。Matrigel(登録商標)アッセイは、実施例2中に記載されるHUVECアッセイ結果の確証をもたらす。
【0095】
さらなる実験において、インビボ血管新生アッセイを、Matrigel(登録商標)およびメラノーマ細胞(「メル−ゲル」アッセイ)を用いて開発した。上記で記載されるような雌C57B1/6Jマウスを、6〜8週齢にて使用し、そしてNIH手引きの下で維持した。上記に記載のような、基底膜マトリックス(Matrigel(登録商標))を、0.5mLのMatrigel(登録商標)あたり50μLでB16.F10悪性メラノーマ細胞に添加する前に4℃にて解凍した。B16.F10メラノーマ細胞の最終濃度を、10,000から100,000細胞/0.5mLのMatrigel(登録商標)まで変化させた。このアッセイについて、50μL(最終濃度は、1.0〜50.0μg/0.5mLのMatrigel(登録商標)で変化する)でのペプチドベースの構築物を、B16.F10メラノーマ細胞と予め混合し、そして腹部正中線付近の皮下注射の前にMatrigel(登録商標)に直接添加する。50μLの滅菌PBSを、コントロール動物に注射されたMatrigel(登録商標)アリコート中の構築物の代わりに置換する。注射の10日後、ゲルを摘出し、そして上記のように、ドラブキン試薬(Sigma)中に置く。総ヘモグロビン含量を、上記のように、ゲルの機械的ホモジナイズ化の後、ドラブキン試薬中に貯蔵したゲルについて決定する。ヘモグロビン濃度を、上記のように、Sigma手順#525およびこの手順において使用される試薬(Sigma(St.Louis,MO)よって供給される)を用いて測定する。メル−ゲルアッセイからのデータを、1グループあたり10匹のマウスを用いる、摘出したゲル(ISEM)からのヘモグロビン濃度の3連の測定の平均として表す。
【0096】
(実施例4)
(慢性炎症性疾患状態モデル:コラーゲン誘導関節炎または反応性関節炎)
この実施例は、ペプチドベースの構築物が関節炎のような慢性炎症性疾患状態におけるそれらの効果のために投与される場合の、ペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)のインビボ活性に関する。
【0097】
コラーゲンで誘導した関節炎モデルについて、関節炎を、Stuartら、1982、J.Clin.Invest.69:673−683の方法に従って、尾の基部において、ウシII型コラーゲンの皮内免疫化によってマウス中で誘導する。一般的に、マウスは、コラーゲン免疫化の21日後に関節炎症候群を発症し始める。次いで、処置されたマウスの関節炎スコアを、21〜25日の各日に、実施例1に従って調製されたペプチドベースの構築物またはコントロールとして緩衝液を尾静脈を介して静脈内注射して処置したマウスについて、120日の期間にわたって、盲目的様式で評価する。
【0098】
詳細には、ウシII型コラーゲン(Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham AL)を、0日目に尾の基部の皮内注射(0.1mg/マウス)を介して雄マウス(Mouse/DBA/1J)のグループ(各々は、約20〜25gの重量)に投与する。ペプチドベースの構築物を、0.5M NaCl、20mMの酢酸ナトリウム(pH6.0)からなる緩衝液中に溶解し、そして種々の濃度での投与のためにPBS緩衝液で希釈する。PBS緩衝液単独(0.1mL)を、コントロールとして投与する。
【0099】
コラーゲンで誘導した関節炎モデルをまた使用して、硫酸プロタミンとの比較においてペプチドの能力を評価する。詳細には、ペプチドベースの構築物を、上記のようにPBS中に溶解し、そして種々の濃度にて投与する。他の試験物質を、以下の投薬量にて投与する:硫酸プロタミン(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)(0.13mg/マウス)、タウマチンコントロールタンパク質(0.12mg/マウス)、およびPBS緩衝液(0.1mL)。マウスのグループに、コラーゲンでの注射後28〜32日の各々において尾静脈を介して静脈内注射により試験物質またはコントロール物質を与える。
【0100】
反応性関節炎モデルについて、ペプチドベースの構築物を投与して、Yongら、1988、Microbial Pathogenesis 4:305−310の方法に従って、Yersinia enterocolitica反応性関節炎モデルにおける反応性関節炎を処置する。詳細には、ペプチドベースの構築物を、Yersinia enterocolitica cWA 0:8 T2を以前に静脈内に注射した(すなわち、Yongら、前出に従うビルレンスプラスミドを欠く)DBA/2Jマウスに4×108細菌の計算した投薬量にて投与し、マウスにおける非敗血症関節炎を誘導する。マウスの各グループに、尾静脈を介して静脈内注射により試験物質またはコントロール物質を与える。
【0101】
Borrelia burgdorferiは、ライム病および関連する関節炎の原因である病原体であり、そしてそれは、その細胞壁においてLPS様複合体を所有し、この細胞壁は、E.coli.の細胞壁と異なるが構造的に関連する。Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)阻害アッセイにおいてB.burgdorferi LPSの阻害に対するペプチドベースの構築物の投与の効果を決定する。詳細には、LALアッセイを、例えば、2.5μg/mLにて投与されたB.burgdorferi LPSおよび例えば2ng/mLにて投与されたE.coli.0113 LPSに対するペプチドベースの構築物の効果を測定することによって実行する。
【0102】
(実施例5)
(悪性メラノーマ転移モデル)
この実施例は、インビボの悪性メラノーマ転移モデルにおけるペプチドベースの構築物(誘導体化構築物を含む)の活性に関する。
【0103】
これらの実験のために、ペプチドベースの構築物、プロタミンまたは緩衝液コントロールを、マウス悪性メラノーマ転移モデルにおいてそれらの効果を試験するために投与する。詳細には、C57BL6Jマウスのグループを、0日目に静脈内注射を介して尾静脈に105B16.F10悪性メラノーマ細胞を接種する。実施例1に従って調製された種々の濃度のペプチドベースの構築物を、1、3、6、8、10、13、15、17および19日に試験マウスの尾静脈に投与する。陽性コントロールとしての硫酸プロタミン(0.13mg/マウス)または陰性コントロールとしてのPBS緩衝液(0.1mL/マウス)を、コントロールマウスのさらなるグループに同様に投与する。この動物を、肺組織の観察のために20日目に頚部脱臼を介して屠殺するかまたは40日目まで死亡率について観察するかのいずれかを行う。各肺の葉を、気管を介して肺に3mLの水を注入することによって灌流しかつ膨張させる。次いで、表在性の腫瘍小節を、解剖顕微鏡を用いて計数し、そしてグループあたりに見出された腫瘍の数を、統計学的有意差について分析した。このような分析により、腫瘍の数を有意に減少しかつ生存を有意に延長させる効果を有するそれらの構築物を同定する。
【0104】
(実施例6)
(インビトロ経口吸収スクリーニング)
本実施例は、インビトロ輸送スクリーニングアッセイにおいて、ペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)の活性を扱う。
【0105】
これらの実験について、ペプチドベースの構築物を、MDCK細胞および/またはCACO−2細胞を使用するインビトロスクリーニングアッセイにおいて、潜在的な経口吸収についてスクリーニングする。手短に言うと、培養したMadin−Derbyイヌ腎臓上皮(MDCK)細胞(ATCC登録番号CCL−34)および/またはCACO−2(ヒト結腸癌)細胞(Audus,K.L.ら、1990、Phar.Res.,7:435−451)の単層を、コラーゲンコートした透過性フィルター支持体(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上で増殖させる。これらの細胞をコンフルエントにまで増殖させ、そして分化させる(例えば、MDCK細胞については約3日間またはCACO−2細胞については約21日間)。これらの単層の完全性を、経上皮(transepithelial)抵抗性を測定することによって決定する。これらの細胞を、MDCKまたはCACO−2のスクリーニングにおいて2.5時間、その上面側でペプチドベースの構築物と共にインキュベートする。この構築物の経上皮輸送を、それらの細胞の側底面側のインキュベーション培地の定量的HPLC分析によって測定する(順方向(forward)輸送)。放射性標識したマンニトールおよび/またはコルチゾンを、ポジティブコントロールとして使用する。さらに、この構築物の流出を、これらの細胞の上面側のインキュベーション培地の定量的HPLC分析によって測定する。これは、2.5時間の側底面側の構築物との細胞のインキュベーション後に行う。
【0106】
実験手順の詳細は以下のとおりであった:MDCK細胞またはCACO−2細胞を、細胞増殖培地(MDCK細胞については最小必須培地(イーグル)GIBCO(Grand Island,NY)#11095−080またはCACO−2細胞についてはDMEM、GIBCO#11965−050、高グルコース−500mL;FBS 10%(Hyclone)(熱処理した)−50mL;L−グルタミン(200mM)GIBCO#25030−016−5mL;CACO−2細胞については、非必須アミノ酸、GIBCO#11140−050(200mM、100×)−5.5mL;およびペニシリン/ストレプトマイシン(100μg/mL)GIBCO #15140−015−5mL(これらは、濾過しそして4℃で保存した))中のT75組織培養フラスコ中で、約90%のコンフルエンシーにまで増殖させる。これらの細胞をトリプシン処理し(MDCK細胞については、継代のために、その堅固な粘着性に起因して約20分間)、そして約3×106MDCK細胞/ウェルまたは約3×105CACO−2細胞/ウェルの濃度で、24.5mmトランスウェル(Transwell−COL、#3245、Corning Costar Corp.,Cambridge,MA)上に播種する。MDCK細胞については、培地を播種後1日で交換し、そしてそのMDCK細胞をさらに2日間増殖させる。CACO−2細胞については、培地を播種後2日毎に交換し、そしてそのCACO−2細胞を合計21日間まで増殖させる。
【0107】
その播種後の日の後に、それらの細胞を、輸送実験のために準備する。細胞に、新鮮な培地を2時間供給し、その後、輸送実験を開始する。次いで、細胞を、輸送培地(TM:ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)GIBCO#14025−027(フェノールレッドを含まない);10mM HEPES(1M HEPESから)GIBCO#15630−015(NaOHでpHを7.4に合わせる))で洗浄し、そして新しい6ウェルプレート中に配置する。アッセイのためのペプチドベースの構築物のドナー溶液を、約100μg/mLの濃度で1.5mL TM中に調製する。順方向輸送研究については、これらの1.5mL構築物溶液を、トランスウェルの上面チャンバに加える。約2.6mLのアクセプター溶液(TMのみ、構築物を含まない)を、側底面チャンバに加える。流出研究については、構築物を含むドナー溶液を、側底面チャンバに加え、そしてアクセプター溶液(TMのみ、構築物を含まない)を、上面チャンバに加える。各構築物を少なくとも3連でアッセイする。
【0108】
これらのトランスウェルを、2.5時間、37℃組織培養インキュベーターに戻す。2.5時間の終了時に、上面溶液および側底面溶液を、15mLのコニカルチューブ中で、高真空下で別々にフリーズドライ(凍結乾燥)する。次いで、これらのサンプルを、200μL HPLC緩衝液A(5% アセトニトリル;95% 水;0.1% テトラフルオロ酢酸(TFA))中に再懸濁し、そして50μLのこの再懸濁サンプルをHPLC分析に使用する。
【0109】
トリチウム化マンニトール(3H−マンニトール、1μCi/mL;Dupont NEN Research Products,#NET−101,Boston,MA)を含む1.5mL TMを含む上面コントロールウェルを、トリチウムのカウント/分(cpm)について別々に分析し、MDCK細胞単層の完全性を試験する。
【0110】
順方向輸送を、上面溶液の開始濃度(約100μg/mLの開始ドナー濃度)に対する、側底面チャンバ中のペプチドベースの構築物(HPLCピーク下の面積によって決定する)のパーセンテージとして計算する。流出実験について、その逆の計算(側底面溶液における開始構築物濃度に対する上面チャンバ中のペプチドベースの構築物のパーセンテージ)を行う。このような腸吸収スクリーニングは、潜在的な経口的に利用可能な化合物である構築物を同定する。
【0111】
(実施例7)
(インビボ経口吸収スクリーニング)
本実施例は、インビボスクリーニングアッセイにおいて、経口吸収についてのペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)の活性を扱う。このアッセイにおいて、経口栄養法によって構築物をマウスに投与する。
【0112】
手短に言うと、構築物の血清濃度を、投与後の種々の時間間隔でHPLCによって測定する。例えば、構築物を、種々の投薬量(例えば、10mg/kg体重または20mg/kg体重)でマウスに投与し得、そして血清ペプチド濃度を、マウスへの投与後の種々の時間間隔(例えば、1時間、4時間および/または24時間)で測定する。HPLC分析は、経口投与後に吸収される構築物を同定する。経口利用可能性の増加を示すこのような構築物は、経口投与後に治療的に有効な血清濃度を達成し得る。
【0113】
(実施例8)
(経口活性)
本実施例は、インビボ動物モデルにおいて、経口投与時の活性(経口活性)についてのペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)の活性を扱う。
【0114】
経口活性を試験するために有用な動物モデルとしては、上記実施例4および5において記載されたモデルが挙げられる。処置を、0.5%デキストロース、または種々の投薬量レベル(例えば、投薬レジメンに従う、10mg/kgまたは20mg/kg)の、0.5%デキストロース中の試験ペプチドベース構築物のいずれかの経口栄養法(約400μl)によって開始する。効力についてのモニタリングを、毎日行う。経口活性なペプチドベースの構築物で処置した動物は、デキストロース処置したコントロールと比較して改善を示す。
【0115】
(実施例9)
(網膜新生血管形成モデル)
本実施例は、網膜新生血管形成モデルにおけるペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)が投与される場合のそれらの効果についての、それらのインビボ活性を扱う。
【0116】
これらの実験において、ペプチドベースの構築物を、網膜色素上皮細胞(RPE)、網膜微小血管周囲細胞および網膜内皮細胞のインビトロ増殖および移動に対するVEGF、bFGF、IGF−1および馴化培地(低酸素および高血糖)の作用に対する、それらの活性について試験する。効果を、低酸素条件下または高血糖条件下での遺伝子発現に対して評価する。さらなる実験において、このような構築物の効果を、新生児マウスの網膜における低酸素に対する血管新生応答に対してインビボで特徴付ける。
【0117】
インビトロ培養実験のために、ウシ網膜由来の網膜微小血管周囲細胞、網膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞(RPE)を、培養する。VEGF、bFGFおよびIGF−1によって刺激された場合の増殖および移動に対する、用量応答および時間経過を取る。例えば、VEGFによって刺激された場合の網膜内皮細胞増殖は、DNA含量(ng/細胞ウェル)によって測定したときに、5μg/mLおよび15μg/mLのXMP.679で阻害された。XMP.670処理したVEGF刺激細胞におけるDNA含量によって測定したときの細胞増殖は、VEHFによって刺激されていない細胞の細胞増殖に匹敵した。さらに、低酸素条件または高血糖条件に曝した培養RPE、周囲細胞および内皮細胞から収集した馴化培地を、無血清培地中に収集する。これらの増殖因子および馴化培地の用量応答を決定する場合、個々での、および上記増殖因子との組合せでのペプチドベースの構築物の効果を、増殖および移動アッセイにおいて試験する。
【0118】
インビボ実験のために、網膜新生血管形成に対するペプチドベースの構築物の効果を評価するための研究を行う。新生児マウスを、100% O2に長期間曝し、そして取り出す。この増加した酸素供与は、網膜血管構造の発達を遅延させ、その結果、新生児マウスを大気中に戻すときに、網膜は重篤な低酸素状態になり、そしてVEGF、bFGF、IGF−1などを含む多くのサイトカインの放出が生じる。網膜新生血管形成は、100%の動物で生じる。網膜新生血管形成の重篤度を、網膜切片中の内部境界膜に対して内部にある内皮細胞核を計数することによって定量する。VEGFおよびKDRの発現を、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンおよびウエスタンブロット分析によって評価する。網膜全体のチロシンリン酸化パターンもまた、ウエスタンブロット分析によって評価する。網膜新生血管形成を阻害するかまたは減少させるペプチドベースの構築物を同定する。
【0119】
(実施例10)
(ヘパリンの結合および中和)
本実施例は、ペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)のヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性を扱う。
【0120】
ChromostrateTMアッセイを使用して、ATIII/ヘパリン複合体による第Xa因子中和に対する、ペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)の効果および(ポジティブコントロールとしての)硫酸プロタミンの効果を決定した。このアッセイは、ChromostrateTMヘパリン抗第Xa因子アッセイキット(Organon Teknika Corp.,Durham,N.C.)を使用して行った。ヘパリン濃度を変化させ、それによってヘパリン標準曲線を作成した。このアッセイは、インビトロでの抗Xa活性に対するヘパリンの増強効果を測定した。ヘパリンを含む溶液を、過剰の第Xa因子と共にATIIIの存在下でインキュベートし、ATIII−ヘパリン−Xa複合体を形成させる。残存するXaは、その色素生産性基質からのp−ニトロアニリン(pNA)の放出を触媒する。このp−ニトロアニリンの放出は、405nmで測定される。吸光度は、サンプル中のヘパリンの濃度に対して逆に比例して得られた。
【0121】
このアッセイのための試薬は、以下のように調製する。ヘパリン、ペプチドベースの構築物および硫酸プロタミンのストックは、生理食塩水中に作製する。ストック溶液は、約1mg/mL=1μg/μLである。第Xa因子試薬および基質試薬は、2.0mLの精製水を用いて再構成する。アンチトロンビンIII(ATIII)試薬は、1.0mLの精製水を用いて再構成する。このアッセイを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。アッセイ成分を、以下のように、このマイクロタイターウェルに添加する:12.5μlのヘパリン(0〜10U/mL)、25μlの構築物または硫酸プロタミン、12.5μLのATIII(0.5 PEU/mL)、25μLのウシ第Xa因子(14nKat/mL)、25μLの基質(3μモル/mL)。反応を20分間進行させ、次いで、25μLの0.1M酢酸を添加する。この着色反応を、405nmでマイクロプレートリーダーで定量する。ヘパリンを中和する構築物は、405nmでの吸光度における増加を示す。プロタミンをポジティブコントロールとして使用し、その活性を100%と定める。各ペプチド構築物についてのパーセント(%)ヘパリン中和を、プロタミンによる中和(100%)に対して計算し、そして表IVに示す。
【0122】
【表4】
【0123】
(実施例11)
(さらなる活性のアッセイ)
本実施例は、BPIタンパク質産物の活性についての当該分野で公知の種々のアッセイにおいて、ペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)の活性についてのそれらの試験に取り組む。
【0124】
BPIタンパク質産物(BPI由来ペプチドを含む)の種々の生物学的活性を試験するために有用なアッセイは、共有に係る米国特許第5,733,872号;同第5,763,567号;同第5,652,332号および同第5,856,438号ならびに対応PCT公開番号WO94/20532(PCT/US/02465)およびWO95/19372(PCT/US94/10427)、および米国特許第5,858,974号および対応PCT公開番号WO96/08509(PCT/US95/09262)およびWO97/04008(PCT/US96/03845)(これらは、本明細書中に参考として援用される)に記載される。これらの活性としては、抗微生物(抗細菌および抗真菌を含む)、LPS結合、LPS中和、ならびにヘパリン結合およびヘパリン中和のさらなるアッセイが挙げられる。表Iに示されるペプチドベースの構築物(誘導体化された構築物を含む)を、E.coli(J5および0111B4)、Staphylococcus aureusおよびCandida albicansに対するそれらの抗微生物効果について、ブロスアッセイおよび/または放射状拡散アッセイにおいて試験し(例えば、米国特許第5,858,974号の実施例2(Candida細胞を用いるブロスアッセイについて、ブロス中に2×106細胞/mLに代って5×103細胞/mLに希釈したことを除く)ならびに米国特許第5,652,332号の実施例2および13(細菌トリプシンソイブロスでのブロスアッセイを、Mueller Hintonの代わりに使用したことを除く)に実質的に従って)、各構築物は、1以上の細菌株および/またはCandidaに対する抗微生物活性を示した。試験した最も高い抗微生物活性を有する非誘導体化構築物としては、XMP.627、XMP.628、XMP.629、XMP.656、XMP.679、XMP.760、XMP.764、XMP.776およびXMP.778が挙げられた。試験したとき最も高い活性を有する誘導体化構築物としては、XMP.664およびXMP.767が挙げられた。
【0125】
LPS中和の他のアッセイにおいて、本発明の例示的な構築物(例えば、XMP.624、XMP.625、XMP.626、、XMP.628およびXMP.629)は、RAW細胞アッセイ(例えば、米国特許第5,858,974号の実施例7、および米国特許第5,653,332号の実施例20Dに実質的に従って;他のLPSアッセイとしては、米国特許第5,652332号の実施例4、20A、B、C、E、FおよびG、25ならびに26が挙げられる)において活性を示した。
【0126】
インビトロおよびインビボの両方のさらなるヘパリン結合アッセイおよびヘパリン中和アッセイ(例えば、米国特許第5,652,332号の実施例6、11、17および21が挙げられる)は、BPIタンパク質産物について記載されており、そして本発明のペプチドベースの構築物を試験するために有用である。
【0127】
他のペプチドベースの構築物は、米国特許出願番号09/344,541および同時に出願された一部継続出願米国特許出願番号_[「Derivative Compounds」、代理人整理番号11045US02(100−257.P1)]および同時に出願された対応PCT出願番号_に記載され、そしてそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。本明細書中に引用される全ての米国特許、米国特許出願、国際PCT公開および参考文献は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。上記の本発明の多くの改変および変更は、当業者によって想到されるものと予想される。従って、添付の特許請求の範囲において明らかなような限定のみが、本発明に対して付与されるべきである。
【配列表】
Claims (20)
- へパリン結合、へパリン中和、内皮細胞増殖阻害または抗脈管形成特性のうちの少なくとも1つを有する、ペプチドベースの構築物であって、以下の式:
KLFR(D−ナフチルアラニン)QAK(D−ナフチルアラニン)
を有する配列からなる、ペプチドベースの構築物。 - ヘパリン中和特性を有する、請求項1に記載の構築物。
- 内皮細胞増殖阻害特性を有する、請求項1に記載の構築物。
- 抗脈管形成特性を有する、請求項1に記載の構築物。
- 外因性ヘパリン化合物を投与された哺乳動物におけるヘパリンを中和するための組成物であって、該外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するに有効な量で、請求項1に記載の構築物を含む、組成物。
- 前記哺乳動物の凝固時間が、正常に戻る、請求項5に記載の組成物。
- 内皮細胞増殖の阻害を必要とする哺乳動物における該内皮細胞増殖を阻害するための組成物であって、該内皮細胞増殖を阻害するに有効な量で、請求項1に記載の構築物を含む、組成物。
- 血管新生を阻害する必要がある哺乳動物において該血管新生を阻害するための組成物であって、該血管新生を阻害するに有効な量で、請求項1に記載の構築物を含む、組成物。
- 前記血管新生が、眼においてである、請求項8に記載の組成物。
- へパリン結合、へパリン中和、内皮細胞増殖阻害または抗脈管形成特性を有する、誘導体化されたペプチドベースの構築物であって、以下の式:
R1−KLFR(D−ナフチルアラニン)QAK(D−ナフチルアラニン)
を有する配列からなり、ここで、
R1は、R2−CH2−、R2−CH2−CO−、R2−CO−、R2−SOy−またはR2−PO z −のいずれか1つであり;
ここで、y=0〜3、z=1〜4であり;
R2は、少なくとも3つの炭素原子を有する環式分子、少なくとも3つの原子を有する複素環式分子、少なくとも3つの炭素原子を有する官能化された環式分子または少なくとも3つの原子を有する官能化された複素環式分子のうちのいずれか1つである疎水性部分である、誘導体化されたペプチドベースの構築物。 - ヘパリン中和特性を有する、請求項10に記載の構築物。
- 内皮細胞増殖阻害特性を有する、請求項10に記載の構築物。
- 抗脈管形成特性を有する、請求項10に記載の構築物。
- 外因性ヘパリン化合物を投与された哺乳動物におけるヘパリンを中和するための組成物であって、該外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するに有効な量で、請求項10に記載の構築物を含む、組成物。
- 前記哺乳動物の凝固時間が、正常に戻る、請求項14に記載の組成物。
- 内皮細胞増殖の阻害を必要とする哺乳動物における内皮細胞増殖を阻害するための組成物であって、内皮細胞増殖を阻害するに有効な量で、請求項10に記載の構築物を含む、組成物。
- 血管新生を阻害する必要がある哺乳動物において血管新生を阻害するための組成物であって、血管新生を阻害するに有効な量で、請求項10に記載の構築物を含む、組成物。
- 前記血管新生が、眼においてである、請求項17に記載の組成物。
- 前記R2が、(a)飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、3〜8、好ましくは5または6の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭素環式環;(b)飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、3〜8、好ましくは5または6の原子を含む、必要に応じて置換された複素環式環であって、ここで、少なくとも1つの原子が、酸素、窒素または硫黄のうちのいずれか1つであるヘテロ原子である、複素環式環;あるいは(c)必要に応じて置換された二環式環:
- 前記R2が、ビオチン、2−ビフェニレン、2−アントラキノン、2−ベンゾフラン、2−インドール、1−イソキノリン、ヒドロキシフェニル、2−キノリン、1−[3−(3,4−ジヒドロキシシンナモイル)−1,3,4,5−テトラヒドロキシシクロヘキシル]、1−(3,5−ジクロロ−2−ヒドロキシフェニル)、1−(3,5−ジヨード−2−ヒドロキシフェニル)、1−(3,5−ジニトロ−2−ヒドロキシフェニル)、1−(4−アジド−2−ヒドロキシフェニル)、4−ビフェニル、2−ビフェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、3−アミノ−2−ナフチル、3−クロロ−2−ニトロフェニル、3,4−ジヒドロキシフェニル、3,4,5−トリヒドロキシフェニル、2−クロロ−3−ニトロフェニル、5−アジド−2−ニトロフェニル、3−アミノ−2−ピラジル、2−ベンジルオキシカルボニル−エチル、2−チエニル、2−(3,4−ジヒドロキシフェニル)エチレン、5−ブロモ−3−インドールメチレン、2−(4−ヒドロキシ−3−メトキシフェニル)エチレン、2−(3−クロロフェニル)エチレン、2−ピラジル、4−イミダゾリル、2−イミノ−1−イミダゾリジル、ピリジル、3−ピペリジル、4−ピペリジル、フルオレセイン、2−(4−アミノ−3,5,6−トリクロロ−ピリジル)、3−(2−クロロ−6−フルオロフェニル)−5−メチルイソキサゾリルまたは4−アジド−フェニルのうちのいずれか1つである疎水性部分である、請求項10に記載の構築物。
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