ES2246178B1 - Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas. - Google Patents
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Abstract
Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas. Uso del péptido de SEQ NO 1 obtenido a partir de la proteína beta amiloide o del correspondiente anticuerpo, obtenido por inmunización de mamíferos o aves con una proteína conjugada a dicho péptido, en la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de otras enfermedades relacionadas, que supera las desventajas asociadas a usar péptidos, proteínas o inmunógenos endógenos.
Description
Uso de anticuerpos para el tratamiento de
enfermedades amiloideas.
La presente invención se relaciona con una
vacuna para el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas
con la presencia de depósitos amiloides, entre las que se
encuentra la enfermedad de Alzheimer.
Se conocen ciertos hechos acerca de los
fenómenos bioquímicos y metabólicos asociados con la presencia de
la enfermedad de Alzheimer (AD). Dos cambios morfológicos e
histopatológicos observados en cerebros con enfermedad de Alzheimer
son las marañas neurofibrilares (NFT) y los depósitos amiloides.
Las marañas neurofibrilares intraneuronales está presentes también
en otras enfermedades neurodegenerativas, pero la presencia de los
depósitos amiloides tanto en los espacios intraneuronales (placas
neuríticas) como en las proximidades de la microvasculatura (placas
vasculares) parece ser característico de la enfermedad de
Alzheimer. De estas, las placas neuríticas parecen ser las más
frecuentes (Price, D.L., y col., Drug Development Research (1985)
5:59-68).
El componente principal de estas placas
amiloides es un péptido de 40-42 aminoácidos
denominado péptido amiloide A\beta4.
El péptido amiloide A\beta4 es un polipéptido
originado por proteolisis a partir de unas glucoproteínas de
membrana denominadas proteínas precursoras del péptido amiloide
A\beta4 (\betaAPP). Estando estas proteínas, precursoras del
péptido amiloide, constituidas por 695 a 770 aminoácidos, siendo
todas ellas producidas por el mismo gen.
Se han identificado dos variantes principales
del péptido amiloide A\beta4, el péptido A\beta40 y el
A\beta42, de 40 y 42 aminoácidos respectivamente, que presentan
una distribución tisular diferente en condiciones tanto
fisiológicas como patológicas. Es la variante de 42 aminoácidos la
forma predominante en las placas amiloides localizadas en cerebros
de enfermos de Alzheimer.
Hasta la fecha se han propuesto diferentes
posibles soluciones hacia una posible vacuna frente a la
enfermedad de Alzheimer.
En la EP 526.511 se propone la administración de
dosis homeopáticas de A\beta a pacientes con AD preestablecida.
Sin embargo, debido a que las dosis empleadas apenas varían los
niveles de A\beta endógeno circulante en plasma, no se espera
ningún beneficio terapéutico.
Schenk et al., (Nature, 1999; 400 :
173-177) describe la inmunización con A\beta42,
de ratones transgénicos PDAPP, los cuales sobreexpresan APP mutante
humana, previniendo la formación de placas amiloides, distrofia
neurítica y astrogliosis.
En la solicitud de patente WO 99/27944 (Schenk
D.) se describe el tratamiento de AD por administración de
A\beta42 a un paciente.
Un ensayo clínico de fase II en 360 pacientes
diagnosticados con media a moderada AD en 4 países Europeos y
Estatos Unidos en el que se empleaba péptido amiloide A\beta42
como antígeno, fue discontinuado tras reportarse encefalitis en
algunos de los pacientes (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002,
S007455320, The Scientist 16[7]:22, Apr. 1, 2002).
El problema de emplear como vacuna una proteína
endógena (o una proteína presente naturalmente en el animal que
está siendo vacunado), como es en el caso de el péptido A\beta42,
es que el organismo responde fabricando anticuerpos frente a
A\beta42 y frente a fracciones más cortas que pueden tener
también funciones fisiológicas todavía desconocidas, entre algunos
de los posibles problemas podemos citar el posible desarrollo de
enfermedades autoinmunes debido a la generación de anticuerpos
frente a la proteína endógena, dificultad en la generación de una
respuesta inmune debido al fallo del sistema inmune para reconocer
antígenos endógenos y posible desarrollo de una respuesta
inflamatoria aguda.
La presente invención está dirigida al
tratamiento de Alzheimer y otras enfermedades amiloideas por
administración bien de un péptido, de la parte
C-terminal de A\beta conjugado con una proteína,
que en una realización preferida de la presente invención dicha
proteína es la hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin
en inglés), o bien del correspondiente anticuerpo obtenido por
inmunización de mamíferos o aves con dicho péptido.
En la ES 2.201.929 se describen cuatro
anticuerpos policlonales que reconocen específicamente los péptidos
amiloides A\beta40 y A\beta42. Entre ellos se encuentra el
anticuerpo policlonal obtenible por inmunización de mamíferos con
una proteína conjugada con el péptido de SEQ ID NO 1. En esta
patente se describe también el uso de éstos en métodos de
valoración de fármacos que degradan o inhiben la formación de los
péptidos amiloides anteriores.
Es por tanto deseable contar con medicamentos
que comprendan un agente activo capaz de inducir una respuesta
inmune frente a los péptidos amiloides. La inducción de una
respuesta inmune puede ser activa o pasiva.
Los inventores sorprendentemente han encontrado
que el empleo del péptido de SEQ ID NO 1, bien como inmunógeno
para inducir de manera activa la respuesta inmune frente a los
péptidos amiloides, o bien del correspondiente anticuerpo, obtenido
por inmunización de mamíferos o aves con una proteína conjugada a
dicho péptido, para inducir de manera pasiva la respuesta inmune
frente a los péptidos amiloides, supera las desventajas asociadas a
usar péptidos, proteínas o immunógenos endógenos.
De modo que, según una realización de la
presente invención, se proporciona una vacuna para la prevención
y/o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de otras
enfermedades relacionadas, que supera las desventajas asociadas a
usar péptidos, proteínas o immunógenos endógenos.
Ejemplos de otras enfermedades caracterizadas
por depósitos amiloides son el Síndrome Hereditario Islándico,
mieloma múltiple, encefalopatías espongiforme, incluyendo la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.
Para los propósitos de la presente invención,
los siguientes términos son definidos a continuación:
El término "enfermedades amiloideas
relacionadas" incluye enfermedades asociadas con la acumulación
de amiloide el cual puede estar restringido a un órgano,
amiloidosis localizada, o difundido en varios órganos, amiloidosis
sistémica. Amiloidosis secundaria puede ser asociada con
infecciones crónicas (como p.e. tuberculosis) o inflamación crónica
(p.e. artritis reumatoide), Fiebre Mediterránea Familial (FMF) y
otro tipo de amiloidosis sistémica encontrada en pacientes en
tratamiento de hemodiálisis de largo plazo. Formas localizadas de
amiloidosis incluye, sin limitarse a estas, diabetes tipo II y
cualquier otra enfermedad relacionada con esta, enfermedades
neurodegenerativas con
SCRAPIE, encefalitis espongiforme bovina, enfermedad de Cretzfeldt-Jakob, enfermedad de Alzheimer, angiopatía amiloide cerebral.
SCRAPIE, encefalitis espongiforme bovina, enfermedad de Cretzfeldt-Jakob, enfermedad de Alzheimer, angiopatía amiloide cerebral.
El término "inmunización pasiva" es
utilizado para referirse a la administración de anticuerpos o
fragmentos de ellos a un individuo con la intención de conferirle
inmunidad.
El término "inmunización activa" es
utilizado para referirse a la administración de péptidos que actúan
como inmunógenos, a un individuo con la intención de conferirle
inmunidad.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de un péptido seleccionado entre el
grupo formado por el péptido de SEQ ID NO 1, los péptidos con una
secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido
N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID
NO 1 y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las
secuencias precedentes los restos de aminoácido necesarios para la
conjugación de una proteína, en la preparación de un medicamento
para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad caracterizada
por la acumulación de depósitos amiloides en el cerebro de un
paciente.
Según una realización preferida, el péptido
induce la producción de anticuerpos capaces de reconocer de forma
específica cualquiera de las variantes predominantes del péptido
beta amiloide A\beta40 y A\beta42.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de un anticuerpo o un fragmento
activo o derivado de un anticuerpo obtenible por inmunización de
mamíferos con una proteína conjugada al péptido de SEQ ID NO 1, en
la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento
de una enfermedad caracterizada por la acumulación de depósitos
amiloides en el cerebro de un paciente.
Según una realización preferida, el anticuerpo,
fragmento activo o derivado es capaz de reconocer de forma
específica cualquiera de las variantes predominantes del péptido
beta amiloide A\beta40 y A\beta42.
El medicamento obtenido puede ser empleado tanto
en pacientes asintomáticos como en aquellos que ya muestran
síntomas de la enfermedad.
De acuerdo con la presente invención, las
composiciones capaces de provocar una respuesta inmune dirigida
contra ciertos componentes de las placas amiloideas son efectivas
para el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con
depósitos amiloides. En particular, de acuerdo con una realización
de la presente invención, es posible prevenir el progreso,
disminuir los síntomas y/o reducir el proceso de deposición
amiloide en un individuo, cuando una dosis inmunoestimulatoria del
péptido o de un anticuerpo obtenido a partir de éste, es
administrado al pa-
ciente.
ciente.
Los anticuerpos empleados son obtenidos por
inmunización de mamíferos o aves, mediante el empleo de un péptido
conjugado a una proteína como inmunógeno.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, los mamíferos empleados para su inmunización
pueden ser rumiantes, équidos, lagomorfos, carnívoros, primates o
cualquier otro animal que permita obtener cantidades de suero
adecuadas como para extraer de éste suficiente cantidad de
anticuerpo. De entre las aves empleadas para su inmunización
podemos citar, no considerándose de forma limitativa, las
galliformes, anseriformes y columbiformes, entre otras.
En esta solicitud los aminoácidos se abrevian
utilizando los códigos de una letra aceptados en el campo, en la
forma que se muestra a continuación:
A= Ala = alanina,
C= Cys = cisteína,
D= Asp = ácido aspártico,
E= Glu = ácido glutámico,
F= Phe = fenilalanina,
G= Gly = glicina,
H= His = histidina,
I= Ile = isoleucina,
K= Lys = lisina,
L= Leu = leucina,
M= Met = metionina,
N= Asn = asparagina,
P= Pro = prolina
Q= Gln = glutamina,
R= Arg = arginina,
S= Ser = serina,
T= Thr = treonina,
V= Val = valina,
W= Trp = triptofano,
Y= Tyr = tirosina,
La secuencia descrita anteriormente en la
presente invención, e identificada como SEQ ID NO 1, se
corresponde con la siguiente secuencia de aminoácidos:
SEQ ID NO 1 \hskip1cm RHDSGYEVHHQK
Los anticuerpos obtenidos a partir de los
péptidos anteriores reciben en la presente solicitud el código de
SAR-1.
La información relativa a la identificación de
las secuencias peptídicas, descritas en la presente invención, que
se acompaña a la presente memoria en formato legible por ordenador,
es idéntica al listado de secuencias que se presenta acompañando a
la memoria.
Figura 1.- Placas amiloides en cerebros con
Alzheimer detectadas con el anticuerpo SAR-4.
Figura 2.- Western Blot en el que se demuestra
la especificidad del anticuerpo SAR-1, el cual
detecta específicamente las dos isoformas, pero teniendo más
afinidad por la supuestamente más neurotóxica (A\beta42). En cada
calle se ha cargado el péptido indicado en la cantidad de
nanogramos especificada (10, 100, 200 ó 500).
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos.
Los anticuerpos policlonales fueron generados
por inmunización de conejos New Zealand White contra el péptido
acoplado a KLH que se utilizó como inmunógeno.
El inmunógeno se inyectó en dos conejos,
realizándose cinco inyecciones: la primera inyección intradérmica
del conjugado péptido-KLH en PBS y emulsionados en
adyuvante completo de Freund y cuatro más intramusculares, a modo
de dosis de recuerdo en los días 14, 28, 49 y 80, del mismo
conjugado péptido-KLH en PBS pero esta vez
emulsionados en adyuvante incompleto de Freund, realizándose la
sangría de control a los 90 días para detectar la presencia de los
anticuerpos.
Tras la recogida de sangre, se separó el suero y
se prepurificó mediante desalado y posteriormente se purificaron
los anticuerpos por afinidad en una matriz compuesta por 1,5 ml de
material EMD-Epoxy activated (Merck) a la que se
añadió 5 mg del correspondiente péptido. Las fracciones purificadas
se estabilizaron en 0.1% de BSA (Sigma) y se conservaron a 4ºC,
pudiéndose añadir glicerol 20-50% como
crioprotector.
Se utilizó el método de Laemmli, descrito en
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New
York, 1998, modificado para mejorar la separación de péptidos
pequeños.
El aparato empleado fue un Miniprotean 3 de
Bio-Rad.
Se utilizó un gel del 15% de acrilamida,
mezclando los siguientes componentes:
Se partió de disoluciones stock de péptido
A\beta40 y 42 de 1 mg/ml. (disueltos en PBS). Se tomó el volumen
necesario de estas soluciones para cada una de las muestras y lo
llevamos hasta 20 \mul con SBLT (SBL + Tris base 2 M). A
continuación se hirvieron las muestras durante 5 minutos para
desnaturalizar los péptidos y eliminar posibles proteasas.
Se llenó el centro de la cubeta con tampón
catódico y el exterior con tampón anódico, siendo la composición de
estos tampones las siguientes:
24.2 g Tris base (0.2 M final)
Diluir a 1 litro con H_{2}O
Ajustar a pH 8.9 con HCl concentrado
Almacenar a 4ºC hasta 1 mes
12.11 g Tris base (0.1 M final)
17.92 g tricine (0.1 M final)
1 g SDS (0.1% final)
Diluir a 1 litro con H_{2}O
No ajustar el pH.
Almacenar a 4ºC hasta 1 mes
Finalmente se cargaron las muestras en los
pocillos: 20 \mul/pocillo. Utilizando como marcador el
Polypeptide Standard Kaleidoscope de Bio-Rad, se
comenzó la migración a bajo voltaje (30 V), y posteriormente se
subió hasta los 100 V, transcurrida aprox. 1 hora de
electroforesis.
Se transfirieron las proteínas separadas en el
gel a una membrana de PVDF, mediante el electroblotting. En los
"librillos" de transferencia se colocaron:
Lado negro - - - esponja
- - - 3 papeles Whatmann (o de filtro)
- - - gel - - - membrana - - - 3
papeles Whatmann - - - esponja - - - lado
transparente
A continuación se llenó la cubeta con
"electroblotting buffer":
- Glicina 38 mM
- Tris base 50 mM
- Metanol 40%
Se realizó la transferencia durante 2 horas a
200 mA. Durante la transferencia se mantuvo la agitación del
buffer con agitador magnético.
Los anticuerpos y la leche en polvo se
disolvieron en PBS-T (PBS + 0,5% Tween 20),
realizándose los lavados también con PBS-T. Tras la
transferencia se bloqueó la superficie de la membrana con solución
5% de leche en polvo, durante 1 hora con agitación y a temperatura
ambiente (RT).
Tras lo cual se lavó la membrana 2 x 5 min. a
RT.
A continuación se incubó con anticuerpo primario
(SAR-3) 1 hora a RT como mínimo diluido 1:500 en
PBS-T.
Se realizó el lavado de la membrana: 3 x 10 min.
a RT
Posteriormente se incubó con anticuerpo
secundario: anti-conejo de cabra conjugado a
peroxidasa de rábano (goat
anti-rabbit-HRP) durante 1 hora a RT
(1:10.000 en todos los casos).
Se realizó de nuevo el lavado de la membrana: 3
x 10 min. a RT.
Tras el último lavado se incubó la membrana con
la solución del kit de quimioluminiscencia. Utilizándose el kit
ECL+Plus de Pharmacia.
Se envolvió la membrana en papel celofán y la
expusimos a film (Hyperfilm MP de Amersham) de doble emulsión,
durante distintos tiempos, entre 30 seg. y 2 minutos.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Las secciones de tejido se fijaron en parafina
siguiendo los siguientes pasos:
- a)
- fijación en formol neutro al 10%
- b)
- deshidratación por pases sucesivos en concentraciones crecientes de alcohol
- c)
- pases por xilol y parafina, esta última en estufa de 60-62ºC
- d)
- realización de los bloques de parafina, los cuales se cortan a 4 micras y se montan en portaobjetos
A continuación, dichas secciones fueron
desparafinadas mediante pases por las siguientes soluciones:
| Xilol | 100% | 10 minutos | |
| Xilol | 100% | 10 minutos | |
| Etanol | 100% | 5 minutos | |
| Etanol | 100% | 5 minutos | |
| Etanol | 96% | 5 minutos | |
| Etanol | 90% | 5 minutos | |
| Etanol | 70% | 5 minutos | |
| PBS | 5 minutos X 3 veces |
Posteriormente se trataron de la siguiente
forma:
a) Ácido fórmico al 96% durante 3 minutos en
campana de gases y en agitación.
b) Lavado rápido de agua
c) Lavados en PBS 2 X 5 minutos
d) Bloqueo de las peroxidasas endógenas durante
15 minutos en una solución formada por 70 ml de PBS, 30 ml de
metanol y 1 ml de H_{2}O_{2}
e) Lavados en PBS 3 X 5 minutos
f) Lavados en PBS/T (Triton o
Tween-20 al 0,5% en PBS) 3 X 5 minutos
g) Bloqueo de las uniones inespecíficas con
suero de cabra (Normal Goat Serum) diluido 10:100 en PBS/T durante
dos horas
h) Incubación de los anticuerpos primarios toda
la noche a 4ºC en cámara húmeda:
- SAR-1....Dilución 1:1500 en PBS
i) Lavados de PBS/T 3 X 5 minutos
j) Incubación en anticuerpo secundario
(anti-conejo de cabra) diluido 1:200 en PBS durante
45 minutos
k) Lavados de PBS 4 X 5 minutos
l) Incubación del ABC (complejo
avidina-biotina) de Vector Labs a una dilución de
1:100 en PBS/T durante 45 minutos en oscuridad, manteniéndose esta
condición hasta finalizar el revelado
m) Lavados de PBS 3 X 5 minutos
n) Revelado en diaminobencidina (DAB).
Se controló el tiempo empíricamente bajo
microscopio estereoscópico. Para ello, primero se hizo un lavado en
una solución de Tris-HCl 0.5 M durante 10 minutos
en agitación, para proseguir con la incubación con un sustrato
diaminobencidina (DAB) diluida en Tris-HCl 0.05 M y
a la que se añade 0.5 \mul/ml de H_{2}O_{2} a 4ºC. Una vez
finalizada la reacción se realizaron tres lavados en PBS a 4ºC de 5
minutos cada uno y se procedió a la deshidratación en etanol al
70%, 90% y 100% durante 2 minutos cada uno, pase por xilol de 4
minutos y otro pase de xilol de 2 minutos, hasta que se montaron
con Eukitt para su observación al microscopio.
NUMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACION SOBRE LA SECUENCIA 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- LONGITUD: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE: Síntesis Química
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO
1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
Lys}
<110> Universidad Zaragoza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE ANTICUERPOS PARA EL
TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AMILOIDEAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P200301054
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Síntesis Química
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
Lys}
Claims (5)
1. Uso del péptido seleccionado entre el grupo
formado por:
- (i)
- el péptido de SEQ ID NO 1;
- (ii)
- los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 1;
- (iii)
- y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de una proteína,
en la preparación de un medicamento
para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad
caracterizada por la acumulación de depósitos amiloides en
el cerebro de un
paciente.
2. El uso según la reivindicación anterior,
caracterizado porque el péptido induce la producción de
anticuerpos capaces de reconocer de forma específica cualquiera de
las variantes predominantes del péptido beta amiloide A\beta40 y
A\beta42.
3. Uso de un anticuerpo o un fragmento activo o
derivado de un anticuerpo obtenible por inmunización de mamíferos
con una proteína conjugada al péptido de SEQ ID NO 1, en la
preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de
una enfermedad caracterizada por la acumulación de depósitos
amiloides en el cerebro de un paciente.
4. El uso según la reivindicación anterior,
caracterizado porque el anticuerpo, fragmento activo o
derivado es capaz de reconocer de forma específica cualquiera de las
variantes predominantes del péptido beta amiloide A\beta40 y
A\beta42.
5. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque la
enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
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