RU2385161C2 - Способ лечения болезни альцгеймера - Google Patents

Способ лечения болезни альцгеймера Download PDF

Info

Publication number
RU2385161C2
RU2385161C2 RU2005134351/15A RU2005134351A RU2385161C2 RU 2385161 C2 RU2385161 C2 RU 2385161C2 RU 2005134351/15 A RU2005134351/15 A RU 2005134351/15A RU 2005134351 A RU2005134351 A RU 2005134351A RU 2385161 C2 RU2385161 C2 RU 2385161C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
disease
seq
antibody
amyloid
Prior art date
Application number
RU2005134351/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2005134351A (ru
Inventor
БАРРИО Мануэль САРАСА (ES)
БАРРИО Мануэль САРАСА
Original Assignee
Араклон Байотек, С.Л.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Араклон Байотек, С.Л. filed Critical Араклон Байотек, С.Л.
Publication of RU2005134351A publication Critical patent/RU2005134351A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2385161C2 publication Critical patent/RU2385161C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается применения антител, специфически узнающих любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида, Аβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства, которое применяют для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера. Изобретение обеспечивает предотвращение прогрессирования или снижение симптомов, и/или снижение процесса отложения амилоида у индивидуума при введении больному иммуностимулирующей дозы пептида или антитела, полученного против него. 2 н. и 5 з.п. ф-лы.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с отложениями амилоида, которые включают болезнь Альцгеймера.
Уровень техники
Определенные факты известны о биохимических и метаболических феноменах, связанных с наличием болезни Альцгеймера (AD). Два структурных и гистопатологических изменения, наблюдаемых в мозге заболевших AD, представляют собой нейрофибриллярные пучки (NFT) и отложения амилоида. Внутринейрональные нейрофибриллярные пучки присутствуют также при других нейродегенеративных заболеваниях, но наличие отложений амилоида как во внутринейрональном пространстве (нейритные бляшки), так и в непосредственной близости к микрососудам (сосудистые бляшки), как представляется, является характерной чертой AD. Из них нейритные бляшки кажутся наиболее распространенными (Price, D.L., and co-workers. Drug Development Research (1985) 5:59-68).
Главным компонентом данных амилоидных бляшек является пептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоидным пептидом Аβ4.
Амилоидный пептид Аβ4 представляет собой полипептид, который образуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Аβ4 (рарр). Данные белки - предшественники амилоидного пептида, состоят из от 695 до 770 аминокислот, причем все они кодируются одним и тем же геном.
Идентифицировано два главных варианта амилоидного пептида Аβ4, пептид Аβ40 и Аβ42, содержащих 40 и 42 аминокислоты, соответственно, которые характеризуются различным тканевым распределением как в физиологических, так и в патологических условиях. Вариант из 42 аминокислот является преобладающей формой в амилоидных бляшках, локализованных в мозге больных AD.
До настоящего времени предлагались различные возможные решения для обеспечения возможной вакциной против AD.
В европейском патенте ЕР 526511 предлагается введение гомеопатических доз Аβ больным с предварительно установленной AD. Однако из-за применяемых доз уровни циркулирующего эндогенного Аβ в плазме существенно варьируются и, таким образом, преимущества в такой терапии не ожидается.
Schenk et al. (Nature, 1999; 400: 173-177) описывают иммунизацию Аβ42 трансгенных мышей PDAPP, которые гиперэкспрессируют мутантный АРР человека, предотвращая, таким образом, образование амилоидных бляшек, дистрофию нейритов и астроглиоз.
В заявке WO 9927944 (Schenk D.) описано лечение AD путем введения больному Аβ42.
Фаза III клинических испытаний у 360 больных с диагнозом средней и умеренной AD в 4 европейских странах и в Соединенных Штатах, при которых амилоидный пептид Аβ42 был использован в качестве антигена, была прекращена после сообщения об энцефалите у некоторых больных (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]:22, April 1, 2002).
Среди некоторых из возможных проблем, которые при использовании в качестве вакцины эндогенного белка (или белка, естественно присутствующего у животного, которого вакцинируют), как в случае пептида Аβ42, когда организм отвечает путем выработки антител против Аβ42 и против более мелких фракций, которые могут иметь также еще не известные физиологические функции, можно отметить проблему возможного развития аутоиммунных заболеваний, обусловленных выработкой антител против эндогенного белка, трудность в выработке иммунного ответа из-за неспособности иммунной системы узнавать эндогенные антигены и возможное развитие острого воспалительного ответа.
Задачей настоящего изобретения является лечение болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний посредством введения пептида, С-концевой части Аβ, конъюгированного с белком, где в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения указанный белок представляет собой гемоцианин моллюска фиссуреллии.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцине для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных амилоидных заболеваний.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения предлагается вакцина для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных заболеваний, которая преодолевает недостатки, связанные с пептидами, белками или эндогенными иммуногенами.
Примерами других заболеваний, характеризуемых амилоидными отложениями, являются исландский наследуемый синдром, множественная миелома и губчатый энцефалит, включая болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Индукция иммунного ответа может быть активной, например, когда иммуноген вводят для выработки антител, которые взаимодействуют с Аβ у больного, или пассивной, например, когда вводят антитело, которое само взаимодействует с Аβ у больного.
Для задач настоящего изобретения последующие термины определяются следующим образом.
Термин “родственные амилоидные заболевания” включает заболевания, связанные с аккумуляцией амилоида, которые могут быть ограничены одним органом, местный амилоидоз, или распространяться на несколько органов, системный амилоидоз. Вторичный амилоидоз может быть связан с хроническими инфекциями (такими как, например, туберкулез), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) и другие типы системного амилоидоза, найденного у больных с длительным лечением с помощью гемодиализа. Местные формы амилоидоза включают, но не ограничиваются перечисленными, диабет типа II и любое другое, относящееся к этому заболевание, нейродегенеративные заболевания с губчатым энцефалитом, коровий губчатый энцефалит, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию.
Термин “пассивная иммунизация” применяют в отношении введения антител или их фрагментов индивидууму с целью создания иммунитета у данного индивидуума.
В первом аспекте изобретение включает применение пептида, который действует или в качестве иммуногена, или в качестве антитела, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением отложений амилоида. Указанные способы состоят в индукции иммунного ответа против пептидного компонента амилоидных отложений у больного. Указанная индукция может быть активной при введении иммуногена или пассивной при введении антитела или активного фрагмента, или производного антитела.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
Полученное лекарство может быть использовано как у бессимптомных пациентов, так и у пациентов, проявляющих симптомы заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением, композиции, способные вызывать иммунный ответ, направленный против определенных компонентов амилоидных бляшек, эффективны при лечении или профилактике заболеваний, связанных с амилоидными отложениями. В частности, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, возможно предотвратить прогрессирование или снизить симптомы и/или снизить процесс отложения амилоида у индивидуума при введении больному иммуностимулирующей дозы пептида или антитела, полученного против него.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения, антитела получают иммунизацией млекопитающих или птиц посредством использования в качестве иммуногена пептида, конъюгированного с белком.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, млекопитающие, используемые для иммунизации, могут представлять собой жвачных животных, лошадей, зайцеобразных, плотоядных животных, приматов или любое другое животное, у которого можно получить адекватные количества сыворотки для выделения из нее антитела. Среди птиц, используемых для иммунизации, заявители могут отметить, но не в плане ограничения, среди других Galliformes, Anseriformes и Columbiformes.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, предложено применение пептида, конъюгированного с белком, который действует в качестве иммуногена для продукции антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 или Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением амилоидных отложений в мозге больного.
В соответствии с наиболее предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, белок, применяемый для конъюгации с пептидом, представляет собой белок моллюска фиссуреллии.
В соответствии с более предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, пептид выбран из группы, состоящей из пептида SEQ ID No 1, пептида SEQ ID No 2, пептида SEQ ID No 3, пептида SEQ ID No 4, пептидов, полученных в результате укорочения с помощью удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или С-концов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате удлинения путем добавления остатков к любому из пептидов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4.
В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, пептид выбран из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 2, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 2, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 3, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 3, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 4, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В соответствии с другим осуществлением настоящего изобретения, предложено применение антитела или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 или Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, антитело или активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Аβ, получают против пептида, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, необязательно укороченных в результате удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или С-концов, и необязательно удлиненных в результате добавления аминокислотных остатков, подходящих для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 2, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 2, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 3, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 3, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 4, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 4, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В данном описании аминокислоты сокращают с применением однобуквенных кодов, применяемых в данной области, как указано ниже:
А=Ala = аланин
С=Cys = цистеин
D=Asp = аспарагиновая кислота
Е=Glu = глутаминовая кислота
F=Phe = фенилаланин
G=Gly = глицин
Н=His = гистидин
I=Ile = изолейцин
К=Lys = лизин
L=Leu = лейцин
М=Met = метионин
N=Asn = аспарагин
Р=Pro = пролин
Q=Gin = глутамин
R=Arg = аргинин
S=Ser = серин
Т=Thr = треонин
V=Val = валин
W=Trp = триптофан
Y=Tyr = тирозин
Последовательности, описанные ранее в настоящем изобретении и идентифицированные как SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, соответствуют следующим аминокислотным последовательностям:
SEQ ID NO 1 LVFFAEDV
SEQ ID NO 2 GLMVGGVV
SEQ ID NO 3 GLMVGGVVIA
SEQ ID NO 4 RHDSGYEVHHQK
Антителам, полученным против указанных пептидов, даны коды SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 в соответствии с тем, что указано ниже:
SEQ ID NO 1 SAR-2
SEQ ID NO 2 SAR-3
SEQ ID NO 3 SAR-4
SEQ ID NO 4 SAR-l
Информация, относящаяся к идентификации пептидных последовательностей, описанных в настоящем изобретении, которая приложена к настоящему документу в формате для компьютерного прочтения, представляет собой перечень последовательностей, которые присутствуют в данном документе.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров.
Пример 1. Получение поликлональных антител
Путем иммунизации Новозеландских белых кроликов было получено четыре поликлональных антитела против четырех пептидов, конъюгированных с KLH, которые были использованы в качестве иммуногена.
Каждый иммуноген инъецировали двум кроликам, по пять инъекций каждому кролику: первая внутрикожная инъекция конъюгата пептид-KLH в ЗФР, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, и четыре дополнительные внутримышечные инъекции в качестве поддерживающей дозы на 14, 28, 49 и 80 дни того же конъюгата пептид-KLH в ЗФР, но на этот раз эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда, при отборе крови на 90 день для определения наличия антител.
После сбора крови отделяли сыворотку и производили предварительную очистку обессоливанием, после чего антитела очищали по сродству на матриксе, включающем 1,5 мл активированного вещества EMD-Epoxy (Merck), к которому добавляли 5 мг соответствующего пептида. Очищенные фракции консервировали в 0,1% БСА (Sigma) и хранили при 4°С, а в качестве криопротектора можно было добавить 20-50% глицерина.
Пример 2. Иммуноблоттинг для Аβ
1. Электрофорез
Применяли способ Леммли, описанный в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1998, модифицированный для улучшения разделения небольших пептидов.
Применяли прибор Miniprotean 3 от Bio-Rad.
Применяли 15% акриламидный гель, смешанный со следующими компонентами:
Исходные растворы Разделяющий гель (15%) Концентрирующий гель
40% акриламид 3, 75 мл 500 мкл
Трис 3 М, рН=8,45 3, 3 мл 250 мкл
Глицерин 1, 05 мл -
Вода 1, 9 мл 4,2 мкл
ДДС-Na 20% 50 мкл 18,6 мкл
APS 10% 50 мкл 25 мкл
TEMED 10 мкл 5 мкл
Применяли исходные растворы пептидов Аβ40 и 42 с концентрацией 1 мг/мл (растворенных в ЗФР). Отбирали необходимый объем данных растворов для каждого из образцов и доводили до 20 мкл с помощью SBLT (SBL + трис-основание 2 М). Образцы затем кипятили в течение 5 минут для денатурации пептидов и удаления возможных протеаз.
Середину кюветы наполняли катодным буфером, а окружение - анодным буфером, причем состав данных буферов был следующим:
Анодный буфер
24,2 г трис-основания (конечная концентрация 0,2 М)
Разбавить до 1 л Н2О
Довести рН до 8,9 концентрированной НС1
Хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Катодный буфер
12,11 г трис-основания (конечная концентрация 0,1 М)
17,92 г трицина (конечная концентрация 0,1 М)
1 г ДДС-Na (конечная концентрация 0,1%)
Разбавить до 1 л H2O
Не доводить рН
Хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Наконец, образцы вносили в лунки: 20 мкл/лунку. С применением Polypeptide Standard Kaleidoscope от Bio-Rad в качестве маркера перемещение начинали при низком напряжении (30 В) и затем приблизительно через 1 час электрофореза напряжение увеличивали до 100 В.
2. Перенос на мембрану
Разделенные в геле белки переносили на мембрану PVDF с помощью электроблоттинга. В буклеты для переноса помещали следующее.
Тыльная сторона - губка - 3 листа ватманской бумаги (или фильтровальной бумаги - гель - мембрана - 3 листа ватманской бумаги - губка - сторона отпечатка.
После этого кювету наполняли буфером для электроблоттинга:
Глицин 38 нМ
Трис-основание 50 мМ
Метанол 40%
Перенос производили в течение 2 часов при 200 мА. Во время переноса буфер перемешивали с помощью магнитной мешалки.
3. Инкубация с антителами
Антитела и порошковое молоко растворяли в ЗФР-t (ЗФР+0,5% твин 20), промывку также производили с помощью ЗФР-Т.
После переноса поверхность мембраны блокировали 5% раствором порошкового молока в течение 1 часа при перемешивании при комнатной температуре (RT).
После этого мембрану промывали 2х5 минут при RT.
Затем ее инкубировали с первичным антителом (SAR-1, SAR-2, SAR-3 или SAR-4) в течение 1 часа при RT в разведении, по меньшей мере 1:500 в ЗФР-Т.
Мембрану промывали 3х10 минут при RT. Затем ее инкубировали со вторичным антителом: козьим-HRP против кролика в течение 1 часа при RT (1:10000 во всех случаях).
Вновь повторяли промывку мембраны: 3×10 минут при RT.
4. Окраска
После последней промывки мембрану инкубировали с раствором хемолюминесцентного набора с применением ECL kit+Plus от Pharmacia.
Мембрану заворачивали в целлофан и экспонировали с пленкой с двойной эмульсией (Hyperfilm МР от Amersham) на протяжении различных периодов времени от 30 секунд до 2 минут.
Пример 3. Иммуногистохимия с антителами SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 ткани мозга человека
Срезы ткани фиксировали в парафине в соответствии со следующими стадиями:
a) фиксации в нейтральном 10% формальдегиде;
b) дегидратации с помощью последовательных стадий с возрастающими концентрациями спирта;
c) проводки через ксилол и парафин, причем последнюю стадию осуществляют в печи при 60-62°С;
d) получения парафиновых блоков, из которых получали срезы 4 микрона, которые монтировали на стеклах.
Срезы затем депарафинизировали проводкой через следующие растворы:
Ксилол 100% 10 минут
Ксилол 100% 10 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 96% 5 минут
Этанол 90% 5 минут
Этанол 70% 5 минут
ЗФР 5 минут ×3 раза
Затем их обрабатывали следующим образом:
a) 96% муравьиной кислотой в течение 3 минут в вытяжном шкафу при перемешивании;
b) быстрой промывкой водой;
c) промывкой ЗФР 2×5 минут;
d) блокированием эндогенных пероксидаз в течение 15 минут в растворе, составленном из 70 мл ЗФР, 30 мл метанола и 1 мл H2O г;
e) промывкой ЗФР 3×5 минут;
f) промывкой ЗФР/Т (0,5% тритон или твин-20 в ЗФР) 3×5 минут;
g) блокированием неспецифического связывания сывороткой козы (нормальной сывороткой козы), разведенной 10:100 в ЗФР/Т, в течение 2 часов;
h) инкубацией с первичными антителами в течение ночи при 4°С во влажной камере:
Sar-1… Разведение 1:150 в ЗФР
Sar-2… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-3… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-4… Разведение 1:2000 в ЗФР;
i) промывкой ЗФР/Т 3×5 минут;
j) инкубацией со вторичным антителом (козьим против кролика), разведенным 1:200 ЗФР, в течение 45 минут;
k) промывкой ЗФР 4×5 минут;
l) инкубацией АВС (авидин-биотинового комплекса) Vector Labs в разведении 1:100 в ЗФР/Т в течение 45 минут в темноте при сохранении данных условий до завершения развития окраски;
m) промывкой ЗФР 3×5 минут;
n) проявлением в диаминобензидине (DAB).
Время контролировали эмпирически под стереоскопическим микроскопом. Для этого, во-первых, производили промывку в 0,5 М растворе трис-HCl в течение 10 минут при перемешивании с последующей инкубацией с диаминобензидиновым субстратом (DAB), разведенным в 0,05 М трис-HCl, и к которому добавляли 0,5 мкл/мл Н2О2 при 4°С. После окончания реакции производили три промывки в ЗФР при 4°С в течение 5 минут каждая и затем производили обезвоживание в этаноле при 70%, 90% и 100% в течение 2 минут каждый раз, проводку через ксилол в течение 4 минут и затем проводку через ксилол в течение 2 минут, после чего срезы монтировали с помощью Eukitt для исследования под микроскопом.
Перечень последовательностей
Количество последовательностей: 4
Информация о последовательности 1:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 1
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val
1   5          
Информация о последовательности 2:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 2
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
1   5          
Информация о последовательности 3:
Свойства последовательности:
Длина: 10
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 3
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
1   5       10      
Информация о последовательности 4:
Свойства последовательности:
Длина: 12
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 4
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys
1   5       10          

Claims (7)

1. Применение пептида, конъюгированного с белком, который действует в качестве иммуногена для получения антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 и Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, страдающего любым из заболеваний, выбранных из болезни Альцгеймера и церебральной амилоидной ангиопатии, характеризующееся тем, что пептид представляет собой SEQ ID No 2.
2. Применение по п.1, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
3. Применение по п.1, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой церебральную амилоидную ангиопатию.
4. Применение по любому из предыдущих пунктов, характеризующееся тем, что белок представляет собой белок моллюска фиссуреллии (KLH).
5. Применение антитела, или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, страдающего любым из заболеваний, выбранных из болезни Альцгеймера и церебральной амилоидной ангиопатии, при этом антитело, или его активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Аβ, получено посредством иммунизации млекопитающих или птиц пептидом SEQ ID No 2.
6. Применение по п.5, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
7. Применение по п.5, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой церебральную амилоидную ангиопатию.
RU2005134351/15A 2003-05-08 2004-05-03 Способ лечения болезни альцгеймера RU2385161C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200301054A ES2246105B1 (es) 2003-05-08 2003-05-08 Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
ESP200301054 2003-05-08

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009148539/15A Division RU2526155C2 (ru) 2003-05-08 2009-12-25 Способ лечения болезни альцгеймера

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005134351A RU2005134351A (ru) 2006-04-27
RU2385161C2 true RU2385161C2 (ru) 2010-03-27

Family

ID=32982086

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005134351/15A RU2385161C2 (ru) 2003-05-08 2004-05-03 Способ лечения болезни альцгеймера
RU2009148539/15A RU2526155C2 (ru) 2003-05-08 2009-12-25 Способ лечения болезни альцгеймера

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009148539/15A RU2526155C2 (ru) 2003-05-08 2009-12-25 Способ лечения болезни альцгеймера

Country Status (19)

Country Link
US (6) US20090162362A1 (ru)
EP (5) EP1623719B1 (ru)
JP (5) JP2006525288A (ru)
CN (2) CN101264326A (ru)
AT (1) ATE435024T1 (ru)
AU (2) AU2004237373A1 (ru)
BR (1) BRPI0410684A (ru)
CA (1) CA2524571C (ru)
CY (1) CY1109454T1 (ru)
DE (1) DE602004021797D1 (ru)
DK (3) DK2356996T5 (ru)
ES (6) ES2246177B1 (ru)
IL (8) IL171651A (ru)
MX (1) MXPA05010914A (ru)
PL (3) PL2356996T3 (ru)
PT (3) PT2075007E (ru)
RU (2) RU2385161C2 (ru)
SI (1) SI1623719T1 (ru)
WO (1) WO2004098631A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2567808C2 (ru) * 2010-07-14 2015-11-10 Мерк Шарп Энд Домэ Корп. Моноклональное антитело против addl и его применения
RU2607368C2 (ru) * 2010-07-30 2017-01-10 Ац Иммуне С.А. Безопасные и функциональные гуманизированные антитела
RU2712750C1 (ru) * 2016-02-15 2020-01-31 Араклон Байотек, С.Л. Амилоидный конъюгат, его применения и способы

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246177B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
JP5042828B2 (ja) 2004-07-30 2012-10-03 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション アミロイド−ベータ・ペプチドに対して向けられる抗体、および該抗体を用いる方法
UY29504A1 (es) 2005-04-29 2006-10-31 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el péptido amiloide beta y métodos que utilizan los mismos.
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
CA2632822C (en) 2005-12-12 2018-08-28 Ruth Greferath A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
AR062065A1 (es) 2006-07-14 2008-10-15 Ac Immune Sa Anticuerpo humanizado
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
EP2481408A3 (en) 2007-03-01 2013-01-09 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2865670B1 (en) 2007-04-18 2017-01-11 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US9403902B2 (en) * 2007-10-05 2016-08-02 Ac Immune S.A. Methods of treating ocular disease associated with amyloid-beta-related pathology using an anti-amyloid-beta antibody
BRPI0818623A2 (pt) * 2007-10-05 2017-05-23 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para reduzir a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para diminuir a quantidade total de amilóide-beta solúvel na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular associada com anormalidades patológicas/mudanças no tecido do sistema visual, para monitorar doença ocular residual mínima associada com anormalidades patológicas/mudanças nos tecidos do sistema visual, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir a pressão ocular nos olhos de um animal
EP2149380A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-03 Medivet Pharma, S.L. Veterinary immunotherapy compositions for the Aged Related Cognitive Dysfunction.
EP2258398A1 (en) * 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
US8486940B2 (en) 2009-09-11 2013-07-16 Probiodrug Ag Inhibitors
KR101531949B1 (ko) 2009-12-11 2015-06-26 아라클론 바이오테크, 에스.엘. 아밀로이드 베타 펩티드의 개선된 검출 방법 및 시약
JP6026284B2 (ja) 2010-03-03 2016-11-16 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤
EP2545047B9 (en) 2010-03-10 2015-06-10 Probiodrug AG Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
JP2013523182A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アボット・ラボラトリーズ アミロイドベータ結合タンパク質
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2603524A1 (en) 2010-08-14 2013-06-19 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
WO2015017280A1 (en) 2013-07-28 2015-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
PL237739B1 (pl) 2018-06-06 2021-05-17 Univ Gdanski Genisteina do zastosowania do leczenia choroby Alzheimera

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339014C (en) * 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
AU5525090A (en) * 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
CA2081482C (en) 1990-04-27 2000-11-21 Ellis L. Kline Method and composition for treatment of central nervous system disease states associated with abnormal amyloid beta protein molecular organization
US7427392B1 (en) * 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
CA2340394A1 (en) * 1998-08-20 2000-03-02 Jorge R. Barrio Methods for labeling .beta.-amyloid plaques and neurofibrillary tangles
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
CA2500462A1 (en) * 2001-12-26 2004-03-25 Universidad De Zaragoza Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
EP1371986A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-17 ABETA GmbH Diagnosis of Alzheimer's disease based on the hAbeta42:hAbeta40 ratio
CA2487528A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with beta-amyloid formation and/or aggregation
ES2201929B1 (es) * 2002-09-12 2005-05-16 Araclon Biotech, S.L. Anticuerpos policlonales, metodo de preparacion y uso de los mismos.
WO2004032868A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
NZ567324A (en) * 2003-02-01 2009-08-28 Wyeth Corp Active immunization to generate antibodies to soluble A-beta
ES2246177B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEZLIN R.S. Structure and biosynthesis of antibodies. - Moscow: Nauka,p.156-159, 1972. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2567808C2 (ru) * 2010-07-14 2015-11-10 Мерк Шарп Энд Домэ Корп. Моноклональное антитело против addl и его применения
RU2607368C2 (ru) * 2010-07-30 2017-01-10 Ац Иммуне С.А. Безопасные и функциональные гуманизированные антитела
RU2712750C1 (ru) * 2016-02-15 2020-01-31 Араклон Байотек, С.Л. Амилоидный конъюгат, его применения и способы

Also Published As

Publication number Publication date
IL207880A0 (en) 2011-07-31
IL207880A (en) 2013-02-28
JP2006525288A (ja) 2006-11-09
EP1623719B1 (en) 2009-07-01
IL207876A (en) 2013-03-24
EP1623719A1 (en) 2006-02-08
EP2075007B9 (en) 2013-09-04
PL2075007T3 (pl) 2013-09-30
AU2004237373A1 (en) 2004-11-18
ES2423281T3 (es) 2013-09-19
ES2423590T3 (es) 2013-09-23
ES2246177B1 (es) 2007-03-01
IL207881A0 (en) 2011-07-31
DK2356996T3 (da) 2013-07-22
IL171651A (en) 2011-11-30
WO2004098631A1 (es) 2004-11-18
SI1623719T1 (sl) 2009-12-31
IL207876A0 (en) 2011-07-31
US20210214394A1 (en) 2021-07-15
EP2356996A1 (en) 2011-08-17
RU2005134351A (ru) 2006-04-27
ES2246105B1 (es) 2007-03-01
ES2246105A1 (es) 2006-02-01
CA2524571A1 (en) 2004-11-18
AU2011200170B2 (en) 2011-09-01
EP2356996B1 (en) 2013-06-26
MXPA05010914A (es) 2006-03-21
PL1623719T3 (pl) 2010-11-30
JP2012006967A (ja) 2012-01-12
BRPI0410684A (pt) 2006-06-20
CN1784240A (zh) 2006-06-07
CN101264326A (zh) 2008-09-17
EP2075007A3 (en) 2009-11-11
DE602004021797D1 (de) 2009-08-13
EP2082747A2 (en) 2009-07-29
IL207879A0 (en) 2011-07-31
EP2305286A2 (en) 2011-04-06
IL207877A0 (en) 2011-07-31
IL207878A (en) 2013-02-28
IL207875A0 (en) 2011-07-31
US20200140488A1 (en) 2020-05-07
JP2014129389A (ja) 2014-07-10
PL2356996T3 (pl) 2013-09-30
RU2526155C2 (ru) 2014-08-20
EP2305286A3 (en) 2011-11-09
CA2524571C (en) 2017-01-10
JP2016065100A (ja) 2016-04-28
EP2082747A3 (en) 2010-01-13
US20090162362A1 (en) 2009-06-25
EP2075007A2 (en) 2009-07-01
US20170260234A1 (en) 2017-09-14
ES2246178A1 (es) 2006-02-01
US20140044725A1 (en) 2014-02-13
EP2075007B1 (en) 2013-05-22
ES2246178B1 (es) 2007-03-01
IL207877A (en) 2013-03-24
IL207875A (en) 2013-02-28
DK1623719T3 (da) 2009-11-09
IL207879A (en) 2013-02-28
ES2329369T3 (es) 2009-11-25
US20110262458A1 (en) 2011-10-27
RU2009148539A (ru) 2011-06-27
PT2075007E (pt) 2013-08-23
PT1623719E (pt) 2009-10-08
ES2246177A1 (es) 2006-02-01
AU2011200170C1 (en) 2012-03-22
DK2356996T5 (da) 2013-08-26
EP2356996B9 (en) 2013-08-28
IL207878A0 (en) 2011-07-31
AU2011200170A1 (en) 2011-02-03
JP2018119011A (ja) 2018-08-02
IL207881A (en) 2013-02-28
ATE435024T1 (de) 2009-07-15
DK2075007T3 (da) 2013-07-29
CY1109454T1 (el) 2014-08-13
PT2356996E (pt) 2013-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2385161C2 (ru) Способ лечения болезни альцгеймера
AU2011226926A1 (en) Alzheimer's disease treatment method

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner