RU2526155C2 - Способ лечения болезни альцгеймера - Google Patents

Способ лечения болезни альцгеймера Download PDF

Info

Publication number
RU2526155C2
RU2526155C2 RU2009148539/15A RU2009148539A RU2526155C2 RU 2526155 C2 RU2526155 C2 RU 2526155C2 RU 2009148539/15 A RU2009148539/15 A RU 2009148539/15A RU 2009148539 A RU2009148539 A RU 2009148539A RU 2526155 C2 RU2526155 C2 RU 2526155C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
seq
antibody
amyloid
disease
Prior art date
Application number
RU2009148539/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2009148539A (ru
Inventor
БАРРИО Мануэль САРАСА
Original Assignee
Араклон Байотек, С.Л.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Араклон Байотек, С.Л. filed Critical Араклон Байотек, С.Л.
Publication of RU2009148539A publication Critical patent/RU2009148539A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2526155C2 publication Critical patent/RU2526155C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается применения пептида, конъюгированного с белком, представляющим собой белок моллюска фиссуреллии (KLH), который действует в качестве иммуногена для получения антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Aβ40 и Aβ42; или применения полученного на основе указанного пептида антитела, или активного фрагмента, или производного антитела в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента. Группа изобретений обеспечивает эффективную иммунизацию, снижение амилоидной нагрузки и количества амилоидных бляшек в мозге. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с отложениями амилоида, которые включают болезнь Альцгеймера.
Уровень техники
Определенные факты известны о биохимических и метаболических феноменах, связанных с наличием болезни Альцгеймера (AD). Два структурных и гистопатологических изменения, наблюдаемых в мозге заболевших AD, представляют собой нейрофибриллярные пучки (NFT) и отложения амилоида. Внутринейрональные нейрофибриллярные пучки присутствуют также при других нейродегенеративных заболеваниях, но наличие отложений амилоида как во внутринейрональном пространстве (нейритные бляшки), так и в непосредственной близости к микрососудам (сосудистые бляшки), как представляется, является характерной чертой AD. Из них нейритные бляшки кажутся наиболее распространенными (Price, D.L. and co-workers, Drug Development Research (1985) 5:59-68).
Главным компонентом данных амилоидных бляшек является пептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоидным пептидом Aβ4.
Амилоидный пептид Aβ4 представляет собой полипептид, который образуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Aβ4 (βAPP). Данные белки-предшественники амилоидного пептида, состоят из от 695 до 770 аминокислот, причем все они кодируются одним и тем же геном.
Идентифицировано два главных варианта амилоидного пептида Aβ4 - пептид Aβ40 и Aβ42, содержащие 40 и 42 аминокислоты, соответственно, которые характеризуются различным тканевым распределением как в физиологических, так и в патологических условиях. Вариант из 42 аминокислот является преобладающей формой в амилоидных бляшках, локализованных в мозге больных AD.
До настоящего времени предлагались различные возможные решения для обеспечения возможной вакциной против AD.
В европейском патенте EP526511 предлагается введение гомеопатических доз Aβ больным с предварительно установленной AD. Однако из-за применяемых доз уровни циркулирующего эндогенного Aβ в плазме существенно варьируются и, таким образом, преимущества в такой терапии не ожидается.
Schenk et al. (Nature, 1999; 400: 173-177) описывают иммунизацию Aβ42 трансгенных мышей PDAPP, которые гиперэкспрессируют мутантный APP человека, предотвращая, таким образом, образование амилоидных бляшек, дистрофию нейритов и астроглиоз.
В заявке WO9927944 (Schenk D.) описано лечение AD путем введения больному Aβ42.
Фаза III клинических испытаний у 360 больных с диагнозом средней и умеренной AD в 4 европейских странах и в Соединенных Штатах, при которых амилоидный пептид Aβ42 был использован в качестве антигена, была прекращена после сообщения об энцефалите у некоторых больных (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]: 22, April 1, 2002).
Среди некоторых из возможных проблем, которые при использовании в качестве вакцины эндогенного белка (или белка, естественно присутствующего у животного, которого вакцинируют), как в случае пептида Aβ42, когда организм отвечает путем выработки антител против Aβ42 и против более мелких фракций, которые могут иметь также еще не известные физиологические функции, можно отметить проблему возможного развития аутоиммунных заболеваний, обусловленных выработкой антител против эндогенного белка, трудность в выработке иммунного ответа из-за неспособности иммунной системы узнавать эндогенные антигены и возможное развитие острого воспалительного ответа.
Задачей настоящего изобретения является лечение болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний посредством введения пептида, С-концевой части Aβ, конъюгированного с белком, где в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения указанный белок представляет собой гемоцианин моллюска фиссуреллии.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцине для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных амилоидных заболеваний.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения предлагается вакцина для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных заболеваний, которая преодолевает недостатки, связанные с пептидами, белками или эндогенными иммуногенами.
Примерами других заболеваний, характеризуемых амилоидными отложениями, являются исландский наследуемый синдром, множественная миелома и губчатый энцефалит, включая болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Индукция иммунного ответа может быть активной, например, когда иммуноген вводят для выработки антител, которые взаимодействуют с Aβ у больного, или пассивной, например, когда вводят антитело, которое само взаимодействует с Aβ у больного.
Для задач настоящего изобретения последующие термины определяются следующим образом.
Термин «родственные амилоидные заболевания» включает заболевания, связанные с аккумуляцией амилоида, которые могут быть ограничены одним органом - местный амилоидоз, или распространяться на несколько органов - системный амилоидоз. Вторичный амилоидоз может быть связан с хроническими инфекциями (такими как, например, туберкулез), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) и другие типы системного амилоидоза, найденного у больных с длительным лечением с помощью гемодиализа. Местные формы амилоидоза включают, но не ограничиваются перечисленными, диабет типа II и любое другое, относящееся к этому заболевание, нейродегенеративные заболевания с губчатым энцефалитом, коровий губчатый энцефалит, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию.
Термин «пассивная иммунизация» применяют в отношении введения антител или их фрагментов индивидууму с целью создания иммунитета у данного индивидуума.
В первом аспекте изобретение включает применение пептида, который действует или в качестве иммуногена, или в качестве антитела, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением отложений амилоида. Указанные способы состоят в индукции иммунного ответа против пептидного компонента амилоидных отложений у больного. Указанная индукция может быть активной при введении иммуногена или пассивной при введении антитела или активного фрагмента, или производного антитела.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
Полученное лекарство может быть использовано как у бессимптомных пациентов, так и у пациентов, проявляющих симптомы заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением, композиции, способные вызывать иммунный ответ, направленный против определенных компонентов амилоидных бляшек, эффективны при лечении или профилактике заболеваний, связанных с амилоидными отложениями. В частности, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, возможно предотвратить прогрессирование или снизить симптомы и/или снизить процесс отложения амилоида у индивидуума при введении больному иммуностимулирующей дозы пептида или антитела, полученного против него.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения, антитела получают иммунизацией млекопитающих или птиц посредством использования в качестве иммуногена пептида, конъюгированного с белком.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, млекопитающие, используемые для иммунизации, могут представлять собой жвачных животных, лошадей, зайцеобразных, плотоядных животных, приматов или любое другое животное, у которого можно получить адекватные количества сыворотки для выделения из нее антитела. Среди птиц, используемых для иммунизации, заявители могут отметить, но не в плане ограничения, среди других Galliformes, Anseriformes и Columbiformes.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, предложено применение пептида, конъюгированного с белком, который действует в качестве иммуногена для продукции антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Aβ40 или Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением амилоидных отложений в мозге больного.
В соответствии с наиболее предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, белок, применяемый для конъюгации с пептидом, представляет собой белок моллюска фиссуреллии.
В соответствии с более предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, пептид выбран из группы, состоящей из пептида SEQ ID No 1, пептида SEQ ID No 2, пептида SEQ ID No 3, пептида SEQ ID No 4, пептидов, полученных в результате укорочения с помощью удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или C-концов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате удлинения путем добавления остатков к любому из пептидов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4.
В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, пептид выбран из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или C-концевых аминокислот из SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 2, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или C-концевых аминокислот из SEQ ID No 2, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 3, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или C-концевых аминокислот из SEQ ID No 3, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 4, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или C-концевых аминокислот из SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В соответствии с другим осуществлением настоящего изобретения, предложено применение антитела, или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Aβ40 или Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, антитело, или активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Aβ, получают против пептида, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, необязательно укороченных в результате удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или C-концов, и необязательно удлиненных в результате добавления аминокислотных остатков, подходящих для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело, или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и C-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело, или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 2, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и C-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 2, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело, или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 3, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и C-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 3, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело, или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 4, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и C-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 4, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В данном описании аминокислоты сокращают с применением однобуквенных кодов, применяемых в данной области, как указано ниже:
A = Ala = аланин
C = Cys = цистеин
D = Asp = аспарагиновая кислота
E = Glu = глутаминовая кислота
F = Phe = фенилаланин
G = Gly = глицин
H = His = гистидин
I = Ile = изолейцин
K = Lys = лизин
L = Leu = лейцин
M = Met = метионин
N = Asn = аспарагин
P = Pro = пролин
Q = Gln = глутамин
R = Arg = аргинин
S = Ser = серин
T = Thr = треонин
V = Val = валин
W = Trp = триптофан
Y = Tyr = тирозин
Последовательности, описанные ранее в настоящем изобретении и идентифицированные как SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 соответствуют следующим аминокислотным последовательностям:
SEQ ID NO 1 LVFFAEDV
SEQ ID NO 2 GLMVGGVV
SEQ ID NO 3 GLMVGGVVIA
SEQ ID NO 4 RHDSGYEVHHQK
Антителам, полученным против указанных пептидов, даны коды SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 в соответствии с тем, что указано ниже:
SEQ ID NO 1 SAR-2
SEQ ID NO 2 SAR-3
SEQ ID NO 3 SAR-4
SEQ ID NO 4 SAR-1
Информация, относящаяся к идентификации пептидных последовательностей, описанных в настоящем изобретении, которая приложена к настоящему документу в формате для компьютерного прочтения, представляет собой перечень последовательностей, которые присутствуют в данном документе.
Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров.
Пример 1. Получение поликлональных антител.
Путем иммунизации Новозеландских белых кроликов было получено четыре поликлональных антитела против четырех пептидов, конъюгированных с KLH, которые были использованы в качестве иммуногена.
Каждый иммуноген инъецировали двум кроликам, по пять инъекций каждому кролику: первая внутрикожная инъекция конъюгата пептид-KLH в ЗФР, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, и четыре дополнительные внутримышечные инъекции в качестве поддерживающей дозы на 14, 28, 49 и 80 дни того же конъюгата пептид-KLH в ЗФР, но на этот раз эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда, при отборе крови на 90 день для определения наличия антител.
После сбора крови отделяли сыворотку и производили предварительную очистку обессоливанием, после чего антитела очищали по сродству на матриксе, включающем 1,5 мл активированного вещества EMD-Epoxy (Merck), к которому добавляли 5 мг соответствующего пептида. Очищенные фракции консервировали в 0,1% БСА (Sigma) и хранили при 4°С, а в качестве криопротектора можно было добавить 20-50% глицерина.
Пример 2. Иммуноблоттинг для Аβ.
1. Электрофорез.
Применяли способ Леммли, описанный в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1998, модифицированный для улучшения разделения небольших пептидов.
Применяли прибор Miniprotean 3 от Bio-Rad.
Применяли 15%-ный акриламидный гель, смешанный со следующими компонентами:
Исходные растворы Разделяющий гель (15%-ный) Концентрирующий гель, мкл
40% акриламид 3,75 мл 500
Трис 3 М, pH 8,45 3,3 мл 250
Глицерин 1,05 мл -
Вода 1,9 мл 4,2
ДДС-Na 20% 50 мкл 18,6
APS 10% 50 мкл 25
TEMED 10 мкл 5
Применяли исходные растворы пептидов Aβ40 и 42 с концентрацией 1 мг/мл (растворенных в ЗФР). Отбирали необходимый объем данных растворов для каждого из образцов и доводили до 20 мкл с помощью SBLT (SBL + трис-основание 2 М). Образцы затем кипятили в течение 5 минут для денатурации пептидов и удаления возможных протеаз.
Середину кюветы наполняли катодным буфером, а окружение - анодным буфером, причем состав данных буферов был следующим:
Анодный буфер.
24,2 г трис-основания (конечная концентрация 0,2 М)разбавить до 1 л H2O,
довести pH до 8,9 концентрированной HCl,
хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Катодный буфер.
12,11 г трис-основания (конечная концентрация 0,1 М),
17,92 г трицина (конечная концентрация 0,1 М,)
1 г ДДС-Na (конечная концентрация 0,1%)
разбавить до 1 л H2O,
не доводить pH.
Хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Наконец, образцы вносили в лунки: 20 мкл/лунку. С применением Polypeptide Standard Kaleidoscope от Bio-Rad в качестве маркера перемещение начинали при низком напряжении (30 В), и затем приблизительно через 1 час электрофореза напряжение увеличивали до 100 В.
2. Перенос на мембрану.
Разделенные в геле белки переносили на мембрану PVDF с помощью электроблоттинга. В буклеты для переноса помещали следующее:
Тыльная сторона - губка - 3 листа ватманской бумаги (или фильтровальной бумаги - гель - мембрана - 3 листа ватманской бумаги - губка - сторона отпечатка.
После этого кювету наполняли буфером для электроблоттинга:
Глицин 38 нМ
Трис-основание 50 мМ
Метанол 40%
Перенос производили в течение 2 часов при 200 мА. Во время переноса буфер перемешивали с помощью магнитной мешалки.
3. Инкубация с антителами.
Антитела и порошковое молоко растворяли в ЗФР-t (ЗФР + 0,5% твин 20), промывку также производили с помощью ЗФР-T.
После переноса поверхность мембраны блокировали 5%-ным раствором порошкового молока в течение 1 часа при перемешивании при комнатной температуре (RT).
После этого мембрану промывали 2×5 минут при RT.
Затем ее инкубировали с первичным антителом (SAR-1, SAR-2, SAR-3 или SAR-4) в течение 1 часа при RT в разведении, по меньшей мере 1:500 в ЗФР-T.
Мембрану промывали 3×10 минут при RT. Затем ее инкубировали со вторичным антителом: козьим-HRP против кролика в течение 1 часа при RT (1:10000 во всех случаях).
Вновь повторяли промывку мембраны: 3×10 минут при RT.
4. Окраска.
После последней промывки мембрану инкубировали с раствором хемолюминесцентного набора с применением ECL kit+Plus от Pharmacia.
Мембрану заворачивали в целлофан и экспонировали с пленкой с двойной эмульсией (Hyperfilm MP от Amersham) на протяжении различных периодов времени от 30 секунд до 2 минут.
Пример 3. Иммуногистохимия с антителами SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 ткани мозга человека.
Срезы ткани фиксировали в парафине в соответствии со следующими стадиями:
a) фиксации в нейтральном 10%-ном формальдегиде,
b) дегидратации с помощью последовательных стадий с возрастающими концентрациями спирта,
c) проводки через ксилол и парафин, причем последнюю стадию осуществляют в печи при 60-62°С,
d) получения парафиновых блоков, из которых получали срезы 4 мкм, которые монтировали на стеклах.
Срезы затем депарафинизировали проводкой через следующие растворы:
Ксилол 100% 10 минут
Ксилол 100% 10 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 96% 5 минут
Этанол 90% 5 минут
Этанол 70% 5 минут
ЗФР 5 минут x 3 раза
Затем их обрабатывали следующим образом:
a) 96%-ной муравьиной кислотой в течение 3 минут в вытяжном шкафу при перемешивании,
b) быстрой промывкой водой,
c) промывкой ЗФР 2×5 минут,
d) блокированием эндогенных пероксидаз в течение 15 минут в растворе, составленном из 70 мл ЗФР, 30 мл метанола и 1 мл H2O2,
e) промывкой ЗФР 3×5 минут,
f) промывкой ЗФР/T (0,5% тритон или твин-20 в ЗФР) 3×5 минут,
g) блокированием неспецифического связывания сывороткой козы (нормальной сывороткой козы), разведенной 10:100 в ЗФР/T, в течение 2 часов,
h) инкубацией с первичными антителами в течение ночи при 4°С во влажной камере:
Sar-1… Разведение 1:150 в ЗФР
Sar-2… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-3… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-4… Разведение 1:2000 в ЗФР
i) промывкой ЗФР/T 3×5 минут,
j) инкубацией со вторичным антителом (козьим против кролика), разведенным 1:200 ЗФР, в течение 45 минут,
k) промывкой ЗФР 4×5 минут,
l) инкубацией ABC (авидин-биотинового комплекса) Vector Labs в разведении 1:100 в ЗФР/T в течение 45 минут в темноте при сохранении данных условий до завершения развития окраски,
m) промывкой ЗФР 3×5 минут,
n) проявлением в диаминобензидине (DAB).
Время контролировали эмпирически под стереоскопическим микроскопом. Для этого, во-первых, производили промывку в 0,5 М растворе трис-HCl в течение 10 минут при перемешивании с последующей инкубацией с диаминобензидиновым субстратом (DAB), разведенным в 0,05 М трис-HCl, и к которому добавляли 0,5 мкл/мл H2O2 при 4°С. После окончания реакции производили три промывки в ЗФР при 4°С в течение 5 минут каждая, и затем производили обезвоживание в этаноле при 70, 90 и 100% в течение 2 минут каждый раз, проводку через ксилол в течение 4 минут и затем проводку через ксилол в течение 2 минут, после чего срезы монтировали с помощью Eukitt для исследования под микроскопом.
Перечень последовательностей
Количество последовательностей: 4
Информация о последовательности 1:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 1
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val
1   5          
Информация о последовательности 2:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 1
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
1   5          
Информация о последовательности 3:
Свойства последовательности:
Длина: 10
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 1
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
1   5       10      
Информация о последовательности 4:
Свойства последовательности:
Длина: 12
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 4
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1   5       10          

Claims (5)

1. Применение пептида, конъюгированного с белком, представляющим собой белок моллюска фиссуреллии (KLH), который действует в качестве иммуногена для получения антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Aβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, где пептид состоит из SEQ ID No 3.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
3. Применение антитела, или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Aβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, где антитело, или активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Aβ, получено на основе пептида, состоящего из SEQ ID No 3.
4. Применение по п.3, отличающееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
5. Применение по п.3, отличающееся тем, что указанное антитело, или активный фрагмент, или производное антитела получены иммунизацией млекопитающих или птиц пептидом SEQ ID No 3.
RU2009148539/15A 2003-05-08 2009-12-25 Способ лечения болезни альцгеймера RU2526155C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200301054 2003-05-08
ES200301054A ES2246105B1 (es) 2003-05-08 2003-05-08 Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005134351/15A Division RU2385161C2 (ru) 2003-05-08 2004-05-03 Способ лечения болезни альцгеймера

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2009148539A RU2009148539A (ru) 2011-06-27
RU2526155C2 true RU2526155C2 (ru) 2014-08-20

Family

ID=32982086

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005134351/15A RU2385161C2 (ru) 2003-05-08 2004-05-03 Способ лечения болезни альцгеймера
RU2009148539/15A RU2526155C2 (ru) 2003-05-08 2009-12-25 Способ лечения болезни альцгеймера

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005134351/15A RU2385161C2 (ru) 2003-05-08 2004-05-03 Способ лечения болезни альцгеймера

Country Status (19)

Country Link
US (6) US20090162362A1 (ru)
EP (5) EP2082747A3 (ru)
JP (5) JP2006525288A (ru)
CN (2) CN101264326A (ru)
AT (1) ATE435024T1 (ru)
AU (2) AU2004237373A1 (ru)
BR (1) BRPI0410684A (ru)
CA (1) CA2524571C (ru)
CY (1) CY1109454T1 (ru)
DE (1) DE602004021797D1 (ru)
DK (3) DK2075007T3 (ru)
ES (6) ES2246177B1 (ru)
IL (8) IL171651A (ru)
MX (1) MXPA05010914A (ru)
PL (3) PL2356996T3 (ru)
PT (3) PT2075007E (ru)
RU (2) RU2385161C2 (ru)
SI (1) SI1623719T1 (ru)
WO (1) WO2004098631A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712750C1 (ru) * 2016-02-15 2020-01-31 Араклон Байотек, С.Л. Амилоидный конъюгат, его применения и способы

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246177B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
AP2007003890A0 (en) 2004-07-30 2007-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amy-loid-beta peptide and methods using same
PE20061323A1 (es) 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
KR101667623B1 (ko) 2005-11-30 2016-10-19 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
EP2808032B1 (en) * 2005-12-12 2018-08-01 AC Immune S.A. A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
MX2009000476A (es) * 2006-07-14 2009-01-28 Ac Immune Sa Anticuerpo humanizado contra beta amiloide.
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
MX2009009234A (es) 2007-03-01 2009-12-01 Probiodrug Ag Uso nuevo de inhibidores de ciclasa de glutaminilo.
WO2008128985A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Probiodrug Ag Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
US8048420B2 (en) * 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
AU2008311367B2 (en) * 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
BRPI0818623A2 (pt) * 2007-10-05 2017-05-23 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para reduzir a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para diminuir a quantidade total de amilóide-beta solúvel na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular associada com anormalidades patológicas/mudanças no tecido do sistema visual, para monitorar doença ocular residual mínima associada com anormalidades patológicas/mudanças nos tecidos do sistema visual, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir a pressão ocular nos olhos de um animal
EP2149380A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-03 Medivet Pharma, S.L. Veterinary immunotherapy compositions for the Aged Related Cognitive Dysfunction.
EP2258398A1 (en) * 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
KR101755737B1 (ko) 2009-09-11 2017-07-07 프로비오드룩 아게 글루타미닐 사이클라제의 억제제로서 헤테로사이클릭 유도체
WO2011070174A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
US9181233B2 (en) 2010-03-03 2015-11-10 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
CA2789440C (en) 2010-03-10 2020-03-24 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
JP5945532B2 (ja) 2010-04-21 2016-07-05 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
EP2593475B1 (en) * 2010-07-14 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-addl monoclonal antibody and uses thereof
CA2806909C (en) * 2010-07-30 2019-12-17 Ac Immune S.A. Safe and functional humanized antibodies
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
ES2570167T3 (es) 2011-03-16 2016-05-17 Probiodrug Ag Derivados de benzimidazol como inhibidores de glutaminil ciclasa
WO2015017280A1 (en) 2013-07-28 2015-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
PL237739B1 (pl) 2018-06-06 2021-05-17 Univ Gdanski Genisteina do zastosowania do leczenia choroby Alzheimera

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339014C (en) * 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
AU5525090A (en) * 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
EP0526511B1 (en) 1990-04-27 1997-05-28 MCMICHAEL, John Method and composition for treatment of central nervous systems disease states associated with abnormal amyloid beta protein
US7427392B1 (en) * 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
EP1105163A4 (en) * 1998-08-20 2003-05-02 Univ California METHOD FOR MARKING AMYLOID PLAQUES AND NEUROFIBRILLIC GIFTS
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
CA2500462A1 (en) * 2001-12-26 2004-03-25 Universidad De Zaragoza Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
EP1371986A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-17 ABETA GmbH Diagnosis of Alzheimer's disease based on the hAbeta42:hAbeta40 ratio
CA2487528A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with beta-amyloid formation and/or aggregation
ES2201929B1 (es) * 2002-09-12 2005-05-16 Araclon Biotech, S.L. Anticuerpos policlonales, metodo de preparacion y uso de los mismos.
JP2006519762A (ja) * 2002-10-09 2006-08-31 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション アミロイドβペプチド及びその組成物に対する抗体を使用して、アルツハイマー病を治療する方法
AU2004209981B2 (en) * 2003-02-01 2009-02-26 Janssen Sciences Ireland Uc Active immunization to generate antibodies to soluble A-beta
ES2246177B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712750C1 (ru) * 2016-02-15 2020-01-31 Араклон Байотек, С.Л. Амилоидный конъюгат, его применения и способы

Also Published As

Publication number Publication date
IL207877A (en) 2013-03-24
PL1623719T3 (pl) 2010-11-30
JP2014129389A (ja) 2014-07-10
IL207875A (en) 2013-02-28
IL207878A0 (en) 2011-07-31
IL207878A (en) 2013-02-28
DE602004021797D1 (de) 2009-08-13
ES2423590T3 (es) 2013-09-23
JP2012006967A (ja) 2012-01-12
DK2356996T5 (da) 2013-08-26
EP2082747A2 (en) 2009-07-29
IL207877A0 (en) 2011-07-31
CA2524571A1 (en) 2004-11-18
PT2356996E (pt) 2013-08-23
IL207876A (en) 2013-03-24
EP2082747A3 (en) 2010-01-13
DK2356996T3 (da) 2013-07-22
CA2524571C (en) 2017-01-10
WO2004098631A1 (es) 2004-11-18
AU2011200170A1 (en) 2011-02-03
DK1623719T3 (da) 2009-11-09
CY1109454T1 (el) 2014-08-13
EP2356996B1 (en) 2013-06-26
AU2004237373A1 (en) 2004-11-18
SI1623719T1 (sl) 2009-12-31
PL2356996T3 (pl) 2013-09-30
PT1623719E (pt) 2009-10-08
EP2075007A3 (en) 2009-11-11
RU2385161C2 (ru) 2010-03-27
IL207875A0 (en) 2011-07-31
RU2005134351A (ru) 2006-04-27
PL2075007T3 (pl) 2013-09-30
ES2246105B1 (es) 2007-03-01
EP2356996A1 (en) 2011-08-17
ES2329369T3 (es) 2009-11-25
US20200140488A1 (en) 2020-05-07
MXPA05010914A (es) 2006-03-21
JP2018119011A (ja) 2018-08-02
AU2011200170B2 (en) 2011-09-01
IL207880A (en) 2013-02-28
ES2246178B1 (es) 2007-03-01
CN101264326A (zh) 2008-09-17
EP2305286A3 (en) 2011-11-09
EP2305286A2 (en) 2011-04-06
ES2246105A1 (es) 2006-02-01
EP2356996B9 (en) 2013-08-28
PT2075007E (pt) 2013-08-23
DK2075007T3 (da) 2013-07-29
BRPI0410684A (pt) 2006-06-20
CN1784240A (zh) 2006-06-07
EP2075007B1 (en) 2013-05-22
IL207881A0 (en) 2011-07-31
EP1623719B1 (en) 2009-07-01
ATE435024T1 (de) 2009-07-15
US20140044725A1 (en) 2014-02-13
RU2009148539A (ru) 2011-06-27
IL207880A0 (en) 2011-07-31
EP2075007B9 (en) 2013-09-04
US20110262458A1 (en) 2011-10-27
US20090162362A1 (en) 2009-06-25
ES2246177A1 (es) 2006-02-01
IL171651A (en) 2011-11-30
AU2011200170C1 (en) 2012-03-22
IL207876A0 (en) 2011-07-31
ES2246178A1 (es) 2006-02-01
EP2075007A2 (en) 2009-07-01
US20170260234A1 (en) 2017-09-14
US20210214394A1 (en) 2021-07-15
ES2246177B1 (es) 2007-03-01
IL207881A (en) 2013-02-28
JP2016065100A (ja) 2016-04-28
ES2423281T3 (es) 2013-09-19
EP1623719A1 (en) 2006-02-08
IL207879A0 (en) 2011-07-31
JP2006525288A (ja) 2006-11-09
IL207879A (en) 2013-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2526155C2 (ru) Способ лечения болезни альцгеймера
AU2011226926A1 (en) Alzheimer's disease treatment method

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner