PT2356996E - Tratamento para a doença de alzheimer - Google Patents

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PT2356996E
PT2356996E PT100123421T PT10012342T PT2356996E PT 2356996 E PT2356996 E PT 2356996E PT 100123421 T PT100123421 T PT 100123421T PT 10012342 T PT10012342 T PT 10012342T PT 2356996 E PT2356996 E PT 2356996E
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Araclon Biotech Sl
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Description

ΡΕ2356996 1
DESCRIÇÃO " TRATAMENTO PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER " 0 presente invento proporciona meios para o tratamento de doenças associadas à presença de depósitos amilóides, as quais incluem a doença de Alzheimer.
Estado da arte São conhecidos alguns factos acerca dos fenómenos bioquímicos e metabólicos associados à presença da doença de Alzheimer (AD) . Duas alterações estruturais e histopatológicas observadas nos cérebros dos que possuem AD são os emaranhados neurofibrilares (NFT) e os depósitos amilóides. Os emaranhados neurofibrilares intraneuronais estão também presentes noutras doenças neurodegenerativas, mas a presença de depósitos amilóides tanto nos espaços intraneuronais (placas neuríticas) como perto da microvasculatura (placas vasculares) parece ser característica de AD. Destes, as placas neuríticas parecem ser as mais comuns (Price, D.L., e colaboradores, Drug Development Research (1985) 5:59-68). 0 principal componente destas placas amilóides é um péptido de 40-42 aminoácidos designado péptido amilóide Αβ4 . 2 ΡΕ2356996 0 péptido amilóide Αβ4 é um péptido que tem origem na proteólise de glicoproteinas de membrana designadas proteínas precursoras do péptido amilóide Αβ4 (βΑΡΡ). Estas proteínas, precursoras do péptido amilóide, consistem em 695 a 770 aminoácidos, todos eles sendo codificados pelo mesmo gene.
Foram identificadas duas variantes principais do péptido amilóide Αβ4, os péptidos Αβ40 e Αβ42, contendo respectivamente 40 e 42 aminoácidos, os quais apresentam diferentes distribuições tecidulares em condições fisiológicas e patológicas. A variante de 42 aminoácidos é a forma predominante nas placas amilóides localizadas nos cérebros de doentes com AD.
Até agora, foram propostas diferentes soluções possíveis para proporcionar uma possível vacina contra AD.
Em EP526511, foi proposta a administração de doses homeopáticas de Αβ a doentes com AD pré-estabelecida. No entanto, devido às doses usadas, os níveis de Αβ circulante endógeno no plasma dificilmente variaram, e assim não foi expectável qualquer benefício terapêutico.
Schenk et al., (Nature, 1999; 400: 173-177) descrevem a imunização com Αβ42 de murganhos transgénicos PDAPP, que expressavam em excesso APP humana mutante, prevenindo assim a formação de placas amilóides, distrofia neurítica e astrogliose. 3 ΡΕ2356996
Em W09927944 (Schenk D.), é descrito um tratamento para AD através da administração a um doente de Αβ42 .
Um ensaio clinico de fase III em 360 doentes diagnosticados com AD média a moderada em 4 países Europeus e nos Estados Unidos, em que o péptido amilóide Αβ42 foi usado como antigénio, foi descontinuado após ser descrita encefalite nalguns doentes (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16 [7]: 22, April 1, 2002). O problema de usar uma proteína endógena como vacina (ou uma proteína presente naturalmente no animal que que é vacinado), como é o caso do péptido Αβ42, é o organismo responder fazendo anticorpos contra Αβ42 e contra fracções mais pequenas que podem também ter funções fisiológicas até agora desconhecidas. Entre alguns potenciais problemas que podemos mencionar está o possível desenvolvimento de doenças auto-imunes devido à geração de anticorpos contra a proteína endógena, dificuldade na geração de uma resposta imune devido à falência do sistema imune em reconhecer antigénios endógenos e possível desenvolvimento de uma resposta inflamatória aguda. O presente invento destina-se ao tratamento da doença de Alzheimer e de outras doenças amilóides através da administração de um péptido, da parte C terminal de Αβ, conjugado com uma proteína, em que numa realização preferida do presente invento a referida proteína é a 4 ΡΕ2356996 hemocianina de lapa.
Descrição do invento 0 presente invento está relacionado com uma vacina para o tratamento da doença de Alzheimer e de outras doenças amilóides relacionadas.
Em particular, o presente invento é dirigido a uma composição farmacêutica compreendendo um péptido com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2, que actua como um imunogénio para induzir anticorpos que reagem com Αβ para usar no tratamento de doença amilóide. 0 presente invento é igualmente dirigido a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo capaz de especificamente reconhecer qualquer uma das variantes predominantes dos péptidos amilóides beta Αβ40 e Αβ42, para usar no tratamento de uma doença amilóide, em que o anticorpo é obtido através de imunização de mamíferos ou aves, com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2, em que a sequência de aminoácidos está conjugada com uma proteína.
De acordo com uma realização preferida do presente invento, é proporcionada uma vacina para o tratamento da doença de Alzheimer e de outras doenças relacionadas, que ultrapassa as desvantagens associadas com a utilização de péptidos, proteínas ou imunogénios endógenos. 5 ΡΕ2356996
Exemplos de outras doenças caracterizadas por depósitos amilóides são a síndrome hereditária Islandesa, mieloma múltiplo e encefalite espongiforme, incluindo a doença de Creutzfeldt-Jakob. A introdução de uma resposta imune pode ser activa, como quando um imunogénio é administrado para induzir anticorpos que reagem com Αβ num doente, ou passiva, como quando é administrado um anticorpo que reage por si só com Αβ num doente.
Para fins do presente invento, os termos seguintes são definidos como se segue: 0 termo "doenças amilóides relacionadas" inclui doenças associadas com a acumulação de amilóide que pode ser restringida a um órgão, amiloidose localizada, ou disseminada por vários órgãos, amiloidose sistémica. Amiloidose secundária pode estar associada a infecções crónicas (tais como, por exemplo, tuberculose) ou inflamação crónica (por exemplo, artrite reumatóide), febre mediterrânica familiar (FMF) e outros tipos de amiloidose sistémica encontrada em doentes no tratamento a longo termo de hemodiálise. As formas localizadas de amiloidose incluem mas não estão limitadas a diabetes tipo II e quaisquer outras doenças relacionadas, doenças neurodegenerativas, tais como tremor epizoótico, encefalite espongiforme bovina, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Alzheimer e angiopatia amilóide cerebral. 6 ΡΕ2356996 0 termo "imunização passiva" é usado para relacionar com a administração de anticorpos ou fragmentos dos mesmos a um indivíduo com a intenção de conferir imunidade ao indivíduo.
No primeiro aspecto, é descrito o uso de um péptido que actua como um imunogénio ou como um anticorpo, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença caracterizada pela acumulação de depósitos amilóides. Os referidos métodos consistem na indução de uma resposta imune contra um componente peptídico dos depósitos amilóides no doente. A referida indução poderá ser activa, através da administração de um imunogénio, ou passiva, através da administração de um anticorpo ou de um fragmento activo ou derivado de um anticorpo.
Numa realização preferida do presente invento, a doença é a doença de Alzheimer. A medicação obtida pode ser usada em doentes assintomáticos e sintomáticos, tais como os que apresentam sintomas da doença.
As composições capazes de provocar uma resposta imune dirigida contra determinados componentes das placas amilóides são eficazes para o tratamento de doenças relacionadas com depósitos amilóides. Em particular, é possível prevenir a progressão, reduzir os sintomas e/ou reduzir o processo de deposição de amilóide num indivíduo, 7 ΡΕ2356996 quando uma dose imuno-estimuladora de um péptido ou de um anticorpo obtido a partir dele é administrado ao doente.
De acordo com um aspecto do presente invento, os anticorpos são obtidos através da imunização de mamíferos ou aves através do uso de um péptido conjugado com uma proteína como um imunogénio.
De acordo com uma realização preferida do presente invento, o mamífero usado para imunização pode ser ruminante, equino, lagomorfo, carnívoro, primata ou qualquer outro animal que permita que sejam extraídas quantidades adequadas de soro para o anticorpo. Entre as aves usada para imunização, podemos mencionar, embora não lhes estando limitados, galiformes, anseriformes e columbiformes, entre outros. 0 presente invento proporciona o uso de um péptido com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2 que actua como imunogénio para induzir anticorpos que reagem com Αβ para usar no tratamento de uma doença amilóide. 0 presente invento também proporciona o uso de um anticorpo capaz de reconhecer especificamente qualquer uma das variantes predominantes do péptido amilóide beta, Αβ40 e Αβ42, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença amilóide, em que o anticorpo é obtido através de imunização de mamíferos ou aves, com uma sequência de ΡΕ2356996 aminoácidos compreendendo SEQ ID N°2, em que a sequência de aminoácidos é conjugada com uma proteína.
De acordo com a realização mais preferida do presente invento, a proteína usada para conjugação com o péptido 'é a proteína de lapa.
Neste pedido, os aminoácidos são abreviados usando os códigos de uma única letra aceite na área, como indicado abaixo: A= Ala = alanina C= Cys= cisterna D= Asp= ácido aspártico E= Glu= ácido glutâmico F= Phe= fenilalanina G= Gly= glicina H= His = histidina 1 = Ile= isoleucina K= Lys = lisina L= Leu= leucina M= Met= metionina N= Asn= asparagina P= Pro= prolina Q= Gln= glutamina R= Arg= arginina S = Ser= serina T= Thr= treonina V= Val= valina 9 ΡΕ2356996 W= Trp= triptofano Y= Tir= tirosina A sequência descrita no presente invento e identificada como SEQ ID N° 2 corresponde à seguinte sequência de aminoácidos:
SEQ ID NO 2 GLMVGGVV
Ao anticorpo obtido a partir do péptido anterior foi atribuído o código SAR-3 correspondendo ao apresentado abaixo: SEQ ID NO 2 SAR-3 A informação relacionada com a identificação das sequências peptídicas, descritas no presente invento, que acompanham o presente documento num formato legível em computador, está indicada na lista de sequências que é apresentada juntamente com este documento.
Exemplos 0 presente invento é ilustrado por meio dos exemplos que se seguem.
Exemplo 1. Geração de anticorpos policlonais. 0 anticorpo policlonal contra o péptido conjugado 10 ΡΕ2356996 com KLH que foram usados como imunogénio foi gerado por imunização em coelhos brancos da Nova Zelândia. O imunogénio foi injectado em dois coelhos, com cinco injecções em cada coelho: a primeira injecção intradérmica do conjugado péptido-KLH em PBS e emulsionado em adjuvante completo de Freund e mais quatro injecções intramusculares, como uma dose de reforço nos dias 14, 28, 4 9 e 80, do mesmo conjugado péptido-KLH em PBS mas desta vez emulsionado em adjuvante incompleto de Freund, com colheita de sangue 90 dias depois para detectar a presença de anticorpos.
Após colheita do sangue, o soro foi separado e pré-purifiçado através de remoção de sal e depois o anticorpo foi purificado por afinidade numa matriz compreendendo 1,5 ml de material activado com EMD-Epoxi (Merck) a que foi adicionado 5 mg do péptido correspondente. As fracções purificadas foram ajustadas a 0,1% de BSA (Sigma) e guardadas a 4°C, podendo ser adicionado 20-50% de glicerol como crioprotector.
Exemplo 2. Transferência Western para Αβ 1. Electroforese
Usou-se o método de Laemmmli, descrito em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, 1998, modificado para melhorar a separação 11 ΡΕ2356996 de pequenos péptidos. 0 sistema usado foi um Miniprotean 3 da Bio-Rad.
Usou-se um gel de 15% de acrilamida, com mistura dos seguintes componentes:
Soluções stock Gel de separação Gel de (15%) concentração 40% acrilamida 3.75 ml 500 μΐ Tris 3M, pH= 8,45 3,3 ml 250 μΐ Glicerol 1,05 ml _ Água 1, 9 ml 4,2 μΐ 20% SDS 50 μΐ 18,6 μΐ 10% APS 50 μΐ 25 μΐ TEMED 10 μΐ 5 μΐ
Foram usadas soluções stock iniciais de 1 mg/ml dos péptidos Αβ40 e Αβ42 (dissolvidos em PBS) . 0 volume necessário foi retirado destas soluções para cada uma das amostras e ajustado a 20 μΐ com SBL + Tris base 2M) . As amostras foram então fervidas durante 5 minutos para desnaturar os péptidos e eliminar possíveis proteases. O centro da tina foi preenchido com tampão do cátodo e o exterior com tampão do ânodo, a composição destes tampões é a seguinte. 12 ΡΕ2356996
Tampão do ânodo 24,2 g de Tris base (concentração final 0,2M).
Diluir para 1 litro com H20.
Ajustar a pH 8,9 com HC1 concentrado.
Guardar a 4°C até 1 mês.
Tampão do cátodo 12,11 g de Tris base (concentração final 0,1M). 17,92 g de tricina (concentração final 0,1M). lg de SDS (0,1% concentração final).
Diluir para 1 litro com H20. Não ajustar o pH.
Guardar a 4°C até 1 mês.
Finalmente as amostras foram aplicadas nos alvéolos: 20 μΐ/alvéolo. Usando o Polypeptide Standard
Kaleidoscope da Bio-Rad como marcador, a migração começou numa voltagem baixa (30 V) e depois a voltagem foi aumentada para 100 V, após aproximadamente 1 hora de electroforese. 2. Transferência para membrana
As proteínas separadas no gel foram transferidas para membrana PVDF através de electrotransferência. Nas sanduíches colocou-se o seguinte
Lado preto - esponja - 3 papéis Whatmann (ou papéis de filtro) - gel - 3 papéis Whatmann - esponja - 13 ΡΕ2356996 lado transparente. A tina foi então cheia com tampão de electrotransferência.
Glicina 38 nM Tris base 50 mM Metanol 40% A transferência foi realizada durante 2 horas a 200 mA. Durante a transferência, o tampão foi mantido em agitação com a barra magnética. 3. Incubação com anticorpos O anticorpo e o leite em pó foram dissolvidos em PBS-t (PBS + 0,5% Tween 20), fazendo as lavagens igualmente com PBS-T.
Após a transferência, a superfície da membrana foi bloqueada com solução a 5% de leite em pó, durante 1 hora, com agitação e à temperatura ambiente (t.a.).
Após isto, a membrana foi lavada durante 2x5 minutos a t.a.
Em seguida, foi incubada com anticorpo primário (SAR-3) durante 1 hora à t.a., diluído pelo menos a 1:500 em PBS-T. 14 ΡΕ2356996 A membrana foi lavada: 3x 10 minutos à t.a. Em seguida, foi incubada com anticorpo secundário: cabra anti-coelho-HRP durante 1 hora à t.a. (1:10000 em todos os casos). A lavagem da membrana foi repetida mais uma vez: 3 x 10 minutos à t.a. 4. Revelação
Após a última lavagem, a membrana foi incubada com a solução do kit de quimioluminescência, usando o kit ECL+Plus da Pharmacia. A membrana foi envolvida em celofane e exposta a filme de dupla emulsão (Hyperfilm MP da Amersham), durante diferentes tempos entre 30 segundo e 2 minutos.
Exemplo 3. Imuno-histoquímica com anticorpos SAR-3 no tecido de cérebro humano.
As secções de tecido foram fixadas em parafina seguindo os seguintes passos: a) fixação em formol neutro a 10% b) desidratação através de passos sucessivos em concentrações crescentes de álcool c) passagens através de xilol e parafina, este último passo na estufa a 60-62°C. 15 ΡΕ2356996 d) obtenção de blocos de parafina, os quais foram cortados em 4 microns e montados em lâminas.
As secções foram então desparafinizadas através da passagem pelas seguintes soluções:
Xilol 100% 1C 1 minutos Xilol 100% 1C 1 minutos Etanol 100% 5 minutos Etanol 100% 5 minutos Etanol 96% 5 minutos Etanol 96% 5 minutos Etanol 90% 5 minutos Etanol 70% 5 minutos PBS 5 minutos x 3 vezes
Em seguida foram tratadas da seguinte forma: a) 96% de ácido fórmico durante 3 minutos numa hote química e com agitação b) Lavagem rápida com água c) Lavagem em PBS 2x5 minutos d) Bloqueio das peroxidases endógenas durante 15 minutos numa solução constituída por 70 ml de PBS, 30 ml de metanol e 1 ml de H2O2 e) Lavagem em PBS 3x5 minutos f) Lavagem com PBS/T (triton ou Tween-20 a 0,5% em PBS) 3 x 5 minutos g) Bloqueio da ligação não específica com soro de cabra 16 ΡΕ2356996 (Soro de cabra normal) diluído a 10:100 em PBS/T durante duas horas h) Incubação do anticorpo primário toda a noite a 4°C numa câmara húmida:
SAR-3... Diluição 1:1500 em PBS i) Lavagem em PBS/T 3x5 minutos j) Incubação em anticorpo secundário (cabra anti-coelho) diluído a 1:200 em PBS durante 45 minutos k) Lavagem em PBS 4x5 minutos l) Incubação de ABC (complexo avidina-biotina) da Vector Labs numa diluição de 1:100 em PBS/T durante 45 minutos mo escuro, mantendo estas condições até a revelação estar finalizada m) Lavagem em PBS 3x5 minutos n) Revelação em diaminobenzidina (DAB) O tempo foi controlado empiricamente ao estereomicroscópio. Para tal, primeiro foi feita uma lavagem numa solução de Tris-HCl 0,5M durante 10 minutos com agitação, para depois continuar a incubação com um substrato diaminobenzidina (DAB) diluído em Tris-HCl 0,5M e ao qual se adicionou 0,5 μΐ/ml de H202 a 4°C. Uma vez terminada a reacção, foram feitas três lavagens com PBS a 4°C durante 5 minutos de cada vez e depois foi feita desidratação em etanol a 70%, 90% e 100% durante 2 minutos da cada vez, passando através de xilol durante 4 minutos e ainda mais um passo através de xilol durante 2 minutos, até serem montados com Eukitt para observação ao microscópio. 17 ΡΕ2356996
Lista de sequências NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 INFORMAÇÃO SOBRE A SEQUÊNCIA 1: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 8 TIPO: aminoácido TIPO DA MOLÉCULA: péptido FONTE: Sintese quimica DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO 2
Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai Vai 1 5 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ARACLON BIOTECH, S.L. <120> Método para o tratamento da doença de Alzheimer. <130> EP1513.A.2.div2 <140> EP10012342.1 <141> 2101-09-30 <160> 4 ΡΕ2356996 18 <17 0> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Um fragmento beta do péptido amilóide beta <4 0 0> 1Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Um fragmento beta do péptido amilóide beta <4 0 0> 2
Gly Leu Met vai Gly Gly vai vai 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT 19 ΡΕ2356996 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Um fragmento beta do péptido amilóide beta <400> 3
Gly Leu Met vai Gly Gly vai vai ile Ala 1 5 10
<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Um fragmento beta do péptido amilóide beta <400> 4
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu vai His His Gin Lys 1 5 10
Lisboa, 6 de Agosto de 2013

Claims (4)

  1. ΡΕ2356996 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2, que actua como imunogénio para induzir anticorpos que reagem com Αβ para usar no tratamento de uma doença amilóide.
  2. 2. A composição farmacêutica compreendendo um péptido com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2 para usar de acordo com a reivindicação 1, em que a doença amilóide é a doença de Alzheimer ou angiopatia amilóide cerebral.
  3. 3. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo capaz de especificamente reconhecer qualquer uma das variantes predominantes do péptido amilóide beta Αβ40 e Αβ42, para usar no tratamento de uma doença amilóide, em que o anticorpo é obtido através de imunização de mamíferos ou aves com uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N° 2, em que a sequência de aminoácidos é conjugada com uma proteína.
  4. 4. A composição farmacêutica compreendendo um anticorpo capaz de especificamente reconhecer qualquer uma das variantes predominantes do péptido amilóide beta Αβ40 e Αβ42, para usar de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína conjugada com a sequência de aminoácidos usada 2 ΡΕ2356996 para obter o anticorpo através de imunização de mamiferos e aves é proteina de lapa (KLH). Lisboa, 6 de Agosto de 2013 1 ΡΕ2356996 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na descrição • EP 526511 A · WO 9927944 A, Schenk D. • EP 1513 A ·ΕΡ 10012342 A Literatura que não é de patentes citada na descrição • PRICE, D.L. Drug Development Research, 1985, vol.5, 59-68 • SCHENK et al. Nature, 1999, vol. 400, 173-177 • The Scientist, 01 April 2002, vol. 16 (7), 22 • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1998
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