ES2263408T3 - Prevencion y tratamiento de enfermedad amiloidogenica. - Google Patents

Prevencion y tratamiento de enfermedad amiloidogenica. Download PDF

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Abstract

Un conjugado comprende un agente unido a una proteína portadora, donde el agente es: i) Aâ ii) un fragmento Aâ que contiene un epitope que induce una respuesta inmune terapéutica o protectora similar tras la administración a un paciente como un péptido Aâ; o iii) un análogo o mimético de (i) o (ii), donde el análogo o mimético contiene un epitope que induce una respuesta inmune terapéutica o protectora similar tras la administración a un paciente como un péptido Aâ; y donde la proteína portadora aumenta una respuesta inmune contra Aâ.

Description

Prevención y tratamiento de enfermedad amiloidogénica.
Campo técnico
La invención se refiere a los campos técnicos de inmunología y medicina.
Antecedentes
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva que da como resultado demencia senil. Véanse generalmente Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et al., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995). En líneas generales, la enfermedad cae dentro de dos categorías: comienzo tardío, que se produce en ancianos (65 o más años de edad) y comienzo temprano, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre los 35 y los 60 años de edad. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma, pero las anomalías tienden a ser más graves y extendidas en los casos que comienzan en una edad más temprana. La enfermedad está caracterizada por dos tipos de lesiones en el cerebro, placas seniles y ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son zonas de neurópilos desorganizados de hasta 150 \mum de ancho con depósitos amiloides extracelulares en el centro visibles mediante análisis microscópico de cortes de tejido cerebral. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de la proteína tau que consiste en dos filamentos enrollados uno alrededor del otro en pares.
El constituyente principal de las placas es un péptido denominado péptido A\beta o \beta-amiloide. El péptido A\beta es un fragmento interno de 39-43 aminoácidos de una proteína precursora denominada proteína precursora de amiloide (APP). Varias mutaciones dentro de la proteína APP se han correlacionado con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Véanse, por ejemplo, Goate et al., Nature 349, 704 (1991) (de valina^{717} a isoleucina); Chartier Harlan et al. Nature 353, 844 (1991)) (de valina^{717} a glicina); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (de valina^{717} a fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (una mutación doble que cambia de lisina^{595}-metionina^{596} a asparagina^{595}-leucina^{596}). Se cree que tales mutaciones producen la enfermedad de Alzheimer aumentando o alterando el procesamiento de APP en A\beta, particularmente el procesamiento de APP a cantidades crecientes de la forma larga de A\beta (es decir, A\beta1-42 y A\beta1-43). Se cree que las mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades crecientes de la forma larga A\beta (véase Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Estas observaciones indican que A\beta, y particularmente su forma larga, es un elemento causante de la enfermedad de Alzheimer.
McMichael, documento EP 526.511, propone la administración de dosificaciones homeopáticas (inferiores a o iguales a 10^{-2} mg/día) de A\beta a pacientes con EA establecida previamente. En un ser humano típico con aproximadamente 5 litros de plasma, podría esperarse que incluso el límite superior de esta dosificación generase una concentración no superior a 2 pg/ml. La concentración normal de A\beta en el plasma humano normalmente está en el intervalo de 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)). Dado que la dosificación propuesta del documento EP 526.511 apenas alteraría el nivel de A\beta circulante endógeno y dado que el documento EP 526.511 no recomienda el uso de un adyuvante, no parece plausible que pudiera resultar ningún beneficio terapéutico.
En contraposición, la presente invención se refiere, entre otros, al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de otras enfermedades amiloidogénicas mediante la administración de A\beta u otro inmunógeno a un paciente en condiciones que generen una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. La invención cumple así una necesidad que viene de antiguo de regímenes terapéuticos para evitar o mejorar la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer.
Sumario de la invención reivindicada
En un aspecto la invención proporciona un conjugado que comprende un agente unido a una proteína vehículo, como se indica en las reivindicaciones, para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por las deposiciones de amiloide en un paciente. Tales usos suponen la inducción de una respuesta inmunitaria contra un componente peptídico de un depósito de amiloide en el paciente. Tal inducción es activa mediante la administración de un conjugado inmunógeno. En algunos pacientes, el depósito amiloide es el péptido A\beta agregado y la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. El paciente puede ser asintomático. El paciente puede ser menor de 50 años de edad. El paciente puede tener factores de riesgo heredados que indican propensión a la enfermedad de Alzheimer. Tales factores de riesgo incluyen alelos variantes en el gen de la presenilina PS1 o PS2 y formas variantes de APP. El paciente puede no tener factores de riesgo conocidos para la enfermedad de Alzheimer.
Para el tratamiento de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer, un régimen de tratamiento supone administrar una dosis del conjugado de péptido A\beta al paciente para inducir la respuesta inmunitaria. El conjugado de péptido A\beta puede administrarse con un adyuvante que potencia la respuesta inmunitaria frente al péptido A\beta. El adyuvante puede ser alumbre. El adyuvante puede ser MPL. La dosis del péptido A\beta administrada al paciente normalmente es de al menos 1 \mug ó 10 \mug, si se administra con adyuvante, y de al menos 50 \mug si se administra sin adyuvante. La dosis puede ser de al menos 100 \mug.
El péptido A\beta puede ser A\beta_{1}-42.
La respuesta inmunitaria puede dirigirse al péptido A\beta agregado sin dirigirse al péptido A\beta disociado. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria puede comprender anticuerpos que se unen al péptido A\beta agregado sin unirse al péptido A\beta disociado. La respuesta inmunitaria puede comprender células T que se unen a A\beta que forma complejo con MCH1 o MCHII sobre células CD8 o CD4. La respuesta inmunitaria puede inducirse mediante la eliminación de las células T del paciente poniendo en contacto las células T con el conjugado del péptido A\beta en condiciones en las que las células T están cebadas y reemplazando las células T en el paciente.
El agente terapéutico normalmente se administra por vía oral, intranasal, intradérmica, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa. En algunos procedimientos, el paciente puede controlarse tras la administración para evaluar la respuesta inmunitaria. Si el control indica una reducción de la respuesta inmunitaria a lo largo del tiempo, puede administrarse al paciente una o más dosis adicionales del agente.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado A\beta y un excipiente adecuado para la vía oral y otras vías de administración. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un agente eficaz para inducir una respuesta inmunogénica contra A\beta en un paciente, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. El agente es un conjugado de A\beta o un fragmento activo del mismo. En algunas composiciones, el adyuvante comprende alumbre. En algunas composiciones, el adyuvante comprende una emulsión de aceite en agua. En algunas composiciones, el fragmento de A\beta o fragmento activo es un componente o un copolímero de polilactida-poliglicólido (PLPG) u otra partícula. La molécula de conjugado promueve una respuesta inmunitaria frente a A\beta. En algunas composiciones, el conjugado es la toxina colérica. En algunas composiciones, el conjugado es una inmunoglobulina. En algunas composiciones, el conjugado es toxina diftérica atenuada CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-3 (1997).
La invención proporciona además el uso de conjugados de A\beta en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En otro aspecto la invención proporciona procedimientos de evaluar la eficacia de un tratamiento para el Alzheimer en un paciente. En estos procedimientos se determina una cantidad inicial de anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejido del paciente antes del tratamiento con el conjugado. Se compara una cantidad de anticuerpo específico frente al péptido A\beta en la muestra de tejido del paciente tras tratamiento con el conjugado con la cantidad inicial del anticuerpo específico frente al péptido A\beta. Una cantidad del anticuerpo específico frente al péptido A\beta medida tras el tratamiento que es significativamente mayor que la cantidad inicial del anticuerpo específico frente al péptido A\beta indica un desenlace de tratamiento positivo.
En otros procedimientos de evaluar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina una cantidad inicial del anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejido de un paciente antes del tratamiento con un conjugado. Se compara una cantidad de anticuerpo específico para péptido A\beta en la muestra de tejido del sujeto tras el tratamiento con el conjugado con la cantidad inicial del anticuerpo específico frente al péptido A\beta. Una reducción o ausencia de diferencia significativa entre la cantidad del anticuerpo específico frente al péptido A\beta medida tras el tratamiento en comparación con la cantidad inicial del anticuerpo específico frente al péptido A\beta indica un desenlace de tratamiento negativo.
En otros procedimientos de evaluar la eficacia de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina una cantidad control de anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejidos de una población control. Se compara una cantidad de anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejido del paciente tras administrar un conjugado con la cantidad control del anticuerpo específico frente al péptido A\beta. Una cantidad de anticuerpo específico frente al péptido A\beta medida tras el tratamiento que es significativamente mayor que la cantidad control de anticuerpo específico frente al péptido A\beta indica un desenlace de tratamiento positivo.
En otros procedimientos de evaluar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina una cantidad control de anticuerpo específico para el péptido A\beta en muestras de tejidos de una población control. Se compara una cantidad de anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejido del paciente tras administrar un agente con la cantidad control de anticuerpo específico frente al péptido A\beta. Una ausencia de diferencia significativa entre la cantidad de anticuerpo específico frente al péptido A\beta medida tras el comienzo de dicho tratamiento en comparación con la cantidad control de anticuerpo específico frente al péptido A\beta indica un desenlace de tratamiento negativo.
Otros procedimientos de control de la enfermedad de Alzheimer o propensión a la misma en un paciente, comprenden detectar una respuesta inmunitaria frente al péptido A\beta en una muestra del paciente. En algunos procedimientos de este tipo, al paciente se le está administrando un agente eficaz para tratar o evitar la enfermedad de Alzheimer, y el nivel de respuesta determina el régimen de tratamiento futuro del paciente.
En otros procedimientos de evaluación de la eficacia de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina un valor para una cantidad de anticuerpo específico para el péptido A\beta en una muestra de tejido de un paciente que se ha tratado con un conjugado. El valor se compara con un valor control determinado a partir de una población de pacientes que experimentan mejoría de, o ausencia de, síntomas de la enfermedad de Alzheimer debido al tratamiento con el conjugado. Un valor en el paciente al menos igual al valor control indica una respuesta positiva al tratamiento.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Título de anticuerpos tras la inyección a ratones transgénicos con A\beta1-42.
Figura 2: Carga de amiloide en el hipocampo. Se determinó el porcentaje de la zona de la región del hipocampo ocupada por placas amiloides, definido mediante la reactividad con el mA\beta 3D6 específico para A\beta, mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Se muestran los valores para los ratones individuales clasificados por grupo de tratamiento. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor de mediana de la distribución.
Figura 3: Distrofia neurítica en el hipocampo. Se determinó el porcentaje de la zona de la región del hipocampo ocupada por neuritas distróficas, definido por su reactividad con el mA\beta 8E5 específico para la APP humana mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Se muestran los valores para los ratones individuales para el grupo tratado con AN1792 y el grupo control tratado con PBS. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor de mediana de la distribución.
Figura 4: Astrocitosis en la corteza retroesplenial. Se determinó el porcentaje de la zona de la región cortical ocupada por astrocitos positivos para la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Los valores para los ratones individuales se muestran clasificados por grupo de tratamiento y los valores de mediana de los grupos se indican mediante líneas horizontales.
Figura 5: Títulos de anticuerpos en media geométrica frente a A\beta1-42 tras inmunización con un intervalo de ocho dosis de AN1792 que contienen 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 ó 300 \mug.
Figura 6: Cinéticas de respuesta de anticuerpos frente a inmunización con AN1792. Los títulos se expresan como las medias geométricas de los valores para los 6 animales en cada grupo.
Figura 7: Análisis de imágenes cuantitativo de la carga de amiloide cortical en ratones tratados con PBS y AN1792.
Figura 8: Análisis de imágenes cuantitativo de la carga de placas neuríticas en ratones tratados con PBS y AN1792.
Figura 9: Análisis de imágenes cuantitativo del porcentaje de la corteza retroesplenial ocupada por astrocitosis en ratones tratados con PBS y AN1792.
Figura 10: Ensayo de proliferación de linfocitos en células de bazo de tratados con AN1792 (panel superior) o tratados con PBS (panel inferior)).
Figura 11: Niveles totales de A\beta en la corteza. Un diagrama de dispersión de perfiles individuales de A\beta en ratones inmunizados con derivados de APP o A\beta combinados con adyuvante de Freund.
Figura 12: Se determinó la carga de amiloide en la corteza mediante análisis de imágenes cuantitativo de cortes de cerebro inmunorreactivo para ratones inmunizados con los conjugados A\beta1-5, A\beta1-12, y A\beta13-28 del Optido A\beta; el grupo control tratado con PBS y con los agregados de A\beta de longitud completa AN1792 (A\beta1-42) y AN1528 (A\beta1-40).
Figura 13: Títulos en media geométrica del anticuerpo específico para A\beta para grupos de ratones inmunizados con derivados de APP o A\beta combinados adyuvante de Freund.
Figura 14: Títulos en media geométrica del anticuerpo específico para A\beta para grupos de cobayas inmunizados con AN1792, o un derivado palmitoilado del mismo, combinado con diversos adyuvantes.
Figuras 15A: Niveles de A\beta en la corteza de ratones PDAPP de 12 meses de edad tratados con AN1792 o AN1528 con diferentes adyuvantes.
Definiciones
La expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan valores de hueco por defecto, comparten al menos una identidad de secuencia del 65 por ciento, preferiblemente al menos una identidad de secuencia del 80 o el 90 por ciento, más preferiblemente al menos una identidad de secuencia del 95 por ciento o más (por ejemplo, una identidad de secuencia del 99 por ciento o superior). Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba.
\newpage
Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de prueba y de referencia, se diseñan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces la identidad de secuencia en porcentaje para la(s) secuencias(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros diseñados del programa.
La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de programa Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente Ausubel et al., citado anteriormente). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el tanto por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo de BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Normalmente, pueden usarse los parámetros del programa por defecto para realizar la comparación de las secuencias, aunque también pueden usarse parámetros personalizados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989))
Para el fin de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan tal como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.
Los agentes terapéuticos de la invención normalmente son sustancialmente puros. Esto significa que un agente normalmente tiene al menos aproximadamente el 50% p/p (peso/peso) de pureza, así como que está sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieren. En ocasiones los agentes tienen al menos aproximadamente el 80% p/p y, más preferiblemente al menos el 90% p/p o aproximadamente el 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando técnicas convencionales de purificación de proteínas pueden obtenerse péptidos homogéneos de al menos el 99% p/p.
La unión específica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} M^{-1} o 10^{10} M^{-1}. Se prefieren las afinidades mayores que 10^{8} M^{-1}.
El término "anticuerpo" se usa. para incluir anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Normalmente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivan para la unión específica a un antígeno. Opcionalmente, los anticuerpos o los fragmentos de unión de los mismos, pueden estar químicamente conjugados a, o expresarse como, proteínas de fusión con otras proteínas.
APP^{695}, APP^{751} y APP^{770} se refieren, respectivamente, a los polipéptidos largos de 695, 751 y 770 residuos de aminoácidos codificados por el gen de la APP humana. Véanse Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); y Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). A los aminoácidos dentro de la proteína precursora de amiloide (APP) humana se les asignan números según la secuencia de la isoforma APP770. Los términos tales como A\beta39, A\beta40, A\beta41, A\beta42 y A\beta43 se refieren a un péptido A\beta que contiene 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 y 1-43 residuos de aminoácidos.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos para las células B pueden estar formados por ambos aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden con el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Normalmente un epítopo incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 ó 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos de determinación de la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Las células T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Las células T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, tal como se determina mediante la incorporación de ^{3}H-timidina por las células T cebadas en respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante la eliminación dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) o mediante la secreción de citocinas.
La expresión respuesta "inmunológica" o "inmunitaria" es el desarrollo de una respuesta beneficiosa humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por células T específicas de antígeno o por sus productos de secreción) dirigida frente a un péptido amiloide en un paciente receptor. Una respuesta de este tipo puede ser una respuesta activa inducida mediante la administración de inmunógenos o una respuesta pasiva inducida mediante la administración de anticuerpos o células T cebadas. Una respuesta inmunitaria celular está provocada por la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas del CMH de Clase I o de Clase II para activar a las células T cooperadoras CD4^{+} específicas de antígeno y/o a las células T citotóxicos CD8^{+}. La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de la microglía, eosinófilos u otros componentes de inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante ensayos de proliferación (células T CD4^{+}) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos) (véanse Burke, citado anteriormente; Tigges, citado anteriormente). Las contribuciones relativas de las respuestas humoral y celular al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno pueden distinguirse aislando separadamente IgG y células T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.
Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" puede inducir una respuesta inmunológica frente a sí mismo con la administración a un paciente, opcionalmente junto con un adyuvante.
La expresión "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido no complejado con materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos se clonan a veces en un vector de plásmido.
El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmunitaria al antígeno, pero que cuando se administra sólo no genera una respuesta inmunitaria al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos.
El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o bien terapéutico.
A\beta disgregado o monomérico significa unidades peptídicas monoméricas solubles de A\beta. Un procedimiento para preparar A\beta monomérico es disolver el péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación.
La disolución resultante se centrifuga para eliminar cualquier material particulado no soluble. El A\beta agregado es una mezcla de oligómeros en los que las unidades monoméricas se mantienen juntas mediante enlaces no covalentes.
Las composiciones o los procedimientos "que comprenden" uno o más de los elementos nombrados pueden incluir otros elementos no nombrados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende el péptido A\beta engloba ambos un péptido A\beta aislado y un péptido A\beta como componente de una secuencia polipeptídica más grande.
Descripción detallada I. General
La invención proporciona composiciones farmacéuticas y agentes para el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades caracterizadas por la acumulación de depósitos amiloides. Los depósitos amiloides comprenden un péptido agregado a una masa insoluble. La naturaleza del péptido varía en las diferentes enfermedades, pero en la mayoría de los casos, el agregado tiene una estructura en lámina \beta plegada y se tiñe con colorante rojo Congo. Las enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA), de comienzo tardío y temprano. En ambas enfermedades, el depósito amiloide comprende un péptido denominado A\beta, que se acumula en el cerebro de los individuos afectados. Los ejemplos de algunas de otras enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides son amiloidosis por SAA, síndrome islándico hereditario, mieloma múltiple y encefalopatías espongiformes, incluyendo la enfermedad de las vacas locas, la enfermedad de Creutzfeldt Jakob, encefalopatía espongiforme ovina y encefalopatía espongiforme del visón (véanse Weissmann et al., Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits et al., Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997); Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 145, 959-969 (1997)). Los péptidos que forman los agregados en esas enfermedades son amiloide sérico A, cistatina C, cadena lingera kappa de la IgG, respectivamente para las tres primeras, y proteína priónica para las otras.
II. Agentes terapéuticos 1. Enfermedad de Alzheimer
Los agentes terapéuticos para su uso en la presente invención inducen una respuesta inmunitaria frente al péptido A\beta. Estos agentes comprenden un conjugado tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. La inducción de una respuesta inmunitaria se activa cuando se administra un inmunógeno para inducir anticuerpos o células T reactivas con A\beta en un paciente.
A\beta, también conocido como péptido \beta-amiloide, o péptido A4 (véanse el documento US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), es un péptido de 39-43 aminoácidos, que es el principal componente de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. A\beta se genera mediante el procesamiento de una proteína más grande, APP, mediante dos enzimas denominadas \beta y \gamma-secretasas (véase Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Se producen mutaciones conocidas en APP asociadas con la enfermedad de Alzheimer próximas al sitio de \beta o \gamma-secretasa, o dentro de A\beta. Por ejemplo, la posición 717 está próxima al sitio de escisión de \gamma-secretasa de APP en su procesamiento a A\beta, y las posiciones 670/671 están próximas al sitio de escisión de \beta-secretasa. Se cree que las mutaciones producen la enfermedad EA mediante la interacción con reacciones de escisión mediante las cuales se forma A\beta, de modo que se aumenta la cantidad de la forma de 42/43 aminoácidos del A\beta generado.
A\beta tiene la propiedad inusual de que puede fijarse y activar ambas cascadas del complemento clásica y alternativa. En particular, se une a Clq y en última instancia a C3bi. Esta asociación facilita la unión a macrófagos, lo que conduce a la activación de las células B. Además, C3bi se rompe adicionalmente y entonces se une a CR2 en las células B de una manera dependiente de células T, lo que conduce a un aumento de 10.000 en la activación de estas células.
Este mecanismo hace que A\beta genere una respuesta inmunitaria en exceso de la de otros antígenos.
El agente terapéutico usado en la invención puede ser un conjugado de cualquiera de las formas de origen natural del péptido A\beta, y particularmente de las formas humanas (es decir, A\beta39, A\beta40, A\beta41, A\beta42 o A\beta43). Las secuencias de estos péptidos y su relación con el precursor APP se ilustran mediante la figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, A\beta42 tiene la secuencia:
\quad
H_{2}N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.
A\beta41, A\beta40 y A\beta39 difieren de A\beta42 por la omisión de Ala, Ala-Ile y Ala-Ile-Val, respectivamente, del extremo C-terminal. A\beta43 difiere de A\beta42 por la presencia de un residuo de treonina en el extremo C-terminal. El agente terapéutico también puede ser un conjugado de un fragmento activo de un péptido A\beta natural que contiene un epítopo que induce una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica similar con su administración a un ser humano. Los fragmentos inmunogénicos típicamente tienen para su uso una secuencia de al menos 3, 5, 6, 10 ó 20 aminoácidos contiguos de un péptido natural. Los fragmentos inmunogénicos incluyen A\beta1-5 y 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 y 35-42. Se prefieren los fragmentos de la mitad N-terminal de A\beta. Los fragmentos pueden examinarse para determinar su eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales transgénicos, tal como se describe más adelante.
A\beta y sus fragmentos pueden sintetizarse mediante síntesis de péptidos en fase sólida o expresión recombinante, o pueden obtenerse de fuentes naturales. Los sintetizadores de péptidos automáticos están disponibles comercialmente de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresión recombinante puede ser en bacterias, tales como E. coli, levaduras, células de insectos o células de mamíferos. Los procedimientos para la expresión recombinante se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2^{a} ed., 1989). Algunas formas del péptido A\beta también están disponibles comercialmente (por ejemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA y California Peptide Research, Inc. Napa, CA).
Los agentes terapéuticos también incluyen conjugados de polipéptidos más largos que incluyen, por ejemplo, un péptido A\beta, o fragmento activo conjuntamente con otros aminoácidos. Por ejemplo, el péptido A\beta puede estar presente en forma de una proteína APP intacta o su segmento, tal como el fragmento C-100 que comienza en el terminal N de A\beta y continúa hasta el extremo de APP. Tales polipéptidos se pueden examinar para determinar la eficacia profiláctica y terapéutica en modelos animales como se describe más adelante. El péptido o fragmento activo de A\beta u otro polipéptido puede administrarse en forma asociada (es decir, como un péptido amiloide) o en forma disociada. Los agentes terapéuticos también incluyen conjugados de multímeros de agentes inmunogénicos monoméricos.
En una variación adicional, puede presentarse un conjugado de A\beta como una vacuna viral o bacteriana. Un ácido nucleico que codifica el péptido inmunogénico se incorpora en un genoma o episoma del virus o la bacteria. Opcionalmente, el ácido nucleico se incorpora de una manera tal que el péptido inmunogénico se expresa como una proteína secretada o como una proteína de fusión con una proteína de la superficie externa de un virus o una proteína transmembrana de una bacteria de modo que se presenta el péptido. Los virus o las bacterias usados en tales procedimientos deben ser no patogénicos o atenuados. Los virus adecuados incluyen adenovirus, VHS, virus vaccinia y virus de la viruela aviar. La fusión de un péptido inmunogénico con HBsAg de VHB es particularmente adecuada.
También pueden examinarse bibliotecas aleatorias de péptidos u otros compuestos por su idoneidad. Pueden producirse bibliotecas combinatorias para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse de una forma por etapas. Tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de giros beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiacepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas y oligocarbamatos. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos mediante el procedimiento de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) procedimiento descrito en Affymax, documento WO 95/12608, Affymax, documento WO 93/06121, Columbia University, documento WO 94/08051, Pharmacopeia, documento WO 95/35503 y Scripps, documento WO 95/30642 (incorporándose cada uno de ellos por referencia para todos los fines). Las bibliotecas de péptidos también pueden generarse mediante procedimientos de presentación en fagos. Véase, por ejemplo, Devlin, documento WO 91/18980.
Las bibliotecas combinatorias y otros compuestos se examinan inicialmente por su idoneidad determinando su capacidad para unirse a anticuerpos o linfocitos (B o T) que se sabe que son específicos para A\beta u otros péptidos amiloidogénicos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un examen inicial con cualquier suero policlonal o anticuerpo monoclonal frente a A\beta u otro péptido amiloidogénico. Los compuestos identificados mediante tales exámenes se analizan entonces adicionalmente por su capacidad para inducir anticuerpos o linfocitos reactivos frente a A\beta u otro péptido amiloidogénico. Por ejemplo, pueden someterse a prueba diluciones múltiples de sueros en placas de microtitulación que se han recubierto previamente con el péptido A\beta y puede llevarse a cabo un ELISA convencional para someter a prueba los anticuerpos reactivos frente a A\beta. Entonces pueden someterse a prueba los compuestos para determinar su eficacia profiláctica y terapéutica en animales transgénicos propensos a padecer una enfermedad amiloidogénica, tal como se describe en los ejemplos. Tales animales incluyen, por ejemplo, ratones que portan una mutación en 717 de APP descrito por Games et al., citado anteriormente, y ratones que portan una mutación sueca ("Swedish") de APP tal como se describe por McConlogue et al., el documento US 5.612.486 y Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Puede usarse el mismo enfoque de examen con otros agentes potenciales tales como fragmentos de A\beta, análogos de A\beta y péptidos más grandes incluyendo A\beta, descritos anteriormente.
2. Otras enfermedades
Los mismos principios u otros análogos determinan la producción de agentes terapéuticos para el tratamiento de otras enfermedades amiloidogénicas. En general, los agentes apuntados anteriormente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer también pueden usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer de comienzo temprano asociada con el síndrome de Down.
3. Proteínas vehículo
Algunos agentes para inducir una respuesta inmunitaria contienen el epítopo adecuado para inducir una respuesta inmunitaria frente a los depósitos de amiloides pero son demasiado pequeños para ser inmunogénicos. El inmunógeno peptídico está unido a vehículo adecuado para ayudar a inducir una respuesta inmunitaria. Los vehículos adecuados incluyen albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico o un toxoide de otra bacteria patógena, tal como difteria, E. coli, cólera, o H. pylori, o un derivado de toxina atenuada. Otros vehículos para estimular o potenciar una respuesta inmunitaria incluyen citocinas tales como IL-1, péptidos IL-1 \alpha y \beta, IL-2, INF-\gamma, IL-10, GM-CSF y quimiocinas, tales como M1P1 \alpha y \beta y RANTES. Los agentes inmunogénicos también pueden unirse a péptidos que potencian el transporte a través de los tejidos, tal como se describe en O'Mahony, documento WO 97/17613 y documento WO 97/17614.
Los agentes inmunogénicos pueden unirse a los vehículos mediante reticulación química. Las técnicas para unir un inmunógeno a un vehículo incluyen la formación de enlaces disulfuro usando 3-(2-piridil-tio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) (si el péptido carece de un grupo sulfhidrilo, éste puede proporcionarse mediante la adición de un residuo de cisteína). Estos reactivos crean un enlace disulfuro entre ellos mismos y los residuos de cisteína peptídicos en una proteína y un enlace amida a través del \varepsilon-amino en una lisina, u otro grupo amino libre en otros aminoácidos. Una variedad de tales agentes de formación de disulfuro/amida se describen en Immun. Rev. 62, 185 (1982). Otros agentes de acoplamiento funcionales forman un tioéter en lugar de un enlace disulfuro. Muchos de estos agentes de formación de tioéter están comercialmente disponibles e incluyen ésteres reactivos del ácido 6-maleimidocaproico, el ácido 2-bromoacético, el ácido 2-yodoacético y el ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxílico. Los grupos carboxilo pueden activarse combinándolos con succinimida o la sal de sodio del ácido 1-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico.
Los péptidos inmunogénicos también pueden expresarse como proteínas de fusión con vehículos. El péptido inmunogénico puede unirse en el extremo amino terminal, el extremo carboxilo terminal, o internamente al vehículo. Opcionalmente, pueden estar presentes múltiples repeticiones del péptido inmunogénico en la proteína de
fusión.
4. Ácido nucleico que codifica inmunógenos
También pueden inducirse respuestas inmunitarias frente a depósitos amiloides mediante la administración de ácidos nucleicos que codifican el conjugado. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica el inmunógeno normalmente está unido a elementos reguladores, tales como un promotor y un potenciador (enhancer) que permiten la expresión del segmento de ADN en las células diana deseadas de un paciente. Para su expresión en las células sanguíneas, tal como es deseable para la inducción de una respuesta inmunitaria, los elementos de promotor y potenciador de los genes de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas o el promotor inmediato temprano principal y el potenciador de CMV, son adecuados para la expresión directa. Los elementos reguladores unidos y las secuencias codificantes a menudo se clonan en un vector.
Se dispone de varios sistemas de vectores virales incluyendo los sistemas retrovirales (véase, por ejemplo, Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)); vectores de virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vectores virales de la familia de la viruela, incluyendo el virus vaccinia y los virus de la viruela aviar, vectores virales del género de alfa-virus tales como los derivados de los virus Sindbis y del bosque Semliki (véase, por ejemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), y papilomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al., documento WO 94/12629 y Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
El ADN que codifica un inmunógeno, o un vector que contiene el mismo, puede empaquetarse en liposimas. Lípidos adecuados y análogos relacionados se describen en los documentos US 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 y 5.283.185. Los vectores y el ADN que codifican un inmunógeno también pueden adsorberse a o asociarse con vehículos particulados, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de poli(metilmetacrilato) y polilactidas y poli(lactida-co-glicólidos), véase por ejemplo, McGee et al., J. Micro Encap. (1996).
Los vectores para terapia génica o ADN desnudo puede administrarse in vivo mediante la administración a un paciente individual, normalmente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica (véase por ejemplo, el documento US 5.399.346). El ADN también puede administrarse usando una pistola génica. Véase Xiao & Brandsma, citado anteriormente. El ADN que codifica un inmunógeno se precipita en la superficie de perlas metálicas microscópicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o expandiendo gas helio, y penetran en los tejidos a una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, es adecuado el dispositivo de administración génica Accel^{TM} fabricado por Agacetus, Inc. Middleton WI. Alternativamente, el ADN desnudo puede hacerse pasar a través de la piel hacia el torrente sanguíneo simplemente introduciendo el ADN sobre la piel con irritación química o mecánica (véase el documento WO 95/05853).
En otra variación, pueden administrarse vectores que codifican inmunógenos a células ex vivo, tal como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia tisular) o células madre hematopoyéticas de donante universal, seguido por la reimplantación de las células en un paciente, habitualmente tras la selección de las células que han incorporado el vector.
III. Pacientes en los que se puede aplicar el tratamiento
Los pacientes en los que se puede aplicar el tratamiento incluyen individuos en riesgo de padecer la enfermedad pero que no muestran síntomas, así como pacientes que muestran los síntomas actualmente. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, prácticamente cualquiera está en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer si vive lo suficiente.
Por tanto, los presentes procedimientos pueden administrarse profilácticamente a la población general sin ninguna evaluación del riesgo del paciente. Los presentes procedimientos son especialmente útiles para individuos que sí tienen un riesgo genético conocido de padecer la enfermedad de Alzheimer. Tales individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina mediante el análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos del riesgo hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen de APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y en las posiciones 670 y 671 denominadas las mutaciones de Hardy y sueca, respectivamente (véase Hardy, TINS, citado anteriormente). Otros marcadores de riesgo son las mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, historia familiar de EA, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los individuos que padecen actualmente la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse por su demencia característica, así como por la presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente. Además, están disponibles varias pruebas diagnósticas para identificar individuos que tienen EA. Éstas incluyen la medición de los niveles de CSF tau y A\beta42. Los niveles elevados de tau y disminuidos de A\beta42 significan la presencia de EA. Los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse mediante los criterios de MMSE o ADRDA tal como se trata en la sección de ejemplos.
En los pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Habitualmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente alcanza los 40, 50, 60 ó 70 años. Normalmente, el tratamiento supone múltiples dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede controlarse mediante ensayos de anticuerpos, o respuestas de células T o células B activadas al agente terapéutico (por ejemplo, el péptido A\beta) a lo largo del tiempo. Si la respuesta falla, está indicada una dosificación de refuerzo. En el caso de pacientes potenciales con síndrome de Down, puede comenzarse el tratamiento de manera prenatal mediante la administración del agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento.
IV. Regímenes de tratamiento
En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente propenso a, o en cualquier caso en riesgo de, padecer una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o para retrasar el comienzo de la enfermedad. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones o los medicamentos se administran a un paciente que se sospecha que padece, o que ya está padeciendo tal enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos para detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una dosis terapéutica o farmacéuticamente eficaz. En ambos regímenes profiláctico y terapéutico, los agentes habitualmente se administran en varias dosificaciones hasta que se ha logrado una respuesta inmunitaria suficiente. Normalmente, se controla la respuesta inmunitaria y se administran dosis repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a desaparecer.
Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, de otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero en algunas enfermedades, el paciente puede ser un mamífero no humano, tal como un animal bovino. Es necesario ajustar las dosificaciones del tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunógeno depende de si también se administra un adyuvante, requiriéndose dosificaciones superiores en ausencia del adyuvante. La cantidad de un inmunógeno para su administración en ocasiones varía desde 1 \mug hasta 500 \mug por paciente y más habitualmente desde 5 \mug hasta 500 \mug por inyección para la administración a seres humanos. Ocasionalmente, se usa una dosis superior de 1 mg - 2 mg por inyección. Normalmente se usan aproximadamente 10, 20, 50 ó 100 \mug para cada inyección a seres humanos. Las veces de aplicación de las inyecciones pueden variar significativamente desde una vez al día, una vez al año, hasta una vez cada diez años. Cada día en que se administra una dosificación de inmunógeno, la dosificación es mayor que 1 \mug/paciente y habitualmente mayor que 10 \mug/paciente si también se administra adyuvante, y mayor que 10 \mug/paciente y habitualmente mayor que 100 \mug/paciente en ausencia de adyuvante. Un régimen típico está constituido por una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de 6 semanas. Otro régimen está constituido por una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses después. Otro régimen supone una inyección cada dos meses de vida. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo pueden realizarse de manera irregular según se indique mediante el control de la respuesta inmunitaria. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, los intervalos de dosificación son desde aproximadamente 0,0001 mg/kg hasta 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 mg/kg a 5 mg/kg del peso corporal del huésped. Las dosis para los ácidos nucleicos que codifican inmunógenos oscilan desde aproximadamente 10 ng hasta 1 g, de 100 ng a 100 mg, de 1 \mug a 10 mg, o 30 \mug-300 \mug de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos varían desde 10 hasta 10^{9}, o más, viriones por dosis.
Los agentes para inducir una respuesta inmunitaria pueden administrarse mediante medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía de administración más típica es la subcutánea, aunque otras pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza lo más normalmente en los músculos de la pierna o el brazo. Las inyecciones intravenosas, así como las inyecciones intraperitoneales, las inyecciones intraarteriales, intracraneales o intradérmicas también son eficaces en la generación de una respuesta inmunitaria. Los agentes pueden inyectarse directamente en un tejido particular en el que se han acumulado los depósitos.
Los agentes de la invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad amiloidogénica. En el caso de la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, en los que los depósitos amiloides se producen en el cerebro, los agentes de la invención también pueden administrarse junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hematoencefálica.
Los agentes inmunogénicos de la invención en ocasiones se administran en combinación con un adyuvante. Pueden usarse una variedad de adyuvantes en combinación con un agente inmunogénico de la invención para provocar una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un inmunógeno sin producir cambios conformacionales en el inmunógeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, monofosforil lípido A O-desacetilado en la posición 3 (MPL) (véase el documento GB 2220211). QS21 es una saponina o un glucósido triterpénico aislados de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina encontrado en Sudamérica (véanse Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Ajuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente estadounidense número 5.057.540). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como aceite de cacahuete o escualeno), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tal como el monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1897)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Alternativamente, el fragmento de A\beta puede acoplarse a un adyuvante. Por ejemplo, puede prepararse una versión de lipopéptido del fragmento A\beta acoplando ácido palmítico u otros lípidos directamente al extremo N-terminal de A\beta tal como se describe para la vacunación con antígeno de la hepatitis B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Sin embargo, un acoplamiento de este tipo no debe cambiar sustancialmente la conformación de A\beta de manera que afecte a la naturaleza de la respuesta inmunitaria del mismo. Los adyuvantes pueden administrarse como un componente de una composición terapéutica con un principio activo o pueden administrarse por separado, antes, simultáneamente con o tras la administración del agente terapéutico.
Una clase preferida de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos monoméricos o poliméricos tales como poli(ácido glutámico) o polilisina. Otra clase de adyuvantes son las formulaciones de emulsión de aceite en agua. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi-propilamida (DTP-DPP) Teramide^{TM}), o otros componentes de la pared de células bacterianas. Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (documento WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partículas de tamaño de submicra que usan un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque plurónico L121 al 5% y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión de tamaño de submicra o agitado con vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula grande, y (c) el sistema de adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared de células bacterianas del grupo constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trealosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}). Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (QS21, Aquila, Worcester, MA) o partículas generadas a partir del mismo tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), el factor estimulados de colonias de macrófagos (M-CSF), el factor de necrosis tumoral (TNF).
Un adyuvante puede administrarse con un inmunógeno como una única composición, o puede administrarse antes, simultáneamente con o tras la administración del inmunógeno. El inmunógeno y el adyuvante pueden envasarse y suministrarse en el mismo vial o pueden envasarse en viales separados y mezclarse antes de su uso. El inmunógeno y el adyuvante normalmente se envasan con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica a la que están destinados. Si el inmunógeno y el adyuvante se envasan por separado, en envase normalmente incluye instrucciones para el mezclado antes de su uso. La elección de un adyuvante y/o vehículo depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el adyuvante, de la vía de administración, del programa de dosificación, de la eficacia del adyuvante para la especie que va a vacunarse y, en seres humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es uno que se ha aprobado o puede aprobarse para la administración en seres humanos por organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración en seres humanos. Se prefieren el alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, pueden usarse dos o más adyuvantes diferentes simultáneamente. Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21 y alumbre, QS21 y MPL juntos. Además, puede usarse el adyuvante incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.
Los agentes de la invención a menudo se administran como composiciones farmacéuticas que comprenden un principio activo terapéutico, es decir, y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1980). La forma preferida depende del modo deseado de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular las composiciones farmacéuticas para la administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, disolución de dextrosa y disolución de Hank. Además, la formulación o la composición farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Sin embargo, algunos reactivos adecuados para su administración a animales, tales como el adyuvante completo de Freund normalmente no se incluyen en las composiciones para su uso en seres humanos.
Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, de metabolización lenta tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos) y copolímeros (tales como celulosa, agarosa, Sepharose funcionalizados con látex, y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).
Para la administración parenteral, los agentes de la invención pueden administrarse como dosificaciones inyectables de una disolución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril, tal como aceites en agua, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, también pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen sintético, vegetal, animal o de petróleo, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semillas de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para disoluciones inyectables.
Normalmente, las composiciones se preparan como composiciones inyectables, como suspensiones o bien como disoluciones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto del adyuvante potenciado, tal como se trató anteriormente (véanse Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Los agentes de esta invención pueden administrarse en la forma de una preparación de implante o inyección de liberación prolongada que puede formularse de una manera tal que permita una liberación sostenida o pulsátil del principio activo.
Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen las formulaciones orales, intranasales y pulmonares, los supositorios y las aplicaciones transdérmicas.
Para los supositorios, los aglutinantes y los vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios puede formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente el 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones adquieren la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen el 10%-95% del principio activo, preferiblemente el 25%-70%.
La aplicación tópica puede dar como resultado la administración transdérmica o intradérmica. La administración tópica puede facilitarse mediante la coadministración del agente con la toxina colérica o derivados detoxificados o subunidades de la misma u otras toxinas bacterianas similares (véase Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La coadministración puede lograrse mediante el uso de los componentes como una mezcla o como moléculas unidas obtenidas mediante reticulación química o expresión como una proteína de fusión.
Alternativamente, la administración transdérmica puede lograrse usando una ruta cutánea o usando transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).
V. Procedimientos de diagnóstico
La invención proporciona procedimientos de detección de una respuesta inmunitaria frente al péptido A\beta en un paciente que padece o es propenso a la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos son particularmente útiles para controlar un ciclo de tratamiento que está administrándose a un paciente. Los procedimientos pueden utilizarse para controlar ambos el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos y el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos.
Algunos procedimientos implican determinar un valor inicial de una respuesta inmunitaria en un paciente antes de administrar una dosificación del agente, y comparar éste con un valor para la respuesta inmunitaria tras el tratamiento. Un aumento significativo (es decir, mayor que el margen de error experimental típico en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar de la media de tales mediciones) en el valor de la respuesta inmunitaria señala un desenlace de tratamiento positivo (es decir, que la administración del agente ha logrado o aumentado una respuesta inmunitaria). Si el valor para la respuesta inmunitaria no cambia significativamente, o disminuye, se indica un desenlace de tratamiento negativo. En general, se espera que los pacientes que se someten a un ciclo inicial de tratamiento con un agente muestren un aumento en la respuesta inmunitaria con las dosificaciones sucesivas, que finalmente alcanza una meseta. La administración del agente generalmente se continúa mientras la respuesta inmunitaria está aumentando. El logro de la meseta es un indicador de que puede interrumpirse o reducirse la administración del tratamiento en su dosificación o en su frecuencia.
En otros procedimientos, se determina un valor control (es decir, una media y desviación estándar) de la respuesta inmunitaria para una población control. Normalmente, los individuos en la población control no han recibido tratamiento anterior. Entonces se comparan los valores medidos de la respuesta inmunitaria en un paciente tras la administración de un agente terapéutico con el valor control. Un aumento significativo con respecto al valor control (por ejemplo, mayor que una desviación estándar de la media) señala un desenlace de tratamiento positivo. Una ausencia de aumento significativo o una disminución señala un desenlace de tratamiento negativo. La administración del agente generalmente se continúa mientras que la respuesta inmunitaria está aumentando con respecto al valor control. Al igual que anteriormente, el logro de una meseta con respecto a los valores control es un indicador de que puede interrumpirse o reducirse la administración del tratamiento en su dosificación o en su frecuencia.
En otros procedimientos, se determina un valor control de la respuesta inmunitaria (por ejemplo, una media y desviación estándar) de una población control de individuos que se han sometido a tratamiento con un agente terapéutico y cuyas respuestas inmunitarias han alcanzado una meseta en respuesta al tratamiento. Se comparan los valores medidos de la respuesta inmunitaria en un paciente con el valor control. Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, más de una desviación estándar) del valor control, puede interrumpirse el tratamiento. Si el nivel en un paciente es significativamente inferior al valor control, está justificada la administración continuada del agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor control, entonces puede estar indicado un cambio en el régimen de tratamiento, por ejemplo, el uso de un adyuvante diferente.
En otros procedimientos, un paciente que no está recibiendo tratamiento actualmente pero que se ha sometido a un ciclo anterior de tratamiento se controla para determinar la respuesta inmunitaria para determinar si se requiere una reanudación del tratamiento. Puede compararse el valor medido de la respuesta inmunitaria en el paciente con un valor de la respuesta inmunitaria logrado anteriormente en el paciente tras un ciclo anterior de tratamiento. Una disminución significativa con respecto a la medición anterior (es decir, mayor que un margen de error típico en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicación de que puede reanudarse el tratamiento. Como alternativa, puede compararse el valor medido en el paciente con un valor control (media más desviación estándar) determinado en la población de pacientes tras someterse a un ciclo de tratamiento. Como alternativa, puede compararse el valor medido en un paciente con un valor control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente que siguen libres de síntomas de la enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente que muestran una mejora de las características de la enfermedad. En todos estos casos, una disminución significativamente con respecto al nivel control (es decir, más de una desviación estándar) es un indicador de que debe reanudarse el tratamiento en un paciente.
La muestra de tejido para su análisis normalmente es sangre, plasma, suero, moco o líquido cefalorraquídeo del paciente. La muestra se analiza para determinar indicios de una respuesta inmunitaria frente a cualquier forma del péptido A\beta, normalmente A\beta42. La respuesta inmunitaria puede determinarse a partir de la presencia de, por ejemplo, anticuerpos o células T que se unen específicamente al péptido A\beta. En la sección de ejemplos se describen procedimientos de ELISA para detectar anticuerpos específicos frente a A\beta. Los procedimientos para detectar células T reactivas se han descrito anteriormente (véase Definiciones).
Ejemplos
La descripción proporciona los siguientes ejemplos para mostrar los efectos de los protocolos de inmunización activa.
I. Eficacia profiláctica de A\beta frente a la EA
Estos ejemplos describen la administración del péptido A\beta42 a ratones transgénicos que sobreexpresan APP con una mutación en la posición 717 (APP_{717V \rightarrow F}) que los predispone a desarrollar una neuropatología similar al Alzheimer. La producción y las características de estos ratones (ratones PDAPP) se describen en Games et al., Nature, citado anteriormente. Estos animales, en su forma heterocigota, comienzan a depositar A\beta a los seis meses de edad en adelante. Hacia los quince meses de edad, muestran niveles de deposición de A\beta equivalentes a los observados en la enfermedad de Alzheimer. Se inyectaron a ratones PDAPP, A\beta_{42} agregado (A\beta_{42} agregado) o solución salina tamponada con fosfato. Se escogió A\beta_{42} agregado debido a su capacidad para inducir anticuerpos frente a múltiples epítopos de A\beta.
A. Procedimientos 1. Fuente de ratones
Se dividieron aleatoriamente treinta ratones hembra heterogenéticos PDAPP en los siguientes grupos: 10 ratones para inyectarles A\beta_{42} agregado (uno murió en el tránsito), 5 ratones para inyectarles PBS/adyuvante o PBS y 10 controles sin inyección. A cinco ratones se les inyectó proteína amiloide sérica (SAP).
2. Preparación de los inmunógenos
Preparación del A\beta_{42} agregado: se disolvieron dos miligramos de A\beta42 (US Peptides Inc, lote K-42-12) en 0,9 ml de agua y se constituyeron hasta 1 ml añadiendo 0,1 ml de 10 x PBS. Esto se agitó con vórtex y se dejó incubar durante la noche a 37ºC, condiciones en las que se agregó el péptido. Cualquier A\beta no usado se almacenó como un polvo liofilizado seco a -20ºC hasta la siguiente inyección.
3. Preparación de las inyecciones
Se emulsionaron 100 \mug de A\beta_{42} agregado en PBS por ratón 1:1 con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 \mul de emulsión para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) a las 2 semanas. Se administraron dos dosis adicionales en IFA a intervalos mensuales. Las inmunizaciones posteriores se realizaron a intervalos mensuales en 500 \mul de PBS. Las inyecciones se administraron por vía intraperitoneal (i.p.).
Se practicaron inyecciones de PBS que seguían el mismo programa y se inyectó a los ratones una mezcla 1:1 de PBS/adyuvante a 400 \mul por ratón, o 500 \mul de PBS por ratón. De la misma manera, las inyecciones de SAP siguieron el mismo programa usando una dosis de 100 \mug por inyección.
4. Titulación de extracciones de sangre de ratón, preparación de tejidos e inmunohistoquímica
Los procedimientos anteriores se describen más adelante en Materiales generales y procedimientos.
B. Resultados
Se inyectó a ratones PDAPP, A\beta_{42} agregado (A\beta_{42} agregado), péptidos SAP o bien solución salina tamponada con fosfato. También se dejó sin inyectar un grupo de ratones PDAPP, los controles positivos. Se controlaron los títulos de los ratones para A\beta_{42} agregado un mes sí y otro no desde la cuarta administración de refuerzo hasta que los ratones tuvieron un año de edad. Se sacrificaron los ratones a los 13 meses. En todos los puntos de tiempo examinados, ocho de los nueve ratones con A\beta_{42} agregado desarrollaron un alto título de anticuerpos, que permaneció alto a lo largo de la serie de inyecciones (títulos mayores de 1/10000). El noveno ratón tuvo un título bajo pero medible de aproximadamente 1/1000 (figura 1, tabla 1). Los ratones a los que se inyectó SAPP tenían títulos de 1:1.000 a 1:30.000 para este inmunógeno superando sólo un único ratón 1:10.0000.
Se tituló a los ratones tratados con PBS frente a A\beta_{42} agregado a los seis, diez y doce meses. A una dilución de 1/100, cuando se tituló a los ratones con PBS frente A\beta_{42} agregado sólo superaron en 4 veces el fondo en un punto de datos, aparte de esto, fueron inferiores a 4 veces el fondo en todos los puntos de tiempo (tabla 1). La respuesta específica de SAP fue insignificante en estos puntos de tiempo con todos los títulos inferiores a 300.
Siete de los nueve ratones en el grupo de A\beta1-42 agregado no tuvieron amiloide detectable en sus cerebros. En contraposición, el tejido cerebral de los ratones en los grupos de SAP y PBS contenía numerosos depósitos amiloides positivos para 3D6 en el hipocampo, así como en las cortezas frontal y cingulada. El patrón de la deposición fue similar al de los controles no tratados, con implicación característica de subregiones vulnerables, tales como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo. Un ratón del grupo al que se inyectó A\beta1-42 tuvo una carga de amiloide enormemente reducida, confinada en el hipocampo. Se identificó una placa aislada en otro ratón tratado con A\beta1-42.
Los análisis de imágenes cuantitativos de la carga de amiloide en el hipocampo verificaron la espectacular reducción lograda en los animales tratados con AN1792 (figura 2). Los valores de mediana de la carga de amiloide para el grupo con PBS (2,22%) y para el grupo control no tratado (2,65%) fueron significativamente mayores que los de los inmunizados con AN1792 (0,00%, p = 0,0005). En contraposición, el valor de mediana para el grupo inmunizado con péptidos SAP (SAPP) fue del 5,74%. El tejido cerebral de los ratones control no tratados contenía numerosos depósitos amiloides de A\beta visualizados con el anticuerpo monoclonal (Acm) específico para A\beta 3D6 en el hipocampo, así como en la corteza retroesplenial. También se observó un patrón similar de deposición amiloide en ratones inmunizados con SAPP o PBS (figura 2). Además, en estos últimos tres grupos hubo una implicación característica de subregiones vulnerables del cerebro observada clásicamente en la EA, tal como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo, en los tres grupos.
Los cerebros que no contenían depósitos de A\beta también estaban desprovistos de las placas neuríticas que normalmente se visualizan en ratones PDAPP con el anticuerpo anti-APP humano, 8E5. Todos los cerebros de los grupos restantes (ratones a los que se inyectó SAP, PBS y no inyectados) tenían numerosas placas neuríticas típicas de los ratones PDAPP no tratados. Un pequeño número de placas neuríticas estaba presente en un ratón tratado con AN1792 y se encontró una única agrupación de neuritas distróficas en un segundo ratón tratado con AN1792. Los análisis de imágenes del hipocampo, y que se muestran en la figura 3, demostraron la práctica eliminación de las neuritas distróficas en los ratones tratados con AN1792 (mediana del 0,00%) en comparación con los que recibieron PBS (mediana del 0,28%, p = 0,0005).
La astrocitosis característica de la inflamación asociada con las placas también estuvo ausente en los cerebros del grupo al que se inyectó A\beta1-42. Los cerebros de los ratones en los otros grupos contenían astrocitos positivos para GFAP agrupados y abundantes típicos de la gliosis asociada con las placas de A\beta. Un subconjunto de los portaobjetos que reaccionaron con GFAP se contratiñeron con tioflavina S para localizar los depósitos de A\beta. Los astrocitos positivos para GFAP estaban asociados con las placas de A\beta en los ratones tratados con SAP, PBS y en los controles no tratados. No se encontró tal asociación en los ratones tratados con A\beta1-42 negativos para placas, mientras que se identificó una gliosis asociada con las placas mínima en un ratón tratado con AN1792.
Los análisis de imágenes, mostrados en la figura 4 para la corteza retroesplenial, verificaron que la reducción en la astrocitosis fue significativa con un valor de mediana del 1,56% para los ratones tratados con AN1792 frente a valores de mediana mayores del 6% para los grupos inmunizados con péptidos SAP, PBS o no tratados (p = 0,0017).
La evidencia a partir de un subconjunto de ratones a los que se inyectó A\beta1-42 y PBS indicó que la inmunorreactividad del CMH II asociada con las placas estaba ausente en los ratones a los que inyectó A\beta1-42, lo que era consecuente con la ausencia de una respuesta inflamatoria relacionada con A\beta.
También se hicieron reaccionar cortes de cerebro de ratón con un mA\beta específico para MAC-1, una proteína de la superficie celular. MAC-1 (CD11b) es un miembro de la familia de las integrinas y existe como heterodímero con CD18. El complejo CD11b/CD18 está presente en monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos citolíticos naturales (Mak y Simard). Es probable que el tipo de célula reactiva con MAC-1 residente en el cerebro sea microglía basándose en la morfología fenotípica similar en secciones que inmunorreaccionan con MAC-1. El marcaje de MAC-1 asociado con las placas fue inferior en los cerebros de los ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo control con PBS, un hallazgo que es consecuente con la ausencia de respuesta inflamatoria inducida por A\beta.
C. Conclusión
La ausencia de placas de A\beta y cambios glióticos y neuronales reactivos en los cerebros de los ratones a los que se inyectó A\beta1-42 indica que no se depositó o se depositó extremadamente poco amiloide en sus cerebros, y que había ausencia de consecuencias patológicas, tales como gliosis y patología neurítica. Los ratones PDAPP tratados con A\beta1-42 muestran esencialmente la misma ausencia de patología que los ratones no transgénicos control. Por tanto, las inyecciones de A\beta1-42 son sumamente eficaces en la prevención de la deposición o en el aclaramiento de A\beta humano del tejido cerebral, y en la eliminación de cambios degenerativos inflamatorios y neuronales posteriores. Así, la administración del péptido A\beta tiene un beneficio terapéutico en la prevención de la EA.
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II. Estudio de respuesta a la dosis
Se inmunizaron grupos de ratones Swiss Webster hembra de cinco semanas de edad (N = 6 por grupo) con 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 o 0,13 ug de A\beta formulado en CFA/IFA administrado por vía intraperitoneal. Se administraron tres dosis a intervalos bisemanales seguido por una cuarta dosis un mes más tarde. La primera dosis se emulsionó con CFA y las dosis restantes se emulsionaron con IFA. Se extrajo sangre de los animales 4-7 días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. A los animales en un subconjunto de tres grupos, los inmunizados con 11, 33 ó 300 \mug de antígeno, se les extrajo adicionalmente sangre aproximadamente a intervalos mensuales durante cuatro meses tras la cuarta inmunización para controlar la disminución de la respuesta de los anticuerpos a través de una variedad de dosis de vacuna. Estos animales recibieron una quinta inmunización final a los siete meses tras el inicio del estudio. Se sacrificaron una semana más tarde para medir la respuesta de los anticuerpos a AN1792 y para realizar análisis toxicológicos.
Se observó una disminución de la respuesta a la dosis desde 300 \mug hasta 3,7 \mug con ausencia de respuesta en las dos dosis inferiores. Los títulos medios de anticuerpos son de aproximadamente 1:1000 tras 3 dosis y de aproximadamente 1:10,000 tras 4 dosis de 11-300 \mug de antígeno (véase la figura 5).
Los títulos de anticuerpos aumentaron espectacularmente para todos excepto para el grupo de dosis inferior tras la tercera inmunización, oscilando los aumentos en GMT entre 5 veces y 25 veces. Entonces fueron detectables las respuestas de anticuerpos bajas incluso para los que recibieron 0,4 \mug. Los grupos de 1,2 y 3,7 \mug tenían títulos comparables con GMT de aproximadamente 1000 y las cuatro dosis superiores agrupadas juntas con GMT de aproximadamente 25.000, con la excepción del grupo de dosis de 33 \mug con un GMT inferior de 3000. Tras la cuarta inmunización, el aumento del título fue más modesto para la mayoría de los grupos. Hubo una clara respuesta a la dosis a través de los grupos de dosis de antígeno inferior desde 0,14 \mug hasta 11 \mug oscilando entre anticuerpos no detectables para los que recibieron 0,14 y un GMT de 36.000 para los que recibieron 11 \mug. De nuevo, se agruparon juntos los títulos para los cuatro grupos de dosis superiores de 11 \mug a 300 \mug. Así, tras dos inmunizaciones, el título de anticuerpos fue dependiente de la dosis de antígeno a través del amplio intervalo desde 0,4 \mug hasta 300 \mug. Para la tercera inmunización, los títulos para las cuatro dosis superiores fueron todos comparables y se mantuvieron en una meseta tras una inmunización adicional.
Un mes tras la cuarta inmunización, los títulos fueron de 2 a 3 veces superiores en el grupo de 300 \mug a los medidos a partir de la sangre extraída cinco días tras la inmunización (figura 6). Esta observación sugiere que la respuesta anamnésica máxima de los anticuerpos se produjo más tarde de 5 días tras la inmunización. Esta vez se observó un aumento más modesto (50%) en el grupo de 33 \mug. En el grupo de dosis de 300 \mug a los dos meses tras la última dosis, los GMT disminuyeron abruptamente en aproximadamente el 70%. Tras otro mes, la disminución fue menos pronunciada al 45% (100 \mug) y de aproximadamente el 14% para las dosis de 33 \mug y 11 \mug. Así, la tasa de disminución en los títulos de anticuerpos circulantes tras el cese de la inmunización parece ser bifásica con una disminución pronunciada en el primer mes tras la respuesta máxima seguido por una tasa más modesta de disminución a partir de entonces.
Los títulos de anticuerpos y las cinéticas de la respuesta de estos ratones Swiss Webster son similares a los de ratones transgénicos PDAPP heterocigotos jóvenes inmunizados de una manera paralela. Las dosificaciones eficaces para inducir una respuesta inmunitaria en seres humanos normalmente son similares a las dosificaciones eficaces en ratones.
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III. Examen para determinar la eficacia terapéutica frente a la EA establecida
Este ensayo está diseñado para someter a prueba agentes inmunogénicos para determinar su actividad en la detención o la reversión de las características neuropatológicas de la EA en animales de más edad. Se comenzaron las inmunizaciones con A\beta de 42 aminoácidos de longitud (AN1792) en un punto de tiempo en el que ya estaban presentes placas amiloides en los cerebros de los ratones PDAPP.
A lo largo del curso de tiempo usado en este estudio, los ratones PDAPP no tratados desarrollaron varios cambios neurodegenerativos que se asemejaron a los encontrados en la EA (Games et al., citado anteriormente y Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). La deposición de A\beta en placas amiloides está asociada con una respuesta neuronal degenerativa constituida por elementos dendríticos y axonales aberrantes, denominados neuritas distróficas. Los depósitos amiloides que están rodeados por y que contienen neuritas distróficas se denominan placas neuríticas. En ambos la EA y los ratones PDAPP, las neuritas distróficas tienen una estructura globular distintiva, son inmunorreactivas con un panel de anticuerpos que reconocen APP y componentes del citoesqueleto y muestran cambios degenerativos subcelulares complejos en el nivel ultraestructural. Estas características permiten mediciones relevantes para la enfermedad, selectivas y reproducibles de la formación de placas neuríticas en los cerebros de PDAPP. El componente neuronal distrófico de las placas neuríticas de PDAPP se visualiza fácilmente con un anticuerpo específico para el APP humano (mA\beta 8E5), y puede medirse fácilmente mediante análisis de imágenes asistido por ordenador. Por tanto, además de medir los efectos de AN1792 en la formación de la placa amiloide, se controlaron los efectos de este tratamiento en el desarrollo de la distrofia neurítica.
Los astrocitos y la microglía son células no neuronales que responden y reflejan el grado de lesión neuronal. Los astrocitos positivos para GFAP y la microglía positiva para CMH II se observan comúnmente en la EA y su activación aumenta con la gravedad de la enfermedad. Por tanto, también se controló el desarrollo de astrocitosis y microgliosis reactivas en los ratones tratados con AN1792.
A. Materiales y procedimientos
Se dividieron aleatoriamente cuarenta y ocho ratones PDAPP hembra heterocigotos, de 11 a 11,5 meses de edad, obtenidos de Charles River, en dos grupos: 24 ratones para inmunizarse con 100 \mug de AN1792 y 24 ratones para inmunizarse con PBS, cada uno combinado con adyuvante de Freund. Los grupos con AN1792 y PBS se dividieron de nuevo cuando alcanzaron \sim15 meses de edad. A los 15 meses de edad, se sacrificó aproximadamente la mitad de cada grupo de los animales tratados con AN1792 y PBS (n = 10 y 9, respectivamente), el resto continuó recibiendo inmunizaciones hasta la finalización a \sim18 meses (n = 9 y 12, respectivamente). Un total de 8 animales (5 con AN1792, 3 con PBS) murieron durante el estudio. Además de los animales inmunizados, se incluyeron ratones PDAPP no tratados de un año de edad (n = 10), 15 meses de edad (n = 10) y 18 meses de edad (n = 10) para comparación en los ELISA para medir los niveles de A\beta y APP en el cerebro; también se incluyeron los animales de un año de edad en los análisis inmunohistoquímicos.
La metodología fue como la del ejemplo 1, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó el lote 12 de US Peptides y el lote ME0339 de AN1792 de California Peptides para preparar el antígeno para las seis inmunizaciones administradas antes del punto de tiempo de 15 meses. Se usaron los lotes ME0339 y ME0439 de California Peptides para las tres inmunizaciones adicionales administradas entre los 15 y los 18 meses.
Para las inmunizaciones, se emulsionaron 100 \mug de AN1792 en 200 \mul de PBS o PBS solo 1:1 (vol:vol) con adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA) o PBS en un volumen final de 400 \mul. La primera inmunización se administró con CFA como adyuvante, las cuatro dosis siguientes se administraron con IFA y las cuatro dosis finales con PBS solo sin adyuvante añadido. Se administró un total de nueve inmunizaciones a lo largo de un periodo de tiempo de siete meses en un programa de dos semanas para las tres primeras dosis seguido por un intervalo de cuatro semanas para las inyecciones restantes. El grupo de tratamiento de cuatro meses, que se sacrificó a los 15 meses de edad, recibió sólo las 6 primeras inmunizaciones.
B. Resultados 1. Efectos del tratamiento con AN1792 en la carga de amiloide
En la figura 7 se muestran los resultados del tratamiento con AN1792 sobre la carga de amiloide cortical determinada mediante el análisis de imágenes cuantitativo. El valor de mediana de la carga de amiloide cortical fue del 0,28% en un grupo de ratones PDAPP de 12 meses de edad no tratados, un valor representativo de la carga de placa en ratones al inicio del estudio. A los 18 meses, la carga de amiloide aumentó más de 17 veces hasta el 4,87% en los ratones tratados con PBS, mientras que los ratones tratados con AN1792 tenían una carga de amiloide enormemente reducida de tan sólo el 0,01%, notablemente inferior que los no tratados de 12 meses y ambos grupos tratados con PBS de 15 y 18 meses. La carga de amiloide se redujo significativamente en los que recibieron AN1792 en ambos grupos de 15 (reducción del 96%; p = 0,003) y 18 (reducción >99%; p = 0,0002) meses.
Normalmente, la deposición amiloide cortical en ratones PDAPP se inicia en las cortezas frontal y retroesplenial (RSC) y progresa en un sentido ventral-lateral para implicar a las cortezas temporal y entorrinal (EC). Se encontró poco o nada de amiloide en la EC de los ratones de 12 meses de edad, la edad aproximada a la que se administró AN1792 por primera vez. Tras 4 meses de tratamiento con AN1792, la deposición amiloide disminuyó enormemente en la RSC y se eliminó completamente la implicación progresiva de la EC mediante el tratamiento con AN1792. Esta última observación demostró que AN1792 detuvo completamente la progresión del amiloide que normalmente invadiría las cortezas temporal y ventral, así como detuvo o posiblemente revertió la deposición en la RSC.
Los profundos efectos del tratamiento con AN1792 en la carga de amiloide cortical en desarrollo en los ratones PDAPP se demuestran además mediante el grupo de 18 meses, que se había tratado durante siete meses. Se encontró una ausencia casi completa de amiloide cortical en los ratones tratados con AN1792, con una ausencia total de plaques difusas, así como una reducción en los depósitos compactados
2. Cambios celulares y morfológicos asociados con el tratamiento con AN1792
Se encontró una población de células positivas para A\beta en regiones de cerebro que normalmente contienen depósitos amiloides. Notablemente, en varios cerebros que recibieron AN1792, se encontraron muy pocas o ninguna placa amiloide cortical extracelular. La mayoría de la inmunorreactividad con A\beta pareció estar contenida dentro de las células con un soma lobular o aglutinado grande. Fenotípicamente, estas células parecían microglía o monocitos activados. Eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen ligandos expresados por la microglía y los monocitos activados (CMH II y CD11b) y ocasionalmente estaban asociadas con la pared o la luz de los vasos sanguíneos. La comparación de secciones casi adyacentes marcadas con anticuerpos específicos frente a A\beta y CMH II reveló que ambas clases de anticuerpos reconocían patrones similares de estas células. El examen detallado de los cerebros tratados con AN1792 reveló que las células positivas para CMH II estaban limitadas a las proximidades del amiloide limitado que quedaba en estos animales. Con las condiciones de fijación empleadas, las células no eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen ligandos de células T (CD3, CD3e) o células B (CD45RA, CD45RB) o el antígeno común de leucocitos (CD45), pero eran reactivas con un anticuerpo que reconoce leucosialina (CD43) que experimenta una reacción cruzada con los monocitos. No se encontró ninguna de estas células en ninguno de los ratones tratados con PBS.
Los ratones PDAPP desarrollan invariablemente una densa deposición amiloide en la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo. La deposición forma una línea definida dentro de la vía perforante, una subregión que contiene clásicamente placas amiloides en la EA. La aparición característica de estos depósitos en los ratones tratados con PBS se parecía a la caracterizada anteriormente en los ratones PDAPP no tratados. La deposición amiloide estaba constituida por ambas placas difusas y compactadas en una banda continua. En contraposición, en varios cerebros de ratones tratados con AN1792, este patrón estaba drásticamente alterado. La deposición amiloide en el hipocampo ya no contenía amiloide difuso y el patrón en bandas estaba completamente afectado. En cambio, estaban presentes varias estructuras punteadas inusuales que eran reactivas con anticuerpos anti-A\beta, varias de las cuales parecían ser células que contenían amiloide.
Se observaron frecuentemente células positivas para CMH II en las proximidades del amiloide extracelular en animales tratados con AN1792. El patrón de asociación de las células positivas para A\beta con amiloide fue muy similar en varios cerebros de ratones tratados con AN1792. La distribución de estas células monocíticas estaba limitada a la proximidad del amiloide depositado y estaba completamente ausente de otras regiones cerebrales desprovistas de placas de A\beta.
El análisis de imágenes cuantitativo de secciones marcadas para CMH II y MAC I reveló una tendencia hacia un aumento de la inmunorreactividad en la RSC y en el hipocampo de ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo con PBS que alcanzó significación con la medición de la reactividad de MAC-1 en el hipocampo.
Estos resultados son indicativos de una eliminación de amiloide mediada por células, activa, en regiones del cerebro que portan placas.
3. Efectos de AN1792 en los niveles de A\beta: determinaciones mediante ELISA (a) Niveles corticales
En ratones PDAPP no tratados, el nivel de mediana de A\beta total en la corteza a los 12 meses fue de 1.600 ng/g, que aumentó hasta 8.700 ng/g hacia los 15 meses (tabla 2). A los 18 meses, el valor fue de 22.000 ng/g, un aumento de más de 10 veces durante el transcurso de tiempo del experimento. Los animales tratados con PBS tuvieron 8.600 ng/g de A\beta total a los 15 meses que aumentó hasta 19.000 ng/g a los 18 meses. En contraposición, los animales tratados con AN1792 tuvieron un 81% menos de A\beta total a los 15 meses (1.600 ng/g) que el grupo inmunizado con PBS. Se encontró significativamente menos A\beta total (p = 0,0001) (5.200 ng/g) a los 18 meses cuando se compararon los grupos con AN1792 y con PBS (tabla 2), lo que representa una reducción del 72% en A\beta que en caso contrario estaría presente. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de A\beta42, concretamente que el grupo tratado con AN1792 contenía mucho menos A\beta42, pero en este caso las diferencias entre los grupos con AN1792 y con PBS fueron significativas en ambos 15 meses (p = 0,04) y 18 meses (p = 0,0001, tabla 2).
TABLA 2 Niveles de mediana de A\beta (ng/g) en la corteza
1
(b) Niveles en el hipocampo
En ratones PDAPP no tratados, la niveles de mediana en el hipocampo de A\beta total a los doce meses de edad fueron de 15.000 ng/g que aumentaron hasta 51.000 ng/g a los 15 meses y adicionalmente hasta 81.000 ng/g a los 18 meses (tabla 3). De manera similar, los ratones inmunizados con PBS mostraron valores de 40.000 ng/g y 65.000 ng/g a los 15 meses y a los 18 meses, respectivamente. Los animales inmunizados con AN1792 mostraron menos A\beta total, específicamente 25.000 ng/g y 51.000 ng/g en los puntos de tiempo respectivos de 15 meses y 18 meses. El valor del grupo tratado con AN1792 a los 18 meses fue significativamente inferior que el del grupo tratado con PBS (p = 0,0105; tabla 3). La medición de A\beta42 dio el mismo patrón de resultados, concretamente que los niveles en el grupo tratado con AN1792 fueron significativamente inferiores que en el grupo con PBS (39.000 ng/g frente a 57.000 ng/g, respectivamente; p = 0,0022) en la evaluación a los 18 meses (tabla 3).
TABLA 3 Niveles de mediana de A\beta (ng/g) en el hipocampo
2
(c) Niveles cerebelares
En ratones PDAPP no tratados de 12 meses, el nivel de mediana cerebelar de A\beta total fue de 15 ng/g (tabla 4). A los 15 meses, esta mediana aumentó hasta 28 ng/g y hacia los 18 meses había aumentado hasta 35 ng/g. Los animales tratados con PBS mostraron valores de mediana de A\beta total de 21 ng/g a los 15 meses y de 43 ng/g a los 18 meses. Se encontró que los animales tratados con AN1792 tenían 22 ng/g de A\beta total a los 15 meses y significativamente menos (p = 0,002) A\beta total a los 18 meses (25 ng/g) que el grupo con PBS correspondiente (tabla 4).
TABLA 4 Niveles de mediana de A\beta (ng/g) en el cerebelo
3
4. Efectos del tratamiento con AN1792 en los niveles de APP
APP-\alpha y la molécula de APP de longitud completa contienen ambas toda o parte de la secuencia de A\beta y así podrían resultar potencialmente afectadas por la generación de una respuesta inmunitaria dirigida frente a AN1792. En los estudios realizados hasta la fecha, se ha observado un ligero aumento en los niveles de APP como aumentos neuropatológicos en los ratones PDAPP. En la corteza, los niveles de APP-\alpha/FL (longitud completa) o bien APP-\alpha no cambiaron esencialmente por el tratamiento con la excepción de que APP-\alpha se redujo en un 19% en el punto de tiempo de 18 meses en el grupo tratado con AN1792 frente al grupo tratado con PBS. Los valores de APP del grupo tratado con AN1792 a los 18 meses no fueron significativamente diferentes de los valores de los grupos no tratado a los 12 meses y a los 15 meses y tratado con PBS a los 15 meses. En todos los casos, los valores APP permanecieron dentro de los intervalos que se encuentran normalmente en los ratones PDAPP.
5. Efectos del tratamiento con AN1792 en la patología gliótica y neurodegenerativa
La carga de placas neuríticas se redujo significativamente en la corteza frontal de ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo con PBS en ambos a los 15 (84%; p = 0,03) y a los 18 (55%; p = 0,01) meses de edad (figura 8). El valor de mediana de la carga de placas neuríticas aumentó desde el 0,32% hasta el 0,49% en el grupo con PBS entre los 15 y los 18 meses de edad. Esto contrastó con el desarrollo enormemente reducido de placas neuríticas en el grupo con AN1792, con valores de mediana de carga de placas neuríticas del 0,05% y el 0,22%, en los grupos de 15 y 18 meses, respectivamente.
Las inmunizaciones con AN1792 parecieron tolerarse bien y se también se redujo significativamente la astrocitosis reactiva en la RSC de ratones tratados con AN1792 cuando se comparó con el grupo con PBS en ambos los 15 (56%; p = 0,011) y los 18 (39%; p = 0,028) meses de edad (figura 9). Los valores de mediana del porcentaje de astrocitosis en el grupo con PBS aumentaron entre los 15 y los 18 meses desde el 4,26% hasta el 5,21%. El tratamiento con AN1792 suprimió el desarrollo de astrocitosis en ambos puntos de tiempo hasta el 1,89% y el 3,2%, respectivamente. Esto sugiere que el neurópilo no estaba resultando dañado por el proceso de aclaramiento.
6. Respuestas de anticuerpos
Tal como se describió anteriormente, ratones PDAPP heterocigotos, de once meses de edad (N = 24) recibieron una serie de 5 inmunizaciones de 100 \mug de AN1792 emulsionado con adyuvante de Freund y se administraron por vía intraperitoneal en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12, y una sexta inmunización con PBS solo (sin adyuvante de Freund) en la semana 16. Como control negativo, un conjunto paralelo de 24 ratones transgénicos de edad correspondiente recibió inmunizaciones de PBS emulsionado con los mismos adyuvantes y se administraron con el mismo programa.
Se extrajo sangre de los animales en el plazo de tres a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis. Se midieron las respuestas de anticuerpos frente a AN1792 mediante ELISA. Los títulos en media geométrica (GMT) para los animales que se inmunizaron con AN1792 fueron de aproximadamente 1.900, 7.600 y 45.000 tras la segunda, tercera y última (sexta) dosis, respectivamente. No se midió ningún anticuerpo específico para A\beta en los animales control tras la sexta inmunización.
Se trató aproximadamente la mitad de los animales durante tres meses más, recibiendo inmunizaciones aproximadamente a las 20, 24 y 27 semanas. Cada una de estas dosis se administró en vehículo de PBS solo sin adyuvante de Freund. Los títulos medios de anticuerpos permanecieron sin cambios durante este periodo de tiempo. De hecho, los títulos de anticuerpos parecieron permanecer estables desde la cuarta hasta la octava extracción de sangre, correspondiendo a un periodo que cubre de la quinta a la novena inyecciones.
Para determinar si los anticuerpos específicos para A\beta provocados mediante la inmunización que se detectaron en los sueros de ratones tratados con AN1792 también estaban asociados con el amiloide depositado del cerebro, se hizo reaccionar un subconjunto de cortes de los ratones tratados con AN1792 y con PBS con un anticuerpo específico para IgG de ratón. En contraposición con el grupo con PBS, las placas de A\beta en los cerebros tratados con AN1792 se cubrieron con IgG endógena. Esta diferencia entre los dos grupos se observó en ambos grupos de 15 y 18 meses. Particularmente sorprendente fue la ausencia de marcaje en el grupo con PBS, a pesar de la presencia de una densa carga de amiloide en estos ratones. Estos resultados muestran que la inmunización con una proteína A\beta sintética genera anticuerpos que reconocen y se unen in vivo a A\beta en las placas amiloides.
7. Respuesta inmunitarias mediadas por células
Se extrajeron bazos de nueve ratones inmunizados con AN1792 y 12 inmunizados con PBS de 18 meses de edad, 7 días después de la novena inmunización. Se aislaron los esplenocitos y se hicieron crecer en cultivo durante 72 h en presencia de A\beta40, A\beta42 o A\beta40-1 (proteína de orden inverso). El mitógeno Con A sirvió como control positivo. Se obtuvieron respuestas óptimas con >1,7 \muM de la proteína. Las células de los nueve animales tratados con AN1792 proliferaron en respuesta a la proteína A\beta1-40 o bien a la A\beta1-42, con niveles iguales de incorporación de ambas proteínas (figura 10, panel superior). No hubo respuesta a la proteína inversa A\beta40-1. Las células de los animales control no respondieron a ninguna de las proteínas A\beta (figura 10, panel inferior).
C. Conclusión
Los resultados de este estudio muestran que la inmunización con AN1792 de ratones PDAPP que poseen depósitos amiloides existentes ralentiza y evita la deposición amiloide progresiva y retrasa los cambios neuropatológicos consecuentes en el cerebro de ratones PDAPP de más edad. Las inmunizaciones con AN1792 detuvieron esencialmente el desarrollo de amiloide en estructuras que normalmente sucumbirían a la amiloidosis. Así, la administración del péptido A\beta tiene beneficio terapéutico en el tratamiento de la EA.
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IV. Examen de fragmentos de A\beta
Se inmunizaron 100 ratones PDAPP con edades comprendidas entre los 9 meses y los 11 meses con 9 regiones diferentes de APP y A\beta para determinar qué epítopos transmiten la respuesta. Los 9 inmunógenos diferentes y un control se inyectaron por vía i.p. tal como se describió anteriormente. Los inmunógenos incluyen cuatro conjugados de péptido A\beta humano 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, todos ellos acoplados a IgG de oveja anti-ratón mediante un enlace de cistina; los aminoácidos 592-695 de un polipéptido APP, A\beta1-40 humano agregado y A\beta25-35 humano agregado, y A\beta42 de roedor agregado. Se usaron como controles A\beta42 agregado y PBS. Se usaron diez ratones por grupo de tratamiento. Los títulos se controlaron igual que anteriormente y los ratones se sacrificaron al final de los 4 meses de inyecciones. Se determinó la histoquímica, los niveles de A\beta y la toxicología después de la muerte.
A. Materiales y procedimientos 1. Preparación de los inmunógenos
Preparación de péptidos A\beta acoplados: se prepararon cuatro conjugados de péptido A\beta humano (residuos de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno conjugado a IgG de oveja anti-ratón) mediante acoplamiento a través de una cisteína artificial añadida al péptido A\beta usando el reactivo de reticulación sulfo-EMCS. Se sintetizaron los derivados del péptido A\beta con las secuencias de aminoácidos finales. En cada caso, la ubicación del residuo de cisteína insertado está indicada mediante subrayado. Al derivado de péptido A\beta13-28 también se le añadieron dos residuos de glicina antes de la cisteína del extremo carboxilo terminal, tal como se indica.
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Para preparar la reacción de acoplamiento, se dializaron diez mg de IgG de oveja anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante la noche frente a tampón borato de sodio 10 mM, pH 8,5. El anticuerpo dializado se concentró entonces hasta un volumen de 2 ml utilizando un tubo Centriprep de Amicon. Se disolvieron diez mg de sulfo-EMCS [N(\varepsilon-maleimidocuproiloxi)succinimida] (Molecular Sciences Co.) en un ml de agua desionizada. Se añadió un exceso molar de 40 veces de sulfo-EMCS gota a gota con agitación a la IgG de oveja anti-ratón y entonces se agitó la disolución durante diez min. adicionales. La IgG de oveja anti-ratón activada se purificó y se intercambió con tampón mediante el paso a través de una columna de filtración en gel de 10 ml (Pierce Presto Column, obtenida de Pierce Chemicals) equilibrada con NaPO_{4} 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 6,5. Las fracciones que contenían el anticuerpo, identificadas mediante absorbancia a 280 nm, se reunieron y se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, usando 1,4 mg por DO como coeficiente de extinción. Se disolvió un exceso molar de 40 veces del péptido A\beta en 20 ml de NaPO_{4} 10 mM, pH 8,0, con la excepción del péptido A\beta33-42 para el que se disolvieron en primer lugar 10 mg en 0,5 ml de DMSO y después se diluyeron hasta 20 ml con el tampón NaPO_{4} 10 mM. Las disoluciones del péptido se añadieron cada una a 10 ml de la IgG de oveja anti-ratón activada y se agitaron a temperatura ambiente durante 4 h. Los conjugados resultantes se concentraron hasta un volumen final inferior a 10 ml usando un tubo Centriprep de Amicon y entonces se dializaron frente a PBS para realizar el intercambio de tampón y eliminar el péptido libre. Los conjugados se hicieron pasar a través de filtros de 0,22 \mu de tamaño de poro para su esterilización y después se tomaron alícuotas en fracciones de 1 mg y se almacenaron congeladas a -20ºC. Se determinaron las concentraciones de los conjugados usando el ensayo de proteínas de BCA (Pierce Chemicals) con IgG de caballo para la curva patrón. Se documentó la conjugación mediante el aumento del peso molecular de los péptidos conjugados con respecto al de la IgG de oveja anti-ratón activada. El conjugado de anticuerpo de oveja anti-ratón frente a A\beta1-5 fue un conjunto de dos conjugaciones, el resto procedía de una preparación única.
2. Preparación de péptidos A\beta agregados
Se solubilizaron en fresco los péptidos 1-40 humano (AN1528; California Peptides Inc., Lote ME0541), 1-42 humano (AN1792; California Peptides Inc., Lotes ME0339 y ME0439), 25-35 humano y 1-42 de roedor (California Peptides Inc., Lote ME0218) para la preparación de cada conjunto de inyecciones de polvos liofilizados que se habían almacenado desecados a -20ºC. Para este fin, se añadieron dos mg de péptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión o disolución relativamente uniforme. De los cuatro, AN1528 fue el único péptido soluble en esta etapa. Entonces se añadió una alícuota de 100 \mul de 10X PBS (1X PBS: NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5) punto en el que AN1528 comenzó a precipitar. Se agitó de nuevo la suspensión con vórtex y se incubó durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente.
Preparación de la proteína pBx6: Se construyó un plásmido de expresión que codifica pBx6, una proteína de fusión constituida por la secuencia líder N-terminal de la polimerasa del bacteriófago MS-2 de 100 aminoácidos seguido por los aminoácidos 592-695 de APP (\betaAPP) tal como se describe por Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Se transfectó el plásmido en E. coli y se expresó la proteína tras la inducción del promotor. Se lisaron las bacterias en urea 8 M y se purificó parcialmente pBx6 mediante SDS PAGE preparativa. Las fracciones que contenían pBx6 se purificaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo policlonal de conejo anti-pBx6, se reunieron, se concentraron usando un tubo Centriprep de Amicon y se dializaron frente a PBS. La pureza de la preparación, estimada mediante SDSA PAGE teñida con azul de Coomassie, fue de aproximadamente el 5% al 10%.
B. Resultados y discusión 1. Diseño del estudio
Se obtuvieron cien ratones PDAPP transgénicos machos y hembras, heterocigotos de nueve a once meses de edad, de Charles River Laboratory y Taconic Laboratory. Los ratones se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con diferentes regiones de A\beta o APP combinadas con adyuvante de Freund. Se distribuyeron los animales para que se produjera una correspondencia lo más próxima posible en el sexo, la edad, el linaje y la fuente de los animales dentro de los grupos. Los inmunógenos incluyeron cuatro péptidos A\beta derivados de la secuencia humana, 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, conjugados cada uno con la IgG de oveja anti-ratón; cuatro péptidos A\beta agregados, 1-40 humano (AN1528), 1-42 humano (AN1792), 25-35 humano y 1-42 de roedor; y un polipéptido de fusión, denominado pBx6, que contiene los residuos de aminoácidos 592-695 de APP. Se inmunizó un décimo grupo con PBS combinado con adyuvante como control.
Para cada inmunización, se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 100 \mug de cada péptido A\beta en 200 \mul de PBS o 200 \mug del derivado de APP, pBx6, en el mismo volumen de PBS o PBS solo con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 \mul para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las cuatro dosis posteriores y con PBS para la dosis final. Las inmunizaciones se administraron por vía intraperitoneal en un programa bisemanal para las tres primeras dosis, y después en un programa mensual. Se extrajo sangre de los animales cuatro a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. Se sacrificaron los animales aproximadamente una semana tras la dosis final.
2. Niveles de A\beta y APP en el cerebro
Tras aproximadamente cuatro meses de inmunización con los diversos péptidos A\beta o el derivado de APP, se extrajeron los cerebros de los animales con perfusión de solución salina. Se preparó un hemisferio para el análisis inmunohistoquímico y se usó el segundo para la cuantificación de los niveles de A\beta y APP. Para medir las concentraciones de las diversas formas del péptido beta amiloide y de la proteína precursora de amiloide, se diseccionó el hemisferio y se prepararon homogeneizados de regiones del hipocampo, la corteza y el cerebelo en guanidina 5 M. Éstos se diluyeron y se cuantificó el nivel de amiloide o APP mediante la comparación con una serie de diluciones de patrones del péptido A\beta o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA.
La mediana de la concentración de A\beta total para el grupo control inmunizado con PBS fue 5,8 veces superior en el hipocampo que en la corteza (mediana de 24.318 ng/g en el tejido de hipocampo en comparación con 4.221 ng/g para la corteza). El nivel de mediana en el cerebelo del grupo control (23,4 ng/g de tejido) fue aproximadamente 1.000 veces inferior que en el hipocampo. Estos niveles son similares a los que se han notificado anteriormente para los ratones PDAPP transgénicos heterocigotos de esta edad (Johnson-Woods et al., 1997, citado anteriormente).
Para la corteza, un subconjunto de grupos de tratamiento tuvo unos niveles de mediana de A\beta total y A\beta1-42 que difirieron significativamente de los del grupo control (p < 0,05), de los animales que recibieron AN1792, A\beta1-42 de roedor o el conjugado de péptido A\beta1-5, tal como se muestra en la figura 11. Los niveles de mediana de A\beta total se redujeron en el 75%, el 79% y el 61%, respectivamente, en comparación con el control para estos grupos de tratamiento. No hubo correlaciones discernibles entre los títulos de anticuerpos específicos frente a A\beta y los niveles de A\beta en la región cortical del cerebro para ninguno de los grupos.
En el hipocampo, la mediana de la reducción de A\beta total asociada con el tratamiento con AN1792 (46%, p = 0,0543) no fue tan grande como la observada en la corteza (75%, p = 0,0021). Sin embargo, la magnitud de la reducción fue mucho mayor en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 11.186 ng/g de tejido en el hipocampo frente a 3,171 ng/g de tejido en la corteza. Para los grupos de animales que recibieron A\beta1-42 de roedor o A\beta1-5, los niveles de mediana de A\beta total se redujeron en el 36% y el 26%, respectivamente. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los grupos y la alta variabilidad de los niveles de péptido amiloide de un animal a otro dentro de ambos grupos, estas reducciones no fueron significativas. Cuando se midieron los niveles de A\beta1-42 en el hipocampo, ninguna de las reducciones inducidas por el tratamiento alcanzó significación. Así, debido a la menor carga de A\beta en la corteza, los cambios en esta región constituyen un indicador más sensible de los efectos del tratamiento. Los cambios en los niveles de A\beta medidos mediante ELISA en la corteza son similares, pero no idénticos, a los resultados de los análisis inmunohistoquímicos (véase más adelante).
También se midió A\beta total en el cerebelo, una región normalmente no afectada en la patología de la EA. Ninguno de los valores de mediana de las concentraciones de A\beta de cualquiera de los grupos inmunizados con los diversos péptidos A\beta o el derivado de APP difirieron de los del grupo control en esta región del cerebro. Este resultado sugiere que los niveles de A\beta no patológicos no resultan afectados por el tratamiento.
También se determinó la concentración de APP mediante ELISA en la corteza y el cerebelo de ratones tratados y control. Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, denominado APP-\alpha/FL, reconoce ambos APP-alfa (\alpha, la forma secretada de APP que se ha roto dentro de la secuencia de A\beta) y las formas de longitud completa (FL) de APP, mientras que el segundo reconoce sólo APP-\alpha. En contraposición a la disminución asociada con el tratamiento de A\beta en un subconjunto de los grupos de tratamiento, los niveles de APP no cambiaron en todos los animales tratados en comparación con los control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con péptidos A\beta no están reduciendo APP; en cambio, el efecto del tratamiento es específico frente a A\beta.
En resumen, los niveles de A\beta total y A\beta1-42 se redujeron significativamente en la corteza mediante el tratamiento con AN1792, A\beta1-42 de roedor o conjugado de A\beta1-5. En el hipocampo, A\beta total se redujo significativamente sólo mediante el tratamiento con AN1792. Ningún otro cambio asociado con el tratamiento en los niveles de A\beta o APP en las regiones del hipocampo, la corteza o el cerebelo fue significativo.
2. Análisis histoquímicos
Se prepararon los cerebros de un subconjunto de seis grupos para el análisis inmunohistoquímico, tres grupos inmunizados con conjugados del péptido A\beta, A\beta1-5, A\beta1-12 y A\beta13-28; dos grupos inmunizados con los agregados de A\beta de longitud completa AN1792 y AN1528 y el grupo control tratado con PBS. En la figura 12 se muestran los resultados de los análisis de imágenes de la carga de amiloide en cortes de cerebro de estos grupos. Hubo reducciones significativas de la carga de amiloide en las regiones corticales de tres de los grupos de tratamiento frente a los animales control. La mayor reducción de la carga de amiloide se observó en el grupo que recibió AN1792, en el que el valor medio se redujo en un 97% (p = 0,001). También se observaron reducciones significativas para los animales tratados con AN1528 (95%, p = 0,005) y el conjugado de péptido A\beta1-5 (67%, p = 0,02).
Los resultados obtenidos mediante la cuantificación de A\beta total o A\beta1-42 mediante ELISA y la carga de amiloide mediante el análisis de imágenes difieren en cierto grado. El tratamiento con AN1528 tuvo un efecto significativo en el nivel de carga de amiloide cortical cuando se midió mediante el análisis de imágenes cuantitativo pero no en la concentración de A\beta total en la misma región cuando se midió mediante ELISA. Es probable que la diferencia entre estos dos resultados se deba a las especificidades de los ensayos. El análisis de imágenes mide sólo A\beta insoluble agregado en placas. En contraposición, el ELISA mide todas las formas de A\beta, ambas soluble e insoluble, monomérica y agregada. Dado que se cree que la patología de la enfermedad está asociada con la forma asociada en placas insoluble de A\beta, la técnica del análisis de imágenes puede tener más sensibilidad para revelar los efectos del tratamiento. Sin embargo dado que el ELISA es un ensayo más rápido y más fácil, es muy útil para fines de examen. Además, puede revelar que la reducción asociada con el tratamiento de A\beta es mayor para el asociado en placas que para A\beta total.
Para determinar si los anticuerpos específicos frente a A\beta provocados mediante la inmunización en los animales tratados reaccionaron con el amiloide depositado del cerebro, se hizo reaccionar un subconjunto de cortes de los animales tratados y los ratones control con un anticuerpo específico frente a la IgG de ratón. En contraposición al grupo con PBS, las placas que contenían A\beta se recubrieron con IgG endógenas para los animales inmunizados con los conjugados del péptido A\beta, A\beta1-5, A\beta1-12 y A\beta13-28; y los agregados de A\beta de longitud completa, AN1792 y AN1528. No se analizaron mediante este ensayo los cerebros de los animales inmunizados con otros péptidos A\beta o el péptido de APP, pBx6.
3. Medición de los títulos de anticuerpos
Se extrajo sangre de los ratones cuatro a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda inmunización, para un total de cinco extracciones de sangre. Se midieron los títulos de anticuerpos como el anticuerpo de unión a A\beta1-42 usando un ELISA tipo sándwich con placas de plástico de múltiples pocillos recubiertas con A\beta1-42. Tal como se muestra en la figura 13, se obtuvieron títulos de anticuerpos máximos tras la cuarta dosis para las cuatro vacunas que provocaron los títulos superiores de anticuerpos específicos frente a AN1792: AN1792 (GMT máximo: 94.647), AN1528 (GMT máximo: 88.231), conjugado de A\beta1-12 (GMT máximo: 47.216) y A\beta1-42 de roedor (GMT máximo: 10.766). Los títulos para estos grupos disminuyeron algo tras la quinta y sexta dosis. Para los cinco inmunógenos restantes, se alcanzaron los títulos máximos tras la quinta o la sexta dosis y fueron de magnitud muy inferior a los de los cuatro grupos de título superior: conjugado de A\beta1-5 (GMT máximo: 2.356), pBx6 (GMT máximo: 1.986), conjugado de A\beta13-28 (GMT máximo: 1.183), conjugado de A\beta33-42 (GMT máximo: 658), A\beta25-35 (GMT máximo: 125). También se midieron los títulos de anticuerpos frente a los péptidos homólogos usando el mismo formato de ELISA tipo sándwich para un subconjunto de los inmunógenos, los grupos inmunizados con A\beta1-5, A\beta13-28, A\beta25-35, A\beta3-42 o A\beta1-42 de roedor. Estos títulos fueron aproximadamente los mismos que los medidos frente a A\beta1-42, excepto para el inmunógeno A\beta1-42 de roedor en cuyo caso los títulos de anticuerpos frente al inmunógeno homólogo fueron aproximadamente dos veces superiores. La magnitud del título de anticuerpos específicos frente a AN1792 de los animales individuales o los valores medios de los grupos de tratamiento no se correlacionó con la eficacia medida como la reducción de A\beta en la corteza.
4. Respuestas linfoproliferativas
Se midió la linfoproliferación dependiente de A\beta usando células de bazo recogidas aproximadamente una semana tras la sexta inmunización final. Se cultivaron células recogidas en fresco, 10^{5} por pocillo durante 5 días en presencia de A\beta1-40 a una concentración de 5 \muM por estimulación. También se cultivaron células procedentes de un subconjunto de siete de los diez grupos en presencia del péptido inverso, A\beta40-1. Como control positivo, se cultivaron células adicionales con el mitógeno de células T, PHA, y como control negativo, se cultivaron células sin péptido añadido.
Los linfocitos de una mayoría de los animales proliferaron en respuesta a PHA. No hubo respuestas significativas al péptido inverso A\beta40-1. Las células procedentes de animales inmunizados con los péptidos A\beta agregados más grandes, AN1792, A\beta1-42 de roedor y AN1528 proliferaron mucho cuando se estimularon con A\beta1-40 obteniéndose la mayor cantidad de cpm en los que recibieron AN1792. Un animal en cada uno de los grupos inmunizados con conjugado de A\beta1-12, conjugado de A\beta13-28 y A\beta25-35 proliferó en respuesta a A\beta1-40. Los grupos restantes que recibieron conjugado de A\beta1-5, conjugado de A\beta33-42 pBx6 o PBS no tuvieron animales con respuesta estimulada por A\beta. Estos resultados se resumen en la tabla 5 a continuación.
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Estos resultados muestran que AN1792 y AN1528 estimulan respuestas fuertes de células T, más probablemente del fenotipo CD4^{+}. La ausencia de una respuesta de células T específica frente a A\beta en los animales inmunizados con A\beta1-5 no es sorprendente, dado que los epítopos peptídicos reconocidos por las células T CD4^{+} habitualmente tienen aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, aunque a veces pueden funcionar péptidos más cortos con menos eficacia. Así, es probable que la mayoría de los epítopos de las células T cooperadoras para los cuatro péptidos del conjugado resida en la pareja del conjugado de IgG, no en la región de A\beta. Esta hipótesis está apoyada por la incidencia muy baja de respuestas proliferativas para los animales en cada uno de estos grupos de tratamiento. Dado que el conjugado de A\beta1-5 fue eficaz en reducir significativamente el nivel de A\beta en el cerebro, en la ausencia aparente de células T específicas frente a A\beta, la respuesta inmunitaria efectora clave inducida por la inmunización con este péptido parece ser los anticuerpos.
La ausencia de células T y la baja respuesta de anticuerpos del péptido de fusión pBx6, que engloba los aminoácidos 592-695 de APP incluyendo todos los residuos de A\beta puede deberse a la escasa inmunogenicidad de esta preparación particular. La escasa inmunogenicidad del agregado de A\beta25-35 se debe probablemente a que el péptido es demasiado pequeño para que sea probable que contenga un buen epítopo de células T para ayudar a la inducción de una respuesta de anticuerpos. Si este péptido estuviera conjugado a una proteína vehículo, probablemente sería más inmunogénico.
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V. Preparación de anticuerpos policlonales para la Protección pasiva
Se inmunizaron 20 ratones transgénicos con A\beta u otro immunógeno, opcionalmente más adjuvante, y se sacrificaron a los 4-5 meses. Se recogió sangre de ratones inmunizados. Opcionalmente, se separó IgG de otros componentes de la sangre. Se puede purificar parcialmente el anticuerpo específico para el inmunógeno mediante cromatografía de afinidad. Se obtiene una media de 0,5-1 mg de anticuerpo específico de inmunógeno por ratón, proporcionando un total de 5-10 mg.
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VI. Inmunización pasiva con anticuerpos para A\beta
Se inyectan cada uno de los grupos de ratones POAPP 7-9 meses de edad con 0,5 mg en PBS de monoclonales anti A\beta o monoclonales anti A\beta específicos como se muestra más adelante. Todas las preparaciones de anticuerpo se purifican para que tengan bajos niveles de endotoxinas. Se pueden preparar monoclonales frente a un fragmento mediante la inyección de un fragmento o forma más larga de A\beta en un ratón, preparando hibridomas y examinando los hibridomas para un anticuerpo que específicamente se une a un fragmento deseado v sin unión a otros fragmentos que no se sobreponen a A\beta.
TABLA 6
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Se inyectan ratones por vía ip según necesidad durante un período de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpo circulante medida mediante título de ELISA de más de 1/1000 definido por ELISA a A\beta 42 u otro inmunógeno. Se controlan los títulos como se ha descrito anteriormente y se sacrificaron los ratones al final de los 4 meses de infecciones.
Histoquímica, Se analizan los niveles de A\beta y toxicología después de la muerte. Se usan diez ratones por grupo.
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VII. Comparación de adyuvantes diferentes
Estos ejemplos comparan CFA, alumbre, una emulsión de aceite en agua y MPL para determinar su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria.
A. Materiales y procedimientos 1. Diseño del estudio
Se clasificaron cien cobayas de la variedad Hartley hembra, de seis semanas de edad, obtenidas de Elm Hill, en diez grupos para inmunizarse con AN1792 o un derivado de palmitoílo del mismo combinado con diversos adyuvantes. Siete grupos recibieron inyecciones de AN1792 (33 \mug a menos que se especifique lo contrario) combinado con a) PBS, b) adyuvante de Freund, c) MPL, d) escualeno, e) MPL/escualeno f) alumbre a dosis baja, o g) alumbre a dosis alta (300 \mug de AN1792). Dos grupos recibieron inyecciones de un derivado de palmitoílo de AN1792 (33 \mug) combinado con a) PBS o b) escualeno. Un décimo grupo final recibió PBS solo sin antígeno ni adyuvante adicional. Para el grupo que recibió adyuvante de Freund, la primera dosis se emulsionó con CFA y las cuatro dosis restantes con IFA. Se administró el antígeno a una dosis de 33 \mug para todos los grupos excepto para el grupo con alumbre a dosis alta, que recibió 300 \mug de AN1792. Se administraron las inyecciones por vía intraperitoneal para CFA/IFA y por vía intramuscular en los cuádriceps de las extremidades traseras alternativamente en el lado derecho e izquierdo de los otros grupos. Las tres primeras dosis se administraron en un programa bisemanal seguido por dos dosis en un intervalo mensual. Se extrajo sangre seis a siete días tras cada inmunización, comenzando tras la segunda dosis, para la medición de los títulos de anticuerpos.
2. Preparación de los inmunógenos
Se añadieron dos mg de A\beta42 (California Peptide, Lote ME0339) a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión relativamente uniforme. Se añadió una alícuota de 100 \mul de 10X PBS (1X PBS, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5). Se agitó de nuevo la suspensión con vórtex y se incubó durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente. Se almacenó el A\beta1-42 no utilizado con desecante como un polvo liofilizado a -20ºC.
Se preparó un derivado de palmitoílo de AN1792 mediante el acoplamiento de anhídrido palmítico, disuelto en dimetilformamida, al residuo amino terminal de AN1792 antes de la eliminación del péptido naciente de la resina mediante tratamiento con ácido fluorhídrico.
Para preparar las dosis de vacuna con adyuvante completo de Freund (CFA) (grupo 2), se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 33 \mug de AN1792 en 200 \mul de PBS con CFA en un volumen final de 400 \mul para la primera inmunización. Para las inmunizaciones posteriores, el antígeno se emulsionó de manera similar con adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Para preparar las dosis de vacuna con MPL para los grupos 5 y 8, se añadió polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) a trietilamina acuosa al 0,2% hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La mezcla se calentó hasta de 65ºC a 70ºC durante 30 s para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La disolución se preparó en fresco para cada conjunto de inyecciones. Para cada inyección en el grupo 5, se mezclaron 33 \mug de AN1792 en 16,5 \mul de PBS, 50 \mug de MPL (50 \mul) y 162 \mul de PBS en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.
Para preparar las dosis de vacuna con la emulsión de aceite en agua baja, se añadió AN1792 en PBS a escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, Span 85 al 0,5% en PBS para alcanzar una concentración final de dosis única de 33 \mug de AN1792 en 250 \mul (grupo 6). La mezcla se emulsionó haciéndola pasar a través de un dispositivo de mano de dos cámaras de 15 a 20 veces hasta que las gotitas de la emulsión parecieron ser de diámetro aproximadamente igual a perlas de látex convencionales de 1,0 \mum de diámetro cuando se observaron al microscopio. La suspensión resultante era de color blanco lechoso opalescente. Las emulsiones se prepararon en fresco para cada serie de inyecciones. Para el grupo 8, se añadió MPL en trietilamina al 0,2% a una concentración de 50 \mug por dosis de la mezcla de detergente y escualeno para la emulsión tal como se observó anteriormente. Para el derivado de palmitoílo (grupo 7), se añadieron 33 \mug por dosis de palmitoil-NH-A\beta1-42 al escualeno y se agitó con vórtex. Entonces se añadieron Tween 80 y Span 85 con agitación con vórtex. Esta mezcla se añadió al PBS para alcanzar concentraciones finales de escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, Span 85 al 0,5% y la mezcla se emulsionó tal como se observó anteriormente.
Para preparar las dosis de vacuna con alumbre (grupos 9 y 10), se añadió AN1792 en PBS a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio, Accurate, Westbury, NY) hasta alcanzar concentraciones de 33 \mug (dosis baja, grupo 9) o 300 \mug (dosis alta, grupo 10) AN1792 por 5 mg de alumbre en un volumen de dosis final de 250 \mul. La suspensión se mezcló suavemente durante 4 h a TA.
3. Medición de los títulos de anticuerpos
Se extrajo sangre de cobayas seis a siete días tras inmunización comenzando tras la segunda inmunización para un total de cuatro extracciones de sangre. Se midieron los títulos de anticuerpos frente a A\beta42 mediante ELISA tal como se describe en Materiales generales y procedimientos.
4. Preparación del tejido
Tras aproximadamente 14 semanas, se administró CO_{2} a todos los cobayas. Se recogió el líquido cefalorraquídeo y se extrajeron los cerebros y se diseccionaron tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) y se usaron para medir la concentración de proteína A\beta total usando ELISA.
B. Resultados 1. Respuestas de anticuerpos
Hubo una amplia variedad en la potencia de los diversos adyuvantes cuando se midió como la respuesta de anticuerpos a AN1792 tras la inmunización. Tal como se muestra en la figura 14, cuando se administró AN1792 en PBS, no se detectaron anticuerpos tras dos o tres inmunizaciones y se detectaron respuestas insignificantes tras la cuarta y la quinta dosis con títulos en media geométrica (GMT) de sólo aproximadamente 45. La emulsión de o/w indujo títulos modestos tras la tercera dosis (GMT 255) que se mantuvieron tras la cuarta dosis (GMT 301) y disminuyeron con la dosis final (GMT 54). Hubo una clara respuesta a la dosis de antígeno para AN1792 unido a alumbre, siendo 300 \mug más inmunogénico en todos los puntos de tiempo que 33 \mug. En el nivel máximo de la respuesta de anticuerpos, tras la cuarta inmunización, la diferencia entre las dos dosis fue del 43% con GMT de aproximadamente 1940 (33 \mug) y 3400 (300 \mug). La respuesta de anticuerpos a 33 \mug de AN1792 más MPL fue muy similar a la generada con una dosis casi diez veces superior de antígeno (300 \mug) unido a alumbre. La adición de MPL a una emulsión de o/w redujo la potencia de la vacuna con respecto a con MPL como el único adyuvante en hasta el 75%. Un derivado de palmitoílo de AN1792 fue completamente no inmunogénico cuando se administró en PBS y produjo títulos modestos cuando se presentó en una emulsión de o/w con GMT de 340 y 105 para la tercera y la cuarta extracciones de sangre. Los títulos de anticuerpos superiores se generaron con adyuvante de Freund con un GMT máximo de aproximadamente 87.000, un valor casi 30 veces mayor que los GMT de las siguientes dos vacunas más potentes, MPL y AN1792/alumbre a dosis alta.
Los adyuvantes más prometedores identificados en este estudio son MPL y alumbre. De estos dos, MPL parece ser preferible debido a que se requirió una dosis de antígeno 10 veces inferior para generar la misma respuesta de anticuerpos que la obtenida con alumbre. La respuesta puede aumentarse mediante el aumento de la dosis de antígeno y/o de adyuvante y mediante la optimización del programa de inmunización. La emulsión de o/w fue un adyuvante muy débil para AN1792 y la adición de una emulsión de o/w al adyuvante MPL disminuyó la actividad intrínseca del adyuvante de MPL solo.
2. Niveles de A\beta en el cerebro
Aproximadamente a las 14 semanas, se anestesiaron los cobayas profundamente, se extrajo el líquido cefalorraquídeo (CSF) y se extirparon los cerebros de los animales en un subconjunto de los grupos, los inmunizados con adyuvante de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5), alumbre a dosis alta, 300 pg, de AN1792 (grupo 10) y el grupo control inmunizado con PBS (grupo 3). Para medir el nivel de péptido A\beta, se diseccionó un hemisferio y se prepararon homogeneizados de regiones del hipocampo, la corteza y el cerebelo en guanidina 5 M. Éstos se diluyeron y se cuantificaron mediante comparación con una serie de diluciones de la proteína patrón A\beta de concentraciones conocidas en un formato de ELISA. Los niveles de la proteína A\beta en el hipocampo, la corteza y el cerebelo fueron muy similares para los cuatro grupos a pesar del amplio intervalo de respuestas de anticuerpos a A\beta provocadas por estas vacunas. Se midieron niveles medios de A\beta de aproximadamente 25 ng/g de tejido en el hipocampo, 21 ng/g en la corteza y 12 ng/g en el cerebelo. Así, la presencia de un alto título de anticuerpos circulante frente a A\beta, durante casi tres meses en algunos de estos animales no alteró los niveles totales de A\beta en sus cerebros. Los niveles de A\beta en el CSF también fueron bastante similares entre los grupos. La ausencia de un gran efecto de inmunización con AN1792 en A\beta endógeno indica que la respuesta inmunitaria se centra en las formaciones patológicas de A\beta.
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VIII. Respuesta inmunitaria a diferentes adyuvantes en ratones
Para este estudio se utilizaron ratones Swiss Webster hembra de seis semanas de edad para este estudio con 10-13 animales por grupo. Las inmunizaciones se administraron en los días 0, 14, 28, 60, 90 y 20 administradas por vía subcutánea en un volumen de dosis de 200 \mul. Se usó PBS como el tampón para todas las formulaciones. Se extrajo sangre de los animales siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para el análisis de los títulos de anticuerpos mediante ELISA. En la tabla 7 se resume el régimen de tratamiento de cada grupo.
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TABLA 7
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En la tabla 8 a continuación se muestran los títulos de anticuerpos del ELISA frente a A\beta42 en cada grupo.
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TABLA 8
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La tabla muestra que los títulos superiores se obtuvieron para los grupos 4, 5 y 18, en los que los adyuvantes fueron 125 \mug de MPL, 50 \mug de MPL y QS21 más MPL.
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IX. Eficacia terapéutica de diferentes adyuvantes
Se llevó a cabo un estudio de la eficacia terapéutica en ratones PDAPP transgénicos con un conjunto de adyuvantes adecuados para su uso en seres humanos para determinar su capacidad para potenciar respuestas inmunitarias a A\beta y para inducir el aclaramiento mediado por el sistema inmunitario de los depósitos amiloides en el cerebro.
Se obtuvieron ciento ochenta ratones PDAPP transgénicos heterocigotos machos y hembras, de 7,5 a 8,5 meses de edad de Charles River Laboratories. Se clasificaron los ratones en nueve grupos que contenían de 15 a 23 animales por grupo para inmunizarse con AN1792 o AN1528 combinados con diversos adyuvantes. Se distribuyeron los animales para que se produjera una correspondencia lo más próxima posible en el sexo, la edad y el linaje de los animales dentro de los grupos. Los adyuvantes incluyeron alumbre, MPL y QS21, cada uno combinado con ambos antígenos y adyuvante de Freund (FA) combinado sólo con AN1792. Se inmunizó un grupo adicional con AN1792 formulado en tampón PBS más el conservante timerosal sin adyuvante. Se inmunizó un noveno grupo con PBS solo como control negativo.
Preparación de péptidos A\beta agregados: se solubilizaron en fresco los péptidos A\beta1-40 humano (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; Lote ME0541) y A\beta1-42 humano (AN1792; California Peptides Inc., Lote ME0439) para la preparación de cada conjunto de inyecciones a partir de polvos liofilizados que se habían almacenado desecados a -20ºC. Para este fin, se añadieron dos mg de péptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión o disolución relativamente uniforme. AN1528 era soluble en esta etapa, en contraposición con AN1792. Entonces se añadió una alícuota de 100 \mul de 10X PBS (1X PBS: NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5), punto en el que AN1528 comenzó a precipitar. Las suspensiones se agitaron en vórtex de nuevo y se incubaron durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente.
Para preparar las dosis de vacuna con alumbre (grupos 1 y 5), se añadió el péptido A\beta en PBS a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio acuoso al dos por ciento, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) hasta alcanzar concentraciones de 100 \mug de péptido A\beta por 1 mg de alumbre. Se añadió 10X PBS hasta un volumen de dosis final de 200 \mul en 1X PBS. Entonces se mezcló suavemente la suspensión durante aproximadamente 4 h a TA antes de la inyección.
Para preparar las dosis de vacuna con MPL (grupos 2 y 6), se añadió polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) a trietilamina acuosa al 0,2% hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La mezcla se calentó hasta 65ºC a 70ºC durante 30 s para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La disolución se almacenó a 4ºC. Para cada conjunto de inyecciones, se mezclaron 100 \mug de péptido por dosis en 50 \mul de PBS, 50 \mug de MPL por dosis (50 \mul) y 100 \mul de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.
Para preparar las dosis de vacuna con QS21 (grupos 3 y 7), se añadió polvo liofilizado (Aquila, Framingham, MA; Lote A7018R) a PBS, pH 6,6-6,7 hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La disolución se almacenó a -20ºC. Para cada conjunto de inyecciones, se mezclaron 100 \mug de péptido por dosis en 50 \mul de PBS, 25 \mug de QS21 por dosis en 25 \mul de PBS y 125 \mul de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.
Para preparar las dosis de vacuna con adyuvante de Freund (grupo 4), se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 100 \mug de AN1792 en 200 \mul de PBS con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 \mul para la primera inmunización. Para las inmunizaciones posteriores, el antígeno se emulsionó de manera similar con adyuvante incompleto de Freund (IFA). Para las vacunas que contienen los adyuvantes alumbre, MPL o QS21, se combinaron 100 \mug por dosis de AN1792 o de AN1528 con alumbre (1 mg por dosis) o MPL (50 \mug por dosis) o QS21 (25 \mug por dosis) en un volumen final de 200 \mul de PBS y se administraron mediante inoculación subcutánea en la espalda entre los omóplatos. Para el grupo que recibió FA, se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 100 \mug de AN1792 con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 \mul y se administraron por vía intraperitoneal para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las cinco dosis posteriores. Para el grupo que recibió AN1792 sin adyuvante, se combinaron 10 \mug de AN1792 con 5 \mug de timerosal en un volumen final de 50 \mul de PBS y se administraron por vía subcutánea. El noveno grupo control recibió sólo 200 \mul de PBS administrados por vía subcutánea. Las inmunizaciones se administraron en un programa bisemanal para las primeras tres dosis, después en un programa mensual en los días 0, 16, 28, 56, 85 y 112. Se extrajo sangre de los animales seis a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. Se sacrificaron los animales aproximadamente una semana tras la dosis final. Los desenlaces se midieron mediante ensayo de ELISA de los niveles de A\beta y APP en el cerebro y mediante la evaluación inmunohistoquímica de la presencia de placas amiloides en cortes de cerebro. Además, se determinaron los títulos de anticuerpos específicos frente a A\beta y las respuestas de citocina y proliferativa dependientes de A\beta.
La tabla 9 muestra que los máximos títulos de anticuerpos frente a A\beta1-42 se obtuvieron con FA y AN1792, títulos que alcanzaron un máximo tras la cuarta inmunización (GMT máximo: 75.386) y después disminuyeron en un 59% tras la sexta inmunización final. El título medio máximo obtenido mediante MPL con AN1792 fue un 62% inferior al generado con FA (GMT máximo: 28.867) y también se alcanzó pronto en el esquema de inmunización, tras 3 dosis, seguido por una disminución hasta el 28% del valor máximo tras la sexta inmunización. El título medio máximo generado con QS21 combinado con AN1792 (GMT: 1.511) fue aproximadamente 5 veces inferior que el obtenido con MPL.
Además, las cinéticas de la respuesta fueron más lentas, ya que se requirió una inmunización adicional para alcanzar la respuesta máxima. Los títulos generados por AN1792 unido a alumbre fueron ligeramente mayores que los obtenidos con QS21 y las respuestas cinéticas fueron más rápidas. Para AN1792 administrado en PBS con timerosal, la frecuencia y el tamaño de los títulos fueron apenas mayores que para el PBS solo. Los títulos máximos generados con MPL y AN1528 (GMT máximo 3099) fueron aproximadamente 9 veces inferiores a los obtenidos con AN1792. El AN1528 unido a alumbre fue muy escasamente inmunogénico con títulos bajos generados sólo en algunos de los animales. No se observaron respuestas de anticuerpos en los animales control inmunizados con PBS solo.
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TABLA 9
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En la figura 15 se muestran los resultados del tratamiento con AN1792 o AN1592 con diversos adyuvantes, o timerosal en la carga de amiloide cortical en ratones de 12 meses de edad determinados mediante ELISA. En ratones PDAPP control con PBS, el nivel de mediana de A\beta total en la corteza a los 12 meses fue de 1.817 ng/g. Se observaron niveles notablemente reducidos de A\beta en ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y QS21 más AN1792. La reducción alcanzó significación estadística (p < 0,05) sólo para AN1792 más CFA/IFA. Sin embargo, tal como se muestra en los ejemplos I y III, los efectos de la inmunización en la reducción de los niveles de A\beta se hicieron sustancialmente mayores en ratones de 15 meses y 18 meses de edad.
Así, se espera que al menos las composiciones de AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS21 lograrán significación estadística en el tratamiento de los ratones de más edad. En contraposición, AN1792 más el conservante timerosal mostró un nivel de mediana de A\beta aproximadamente igual al de los ratones tratados con PBS. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de A\beta42. El nivel de mediana de A\beta42 en los controles con PBS fue de 1624 ng/g. Se observaron niveles de mediana notablemente reducidos de 403, 1149, 620 y 714 en los ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS21, respectivamente, logrando la reducción de la significación estadística (p = 0,05) para el grupo de tratamiento con AN1792 CFA/IFA. El nivel de mediana en los ratones tratados con AN1792 - timerosal fue de 1619 ng/g de A\beta42.
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X. Análisis de toxicidad
Se recogieron tejidos para el examen histopatológico a la finalización de los estudios descritos en los ejemplos 2, 3 y 7. Además, se llevaron a cabo análisis de hematología y bioquímica clínica en las muestras de sangre terminales de los ejemplos 3 y 7. Se evaluó la mayoría de los órganos principales incluyendo, cerebro, pulmones, tejido linfático, sistema gastrointestinal, hígado, riñones, glándulas suprarrenales y gónadas. Aunque se observaron lesiones esporádicas en los animales del estudio, no hubo diferencias obvias, ni en los tejidos afectados ni en la gravedad de las lesiones, entre los animales tratados con AN1792 y no tratados. No hubo lesiones histopatológicas únicas observadas en los animales inmunizados con AN-1782 en comparación con los animales tratados con PBS o no tratados. Tampoco hubo diferencias en el perfil de análisis de bioquímica clínica entre los grupos con adyuvante y los animales tratados con PBS en el ejemplo 7. Aunque hubo aumentos significativos en varios de los parámetros de hematología entre los animales tratados con AN1792 y adyuvante de Freund en el ejemplo 7 con respecto a los animales tratados con PBS, se esperan estos tipos de efectos a partir del tratamiento con adyuvante de Freund y la peritonitis que acompaña y no indican ningún efecto adverso del tratamiento con AN1792. Aunque no formó parte de la evaluación toxicológica, se examinó extensamente la patología del cerebro de ratón PDAPP como parte de los criterios de valoración de eficacia. No se observaron signos de efectos adversos relacionados con el tratamiento en la morfología del cerebro en ninguno de los estudios. Estos resultados indican que el tratamiento con AN1792 se tolera bien y está al menos sustancialmente libre de efectos secundarios.
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XI. Prevención y tratamiento de los sujetos
Se lleva a cabo un ensayo de fase I de dosis única para determinar la seguridad. Se administra un agente terapéutico en dosificaciones crecientes a diferentes pacientes comenzando desde aproximadamente el nivel de eficacia supuesta de 0,01 y aumentando en un factor de tres hasta alcanzar un nivel de aproximadamente 10 veces la dosificación eficaz en el ratón.
Se lleva a cabo un ensayo de fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionan pacientes con enfermedad de Alzheimer de temprana a media definida usando los criterios de la Alzheimer's disease and Related Disorders Association (ADRDA) (Asociación de la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados) por EA probable. Los pacientes adecuados puntúan en el intervalo 12-26 en el Mini-Mental State Exam (MMSE) (examen de estado mini-mental). Otros criterios de selección son que es probable que los pacientes sobrevivan durante la duración del estudio y la ausencia de problemas de complicación tales como el uso de medicaciones concomitantes que pueden interferir. Las evaluaciones en el nivel inicial de la función del paciente se realizan usando medidas psicométricas clásicas, tales como MMSE, y ADAS, que es una escala exhaustiva para evaluar pacientes con estado y función de enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicométricas proporcionan una medida de la progresión de la afección de Alzheimer. También pueden usarse escalas de vida cualitativas adecuadas para controlar el tratamiento. También puede controlarse la progresión de la enfermedad mediante RMN. También pueden controlarse los perfiles sanguíneos de los pacientes incluyendo ensayos de respuestas de células T y anticuerpos específicos frente al
inmunógeno.
Tras las medidas del nivel inicial, los pacientes comenzaron a recibir el tratamiento. Se aleatorizaron y se trataron con el agente terapéutico o bien placebo de una forma enmascarada. Los pacientes se controlaron al menos cada seis meses. La eficacia se determina mediante una reducción significativa en la progresión de un grupo de tratamiento con respecto a un grupo placebo.
Se lleva a cabo un segundo ensayo de fase II para evaluar la conversión de los pacientes desde pérdida de memoria temprana sin enfermedad de Alzheimer, denominada en ocasiones alteración de la memoria asociada con la edad (AAMI), hasta enfermedad de Alzheimer probable tal como se define mediante los criterios de la ADRDA. Los pacientes con alto riesgo de conversión a la enfermedad de Alzheimer se seleccionan de una población no clínica examinando las poblaciones de referencia para determinar signos tempranos de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con sintomatología previa al Alzheimer, una historia familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genéticos, edad, sexo y otras características encontradas para predecir un alto riesgo en la enfermedad de Alzheimer. Se recogen las puntuaciones de nivel inicial en las métricas adecuadas incluyendo MMSE y ADAS junto con otras métricas diseñadas para evaluar una población más normal. Estas poblaciones de pacientes de dividieron en grupos adecuados con comparación de placebo frente a alternativas de dosificación con el agente. Se realizaron seguimientos de estas poblaciones de pacientes a intervalos de aproximadamente seis meses, y el criterio de valoración para cada paciente es si se convierte o no en enfermedad de Alzheimer probable tal como se define por los criterios de ADRDA al final de la observación.
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XII. Procedimientos y materiales generales 1. Medición de los títulos de anticuerpos
Se extrajo sangre de ratones realizando un pequeño corte en la vena de la cola y recogiendo aproximadamente 200 \mul de sangre en un tubo de microcentrífuga. Se extrajo sangre de cobayas afeitando en primer lugar la zona posterior del corvejón y después usando una aguja de calibre 18 para cortar la vena metatarsiana y recogiendo la sangre en tubos de microcentrífuga. Se dejó coagular la sangre durante una h a temperatura ambiente (TA), se agitó con vórtex, después se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min. para separar el coágulo del suero. Entonces se transfirió el suero a un tubo de microcentrífuga limpio y se almacenó a 4ºC hasta que se tituló.
Se midieron los títulos de anticuerpos mediante ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (placas de EIA Costar) con 100 \mul de una disolución que contenía 10 \mug/ml de A\beta42 o SAPP o bien otros antígenos tal como se observa en cada uno de los informes individuales en tampón de recubrimiento de pocillos (fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,5, azida sódica 0,1%) y se mantuvieron durante la noche a TA. Se aspiraron los pocillos y se añadieron los sueros a los pocillos comenzando a una dilución de 1/100 en diluyente de muestras (fosfato de sodio 0,014 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, albúmina sérica bovina al 0,6%, timerosal al 0,05%). Se realizaron siete diluciones en serie de las muestras directamente en las placas en etapas de tres veces hasta alcanzar una dilución final de 1/218.700. Se incubaron las diluciones en los pocillos de las placas recubiertos durante una h a TA. Entonces se lavaron las placas cuatro veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. Se añadió a los pocillos el segundo anticuerpo, una Ig de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano blanco (obtenida de Boehringer Mannheim), como 100 \mul de una dilución 1/3000 en diluyente de muestras y se incubó durante una h a TA. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces en PBS, Tween 20. Para desarrollar el cromógeno, se añadieron 100 \mul de Slow TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina obtenida de Pierce Chemicals) a cada pocillo y se incubó durante 15 min. a TA. Se detuvo la reacción mediante la adicción de 25 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M. Entonces se leyó la intensidad del color en un Vmax de Molecular Devices a (450 nm-650 nm).
Se definieron los títulos como el recíproco de la dilución de suero que da la mitad de la DO máxima. La DO máxima generalmente se tomó de una dilución 1/100 inicial, excepto en los casos con títulos muy altos, en cuyo caso fue necesaria una dilución inicial superior para establecer la DO máxima. Si el punto al 50% cayó entre dos diluciones, se realizó una extrapolación lineal para calcular el título final. Para calcular los títulos en media geométrica de anticuerpos, se asignaron arbitrariamente a los títulos inferiores a 100 un valor de título de 25.
2. Ensayo de proliferación de linfocitos
Se anestesiaron los ratones con isoflurano. Se extrajeron los bazos y se enjuagaron dos veces con 5 ml de PBS que contenía suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (PBS-FBS) y después se homogeneizaron en una unidad Centricon de 50 \mu (Dako A/S, Dinamarca) en 1,5 ml de PBS-FBS durante 10 s a 100 rpm en un sistema Medimachine (Dako) seguido por filtración a través de una malla de nailon de tamaño de poro 100 \mu. Se lavaron los esplenocitos una vez con 15 ml de PBS-FBS, después se hicieron sedimentar mediante centrifugación a 200 x g durante 5 min. Se lisaron los glóbulos rojos resuspendiendo el sedimento en 5 ml de tampón que contenía NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 1 M, NaEDTA 0,1 M, pH 7,4 durante cinco min. a TA. Entonces se lavaron los leucocitos como anteriormente. Se cultivaron células de bazo aisladas en fresco (10^{5} células por pocillo) en conjuntos por triplicado en placas de microtitulación tratadas para cultivo tisular con fondo en forma de U de 96 pocillos (Corning, Cambridge, MA) en medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) complementado con L-glutamina 2,05 mM, penicilina/estreptomicina al 1% y FBS inactivado con calor al 10% durante 96 h a 37ºC. También se añadieron diversos péptidos A\beta, A\beta1-16, A\beta1-40, A\beta1-42 o la proteína de secuencia inversa A\beta40-1 a dosis que oscilaban desde 5 \muM hasta 0,18 \muM en cuatro etapas. Las células en los pocillos control se cultivaron con concanavalina A (Con A) (Sigma, nº de catálogo C-5275, a 1 \mug/ml) sin proteína añadida. Se pulsaron las células durante las 24 h finales con ^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo obtenida de Amersham Corp., Arlington Heights IL). Entonces se recogieron las células en placas UniFilter y sé contaron en un contador de centelleo de microplacas Top Count (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm) de la radiactividad incorporada en las macromoléculas
insolubles.
4. Preparación del tejido cerebral
Tras sacrificar los animales, se extrajeron los cerebros y se preparó un hemisferio para el análisis inmunohistoquímico, mientras que se diseccionaron tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) del otro hemisferio y se usaron para medir la concentración de diversas proteínas A\beta y formas de APP usando ELISA específicos (Johnson-Wood et al., citado anteriormente).
Se homogeneizaron los tejidos destinados para ELISA en 10 volúmenes de tampón guanidina enfriado con hielo (guanidina-HCl 5,0 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Se mezclaron homogeneizados mediante agitación suave usando una mezcladora Adams Nutator (Fisher) durante tres a cuatro h a TA, entonces se almacenaron a -20ºC antes de la cuantificación de A\beta y APP. Los experimentos anteriores han demostrado que los analitos eran estables en estas condiciones de almacenamiento y que la proteína A\beta sintética (Bachem) podía recuperarse cuantitativamente cuando se añadía de manera conocida a los homogeneizados de tejido cerebral control de crías de ratón (Johnson-Wood et al., citado anteriormente).
5. Medición de los niveles de A\beta
Se diluyeron los homogeneizados de cerebro 1:10 con diluyente de caseína enfriado con hielo (caseína al 0,25%, PBS, azida sódica al 0,05%, aprotinina 20 \mug/ml, EDTA 5 mM pH 8,0, leupeptina 10 \mug/ml) y después se centrifugaron a 16.000 x g durante 20 min. a 4ºC. Se prepararon los patrones de proteína A\beta sintética (1-42 aminoácidos) y los patrones de APP para que incluyeran guanidina 0,5 M y albúmina sérica bovina al 0,1% (BSA) en la composición final. El ELISA tipo sándwich para A\beta total utiliza el anticuerpo monoclonal (mA\beta) 266, específico para los aminoácidos 13-28 de A\beta (Seubert, et al.), como el anticuerpo de captura y el mA\beta 3D6 biotinilado específico para los aminoácidos 1-5 de A\beta (Johnson-Wood, et al), como el anticuerpo indicador. El 3D6 mA\beta no reconoce APP secretado ni APP de longitud completa, sino que sólo detecta especies de A\beta con un ácido aspártico amino-terminal. Este ensayo tiene un límite inferior de sensibilidad de \sim50 \rhog/ml (11 \rhoM) y muestra que no hay reactividad cruzada para la proteína A\beta murina endógena a concentraciones de hasta 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., citado anteriormente).
El ELISA tipo sándwich específico para A\beta1-42 emplea el mA\beta 21F12, específico para los aminoácidos 33-42 de A\beta (Johnson-Wood, et al.), como el anticuerpo de captura. En este ensayo, mA\beta 3D6 biotinilado también es el anticuerpo indicador que tiene un límite inferior de sensibilidad de aproximadamente 125 \rhog/ml (28 \rhoM, Johnson-Wood et al.). Para los ELISA de A\beta, se recubrieron 100 \mul de mA\beta 266 (a 10 \mug/ml) o bien mA\beta 21F12 a (5 \mug/ml) en los pocillos de placas de inmunoensayo de 96 pocillos (Costar) mediante incubación durante la noche a TA.
Se extrajo la disolución mediante aspiración y se bloquearon los pocillos mediante la adición de 200 \mul de albúmina sérica humana la 0,25% en tampón PBS durante al menos 1 h a TA. Se extrajo la disolución de bloqueó y se almacenaron las placas desecadas a 4ºC hasta su uso. Se rehidrataron las placas con tampón de lavado [solución salina tamponada con Tris (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5), más Tween 20 al 0,05%] antes de su uso. Se añadieron las muestras y los patrones en alícuotas por triplicado de 100 \mul por pocillo y después se incubaron durante la noche a 4ºC. Se lavaron las placas al menos tres veces con tampón de lavado entre cada etapa del ensayo. Se añadió el mA\beta 3D6 biotinilado, diluido hasta 0,5 \mug/ml en tampón de ensayo de caseína (caseína al 0,25%, PBS, Tween 20 al 0,05% 20, pH 7,4) y se incubó en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió a los pocillos un conjugado de avidina-peroxidasa de rábano blanco, (Avidina-HRP obtenida de Vector, Burlingame, CA), diluido 1:4000 en tampón de lavado de caseína, durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce) y se dejó reaccionar durante 15 minutos a TA, tras lo que se detuvo la reacción enzimática mediante la adición de 25 \mul de H_{2}SO_{4} 2 N. Se cuantificó el producto de la reacción usando un lector de microplacas automatizado Vmax de Molecular Devices que mide la diferencia en la absorbancia a 450 nm y 650 nm.
6. Medición de los niveles de APP
Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, denominado APP-\alpha/FL, reconoce ambos APP-alfa (\alpha) y las formas de longitud completa (FL) de APP. El segundo ensayo es específico para APP-\alpha. El ensayo APP-\alpha/FL reconoce la APP secretada incluyendo los primeros 12 aminoácidos de A\beta. Dado que el anticuerpo indicador (2H3) no es específico frente al sitio clip \alpha, que se produce entre los aminoácidos 612-613 de APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); este ensayo también reconoce APP de longitud completa (APP-FL). Los experimentos preliminares que utilizaban anticuerpos de APP inmovilizados frente a la cola citoplasmática de APP-FL para reducir los homogenizados en cerebro de APP-FL sugieren que aproximadamente el 30%-40% del APP APP-\alpha/FL es FL (datos no mostrados). El anticuerpo de captura para ambos ensayos de APP-\alpha/FL y APP-\alpha es mA\beta 8E5, obtenido frente a los aminoácidos 444 a 592 de la forma APP695 (Games et al., citado anteriormente). El mA\beta indicador para el ensayo de APP-\alpha/FL es mA\beta 2H3, específico para los aminoácidos 597-608 de APP695 (Johnson-Wood et al., citado anteriormente) y el anticuerpo indicador para el ensayo de APP-\alpha es un derivado biotinilado de mA\beta 16H9, obtenido frente a los aminoácidos 605 a 611 de APP. El límite inferior de sensibilidad del ensayo de APP-\alpha/FL es de aproximadamente 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al.) y el del ensayo específico para APP-\alpha es de 22 ng/ml (0,3 nM). Para ambos ensayos de APP, mA\beta 8E5 se recubrió en los pocillos de placas de EIA de 96 pocillos tal como se describió anteriormente para mA\beta 266. Se usó APP-\alpha recombinante, purificado, como el patrón de referencia para el ensayo de APP-\alpha y el ensayo de APP-\alpha/FL (Esch et al., citado anteriormente). Se diluyeron 1:10 las muestras de homogenizado de cerebro en guanidina 5 M en diluyente de muestras para ELISA (tampón fosfato 0,014 M, pH 7,4, albúmina sérica bovina al 0,6%, timerosal al 0,05%, NaCl 0,5 M, NP40 al 0,1%). Después de diluyeron 1:4 en diluyente de muestras que contenía guanidina 0,5 M. Entonces se centrifugaron los homogeneizados diluidos a 16.000 x g durante 15 segundos a TA. Se añadieron las muestras y los patrones de APP a la placa en alícuotas por duplicado y se incubaron durante 1,5 h a TA. Se incubó el anticuerpo 3H3 o 16H9 indicador biotinilado con las muestras durante 1 h a TA. Se incubó estreptavidina-fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim), diluida 1:1000 en diluyente de muestras en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato fluorescente 4-metil-umbeliferil-fosfato para incubación durante 30 min. a TA y se leyeron las placas en un fluorímetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a excitación de 365 nm y a emisión de 450 nm.
7. Inmunohistoquímica
Se fijaron los cerebros durante tres días a 4ºC en paraformaldehído al 4% en PBS y después se almacenaron desde uno hasta siete días a 4ºC en paraformaldehído al 1%, PBS hasta que se realizaron los cortes. Se practicaron cortes coronales de cuarenta micrómetros de espesor con un vibratomo a TA y se almacenaron en crioprotector (glicerol al 30%, etilenglicol al 30% en tampón fosfato) a -20ºC antes del tratamiento inmunohistoquímico. Para cada cerebro se incubaron durante la noche seis cortes en el nivel del hipocampo dorsal, cada uno separado mediante intervalos consecutivos de 240 \mum, con uno de los siguientes anticuerpos: (1) un anti-A\beta biotinilado (mA\beta, 306, específico para el A\beta humano) diluido hasta una concentración de 2 \mug/ml en PBS y suero de caballo al 1%; o (2) un mA\beta biotinilado específico para el APP humano, 8E5, diluido hasta una concentración de 3 \mug/ml en PBS y suero de caballo al 1,0%; o (3) un mA\beta específico para la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluida 1:500 con Triton X-100 al 0,25% y suero de caballo al 1%, en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS); o (4) un mA\beta específico para CD11b, el antígeno de MAC-1, (Chemicon International) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (5) un mA\beta específico para el antígeno del CMH II, (Pharmingen) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (6) un mA\beta de rata específico para CD 43 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS o (7) un mA\beta de rata específico para CD 45RA (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (8) un A\beta monoclonal de rata específico para CD 45RB (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (9) un A\beta monoclonal de rata específico para CD 45 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (10) un A\beta de hámster policlonal biotinilado específico para CD3e (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS o (11) un mA\beta de rata específico para CD3 (Serotec) diluido 1:200 con suero de conejo al 1% en PBS; o con (12) una disolución de PBS que carece de un anticuerpo primario que contiene suero de caballo normal al 1%.
Los cortes que se habían hecho reaccionar con las disoluciones de anticuerpo enumeradas en 1,2 y 6-12 anteriormente se pretrataron con Triton X-100 al 1,0%, peróxido de hidrógeno al 0,4% en PBS durante 20 min. a TA para bloquear la peroxidasa endógena. A continuación se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpo primario. Los cortes que se habían hecho reaccionar con los mA\beta frente a 3D6 o 8E5 o CD3e se hicieron reaccionar entonces durante 1 h a TA con un complejo peroxidasa de rábano blanco - avidina - biotina con los componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (kit patrón Vector Elite, Vector Labs, Burlingame, CA.). Los cortes que se habían hecho reaccionar con anticuerpos específico para CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 y la disolución de PBS desprovista del anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a TA con IgG anti-rata biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS o IgG anti-ratón biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS, respectivamente. Los cortes se hicieron reaccionar entonces durante una h a TA con un complejo peroxidasa de rábano blanco - avidina - biotina con los componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (kit patrón Vector Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).
Se desarrollaron los cortes en peróxido de hidrógeno al 0,01%, 3,3'-diaminobencidina (DAB) al 0,05% a TA. Los cortes destinados a la incubación con los anticuerpos específicos frente a GFAP, MAC-1 y CMH II se pretrataron con peróxido de hidrógeno al 0,6% a TA para bloquear la peroxidasa endógena, después se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario a 4ºC. Los cortes que se habían hecho reaccionar con el anticuerpo frente a GFAP se incubaron durante 1 h a TA con la IgG anti-ratón biotinilada obtenida en caballo (Vector Laboratories; kit de vectastaína Elite ABC) diluida 1:200 con TBS. Entonces se hicieron reaccionar los cortes durante una h con un complejo avidina - biotina - peroxidasa (Vector Laboratories; kit de vectastaína Elite ABC) diluido 1:1000 con TBS. Los cortes incubados con los mA\beta específicos frente a MAC-1 o CMH II, como los anticuerpos primarios, se hicieron reaccionar posteriormente durante 1 h a TA con IgG anti-rata biotinilada obtenida en conejo diluida 1:200 con TBS, seguido por la incubación durante una h con el complejo avidina - biotina - peroxidasa diluido 1:1000 con TBS. Los cortes incubados con anticuerpos específicos frente a GFAP, MAC-1 y MHC II se visualizaron entonces mediante tratamiento a TA con DAB al 0,05%, peróxido de hidrógeno al 0,01%, cloruro de níquel al 0,04%, TBS durante 4 y 11 min., respectivamente.
Los cortes marcados inmunológicamente se montaron en portaobjetos de vidrio (VWR, portaobjetos Superfrost), se secaron al aire durante la noche, se sumergieron en Propar (Anatech) y se recubrieron con cubreobjetos usando Permount (Fisher) como medio de montaje.
Para contrateñir las placas con A\beta, se montó un subconjunto de los cortes positivos para GFAP en portaobjetos Superfrost y se incubó en tioflavina S acuosa al 1% (Sigma) durante 7 min. tras el tratamiento inmunohistoquímico. Entonces se deshidrataron los cortes y se aclararon en Propar, después se recubrieron con cubreobjetos montados con Permount.
8. Análisis de imágenes
Se utilizó un sistema de análisis de imágenes Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) asociado a un microscopio Microphot-FX de Nikon a través de una cámara de vídeo CCD y un monitor Triniton de Sony para la cuantificación de los portaobjetos inmunorreactivos. Se almacenó la imagen del corte en un tampón de vídeo y se determinó un umbral basado en el color y la saturación para seleccionar y calcular el área de píxel total ocupada por las estructuras marcadas inmunológicamente. Para cada corte, se realizó un perfil manual del hipocampo y se calculó el área de píxel total ocupada por el hipocampo. El porcentaje de carga de amiloide se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contiene depósitos de A\beta inmunorreactivos mA\beta 3D6) x 100. De manera similar, se midió el porcentaje de carga neurítica como: (la fracción del área del hipocampo que contiene neuritas distróficas reactivas con mA\beta 8E5) x100. El sistema C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que opera con el programa de aplicación Simple 32 se asoció con un microscopio Microphot-FX de Nikon a través de una cámara Optronics y se usó para cuantificar el porcentaje de la corteza retrospenial ocupada por astrocitos positivos para GFAPy microglía positiva para MAC-1 y CMH II. Se almacenó la imagen del corte que había reaccionado inmunológicamente en un tampón de vídeo y se determinó un umbral basado en monocromo para seleccionar y calcular el área de píxel total ocupada por las células marcadas inmunológicamente. Para cada corte, se realizó un perfil manual de la corteza retroesplenial (RSC) y se calculó el área de píxel total ocupada por la RSC. El porcentaje de astrocitosis se definió como: (la fracción de RSC ocupada por astrocitos reactivos con GFAP) X 100. De manera similar, el porcentaje de microgliosis se definió como: (la fracción de la RSC ocupada por microglía reactiva con MAC-1 o CMH II) X 100. Para todos los análisis de imágenes, se cuantificaron para cada animal seis cortes en el nivel del hipocampo dorsal, separado cada uno mediante intervalos consecutivos de 240 \mum. En todos los casos, el observador desconocía el estado de tratamiento de los animales.
Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle con el propósito de clarificar su comprensión, será obvio que se pueden poner en práctica ciertas modificaciones
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Claims (30)

1. Un conjugado que comprende un agente unido a una proteína portadora, para uso en el tratamiento o prevención de enfermedad en el cual el agente es:
i) A\beta; o
ii) un fragmento A\beta que induce una respuesta inmune contra A\beta; y
en el cual la proteína portadora aumenta una respuesta inmune contra A\beta o el fragmento de A\beta.
2. Un conjugado de la reivindicación 1, en el cual la proteína portadora es:
Una albúmina sérica;
Hemocianina de lapa californiana;
Una molécula de inmunoglobulina
Tiroglobulina
Ovalbúmina; o
Un toxoide a partir de una bacteria patogénica.
3. Un conjugado de la reivindicación 2, en el cual la proteína portadora es un toxoide tetánico, toxoide diftérico, toxoide de E. coli o toxoide H. pylori.
4. Un conjugado de la reivindicación 3, en el cual el toxoide diftérico es una toxina diftérica CRM 197 atenuada.
5. Un conjugado de la reivindicación 1, en el cual la proteína portadora es toxina colérica.
6. Un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el agente se une a una proteína portadora mediante cruzamiento químico.
7. Un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el agente se expresa como la proteína de fusión con la proteína portadora.
8. Un conjugado de la reivindicación 7, en el cual el agente está ligado al término amino a la proteína portadora.
9. Un conjugado de la reivindicación 7, en el cual el agente se une por el término carboxilo a la proteína portadora.
10. Un conjugado de la reivindicación 7, en el cual el agente se une internamente a la proteína portadora.
11. Un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el cual múltiples repeticiones del agente están presentes en la proteína de fusión.
12. Un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el cual el agente es un fragmento de A\beta.
13. Un conjugado de la reivindicación 12, en el cual dicho fragmento de A\beta es de la mitad de la N-terminal de A\beta.
14. Un conjugado de la reivindicación 12 o reivindicación 13, en el cual dicho fragmento de A\beta comprende al menos 3 aminoácidos contiguos de un péptido natural A\beta.
15. Un conjugado de la reivindicación 14, en el cual dicho fragmento de A\beta comprende al menos 5 aminoácidos contiguos de un péptido natural A\beta.
16. Un conjugado de la reivindicación 15, en el cual dicho fragmento de A\beta comprende al menos 6 aminoácidos contiguos de un péptido natural de A\beta.
17. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el agente es parte de un polipéptido más largo que incluye el agente junto con otros aminoácidos.
18. Un conjugado de la reivindicación 1, en el cual el agente es un componente de una partícula.
19. Un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el cual el péptido se selecciona entre A\beta39, A\beta40, A\beta41, A\beta42 o A\beta43.
20. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el péptido de A\beta tiene la secuencia:
\quad
H_{2}N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.
21. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y uno o más componentes farmacéuticamente aceptables para uso en terapia.
22. Una composición farmacéutica según la reivindicación 21, que comprende un excipiente adecuado para la administración oral u otras vías de administración.
23. Una composición farmacéutica según la reivindicación 21 o reivindicación 22, que comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición farmacéutica según la reivindicación 23, en el cual el adyuvante se administra al mismo tiempo con el agente.
25. Una composición farmacéutica según la reivindicación 24, en el cual el agente se acopla al adyuvante.
26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 23, en el cual el adyuvante se administra antes o después del agente.
27. un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1 a 20 para uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra a A\beta en el cerebro de un paciente.
28. Uso de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 20 en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra A\beta y de ese modo prevenir o tratar una enfermedad asociada con depósitos de amiloides de A\beta en el cerebro de un paciente.
29. Un conjugado de la reivindicación 27 o un uso de la reivindicación 28, en el cual la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
30. Un conjugado o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el cual el paciente es:
a) asintomático, y/o
b) por debajo de 50; y/o
i)
ha heredado factores de riesgo indicativos de susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer.
ii)
no tiene conocimiento de factores de riesgo conocidos a la enfermedad de Alzheimer.
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Families Citing this family (293)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6703015B1 (en) 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
DE69942274D1 (de) * 1998-05-21 2010-06-02 Univ Tennessee Res Foundation Methoden zur amyloidentfernung mit anti-amyloid-antikörper
US7060670B1 (en) 1999-05-05 2006-06-13 Neurochem (International) Limited Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof
CN1192799C (zh) 1999-05-13 2005-03-16 惠氏控股有限公司 佐剂组合制剂
AU2008203784B2 (en) * 1999-05-28 2012-01-19 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AU2005202644B2 (en) * 1999-06-01 2009-03-05 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
PE20010212A1 (es) * 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
US6582945B1 (en) 1999-06-16 2003-06-24 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of β-amyloid levels in vivo
IL142948A0 (en) * 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US7384640B1 (en) 1999-09-30 2008-06-10 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
US20070135337A2 (en) * 1999-11-29 2007-06-14 Neurochem (International) Limited Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1752472A3 (en) * 1999-12-08 2007-04-25 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
IL149976A0 (en) * 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
EP1259251B1 (en) * 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CA2400838C (en) * 2000-02-21 2013-04-23 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CZ306683B6 (cs) 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
DE60108111T2 (de) 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP2003516929A (ja) * 2000-06-01 2003-05-20 ニユーララブ・リミテツド アミロイド形成性疾患の予防および治療
US7371920B2 (en) 2000-06-20 2008-05-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic mouse model of neurodegenerative disorders
PT1292187E (pt) * 2000-06-20 2006-07-31 Univ Toronto Modelo animal transgenico de disturbios neurodegenerativos
JP5008244B2 (ja) 2000-06-23 2012-08-22 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）のアセンブリー
NZ523428A (en) * 2000-06-28 2008-03-28 Prana Biotechnology Ltd Neurotoxic oligomers
JP5362164B2 (ja) * 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
AU2007200047B2 (en) * 2000-07-07 2009-11-26 Bioarctic Neuroscience Ab Prevention and treatment of Alzheimer's disease
DK1317479T3 (da) * 2000-09-06 2009-11-23 Aventis Pharma Sa Fremgangsmåder og sammensætninger for sygdomme, der er associeret med amyloidosis
US20040038302A1 (en) * 2000-09-19 2004-02-26 Roger Nitsch Methods and compounds for treating brain amyloidosis
IL139308A0 (en) * 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
BR0115271A (pt) 2000-11-10 2005-12-13 Wyeth Corp Composição antigênica, método para incrementar a capacidade de uma composição antigênica em elicitar a resposta imunológica de um hospedeiro vertebrado, em elicitar linfócitos t citotóxicos em um hospedeiro vertebrado, em elicitar um efeito terapêutico ou profilático anti-câncer em um hospedeiro vertebrado, em moderar uma resposta alérgica em um hospedeiro vertebrado, e em prevenir ou tratar doença caracterizada por deposição amilóide em um hospedeiro vertebrado, e, formulação adjuvante
DE60141976D1 (de) 2000-11-29 2010-06-10 Univ Rochester Helfervirus-freie herpesvirus-amplifikatpartikel und deren verwendungen
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7118756B2 (en) 2000-12-28 2006-10-10 Wyeth Recombinant protective protein from Streptococcus pneumoniae
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
US8092791B2 (en) 2001-05-23 2012-01-10 University Of Rochester Method of producing herpes simplex virus amplicons, resulting amplicons, and their use
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
IL159209A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
KR100898648B1 (ko) 2001-06-07 2009-05-22 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제로서 콜레라 홀로톡신의 돌연변이체 형태
US7829087B2 (en) 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
JP4351043B2 (ja) 2001-07-09 2009-10-28 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アミロイド毒性の阻害方法
EP1519740A4 (en) * 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
US20040192898A1 (en) * 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
CA2452104A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
US7771722B2 (en) * 2001-08-17 2010-08-10 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
PT1416965E (pt) * 2001-08-17 2008-04-01 Lilly Co Eli Método de ensaio para a doença de alzheimer
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030082191A1 (en) * 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
US20040052928A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Ehud Gazit Peptides and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20040001848A1 (en) * 2002-03-01 2004-01-01 Szu-Yi Chou Method of producing disease-specific antigens
EP1480666B1 (en) 2002-03-05 2012-06-13 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the beta-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2493119A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease
SI1524994T1 (sl) 2002-07-19 2011-08-31 Cytos Biotechnology Ag Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe
AU2003256789A1 (en) 2002-08-13 2004-02-25 U.S. Department Of Veterans Affairs Method of detecting and preventing alzheimer's disease, particularly at prodromal and early stages
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US9535076B2 (en) 2002-09-12 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
JP2006516535A (ja) * 2002-09-12 2006-07-06 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、カリフォルニア 異なる配列のタンパク質から形成されたアミロイドに共通する高分子量凝集中間体に対して特異的な免疫原および対応する抗体
US20040146512A1 (en) * 2002-10-09 2004-07-29 Arnon Rosenthal Methods of treating Alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
CN100450551C (zh) * 2002-11-29 2009-01-14 中国医学科学院基础医学研究所 用于治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途
US20070010435A1 (en) 2002-12-19 2007-01-11 New York University Method for treating amyloid disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CN1745175A (zh) * 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
ES2344645T3 (es) 2003-02-10 2010-09-02 Applied Molecular Evolution, Inc. Moleculas de union al abeta.
JP5036302B2 (ja) * 2003-02-10 2012-09-26 ティオー − ビービービー ホールディング ベスローテン フェンノートシャップ 炎症状態下に血液脳関門で示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）に発現される核酸
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US20060251675A1 (en) * 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
KR100546066B1 (ko) * 2003-03-21 2006-01-26 한국생명공학연구원 베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물
WO2004087733A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 New York University Prevention and treatment of alzheimer amyloid deposition
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
CA2530927A1 (en) 2003-06-30 2005-01-06 Tel Aviv University Future Technology Development L.P. Peptides antibodies directed thereagainst and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
WO2005014041A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1682171A4 (en) * 2003-11-07 2008-02-27 Univ Rochester COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL ILLNESSES
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
PT2336147E (pt) * 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
US20050225165A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Naik Sanjeev M Brake by-wire control system
WO2005102385A1 (en) 2004-04-26 2005-11-03 Innate Pharma Adjuvant composition and methods for its use
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
KR101347105B1 (ko) * 2004-06-25 2014-01-02 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 신경계 장애의 예방을 위한 조성물 및 방법
US7955812B2 (en) 2004-07-19 2011-06-07 The General Hospital Corporation Methods of diagnosing alzheimer's disease by detecting antibodies to cross-linked β-amyloid oligomers
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
CN101080421A (zh) 2004-08-11 2007-11-28 三菱化学株式会社 抗体以及其利用
ZA200703561B (en) * 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
WO2006044666A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Northeastern University Detection of disease associated proteolysis by direct mass spectrometry analysis of low molecular weight peptides
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
TW200635608A (en) * 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
CA2593846A1 (en) * 2005-01-14 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting drusen formation and for diagnosing or treating drusen-related disorders
CA2589860A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
JP2008528638A (ja) * 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
CA2605957A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dnavec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating alzheimer's disease
JP4903159B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 ディナベック株式会社 アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
MY148086A (en) * 2005-04-29 2013-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
WO2006119352A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 University Of South Florida Method of treating cognitive decline and synaptic loss related to alzheimer's disease
CA2607868A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
WO2006126682A1 (ja) * 2005-05-27 2006-11-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン
ES2402650T3 (es) * 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
AU2006268293B2 (en) 2005-07-10 2011-03-17 Assia Spe, Llc Adaptive margin and band control
WO2007056401A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of osbp useful for treating alzheimer's disease
EP1963369B1 (en) * 2005-11-28 2013-05-15 Zymogenetics, Inc. Il-21 antagonists
JP2009517406A (ja) * 2005-11-28 2009-04-30 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−２１受容体アンタゴニスト
DK1954718T3 (en) 2005-11-30 2014-12-15 Abbvie Inc Anti-A-globulomer antibodies antigenbindingsgrupper thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods for producing said antibodies,
EP1976877B2 (en) 2005-11-30 2016-10-05 AbbVie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
WO2007067512A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of adprh useful for treating alzheimer's disease
MX358175B (es) * 2005-12-12 2018-08-08 Ac Immune Sa Anticuerpos monoclonales especificos 1-42 beta con propiedades terapeuticas.
TWI382990B (zh) 2005-12-12 2013-01-21 Hoffmann La Roche 可變區域抗體之糖化
CA2638775A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-30 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Peptide vaccine for inducing production of anti-amyloid-.beta.-peptide antibody
ATE492561T1 (de) 2006-03-23 2011-01-15 Bioartic Neuroscience Ab Verbesserte protofibrilselektive antikörper und deren verwendung
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US7479550B2 (en) 2006-06-02 2009-01-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Amyloid β gene vaccines
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
WO2008021296A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Thymon, L.L.C. Compositions and methods for the treatment and prophylaxis of alzheimer's disease
MX2009003542A (es) * 2006-10-12 2009-04-15 Wyeth Corp Metodos y composiciones con opalescencia reducida.
US8188046B2 (en) * 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20080214987A1 (en) 2006-12-22 2008-09-04 Nanomed Devices, Inc. Microdevice And Method For Transdermal Delivery And Sampling Of Active Substances
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
KR101735257B1 (ko) 2007-01-05 2017-05-12 유니버시티 오브 취리히 질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
DK2104682T3 (en) 2007-01-11 2017-01-16 Michael Bacher DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S AND OTHER DEMENTIA DISEASES
ES2535641T3 (es) 2007-01-18 2015-05-13 Eli Lilly & Company Amiloide beta Fab pegilado
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2583978B1 (en) 2007-02-23 2016-04-06 Prothena Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
NZ579310A (en) 2007-03-01 2012-03-30 Probiodrug Ag Use of glutaminyl cyclase inhibitors for the treatment of mild cognitive impairment and diagnostic purposes thereof
EP2142514B1 (en) 2007-04-18 2014-12-24 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
JP2011526240A (ja) * 2007-04-18 2011-10-06 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 脳アミロイド血管症の予防および治療
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2012122A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
JP2010528583A (ja) * 2007-06-11 2010-08-26 エーシー イミューン ソシエテ アノニム アミロイドβに対するヒト化抗体
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
EP2170389B1 (en) * 2007-06-12 2014-10-29 AC Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
ES2466916T3 (es) 2007-06-27 2014-06-11 Admune Therapeutics Llc Complejos de IL-15 e IL-15R alfa y usos de los mismos
AU2008303023B2 (en) 2007-09-27 2014-01-09 Immunovaccine Technologies Inc. Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo
EP2205631B1 (en) * 2007-10-05 2016-11-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosis and treatment of amyloidosis
SG178809A1 (en) * 2007-10-05 2012-03-29 Genentech Inc Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
CA2701793C (en) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
WO2009057664A1 (ja) * 2007-10-29 2009-05-07 Mitsubishi Chemical Corporation 抗体及びその利用
CA2707026C (en) * 2007-12-07 2017-04-11 Zymogenetics, Inc. Anti-human il-21 monoclonal antibodies
EP2261254A3 (en) 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
WO2009090650A2 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Vaccine for alzheimer's disease
US20110070298A1 (en) * 2008-06-05 2011-03-24 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions Comprising Liposomes, An Antigen, A Polynucleotide and A Carrier Comprising a Continuous Phase of a Hydrophobic Substance
JP5699081B2 (ja) * 2008-09-05 2015-04-08 アイ ディー バイオメディカル コーポレーション オブ ケベック 新規の組成物及びアジュバント
US20110263450A1 (en) * 2008-09-26 2011-10-27 The University Of Melbourne Alzheimer's disease biomarkers
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
CN102272301A (zh) * 2008-10-31 2011-12-07 生物载体株式会社 用于治疗阿尔茨海默病的载体
RU2478396C2 (ru) 2008-11-05 2013-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО β-ГЕМОЛИТИЧЕСКИМИ СТРЕПТОКОККАМИ (БГС)
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
US8614297B2 (en) * 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
AU2010221418B2 (en) 2009-03-02 2015-06-04 Dignity Health Diagnostic devices and methods of use
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
JP5883384B2 (ja) 2009-08-13 2016-03-15 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 免疫機能を調節する方法
CA2772488C (en) 2009-09-11 2018-04-17 Probiodrug Ag Heterocyclic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US9757398B2 (en) 2010-02-20 2017-09-12 Euroespes Biotecnnologia, S.L. Prevention and treatment of alzheimer's disease by amyloid beta peptide and sphin-gosine-1-phosphate
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
SG183854A1 (en) * 2010-03-03 2012-10-30 Univ British Columbia Oligomer-specific amyloid beta epitope and antibodies
US9181233B2 (en) 2010-03-03 2015-11-10 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
US8269019B2 (en) 2010-03-10 2012-09-18 Probiodrug Ag Inhibitors
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2576617B1 (en) 2010-06-04 2016-04-27 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING Aß OLIGOMERS
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
ES2639035T3 (es) 2010-08-23 2017-10-25 Wyeth Llc Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis
RU2546873C2 (ru) 2010-09-10 2015-04-10 УАЙТ ЭлЭлСи Нелипидизированные варианты антигенов neisseria meningitidis orf2086
CA2817973C (en) 2010-10-15 2019-06-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
AR083561A1 (es) 2010-10-26 2013-03-06 Ac Immune Sa Preparacion de una construccion antigenica
MX2013005413A (es) 2010-11-15 2014-02-27 Univ Ramot Analogos de dipeptidos para el tratamiento de afecciones asociadas con la formacion de fibrillas amiloides.
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
RU2473133C2 (ru) * 2011-03-30 2013-01-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Осетинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития РФ Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных
EP2691393B1 (en) 2011-03-31 2016-09-14 Pfizer Inc Novel bicyclic pyridinones
BR112013030963B1 (pt) * 2011-06-01 2020-12-01 Xiamen University proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo
WO2012172449A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Pfizer Inc. Lactams as beta secretase inhibitors
PT2723379T (pt) 2011-06-23 2018-11-14 Univ Of Zuerich Moléculas de ligação anti-alfa-sinucleína
WO2013012811A2 (en) 2011-07-19 2013-01-24 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
WO2013013056A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 New York University Method for treating amyloid disease
CN102895659B (zh) * 2011-07-29 2014-10-29 复旦大学 一种防治老年痴呆症复合疫苗及其制备方法
US20150065449A1 (en) 2011-08-12 2015-03-05 Florida State University Research Foundation, Inc. Treating Amyloidoses With A Vitamin B12 Composition Including Melatonin, Resveratrol, and EGCG
US20150065448A1 (en) * 2011-08-12 2015-03-05 The Florida State University Research Foundation Inc. Methods of treating amyloidoses with vitamin b12 and diagnostic test for detecting the presence of amyloid-beta peptides
EP2751116B1 (en) 2011-08-31 2016-10-12 Pfizer Inc Hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
PL2579042T3 (pl) 2011-10-04 2014-12-31 Affiris Ag Sposób wykrywania przeciwciał swoistych wobec Aß w próbce biologicznej
CA2853100A1 (en) * 2011-10-24 2013-05-02 Intellect Neurosciences, Inc. Compositions and methods for treatment of proteinopathies
JP2012102131A (ja) * 2012-01-05 2012-05-31 Elan Pharma Internatl Ltd アミロイド形成性疾患の予防および治療
AU2013229063B2 (en) 2012-03-09 2016-10-06 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
ES2585262T3 (es) 2012-05-04 2016-10-04 Pfizer Inc Compuestos heterocíclicos de hexahidropiran[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina sustituidos como inhibidores de PPA, BACE1 y BACE2
ES2637245T3 (es) 2012-06-29 2017-10-11 Pfizer Inc. Nuevas 4-(amino sustituido)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas como inhibidores de LRRK2
EP2897964A1 (en) 2012-09-20 2015-07-29 Pfizer Inc. Alkyl-substituted hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
UA110688C2 (uk) 2012-09-21 2016-01-25 Пфайзер Інк. Біциклічні піридинони
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
JP6499077B2 (ja) 2012-10-25 2019-04-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アルツハイマー病と関連疾患の治療のための併用療法
US9295393B2 (en) 2012-11-09 2016-03-29 Elwha Llc Embolism deflector
EP2931731A1 (en) 2012-12-11 2015-10-21 Pfizer Inc. Hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds as inhibitors of bace1
WO2014097038A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Pfizer Inc. CARBOCYCLIC- AND HETEROCYCLIC-SUBSTITUTED HEXAHYDROPYRANO[3,4-d][1,3]THIAZIN-2-AMINE COMPOUNDS
AU2014203873A1 (en) 2013-01-07 2015-07-30 Biomedical Research Models, Inc. Therapeutic vaccines for treating herpes simplex virus type 2 infections
EP2956458B1 (en) 2013-02-13 2017-08-09 Pfizer Inc Heteroaryl-substituted hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
US9233981B1 (en) 2013-02-15 2016-01-12 Pfizer Inc. Substituted phenyl hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
PE20151332A1 (es) 2013-02-19 2015-09-20 Pfizer Compuestos de azabencimidazol
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
WO2014159614A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Flow Pharma, Inc. Adjuvant and antigen particle formulation
US9102752B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
EP2787347A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting Aß-specific antibodies in a biological sample
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
EP3027205A4 (en) 2013-07-28 2017-07-19 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
KR20210002757A (ko) 2013-09-08 2021-01-08 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
WO2015049616A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Pfizer Inc. Novel bicyclic pyridinones as gamma-secretase modulators
CN106102737B (zh) 2013-10-22 2019-06-14 综合医院公司 色甘酸衍生物以及成像和治疗的相关方法
WO2015092592A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Pfizer Inc. Novel 3,4-disubstituted-1h-pyrrolo[2,3-b]pyridines and 4,5-disubstituted-7h-pyrrolo[2,3-c]pyridazines as lrrk2 inhibitors
BR112016022519A8 (pt) 2014-04-01 2018-03-06 Pfizer cromeno e 1,1a,2,7b-tetra-hidrociclopropa[c]cromeno piridopirazinadionas como moduladores de gama-secretase
CR20160455A (es) 2014-04-10 2016-12-16 Pfizer 2-AMINO-6-METIL-4,4a,5,6-TETRAHIDROPIRANO[3,4-d][1,3]TIAZIN-8a(8H)-IL-1,3-TIAZOL-4-ILA
DK3137094T3 (da) 2014-04-29 2023-02-27 Advantage Therapeutics Inc Behandling og forebyggelse af alzheimers sygdom (ad)
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015165964A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015165971A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
SI3137093T1 (en) * 2014-04-29 2018-01-31 Affiris Ag Treatment and prevention of Alzheimer's disease
KR101892837B1 (ko) * 2014-06-17 2018-08-28 아카데미아 시니카 B 림프구 상에서 CD23을 가교시키지만 비만 세포는 감작하지 않는 인간화된 항-IgE 항체
JO3537B1 (ar) 2014-07-10 2020-07-05 Bioarctic Neuroscience Ab أجسام مضادة لييفية أولية لاميلويد بيتا الببتيد ab المحسنة
JP6713982B2 (ja) 2014-07-24 2020-06-24 ファイザー・インク ピラゾロピリミジン化合物
KR102061952B1 (ko) 2014-08-06 2020-01-02 화이자 인코포레이티드 이미다조피리다진 화합물
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
KR102000382B1 (ko) 2015-02-03 2019-07-15 화이자 인코포레이티드 신규 시클로프로파벤조푸라닐 피리도피라진디온
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
CA2989456C (en) 2015-06-17 2022-01-04 Pfizer Inc. Tricyclic compounds and their use as phosphodiesterase inhibitors
EP4074730A1 (en) 2015-06-24 2022-10-19 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
CN108137586B (zh) 2015-09-14 2021-04-13 辉瑞大药厂 作为LRRK2抑制剂的新颖咪唑并[4,5-c]喹啉和咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶衍生物
WO2017051303A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Pfizer Inc. Tetrahydropyrano[3,4-d][1,3]oxazin derivatives and their use as bace inhibitors
EP3353174A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 Pfizer Inc N-[2-(3-amino-2,5-dimethyl-1,1-dioxido-5,6-dihydro-2h-1,2,4-thiadiazin-5-yl)-1,3-thiazol-4-yl]amides useful as bace inhibitors
BR112018003489A2 (pt) 2015-09-24 2018-09-25 Pfizer n-[2-(2-amino-6,6-dissubstituído-4,4a,5,6-tetra-hidropirano[3,4-d][1,3]tiazin-8a(8h)-il)-1,3-tiazol-4-il]amidas
NZ741067A (en) 2015-10-02 2023-07-28 Hoffmann La Roche Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3374381A4 (en) * 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia EPITAOPES IN THE CENTRAL REGION OF BETA-AMYLOID AND RELATED CONFORMATIONAL ANTIBODIES
JP7452829B2 (ja) * 2015-11-09 2024-03-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体
EP3374379A4 (en) 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia N-TERMINAL EPITOPES IN BETA-AMYLOID AND CONFORMATIONALLY SELECTIVE ANTIBODIES THEREOF
RU2719599C2 (ru) 2016-02-23 2020-04-21 Пфайзер Инк. Соединения 6, 7-дигидро-5H-пиразоло[5,1-b][1,3]оксазин-2-карбоксамида
JP7046018B2 (ja) 2016-07-01 2022-04-01 ファイザー・インク 神経性疾患および神経変性疾患を処置するための５，７－ジヒドロピロロピリジン誘導体
US20190240194A1 (en) 2016-08-31 2019-08-08 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
IL303108B1 (en) 2017-01-31 2024-03-01 Pfizer NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor
ES2910083T3 (es) 2017-03-10 2022-05-11 Pfizer Derivados de imidazo[4,5-c]quinolina cíclicos sustituidos
JP7219223B2 (ja) 2017-03-10 2023-02-07 ファイザー・インク ＬＲＲＫ２阻害剤としての新規のイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン誘導体
RU2678987C2 (ru) 2017-04-28 2019-02-05 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Пептид для лечения болезни альцгеймера
WO2018226992A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
KR20200013783A (ko) 2017-06-22 2020-02-07 화이자 인코포레이티드 디히드로-피롤로-피리딘 유도체
US11209638B2 (en) * 2017-07-05 2021-12-28 West Virginia University Systems and methods for supporting and positioning body tissue samples in a microscope
CA3070386A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aztherapies, Inc. Powdered formulations of cromolyn sodium and ibuprofen
US11453701B2 (en) 2017-08-18 2022-09-27 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
CA3073066A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
EP4219464A1 (en) 2018-03-23 2023-08-02 Pfizer Inc. Piperazine azaspiro derivaves
JP2021529771A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション クロモリンナトリウムおよびα−ラクトースの粉末製剤
TW202208409A (zh) 2020-05-19 2022-03-01 愛爾蘭商歐薩爾普羅席納有限公司 用於治療阿茲海默症之多抗原決定基疫苗

Family Cites Families (433)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589566A (en) * 1897-09-07 meevten
US6096318A (en) 1973-05-07 2000-08-01 The Ohio State University Antigenically modified HCG polypeptides
JPS57212347A (en) * 1981-06-25 1982-12-27 Nissan Motor Co Ltd Air-fuel ratio control system
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5158769A (en) 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5417986A (en) 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
IT1190383B (it) * 1985-08-01 1988-02-16 Eniricerche Spa Sostanze peptidominetiche ad azione ipotensiva
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4713366A (en) * 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) * 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5278049A (en) * 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) * 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5187153A (en) * 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) * 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US4879213A (en) 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US4818397A (en) * 1986-12-22 1989-04-04 Sundstrand Corporation Shut-off valve seal
DE3702789A1 (de) 1987-01-30 1988-08-18 Bayer Ag Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins
US4912206A (en) * 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
DE3883899T3 (de) * 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5571500A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5571499A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
WO1988010120A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Brigham And Women's Hospital Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
US5645820A (en) * 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5869054A (en) * 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5641474A (en) * 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US4912208A (en) * 1987-06-29 1990-03-27 Abbott Laboratories Fluorophores for encapsulation into liposomes
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US4966753A (en) 1987-08-18 1990-10-30 Molecular Rx, Inc. Immunotherapeutic methods and compositions employing antigens characteristic of malignant neoplasms
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
CA1339014C (en) 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
AU2728588A (en) 1987-10-23 1989-05-23 Genetics Institute Inc. Composition and method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
WO1989006689A1 (en) 1988-01-13 1989-07-27 The Mclean Hospital Corporation Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5098706A (en) * 1988-11-01 1992-03-24 The Regents Of The University Of California Juvenile hormone esterase for insect control
EP0442926A1 (en) 1988-11-10 1991-08-28 Imperial Cancer Research Technology Limited Polypeptides
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5227159A (en) 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
AU5439790A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10
AU5525090A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE69033487T2 (de) 1989-12-20 2000-06-29 Autoimmune Inc Behandlung von autoimmunkrankheiten durch verabreichung von autoantigenen in form von aerosol
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
JPH05508621A (ja) 1990-03-02 1993-12-02 オートイミューン　インク 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患のダウンコントロール
GB9005705D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Health Lab Service Board Particle manipulation
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
EP0451700A1 (en) 1990-04-10 1991-10-16 Miles Inc. Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0527823A1 (en) * 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
DE69126304T2 (de) * 1990-04-27 1997-09-04 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
AU646877B2 (en) * 1990-06-15 1994-03-10 Scios Nova Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
US5914109A (en) * 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
CA2085897A1 (en) 1990-06-19 1991-12-20 George Pieczenik Nonpathogenic variant virus
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
KR970005049B1 (ko) * 1990-07-16 1997-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니벌시티 오브 캘리포니아 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
CA2092823A1 (en) 1990-09-28 1992-03-29 Barry D. Greenberg Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene
EP0553244B8 (en) * 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
AU9023791A (en) 1990-10-15 1992-05-20 Brigham And Women's Hospital Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
GB9023352D0 (en) * 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
ES2335720T3 (es) 1991-01-21 2010-03-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer.
WO1992015330A1 (fr) * 1991-03-01 1992-09-17 Rhône Merieux Procede d'immunoneutralisation anti-lhrh des animaux domestiques males non castres et peptide pour cela
DE4107857A1 (de) * 1991-03-12 1992-09-17 Thomae Gmbh Dr K Cyclische harnstoffderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und verfahren zu ihrer herstellung
US5192753A (en) * 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
CA2086831C (en) 1991-05-08 1999-03-16 Reinhard Gluck Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
US5672805A (en) 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
CA2127450C (en) 1992-01-07 2007-04-17 Samuel Wadsworth Transgenic animal models for alzheimer's disease
US5679348A (en) * 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
AU685047B2 (en) 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
BR9306042A (pt) 1992-02-28 1997-11-18 Autoimmune Inc Método para tratar uma doença auto-immune em um mamifero e formas de dosagens farmacêuticas oral e inalável
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0561087B1 (en) 1992-03-20 1999-08-04 N.V. Innogenetics S.A. Mutated form of the beta-amyloid precursor protein gene
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
GB9209118D0 (en) 1992-04-28 1992-06-10 Sb 120 Amsterdam Bv Vaccine compositions
CA2138137C (en) 1992-06-18 2004-11-09 R. John Collier Diphtheria toxin vaccines
ES2143716T3 (es) * 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
WO1994001772A1 (en) 1992-07-13 1994-01-20 The Children's Medical Center Corporation SCREEN FOR ALZHEIMER'S DISEASE THERAPEUTICS BASED ON β-AMYLOID PRODUCTION
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US6680182B1 (en) 1992-07-31 2004-01-20 Acambis Research Limited Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
BR9306984A (pt) * 1992-08-27 1999-01-12 Deakin Res Ltd Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo
FI96267C (sv) 1992-09-16 1996-06-10 Formit Foodprocessing Ab Oy Vals och maskin för skalning eller formning av potatis och liknande produkter
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
DE69311048T2 (de) * 1992-09-29 1997-12-11 Nippon Telegraph & Telephone Multi/Demultiplexer mit Gitter aus gruppierten Wellenleitern und zurückgefürten optischen Wegen
ATE244769T1 (de) 1992-10-01 2003-07-15 Univ Columbia Komplexe kombinatorische chemische banken, die mit markierungen versehen sind
WO1994009364A1 (en) 1992-10-13 1994-04-28 Duke University Method of inhibiting binding of amyloid precursor protein to beta-amyloid protein
PT1298436E (pt) 1992-10-26 2010-10-21 Lilly Co Eli Métodos para a identificação de compostos inibidores da libertação de péptido beta-amilóide (bap)
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
US5733647A (en) * 1992-11-05 1998-03-31 Polymer Innovations, Inc. Insole
US6210671B1 (en) * 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
ATE237357T1 (de) * 1993-01-22 2003-05-15 Sloan Kettering Inst Cancer Gangliosid-klh-konjugatimastoffe mit qs-21
US5955317A (en) * 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
EP0683234B2 (en) * 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5750106A (en) * 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
US5989565A (en) * 1993-01-29 1999-11-23 University Of Pittsburgh Elution and identification of T cell epitopes from viable cells
US5358708A (en) 1993-01-29 1994-10-25 Schering Corporation Stabilization of protein formulations
US5472693A (en) * 1993-02-16 1995-12-05 The Dow Chemical Company Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies
DE614989T1 (de) * 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
AU692152B2 (en) * 1993-03-17 1998-06-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
DE69433870T2 (de) * 1993-03-18 2005-06-30 Cytimmune Sciences, Inc. Zusammensetzung und methode zur reduktion der toxizität von biologisch-aktiven faktoren
EP0689454B2 (en) * 1993-03-23 2005-02-23 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a
CA2119090A1 (en) * 1993-03-26 1994-09-27 Wayne R. Gombotz Compositions for controlled release of biologically active tgf-.beta.
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
ES2150493T5 (es) 1993-05-25 2004-07-01 Wyeth Holdings Corporation Adyuvantes para vacunas contra el virus sincitico respiratorio.
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
ES2171454T3 (es) 1993-06-04 2002-09-16 Whitehead Biomedical Inst Proteinas de estres y sus usos.
US5464823A (en) * 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
JPH09500540A (ja) 1993-07-30 1997-01-21 メデヴァ ホールディングス ビー．ヴイ． ワクチン組成物
JPH08503490A (ja) 1993-08-18 1996-04-16 モルフォシス・ゲゼルシャフト・フュア・プロタインオプティミールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
WO1995005853A1 (en) 1993-08-26 1995-03-02 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
AU707083B2 (en) 1993-08-26 1999-07-01 Bavarian Nordic Inc. Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign T-cell epitopes
FR2709247B1 (fr) * 1993-08-27 1995-09-29 Martin Jean Raymond Dispositif d'ancrage d'une instrumentation rachidienne sur une vertèbre.
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
ES2236693T3 (es) 1993-09-07 2005-07-16 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos recombinantes contra il4 utiles en el tratamiento de afecciones mediadas por il4.
US5652334A (en) * 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
ES2318848T3 (es) * 1993-09-14 2009-05-01 Pharmexa Inc. Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
US5415584A (en) 1993-09-21 1995-05-16 Tomco2 Equipment Company Particle blast cleaning apparatus
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) * 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
WO1995011311A1 (en) 1993-10-20 1995-04-27 Duke University METHOD OF BINDING MATERIAL TO THE β-AMYLOID PEPTIDE
CA2172507C (en) 1993-10-22 2008-12-02 Jeffrey L. Cleland Methods and compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines
CA2175587A1 (en) 1993-11-02 1995-05-11 Jeffrey H. Sugarman Synthesizing and screening molecular diversity
US5744368A (en) * 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) * 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
JPH09511388A (ja) * 1994-01-27 1997-11-18 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミネソタ 進行性神経疾患を持つヒト以外のトランスジェニック哺乳類
US5877399A (en) * 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
EP0802797A1 (en) * 1994-02-03 1997-10-29 The Picower Institute For Medical Research Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
CN1069667C (zh) 1994-02-28 2001-08-15 住友化学工业株式会社 聚烯烃系树脂组合物及树脂薄膜
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6270757B1 (en) 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
CA2191101C (en) 1994-05-25 2001-08-07 Ellis L. Kline Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5798100A (en) * 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
NZ290089A (en) 1994-07-27 1999-05-28 Queensland Inst Med Res Recombinant polyepitope cytotoxic t lymphocyte (ctl) vaccines
EP0784684B8 (en) 1994-09-16 2008-03-26 Cancer Research Institute of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
DE69508521T2 (de) * 1994-10-14 1999-10-07 Oriental Sangyo Co Ltd Elektrolytische Vorrichtung zur Herstellung von Kohlenstoff-Dioxyd
NL9401735A (nl) * 1994-10-19 1996-06-03 Crown Gear Bv Tandwieloverbrenging van een cilindrisch rondsel met een kroonwiel, het kroonwiel dat toegepast wordt in deze tandwieloverbrenging, een werkwijze volgens welke het kroonwiel gemaakt kan worden alsmede een gereedschap waarmee het kroonwiel gemaakt kan worden.
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
JPH08137927A (ja) * 1994-11-07 1996-05-31 Hitachi Ltd 部品配置配線表示方法
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
AU695129B2 (en) * 1995-02-06 1998-08-06 Genetics Institute, Llc Formulations for IL-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US5854215A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
WO1996028471A1 (en) 1995-03-14 1996-09-19 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
EP0871755A1 (en) * 1995-03-23 1998-10-21 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
ATE274064T1 (de) 1995-05-23 2004-09-15 Morphosys Ag Multimere proteine
WO1996039176A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Brigham & Women's Hospital USE OF ORAL TOLERANCE TO SUPPRESS BOTH Th1 AND Th2 IMMUNE RESPONSES AND TO SUPPRESS ANTIBODY PRODUCTION
US5948763A (en) 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
AU6264996A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Athena Neurosciences, Inc. Method for identifying alzheimer's disease therapeutics usin g transgenic animal models
IT1276680B1 (it) * 1995-06-08 1997-11-03 Oris Spa Processo di sintesi dell'1-piridiniopropan-3-solfonato
US5910427A (en) 1995-06-22 1999-06-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigen non-specific glycosylation inhibiting factor derivatives
US5780361A (en) * 1995-06-23 1998-07-14 Nec Corporation Salicide process for selectively forming a monocobalt disilicide film on a silicon region
PT750907E (pt) * 1995-06-30 2002-08-30 American Cyanamid Co Formulacoes de vacinas estaveis para administracao parenterica metodo para a sua utilizacao e processo para a sua preparacao
EP1637600A1 (en) * 1995-07-07 2006-03-22 Darwin Molecular Corporation Chromosome 1 gene and gene products related to Alzheimer's disease
AUPN443995A0 (en) 1995-07-27 1995-08-17 Csl Limited Papillomavirus polyprotein
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DE69621940T2 (de) 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
US5824322A (en) * 1995-08-21 1998-10-20 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
BR9610580A (pt) 1995-09-14 2000-10-24 Univ California Anticorpos especìficos para prpse nativos
US5664823A (en) * 1995-09-18 1997-09-09 Ford Global Technologies, Inc. Instrument panel brace
US5731284A (en) 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
AU3804995A (en) 1995-10-10 1997-04-30 Novartis Ag Melanoma-associated protein
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
ES2203722T3 (es) 1995-11-10 2004-04-16 Elan Corporation, Plc Peptidos que faccilitan el transporte a traves de tejidos y metodos de identificarlos y usarlos.
WO1997018855A1 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Eduard Naumovich Lerner Device for enhanced delivery of biologically active substances and compounds in an organism
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
ZA97452B (en) 1996-01-25 1997-08-15 Trinity College Dublin Streptococcus equi vaccine.
US5770700A (en) 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
AU1832797A (en) 1996-01-26 1997-08-20 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The A polypeptide from lung extract which binds amyloid-beta peptide
GB9602294D0 (en) * 1996-02-05 1996-04-03 Zeneca Ltd Heterocyclic compounds
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
WO1997032017A1 (en) 1996-02-26 1997-09-04 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Novel method for the identification of nucleic acid sequences encoding two or more interacting (poly)peptides
US6150091A (en) * 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
US5870587A (en) * 1996-03-20 1999-02-09 International Business Machines Corporation Information-handling system, method, and article of manufacture including a mechanism for providing an improved application binary interface
JP4229341B2 (ja) 1996-03-23 2009-02-25 財団法人阪大微生物病研究会 破傷風毒素の機能的フラグメント抗原及び破傷風ワクチン
JP2000507449A (ja) * 1996-03-29 2000-06-20 ユニバーシティ オブ オタゴ パラポックスウイルスベクター
AU713067B2 (en) * 1996-04-03 1999-11-25 Anergen, Inc. Cyclic peptide vaccines for treatment and prevention of diabetes
JP2002506419A (ja) * 1996-04-19 2002-02-26 アメリカ合衆国 Ａ型肝炎ウイルスポリタンパク質の抗原反応性領域
US6284533B1 (en) * 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
EP0938506B1 (en) 1996-07-16 2003-11-05 Plückthun, Andreas, Prof. Dr. Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
JP2000516090A (ja) 1996-07-26 2000-12-05 スローン―ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 遺伝子的免疫化のための方法と試薬
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
CA2183901A1 (en) 1996-08-22 1998-02-23 Johanna E. Bergmann Targets for therapy and diagnosis of alzheimer's disease and down syndrome in humans
DK0929574T3 (da) 1996-08-27 2005-10-31 Praecis Pharm Inc Modulatorer af beta-amyloidpeptidaggregering, som omfatter D-aminosyrer
US6057367A (en) * 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) * 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
US6022859A (en) * 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6218506B1 (en) * 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998039303A1 (en) 1997-03-03 1998-09-11 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Small molecules useful in the treatment of inflammatory disease
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US6611610B1 (en) * 1997-04-02 2003-08-26 Gentex Corporation Vehicle lamp control
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
WO1998044955A1 (en) 1997-04-09 1998-10-15 Mindset Ltd. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, dna encoding and methods of use thereof
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
PL194221B1 (pl) 1997-04-15 2007-05-31 Pharmexa As Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFalfa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, wyizolowana cząsteczka DNA, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, szczepionki przeciwko TNFalfa oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa
US6787319B2 (en) * 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US5858205A (en) * 1997-05-13 1999-01-12 Uop Llc Multizone catalytic reforming process
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
IT1293511B1 (it) 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
WO1999006545A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
DE69840962D1 (de) 1997-08-29 2009-08-20 Antigenics Inc Adjuvant qs-21 enthaltende zusammensetzungen mit polysorbate oder cyclodextrin als hilfsmittel
US6175057B1 (en) 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
JP2002511385A (ja) 1997-12-03 2002-04-16 ニューララブ リミテッド アルツハイマー病におけるβ−アミロイド関連変化を抑制する方法
HUP0004821A2 (hu) 1997-12-03 2001-06-28 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Lágy pellet alakjában lévő gyógyszerkészítmény és előállítása
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
JP2002512776A (ja) * 1998-04-28 2002-05-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫原性の低下したモノクローナル抗体
NO314086B1 (no) 1998-05-08 2003-01-27 Gemvax As Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til
EP1080110A2 (en) 1998-05-19 2001-03-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of activated t cells, nervous system-specific antigens for treating disorders of the nevrous system
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
DE69942274D1 (de) 1998-05-21 2010-06-02 Univ Tennessee Res Foundation Methoden zur amyloidentfernung mit anti-amyloid-antikörper
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6710228B1 (en) * 1998-05-29 2004-03-23 Mycogen Corporation Cotton cells, plants, and seeds genetically engineered to express insecticidal and fungicidal chitin binding proteins (lectins)
US6727349B1 (en) * 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
EA003634B1 (ru) 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
CA2354862A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US7112661B1 (en) 1998-10-30 2006-09-26 The Research Foundation Of State University Of New York Variable heavy chain and variable light chain regions of antibodies to human platelet glycoprotein Ib alpha
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
ES2216509T3 (es) 1999-01-19 2004-10-16 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Procedimiento de envasado para sustancias medicinales sensibles a la oxidacion.
EP1146898A1 (en) 1999-01-22 2001-10-24 Matthew John During Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
US7282570B2 (en) 1999-04-20 2007-10-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
ATE384077T1 (de) 1999-05-05 2008-02-15 Neurochem Int Ltd Stereoselektive antifibrillogene peptide
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
US6582945B1 (en) 1999-06-16 2003-06-24 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of β-amyloid levels in vivo
JP2003503083A (ja) 1999-07-01 2003-01-28 サイオス，インコーポレーテッド アミロイド関連疾患の予防及び治療
WO2001005355A2 (en) 1999-07-15 2001-01-25 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-11
ATE445639T1 (de) 1999-08-04 2009-10-15 Univ Southern California Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
IL142948A0 (en) 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
AU784312B2 (en) 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
IL149976A0 (en) 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
US6399314B1 (en) * 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
EP1259251B1 (en) 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CA2400838C (en) * 2000-02-21 2013-04-23 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CZ306683B6 (cs) 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci
US6294221B1 (en) * 2000-03-08 2001-09-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for spray-coating with frequent changes between aqueous and non-aqueous coating agents inside a spray-coating chamber
US6548840B1 (en) * 2000-04-03 2003-04-15 Hrl Laboratories, Llc Monolithic temperature compensation scheme for field effect transistor integrated circuits
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
AU5162201A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Corixa Corporation Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21
DE60108111T2 (de) * 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US7199102B2 (en) * 2000-08-24 2007-04-03 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides synergize statin activity
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
DK1317479T3 (da) 2000-09-06 2009-11-23 Aventis Pharma Sa Fremgangsmåder og sammensætninger for sygdomme, der er associeret med amyloidosis
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
WO2002064084A2 (en) 2000-11-02 2002-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostic detection and imaging of a neurodegenerative disease
PT1346041E (pt) * 2000-11-27 2007-06-05 Praecis Pharm Inc Agentes terapêuticos e métodos para a sua utilização no tratamento de uma doença amiloidogénica.
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
WO2002060920A2 (en) * 2000-12-27 2002-08-08 Board Of Regents, University Of Texas System Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
US20020160394A1 (en) * 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
DE60121729T2 (de) * 2001-04-19 2007-11-29 Dr. Hermann Schätzl Prion Proteindimere für Impfungen
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
US6524624B1 (en) * 2001-05-16 2003-02-25 Alcide Corporation Two-part disinfecting systems and compositions and methods related thereto
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
US6888849B2 (en) * 2001-06-15 2005-05-03 Lucent Technologies Inc. Method for evaluating capacity utilization of a terminus in a communication system
AU2002345843A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
JP4317010B2 (ja) 2001-07-25 2009-08-19 ピーディーエル バイオファーマ，インコーポレイティド ＩｇＧ抗体の安定な凍結乾燥医薬製剤
US20030135035A1 (en) 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
CA2452104A1 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
US20040192898A1 (en) 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
EP1519740A4 (en) 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
EP1435774B1 (en) 2001-09-10 2010-08-25 AntiCancer, Inc. Enhanced resolution of tumor metastasis
US6736142B2 (en) * 2001-09-13 2004-05-18 Gines Sanchez Gomez Protective tube and harness
US6907297B2 (en) 2001-09-28 2005-06-14 Ethicon, Inc. Expandable intracardiac return electrode and method of use
US6597198B2 (en) * 2001-10-05 2003-07-22 Intel Corporation Current mode bidirectional port with data channel used for synchronization
GB0124446D0 (en) * 2001-10-11 2001-12-05 Short Brothers Ltd Aircraft propulsive power unit
US7781413B2 (en) 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
WO2003039485A2 (en) 2001-11-08 2003-05-15 Protein Design Labs Stable liquid pharmaceutical formulation of igg antibodies
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
WO2003051374A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 New York State Office Of Mental Health SEQUESTRATION OF Aβ IN THE PERIPHERY IN THE ABSENCE OF IMMUNOMODULATING AGENT AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF BETA-AMYLOID RELATED DISEASES
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US6688651B2 (en) * 2002-02-21 2004-02-10 Dmt Co., Ltd. Device for locking cap nut for coupling
EP1476120B1 (en) 2002-02-21 2010-09-29 Duke University Treatment methods using anti-cd22 antibodies
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2390700C (en) * 2002-06-11 2004-09-07 Henry Tsang Illuminated soap bar with sound
GB0213437D0 (en) 2002-06-12 2002-07-24 Univ Cranfield Temporary tattoos: A novel vehicle for skin testing
US6892535B2 (en) * 2002-06-14 2005-05-17 Volvo Construction Equipment Holding Sweden Ab Hydraulic circuit for boom cylinder combination having float function
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
SI1524994T1 (sl) 2002-07-19 2011-08-31 Cytos Biotechnology Ag Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe
WO2004013172A2 (en) 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
JP2006508072A (ja) 2002-10-01 2006-03-09 ノースウエスタン ユニバーシティ アミロイドベータ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）、ＡＤＤＬ代替物、ＡＤＤＬ結合性分子、およびそれらの使用
US20040080762A1 (en) * 2002-10-25 2004-04-29 Xerox Corporation Half-tone based enhancement of black
US20060019850A1 (en) * 2002-10-31 2006-01-26 Korzenski Michael B Removal of particle contamination on a patterned silicon/silicon dioxide using dense fluid/chemical formulations
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
WO2004055164A2 (en) 2002-12-13 2004-07-01 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
US6787129B1 (en) 2003-01-13 2004-09-07 Zenitech Llc Castor polyester as gloss agents in anionic systems
CN1745175A (zh) 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
ES2344645T3 (es) 2003-02-10 2010-09-02 Applied Molecular Evolution, Inc. Moleculas de union al abeta.
AU2004229335C1 (en) 2003-04-04 2010-06-17 Genentech, Inc. High concentration antibody and protein formulations
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2005002444A1 (en) 2003-07-07 2005-01-13 Agency For Science, Technology And Research Method and apparatus for extracting third ventricle information
WO2005014041A2 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US20060233788A1 (en) 2003-09-05 2006-10-19 Heiman Mark L Anti-ghrelin antibodies
CA2445743A1 (en) 2003-10-08 2005-04-08 The University Of British Columbia Methods for modulating neuronal responses
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
PT2336147E (pt) 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
SG182163A1 (en) 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
US20050214222A1 (en) 2004-02-13 2005-09-29 Mckinnon Stuart J In vivo imaging of amyloid plaques in glaucoma using intravenous injectable dyes
DK2653465T3 (da) 2004-03-15 2016-08-22 Janssen Pharmaceutica Nv Opioid-receptormodulatorer
AU2005270026A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of thioflavin radiolabeled derivatives in amyloid imaging for assessing anti-amyloid therapies
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US7328838B2 (en) * 2004-09-09 2008-02-12 Igt Counterfeit cashless instrument detection methods and systems
CN101035564A (zh) 2004-09-10 2007-09-12 惠氏公司 人源化的抗5t4抗体和抗5t4抗体/加利车霉素缀合物
ZA200703561B (en) 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
US20060160161A1 (en) 2004-10-26 2006-07-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
US20060026911A1 (en) * 2004-11-18 2006-02-09 Sutton Adam F Footer track with moisture vent
WO2006066118A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Contextual fear test for predicting efficacy of alzheimer immunotherapeutic treatment
TW200635608A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
WO2006066233A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited An immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
US7625560B2 (en) 2004-12-15 2009-12-01 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
JP2008528638A (ja) 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
CA2607868A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
ES2402650T3 (es) 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
WO2007011833A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Merck & Co., Inc. Spiropiperidine beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease
EP1951750A4 (en) 2005-11-10 2009-12-09 Roskamp Res Llc MODULATION OF THE ANGIOGENESIS BY A-BETA PEPTIDE FRAGMENTS
EA015654B9 (ru) 2006-03-30 2012-01-30 Глаксо Груп Лимитед Антитела против бета-амилоидного пептида
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
WO2010044803A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2008011348A2 (en) 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
JP2010521651A (ja) 2007-03-12 2010-06-24 独立行政法人放射線医学総合研究所 脳内のアミロイド関連神経炎症の画像化
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
JP2011526240A (ja) 2007-04-18 2011-10-06 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 脳アミロイド血管症の予防および治療
WO2011133919A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Janssen Alzheimer Immunotherapy Use of tau to monitor immunotherapy
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
PT2237803E (pt) 2007-12-28 2015-10-16 Prothena Biosciences Ltd Tratamento e profilaxia da amiloidose
TR201816335T4 (tr) 2008-09-18 2018-11-21 Cedars Sinai Medical Center Alzheimer hastalığının tespitine yönelik optik yöntem.
US20130084245A1 (en) 2010-02-25 2013-04-04 Wyeth Llc Pet monitoring of a-beta-directed immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999027944A9 (en) 1999-09-23
ES2310017T3 (es) 2008-12-16
ES2262460T1 (es) 2006-12-01
US20090191231A1 (en) 2009-07-30
KR100936419B1 (ko) 2010-01-12
EE200000379A (et) 2001-04-16
ATE435659T1 (de) 2009-07-15
JP4677334B2 (ja) 2011-04-27
US20040228865A1 (en) 2004-11-18
JP4677094B2 (ja) 2011-04-27
EE05377B1 (et) 2011-02-15
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