ES2356994T3 - Prevención y tratamiento de enfermedad amiloidogénica. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo para A y un vehículo o diluyente no tóxico farmacéuticamente aceptable para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente, en la que el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana.

Description

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere a los campos técnicos de inmunología y medicina.

ANTECEDENTES 5

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva que da como resultado demencia senil. Véanse generalmente Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et al., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995). En líneas generales, la enfermedad cae dentro de dos categorías: comienzo tardío, que se produce en ancianos (65 o más años de edad) y comienzo temprano, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, 10 entre los 35 y los 60 años de edad. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma, pero las anomalías tienden a ser más graves y extendidas en los casos que comienzan en una edad más temprana. La enfermedad está caracterizada por dos tipos de lesiones en el cerebro, placas seniles y ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son zonas de neurópilos desorganizados de hasta 150 µm de ancho con depósitos amiloides extracelulares en el centro visibles mediante análisis microscópico de cortes de tejido cerebral. Los ovillos neurofibrilares son depósitos 15 intracelulares de la proteína tau que consiste en dos filamentos enrollados uno alrededor del otro en pares.

El constituyente principal de las placas es un péptido denominado péptido Aβ o β-amiloide. El péptido Aβ es un fragmento interno de 39-43 aminoácidos de una proteína precursora denominada proteína precursora de amiloide (APP). Varias mutaciones dentro de la proteína APP se han correlacionado con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Véanse, por ejemplo, Goate et al., Nature 349, 704 (1991) (de valina717 a isoleucina); Chartier Harlan et 20 al. Nature 353, 844 (1991)) (de valina717 a glicina); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (de valina717 a fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (una mutación doble que cambia de lisina595-metionina596 a asparagina595-leucina596). Se cree que tales mutaciones producen la enfermedad de Alzheimer aumentando o alterando el procesamiento de APP en Aβ, particularmente el procesamiento de APP a cantidades crecientes de la forma larga de Aβ (es decir, Aβ1-42 y Aβ1-43). Se cree que las mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, 25 PS1 y PS2, afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades crecientes de la forma larga Aβ (véase Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Estas observaciones indican que Aβ, y particularmente su forma larga, es un elemento causante de la enfermedad de Alzheimer.

El documento EP-A-0683234 describe anticuerpos que tienen especificidad de unión para el amiloide . La combinación de estos anticuerpos proporciona un método de ensayo por el que el amiloide  se puede determinar 30 específicamente con una alta sensibilidad. Este método es útil para diagnosticar enfermedades en las que participa el amiloide  o un derivado del mismo, tal como la enfermedad de Alzheimer y los anticuerpos son útiles para desarrollar agentes preventivos o terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer.

McMichael, documento EP 526.511, propone la administración de dosificaciones homeopáticas (inferiores a o iguales a 10-2 mg/día) de Aβ a pacientes con EA establecida previamente. En un ser humano típico con 35 aproximadamente 5 litros de plasma, podría esperarse que incluso el límite superior de esta dosificación generase una concentración no superior a 2 pg/ml. La concentración normal de Aβ en el plasma humano normalmente está en el intervalo de 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)). Dado que la dosificación propuesta del documento EP 526.511 apenas alteraría el nivel de Aβ circulante endógeno y dado que el documento EP 526.511 no recomienda el uso de un adyuvante, no parece plausible que pudiera resultar ningún beneficio terapéutico. 40

En contraposición, la presente invención se refiere al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de otras enfermedades amiloidogénicas mediante la administración de un anticuerpo para Aβ a un paciente en condiciones que generen una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. La invención cumple así una necesidad que viene de antiguo de regímenes terapéuticos para evitar o mejorar la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA 45

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo para Aβ y un vehículo o diluyente no tóxico farmacéuticamente aceptable, para el uso en métodos de prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente, donde el isotipo del anticuerpo es IgG2 humana. Tales métodos incluyen inducir una respuesta inmunitaria contra un componente peptídico de un depósito amiloide en el paciente mediante la administración de un anticuerpo que tiene el isotipo de IgG1 humana. 50 En algunos pacientes, el depósito amiloide es el péptido Aβ agregado y la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. En algunos métodos, el paciente es asintomático. En algunos métodos, el paciente es menor de 50 años de edad. En algunos métodos, el paciente tiene factores de riesgo heredados que indican propensión a la enfermedad de Alzheimer. Tales factores de riesgo incluyen alelos variantes en el gen de la presenilina PS1 o PS2 y formas variantes de APP. En algunos métodos, el paciente no tiene factores de riesgo conocidos para la enfermedad 55 de Alzheimer.

En algunos métodos, la respuesta inmunitaria se dirige al péptido Aβ agregado sin dirigirse al péptido Aβ disociado. Por ejemplo, los anticuerpos se unen al péptido Aβ agregado sin unirse al péptido Aβ disociado. La respuesta inmunitaria se induce por la administración de un anticuerpo para Aβ al paciente.

El anticuerpo normalmente se administra por vía oral, intranasal, intradérmica, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa. En algunos métodos, el paciente se controla tras la administración para evaluar la respuesta 5 inmunitaria. Si el control indica una reducción de la respuesta inmunitaria a lo largo del tiempo, puede administrarse al paciente una o más dosis adicionales del anticuerpo.

Un método in vitro de control de la enfermedad de Alzheimer o propensión a la misma en un paciente comprende detectar un anticuerpo que se une específicamente al péptido Aβ en una muestra del paciente, donde al paciente se le ha administrado una composición farmacéutica de acuerdo con el primer aspecto eficaz para tratar o 10 evitar la enfermedad de Alzheimer, y el nivel del anticuerpo detectado determina el régimen de tratamiento futuro del paciente.

Un método in vivo de evaluación de la eficacia de un procedimiento de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer en un paciente comprende determinar un valor para una cantidad de anticuerpo específico para el péptido Aβ en una muestra de tejido de un paciente que se ha tratado con una composición farmacéutica de acuerdo con el 15 primer aspecto. El valor se compara con un valor control determinado a partir de una población de pacientes que experimentan mejoría de, o ausencia de, síntomas de la enfermedad de Alzheimer debido al tratamiento con el anticuerpo del primer aspecto. Un valor en el paciente al menos igual al valor control indica una respuesta positiva al tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 20

Figura 1: Título de anticuerpos tras la inyección a ratones transgénicos con Aβ1-42.

Figura 2: Carga de amiloide en el hipocampo. Se determinó el porcentaje de la zona de la región del hipocampo ocupada por placas amiloides, definido mediante la reactividad con el mAβ 3D6 específico para Aβ, mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Se muestran los valores para los ratones individuales clasificados por grupo de tratamiento. 25 La línea horizontal para cada agrupación indica el valor de mediana de la distribución.

Figura 3: Distrofia neurítica en el hipocampo. Se determinó el porcentaje de la zona de la región del hipocampo ocupada por neuritas distróficas, definido por su reactividad con el mAβ 8E5 específico para la APP humana mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Se muestran los valores para los ratones individuales para el grupo tratado con AN1792 y el 30 grupo control tratado con PBS. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor de mediana de la distribución.

Figura 4: Astrocitosis en la corteza retroesplenial. Se determinó el porcentaje de la zona de la región cortical ocupada por astrocitos positivos para la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) mediante el análisis de imágenes cuantitativo asistido por ordenador de cortes de cerebro inmunorreactivo. Los valores para los 35 ratones individuales se muestran clasificados por grupo de tratamiento y los valores de mediana de los grupos se indican mediante líneas horizontales.

Figura 5: Títulos de anticuerpos en media geométrica frente a Aβ1-42 tras inmunización con un intervalo de ocho dosis de AN1792 que contienen 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 ó 300 µg.

Figura 6: Cinéticas de respuesta de anticuerpos frente a inmunización con AN1792. Los títulos se expresan 40 como las medias geométricas de los valores para los 6 animales en cada grupo.

Figura 7: Análisis de imágenes cuantitativo de la carga de amiloide cortical en ratones tratados con PBS y AN1792.

Figura 8: Análisis de imágenes cuantitativo de la carga de placas neuríticas en ratones tratados con PBS y AN1792. 45

Figura 9: Análisis de imágenes cuantitativo del porcentaje de la corteza retroesplenial ocupada por astrocitosis en ratones tratados con PBS y AN1792.

Figura 10: Ensayo de proliferación de linfocitos en células de bazo de tratados con AN1792 (panel superior) o tratados con PBS (panel inferior)).

Figura 11: Niveles totales de Aβ en la corteza. Un diagrama de dispersión de perfiles individuales de Aβ en 50 ratones inmunizados con derivados de APP o Aβ combinados con adyuvante de Freund.

Figura 12: Se determinó la carga de amiloide en la corteza mediante análisis de imágenes cuantitativo de cortes de cerebro inmunorreactivo para ratones inmunizados con los conjugados Aβ1-5, Aβ1-12, y Aβ13-28

del péptido Aβ; el grupo control tratado con PBS y con los agregados de Aβ de longitud completa AN1792 (Aβ1-42) y AN1528 (Aβ1-40).

Figura 13: Títulos en media geométrica del anticuerpo específico para Aβ para grupos de ratones inmunizados con derivados de APP o Aβ combinados con adyuvante de Freund.

Figura 14: Títulos en media geométrica del anticuerpo específico para Aβ para grupos de cobayas 5 inmunizados con AN1792, o un derivado palmitoilado del mismo, combinado con diversos adyuvantes.

Figuras 15: Niveles de Aβ en la corteza de ratones PDAPP de 12 meses de edad tratados con AN1792 o AN1528 con diferentes adyuvantes.

DEFINICIONES

La expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas 10 óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan valores de hueco por defecto, comparten al menos una identidad de secuencia del 65 por ciento, preferiblemente al menos una identidad de secuencia del 80 o el 90 por ciento, más preferiblemente al menos una identidad de secuencia del 95 por ciento o más (por ejemplo, una identidad de secuencia del 99 por ciento o superior). Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. 15

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de prueba y de referencia, se diseñan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces la identidad de secuencia en porcentaje para la(s) secuencias(s) de prueba con 20 respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros diseñados del programa.

La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante 25 implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de programa Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente Ausubel et al., citado anteriormente). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el tanto por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo de BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa para realizar los análisis de BLAST está 30 públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). Normalmente, pueden usarse los parámetros del programa por defecto para realizar la comparación de las secuencias, aunque también pueden usarse parámetros personalizados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)). 35

Para el fin de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan tal como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican 40 sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Los agentes terapéuticos de la invención normalmente son sustancialmente puros. Esto significa que un agente normalmente tiene al menos aproximadamente el 50% p/p (peso/peso) de pureza, así como que está sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieren. En ocasiones los agentes tienen al menos 45 aproximadamente el 80% p/p y, más preferiblemente al menos el 90% p/p o aproximadamente el 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando técnicas convencionales de purificación de proteínas pueden obtenerse péptidos homogéneos de al menos el 99% p/p.

La unión específica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M-1 o 1010 M-1. Se prefieren las afinidades mayores que 108 M-1. 50

El término “anticuerpo” se usa para incluir anticuerpos intactos. Opcionalmente, los anticuerpos pueden estar químicamente conjugados a, o expresarse como, proteínas de fusión con otras proteínas.

APP695, APP751 y APP770 se refieren, respectivamente, a los polipéptidos largos de 695, 751 y 770 residuos de aminoácidos codificados por el gen de la APP humana. Véanse Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); y Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). A los aminoácidos dentro de la proteína 55 precursora de amiloide (APP) humana se les asignan números según la secuencia de la isoforma APP770. Los

términos tales como Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 y Aβ43 se refieren a un péptido Aβ que contiene 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 y 1-43 residuos de aminoácidos.

El término “epítopo” o “determinante antigénico” se refiere a un sitio en un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos para las células B pueden estar formados por aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de 5 aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden con el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Normalmente un epítopo incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 ó 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos de determinación de la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. 10 Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Las células T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Las células T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante 15 ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, tal como se determina mediante la incorporación de 3H-timidina por las células T cebadas en respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante la eliminación dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) o mediante la secreción de citocinas.

La expresión respuesta “inmunológica” o “inmunitaria” es el desarrollo de una respuesta beneficiosa 20 humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por células T específicas de antígeno o por sus productos de secreción) dirigida frente a un péptido amiloide en un paciente receptor. Una respuesta de este tipo puede ser una respuesta activa inducida mediante la administración de inmunógenos o una respuesta pasiva inducida mediante la administración de anticuerpos o células T cebadas. Una respuesta inmunitaria celular está provocada por la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas del CMH de Clase I o de Clase II para 25 activar a las células T cooperadoras CD4+ específicas de antígeno y/o a las células T citotóxicas CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de la microglía, eosinófilos u otros componentes de inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante ensayos de proliferación (células T CD4+) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos) (véanse Burke, citado anteriormente; Tigges, citado anteriormente). Las 30 contribuciones relativas de las respuestas humoral y celular al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno pueden distinguirse aislando separadamente IgG y células T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Un “agente inmunogénico” o “inmunógeno” puede inducir una respuesta inmunológica frente a sí mismo con la administración a un paciente, opcionalmente junto con un adyuvante. 35

La expresión “polinucleótido desnudo” se refiere a un polinucleótido no complejado con materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos se clonan a veces en un vector de plásmido.

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmunitaria al antígeno, pero que cuando se administra sólo no genera una respuesta inmunitaria al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen el 40 reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos.

El término “paciente” incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o bien terapéutico.

Aβ disgregado o monomérico significa unidades peptídicas monoméricas solubles de Aβ. Un procedimiento para preparar Aβ monomérico es disolver el péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La solución resultante 45 se centrifuga para eliminar cualquier material particulado no soluble. El Aβ agregado es una mezcla de oligómeros en los que las unidades monoméricas se mantienen juntas mediante enlaces no covalentes.

Las composiciones o los procedimientos “que comprenden” uno o más de los elementos nombrados pueden incluir otros elementos no nombrados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende el péptido Aβ engloba un péptido Aβ aislado y un péptido Aβ como componente de una secuencia polipeptídica más 50 grande.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. General

La invención proporciona composiciones farmacéuticas para el uso en métodos para el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades caracterizadas por la acumulación de depósitos amiloides. Los depósitos 55 amiloides comprenden un péptido agregado a una masa insoluble. La naturaleza del péptido varía en las diferentes enfermedades, pero en la mayoría de los casos, el agregado tiene una estructura en lámina β plegada y se tiñe con

colorante rojo Congo. Las enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA), de comienzo tardío y temprano. En ambas enfermedades, el depósito amiloide comprende un péptido denominado Aβ, que se acumula en el cerebro de los individuos afectados. Los ejemplos de algunas de otras enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides son amiloidosis por SAA, síndrome islándico hereditario, mieloma múltiple y encefalopatías espongiformes, incluyendo la enfermedad de las vacas locas, la enfermedad de 5 Creutzfeldt Jakob, encefalopatía espongiforme ovina y encefalopatía epongiforme del visón (véanse Weissmann et al., Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits et al., Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997); Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 145, 959-969 (1997)). Los péptidos que forman los agregados en esas enfermedades son amiloide sérico A, cistatina C, cadena ligera kappa de la IgG, respectivamente para las tres primeras, y proteína priónica para las otras. 10

II. Agentes terapéuticos

1. Enfermedad de Alzheimer

Los agentes terapéuticos para su uso en la presente invención inducen una respuesta inmunitaria frente al péptido Aβ. Estos agentes son anticuerpos IgG1 humanos reactivos con péptido Aβ. La inducción de una respuesta inmunitaria es pasiva cuando se administra un anticuerpo que se une por sí mismo a Aβ en un paciente. 15

Aβ, también conocido como péptido β-amiloide, o péptido A4 (véanse el documento US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), es un péptido de 39-43 aminoácidos, que es el principal componente de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. Aβ se genera mediante el procesamiento de una proteína más grande, APP, mediante dos enzimas denominadas β y γ-secretasas (véase Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Se producen mutaciones conocidas en APP asociadas con la enfermedad de 20 Alzheimer próximas al sitio de β o γ-secretasa, o dentro de Aβ. Por ejemplo, la posición 717 está próxima al sitio de escisión de γ-secretasa de APP en su procesamiento a Aβ, y las posiciones 670/671 están próximas al sitio de escisión de β-secretasa. Se cree que las mutaciones producen la enfermedad EA mediante la interacción con reacciones de escisión mediante las cuales se forma Aβ, de modo que se aumenta la cantidad de la forma de 42/43 aminoácidos del Aβ generado. 25

Aβ tiene la propiedad inusual de que puede fijarse y activar las cascadas del complemento clásica y alternativa. En particular, se une a Clq y en última instancia a C3bi. Esta asociación facilita la unión a macrófagos, lo que conduce a la activación de las células B. Además, C3bi se rompe adicionalmente y entonces se une a CR2 en las células B de una manera dependiente de células T, lo que conduce a un aumento de 10.000 en la activación de estas células. Este mecanismo hace que Aβ genere una respuesta inmunitaria en exceso de la de otros antígenos. 30

El anticuerpo de la invención se puede unir a cualquiera de las formas de origen natural del péptido Aβ y particularmente las formas humanas (es decir, Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 o Aβ43). Las secuencias de estos péptidos y su relación con el precursor APP se ilustran mediante la figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, Aβ42 tiene la secuencia: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH. 35

Aβ41, Aβ40 y Aβ39 difieren de Aβ42 por la omisión de Ala, Ala-Ile y Ala-Ile-Val, respectivamente, del extremo C-terminal. Aβ43 difiere de Aβ42 por la presencia de un residuo de treonina en el extremo C-terminal.

Los péptidos de Aβ pueden sintetizarse mediante síntesis de péptidos en fase sólida o expresión recombinante, o pueden obtenerse de fuentes naturales. Los sintetizadores de péptidos automáticos están disponibles comercialmente de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La 40 expresión recombinante puede ser en bacterias, tales como E. coli, levaduras, células de insectos o células de mamíferos. Los procedimientos para la expresión recombinante se describen por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2ª ed., 1989). Algunas formas del péptido Aβ también están disponibles comercialmente (por ejemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA y California Peptide Research, Inc. Napa, CA). 45

Los agentes terapéuticos de la invención incluyen anticuerpos IgG1 humanos que se unen específicamente a A. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Algunos de tales anticuerpos se unen específicamente a la forma agregada de A sin unirse a la forma disociada. Algunos se unen específicamente a la forma disociada sin unirse a la forma agregada. Algunos se unen a las formas tanto agregadas como disociadas. La producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murinos o de rata, se puede conseguir, por 50 ejemplo, inmunizando el animal con A. Véase Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Tal inmunógeno se puede obtener a partir de una fuente natural, mediante síntesis de péptidos o mediante expresión recombinante.

Las formas humanizadas de anticuerpos de ratón se pueden generar uniendo las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de ADN recombinante. Véase Queen et 55 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) y documento WO 90/07861.

Los anticuerpos humanos se pueden obtener usando métodos de presentación en fago. Véase, por

ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271; McCafferty et al., documento WO 92/01047. En estos métodos se producen bibliotecas de fagos en los que los miembros presentan diferentes anticuerpos sobre sus superficies externas. Los anticuerpos se presentan habitualmente como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos que presentan fagos con una especificidad deseada se seleccionan mediante enriquecimiento de afinidad para A o fragmentos del mismo. Los anticuerpos humanos frente a A también se pueden producir a partir de mamíferos transgénicos no 5 humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de la inmunoglobulina humana y un locus de inmunoglobulina endógeno inactivado. Véase, por ejemplo, Lonberg et al., documento 93/12227 (1993); Kucherlapati, documento WO 91/10741 (1991). Los anticuerpos humanos se pueden seleccionar mediante experimentos de unión competitiva, o de otro modo, para tener la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular. Tales anticuerpos probablemente comparten de forma particular las propiedades funcionales 10 útiles de los anticuerpos de ratón. Los anticuerpos policlonales humanos también se pueden proporcionar en forma de suero de seres humanos inmunizados con un agente inmunógeno. Opcionalmente, tales anticuerpos policlonales se pueden concentrar mediante purificación por afinidad usando A u otro péptido amiloide como un reactivo de afinidad.

Los anticuerpos humanos o humanizados se pueden diseñar para tener una región constante de IgG, IgD, 15 IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos se pueden expresar como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab’ F(ab’)2 y Fv o como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos entre sí mediante un espaciador. Los anticuerpos de la invención son del isotipo IgG1 humano. 20

2. Otras enfermedades

Los mismos principios u otros análogos determinan la producción de agentes terapéuticos para el tratamiento de otras enfermedades amiloidogénicas. En general, los agentes apuntados anteriormente para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer también pueden usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer de comienzo temprano asociada con el síndrome de Down. En la enfermedad de las vacas locas, péptido 25 priónico, fragmentos activos y análogos y anticuerpos para el péptido priónico se usan en lugar del péptido A, fragmentos activos, análogos y anticuerpos para el péptido A en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. En el tratamiento de mieloma múltiple se usa la cadena ligera de IgG y análogos y anticuerpos de la misma y así sucesivamente en otras enfermedades.

III. Pacientes en los que se puede aplicar el tratamiento 30

Los pacientes en los que se puede aplicar el tratamiento incluyen individuos en riesgo de padecer la enfermedad pero que no muestran síntomas, así como pacientes que muestran los síntomas actualmente. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, prácticamente cualquiera está en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer si vive lo suficiente. Por tanto, los presentes procedimientos pueden administrarse profilácticamente a la población general sin ninguna evaluación del riesgo del paciente. Los presentes procedimientos son especialmente 35 útiles para individuos que sí tienen un riesgo genético conocido de padecer la enfermedad de Alzheimer. Tales individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina mediante el análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos del riesgo hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen de APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y en las posiciones 670 y 671 denominadas las mutaciones de Hardy y sueca, respectivamente (véase Hardy, TINS, 40 citado anteriormente). Otros marcadores de riesgo son las mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, historia familiar de EA, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los individuos que padecen actualmente la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse por su demencia característica, así como por la presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente. Además, están disponibles varias pruebas diagnósticas para identificar individuos que tienen EA. Éstas incluyen la medición de los niveles de CSF tau y Aβ42. Los niveles elevados de tau 45 y disminuidos de Aβ42 significan la presencia de EA. Los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse mediante los criterios de MMSE o ADRDA tal como se trata en la sección de ejemplos.

En los pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Habitualmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente alcanza los 40, 50, 60 50 ó 70 años. Normalmente, el tratamiento supone múltiples dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede controlarse mediante ensayos de anticuerpos, o respuestas de células T o células B activadas al agente terapéutico (por ejemplo, el péptido Aβ) a lo largo del tiempo. Si la respuesta falla, está indicada una dosificación de refuerzo. En el caso de pacientes potenciales con síndrome de Down, puede comenzarse el tratamiento de manera prenatal mediante la administración del agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento. 55

IV. Regímenes de tratamiento

En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente propenso a, o en cualquier caso en riesgo de, padecer una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o para retrasar el comienzo de la enfermedad. En las aplicaciones

terapéuticas, las composiciones o los medicamentos se administran a un paciente que se sospecha que padece, o que ya está padeciendo tal enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos para detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una dosis terapéutica o farmacéuticamente eficaz. En regímenes profiláctico y terapéutico, los agentes habitualmente se administran en varias dosificaciones hasta que se ha logrado una respuesta inmunitaria suficiente. 5 Normalmente, se controla la respuesta inmunitaria y se administran dosis repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a desaparecer.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, de otros 10 medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero en algunas enfermedades, tales como la enfermedad de las vacas locas, el paciente puede ser un mamífero no humano, tal como un bovino. Es necesario ajustar las dosificaciones del tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunógeno depende de si también se administra un adyuvante, requiriéndose dosificaciones superiores en ausencia del adyuvante. La cantidad de un inmunógeno para su 15 administración en ocasiones varía desde 1 µg hasta 500 µg por paciente y más habitualmente desde 5 µg hasta 500 µg por inyección para la administración a seres humanos. Ocasionalmente, se usa una dosis superior de 1 mg - 2 mg por inyección. Normalmente se usan aproximadamente 10, 20, 50 ó 100 µg para cada inyección a seres humanos. Las veces de aplicación de las inyecciones pueden variar significativamente desde una vez al día, una vez al año, hasta una vez cada diez años. Cada día en que se administra una dosificación de inmunógeno, la 20 dosificación es mayor que 1 µg/paciente y habitualmente mayor que 10 µg/paciente si también se administra adyuvante, y mayor que 10 µg/paciente y habitualmente mayor que 100 µg/paciente en ausencia de adyuvante. Un régimen típico está constituido por una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de 6 semanas. Otro régimen está constituido por una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses después. Otro régimen supone una inyección cada dos meses a lo largo de la vida. Alternativamente, las inyecciones de 25 refuerzo pueden realizarse de manera irregular según se indique mediante el control de la respuesta inmunitaria. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación varía desde aproximadamente 0,0001 hasta 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg del peso corporal del huésped.

Los agentes para inducir una respuesta inmunitaria pueden administrarse mediante medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento 30 profiláctico y/o terapéutico. La vía de administración más típica es la subcutánea, aunque otras pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza lo más normalmente en los músculos de la pierna o el brazo. Las inyecciones intravenosas, así como las inyecciones intraperitoneales, las inyecciones intraarteriales, intracraneales o intradérmicas también son eficaces en la generación de una respuesta inmunitaria. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido 35 particular en el que se han acumulado los depósitos.

Los agentes de la invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad amiloidogénica. En el caso de la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, en los que los depósitos amiloides se producen en el cerebro, los agentes de la invención también pueden administrarse junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la 40 invención a través de la barrera hematoencefálica.

Los anticuerpos de la invención a menudo se administran como composiciones farmacéuticas que comprenden un principio activo terapéutico, es decir, y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase Remington’s Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1980). La forma preferida depende del modo deseado de administración y de la aplicación terapéutica. Las 45 composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular las composiciones farmacéuticas para la administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de 50 Hank. Además, la composición farmacéutica o formulación también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Sin embargo, algunos reactivos adecuados para su administración a animales, tales como el adyuvante completo de Freund normalmente no se incluyen en las composiciones para su uso en seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, de metabolización lenta 55 tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos) y copolímeros (tales como celulosa, agarosa, Sepharose funcionalizados con látex, y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

Para la administración parenteral, los agentes de la invención pueden administrarse como dosificaciones 60 inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo

farmacéutico que puede ser un líquido estéril, tal como aceites en agua, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, también pueden estar presentes en las composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen sintético, vegetal, animal o de petróleo, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semillas de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o 5 polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables.

Normalmente, las composiciones se preparan como composiciones inyectables, como suspensiones o bien como soluciones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto del adyuvante 10 potenciado, tal como se trató anteriormente (véanse Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Los agentes de esta invención pueden administrarse en la forma de una preparación de implante o inyección de liberación prolongada que puede formularse de una manera tal que permita una liberación sostenida o pulsátil del principio activo.

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen las formulaciones 15 orales, intranasales y pulmonares, los supositorios y las aplicaciones transdérmicas.

Para los supositorios, los aglutinantes y los vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios puede formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente el 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de 20 magnesio. Estas composiciones adquieren la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen el 10%-95% del principio activo, preferiblemente el 25%-70%.

La aplicación tópica puede dar como resultado la administración transdérmica o intradérmica. La administración tópica puede facilitarse mediante la coadministración del agente con la toxina colérica o derivados 25 destoxificados o subunidades de la misma u otras toxinas bacterianas similares (véase Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La coadministración puede lograrse mediante el uso de los componentes como una mezcla o como moléculas unidas obtenidas mediante reticulación química o expresión como una proteína de fusión.

Alternativamente, la administración transdérmica puede lograrse usando un parche cutáneo o usando transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 30 (1998)).

V. Diagnóstico

La descripción proporciona procedimientos de detección de una respuesta inmunitaria frente al péptido Aβ en un paciente que padece o es propenso a la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos son particularmente útiles para controlar un ciclo de tratamiento que está administrándose a un paciente. Los procedimientos pueden 35 utilizarse para controlar el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos y el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos.

Algunos procedimientos implican determinar un valor inicial de una respuesta inmunitaria en un paciente antes de administrar una dosificación del agente, y comparar éste con un valor para la respuesta inmunitaria tras el tratamiento. Un aumento significativo (es decir, mayor que el margen de error experimental típico en mediciones 40 repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar de la media de tales mediciones) en el valor de la respuesta inmunitaria señala un desenlace de tratamiento positivo (es decir, que la administración del agente ha logrado o aumentado una respuesta inmunitaria). Si el valor para la respuesta inmunitaria no cambia significativamente, o disminuye, se indica un desenlace de tratamiento negativo. En general, se espera que los pacientes que se someten a un ciclo inicial de tratamiento con un agente muestren un aumento en la respuesta 45 inmunitaria con dosificaciones sucesivas, que finalmente alcanza una meseta. La administración del agente generalmente se continúa mientras la respuesta inmunitaria está aumentando. El logro de la meseta es un indicador de que puede interrumpirse o reducirse la administración del tratamiento en su dosificación o en su frecuencia.

En otros procedimientos, se determina un valor control (es decir, una media y desviación estándar) de la respuesta inmunitaria para una población control. Normalmente, los individuos en la población control no han 50 recibido tratamiento anterior. Entonces se comparan los valores medidos de la respuesta inmunitaria en un paciente tras la administración de un agente terapéutico con el valor control. Un aumento significativo con respecto al valor control (por ejemplo, mayor que una desviación estándar de la media) señala un desenlace de tratamiento positivo. Una ausencia de aumento significativo o una disminución señala un desenlace de tratamiento negativo. La administración del agente generalmente se continúa mientras que la respuesta inmunitaria está aumentando con 55 respecto al valor control. Al igual que anteriormente, el logro de una meseta con respecto a los valores control es un indicador de que puede interrumpirse o reducirse la administración del tratamiento en su dosificación o en su frecuencia.

En otros procedimientos, se determina un valor control de la respuesta inmunitaria (por ejemplo, una media y desviación estándar) de una población control de individuos que se han sometido a tratamiento con un agente terapéutico y cuyas respuestas inmunitarias han alcanzado una meseta en respuesta al tratamiento. Se comparan los valores medidos de la respuesta inmunitaria en un paciente con el valor control. Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, más de una desviación estándar) del valor control, puede 5 interrumpirse el tratamiento. Si el nivel en un paciente es significativamente inferior al valor control, está justificada la administración continuada del agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor control, entonces puede estar indicado un cambio en el régimen de tratamiento, por ejemplo, el uso de un adyuvante diferente.

En otros procedimientos, un paciente que no está recibiendo tratamiento actualmente pero que se ha sometido a un ciclo anterior de tratamiento se controla para determinar la respuesta inmunitaria para determinar si se 10 requiere una reanudación del tratamiento. Puede compararse el valor medido de la respuesta inmunitaria en el paciente con un valor de la respuesta inmunitaria logrado anteriormente en el paciente tras un ciclo anterior de tratamiento. Una disminución significativa con respecto a la medición anterior (es decir, mayor que un margen de error típico en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicación de que puede reanudarse el tratamiento. Como alternativa, puede compararse el valor medido en el paciente con un valor control (media más 15 desviación estándar) determinado en la población de pacientes tras someterse a un ciclo de tratamiento. Como alternativa, puede compararse el valor medido en un paciente con un valor control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente que siguen libres de síntomas de la enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente que muestran una mejora de las características de la enfermedad. En todos estos casos, una disminución significativamente con respecto al nivel control (es decir, más de una desviación estándar) es un 20 indicador de que debe reanudarse el tratamiento en un paciente.

La muestra de tejido para su análisis normalmente es sangre, plasma, suero, moco o líquido cefalorraquídeo del paciente. La muestra se analiza para determinar indicios de una respuesta inmunitaria frente a cualquier forma del péptido Aβ, normalmente Aβ42. La respuesta inmunitaria puede determinarse a partir de la presencia de, por ejemplo, anticuerpos o células T que se unen específicamente al péptido Aβ. En la sección de 25 ejemplos se describen procedimientos de ELISA para detectar anticuerpos específicos frente a Aβ. Los procedimientos para detectar células T reactivas se han descrito anteriormente (véase Definiciones).

EJEMPLOS

I. Eficacia profiláctica de Aβ frente a la EA

Estos ejemplos describen la administración del péptido Aβ42 a ratones transgénicos que sobreexpresan 30 APP con una mutación en la posición 717 (APP717V→F) que los predispone a desarrollar una neuropatología similar al Alzheimer. La producción y las características de estos ratones (ratones PDAPP) se describen en Games et al., Nature, citado anteriormente. Estos animales, en su forma heterocigota, comienzan a depositar Aβ a los seis meses de edad en adelante. Hacia los quince meses de edad, muestran niveles de deposición de Aβ equivalentes a los observados en la enfermedad de Alzheimer. Se inyectaron a ratones PDAPP, Aβ42 agregado (Aβ42 agregado) o 35 solución salina tamponada con fosfato. Se escogió Aβ42 agregado debido a su capacidad para inducir anticuerpos frente a múltiples epítopos de Aβ.

A. Procedimientos

1. Fuente de ratones

Se dividieron aleatoriamente treinta ratones hembra heterogenéticos PDAPP en los siguientes grupos: 10 40 ratones para inyectarles Aβ42 agregado (uno murió en el tránsito), 5 ratones para inyectarles PBS/adyuvante o PBS y 10 controles sin inyección. A cinco ratones se les inyectó proteína amiloide sérica (SAP).

2. Preparación de los inmunógenos

Preparación del Aβ42 agregado: se disolvieron dos miligramos de Aβ42 (US Peptides Inc, lote K-42-12) en 0,9 ml de agua y se constituyeron hasta 1 ml añadiendo 0,1 ml de 10 x PBS. Esto se agitó con vórtex y se dejó 45 incubar durante la noche a 37ºC, condiciones en las que se agregó el péptido. Cualquier Aβ no usado se almacenó como un polvo liofilizado seco a -20ºC hasta la siguiente inyección.

3. Preparación de las inyecciones

Se emulsionaron 100 µg de Aβ42 agregado en PBS por ratón 1:1 con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 µl de emulsión para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo 50 de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) a las 2 semanas. Se administraron dos dosis adicionales en IFA a intervalos mensuales. Las inmunizaciones posteriores se realizaron a intervalos mensuales en 500 µl de PBS. Las inyecciones se administraron por vía intraperitoneal (i.p.).

Se practicaron inyecciones de PBS que seguían el mismo programa y se inyectó a los ratones una mezcla 1:1 de PBS/adyuvante a 400 µl por ratón, o 500 µl de PBS por ratón. De la misma manera, las inyecciones de SAP 55

siguieron el mismo programa usando una dosis de 100 µg por inyección.

4. Titulación de extracciones de sangre de ratón, preparación de tejidos e inmunohistoquímica

Los procedimientos anteriores se describen más adelante en Materiales generales y procedimientos.

B. Resultados

Se inyectó a ratones PDAPP, Aβ42 agregado (Aβ42 agregado), péptidos SAP o bien solución salina 5 tamponada con fosfato. También se dejó sin inyectar un grupo de ratones PDAPP, los controles positivos. Se controlaron los títulos de los ratones para Aβ42 agregado un mes sí y otro no desde la cuarta administración de refuerzo hasta que los ratones tuvieron un año de edad. Se sacrificaron los ratones a los 13 meses. En todos los puntos de tiempo examinados, ocho de los nueve ratones con Aβ42 agregado desarrollaron un alto título de anticuerpos, que permaneció alto a lo largo de la serie de inyecciones (títulos mayores de 1/10000). El noveno ratón 10 tuvo un título bajo pero medible de aproximadamente 1/1000 (figura 1, tabla 1). Los ratones a los que se inyectó SAPP tenían títulos de 1:1.000 a 1:30.000 para este inmunógeno superando sólo un único ratón 1:10.0000.

Se tituló a los ratones tratados con PBS frente a Aβ42 agregado a los seis, diez y doce meses. A una dilución de 1/100, cuando se tituló a los ratones con PBS frente Aβ42 agregado sólo superaron en 4 veces el fondo en un punto de datos, aparte de esto, fueron inferiores a 4 veces el fondo en todos los puntos de tiempo (tabla 1). La 15 respuesta específica de SAP fue insignificante en estos puntos de tiempo con todos los títulos inferiores a 300.

Siete de los nueve ratones en el grupo de Aβ1-42 agregado no tuvieron amiloide detectable en sus cerebros. En contraposición, el tejido cerebral de los ratones en los grupos de SAP y PBS contenía numerosos depósitos amiloides positivos para 3D6 en el hipocampo, así como en las cortezas frontal y cingulada. El patrón de la deposición fue similar al de los controles no tratados, con implicación característica de subregiones vulnerables, 20 tales como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo. Un ratón del grupo al que se inyectó Aβ1-42 tuvo una carga de amiloide enormemente reducida, confinada en el hipocampo. Se identificó una placa aislada en otro ratón tratado con Aβ1-42.

Los análisis de imágenes cuantitativos de la carga de amiloide en el hipocampo verificaron la espectacular reducción lograda en los animales tratados con AN1792 (figura 2). Los valores de mediana de la carga de amiloide 25 para el grupo con PBS (2,22%) y para el grupo control no tratado (2,65%) fueron significativamente mayores que los de los inmunizados con AN1792 (0,00%, p = 0,0005). En contraposición, el valor de mediana para el grupo inmunizado con péptidos SAP (SAPP) fue del 5,74%. El tejido cerebral de los ratones control no tratados contenía numerosos depósitos amiloides de Aβ visualizados con el anticuerpo monoclonal (Acm) específico para Aβ 3D6 en el hipocampo, así como en la corteza retroesplenial. También se observó un patrón similar de deposición amiloide en 30 ratones inmunizados con SAPP o PBS (figura 2). Además, en estos últimos tres grupos hubo una implicación característica de subregiones vulnerables del cerebro observada clásicamente en la EA, tal como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo, en los tres grupos.

Los cerebros que no contenían depósitos de Aβ también estaban desprovistos de las placas neuríticas que normalmente se visualizan en ratones PDAPP con el anticuerpo anti-APP humano, 8E5. Todos los cerebros de los 35 grupos restantes (ratones a los que se inyectó SAP, PBS y no inyectados) tenían numerosas placas neuríticas típicas de los ratones PDAPP no tratados. Un pequeño número de placas neuríticas estaba presente en un ratón tratado con AN1792 y se encontró una única agrupación de neuritas distróficas en un segundo ratón tratado con AN1792. Los análisis de imágenes del hipocampo, y que se muestran en la figura 3, demostraron la práctica eliminación de las neuritas distróficas en los ratones tratados con AN1792 (mediana del 0,00%) en comparación con 40 los que recibieron PBS (mediana del 0,28%, p = 0,0005).

La astrocitosis característica de la inflamación asociada con las placas también estuvo ausente en los cerebros del grupo al que se inyectó Aβ1-42. Los cerebros de los ratones en los otros grupos contenían astrocitos positivos para GFAP agrupados y abundantes típicos de la gliosis asociada con las placas de Aβ. Un subconjunto de los portaobjetos que reaccionaron con GFAP se contratiñeron con tioflavina S para localizar los depósitos de Aβ. Los 45 astrocitos positivos para GFAP estaban asociados con las placas de Aβ en los ratones tratados con SAP, PBS y en los controles no tratados. No se encontró tal asociación en los ratones tratados con Aβ1-42 negativos para placas, mientras que se identificó una gliosis asociada con las placas mínima en un ratón tratado con AN1792.

Los análisis de imágenes, mostrados en la figura 4 para la corteza retroesplenial, verificaron que la reducción en la astrocitosis fue significativa con un valor de mediana del 1,56% para los ratones tratados con 50 AN1792 frente a valores de mediana mayores del 6% para los grupos inmunizados con péptidos SAP, PBS o no tratados (p = 0,0017).

La evidencia a partir de un subconjunto de ratones a los que se inyectó Aβ1-42 y PBS indicó que la inmunorreactividad del CMH II asociada con las placas estaba ausente en los ratones a los que inyectó Aβ1-42, lo que era consecuente con la ausencia de una respuesta inflamatoria relacionada con Aβ. 55

También se hicieron reaccionar cortes de cerebro de ratón con un mAβ específico para MAC-1, una

proteína de la superficie celular. MAC-1 (CD11b) es un miembro de la familia de las integrinas y existe como heterodímero con CD18. El complejo CD11b/CD18 está presente en monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos citolíticos naturales (Mak y Simard). Es probable que el tipo de célula reactiva con MAC-1 residente en el cerebro sea microglía basándose en la morfología fenotípica similar en secciones que inmunorreaccionan con MAC-1. El marcaje de MAC-1 asociado con las placas fue inferior en los cerebros de los ratones tratados con AN1792 en 5 comparación con el grupo control con PBS, un hallazgo que es consecuente con la ausencia de respuesta inflamatoria inducida por Aβ.

C. Conclusión

La ausencia de placas de Aβ y cambios glióticos y neuronales reactivos en los cerebros de los ratones a los que se inyectó Aβ1-42 indica que no se depositó o se depositó extremadamente poco amiloide en sus cerebros, y 10 que había ausencia de consecuencias patológicas, tales como gliosis y patología neurítica. Los ratones PDAPP tratados con Aβ1-42 muestran esencialmente la misma ausencia de patología que los ratones no transgénicos control. Por tanto, las inyecciones de Aβ1-42 son sumamente eficaces en la prevención de la deposición o en el aclaramiento de Aβ humano del tejido cerebral, y en la eliminación de cambios degenerativos inflamatorios y neuronales posteriores. Así, la administración del péptido Aβ tiene un beneficio terapéutico en la prevención de la 15 EA.

II. Estudio de respuesta a la dosis

Se inmunizaron grupos de ratones Swiss Webster hembra de cinco semanas de edad (N = 6 por grupo) con 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 ó 0,13 ug de Aβ formulado en CFA/IFA administrado por vía intraperitoneal. Se administraron tres dosis a intervalos bisemanales seguido por una cuarta dosis un mes más tarde. La primera dosis 20 se emulsionó con CFA y las dosis restantes se emulsionaron con IFA. Se extrajo sangre de los animales 4 - 7 días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. A los animales en un subconjunto de tres grupos, los inmunizados con 11, 33 ó 300 µg de antígeno, se les extrajo adicionalmente sangre aproximadamente a intervalos mensuales durante cuatro meses tras la cuarta inmunización para controlar la disminución de la respuesta de los anticuerpos a través de una variedad de dosis de vacuna. Estos 25 animales recibieron una quinta inmunización final a los siete meses tras el inicio del estudio. Se sacrificaron una semana más tarde para medir la respuesta de los anticuerpos a AN1792 y para realizar análisis toxicológicos.

Se observó una disminución de la respuesta a la dosis desde 300 µg hasta 3,7 µg con ausencia de respuesta en las dos dosis inferiores. Los títulos medios de anticuerpos son de aproximadamente 1:1000 tras 3 dosis y de aproximadamente 1:10,000 tras 4 dosis de 11-300 µg de antígeno (véase la figura 5). 30

Los títulos de anticuerpos aumentaron espectacularmente para todos excepto para el grupo de dosis inferior tras la tercera inmunización, oscilando los aumentos en GMT entre 5 veces y 25 veces. Entonces fueron detectables las respuestas de anticuerpos bajas incluso para los que recibieron 0,4 µg. Los grupos de 1,2 y 3,7 µg tenían títulos comparables con GMT de aproximadamente 1000 y las cuatro dosis superiores agrupadas juntas con GMT de aproximadamente 25.000, con la excepción del grupo de dosis de 33 µg con un GMT inferior de 3000. Tras la cuarta 35 inmunización, el aumento del título fue más modesto para la mayoría de los grupos. Hubo una clara respuesta a la dosis a través de los grupos de dosis de antígeno inferior desde 0,14 µg hasta 11 µg oscilando entre anticuerpos no detectables para los que recibieron 0,14 µg y un GMT de 36.000 para los que recibieron 11 µg. De nuevo, se agruparon juntos los títulos para los cuatro grupos de dosis superiores de 11 µg a 300 µg. Así, tras dos inmunizaciones, el título de anticuerpos fue dependiente de la dosis de antígeno a través del amplio intervalo desde 40 0,4 µg hasta 300 µg. Para la tercera inmunización, los títulos para las cuatro dosis superiores fueron todos comparables y se mantuvieron en una meseta tras una inmunización adicional.

Un mes tras la cuarta inmunización, los títulos fueron de 2 a 3 veces superiores en el grupo de 300 µg a los medidos a partir de la sangre extraída cinco días tras la inmunización (figura 6). Esta observación sugiere que la respuesta anamnésica máxima de los anticuerpos se produjo más tarde de 5 días tras la inmunización. Esta vez se 45 observó un aumento más modesto (50%) en el grupo de 33 µg. En el grupo de dosis de 300 µg a los dos meses tras la última dosis, los GMT disminuyeron abruptamente en aproximadamente el 70%. Tras otro mes, la disminución fue menos pronunciada al 45% (100 µg) y de aproximadamente el 14% para las dosis de 33 µg y 11 µg. Así, la tasa de disminución en los títulos de anticuerpos circulantes tras el cese de la inmunización parece ser bifásica con una disminución pronunciada en el primer mes tras la respuesta máxima seguido por una tasa más modesta de 50 disminución a partir de entonces.

Los títulos de anticuerpos y las cinéticas de la respuesta de estos ratones Swiss Webster son similares a los de ratones transgénicos PDAPP heterocigotos jóvenes inmunizados de una manera paralela. Las dosificaciones eficaces para inducir una respuesta inmunitaria en seres humanos normalmente son similares a las dosificaciones eficaces en ratones. 55

III. Examen para determinar la eficacia terapéutica frente a la EA establecida

Este ensayo está diseñado para someter a prueba agentes inmunogénicos para determinar su actividad en la detención o la reversión de las características neuropatológicas de la EA en animales de más edad. Se

comenzaron las inmunizaciones con Aβ de 42 aminoácidos de longitud (AN1792) en un punto de tiempo en el que ya estaban presentes placas amiloides en los cerebros de los ratones PDAPP.

A lo largo del curso de tiempo usado en este estudio, los ratones PDAPP no tratados desarrollaron varios cambios neurodegenerativos que se asemejaron a los encontrados en la EA (Games et al., citado anteriormente y Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). La deposición de Aβ en placas amiloides 5 está asociada con una respuesta neuronal degenerativa constituida por elementos dendríticos y axonales aberrantes, denominados neuritas distróficas. Los depósitos amiloides que están rodeados por y que contienen neuritas distróficas se denominan placas neuríticas. En ratones EA y PDAPP, las neuritas distróficas tienen una estructura globular distintiva, son inmunorreactivas con un panel de anticuerpos que reconocen APP y componentes del citoesqueleto y muestran cambios degenerativos subcelulares complejos en el nivel ultraestructural. Estas 10 características permiten mediciones relevantes para la enfermedad, selectivas y reproducibles de la formación de placas neuríticas en los cerebros de PDAPP. El componente neuronal distrófico de las placas neuríticas de PDAPP se visualiza fácilmente con un anticuerpo específico para el APP humano (mAβ 8E5), y puede medirse fácilmente mediante análisis de imágenes asistido por ordenador. Por tanto, además de medir los efectos de AN1792 en la formación de la placa amiloide, se controlaron los efectos de este tratamiento en el desarrollo de la distrofia 15 neurítica.

Los astrocitos y la microglía son células no neuronales que responden y reflejan el grado de lesión neuronal. Los astrocitos positivos para GFAP y la microglía positiva para CMH II se observan comúnmente en la EA y su activación aumenta con la gravedad de la enfermedad. Por tanto, también se controló el desarrollo de astrocitosis y microgliosis reactivas en los ratones tratados con AN1792. 20

A. Materiales y procedimientos

Se dividieron aleatoriamente cuarenta y ocho ratones PDAPP hembra heterocigotos, de 11 a 11,5 meses de edad, obtenidos de Charles River, en dos grupos: 24 ratones para inmunizarse con 100 µg de AN1792 y 24 ratones para inmunizarse con PBS, cada uno combinado con adyuvante de Freund. Los grupos con AN1792 y PBS se dividieron de nuevo cuando alcanzaron ~15 meses de edad. A los 15 meses de edad, se sacrificó aproximadamente 25 la mitad de cada grupo de los animales tratados con AN1792 y PBS (n = 10 y 9, respectivamente), el resto continuó recibiendo inmunizaciones hasta la finalización a ~ 18 meses (n = 9 y 12, respectivamente). Un total de 8 animales (5 con AN1792, 3 con PBS) murieron durante el estudio. Además de los animales inmunizados, se incluyeron ratones PDAPP no tratados de un año de edad (n = 10), 15 meses de edad (n = 10) y 18 meses de edad (n = 10) para comparación en los ELISA para medir los niveles de A y APP en el cerebro; también se incluyeron los 30 animales de un año de edad en los análisis inmunohistoquímicos.

La metodología fue como la del ejemplo 1, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó el lote 12 de US Peptides y el lote ME0339 de AN1792 de California Peptides para preparar el antígeno para las seis inmunizaciones administradas antes del punto de tiempo de 15 meses. Se usaron los lotes ME0339 y ME0439 de California Peptides para las tres inmunizaciones adicionales administradas entre los 15 y los 18 meses. 35

Para las inmunizaciones, se emulsionaron 100 µg de AN1792 en 200 µl de PBS o PBS solo 1:1 (vol:vol) con adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA) o PBS en un volumen final de 400 µl. La primera inmunización se administró con CFA como adyuvante, las cuatro dosis siguientes se administraron con IFA y las cuatro dosis finales con PBS solo sin adyuvante añadido. Se administró un total de nueve inmunizaciones a lo largo de un periodo de tiempo de siete meses en un programa de dos semanas para las tres primeras dosis 40 seguido por un intervalo de cuatro semanas para las inyecciones restantes. El grupo de tratamiento de cuatro meses, que se sacrificó a los 15 meses de edad, recibió sólo las 6 primeras inmunizaciones.

B. Resultados

1. Efectos del tratamiento con AN1792 en la carga de amiloide

En la figura 7 se muestran los resultados del tratamiento con AN1792 sobre la carga de amiloide cortical 45 determinada mediante el análisis de imágenes cuantitativo. El valor de mediana de la carga de amiloide cortical fue del 0,28% en un grupo de ratones PDAPP de 12 meses de edad no tratados, un valor representativo de la carga de placa en ratones al inicio del estudio. A los 18 meses, la carga de amiloide aumentó más de 17 veces hasta el 4,87% en los ratones tratados con PBS, mientras que los ratones tratados con AN1792 tenían una carga de amiloide enormemente reducida de tan sólo el 0,01%, notablemente inferior que los no tratados de 12 meses y los grupos 50 tratados con PBS de 15 y 18 meses. La carga de amiloide se redujo significativamente en los que recibieron AN1792 a los 15 (reducción del 96%; p = 0,003) y 18 (reducción >99%; p = 0,0002) meses.

Normalmente, la deposición amiloide cortical en ratones PDAPP se inicia en las cortezas frontal y retroesplenial (RSC) y progresa en un sentido ventral-lateral para implicar a las cortezas temporal y entorrinal (EC). Se encontró poco o nada de amiloide en la EC de los ratones de 12 meses de edad, la edad aproximada a la que se 55 administró AN1792 por primera vez. Tras 4 meses de tratamiento con AN1792, la deposición amiloide disminuyó enormemente en la RSC y se eliminó completamente la implicación progresiva de la EC mediante el tratamiento con AN1792. Esta última observación demostró que AN1792 detuvo completamente la progresión del amiloide que

normalmente invadiría las cortezas temporal y ventral, así como detuvo o posiblemente revertió la deposición en la RSC.

Los profundos efectos del tratamiento con AN1792 en la carga de amiloide cortical en desarrollo en los ratones PDAPP se demuestran además mediante el grupo de 18 meses, que se había tratado durante siete meses. Se encontró una ausencia casi completa de amiloide cortical en los ratones tratados con AN1792, con una ausencia 5 total de plaques difusas, así como una reducción en los depósitos compactados

2. Cambios celulares y morfológicos asociados con el tratamiento con AN1792

Se encontró una población de células positivas para A en regiones de cerebro que normalmente contienen depósitos amiloides. Notablemente, en varios cerebros que recibieron AN1792, se encontraron muy pocas o ninguna placa amiloide cortical extracelular. La mayoría de la inmunorreactividad con A pareció estar contenida dentro de 10 las células con un soma lobular o aglutinado grande. Fenotípicamente, estas células parecían microglía o monocitos activados. Eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen ligandos expresados por la microglía y los monocitos activados (CMH II y CD11b) y ocasionalmente estaban asociadas con la pared o la luz de los vasos sanguíneos. La comparación de secciones casi adyacentes marcadas con anticuerpos específicos frente a A y CMH II reveló que ambas clases de anticuerpos reconocían patrones similares de estas células. El examen detallado 15 de los cerebros tratados con AN1792 reveló que las células positivas para CMH II estaban limitadas a las proximidades del amiloide limitado que quedaba en estos animales. Con las condiciones de fijación empleadas, las células no eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen ligandos de células T (CD3, CD3e) o células B (CD45RA, CD45RB) o el antígeno común de leucocitos (CD45), pero eran reactivas con un anticuerpo que reconoce leucosialina (CD43) que experimenta una reacción cruzada con los monocitos. No se encontró ninguna de estas 20 células en ninguno de los ratones tratados con PBS.

Los ratones PDAPP desarrollan invariablemente una densa deposición amiloide en la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo. La deposición forma una línea definida dentro de la vía perforante, una subregión que contiene clásicamente placas amiloides en la EA. El aspecto característico de estos depósitos en los ratones tratados con PBS se parecía a la caracterizada anteriormente en los ratones PDAPP no tratados. La 25 deposición amiloide estaba constituida por placas difusas y compactadas en una banda continua. En contraposición, en varios cerebros de ratones tratados con AN1792, este patrón estaba drásticamente alterado. La deposición amiloide en el hipocampo ya no contenía amiloide difuso y el patrón en bandas estaba completamente afectado. En cambio, estaban presentes varias estructuras punteadas inusuales que eran reactivas con anticuerpos anti-Aβ, varias de las cuales parecían ser células que contenían amiloide. 30

Se observaron frecuentemente células positivas para CMH II en las proximidades del amiloide extracelular en animales tratados con AN1792. El patrón de asociación de las células positivas para Aβ con amiloide fue muy similar en varios cerebros de ratones tratados con AN1792. La distribución de estas células monocíticas estaba limitada a la proximidad del amiloide depositado y estaba completamente ausente de otras regiones cerebrales desprovistas de placas de Aβ. 35

El análisis de imágenes cuantitativo de secciones marcadas para CMH II y MAC I reveló una tendencia hacia un aumento de la inmunorreactividad en la RSC y en el hipocampo de ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo con PBS que alcanzó significación con la medición de la reactividad de MAC-1 en el hipocampo.

Estos resultados son indicativos de una eliminación de amiloide mediada por células, activa, en regiones del 40 cerebro que portan placas.

3. Efectos de AN1792 en los niveles de Aβ: determinaciones mediante ELISA

(a) Niveles corticales

En ratones PDAPP no tratados, el nivel de mediana de Aβ total en la corteza a los 12 meses fue de 1.600 ng/g, que aumentó hasta 8.700 ng/g hacia los 15 meses (tabla 2). A los 18 meses, el valor fue de 22.000 ng/g, un 45 aumento de más de 10 veces durante el transcurso de tiempo del experimento. Los animales tratados con PBS tuvieron 8.600 ng/g de Aβ total a los 15 meses que aumentó hasta 19.000 ng/g a los 18 meses. En contraposición, los animales tratados con AN1792 tuvieron un 81% menos de Aβ total a los 15 meses (1.600 ng/g) que el grupo inmunizado con PBS. Se encontró significativamente menos Aβ total (p = 0,0001) (5.200 ng/g) a los 18 meses cuando se compararon los grupos con AN1792 y con PBS (tabla 2), lo que representa una reducción del 72% en Aβ 50 que en caso contrario estaría presente. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de Aβ42, concretamente que el grupo tratado con AN1792 contenía mucho menos Aβ42, pero en este caso las diferencias entre los grupos con AN1792 y con PBS fueron significativas a los 15 meses (p = 0,04) y 18 meses (p = 0,0001, tabla 2).

Tabla 2: Niveles de mediana de Aβ (ng/g) en la corteza

NO TRATADOS PBS AN1792

Edad

A Total A42 (n) A Total A42 (n) Total A42 (n)

12

1.600 1.300 (10)

15

8.700 8.300 (10) 8.600 7.200 (9) 1.600 1.300* (10)

18

22.200 18.500 (10) 19.000 15.900 (12) 5.200** 4.000** (9)

*p = 0,00412 **p = 0,0001

(b) Niveles en el hipocampo

En ratones PDAPP no tratados, los niveles de mediana en el hipocampo de Aβ total a los doce meses de edad fueron de 15.000 ng/g que aumentaron hasta 51.000 ng/g a los 15 meses y adicionalmente hasta 81.000 ng/g a los 18 meses (tabla 3). De manera similar, los ratones inmunizados con PBS mostraron valores de 40.000 ng/g y 5 65.000 ng/g a los 15 meses y a los 18 meses, respectivamente. Los animales inmunizados con AN1792 mostraron menos Aβ total, específicamente 25.000 ng/g y 51.000 ng/g en los puntos de tiempo respectivos de 15 meses y 18 meses. El valor del grupo tratado con AN1792 a los 18 meses fue significativamente inferior que el del grupo tratado con PBS (p = 0,0105; tabla 3). La medición de Aβ42 dio el mismo patrón de resultados, concretamente que los niveles en el grupo tratado con AN1792 fueron significativamente inferiores que en el grupo con PBS (39.000 ng/g 10 frente a 57.000 ng/g, respectivamente; p = 0,0022) en la evaluación a los 18 meses (tabla 3).

Tabla 3: Niveles de mediana de Aβ (ng/g) en el hipocampo

NO TRATADOS PBS AN1792

Edad

A Total A42 (n) A Total A42 (n) Total A42 (n)

12

15.500 11.100 (10)

15

51.500 44.400 (10) 40.100 35.700 (9) 24.500 22.100 (10)

18

80.800 64.200 (10) 65.400 57.100 (12) 50.900* 38.900** (9)

*p = 0,0105 **p = 0,0022

(c) Niveles cerebelares 15

En ratones PDAPP no tratados de 12 meses, el nivel de mediana cerebelar de Aβ total fue de 15 ng/g (tabla 4). A los 15 meses, esta mediana aumentó hasta 28 ng/g y hacia los 18 meses había aumentado hasta 35 ng/g. Los animales tratados con PBS mostraron valores de mediana de Aβ total de 21 ng/g a los 15 meses y de 43 ng/g a los 18 meses. Se encontró que los animales tratados con AN1792 tenían 22 ng/g de Aβ total a los 15 meses y significativamente menos (p = 0,002) Aβ total a los 18 meses (25 ng/g) que el grupo con PBS correspondiente (tabla 20 4).

Tabla 4: Niveles de mediana de Aβ (ng/g) en el cerebelo

NO TRATADOS PBS AN1792

Edad (meses)

A Total (n) A Total (n) A Total (n)

12

15,6 (10)

15

27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10)

18

35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9)

*p = 0,0018

4. Efectos del tratamiento con AN1792 en los niveles de APP

APP-α y la molécula de APP de longitud completa contienen ambas toda o parte de la secuencia de Aβ y así podrían resultar potencialmente afectadas por la generación de una respuesta inmunitaria dirigida frente a 5 AN1792. En los estudios realizados hasta la fecha, se ha observado un ligero aumento en los niveles de APP como aumentos neuropatológicos en los ratones PDAPP. En la corteza, los niveles de APP-α/FL (longitud completa) o bien APP-α no cambiaron esencialmente por el tratamiento con la excepción de que APP-α se redujo en un 19% en el punto de tiempo de 18 meses en el grupo tratado con AN1792 frente al grupo tratado con PBS. Los valores de APP del grupo tratado con AN1792 a los 18 meses no fueron significativamente diferentes de los valores de los grupos no 10 tratados a los 12 meses y a los 15 meses y tratado con PBS a los 15 meses. En todos los casos, los valores APP permanecieron dentro de los intervalos que se encuentran normalmente en los ratones PDAPP.

5. Efectos del tratamiento con AN1792 en la patología gliótica y neurodegenerativa

La carga de placas neuríticas se redujo significativamente en la corteza frontal de ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo con PBS a los 15 (84%; p = 0,03) y a los 18 (55%; p = 0,01) meses de edad 15 (figura 8). El valor de mediana de la carga de placas neuríticas aumentó desde el 0,32% hasta el 0,49% en el grupo con PBS entre los 15 y los 18 meses de edad. Esto contrastó con el desarrollo enormemente reducido de placas neuríticas en el grupo con AN1792, con valores de mediana de carga de placas neuríticas del 0,05% y el 0,22%, en los grupos de 15 y 18 meses, respectivamente.

Las inmunizaciones con AN1792 parecieron tolerarse bien y se también se redujo significativamente la 20 astrocitosis reactiva en la RSC de ratones tratados con AN1792 cuando se comparó con el grupo con PBS a los 15 (56%; p = 0,011) y los 18 (39%; p = 0,028) meses de edad (figura 9). Los valores de mediana del porcentaje de astrocitosis en el grupo con PBS aumentaron entre los 15 y los 18 meses desde el 4,26% hasta el 5,21%. El tratamiento con AN1792 suprimió el desarrollo de astrocitosis en ambos puntos de tiempo hasta el 1,89% y el 3,2%, respectivamente. Esto sugiere que el neurópilo no estaba resultando dañado por el proceso de aclaramiento. 25

6. Respuestas de anticuerpos

Tal como se describió anteriormente, ratones PDAPP heterocigotos, de once meses de edad (N = 24) recibieron una serie de 5 inmunizaciones de 100 µg de AN1792 emulsionado con adyuvante de Freund y se administraron por vía intraperitoneal en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12, y una sexta inmunización con PBS solo (sin adyuvante de Freund) en la semana 16. Como control negativo, un conjunto paralelo de 24 ratones transgénicos de 30 edad correspondiente recibió inmunizaciones de PBS emulsionado con los mismos adyuvantes y se administraron con el mismo programa. Se extrajo sangre de los animales en el plazo de tres a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis. Se midieron las respuestas de anticuerpos frente a AN1792 mediante ELISA. Los títulos en media geométrica (GMT) para los animales que se inmunizaron con AN1792 fueron de aproximadamente 1.900, 7.600 y 45.000 tras la segunda, tercera y última (sexta) dosis, respectivamente. No se 35 midió ningún anticuerpo específico para A en los animales control tras la sexta inmunización.

Se trató aproximadamente la mitad de los animales durante tres meses más, recibiendo inmunizaciones aproximadamente a las 20, 24 y 27 semanas. Cada una de estas dosis se administró en vehículo de PBS solo sin adyuvante de Freund. Los títulos medios de anticuerpos permanecieron sin cambios durante este periodo de tiempo. De hecho, los títulos de anticuerpos parecieron permanecer estables desde la cuarta hasta la octava extracción de 40 sangre, correspondiendo a un periodo que cubre de la quinta a la novena inyecciones.

Para determinar si los anticuerpos específicos para A provocados mediante la inmunización que se detectaron en los sueros de ratones tratados con AN1792 también estaban asociados con el amiloide depositado del cerebro, se hizo reaccionar un subconjunto de cortes de los ratones tratados con AN1792 y con PBS con un

anticuerpo específico para IgG de ratón. En contraposición con el grupo con PBS, las placas de A en los cerebros tratados con AN1792 se cubrieron con IgG endógena. Esta diferencia entre los dos grupos se observó en grupos de 15 y 18 meses. Particularmente sorprendente fue la ausencia de marcaje en el grupo con PBS, a pesar de la presencia de una densa carga de amiloide en estos ratones. Estos resultados muestran que la inmunización con una proteína A sintética genera anticuerpos que reconocen y se unen in vivo a A en las placas amiloides. 5

7. Respuestas inmunitarias mediadas por células

Se extrajeron bazos de nueve ratones PDAPP inmunizados con AN1792 y 12 inmunizados con PBS de 18 meses de edad, 7 días después de la novena inmunización. Se aislaron los esplenocitos y se hicieron crecer en cultivo durante 72 h en presencia de A40, A42 o A40-1 (proteína de orden inverso). El mitógeno Con A sirvió como control positivo. Se obtuvieron respuestas óptimas con >1,7 µM de la proteína. Las células de los nueve 10 animales tratados con AN1792 proliferaron en respuesta a la proteína A1-40 o bien a la A1-42, con niveles iguales de incorporación de ambas proteínas (figura 10, panel superior). No hubo respuesta a la proteína inversa A40-1. Las células de los animales control no respondieron a ninguna de las proteínas A (figura 10, panel inferior).

C. Conclusión

Los resultados de este estudio muestran que la inmunización con AN1792 de ratones PDAPP que poseen 15 depósitos amiloides existentes ralentiza y evita la deposición amiloide progresiva y retrasa los cambios neuropatológicos consecuentes en el cerebro de ratones PDAPP de más edad. Las inmunizaciones con AN1792 detuvieron esencialmente el desarrollo de amiloide en estructuras que normalmente sucumbirían a la amiloidosis. Así, la administración del péptido A tiene beneficio terapéutico en el tratamiento de la EA.

IV. Examen de fragmentos de A 20

Se inmunizaron 100 ratones PDAPP con edades comprendidas entre los 9 meses y los 11 meses con 9 regiones diferentes de APP y A para determinar qué epítopos transmiten la respuesta. Los 9 inmunógenos diferentes y un control se inyectaron por vía i.p. tal como se describió anteriormente. Los inmunógenos incluyen cuatro conjugados de péptido A humano 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, todos ellos acoplados a IgG de oveja anti-ratón mediante un enlace de cistina; los aminoácidos 592-695 de un polipéptido APP, A1-40 humano agregado y A25-25 35 humano agregado, y A42 de roedor agregado. Se usaron como controles A42 agregado y PBS. Se usaron diez ratones por grupo de tratamiento. Los títulos se controlaron igual que anteriormente y los ratones se sacrificaron al final de los 4 meses de inyecciones. Se determinó la histoquímica, los niveles de A y la toxicología post-mortem.

A. Materiales y procedimientos

1. Preparación de los inmunógenos 30

Preparación de péptidos A acoplados: se prepararon cuatro conjugados de péptido A humano (residuos de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno conjugado a IgG de oveja anti-ratón) mediante acoplamiento a través de una cisteína artificial añadida al péptido A usando el reactivo de reticulación sulfo-EMCS. Se sintetizaron los derivados del péptido A con las siguientes secuencias de aminoácidos finales. En cada caso, la ubicación del residuo de cisteína insertado está indicada mediante subrayado. Al derivado de péptido A13-28 también se le 35 añadieron dos residuos de glicina antes de la cisteína del extremo carboxilo terminal, tal como se indica.

Péptido A1-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC COOH

Péptido A1-5 NH2-DAEFRC COOH

Péptido A33-42 NH2-C-ácido aminoheptanoico-GLMVGGVVIA COOH

Péptido A13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH 40

Para preparar la reacción de acoplamiento, se dializaron diez mg de IgG de oveja anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante la noche frente a tampón borato de sodio 10 mM, pH 8,5. El anticuerpo dializado se concentró entonces hasta un volumen de 2 ml utilizando un tubo Centriprep de Amicon. Se disolvieron diez mg de sulfo-EMCS [N(-maleimidocuproiloxi)succinimida] (Molecular Sciences Co.) en un ml de agua desionizada. Se añadió un exceso molar de 40 veces de sulfo-EMCS gota a gota con agitación a la IgG de oveja 45 anti-ratón y entonces se agitó la solución durante diez min adicionales. La IgG de oveja anti-ratón activada se purificó y se intercambió con tampón mediante el paso a través de una columna de filtración en gel de 10 ml (Pierce Presto Column, obtenida de Pierce Chemicals) equilibrada con NaPO4 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 6,5. Las fracciones que contenían el anticuerpo, identificadas mediante absorbancia a 280 nm, se reunieron y se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, usando 1,4 mg por DO como coeficiente de extinción. Se disolvió un 50 exceso molar de 40 veces del péptido A en 20 ml de NaPO4 10 mM, pH 8,0, con la excepción del péptido A33-42 para el que se disolvieron en primer lugar 10 mg en 0,5 ml de DMSO y después se diluyeron hasta 20 ml con el tampón NaPO4 10 mM. Las soluciones del péptido se añadieron cada una a 10 ml de la IgG de oveja anti-ratón

activada y se agitaron a temperatura ambiente durante 4 h. Los conjugados resultantes se concentraron hasta un volumen final inferior a 10 ml usando un tubo Centriprep de Amicon y entonces se dializaron frente a PBS para realizar el intercambio de tampón y eliminar el péptido libre. Los conjugados se hicieron pasar a través de filtros de 0,22 µ de tamaño de poro para su esterilización y después se tomaron alícuotas en fracciones de 1 mg y se almacenaron congeladas a -20ºC. Se determinaron las concentraciones de los conjugados usando el ensayo de 5 proteínas de BCA (Pierce Chemicals) con IgG de caballo para la curva patrón. Se documentó la conjugación mediante el aumento del peso molecular de los péptidos conjugados con respecto al de la IgG de oveja anti-ratón activada. El conjugado de anticuerpo de oveja anti-ratón frente a A1-5 fue un conjunto de dos conjugaciones, el resto procedía de una preparación única.

2. Preparación de péptidos A agregados 10

Se solubilizaron en fresco los péptidos 1-40 humano (AN1528; California Peptides Inc., Lote ME0541), 1-42 humano (AN1792; California Peptides Inc., Lotes ME0339 y ME0439), 25-35 humano y 1-42 de roedor (California Peptides Inc., Lote ME0218) para la preparación de cada conjunto de inyecciones de polvos liofilizados que se habían almacenado desecados a -20ºC. Para este fin, se añadieron dos mg de péptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión o solución relativamente uniforme. De los cuatro, 15 AN1528 fue el único péptido soluble en esta etapa. Entonces se añadió una alícuota de 100 µl de 10X PBS (1X PBS: NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5) punto en el que AN1528 comenzó a precipitar. Se agitó de nuevo la suspensión con vórtex y se incubó durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente.

Preparación de la proteína pBx6: Se construyó un plásmido de expresión que codifica pBx6, una proteína de fusión constituida por la secuencia líder N-terminal de la polimerasa del bacteriófago MS-2 de 100 aminoácidos 20 seguido por los aminoácidos 592-695 de APP (APP) tal como se describe por Oltersdorf et al, J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). Se transfectó el plásmido en E. coli y se expresó la proteína tras la inducción del promotor. Se lisaron las bacterias en urea 8 M y se purificó parcialmente pBx6 mediante SDS PAGE preparativa. Las fracciones que contenían pBx6 se purificaron mediante transferencia de Western usando anticuerpo policlonal de conejo anti-pBx6, se reunieron, se concentraron usando un tubo Centriprep de Amicon y se dializaron frente a PBS. La pureza 25 de la preparación, estimada mediante SDS PAGE teñida con azul de Coomassie, fue de aproximadamente del 5% al 10%.

B. Resultados y discusión

1. Diseño del estudio

Se obtuvieron cien ratones PDAPP transgénicos machos y hembras, heterocigotos de nueve a once meses 30 de edad, de Charles River Laboratory y Taconic Laboratory. Los ratones se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con diferentes regiones de A o APP combinadas con adyuvante de Freund. Se distribuyeron los animales para que se produjera una correspondencia lo más próxima posible en el sexo, la edad, el linaje y la fuente de los animales dentro de los grupos. Los inmunógenos incluyeron cuatro péptidos A derivados de la secuencia humana, 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, conjugados cada uno con la IgG de oveja anti-ratón; cuatro péptidos A 35 agregados, 1-40 humano (AN1528), 1-42 humano (AN1792), 25-35 humano y 1-42 de roedor; y un polipéptido de fusión, denominado pBx6, que contiene los residuos de aminoácidos 592-695 de APP. Se inmunizó un décimo grupo con PBS combinado con adyuvante como control.

Para cada inmunización se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 100 µg de cada péptido A en 200 µl de PBS o 200 µg del derivado de APP pBx6 en el mismo volumen de PBS o PBS solo con adyuvante completo de Freund (CFA) 40 en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las cuatro dosis posteriores y con PBS para la dosis final. Las inmunizaciones se administraron por vía intraperitoneal en un programa bisemanal para las tres primeras dosis, y después en un programa mensual. Se extrajo sangre de los animales cuatro a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. Se sacrificaron los 45 animales aproximadamente una semana tras la dosis final.

2. Niveles de A y APP en el cerebro

Tras aproximadamente cuatro meses de inmunización con los diversos péptidos A o el derivado de APP, se extrajeron los cerebros de los animales con perfusión de solución salina. Se preparó un hemisferio para el análisis inmunohistoquímico y se usó el segundo para la cuantificación de los niveles de A y APP. Para medir las 50 concentraciones de las diversas formas del péptido beta amiloide y de la proteína precursora de amiloide, se diseccionó el hemisferio y se prepararon homogeneizados de regiones del hipocampo, la corteza y el cerebelo en guanidina 5 M. Éstos se diluyeron y se cuantificó el nivel de amiloide o APP mediante la comparación con una serie de diluciones de patrones del péptido A o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA.

La mediana de la concentración de A total para el grupo control inmunizado con PBS fue 5,8 veces 55 superior en el hipocampo que en la corteza (mediana de 24.318 ng/g en el tejido de hipocampo en comparación con 4.221 ng/g para la corteza). El nivel de mediana en el cerebelo del grupo control (23,4 ng/g de tejido) fue

aproximadamente 1.000 veces inferior que en el hipocampo. Estos niveles son similares a los que se han notificado anteriormente para los ratones PDAPP transgénicos heterocigotos de esta edad (Johnson-Woods et al, 1997, citado anteriormente).

Para la corteza, un subconjunto de grupos de tratamiento tuvo unos niveles de mediana de A total y A1-42 que difirieron significativamente de los del grupo control (p < 0,05), de los animales que recibieron AN1792, A1-5 42 de roedor o el conjugado de péptido A1-5, tal como se muestra en la figura 11. Los niveles de mediana de A total se redujeron en el 75%, el 79% y el 61%, respectivamente, en comparación con el control para estos grupos de tratamiento. No hubo correlaciones discernibles entre los títulos de anticuerpos específicos frente a A y los niveles de A en la región cortical del cerebro para ninguno de los grupos.

En el hipocampo, la mediana de la reducción de A total asociada con el tratamiento con AN1792 (46%, p = 10 0,0543) no fue tan grande como la observada en la corteza (75%, p = 0,0021). Sin embargo, la magnitud de la reducción fue mucho mayor en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 11.186 ng/g de tejido en el hipocampo frente a 3,171 ng/g de tejido en la corteza. Para los grupos de animales que recibieron A1-42 de roedor o A1-5, los niveles de mediana de A total se redujeron en el 36% y el 26%, respectivamente. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los grupos y la alta variabilidad de los niveles de péptido amiloide de un animal a otro 15 dentro de ambos grupos, estas reducciones no fueron significativas. Cuando se midieron los niveles de A1-42 en el hipocampo, ninguna de las reducciones inducidas por el tratamiento alcanzó significación. Así, debido a la menor carga de A en la corteza, los cambios en esta región constituyen un indicador más sensible de los efectos del tratamiento. Los cambios en los niveles de A medidos mediante ELISA en la corteza son similares, pero no idénticos, a los resultados de los análisis inmunohistoquímicos (véase más adelante). 20

También se midió A total en el cerebelo, una región normalmente no afectada en la patología de la EA. Ninguno de los valores de mediana de las concentraciones de A de cualquiera de los grupos inmunizados con los diversos péptidos A o el derivado de APP difirieron de los del grupo control en esta región del cerebro. Este resultado sugiere que los niveles de A no patológicos no resultan afectados por el tratamiento.

También se determinó la concentración de APP mediante ELISA en la corteza y el cerebelo de ratones 25 tratados y control. Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, denominado APP-/FL, reconoce APP-alfa (, la forma secretada de APP que se ha roto dentro de la secuencia de A) y las formas de longitud completa (FL) de APP, mientras que el segundo reconoce sólo APP-. En contraposición a la disminución asociada con el tratamiento de A en un subconjunto de los grupos de tratamiento, los niveles de APP no cambiaron en todos los animales tratados en comparación con los control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con péptidos Aβ 30 no están reduciendo APP; en cambio, el efecto del tratamiento es específico frente a Aβ.

En resumen, los niveles de Aβ total y Aβ1-42 se redujeron significativamente en la corteza mediante el tratamiento con AN1792, Aβ1-42 de roedor o conjugado de Aβ1-5. En el hipocampo, Aβ total se redujo significativamente sólo mediante el tratamiento con AN1792. Ningún otro cambio asociado con el tratamiento en los niveles de Aβ o APP en las regiones del hipocampo, la corteza o el cerebelo fue significativo. 35

2. Análisis histoquímicos

Se prepararon los cerebros de un subconjunto de seis grupos para el análisis inmunohistoquímico, tres grupos inmunizados con conjugados del péptido Aβ, Aβ1-5, Aβ1-12 y Aβ13-28; dos grupos inmunizados con los agregados de Aβ de longitud completa AN1792 y AN1528 y el grupo control tratado con PBS. En la figura 12 se muestran los resultados de los análisis de imágenes de la carga de amiloide en cortes de cerebro de estos grupos. 40 Hubo reducciones significativas de la carga de amiloide en las regiones corticales de tres de los grupos de tratamiento frente a los animales control. La mayor reducción de la carga de amiloide se observó en el grupo que recibió AN1792, en el que el valor medio se redujo en un 97% (p = 0,001). También se observaron reducciones significativas para los animales tratados con AN1528 (95%, p = 0,005) y el conjugado de péptido Aβ1-5 (67%, p = 0,02). 45

Los resultados obtenidos mediante la cuantificación de Aβ total o Aβ1-42 mediante ELISA y la carga de amiloide mediante el análisis de imágenes difieren en cierto grado. El tratamiento con AN1528 tuvo un efecto significativo en el nivel de carga de amiloide cortical cuando se midió mediante el análisis de imágenes cuantitativo pero no en la concentración de Aβ total en la misma región cuando se midió mediante ELISA. Es probable que la diferencia entre estos dos resultados se deba a las especificidades de los ensayos. El análisis de imágenes mide 50 sólo Aβ insoluble agregado en placas. En contraposición, el ELISA mide todas las formas de Aβ, soluble e insoluble, monomérica y agregada. Dado que se cree que la patología de la enfermedad está asociada con la forma asociada en placas insoluble de Aβ, la técnica del análisis de imágenes puede tener más sensibilidad para revelar los efectos del tratamiento. Sin embargo dado que el ELISA es un ensayo más rápido y más fácil, es muy útil para fines de examen. Además, puede revelar que la reducción asociada con el tratamiento de Aβ es mayor para el asociado en 55 placas que para Aβ total.

Para determinar si los anticuerpos específicos frente a Aβ provocados mediante la inmunización en los

animales tratados reaccionaron con el amiloide depositado del cerebro, se hizo reaccionar un subconjunto de cortes de los animales tratados y los ratones control con un anticuerpo específico frente a la IgG de ratón. En contraposición al grupo con PBS, las placas que contenían Aβ se recubrieron con IgG endógenas para los animales inmunizados con los conjugados del péptido Aβ, Aβ1-5, Aβ1-12 y Aβ13-28; y los agregados de Aβ de longitud completa, AN1792 y AN1528. No se analizaron mediante este ensayo los cerebros de los animales inmunizados con 5 otros péptidos Aβ o el péptido de APP pBx6.

3. Medición de los títulos de anticuerpos

Se extrajo sangre de los ratones cuatro a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda inmunización, para un total de cinco extracciones de sangre. Se midieron los títulos de anticuerpos como el anticuerpo de unión a Aβ1-42 usando un ELISA tipo sándwich con placas de plástico de múltiples pocillos 10 recubiertas con Aβ1-42. Tal como se muestra en la figura 13, se obtuvieron títulos de anticuerpos máximos tras la cuarta dosis para las cuatro vacunas que provocaron los títulos superiores de anticuerpos específicos frente a AN1792: AN1792 (GMT máximo: 94.647), AN1528 (GMT máximo: 88.231), conjugado de Aβ1-12 (GMT máximo: 47.216) y Aβ1-42 de roedor (GMT máximo: 10.766). Los títulos para estos grupos disminuyeron algo tras la quinta y sexta dosis. Para los cinco inmunógenos restantes, se alcanzaron los títulos máximos tras la quinta o la sexta dosis 15 y fueron de magnitud muy inferior a los de los cuatro grupos de título superior: conjugado de Aβ1-5 (GMT máximo: 2.356), pBx6 (GMT máximo: 1.986), conjugado de Aβ13-28 (GMT máximo: 1.183), conjugado de Aβ33-42 (GMT máximo: 658), Aβ25-35 (GMT máximo: 125). También se midieron los títulos de anticuerpos frente a los péptidos homólogos usando el mismo formato de ELISA tipo sándwich para un subconjunto de los inmunógenos, los grupos inmunizados con Aβ1-5, Aβ13-28, Aβ25-35, Aβ33-42 o Aβ1-42 de roedor. Estos títulos fueron aproximadamente los 20 mismos que los medidos frente a Aβ1-42, excepto para el inmunógeno Aβ1-42 de roedor en cuyo caso los títulos de anticuerpos frente al inmunógeno homólogo fueron aproximadamente dos veces superiores. La magnitud del título de anticuerpos específicos frente a AN1792 de los animales individuales o los valores medios de los grupos de tratamiento no se correlacionó con la eficacia medida como la reducción de Aβ en la corteza.

4. Respuestas linfoproliferativas 25

Se midió la linfoproliferación dependiente de Aβ usando células de bazo recogidas aproximadamente una semana tras la sexta inmunización final. Se cultivaron células recogidas en fresco, 105 por pocillo durante 5 días en presencia de Aβ1-40 a una concentración de 5 µM para estimulación. También se cultivaron células procedentes de un subconjunto de siete de los diez grupos en presencia del péptido inverso, Aβ40-1. Como control positivo, se cultivaron células adicionales con el mitógeno de células T, PHA, y como control negativo, se cultivaron células sin 30 péptido añadido.

Los linfocitos de una mayoría de los animales proliferaron en respuesta a PHA. No hubo respuestas significativas al péptido inverso Aβ40-1. Las células procedentes de animales inmunizados con los péptidos Aβ agregados más grandes, AN1792, Aβ1-42 de roedor y AN1528 proliferaron mucho cuando se estimularon con Aβ1-40 obteniéndose la mayor cantidad de cpm en los que recibieron AN1792. Un animal en cada uno de los grupos 35 inmunizados con conjugado de Aβ1-12, conjugado de Aβ13-28 y Aβ25-35 proliferó en respuesta a Aβ1-40. Los grupos restantes que recibieron conjugado de Aβ1-5, conjugado de Aβ33-42 pBx6 o PBS no tuvieron animales con respuesta estimulada por Aβ. Estos resultados se resumen en la tabla 5 a continuación.

Tabla 5

Inmunógeno

Conjugado Aminoácidos de A Respondedores

A1-5

sí 5-mero 0/7

A1-12

sí 12-mero 1/8

A13-28

sí 16-mero 1/9

A25-35

11-mero 1/9

A33-42

sí 10-mero 0/10

A1-40

40-mero 5/8

A1-42

42-mero 9/9

r A1-42

42-mero 8/8

pBx6

0/8

PBS

0-mero 0/8

Estos resultados muestran que AN1792 y AN1528 estimulan respuestas fuertes de células T, más probablemente del fenotipo CD4+. La ausencia de una respuesta de células T específica frente a Aβ en los animales inmunizados con Aβ1-5 no es sorprendente, dado que los epítopos peptídicos reconocidos por las células T CD4+ habitualmente tienen aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, aunque a veces pueden funcionar péptidos más cortos con menos eficacia. Así, es probable que la mayoría de los epítopos de las células T cooperadoras para los 5 cuatro péptidos del conjugado resida en la pareja del conjugado de IgG, no en la región de Aβ. Esta hipótesis está apoyada por la incidencia muy baja de respuestas proliferativas para los animales en cada uno de estos grupos de tratamiento. Dado que el conjugado de Aβ1-5 fue eficaz en reducir significativamente el nivel de Aβ en el cerebro, en la ausencia aparente de células T específicas frente a Aβ, la respuesta inmunitaria efectora clave inducida por la inmunización con este péptido parece ser los anticuerpos. 10

La ausencia de células T y la baja respuesta de anticuerpos del péptido de fusión pBx6, que engloba los aminoácidos 592-695 de APP incluyendo todos los residuos de Aβ puede deberse a la escasa inmunogenicidad de esta preparación particular. La escasa inmunogenicidad del agregado de Aβ25-35 se debe probablemente a que el péptido es demasiado pequeño para que sea probable que contenga un buen epítopo de células T para ayudar a la inducción de una respuesta de anticuerpos. Si este péptido estuviera conjugado a una proteína vehículo, 15 probablemente sería más inmunogénico.

V. Preparación de Anticuerpos Policlonales para la Protección Pasiva

Se inmunizan 20 ratones no transgénicos con A u otro inmunógeno, opcionalmente más adyuvante, y se eutanasian a los 4-5 meses. Se recoge sangre de ratones inmunizados. Opcionalmente, se separa IgG de otros componentes de la sangre. El anticuerpo específico para el inmunógeno puede purificarse parcialmente mediante 20 cromatografía de afinidad. Se obtiene un promedio de aproximadamente 0,5-1 mg de anticuerpo específico de inmunógeno por ratón, dando un total de 5-10 mg.

VI. Inmunización Pasiva con Anticuerpos para A

Se inyecta a grupos de ratones PDAPP de 7-9 meses de edad 0,5 mg en PBS de anti-A policlonal o monoclonales anti-A específicos como se muestra a continuación. Todas las preparaciones de anticuerpo se 25 purifican para tener bajos niveles de endotoxina. Los monoclonales se pueden preparar frente a un fragmento inyectando el fragmento o una forma más larga de A en un ratón, preparando hibridomas y explorando los hibridomas para un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de A sin unirse a otros fragmentos no solapantes de A.

Tabla 6 30

Anticuerpo

Epítopo

2H3

A 1-12

10D5

A 1-12

266

A 13-28

21F12

A 33-42

Anti-A42 humano policlonal de ratón

Anti-A42 agregado

Se inyecta ip a los ratones cuando sea necesario a lo largo de un periodo de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpos circulante medida mediante el título de ELISA de más de 1/1000 definido por ELISA para A42 u otro inmunógeno. Los títulos se controlan como anteriormente y los ratones se eutanasian al final de 4 meses de inyecciones. Se realizan histoquímica, niveles de A y toxicología post-mortem. Se usan diez ratones por 35 grupo.

VII. Comparación de adyuvantes diferentes

Este ejemplo compara CFA, alumbre, una emulsión de aceite en agua y MPL para determinar su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria.

A. Materiales y procedimientos 40

1. Diseño del estudio

Se clasificaron cien cobayas de la variedad Hartley hembra, de seis semanas de edad, obtenidas de Elm Hill, en diez grupos para inmunizarse con AN1792 o un derivado de palmitoílo del mismo combinado con diversos

adyuvantes. Siete grupos recibieron inyecciones de AN1792 (33 µg a menos que se especifique lo contrario) combinado con a) PBS, b) adyuvante de Freund, c) MPL, d) escualeno, e) MPL/escualeno f) alumbre a dosis baja, o g) alumbre a dosis alta (300 µg de AN1792). Dos grupos recibieron inyecciones de un derivado de palmitoílo de AN1792 (33 µg) combinado con a) PBS o b) escualeno. Un décimo grupo final recibió PBS solo sin antígeno ni adyuvante adicional. Para el grupo que recibió adyuvante de Freund, la primera dosis se emulsionó con CFA y las 5 cuatro dosis restantes con IFA. Se administró el antígeno a una dosis de 33 µg para todos los grupos excepto para el grupo con alumbre a dosis alta, que recibió 300 µg de AN1792. Se administraron las inyecciones por vía intraperitoneal para CFA/IFA y por vía intramuscular en los cuádriceps de las extremidades traseras alternativamente en el lado derecho e izquierdo de los otros grupos. Las tres primeras dosis se administraron en un programa bisemanal seguido por dos dosis en un intervalo mensual. Se extrajo sangre seis a siete días tras cada 10 inmunización, comenzando tras la segunda dosis, para la medición de los títulos de anticuerpos.

2. Preparación de los inmunógenos

Se añadieron dos mg de Aβ42 (California Peptide, Lote ME0339) a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión relativamente uniforme. Se añadió una alícuota de 100 µl de 10X PBS (1X PBS, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5). Se agitó de nuevo la suspensión con vórtex y se 15 incubó durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente. Se almacenó el Aβ1-42 no utilizado con desecante como un polvo liofilizado a -20ºC.

Se preparó un derivado de palmitoílo de AN1792 mediante el acoplamiento de anhídrido palmítico, disuelto en dimetilformamida, al residuo amino terminal de AN1792 antes de la eliminación del péptido naciente de la resina mediante tratamiento con ácido fluorhídrico. 20

Para preparar las dosis de vacuna con adyuvante completo de Freund (CFA) (grupo 2), se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 33 µg de AN1792 en 200 µl de PBS con CFA en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización. Para las inmunizaciones posteriores, el antígeno se emulsionó de manera similar con adyuvante incompleto de Freund (IFA).

Para preparar las dosis de vacuna con MPL para los grupos 5 y 8, se añadió polvo liofilizado (Ribi 25 ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) a trietilamina acuosa al 0,2% hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La mezcla se calentó hasta de 65ºC a 70ºC durante 30 s para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La solución se preparó en fresco para cada conjunto de inyecciones. Para cada inyección en el grupo 5, se mezclaron 33 µg de AN1792 en 16,5 µl de PBS, 50 µg de MPL (50 µl) y 162 µl de PBS en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso. 30

Para preparar las dosis de vacuna con la emulsión de aceite en agua baja, se añadió AN1792 en PBS a escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, Span 85 al 0,5% en PBS para alcanzar una concentración final de dosis única de 33 µg de AN1792 en 250 µl (grupo 6). La mezcla se emulsionó haciéndola pasar a través de un dispositivo de mano de dos cámaras de 15 a 20 veces hasta que las gotitas de la emulsión parecieron ser de diámetro aproximadamente igual a perlas de látex convencionales de 1,0 µm de diámetro cuando se observaron al 35 microscopio. La suspensión resultante era de color blanco lechoso opalescente. Las emulsiones se prepararon en fresco para cada serie de inyecciones. Para el grupo 8, se añadió MPL en trietilamina al 0,2% a una concentración de 50 µg por dosis de la mezcla de detergente y escualeno para la emulsión tal como se observó anteriormente. Para el derivado de palmitoílo (grupo 7), se añadieron 33 µg por dosis de palmitoil-NH-Aβ1-42 al escualeno y se agitó con vórtex. Entonces se añadieron Tween 80 y Span 85 con agitación con vórtex. Esta mezcla se añadió al 40 PBS para alcanzar concentraciones finales de escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, Span 85 al 0,5% y la mezcla se emulsionó tal como se observó anteriormente.

Para preparar las dosis de vacuna con alumbre (grupos 9 y 10), se añadió AN1792 en PBS a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio, Accurate, Westbury, NY) hasta alcanzar concentraciones de 33 µg (dosis baja, grupo 9) o 300 µg (dosis alta, grupo 10) AN1792 por 5 mg de alumbre en un volumen de dosis final de 250 µl. La 45 suspensión se mezcló suavemente durante 4 h a TA.

3. Medición de los títulos de anticuerpos

Se extrajo sangre de cobayas seis a siete días tras inmunización comenzando tras la segunda inmunización para un total de cuatro extracciones de sangre. Se midieron los títulos de anticuerpos frente a Aβ42 mediante ELISA tal como se describe en Materiales generales y procedimientos. 50

4. Preparación del tejido

Tras aproximadamente 14 semanas, se administró CO2 a todos los cobayas. Se recogió el líquido cefalorraquídeo y se extrajeron los cerebros y se diseccionaron tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) y se usaron para medir la concentración de proteína Aβ total usando ELISA.

B. Resultados

1. Respuestas de anticuerpos

Hubo una amplia variedad en la potencia de los diversos adyuvantes cuando se midió como la respuesta de anticuerpos a AN1792 tras la inmunización. Tal como se muestra en la figura 14, cuando se administró AN1792 en PBS, no se detectaron anticuerpos tras dos o tres inmunizaciones y se detectaron respuestas insignificantes tras la cuarta y la quinta dosis con títulos en media geométrica (GMT) de sólo aproximadamente 45. La emulsión de o/w 5 indujo títulos modestos tras la tercera dosis (GMT 255) que se mantuvieron tras la cuarta dosis (GMT 301) y disminuyeron con la dosis final (GMT 54). Hubo una clara respuesta a la dosis de antígeno para AN1792 unido a alumbre, siendo 300 µg más inmunogénico en todos los puntos de tiempo que 33 µg. En el nivel máximo de la respuesta de anticuerpos, tras la cuarta inmunización, la diferencia entre las dos dosis fue del 43% con GMT de aproximadamente 1940 (33 µg) y 3400 (300 µg). La respuesta de anticuerpos a 33 µg de AN1792 más MPL fue muy 10 similar a la generada con una dosis casi diez veces superior de antígeno (300 µg) unido a alumbre. La adición de MPL a una emulsión de o/w redujo la potencia de la vacuna con respecto a con MPL como el único adyuvante en hasta el 75%. Un derivado de palmitoílo de AN1792 fue completamente no inmunogénico cuando se administró en PBS y produjo títulos modestos cuando se presentó en una emulsión de o/w con GMT de 340 y 105 para la tercera y la cuarta extracciones de sangre. Los títulos de anticuerpos superiores se generaron con adyuvante de Freund con 15 un GMT máximo de aproximadamente 87.000, un valor casi 30 veces mayor que los GMT de las siguientes dos vacunas más potentes, MPL y AN1792/alumbre a dosis alta.

Los adyuvantes más prometedores identificados en este estudio son MPL y alumbre. De estos dos, MPL parece ser preferible debido a que se requirió una dosis de antígeno 10 veces inferior para generar la misma respuesta de anticuerpos que la obtenida con alumbre. La respuesta puede aumentarse mediante el aumento de la 20 dosis de antígeno y/o de adyuvante y mediante la optimización del programa de inmunización. La emulsión de o/w fue un adyuvante muy débil para AN1792 y la adición de una emulsión de o/w al adyuvante MPL disminuyó la actividad intrínseca del adyuvante de MPL solo.

2. Niveles de Aβ en el cerebro

Aproximadamente a las 14 semanas, se anestesiaron los cobayas profundamente, se extrajo el líquido 25 cefalorraquídeo (CSF) y se extirparon los cerebros de los animales en un subconjunto de los grupos, los inmunizados con adyuvante de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5), alumbre a dosis alta, 300 pg, de AN1792 (grupo 10) y el grupo control inmunizado con PBS (grupo 3). Para medir el nivel de péptido Aβ, se diseccionó un hemisferio y se prepararon homogeneizados de regiones del hipocampo, la corteza y el cerebelo en guanidina 5 M. Éstos se diluyeron y se cuantificaron mediante comparación con una serie de diluciones de la proteína patrón Aβ de 30 concentraciones conocidas en un formato de ELISA. Los niveles de la proteína Aβ en el hipocampo, la corteza y el cerebelo fueron muy similares para los cuatro grupos a pesar del amplio intervalo de respuestas de anticuerpos a Aβ provocadas por estas vacunas. Se midieron niveles medios de Aβ de aproximadamente 25 ng/g de tejido en el hipocampo, 21 ng/g en la corteza y 12 ng/g en el cerebelo. Así, la presencia de un alto título de anticuerpos circulante frente a Aβ, durante casi tres meses en algunos de estos animales no alteró los niveles totales de Aβ en 35 sus cerebros. Los niveles de Aβ en el CSF también fueron bastante similares entre los grupos. La ausencia de un gran efecto de inmunización con AN1792 en Aβ endógeno indica que la respuesta inmunitaria se centra en las formaciones patológicas de Aβ.

VIII. Respuesta inmunitaria a diferentes adyuvantes en ratones

Para este estudio se utilizaron ratones Swiss Webster hembra de seis semanas de edad con 10-13 40 animales por grupo. Las inmunizaciones se administraron en los días 0, 14, 28, 60, 90 y 20 administradas por vía subcutánea en un volumen de dosis de 200 µl. Se usó PBS como el tampón para todas las formulaciones. Se extrajo sangre de los animales siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para el análisis de los títulos de anticuerpos mediante ELISA. En la tabla 7 se resume el régimen de tratamiento de cada grupo.

Tabla 7

Diseño experimental del estudio Betabloc 010

Grupo

Na Adyuvante b Dosis Antígeno Dosis (µg)

1

10 MPL 12,5 µg AN1792 33

2

10 MPL 25 µg AN1792 33

3

10 MPL 50 µg AN1792 33

4

13 MPL 125 µg AN1792 33

5

13 MPL 50 µg AN1792 150

6

13 MPL 50 µg AN1528 33

7

10 PBS AN1792 33

8

10 PBS ninguno

9

10 Escualeno emulsionado 5% AN1792 33

10

10

Escualeno mezclado 5% AN1792 33

11

10 Alumbre 2 mg AN1792 33

12

13 MPL + Alumbre 50 µg/2 mg AN1792 33

13

10 QS21 5 µg AN1792 33

14

10 QS21 10 µg AN1792 33

15

10 QS21 25 µg AN1792 33

16

13 QS21 25 µg AN1792 150

17

13 QS21 25 µg AN1528 33

18

13 QS21 + MPL 25 µg /50 µg AN1792 33

19

13 QS21 + Alumbre 25 µg/2 mg AN1792 33

Notas al pie: a Número de ratones en cada grupo al inicio del experimento. b Se anotan los adyuvantes. El tampón para todas estas formulaciones fue PBS. Para el grupo 8, no hubo adyuvante ni antígeno.

En la tabla 8 a continuación se muestran los títulos de anticuerpos del ELISA frente a Aβ42 en cada grupo.

Tabla 8

Títulos en media geométrica de anticuerpos

Semana de extracción de sangre

Grupo de tratamiento

2,9 5,0 8,7 12,9 16,7

1

248 1797 2577 6180 4177

2

598 3114 3984 5287 6878

3

1372 5000 7159 12333 12781

4

1278 20791 14368 20097 25631

5

3288 26242 13229 9315 23742

6

61 2536 2301 1442 4504

7

37 395 484 972 2149

8

25 25 25 25 25

9

25 183 744 952 1823

10

25 89 311 513 817

11

29 708 2618 2165 3666

12

198 1458 1079 612 797

13

38 433 566 1080 626

14

104 541 3247 1609 838

15

212 2630 2472 1224 1496

16

183 2616 6680 2085 1631

17

28 201 375 222 1540

18

31699 15544 23095 6412 9059

19

63 243 554 299 441

La tabla muestra que los títulos superiores se obtuvieron para los grupos 4, 5 y 18, en los que los adyuvantes fueron 125 µg de MPL, 50 µg de MPL y QS21 más MPL.

IX. Eficacia terapéutica de diferentes adyuvantes

Se llevó a cabo un estudio de la eficacia terapéutica en ratones PDAPP transgénicos con un conjunto de 5 adyuvantes adecuados para su uso en seres humanos para determinar su capacidad para potenciar respuestas inmunitarias a Aβ y para inducir el aclaramiento mediado por el sistema inmunitario de los depósitos amiloides en el cerebro.

Se obtuvieron ciento ochenta ratones PDAPP transgénicos heterocigotos machos y hembras, de 7,5 a 8,5 meses de edad de Charles River Laboratories. Se clasificaron los ratones en nueve grupos que contenían de 15 a 23 10 animales por grupo para inmunizarse con AN1792 o AN1528 combinados con diversos adyuvantes. Se distribuyeron los animales para que se produjera una correspondencia lo más próxima posible en el sexo, la edad y el linaje de los animales dentro de los grupos. Los adyuvantes incluyeron alumbre, MPL y QS21, cada uno combinado con ambos antígenos y adyuvante de Freund (FA) combinado sólo con AN1792. Se inmunizó un grupo adicional con AN1792 formulado en tampón PBS más el conservante timerosal sin adyuvante. Se inmunizó un noveno grupo con PBS solo 15 como control negativo.

Preparación de péptidos Aβ agregados: se solubilizaron en fresco los péptidos Aβ1-40 humano (AN1528;

California Peptides Inc., Napa, CA; Lote ME0541) y Aβ1-42 humano (AN1792; California Peptides Inc., Lote ME0439) para la preparación de cada conjunto de inyecciones a partir de polvos liofilizados que se habían almacenado desecados a -20ºC. Para este fin, se añadieron dos mg de péptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó con vórtex para generar una suspensión o solución relativamente uniforme. AN1528 era soluble en esta etapa, en contraposición con AN1792. Entonces se añadió una alícuota de 100 µl de 10X PBS (1X PBS: NaCl 5 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5), punto en el que AN1528 comenzó a precipitar. Las suspensiones se agitaron en vórtex de nuevo y se incubaron durante la noche a 37ºC para su uso al día siguiente.

Para preparar las dosis de vacuna con alumbre (grupos 1 y 5), se añadió el péptido Aβ en PBS a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio acuoso al dos por ciento, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) hasta alcanzar concentraciones de 100 µg de péptido Aβ por 1 mg de alumbre. Se añadió 10X PBS hasta un volumen de dosis final de 200 µl en 1X 10 PBS. Entonces se mezcló suavemente la suspensión durante aproximadamente 4 h a TA antes de la inyección.

Para preparar las dosis de vacuna con MPL (grupos 2 y 6), se añadió polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) a trietilamina acuosa al 0,2% hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La mezcla se calentó hasta 65ºC a 70ºC durante 30 s para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La disolución se almacenó a 4ºC. Para cada conjunto de inyecciones, se 15 mezclaron 100 µg de péptido por dosis en 50 µl de PBS, 50 µg de MPL por dosis (50 µl) y 100 µl de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

Para preparar las dosis de vacuna con QS21 (grupos 3 y 7), se añadió polvo liofilizado (Aquila, Framingham, MA; Lote A7018R) a PBS, pH 6,6-6,7 hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó con vórtex. La solución se almacenó a -20ºC. Para cada conjunto de inyecciones, se mezclaron 100 µg de péptido por dosis en 20 50 µl de PBS, 25 µg de QS21 por dosis en 25 µl de PBS y 125 µl de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

Para preparar las dosis de vacuna con adyuvante de Freund (grupo 4), se emulsionaron 1:1 (vol:vol) 100 µg de AN1792 en 200 µl de PBS con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización. Para las inmunizaciones posteriores, el antígeno se emulsionó de manera similar con 25 adyuvante incompleto de Freund (IFA). Para las vacunas que contienen los adyuvantes alumbre, MPL o QS21, se combinaron 100 µg por dosis de AN1792 o de AN1528 con alumbre (1 mg por dosis) o MPL (50 µg por dosis) o QS21 (25 µg por dosis) en un volumen final de 200 µl de PBS y se administraron mediante inoculación subcutánea en la espalda entre los omóplatos. Para el grupo que recibió FA, se emulsionaron 1: 1 (vol:vol) 100 µg de AN1792 con adyuvante completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 µl y se administraron por vía intraperitoneal 30 para la primera inmunización, seguido por una administración de refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las cinco dosis posteriores. Para el grupo que recibió AN1792 sin adyuvante, se combinaron 10 µg de AN1792 con 5 µg de timerosal en un volumen final de 50 µl de PBS y se administraron por vía subcutánea. El noveno grupo control recibió sólo 200 µl de PBS administrados por vía subcutánea. Las inmunizaciones se administraron en un programa bisemanal para las primeras tres dosis, después 35 en un programa mensual en los días 0, 16, 28, 56, 85 y 112. Se extrajo sangre de los animales seis a siete días tras cada inmunización comenzando tras la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpos. Se sacrificaron los animales aproximadamente una semana tras la dosis final. Los desenlaces se midieron mediante ensayo de ELISA de los niveles de Aβ y APP en el cerebro y mediante la evaluación inmunohistoquímica de la presencia de placas amiloides en cortes de cerebro. Además, se determinaron los títulos de anticuerpos específicos frente a Aβ y 40 las respuestas de citocina y proliferativa dependientes de Aβ.

La tabla 9 muestra que los máximos títulos de anticuerpos frente a Aβ1-42 se obtuvieron con FA y AN1792, títulos que alcanzaron un máximo tras la cuarta inmunización (GMT máximo: 75.386) y después disminuyeron en un 59% tras la sexta inmunización final. El título medio máximo obtenido mediante MPL con AN1792 fue un 62% inferior al generado con FA (GMT máximo: 28.867) y también se alcanzó pronto en el esquema de inmunización, tras 3 45 dosis, seguido por una disminución hasta el 28% del valor máximo tras la sexta inmunización. El título medio máximo generado con QS21 combinado con AN1792 (GMT: 1.511) fue aproximadamente 5 veces inferior que el obtenido con MPL. Además, las cinéticas de la respuesta fueron más lentas, ya que se requirió una inmunización adicional para alcanzar la respuesta máxima. Los títulos generados por AN1792 unido a alumbre fueron ligeramente mayores que los obtenidos con QS21 y las respuestas cinéticas fueron más rápidas. Para AN1792 administrado en PBS con 50 timerosal, la frecuencia y el tamaño de los títulos fueron apenas mayores que para el PBS solo. Los títulos máximos generados con MPL y AN1528 (GMT máximo 3099) fueron aproximadamente 9 veces inferiores a los obtenidos con AN1792. El AN1528 unido a alumbre fue muy escasamente inmunogénico con títulos bajos generados sólo en algunos de los animales. No se observaron respuestas de anticuerpos en los animales control inmunizados con PBS solo. 55

Tabla 9

Títulos en media geométrica de anticuerposa

Semana de extracción de sangre

Tratamiento

3,3 5,0 9,0 13,0 17,0

Alumbre/ AN1792

102 (12/21)b 1.081 (17/20) 2.366 (21/21) 1.083 (19/21) 572 (18/21)

MPL/ AN1792

6241 (21/21) 28.867 (21/21) 1.1242 (21/21) 5.665 (20/20) 8.204 (20/20)

QS21/ AN1792

30 (1/20) 227 (10/19) 327 (10/19) 1.511 (17/18) 1.188 (14/18)

CFA/

10.076 61.279 75.386 41.628 30.574

AN1792

(15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)

Alumbre/ AN1528

25 (0/21) 33 (1/21) 39 (3/20) 37 (1/20) 31 (2/20)

MPL/ AN1528

184 (15/21) 2.591 (20/21) 1.653 (21/21) 1.156 (20/20) 3.099 (20/20)

QS21/ AN1528

29 (1/22) 221 (13/22) 51 (4/22) 820 (20/22) 2,994 (21/22)

PBS más timerosal

25 (0/16) 33 (2/16) 39 (4/16) 37 (3/16) 47 (4/16)

PBS

25 (0/16) 25 (0/16) 25 (0/15) 25 (0/12) 25 (0/16)

Notas al pie: a Títulos en media geométrica de anticuerpos medidos frente a Aβ1-42 b Número de animales que responden por grupo

En la figura 15 se muestran los resultados del tratamiento con AN1792 o AN1592 con diversos adyuvantes, o timerosal en la carga de amiloide cortical en ratones de 12 meses de edad determinados mediante ELISA. En ratones PDAPP control con PBS, el nivel de mediana de Aβ total en la corteza a los 12 meses fue de 1.817 ng/g. Se 5 observaron niveles notablemente reducidos de Aβ en ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y QS21 más AN1792. La reducción alcanzó significación estadística (p < 0,05) sólo para AN1792 más CFA/IFA. Sin embargo, tal como se muestra en los ejemplos I y III, los efectos de la inmunización en la reducción de los niveles de Aβ se hicieron sustancialmente mayores en ratones de 15 meses y 18 meses de edad. Así, se espera que al menos las composiciones de AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS21 10 lograrán significación estadística en el tratamiento de los ratones de más edad. En contraposición, AN1792 más el conservante timerosal mostró un nivel de mediana de Aβ aproximadamente igual al de los ratones tratados con PBS. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de Aβ42. El nivel de mediana de Aβ42 en los controles con PBS fue de 1624 ng/g. Se observaron niveles de mediana notablemente reducidos de 403, 1149, 620 y 714 en los ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y 15 AN1792 más QS21, respectivamente, logrando la reducción de la significación estadística (p = 0,05) para el grupo de tratamiento con AN1792 CFA/IFA. El nivel de mediana en los ratones tratados con AN1792-timerosal fue de 1619 ng/g de Aβ42.

X. Análisis de toxicidad

Se recogieron tejidos para el examen histopatológico a la finalización de los estudios descritos en los ejemplos 2, 3 y 7. Además, se llevaron a cabo análisis de hematología y bioquímica clínica en las muestras de sangre terminales de los ejemplos 3 y 7. Se evaluó la mayoría de los órganos principales incluyendo cerebro, pulmones, tejido linfático, sistema gastrointestinal, hígado, riñones, glándulas suprarrenales y gónadas. Aunque se observaron lesiones esporádicas en los animales del estudio, no hubo diferencias obvias, ni en los tejidos afectados 5 ni en la gravedad de las lesiones, entre los animales tratados con AN1792 y no tratados. No hubo lesiones histopatológicas únicas observadas en los animales inmunizados con AN-1782 en comparación con los animales tratados con PBS o no tratados. Tampoco hubo diferencias en el perfil de análisis de bioquímica clínica entre los grupos con adyuvante y los animales tratados con PBS en el ejemplo 7. Aunque hubo aumentos significativos en varios de los parámetros de hematología entre los animales tratados con AN1792 y adyuvante de Freund en el 10 ejemplo 7 con respecto a los animales tratados con PBS, se esperan estos tipos de efectos a partir del tratamiento con adyuvante de Freund y la peritonitis que acompaña y no indican ningún efecto adverso del tratamiento con AN1792. Aunque no formó parte de la evaluación toxicológica, se examinó extensamente la patología del cerebro de ratón PDAPP como parte de los criterios de valoración de eficacia. No se observaron signos de efectos adversos relacionados con el tratamiento en la morfología del cerebro en ninguno de los estudios. Estos resultados indican 15 que el tratamiento con AN1792 se tolera bien y está al menos sustancialmente libre de efectos secundarios.

XI. Prevención y tratamiento de los sujetos

Se lleva a cabo un ensayo de fase I de dosis única para determinar la seguridad. Se administra un agente terapéutico en dosificaciones crecientes a diferentes pacientes comenzando desde aproximadamente el nivel de eficacia supuesta de 0,01 y aumentando en un factor de tres hasta alcanzar un nivel de aproximadamente 10 veces 20 la dosificación eficaz en el ratón.

Se lleva a cabo un ensayo de fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionan pacientes con enfermedad de Alzheimer de temprana a media definida usando los criterios de la Alzheimer’s disease and Related Disorders Association (ADRDA) (Asociación de la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados) por EA probable. Los pacientes adecuados puntúan en el intervalo 12-26 en el Mini-Mental State Exam (MMSE) (examen de 25 estado mini-mental). Otros criterios de selección son que es probable que los pacientes sobrevivan durante la duración del estudio y la ausencia de problemas de complicación tales como el uso de medicaciones concomitantes que pueden interferir. Las evaluaciones en el nivel inicial de la función del paciente se realizan usando medidas psicométricas clásicas, tales como MMSE, y ADAS, que es una escala exhaustiva para evaluar pacientes con estado y función de enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicométricas proporcionan una medida de la progresión de la 30 afección de Alzheimer. También pueden usarse escalas de vida cualitativas adecuadas para controlar el tratamiento. También puede controlarse la progresión de la enfermedad mediante RMN. También pueden controlarse los perfiles sanguíneos de los pacientes incluyendo ensayos de respuestas de células T y anticuerpos específicos frente al inmunógeno.

Tras las medidas del nivel inicial, los pacientes comenzaron a recibir el tratamiento. Se aleatorizaron y se 35 trataron con el agente terapéutico o bien placebo de una forma enmascarada. Los pacientes se controlaron al menos cada seis meses. La eficacia se determina mediante una reducción significativa en la progresión de un grupo de tratamiento con respecto a un grupo placebo.

Se lleva a cabo un segundo ensayo de fase II para evaluar la conversión de los pacientes desde pérdida de memoria temprana sin enfermedad de Alzheimer, denominada en ocasiones alteración de la memoria asociada con 40 la edad (AAMI), hasta enfermedad de Alzheimer probable tal como se define mediante los criterios de la ADRDA. Los pacientes con alto riesgo de conversión a la enfermedad de Alzheimer se seleccionan de una población no clínica examinando las poblaciones de referencia para determinar signos tempranos de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con sintomatología previa al Alzheimer, una historia familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genéticos, edad, sexo y otras características encontradas para predecir un alto riesgo en la 45 enfermedad de Alzheimer. Se recogen las puntuaciones de nivel inicial en las métricas adecuadas incluyendo MMSE y ADAS junto con otras métricas diseñadas para evaluar una población más normal. Estas poblaciones de pacientes se dividieron en grupos adecuados con comparación de placebo frente a alternativas de dosificación con el agente. Se realizaron seguimientos de estas poblaciones de pacientes a intervalos de aproximadamente seis meses, y el criterio de valoración para cada paciente es si se convierte o no en enfermedad de Alzheimer probable tal como se 50 define por los criterios de ADRDA al final de la observación.

XII. Procedimientos y materiales generales

1. Medición de los títulos de anticuerpos

Se extrajo sangre de ratones realizando un pequeño corte en la vena de la cola y recogiendo aproximadamente 200 µl de sangre en un tubo de microcentrífuga. Se extrajo sangre de cobayas afeitando en 55 primer lugar la zona posterior del corvejón y después usando una aguja de calibre 18 para cortar la vena metatarsiana y recogiendo la sangre en tubos de microcentrífuga. Se dejó coagular la sangre durante una h a

temperatura ambiente (TA), se agitó con vórtex, después se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min para separar el coágulo del suero. Entonces se transfirió el suero a un tubo de microcentrífuga limpio y se almacenó a 4ºC hasta que se tituló.

Se midieron los títulos de anticuerpos mediante ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (placas de EIA Costar) con 100 µl de una solución que contenía 10 µg/ml de Aβ42 o SAPP o bien otros 5 antígenos tal como se observa en cada uno de los informes individuales en tampón de recubrimiento de pocillos (fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,5, azida sódica 0,1%) y se mantuvieron durante la noche a TA. Se aspiraron los pocillos y se añadieron los sueros a los pocillos comenzando a una dilución de 1/100 en diluyente de muestras (fosfato de sodio 0,014 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, albúmina sérica bovina al 0,6%, timerosal al 0,05%). Se realizaron siete diluciones en serie de las muestras directamente en las placas en etapas de tres veces hasta alcanzar una 10 dilución final de 1/218.700. Se incubaron las diluciones en los pocillos de las placas recubiertos durante una h a TA. Entonces se lavaron las placas cuatro veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. Se añadió a los pocillos el segundo anticuerpo, una Ig de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano blanco (obtenida de Boehringer Mannheim), como 100 µl de una dilución 1/3000 en diluyente de muestras y se incubó durante una h a TA. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces en PBS, Tween 20. Para desarrollar el cromógeno, se añadieron 100 µl de 15 Slow TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbencidina obtenida de Pierce Chemicals) a cada pocillo y se incubó durante 15 min a TA. Se detuvo la reacción mediante la adición de 25 µl de H2SO4 2 M. Entonces se leyó la intensidad del color en un Vmax de Molecular Devices a (450 nm - 650 nm).

Se definieron los títulos como el recíproco de la dilución de suero que da la mitad de la DO máxima. La DO máxima generalmente se tomó de una dilución 1/100 inicial, excepto en los casos con títulos muy altos, en cuyo 20 caso fue necesaria una dilución inicial superior para establecer la DO máxima. Si el punto al 50% cayó entre dos diluciones, se realizó una extrapolación lineal para calcular el título final. Para calcular los títulos en media geométrica de anticuerpos, se asignaron arbitrariamente a los títulos inferiores a 100 un valor de título de 25.

2. Ensayo de proliferación de linfocitos

Se anestesiaron los ratones con isoflurano. Se extrajeron los bazos y se enjuagaron dos veces con 5 ml de 25 PBS que contenía suero bovino fetal inactivado con calor al 10% (PBS-FBS) y después se homogeneizaron en una unidad Centricon de 50 µ (Dako A/S, Dinamarca) en 1,5 ml de PBS-FBS durante 10 s a 100 rpm en un sistema Medimachine (Dako) seguido por filtración a través de una malla de nailon de tamaño de poro 100 µ. Se lavaron los esplenocitos una vez con 15 ml de PBS-FBS, después se hicieron sedimentar mediante centrifugación a 200 x g durante 5 min. Se lisaron los glóbulos rojos resuspendiendo el sedimento en 5 ml de tampón que contenía NH4Cl 30 0,15 M, KHCO3 1 M, NaEDTA 0,1 M, pH 7,4 durante cinco min a TA. Entonces se lavaron los leucocitos como anteriormente. Se cultivaron células de bazo aisladas en fresco (105 células por pocillo) en conjuntos por triplicado en placas de microtitulación tratadas para cultivo tisular con fondo en forma de U de 96 pocillos (Corning, Cambridge, MA) en medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) complementado con L-glutamina 2,05 mM, penicilina/estreptomicina al 1% y FBS inactivado con calor al 10% durante 96 h a 37ºC. También se añadieron 35 diversos péptidos A, A1-16, A1-40, A1-42 o la proteína de secuencia inversa A40-1 a dosis que oscilaban desde 5 µM hasta 0,18 µM en cuatro etapas. Las células en los pocillos control se cultivaron con concanavalina A (Con A) (Sigma, nº de catálogo C-5275, a 1 µg/ml) sin proteína añadida. Se pulsaron las células durante las 24 h finales con 3H-timidina (1 µCi/pocillo obtenida de Amersham Corp., Arlington Heights IL). Entonces se recogieron las células en placas UniFilter y se contaron en un contador de centelleo de microplacas Top Count (Packard 40 Instruments, Downers Grove, IL). Los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm) de la radiactividad incorporada en las macromoléculas insolubles.

4. Preparación del tejido cerebral

Tras sacrificar los animales, se extrajeron los cerebros y se preparó un hemisferio para el análisis inmunohistoquímico, mientras que se diseccionaron tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) del 45 otro hemisferio y se usaron para medir la concentración de diversas proteínas A y formas de APP usando ELISA específicos (Johnson-Wood et al, citado anteriormente).

Se homogeneizaron los tejidos destinados para ELISA en 10 volúmenes de tampón guanidina enfriado con hielo (guanidina-HCl 5,0 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Se mezclaron los homogeneizados mediante agitación suave usando una Adams Nutator (Fisher) durante tres a cuatro h a TA, entonces se almacenaron a -20ºC antes de la 50 cuantificación de A y APP. Los experimentos anteriores han demostrado que los analitos eran estables en estas condiciones de almacenamiento y que la proteína A sintética (Bachem) podía recuperarse cuantitativamente cuando se añadía de manera conocida a los homogeneizados de tejido cerebral control de crías de ratón (Johnson-Wood et al, citado anteriormente).

5. Medición de los niveles de A 55

Se diluyeron los homogeneizados de cerebro 1:10 con diluyente de caseína enfriado con hielo (caseína al 0,25%, PBS, azida sódica al 0,05%, aprotinina 20 µg/ml, EDTA 5 mM pH 8,0, leupeptina 10 µg/ml) y después se centrifugaron a 16.000 x g durante 20 min a 4ºC. Se prepararon los patrones de proteína A sintética (1-42

aminoácidos) y los patrones de APP para que incluyeran guanidina 0,5 M y albúmina sérica bovina al 0,1% (BSA) en la composición final. El ELISA tipo sándwich para A "total" utiliza el anticuerpo monoclonal (mA) 266, específico para los aminoácidos 13-28 de A (Seubert, et al), como el anticuerpo de captura y el mA 3D6 biotinilado específico para los aminoácidos 1-5 de A (Johnson-Wood, et al), como el anticuerpo indicador. El mA 3D6 no reconoce APP secretado ni APP de longitud completa, sino que sólo detecta especies de A con un ácido aspártico amino-terminal. 5 Este ensayo tiene un límite inferior de sensibilidad de ~50 pg/ml (11 pM) y muestra que no hay reactividad cruzada con la proteína A murina endógena a concentraciones de hasta 1 ng/ml (Johnson-Wood et al, citado anteriormente).

El ELISA tipo sándwich específico para A1-42 emplea el mA 21F12, específico para los aminoácidos 33-42 de A (Johnson-Wood, et al), como el anticuerpo de captura. En este ensayo, mA 3D6 biotinilado también es el 10 anticuerpo indicador que tiene un límite inferior de sensibilidad de aproximadamente 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood et al). Para los ELISA de A/3, se recubrieron 100 µl de mA 266 (a 10 µg/ml) o bien mA 21F12 a (5 µg/ml) en los pocillos de placas de inmunoensayo de 96 pocillos (Costar) mediante incubación durante la noche a TA. Se extrajo la disolución mediante aspiración y se bloquearon los pocillos mediante la adición de 200 µl de albúmina sérica humana al 0,25% en tampón PBS durante al menos 1 h a TA. Se extrajo la solución de bloqueo y se 15 almacenaron las placas desecadas a 4ºC hasta su uso. Se rehidrataron las placas con tampón de lavado [solución salina tamponada con Tris (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5), más Tween 20 al 0,05%] antes de su uso. Se añadieron las muestras y los patrones en alícuotas por triplicado de 100 µl por pocillo y después se incubaron durante la noche a 4ºC. Se lavaron las placas al menos tres veces con tampón de lavado entre cada etapa del ensayo. Se añadió el mA 3D6 biotinilado, diluido hasta 0,5 µg/ml en tampón de ensayo de caseína (caseína al 20 0,25%, PBS, Tween 20 al 0,05% 20, pH 7,4) y se incubó en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió a los pocillos un conjugado de avidina-peroxidasa de rábano blanco, (Avidina-HRP obtenida de Vector, Burlingame, CA), diluido 1:4000 en tampón de ensayo de caseína, durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce) y se dejó reaccionar durante 15 minutos a TA, tras lo que se detuvo la reacción enzimática mediante la adición de 25 µl de H2SO4 2 N. Se cuantificó el producto de la reacción usando un Vmax de Molecular Devices que 25 mide la diferencia en la absorbancia a 450 nm y 650 nm.

6. Medición de los niveles de APP

Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, denominado APP-α/FL, reconoce APP-alfa (α) y las formas de longitud completa (FL) de APP. El segundo ensayo es específico para APP-α. El ensayo APP-α/FL reconoce la APP secretada incluyendo los primeros 12 aminoácidos de Aβ. Dado que el anticuerpo indicador (2H3) 30 no es específico frente al sitio clip α, que se produce entre los aminoácidos 612-613 de APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); este ensayo también reconoce APP de longitud completa (APP-FL). Los experimentos preliminares que utilizaban anticuerpos de APP inmovilizados frente a la cola citoplasmática de APP-FL para reducir los homogenizados en cerebro de APP-FL sugieren que aproximadamente el 30%-40% del APP-α/APP FL es FL (datos no mostrados). El anticuerpo de captura para ensayos de APP-α/FL y APP-α es mAβ 8E5, obtenido frente a 35 los aminoácidos 444 a 592 de la forma APP695 (Games et al., citado anteriormente). El mAβ indicador para el ensayo de APP-α/FL es mAβ 2H3, específico para los aminoácidos 597-608 de APP695 (Johnson-Wood et al., citado anteriormente) y el anticuerpo indicador para el ensayo de APP-α es un derivado biotinilado de mAβ 16H9, obtenido frente a los aminoácidos 605 a 611 de APP. El límite inferior de sensibilidad del ensayo de APP-α/FL es de aproximadamente 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al.) y el del ensayo específico para APP-α es de 22 ng/ml 40 (0,3 nM). Para ambos ensayos de APP, mAβ 8E5 se recubrió en los pocillos de placas de EIA de 96 pocillos tal como se describió anteriormente para mAβ 266. Se usó APP-α recombinante, purificado, como el patrón de referencia para el ensayo de APP-α y el ensayo de APP-α/FL (Esch et al., citado anteriormente). Se diluyeron 1:10 las muestras de homogenizado de cerebro en guanidina 5 M en diluyente de muestras para ELISA (tampón fosfato 0,014 M, pH 7,4, albúmina sérica bovina al 0,6%, timerosal al 0,05%, NaCl 0,5 M, NP40 al 0,1%). Después se 45 diluyeron 1:4 en diluyente de muestras que contenía guanidina 0,5 M. Entonces se centrifugaron los homogeneizados diluidos a 16.000 x g durante 15 segundos a TA. Se añadieron las muestras y los patrones de APP a la placa en alícuotas por duplicado y se incubaron durante 1,5 h a TA. Se incubó el anticuerpo 2H3 o 16H9 indicador biotinilado con las muestras durante 1 h a TA. Se incubó estreptavidina-fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim), diluida 1:1000 en diluyente de muestras en los pocillos durante 1 h a TA. Se añadió el sustrato 50 fluorescente 4-metil-umbeliferil-fosfato para incubación durante 30 min a TA y se leyeron las placas en un fluorímetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a excitación de 365 nm y a emisión de 450 nm.

7. Inmunohistoquímica

Se fijaron los cerebros durante tres días a 4ºC en paraformaldehído al 4% en PBS y después se almacenaron desde uno hasta siete días a 4ºC en paraformaldehído al 1%, PBS hasta que se realizaron los cortes. 55 Se practicaron cortes coronales de cuarenta micrómetros de espesor con un vibratomo a TA y se almacenaron en crioprotector (glicerol al 30%, etilenglicol al 30% en tampón fosfato) a -20ºC antes del tratamiento inmunohistoquímico. Para cada cerebro se incubaron durante la noche seis cortes en el nivel del hipocampo dorsal, cada uno separado mediante intervalos consecutivos de 240 µm, con uno de los siguientes anticuerpos: (1) un anti-Aβ biotinilado (mAβ, 3D6, específico para el Aβ humano) diluido hasta una concentración de 2 µg/ml en PBS y suero 60 de caballo al 1%; o (2) un mAβ biotinilado específico para el APP humano, 8E5, diluido hasta una concentración de 3

µg/ml en PBS y suero de caballo al 1,0%; o (3) un mAβ específico para la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluida 1:500 con Triton X-100 al 0,25% y suero de caballo al 1%, en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS); o (4) un mAβ específico para CD11b, el antígeno de MAC-1, (Chemicon International) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (5) un mAβ específico para el antígeno del CMH II, (Pharmingen) diluido 1:100 con Triton X-100 al 0,25% y suero de conejo al 1% en TBS; o (6) 5 un mAβ de rata específico para CD 43 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS o (7) un mAβ de rata específico para CD 45RA (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (8) un Aβ monoclonal de rata específico para CD 45RB (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (9) un Aβ monoclonal de rata específico para CD 45 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (10) un Aβ de hámster policlonal biotinilado específico para CD3e (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 10 1% en PBS o (11) un mAβ de rata específico para CD3 (Serotec) diluido 1:200 con suero de conejo al 1% en PBS; o con (12) una solución de PBS que carece de un anticuerpo primario que contiene suero de caballo normal al 1%.

Los cortes que se habían hecho reaccionar con las soluciones de anticuerpo enumeradas en 1,2 y 6-12 anteriormente se pretrataron con Triton X-100 al 1,0%, peróxido de hidrógeno al 0,4% en PBS durante 20 min a TA para bloquear la peroxidasa endógena. A continuación se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpo primario. 15 Los cortes que se habían hecho reaccionar con los mAβ 3D6 o 8E5 o CD3e se hicieron reaccionar entonces durante 1 h a TA con un complejo peroxidasa de rábano blanco-avidina-biotina con los componentes del kit “A” y “B” diluidos 1:75 en PBS (kit patrón Vector Elite, Vector Labs, Burlingame, CA.). Los cortes que se habían hecho reaccionar con anticuerpos específicos para CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 y la solución de PBS desprovista del anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a TA con IgG anti-rata biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS o IgG anti-ratón 20 biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS, respectivamente. Los cortes se hicieron reaccionar entonces durante una h a TA con un complejo peroxidasa de rábano blanco-avidina-biotina con los componentes del kit “A” y “B” diluidos 1:75 en PBS (kit patrón Vector Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).

Se desarrollaron los cortes en peróxido de hidrógeno al 0,01%, 3,3’-diaminobencidina (DAB) al 0,05% a TA. Los cortes destinados a la incubación con los anticuerpos específicos frente a GFAP, MAC-1 y CMH II se pretrataron 25 con peróxido de hidrógeno al 0,6% a TA para bloquear la peroxidasa endógena, después se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario a 4ºC. Los cortes que se habían hecho reaccionar con el anticuerpo frente a GFAP se incubaron durante 1 h a TA con la IgG anti-ratón biotinilada obtenida en caballo (Vector Laboratories; kit de vectastaína Elite ABC) diluida 1:200 con TBS. Entonces se hicieron reaccionar los cortes durante una h con un complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories; kit de vectastaína Elite ABC) diluido 1:1000 con TBS. Los 30 cortes incubados con los mAβ específicos frente a MAC-1 o CMH II, como los anticuerpos primarios, se hicieron reaccionar posteriormente durante 1 h a TA con IgG anti-rata biotinilada obtenida en conejo diluida 1:200 con TBS, seguido por la incubación durante una h con el complejo avidina-biotina-peroxidasa diluido 1:1000 con TBS. Los cortes incubados con anticuerpos específicos frente a GFAP, MAC-1 y CMH II se visualizaron entonces mediante tratamiento a TA con DAB al 0,05%, peróxido de hidrógeno al 0,01%, cloruro de níquel al 0,04%, TBS durante 4 y 11 35 min, respectivamente.

Los cortes marcados inmunológicamente se montaron en portaobjetos de vidrio (VWR, portaobjetos Superfrost), se secaron al aire durante la noche, se sumergieron en Propar (Anatech) y se recubrieron con cubreobjetos usando Permount (Fisher) como medio de montaje.

Para contrateñir las placas con Aβ, se montó un subconjunto de los cortes positivos para GFAP en 40 portaobjetos Superfrost y se incubó en tioflavina S acuosa al 1% (Sigma) durante 7 min tras el tratamiento inmunohistoquímico. Entonces se deshidrataron los cortes y se aclararon en Propar, después se recubrieron con cubreobjetos montados con Permount.

8. Análisis de imágenes

Se utilizó un sistema de análisis de imágenes Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) asociado a 45 un microscopio Microphot-FX de Nikon a través de una cámara de vídeo CCD y un monitor Triniton de Sony para la cuantificación de los portaobjetos inmunorreactivos. Se almacenó la imagen del corte en un tampón de vídeo y se determinó un umbral basado en el color y la saturación para seleccionar y calcular el área de píxel total ocupada por las estructuras marcadas inmunológicamente. Para cada corte, se realizó un perfil manual del hipocampo y se calculó el área de píxel total ocupada por el hipocampo. El porcentaje de carga de amiloide se midió como: (la 50 fracción del área del hipocampo que contiene depósitos de Aβ inmunorreactivos con mAβ 3D6) x 100. De manera similar, se midió el porcentaje de carga neurítica como: (la fracción del área del hipocampo que contiene neuritas distróficas reactivas con mAβ 8E5) x100. El sistema C-Imaging (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que opera con el programa de aplicación Simple 32 se asoció con un microscopio Microphot-FX de Nikon a través de una cámara Optronics y se usó para cuantificar el porcentaje de la corteza retrospenial ocupada por astrocitos positivos 55 para GFAP y microglía positiva para MAC-1 y CMH II. Se almacenó la imagen del corte que había reaccionado inmunológicamente en un tampón de vídeo y se determinó un umbral basado en monocromo para seleccionar y calcular el área de píxel total ocupada por las células marcadas inmunológicamente. Para cada corte, se realizó un perfil manual de la corteza retroesplenial (RSC) y se calculó el área de píxel total ocupada por la RSC. El porcentaje de astrocitosis se definió como: (la fracción de RSC ocupada por astrocitos reactivos con GFAP) X 100. De manera 60 similar, el porcentaje de microgliosis se definió como: (la fracción de la RSC ocupada por microglía reactiva con

MAC-1 o CMH II) X 100. Para todos los análisis de imágenes, se cuantificaron para cada animal seis cortes en el nivel del hipocampo dorsal, separado cada uno mediante intervalos consecutivos de 240 µm. En todos los casos, el observador desconocía el estado de tratamiento de los animales.

Aunque la anterior invención se ha descrito con detalle para el fin de la claridad de la comprensión, será evidente que se pueden realizar ciertas modificaciones en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. 5

TABLA 1

TÍTULO AL 50% de la D.O. MÁXIMA

Ratón inyectado con A agregado

Edad de PDAPP

Ratón 100 Ratón 101 Ratón 102 Ratón 103 Ratón 104 Ratón 105 Ratón 106 Ratón 107 Ratón 108

4

70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 80000 100000

6

15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000

8

20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000

10

40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000

12

25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000

Ratón inyectado con PBS con ambos inmunógenos

a 1/100

Edad de PDAPP ratón 113 ratón 114 ratón 115 ratón 116 ratón 117

6 < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c.

10 5 x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c.

12 < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c. < 4x kg peso c.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo para A y un vehículo o diluyente no tóxico farmacéuticamente aceptable para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente, en la que el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana.
2. 2. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada 5 por depósito amiloide en un paciente de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. 3. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
4. 4. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada 10 por depósito amiloide en un paciente de cualquier reivindicación precedente, en la que el anticuerpo se une específicamente a la forma agregada del péptido A sin unirse a la forma disociada.
5. 5. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el anticuerpo se une específicamente a la forma disociada del péptido A sin unirse a la forma agregada. 15
6. 6. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el anticuerpo se une a las formas tanto agregada como disociada del péptido A.
7. 7. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el depósito 20 amiloide comprende péptido A agregado.
8. 8. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el paciente es un ser humano.
9. 9. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada 25 por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la enfermedad es enfermedad de Alzheimer.
10. 10. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el paciente es asintomático opcionalmente en la que el pacientes tiene menos de 50 y/o tiene factores de riesgos hereditarios que 30 indican susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer.
11. 11. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el anticuerpo se administra por vía oral, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía tópica o por vía intravenosa.
12. 12. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada 35 por depósito amiloide en un paciente de cualquier reivindicación precedente, en la que el anticuerpo se administra a una dosificación de aproximadamente 0,01 a 5 mg/kg del peso corporal del hospedador.
13. 13. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad caracterizada por depósito amiloide en un paciente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se administra mediante una primera inmunización seguida de refuerzos a intervalos de 6 semanas o que se administra 40 mediante una primera inmunización seguido de refuerzos 1, 2 y 12 meses más tarde o que se administra cada dos meses a lo largo de la vida.
14. 14. Un método in vitro de control de la enfermedad de Alzheimer o propensión a la misma en un paciente, que comprende: detectar un anticuerpo que se une específicamente al péptido A en una muestra del paciente, donde una composición farmacéutica como se indica en cualquiera de las reivindicaciones 1-6 eficaz para tratar o prevenir 45 la enfermedad de Alzheimer se ha administrado al paciente y el nivel del anticuerpo detectado determina el régimen del tratamiento futuro del paciente.
15. 14. Un método in vitro de evaluación de la eficacia de un método de tratamiento de Alzheimer en un paciente, que comprende determinar un valor para una cantidad de anticuerpo específico para péptido A en una muestra de tejido en un paciente que se ha tratado con una composición farmacéutica como se indica en cualquiera de las 50 reivindicaciones 1-6;

    comparar el valor con un valor control determinado de una población de pacientes que experimentan mejoría de, o

    ausencia de, síntomas de la enfermedad de Alzheimer debido al tratamiento con el anticuerpo como se indica en cualquiera de las reivindicaciones 1-6; donde un valor en el paciente al menos igual al valor control indica una respuesta positiva al tratamiento.