MXPA00005426A - Prevencion y tratamiento de enfermedades amiloidogenicas - Google Patents

Abstract

Esta invención suministra composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades amiloidogénicas. Estos métodos consisten en administrar un agente que induzca una respuesta inmune benéfica contra un depósito de amiloides en el paciente. Los métodos son particularmenteútiles para el tratamiento profiláctico y terapéutico de la enfermedad de Alzheimer. En estos métodos, un agente adecuado es el péptido A( o un anticuerpo del mismo.

Description

PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AMILOIDOGÉNICAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud se deriva de la prioridad de la solicitud de patente USSN 60/067,740, presentada el 2 de diciembre de 1997, y la solicitud de patente USSN 60/080,970, presentada el 7 de abril de 1998, las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad y para todo propósito.

CAMPO TÉCNICO Esta Invención reside en los campos técnicos de la inmunología y la medicina.

ANTECEDENTES La enfermedad de Alzheimer (AD) es une enfermedad progresiva, que resulta en la demencia senil. Véase generalmente Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Ardí et al., WO 92/13068; Selkoe, J. Neuropathol . Exp . Neurol . 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995). Hablando generalmente, la enfermedad se divide en dos categorías: ataque tardío, que ocurre en la vejez (65 años y más) y el ataque temprano, el cual se desarrolla mucho antes del período senil, es decir, entre los 35 y 60 años. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma, pero las anormalidades tienden a hacerla más severa y extensa en casos que comienzan en una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por dos tipos de lesiones en el cerebro, placas seniles y laberintos neurofibrilares . Las placas seniles son áreas de neurópilos desorganizados hasta de 150 µm transversalmente, con depósitos amiloides extracelulares en el centro, visibles por el análisis microscópico de secciones de tejidos del cerebro. Los laberintos neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteínas tau, que consisten de dos filamentos torcidos entre sí en parejas. El constituyente principal de las placas es un péptido nombrado péptido Aß o ß-amiloide. Este péptido Aß es un fragmento interno de 39 a 43 aminoácidos de una proteína precursora denominada proteína precursora de amiloide (APP) . Varias mutaciones dentro de la proteína APP se han correlacionado con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Véase, por ejemplo, Goate et al., Nature 349, 704 (1991) (valina717 hasta isoleucina); Chartier Harían et al., Nature 353, 844 (1991) (valina717 hasta glicina) ; Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valina717 hasta fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet . 1, 345 (1992) (una doble mutación que cambia la lisina -metionina la asparaginaS95-leucinaS9S) . Tales mutaciones se piensa causan la enfermedad de Alzheimer por procesos aumentados o alterados de la APP al Aß, particularmente de la APP a cantidades aumentadas de la forma larga del Aß (es decir, Aßl-42 y Aßl-43), Las mutaciones de otros genes, tal como los genes de presenilina, PS1 y PS2 , se piensa afectan indirectamente el proceso de la APP para generar cantidades aumentadas de la forma larga de Aß (véase Ardí, TINS 20, 154 (1997)). Estas observaciones indican que el Aß, y particularmente su forma larga, es un elemento que causa la enfermedad de Alzheimer. McMichael, patente EP 256,511, propone la administración de una dosis homeopática (menor o igual a 10* -2 mg/día) del Aß a pacientes con la AD preestablecida. En un humano típico, con alrededor de 5 litros de plasma, aún el límite superior de esta dosis se espera genera una concentración no mayor de 2 pg/ml. La concentración normal del Aß en el plasma humano, está típicamente en el intervalo de 50-200 pg/ml (Saubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)) . Debido a que la dosis propuesta en la patente EP 526,511 apenas altera el nivel del Aß de circulación endógena y debido a que la EP 526,511 no recomienda el uso de un auxiliar, parece improbable que resulte cualquier beneficio terapéutico. En contraste, la presente invención se dirige ínter, alia al tratamiento de enfermedades de Alzheimer y otras amiloidogénicas, por la administración del Aß u otros inmunógenos a un paciente, bajo condiciones que generen una respuesta inmune benéfica en el paciente. La invención cumple así con una necesidad que existe desde hace muchos años, para regímenes terapéuticos, con el fin de prevenir o mejorar la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN RECLAMADA En un aspecto, la invención suministra métodos para prevenir o tratar una enfermedad, caracterizada por el depósito amiloide en un paciente. Tales métodos inducen una respuesta inmune contra un componente de péptido de un depósito amiloide en el paciente. Tal inducción puede ser activa, por la administración de un inmunógeno, o pasiva, por la administración de un anticuerpo o un fragmento activo o derivado del - anticuerpo . En algunos pacientes, el depósito amiloide es el péptido Aß agregado y la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. En algunos métodos, el paciente es asintomático. En otros métodos, el paciente es menor de 50 años de dad. En otros métodos, el paciente tiene factores de riesgo heredados, que indican la susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer. Tales factores de riesgo incluyen variantes de alelos en el gene de presenilina PS1 o PS2 y formas variantes de la APP. En otros métodos el paciente no tiene -factores de riesgo para la enfermedad de Alzheimer. Para el tratamiento de pacientes que sufren de la enfermedad de Alzheimer, un régimen de tratamiento causa la administración de una dosis del péptido Aß al paciente, para inducir la respuesta inmunológica. En algunos métodos, el péptido Aß es administrado con un auxiliar, que aumenta la respuesta inmune al péptido Aß. En algunos métodos, el auxiliar es el alumbre. En otros métodos, el auxiliar es la MPL. La dosis del péptido Aß administrado al paciente es típicamente de al menos 1 ó 10 µg, si se administra con el auxiliar, y al menos de 50 µg, si se administra sin auxiliar. En algunos métodos, la dosis es cuando menos de 100 µg.

En algunos métodos, el péptido Aß es el Aßl-41. En algunos métodos, el péptido Aß se administra en forma agregada. En otros métodos, el péptido Aß se administra en forma disociada. En algunos métodos, el agente terapéutico es una dosis efectiva de un Aß que codifica un ácido nucleico o un fragmento activo o su derivado. El Aß que codifica el ácido nucleico o su fragmento, se expresa en el paciente para producir el Aß o su fragmento activo, el cual induce la respuesta inmunogénica. En algunos de estos métodos, el ácido nucleico se administra a través de la piel, opci nalmente por medio de un parche. En algunos métodos, el agente terapéutico se identifica por la clasificación de una colección de compuestos para identificar un compuesto reactivo con los anticuerpos al Aß, y la administración del compuesto al paciente induce la respuesta inmunológica. En algunos métodos, la respuesta inmunológica se dirige al péptido Aß agregado sin ser dirigido al péptido Aß disociado. Por ejemplo, la respuesta inmunológica puede comprender anticuerpos que se unen al péptido Aß agregado sin unirse al péptico Aß disociado. En algunos métodos, la respuesta inmunológica comprende las células T que se unen al Aß que forma un complejo con MCHI o MHC11 en las células CD8 o CD4. En otros métodos, la respuesta inmunológica es inducida por la administración de un anticuerpo al Aß en el paciente. En algunos métodos, la respuesta inmunológica es inducida por remover las células T desde el paciente, hacer el contacto de las células T con el péptido Aß bajo condiciones en las cuales estas células T son preparadas, y reemplazar las células T en el paciente. El agente terapéutico es administrado típicamente en forma oral, intranasal, intradermal, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosamente. En algunos métodos, el paciente es vigilado en seguida de la administración, para evaluar la respuesta inmunológica. Si la inspección indica una reducción en la respuesta ínmunológica con el tiempo, el paciente puede ser administrado con una o más dosis adicionales del agente. En otro aspecto, la invención suministra composiciones farmacéuticas que comprenden el Aß y un excipiente adecuado para las rutas de administración orales y otras. La invención también suministra composiciones farmacéuticas que comprenden un agente efectivo para inducir una respuesta inmunogénica contra el Aß en un paciente, y un auxiliar aceptable f rmacéuticamente. En algunas de tales composiciones, el agente es el Aß o su fragmento activo. En algunas composiciones, el auxiliar comprende el alumbre. En algunas composiciones, el auxiliar comprende una emulsión de aceite en agua. En algunas composiciones, el Aß o el fragmento activo es un componente de un copolímero de poliláctido-poliglicólido (PLPG) u otra partícula. La invención asimismo suministra composiciones que comprenden el Aß o un fragmento activo enlazado a una molécula conjugada, que promueve la entrega del Aß a la corriente sanguínea de un paciente y/o promueve una respuesta inmunológica contra el Aß. Por ejemplo, el conjugado puede servir para promover una respuesta inmunológica contra el Aß. En algunas composiciones, el conjugado es la toxina del cólera. En algunas composiciones, el conjugado es una inmunoglobulina. En algunas composiciones, el conjugado es la toxina de difteria atenuada CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-3 (1997) ) . La invención también suministra composiciones farmacéu icas que comprenden un agente efectivo en inducir una respuesta inmunogénica contra el Aß en un paciente, con la condición que la composición esté exenta del auxiliar de Freund Completo. La invención también suministra composiciones que comprenden un vector viral que codifica el Aß o un fragmento activo del mismo, efectivo en inducir una respuesta inmunológica contra el Aß. Vectores virales adecuados incluyen los herpes, adenovirus, virus adenoasociados, un retrovirus, sinbis, semiliki forest virus, vacuna o erupciones pustulosas de las aves. La invención asimismo suministra métodos para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer. En tales métodos, una dosis efectiva del péptido Aß se administra a un paciente. La invención además suministra el uso del Aß, o un anticuerpo del mismo, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. - En otro aspecto, la invención suministra métodos para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de Alzheimer en un paciente. En estos métodos, una cantidad básica del anticuerpo específico para el péptido Aß se determina en una muestra de tejido desde el paciente antes del tratamiento con un agente. Una cantidad del anticuerpo específico para el péptido Aß en la muestra de tejido desde el paciente, después del tratamiento con el agente, se compara a la cantidad de línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß. Una cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después del tratamiento, la cual es significativamente mayor que la cantidad de línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß, indica un tratamiento positivo resultante. En otros métodos de evaluar la eficacia de un método de tratamiento de Alzheimer en un paciente, una cantidad de línea básica del anticuerpo específico para el péptido Aß en una muestra de tejido de un paciente, antes del tratamiento con un agente, se determina. Una cantidad del anticuerpo específico para el péptido Aß en la muestra de tejido desde el sujeto, después del tratamiento con el agente, se compara a la cantidad de línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß. Una reducción o carencia de una diferencia significante entre la cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después del tratamiento, comparada con la cantidad de línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß, indica un resultado de tratamiento negativo. En otros métodos para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina una cantidad de control específica del anticuerpo para el péptido Aß en las muestras del tejido desde una población de control. Una cantidad del anticuerpo específico para el péptido Aß en una muestra de tejido desde el paciente, después de la administración de un agente, se compara a la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido A-ß. Una cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después del tratamiento, que es significantemente mayor que la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido Aß, indica un resultado de tratamiento positivo. En otros métodos de evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, una cantidad de control del anticuerpo específica para el péptido Aß en muestras de tejidos desde una población de control se determina. Una cantidad del anticuerpo específico para el péptido Aß en una muestra de tejido del paciente, después de administrar un agente, se compara con la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido Aß. Una carencia de una diferencia significante entre la cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después de iniciar el tratamiento, comparada con la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido Aß, indica un resultado de tratamiento negativo. Otros métodos de vigilar la enfermedad de Alzheimer o su susceptibilidad en un paciente, comprende detectar una respuesta inmunológica contra el péptido Aß en una muestra del paciente. En algunos de tales métodos, el paciente es administrado con un agente efectivo para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, y el nivel de la respuesta determina el régimen de tratamiento futuro del paciente. En otros métodos de evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, se determina un valor para una cantidad específica del anticuerpo para el péptido Aß en una muestra de tejido de un paciente, el cual se ha tratado con un agente. EL valor se compara con el valor de control, determinado de una población del paciente que experimenta una mejora de, o exenta de, síntomas de la enfermedad de Alzheimer, debido al tratamiento con el agente. Un valor en el paciente al menos igual al valor de control, indica una respuesta positiva del tratamiento.

La invención además suministra equipos d diagnóstico para llevar a cabo los métodos anteriores. Esto equipos incluyen típicamente un reactivo, que se un específicamente a los anticuerpos en el Aß o que estimula la proliferación de las células T reactivas con A-ß.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Título del anticuerpo, después de l inyección del ratón transgénico con el Aßl-42. Figura 2: Amiloide cargado en el hipocampo. El porcentaje del área de la región del hipocampo ocupada po las placas de amiloide, definido por la reactividad con el mAß 3D6 específico de Aß, se determinó por el análisis de imagen cuantitativa, asistida por computadora de las secciones del cerebro inmunorre ccionadas . Los valores para ratones individuales se muestran clasificados por el grupo de tratamiento. La línea horizontal para cada agrupació indica el valor mediano de la distribución. Figura 3: Distrofia neurítica en el hipocampo. El porcentaje del área de la región del hipocampo, ocupada por las neuritas distróficas, definida por su reactividad con el mAß 8ES específico de la APP humana, se determinó por el análisis cuantitativo de imagen, asistido por computadora, de las secciones del cerebro inmunorreaccionadas . Los valores para los ratones individuales se muestran para el grupo tratado con AN1792 y el grupo de control tratado con PBS. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor mediano de la distribución. Figura Astrocitosis en la corteza retroesplenial . El porcentaje del área de la región cortical ocupada por los astrocitos positivos de la proteína acida fibrilar glial (GFAP) , se determinó por el análisis cuantitativo, asistido por computadora, de las secciones del cerebro inmunorreaccionadas . Los valores para ratones individuales se muestran clasificados por el grupo de tratamiento y los valores del grupo mediano se indican po las líneas horizontales." Figura 5 : Títulos promedios geométricos de anticuerpos al Aßl-42, en seguida de la inmunización con un intervalo de ocho dosis del AN1792, que contiene 0.14, 0.4, 1.2, 3.7, 11, 33, 100 ó 300 µg. Figura 6: Cinética de la respuesta de anticuerpo a la inmunización de AN1792. Los títulos se expresan como las medias geométricas de los valores para los 6 animales en cada grupo . Figura 7: El análisis cuantitativo de imagen del amiloide cortical cargado en ratones tratados con PBS y AN1792. Figura 8: Análisis cuantitativa de imagen de la placa neurítica cargada en ratones tratados con PBS y AN1792. Figura 9: Análisis cuantitativa de imagen del porcentaje de la corteza retroesplenial ocupada po astrocitosis en ratones tratados con PBS y AN1792. Figura 10: Ensayo de Proliferación de Linfocitos en células del bazo de ratones tratados con AN1792 (panel superior) o tratados con PBS (panel inferior) . Figura 11: Niveles totales de Aß en la corteza.

Una proyección diseminada de los perfiles individuales de Aß en ratones inmunizados con los derivados del Aß o la APP, combinados con el auxiliar de Freund. Figura 12 : El amiloide cargado en la corteza se determinó por el análisis cuantitativo de imagen de las secciones del cerebro inmunorreaccionadas para ratones inmunizados con los conjugados del péptido de Aß, Aßl-5, ASI -12, Aßl-13-28; la longitud completa de los agregados de Aß, AN1792 (ASI - 1) y AN1528 (Aßl-40) y el grupo de control tratado con PBS. Figura 13 : Los títulos medios geométricos del anticuerpo específico de Aß para grupos de ratones inmunizados con derivados del Aß o la APP, combinados con el auxiliar de Freund. Figura 14 : Títulos medios geométricos del anticuerpo específico de Aß para grupos de conejillos de India, inmunizados con AN1792, o su derivado del ácido palmítico, combinado con varios auxiliares. Figura 15 : Niveles de Aß en la corteza de ratones PDAPP de 12 meses de edad, tratados con AN1792 o AN1528, con diferentes auxiliares.

DEFINICIONES El término de "identidad substancial", significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineados óptimamente, tal como por los programas GAP o BESTFIT, usando pesos de huecos implícitos, comparten al menos 65 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 80 ó 90 por ciento de la identidad de secuencia, más preferiblemente, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo el 99 por ciento de la identidad de secuencia o mayor) . Preferiblemente, las posiciones residuales que no son idénticas difieren por substituciones conservativas de aminoácidos. Para comparaciones de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de la comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia entran en una computadora, las coordenadas de subsecuencias se diseñan, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de la secuencia luego calcula el porcentaje de la identidad de secuencia para una o más secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa designado. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación, se puede realizar, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math . 2:2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman S- Wunsch, ". Mol . Biol . . 48:443 (1979) , por la búsqueda para la similaridad del método d Person & Lipman, Proc . Nat-1 . Acad. Sci . USA 85:2444 (1998), por realizaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) , o por la inspección visual (véase generalmente Ausubel et al., supra) . Un ejemplo del algoritmo que es adecuado para determina la identidad del porcentaje de secuencia y la similaridad de secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschull et al., ". Mol .

Biol . . 215:403-410 (1990). El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Informatio (http : //www.ncbi .nlm.nih.gov/) . Típicamente, los parámetros del programa implícitos pueden ser usados para llevar a cabo la compasión de la secuencia, aunque también se pueden usar los parámetros acostumbrados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores implícitos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de clasificación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89, 10915 (1989)).

Para fines de la clasificación de substituciones de aminoácidos como conservativas y no conservativas, los aminoácidos son agrupados como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas) : norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutrales) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas) : asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena) : gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas) : trp, tyr, phe. Las substituciones conservativas implican substituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las substituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra. Los agentes terapéuticos de la invención son, típicamente, substancialmente puros. Esto significa que un agente es típicamente al menos de alrededor del 50% en pésol peso de pureza, al igual que substancialmente libre de proteínas y contaminantes que causan interferencia. Algunas veces los agentes son al menos de alrededor del 80% en pésol peso y, más preferiblemente, al menos el 90 o alrededor del 95% pésol peso de pureza. Sin embargo, usando las técnicas convencionales de purificación de proteínas, péptidos homogéneos de al menos el 99% peso/peso se pueden obtener. La unión específica entre dos entidades significan una afinidad de cuando menos 10s, 107, 108, ÍO^'1 ó 1010 M"1. Las afinidades mayores de 108 M"1, se prefieren. El término de "anticuerpo" se usa para incluir anticuerpos intactos y sus fragmentos de unión. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto desde el cual ellos se derivan para el enlazamiento específico a un antígeno. Opcionalmente, anticuerpos o sus fragmentos de unión, pueden ser conjugados químicamente a, o expresados como, proteínas de fusión con otras proteínas. APP695, APP751 y APP770, se refieren, respectivamente, a los residuos de aminoácidos 695, 751 y 770 de polipéptidos largos codificados por el gene APP humano. Véase Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988) ; y Ki taguchi et al . , Nature 331, 530 (1988). Los aminoácidos dentro de la proteína precursora amiloide (APP) humana, tienen números signados de acuerdo con la secuencia de la isoforma de APP770. Los términos, tal como Aß39, Aß40, Aß41, Aß42 y Aß43 se refieren a un péptido Aß que contiene los residuos de los aminoácidos 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 y 1-43. El término de "epítope" "determinante antigénico", se refiere a un sitio en un antígeno, al cual responden las células B y/o T. Los epítopes de células B se pueden formar tanto de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos, yuxtapuestos por el doblez terciario de una proteína. Los epítopes formados de aminoácidos contiguos se retienen típicamente en la exposición a solventes de desnaturalización, en tanto los epítopes formados por el doblez terciario se pierden típicamente en el tratamiento con - solventes de desnaturalización. Un epítope incluye generalmente al menos 3 y, más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopes incluyen, por ejemplo la cristalografía de rayos x y la resonancia magnético-nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epi tope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E Morris, Ed. (1996) . Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope pueden ser identificados en un inmunoensayo sencillo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Las células T reconocen epítopes continuos de alrededor de nueve aminoácidos para las células CD8 o alrededor de 13 a 15 aminoácidos para las células CD4. Las células T que reconocen el epítope pueden ser identificadas por los ensayos in vi tro que miden la proliferación dependiente del antígeno, según se determina por la incorporación de la 3H-timidina por las células T tratadas previamente, en respuesta a un epítope (Burke et al., J". Inf . Dis . 170, 11110-19 (1994)), por la destrucción dependiente del antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Im unol . 156, 3901-3910) o por la secreción de la citosina. El término de respuesta "inmunológica" o "inmune", es el desarrollo de una respuesta humoral benéfica (mediada por anticuerpo) y/o celular (mediada por células T específicas del antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un péptido amiloide en un paciente receptor. Tal respuesta puede ser una respuesta activa, inducida por la administración de un inmunógeno, o una respuesta pasiva, inducida por la administración del anticuerpo o las células T tratadas. Una respuesta inmune celular es evocada por la presentación de epítopes de polipéptidos en asociación con las moléculas MHC de Clase I o Clase II, para activar las células asistentes T CD4+ específicas del antígeno y/o las células T citotóxicas CD8+. La respuesta puede también implicar la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrositos, células microglia, eosinófilos u otros componentes de inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células, puede ser determinada por ensayos de proliferación (células T CD4+) o ensayos CTL (linfocitos T citotóxicos) (véase Burke, supra : Tigges, supra) . Las contribuciones relativas de las respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno, pueden ser distinguidas por asilar separadamente la IgG y las células T de un animal singenéico inmunizado y medir el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto . Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo, en la administración a un paciente, opcionalmente en conjunto con un auxiliar.

El término de "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido que no forma complejos con los materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos son algunas veces clonados en un vector de plasmida. El término de "auxiliar" se refiere a un compuesto que, cuando se administra en conjunto con un antígeno, aumenta la respuesta inmune al antígeno, pero, cuando se administra solo, no genera una respuesta inmune al antígeno. Los auxiliares pueden aumentar una respuesta inmune por varios mecanismos, que incluyen el reclutamiento de linfocitos, el estímulo de las células B y/o T y el estímulo de los macrófagos . El término de "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos, que reciben un tratamiento o profiláctico o terapéutico. El Aß no agregado o monomérico significa unidades solubles de péptido monoméricas de Aß. Un método para preparar el Aß monomérico es disolver el péptido liofilizado en el DMSO neto, con sonicación. La solución resultante se centrífuga para remover cualquier partícula no soluble. El Aß agregado es una mezcla de oligómeros en la cual las unidades monoméricas son mantenidas juntas por enlaces no covalentes . Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o más de los elementos mencionados, pueden incluir otros elementos no mencionados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un péptido Aß abarca tanto un péptido Aß aislado como un péptido Aß como un componente de una secuencia de polipéptidos mayor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA I . Datos Generales La invención suministra composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades, caracterizadas por la acumulación de depósitos amiloides. Estos depósitos amiloides comprenden un péptido agregado a una masa insoluble. La naturaleza del péptido varía en diferentes enfermedades y en muchos casos, el agregado tiene una estructura de hoja ß-plegada y teñida con el tinte Congo Rojo. Las enfermedades caracterizadas por los depósitos de amiloides incluyen la enfermedad de Alzheimer (AD) , de ataque tanto tardío como tempranero. En ambas enfermedades, el depósito de amiloide comprende un péptido nombrado Aß, el cual se acumula en el cerebro de los individuos afectados. Ejemplos de algunas otras enfermedades, caracterizadas por los depósitos de amiloides son la amiloidosis SAA, el síndrome hereditario de Islandia, mieloma múltiple y encefalopatías espongiformes, que incluyen la enfermedad de las vacas "locas", la enfermedad de Creutzfeldt Jacob, descarnado de ovejas y encefalopatía espongiforme del visón (véase Weissmann et al., Curr. Opin . Neurobiol . 7, 695-700 (1997); Smits et al., Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997); Nathansn et al., Am. J. Epidemiol . 145, 959-969 (1997) ) . Los péptidos que forman los agregados en estas enfermedades son el amiloide A del suero, cistantina C, IgG kappa de cadena ligera respectivamente para los primeros tres y proteína prion para los otros.

II . Agentes Terapéuticos 1. Enfermedad de Alzheimer Los agentes terapéuticos para su uso en la presente invención, inducen una respuesta inmune contra el péptido Aß. Estos agentes incluyen el propio péptido Aß y sus variantes, análogos y miméticos de este péptido Aß, que inducen y/o reaccionan en forma cruzada con los anticuerpos al péptido Aß, y los anticuerpos o las células T reactivos con el péptido Aß. La inducción de una respuesta inmune puede ser activa, como cuando un inmunológico se administra para inducir a que los anticuerpos o las células T reaccionen con el Aß en un paciente, o pasiva, como cuando un anticuerpo se administra de modo que por sí solo se una al Aß del paciente. El Aß también se conoce como el péptido -----amiloide, o el péptido A4 (véase la patente US 4,666,829; Glenenr & Wong, Biochem, Biophys, Res . Común, 120, 1131 (1984) ) . es un péptido de 39-43 aminoácidos, el cual es el componente principal de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. El Aß se genera por el proceso de una proteína mayor, APP, por dos enzimas, denominadas secretasas ß y ? (véase Ardí, TINS 20, 154, (1997)). Mutaciones conocidas en la APP, asociadas con la enfermedad de Alzheimer, ocurren próximas al sitio de la secretasa ß o Y , o dentro de Aß. Por ejemplo, la posición 717 está próxima al sitio de desdoblamiento de la secretasa ? de la APP en su proceso al Aß, y las posiciones 670/671 están próximas al sitio del desdoblamiento de la secretasa ß. Se cree que lasa mutaciones causan la enfermedad AD por interaccionar con las reacciones de desdoblamiento por las cuales el Aß se forma, para así aumentar la cantidad de la forma 42/43 de aminoácidos del Aß generado. Este Aß tiene la propiedad inusual que puede fijarse y activar cascadas complementarias tanto clásicas como alternativas. En particular, se une a Clq y finalmente a C3bi. Esta asociación facilita la unión a macrófagos que conducen a la activación de las células B. Además, el C3bi se descompone ulteriormente y luego se une a CR2 en las células B en una manera dependiente de la célula T, que causa un aumento de 10,000 en la activación de estas células. Este mecanismo causa que Aß genere tina respuesta inmune en exceso de aquélla de otros antígenos. El agente terapéutico usado en los métodos reclamados, puede ser cualquiera de las formas que ocurren naturalmente del péptido Aß y particularmente las formas humanas (es decir, Aß39, Aß40, Aß41, Aß42 o Aß43) . Las secuencias de estos péptidos y su relación al precursor de la APP se ilustran por la Figura 1 de Ardí et al., TINS 20, 155-158 (1992). Por ejemplo, el Aß42 tiene la secuencia: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val . Ile-Ala-OH.

Los Aß41, Aß40 y Aß39 difieren de Aß42 por la omisión de Ala, Ala-lie, y Ala-Ile-Val, respectivamente, desde el extremo terminal C. Aß43 difiere de Aß42 por la presencia de un residuo de treonina en la terminal C. El agente terapéutico puede también ser un fragmento activo o análogo del péptido Aß natural, que contiene un epítope que induce a una respuesta inmunológica similar, protectora o terapéutica, en la administración a un humano. Los fragmentos inmunogénicos tienen típicamente una secuencia de al menos 3, 5, 6, 10 ó 20, aminoácidos contiguos desde un péptido natural. Fragmentos inmunogénicos incluyen el Aßl-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 y 35-42. Fragmentos de la mitad de la terminal N de Aß son preferidos en algunos métodos. Los análogos incluyen las especies alélicas y las variantes inducidas . Los análogos difieren típicamente de los péptidos que ocurren naturalmente en una o unas cuantas posiciones, a menudo en virtud de las substituciones conservativas. Los análogos exhiben típicamente al menos el 80 ó 90% de identidad de secuencia con los péptidos naturales . Algunos análogos también incluyen aminoácidos no naturales o modificaciones de los aminoácidos de la terminal N ó C. Ejemplos de aminoácidos no naturales son los aminoácidos , a-disubstituidos, los aminoácidos de N-alquilo, el ácido láctico, 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxi-lisina, ?-N-metilarginina . Los fragmentos y análogos se pueden clasificar en la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales transgénicos, como se describe abajo. El Aß, sus fragmentos, análogos y otros péptidos amiloidogénicos, pueden ser sintetizados por la síntesis de péptidos de fase sólida o la expresión recombinante, o pueden ser obtenidos de fuentes naturales. Los sintetizadores automáticos de péptidos están disponibles comercialmente de muchos surtidores, tal como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresión recombinante puede ser en bacterias, tal como en E. coli, levaduras, células de insectos o células de mamíferos. Los procedimientos para la expresión recombinante se describen por Sambrook et al., Molecular Cloninga : A Laboratory Manual (C.S. H.P. Press, NY 2a Ed., 1989). Algunas formas del péptido Aß también están disponibles comercialmente (por ejemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA y California Peptide Research, Inc. Napa, CA) . Los agentes terapéuticos también incluye polipéptidos que comprenden, por ejemplo, un péptido Aß, su fragmento activo o análogo, junto con otros aminoácidos. Por ejemplo, el péptido Aß puede estar presente como una proteína intacta de la APP o su segmento, tal como un fragmento C-100 que comienza en la terminal N de Aß y continúa hasta el final de la APP. Tales polipéptidos pueden ser clasificados para la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales, como se describe abajo. El péptido Aß, su análogo, fragmento activo u otro polipéptido se pueden administrar en forma asociada (es decir, como un péptido amiloide) o en forma disociada. Los agentes terapéuticos también incluyen multímeros de los agentes inmunogénicos monoméricos . En una variante más, un péptido inmunogénico, tal como Aß, puede ser presentado como una vacuna viral o bacterial. Un ácido nucleico que codifica el péptido inmunogénico se incorpora en un genoma o episona del virus o bacteria. Opcionalmente, el ácido nucleico se incorpora de tal manera que el péptido inmunogénico se exprese como una proteína secretada o como una proteína de fusión con una proteína superficial externa de un virus o una proteína de transmembrana de una bacteria, así que el péptido sea exhibido. Los virus o bacterias usados en tales métodos deben ser no patogénicos o estar atenuados. Virus adecuados incluyen el adenovirus, HSV, vacuna y rubéola. La fusión de un péptido inmunogénico al HbsAg del HBV es particularmente adecuada. Los agentes terapéuticos también incluyen los péptidos y otros compuestos que no tienen necesariamente una similaridad de secuencia de aminoácidos significante con el Aß, pero, no obstante, sirven como imitativos del Aß e inducen una respuesta inmune similar. Por ejemplo, cualquier - péptido y proteína que forme hojas ß-plegadas, puede ser clasificado por su forma adecuada. Los anticuerpos anti- idiotípicos contra los anticuerpos monoclonales al Aß u otros péptidos amiloidogénicos pueden también ser usados. Tales anticuerpos anti-ld imitan el antígeno y generan una respuesta inmune al mismo (véase Essential Immunology (Roit Ed. , Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6a Ed. ) página 181) .

Las colecciones aleatorias de péptidos u otros compuestos pueden también ser clasificadas en su forma adecuada. Las colecciones combinatorias pueden ser producidas por muchos tipos de compuestos, que se pueden sintetizar en una forma paso por paso. Tales compuestos incluyen los polipéptidos, miméticos beta-vuelta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas N-substituidas oligoméricas y oligocarbamatos . Las colecciones combinatorias grandes de los compuestos pueden ser construidas por el método de las colecciones sintéticas codificadas (ESL) , descrito en Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 y Scripps, WO 95/30642 (cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia para todo propósito. Las colecciones de péptidos pueden también ser generadas por los métodos de exhibición de fagos. Véase, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980. Las colecciones combinadas y otros compuestos se clasifican inicialmente para la forma adecuada, determinando su capacidad de unirse a anticuerpos o linfocitos )B ó T) , conocidos como específicos para Aß u otros péptidos amiloidogénicos. Por ejemplo, las clasificaciones iniciales se pueden realizar con cualquier suero policlonal o anticuerpo monoclonal a Aß u otro péptido amiloidogénico. Los compuestos identificados por tales clasificaciones son luego analizados en la capacidad de inducir anticuerpos o linfocitos reactivos a Aß u otro péptido amiloidogénico. Por ejemplo, se pueden probar múltiples diluciones de sueros en placas microtituladoras, que se han recubierto previamente con el péptido Aß y se puede realizar un análisis ELISA estándar para probar los anticuerpos reactivos al Aß. Los compuestos pueden luego ser probados en la eficiencia profiláctica y terapéutica en animales transgénicos, predispuestos a una enfermedad amiloidogénica, como se describe en los Ejemplos. Tales animales incluyen, por ejemplo, ratones que llevan una mutación 717 de la APP, descritos por Games et al., supra, y ratones que llevan una mutación Swedish de la APP, tal como se describe por McConlogue et al., US 5,612,486, y Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc . Nati . Acad. Sci. USA 94,13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1977)). El mismo acercamiento de clasificación se puede usar en otros agentes potenciales, tal como los fragmentos de Aß, análogos de Aß y péptidos más largos que incluyen el Aß, descritos antes. Los agentes terapéuticos de la invención también incluyen anticuerpos que se unen específicamente a Aß. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Algunos de estos anticuerpos se unen específicamente a la forma agregada de Aß sin unirse a la forma disociada. Alguna unión específicamente a la forma disociada sin unirse a la forma agregada. Alguna unión a las formas tanto agregada como disociada. La producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo el murino o la rata, puede ser lograda, por ejemplo, inmunizando el animal sin Aß. Véase Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado aquí como referencia para todo propósito) . Tal inmunógeno puede ser obtenido de una fuente natural, por la síntesis de péptidos o por la expresión recombinante. Las formas humanizadas de anticuerpos de ratón se pueden generar enlazándolas regiones de CDR de los anticuerpos no humanos a las regiones constantes humanas por técnicas del ADN recombinante. Véase Queen et al., Proc .

Na ti . Acad. Sci . USA 86, 10029-10033 (1939) y WO 90/07861 (incorporadas aquí como referencia para todo propósito) . Los anticuerpos humanos se pueden obtener usando los métodos de exhibición de fagos. Véase, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047. E? estos métodos, las colecciones de fagos se producen en las cuales los miembros exhiben anticuerpos diferentes en sus superficies externas. Los anticuerpos se exhiben usualmente como fragmentos Fv ó Fab. Los anticuerpos que exhiben fagos con una especificidad deseada, se seleccionan por el enriquecimiento de afinidad al Aß, o sus fragmentos. Los anticuerpos humanos contra el Aß, pueden también ser producidos de mamíferos transgénicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del sitio de la inmunoglobulina humana y un sitio de inmunoglobulina endógeno inactivado. Véase, por ejemplo, Lonberg et al.,, WO 93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad y para todo propósito) . Los anticuerpos humanos pueden ser seleccionados por experimentos competitivos de unión, o de otra manera, para tener la misma especificidad de epítope como un anticuerpo de ratón particular. Estos anticuerpos probablemente, en forma particular, comparten las propiedades funcionales útiles de los anticuerpos del ratón. Los anticuerpos policlonales humanos pueden también ser provistos en la forma de suero de humanos inmunizado con un agente inmunogénico. Opcionalmente, estos anticuerpos policlonales se pueden concentrar por la purificación de afinidad, usando el Aß u otro péptido amiloide, como un reactivo de afinidad. Los anticuerpos humanos o humanizados se pueden diseñar para tener la región constante de la IgG, IgD, IgA e Ige, y cualquier isótopo, que incluyen la IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. Los anticuerpos se pueden expresar como tetrámeros, que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab' F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena sencilla, en que los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras se enlazan a través de un espaciador. Los agentes terapéuticos, para el uso en los métodos presentes también incluyen las células T que se unen al péptido Aß. Por ejemplo, las células T pueden ser activadas contra el péptido A-ß, expresando un gene humano MHC de clase I, y un gene humano de la ß-2-microglobulina desde una línea celular de insectos, por lo cual se forma un complejo vacío sobre la superficie de las células y puede unirse al péptido Aß. Las células T en contacto con la línea celular llegan a ser activados específicamente contra el péptido. Véase Peterson et al., US 5,314,813. Las líneas celulares de insectos, que expresan un antígeno MHC clase II pueden ser similarmente usadas para activar las células T de CD4. 2. Otras Enfermedades Principios iguales o análogos determinan la producción de los agentes terapéuticos para el tratamiento de otras enfermedades amiloidogénicas . En general, los agentes, antes mencionados, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, pueden también ser usados para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer de ataque temprano, asociada con el síndrome de Down. En la enfermedad de las vacas "locas", el péptido prion, sus fragmentos activos y análogos, y los anticuerpos al péptido prion, se usan en la colocación del péptido Aß, sus fragmentos activos, análogos y anticuerpos al péptido Aß, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. En el tratamiento del mieloma múltiple, la cadena ligera de la IgG y sus análogos y anticuerpos se usa, etc., en otras enfermedades. 3. Proteínas Portadoras Algunos agentes para inducir la respuesta inmunológica contienen el epítope apropiado para inducir una respuesta inmunológica contra los depósitos de amiloides, pero son demasiado pequeños para ser inmunogénicos. En esta situación, un inmunógeno de péptido puede ser enlazado a un portador adecuado para ayudar a evocar una respuesta inmunológica. Portadores adecuados incluyen las albúminas del suero, hemocianina de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, toxoide del tétano, o un toxoide de otras bacterias patógenas, tal como de la difteria, E. coli , cólera o H. pylori , o un derivado de toxina atenuado. Otros portadores para estimular o aumentar una respuesta inmunológica incluyen las citocinas, tal como la IL-1, IL-1 a y MlPla y ß y RANTES. Los agentes inmunogénicos pueden también ser enlazados a péptidos que aumentan el transporte a través de tejidos, como se describe en O'Mahony, WO 97/17613 y WO 97/17614. Los agentes inmunogénicos pueden ser enlazados a portadores por entrelazamiento químico. Las técnicas para el enlace de un inmunógeno a un portador incluyen la formación de enlaces de disulfuro, que usan el N-succinimidil-3- (2-piridil -tio) -propionato (SPDP) y el succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) (si el péptido carece de un grupo sulfhidrilo, éste puede ser provisto por la adición de un residuo de cisteína) . estos reactivos crean un enlace de disulfuro entre ellos mismos y la cisteína del péptido reside en una proteína y un enlace de amida a través del e-amino en una lisina, u otro grupo amino libre en otros aminoácidos. Una variedad de agentes que forman disulfuro/amida se describen por Immun . Rev. 62, 185 (1982). Otros agentes acopladores bifuncionales forman un tioéter, más bien que un enlace de disulfuro. Muchos de estos agentes que forman el tioéter están disponibles comercialmente e incluyen los esteres reactivos del ácido 6-maleímidocapróico, ácido 2-bromoacético y ácido 2-yodoacético. ácido 4- (N-maleimido-metil) ciclohexan-1-carboxílico. Los grupos de carboxilo pueden ser activados combinando estos con la succinimida o el ácido l-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico, como sal de sodio. Los péptidos inmunogénicos pueden también ser expresados como proteínas de fusión con portadores. El péptido inmunogénico puede ser enlazado a la terminal de amino, la terminal de carboxilo o internamente al portador. Opcionalmente, múltiples repeticiones del péptido inmunogénico pueden estar presentes en la proteína de fusión. 4. Inmunógenos que Codifican el Ácido Nucleico Las respuestas inmunológícas contra los depósitos amiloides pueden también ser inducidas por la administración de ácidos nucleicos que codifican al péptido Aß u otros inmunógenos de péptidos. Tales ácidos nucleicos pueden ser el ADN o el ARN. Un segmento del ácido nucleico que codifica el inmunógeno está enlazado típicamente a elementos reguladores, tal como un promotor e intensificador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células objetivo intentadas de un paciente. Para la expresión en células sanguíneas, como es conveniente por la inducción de una respuesta inmunológica, los elementos promotores e intensificadores de genes de la inmunoglobulina de cadenas ligeras o pesadas o el promotor e intensificador temprano intermedio principal de CMV, son adecuados para dirigir la expresión. Los elementos reguladores enlazados y las secuencias codificadoras son a menudo clonadas en un vector.

Un número de sistemas de vectores virales están disponibles, que incluyen los sistemas retrovirales (véase, por ejemplo, Lawrie y Tumin, Cur. Opin, Genet, Develop. 3 , 102-109 (1993) ) ; vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Bett et al., ". Virol . 67, 5911 (1993)); vectores de virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. , 179, 1867 (1994), vectores virales de la familia de erupciones pustulosas , que incluyen los virus de la vacuna y los virus de erupciones pustulosas de las aves, vectores virales de géneros de virus alfa, tal como aquellos derivados de Sinbis y Semliki Forest Viruses (véase, por ejemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), y virus del papiloma (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 315-333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 y Xiao & Brandsma, Nucleic Acids, Res. 24, 2630-2622 (1996)). El ADN que codifica un inmunógeno, o un vector que contiene el mismo, pueden ser empacados en liposomas. Lípidos adecuados y análogos relacionados se describen en las patentes de E.U.A., Nos. 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 y 5,283,185. Los vectores y el "ADN que codifica un inmunógeno puede también ser adsorbido a, o asociado con, portadores en partículas, ejemplos de los cuales incluyen los polímeros de metacrilato de polimetilo y los poli-láctidos y poli (láctido-co-glicólidos) , véase, por ejemplo, McGee et al., J". Micro Encap . (1996) . Los vectores de la terapia de genes o el ADN sin tratamiento se pueden entregar in vivo por la administración de un paciente individual, típicamente por la administración sistémica, (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradermal , intramuscular, subdermal o infusión intracraneal) o la aplicación tópica (véase, por ejemplo, la patente US 5,399,346). El ADN puede también ser administrado usando una pistola de genes. Véase Xiao & Brandsma, supra . El ADN que codifica un inmunógeno se precipita sobre la superficie de glóbulos de metal microscópicos. Los microproyectiles son acelerados con una onda de choque o gas de helio en expansión, y penetran en tej idos a una profundidad de varias capas celulares . Por ejemplo, es adecuado el dispositivo The Accel ™ Gene Delivery Device, fabricado por Agacetus, Inc., Middleton Wl . Alternativamente, el ADN sin tratamiento puede pasar a través de la piel dentro de la corriente sanguínea, simplemente manchando el ADN sobre la piel con irritación química o mecánica (véase WO 95/05853) .

En una variante más, los vectores que codifican los inmunógenos, pueden ser entregados a células ex vivo, tal como a células explantadas de un paciente individual (por ejemplo linfocitos, aspirados de la médula del hueso, biopsia de tejidos) o células donadoras universales de estirpe hematopoiética , seguido por la reimplantación de las células en un paciente, usualmente después de la selección de las células que han incorporado el vector.

III. Pacientes Recomendables al Tratamiento Pacientes que pueden someterse al tratamiento incluyen los individuos con riesgo de enfermedad, pero que no muestran síntomas, al igual que pacientes que muestran actualmente síntomas. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, virtualmente cualquier individuo tiene el riesgo de sufrir la enfermedad de Alzheimer cuando vive demasiado. Por lo tanto, los presentes métodos se pueden administrar profilácticamente a Ta población general sin cualquier evaluación del riesgo del paciente. Los presentes métodos son especialmente útiles para individuos quienes tienen un riesgo genético conocido de la enfermedad de Alzheimer. Estos individuos incluyen aquellos que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad, y aquellos cuyo riesgo se determina por el análisis de los marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos de riesgo hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen las mutaciones en el gene APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y las posiciones 670 y 671, referidas como las mutaciones de Ardí y de Swedish, respectivamente (véase Ardí, TINS, supra) . Otros marcadores de riesgo son las mutaciones en los genes de la presenilina, PS1 y PS2 , y ApoE4 , la historia de la familia de la AD, la hipercolesterolemia o ateroesclerosis. Los individuos que sufren actualmente de la enfermedad de Alzheimer pueden ser reconocidos de la demencia característica, al igual que la presencia de los factores de riesgo antes descritos. Además, un número de pruebas de diagnóstico están disponibles para identificar individuos que tienen la AD . Ellos incluyen la medición de los niveles de CSF tau y Aß42. Los niveles de tau elevados y Aß42 disminuidos, significan la presencia de la AD. Los individuos que sufren de la enfermedad de Alzheimer pueden también ser diagnosticados por los criterios de MMSE o ADRDA, como se discute en la sección de Ejemplos.

En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar en cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30 años) . Sin embargo, usualmente no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente llega a los 40, 50, 60 ó 70 años. El tratamiento consiste típicamente en múltiples dosis en un período de tiempo. Este tratamiento puede ser inspeccionado por el ensayo de anticuerpos, o respuestas de células T o células B activadas al agente terapéutico (por ejemplo, el péptido Aß) con el tiempo. Si la respuesta falla, se indica una dosis de impulso. En el caso de pacientes potenciales del síndrome de Down, el tratamiento puede comenzar antenatalmente por la administración del agente terapéutico a la madre o brevemente después del nacimiento .

IV. Regímenes de Tratamiento En aplicaciones profilácticas, las composiciones o medicamentos farmacéuticos se administran a un paciente susceptible a, o de otra manera con riesgo de, una enfermedad particular, en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o retardo del comienzo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente que se sospecha o ya sufre de tal enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como la dosis efectiva terapéutica o farmacéuticamente. En los regímenes, tanto profilácticos como terapéuticos, los agentes se administran usualmente en varias dosis, hasta que se logre una respuesta inmunológica suficiente. Típicamente, la respuesta inmunológica es vigilada y se suministran dosis repetidas si esta respuesta inmunológica comienza a disminuir. Dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las condiciones antes descritas, varían en dependencia de muy diferentes factores, que incluyen los medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras medicinas administradas y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente, el paciente es un humano, pero, en algunas enfermedades, tal como la enfermedad de las vacas "locas", el paciente puede ser un mamífero no humano, tal como un bovino. Las dosis de tratamiento necesitan ser tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. La cantidad del inmunógeno depende de si se va a administrar también un auxiliar, con dosis mayores siendo requeridas en la ausencia del auxiliar. La cantidad del inmunógeno para la administración, algunas veces varía de 1 µg hasta 500 µg por paciente y más usualmente de 5 a 500 µg por inyección para la administración a humanos. Ocasionalmente, una dosis mayor de 1-2 mg por inyección se usa. Típicamente, alrededor de 10, 20, 50 ó 100 µg se usan para cada inyección a un humano. El tiempo de las inyecciones puede variar significantemente desde una vez al día o una vez al año, hasta una vez en una década. En cualquier día dado cuando la dosis del inmunógeno se suministra, la dosis es mayor de 1 µg/paciente y usualmente mayor de 10 µg/paciente, si el auxiliar también se administra y mayor de 10 µg/paciente y usualmente mayor de 100 µg/paciente en la ausencia del auxiliar. Un régimen típico consiste de una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de 6 semanas. Otro régimen consiste de una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo a 1, 2 y 12 meses después. Otro régimen consiste en la inyección cada dos meses de por vida. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo pueden ser con una base irregular, como se indica por la vigilancia de la respuesta inmune. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0.0001 hasta 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 hasta 5 mg/kg del peso corpóreo del anfitrión. Las dosis para los ácidos nucleicos que codifican el intervalo inmunológico es de aproximadamente 10 ng hasta 1 g, 100 ng hasta 100 mg, 1 µg hasta 10 mg, o 30 a 300 µg del ADN por paciente. Dosis para los vectores virales infecciosos varían de 10 hasta 109, o más viriones por dosis. Los agentes para inducir una respuesta inmune pueden ser administrados por medios parenterales, tópicos, intravenoso, orales, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales o intramusculares, para un tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La ruta más típica de administración es la subcutánea, aunque otras pueden ser igualmente efectivas. La siguiente más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección es llevado a cabo más típicamente en los músculos del brazo o la pierna. Las inyecciones intravenosas, al igual que las inyecciones intraperitoneales, intraarteriales, intracraneales o intradérmicas, son también efectivas en generar una respuesta inmune. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular, donde los depósitos se han acumulado. Los agentes de la invención pueden, opcionalmente, ser administrados en combinación con otros agentes que son, al menos parcialmente, efectivos en el tratamiento de enfermedades amiloidogénicas . En el caso del síndrome de Alzheimer y de Down, en donde los depósitos amiloides ocurren en el cerebro, los agentes de la invención pueden también ser administrados en conjunto con otros agentes, que aumentan el pasaje de los agentes de la invención a través de la barrera de sangre-cerebro. Los agentes inmunogénicos de la invención, tal como los péptidos, son algunas veces administrados en combinación con un auxiliar. Se pueden usar una variedad de auxiliares en combinación con un péptido, tal como el Aß, para provocar una respuesta inmune. Los auxiliares preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un inmunógeno, sin causar cambios de conformación en el inmunógeno que afecte la forma cualitativa de la respuesta. Auxiliares preferidos incluyen el alumbre, el lípido A de monofosforilo 3-de-0-acetilado (MPL) (véase la patente GB 2220211) . El QS21 es un glicósido de triterpeno o saponina aislado de la corteza del árbol de Quillaja Saponaria Molina, encontrad en América del Sur (véase Kensil et al . , en Vaccine Desig The Subuni t and Ajuvant Approach (Eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); la patente de E.U.A., No. 5,057,540). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite e agua (tal como el aceite de escualos o de cacahuate) , opcionalmente en combinación con estimulantes inmunes, tal como el lípido A de monofosforilo (véase Stoute et al . , N. Engl . J. Med. 336, 86-91 (1997) ) . "otro auxiliar es el Cp (Bioworld Today, Nov. 15, 1998) . Alternativamente, el A puede ser acoplado a un auxiliar. Por ejemplo, una versió de lipopéptido del Aß puede ser preparada acoplando el ácid palmítico u otros lípidos, directamente a la terminal N del Aß, como se describe para la vacuna de antígeno de l hepatitis B (Livingston, J. Inmuno 1 . 159, 1383-1392 (1977)). Sin embargo, tal acoplamiento no debe cambia substancialmente la conformación del Aß para así afectar l naturaleza de la respuesta inmunológica. Los auxiliares se pueden administrar como un componente de una composició terapéutica con un agente activo o pueden ser administradas separadamente, antes, concurrentemente con, o después de l administración del agente terapéutico.

Una clase preferida de auxiliares son las sales de aluminio (alumbre) , tal como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Algunos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes específicos de inmunoestímulo, tal como el MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos, tal como el ácido poliglutámico o la polilisina. Otra clase de auxiliares son las formulaciones en emulsión de aceite en agua. Tales auxiliares se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tal como los péptidos de muramilo (por ejemplo, la N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , N-acetilglucosa-aminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi-propil-amida (DTP-DPP) theramide™) u otros componentes bacteriales de la pared celular. Las emulsiones de aceite en agua incluyen: (a) MF59 (WO 90/14837) , que contiene 5% de Squalene, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85 (conteniendo, opciopalmente, varias cantidades de MTP-PE) formulado en partículas submicrométricas con el uso de un microfluidizador, tal como el microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) ; (b) SAF, que contiene 10% de Squalene, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado plurónico y thr.MDP, o microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a un vórtice para generar una emulsión con tamaño de partículas más grandes, y (c) el sistema de auxiliar Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) , que contiene 2% de Squalene, 0.2% de Tween 80 y uno o más componentes celulares de paredes celulares, del grupo que consta de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueletos de paredes celulares (CWS) , preferiblemente MPL + CWS (Detox™) , Otras clases de auxiliares preferidos son los auxiliares de la saponina, tal como el Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, MA) o partículas generadas del mismo, tal como los ISOCOM (complejos inmunoestimuladores) y el ISCOMATRIX. Otros auxiliares incluyen el Auxiliar de Freund Completo (CFA) , y el Auxiliar de Freund Incompleto (IFA) . Otros auxiliares incluyen las citocinas, tal como las interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12) , el factor que estimula colonias de macrófagos (M-CSF) , y el factor de necrosis de tumores (TNF) .

Un auxiliar se puede administrar con un inmunógeno antes, concurrente con o después de_ la administración de este inmunógeno. El inmunógeno y auxiliar se pueden empacar y suministrar en el mismo frasco o pueden ser empacados en frascos separados y mezclarlos antes del uso. El inmunógeno y auxiliar se empacan típicamente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica intentada. Si el inmunógeno y auxiliar se empacan separadamente, el paquete incluye típicamente las instrucciones para la mezcla antes del uso. La selección de un auxiliar y/o portador depende de la estabilidad de la vacuna que contiene el auxiliar, la ruta de administración, el programa de dosis, la eficacia del auxiliar para las especies que se vacunan y, en humanos, un auxiliar aceptable farmacéuticamente es uno que se ha aprobado o se puede aprobar para la administración humana por cuerpos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el auxiliar de Freund Completo no es adecuado para la administración humana. El alumbre, MPL y QS21 son preferidos. Opcionalmente, dos o más diferentes auxiliares pueden ser usados simultáneamente. Combinaciones preferidas incluyen el alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21, y alumbre, QS21 y MPL juntos. También, el auxiliar de Freund Incompleto se puede usar (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinación con cualquiera del alumbre, QS21 y MPL, y sus combinaciones . Los " agentes de la invención son a menudo administrados como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase Remington ' s Pharmaceutical Science (15a Ed. Mack Publishing Company, , Easton, Pennsylvania, 1980) . La forma preferida depende del modo intentado de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones pueden también incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluentes farmacéuticamente aceptables, que se definen como los vehículos comúnmente usados para formular las composiciones farmacéuticas para la administración a humanos o animales. El diluente se selecciona para no afectar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluentes son el agua destilada, solución fisiológica salina regulada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrano y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, auxiliares o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos no inmunogénicos, y similares. Sin embargo, algunos reactivos adecuados para la administración a animales, tal como el auxiliar de Freund Completo, no se incluyen típicamente en composiciones para el uso humano. Las composiciones farmacéuticas pueden también incluir macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tal como las proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tal como la sefarosa funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, y similares) , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y agregados lípidos (tal como gotitas de aceite o liposomas) . Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, auxiliares) . Para la administración parenteral, los agentes de la invención se pueden administrar como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluente aceptable fisiológicamente, con un portador farmacéutico, el cual puede ser un líquido estéril, tal como aceites en agua, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, substancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionadores, agentes tensoactivos, substancias que regulan el pH y similares, pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son aquellos del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético. En general, los glicoles, tal como el propílen-glicol o el polietilen-glicol son los portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables . Típicamente, las composiciones se preparan como preparaciones inyectables, o como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para soluciones en, o suspensiones en , vehículos líquidos antes de la inyección también se preparan. La preparación también puede ser emulsionada o encapsulada en liposomas o micropartículas, tal como el poliláctido, poliglicólido, o copolímero para el efecto auxiliar aumentado, como se discute abajo (véase Lange, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Los agentes de esta invención se pueden administrar en la forma de una inyección de depósito o preparación de implante, la cual se puede formular de tal manera como para permitir la liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

Formulaciones adicionales, adecuadas para otro modos de administración, incluyen las formulaciones orales intranasales y pulmonares, supositorios y aplicacione tansdermales . Para los supositorios, los aglutinantes portadores incluyen, por ejemplo, los polialquilen-glicole o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar d mezclas que contienen el ingrediente activo en el interval del 0.5 al 10%, preferiblemente del 1 al 2%. Formulacione orales incluyen los excipientes, tal como los grado farmacéuticos del manitol, lactosa, almidón, estearato d magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato d magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones polvos de liberación sostenida, y contienen del 10 al 95 del ingrediente activo, preferiblemente del 25 al 70%. La aplicación tópica puede resultar en la entreg transdermal o intradermal . Esta administración tópica pued ser -facilitada por la co-administración del agente con l toxina del cólera o derivados destoxificados o su subunidades u otras toxinas bacteriales similares (véas Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La co-administració puede ser lograda usando los componentes como una mezcla o como moléculas enlazadas, obtenidas por el entrelazamiento o expresión químicos como una proteína de fusión. Alternativamente, la entrega transdermal puede ser lograda usando una trayectoria de la piel o usando transferosomas (Paul et al., Eur. J. I munol . 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys, Acta 1368, 201-15 (1998) ) .

V. Métodos de Diagnóstico La invención suministra métodos para detectar una respuesta inmunológica contra el péptido Aß en un paciente que sufre de o es susceptible a la enfermedad de Alzheimer. Los métodos son particularmente útiles para vigilar el curso del tratamiento administrado a un paciente. Los métodos se pueden usar para vigilar tanto el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos como el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos . Algunos métodos consisten en determinar un valor de línea básica de una respuesta inmunológica en un paciente, antes de la administración de una dosis del agente, y comparar éste con un valor para la respuesta inmunológica después del tratamiento. Un aumento significante (es decir, mayor del intervalo típico de error experimental en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar del valor medio de tales mediciones) en valor de la respuesta inmune señala un resultado de tratamiento positivo (es decir, la administración del agente ha logrado o aumentado la respuesta inmunológica) . Si el valor de la respuesta inmunológica no cambia significativamente, o disminuye, se indica un tratamiento negativo. En general, los pacientes que sufren de un curso inicial de tratamiento con un agente se espera muestren un aumento en la respuesta inmunológica con dosis sucesivas, el cual llega finalmente a una estabilización. La administración del agente es continuada generalmente mientras las respuesta inmune es aumentada. La obtención del equilibrio es un indicador de que el tratamiento de administración se puede discontinuar o reducir en la dosis o la frecuencia. En otros métodos, un valor de control (es decir, una desviación media y estándar) de la respuesta inmune se determina por una población de control.- Típicamente, los individuos n la población de control no han recibido un tratamiento anterior. Los valores medidos de la respuesta inmune" en un paciente, después de la administración de un agente ~ terapéutico, son luego comparados con el valor de control. Un aumento significante con relación al valor de control (por ejemplo, mayor de una desviación estándar del promedio) señala un resultado de tratamiento positivo. Una carencia de un aumento significante o disminución, señala un resultado de tratamiento negativo. La administración del agente es continuada generalmente mientras la respuesta inmunológica es aumentada con relación al valor de control. Como antes, el logro de un equilibrio con relación a los valores de control es una indicación que la administración del tratamiento puede ser discontinuada o reducida en dosis o frecuencia. En otros métodos, un valor de control de la respuesta inmunológica (por ejemplo una desviación media y estándar) se determina de una población de control de individuos quienes se someten al tratamiento con un agente terapéutico y cuyas respuestas inmunes se han equilibrado con -respuesta al tratamiento. Los valores medidos de la respuesta inmune en un paciente se compara con el valor de control . Si el nivel medido en un paciente no es significantemente diferente (por ejemplo, mayor que una desviación estándar) del valor de control, el tratamiento puede ser discontinuado. Si el nivel en un paciente está significantemente debajo del valor de control, la administración continuada del agente es ordenada. Si el nivel en los pacientes persiste debajo del valor de control, entonces puede ser indicado un cambio en el régimen del tratamiento, por ejemplo, el uso de un diferente auxiliar. En otros métodos, un paciente que no recibe actualmente tratamiento, pero se ha sometido a un curso previo de tratamiento, se vigila en la respuesta inmunológica para determinar si se requiere reasumir el tratamiento. El valor medido de la respuesta inmunológica en el paciente se puede comparar con un valor de la respuesta inmunológica previamente lograda en el paciente, después de un curso previo de tratamiento. Una disminución significante con relación a la medición previa (es decir, mayor de un intervalo típico de error en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicación que el tratamiento se puede reasumir. Alternativamente, el valor medido en el paciente puede ser comparado con un valor de control (desviación media más estándar) determinado en la población de pacientes después de someterse a un curso de tratamiento. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede ser comparado con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente, quienes permanecen exentos de síntomas de enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente, quienes muestran una mejoría de las características de la enfermedad. En todos estos casos, una disminución significante con relación al nivel de control (es decir, mayor que la desviación estándar) es un indicador que el tratamiento debe ser reasumido en un paciente. La muestra del tejido para el análisis es típicamente la sangre, plasma, suero, moco o fluido espinal cerebral del paciente. La muestra se analiza para índices de una respuesta inmunológica a cualquier forma del péptido Aß, típicamente el Aß42. La respuesta inmunológica puede ser determinada de la presencia de, por ejemplo, anticuerpos o células T, que se unen específicamente al péptido Aß. Los métodos de ensayos ELISA para detectar anticuerpos, específicos al Aß, se describen en la sección de Ejemplos. Los métodos de detectar células T reactivas se han descrito anteriormente (véase Definiciones) .

La invención además suministra equipos de diagnóstico para llevar a cabo los métodos de diagnostico descritos anteriormente. Típicamente, estos equipos contienen un agente que se une específicamente a los anticuerpos a Aß o reacciona con las células T específicas para el Aß. El equipo puede también incluir una etiqueta. Para la detección de anticuerpos a Aß, la etiqueta está típicamente en la forma de anticuerpos anti-idiotípicos rotulados. Para la detección de anticuerpos, el agente puede ser suministrado antes de unir a la fase sólida, tal como a las cavidades de un disco microtitulador . Para la detección de las células T reactivas, la etiqueta puede ser suministrada como la 3H~timidina, para medir una respuesta proliferativa. Los equipos también contienen típicamente leyendas que suministran las direcciones para el uso del equipo. Estas indicaciones pueden también incluir una gráfica u otro sistema de correspondencia que correlaciona los niveles de la etiqueta medida con los niveles de anticuerpos al Aß o células T reactivas con el Aß. El término de indicaciones se refiere a cualquier material escrito o grabado que se une a, o acompaña de otra manera a, un equipo en cualquier momento, durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, este término abarca los volantes o folletos de publicidad, materiales de empaque, instrucciones, casetes de audio o video, al igual que impresos escritos directamente sobre los equipos.

EJEMPLOS I . Eficacia Profiláctica del Aß contra la AD Estos ejemplos describen la administración del péptido Aß42 a ratones transgénicos que sobreexpresan la APP con una mutación en la posición 717 (APP717V?F) , que los predispone a desarrollar la neuropatología, como la enfermedad de Alzheimer. La producción y características de estos ratones (ratones (PDAPP) se describe en Games et al., Nature, supra . Estos animales, en su forma heterocigótica, comienzan a depositar el Aß a los seis meses de edad y más adelante. Por los quince meses de edad, ellos exhiben niveles del depósito del Aß equivalentes a aquellos vistos en la enfermedad de Alzheimer. Los ratones PDAPP se inyectaron con el A 42 agregado (Aß42) agregado) o una solución regulada con fosfato. El Aß agregado se escogió debido a su capacidad de inducir anticuerpos a múltiples epítopes de Aß.

A. Métodos 1. Fuente de Ratones Treinta ratones hembra heterogénicos PDAPP se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos: 10 ratones para ser inyectados con el Aß42 agregado (uno murió en el tránsito) , 5 ratones para ser inyectados con PBS/auxiliar o PBS, y 10 controles sin inyectar. Cinco ratones se inyectaron con proteína amiloide de suero (SAP) . 2. Preparación de Inmunógenos Preparación del Aß52 agregado: dos miligramos de Aß42 (US Peptides Inc., lote K-42-12) se disolvieron en 0.9 ml de agua y se llegó hasta 1 ml agregando 0.1 ml 10 x PBS. Esto se sometió a vórtice y se permitió incubar durante la noche a 37°C, bajo estas condiciones el péptido se agregó. Cualquier Aß sin usar se almacenó como un polvo liofilizado seco a -20°C, hasta la siguiente inyección. 3. Preparación de las Inyecciones 100 µg del Aß42 agregado en PBS por ratón se emulsionaron 1:1 con el auxiliar de Freund Completo (CFA( en un volumen final de 400 µl de emulsión para la primera inmunización, seguido por un refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en el auxiliar de Freund Incompleto (IFA) en 2 semanas. Dos dosis adicionales en IFA se dieron en intervalos mensuales. Las inmunizaciones subsecuentes se hicieron en intervalos mensuales en 500 µl de PBS. Las inyecciones se entregaron intraperitonealmente (i.p.). Las inyecciones de PBS siguieron el mismo programa y los ratones se inyectaron con una mezcla 1:1 de PBS/Auxiliar a 400 µl por ratón, o 500 µl de PBS por ratón. Las inyecciones de SAP siguieron similarmente el mismo programa usando una dosis de 100 µg por inyección. 4. Titulación de Sangrías de Ratones . Preparación del Tejido e Inmunohistoquímica Los métodos anteriores son descritos infra en Materiales Generales y Métodos .

B. Resultados Los ratones PDAPP se inyectaron con cualquiera del Aß42 agregado (Aß42 agregado) , péptidos SAP o una solución salina regulada de fosfato. Un grupo de ratones PDAPP también se dejaron como controles positivos no inyectados. Los títulos de los ratones al Aß42 agregado se vigilaron cada mes, desde el cuarto refuerzo hasta que los ratones tenían un año de edad. Los ratones se sacrificaron a los 13 meses. En todos los puntos de tiempo examinados, ocho de los nueve ratones con Aß42 agregado desarrollaron un título de anticuerpo elevado, el cual permaneció alto a través de la serie de inyecciones (títulos mayores de 1/10000) . Los nueve ratones tenían un título bajo, pero que se puede medir, de aproximadamente 1/1000 (Figura 1, Tabla 1) . Los ratones inyectados con SAPP tenían títulos de 1:1,000 hasta 1:30,000 para este inmunógeno, con solamente un ratón excediendo de 1:100000. Los ratones tratados con PBS se titularon contra el Aß42 agregado en seis, diez y doce meses. A una dilución de 1/100, el ratón del PBS cuando se tituló contra el Aß42 agregado, sólo excedió 4 veces el fondo en un punto de datos, de otra manera, ellos son menores de 4 veces el fondo en todos los puntos de tiempo (Tabla 1) . La respuesta específica de SAP fue insignificante en estos puntos del tiempo con todos los títulos menores de 300. Siete de los nueve ratones en el grupo de Aßl-42 agregado, no tenían amiloide detectable en sus cerebros. En contraste, el tejido del cerebro de los ratones en los grupos de SAP y PBS contenían numerosos depósitos de amiloide 3D6-positivos en el hipocampo, al igual que en las cortezas frontal y cingulada. El patrón del depósito fue similar a aquél de los controles sin tratar, con implicación característica de las subregiones vulnerables, tala como la capa molecular externa del circunvoluciones dentadas del hipocampo. Un ratón del grupo inyectado con Aßl-42, tenía una carga amiloide grandemente reducida, confinada al hipocampo. Una placa aislada se identificó en otro ratón tratado con Aßl-42. Los análisis de imágenes cuantitativos del amiloide cargado en el hipocampo verificó la reducción dramática lograda en los animales tratados con AN1792 (Figura 2) . Los valores medianos del amiloide cargado para el grupo de PBS (2.22%) y para el grupo de control sin tratar (2.65%) fueron significantemente mayores que para los inmunizados con AN1792 (0.00%, p=0.0005). En contraste, el valor mediano para el grupo inmunizado con péptidos SAP (SAPP) fue del 5.74%. El tejido del cerebro de los ratones de control, sin tratar, contenía numerosos depósitos de amiloide Aß visualizado con el anticuerpo monoclonal específico (mAB) 3D6 en el hipocampo, al igual que en la corteza retroesplenial . Un patrón similar de depósito de amiloide fue también visto en los ratones inmunizados con SAPP ó PBS (Figura 2) . Además, en estos últimos tres grupos hubo una implicación característica de subregiones vulnerables del cerebro, clásicamente vistos en la AD, tal como la capa molecular externa de las circunvalaciones dentadas del hipocampo en todos los tres grupos . Los cerebros que no contienen depósitos de Aß también carecían de placas neuríticas, que se visualizan típicamente en los ratones PDAPP con el anticuerpo APP humano 8E5. Todos los cerebros de los grupos restantes (inyectados con SAP, PBS y ratones sin inyectar) tenían numerosas placas neuríticas, típicas de ratones de PDAPP sin tratar. Un pequeño número de placas neuríticas estaban presentes en un ratón tratado con AN1792, y un racimo sencillo de neuritas distróficas se encontró en un segundo ratón tratado con AN1792. Los análisis de imágenes del hipocampo, y mostradas en la Figura 3, demostraron l eliminación virtual de neuritas distróficas en los rato tratados con AN1782 (mediana 0.00%) comparado con lo receptores de PBS (mediana 0.28%, p = 0.0005). ~ La astrocitosis característica de inflamació asociada con las placas, estaba también ausente en lo cerebros del grupo inyectado con Aßl-42. Los cerebros de lo ratones en los otros grupos contenían astrositos GFA positivos, abundantes y en racimos, típicos de la heliosis asociada con la placa Aß. Un subconjunto de portaobjetos reaccionados con GFAP se contra-tiñeron con Tioflavin S par localizar los depósitos de Aß. Los astrositos positivos d GFAP se asociaron con las palcas de Aß en SAP, PBS controles sin tratar. No se encontró tai asociación en los ratones tratados con Aßl-42 negativos en la placa, mientras la gliosis mínima asociada con la placa se identificó en u ratón tratado con AN1792. Los análisis de imágenes, mostrados en la Figura 4, para la corteza retroesplenial, verificaron que la reducción en astrositos fue significante con el valor mediano de 1.56% para aquellos tratados con AN1792 versus los valores medianos mayores del 6% para los grupos inmunizados con los péptidos SAP, PBS o sin tratar (p=0.0017) . La evidencia de un subconjunto de ratones inyectados con PBS y Aßl-42, indicó que la inmunorreactividad de MHC II, asociada con la placa, estaba ausente en los ratones inyectados con Aßl-42, consistente con la carencia de una respuesta inflamatoria relacionada con Aß. Las secciones de los cerebros de ratones fueron también reaccionadas con un m Aß específico para MAC-1, una proteína de superficie celular. La MAC-1 (CDllb) es un miembro de la familia de la integrina y existe como un heterodímero con CD18. El complejo de CDllb/CD18 está presente en monocito, macrófagos, neutrófilos y células destructoras naturales (Mak y Simard) . El tipo celular reactivo de MAC-1 residente en el cerebro es probablemente de microglia basado en la morfología fenotípica similar en las secciones inmunorreaccionadas de MAC-1. La MAC-1 asociada con la placa rotulada fue menor en los cerebros de los ratones tratados con AN1792 en compasión con el grupo de control de PBS, un hallazgo consistente con la carencia de la respuesta inflamatoria inducida por Aß.

C. Conclusión La carencia de placas Aß y cambios reactivos neuronales y glióticos en los cerebros de los ratones inyectados con Aßl-42 indicaron que se depositó extremadamente poco o nada de amiloide en sus cerebros, y las consecuencias patológicas, tal como la gliosis y la patología neurítica estaba ausente. Los ratones PDAPP tratados con Aßl-42 mostraron esencialmente la misma carencia de patología como los ratones no transgénicos de control. Por lo tanto, las inyecciones de Aßl-42 son altamente efectivas en la prevención del depósito o la limpieza del Aß humano del tejido del cerebro y la eliminación , de cambios degenerativos, neuronales e inflamatorios, subsecuentes. Así, la administración del péptido Aß tiene un beneficio terapéutico en la prevención de la AD.

II . Estudio de Respuesta de Dosis Grupos de ratones Swiss Webster hembra, de cinco semanas de edad (N=6 por grupo) se inmunizaron con 300, 100, 33, 11, 3, 7, 1.2, 0.4 ó 0.13 µg de Aß formulado en CFA/IFA, administrado intraperitonealmente. Tres dosis se dieron en intervalos bisemanales, seguido por una cuarta dosis un mes después. La primera dosis se emulsionó con CFA y las dosis restantes se emulsionaron con IFA. Los animales se sangraron 4-7 días en seguida de cada inmunización, comenzando después de la segunda dosis, para medir los títulos de anticuerpos. Los animales, en un subconjunto de tres grupos, se inmunizaron con 11, 33 ó 200 µg de antígeno, se sangraron adicionalmente en intervalos aproximados mensuales durante cuatro meses, seguido por la cuarta inmunización para vigilar la disminución de la respuesta del anticuerpo a través de un intervalo de dosis de vacunas. Estos animales recibieron una quinta inmunización final en siete meses después del estudio de inicio. Ellos se sacrificaron una semana después, para medir las respuestas de los anticuerpos al AN1792 y para realizar análisis toxicológicos . Se observó una respuesta de la dosis declinante de 300 a 3.7 µg sin respuesta en las dos dosis menores. Los títulos promedio de anticuerpos son de aproximadamente 1:1000, después de 3 dosis y alrededor de 1:10,000 después de 4 dosis de 11-300 µg del antígeno (véase la Figura 5) . Los títulos de anticuerpos se elevaron drásticamente para casi todos los del grupo de dosis más baja, en seguida de la tercera inmunización, con aumentos e los GMT que varían de 5 a 25 veces. Las respuestas de anticuerpos bajas luego se detectaron para aún los receptores de 0.4 µg. Los grupos de 1.2 y 3.7 µg fueron títulos comparables con los GMT de alrededor de 1000 y las cuatro dosis más altas se aglomeraron juntas con los GMT de alrededor de 25,000, con la excepción del grupo de dosis de 33 µg con un GMT menor de 3000. En seguida de la cuarta inmunización, el título aumentó en forma más modesta para la mayoría de los grupos. Hubo una respuesta de dosis clara a través de los grupos de dosis de antigéno menor desde 0.14 µg hasta 11 µg, que varía desde anticuerpos no detectables para los receptores de 0.14 µg hasta un GMT de 36,000 para receptores de 11 µg . De nuevo, los títulos para los cuatro grupos de dosis más altos de 11 a 300 µg, se aglomeraron entre sí. Así, en seguida de dos inmunizaciones, el título del anticuerpo fue dependiente de la dosis de antígeno a través de un amplio intervalo de 0.4 hasta 300 µg. Por la tercera inmunización, los títulos de las cuatro dosis más altas fueron todos comparables y ellos permanecieron en un equilibrio, después de una inmunización adicional.

Un mes después de la cuarta inmunización, los títulos fueron de 2 a 3 veces mayores en el grupo de 300 µg que aquellos medidos de la sangre sacada cinco días después de la inmunización (Figura 6) . Esta observación sugiere que la respuesta cresta de anticuerpos ana néstica ocurrió después de 5 días post-inmunización. Un aumento más modesto (50%) se vio en este momento en el grupo de 33 µg. En el grupo de dosis de 300 µg, al menos de meses en seguida de la última dosis, los GMT declinaron abruptamente por alrededo del 70%. Después de otro mes, la declinación fue menos abrupta, de 45% (100 µg) y alrededor del 14% para las dosis de 33 y 11 µg . Así, el régimen de declinación en los títulos del anticuerpo circulatorios, en seguida de cesar l inmunización, parece ser bifásico, con una declinació abrupta en el quinto mes, en seguida de la respuesta cresta y siguiendo un régimen más modesto de disminución después. Los títulos de anticuerpo y la cinética de la respuesta de estos ratones Swiss Webster son similares a aquellos de los ratones transgénicos de PDAPP heterocigóticos jóvenes, inmunizados en una manera paralela. Las dosis efectivas para inducir una respuesta inmunológica en humanos fueron típicamente similares a las dosis efectivas en los ratones.

III . Clasificación para la Eficacia Terapéutica Contra la AD Establecida Este ensayo se diseñó para probar los agentes inmunogénicos en la actividad en detener o invertir las características neuropatológicas de la AD en animales envejecidos. Las inmunizaciones con el Aß de 42 aminoácidos de largo (AN1792) comenzó en un punto de tiempo, donde las placas amiloides están ya presentes en los cerebros de los ratones PDAPP. En el curso de tiempo fado en este estudio, los ratones PDAPP sin tratar desarrollaron un número de cambios neurodegenerativos que asemejan aquellos encontrados en la AD (Games et al., supra, y Jonson Wood et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 94, 1550-1555 (1997)). El depósito del Aß en placas amiloides se asoció con una respuesta neuronal degenerativa que consiste de elementos axonales y dendríticos aberrantes, nombrados neuritas distróficas. Los depósitos amiloides que son rodeados por y contienen neuritas distróficas se nombran placas neuríticas. En tanto la AD como el ratón PDAPP, las neuritas distróficas tienen una estructura globular distintiva, son inmunorreactivos con un panel de anticuerpos que reconocen la APP y los componentes citoesqueletales, y exhiben cambios degenerativos subcelulares complejos en el nivel ultraestructural . Estas características permiten para una enfermedad pertinente, medidas selectivas y reproducibles de la formación de placas neuríticas en los cerebros de PDAPP. El componente neuronal distrófico de las palcas neuríticas de PDAPP es fácilmente visualizado con un anticuerpo específico para la APP humana (mAß 8ES) y se puede medir fácilmente por el análisis de imágenes asistido por computadora. Por lo tanto, además de medir los efectos del AN1792 en la formación de placas amiloides, vigilamos los efectos de este tratamiento en el desarrollo de la distrofia neurítica. Loa astrositos y microglia son células no neuronales que responden a y reflejan el grado de daño neuronal. Los astrositos positivos de GFAP y la microglia positiva de MHC II, se observan comúnmente en la AD, y su activación aumenta con la severidad de las enfermedades. Por lo tanto, también vigilamos el desarrollo de astrocitosi reactiva y microgliosis en los ratones tratados con AN1792.

A. Materiales y Métodos Cuarenta y ocho ratones PDAPP hembr heterocigóticos, de 11 a 11.5 meses de edad, obtenidos d Charles River, se dividieron aleatoriamente en dos grupos: 24 ratones que se van a inmunizar con 100 µg de AN1792 y 2 ratones que se van a inmunizar con PBS, cada cual combinad con el auxiliar de Freund. Los grupos de AN1792 y PBS s dividieron de nuevo cuando llegaron a -15 meses de edad. los 15 meses de edad, aproximadamente la mitad de cada grup de los animales tratados con AN1792 y PBS se eutanizaro (n=10 y 9, respectivamente), el resto continuó para recibi inmunizaciones hasta la terminación a -18 meses (n=9 y 12, respectivamente). Un total de 8 animales (5 AN1792, 3 PBS) murieron durante el estudio. Además de los animale inmunizados, ratones PDAPP sin tratar de un año (n=10) , 15 meses (n=10) y 18 meses (n=10)se incluyeron para l compasión con ensayos ELISA para medir los niveles de Aß de la APP en el cerebro; los animales de un año fuero también incluidos en los análisis inmunohistoquímicos .

La metodología fue como en el Ejemplo 1, a no ser que se indique de otra manera. El lote 12 de US Peptides y el lote ME0339 de California Peptides del AN1792 se usaron para preparar el antígeno para las seis inmunizaciones, administradas antes del punto de tiempo de 15 meses. Los lotes ME0339 y ME0439 de California Peptides se usaron para las tres inmunizaciones adicionales, administradas entre 15 y 18 meses. Para Inmunizaciones, 100 µg de AN1792 en 200 µl de PBS o el PBS solo, se emulsionaron 1:1 (vol: vol) con el auxiliar de Freund Completo (CFA) o el auxiliar de Freund Incompleto (IFA) o el PBS, a un volumen final de 400 µl . La primera inmunización se entregó con el CFA como auxiliar, las siguientes cuatro dosis se dieron con el IFA y las cuatro dosis finales con el PBS solo sin agregar auxiliar. Un total de nueve inmunizaciones se dieron en el período de siete meses en un programa de dos semanas para las primeras tres dosis, seguido por un intervalo de cuatro semanas para las inyecciones restantes. El grupo de tratamiento de cuatro meses, eutanizado a los 15 meses de edad, recibió solamente las primeras 6 inmunizaciones.

B. Resultados 1. Efectos del Tratamiento de AN1792 en la Carg de Amiloide Los resultados del tratamiento de AN1792 en el amiloide cortical cargado, determinado por los análisis de imagen cuantitativa se muestran en la Figura 7. El valo mediano del amiloide cortical cargado fue del 0.28% en u grupo de ratones PDAPP de 12 meses de edad, sin tratar, u valor representativa de carga de placa en ratones en el inicio del estudio. A los 18 meses, el amiloide cargado aumentó a 17 veces hasta el 4.87% en ratones tratados co PBS, mientras los ratones tratados con AN1782 tenían una carga de amiloide grandemente reducida de sólo el 0.01%, notablemente menor que los grupos sin tratar de 12 meses los grupos tratados con PBS, tanto de 15 como de 18 meses. El amiloide cargado se redujo significantemente en los receptores del AN1792 en grupos tanto de 15 meses (reducció del 96% ; p=0.003) como 18 meses (reducción de >99%; p=0.0002) . Típicamente, el depósito de amiloide cortical en ratones PDAPP inicia en las cortezas frontal y retroesplenial (RSC) y progresa en una dirección ventral-lateral para implicar las cortezas temporal y entorinal (EC) . Poco o nada de amiloide se encontró en las EC d ratones de 12 meses de edad, la edad aproximada, en que e AN1792 se administró primero. Después de 4 meses d tratamiento del AN1792, el depósito de amiloide disminuy grandemente en el RSC, y la implicación progresiva de EC s eliminó enteramente por el tratamiento de AN1792. La últim observación mostró que el AN1792 detuvo completamente l progresión del amiloide que invade normalmente las cortezas temporal y ventral, al igual que detuvo o posiblement invirtió el depósito en RSC. Los efectos profundos del tratamiento del AN1792 en el desarrollo de la carga de amiloide cortical en los ratones PDAPP se demostraron además por el grupo de 18 meses, el cual se había tratado durante siete meses. Una ausencia casi completa del amiloide cortical se encontró e ratones tratados con AN1792, con una carencia total de placas difusas, al igual que una reducción en los depósitos compactados . 2. Cambios Celulares y Morfológicos asociados co el Tratamiento del AN1792 Una población de células Aß-positivas se encontró en_ las regiones del cerebro que contienen típicamente depósitos de amiloide. Notablemente, en varios cerebros d los receptores del AN1792, muy pocas o nada de placas d amiloide cortical extracelular se encontraron. La mayoría d la inmunorreactividad de A-ß apareció contenida dentro d células con soma lobular o agrupado grande. Fenotípicamente, estas células asemejan la microglias o monocitos activados. Ellas son inmunorreactivas con ligaduras que reconoce anticuerpo, expresadas por los monocitos y micorgli activados (MHC II y CDllb) y se asociaron ocasionalmente co la pared o el lumen de los vasos sanguíneos. La comparació de las secciones casi adyacentes, etiquetadas co anticuerpos específicos de MHC II y Aß, revelo que patrone similares de estas células se reconocieron por ambas clase de anticuerpos. El examen detallado de los cerebros tratado con AN1792 reveló que las células positivas de MHC II s restringen en la vecindad del amiloide limitado qu permanece en estos animales. Bajo las condiciones d fijación empleadas, las células no fueron inmunorreactiva con los anticuerpos que reconocen las células T (CD3, CD3e) o células B (CD45RA, CD45RB) en ligaduras o el antígen común de leucocitos (CD45) , pero son reactivos con u leucosialin (CD43) que reconoce el anticuerpo, el cual reacciona en forma cruzada con los monocitos. Ninguna de tales células se encontró en cualquiera de los ratones tratados con PBS. Los ratones PDAPP desarrollaron invariablemente depósitos pesados de amiloides en la capa molecular externa de las circunvalaciones dentadas del hipocampo. El depósito forma una faja distinta dentro de la trayectoria perforante, una subregión que contiene clásicamente placas de amiloide en la AD. La apariencia característica de estos depósitos en los ratones tratados con PBS, asemejan aquélla caracterizada previamente en los ratones PDAPP sin tratar. El depósito amiloide consta de placas difusas y compactadas en una banda continua. En contraste, en un número de cerebros de ratones tratados con AN1792, este patrón se alteró drásticamente. El depósito de amiloide del hipocampo ya no contiene amiloide difuso y el patrón de bandas se interrumpió completamente. En lugar de ellos, un número de estructuras moteadas inusuales están presentes, que son reactivas con los anticuerpos anti- Aß, varias de las cuales parecen ser células que contienen amiloide. Las células positivas de MHC II se observaron frecuentemente en la vecindad del amiloide extracelulas en los animales tratados con AN1792. El patrón de la asociación de las células positivas de Aß con el amiloide es muy similar en varios cerebros de ratones tratados con AN1792. La distribución de estas células monocíticas se restringió en la proximidad del amiloide depositado y estaba enteramente ausente de otras regiones del cerebro no provistas de placas de Aß. El análisis de imagen cuantitativo de las secciones rotuladas con MHC y MAC I reveló una tendencia hacia la inmunorrectividad aumentada en el RSC e hipocampo de los ratones tratados con AN1792, comparado con el grupo PBS que alcanzó significancia con la medida de la reactividad MAC 1 en el hipocampo. Estos resultados son indicativos de la remoción activa mediada por células del amiloide en regiones del cerebro que llevan placas. 3. Efectos del AN1792 en los niveles de Aß: Determinaciones ELISA (a) Niveles Corticales En ratones PDAPP sin tratar, el nivel mediano del Aß total en la corteza a los 12 meses fue de 1,600 ng/g, el cual aumentó a 8,700 ng/g en 15 meses (Tabla 2) . A los 18 meses, el valor fue de 22,000 ng/g, un aumento de más de 10 veces, durante el curso del tiempo del experimento. Los animales tratados con PBS tenían 8,600 ng/g en total de Aß en 15 meses, el cual aumentó a 19,000 ng/g a los 18 meses. En contraste, los animales tratados con AN1792 tenían 81% menos en total de Aß a los 15 meses (1,600 ng/g) que el grupo inmunizado con PBS. Significantemente menos (p=0.0001) de Aß total (5,200 ng/g) se encontró a los 18 meses, cuando los grupos de AN1793 y de PBS se comparación (Tabla 2) , lo que representa una reducción del 72% en el Aß que de otra manera estaría presente. Resultados similares se obtuvieron cuando los niveles corticales del Aß42 se compararon, es decir, aquellos del grupo tratado con AN1792 contenían mucho menos de Aß42, pero, en este caso, las diferencias entre los grupos de AN1792 y PBS fueron significantes en tanto 15 meses (p=0.04) como en 18 meses (p=0.002, Tabla 2) .

Tabla 2; Niveles de AS Medianos (ng/g) en la Corteza SIN TRATAR PBS AN1792 Edad Aß total Aß42 (n)| Aß total Aß42 íülL Aß total Aß42 ípli 12 1,600 1,300 (10) 15 8,700 8,300 (10) 8,600 7,200 (9) 1,600 1,300* (10) 18 22,200 18,500 (10) 19,000 15,900 (12) 5,200** 4,000** (9) * p = 0.0412 ** p = 0.0001 (b) Niveles del Hipocampo En ratones PDAPP sin tratar, los niveles medianos del liipocampo del Aß total en doce meses de edad, fueron de ,000 ng/g, lo cual aumentó a 51,000 ng/g en 15 meses y ulteriormente a 81,000 ng/g en 18 meses (Tabla 3) .

Similarmente, los ratones inmunízaos con PBS mostraron valores de 40,000 ng/g y de 65,000 ng/g en 15 meses y 18 meses, respectivamente. Los animales inmunizados con AN1792 exhibieron menor Aß total, específicamente 25,000 ng/g y 51,000 ng/g en puntos de tiempo respectivos de 15 y 18 meses. El valor del grupo tratado con AN1792 de 18 meses fue significantemente menor de aquél del grupo tratado con PBS (p = 0.0105; Tabla 3). La medición del Aß42 dio el mismo patrón de resultados, es decir esos niveles en el grupo tratado con AN1792 fueron significantemente menores que en el grupo PBS (39,000 ng/g vs . 57,000 ng/g, respectivamente; p = 0.0022) en la evaluación de 18 meses (Tabla 3) .

Tabla 3 ; Niveles de A-S Medianos (ng/g) en el Hipocampo SIN TRATAR PBS A 1792 Edad Aß total Aß42 Mi Aß total Aß42 MI Aß total Aß42 Mi 12 15,500 1 1 ,100 (10) 15 51 ,500 44,400 (10) 40,100 35,700 (9) 24,500 22,100 (10) 18 80,800 64,200 (10) 65,400 57,100 (12) 50,900* 38,900** (9) * p = 0.015 ** p = 0.0022 (c) Niveles Cerebelares En ratones PDAPP sin tratar de 12 meses, el nivel cerebelar mediano del Aß total fue de 15 ng/g (Tabla 4) . A los 15 meses, esta mediana aumentó a 28 ng/g y a los 18 meses se elevó a 35 ng/g. Los animales tratados con PBS exhibieron valores de Aß totales medianos de 21 ng/g en 15 meses y de 43 ng/g en 18 meses. Los animales tratados con AN1792 se encontró tenían 22 ng/g de Aß total en 15 meses y significantemente menos (p=0.002) de Aß total en 18 meses (25 ng/g) que el grupo de PBS correspondiente (Tabla 4) .

Tabla 4 : Niveles de Aß Medianos (ng/g) en el Cerebelo * P = 0.001. 4. Efectos del Tratamiento de AN1792 en Niveles de la APP La APP-a y la molécula de APP de longitud completa, ambas contienen todo o parte de la secuencia de Aß y así puede tener potencialmente impacto por la generación de una respuesta inmunológica dirigida por AN1792. En estudios actuales, un leve aumento en los niveles de la APP se ha notado conforme aumenta neuropatológicamente en el ratón PDAPP. En la corteza, los niveles de cualquiera de APP-a/FL (longitud completa) o APP-a fueron esencialmente sin cambiar por el tratamiento, con la excepción que la APP- a se redujo por el 19% en el punto de tiempo de 18 meses en el grupo tratado con AN1792 contra el grupo tratado con PBS. Los valores de la APP tratados con AN1792 de 18 meses, no fueron significantemente diferentes de los valores de los grupos de 12 meses y 15 meses sin tratar y los grupos de PBS de 15 12 meses. En todos los casos, los valores de la APP permanecieron sin los intervalos que se encuentran normalmente en los ratones PDAPP.

. Efectos del Tratamiento de AN1792 en la Patología Neurodegenerativa y Gliótica. La placa neurítica cargada fue reducida significantemente en la corteza frontal de los ratones tratados con AN1792 en comparación con el grupo de PBS, en tanto 15 meses (84%; p=0.03) como en 18 meses (50%; p=0.01) de edad (Figura 8) . El valor mediano de la placa neurítica cargada aumentó del 0.32% al 0.49% en el grupo de PBS entre 15 y 18 meses de edad. Esto contrastó con el desarrollo, grandemente reducido, de las placas neuríticas en el grupo de AN1792, con los valores de carga de la placa neurítica del 0.05% y 0.22%, en los grupos de 15 y 18 meses, respectivamente . Las inmunizaciones con AN1792 parecen ser bien toleradas y la astrocitosis reactiva fue también reducida significantemente en el RSC de los ratones tratados co ANT792, cuando se compara con el grupo de PBS en tanto los 15 meses (56%; p=0.011) como los 18 meses (39%; p=0.028) de edad (Figura 9) . Los valores medianos del porcentaje de astrocitosis en el grupo PBS aumentó entre los 15 y 18 meses desde 4.26% a 5.21%. El tratamiento de AN1792 suprimió el desarrollo de la astrocitosis en ambos puntos del tiempo a 1.89% y 3.2%, respectivamente. Esto sugiere que el neropil no se daña por el proceso de despeje. 6. Respuestas de Anticuerpos Como se describió antes, ratones PDAPP heterocigóticos de once meses de edad (N=24) recibieron una serie de 5 inmunizaciones de 100 µg del AN1792 emulsionado con el auxiliar de Freund y se administraron intraperitonealmente en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12, y una sexta inmunización con el PBS solo (sin auxiliar de Freund) en la semana 16. Como un control negativo, un conjunto paralelo de 24 ratones transgénicos de edad similar, recibieron inmunizaciones de PBS emulsionado con los mismos auxiliares y entregados con el mismo programa. Los animales se sangraron dentro de tres a siete días en seguida de cada inmunización, comenzando después de la segunda dosis. Las respuestas de anticuerpo al AN1792 se midió por el ensayo ELISA. Los títulos medios geométricos para los animales que se inmunizaron con AN1792 fueron aproximadamente de 1,900, 7.600 y 45,000, en seguida de la segunda, tercera y última (sexta) dosis, respectivamente. No se midió algún anticuerpo específico en los animales de control, después de la sext inmunización. Aproximadamente la mitad de los animales s trataron por tres meses adicionales, recibiend inmunizaciones a las 20, 24 y 27 semanas, aproximadamente. Cada una de estas dosis se entregó en el vehículo de PBS solo sin el auxiliar de Freund. Los títulos medios d anticuerpos permanecieron sin cambiar en este período de tiempo. De hecho, los títulos del anticuerpo parecí permanecían ^estables desde la cuarta hasta la octav sangría, lo cual corresponde al período que cubre de l quinta a la novena inyecciones. Para determinar si los anticuerpos específicos d Aß evocados por la inmunización, que se detectaron en los sueros de los ratones tratados por AN1792 estaban tambié asociados con el amiloide depositado del cerebro, u subconjunto de secciones desde los ratones tratados con el AN1792 y PBS se hicieron reaccionar con un anticuerpo específico para la IgG del ratón. En contraste al grupo PBS, las placas de Aß en los cerebros tratados con AN1792 se recubrieron con la IgG endógena. Esta diferencia entre los dos grupos se vio en ambos grupos de 15 y 18 meses.

Particularmente, el hallazgo fue la carencia de rotulación en el grupo PBS, a pesar de la presencia de un amiloide pesado cargado en estos ratones. Estos resultados muestran que la inmunización con la proteína Aß sintética genera anticuerpos que reconocen y se unen in vivo al Aß en las placas de amiloide. 7. Respuestas Inmunes Mediadas Celulares Se removieron los bazos de nueve ratones PDAPP de 18 meses de edad, inmunizados con AN1792 y 12 inmunizados con PBS, 7 días después de la novena inmunización. Los esplenocitos se aislaron y cultivaron durante 72 horas, en la presencia de Aß40, Aß42 o Aß40-1 (proteína de orden inverso) . El mitógeno Con A sirvió como un control positivo. Las respuestas óptimas se obtuvieron con > 1.7 µM de proteína. Las células de todos los nueve animales tratados con AN1792 proliferaron en respuesta a la proteína Aßl-40 o Aßl-42, con niveles iguales de incorporación para ambas proteínas (Figura 10, Panel Superior) . No hubo respuesta a la proteína inversa Aß40-1. Las células de los animales de control no respondieron a cualquiera de las proteínas Aß (Figura 10, Panel Inferior) .

C. Conclusión Los resultados de este estudio muestran que la inmunización de AN1792 de los ratones PDAPP, que posee depósitos de amiloides existentes, disminuyen e impiden el depósito progresivo de amiloides y retardan los cambios neuropatológicos consecuenciales en el cerebro del ratón PDAPP envejecido. Las inmunizaciones con AN1792 detiene esencialmente el desarrollo de amiloides en estructuras que normalmente sucumben a la amiloidosis. Así, la administración del péptido Aß tiene un beneficio terapéutico en el tratamiento de la AD.

IV. Clasificación de Fragmentos Aß 100 ratones PDAPP de 9 a 11 meses de edad, se inmunizaron con 9 regiones diferentes de la APP y Aß para determinar cuáles epítopes transportan la respuesta. Los 9 diferentes inmunógenos y un control se inyectaron i.p., como se describió antes. Los inmunógenos incluyen cuatro conjugados del péptido Aß humano, 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, todos acoplados a la IgG anti-ratón de la oveja, por medio del enlace de cisteína; un polipéptido aa 582-695 de la APP, Aß humano agregado 1-40, y Aß humano agregado 25-35, y el Aß42 de roedor agregado. El Aß42 agregado y el PBS se usaro como controles. Se usaron diez ratones por grupo de tratamiento. Los títulos se vigilaron como antes y los ratones se eutanizaron al final de los 4 meses de inyecciones. Histoquímicamente, los niveles de Aß y la toxicología se determinaron post mortem .

A. Materiales y Métodos 1. Preparación de Inmunógenos Preparación de los péptidos Aß acoplados: cuatro conjugados de péptidos Aß humanos (residuos de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno conjugado a la IgG antiratón de la oveja) se prepararon acoplando a través de una cisteína artificial agregada al péptido Aß usando el reactivo de entrelazamiento sulfo-EMCS. Los derivados del péptido Aß se sintetizaron con las siguientes secuencias de aminoácidos finales. En cada caso, la ubicación del residuo de cisteína insertado es indicado por el subrayado. El derivado del péptido Aßl3-28 también tenía dos residuos de glicina agregados, antes de la cisteína de la terminal carboxi, como se indica.

Péptido Aßl-12 NH~-DAEFRHDSGYEVC COOH Péptido Aßl-5 NH2-DAEFRC COOH Péptido Aß33-42 NH2-ácido C-amino-heptanóico-GLMVGGWIA COOH Péptido AB13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH .

Para preparar la reacción de acoplamiento, diez mg de la IgG anti-ratón de la oveja (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se dializó durante la noche contra 10 mM de regulador de borato de sodio, pH de 8.5. El anticuerpo dializado luego se concentró a un volumen de 2 ml , usando el tubo Amicon Centriprep. Diez mg de sulfo-EMCS [N- (e-maleimidocuproiloxi) succinimida] (Molecular Sciences Co . ) se disolvió en un ml de agua desionizada. Un exceso molar de 40 veces de sulfo-EMCS se agregó, en gotas, con agitación, a la IgG anti-ratón de la oveja y luego la solución se agitó durante diez minutos más. La IgG anti-ratón activada de la oveja se purificó y se intercambió regulando por el pasaje sobre una columna de filtración de 10 ml de gel (Pierce Presto Column, obtenida de Pierce Chemicals) equilibrada con 0.1 M de NaP04, 5 mM deEDTA, pH de 6.5. Las fracciones que contienen el anticuerpo, identificadas por la absorbencia a 280 nm, se agruparon y diluyeron a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, usando 1.4 mg por OD, como un coeficiente de extinción. Un exceso molar de 40 veces del péptido Aß, se disolvió en 20 ml de 10 mM de NaP04, pH de 8.0, con la excepción del péptido Aß33-42, para el cual 10 mg primero se disolvieron en 0.5 ml de DMSO y luego se diluyeron a 20 ml con 10 mM del regulador NaP04 Las soluciones de péptido se agregaron cada una a 10 ml de la IgG anti-ratón activada de la oveja y se agitaron a la temperatura ambiente durante 4 horas. Los conjugados resultantes se concentraron a un volumen final menor de 10 ml, usando un tubo Amicon Centriprep y luego se dializaron contra PBS para regular el intercambio y remover el péptido libre. Los conjugados se pasaron a través de filtros de tamaño de poros de 0.22 µ para la esterilización y luego se dividió en fracciones de partes alícuotas de 1 mg y se almacenó congelando a -20°C. Las concentraciones de los conjugados se determinaron usando el ensayo de la proteína BCA (Pierce Chemicals) con la IgG del caballo para la curva estándar. La conjugación se documentó por el aumento del peso molecular de los péptidos conjugados con relación a aquella de la IgG anti-ratón activada de la oveja. Este Aß del conjugado anti-ratón de la oveja 1-5, se recogió de dos conjugaciones, el resto es de una sola preparación. 2. Preparación de los péptidos Aß agregados Los péptidos humanos 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Lote ME0541) , humanos 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lotes ME0339 y ME0439) , humanos 25-35, y de roedores 1-42 (California Peptides Inc., Lote ME0218) se solubilizaron en forma fresca para la preparación de cada conjunto de inyecciones desde los polvos liofilizados que se habían almacenado, disecados a -20°C. Para este propósito, dos mg de péptidos se agregaron a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla se sometió a un vórtice para generar una solución o suspensión relativamente uniforme. De los cuatro, AN1528 fue el único péptido soluble en esta etapa. Una parte alícuota de 100 µl de 10X PBS (IX BS; 0.15 M de NaCl , 0.01 M de fosfato de sodio, pH de 7.5) luego se agregaron en este punto AN1528 comenzó a precipitar. La suspensión se sometió a un vórtice de nuevo y se incubó durante la noche a 37°C para su uso al siguiente día. Preparación de la proteína pBx6 : Una plasmida de expresión que codifica pBx6, una proteína de fusión que consiste de la secuencia de guía N-terminal de polimerasa del bacteriófago de 100 aminoácidos, seguido por los aminoácidos 592-695 de APP (ßAPP) se construyó como describen Oltersdor et al., J. Biol . . Chem . 265, 4492 -4497 (1990) . La plasmida se introdujo en E. coli y la proteína se expresó después de la inducción del promotor. La bacteria se sometió a lisis en 8M de urea y pBx6 se purificó parcialmente por la PAGE de SDS preparativa. Las fracciones que contienen pBx6 se identificaron por la mancha Western usando el anticuerpo policlonal anti-pBx6 del conejo, se agruparon, concentraron usando un tubo Amicon Centriprep y dializaron contra PBS. La pureza de la preparación, estimada por la PAGE de SDS teñida con Coomassie Blue, fue aproximadamente del 5 al 10%.

B. Resultados y Discusión - 1- Diseño del Estudio Cien ratones transgénicos PDAPP, heterócigo, de nueve a once meses de edad, machos y hembras, se obtuvieron de Charles River Laboratory y de Taconic Laboratory. Los ratones se clasificaron en diez grupos, que se van a inmunizar con diferentes regiones de Aß y APP combinadas con el auxiliar de Freund. Los animales se distribuyeron para coincidir en el género, edad, porcentaje y fuente de los animales dentro de los grupos, tan estrechamente como sea posible. Los inmunógenos incluyeron cuatro péptidos de Aß derivados de las secuencias humanas, 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno conjugado para la IgG anti-ratón de la oveja; cuatro péptidos Aß agregados, humanos 1-40 (AN1528) , humanos 1-42 (AN1792) , humanos 25-35, y roedores 1-42; y un polipéptido de fusión, designado como pBx6, que contiene la APP con los residuos 592-695 de aminoácidos. Un décimo grupo se inmunizó, el cual se inmunizó con PBS combinado con el auxiliar, como un control. Para cada inmunización, 100 µg de cada péptido Aß en 200 µl de PBS o 200 µg del derivado de APP pBx6 en el mismo volumen de PBS o en PBS solo se emulsionaron 1_1 (volumen/volumen) con el auxiliar de Freund Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización, seguido por un refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en el auxiliar de Freund Incompleto (IFA) para las cuatro dosis subsiguientes y con PBS para la dosis final. Las inmunizaciones se entregaron intraperitonealmente en un programa bisemanal para las primeras tres dosis, luego en un programa mensual después. Los animales se sangraron de cuatro a siete días en seguida de cada inmunización, comenzando después de la segunda dosis para la medición de los títulos de anticuerpo. Los animales se eutanizaron aproximadamente una semana después de la dosis final. 2. Niveles de Aß y APP en el Cerebro Después de unos cuatro meses de la inmunización con los varios péptidos Aß o el derivado de la APP, los cerebros se removieron de los animales prefundidos con solución salina. Una hemisferio se preparó para el análisis inmunohistoquímico y el segundo se usó para el análisis cuantitativo de los niveles de Aß y APP. Para medir las concentraciones de las varias formas del péptido beta amiloide y la proteína precursora de amiloide. el hemisferio se disecó y los homogenados de las regiones del hipocampo, cortical y cerebelar se prepararon en 5 M de guanidina. Ellos se diluyeron y el nivel del amiloide o APP se cuantificó por comparación a una serie de diluciones de estándares del péptido Aß o la APP de concentraciones conocidas en-un formato ELISA. La concentración mediana del Aß total para el grupo de control inmunizado con PBS fue de 5.8 veces mayor en el hipocampo que en la corteza (mediana de 24,318 ng/g de tejido del hipocampo en comparación con los 4,221 ng/g para la corteza) . EL nivel mediano en el cerebelo del grupo de control (23.4 ng/g de tejido) fue, de alrededor de 1,000 veces menor que en el hipocampo. Estos niveles son similares a aquellos que se han reportado previamente para los ratones transgénicos PDAPP heterócigos de esta edad (Jonson-Woods et al . , 1997, supra) . Para la corteza, un subconjunto de grupos de tratamiento tenían niveles de Aß y Aßl-42 medianos totales que difieren significantemente de aquellos del grupo de control (p < 0.5), esos animales que recibieron el AN1792, los roedores Aßl-42 o el conjugado del péptido Aßl-5, son como se muestra en la Figura 11. Los niveles medianos del Aß total se redujeron por el 75%, 79% y 61%, respectivamente, comparado con el control para esos grupos de tratamiento. No hubo correlaciones discernibles entre los títulos de anticuerpos específicos de Aß y los niveles de Aß en la región cortical del cerebro para cualquiera de los grupos. En el hipocampo, la reducción mediana del Aß total asociada con el tratamiento del AN1792 (46%, p = 0.0543) no fue tan grande como la observada en la corteza (75%, p = 0.0021). Sin embargo, la magnitud de la reducción fue más grande en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 11,186 ng/g de tejido en el hipocampo yersus 3.171 ng/g de tejido en la corteza. Para grupos de animales que reciben el A-ßl-42 o AJS1-5 de roedores, los niveles totales medianos de Aß se redujeron por el 36 y 26%, respectivamente. Sin embargo, dado que los tamaños de los grupos pequeños y la alta variabilidad de los niveles de péptidos amiloides de un animal a otro dentro de ambos grupos, estas reducciones no fueron significantes. Cuando los niveles de los Aßl-42 se midieron en el hipocampo, ninguna de las reducciones, inducidas por el tratamiento, llegó a ser significante. Así, debido a la carga de Aß menor en la corteza, los cambios en esta región son los indicadores más sensibles de los efectos de tratamiento. Los cambios en los niveles de Aß medidos por ELISA en la corteza son similares, pero no idénticos, a los resultados del análisis inmunohistoquímico (véase abajo) . El Aß total fue también medido en el cerebelo, una región típicamente no afectada en la patología de la AD. Ninguna de las concentraciones medianas de Aß de cualquiera de los grupos inmunizados con los varios péptidos de Aß o el derivado de la APP difieren de las del grupo de control en esta región del cerebro. Este resultado sugiere que niveles no patológicos del Aß no se afectan por el tratamiento. La concentración de la APP fue también determinada por el ensayo ELISA en la corteza y el cerebelo de los ratones tratados y de control. Se utilizaron dos diferentes ensayos de la APP. El primero, designado APP-a/FL, reconoce que tanto APP-alfa (a, en la forma secretada de la APP, que se ha desdoblado dentro de la secuencia de Aß) , como las formas de longitud completa (FL) de APP, mientras el segundo reconoce sólo a APP-a. En contraste a la disminución asociada con el tratamiento de Aß, en un subconjunto de grupos de tratamiento, los niveles de la APP no cambiaron del todo de los comparados tratados a los animales de control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con los péptidos no están agotando la APP; más bien, el efecto del tratamiento es específico al Aß. En resumen, los niveles totales de Aß y de Aßl-42 son reducidos significantemente en la corteza por el tratamiento con el AN1792, el Aßl-42 de roedores o el conjugado de Aßl-5. En el hipocampo, el Aß total fue reducido significantemente sólo por el tratamiento de AN1792. Ningún otro cambio asociado con el tratamiento en los niveles de Aß o de APP en las regiones del hipocampo, cortical o cerebelar, fueron significantes. 2. Análisis Histoquímico Los cerebros de un subconjunto de seis grupos se prepararon para el análisis inmunohistoquímico, tres grupos inmunizados con los conjugados del péptido Aß: Aßl-5, AJ51-12 y Aßl3-28; dos grupos inmunizados con el Aß de longitud completa, los agregados AN1792 y AN1528 y el grupo de control tratado con PBS. Los resultados de los análisis de imagen del amiloide cargado en las secciones del cerebro de estos grupos se muestran en la Figura 12. Hay reducciones significantes del amiloide cargado en las regiones corticales de los tres grupos de tratamiento versus los animales de control . La reducción mayor del amiloide cargado se observó en el grupo que recibe el AN1792 donde el valor medio se redujo por el 97% (p = 0.001) . Reducciones significantes también ser observaron para esos animales tratados con AN1528 (95%, p = 0.005) y el conjugado del péptido Aßl-5 (67%, P = 0.02). Los resultados obtenidos por la cuantificación del Aß total o el Aßl-42 por ELISA y el amiloide cargado por el análisis de imagen difieren en alguna extensión. El tratamiento con AN1528 tuvo un impacto significante en el nivel del amiloide cortical cargado, cuando se mide por el análisis de imagen cuantitativo, pero no en la concentración del Aß total en la misma región, cuando se mide por ELIA. La diferencia entre estos dos resultados es probablemente debida a las especificidades de los ensayos. El análisis de imagen mide sólo el Aß insoluble agregado en las placas. En contraste, ELISA mide todas las formas de Aß, tanto solubles como insolubles, monoméricas y agregadas. Puesto que la patología de la enfermedad se cree se asocia con la forma insoluble asociada de placas de Aß, la técnica del análisis de imagen puede tener más sensibilidad a revelar los efectos del tratamiento. Sin embargo, puesto que ELISA es un ensayo más rápido y más fácil, es muy útil en clasificar los propósitos. Asimismo puede revelar que la reducción asociada del tratamiento de Aß es mayor para la placa asociada que el Aß total. Para determinar si los anticuerpos específicos de Aß, evocados por la inmunización en los animales tratados, reaccionados con el amiloide del cerebro depositado, un subconjunto de las secciones de los animales tratados y los ratones de control reaccionaron con un anticuerpo específico para la IgG del ratón. EN contraste al grupo PBS, las placas que contienen el Aß se recubrieron con la IgG endógena para los animales inmunizados con los conjugados del péptido Aß, Aßl-5, Aßl-12 y Aßl3-28; y los agregados de Aß de longitud completa, AN1792 y AN1528. Los cerebros de los animales inmunizados con los otros péptidos de Aß o el péptido de APP pBx6 no se analizaron por este ensayo. 3. Medición de los Títulos del Anticuerpo Los ratones se sangraron cuatro a siete días después de cada inmunización, comenzando después de la segunda inmunización, para un total de cinco sangrías. Los títulos de anticuerpos se midieron como anticuerpos de unión a Aßl-42, usando un ensayo de ALISA de emparedado con placas de plástico con múltiples cavidades, recubiertas con Aßl-42. Como se muestra en la Figura 13, los títulos de anticuerpos cresta se evocaron en seguida de la cuarta dosis para esas cuatro vacunas que evocan los títulos mayores de los anticuerpos específicos de AN1792 : AN1792 (cresta GMT: 94,647), AN1528 (cresta GMT: 88,231), conjugado Aßl-12 (cresta GMT: 94,647), AN1528 (cresta GMT: 88,231), conjugado ASI-12 (cresta GMT: 47,216) y Aßl-42 de roedor (cresta GMT: 10,766) . Los títulos para esos grupos declinaron algo en seguida de la quinta y sexta dosis. Para los cinco inmunógenos restantes, los títulos cresta se alcanzaron en seguida de la quinta o la sexta dosis y fueron de una magnitud mucho menor que la de los cuatro grupos de título mayores: conjugado Aßl-5 (cresta GMT: 2,356) pBx6 (cresta GMT: 1,986), conjugado Aßl3-28 (cresta GMT: 1,183), conjugado Aß33-42 (cresta GMT:658), Aß25-35 (cresta GMT: 125) . Los títulos de anticuerpo fueron también medidos contra los péptidos homólogos usando el mismo formato de emparedado de ALISA para un subconjunto de los inmunógenos, esos grupos inmunizados con Aßl-5, Aßl3-28, Aß25-35, Aß33-42 o Aßl-42 de roedor. Estos títulos fueron aproximadamente los mismos como los medidos contra Aßl-42, excepto para el inmunógeno de Aßl-42 del roedor, en el cual los títulos de anticuerpo contra el inmunógeno homólogo fueron de aproximadamente dos veces mayor. La magnitud del título de anticuerpo específico de AN1792 de animales individuales o los valores medios de los grupos de tratamiento no se correlacionan con la eficacia medida como la reducción del Aß en la corteza. 4. Respuestas Linfoproliferativas Se midió el Aß dependiente de la linfoproliferación, usando las células del bazo recogidas aproximadamente una semana en seguida de la sexta inmunización final. Las células recién recogidas, 105 por cavidad, se cultivaron durante 5 días, en la presencia de ASI-40, a una concentración de 5 µM por estímulo. Las células de un subconjunto de siete de los diez grupos fueron también cultivadas en la presencia del péptido inverso, el Aß40-1. Como un control positivo, se cultivaron células adicionales con el mitógeno de células T, PHA, y, como un control negativo, las células se cultivaron sin el péptido agregado . Los linfocitos de una mayoría de los animales proliferaron en respuesta al PHA. No hubo respuestas significantes al péptido inverso de Aß40-1. Las células de los animales inmunizados con los péptidos de Aß agregados mayores, AN1792, Aßl-42 de roedor y AN1528, proliferaron robustamente cuando se estimularon con Aßl-40 con el cpm mayor en los receptores de AN1792. Un animal en cada uno de los grupos inmunizados con el conjugado de Aßl-42, el conjugado de Aßl3-28 y el Aß25-35, proliferaron en respuesta al Aßl-40. Los grupos restantes que recibieron el conjugado de Aßl-5, el conjugado de Aß33-42 pBx6 o PBS no tenían animales con la respuesta estimulada por Aß. Estos resultados se resumen en la siguiente Tabla 5.

Estos resultados muestran que el AN1792 y AN1528 estimulan respuestas fuertes de las células T, más probablemente del fenotipo CD4+. La ausencia de una respuesta de célula T específica de Aß en animales inmunizados con Aßl-5, no es sorprendente, puesto que los epítopes de péptidos reconocidos por las células CD4+ son usualmente de alrededor de 15 aminoácidos de longitud, aunque péptidos más cortos pueden algunas veces funcionar con menos eficiencia. Así la mayoría de los epítopes de células T de ayuda para los cuatro péptidos conjugados probablemente residen en el modelo conjugado de la IgG, no en la región de Aß. Esta hipótesis es soportada por la incidencia muy baja de respuestas proliferativas para animales en cada uno de estos grupos de tratamiento. Puesto que el conjugado Aßl-5 fue efectivo en reducir significantemente el nivel del Aß en el cerebro, en la ausencia aparente de las células T específicas de Aß, la respuesta inmune del efector clave, inducida por la inmunización con este péptido, parece ser el anticuerpo . La carencia de células T y la respuesta baja de anticuerpos del péptido de fusión pBx6, que abarca los aminoácidos 592-695 de la APP, incluyen todos los residuos de Aß, puede ser debida a la pobre inmunogenicidad de esta preparación particular. Esta pobre inmunogenicidad del agregado Aß25-35 se debe probablemente a que el péptido es demasiado pequeño para contener probablemente un epítope d células T, para ayudar a la inducción de una respuesta d anticuerpo. Si este péptido se conjuga a una proteín portadora, probablemente será más inmunógeno.

V. Preparación de Anticuerpos Policlonales para l Protección Positiva 20 animales no transgénicos se inmunizaron con A u otro inmunógeno, opcionalmente más un auxiliar, y s eutanizaron en 4 a 5 meses. La sangre se recogió de los ratones inmunizados. Opcionalmente, la IgG se separó de los otros componentes de la sangre. El anticuerpo específic para el inmunógeno puede ser purificado parcialmente por l cromatografía de afinidad. Un promedio de alrededor de 0.5 1 mg del anticuerpo específico del inmunógeno se obtuvo po ratón, dando un total de 5-10 mg.

VI . Inmunización Pasiva con Anticuerpos al Aß Grupos de ratones PDAPP de 1-9 meses de edad, se inyectaron cada uno con 0.5 mg en PBS de policlonales anti-Aß o monoclonales específicos anti- Aß. Todas las preparaciones de anticuerpos se purificaron para tene niveles bajos de endotoxina. Los monoclonales pueden se preparados contra un fragmento, inyectando el fragmento o l forma más larga de Aß en un ratón, preparando hibridomas clasificando los hibridomas para un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de A-ß sin unir otros fragmentos que no traslapan de Aß. Tabla 6 Los ratones se inyectaron i.p., según se necesario en un período de 4 meses, para mantener un concentración de anticuerpo circulante, medida por el título ELISA de más de 1/1000, definida por ELISA a Aß42 u otro inmunógeno. Los títulos se vigilaron como antes y los ratones se eutanizaron al final del período de 4 meses de inyecciones.

VII . Comparación de Diferentes Auxiliares Estos ejemplos comparan el CFA, alumbre, un emulsión de aceite en agua y MPL, para la capacidad d estimular una respuesta inmune.

A. Materiales y Métodos 1. Diseño del Estudio Cien conejillos de la India, de seis semanas de edad, de la cepa Hartley, hembras, obtenidos de Elm Hill, se clasificaron en diez grupos para ser inmunizados con AN1792 o su derivado palmitilado, combinado con varios auxiliares. Siete grupos recibieron inyecciones de AN1792 (33 µg, a no ser que se especifique de otra manera) combinados con a) PBS, b) auxiliar de Freund, c) MPL, d) escualeno, e) MPL/escualeno, f) alumbre en dosis baja o g) alumbre de alta dosis (300 µg AN1792) . Dos grupos recibieron inyecciones de un derivado palmitoilado del AN1792 (33 µg) , combinado con a) PBS o b) escualeno. Un décimo grupo, final, recibió el PBS solo sin antígeno o auxiliar adicional. Para el grupo que recibió el auxiliar de Freund, la primera dosis se emulsionó con CFA y las cuatro dosis restantes con IFA. El antígeno se administró a una dosis de 33 µg para todos los grupos, excepto que el grupo de alumbre de alta dosis, que recibió 300 µg de AN1792. Las inyecciones se administraro intraperitonealmente para el CFA/IFA e intramuscularmente e los cuadríceps de la extremidad posterior alternativamente en el costado derecho e izquierdo para todos los otros grupos. Las primeras tres dosis se dieron en un program bisemanal, seguido por dos dosis a un intervalo mensual. L sangre se retiró seis a siete días seguido de cad inmunización, partiendo después de la segunda dosis, par medir los títulos del anticuerpo. 2. Preparación del Inmunógeno Dos mg de Aß42 (California Peptide, Lote ME0339) se agregaron a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla s sometió a un vórtice para generar una suspensió relativamente uniforme. Una parte alícuota de 100 µl de 10 PBS (IX PBS, 0.25 M NaCl , 0.01 M fosfato de sodio, pH d 7.5) se agregó. La suspensión se sometió de nuevo al vórtic y se incubó durante la noche a 37°C para su uso al siguient día. El Aßl-42 sin usar se almacenó con un desecante como u polvo liofilizado a -20°C.

Un derivado palmitoilado del AN1792 se preparó po acoplamiento del anhídrido plamítico, disuelto en dimetilformamida, al residuo de la terminal amino de AN1792, antes de la remoción del péptido naciente desde la resina, po tratamiento con el ácido fluorhídrico. Para preparar dosis de vacunas con el auxiliar d Freund Completo (CFA) (grupo 2) , 33 µg del AN1792 en 200 µl de PBS se emulsionaron 1 : 1 (volumen/volumen) con CFA en u volumen final de 400 µl para la primera inmunización. Par las inmunizaciones subsecuentes, el antígeno se emulsion similarmente con el auxiliar de Freund Incompleto (IFA) . Para preparar dosis de vacunas con MPL para los grupos 5 y 8, polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) se agregó a la trietilamina acuosa al 0.2% a una concentración final de 1 mg/ml y se sometió a u vórtice. La mezcla se calentó a 65-70°C durante 30 segundos, para crear una suspensión uniforme, levemente opaca de micelas. La solución se preparó en forma fresca para cad juego de inyecciones. Para cada inyección en el grupo 5, 33 µg del AN1792 en 16.5 µl de PBS, 50 µg de MPL (50 µl) y 152 µl de PBS, se mezclaron en un tubo de borosilicato, inmediatamente antes del uso.

Para preparar dosis de vacunas con la emulsió baja de aceite en agua, el AN1792 en PBS se agregó a 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, 0.5% de Span 85 en PBS par llegar a una concentración de dosis sencilla final de 33 µ de AN1792 en 250 µl (grupo 6) . La mezcla se emulsion pasándola a través de un dispositivo manual de dos cámaras, 15 a 20" veces, hasta que aparecieron gotitas de emulsión d un diámetro igual a 1.0 µm de glóbulos estándar de látex, vistas bajo un microscopio. La suspensión resultante fu opalescente, blanco lechoso. Las emulsiones se prepararon e forma fresca para cada serie de inyecciones . Para el grup 8, el MPL en 0.2% de trietilamina se agregó a un concentración de 50 µg por dosis a la mezcla de escualeno detergente para la emulsificación, como se mencionó antes. Para el derivado de palmitoílo (grupo 7) , 33 µg por dosis del palmitoil-NH- Aßl-12 se agregó al escualeno y se sometió a vórtice. Luego se agregaron el Tween 80 y Span 85 co vórtice. Esta mezcla se agregó al PBS para llegar concentraciones finales de 5% de escualeno, 0.5% de Twee 80, 0.5% de Span 85 y la mezcla se emulsionó, como se mencionó antes .

Para preparar dosis de vacunas con alumbre (grupos y 19) , el AN1792 en PBS se agregó a Alhydrogel (gel d hidróxido de aluminio, Achúrate, Westbury, NY) para llegar concentraciones de 33 µg (dosis baja, grupo 9) o de 300 µ (dosis alta, grupo 10) AN1792 por 5 mg de alumbre en u volumen de dosis final de 150 µl . La suspensión se mezcl moderadamente durante 4 horas a la temperatura ambiente . 3. Medición de los Títulos de Anticuerpo Conejillos de India se sangraron seis a siete días en seguida de la inmunización, partiendo después de l segunda inmunización, para un total de cuatro sangrías. Los títulos de anticuerpo contra el Aß42 se midieron por ELISA, como se describe en Materiales y Métodos Generales. 4 , Preparación del Tejido Después de unas 14 semanas, todos los conejillos de India se administraron con C02. El fluido cerebroespinal se recogió y los cerebros se removieron y tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) se disecaron usaron para medir la concentración de la proteína Aß total, usando el ensayo ELISA.

B. Resultados 1. Respuestas de Anticuerpos Hay un intervalo amplio en la potencia de los varios" auxiliares cuando se miden como la respuesta del anticuerpo al AN1792 en seguida de la inmunización. Como s muestra en la Figura 14, cuando el AN1792 se administró al PBS, ningún anticuerpo se detectó en seguida de dos o tres inmunizaciones y se detectaron respuestas insignificantes e seguida de la cuarta y quinta dosis con los títulos de l media geométrica (GMT) de sólo alrededor de 45. La emulsió de aceite en agua indujo títulos modestos en seguida de l tercera dosis (GMT 255) que se mantuvieron en seguida de l cuarta dosis (GMT 301) y cayeron con la dosis final (GM 54) . Hubo una respuesta de dosis de antígeno clara para el AN1792 enlazado al alumbre con 300 µg siendo más inmunogénicos en tres puntos de tiempo que 33 µg. En l cresta de la respuesta de anticuerpos, en seguida de l cuarta inmunización, la diferencia entre las dos dosis fue del 43% con los GMT de alrededor de 1940 (33 µg) y 3400 (300 µg) . La respuesta de anticuerpos a 33 µg de AN1792 más MPL fue muy similar a aquélla generada con casi una dosis diez veces mayor de antígeno (300 µg) unido al alumbre. L adición de MPL a una emulsión de aceite en agua disminuyó l potencia de la vacuna con relación a aquélla del MPL como el único auxiliar, por tanto como el 75%. Un derivad palmitoilado del 7AN1792 fue completamente no inmunogénic cuando se administra en PBS y dio títulos modestos cuando s presentó en una emulsión de aceite en agua con los GMT d 340 y 105 para la tercera y cuarta sangrías. Los títulos del anticuerpo mayores se generaron con el auxiliar de Freun con un GMT cresta de alrededor de 87,000, un valor casi 30 veces mayor que los GMT de las siguientes dos vacunas más potentes, MPL y dosis elevada de AN1792/alumbre . Los auxiliares más prometedores, identificados e este estudio, son el MPL y el alumbre. De estos dos, el MP parece preferible, debido a que se requiere una dosis de antígeno 10 veces menor para generar la misma respuesta de anticuerpo como la obtenida con el alumbre. La respuesta puede ser aumentada aumentando la dosis del antígeno y/o auxiliar y optimizando el programa de inmunización. La emulsión de aceite en agua fue un auxiliar muy débil para el AN1792 y al agregar una emulsión de aceite en agua al auxiliar de MPL disminuyó la actividad auxiliar intrínseca del MPL solo. 2. Niveles del Aß en el Cerebro En aproximadamente 14 meses, los conejillos de India se anestesiaron profundamente, el fluido cerebroespinal (CSF) se sacó y los cerebros se cortaron de los animales en un subconjunto de grupos, los inmunizados con el auxiliar de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5), alumbre con alta dosis, 300 µg de AN1792 (grupo 10) y el grupo de control inmunizado con PBS (grupo 3) . Para medir el nivel del péptido Aß, un hemisferio se disecó y los homogenados de las regiones del hipocampo, cortical y cerebelar se prepararon en 5 M de guanidina. Luego se diluyeron y cuantificaron por comparación a una serie de diluciones de la proteína estándar de Aß de concentraciones conocidas en un formato ELISA. Los niveles de la proteína Aß en el hipocampo, la corteza y el cerebelo fueron muy similares para todos los cuatro grupos, a pesar del amplio intervalo de respuestas del anticuerpo al Aß, evocadas por estas vacunas. Los niveles de Aß medios de alrededor de 25 ng/g de tejido se midieron en el hipocampo, 21 ng/g en la corteza y 12 ng/g en el cerebelo. Así, la presencia de un título de anticuerpo de alta circulación de A-ß para casi tres meses en algunos de estos animales no alteró los niveles de Aß totales en sus cerebros . Los niveles de Aß en el CSF fueron muy similares entre los grupos. La carencia de gran efecto de la inmunización del AN1792 en el Aß endógeno indicó que la respuesta inmune está enfocada a las formaciones patológicas de Aß.

VIII. Respuesta Inmunológica para Diferentes Auxiliares en los Ratones Ratones Swiss Webster hembra, de seis semanas de edad, se usaron para este estudio con 10-13 animales por grupo. Las inmunizaciones se dieron en los días 0, 14, 28, 60", 90 y 20, administradas subcutáneamente en un volumen de dosis de 200 µl . El PBS se usó como el regulador para todas las formulaciones. Los animales se sangraron siete días en seguida de cada inmunización, partiendo después de la segunda dosis, para el análisis de los títulos de anticuerpos por el ensayo ELISA. El régimen de tratamiento de cada grupo se resume en la Tabla 7.

Tabla 7 Notas de pié : a Número de ratones en cada grupo al inicio del experimento. b Los auxiliares se anotaron. El regulador para todas estas formulaciones fue el PBS. Para el grupo 8, no hubo auxiliar y no hubo antígeno.

Los títulos ELISA de los anticuerpos contra el Aß42 en cada grupo se muestran en la siguiente Tabla 8.

Tabla 8 La tabla muestra que los títulos más altos se obtienen para los grupos 4, 5 y 18, en donde los auxiliares fueron 125 µg de MPL, 50 µg de MPL y QS21 + MPL.

IX. Eficacia Terapéutica de Diferentes Auxiliares Un estudio de eficacia terapéutica se condujo en ratones transgénicos PDAPP con un conjunto de auxiliares adecuados para el uso en humanos para determinar su capacidad de potenciar respuestas inmunológicas al Aß y para inducir el despeje mediado inmune de los depósitos de amiloides en el cerebro. Ciento ochenta ratones transgénicos PDAPP heterócigos de 7.5 a 8.5 meses de edad, machos y hembras, se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los ratones se clasificaron en nueve grupos que contienen de 15 a 23 animales por grupo, que se inmunizan con AN1792 o AN1528, combinados con varios auxiliares. Los animales se distribuyeron para coincidir en género, edad y porcentaje de animales dentro de los grupos, tan estrechamente como sea posible. Los auxiliares incluyeron el alumbre, MPL y QS21, cada uno combinado con ambos antígenos, y el auxiliar de Freund (FA) combinado con sólo AN1792. Un grupo adicional se inmunizó con AN1792 formulado en regulador de PBS más timerosal preservativo sin auxiliar. Un noveno grupo se inmunizó con PBS solo como un control negativo. Preparación de los péptidos Aß agregados: péptidos humanos Aßl-40 (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; Lote ME0541) y humanos Aßl-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lote ME0439) se solubilizaron en forma fresca para la preparación de cada conjunto de inyecciones de polvos liofilizados que se han almacenado disecando a -20°C. Para este propósito, dos mg de péptidos se agregaron a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla se sometió a un vórtice para generar una solución o suspensión , relativamente uniforme. El AN1528 fue soluble en esta tea, en contraste al AN1792. Una parte alícuota de 100 µl de 10X PBS (IX PBS: 0.15 M NaCl, 0.01 de fosfato de sodio, pH de 7.5) luego se agregó en ese punto el ANT528 comenzó a precipitar. Las suspensiones se sometieron a un vórtice de nuevo y se incubaron durante la noche a 37°C para su uso al siguiente día. Para preparar dosis de vacunas con el alumbre (Grupos 1 y 5) , el péptido Aß en PBS se agregó al Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio al dos por ciento acuoso, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) para llegar a concentraciones de 100 µg del péptido Aß por 1 mg de alumbre. El 10X PBS se agregó a un volumen de dosis final de 200 µl en IX PBS. La suspensión luego se mezcló moderadamente por alrededor de 4 horas a la temperatura ambiente, antes de la inyección.

Para preparar dosis de vacunas con el MPL (Grupos 2 y 6) , polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) se agregó a la trietilenamina acuosa al 0.2% a una concentración final de 1 mg/ml y se sometió a un vórtice. La mezcla se calentó a 65-70 °C durante 30 segundos para crear una suspensión uniforme opaca de micelas. La solución se almacenó a 4°C. Para cada conjunto de inyecciones, 100 µg de péptido por dosis en 50 µl de pBS, 50 µg de MPL por dosis (50 µl) y 100 µl de PBS por dosis, se mezclaron en un tubo de borosílicato, inmediatamente antes de usar. Para prepara dosis de vacunas con QS21 (Grupos 3 7) , polvo liofilizado (Aquila, Framngham MA; Lote A7018R) se agregó al PBS, pH de 6.6-6.7 a una concentración final de 1 mg/ml y se sometió a un vórtice. La solución luego se almacenó a -20°C. Para cada conjunto de inyecciones, 100 µg de péptido por dosis en 50 µl de PBS, 25 µg de QS21 por dosis en 25 µl de PBS y 125 µl de PBS por dosis, se mezclaron en un tubo de borosilicato, inmediatamente antes de usar. Para preparar dosis de vacunas con el Auxiliar de Freund (Grupo 4) , 100 µg del AN1792 en 200 µl de PBS se emulsionaron 1:1 (volumen: volumen) con el Auxiliar de Freun Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl para la primer inmunización. Para inmunizaciones subsecuentes, el antígen se emulsionó similarmente con el Auxiliar de Freun Incompleto (IFA) . Para las vacunas que contienen los auxiliares de alumbre, MPL o QS21, 100 µl por dosis d AN1792 o AN1528 se combinaron con alumbre (1 mg por dosis) MPL (50 µg por dosis) o QS21 (25 µg por dosis) en un volume final de 200 µl de PBS y se entregó por la inoculació subcutánea en el lomo entre los omóplatos. Para el grupo qu recibió el AF, 100 µg del AN1792 se emulsionaron 1:1 (volumen:volumen) con el auxiliar de Freund Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl y se entreg intraperitonealmente para la primera inmunización, seguid por un refuerzo de la misma cantidad del inmunógeno en el auxiliar de Freund Incompleto (IFA) para las cinco dosis subsiguientes. Para el grupo que recibió el AN1792 si auxiliar, 10 µg del AN1792 se combinaron con 5 µg de timerosal en un volumen final de 50 µl de PBS y se entregaron subcutáneamente. El grupo de control, noveno, recibió sólo 200 µl de PBS, entregado subcutáneamente. Las inmunizaciones se dieron en un programa bisemanal para las primeras tres dosis, luego en un programa mensual después e los días 0, 16, 28, 56, 85 y 112. Los animales se sangraro seis a siete días después de cada inmunización, partiendo después de la segunda dosis para la medición de los títulos del anticuerpo. Estos animales se eutanizaro aproximadamente una semana después de la dosis final. Los resultados se midieron por el ensayo ELISA de los niveles de Aß y APP en el cerebro y por la evaluació inmunohistoquímica de la presencia de las placas de anticuerpos en las secciones del cerebro. Además, los títulos específicos de Aß de anticuerpos, y las respuestas proliferativas y de citosina dependientes de Aß se determinaron. La Tabla 9 muestra que los títulos de anticuerpos más altos a Aßl-42 se evocaron con el FA y AN1792, títulos con crestas en seguida de la cuarta inmunización (cresta GMT: 75,386) y luego declinaron por el 59% después de la sexta inmunización final. El título medio de cresta evocado por MPL con 7AN1792 fue del 62% menor que aquél generado co FA (cresta HMT: 28,867) y fue también alcanzada en forma temprana en el esquema de inmunización, después de 3 dosis, seguido por una declinación del 28% del valor de cresta después de la sexta inmunización. El título medio crest generado con QS21 combinado con el AN1792 (GMT: 1,511) fu de alrededor de 5 veces menor del obtenido con el MPL. Además, la cinética de la respuesta fue menor, puesto qu una inmunización adicional fue requerida para llegar a l respuesta cresta. Los títulos generados por el AN1792 enlazado al alumbre fueron marginalmente mayores de aquello obtenidos del S21 y la cinética de respuesta fue más rápida. Para el AN1792 entregado en el PBS con el timerosal, l frecuencia y tamaño de los títulos fue escasamente mayor d aquellos para el PBS solo. Los títulos cresta generados co MPL y AN1528 (cresta GMT: 3099) fueron de alrededor de 9 veces menores de aquellos con el AN1792. El AN1529 unido al alumbre fue muy pobremente inmunogénico con títulos bajo generados en sólo algunos de los animales. No se observaro respuestas de anticuerpos en los anímales de control inmunizados con el PBS solo.

Tabla 9 Notas de pie; a Títulos medios geométricos de anticuerpos medidos contra Aß1-42. b Número de respuestas por grupo Los resultados del tratamiento con AN1792 o AN152 con varios auxiliares, o timerosal en el amiloide cortica cargado en ratones de 12 meses de edad, determinados po ELISA, se muestran en la Figura 15. En los ratones PDAPP d control de PBS, el nivel mediado del Aß total en la cortez en 12 meses fue de 1,817 ng/g. Niveles notablement reducidos de Aß se observaron en ratones tratados con AN179 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y QS21 má AN1792. La reducción llegó al significado estadístico (p 0.05) solamente para el AN1792 más CFA/IFA. Sin embargo, como se muestra en los Ejemplos I y III, los efectos de l inmunización en reducir los niveles de A_ß llegó a se substancialmente mayor en los ratones con edades de 15 y 18 meses. Así, se espera que al menos las composiciones del AN1792 más el alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS21. logren un significado estadístico en el tratamiento d ratones más viejos. En contraste, el AN1792 mas el timerosal preservativo mostró un nivel mediano de Aß casi el mism como aquel en los ratones tratados con PBS . Resultado similares se obtuvieron cuando los niveles corticales del Aß42 se compararon. El nivel mediano del Aß42 en lo controles del PBS fueron de 1624 ng/g. Niveles medianos, notablemente reducidos, de 403, 1149, 620 y 714 s observaron en los ratones tratados con AN1792 más CFA&IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS21, respectivamente, con la reducción logrando un significad estadístico (p = 0.05) para el graupo de tratamiento d AN1792 CFA/IFA. El nivel mediano en ratones tratados co AN1792 y timerosal fue de -1619 ng/g de Aß42.

X. Análisis de la Toxicidad Los tejidos se recogieron para el exame histopatológico al terminar los estudios descritos en lo Ejemplos 2, 3 y 7. Además, la hematología y la químic clínica se realizaron en muestras de sangre terminales d los Ejemplos 3 y 7. La mayoría de los órganos principales fueron evaluados, que incluyen el cerebro, pulmón, linfoide, gastrointestinal hígado, riñon, adrenal y gónadas. Aunque se observaron lesiones esporádicas en los animales de estudio, no hubo diferencias obvias, o en los tejidos afectados o e la severidad de las lesiones, entre los animales tratados con AN1792 y sin tratar. No hubo lesiones histopatológica únicas notadas en los animales inmunizados con AN1782, e comparación con los animales tratados con PBS o sin tratar. Tampoco hubo diferencias en el perfil de la química clínic entre los grupos auxiliares y los animales tratados con PB en el Ejemplo 7. Aunque hubo aumentos significantes e varios de los parámetros de hematología entre los animale tratados con el AN1792 y el auxiliar de Freund en el Ejempl 7, en relación a los animales tratados con PBS, estos tipo de efectos son esperados del tratamiento del auxiliar d Freund y la peritonitis acompañante y no indican algú efecto adverso del tratamiento con AN1792. Aunque no e parte de la evaluación toxicológica, la patología del cerebro del ratón PDAPP fue examinada extensamente com parte de la eficacia de los puntos terminales. No se notaro signos de efectos adversos relacionados con el tratamient en la morfología del cerebro en cualquiera de los estudios . Estos resultados indican que el tratamiento con AN1792 es bien tolerado y está al menos substancialmente exento d efectos secundarios.

XI . Prevención y Tratamiento de Sujetos Se realizó un ensayo de fase I de una dosis, par determinar la seguridad. Un agente terapéutico s administró en dosis crecientes a diferentes pacientes, comenzando de aproximadamente 0.01 el nivel de eficaci presumida, y aumentando por un factor de tres hasta alcanza un nivel de aproximadamente 10 veces la dosis efectiva de ratón- Se realizó un ensayo de fase II para determinar l eficacia terapéutica. Los pacientes con la Enfermedad d Alzheimer, temprana a media, definida usando los criterio de la Enfermedad de Alzheimer y la Asociación de Desórdene relacionados (ADRA) para la AD probable, se seleccionaron. La clasificación de los pacientes adecuados en el interval de 12-26 en el Examen de Estado Mini -Mental (MMSE) . Otro criterios de selección son que los pacientes probablement sobrevivan durante el estudio y que carezcan de problemas d complicación, tal como el uso de medicamentos concomitantes que pudieran interferir. Las evaluaciones de línea básica d la función del paciente se hicieron usando medidas psicometrías clásicas, tal como la MMSE y ADAS, que es un escala amplia para evaluar pacientes con el estado y funció de la Enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicometrías suministran una medida de progresión de la condición d Alzheimer. Escalas adecuadas de vida cuantitativas se puede usar para vigilar el tratamiento. La progresión de l enfermedad puede ser vigilada por MRI . Los perfiles d sangre de los pacientes pueden también ser vigilados, . qu incluyen ensayos de anticuerpos inmunógenos específicos respuestas de células T. Siguiendo las medidas de líneas básicas, lo pacientes comienzan a recibir el tratamiento. Ellos s escogen aleatoriamente y tratan con un agente terapéutico un placebo, en un ensayo a ciegas. Los pacientes se vigila al menos cada seis meses. La eficacia se determina por un reducción significante en la progresión de un grupo d tratamiento con relación a un grupo de placebo. Se realiza un segundo ensayo de fase II par evaluar la conversión de los pacientes de la pérdida d memoria temprana no por la Enfermedad de Alzheimer, alguna veces llamada como el daño a la memoria asociado con la eda (AAMI) , a la probable enfermedad de Alzheimer, como s define por los criterios de ADRDA. Los pacientes con alt riesgo para la conversión a la Enfermedad de Alzheimer s seleccionan de una población no clínica, clasificando las poblaciones de referencia para los signos tempranos d pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con l sintomatología previa de Alzheimer, una historia familiar d la Enfermedad de Alzheimer, factores genéticos de riesgo, edad, sexo y otras características encontradas para predeci el alto riesgo para la Enfermedad de Alzheimer. Se recoge las clasificaciones de líneas básicas en las métrica adecuadas incluyen el MMSE y ADAS junto con otras métrica designadas para evaluar una población más normal . Esta poblaciones de pacientes se dividen en grupos adecuados co la comparación del placebo contra alternativas de dosis co el agente. Estas poblaciones de pacientes son seguidas e intervalos de aproximadamente seis meses, y el punto fina para cada paciente es si o no este paciente se convierte la probable Enfermedad de Alzheimer, como se define por lo criterios ADRA en el final de la observación.

XII . Materiales y Métodos Generales 1. Medición de los Títulos de Anticuerpos Los ratones se sangraron haciendo una pequeñ cortada en la vena de la cola y recogiendo alrededor de 200 µl de sangre en un tubo de microcentrífuga. Los conejillo de India se sangraron rasurando primero el área del tors posterior y luego usando una aguja de calibre 18 par perforar la vena metatarsal y recoger la sangre en tubos d micrscentrífuga. La sangre se dejó coagular durante una hor a la temperatura ambiente, se sometió a un vórtice, luego se centrífugo a 14,000 x g durante 10 minutos para separar los coágulos del suero. El suero luego se transfirió a un tub limpio y se almacenó a 4°C hasta su titulación. Los títulos de anticuerpos se midieron por ELISA. Placas microtituldoras de 96 cavidades (placas Costar EIA) se recubrieron con 10 µl de una solución que contiene o 10 µg/ml o Aß42 o SAPP u otros antígenos, como se cita en cada uno de los reportes individuales en Well Coating Buffe (Regulador de Recubrimiento de Cavidades) (0.1 M de fosfato de sodio, pH de 8.5, 0.1% de azida de sodio) y se mantuvieron a la temperatura ambiente durante la noche. Las cavidades se aspiraron y se agregó suero a estas cavidades, comenzando con una dilución de 1/100 en una Diluente Espécimen (0.014 M de fosfato de sodio, pH de 7.4, 0.15 NaCl , 0.6% de albúmina de suero de bovino, 0.05% de timerosal) . Siete diluciones en serie de las muestras se hicieron directamente en las placas en etapas de tres veces, para llegar a una dilución final de 1/218,700. La diluciones se incubaron en las cavidades de placa recubiertas durante una hora a la temperatura ambiente. La placas luego se lavaron cuatro veces con PBS que contien 0.05% de Tween 20. El segundo anticuerpo, una IgG anti-rató de la cabra, conjugado a la peroxidasa de rábano fuert (obtenida de Boehringer Mannheim) , se agregó a las cavidade como 100 µl de una dilución 1/3000 en el Diluente Espécime y se incubó durante una hora a la temperatura ambiente. La placas se lavaron de nuevo cuatro veces en PBS, Tween 20.

Para desarrollar el cromógeno, 100 µl de Slow TM (3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametil-bencidina, obtenida de Pierc Chemicals) se agregaron a cada cavidad y se incubó por 1 minutos a la temperatura ambiente. La reacción se detuvo po la adición de 25 µl de 2M de H3S04 La intensidad de color fu luego leída en un Dispositivo Molecular Vmax a 450 nm - 650 nm) . Los títulos fueron definidos como el recíproco d la dilución del suero que da la mitad de la OD máxima. La O máxima es generalmente tomada de una dilución inicial d 1/100, excepto en los casos con títulos muy elevados, e este caso, una dilución inicial mayor fue necesaria par establecer la OD máxima. Si el 50% del punto cae entre do diluciones, se hace una extrapolación lineal para calcula el título final. Para calcular los títulos medio geométricos del anticuerpo, títulos menores de 100 so asignados arbitrariamente con un valor de título de 25. 2. Ensayo de proliferación de linfocitos Se anestesiaron ratones con isoflurano. S removieron los bazos y se enjuagaron dos veces con 5 ml d PBS, que contiene 10% de suero de bovino fetal inactivad por calor (PBS-FBS) y luego se homogeneizaron en una unida Centricon de 50 µ (Dako A/S, Dinamarca) en 1.5 ml de PBS-FB durante 10 segundos a 10 rpm en una máquina Medimachin (Dako) seguido por filtración a través de una malla d nylon, con tamaño de poros de 100 µ. Los esplenocitos s lavaron una vez con 15 ml de PBS-FBS, luego formaron pella por centrifugación a 200 x g durante 5 minutos, Los glóbulo rojos se sometieron a lisis por la resuspensión de la pell en 5 ml de regulador que contiene 0.15 M de NH4Cl, 1 M d KHC03, 0.1 M de NaEDTA, pH de 7.4, durante cinco minutos a l temperatura ambiente. Los leucocitos se lavaron como antes. Las células del bazo recientemente aisladas (105 células po cavidad) se cultivaron en juegos triplicados en placa mierotituladoras tratadas por cultivo de tejidos, con fond en U, de 96 cavidades (Corning, Cambridge, MA) en el medi RPMI 1640 (JRH Bíosciences, Lenexa, KS) suplementado co 2.05 mM de L-glutamina, 1% de Penicilina/Estreptomicina 10% de FBS inactivado por calor, durante 96 horas a 37°C. Varios péptidos Aß, Aßl-16, Aßl-40, Aßl-42 o Aßl-40-1 d proteína se secuencia inversa, se agregaron también a dosi que varían de 5 a 0.18 µM en cuatro etapas. Las células e las cavidades de control se cultivaron con Concanavalin (Con A) (Sigma, cat. #C-5275, a 1 µg/ml), sin proteín agregada. Las células se pulsaron en las 24 horas finale con 3H-timidina (1-µCi/cavidad, obtenida de Amersham Corp., Arlington, Heights IL) . Las células luego se recogiero sobre placas UniFilter y se contaron en un instrumento To Count Microplate Scintillation Counter (Contador d Escintilación de Microplaca de Cuenta Superior) (Packar Instruments, Downers Grove, IL) . Los resultados s expresaron como cuentas por minuto (cpm) de radioactivida incorporadas en las macromoléculas insolubles. 4. Preparación del Tej ido del Cerebro Después de la eutanasia, los cerebros s removieron y se preparó un hemisferio para el análisi inmunohistoquimico, mientras tres regiones del cerebr (hipocampo, corteza y cerebelo) se disecaron desde el otr hemisferio y se usaron para medir la concentración de varia proteínas Aß y formas de APP, que usan el ensayo específic de ELISA (Jonson-Wood et al . , supra) . Los tejidos destinados para ELISA s homogeneizaron en 10 volúmenes de regulador de guanidin enfriada con hielo (5.0 M de guanidina-HCl, 50 M de Tris HCl, pH de 8.0) . Los homogenados se mezclaron por agitació moderada usando un dispositivo Adams Nutator (Fisher) durante tres a cuatro horas a la temperatura ambiente, lueg se almacenaron a -20°C antes de la cuantificación de Aß APP. Los experimentos previos han mostrado que los analito fueron estables bajo esta condición de almacenamiento, y qu la proteína Aß sintética (Bachem) pudo ser recuperad cuantitativamente cuando se incorpora en homogenados de tejido de control del cerebro desde residuos de ratone (Jonson-Wood et al., supra) .

. Medición de los Niveles de Aß Los homogenados del cerebro se diluyeron con e diluente Casein Diluent helado (0.25% de caseína, PBS, 0.05 de azida de sodio, 20 µg/ml de aprotinina, 5 mM de EDTA, p de 8.0, 10 µg/ml de leupeptina) y luego se centrifugaron 16,000 x g durante 20 minutos a 4°C. Los estándares d proteínas Aß sintéticas (aminoácidos 1-42) y los estándare de APP se prepararon para incluir 0.5 M de guanidina y 0.1 de albúmina de suero de bovino (BSA) en la composició final. El ELISA de emparedado de Aß "total" utiliza e anticuerpo monoclonal (m Aß) 266 específico para lo aminoácidos 13-28 de Aß (Seubert, et al), como el anticuerp de captura, y el mAß 3D6 biotinilado, específico para lo aminoácidos 1-5 de Aß (Jonson.Wood, et al) , como e anticuerpo informador. El 3D6 mAß no reconoce la AP secretada o la APP de longitud completa, pero detecta sól especies de Aß con un ácido aspártico de la terminal d amino. Este ensayo tiene un límite inferior de l sensibilidad de ~ 50 pg/ml (11 pM) y muestra que no ha reactividad cruzada a la proteína de Aß del murino endógena, a concentraciones hasta de 1 ng/ml (Jonson-Wood et al., supra) .

El ensayo ELISA de emparedado específico de Aßl 42, emplea el m Aß 21F12 específico para los aminoácidos 33 42 de Aß (Jonson-Wood, et al) , como el anticuerpo d captura. El m Aß 3D6 biotinilado es también el anticuerp informador en este ensayo, el cual tiene un límite inferio de sensibilidad de aproximadamente 125 pg/ml (28 pM, Jonson-Wood et al . ) . Para los ensayos ELISA de Aß, 100 µl d cualquiera del m Aß 266 (a 10 µg/ml) o m Aß 21F12 (5 µg/ml) se recubrieron en las cavidades de placas de inmunoensayo d 96 cavidades (Costar) por incubación durante la noche a l temperatura ambiente. La solución se removió por aspiració y las cavidades de bloquearon por la adición de 200 µl d 0.25% de albúmina de suero humano en regulador de PBS por al menos 1 hora a la temperatura ambiente. La solució bloqueadora se removió y las placas se almacenaron disecada a 4°C hasta su uso. Las placas se rehidrataron con e regulador Wash Buffer [solución salina Tris-regulada (0.15 de NaCl, 0.01 M de Tris-HCl, pH de 7.5), más 0.05% de Twee 20] antes del uso. Las muestras y estándares se agregaron e partes alícuotas triplicadas de 100 µl por cavidad y lueg se- incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaro al menos tres veces con el regulador Wash Buffer entre cad etapa del ensayo. El m Aß 3D6 biotinilado, diluido a 0. µg/ml en el regulador Casein Assay Buffer (0.25% de caseína, PBS, 0.05% de Tween 20, pH de 7.4), se agregó e incub dentro de las cavidades por 1 hora a la temperatur ambiente. Un conjugado de peroxidasa de rábano fuerte avidina, (Avidin-HRP, obtenido de Vector, Burlongame, CA) , diluido a 1:4000 en el regulador Casein Assay Buffer, s agregó a las cavidades durante 1 hora a la temperatur ambiente. El substrato colorimétrico, Slow TMB-ELIS (Pierce) se agregó y permitió reaccionar durante 15 minuto a la temperatura ambiente, después de lo cual se detuvo l reacción enzimática por la adición de 25 µl de H2S04 2N. E producto de reacción se cuantificó usando un dispositiv Molecular Devices Vmax, que mide la diferencia en l absorbencia a 450 nm y a 650 nm. 6. Medición de Niveles de la APP Se utilizaron dos diferentes ensayos de APP. E primero, designado APP-a/FL, reconoce ambas formas APP-alf (a) y de longitud completa (FL) . El segundo, es específic para la APP-a. Este ensayo de APP-a/FL reconoce la AP secretada, que incluye los primeros 12 aminoácidos de Aß.

Puesto que el anticuerpo informador (2H3) no es específic al sitio de sujeción a, que ocurre entre los aminoácido 612-613 de APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-112 (1990) ) ; este ensayo también reconoce la APP de longitu completa (APP-FL) - Los experimentos preliminares, que usa los anticuerpos de APP inmovilizados a la cola citoplásmic de APP-FL para agotar los homogenados del cerebro de APP-F sugieren que aproximadamente el 30-40% de APP-a/FL es F (datos no mostrados) . El anticuerpo de captura para lo ensayos tanto de APP-a/FL como APP-a es el mAß 8E5, elevad contra los aminoácidos 444 a 592 de la forma APP695 (Game et al., supra) . El mAß informador para el ensayo de APP-a/F es mAß 2H3 , específico para los aminoácidos 597-608 d APP695 (Jonson-Wood et al., supra) y el anticuerp informador para el ensayo de APP-a es un derivad biotinilado de m Aß 16H9, elevado a los aminoácidos 605-61 de la APP. El límite inferior de la sensibilidad del ensay de APP-a/FL es de alrededor de 11 ng/ml (150 pM) (Jonson Wood et al.) y que el ensayo específico de APP-a es de 2 ng/ml (0.3 nM) . Para ambos ensayos de AAP, m Aß 8E5 s recubre sobre las cavidades de las placas EIA de 9 cavidades, como se describió antes para m Aß 266. El APP-secretado recombinante, purificado, se usó como el estánda de referencia para el ensayo APP-a y el ensayo de APP-a/F (Esch et al., supra) . Las muestras de homogenado del cerebr en 5 M de guanidina se diluyeron 1:10 en el Diluent Espécimen de LISA (0.014 M de regulador de fosfato, pH d 7.4, albúmina de suero de bovino al 0.6%, 0.05% d timerosal, 0.5 M de NaCl, 0.1% de NP40) . Ellas luego s diluyeron 1:4 en el Diluente Espécimen que contiene 0.5 M d guanidina. Los homogenados diluidos luego se centrifugaron 16,000 x g, durante 15 segundos a la temperatura ambiente. Los estándares y muestras de APP se agregaron a la placa e partes alícuotas duplicadas y se incubaron durante 1.5 hora a la temperatura ambiente. El anticuerpo del informado biotinilado 2H3 o 16H9 se incubó con muestras durante 1 hor a la temperatura ambiente. La Streptavidin-fosfatas alcalina (Boehringer Mannheim, diluida 1:1000 en el diluent espécimen, se incubó en las cavidades durante 1 hora a l temperatura ambiente. El substrato fluorescente, el 4-metil-umbeliferil-fosfato se agregó para la incubación a l temperatura ambiente por 30 minutos y las placas se leyero en un fluorímetro Cytofluor™ 2350 (Millipore) a excitació de 365 nm y 450 nm de emisión. 7. Inmunohistoquímica Se fijaron cerebros durante tres días a 4°C e paraformaldehído al 4% en PBS y luego se almacenaron desd uno a siete días a 4°C en 1% de paraformaldehído, PBS hast seccionar. Secciones coronales con espesor de cuarent mieras se cortaron en un vibratomo a la temperatura ambient y se almacenaron en un crioprotector (30% de glicerol, 30 de etilen-glicol en regulador de fosfato) a -20°C, antes de proceso inmunohistoquimico . Para cada cerebro, sei secciones en el nivel del hipocampo dorsal, cada un separada por intervalos de 240 µm consecutivos, se incubaro durante la noche con uno de los siguientes anticuerpos: (1) anti-Aß biotinilado (m Aß 3D6, específico para el Aß humano) diluido a una concentración de 2 µg/ml en PBS y 1% de suer de caballo; o (2) m Aß biotinilado específico para AP humana, 8ES, diluido a una concentración de 3 µg/ml en PBS 1.0% de suero de caballo; o (3) un m Aß específico para l proteína acida fibrilar de glial (GFAP; Sigma Chemical Co . ) diluido 1:500 con 0.25% de Tritón X-100 y 1% de suero d caballo, en una solución salina regulada con Tris, pH de 7. (TBS) ; o (4) m Aß específico para CDllb, antígeno MAC- (Chemicon International) diluido 1:100 con 0.25% de Tritó X-100 y 1% de suero de conejo en TBS: o (5) un m A específico para el antígeno MHC II (Pharmingen) diluid 1:100 con 0.25% de Tritón X-100 y 1% de suero de conejo e TBS; o (6) un m Aß de rata específico para CD 4 (Pharmingen) diluido 1:100 con 2% de suero de conejo en OB o (7) un Aß de la rata específico para CD 45RA (Pharmingen) diluido 1:100 con 1% de suero de conejo en PBS; u (8) un A monoclonal de la rata específico para CD 45RB (Phamingen) , diluido 1:100 con 1% de suero de conejo en PBS; o (9) un A monoclonal de la rata específico para CD 45 (Phamingen) diluido 1:100 con 1% de suero de conejo en PBS; o (10) un A de hámster policlonal biotinilado, específico para CD3 (Pharmingen) , diluido 1:100 con 1% de suero de conejo en PB u (11) m Aß de la rata específico para CD3 (Serotec) , diluido 1:200 con 1% de suero de conejo en PBS; o con (12) una solución de PBS que carece de un anticuerpo primario, que contiene 1% de suero de caballo normal. Las secciones reaccionadas con las soluciones de anticuerpo, listadas en 1,2 y 6-12 anteriores, se trataro previamente con 1.0% de Tritón X-100, 0.4% de peróxido d hidrógeno en PBS durante 20 minutos a la temperatur ambiente, para bloquear la peroxidasa endógena. Ellas e seguida se incubaron durante la noche a 4°C con e anticuerpo primario. Las secciones reaccionadas con 3D6 8E5 o CD3e m Aßs, luego se hicieron reaccionar durante un hora a la temperatura ambiente con un complejo de peroxidas de rábano fuerte- avidina - biotina, con los componentes d equipo "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Élite Standar Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.) . Las seccione reaccionadas con anticuerpos específicos para CD 45RA, C 45RB, CD45, CD3 y la solución PBS sin el anticuerp primario, se incubaron durante 1 hora a la temperatur ambiente, con la IgG anti-rata biotinilada (Vector) diluid 1:75 en PBS o la IgG anti-ratón biotinilada (Vector) diluid 1:75 en . PBS, respectivamente. Las secciones luego s hicieron reaccionar durante una hora a la temperatur ambiente con un complejo de peroxidasa de rábano fuerte avidina - biotina, con los componentes de equipo "A" y "B diluidos 1:75 en PBS (Vector Élite Standard Kit, Vecto Labs, Burlingame, CA.) Las secciones se desarrollaron en 0.01% d peróxido de hidrógeno, 0.05% de 3 , 3 ' -diaminobencidina (DAB) a la temperatura ambiente. Las secciones destinadas para l incubación con los anticuerpos específicos GFAP, MAC-1 y MH se trataron previamente con 0.6% de peróxido de hidrógeno la temperatura ambiente para bloquear la peroxidas endógena, luego se incubó durante la noche con el anticuerp primario a 4°C. Las secciones reaccionadas con el anticuerp de GFAP se incubaron durante 1 hora a la temperatur ambiente con la IgG anti-ratón biotinilada obtenida en e caballo (Vector Laboratories, Vectastain Élite ABC Kit) diluida 1:200 con TBS. Las secciones se hicieron reacciona luego durante una hora con un complejo de avidina - biotin peroxidasa (Vector Laboratories; Vectastain Élite ABC Kit) diluido 1_1000 con TBS. Las secciones incubadas con m A específico de MAC-1 o MHC II como el anticuerpo primario, s hicieron reaccionar subsecuentemente durante 1 hora a l temperatura "ambiente con la IgG anti-rata biotinilada, obtenida en el conejo, diluida 1:200 con TBS, seguido por l incubación durante una hora con el complejo de avidina biotina -peroxidasa diluido 1:1000 con TBS. Las seccione incubadas con anticuerpos específicos de GFAP, MAC-1 y MH II luego se visualizaron por el tratamiento a la temperatur ambiente con 0.05% de DAB, 0.01% de peróxido de hidrógeno, 0.04% de cloruro de níquel, TBS durante 4 y 11 minutos, respectivamente . Las secciones inmuno-etiquetadas se montaron sobr cursores de vidrio (VWR, Superfrost sudes) se secaron a aire durante la noche, se sumergieron en Propar (Anatech) se recubrieron con cursores de cubierta usando el Permoun (Fisher) como el medio de montaje. Para contrateñir las placas de Aß, un subconjunt de las secciones positivas de GFAP se montaron en cursore Superfrost y se incubaron en Thioflavin S acuoso al 1 (Sigma) durante 7 minutos luego del proceso inmunohisto-químico. Las secciones luego se deshidrataron y despejaro en Propar, en seguida se recubrieron con cursores d cubierta montados con Permount. 8. Análisis de Imagen Un sistema de análisis de imagen Videometric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) enlazado a un microscopi Nikon Microphot-FX a través de una cámara de video CCD y u monitor Sony Trinitron, se usaron para la cuantificación d los cursores ínmunorreactivos . La imagen de la sección se almacenó en un regulador de video y un umbral basado e color y saturación se determinó para seleccionar y calcula el área total de píxel ocupada por las estructuras inmuno etiquetadas. Para cada sección, el hipocampo se deline manualmente y el área total de píxel ocupada por e hipocampo se calculó. El porcentaje de amiloide cargado s midió como: (la fracción del área del hipocampo que contien los depósitos de Aß inmunorreactivos con mAß 3D6) x 100. Similarmente, el porcentaje neurítico cargado se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contiene la neuritas distróficas reactivas con el mAß 8E5) x 100. E sistema de Imagen C (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que opera el programa de Aplicación de Software Simple 32 s enlazó a un microscopio Nikon Microphot-FX a través de un cámara Optronics y se usó para cuantificar el porcentaje d la corteza retrosplenial ocupada por los astrosito positivos de GFAP y la microglia MAC-1 y MHC II positiva. L imagen de la sección inmunorreaccionada se almacenó en u almacén temporal de video y se determinó el umbral basado e el monocroma para seleccionar y calcular el área total d píxel ocupada por las células inmuno-etiquetadas. Para cad sección, la corteza retrospleníal (RSC) se deline manualmente y se calculó el área total de píxel ocupada po la RSC. El por ciento de astrocitosis se define como: (l fracción de RSC ocupada por los astrositos reactivos d GFAP) x 100. También, el % de microgliosis se define como (la fracción de la RSC ocupada por la microglia reactiva d MAC-1 o MHC II) x 100. Para todos los análisis de imagen, seis secciones en el nivel del hipocampo dorsal, cada un separada por intervalos de 240 µm consecutivo, se calcularo para cada animal. En todos los casos, el observado desconoce el estado del tratamiento de los animales. Aunque la invención anterior se ha descrito e detalle para fines de claridad y entendimiento, será obvi que se pueden practicar ciertas modificaciones dentro de ámbito de las reivindicaciones anexas. Todas la publicaciones y documentos de patente citados se incorpora como referencia en su totalidad y para todo fin, en l extensión como si se denotaron individualmente.

TABLA 1 TITULO AL 50% MÁXIMO DE O.D.

Claims (66)

R E I V I N D I CAC I O N E S

1. Una composición farmacéutica, que comprende u agente efectivo para inducir una respuesta inmunogénic contra el péptido ß-amiloide ("Aß") en un paciente, y u auxiliar aceptable farmacéuticamente.

2. La composición farmacéutica de la reivindica ción 1, en que el agente es el Aß o un fragmenta activo de mismo .

3. La composición farmacéutica de la reivindíca ción 1 ó 2, en que el auxiliar comprende el alumbre.

4. La composición farmacéutica de la reivindica ción 1 ó 2, en que el auxiliar comprende el lípido d monofosforilo (MPL) .

5. La composición farmacéutica de la reivindica ción 1 ó 2, en que el auxiliar comprende el QS21.

6. La composición farmacéutica de cualquiera d las reivindicaciones precedentes, en que el Aß o s fragmento es un componente de una partícula.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en que la partícula es una partícula de u copolímero de poliglicólido de poliláctido.

8. Un método para prevenir o tratar un enfermedad, caracterizada por el depósito de amiloide en u paciente, este método comprende: administrar un agente efectivo para inducir un respuesta inmune contra un componente de péptido de u depósito de amiloide en el paciente.

9. El método de la reivindicación 8, en que el depósito de amiloide comprende el péptido Aß agregado.

10. El método de la reivindicación 8 ó 9, en qu el paciente es un humano.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la enfermedad es l enfermedad de Alzheimer.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el paciente es asintomático .

13 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el paciente es menor de 50 años ,

14 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el paciente tiene factores de riesgo heredades, que indican la susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en que el paciente no tiene factores de riesgo conocidos para la enfermedad de Alzheimer.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el agente comprende el péptido Aß o un fragmento activo del mismo.

17 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el agente es el péptido Aß o un fragmento activo del mismo.

18. El método de la reivindicación 17, en que la dosis del péptido Aß administrado al paciente es al menos de 50 µg.

19. El método de la reivindicación 17, en que la dosis del péptido Aß administrado al paciente es al menos de 100 µg.

20 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el péptido Aß es el Aß42.

21. El método de la reivindicación 20, en que el péptido Aß se administra en la forma agregada.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la respuesta inmune comprende anticuerpos que se unen al péptido Aß.

23 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la respuesta inmune comprende células T que se unen al péptido Aß, como un componente de un complejo de MHCI o MHC II.

24 El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 10 a 15, en que el agente es un anticuerpo a Aß, el cual induce una respuesta inmune por la unión al Aß en el paciente.

25. El método de las reivindicaciones 8 ó 10 a 15, en que las células T se remueven del paciente, hacen contacto con el péptido Aß, bajo condiciones en las cuales las células T son aprestadas, y estas células T aprestadas se administran al paciente.

26, El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el agente se administra oralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, tópicamente o intravenosamente.

27 El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el agente se administra intramuscularmente o subcutáneamente.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende examinar una colección de compuestos para identificar un compuesto reactivo con anticuerpos a Aß, y administrar el compuesto al paciente, para inducir la respuesta inmune.

29 El método de cualquiera de las reivindicaciones 8, 10 a 15, 26 ó 27, en que el agente es una dosis efectiva de un Aß que codifica un ácido nucleico o un fragmento activo del mismo, por lo cual el ácido nucleico se expresa en el paciente para producir el Aß o uno de sus fragmentos activos, el cual induce la respuesta inmune.

30. El método de la reivindicación 29, en que el ácido nucleico se administra a través de la piel .

31. El método de la reivindicación 30, en que el ácido nucleico se aplica a la piel por medio de un parche.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende vigilar al paciente en la respuesta inmune .

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende administrar un auxiliar, el cual aumenta la respuesta inmune al péptido Aß.

34. El método de la reivindicación 33, en que el auxiliar y el agente se administran juntos como una composición.

35. El método de la reivindicación 33, en que el auxiliar se administra antes que el agente.

36. El método de la reivindicación 33, en que el auxiliar se administra después del agente.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en que el auxiliar es el alumbre.

38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en que el auxiliar es el MPL.

39 El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en que el auxiliar es el QS21.

40 El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en que la dosis del péptido Aß es mayor de 10 µg.

41. Un método para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer, el cual comprende administrar una dosis efectiva del péptido Aß a un paciente.

42. EL uso del péptido Aß, o un anticuerpo del mismo, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.

43. El uso, según la reivindicación 42, en que el péptido Aß se combina con un auxiliar, aceptable farmacéuticamente, en la fabricación del medicamento.

44. Una composición que comprende el péptido Aß, o un fragmento del mismo, enlazado a una molécula conjugada que promueve la entrega del péptido Aß a la corriente sanguínea de un paciente y/o promueve una respuesta inmune contra el péptido Aß.

45. La composición de la reivindicación 44, en que los conjugados promueven una respuesta inmune contra el péptido Aß.

46. La composición de la reivindicación 44 ó 45, en que el conjugado es la toxina del cólera.

47. La composición de la reivindicación 44 ó 45, en que el conjugado es una inmunoglobulina.

48. La composición de la reivindicación 44 ó 45, en que el conjugado es la toxina CRM 197 atenuada de la difteria.

49. Una composición farmacéutica que comprende un agente que induce una respuesta inmunogénica contra el péptido Aß en un paciente, con la condición que la composición se encuentre exenta del auxiliar de Freund Completo .

50. Una composición, que comprende un vector viral, que codifica el péptido Aß o un fragmento del mismo, efectivo en inducir una respuesta inmune contra el péptid Aß.

51. Una composición, según la reivindicación 50, en que el vector viral es el herpes, adenovirus, viru adenoasociado, un retrovirus, sindbis, virus semilik forest, vacuna o una erupción pustulosa de las aves.

52. Un método para evaluar la eficacia de u método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en u paciente, este método comprende: determinar la cantidad de línea básica de anticuerpo específico para el péptido Aß en una muestra d tejido desde el paciente, antes del tratamiento, con u agente, comparar una cantidad del anticuerpo específic para el péptido Aß, en la muestra de tejido desde e paciente, después del tratamiento con el agente, a l cantidad de línea básica del anticuerpo específico de péptido Aß, en que la cantidad del anticuerpo específico a péptido Aß, medida después del tratamiento, que se significantemente mayor que la cantidad de línea básica de anticuerpo específico del péptido Aß, indica un resultad positivo del tratamiento.

53. El método de la reivindicación 52, en que la cantidades del anticuerpo se miden como títulos de anticuerpo .

54. El método de la reivindicación 53, en que la cantidades del anticuerpo se miden por un ensayo ELISA.

55. Un método para evaluar la eficacia de u método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en u paciente, este método comprende: determinar una cantidad de línea básica del anticuerpo específico para el péptido Aß en la muestra d tejido de un paciente, antes del tratamiento con un agente; comparar una cantidad del anticuerpo específic para el péptido Aß en la muestra de tejido del sujeto, después del tratamiento con el agente, a la cantidad d línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß, en que una reducción o carencia de una diferenci significante entre la cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después del tratamiento, comparada con l cantidad de línea básica del anticuerpo específico del péptido Aß, indica un resultado negativo del tratamiento.

56. Un método para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, este método comprende: determinar una cantidad de control del anticuerpo específico para el péptido Aß en muestras de tejido de una población de control, comparar una cantidad del anticuerpo específico para el péptido Aß en una muestra de tejido del paciente, después de administrar un agente, a la cantidad de control del .anticuerpo específico del péptido Aß, en que una cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después del tratamiento, que es significantemente mayor que la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido Aßy indica un resultado positivo del tratamiento.

57. Un método para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, este método comprende: determinar una cantidad de control del anticuerp específico para el péptido Aß, en muestras de tejidos de un población de control, comparar una cantidad del anticuerpo específic para el péptido Aß en una muestra de tejido del paciente, después de administrar un agente, a la cantidad de control del anticuerpo específico del péptido Aß, en que una carencia de una diferencia significant entre la cantidad del anticuerpo específico del péptido Aß, medida después de comenzar el tratamiento, comparada a l cantidad de control del anticuerpo específico del péptid Aß, indica un resultado negativo del tratamiento.

58. Un método para vigilar la enfermedad de Alzheimer o la susceptibilidad a la misma en un paciente, este método comprende: detectar una respuesta inmune contra el péptido A en una muestra del paciente.

59. El método de la reivindicación 58, en que al paciente se administra un agente efectivo para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, y el nivel de l respuesta determina el régimen futuro de tratamiento del paciente .

60. El método de la reivindicación 59, en que el agente es el péptido Aß.

61, El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en que la detección comprende detectar un anticuerpo que se una específicamente al péptido Aß.

62. El método de cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en que la detección comprende detectar células T reactivas específicamente con el péptido Aß.

63. Un método para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, este método comprende: determinar un valor para una cantidad del anticuerpo, específico para el péptido Aß en la muestra de tejido de un paciente, el cual se ha tratado con un agente; comparar el valor con un valor de control, determinado de una población de paciente que experimenta la mejora de, o la libertad de, los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, debido al tratamiento con el agente; en que un valor en el paciente al menos igual al valor del control, indica una respuesta positiva al tratamiento.

64. EL uso del péptido Aß en vigilar el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un paciente.

65. Un equipo de diagnóstico para vigilar el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, este equipo comprende: un agente que se une a los anticuerpos específicos para el péptido Aß.

66. El equipo de diagnóstico de la reivindicación 65, que además comprende etiquetas que indican la manera de usar este equipo para vigilar el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.