CZ306683B6

CZ306683B6 - Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci

Info

Publication number: CZ306683B6
Application number: CZ2008-595A
Authority: CZ
Inventors: David M. Holtzman; Ronald Demattos; Kelly R. Bales; Steven M. Paul; Naoya Tsurushita; Maximiliano Vasquez
Original assignee: Washington University; Eli Lilly And Company
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2017-05-03
Also published as: DK1257584T4; US20110158986A1; NZ520800A; CN101670105B; HK1048640B; UA75881C2; ZA200206712B; US20060039906A1; EP3150633A1; US20040043418A1; US7892545B2; DE60106394D1; PL218883B1; EP1257584B9; JP2003523764A; HUP0204074A2; PT1481992T; BRPI0108676B8; HRP20080430B1; SI1257584T2

Abstract

Je popsáno použití protilátky, která specificky váže epitop obsažený v pozicích 13 až 28 A.beta. peptidu pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci. Je také popsán farmaceutický prostředek vhodný k uvedenému použití.

Description

Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití protilátky, která specificky váže epitop obsažený v pozicích 13 až 28 Αβ peptidu, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci. Konkrétně se vynález týká také farmaceutického prostředku k uvedenému použití.

Dosavadní stav techniky

Mnoho stavů, které vedou ke kognitivním deficitům, mrtvicím, mozkovému krvácení a celkovému mentálnímu zhoršení je patrně asociováno s neuritickými a cerebrovaskulámími plaky v mozku, které obsahují amyloidový beta peptid (Αβ). Mezi takové stavy patří preklinická a klinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a preklinická a klinická cerebrální amyloidová angiopatie (CAA). Amyloidové plaky jsou tvořeny z amyloidových beta peptidu. Tyto peptidy cirkulují v krvi a v mozkomíšním moku (CSF), obvykle ve formě komplexů s lipoproteiny. Αβ peptid v cirkulující formě je složen z 39 až 43 aminokyselin (nejčastěji ze 40 nebo 42 aminokyselin), které vznikají ze štěpení společného prekurzorového proteinu, amyloidového prekurzorového proteinu, který se často označuje jako APP. Některé formy solubilního A jsou sami o sobě neurotoxické a mohou určovat závažnost neurodegenerace a/nebo kognitivní deficit (McLean, C. A., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert, Μ. Ρ., et al. (1998) 95:6448-6453; Naslund, J. J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571).

Důkazy naznačují, že A může být transportován mezi mozkem a krví (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata M, et al., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489-1499). Dále Αβ v plakách je v rovnováze se solubilním Αβ v mozku a v krvi (Kawarabayashi Τ, et al., J. Neurosci. (2001)21:372-381).

Jak bylo popsáno v PCT přihlášce US 00/35681 a U.S. pořadové č. 09/153,130, které jsou zde uvedeny jako odkazy, celkové cirkulující hladiny A peptidu v CSF jsou podobné u normálních jedinců a u jedinců predisponovaných k příznakům Alzheimerovi nemoci. Nicméně, hladiny AS42 jsou v průměru nižší u jedinců s Alzheimerovou nemocí (Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). Je známo, že Αβ₄₂ je více náchylný k agregaci než Αβ₄₀, a když k tomu dojde, vznikají nežádoucí následky jako je depozice Αβ v amyloidových plakách, konverze Αβ na toxické solubilní formy, poškození nervových buněk a poruchy chování, jako je demence (Golde, T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187).

Způsoby pro indukci imunitní reakce pro redukci amyloidových depozit jsou popsány v PCT publikaci WO 99/27944 publikované 10. 6. 1999. Přihláška uvádí, že kompletní agregovaný Αβ peptid může být užitečným imunogenem. imunogen. Podání Αβ fragmentu (aminokyseliny 13-28) konjugovaného na ovčí anti-myší IgG nezpůsobuje žádnou změnu v ukládání amyloidu v kortexu, a pouze u jednoho zvířete z devíti, kterým byl podán konjugát Αβ 13-28 fragmentu, vykazovalo určitou lymfoproliferaci v reakci na Αβ40. Přihláška také naznačuje, že protilátky, které se specificky váží na Αβ peptid, mohou být použity jako terapeutická činidla. Nicméně, toto se jeví jako spekulace, protože data podporující tuto hypotézu odrážejí protokoly, které zahrnují aktivní imunizaci za použití, například, Αβ₄₂. Peptidy jsou podány pomocí adjuvans a jsou určeny titry protilátky indukované imunizaci, stejně jako koncentrace Αβ peptidu a prekurzorového peptidu. Přihláška silně naznačuje, že Αβ plak musí být redukován pro zmírnění příznaků Alzheimerovi nemoci, a že pro úspěšnou redukci Αβ plaku jsou nutné procesy zprostředkované buňkami.

WO 99160024, publikovaná 25. 11. 1999, se týká způsobů pro odstranění amyloidu za použití anti-amyloidové protilátky. Nicméně, je uvedeno, že mechanismus využívá schopnosti anti-Αβ protilátky vázat se na pre-existující amyloidová deposita (tj., plaky) a způsobit následnou lokální mikrogliální reakci na lokalizovaných plakách. Tento mechanismus nebyl ověřen in vivo. Tato přihláška dále uvádí, že aby byly účinné proti Αβ plakům, musí pronikat anti-Αβ protilátky do mozkového parenchymu a překonávat hematoencefalickou bariéru.

Několik PCT přihlášek, které se týkají pokusů o kontrolu amyloidových plaků, bylo publikováno 7. 12. 2000. WO 00/72880 popisuje významnou redukci plaků v kortexu a hippocampu v transgenním myším modelu Alzheimerovi nemoci při léčbě N-terminálních fragmentů Αβ peptidu a protilátek, které se váží na tyto fragmenty, ale ne při léčbě Αβ_]3_₂₈ fragmentem konjugovaným na ovčí anti-myší IgG nebo při použití protilátky proti 13-28 fragmentu, protilátky 266. Bylo zjištěno, že protilátky proti N-konci překonávají hematoencefalickou bariéru a indukují fagocytózu amyloidových plaků v pokusech in vitro.

WO 00/72876 popisuje v podstatě to samé co WO 00/72880 a týká se imunizace složkami amyloidových fibril samotnými.

WO 00/77178 popisuje protilátky, které katalyzují hydrolýzu D-amyloidu, včetně protilátek namířených proti směsi fenylalanin-statinových přechodných sloučenin Cys-Αβιο-^ statin Phei9Phe₂o a Cys-Aβlo-₂5 statin Phe₂o-Ala_2] a protilátky proti Αβιο-₂5 s redukovanou amidovou vazbou mezi Phei9 a Phe₂o. Tato přihláška zmiňuje sekvestrování Αβ, ale jedná se o spekulaci, protože není uveden žádný důkaz takového sekvestrování. Dále, přihláška neuvádí žádný důkaz in vivo, že podání protilátky způsobuje vylučování AS z centrálního nervového systému, interferuje s tvorbou plaků, redukuje tvorbu plaků, tvoří komplexy mezi protilátkou a AS ve tkáních nebo ovlivňuje kognitivní funkce.

Bylo zjištěno, že jednou dráhou Αβ metabolismu je transport z CNS do plazmy (Zlokovic, B.V., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883). Dále bylo zjištěno, že Αβ v plazmě může pronikat přes hematoencefalickou-bariéru a vstupovat do mozku (Zlokovic, Β. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Také bylo zjištěno, že podání některých polyklonálních a monoklonálních Αβ protilátek snižuje deponování Αβ v amyloidových plakách v APPV717F transgenním myším modelu Alzheimerovi nemoci (Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-9 19); nicméně, uvádělo se, že toto je způsobeno tím, že některé anti-Αβ protilátky procházející hematoencefalickoubariérou stimulují fagocytosu amyloidových plaků mikrogliemi. V Bardových pokusech testy na řezech mozku ex vivo ukázaly, že přítomnost Αβ protilátky, společně s exogenně přidanými mikrogliemi, indukuje fagocytosu Αβ, což vede k odstranění Αβ depozit.

Koncentrace jak solubilního Αβ₄₀, tak Αβ₄₂ v CSF a krvi mohou být snadno zjištěny za použití standardních testů za použití protilátky namířené proti epitopům v Αβ řetězci. Takové testy jsou popsány, například, v U.S. patentech 5,766,846; 5,837,672; a 5,593,846. Tyto patenty popisují produkci myší monoklonální protilátky k centrální doméně Αβ peptidu, ta obsahuje epitopy okolo a včetně pozic 16 a 17. Také byly popsány protilátky namířené proti N-terminálnímu regionu. Bylo zjištěno, že některé monoklonální protilátky jsou imunoreaktivní s pozicemi 13-28 Αβ peptidu; tyto se neváží na peptid obsahující pozice 17-28, a proto - podle uvedených patentů - že tyto protilátky se váží na tento region, včetně pozic 16-17 (místo alfa-sekretasy). Mezi protilátky, o kterých je známo, že se váží na region mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, patří myší protilátky 266, 4G8 a 1C2.

Neočekávaně jsme zjistili, že podání 266 protilátky velmi rychle a téměř úplně obnovuje kognitivní funkce (paměť) u 24-měsíčních hemizygotních transgenních myší (APP V717F). Dále, protilátka nemá vlastnosti, které se v oboru uvádějí jako nutné pro to, aby byla protilátka účinná při léčbě Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu a jiných onemocnění souvisejících s Αβ peptidem. K našemu překvapení jsme pozorovali, že protilátky, které se váží na Αβ mezi pozicemi 13 a 28 (266 a 4G8), jsou schopné sekvestrovat solubilní formy Αβ z vázaných, cirkulujících forem v krvi, a že periferní podání protilátky 266 vede k rychlému vylučování relativně velkých množství Αβ peptidu z CNS do plazmy. Toto vede ke změně klírens solubilního Αβ, prevenci tvorby plaků, a - což je nejvíce překvapivé - ke zlepšení kognitivních funkcí, i bez nutné redukce Αβ amyloidových plaků, jakéhokoliv významného překonávání hematoencefalické bariéry, vazby na plaky, aktivace buněčných mechanismů nebo vazby s vysokou afinitou na agregovaný Αβ.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu dále je farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro použití pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQIDNO: l)nebo

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQIDNO: 15),

- CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce, a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

-CDR1 těžkého řetězce: 15

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQIDNO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

¹⁵ 1015

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

1015

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQIDNO: 16)

- CDR3 těžkého řetězce: 1 ·

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Předmětem tohoto vynálezu dále je farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo ¹ 5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

o

- CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

1015

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvenci úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Výhodné provedení každého z farmaceutických prostředků pro použití uvedená výše spočívá v tom, protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) a

15

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).

Výhodné provedení každého z farmaceutických prostředků pro použití uvedená výše spočívá v tom, že humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg 20

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp 3540

Pro Xaa Leu Leu lie Tyr Lys Val 5055

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 6570

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa 85

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly 100

Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 10 15

Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 25 30

Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 7580

Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 9095

Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu lie Lys 105HO

Arg (SEQ ID NO: 7) kde

Xaa v pozici 2 je Val nebo lie;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je lie nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahuje dále uvedené sekvence:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala 3540

Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn 5055

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg 6570

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin 100

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 45

Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 60

Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 7580

Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 9095

Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 105110 kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr;

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebe Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Výhodné provedení pro použití svrchu uvedeného předmětu vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.

Výhodné provedení pro použití každého svrchu uvedeného předmětu vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

- CDR1 lehkého řetězce:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

- CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

CDR2 těžkého řetězce:

1.5 10 15

Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

10 15

Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr' (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití farmaceutického prostředku obsahujícího humanizoio vanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

- CDR1 lehkého řetězce:

Arg Ser Ser Gin Ser Léu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

1' 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetěz5 ce a

- CDR1 těžkého řetězce:

¹ 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

CDR2 těžkého řetězce:

Gin He Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a - CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek pro použití blíže specifikované v úvodu této kapitoly, kde protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 těžký řetězec:

Gin Tle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).

Výhodným provedením tohoto vynálezu je použití farmaceutického prostředku, ve kterém, jak uvedeno výše,

- protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10, nebo

- protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12, nebo

- farmaceutický prostředek obsahuje humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, přičemž uvedená protilátka obsahuje:

- CDR1 lehkého řetězce SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 15;

- CDR2 lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3 a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

- CDR1 těžkého řetězce SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 15;

- CDR2 těžkého řetězce SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 16;

- CDR3 těžkého řetězce SEQ ID NO: 6 a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

Asp 1

Xaa

Val

Met

Thr 5

Gin

Xaa

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Xaa

Xaa 15

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser 20

lie

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Gin

Ser

Leu

Xaa 30

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn 35

Ala

Tyr

Leu

His

Trp 40

Phe

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly

Gin

Ser

Pro

Xaa 50

Leu

lie

Tyr

Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

Leu

Lys

lie 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Xaa

Gly

Val 90

Tyr

Cys

Ser

Gin 95

Ser

Thr

His

Val

Pro 100

Trp

Thr

Phe

Gly

Xaa 105

Gly

Thr

Xaa

Glu 110

lie

Lys

Arg (SEQ ID NO: 7) kde

Xaa v pozici 2 je Val nebo lie;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr,

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser,

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je lie nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahující dále uvede sekvence:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Glr. Pro Gly Gly 15 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 2530

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 35 4045

Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr LeuTyr

70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys

9095

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

100

105

110 (SEQ ID NO: 8) kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser,

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser,

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr,

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je použití farmaceutického prostředku uvedeného v předcházejícím odstavci, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je použití farmaceutického prostředku uvedeného v odstavci zařazeném před předcházejícím odstavcem, kde protilátka má sekvence variabilního regionu lehkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 12.

Dále se popisuje předmětný vynález v širších souvislostech. Jsou také uvedeny srovnávací údaje.

Vynález poskytuje humanizované protilátky, nebo jejich fragmenty, které pozitivně ovlivňují kognitivní funkce u nemocí asociovaných s Αβ, jako je klinická nebo preklinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a klinická nebo preklinická cerebrální amyloidová angiopatie. ProtilátCZ 306683 B6 ky nebo jejich fragmenty nemusí pronikat hematoencefalickou bariérou, vázat se na amyloidové plaky, aktivovat buněčnou reakci nebo redukovat amyloidové plaky. V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, které sekvestrují Αβ peptid z vázané, cirkulující formy v krvi, a mění klírens solubilních a vázaných forem Αβ v centrálním nervovém systému a plazmě. V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde humanizované protilátky se specificky váží na epitop mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ molekuly. V jiném aspektu vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde CDR jsou odvozeny od myší monoklonální protilátky 266 a kde si protilátky přibližně zachovávají vazebné vlastnosti myší protilátky a mají in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce (sekvence SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 6). V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde variabilní regiony mají sekvence obsahující CDR z myší protilátky 266 a specifické lidské pracovní sekvence (sekvence SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10), kde si protilátky přibližně zachovávají vazebné charakteristiky myší protilátky a mají in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce 266. V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde lehký řetězec má SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec má SEQ ID NO: 12.

Součástí nalezeného řešení jsou také polynukleotidové sekvence, které kódují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty popsané výše, vektory obsahující polynukleotidové sekvence kódující humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, hostitelské buňky transformované vektory nebo inkorporující polynukleotidy, které exprimují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, farmaceutické přípravky humanizované protilátky a jejích fragmentů popsaných výše, a způsoby výroby a použití těchto přípravků.

Takové humanizované protilátky a jejich fragmenty jsou použitelné pro sekvestrování Αβ u lidí; pro léčbu a prevenci nemocí a stavů charakterizovaných Αβ plaky nebo Αβ toxicity v mozku, jako je Alzheimerovi nemoc, Downův syndrom a cerebrální amyloidová angiopatie u člověka; pro diagnostiku těchto nemocí u člověka; a pro určení toho, zda bude lidský jedinec odpovídat na léčbu lidskou protilátkou proti Αβ.

Podání vhodné humanizované protilátky in vivo pro sekvestraci Αβ peptidu cirkulujícího v biologických tekutinách je použitelné pro preventivní a terapeutickou léčbu stavů spojených s tvorbou difusních, neuritických a cerebrovaskulámích plaků obsahujících Αβ v mozku. Humanizované protilátky, včetně jejich imunologicky reaktivních fragmentů, způsobují odstranění Αβ peptidu z makromolekulámích komplexů, které se normálně podílejí na jejich transportu v tělesných tekutinách do a z míst, ve kterých mohou být tvořeny plaky nebo kde mohou být toxické. Dále, sekvestrování plazmatického Αβ peptidu pomocí protilátky nebo jejího fragmentu působí jako Jímka“, která účinně sekvestruje solubilní Αβ peptid v plazmatickém kompartmentu a indukuje přesun Αβ do plazmy z regionů v centrálním nervovém systému (CNS). Sekvestrováním Αβ v krvi se zvyšuje vylučování Αβ z mozku a brání se ukládání solubilního Αβ v insolubilních plakách a tvorbě toxických solubilních typů Αβ v mozku. Dále, insolubilní Αβ v plakách, který je v rovnováze se solubilním Αβ, může být odstraněn z mozku prostřednictvím sekvestrace v krvi. Sekvestrováním Αβ peptidu pomocí protilátky také zvyšuje jeho vylučování z těla a inhibuje toxické účinky solubilního Αβ v mozku a vznik a další akumulaci insolubilního Αβ ve formě amyloidu v plakách. Protilátky podle předkládaného vynálezu nepronikají hematoencefalickou bariérou ve velkých množstvích (0,1% plazmatické koncentrace). Dále, humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu nemusí při periferním podání pro dosažení účinku vyvolávat buněčnou imunitní reakci v mozku nebo cirkulaci při vazbě na Αβ peptid. Dále, při periferním podání se nemusí pro dosažení účinku vázat na agregovaný Αβ peptid v mozku.

Tak je v jednom aspektu vynález zaměřen na způsob pro léčbu a pro prevenci stavů charakterizovaných tvorbou plaků obsahujících beta-amyloidový protein u člověka, kde tento způsob zahrnuje podání, výhodně periferní, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství humanizované monoklonální protilátky nebo jejího imunologicky reaktivního fragmentu, kde tato protilátka se specificky váže na střední region Αβ peptidu. V jiném aspektu je vynález zaměřen způsob pro inhibici tvorby amyloidových plaků a pro odstranění amyloidových plaků u člověka, kde tento způsob zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky, která sekvestruje Αβ peptid z cirkulující formy v krvi a indukuje vylučování peptidu z mozku, stejně jako mění Αβ klírens v plazmě a mozku, člověku, který potřebuje takovou inhibici. V dalších aspektech je vynález na takové humanizované protilátky, včetně jejich imunologicky účinných částí, a na způsoby jejich přípravy.

Vynález se také týká způsobů pro zastavení zhoršování kognitivních funkcí, zlepšení kognitivních funkcí, léčbu zhoršení kognitivních funkcí a prevenci zhoršení kognitivních funkcí u jedince s diagnostikovanou klinickou nebo preklinickou Alzheimerovou nemocí, Downovým syndromem nebo klinickou nebo preklinickou cerebrální amyloidovou angiopatií, který zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu danému jedinci.

Vynález také zahrnuje použití humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva, včetně dlouhodobé exprese rekombinantní sekvence protilátky nebo protilátkového fragmentu v lidských tkáních, pro léčbu, prevenci nebo reverzi Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu nebo cerebrální amyloidové angiopatie; pro léčbu, prevenci, nebo reverzi zhoršování kognitivních funkcí při klinické nebo preklinické Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie; nebo pro inhibici tvorby amyloidových plaků nebo působení toxických solubílních typů Αβ u člověka.

Vynález se týká překvapivého zjištění, že během krátké doby po podání protilátky podle předkládaného vynálezu dojde k vyloučení relativně velkých množství Αβ z centrálního nervového systému do krve. Proto předkládaný vynález zahrnuje způsoby pro hodnocení odpovědi lidského jedince na léčbu protilátkou, která se váže na Αβ nebo jeho fragment, které zahrnují: a) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; a b) měření koncentrace Αβ v krvi jedince.

Vynález také zahrnuje způsob pro léčbu lidského jedince protilátkou, která se váže na Αβ nebo jeho fragment, který zahrnuje: a) podání první dávky protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; b) během 3 hodin až 2 týdnů po podání první dávky měření koncentrace Αβ v krvi jedince; c) pokud je to nutné, vypočítání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu podle výsledků z kroku b), kde druhá dávka je stejná nebo jiná než první dávka; a d) podání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu.

Vynález také zahrnuje způsob pro hodnocení účinnosti protilátky, která se váže na Αβ nebo jeho fragment, v inhibici nebo prevenci tvorby Αβ amyloidových plaků, v redukci Αβ amyloidových plaků, v redukci účinků toxických solubílních typů Αβ, nebo v léčbě stavů a onemocnění asociovaných s Αβ plaky, u člověka, který zahrnuje: a) získání prvního vzorku plazmy nebo CSF jedince; b) měření základní koncentrace Αβ v prvním vzorku; c) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; d) během 3 hodin až 2 týdnů po podání protilátky nebo jejího fragmentu získání druhého vzorku plazmy nebo CSF jedince; a e) měření koncentrace Αβ ve druhém vzorku; kde účinnost je hodnocena podle množství Αβ navázaného na protilátku v krvi a podle koncentrace Αβ v CSF.

Objasnění výkresů

Obr. 1 ukazuje procento Αβ peptidu v lidském mozkomíšním moku, který se získá přes dialyzační membránu pomocí MAb 266 v závislosti na hraniční hodnotě molekulové hmotnosti dialyzační membrány.

Obr. 2 ukazuje koncentrace ΑβΤοΐ31 v plazmě APP V717F transgenních myší po injekci buď 200 pg nebo 600 pg MAb 266 v závislosti na čase.

Obr. 3A ukazuje množství uloženého Αβ peptidu v kortexu APP C717F transgenních myší léčených salinickým roztokem, myším IgG, nebo MAb 266. Obr. 3B ukazuje korelaci těchto výsledků s původem.

Obr. 4 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 lehkého řetězce z plazmidu pVk-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovaném humanizovaném 266 lehkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 11 ve zralém stavu).

Obr. 5 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 těžkého řetězce z plazmidu pVgl-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovaném humanizovaném 266 těžkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 12 ve zralém stavu).

Obr. 6 je mapa plazmidu pVk-Hu266.

Obr. 7 je mapa plazmidu pVgl-Hu266.

Příklady uskutečnění vynálezu

Αβ peptidy, které cirkulují v biologických kapalinách, představují karboxy terminální region prekurzorového proteinu kódovaného na chromosomu 21. Z výsledků pokusů in vitro bylo popsáno, že Αβ peptid má špatnou rozpustnost ve fyziologických roztocích, protože obsahuje řetězec hydrofobních aminokyselin, které jsou součástí regionu, který zakotvuje jeho delší prekurzor do buněčných lipidových membrán. Proto není překvapivé, že cirkulující Αβ peptid je za normálních okolností v komplexu s jinými skupinami, které brání jeho agregaci. Toto způsobuje obtíže při detekci cirkulujících Αβ peptidu v biologických kapalinách.

Výše uvedené patenty (U.S. patenty 5,766,846; 5,837,672 a 5,593,846) popisují přípravu protilátky, včetně monoklonální protilátky, označené jako klon 266, která je namířena k a specificky se váže na peptid obsahující aminokyseliny 13-28 Αβ peptidu. Předkladatelé vynálezu zjistili, že protilátky, které se váží na tento region, oproti protilátkám, které se váží na jakékoliv jiné místo aminokyselinové sekvence Αβ, jsou schopné velmi účinně sekvestrovat solubilní Αβ peptid z makromolekulových komplexů. Tato sekvestrace způsobuje vylučování AS peptidu z CNS, mění jeho klírens v CNS a plazmě, a redukuje jeho schopnost tvořit plaky. Proto jsou protilátky s touto specificitou, modifikované tak, aby byla snížena jejich imunogenicita pomocí přeměny na humanizované formy, možnou léčbou - jak profylaktickou, tak terapeutickou, stavů spojených s tvorbou beta-amyloidových plaků. Mezi takové stavy patří, jak bylo uvedeno výše, preklinická a klinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a preklinická a klinická cerebrální amyloidová angiopatie.

Termín „léčba“, jak je zde použit, zahrnuje terapeutickou léčbu, při které již existuje léčené onemocnění, stejně jako profylaktickou léčbu - tj., prevenci nebo zmírnění možného budoucího onemocnění.

Termín „monoklonální protilátky, které se váží na střední region Αβ peptidu“, označuje monoklonální protilátky (MAb nebo MAbs), které se váží na aminokyselinovou sekvenci představující epitop obsažený mezi pozicemi 13-28 Αβ. Nemusí být pokryt celý region. Pokud se protilátka váže na alespoň epitop v toto regionu (zejména včetně místa pro x-sekretasu 16-17 nebo místa, na které se váže protilátka 266), tak je protilátka účinná ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Termín „protilátka“ označuje monoklonální protilátku jako takovou, nebo její imunologicky účinný fragment, jako je ΡΑβ, ΡΑβ' nebo Ε(Αβ')2 fragmentu. V některých kontextech jsou fragmenty specificky uvedeny; nicméně, je třeba si uvědomit, že bez ohledu na to, zda jsou uvedeny fragmenty, zahrnuje termín „protilátka“ takové fragmenty, stejně jako jednořetězcové formy. Pokud si protein zachovává schopnost specifické vazby na zamýšlený cíl, a v tomto případě schopnost sekvestrace Αβ peptidu z proteinových nosičů v krvi, je zahrnut v termínu „protilátka.“ Termín „protilátka“ také zahrnuje, například, jedno-řetězcové formy, obvykle označované jako Fv regiony, protilátky s touto specificitou. Výhodně, ale ne nutně, jsou protilátky použitelné v předkládaném vynálezu produkovány rekombinantně, protože při úpravě typické myší nebo jiné non-lidské protilátky s vhodnou specificitou je nutná její přeměna na humanizovanou formu. Protilátky mohou a nemusí být glykosylované, ačkoliv glykosylované protilátky jsou výhodné. Protilátky jsou správně zesítěné prostřednictvím disulfidových vazeb, jak je dobře známo v oboru.

Je známo, že základní strukturální jednotka protilátky je tvořena tetramerem. Každý tetramer je tvořen dvěma identickými páry polypeptidových řetězců, kde každý pár je tvořen jedním „lehkým“ (přibližně 25 kDa) a jedním „těžkým“ řetězcem (přibližně 50-70 kDa). Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní region velikosti přibližně 100 až 110 nebo více aminokyselin primárně odpovědný za rozpoznávání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní region primárně odpovědný za efektorové funkce.

Lehké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa a lambda. Těžké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa, delta a epsilon, a definují izotyp protilátky jako IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, v příslušném pořadí. V lehkých a těžkých řetězcích jsou variabilní a konstantní regiony spojeny „J“ regionem tvořeným přibližně 12 nebo více aminokyselinami, kde těžký řetězec také obsahuje „T“ region tvořený přibližně 10 dalšími aminokyselinami.

Variabilní regiony každého lehkého/těžkého páru řetězců tvoří vazebné místo protilátky. Proto má intaktní protilátka dvě vazebná místa. Řetězce mají stejnou obecnou strukturu tvořenou dvěma relativně konzervovanými pracovními regiony (FR) spojenými třemi hypervariabilními regiony, které se také označují jako regiony určující komplementaritu neboli CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru jsou uspořádány pomocí pracovních regionů, což umožňuje vazbu na specifický epitop. Od N- konce k C-konci obsahují jak lehký, tak těžký řetězec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s dobře známou konvencí (ΚΑβηί „Sequences of Proteins of imunological interest“ National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 a 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)).

Jak je v oboru známo, mohou být monoklonální protilátky snadno připraveny s vhodnou specificitou za použití standardních technik imunizace savců, přípravy hybridomů z buněk produkujících protilátky od uvedených savců a kultivací hybridomů nebo imortalizovaných buněk pro hodnocení jejich specificity. V tomto případě mohou být protilátky připraveny imunizaci člověka, králíka, krysy nebo myší peptidem reprezentujícím epitop obsahující 13-28 region Αβ peptidu nebo jeho vhodný subregion. Materiály pro rekombinantní úpravu mohou být získány získáním nukleotidové sekvence kódující požadovanou protilátku z hybridomů nebo jiných buněk, které jí produkují. Tato nukleotidová sekvence za zisku nukleotidu v humanizované formě.

Termín „humanizovaná protilátka“ označuje protilátku, která je složena částečně nebo zcela z aminokyselinové sekvence odvozené od lidské protilátky pozměněním sekvence protilátky mající non-lidské regiony určující komplementaritu (CDR). Nejjednodušší alterace může spočívat v substituci konstantního regionu lidské protilátky za myší konstantní region, za vzniku lidské/myší chiméry, která může mít dostatečně nízkou imunogenicitu pro to, aby byla přijatelná pro farmaceutické použití. Výhodně jsou variabilní region protilátky a i CDR také humanizované za použití technik, které jsou dobře známé v oboru. Pracovní regiony variabilních regionů jsou substituované příslušnými lidskými pracovními regiony za ponechání non-lidských CDR v podstatě beze změn, nebo nahrazením CDR sekvencí odvozenou z lidského genomu. Plně lidské protilátky jsou produkované geneticky modifikovanými myšmi, jejichž imunitní systémy byly pozměněny tak, aby odpovídaly lidským imunitním systémům. Jak bylo uvedené výše, je ve způsobech podle předkládaného vynálezu dostačující použití imunologicky specifického fragmentu protilátky, včetně fragmentů reprezentujících jednořetězcové formy.

Humanizované protilátka opět označuje protilátku obsahující lidský pracovní region, alespoň jeden CDR z non-lidské protilátky, a ve které jakýkoliv přítomný konstantní region je v podstatě identický s lidským imunoglobulinovým konstantním regionem, tj., alespoň přibližně z 85 až 90 %, výhodně alespoň z 95 % identický. Proto jsou všechny části humanizované protilátky, s výjimkou CDR, v podstatě identické s příslušnými částmi jedné nebo více přirozených lidských imunoglobulinových sekvencí. Například, humanizovaný imunoglobulin obvykle neoznačuje protilátku tvořenou chimérickým myším variabilním regionem/lidským konstantním regionem.

Humanizované protilátky mají alespoň tři potenciální výhody před non-lidskými a chimérickými protilátkami pro použití v lidské terapii:

1) vzhledem k tomu, že efektorová část je lidská, mohou lépe interagovat s lidským imunitním systémem (například účinněji likvidovat cílové buňky pomocí cytotoxicity závislé na komplementu (CDC) nebo buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC)).

2) Lidský imunitní systém by neměl rozpoznávat pracovní region nebo C region humanizované protilátky jako cizí a proto by protilátková reakce proti takové injikované protilátce měla být menší než proti totálně cizorodé non-lidské protilátce nebo a částečně cizorodé chimérické protilátce.

3) Bylo popsáno, že injikované non-lidské protilátky mají poločas v lidské cirkulaci mnohem kratší než je poločas lidských protilátek. Injikované humanizované protilátky budou mít poločas v podstatě identický jako přirozené lidské protilátky, což umožní podání nižších dávek a méně často.

Návrh humanizovaných imunoglobulinů může být proveden následujícím způsobem. Když spadá aminokyselina do následující kategorie, tak může být aminokyselina pracovního rámce lidského imunoglobulinů (akceptorového imunoglobulinů) nahrazena aminokyselinou pracovního regionu z non-lidského imunoglobulinů poskytujícího CDR (donorového imunoglobulinů):

(a) aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinů je neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, zatímco odpovídající aminokyselina v donorovém imunoglobulinů je typická pro lidský imunoglobulin v této pozici;

(b) pozice aminokyseliny je bezprostředně sousedící s jedním z CDR; nebo (c) jakýkoliv atom vedlejšího řetězce pracovní aminokyseliny je ve vzdálenosti přibližně 5 až 6 angstromů (centrum-centrum) od jakéhokoliv atomu CDR aminokyseliny ve třírozměrném modelu imunoglobulinů (Queen, et al., op. cit., a Co, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Když je každá aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinů a příslušná aminokyselina v donorovém imunoglobulinů neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, tak je aminokyselina nahrazena aminokyselinou typickou pro lidský imunoglobulin v této pozici.

Výhodná humanizovaná protilátka je humanizovaná forma myší protilátky 266. CDR humanizované 266 mají následující aminokyselinové sekvence:

lehký řetězec CDR1:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) lehký řetězec CDR2:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:2) lehký řetězec CDR3:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) těžký řetězec CDR1:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4) těžký řetězec CDR2:

1015

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5) a těžký řetězec CDR3:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6).

Výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1 Asp Xaa Val Met	5 Thr	10	15 Xaa
Gin	Xaa	Pro	Leu Ser	Leu Pro Val	Xaa
Gly Gin Pro Ala	20 Ser	Ile	Ser	Cys	25 Arg Ser	Ser Gin Ser	Leu	30 Xaa
Tyr Ser Asp Gly	35 Asn	Ala	Tyr	Leu	40 His Trp	Phe Leu Gin	Lys	45 Pro

	Gly Gin Ser	50 Pro Xaa Leu	55	60 Arg Phe
Leu	Ile Tyr Lys	Val Ser Asn
	Ser Gly Val	65 Pro Asp Arg	Phe	70 Ser Gly Ser	Gly Ser Gly	75 Thr Asp
	Phe Thr Leu	80 Lys Ile Ser	Arg	85 Val Glu Ala	Glu Asp Xaa	90 Gly Val
	Tyr Tyr Cys	95 Ser Gin Ser	Thr	100 His Val Pro Trp Thr Phe	105 Gly Xaa
kde:	Gly Thr Xaa	110 Xaa Glu Ile	Lys Arg	(SEQ ID NO;7)

kde:

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ile;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

• 10 Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

Výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1 Xaa

Val

Gin

Leu

5 Val

Glu

Xaa

10 Gly Gly Gly

Leu Val

Gin

Pro

15 Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

20 Leu

Ser

Cys

Ala

25 Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

30 Ser

Arg

Tyr

Ser

Met

35 Ser

Trp

Val

Arg

Gin

40 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

45 Leu

Xaa

Leu

Val

Ala

50 Gin

Ile

Asn

Ser

Val

55 Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

60 Tyr

Pro Asp

Xaa

Val

65 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

70 Ile

Ser

Arg

Asp

Asii

75 Xaa

Xaa

Asn

Thr

Leu

80

Leu

Gin

Met

Asn

85 Ser

Leu

Arg

Ala

Xaa

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

100 Gly Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO:8) kde:

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr;

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Mg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Zejména výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK.18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1 Asp	Val Val Met	5 Thr	10	15 Leu
Gin Ser Pro Leu Ser	Leu Pro	Val Thr
Gly	Gin Pro Ala	20 Ser	25 lie Ser Cys Arg Ser	Ser Gin	Ser Leu	30 lie
Tyr	Ser Asp Gly	35 Asn	40 Ala Tyr Leu His Trp	Phe Leu	Gin Lys	45 Pro
Gly	Gin Ser Pro	50 Arg	55 Leu Leu lie Tyr Lys	Val Ser	Asn Arg	60 Phe
Ser	Gly Val Pro	65 Asp	70 Arg Phe Ser Gly Ser	Gly Ser	Gly Thr	75 Asp
Phe	Thr Leu Lys	80 lie	85 Ser Arg Val Glu Ala	Glu Asp	Val Gly	90 Val
Tyr	Tyr Cys Ser	95 Gin	100 Ser Thr His Val Pro Trp Thr	Phe Gly	105 Gin

110

Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO:9) .

Zejména výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4.

1015

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

2530

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

4045

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

5560

Glu Leu Val Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

7075

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala

8590

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Tip Gly Gin Gly 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 10) ·

Výhodný lehký řetězec pro humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má aminokyselinovou sekvenci:

1 Asp Val	Val	5 Met Thr	Gin	10	15 Thr Leu
Ser Pro Leu Ser	Leu	Pro Val
Gly Gin	Pro	20 Ala Ser	lie	25 Ser Cys Arg Ser	Ser	Gin Ser	30 Leu .lie
Tyr Ser	Asp	35 Gly Asn	Ala	40 Tyr Leu His Trp	Phe	Leu Gin	45 Lys Pro
Gly Gin	Ser	50 Pro Arg	Leu	55 Leu lie Tyr Lys	Val	Ser Asn	60 Arg Phe
Ser Gly	Val	65 Pro Asp	Arg	70 Phe Ser Gly Ser	Gly	Ser Gly	75 Thr Asp
Phe Thr	Leu	80 Lys lie	Ser	85 Arg Val Glu Ala	Glu	Asp Val	90 Gly Val
Tyr Tyr	Cys	95 Ser Gin	Ser	100 Thr His Val Pro Trp	Thr Phe	105 Gly Gin

110 115120

Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Píro Ser Val

125 130135

Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala

140 145ISO

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

155 160165

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin

170 175180

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

185 ISO195

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

200 205210

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val

215

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 11}.

Výhodný těžký řetězec pro humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má aminokyselinovou sekvenci:

1 Glu Val Gin	Leu	5 Val Glu Ser	10 Gly Gly Gly Leu Val Gin	15 Pro Gly
Gly Ser Leu	Arg	20 Leu Ser Cys	25 Ala Ala Ser Gly Phe Thr	30 Phe Ser
Arg Tyr Ser	Met	35 Ser Trp Val	40 Arg Gin Ala Pro Gly Lys	45 Gly Leu
Glu Leu Val	Ala	50 Gin lie Asn	55 Ser Val Gly Asn Ser Thr	60 Tyr Tyr
Pro Asp Thr	Val	65 Lys Gly Arg	70 Phe Thr lie Ser Arg Asp	75 Asn Ala
Lys Asn Thr	Leu	80 Tyr Leu Gin	85 Met Asn Ser Leu Arg Ala	90 Glu Asp
Thr Ala Val	Tyr	95 Tyr Cys Ala	100 Ser Gly Asp Tyr Trp Gly	105 Gin Gly
Thr Leu Val	Thr	110 Val Ser Ser	115 Ala Ser Thr Lys Gly Pro	120 Ser Val

140 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys	145	150 Vai Thr
Asp Tyr Phe Pro	Glu Pro
155 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala	160 Leu Thr Ser Gly	Vai His	165 Thr Phe
170 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser	175 Gly Leu Tyr Ser	Leu Ser	180 Ser Vai
185 Val Thr Vai Pro Ser Ser Ser	190 Leu Gly Thr Gin	Thr Tyr	195 lie Cys
200 Asn Vai Asn His Lys Pro Ser	205 Asn Thr Lys Vai	Asp Lys	210 Lys Vai
215 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys	220 Thr His Thr Cys	Pro Pro	225 Cys Pro
230 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly	235 Pro Ser Vai Phe	Leu Phe	240 Pro Pro
245 Lys Pro Lys Asp. Thr Leu Met	250 lie Ser Arg Thr	Pro Glu	255 Vai Thr
260 Cys Val Val Val Asp Vai Ser	265 His Glu Asp Pro	Glu Vai	270 Lys Phe
275 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Vai	280 Glu Vai His Asn	Ala Lys	285 Thr Lys
290 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn	295 Ser Thr Tyr Arg	Val Vai	300 Ser Vai
305 Leu Thr Vai Leu His Gin Asp	310 Trp Leu Asn Gly	Lys Glu	315 Tyr Lys
320 Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala	325 Leu Pro Ala Pro	He Glu	330 Lys Thr
335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin	340 Pro Arg Glu Pro	Gin Vai	345 Tyr Thr
350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu	355 Leu Thr Lys Asn	Gin Vai	360 Ser Leu
365 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe	370 Tyr Pro Ser Asp	He Ala	375 Vai Glu
380 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro	385 Glu Asn Asn Tyr	Lys Thr	390 Thr Pro

Pro

Val

Leu

Asp

395 Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

400 Phe Leu

Tyr

Ser

Lys

405 Leu

Thr

Val

Asp

Lys

410 Ser

Arg

Trp

Gin

415 Gly Asm

Val

Phe

Ser

420 Cys

Ser

Val

Met

His

425 Glu

Ala

Leu

His

Asn

430 His Tyr

Thr

Gin

Lys

435 Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

440 Pro

Gly

Lys

(SEQ ID

NO:12).

Pro lehké a těžké řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu a pro humanizovanou 266 jsou možné i jiné sekvence. Imunoglobuliny mohou obsahovat dva páry komplexů lehký řetězec/těžký řetězec, kde alespoň řetězec obsahuje jeden nebo více myších regionů určujících komplementaritu funkčně navázaných na segmenty lidského pracovního regionu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká rekombinantních polynukleotidů kódujících protilátky, které - po expresi - obsahují CDR těžkého a lehkého řetězce z protilátky podle předkládaného vynálezu. Stejně jako pro lidský pracovní region je aminokyselinová sekvence pracovního nebo variabilního non-lídského ímunoglobulinů poskytujícího CDR srovnávána s odpovídajícími sekvencemi v knihovně variabilních regionů lidského ímunoglobulinů a je vybrána sekvence mající nejvyšší procento identických aminokyselinami. Příkladem polynukleotidů, které kódují polypeptidové řetězce obsahující CDR pro těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky 266, jsou uvedeny na obr. 4 a 5. V důsledku degenerace kodonů a nekritických aminokyselinových substitucí mohou být za tyto polynukleotidové sekvence zaměněny jiné sekvence. Zejména výhodné polynukleotidy podle předkládaného vynálezu kódují protilátky, které, po expresi, obsahují CDR SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:6, nebo jakékoliv variabilní regiony SEQ ID NO:7 - SEQ ID NO: 10, nebo lehký a těžký řetězec SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12.

Polynukleotidy budou obvykle dále obsahovat polynukleotidové sekvence řídící expresí operativně navázané na sekvence kódující humanizovaný imunoglobulin, včetně přirozeně asociovaných či heterologních promotorových regionů. Výhodně, jsou sekvence řídící expresi eukaryotické promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfektovat eukaryotické hostitelské buňky, ale mohou být použity také řídicí sekvence pro prokaryotické hostitelské buňky. Po inkorporaci vektoru do vhodné hostitelské buněčné linie se hostitelské buňky propagují za podmínek vhodných pro vysokou expresi nukleotidové sekvence, a, pokud je to žádoucí, může být potom proveden odběr a přečištění lehkých řetězců, těžkých řetězců, dimerů lehký/těžký řetězec nebo intaktní protilátky, jejich vazebných fragmentů nebo jiných forem ímunoglobulinů.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu schopné exprimovat požadované humanizované protilátky mohou být připraveny z mnoha různých polynukleotidů (genomové nebo cDNA, RNA, syntetických oligonukleotidů, atd.) a složek (např., V, J, D a C regionů), stejně jako za použití různých technik. Spojení vhodné genomové a syntetické sekvence je běžným způsobem produkce, ale mohou být také použity cDNA sekvence.

DNA sekvence lidského konstantního regionu mohou být isolovány za použití dobře známých technik z různých lidských buněk, ale výhodně z imortalizovaných B-lymfocytů. CDR pro produkci ímunoglobulinů podle předkládaného vynálezu budou obdobně odvozeny z non-lidské monoklonální protilátky vážící se na epitop mezi aminokyselinami 13 a 28 AS peptidu, kde tyto monoklonální protilátky jsou produkovány v jakémkoliv vhodném savčím zdroji, včetně myší, králíků nebo jiných obratlovců schopných produkovat protilátky dobře známými způsoby, jak je popsáno výše. Vhodnými zdrojovými buňkami pro polynukleotidové sekvence a hostitelskými buňkami pro expresi a sekreci ímunoglobulinů jsou buňky známé v oboru.

Kromě humanizovaných imunoglobulinů, které byly popsány, mohou být snadno připraveny a vyrobeny „v podstatě homologní“ modifikované imunoglobuliny, za použití různých rekombinantních DNA technik dobře známých odborníkům v oboru. Například, pracovní regiony se mohou lišit od přirozené sekvence ve struktuře primární sekvence několika aminokyselinovými substitucemi, terminálními a intermediárními adicemi a delecemi, a podobně. Dále, různé lidské pracovní regiony mohou být použity samostatně nebo v kombinaci podle jako základ pro humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu. Obecně, modifikace genů může být snadno provedena za použití různých dobře známých technik, jako je místně cílená mutagenese.

Alternativně mohou být připraveny polypeptidové fragmenty obsahující pouze část primární protilátky, kde tyto fragmenty mají jednu nebo více aktivit imunoglobulinů (např., fixaci komplementu). Tyto polypeptidové fragmenty mohou být produkovány proteolytickým štěpením intaktní protilátky za použití způsobů dobře známých v oboru, nebo insercí stop kodonů v požadovaných pozicích do vektorů za použití místně cílené mutagenese, například za CH1, což vede k produkci ΡΑβ fragmentů nebo za pantový region, což vede k produkci Ρ(Αβ')2 fragmentů. Jednořetězcové protilátky mohou být produkovány spojením VL a VH za použití DNA linkeru. · ’

Jak bylo uvedeno výše, kódující nukleotidová sekvence bude exprimována v hostitelích po operativním navázání sekvence na (tj., umístění zajištujícím její funkci) sekvenci řídící expresi. Tyto expresní vektory jsou obvykle replikovatelné v hostitelských organismech buď jako episomy, nebo jako integrální součást chromosomální DNA hostitele. Obecně expresní vektory obsahují selekční markéry, např., tetracyklinový nebo neomycinový, umožňující detekci buněk transformovaných požadovanou DNA sekvencí.

E. coli je prokaryotický hostitel použitelný pro klonování polynukleotidů podle předkládaného vynálezu. Mezi další použitelné mikroorganismy patří bacily, jako je Bacillus subtilus, a další enterobacteriacea; jako je Salmonella, Serratia a různé Pseudomonas species. V těchto prokaryotických hostitelích je možno také připravit expresní vektory, které budou obsahovat sekvence řídící expresi kompatibilní s hostitelskou buňkou (např., sekvenci rozpoznávající počátek replikace). Dále, může být použit jakýkoliv počet dobře známých promotorů, jako je laktosový promotorovy systém, tryptofanový (tip) promotorovy systém, beta-laktamasový promotorovy systém nebo a promotorovy systém z fágu lambda. Promotoiy obvykle obsahují sekvencí řídící expresi, volitelně s operátorovou sekvencí, a obsahují sekvenci vazebného místa pro ribosom a podobně, pro iniciaci a dokončení transkripce a translace.

Další mikroby, jako jsou kvasinky, mohou být také použity pro expresi. Saccharomyces jsou výhodným hostitelem, a mohou být použity s vhodnými vektory obsahujícími sekvence řídící expresi, jako jsou promotory, včetně 3-fosfoglycerát-kinasového nebo z jiných glykolytických enzymů, sekvenci rozpoznávající počátek replikace, terminační sekvence a podobně.

Kromě mikroorganismů mohou být savčí tkáňové kultury také použity pro expresi a produkci polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Eukaiyotické buňky jsou opravdu výhodné, protože v oboru existuje mnoho vhodných hostitelských buněčných linií schopných secemovat intaktní imunoglobuliny a mezi tyto linie patří CHO buněčné linie, různé COS buněčné linie, buněčné linie ovariálních buněk, HeLa buňky, výhodně myelomové buněčné linie, transformované Blymfocyty, lidské buněčné linie z embryonálních ledvin nebo hybridomy. Expresní vektory pro tyto buňky mohou obsahovat sekvence pro řízení exprese, jako je sekvence rozpoznávající počátek replikace, promotor, zesilovač transkripce, a nutné místa pro zpracování, jako jsou vazebná místa pro ribozomy, místa pro sestřih RNA, polyadenylační místa, sekvence pro ukončení transkripce. Výhodnými sekvencemi pro řízení transkripce jsou promotory získané z imunoglobulinových genů, SV40, Adenoviru, hovězího papilloma viru, cytomegaloviru a podobně.

Vektory obsahující požadovanou nukleotidovou sekvenci (např. sekvence kódující těžký a lehký řetězec a sekvence řídící expresi) mohou být přeneseny do hostitelské buňky dobře známými způsoby, které jsou vybrány podle typu hostitele. Například, pro prokaryotické buňky se běžně používá transfekce chloridem vápenatým, zatímco pro ostatní hostitelské buňky se běžně používá transfekce s fosforečnanem vápenatým nebo elektroporace.

Po expresi mohou být celé protilátky, jejich dimery, jednotlivé lehké a těžké řetězce, nebo jiné formy imunoglobulinů podle předkládaného vynálezu, přečištěny za použití standardních postupů, včetně srážení síranem amonným, iontové výměny, afmitní, reversní, hydrofobní chromatografíe, gelové elektroforézy a podobně. Výhodné jsou významně přečištěné imunoglobuliny mající alespoň přibližně 90 až 95% homogenitu, nejvýhodnější jsou pro farmaceutické použití imunoglobuliny mající 98 až 99% nebo vyšší homogenitu. Po přečištění - částečném nebo do požadované homogenity, mohou být polypeptidy použity terapeuticky nebo proíýlakticky, jak je zde popsáno.

Protilátky (včetně imunologicky reaktivních fragmentů) jsou podávány jedincům s rizikem nebo existencí příznaků souvisejících s AS-peptidem, nebo s patologií související s AS peptidem, jako je klinická nebo prekiinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom nebo klinická nebo preklinická amyloidová angiopatie, za použití standardních technik podání, výhodně za použití periferního (tj. ne podání do centrálního nervového systému) pomocí intravenosní, intraperitoneální, subkutánní, pulmonální, transdermální, intramuskulámí, intranasální, bukální, sublinguální aplikace nebo aplikace v čípku. Protilátky mohou být také podány přímo do komorového systému, mozkomíšního moku nebo mozkového parenchymu, a techniky pro taková podání jsou dobře známé v oboru, takže není nutné používat obtížnějších postupů. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou účinné tehdy, když jsou podány za použití jednodušších technik, jako je podání do periferní cirkulace. Mezi výhody předkládaného vynálezu patří schopnost protilátky vykazovat příznivé účinky i tehdy, když není podána přímo do centrálního nervového systému. Kromě toho bylo zjištěno, že množství protilátky, které překonává hematoencefalickou bariéru, je <0,1% plazmatické koncentrace a že protilátky podle předkládaného vynálezu mají schopnost sekvestrovat Αβ v periferní cirkulaci, stejně jako měnit klírens CNS a plazmatického solubilního Αβ.

Farmaceutické prostředky jsou navrženy tak, aby byly vhodné pro vybraný způsob podání, a farmaceuticky přijatelné přísady, jako jsou disperzní činidla, pufry, surfaktanty, konzervační činidla, solubilizační činidla, činidla upravující izotonicitu, stabilizační činidla a podobně jsou použita podle potřeby. Remington's Farmaceutické Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, poslední vydání, zde uvedené jako odkaz, poskytuje techniky pro přípravu farmaceutických prostředků. Zejména výhodné může být změnění rozpustnosti protilátky podle předkládaného vynálezu tak, aby byla více lipofilní, například za použití enkapsulace v liposomech nebo blokování polárních skupin.

Výhodné je periferní systémové podání intravenosní nebo intraperitoneální nebo podkožní injekcí. Vhodná vehikula pro takové injekce jsou známá. Dále může být podání provedeno přes sliznice za použití nasálního aerosolu nebo čípků. Vhodné přípravky pro taková podání jsou dobře známé a obvykle obsahují surfaktanty, které usnadňují průnik membránou. Takové surfaktanty jsou často odvozeny od steroidů nebo kationtových lipidů, jako je N-[l-(2,3-dioleoyl)propylΝ,Ν,Ν-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) nebo různé sloučeniny jako je cholesterol hemisukcinát, fosfatidylglyceroly a podobně.

Koncentrace lidské izolované protilátky v prostředcích je od přibližně 0,1 % do 15 nebo 20 % hmotnostních aje určena podle objemu kapalin, viskozity a podobně, v souladu s vybraným způsobem podání. Tak mohou být typické farmaceutické prostředky pro injekce připraveny tak, aby obsahovaly 1 ml sterilní pufrované vody a 1 až 100 mg humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu. Přípravek by měl být sterilně přefiltrován po výrobě, nebo by měl být jiným způsobem upraven tak, aby byl mikrobiologicky přijatelný. Typický prostředek pro intravenosní infusi by měl mít objem asi 250 ml, například za použití sterilního Ringerova roztoku, a koncentrace protilátky by měla být 1 až 100 mg na ml.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být zmrazená nebo lyofilizována pro uskladnění a rekonstituci ve vhodném sterilním nosiči před použitím. Lyofilizace a rekonstituce mohou vést k různému stupni ztráty aktivity protilátky (např. u běžných imunoglobulinů mají IgM protilátky tendenci k větší ztrátě aktivity než IgG protilátky). Dávky by měly být upraveny za účelem kompenzace této ztráty. pH prostředku by mělo být takové, aby bylo dosaženo rovnováhy mezi stabilitou protilátky (chemickou a fyzikální) a komfortem pacienta při aplikaci. Obecně je tolerováno pH mezi 4 a 8.

Ačkoliv se uvedené způsoby zdají být nejvhodnější a nejvýhodnější pro podání proteinů, jako jsou humanizované protilátky, mohou být použity i jiné způsoby podání, jako je transdermáíní podání a orální podání, pokud je připraven vhodný prostředek.

Dále, může být výhodné použít prostředky s řízeným uvolňováním za použití biodegradovatelných potahů a matric, nebo osmotických mini-pump, nebo systémů na bázi dextranových korálků, alginátu nebo kolagenu.

Závěrem, prostředky pro podání protilátek podle předkládaného vynálezu jsou dobře známé v oboru a mohou být vybrány z různých možností.

Typické dávky mohou být optimalizovány za použití standardních klinických technik a dávky závisí na způsobu podání a stavu pacienta.

Následující příklady ilustrují, ale nijak neomezují, předkládaný vynález.

Příklady uvedené dále využívají, mimo jiné, myší monoklonální protilátku označenou 266, která byla původně připravena imunizaci peptidem složeným ze zbytků 13-28 lidského Αβ peptidu. Bylo potvrzeno, že tato protilátka je imunoreaktivní s tímto peptidem, ale dříve bylo uvedeno, že nereaguje s peptidem obsahujícím pouze zbytky 17-28 lidského Αβ peptidu, nebo jakýkoliv jiný epitop v Αβ peptidu. Prostředek obsahující tuto protilátku je popsán v U.S. patentu 5,766,846, který je zde uveden jako odkaz. Protože příklady popisují pokusy provedené na myších, je použití myší monoklonální protilátky uspokojivé. Nicméně, v léčbě lidí za použití způsobů podle předkládaného vynálezu jsou výhodné humanizované formy protilátky s imunospecificitou odpovídající protilátce 266.

Příklad 1

Sekvestrace přidaného Αβ peptidu v lidských tekutinách

Vzorky lidského mozkomíšního moku (CSF) (50 μΐ) a lidské plazmy (50 μΐ) se inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti následujícím způsobem:

1. samostatně;

2. spolu s 5 ng AS 40 peptidu; nebo

3. 5 ng Αβ 40 peptidu plus 1 mg monoklonální protilátky 266 (popsané, například, v U.S. patentu 5,766,846 který je zde uveden jako odkaz).

Vzorky se potom zpracovaly elektroforézou na 4-25% nedenaturujícím gradientovém gelu, tj. nedenaturující gradientovou elektroforézou (NDGGE) a přenesly se do nitrocelulózy. Skvrny se potom barvily Ponceau S nebo, pro Westernovou hybridizaci, sondovaly biotinem-značenou monoklonální protilátkou (3D6), která je namířena proti prvním pěti aminokyselinám Αβ peptidu, vyvíjely se za použití streptavidinu-křenové peroxidázy a detekovaly se pomocí zesílené chemuluminiscence (ECL). Hydratované průměry materiálů obsažených v proužcích na biotech se vyhodnocovaly za použití Pharmacia markérů molekulové hmotnosti. Pokud se Αβ peptid vázal na jiné molekuly, procházel gelem podle velikosti vzniklého komplexu.

Westernová hybridizace CSF s nebo bez 5 ng Αβ peptidu neukazovala žádný důkaz Αβ peptidu při detekci pomocí protilátky 3D6. Podobné výsledky byly získány pro lidskou plazmu. Toto platilo i přes skutečnost, že Αβ peptid mohl být detekován SDS-PAGE po Westernové hybridizaci za použití stejné techniky a na stejných vzorcích CSF. Pravděpodobně bránila detekci Αβ peptidu interakce mezi tímto peptidem a jinými faktory v testovaných kapalinách. Nicméně když byla MAb 266 přidána k inkubaci, tak byly proužky charakteristické pro sekvestrující Αβ peptid v komplexu s protilátkou přítomné, jak v plazmě, tak v CSF. Hlavní proužek má hydratovaný průměr přibližně 11 nm, což odpovídá monomeru protilátky, menší proužek měl 13 nm, což odpovídá dimeru protilátky

Příklad 2

Specificita sekvestrující protilátky

Použily se vzorky obsahující 50 μΐ lidského CSF nebo 10 μΐ of APP^V717F CSF. APP^V717F jsou transgenní myší reprezentující myší model Alzheimerovi nemoci, ve kterých je exprimován transgen pro lidský amyloidový prekurzorový protein s familiární mutací pro Alzheimerovu nemoc, což vede k produkci lidského AS peptidu v centrálním nervovém systému.

Vzorky se inkubovaly s nebo bez různých MAb (1 μg) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a potom se zpracovaly elektroforézou na 4 až 25% NDGGE a přenesly se na nitrocelulózu způsobem popsaným v příkladu 1. Protilátky byly následující:

MAb 266 (váže se na pozice 13 až 28);

MAb 4G 8 (váže se na pozice 17 až 24);

QCBpan (králičí polyklonální protilátka pro pozice 1 až 40);

myší IgG (nespecifický);

MAb 3D6 (váže se na pozice 1 až 5);

MAb 21F12 (váže se na pozice 33 až 42):

MAb 6E10 (váže se na pozice 1 až 17); a

QCB40,42 (králičí polyklonální protilátka pro Αβ40 a Αβ42).

Detekce komplexu Αβ peptid-protilátka se provedla způsobem popsaným v příkladu 1 za použití biotinem značené 3D6 (k N-konci Αβ peptidu) a potom streptavidinu-HRP a ECL. Podobná detekce byly provedena v lidském CSF inkubovaném s MAb 266, v některých případech zaměněnou za QCB40,42, která se váže na karboxylový konec Αβ peptidu, pro 3D6.

Výsledky ukazují, že z testovaných protilátek pouze MAb 4G8 a MAb 266 umožňují detekci Αβ peptidu.

Výsledky ukazují, že pro lidský CSF pouze MAb 266 a MAb 4G8 mohou sekvestrovat v detekovateiných množstvích komplex protilátka-Αβ (opět, bez protilátky nebyl Αβ detekován). MAb 266 byla také schopna produkovat podobné výsledky jako výsledky získané s lidským CSF s CSF z APP^V717F transgenních myší. Αβ peptid mohl být sekvestrován v lidském CSF za použití MAb 266 bez ohledu na to, zda byla pro vyvíjení ve westernovém přenosu použita 3D6 nebo QCB40,42 protilátka.

Příklad 3

Demonstrace komplexu Αβ peptid—266 dvourozměrnou elektroforézou

Vzorek obsahující 50 ng Αβ peptidu se inkubuje s 2 pg MAb 266 a při 37 °C po dobu 3 hodin. Stejná inkubace MAb 266 samotné se použije jako kontrola.

Vzorky se potom zpracují 2-dimenzionální elektroforézou.

V prvním rozměru se inkubované vzorky zpracují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1. Polyakrylamidové gely se potom nastříhají na jednotlivé dráhy kolmé ke směru toku v prvním rozměru a ve druhém rozměru se provede gelová separace za denaturačních/ redukčních podmínek pomocí SDS-PAGE (Tricin-ureové gely). Přítomnost proužků se detekuje buď Ponceau-S barvením (jakýkoliv protein) nebo specifickým barvením za použití 6E10 MAb (Senetek, Inc.) a biotinylované anti-myší A13 v detekčním systému na bázi HRP.

Ponceau-S barvení nitrocelulózových membrán po přenosu umožňuje vizualizaci těžkého a lehkého řetězce MAb 266 samostatně. Pomocí tohoto barvení bylo potvrzeno, že Αβ peptid byl v komplexu s MAb 266 jako proužek velikosti 4 kD, což odpovídá velikosti kompletní MAb 266 v prvním rozměru NDGGE.

Příklad 4

Demonstrace non-ekvivalence vazby a sekvestrace

Předpokládá se, že Αβ peptid cirkulující v plazmě a CSF je obsažen v komplexu s proteiny, včetně apolipoproteinu E. Tento příklad demonstruje to, že protilátky k apoE, ačkoliv se váží na komplex, nesekvestrují apoE od zbytku komplexu.

ApoE komplexy (500 ng) se inkubovaly s MAb nebo polyklonálními protilátkami k apoE (2 pg) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Inkubované vzorky se potom zpracovaly NDGGE za použití technik popsaných v příkladu 1. Po NDGGE se provedl westernový přenos s afinitně přečištěnou kozí anti-apoE protilátkou s detekcí pomocí ECL. Když nebyla přítomna žádná protilátka, tak mohl být apoE detekován při 8 až 13 nm, což je v souladu s přítomností lipoproteinových částic. Přítomnost monoklonální nebo polyklonální protilátky k apoE vedla k posunu apoE k větším molekulám, tzv. „super posunu“. Toto ukazuje, že protilátky k apoE nesekvestrují, tj., neodstraňují apoE z lipoproteinových částic, ale spíše se váží na apoE na lipoproteinech za vzniku větších molekul.

Příklad 5

Sekvestrace AS není narušena anti-apoE protilátkami

Vzorek 100 μΐ lidského CSF se inkubuje buď s MAb 266 samotnou, nebo s polyklonální antiapoE, nebo s oběma protilátkami po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. Vzorky se potom analyzují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1 a detekce proužků se provede, jak je popsáno v příkladu 1.

Výsledky ukazují, že když je MAb 266 přidána ke vzorku, tak je pozorovatelný přibližně 11 nm proužek charakteristický pro sekvestrovaný komplex 266-Αβ peptid. Tak je tomu bez ohledu na to, zda je či není přítomen anti-apoE. Tento proužek, demonstrující sekvestrovaný Αβ, se také objeví tehdy, když se 50 ng Αβ peptidu přidá k inkubační směsi za přítomnosti MAb 266. Tak alterace molekulové hmotnosti apoE přítomností anti-apoE protilátky neinterferuje se sekvestrací Αβ peptidu MAb 266.

Příklad 6

Sekvestrace AS peptidu in vivo

A. Transgenní APP^V7I7F myši, též označované jako PDAPP myši, nadměrně exprimují mutantní formu lidského APP proteinu. Tyto myš produkují lidský Αβ v CNS a mají zvýšené koncentrace lidského Αβ peptidu cirkulujícího v CSF a plazmě. 8měsíčním myším bylo intravenosní injekcí podán salinický roztok nebo 100 pg MAb 266. Krev byla těmto myším odebrána 10 minut po injekci a potom znova za 20 hodin po první injekci.

Vzorky obsahující 20 μΐ plazmy od každého zvířete byly analyzovány NDGGE a Westernovou hybridizací s protilátkou 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Zvířata, kterým byl podán salinický roztok, neměla charakteristický 11 nm proužek odpovídající sekvestrovanému Αβ peptidu po 10 minutách ani po 20 hodinách. Nicméně, dvě zvířata, kterým byla injekčně podána MAb 266, měla tento proužek po 20 hodinách.

Β. V tomto pokusu se použily 2-měsíce staré APP^V717F myši. V den 0 se myším podala buď žádná MAb 266, nebo 1 mg MAb 266, nebo 100 pg této protilátky. Vzorky plazmy se odebraly dva dny před podáním protilátky a v dny 1, 3, 5 a 7. Vzorky plazmy se zpracovaly NDGGE a potom Westernovou hybridizací a detekcí s 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Ve všech dobách po podání MAb 266 byl komplex 266/A13 detekován bez ohledu na to, že vzorek plazmy byl zpracován proteinem G, který se váže na imunoglobulin, čímž účinně odstraňuje MAb 266. V testovaném období byly detekovány stabilní koncentrace komplexu s výjimkou lehkého poklesu v den 7 u zvířat, kterým bylo aplikováno 100 pg MAb 266; obecný byly koncentrace u zvířat, kterým bylo podáno 100 pg, nižší než u zvířat, kterým byl podán 1 mg této protilátky.

C. Dvěma 2-měsíčním APP^V7I7F myším se intravenosně podal 1 mg MAb 266 a od každé myši se odebral 25 pg vzorek plazmy. Vzorek plazmy se zpracoval NDGGE a potom Westernovým přenosem, jak je popsáno výše, s tou výjimkou, po vazbě biotinylované 3D6 se provedla detekce streptavidinem ²⁵I (Amersham) a expozice na fosfodetekčním zařízení. Koncentrace komplexu se hodnotila ve srovnání se standardní křivkou získanou za použití známých množství Αβ40 v komplexu se saturační koncentrací MAb 266 a podobné detekce. Množství Αβ peptidu navázaného na MAb 266 bylo přibližně 100 ng/ml, což představuje přibližně l,000násobné zvýšení vzhledem k endogennímu Αβ peptidu u těchto myší, které je přibližně 100 pl/ml. Toto je také podobné koncentraci Αβ peptidu v mozku APP^V717F myší před depozicí Αβ (50 až 100 ng/g); lidský APP a lidský Αβ v APP^V717F myších jsou produkovány téměř výlučně v mozku. Tak se zdá, že přítomnost MAb 266 v plazmě způsobí vychytání Αβ peptidu usnadňující vylučování Αβ peptidu z CNS do plazmy. Toto zvyšuje vylučování v důsledku zvýšeného přesunu Αβ z CNS do plazmy a také prevencí pronikání Αβ z plazmy do mozku.

Správná velikost sekvestrovaného Αβ peptidu se potvrdí zpracováním 20 μΐ vzorků plazmy získaných od APPV717F myší za 24 hodin pro injekci 1 mg MAb 266 na TRIS-tricinových SDSPAGE gelech a potom Westernovou hybridizací za použití anti-Αβ protilátky 6E10 před nebo po zpracování proteinem G za použití korálků s navázaným proteinem G. Proužek, který byl depletován proteinem G, byl detekován při 4 až 8 kD, což odpovídá přítomností monomerů a snad i dimerů Αβ peptidu.

D. 2-měsíčním APP^V717F myším se aplikoval intraperitoneálně buď PBS (n=7), nebo 500 mg biotinylované MAb 266 - tj., m266B (n=9). Před injekcí a za 24 hodin po injekci se plazma analyzovala na celkový Αβ peptid za použití modifikace ELISA metody dle Johnson-Wood, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555; a Bales, K.R., et al., Nature Genet (1997) 17:263-264. Celkový Αβ navázaný na m266B se stanovil za použití 96-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potažených m3D6. Naředěné vzorky plazmy a standardy (různé koncentrace Αβ40 a m266B) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství Afi/m266B komplexu se určilo za použití ^l25l-streptavidinu. Dále, po 24-hodinách se vzorky plazmy nejprve zpracovaly proteinem G pro kvantifikaci Αβ peptidu nenavázaného na MAb 266, a celkový Αβ a Αβ₄₂ se určil ELISA v CSF. U myší s aplikovaným PBS byly plazmatické koncentrace Αβ peptidu 140 μΙ/ml před i po injekci. Plazmatické koncentrace byly podobné u myší s aplikovanou MAb 266 před injekcí, ale koncentrace Αβ peptidu nenavázaného na MAb 266 byly nedetekovatelné za 24 hodin po injekci.

Také se měřily koncentrace v CSF. CSF reprezentuje extracelulámí kompartment v CNS a koncentrace molekul v CSF v určitém rozsahu odráží koncentrace substancí v extracelulámím prostoru mozku. CSF se izoloval z kompartmentu cisterna magna. Myši se anestezovaly pentobarbitalem a potom se odstranila svalovina na bázi lební až prvním obratlů. CSF se získal opatrnou punkturou arachnoidní membrány překrývající cisternu za použití mikrojehly a disekčního mikroskopu a CSF se odebral do polypropylenové mikropipety. Po 24 hodinách po injekci se detekovalo zvýšení celkového Αβ peptidu v CSF myší s injekcí MAb 266, které bylo přibližně 2násobné v Αβ₄₂ ve srovnání s myšima, kterým byl aplikován PBS. Toto bylo potvrzeno za použití denaturační gelové elektroforézy a potom westernovou hybridizací s Αβ^-specifickou protilátkou 21F12.

V dalším pokusu se 3měsíčním APP^V7I7F injikoval intravenosně buď PBS, nebo MAb 266, a následujícím způsobem se hodnotily koncentrace Αβ^ a Αβ₄₂ v CSF:

Pro měření Αβ₄₀ se použila monoklonální protilátka m2G3 specifická pro Αβ40. Popsaný ELISA test (Johnson-Wood, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) se modifikoval na RIA nahrazením Streptavidin-HRP činidla 1251-Streptavidinem. Fpro vzorky plazmy a CSF se test provedl za nedenaturačních podmínek s chyběním guanidinu v pufrech. Pro hodnocení Αβ peptidu rozpustného a nerozpustného v karbonátu v mozkovém homogenátu se vzorky homogenizovaly s 100 mM karbonátem, 40 mM NaCl, pH 11,5 (40C), odstředily se při 10,000 x g během 15 mm a Αβ se hodnotil v supematantové (solubilní) a peletové (insolubilní) frakci, jak bylo popsáno dříve (Johnson-Wood, K.., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) a jak bylo uvedeno výše. Měření komplexu Αβ/MAb 266 v plazmě se provedlo modifikovanou RIA. Myším se podala biotinylovaná MAb 266 (MAb 26GB) a plazma se izolovala v různých časech. Celkový Αβ navázaný na MAb 266 se měřil za použití 96jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potažených m3D6. Ředěné vzorky plazmy a standardy (různé koncentrace Αβ₄₀ a MAb 26GB) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství komplexu celkový Αβ/MAb 266B se určilo za použití ^l25I-streptavidinu.

hodiny po intravenosní injekci MAb 266 bylo detekováno 2-násobné zvýšení koncentrace Αβ₄ο v CSF a nesignifíkantní zvýšení Αβ₄₂. Nicméně, za 24 a 72 hodin bylo pozorováno 3-násobné zvýšení Αβ₄₀ a Αβ₄₂ v CSF. Podobné výsledky byly získány za použití analýzy na denaturačním gelu následované westernovou hybridizací celkového CSF. Vylučování Αβ prostřednictvím mozkové intersticiální kapaliny, které se odráží v koncentracích CSF, je pravděpodobně odpovědné za pozorované zvýšení Αβ v CSF.

Významné je to, že změna v koncentracích Αβ peptidu v CSF nemůže být způsobena průnikem MAb 266 do CSF, protože koncentrace změřené za 24 hodin po injekci, které jsou nižší než 0,1% plazmatických koncentrací MAb 266, jsou nedostatečné pro to, aby způsobily tyto změny. Tyto výsledky naznačují, že Αβ peptid je přesouván z mozkového parenchymu do CSF přítomností protilátky v krevním řečišti.

Formy Αβ peptidu, které jsou rozpustné v PBS nebo uhličitanovém pufru, byly měřeny v homogenátech mozkového kůry od stejných myší, kterým byla aplikována MAb 266 a u kterých byl CSF analyzován způsobem popsaným výše. Bylo pozorováno podobné zvýšení těchto solubilních forem v homogenátech kůry mozkové.

Příklad 7

M Ab 266 účinkuje in vitro jako vychytávač Αβ peptidu

DialyzaČní komůrka se připravila jako in vitro systém pro testování schopnosti MAb 266 vychytávat Αβ peptid. 1 ml lidské CSF se umístil do horní komůrky polypropylenové zkumavky separované dialyzační membránou s mezí propustnosti 10 až 100 kD od spodní komůrky obsahující 75 pm PBS s nebo bez 1 μΐ MAb 266.

Zdálo se, že rovnováhy bylo dosaženo po 3 hodinách, jak se určilo zpracováním materiálu ze spodní komůrky na kyselých močovinových gelech a potom Westernovým přenosem na přítomnost Αβ peptidu s 6E10 v různých dobách. Vzorky se denaturovaly v kyselině mravenčí na konečnou koncentraci 80% (obj./obj.) a redukovaly se B-merkaptoethanolem (1%). Vzorky se zpracovaly elektroforézou (anoda-katoda) v 0,9 M pracovním pufru s kyselinou octovou na 4% až 35% polyakrylamidovém gradientovém gelu obsahujícím 6 M močoviny, 5% (obj./obj.) ledovou kyselinu octovou a 2,5% TEMED. Kyselé pH gelu se neutralizovalo před přenosem na nitrocelulózu. Potom se standardní techniky westernového přenosu použily pro identifikaci Αβ. Detekované proužky odpovídaly 4 kD.

Množství Αβ odstraněného z horní komůrky se takto určilo ELISA analýzou horní a dolní komůrky (n=4) po 3 hodinách. Výsledky pro různé meze molekulové hmotnosti za přítomnosti a nepřítomnosti MAb266 jsou uvedeny na obr. 1. Jak je uvedeno, zatímco pouze minimální množství Αβ peptidu překonává membránou, když je v dolní komůrce přítomen PBS, 50% Αβ peptidu se sekvestruje v dolní komůrce, když tato komůrka obsahuje MAb 266 a limit molekulové hmotnosti je 25 kDa; větší množství prochází tehdy, když se limit molekulové hmotnosti zvýší na 100 kDa, kdy téměř 100% Αβ peptidu prochází přes membránu.

Také se pozorovalo, že protilátky proti N-konci Αβ 3D6 a 10D5 jsou schopné způsobit v tomto systému přenos Αβ přes membránu, ačkoliv nebyly schopné sekvestrovat Αβ peptid v testech popsaných v příkladu 1. Tyto výsledky ukazují, že protilátky k Αβ peptidu mají za těchto podmínek dostatečnou afinitu pro sekvestrování peptidu ve fyziologických roztocích od jiných vazebných proteinů, ale že MAb, jako je 266, které jsou imunoreaktivní s epitopem v pozici 13-28, jsou významně více účinné a váží se s vyšší afinitou.

V podobných testech měl apoE4 secemovaný astrocyty přečištěný způsobem popsaným v DeMattos, R.B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y., et al., J. Neurosci. (1998) 18:3261-3272, malý, ale statisticky významný efekt na zvýšení množství Αβ peptidu v dolní komůrce. Žádný efekt nebyl pozorován tehdy, když byl polyklonální IgG nebo BSA zaměněn za MAb 266.

Příklad 8

Tok Αβ peptidu z CNS do plazmy

A. 1 pg Αβ40 se rozpustil v 5 βΐ krysího CFS pro uchování v rozpuštěném stavu a potom se injikoval do subarachnoidálního prostoru cisterna magna normálních Swiss-Webster myší, kterým byly před tím podány i.v. injekce buď PBS (n=3), nebo 200 pg biotinylované MAb 266 (n=3). V různých časech po léčbě se celkový Αβ v plazmě myší určil Αβ ELISA, za použití 3D6 jako potahovací protilátky a standardů Αβ ve směsi s nadbytkem biotinylované 266. Do každého vzorku plazmy se po odběru od každého zvířete přidal nadbytek biotinylované 266 pro P43 detekci v ELISA. U myší léčených PBS byly minimální detekovatelná množství peptidu v koncentracích 0,15 ng/ml detekovány jako píkové hodnoty po 30 až 60 minutách, a potom byly hodnoty prakticky nulové. U myší, kterým byla podána MAb 266, dosáhly plazmatické koncentrace P43 pep tidu hodnot 330násobně vyšších než u myší s injekcí PBS po 60 minutách (přibližně 50 ng/ml) a dosahovaly hodnot přibližně 90 ng/ml po 180 minutách.

B. Tento postup se opakoval za použití buď 200 pg (n=3) nebo 600 pg (n=3) injikovaných i.v. 2měsíčním APP V717F myším. MAb 266 se injikovala i.v. 3měsíčním APP^V7I7F myším za použití výše uvedených dávek. Před a v různých intervalech po i.v. injekci se plazmatická koncentrace Αβ navázaného na MAb 266 určila RIA. Podrobné výsledky od jedné myši jsou uvedeny na obr. 2.

Bylo zjištěno, že koncentrace Αβ navázaného na monoklonální protilátku MAb 266 se zvýšila ze základních hodnot 150 pl/ml na hodnoty 100 ng/ml za 4 dny. Analýzou časných částí křivky se určilo, že čistá rychlost vstupu Αβ_ω, do plazmy u APP^V717F Ig myší je 42 pl/ml/minutu za přítomnosti saturačních koncentrací protilátky.

Účinky MAb 266 na plazmatícké koncentrace Αβ u přirozených a APP^V717F Tg myší, stejně jako účinky protilátky na koncentrace AE v CSF ukazují, že přítomnost MAb 266 v cirkulaci vede k změně rovnováhy v transportu Αβ mezi CNS a plazmou.

Příklad 9

Účinek MAb 266 na Αβ v mozku

4-měsíční App^V7,7F+/+ myši se léčily každé 2 týdny po dobu 5 měsíců IP injekcemi salinického roztoku, MAb 266 (500 pg) nebo kontrolního myšího IgG (100 pg, Pharmigen). Myši se utratily ve věku 9 měsíců a určilo se ukládání Αβ v kůře mozkové. % plochy pokryté Αβ-imunoreaktivitou, jak byla určena králičí pan-Αβ protilátkou (QCB, lne.), se kvantifikovalo v kůře mozkové ihned po barvení dorsálního hippocampu, jak je popsáno v Holtzman, D.M., et al., Ann. Neurol. (2000) 97:2892-2897. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3 A. V tomto věku se u přibližně poloviny myší z každé skupiny ještě nezačaly vyvíjet depozita Αβ. Nicméně, % myší s >50% ukládáním Αβ v kůře mozkové bylo signifikantně nižší (P=0,02, Chi-kvadrátový test) ve skupině léčené 266. Ačkoliv se u APPV717P myší mohou vyvíjet větší depozita Αβ v 9 měsících, existuje značná variabilita s přibližně 50% bez depozit a přibližně 50% s výraznými depozity. U zvířat léčených PBS a IgG mělo 6/14 a 5/13 myší více než 50 % kůry mozkové nabarveno Αβ barvením, zatímco pouze jedna ze 14 myší léčených MAb 266 měla tuto úroveň barvení. Téměř 50 % zvířat ve všech skupinách nemělo ukládání Αβ v 9 měsících věku. Toto se zdá být způsobeno původem myší v naší kohortě, protože ačkoliv byly všechny testované myši ověřené jako APPV717+/+, byly vysoké hladiny deponování Αβ pozorovány pouze u myší ze 4/8 párů (vrhy s vysokou patologií). Myši z druhých 4 vrhů byly v podstatě bez depozit Αβ(ν^ s malou patologií). Za použití vrhů jako ko-proměnné byl patrný silný, statisticky významný efekt m266 na redukci deponování Αβ (p=0,0082, obr. 3B).

Příklad 10

Periferně injikovaná MAb 266 se neváže na plaky u APPV717F Tg myší

Pro stanovení toho, zda se MAb 266 injikovaná i.p. během 5 měsíců váže na Αβ v mozku se použily řezy mozkem od 9měsíční APP^V7I7F Tg myši, které obsahovaly depozita Αβ a které byly léčeny MAb 266, salinickým roztokem nebo kontrolním IgG. Zpracování tkání a imunobarvení se provedly popsaným způsobem (Bales, K.R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263-264). Tkáně od všech skupin zvířat se inkubovaly s fluoresceinem-značeným anti-myším IgG (Vektor; Inc.) a potom se hodnotily pod fluorescenčním mikroskopem. V žádné skupině nebylo pozorováno spe cifické barvení Αβ depozit. Naopak, při aplikování MAb 266 na řezy před inkubací řezů s antimyším IgG byla depozita Αβ jasně detekována.

Příklad 11

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce 24-měsíčních transgenních hemyzygotních PDAPP myší

Použilo se 16 hemizygotních transgenních myší (APP^V7I7F). Myši byly v době zahájení testu staré 24 měsíců. Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Polovině myší se podávaly jednou týdně injekce fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS, kontrola) a druhé polovině injekce 500 pg myší protilátky 266 rozpuštěné v PBS. Injekce se prováděly po dobu 7 týdnů (42 dnů), celkově 6 injekcí. 3 dny po poslední injekci se hodnotilo chování zvířat za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v J.C. Dodart, et al., Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999). Vypočetl se index kognitivních funkcí (TB x 100)/(TB-TA). Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 1.

Tabulka 1

	Index kognitivních funkcí
		N	Průměr	Standardní odchylka	Standardní chyba
Kontrola	(PBS)	8	7,22“	8,80	3,11
Protilátka	266	8	54,35	7,43	2,62

“ p - 0,0010

Podávání 500 pg protilátky 266 jednou týdně 24-měsíčním, hemizygotním, transgenním myším bylo spojeno se statisticky významnou změnou chování. Protilátkou léčené myši měly indexy kognitivních funkcí podobné jako normální kontrolní zvířata [J.-C. Dodart, et al.]. Rozdíly v indexech kognitivních funkcí byly statisticky významné při p=0,001. Vyšší index kognitivní funkce ukazuje, že léčba protilátkou, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselin 13-28 revertuje poruchy chování, které byly dokumentovány v tomto myším modelu Alzheimerovi nemoci. Proto může podání protilátky, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselin 13-28 léčit onemocnění jako je Alzheimerovy nemoc a Downův syndrom a také může zastavit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění.

Postižení amyloidem (% plochy barvené imunoreaktivním materiálem po barvení anti-Αβ protilátkou 3D6 nebo 21F12) se kvantifikovali v kůře mozkové ihned po nabarvení hippocampu včetně oblastí cinguly a parietálního kortexu v mozku 24-měsíčních zvířat léčených myší protilátkou 266 po dobu 7 týdnů, jak je popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Rozdíly mezi skupinami nebyly statisticky významné.

Tabulka 2: Množství amyloidových plaků u APPV717F +/- myší po léčbě myší 266 anti-Αβ protilátkou

Velikost plaků (%)
Při použití 3D6	Při použití 21F12
N	Průměr Standard, chyba	Průměr Standardní chyba
Kontrola (PBS) 7	44,3 5,93	0,77 0,14
Protilátka 266 8	38,0 2,96	0,93 0,11

Pro tato velmi stará zvířata nevede léčba myší protilátkou 266 k významně odlišnému množství amyloidu ve srovnání se skupinou léčenou PBS, podle měření buď pomocí 3D6 nebo za použití 21F12. Dále, množství Αβ bylo významně vyšší a signifikantně zvýšení ve srovnání s množstvím amyloidu u mladších zvířat (viz dále), které nebyly schopné rozpoznat nový objekt od známého objektu v testu kognitivních funkcí. Překvapivě tyto výsledky demonstrují, že anti-Αβ protilátky mohou revertovat kognitivní defekty bez nutnosti redukovat množství amyloidu jako takového.

Po 7 týdnech léčby se index kognitivních funkcí ve skupině léčené m26 statisticky významně nelišil od skupiny normálních 24-měsíců starých myší. Toto ukazuje na kompletní vylepšení kognitivního deficitu u těchto transgenních myší.

Příklad 12 ,

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce u mladých transgenních hemizygotních PDAPP myší

Použilo se 54 homozygotních, transgenních myší (APP^V717F). 23 myší bylo na začátku testu ve věku přibližně 2 měsíce. Zbývající myši byly na začátku testu ve věku přibližně 4 měsíce. Trvání léčby bylo 5 měsíců. Tak bylo na konci testu stáří myší přibližně sedm (7) měsíců nebo přibližně devět (9) měsíců.

Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Všechny myši v kontrolní „PBS“ skupině dostávaly jednou týdně injekci fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS; 200 pl). Všechny myši v „IgG“ kontrolních skupinách dostávaly jednou týdně injekci IgGlkappal isotypu (lOOpg/myš/týden). Všechny myši v „high dose“ skupinách dostávaly jednou týdně injekci 500 pg protilátky 266 rozpuštěné v PBS („HD“). Všechny myši v „low dose“ skupinách dostávaly jednou týdně injekci 100 pg protilátky 266 rozpuštěné v PBS („LD“). Tři dny po poslední injekci se chování myší hodnotilo za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v příkladu 10, a diskriminační index se vypočetl jako rozdíl mezi dobou strávenou na novém objektu a dobou strávenou na známém objektu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3. Data jsou sdružena podle věku myší na konci testu.

Tabulka 3: Statistika pro diskriminační index

	Diskriminační index (minuty)
	N	Průměr	Standardní odchylka	Standardní chyba
7 měsíců
PBS	7	2,12	4,22	1,59
igG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,04*	6,52	2,30
9 měsíců
PBS	7	1,87	3,54	1,34
IgG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p < 0.05 *** pcO.OOOl

Dohromady tato data podporují závěr, že podávání protilátky 266, protilátky namířené proti centrální doméně Αβ, zmírňuje deponování plaků u 7 až 9 měsíčních APP^V717F myší, stejně jako revertuje existující poruchy chování. Léčba pacientů protilátkou proti Αβ peptidu bude inhibovat nebo bránit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění, a bude obvykle revertovat takové zhoršení.

Diskriminační index pro léčená zvířata nebyl statisticky významně odlišný od indexu myší stejného věku. Proto - stejně jako u starších zvířat (příklad 11) - léčba m266 zcela revertovala zhoršování kognitivních funkcí u těchto mladších transgenních zvířat.

Příklad 13

Syntéza humanizované protilátky 266

Buňky a protilátky. Myší myelomová buněčná linie Sp2/0 se získala z ATCC (Manassas, VA) a kultivovala se v DME mediu obsahujícím 10% PBS (kat. # SH32661.03, HyClone, Logan, LIT) při 370C v CO₂ inkubátoru. Myší 266 hybridomové buňky se nejprve kultivovaly v RPMI-1640 mediu obsahujícím 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 0,1 mM neesenciální aminokyseliny, 1 mM natrium-pyruvát, 25 pg/ml gentamicinu, a potom se expandovaly v bezsérovém mediu (Hybridoma SFM, kat # 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 2% FBS s nízkým obsahem Ig (kat # 30151.03, HyClone) na objem 2,5 litru ve válcových zkumavkách. Myší monoklonální protilátka 266 (Mu266) se přečistila ze supematantu kultury afínitní chromatografií za použití protein-G sepharosové kolony. Biotinylovaná Mu266 se připravila za použití EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinu (kat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Klonování cDNA variabilního regionu. Celková RNA se extrahovala z přibližně 107 hybridomových buněk za použití TRIzol činidla (Life Technologies) a poly(A)+ RNA se izolovala pomocí PolyATract mRNA Isolation systému (Promega, Madison, WI) podle návodu výrobce. Dvojřetězcová cDNA se syntetizovala za použití SMART-RACE cDNA Amplification Kitu (Clontech, Palo Alto, CA) podél návodu výrobce. cDNA pro variabilní regiony pro lehký a těžký řetězec se amplifikovaly polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití 3' primerů, které se váží v příslušném pořadí na myší kappa a gamma řetězce konstantních regionů, a 5' univerzálního příměru obsaženého v SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitu. Pro VL PCR měl 3' primer sekvenci:

5' - TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC -3' [SEQ ID

NO:13] kde zbytky 17-46 hybridizují na myší Ck region. Pro VH PCR měly 3' primery degenerovanou sekvenci:

A G T

5' -TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTrTGGC-3'

T

[SEQ ID NO:14] se zbytky 17-50 hybridizujícími na myší gamma řetězec CHI. VL a VH cDNA se subklonovaly do pCR4Blunt-TOPO vektoru (Invitrogen, Carlsbad, CA) za účelem stanovení sekvence. DNA sekvencování se provedlo za použití PCR cyklických sekvencovacích reakcí s fluorescentními dideoxy-řetězcovými terminátory (Applied Biosystems, Foster City, CA) podle návodu výrobce. Sekvencovací reakce se analyzovaly na Model 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Konstrukce variabilních regionů humanizované 266 (Hu266). Humanizace V regionů myší protilátky se provedla způsobem popsaným v Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1002910033 (1988)]. Pracovní region lidského V regionu použitý jako akceptor pro Mu266 CDR se vybral podle homologie sekvence. Počítačové programy ASMOD a ENCAD [Levitt, M., 1. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)] se použily pro konstrukci molekulového modelu variabilních regionů. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly určeny jako kontaktní s CDR, se substituovaly příslušnými zbytky Mu266. Toto se provedlo ve zbytcích 46, 47, 49 a 98 v těžkém řetězci a se zbytkem 51 v lehkém řetězci. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly vzácné ve stejné podskupině V-regionů, byly změněny na konvenční aminokyseliny pro eliminaci potenciální imunogenicity. Toto se provedlo ve zbytkách 42 a 44 v lehkém řetězci.

Geny pro variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce se připravily a amplifikovaly za použití 8 překrývajících se syntetických oligonukleotidů délky od přibližně 65 do 80 bází [He, X. Y„ et al, J. Immunol. 160: 029-1035 (1998)]. Oligonukleotidy se tepelnou reakcí spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem DNA polymerázy I, za zisku 4 dvouřetězcových fragmentů. Získané fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem za zisku dvou fragmentů. Tyto fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a znovu se prodloužily za zisku dvou kompletního genu. Získaný produkt se amplifíkoval PCR za použití Expand High Fidelity PCR Systému (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). PCRamplifikované fragmenty se přečistily na gelu a klonovaly se do pCR4Blunt-TOPO vektoru. Po potvrzení sekvence se VL a VH geny trávily Mlul a Xbal, přečistily se na gelu a subklonovaly se v příslušném pořadí do vektorů pro expresi lehkého a těžkého řetězce za zisku pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 (viz obr. 6 a 7, v příslušném pořadí) [Co. M. S., et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]. Zralá humanizovaná 266 protilátka exprimovaná z těchto plazmidů měla lehký řetězec SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec SEQ ID NO: 12.

Stabilní transfekce. Stabilní transfekce do myší myelomové buněčné linie Sp2/0 se provedla elektroporací za použití Gene Pulser přístroje (BioRad, Hercules, CA) při 360 V a 25 pF, jak je popsáno (Co et al., 1992). Před transfekcí se pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 plazmidové DNA linearizovaly za použití FspL Přibližně 107 Sp2/0 buněk se transfektovalo 20 pg pVk-Hu266 a 40 pg pVgl-Hu266. Transfektované buňky se suspendovaly v DME mediu obsahujícím 10% PBS a buňky se umístily na několik 96jamkových ploten. Po 48 hodinách se přidalo selekční medium (DME medium obsahující 10% PBS, HT mediový doplněk, 0,3 mg/ml xanthinu a 1 pg/ml kyseliny mykofenolové. Přibližně 10 dní po zahájení selekce se supematanty kultury testovaly na produkci protilátek za použití ELISA, jak je popsáno dále. Klony s vysokou produkcí se expandovaly v DME mediu obsahujícím 10% PBS a dále se analyzoval na expresi protilátek. Selektované klony se potom adaptovaly na růst v Hybridoma SFM.

Měření exprese protilátek ELISA. Jamky 96jamkové ELISA plotny (Nunc-Immuno plotna, kat. # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) se potáhly 100 μΐ 1 pg/ml kozím anti-lidským IgG, specifickým pro Fcgamma fragment, polyklonální protilátkou (kat # 109-005-098, Jackson ImunoResearch, West Grove, PA) v 0,2 M pufru tvořeným uhličitanem sodným-hydrogenuhličitanem sodný (pH 9,4) přes noc při teplotě 40 °C. Po promytí promývacím pufrem (PBS obsahující 0,1% Tween 20) se jamky blokovaly 400 pl Superblock Blocking Buffer (kat # 37535, Pierce) po dobu 30 minut a potom se promyly promývacím pufrem. Vzorky obsahující Hu266 se vhodně naředily v ELISA pufru (PBS obsahující 1% BSA a 0,1% Tween 20) a aplikovaly se na ELISA plotny (100 pl na jamku). Jako standard se použila humanizovaná anti-CD33 IgGl monoklonální protilátka HuM195 (Co, et al., 1992, výše). ELISA plotna se inkubovala po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a jamky se potom promyly promývacím pufrem. Potom se do každé jamky přidalo 100 μΐ 1/1000-ředěné HRP-konjugované kozí anti-lidský kappa polyklonální protilátky (kat # 105 0-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) v ELISA pufru. Po inkubaci po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a promytí promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 μΐ ΑβΤ8 substrátu (kat # 507602 a 506502, Kirkegaard a Perry LASoratories, Gaithersburg, MD). Vyvíjení barvy se ukončilo přidáním 100 μΐ 2% kyseliny šťavelové na jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm za použití OPTImax čtečky mikroploten (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Přečištění Hu266. Jeden z transformantů s vysokou expresí Hu266 označený jako Sp2/0 (klon 1D9) se upravil na růst v Hybridoma SFM a expandoval se na objem 2 litry v otočných baňkách. Vyčerpaný supernatant kultury se získal poté, co procento živých buněk dosáhlo 10% nebo méně a vnesl se do protein-A Sepharosové kolony. Kolona se promyla PBS před tím, než se protilátka eluovala 0,1 M glycinem-HCl (pH 2,5), 0,1 M NaCl. Eluovaný protein se dialyzoval proti 3 výměnám 2 litrů PBS a přefiltroval se přes 0,2 pm filtr před uskladněním při 40 °C. Koncentrace protilátky se určila měřením absorbance při 280 nm (1 mg/ml =1,4 A280). SDS-PAGE v Tris-glycinovém pufru se provedla standardním způsobem na 4 až 20% gradientovém gelu (kat # EC6025, Novex, San Diego, CA). Přečištěná humanizovaná 266 protilátka se redukovala a zpracovala se na SDS-PAGE gelu. Celá protilátka vykazuje dva proužky přibližné molekulové hmotnosti 25 kDa a 50 kDa. Tyto výsledky jsou v souladu s molekulovými hmotnostmi pro lehký řetězec a těžký řetězec nebo fragment těžkého řetězce vypočtenými podle jejich aminokyselinového složení.

Příklad 14

In vitro vazebné vlastnosti humanizované 266 protilátky

Vazebná účinnost humanizované 266 protilátky, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se srovnávala s myší 266 protilátkou za použití biotinylované myší 266 protilátky ve srovnávací ELISA analýze. Jamky 96-jamkové ELISA plotny (Nunc-Imuno plotna, kat # 439454, NalgeNunc) se potáhly 100 μΐ 13-amyloidového peptidu (1-42) konjugovaného na BSA v 0,2 M pufru tvořeném uhličitanem sodným/hydrogenuhličitanem sodným (pH 9,4) (10 pg/ml) přes noc při 40C. Konjugát ΑβΙ-42-BSA se připravil rozpuštěním 7,5 mg Αβ1-42-Ογ843 (C-terminální cystein na Αβ1-42, AnaSpec) v 500 μΐ dimethylsulfoxidu, a potom okamžitým přidáním 1500 μΐ destilované vody. 2 miligramy maleimidem-aktivovaného hovězího sérového albuminu (Pierce) se rozpustily v 200 μΙ destilované vody. Tyto dva roztoky se smísily a nechaly se ustát při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Chromatografie na gelové koloně se použila pro separování nezreagovaného peptidu od konjugátu ΑβΙ-42-Cys-BSA.

Po promytí jamek fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) obsahujícím 0,1% Tween 20 (promývací pufr) za použití promývacího zařízení pro ELISA plotny se jamky blokovaly přidáním 300 μΙ SuperBlock činidla (Pierce) na jamku. Po 30 minutách blokování se jamky promyly promývacím pufrem a odstranil se nadbytek kapaliny.

Směs biotinylované Mu266 (konečná koncentrace 0,3 pg/ml) a kompetiční protilátky (Mu266 nebo Hu266; konečná koncentrace od 750 μΙ/ml a sériová 3násobná ředění) v ELISA pufru se přidala v trojím provedení v objemu 100 μΐ na jamku. Jako nekompetiční kontrola se přidalo 100 μΐ 0,3 μg/ml biotinylované Mu266. Jako základní kontrola se přidalo 100 μΐ ELISA pufru. ELISA plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 90 min. Po promytí jamek promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 μΐ 1 μΙ/ml HRP-konjugovaného streptavidinu (kat # 21124, Pierce). Plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 30 min. a promyla se promývacím pufrem. Pro vývoj barvy se přidalo 100 μΙ/jamku ARTS Peroxidáze Substráte (Kirkegaard & Perry Laboratories). Vývoj barvy se ukončil přidáním 2% kyseliny šťavelové v dávce 100 μΐ/jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm. Absorbance se zanesly do grafu proti logaritmu koncentrace kompetitoru, křivky se upravily pro data (za použití Prism) a určily se IC50 pro každou protilátku za použití způsobů dobře známých v oboru.

Průměrná IC₅o pro myší 266 byla 4,7 pg/ml (tři samostatné pokusy, standardní odchylka = 1,3 μΙ/ml) a pro humanizovanou 266 byla 7,5 μΙ/ml ((tři samostatné pokusy, standardní odchylka =1,1 μΙ/ml). Byla provedena druhá sada pokusů, v podstatě tak, jak je popsáno výše, a průměrná IC50 pro myší 266 byla 3,87 μΙ/ml (SD = 0,12 μΙ/ml) a pro lidskou 266 byla IC₅o 4,0 μΙ/ml (SD =0,5 μΙ/ml). Podle těchto výsledků lze říci, že humanizovaná 266 má vazebné vlastnosti, které jsou velmi podobné vlastnostem myší protilátky 266. Proto předpokládáme, že humanizovaná 266 má velmi podobné in vitro a in vivo aktivity ve srovnání s myší 266 a dále předpokládáme, že bude mít u člověka stejné účinky jako myší 266 u myší.

Příklad 15

In vitro vazebné vlastnosti myších protilátek 266 a 4G8

Afinita protilátky (KD = Kd/Ka) se určila za použití BIAcore biosensoru 2000 a data se analyzovala BIAevaluation (v.3.1) softwarem. Záchytná protilátka (králičí anti-myší) se navázala prostřednictvím volných amino skupin na karboxylové skupiny na průtokové komůrce 2 biosenzorového čipu (CM5) za použití N-ethyl-N-dimethylaminopropyl-karbodiimidu a N-hydroxysukcinimidu (EDC/NHS). Nespecifický králičí IgG se navázal na průtokovou komůrku 1 jako základní kontrola. Monoklonální protilátky byly zachyceny za dosažení 300 rezonančních jednotek (RU). Amyloid-beta 1^10 nebo 1 -42 (Bioscience International lne.) se potom nechal protékat okolo čipu v klesajících koncentracích (1000 až 0,1-násobek KD). Pro regeneraci čipu se navázané anti-Αβ protilátka eluovala z čipu za použití výplachu glycinem-HCl (pH 2). Kontrolní injekce neobsahující beta-amyloid sloužila jako kontrola pro odečtení základních hodnot. Sensorogramy ukazující asociační a disociační fáze se analyzovaly pro stanovení Kd a Ka. Za použití tohoto způsobu byla afinita myší protilátky 266 pro Αβ^ο a pro Αβ, ^₂ stanovena na 4 pM. Afinita 4G8 pro Αβ,^ο byla 23 nM a pro Αβμ₄₂ byla 24 nM. I přes 6000-násobný rozdíl v afinitách pro Αβ jak 266, tak 4G8, která se váže na epitopy mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, účinně sekvestruji Αβ z lidského CSF. Proto je lokalizace epitopu nejdůležitější - důležitější než vazebná afinita - pro stanovení schopnosti protilátky sekvestrovat Αβ a tím poskytovat výhody předkládaného vynálezu.

Příklad 16:

Epitopové mapování myší protilátky 266 za použití Biacore metody a solubílních peptidu

BIAcore je automatizovaný biosenzorový systém pro měření molekulových interakcí (Karlsson R., et al., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)). Výhody BIAcore ve srovnání s jinými vazebnými testy spočívají v tom, že vazba antigenu může být měřena bez značení nebo imobilizace antigenu (tj. antigen je v přirozenější konformaci). BIAcore metoda byla použita pro hodnocení vazby různých fragmentů beta-amyloidového peptidu na myší protilátku 266, v podstatě tak, jak je to popsáno v příkladu 12, s tou výjimkou, že všechna ředění byla provedena s HEPES pufrovaným salinickým roztokem obsahujícím Tween 20, a injikovaly se různé fragmenty Αβ (BioSource International), a injikovala se jediná koncentrace každého fragmentu (440 nM).

Fragmenty beta-amyloidu 1-28, 12-28, 17-28 a 6-25 se vázaly na myší protilátku 266, zatímco Αβ fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se nevázaly na protilátku. Fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se vázaly na jiné mAβ se známou epitopovou specifickou pro tyto regiony Αβ. Podle této metody se zdá, že vazebný epitop myší protilátky 266 je mezi aminokyselinami 17 a 25 Αβ. Protože se vazba realizuje obvykle s alespoň 3 zbytky v epitopu, lze odvodit, že epitop je obsažen ve zbytkách 19-23.

Příklad 17

In vitro vazebné vlastnosti humanizované protilátky 266

Afinita (KD=Kd/Ka) humanizované protilátky 266, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se určila v podstatě způsobem popsaným v příkladu 15. Za použití tohoto způsob u se určila afinita humanizované 266 pro Αβ 1 -42 jako 4 pM.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro použití pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

CL 306683 B6

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a

5 a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce, a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

o

- CDR1 těžkého řetězce:

1 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

1 5 10 15 Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly SEQ ID NO: 5) nebo 1 5 10 15 Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID N0:16) a

CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr, (SEQ ID NO: 6) a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.
2. Farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidů Αβ, pro použití pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

15 ¹⁰¹⁵

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uve-

5 děných aminokyselinových sekvencí:

- CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

15 1015

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

15 1015

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr^ (SEQ ID NO: 6) a a sekvenci úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého ίο řetězce.
3. Farmaceutický prostředek pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 těžký řetězec:

15 10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).
4. Farmaceutický prostředek pro použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 15 1015

Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 20 2530

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 4045

Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 5560

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lyslie

65 70 7580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser GinSer

85 9095

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys 100 105110

Arg (SEQ ID NO: 7) kde

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ile;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr,

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser, ίο Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly;

15 Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahuje dále uvedené sekvence:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala 3540

Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn 5055

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

2530

Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 45

Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr 65

Leu Gin Met Asn Ser

Ala Ser Gly Asp Tyr

100 lie Ser Arg Asp Asn 70

Leu Arg Ala Xaa Asp

Trp Gly Gin Gly Thr 105

Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 75 80

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 95

Xaa Val Thr Vai Ser Ser 110 kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser;

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser,

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr,

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.
5. Farmaceutický prostředek pro použití podle nároku 4, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.
6. Farmaceutický prostředek pro použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12.
7. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

15 iq 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

1 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

1 5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

- CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

15 10

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

1015

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.
8. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tri regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

1 5 10 .

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo i 5 ¹⁰¹⁵

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 lehkého řetězce:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) , a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

- CDR1 těžkého řetězce:

¹5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 těžkého řetězce:

15 1015

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

15 1015

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

ίο
9. Farmaceutický prostředek pro použití podle nároku 1 nebo 2, kde protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 těžký řetězec:

Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 5) .
10. Použití farmaceutického prostředku podle jakéhokoli z nároků 7 až 9, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

Asp Xaa Val Met Thr 1 5

Gin Pro Ala Ser Ile 20

Asp Gly Asn Ala Tyr 35

Gin Xaa Pro Leu Ser 10

Ser Cys Arg Ser Ser 25

Leu His Trp Phe Leu 40

Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 15

Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45

Pro Xaa Leu Leu Ile 50

Asp Arg Phe Ser Gly 65

Ser Arg Val Glu Ala 85

Thr His Val Pro Trp

100

Tyr Lys Val Ser Asn 55

Ser Gly Ser Gly Thr 70

Glu Asp Xaa Gly Val 90

Thr Phe Gly Xaa Gly 105

Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 95

Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys 110

Arg (SEQ ID NO: 7) kde

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ile;

1 o Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr,

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser, Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro; Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val; Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

15 Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly;

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahující dále uvede sekvence:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly 15 Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20 Ala Ser Gly Phe 25 Thr Phe Ser 30 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin 35 Ala Pro Gly Lys 40 Gly Leu 45 Xaa Leu Val Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly 50 55 Asn Ser Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Xaa Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Xaa 75 Xaa Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85 Ala Xaa Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

110

100 ¹⁰⁵ (SEQ ID NO: 8) kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser,

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser,

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr,

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.
11. Použití farmaceutického prostředku podle nároku 10, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.
12. Použití farmaceutického prostředku podle jakéhokoli z nároků 7 až 11, kde protilátka má sekvence variabilního regionu lehkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 12.

9 výkresů

casOhPBs nidMtts WBtePBS M5(We4«S EHMHta-PBS ®WkD»-29S ^22kDa-2fi6 BffiS0kD&^6 MKXW2&6

Obr. 1

Koocatace AB rptami pa itannoaii ňjekci 2ft u APFV717F mjrfi

Ču^iík^)

Obr. 2

iiinciý aďtf kodrofaí raitok Tg?

piUtogimvdkfch

Obr. 3

Obr. 4. pVk-Hu266 polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 lehkého řetězce a kódy jednotlivých aminokyselin pro exprimovaný humanizovaný 266 lehký řetězec

MKLPVRX.I.VI.MFWlPASRCJiVVM

699 ACaaGMCOaCTCTťXXnGCCTGTCACOCTTOGACAXaMCCTCCMCTCrTOCWSXTX^JU^^

TQSPIiSI>PVTI>GQPASX-8CRSSQSI>XY

779 TRGTmiwaMoaxiKTrrMTmraaTrerKxsiGMMaccMKCcaGTCTcauvstKz^^

8DGSAYX.BWFI>QKPGQ8PRI>I>XYKVS1I

859 ACCGASTTTCMGGGXCCCIIGACMGXYCMTOQCNnGGKXCTQQQKMOKXTTCXCACTCAAGATCNSCNJkGroGnG

RFSGVPDRPSGSGSGTDPTLKISRVE

939 GCCGAOaTGTCCXSAGTrrATTACTGTtCTCAAACn7U3lCaYGTTCCGTOGACGTrOGGTCAXOGCACCAAGGTGGAAAT ABDVGVYYCSQSTHVPKTFG Q-G T K V E X

1019 C3ÚMCGXG>0I3UaAXTXaMCSUXUATZ«MJlCn3GM9GGGTO9G«X«*anO3CC3UTCTrPS^^

K ^E

1099 GAOTTraaWaUGGKaGMAAGClTaaiAGCOCTaUMlTCGCTCCAAAGA^^ .1179 jfflauraaAaassQGUGcziiGGaMaMCTCMMcanaAGm

12S9 AKaGGGMMGOUGcaGiTTTcxGrcnmxxsDuiaTscanCTGATnnxx^^

1339 canGnaarxMAíaaaiccitHTTCCTRaTRXTCxapuunGiGGcitK»^^

TVAAPSVFIFPPS

1*19 OGATGaGCAGTIGAAMX3GGAM»XXncnCTnOTG(XTGCIGM33MCXT^^

DEQLKSGTASVVCI. L M EFYPREAKVQW

1*99 VX»AGOIGGmACSCCaKXMTCGGGIMCKXCllGGMSKnGTCa£aGftGraG^^

KVDMALQSGMeQKSVTBQDSKDSTYSL

1579 CCICMX3tf»tfX»raXCa3WKK3lMGCMIN^3MXaMaUUU3kaUUUm37ba3CCIGCGN^^

SSTLTI.sriDYBKMKVYACEVTHQGL

1659 2GNGCXaXXnSrcM3UUMaGCITCUCMQGQGNSKnGTTN»GGGnGAAGTGCCpCX3V^^

SSPVTKSFMRGBC·

1739 CTGACCCCCTCOCATOCITTGGCCTCTGACCCnmCCMTtGGGGACCrACCCCWTGCGGTCCTCCAGCTCASCTTT

1819 CaCCTCMXXXXXTCCTCCXtXrnGGCTTDaYTMXXnMIGTrGGMGMNei^

1899 CTGTOGTTTCICTraTTOTCMTmTMern«ra*TCTGTTGTTTn«XM«ri3USX^^

1979 AXKIGI»GIC3l3XX3M<XXXXa33UU0aem3VIMUUUlTC»TCCrT(OTICTA^^

2059 KmXTOXICMN3an0UMGa!n(3GTCCKM3USTCCCCTQGGC£l^^

2139 CCTCCTCaGCAAGCCCTCATAGTCCTTTTTAJKXXTrGACAGGTCTrACAffrovWMXXT^^

2219 ATCAXCCAMGCAAATTrTTCAAAAGAJUaUUUXTCCTATAAACAGAATCATTCATTGCAACATGATATAWU.TAACAAC

2299 ^OU\XXAAAGCAATrAAATAAACJUGU>ATAGGGAXATGTITAAGTTCATCATGGTACTTAGACTrAATGGAATGTCATG

2379 COTATTTACATTTrrAAACflGGTACTGAGGGACTCXrrcTCTGarAAGGGCCGTATTGAGTACTTrCCACAACCTAATTT

2*59 AATCCACACTATAmXnWUGATTAAAAACATTCATrAAAATcnTXX3«AGGTTCTATAAAGCTGAGAGACAAATATATTC

2539 xkTwunraGoaraxsu^^

Kompletní sekvence genu pro lehký řetězec Hu266 je lokalizovaná mezi Mlul a BamHI místy v pVk-Hu266. Čísla nukleotidů ukazují jejich pozici ve pVgK-Hu266. Vk a Ck exony jsou translatovány do jednopísmenného kódu; tečky ukazují translační terminační kodon. Zralý těžký řetězec začíná dvojitě podtrženou kyselinou asparagovou (D). Intronové sekvence jsou kurzívou.

Obr. 5. pVk-Hu266 polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 těžkého řetězce a kódy jednotlivých aminokyselin pro exprimo váný humanizovaný 266 těžký řetězec eis Ao»nccNX3aGMvnTcx»3CKa6cnx»mTTCCCTorccrrQTmw^^

ΜΜΓΟ13Ι.ΧΡΐνΐνΐΚανΐΟ§ν0Ι.

699 GTCxjMncTGGGQGAQGXTXAGiGCAGCcxGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCiusccTCTGGAncACTTTTAGZAG VESGGGI.VQPGGSI.RI.SCAASGFTFSR

779 GTMTtXATGTCTTOGGTTOGCCAGGCTaaMQGCAAGGGOCTQGAATTGGTCGCACAAATTAATAGIGTTGGTAATAQCA YSMSWVRQAPGKGLEnVAQIHSVGNS

859 <X?TACTArcCWSACAC7X7rAAA3GGCCiaTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTCCAAATGAAC TYYPDTVKGRFTISRDWAKMTLYI.QMH

939 TCCCTOA0GGCOGAAGM2ACGGCCGTGTATTAX2TGrGCAAGCGGAJ^CTACrGGGGCCAAGGCACCCIGGTCACAGTCTC SLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVS ιοί» ctaaeTaaeTcaaauiocTCZ&kaciTTCiGaaxwxxxxGGazrauxs^^ s

1099 AGtJTC*GGOkXnX»3GCXAOCCAGGTCCACACCCAiTtXXCMWU3<XCAGaCAC7GGAOG<nUAACCraAXXIAOU3T 117» TMGNuxxHaeGGcaciaBcawoacc&acTaxmxxsuaacGoasms^

A

1259 CXMX3UK]QGXXX3ttaxnX3T<XXXX!TG(X3MXX3CacauK3tf3CACCTCIGQGGG^^

ΕτκορενΕΡΒΑΡΞδκβτεαατΑΑίοεϋ

133» GTCMGGACWrrrCCCaSAACCXXnGACGGTGTanGGAACTCAGGCGCCXrrcaVXaGCGGCGT^^

VKDYFPBPVTVSWHSGAI.TSGVHTFPA

141» TGTCCTACAGTCCTCMXaCTCTACtOCCTCAGCňXXJGTGGTGACOGTGCCXrrCCAGCAGCTTGGGOICCCAGACOT

Ví.QSSGLYSLSSVVTVPSSSIiGTQTY

1499 TCTGOlACGTGAATCACAAGClXAGCAV2ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGaraGCACaGGGAaGGaGCCrc ICMVHHKPSKTKVDKKV

1579 TCiaaGGMGCCMQaOUXBaXX3tXXXQG&aXiaVCaBC^^

1659 CanTnVCXnX3TC3CXX3GGUU3C»CIClGCXXXXXXC3U3C3UCCTC7UKXaG»GGG^^

1739 CTQOX3eGaaUIGCiaetaXICCCCTMCCX30GCCaQCAOuCAMaXKXXlG3^^

1819 CraCUYXCGqAGtnaOQOaXXSauX^MJtGCCCIUXItXAAAGIXCaAACI^^

1899 Tt2TtXTtXX14GA7TtXAGTAAC7XXXZAATCT7CTCTCTGCAGSGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG

EPKSCDKTHTCPP

1979 YGCCC»GG2aAGtX3IGCXX3U3G»CTa9CtXKXaGCroUGQa9GGaCAOtnnGCXXTAGAGTAGC^^ C P

2059 GGaxxMxo»?GT«nisAciu33za»a3rcararcTn^^

APBI>I>GGPSYFL·

2139 TKXXXXXM*ACCCAAGG»CA<XXrrcMT<»TCreCOQGACCXCTGAGGTCRCMGanXXrrcCTGGACGTGAGCCACGA FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE

2219 AGACCCTGAGGTCAAGITCAACIOGTACGTGGACGGCGTGGSGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGftCGAGCAGT DPEVKFMW YVDGVEV HHAKTKPREEQ

2299 ACAACAGCAOtnnca3IGTanCAGa7KXnraCCGTCCra3UX3UX9UCTG(Mri^

YMSTY RVVSVLTVI.HQDWI.HGKEYKCK

2379 GTCTCOUlCAAAGCCCTCCCAGCXXCCATCGAGAAAACCATCrCCAAAGCCAAAGťTna^aXinTOGGTCCCAGGGCC VSNKALPAPIEKTISKAK

2459 M3T<maGaGGXXGCTa3GaXMattfíSaXZGM2UIRaCaXStnMXmCCTC^^

G Q P

2539 CGAGAACCACAGGTVrACACCCTG<rCCCATCCCGGGATGA£XnXaCCAAGAACCAGGTCArarrcACCraX7^^

ΗΕΡ0νΥΤΙ.ΡΡ3ΕηΕΙ,ΤΚΗ0ν5ΕΤαΐ.νΚ

2619 AGGCTTCTATCCCaGCGACATCGCajICGAGTGGGAGAGCJaTGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTOXG

GFYPSDIAVEWESKGOPEWSYKTTPP

2699 TGCIGGACTCXX»U3XXnXX3TCITCCTCaU3UX3UCCTClUXXnGGM^^ .

νυηεηοδΡΓΚΥεκϋτνϋκεΕΗοςαΜνρ

2779 TCATGCTCCGTGXrcCATCAGCXZrCIGCMMCCACTXCAOGCaGAAGAGCCTCTCCCIOTCrCOGGGTAAXraAGTCCG SCSVMHEALHHHYTQKSIiSLSPGK·

2BS9 AO3GCCGGCMGCCCCOGCTCCCCGGGCTCICGQXnOGCACGN2GKSSCXTGGC8CGYACCC!CCÍGTll£KEM3TCCCG 2939 GGCGCCCXGClUCGGMKnMGCMSCOkGCGCIGCCCTGGGCCCCIGCGMMCIGIGMIOGTTCmCQkCGGGTCMGGC 3019 aavncB»CÍ»3GMSGGaaGKGGGiiGQauauscGGG«xx»cnTaxa^^

3099 CroGGOCGCCIAGGGTGGGQCICXGCaeGGQCTOOCCTaSGCMGGianQGMTTQCCROCGTQGCCCTCCCICCAGC 3179 MX3k03GCCXT<X3GarcGG(XlU»GGMGaX3ftGra0aXX3EGGGGkCMM3IC^^

3259 TGiamnTCIGTGM3CGCCCTGItXTCOSlUCCK£MQCtXlUSCGGGQGaUGCX33IGiraaGnSCGIAGGGM2U» 3339 Ca=KXXZOUXXaTCSMXXXauaXK3U3NUX»CTGGCT3CCCigCXX3GCaC^^

3419 MX<XSGGG>uaaGa<CTCK»»CCCXGTa3N3GG»CTOGICK»GUGCCa^

3499 MMiuxcaKMxeiasrTGaaoQaccHaca&xacouaaaaam^

3579 GasMCiGouaGCMxaunccMaGCMGGzasaxaaucGXGMcacTccxcGG^

3659 CX9CGGCACCTCNUGGCQ3VCGMCCn3CQGC*QCnQCCM33QCTG*DCIQCICM3k£9lMCCCKKC!CICCICICA 3739 CXM3QOTGCCCCTGCAaXGCCIUaau3U2MMGQGATCaCACAa3kam»OGTOCCr<XXXXnaX^^

3819 TGCCGCCCITCCCTSCMJGATCC

Kompletní sekvence genu pro těžký řetězec Hu266 je lokalizovaná mezi Mlul a BamHI místy v pVgl-Hu266. Čísla nukleotidů ukazuji jejich pozici ve pVgl-Hu266. Vh a Ch exony jsou translatovány do jednopísmenného kódu; tečky ukazují translační terminační kodon. Zralý těžký řetězec začíná dvojitě podtrženou kyselinou glutamovou (E). Intronové sekvence jsou kurzívou.