SK288723B6

SK288723B6 - Farmaceutický prostriedok a použitie tohto farmaceutického prostriedku

Info

Publication number: SK288723B6
Application number: SK69-2008A
Authority: SK
Inventors: David M Holtzman; Ronald Demattos; Kelly R Bales; Steven M Paul; Naoya Tsurushita; Maximiliano Vasquez
Original assignee: Univ Washington; Lilly Co Eli
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2020-01-07
Also published as: ES2184660T1; DE60106394D1; EP1257584B2; HRP20080430A9; CN1426423A; CN101670105A; ES2184660T3; HU230768B1; PL210157B1; EP1257584A2; CN104341500A; ATE279442T1; SI1257584T1; BR0108676A; BRPI0108676B8; HK1048640A1; HRP20080430B1; CZ2008595A3; IL151378A0; US20040043418A1

Abstract

Farmaceutický prostriedok obsahujúci humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý medzi aminokyselinami 13 až 28 peptidu Abeta (amyloidu beta), na použitie na prevenciu alebo liečbu predklinickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby a prevenciu, liečbu alebo reverziu kognitívneho deficitu u subjektu, ktorému bola diagnostikovaná predklinická alebo klinická Alzheimerova choroba.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka farmaceutického prostriedku a použitia tohto farmaceutického prostriedku. Farmaceutický prostriedok obsahuje humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ. Použitie sleduje prevenciu alebo liečenie predklinickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby.

Doterajší stav techniky

Mnoho stavov, ktoré vedú ku kognitívnym deficitom, múviciam, mozgovému krvácaniu a celkovému mentálnemu zhoršeniu, je evidentne asociovaných s neurotickými a cerebrovaskulámymi plakmi v mozgu, ktoré obsahujú amyloidový beta peptid (Αβ). Medzi takéto stavy patrí predklinická a klinická Alzheimerova choroba, Downov syndróm a predklinická a klinická cerebrálna amy loidová angiopatia (CAA). Amy loidové plaky sú tvorené z amyloidových beta peptidov. Tieto peptidy cirkulujú v krvi a v mozgovomiechovom moku (CSF), obvykle vo forme komplexov s lipoproteínmi. Αβ peptid v cirkulujúcej forme je zložený z 39 - 43 aminokyselín (najčastejšie zo 40 alebo 42 aminokyselín), ktoré vznikajú zo štiepenia spoločného prekurzorového proteínu, amyloidového prekurzorového proteínu, ktorý sa často označuje ako APP. Niektoré formy solubilného A sú samy osebe neurotoxické a môžu určovať závažnosť neurodegenerácie a/alebo kognitívny deficit (McLean, C. A., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860:866; Lambert, M. P., et al. (1998) 95:6448-6453; Naslund, J., J. Am Med. Asoc.(2000) 283:1571).

Dôkazy naznačujúce, že A môže byť transportované medzi mozgom a krvou (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neumeliem (1996) 67:880-883; Zlokovic, B. V., et al., Biochem Biophys. Res. Comm (1993) 67:1034-1040; Shibata M, et al., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489-1499). Ďalej, Αβ v plakoch je v rovnováhe so solubilným Αβ v mozgu av krvi (Kawarabayashi T, et al., J. Neurosci. (2001)21:372-381).

Ako bolo opísané v PCT prihláške US 00/35681 a U.S. poradové č. 09/153,130, ktoré sú tu uvedené ako odkazy, celkové cirkulujúce hladiny A peptidu v CSF sú podobné u normálnych jedincov a u jedincov predisponovaných k príznakom Alzheimerovej choroby. Ale, hladiny Αβ42 sú v priemere nižšie u jedincov s Alzheimerovou chorobou (Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). Je známe, že Αβ42 je viac náchylný k agregácri ako Αβ4ο, keď k tomu dôjde, vznikajú nežiaduce následky, ako je depozícia Αβ v amyloidových plakoch, konverzia Αβ na toxické solubilné formy, poškodenie nervových buniek a poruchy správania, ako je demencia (Golde, T. E., et al., Biochem Biophys. Acta (2000) 1502:172-187).

Spôsoby indukcie imunitnej reakcie na redukciu amyloidových depozitov sú opísané v PCT publikácii WO 99/27944 publikovanej 10. 6. 1999. Prihláška uvádza, že kompletný agregovaný Αβ peptid môže byť užitočný imunogén. Imunogén. Podanie Αβ fragmentu (aminoky seliny 13-28) konjugovanej na ovčiu antimyšiu IgG nespôsobuje žiadnu zmenu v ukladaní amyloidu v kortexe, a len pri jednom zvierati z deviatich, ktorým bol podaný konjugát Αβ 13-28 fragmentu, malo určitú lymfoproliferáciu v reakcii na Αβ4ο. Prihláška tiež naznačuje, že protilátky, ktoré sa špecificky viažu na Αβ peptid, môžu byť použité ako terapeutické činidlá. Ale, toto sa javí ako špekulácia, pretože dáta podporujúce túto hypotézu odrážajú protokoly, ktoré zahŕňajú aktívnu imunizáciu s použitím, napríklad Αβ42. Peptidy sú podané pomocou adjuvans a sú určené titie protilátky indukované imunizáciou, rovnako ako koncentrácie Αβ peptidu a prekurzorového peptidu. Prihláška silno naznačuje, že Αβ plak musí byť redukovaný na zmiernenie príznakov Alzheimerovej choroby a že na úspešnú redukciu Αβ plaku sú nutné procesy sprostredkované bunkami.

WO 99160024, publikovaná 25. 11. 1999, sa týka spôsobu odstránenie amyloidu s použitím antiamylordovej protilátky. Ale, je uvedené, že mechanizmus využíva schopnosti anti-Αβ protilátky viazať sa na preexistujúce amyloidové depozitá (t. j. plaky) a spôsobiť následnú lokálnu mikrogliálnu reakciu na lokalizovaných plakoch. Tento mechanizmus nebol overený in vivo. Táto prihláška ďalej uvádza, že aby boli účinné proti Αβ plakom, musia prenikať anti-Αβ protilátky do mozgového parenchýmu a prekonávať hematoeneefalitickú bariéra.

Niekoľko PCT prihlášok, ktoré sa týkajú pokusov o kontrolu amyloidových plakov, bolo publikovaných 7. 12. 2000. WO 00/72880 opisuje významnú redukciu plakov v kortexe a hipokampe v transgénnom myšom modeli Alzheimerovej choroby pri liečbe N-termmálnych fragmentov Αβ peptidov a protilátok, ktoré sa viažu na tieto fragmenty, ale nie pri liečbe Αβΐ3-28 fragmentomkonjugovaným na ovčie anti-myšie IgGalebo pri použití protilátky proti 13-28 fragmentu, protilátky 266. Bolo zistené, že protilátky proti N-koncu prekonávajú hematoencefalitickú bariéru a indukujú fagocytózu amylordových plakov v pokusoch in vitro.

WO 00/72876 opisuje v podstate to isté čo WO 00/72880 a týka sa imunizácie zložkami amyloidových fibril samotnými.

WO 00/77178 opisuje protilátky, ktoré katalyzujú hydrolýzu D-amyloidu. vrátane protilátok namierených proti zmesi fenylalanín-statínových prechodných zlúčenín Cys-Aβlo-25 statínPhei9-Phe2o aCys-Aβlo-25 statín Phe2o-Ala2i a protilátky proti Αβιο-25 s redukovanou amidovou väzbou medzi Phei9 a Phe2o. Táto prihláška

S K 288723 B6 spomína sekvestrovanie Αβ, ale ide o špekuláciu, pretože nie je uvedený žiadny dôkaz takéhoto sekvestrovania. Ďalej, prihláška neuvádza žiadny dôkaz in vivo, že podanie protilátky spôsobuje vylučovanie Αβ z centrálneho nervového systému, interferuje s tvorbou plakov, redukuje tvorbu plakov, tvorí komplexy medzi protilátkou a Αβ v tkanivách alebo ovplyvňuje kognitívne funkcie.

Bolo zistené, že jednou dráhou Αβ metabolizmu je transport z CNS do plazmy (Zlokovic, B. V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883). Ďalej bolo zistené, že Αβ v plazme môže prenikať cez hematoencefalitickú bariéru a vstupovať do mozgu Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Tiež bolo zistené, že podanie niektorých polyklonálnych a monoklonálnych Αβ protilátok znižuje deponovanie Αβ v amyloidových plakoch v APPV717F transgénnom myšom modeli Alzheimerovej choroby (Bard, F. et. al., Náture Med. (2000) 6:916-919); ale uvádzalo sa, že toto je spôsobené tým, že niektoré anti-Αβ protilátky prechádzajúce hematoencefalickou bariérou stimulujú fagocytózu amyloidových plakov mikrogliami. V Bardových pokusoch testy na rezoch mozgu ex vivo ukázali, že prítomnosť Αβ protilátky, spoločne s exogénne pridanými mikrogliami, indukuje fagocytózu Αβ, čo vedie k odstráneniu Αβ depozitov.

Koncentrácie tak solubilného Αβ4ο, ako Αβ42 v CSF a krvi môžu byť ľahko zistené s použitím štandardných testov s použitím protilátky namierenej proti epitopomv Αβ reťazci. Takéto testy sú opísané, napríklad, v U.S. patentoch 5,766,846; 8,837,672 a 5,593,846. Tieto patenty opisujú produkciu myšej monoklonálnej protilátky k centrálnej doméne Αβ peptidu, tá obsahuje epitopy okolo a vrátane pozícií 16 a 17. Tiežboh opísané protilátky namierené proti N-terminálnemu regiónu. Bolo zistené, že niektoré monoklonálne protilátky sú imunoreaktívne s pozíciami 13-28 Αβ peptidu; tieto sa neviažu na peptid obsahujúci pozície 17-28, a preto - podľa uvedených patentov - že tieto protilátky sa viažu na tento región, vrátane pozícií 16-17 (namiesto alfa-sekretázy). Medzi protilátky, o ktoiých je známe, že sa viažu na región medzi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, patria myšie protilátky 266, 4G8 a 1C2.

Neočakávane sa zistilo, že podanie 266 protilátky veľmi rýchlo a takmer úplne obnovuje kognitívne funkcie (pamäť) 24-mesačných licinizygotných transgénnych myší (APP V717F). Ďalej, protilátka nemá vlastnosti, ktoré sa v odbore uvádzajú ako nutné na to, aby bola protilátka účinná pri liečbe Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu a iných ochorení súvisiacich s Αβ peptidom Na prekvapenie s a pozorovalo, že protilátky, ktoré sa viažu na Αβ medzi pozíciami 13 a 28 (266 a 4G8), sú schopné sekvestrovať solubilné formy Αβ z viazaných, cirkulujúcich foriem v krvi, a že periférne podanie protilátky 266 vedie k rýchlemu vylučovaniu relatívne veľkých množstiev Αβ peptidu z CNS do plazmy. Toto vedie k zmene klírens solubilného Αβ, prevencii tvorby plakov, a - čo je najviac prekvapivé - k zlepšeniu kognitívnych funkcií, i bez nutnej redukcie Αβ amyloidových plakov, akéhokoľvek významného prekonávania hematoencefalitickej bariéry, väzby na plaky, aktivácie bunkových mechanizmov alebo väzby s vysokou afinitou na agregovaný Αβ.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je farmaceutický prostriedok obsahujúci humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na použitie na prevenciu alebo liečbu predklinickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby, kde uvedená protilátka obsahuje: a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené ammokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

5 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) alebo

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a región úseku kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulínového ľahkého reťazca, a

S K 288723 B6

b) ťažký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Ty r Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

1015

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) alebo

1015

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a sekvenciu úseku kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ťažkého reťazca.

Predmetom tohto vynálezu je ďalej farmaceutický prostriedok obsahujúci humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na použitie na prevenciu, liečbu alebo reverziu kognitívneho deficitu pri subjekte, ktorému bola diagnostikovaná prcdklinická alebo klinická Alzheimerova choroba, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) alebo

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a región úseku kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ľahkého reťazca a

b) ťažký reťazec obsahujúcitri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

1015

Gn íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gy (SEQ ID NO: 5) alebo

1015

- CDR3 ťažkého reťazca:

Výhodné uskutočnenie každého z farmaceutických prostriedkov na uvedené použitie spočíva v tom, že protilátka obsahuje CDR1 ľahkého reťazca:

S K 288723 B6

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 ťažkého letezca:

10 15

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).

Výhodné uskutočnenie každého z farmaceutických prostriedkov na použitie uvedených skôr spočíva v tom, že humanizovaná protilátka obsahuje variabilný región ľahkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu:

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly

1015

Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser

2530

Asp Gly Asn Ala TyrLeu His Trp PheLeu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

4045

Pro Xaa Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

5560

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He

70 7580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser

9095

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu He Lys

100 105110

Arg (SEQ ID NO: 7), kde

Xaa v pozícii 2 je Val alebo He;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Thr,

Xaa v pozícii 14 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 15 je Leu alebo Pro;

Xaa v pozícii 30 je íle alebo Val;

Xaa v pozícii 50 je Agr, Gin alebo Lys;

Xaa v pozícii 88 je Val alebo Leu;

Xaa v pozícii 105 je Gin alebo Gly;

Xaa v pozícii 108 je Lys alebo Arg a

Xaa v pozícii 109 je Val alebo Leu;

a variabilný región ťažkého reťazca obsahujúciďalej uvedenú sekvenciu:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

2530

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val

4045

Ala Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp AsnXaa Xaa Asn ThrLeu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

100 105110 (SEQ ID NO: 8), kde

Xaa v pozícii 1 je Glu alebo Gin;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Leu;

Xaa v pozícii 46 je Glu, Val, Asp alebo Ser;

Xaa v pozícii 63 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr,

Xaa v pozícii 76 je Lys alebo Arg;

S K 288723 B6

Xaa v pozícii 86 je Glu alebo Asp a

Xaa v pozícii 107 je Leu alebo Thr.

Výhodné uskutočnenie použitia uvedeného farmaceutického prostriedku v protilátke, ktorá má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 9 a variabilného regiónu ťažkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 10.

Výhodné uskutočnenie uvedeného farmaceutického prostriedku spočíva v protilátke, ktorá má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 11 a variabilného regiónu ťažkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 12.

Predmetom tohto vynálezu je tiež použitie farmaceutického prostriedku obsahujúceho humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na výrobu liečiva na prevenciu alebo liečenie predklinickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby, kde uvedená protilátka obsahuje:

- CDR1 ľahkého reťazca:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a región úseku kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského mrunoglobulínového ľahkého reťazca a

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

1015

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a sekvencie úseku kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ťažkého reťazca.

Predmetom tohto vynálezu je tiež použitie farmaceutického prostriedku obsahujúceho humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na výrobu liečba na prevenciu, liečenie alebo reverziu kognitívneho deficitu pri subjekte, ktorému bola diagnostikovanápredklinická alebo klinická Alzheimerova choroba, kde uvedená protilátka obsahuje: a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His

S K 288723 B6 (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a región úseku kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ľahkého reťazca a b) ťažký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené ammokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Ty r Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) alebo

1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je farmaceutický prostriedok na použitie, kde protilátka obsahuje CDR1 ľahký reťazec:

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 ťažký reťazec:

10 15

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je použitie vymedzeného farmaceutického prostriedk, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilný región ľahkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu: Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser

2530

Asp Gly Asn Ala TyrLeu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

4045

Pro Xaa Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

5560

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He

70 7580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser

9095

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu íle Lys

100 105110

Arg (SEQ ID NO: 7), kde

Xaa v pozícii 2 je Val alebo íle;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Thr,

Xaa v pozícii 14 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 15 je Leu alebo Pro;

S K 288723 B6

Xaa v pozícii 30 je íle alebo Val;

Xaa v pozícn 50 je Arg, Gbi alebo Lys;

Xaa v pozícn 88 je Val alebo Leu;

Xaa v pozícii 105 je Gin alebo Gly; Xaa v pozícn 108 je Lys alebo Arg a Xaa v pozícii 109 je Val alebo Leu; a variabilný región ťažkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu: Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ThrPhe Ser Arg Tyr

2530

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val

4045

Ala Gin He Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp AsnXaa Xaa Asn ThrLeu Tyr

70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

100 105110 (SEQ ID NO: 8), kde

Xaa v pozícii 1 je Glu alebo Gin; Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Leu;

Xaa v pozícii 46 je Glu, Val, Asp alebo Ser;

Xaa v pozícii 63 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr,

Xaa v pozícii 76 je Lys alebo Arg;

Xaa v pozícii 89 je Glu alebo Asp a Xaa v pozícii 107 je Leu alebo Thr.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je použitie farmaceutického prostriedku uvedeného v predchádzajúcom odseku, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca uvedenú v SEQ IDNO: 9 a variabilného regiónu ťažkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 10.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je použitie farmaceutického prostriedku uvedeného v ktoromkoľvek z uvedených odsekov, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 11 a variabilného regiónu ťažkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 12.

Ďalej sa opisuje predmetný vynález v širších súvislostiach. Sú tiež uvedené porovnávacie údaje.

Výnález poskytuje humanizované protilátky alebo ich fragmenty, ktoré pozitívne ovplyvňujú kognitívne funkcie pri chorobách asociovaných s Αβ, ako je klinická alebo predklinická Alzheimerova choroba, Downov syndróm a klinická alebo predklinická cerebrálna amyloidová angiopatia. Protilátky alebo ich fragmenty nemusia prenikať hematoencefalickou bariérou, viazať sa na amyloidové plaky, aktivovať bunkovú reakciu alebo redukovať amyloidové plaky. V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky a ich fragmenty, ktoré sekvestrujú Αβ peptid z viazanej, cirkulujúcej formy v krvi, a menia klirens solubilných a viazaných foriem Αβ v centrálnom nervovom systéme a plazme. V inom aspekte a viazaných foriem Αβ v centrálnom nervovom systéme a plazme. V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky a ich fragmenty, kde humanizované protilátky sa špecificky viažu na epitop medzi aminokyselinami 13 a 28 Αβ molekuly. V inom aspekte vynález poskytuje humanizované protilátky a ich fragmenty, kde CDR sú odvodené od my šej monoklonálnej protilátky 266 a kde si protilátky približne zachovávajú väzbové vlastnosti myšej protilátky a majú in vitro a in vivo vlastnosti funkčne ekvivalentné myšej protilátke (sekvencia SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 6). V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky a ich fragmenty, kde variabilné regióny majú sekvencie obsahujúce CDR z my šej protilátky 266 a špecifické ľudské pracovné sekvencie (sekvencia SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10), kde si protilátky približne zachovávajú väzbové charakteristiky my šej protilátky a majú in vitro a in vivo vlastnosti funkčne ekvivalentné myšej protilátky 266. V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje humanizované protilátky a ich fragmenty, kedy ľahký reťazec má SEQ ID NO: 11 a ťažký reťazec má SEQ ID NO: 12.

Súčasťou predkladaného vynálezu sú tiež polynukleotidové sekvencie, ktoré kódujú humanizované protilátky alebo ich fragmenty opísané skôr, vektory obsahujúce polynukleotidové sekvencie kódujúce humanizované protilátky alebo ich fragmenty, hostiteľské bunky transformované vektormi alebo inkorporujúce polynukleotidy, ktoré exprimujú humanizované protilátky alebo ich fragmenty, farmaceutické prípravky humanizovanej protilátky a ich fragmentov opísaných skôr, a spôsoby výroby apoužitia týchto prípravkov.

S K 288723 B6

Takéto humanizované protilátky a ich fragmenty sú použiteľné na sekvestrovanie Αβ u ľudí; na liečbu a prevenciu ochorení a stavov charakterizovaných Αβ plukmi alebo Αβ toxicitou v mozgu, ako je Alzheimerova choroba, Downov syndróm a cerebrálna amyloidová angiopatia u človeka; na diagnostiku týchto ochorení u človeka; a na určenie toho, či bude ľudský jedinec odpovedať na liečbu ľudskou protilátkou proti Αβ.

Podanie vhodnej humanizovanej protilátky in vivo pre sekvestráciu Αβ peptidu cirkulujúceho v biologických tekutinách je použiteľné na preventívnu a terapeutickú liečbu stavov spojených s tvorbou difúznych, neurotických a cerebrovaskulámych plakov obsahujúcich Αβ v mozgu. Humanizované protilátky, vrátane ich imunologický reaktívnych fragmentov, spôsobujú odstránenie Αβ peptidu z makro molekulárny ch komplexov, ktoré sa normálne podieľajú na ich transporte v telesných tekutinách do a z miest, v ktoiých môžu byť tvorené plaky alebo kde môžu byť toxické. Ďalej, sekvestrovanie plazmatického Αβ peptidu pomocou protilátky alebo jej fragmentu pôsobí ako Jamka“, ktorá účinne sekvestruje solubilný Αβ peptid v plazmatickom kompartmente a indukuje presun Αβ do plazmy z regiónov v centrálnom nervovom systéme (CNS). Sekvestrovaním Αβ v krvi sa zvyšuje vylučovanie Αβ z mozgu a bráni sa ukladaniu solubilného Αβ v insolubilných plukoch a tvorbe toxických solubilných typov Αβ v mozgu. Ďalej, insolubilný Αβ v plukoch, ktoiý je v rovnováhe so solubilným Αβ, môže byť odstránený z mozgu prostredníctvom sekvestrácie v krvi. Sekvestrovaním Αβ peptidu pomocou protilátky tiež zvyšuje jeho vylučovunie u inhibuje toxické účinky solubilného Αβ v mozgu u vznik u d’ulšiu ukumuláciu insolubilného Αβ vo forme amyloidu v plukoch. Protilátky podľu predkluduného vynálezu neprenikujú hemutoencefulickou buriérou vo veľkých množstvách (0,1 % plazmutickej koncentrácie). Ďulej, humunizovuné protilátky podľu predkluduného vynálezu nemusiu p ri periférnom poduní nu dosiuhnutie účinku vyvolávuť bunkovú imunitnú reukciu v mozgu ulebo cirkuláciu pri väzbe nu Αβ peptid. Ďulej, pri periférnom poduní sunemusí nu dosiuhnutie účinku viazať naagregovaný Αβ peptid v mozgu.

Tuk je v jednom uspekte vynález zumeruný nu spôsob liečby u nu prevenciu stuvov churukterizovuných tvorbou plukov obsuhujúcich bcta-amyloidový proteín u človeka, kde tento spôsob zahŕňa podanie, výhodne periférne, terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva humanizovanej monoklonálnej protilátky alebo jej imunologický reaktívneho fragmentu, kde táto protilátka sa špecificky viaže na stredný región Αβ peptidu. V inom aspekte je vynález zameraný na spôsob inhibície tvorby amyloidových plakov a na odstránenie amylordových plakov u človeka, kde tento spôsob zahŕňa podanie účinného množstva humanizovanej protilátky, ktorá sekvestruje Αβ peptid z cirkulujúcej formy v krvi a indukuje vylučovanie peptidu z mozgu, rovnako ako mení Αβ klírens v plazme a mozgu, človeku, ktoiý potrebuje takúto inhibíciu. V ďalších aspektoch je vynález zameraný na takéto humanizované protilátky, vrátane ich imunologický účinných častí a na spôsoby ich prípravy.

Vynález sa tiež týka spôsobov na zastavenie zhoršovania kognitívnych funkcií, zlepšenie kognitívnych funkcií, liečbu zhoršenia kognitívnych funkcií a prevenciu zhoršenia kognitívnych funkcií u jedinca s diagnostikovanou klinickou alebo predklinickou Alzheimerovou chorobou, Downovým syndrómom alebo klinickou alebo predklinickou cerebrálnou amyloidovou angiopatiou, ktorá zahŕňa podanie účinného množstva humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu danému jedincovi.

Vynález tiež zahŕňa použitie humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu na výrobu liečiva, vrátane dlhodobej expresic rekombinantnej sekvencie protilátky alebo protilátkového fragmentu v ľudských tkanivách, na liečbu, prevenciu alebo reverziu Alzheimerovej choroby, Downovho syndrómu alebo cerebrálnej amylordovej angiopatie; na liečbu, prevenciu alebo reverziu zhoršovania kognitívnych funkcií pri klinickej alebo predklinickej cerebrálnej amylordovej angiopatie; alebo na inhibíciu tvorby amyloidových plakov, alebo pôsobenie toxických solubilných typov Αβ u človeka.

Vynález sa týka prekvapivého zistenia, že v priebehu krátkeho času po podaní protilátky podľa predkladaného vynálezu dôjde k vylúčeniu relatívne veľkých množstiev Αβ z centrálneho nervového systému do krvi. Preto predkladaný vynález zahŕňa spôsoby na hodnotenie odpovede ľudského jedinca na liečbu protilátkou, ktorá sa viaže na Αβ alebo jeho fragment, ktoré zahŕňa: a) podanie protilátky alebo jej fragmentu jedincovi a b) merame koncentrácie Αβ v krvi jedinca.

Vynález tiež zahŕňa spôsob liečby ľudského jedinca protilátkou, ktorá sa viaže na Αβ alebo jeho fragment, ktorý zahŕňa: a) podanie prvej dávky protilátky alebo jej fragmentu jedincovi; b) v priebehu 3 hodín až 2 týždňov po podaní prvej dávky meranie koncentrácie Αβ v krvi jedinca; c) pokiaľ je to nutné, vypočítanie druhej dávky protilátky alebo jej fragmentu podľa výsledkov z kroku b), kde druhá dávka je rovnaká alebo iná ako prvá dávka a d) podanie druhej dávky protilátky alebo jej fragmentu.

Vynález tiež zahŕňa spôsob hodnotenia účinnosti protilátky, ktorá sa viaže na Αβ alebo jeho fragment, v mhibícn alebo prevenen tvorby Αβ amyloidových plakov, v redukcn Αβ amyloidových plakov, v redukcň účinkov toxických solubilných typov Αβ alebo v liečbe stavov a ochorení asociovaných s Αβ plakmi. u človeka, ktoiý zahŕňa: a) získanie prvej vzorky plazmy alebo CSF jedinca; b) meranie základnej koncentrácie Αβ v prvej vzorke; c) podanie protilátky alebo jej fragmentu jedincovi; d) v priebehu 3 hodín až 2 týždňov po podaní protilátky alebo jej fragmentu získanie druhej vzorky plazmy alebo CSF jedinca a e) merame koncentrácie Αβ v druhej vzorke; kde účinnosť je hodnotená podľa množstva Αβ naviazaného na protilátku v krvi a podľa koncentrácie Αβ v CSF.

S K 288723 B6

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje percento Αβ peptidu v ľudskom mozgovomiechovom moku, ktorý sa získa cez dialyzačnú membránu pomocou MAb 266 v závislosti od hraničnej hodnoty molekulovej hmotnosti dialyzačnej membrány.

Obr. 2 ukazuje koncentrácie ΑβΤοίηΙ v plazme APP^V717F transgénnych myší po injekciibuď 200 pg, alebo 600 pg MAb 266 v závislosti od času.

Obr. 3A ukazuje množstvo uloženého Αβ peptidu v kortcxc APP^C717F tiansgénnych myší liečených salinickým roztokom, myším IgG alebo MAb 266. Obr. 3B ukazuje koreláciu týchto výsledkov s pôvodom

Obr. 4 ukazuje polynukleotidové sekvencie na expresiu humanizovaného 266 ľahkého reťazca z plazmidu pVk-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovanom humanizovanom 266 ľahkom reťazci (čo zodpovedá SEQ ID NO: 11 v zrelom stave). Je tu znázornený pVk-Hu266 polynukleotidovej sekvencie na expresiu humanizovaného 266 ľahkého reťazca, s kódmi jednotlivých aminokyselin pre exprimovaný humanizovaný 266 ľahký reťazec; kompletná sekvencia génu pre ľahký reťazec Hu266 je lokalizovaná medzi Mlul a BamHI miestami v pVk-Hu266. Vk a Ck cxóny sú translatované do jednopísmenového kódu; bodky ukazujú translačný terminančný kodóm Zrelý ťažký reťazec začína dvojito podtrhnutou kyselinou asparágovou (D) a iónové sekvencie sú značené kurzívou.

Obr. 5 ukazuje polynukleotidové sekvencie na expresiu humanizovaného 266 ťažkého reťazca z plazmidu pVgl-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovanom humanizovanom 266 ťažkom reťazci (čo zodpovedá SEQ ID NO: 12 v zrelom stave). Je tu znázornený pVgl-Hu266 polynukleotidovej sekvencie pre expresiu humanizovaného 266 ťažkého reťazca, s kódmi jednotlivých aminokyselín pre exprimovaný humanizovaný 266 ťažký reťazec; kompletná sekvencia génu pre ťažký reťazec Hu266 je lokalizovaná medzi Mlul a BamHI miestami v pVgl-Hu266. Vh a Ch cxóny sú translatované do jednopísmenového kódu; bodky ukazujú translačný teminačný kodóm Zrelý ťažký reťazec začína dvojito podtrhnutou kyselinou glutámovou (E) a iónové sekvencie sú značené kurzívou.

Obr. 6 je mapa plazmidu pVk-Hu266.

Obr. 7 je mapa plazmidu pVgl-Hu266.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Spôsoby uskutočnenia vy nálezu

Αβ peptidy, ktoré cirkulujú v biologických kvapalinách, predstavujú karboxy terminálny región piekurzorového proteínu kódovaného na chromozóme 21. Z výsledkov pokusov in vitro bolo opísané, že Αβ peptid má zlú rozpustnosť vo fyziologických roztokoch, pretože obsahuje reťazec hydrofóbnych aminokyselín, ktoré sú súčasťou regiónu, ktorý zakotvuje jeho ďalší prekurzor do bunkových lipidových membrán. Preto nie je prekvapivé, že cirkulujúci Αβ peptid je za normálnych okolností v komplexe s inými skupinami, ktoré bránia jeho agiegácii. Toto spôsobuje obtiaže pri detekcii cirkulujúcich Αβ peptidovv biologických kvapalinách.

Uvedené patenty (U. S. patenty 5,766,846; 5,837,672 a 5,593,846) opisujú prípravu protilátky, vrátane monoklonálnej protilátky, označenej ako kloň 266, ktorá je namierená k a špecificky sa viaže na peptid obsahujúci aminokyseliny 13-28 Αβ peptidu. Predkladatelia vynálezu zistili, že protilátky, ktoré sa viažu na tento región, oproti protilátkam, ktoré sa viažu na akékoľvek iné miesto ammokyselinovej sekvencie Αβ, sú schopné veľmi účinne sekvestrovať solubilný Αβ peptid z makromolekulových komplexov. Táto sekvestrácia spôsobuje vylučovanie Αβ peptidu z CNS, mení jeho klírens v CNS a plazme, a redukuje jeho schopnosť tvoriť plaky. Preto sú protilátky s touto špecifickou modifikované tak, aby bola znížená ich imunogenicita pomocou premeny na humanizované formy, možnou liečbou - tak profylaktickou, ako terapeutickou, stavov spojených s tvorbou beta-amylordových plakov. Medzi takého stavy patrí, ako bolo uvedené, predklinická a klinická cerebrálna amyloidová angiopatia.

Termín „liečba“, ako je tu použitý, zahŕňa terapeutickú liečbu, pri ktorej už existuje liečené ochorenie, rovnako ako profylaktickú liečbu - t. j. prevenciu alebo zmiernenie možného budúceho ochorenia.

Termín „monoklonálne protilátky, ktoré sa viažu na stredný región Αβ peptidu“, označuje monoklonálne protilátky (MAb alebo MAbs), ktoré sa viažu na aminokyselinovú sekvenciu predstavujúcu epitop obsiahnutý medzi pozíciami 13-28 Αβ. Nemusí pokryť celý región. Pokiaľ sa protilátka viaže na aspoň epitop v tomto regióne (predovšetkým vrátane miesta pre x-sekretázu 16-17 alebo miesta, na ktoré sa viaže protilátka 266), tak je protilátka účinná v spôsobe podľapredkladaného vynálezu.

Termín „protilátka“ označuje monoklonálnu protilátku samu osebe, alebo jej imunologický účinný fragment, ako je ΡΑβ, ΡΑβ' alebo Ρ(Αβ')2 fragmentu. V niektorých kontextoch sú fragmenty špecificky uvedené; ale, je potrebné si uvedomiť, že bez ohľadu na to, či sú uvedené fragmenty, zahŕňa termín „protilátka“ takéto fragmenty, rovnako ako jednoreťazcové formy. Pokiaľ siproteín zachováva schopnosť špecifickej väzby pre zamýšľaný cieľ, a v tomto prípade schopnosť sekvestrácie Αβ peptidu zproteínových nosičov v krvi, je zahr

S K 288723 B6 nutý v termíne „protilátka“. Termín „protilátka“ tiež zahŕňa, napríklad jednoreťazcové formy, obvykle označované ako Fv regióny, protilátky s touto špecifickou. Výhodne, ale nie nutne, sú protilátky použiteľné v predkladanom vynáleze produkované rekombinantne, pretože pri úprave typickej myšej alebo inej nonľudskej protilátky s vhodnou špecifickou je nutná jej premena na humanizovanú formu. Protilátke môžu a nemusia byť glykozylované. hoci glykozylované protilátky sú výhodné. Protilátky sú správne zosieťované prostredníctvomdisulfidových väzieb, ako je dobre známe v odbore.

Je známe, že základná štruktúrna jednotka protilátky je tvorená tetrametrom. Každý tetrameter je tvorený dvoma identickými párni polypeptidových reťazcov, kde každý pár je tvorený jedným „ľahkým“ (približne 25 kDa) a jedným ..ťažkým reťazcom (približne 50 - 70 kDa). Amino-koncová časť každého reťazca obsahuje variabilný región veľkosti približne 100 až 110 alebo viac aminokyselín primáme zodpovedný za rozpoznanie antigénu. Karboxy -koncová časť každého reťazca definuje konštantný región primáme zodpovedný za efektorové funkcie.

Ľahké reťazce sa delia na gamma, mu, alfa a lambda. Ťažké reťazce sa delia na gamma, mu, alfa, delta a epsilon a definujú izotyp protilátky, ako IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, v príslušnom poradí. V ľahkých a ťažkých reťazcoch sú variabilné a konštantné regióny spojené „J“ regiónom tvoreným približne 12 alebo viac aminokyselinami, kde ťažký reťazec tiež obsahuje „T“ región tvorený približne 10 ďalšími aminokyselinami.

Variabilné regióny každého ľahkého/ťažkého páru reťazcov tvoria väzbové miesto protilátky. Preto má intaktná protilátka dve väzbové miesta. Reťazce majú rovnakú všeobecnú štruktúru tvorenú dvoma relatívne konzervovanými pracovnými regiónmi (FR) spojenými tromi hypervariabilnými regiónmi, ktoré sa tiež označujú ako regióny určujúce komplementárnu alebo CDR. CDR z dvoch reťazcov každého páru sú usporiadané pomocou pracovných regiónov, čo umožňuje väzbu na špecifický epitop. OdN-koncakC-koncu obsahujú tak ľahký, ako ťažký reťazec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Priradenie aminokyselín ku každej doméne je v súlade s dobre známou konvenciou (KApat „Sequences of Proteins ofimunological interest“ National Institutes of Health, Bethesda, Md„ 1987 a 1991; Chothia, et al„ J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al„ Náture 342:878-883 (1989)).

Ako je v odbore známe, môžu byť monoklonálne protilátky ľahko pripravené s vhodnou špecifickou s použitím štandardných techník imunizácie cicavcov, prípravy hybridómov z buniek produkujúcich protilátky od uvedených cicavcov a kultiváciou hybridómov alebo imortalizovaných buniek na hodnotenie ich špecificity. V tomto prípade môžu byť protilátky pripravené imunizáciou človeka, králika, krysy alebo myšipeptidom reprezentujúcim epitop obsahujúci 13-28 región Αβ peptidu alebo jeho vhodný subregión. Materiály na rekombinantnú úpravu môžu byť získané získaním nukleotidovej sekvencie kódujúcej požadovanú protilátku z hydridómu alebo iných buniek, ktoré ju produkujú, táto nukleotidová sekvencia za získania nukleotidu v humanizovanej forme.

Termín „humanizovaná protilátka“ označuje protilátku, ktorá je zložená čiastočne alebo úplne z aminokyselinovej sekvencie odvodenej od ľudskej protilátky pozmenením sekvencie protilátky majúcej nonľudské regióny určujúce komplementaritu (CDR). Najjednoduchšia alterácia môže spočívať v substitúcu konštantného regiónu ľudskej protilátky za my ši konštantný región, za vzniku ľudskej/ myšej chiméry, ktorá môže mať dostatočne nízku imunogenicitu pre to, aby bola prijateľná na farmaceutické použitie. Výhodne sú variabilný región protilátky a i CDR tiež humanizované s použitím techník, ktoré sú dobre známe v odbore. Pracovné regióny variabilných regiónov sú substituované príslušnými ľudskými pracovnými regiónmi s ponechaním non-ľudských CDR v podstate bezo zmien alebo nahradením CDR sekvenciou odvodenou z ľudského genómu. Úplne ľudské protilátky sú produkované geneticky modifikovanými myšami, ktorých imunitné systémy boli pozmenené tak, aby zodpovedali ľudským imunitným systémom Ako bolo uvedené, je v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu dostačujúce použitie imunologický špecifického fragmentu protilátky, vrátane fragmentov reprezentujúcich jednoreťazcové fo my.

Humanizovaná protilátka opäť označuje protilátku obsahujúcu ľudský pracovný región, aspoň jeden CDR z non-ľudskej protilátky, a v ktorej akýkoľvek prítomný konštantný región je v podstate identický s ľudským imunoglobulínovým konštantným regiónom, t. j. aspoň približne z 85 - 90 %, výhodne aspoň z 95 % identický. Preto sú všetky časti humanizovanej protilátky, s výnimkou CDR, v podstate identické s príslušnými časťami jednej alebo viacerých prirodzených ľudských imunoglobulínových sekvencu. Napríklad, humanizovaný imunoglobulín obvykle neoznačuje protilátku tvorenú chimérickým myším variabilným regiónom/ľudským konštantným regiónom

Humanizované protilátky majú aspoň tri potenciálne výhody pred non-ľudskými a chimérickými protilátkami pri použití v ľudskej terapn:

1. Vzhľadom na to, že efektorová časť je ľudská, môžu lepšie interagovať s ľudským imunitným systémom (napríklad účinnejšie likvidovať cieľové bunky pomocou cytotoxicity závislej od komplementu (CDC) alebo bunkovej cytotoxicity závislej od protilátok (ADCC)).

2. Ľudský imunitný systém by nemal rozpoznávať pracovný región alebo C región humanizovanej protilátky ako cudzí, a preto by protilátková reakcia proti takejto injikovanej protilátke mala byť menšia ako proti úplne cudzorodej non-ľudskej protilátke alebo a čiastočne cudzorodej chimérickej protilátke.

S K 288723 B6

3. Bolo opísané, že injíkované non-ľudské protilátky majú polčas v ľudskej cirkulácii omnoho kratší, ako je polčas ľudských protilátok. Injíkované humanizované protilátky budú mať polčas v podstate identický ako prirodzené ľudské protilátky, čo umožní podanie nižších dávok a menej často.

Návrh humanizovaných imunoglobulínov môže byť uskutočnený nasledujúcim spôsobom. Keď spadá aminokyselina do nasledujúcej kategórie, tak môže byť aminokyselina pracovného rámca ľudského imunoglobulínu (akceptorového imunoglobulínu) nahradená aminoky selinou pracovného regiónu z nonľudského imunoglobulínu poskytujúceho CDR (donorového imunoglobulínu):

(a) aminokyselina v ľudskom pracovnom regióne akceptorového imunoglobulínu je neobvyklá pre ľudský imunoglobulín v tejto pozícii, zatiaľ čo zodpovedajúca aminokyselina v donorovom imunoglobulíne je typická pre ľudský imunoglobulín v tejto pozícii;

(b) pozícia aminokyseliny je bezprostredne susediaca s jedným z CDR; alebo (c) akýkoľvek atóm vedľajšieho reťazca pracovnej aminokyseliny je vo vzdialenosti približne 5-6 angstromov (centmm-centrum) od akéhokoľvek atómu CDR aminokyseliny v trojrozmernom modeli imunoglobulínov (Queen, et. al., op. cit., a co, et aľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)). Keď je každá aminokyselina v ľudskom pracovnom regióne akceptorového imunoglobulinu a príslušná aminokyselina v donorovom imunoglobulíne neobvyklá pre ľudský imunoglobulín v tejto pozícii, tak je aminokyselina nahradená aminokyselinou typickou pre ľudský imunoglobulín v tejto pozícii.

Výhodná humanizované protilátka je humanizovaná forma my šej protilátky 266. CDR humanizované 266 majú nasledujúce aminokyselinové sekvencie:

ľahký reťazec CDR1:

1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) ľahký reťazec CDR2:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:2) ľahký reťazec CDR3:

Ser Gin Ser ThrHis Val Pro Trp Thr (SEQ: ID NO:3) ťažký reťazec CDR1:

Arg Tyr Ser Met Ser(SEQ ID NO:4) ťažký reťazec CDR2:

1015

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5) a ťažký reťazec CDR3:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6).

Výhodný variabilný región ľahkého reťazca humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej pracovný región pochádza z ľudských Vk segmentov DPK18 a J segmentu Jkl, s niekoľkými aminokysclinovými substitúciami na konvenčné aminokyseliny v rovnakej ľudskej V podskupine na redukciu potenciálnej imunogenicity:

1015

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa

2530

Gly Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa

4045

Tyr Ser Asp Gy Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gn Lys Pro

5560

Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

7075

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

8590

Phe Thr Leu Lys íle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val

100105

Tyr TyrCys Ser Gin Ser ThrHis Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa

110

Gly Thr Xaa Xaa Glu He Lys Arg (SEQ ID NO:7), kde:

S K 288723 B6

Xaa v pozícii 2 je Val alebo íle;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Thr,

Xaa v pozícii 14 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 15 je Leu alebo Pro;

Xaa v pozícii 30 je íle alebo Val;

Xaa v pozícii 50 je Arg, Gin alebo Lys;

Xaa v pozícii 88 je Val alebo Leu;

Xaa v pozícii 105 je Gin alebo Gly;

Xaa v pozícii 108 je Lys alebo Arg a

Xaa v pozícii 109 je Val alebo Leu.

Výhodný variabilný región ťažkého reťazca humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej pracovný región pochádza z ľudských VH segmentov DP53 a J segmentu JH4, s niekoľkými ammokyselinovými substitúciami na konvenčné aminokyseliny v rovnakej ľudskej V podskupine na redukciu potenciálnej imunogenicity:

1015

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

2530

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ThrPhe Ser

4045

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

5560

Xaa Leu Val Ala Gin He Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

7075

Pro AspXaa Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Xaa

8590

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp

100105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO:8), kde:

Xaa v pozícii 1 je Glu alebo Gin;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Leu;

Xaa v pozícii 46 je Gin, Val, Asp alebo Ser;

Xaa v pozícii 63 je Thr alebo Ser,

Xaa v pozícii 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr,

Xaa v pozícii 76 je Lys alebo Mg;

Xaa v pozícii 89 je Glu alebo Asp a

Xaa v pozícii 107 je Leu alebo Thr.

Predovšetkým výhodný variabilný región ľahkého reťazca humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej pracovný región pochádza z ľudských Vk segmentov DPK18 a J segmentu Jkl, s niekoľkými ammokyselinovými substitúciami na konvenčné aminokyseliny v rovnakej ľudskej V podskupine na redukciu potenciálnej imunogenicity:

5 1015

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu

2530

Gly Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu íle

4045

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro

5560

Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu íle Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

7075

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

8590

Phe Thr Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

100105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin

110

Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg (SEQ ID NO:9).

S K 288723 B6

Predovšetkým výhodný variabilný región ťažkého reťazca humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej pracovný región pochádza zľudských VH segmentov DP53 a J segmentu JH4.

1015

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

2530

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

4045

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

5560

Glu Leu Val Ala Gn íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

7075

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala

8590

Lys Asn Thr Leu TyrLeu Gin Met Asn Ser leu Arg Ala Glu Asp

100105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

110

Thr Ala Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 10).

Výhodný ľahký reťazec pre humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu má aminokyselinovú sekvenciu:

5 1015

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu

2530

Gly Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Gin Ser Leu íle

4045

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro

5560

Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

7075

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

8590

Phe Thr Leu Lys íle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

100105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin

110 115120

Gly Thr Val Glu íle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

125 130135

Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala

140 145150

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe TyrPro Arg Glu Ala Lys

155 160165

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin

170 175180

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

185 190195

Ser Ser Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

200 205210

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val

215

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 11).

Výhodný ťažký reťazec pre humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu má aminokyselinovú sekvenciu:

1015

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

2530

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

4045

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gn Ala Pro Gly Lys Gly Leu

S K 288723 B6

5560

Glu Leu Val Ala Gin He Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

7075

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala

8590

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

110 115120

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

125 130135

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

140 145150

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

155 160165

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

170 175180

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

185 190195

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gn Thr Tyr He Cys

200 205210

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

215 220225

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

230 235240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250255

Lys Pro Lys Asp ThrLeu Met íle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

290 295300

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310315

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

320 325330

Cys Lys Val Ser AsnLys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr

335 340345

He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr

350 355360

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu

365 370375

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu

380 385390

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn AsnLys Thr Thr Pro

395 400405

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

410 415420

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys

425 430435

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser

440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ ID NO: 12).

Pre ľahké a ťažké reťazce humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu a pre humanizovanú 266 sú možné i iné sekvencie. Imunoglobulíny môžu obsahovať dva páry komplexov ľahký reťazec/ťažký reťazec, kde aspoň reťazec obsahuje jeden alebo viac myších regiónov určujúcich komplementaritu funkčne naviazaných na segmenty ľudského pracovného regiónu.

V inom aspekte sa predkladaný vynález týka rekombinantných polynukleotidov kódujúcich protilátky, ktoré - po expresii - obsahujú CDR ťažkého a ľahkého reťazca z protilátky podľa predkladaného vynálezu.

S K 288723 B6

Rovnako ako pre ľudský pracovný región je aminokyselinová sekvencia pracovného alebo variabilného nonľudského imunoglobulinu poskytujúceho CDR porovnávaná so zodpovedajúcimi sekvenciami v knižnici variabilných regiónov ľudského imunoglobulinu a je vybraná sekvencia majúca najvyššie percento identických s aminokyselinami. Príklady polynukleotidov, ktoré kódujú polypeptidové reťazce obsahujúce CDR pre ťažký a ľahký’ reťazec monoklonálnej protilátky 266, sú uvedené na obr. 4 a 5. Vdôsledku degenerácie kodónov a nekritických aminokyselmových substitúcií môžu byť za tieto polynukleotidové sekvencie zamenené iné sekvencie. Predovšetkým výhodné polynukleotidy podľa predkladaného vynálezu kódujú protilátky, ktoré po expresii - obsahujú CDR SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 6, alebo akékoľvek variabilné regióny SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10, alebo ľahký a ťažký reťazec SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12.

Polynukleotidy budú obvykle ďalej obsahovať polynukleotidové sekvencie riadiace expresiu operatívne naviazané na sekvencie kódujúce humanizovaný imunoglobulín, vrátane prirodzene asociovaných či heterológnych promótorových regiónov. Výhodne sú sekvencie riadiace expresiu eukaryotické promótorové systémy vo vektoroch schopných transformovať alebo transfekovať eukaryotické hostiteľské bunky, ale môžu byť použité tiež riadiace sekvencie pre prokaryotické hostiteľské bunky. Po inkorporácii vektora do vhodnej hostiteľskej bunkovej línie sa hostiteľské bunky propagujú za podmienok vhodných pre vysokú expresiu nukleotidovej sekvencie, a pokiaľ je to žiaduce, môže byť potom uskutočnený odber a prečistenie ľahkých reťazcov, ťažkých reťazcov, dimérov ľahký/ťažký reťazec alebo intaktné protilátky, ich väzbových fragmentov alebo iných foriem imunoglobulínov.

Nukleotidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu schopné cxprimovat' požadované humanizované protilátky môžu byť pripravené z mnohých rôznych polynukleotidov (genómovej alebo cDNA, RNA, syntetických oligonuklcotidov atď.) a zložiek (napr. V, J, D a C regiónov), rovnako ako s použitím rôznych techník. Spojenie vhodnej genómovej a syntetickej sekvencie je bežným spôsobom produkcie, ale môžu byť tiež použité cDNA sekvencie.

DNA sekvencie ľudského konštantného regiónu môžu byť izolované s použitím dobre známy ch techník z rôznych ľudských buniek, ale výhodne z imortalizovaných B-lymfocytov. CDR na produkciu imunoglobulínov podľa predkladaného vynálezu budú obdobne odvodené z non-ľudskej monoklonálnej protilátky viažucej sa na epitop medzi aminokyselinami 13 a 28 Αβ peptidu, kde tieto monoklonálne protilátky sú produkované v akomkoľvek vhodnom cicavčom zdroji, vrátane myší, králikov alebo iných stavovcov schopných produkovať protilátky dobre známymi spôsobmi, ako je opísané. Vhodnými zdrojovými bunkami pre polynukleotidové sekvencie a hostiteľskými bunkami pre expresiu a sekréciu imunoglobulínov sú bunky známe v odbore.

Okrem humanizovaných imunoglobulínov, ktoré boli opísané, môžu byť ľahko pripravené a vyrobené „v podstate homológne“ modifikované imunoglobulíny, s použitím rôznych rekombinantných DNA techník dobre známych odborníkom v odbore. Napríklad, pracovné regióny sa môžu líšiť od prirodzenej sekvencie v štruktúre primárnej sekvencie niekoľkými ammokyselinovými substitúciami, terminálnymi a intermediárnymi adíciami a deléciami, a podobne. Ďalej, rôzne ľudské pracovné regióny môžu byť použité samostatne alebo v kombinácii ako základ pre humanizované imunoglobulíny podľa predkladaného vynálezu. Všeobecne, modifikácia génu môže byť ľahko uskutočnená s použitím rôznych dobre známy ch techník, ako je miestne cielene mutagenéza.

Alternatívne môžu byť pripravené polypeptidové fragmenty obsahujúce len časť primárnej protilátky, kde tieto fragmenty majú jednu alebo viac aktivít imunoglobulinu (napr. fixáciu komplementu). Tieto polypeptidové fragmenty môžu byť produkované proteolytickým štiepením intaktnej protilátky s použitím spôsobov dobre známych v odbore, alebo inzerciou stop kodónov v požadovaných pozíciách do vektorov s použitím miestne cielenej mutagenézy, napríklad za CH1, čo vedie k produkcii ΕΑβ fragmentov alebo za pantový región, čo vedie k produkcii Ε(Αβ')2 fragmentov. Jednoreťazcové protilátky môžu byť produkované spojením VL a VH s použitím DNA linkeru.

Ako bolo uvedené, kódujúca nukleotidová sekvencia bude exprimovaná v hostiteľoch po operatívnom naviazaní sekvencie na (t. j. umiestnenie zaisťujúcom jej funkciu) sekvenciu riadiacu expresiu. Tieto expresné vektory sú obvykle replikovateľné v hostiteľských organizmoch buď ako epizómy, alebo ako integrálna súčasť chromozomálnej DNA hostiteľa. Všeobecne expresné vektory obsahujú selekčné markery, napr. tetracyklinový alebo neomycínový, umožňujúce detekciu buniek transformovaných požadovanou DNA sekvenciou.

E. coli je prokaryotický hostiteľ použiteľný na klonovanie polynukleotidov podľa predkladaného vynálezu. Medzi ďalšie použiteľné mikroorganizmy patria bacily, ako je Bacillus subtilus, a ďalšie enterobacteriacea; ako je Salmonella, Serratia a rôzne Pseudomonas species. V týchto prokaryotických hostiteľoch je možné tiež pripraviť expresné vektory, ktoré budú obsahovať sekvencie riadiace expresiu kompatibilnú s hostiteľskou bunkou (napr. sekvenciu rozpoznávajúcu počiatok replikácie). Ďalej, môže byť použitý akýkoľvek počet dobre známych promótorov, ako je laktózový promótorový systém, tryptofánový (tip) promótorový systém, beta-laktamázový promótorový systém alebo promótorový systém z fágu lambda. Promótory

S K 288723 B6 obvykle obsahujú sekvenciu riadiacu expresiu, voliteľne s operátorovou sekvenciou, a obsahujú sekvenciu väzbového miesta pre ribozóm a podobne, pie iniciáciu a dokončenie transkripcie a translácie.

Ďalšie mikróby, ako sú kvasinky, môžu byť tiež použité na expiesiu. Saccharomyces sú výhodnýmhostiteľom a môžu byť použité s vhodnými vektormi obsahujúcimi sekvencie riadiace expresiu, ako sú promótoiy, vrátane 3-fosfoglycerát-kinázového alebo z iných glykolitických enzýmov, sekvenciu rozpoznávajúcu počiatok replikácie, terminačné sekvencie a podobne.

Okrem mikroorganizmov môžu byť cicavčie tkanivové kultúry tiež použité na expresiu a produkciu polypeptidov podľa predkladaného vynálezu. Eukaiyotické bunky sú naozaj výhodné, pretože v odbore existuje mnoho vhodných hostiteľskýchbunkových línií schopných secemovať intaktné imunoglobulíny a medzi tieto línie patria CHO bunkové línie, rôzne COS bunkové línie, bunkové línie ovariálnych buniek, HeLa bunky, výhodne myelómové bunkové línie, transformované B-lymfocyty, ľudské bunkové línie z embryonálnych obličiek lebo hybridómy. Expresná vektory pre tieto bunky môžu obsahovať sekvencie na riadenie expresie, ako je sekvencia rozpoznávajúca počiatok replikácie, promótor, zosilňovač transkripcie a nutné miesta na spracovanie, ako sú väzbové miesta pre ribozómy, miesta na zostrih RNA, polyadenylačné miesta, sekvencie na ukončenie transkripcie. Výhodnými sekvenciami na riadenie transkripcie sú promótoiy získané z imunoglobulínových génov, SV40, adenovírusu, hovädzieho papilloma vírusu, cytomegalovírusu a podobne.

Vektory obsahujúce požadovanú nukleotidovú sekvenciu (napr. sekvencia kódujúca ťažký a ľahký reťazec a sekvencia riadiaca expresiu) môžu byť prenesené do hostiteľskej bunky dobre známymi spôsobmi, ktoré sú vybrané podľa typu hostiteľa. Napríklad pre prokaryotické bunky sa bežne používa transfekcia chloridom vápenatým, zatiaľ čo pie ostatné hostiteľské bunky sa bežne používa transfekcia s fosfoiečnanomvápenatým alebo elektroporácia.

Po c?q3rcsii môžu byť celé protilátky, ich diméry, jednotlivé ľahké a ťažké reťazce, alebo iné formy imunoglobulínov podľa predkladaného vynálezu, prečistené s použitím štandardných postupov, vrátane zrážania síranom amónnym, iónovej výmeny, afinitnej, reverznej, hydrofóbnej chromatograíie, gélovej elektroforézy a podobne. Výhodné sú významne prečistené imunoglobulíny majúce aspoň približne 90 až 95 % homogenitu, najvýhodnejšie sú na farmaceutické použitie imunoglobulíny majúce 98 až 99 % alebo vyššiu homogenitu. Po prečistení - čiastočnomalebo do požadovanej homogenity, môžu byť polypeptidy použité terapeuticky alebo profylaktický, ako je tu opísané.

Protilátky (vrátane imunologický reaktívnych fragmentov) sú podávané jedincom s rizikom alebo existenciou príznakov súvisiacich s Αβ-peptidom, alebo s patológiou súvisiacou s Αβ peptidom, ako je klinická alebo predklinická Alzheimerova choroba, Downov syndróm alebo klinická alebo predklinická auty lordov á angiopatia, s použitím štandardných techník podania, výhodne s použitím periférneho (t. j. nie podania do centrálneho nervového systému) pomocou intravenóznej, intraperitoneálnej, subkutánnej, pulmonálnej, transdermálnej, intramuskulámej, intranzálnej, bukálnej, sublinguálnej aplikácie alebo aplikácie v čapíku. Protilátky môžu byť tiež podané priamo do komorového systému, mozgovomiechového moku alebo mozgového paienchýmu, a techniky pre takéto podanie sú dobre známe v odbore, takže nie je nutné používať obtiažnejšie postupy. Protilátky podľa predkladaného vynálezu sú teda účinné, keď sú podané s použitím jednoduchších techník, ako je podanie do periférnej cirkulácie. Medzi výhody predkladaného vynálezu patrí schopnosť protilátky vykazovať priaznivé účinky i vtedy, keď nie je podaná priamo do centrálneho nervového systému. Okrem toho bolo zistené, že množstvo protilátky, ktoré prekonáva hematoencefalickú bariéru, je <0,1 % plazmatickej koncentrácie a že protilátky podľa predkladaného vynálezu majú schopnosť sekvestrovať Αβ v periférnej cirkulácii, rovnako ako meniť klírens CNS a plazmatického solubilného Αβ.

Farmaceutické prostriedky sú navrhnuté tak, aby boh vhodné pie vybraný spôsob podania, a farmaceutický prijateľné prísady, ako sú disperzné činidlá, pufre, surfaktanty, konzervačné činidlá, solubilizačné činidlá, činidlá upravujúce izotonicitu, stabilizačné činidlá a podobne, sú použité podľa potreby. Remington's Farmaceutické Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, posledné vydanie, tu uvedené ako odkaz, poskytuje techniky na prípravu farmaceutických prostriedkov. Predovšetkým výhodné môže byť zmenenie robustnosti protilátky podľa predkladaného vynálezu tak, aby bola viac lipolilná. napríklad s použitím enkapsulácie v lipozómoch alebo blokovaním polárnych skupín.

Výhodné je periférne systémové podanie intravenózne alebo intraperitoneálne, alebo podkožnou injekciou. Vhodné vehikulá pre takéto injekcie sú známe. Ďalej môže byť podanie uskutočnené cez sliznice s použitím nazálneho aerosólu alebo čapíkov. Vhodné prípravky pre takéto podanie sú dobre známe a obvykle obsahujú surfaktanty, ktoré uľahčujú prienik membránou. Takéto surfaktanty sú často odvodené od steroidov alebo katiónových lipidov, ako je N-[l-(2,3-dioleoyl)propyl-N,N,N-trimetylamóniumchlorid (DOTMA) alebo rôzne zlúčeniny, ako je cholesterol hemisukcinát, fosfatidylglyceroly a podobne.

Koncentrácia ľudskej izolovanej protilátky v prostriedkoch je od približne 0,1 % do 15 alebo 20 % hmotnostných a je určená podľa objemu kvapalín, viskozity a podobne, v súlade s vybraným spôsobompodania. Tak môžu byť typické farmaceutické prostriedky pre injekcie pripravené tak, aby obsahovali 1 ml sterilnej pufrovanej vody a 1 - 100 mg humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu. Prípravok by mal byť sterilné piefiltrovaný po výrobe alebo by mal byť inýmspôsobomupravený tak, aby bol mikrobiologický

S K 288723 B6 prijateľný. Typický prostriedok pre intravenóznu infúziu by mal mať objem asi 250 ml, napríklad s použitím sterilného Ringerovho roztoku, a koncentrácia protilátky by mala byť 1 - 100 mg na ml.

Terapeutické činidlá podľa predkladaného vynálezu môžu byť zmrazené alebo lyorilizované na uskladnenie a rekonštitúciu vo vhodnom sterilnom nosiči pred použitím. Lyofilizácia a rekonštitúcia môžu viesť k rôznemu stupňu straty aktivity protilátky (napr. pri bežných imunoglobulínoch majú IgM protilátky tendenciu k väčšej strate aktivity ako IgC protilátky). Dávky by mali byť upravené na účely kompenzácie tejto straty. pH prostriedku by malo byť také, aby bola dosiahnutá rovnováha medzi stabilitou protilátky (chemickou a íýzikálnou) a komfortom pacienta pri aplikácii. Všeobecne je tolerované pH medzi 4 a 8.

Hoci sa uvedené spôsoby zdajú byť najvhodnejšie a najvýhodnejšie na podanie proteínov, ako súhumanizované protilátky, môžu byť použité aj iné spôsoby podania, ako je transdermálne podanie a orálne podanie, pokiaľ je pripravený vhodný prostriedok.

Ďalej, môže byť výhodné použiť prostriedky s riadeným uvoľňovaním s použitím biodegradovateľných povlakov a matríc alebo osmotických mmipúmp, alebo systémov na báze dextránových korálikov, alginátu alebo kolagénu.

Prostriedky na podanie protilátok podľa predkladaného vynálezu sú dobre známe v odbore a môžu byť vybrané z rôznych možností.

Typické dávky môžu byť optimalizované s použitím štandardných klinických techník a dávky závisia od spôsobu podania a stavu pacienta.

Nasledujúce príklady ilustrujú, ale nijak neobmedzujú predkladaný vynález.

Príklady uvedené ďalej využívajú, okrem iného, myšiu monoklonálnu protilátku označenú „266“, ktorá bola pôvodne pripravená imunizáciou peptidom zloženým zo zvyškov 13-28 ľudského Αβ peptidu. Bolo potvrdené, že táto protilátka je imunoreaktívna s týmto peptidom, ale skôr bolo uvedené, že nereaguje s peptidom obsahujúcim len zvyšky 17-28 ľudského Αβ peptidu alebo akýkoľvek iný epitop v Αβ peptide. Prostriedok obsahujúci túto protilátku je opísaný v U.S. patente 5,766,846, ktorý je tu uvedený ako odkaz. Pretože príklady opisujú pokusy uskutočnené na myšiach, je použitie myšej monoklonálnej protilátky uspokojivé. Ale, v liečbe ľudí s použitím spôsobov podľa predkladaného vynálezu sú výhodné humanizované formy protilátky s imunošpecificitou zodpovedajúcou protilátke 266.

Príklad 1

Sekvestrácia pridaného Αβ peptidu v ľudských tekutinách

Vzorky ľudského mozgovomiechového moku (CSF) (50 ul) a ľudskej plazmy (50 ul) sa inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti nasledujúcim spôsobom

1. samostatne;

2. spolu s 5 ng Αβ 40 peptidu alebo

3. 5 ng Αβ 40 peptidu plus 1 mg monoklonálnej protilátky 266 (opísané napríklad v U.S. patente 5,766,846, ktorý je tu uvedený ako odkaz).

Vzorky sa potom spracovali elektrofotézou na 4 - 25 % nedenaturujúcom gradientovom géli, t. j. nedenaturujúcou gradientovou elektroforézou (NDGGE) a preniesli sa do nitrocelulózy. Škvrny sa potom farbili Ponceau S alebo, pre Westemovú hybridizáciu, sondovali biotínom-značenou monoklonálnou protilátkou (3D6), ktorá je namierená oproti prvým piatim aminokyselinám Αβ peptidu, vyvíjali sa s použitím streptavidínu-chrenovej peroxidázy a delegovali sa pomocou zosilnenej chemiluminiscencie (ECL). Hydratované priemery materiálov obsiahnutých v prúžkoch na blotoch sa vyhodnocovali s použitím Pharmacia markerov molekulovej hmotnosti. Pokiaľ sa Αβ peptid viazal na iné molekuly, prechádzal gélom podľa velkosti vzniknutého komplexu.

Westemová hybridizácia CSF s alebo bez 5 ng Αβ peptidu neukazovala žiadny dôkaz Αβ peptidu pridetekcň pomocou protilátky 3D6. Podobné výsledky boh získané pre ľudskú plazmu. Toto platilo aj napriek skutočnosti, že Αβ peptid mohol byť delegovaný SDS-PAGEpo Westemovej hybridizácň s použitím rovnakej techniky a na rovnakých vzorkách CSF. Pravdepodobne bránila detekcň Αβ peptidu interakcia medzi týmto peptidom a inými faktormi v testovaných kvapalinách. Ale, keď bola MAb 266 pridaná k inkubácii, tak boh prúžky charakteristické pre sekvestrujúci Αβ peptid v komplexe s protilátkou prítomnou tak v plazme, ako v CSF. Hlavný prúžok má hydratovaný priemer približne 11 nm, čo zodpovedá monoméru protilátky, menší prúžok mal 13 nm, čo zodpovedádiméru protilátky

Príklad 2

Špecifická sekvestrujúcej látky

Použili sa vzorky obsahujúce 50 ul ľudského CSF alebo 10 ul APP^V717F CSF. APP^V717F sú transgénne myši reprezentujúce myši model Alzheimerovej choroby, v ktorých je cxprimovaný transgén pre ľudský amyloidový prekurzorový proteín s familiárnou mutáciou pre Alzheimerovu chorobu, čo vedie k produkcii ľudského Αβ peptidu v centrálnom nervovom systéme.

S K 288723 B6

Vzorky sa inkubovali s alebo bez rôznych MAb (1 ug) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, a potom sa spracovali elektroforézou na 4 - 25 % NDGGE a preniesli sa na nitrocelulózu spôsobom opísaným v príklade 1. Protilátky boh nasledujúce:

MAb 266 (viaže sa na pozície 13-28);

MAb4G8 (viaže sa na pozície 17-24);

QCBpan (králičia polyklonálna protilátka pie pozície MO);

myší IgG (nešpecifický);

MAb3D6 (viaže sa na pozície 1-5);

MAb21F12 (viaže sanapozície 33-42);

MAb6E10 (viaže sanapozície 1-17) a

QCB40, 42 (králičia polyklonálna protilátka pre Αβ40 a Αβ42).

Detekcia komplexu Αβ peptid-protilátka sa uskutočnila spôsobom opísaným v príklade 1 s použitím biotínom značenej 3D6 (k N-koncu Αβ peptidu), a potom stieptavidínu-HRP a ECL. Podobná detekcia bola uskutočnená v ľudskom CSF inkubovanom s MAb 266, v niektorých prípadoch zamenenou za QCB40,42, ktorá saviaže na karboxylový koniec Αβ peptidu, pie 3D6.

Výsledky ukazujú, že z testovanýchprotilátoklen MAb4G8 a MAb 266 umožňujú detekciu Αβ peptidu.

Výsledky ukazujú, že pre ľudský CSF len MAb 266 a MAb 4G8 môžu sekvestrovať v detegovateľných množstvách komplex protilátka-Αβ (opäť bez protilátky nebol Αβ delegovaný). MAb 266 bola tiež schopná produkovať podobné výsledky ako výsledky získané s ľudským CSF s CSF z APP^V717F transgénnnych myší. Αβ peptid mohol byť sekvestrovaný v ľudskom CSF s použitím MAb 266 bez ohľadu na to, čibola na vyvíjanie vo westemovompienosepoužitá 3D6 alebo QCB40.42 protilátka.

Príklad 3

Demonštrácia komplexu Αβ peptid-266 dvojrozmernou elektroforézou

Vzorka obsahujúca 50 ng Αβ peptidu sa inkubuje s 2 ug MAb 266 pri 37 °C počas 3 hodín. Rovnaká inkubácia MAb 266 samotnej sa použije ako kontrola.

Vzorky sa potom spracujú 2-dimenzionálnou elektroforézou.

V prvom rozmere sa inkubované vzorky spracujú NDGGE, ako je opísané v príklade 1. Polyakiylamidové gély sa potom nastrihajú na jednotlivé dráhy kolmé na smer toku v prvomrozmere a v dmhomrozmere sa uskutoční gélová separácia za denaturačných/redukčných podmienok pomocou SDS-PAGE (Tricín-ureové gély). Prítomnosť prúžkov sa deleguje buď Ponceau-S farbením (akýkoľvek proteín), alebo špecifickým farbením s použitím 6E10 MAb (Senetek, Inc.) a biotinylovanej anti-myšej A13 v detekčnom systéme na báze HRP.

Ponceau-S farbenie nitrocelulózových membrán po prenose umožňuje vizualizáciu ťažkého a ľahkého MAb 266 samostatne. Pomocou tohto farbenia bolo potvrdené, že Αβ peptid bol v komplexe s MAb 266 ako prúžok veľkosti 4 kD, čo zodpovedá veľkosti kompletnej MAb 266 v prvomrozmere NDGGE.

Príklad 4

Demonštrácia non-ekvivalencie väzby a sekvestrácie

Predpokladá sa, že Αβ peptid cirkulujúci v plazme a CSF je obsiahnutý v komplexe s proteínmi, vrátane apolipoproteínu E. Tento príklad demonštruje to, že protilátky k apoE, hoci sa viažu na komplex, nesekvestrujú apoEod zvyšku komplexu.

ApoE komplexy (500 ng) sa inkubovali s MAb alebo polyklonálnymi protilátkami k apoE (2 ug) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Inkubované vzorky sa potom spracovali NDGGE s použitím techník opísaných v príklade 1. Po NDGGE sa uskutočnil westemový prenos s afinitne prečistenou kozou anti-apoE protilátkou s detekciou pomocou ECL. Keď nebola prítomná žiadna protilátka, tak mohol byť apoE delegovaný pri 8-13 nm, čo je v súlade s prítomnosťou lipoproteínových častíc. Prítomnosť monoklonálnej alebo polyklonálnej protilátky k apoE viedla k posunu apoE k väčším molekulám, tzv. „super posunu“. Toto ukazuje, že protilátky k apoE nesekvestnrjú, t. j. neodstraňujú apoE z lipoproteínových častíc, ale skôr sa viažu na apoE na lipoproteínoch za vzniku väčších molekúl.

Príklad 5

Sekvestrácia Αβ nie je narušenáanti-apoE protilátkami

Vzorka 100 ul ľudského CSF sa inkubuje buď s MAb 266 samotnou, alebo s polyklonálnu anti-apoE, alebo s oboma protilátkami počas 60 minút pri teplote 37 °C. Vzorky sa potom analyzujú NDGGE, ako je opísané v príklade 1 a detekcia prúžkov sa uskutoční, ako je opísané v príklade 1.

Výsledky ukazujú, že keď je MAb 266 pridaná k vzorke, tak je pozorovateľný približne 11 nm prúžok charakteristický pre sekvestrovaný komplex 266-Αβ peptid. Tak je to bez ohľadu na to, či je alebo nie je prítomná anti-apoE. Tento prúžok, demonštrujúci sekvestrovaný Αβ, sa tiež objaví vtedy, keď sa 50 ng Αβ pep

S K 288723 B6 tidu pridá k inkubačnej zmesi za prítomnosti MAb 266. Tak alteiácia molekulovej hmotnosti apo E prítomnosťou anti-apoE protilátky neinterferuje so sekvestráciou Αβ peptidu MAb 266.

Príklad 6

Sekvestrácia Αβ peptidu in vivo

A. Transgénne APP^V717F myši, tiež označované ako PDAPP myši, nadmerne exprimujú mutantnú formu ľudského APP protemu. Tieto my ši produkujú ľudský Αβ v CNS a majú zvýšené koncentrácie ľudského Αβ peptidu cirkulujúceho v CSF a plazme. 8-mesačným myšiam bol intravenóznou injekciou podaný salinický roztok alebo 100 ug MAb 266. Krv bola týmto myšiam odobratá 10 minút po injekcii, a potom znova za 20 hodín po prvej injekcii.

Vzorky obsahujúce 20 ul plazmy od každého zvieraťa boli analyzované NDGGE a Westemovou hybridizáciou s protilátkou 3D6, ako je opísané v príklade 1. Zvieratá, ktoiým bol podaný salinický roztok, nemali charakteristický 11 nm prúžok zodpovedajúci sekvestrovanému Αβ peptidu po 10 minútach, ani po 20 hodinách. Ale, dve zvieratá, ktorým bola injekčné podanáMAb 266, mali tento prúžok po 20 hodinách.

B. V tomto pokuse sa použili 2 mesiace staré APP^V717F myši. V deň 0 sa myšiam podala buď žiadna MAb 266, alebo 1 mg MAb 266, alebo 100 ug tejto protilátky. Vzorky plazmy sa odobrali dva dni pred podaním protilátky a v dňoch 1, 3, 5 a 7. Vzorky plazmy sa spracovali NDGGE, a potom Westemovou hybridizáciou a detekciou s 3D6, ako je opísané v príklade 1. Vo všetkých časoch po podaní MAb 266 bol komplex 266/A13 delegovaný bez ohľadu na to, že vzorka plazmy bola spracovaná proteínom G, ktorý sa viaže na imunoglobulín, čím účinne odstraňuje MAb 266. V testovanom období boli delegované stabilné koncentrácie komplexu s výnimkou ľahkého poklesu v deň 7 pri zvieratách, ktorým bolo aplikovaných 100 ug MAb 266; všeobecne boli koncentrácie pri zvieratách, ktorým bolo podaných 100 ug, nižšie ako pri zvieratách, ktorým bol podaný 1 mg tejto protilátky.

C. Dvom 2-mesačným APP^V717F myšiam sa intravenózne podal 1 mg MAb 266 a od každej myši sa odobrala 25 ug vzorka plazmy. Vzorka plazmy sa spracovala NDGGE, a potom Westemovým prenosom, ako je opísané s tou výnimkou, po väzbe biotinylovanej 3D6 sa uskutočnila detekcia streptavidínom¹²⁵! (Amersham) a expozícia na fosfo-detekčnom zariadení. Koncentrácia komplexu sa hodnotila v porovnaní so štandardnou krivkou získanou s použitím známy ch množstiev Αβ40 v komplexe so saturačnou koncentráciou MAb 266 a podobnej detekcie. Množstvo Αβ peptidu naviazaného na MAb 266 bolo približne 100 ng/ml, čo predstavuje približne 1,000-násobné zvýšenie vzhľadom na endogénny Αβ peptid pri týchto myšiach, ktoré je približne 100 ul/ml. Toto je tiež podobné koncentrácii Αβ peptidu v mozgu APP^V717F myší pred depozíciou Αβ (50-100 ng/g); ľudský APP a ľudský Αβ v APP^V717F myšiach sú produkované takmer výlučne v mozgu. Tak sa zdá, že prítomnosť MAb 266 v plazme spôsobí vychytanie Αβ peptidu uľahčujúce vylučovanie Αβ peptidu z CNS do plazmy. Toto zvyšuje vylučovanie v dôsledku zvýšeného presunu Αβ z CNS do plazmy a tiež prevenciu prenikania Αβ z plazmy do mozgu.

Správna veľkosť sekvestrovaného Αβ peptidu sa potvrdí spracovaním 20 ul vzoriek plazmy získaných od APPV717F myší za 24 hodín pre injekciu 1 mg MAb 266 na TRIS-tricínových SDS-PAGE géloch, a potom Westemovou hybridizáciou s použitím anti-Αβ protilátky 6E10 pred alebo po spracovaní proteínom G s použitím korálkov s naviazaným proteínom G. Prúžok, ktorý bol depletovaný proteínom G, bol delegovaný pri 4-8 kD, čo zodpovedáprítomnosti monomérov a snáď i dimérov Αβ peptidu.

D. 2-mesačným APP^V717F myšiam sa aplikoval intraperitoneálne buď PBS (n=7), alebo 500 mg biotinylovanej MAb 266 - t. j. m266B (n=9). Pred injekciou a 24 hodín po injekcii sa plazma analyzovala na celkový Αβ peptid s použitím modifikácie ELISA metódy podľa Johnson-Wood, K, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555; a Bales, K. R., et al., Náture Genet (1997) 17:263-264. Celkový Αβ naviazaný na m266B sa stanovil s použitím 96-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.). potiahnutých m3D6. Nariedené vzorky plazmy a štandardy (rôzne koncentrácie Αβ40 a m266B) sa inkubovali cez noc v potiahnutých platniach a množstvo Αβ/ηι266Β komplexu sa určilo s použitím ¹²⁵l-streptavidínu. Ďalej, po 24-hodinách sa vzorky plazmy najprv spracovali proteínom G pre kvantifikáciu Αβ peptidu nenaviazaného na MAb 266, a celkový Αβ a Αβ42 sa určil ELISA v CSF. Pri myšiach s aplikovaným PBS boli plazmatické koncentrácie Αβ peptidu 140 ul/ml pred i po injekcii. Plazmatické koncentrácie boli podobné pri myšiach s aplikovanou MAb 266 pred injekciou, ale koncentrácie Αβ peptidu nenaviazaného na MAb 266 boli nedetegovateľné 24 hodín po injekcii.

Tiež sa merali koncentrácie v CSF. CSF reprezentuje extracelulámy kompartment v CNS a koncentrácie molekúl v CSF v určitom rozsahu odrážajú koncentrácie substancií v extracelulámom priestore mozgu. CSF sa izoloval z kompartmentu cisterna magna. Myši sa anestezovali pentobarbitolom, a potom sa odstránila svalovina na báze lebkovej až prvého stavca. CSF sa získal opatrnou punktúrou arachnoidnej membrány prekrývajúcej cisternu s použitím mikroihly a disekčného mikroskopu a CSF sa odobral do polypropylénovej mikropipety. Po 24 hodinách po injekcii sa delegovalo zvýšenie celkového Αβ peptidu v CSF myší s injekciou MAb 266, ktoré bolo približne 2-násobné v Αβ42 v porovnaní s myšatni, ktorýmbol aplikovaný PBS. Toto

S K 288723 B6 bolo potvrdené s použitím denaturačnej gélovej elektroforézy a potom westemovou hybridizáciou s Αβ42-špecifickou protilátkou 21F12.

V ďalšom pokuse sa 3-mesačným APP^V7l7r injikoval intravenózne buď PBS, alebo MAb 266 a nasledujúcim spôsobomsa hodnotili koncentrácie Αβ4οηΑβ42 vCSF:

Na meranie Αβ4ο sa použila monoklonálna protilátka m2G3 špecifická pre Αβ40. Opísaný ELISA test (Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) sa modifikoval na RIA nahradením streptavidín-HRP činidla ¹²⁵Lstieptavidínom. Fpro vzorky plazmy a CSF sa test uskutočnil za nedenaturačných podmienok s chýbaním guadnidínu v pufroch. Na hodnotenie Αβ peptidu rozpustného a nerozpustného v karbonáte v mozgovom homogenáte sa vzorky homogenizovali s 100 mM karbonátom, 40 mM NaCI, pH 11,5 (40C), odstredili sa pri 10,000 xg v priebehu 15 mm a Αβ sa hodnotil v supematantovej (solubilnej) a peletovej (insolubilnej) frakcii, ako bolo opísané skôr (Johnson-Wood, K., et ak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) a ako bolo uvedené. Meranie komplexu Αβ/MAb 266 v plazme sa uskutočnilo modifikovanou RIA. Myšiam sa podala biotinylovaná MAb 266 (MAb 26GB) a plazma sa izolovala v rôznych časoch. Celkový Αβ naviazaný na MAb 266 sa meral s použitím 96-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potiahnutých m3D6. Riedené vzorky plazmy a štandardy (rôzne koncentrácie Αβ40 a MAb 26GB) sa inkubovali cez noc v potiahnutých platniach a množstvo komplexu celkový Αβ/MAb 266B sa určilo s použitím ¹²⁵I-stieptavidínu.

hodiny po intravenóznej injekcii MAb 266 bolo delegované 2-násobné zvýšenie koncentrácie Αβ40 v CSF a nesignifikantné zvýšenie Αβ42. Ale, za 24 a 72 hodín bolo pozorované 3-násobné zvýšenie Αβ4ο a Αβ42 v CSF. Podobné výsledky boli získané s použitím analýzy na denaturačnomgéli nasledované westemovou hybridizáciou celkového CSF. Výlučovanie Αβ prostredníctvom mozgovej intersticiálnej kvapaliny, ktoré saodráža v koncentráciách CSF, je pravdepodobne zodpovedné za pozorované zvýšenie Αβ v CSF.

Významné je to, že zmena v koncentráciách Αβ peptidu v CSF nemôže byť spôsobená prienikom MAb 266 do CSF, pretože koncentrácie zmerané 24 hodín po injekcii, ktoré sú nižšie ako 0,1 % plazmatických koncentrácií MAb 266, sú nedostatočné na to, aby spôsobili tieto zmeny. Tieto výsledky naznačujú, že Αβ peptid je presúvaný z mozgového paienchýmu do CSF prítomnosťou protilátky v krvnom riečišti.

Formy Αβ peptidu, ktoré sú rozpustné v PBS alebo uhličitanovom pufri, boli merané v homogenátoch mozgovej kôiy od rovnakých myší, ktorým bola aplikovaná MAb 266 a pri ktorých bol CSF analyzovaný opísaným spôsobom. Bolo pozorované podobné zvýšenie týchto solubilných foriem v homogenátoch mozgovej kôry.

Príklad 7

MAb 266 účinkuje in vitroako vychytávačAβ peptidu

Dialyzačná komôrka sa pripravila ako in vitro systém na testovanie schopnosti MAb 266 vychytávať Αβ peptid. 1 ml ľudskej CSF sa umiestnil do hornej komôrky polypropylénovej skúmavky separovanej dialyzačnou membránou s medzou priepustnosti 10-100 kD od spodnej komôrky obsahujúcej 75 um PBS s alebo bez 1 ul MAb 266.

Zdalo sa, že rovnováha bola dosiahnutá po 3 hodinách, ako sa určilo spracovaním materiálu zo spodnej komôrky na kyslých močovinových géloch, a potom Westemovým prenosom na prítomnosť Αβ peptidu s 6E10 v rôznych časoch. Vzorky sa denaturovali v kyseline mravčej na konečnú koncentráciu 80 % (obj./obj.) a redukovali sa B-merkaptoetanolom (1 %). Vzorky sa spracovali elektrofoiézou (anóda-katóda) v 0,9 M pracovnom pufri s kyselinou octovou na 4 % až 35 % polyakrylamidovom gradientovom géli obsahujúcom 6 M močoviny, 5 % (obj./obj.) ľadovou kyselinou octovou a 2,5 % TEMED. Kyslé pH gélu sa neutralizovalo pred prenosom na nitrocelulózu. Potom sa štandardné techniky westemového prenosu použili na identifikáciu Αβ. Delegované prúžky zodpovedali 4 kD.

Množstvo Αβ odstráneného z hornej komôrky sa takto určilo ELISA analýzou hornej a dolnej komôrky (n=4) po 3 hodinách. Výsledky pre rôzne medze molekulovej hmotnosti za prítomnosti a neprítomnosti MAb 266 sú uvedené na obr. L Ako je uvedené, zatiaľ čo len minimálne množstvo Αβ peptidu prekonáva membránu, keď je v dolnej komôrke prítomný PBS, 50 % Αβ peptidu sa sekvestmje v dolnej komôrke, keď táto komôrka obsahuje MAb 266 a limit molekulovej hmotnosti je 25 kDa; väčšie množstvo prichádza vtedy, keď sa limit molekulovej hmotnosti zvýši na 100 kDa, keď takmer 100 % Αβ peptidu prechádza cez membránu.

Tiež sa pozorovalo, že protilátky oproti N-koncu Αβ 3D6 a 10D5 sú schopné spôsobiť v tomto systéme prenos Αβ cez membránu, hoci neboli schopné sekvestrovať Αβ peptid v testoch opísaných v príklade 1. Tieto výsledky ukazujú, že protilátky k Αβ peptidu majú za týchto podmienok dostatočnú afinitu na sekvestrovanie peptidu vo íyziologických roztokoch od iných väzbových proteínov, ale že MAb, ako je 266, ktoré sú imunoreaktívne s epitopomv pozícii 13-28, súvýznamne viac účinné aviažu sas vyššou afinitou.

V podobných testoch mal apoE4 secerovananý astrocy tnú prečistený spôsobomopísanýmv DeMattos,R. B., et al., J. Biol. Chem (1998) 273:42064212; Sun, Y., et al., J. Neurosci. (1998) 18:3261-3272, malý, ale štatisticky významný efekt na zvýšenie množstva Αβ peptidu v dolnej komôrke. Žiadny efekt nebol pozorovaný vtedy, keď bol polyklonálny IgG alebo BSA zameraný za MAb 266.

S K 288723 B6

Príklad 8

Tok Αβ peptidu z CNS do plazmy

A. 1 ug Αβ40 sa rozpustil v 5 ul krysieho CSF na uchovanie v rozpustenom stave, a potom sa injikoval do subarchnoidálneho priestoru cisterna magna normálnych Swiss-Webster myší, ktoiýmbolipredtýmpodané i.v. injekcie buď PBS (n=3), alebo 200 ug biotinylované MAb 266 (n=3). V rôznych časoch po liečbe sa celkový Αβ v plazme myší určil Αβ ELISA s použitím 3D6 ako povlakov ej protilátky a štandardov Αβ v zmesi s nadbytkom biotinylovanej 266. Do každej vzorky plazmy sa po odbere od každého zvieraťa pridal nadbytok biotinylovanej 266 pre P43 detekciu v EHS A. Pri myšiach hečených PBS boh minimálne detegovateľné množstvá peptidu v koncentráciách 0,15 ng/nú delegované ako pikové hodnoty po 30 - 60 minútach, a potom boh hodnoty prakticky nulové. Pri myšiach, ktorým bola podaná MAb 266, dosiahli plazmatické koncentrácie P43 peptidu hodnôt 330-násobne vyšších ako pri myšiach s injekciou PBS po 60 minútach (približne 50 ng/ml) a dosahovahhodnoty približne 90 ng/ml po 180 minútach.

B. Tento postup sa opakoval s použitím buď 200 ug (n=3), alebo 600 ug (n=3) injikovaných i.v. 2-mesačným APP^V717F myšiam. MAb 266 sa injikovala i.v. 3-mesačným APP^V717F myšiam s použitím uvedených dávok. Pred a v rôznych intervaloch po i.v. injekcii sa plazmatická koncentrácia Αβ naviazaného na MAb 266 určila RIA. Podrobné výsledky od jednej myši sú uvedené na obr. 2.

Bolo zistené, že koncentrácia Αβρ naviazaného na monoklonálnu protilátku MAb 266 sa zvýšila zo základných hodnôt 150 ul/ml na hodnoty 100 ng/nú za 4 dni. Analýzou skorých častí krivky sa určilo, že čistá rýchlosť vstupu Αβκ,ι do plazmy u APP^V717F Ig myší je 42 ul/nú/minútu za prítomnosti saturačných koncentrácií protilátky.

Účinky MAb 266 na plazmatické koncentrácie Αβ u prirodzených a APP^V7l7r Tg myší, rovnako ako účinky protilátky na koncentrácie Αβ v CSF ukazujú, že prítomnosť MAb 266 v cirkulácii vedie k zmene rovnováhy v transporte Αβ medzi CNS a plazmou.

Príklad 9

Účinok MAb 266 na Αβ v mozgu

4-mesačné APP^V717F+/+ myši sa liečili každé 2 týždne počas 5 mesiacov IP injekciami salinického roztoku, MAb 266 (500 ug) alebo injekciami kontrolného myšieho IgG (100 ug, Pharmigen). Myši sa utratili vo veku 9 mesiacov a určilo sa ukladanie Αβ v mozgovej kôre. % plochy pokrytej Αβ-imunoreaktivitou, ako bola určená králičou pan-Αβ protilátkou (QCB, Inc.), sa kvantifikovalo v kôre mozgovej ihneď po farbení dorzálneho hipokampu, ako je opísané v Holtzman, D. M., et al., Ann. Neurol. (2000) 97:2892-2897. Výsledky sú uvedené na obr. 3A. V tomto veku sa pri približne polovici myší z každej skupiny ešte nezačali vyvíjať depozitá Αβ. Ale, % myší s >50 % ukladaním Αβ v mozgovej kôre bolo signifikantne nižšie (P=0,02, Chikvadrátový test) v skupine liečenej 266. Hoci sa u APPV717P myší môžu vyvíjať väčšie depozitá Αβ v 9 mesiacoch, existuje značná variabilita s približne 50 % bez depozitov a približne 50 % s výraznými depozitmi. Pri zvieratách hečených PBS a IgG malo 6/14 a 5/13 myší viac ako 50 % mozgovej kôry zafarbené Αβ farbením, zatiaľ čo len jedna zo 14 myší Hečených MAb 266 mala túto úroveň farbenia. Takmer 50 % zvierat vo všetkých skupinách nemalo ukladanie Αβ v 9 mesiacoch veku. Toto sa zdá byť spôsobené pôvodom myší v našej kohorte, pretože hoci boh všetky testované myši overené ako APPV717+/+, boh vysoké hladiny deponovania Αβ pozorované len u myší zo 4/8 párov (vrhy s vysokou patológiou). Myši z druhých 4 vrhov boh v podstate bez depozitov Αβ (vrhy s malou patológiou). S použitím vrhov ako kopremennej bol zjavný silný, štatisticky významný efekt m266 na redukciu deponovania Αβ (p=0,0082, obr. 3B).

Príklad 10

Periférne injikovaná MAb 266 saneviaže naplaky u APPV717F Tg myší

Na stanovenie toho, či sa MAb 266 injikovaná i.p. v priebehu 5 mesiacov viaže na Αβ v mozgu sa použih rezy mozgom od 9-mesačnej APP^V7l7r Tg myši, ktoré obsahovah depozitá Αβ a ktoré boh Hečené MAb 266, salinickým roztokom alebo kontrolným IgG. Spracovanie tkaniva a imunofarbenie sa uskutočnili opísaným spôsobom (Bales, K.R., et al., Náture Genet. (1997) 17:263-264). Tkanivá od všetkých skupín zvierat sa inkubovah s fluoresceínom-značeným anti-my ším IgG (Vektor: Inc.), a potom sa hodnotili pod fluorescenčným mikroskopom. V žiadnej skupine nebolo pozorované špecifické farbenie Αβ depozitov. Naopak, pri aplikovaníMAb 266 na rezy pred inkubáciou rezov s anti-myšíni IgG boh depozitá Αβ jasne definované.

Príklad 11

Efekt podania protilátky 266 na kognitívne funkcie 24-mesačných transgénnych lícniizygotných PDAPP myší

Použilo sa 16 henúzygotných transgénnych myší (APP^V717F). Myši boh v čase začiatku testu staré 24 mesiacov. Všetky injekcie boh intraperitoneálne (i.p.). Polovici myší sa podávali raz týždenne injekcie s fosfátom pufrovaného salinického roztoku (PBS, kontrola) a druhej polovici injekcie 500 ug my šej protilátky 266 rozpustenej v PBS. Injekcie sa uskutočňovali počas 7 týždňov (42 dní), celkovo 6 injekcu. 3 dni po poslednej

S K 288723 B6 injekcii sa hodnotilo správanie zvierat s použitím testu kognitívnych funkcií, ako je opísaný v J.C. Dodart, et ak, Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999). Výpočítal sa index kognitívnych funkcií (TB x 100) / (TB-TA).

Výsledky sú uvedené ďalej v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Index kognitívnych funken
	N	Priemer	Štandardná odchýlka	Štandardná chyba
Kontrola (PBS)	8	7,22**	8,80	3,11
Protilátka 266	8	54,35	7,43	2,62

** p = 0,0010

Podávanie 500 ug protilátky 266 raz týždenne 24-mesačným hemizygotným transgénnym myšiam bolo spojené so štatisticky významnou zmenou správania. Protilátkou liečené myši mali indexy kognitívnych funkcií podobné ako normálne kontrolné zvieratá [J.-C. Dodart, et al.]. Rozdiely v indexoch kognitívnych funkcií boli štatisticky významné pri p = 0,001. Výšší index kognitívnych funkcií ukazuje, že liečba protilátkou, ktorá sa viaže na beta amyloidový peptid v regióne aminokyselín 13-28, revertuje poruchy správania, ktoré boli dokumentované v tomto myšom modeli Alzheimerovej choroby. Preto môže podanie protilátky, ktorá sa viaže na beta amyloidový peptid v regióne aminokyselín 13-28, liečiť ochorenie, ako je Alzheimerova choroba a Downov syndróm a tiež môže zastaviť zhoršovanie kognitívnych funkcií, ktoré je obvykle spojené s progresiou ochorenia.

Postihnutie amyloidom (% plochy zafarbené imunoreaktívnym materiálom po farbení anti-Αβ protilátkou 3D6 alebo 21F12) sa kvantifikovalo v mozgovej kôre po zafarbení hipokampu vrátane oblastí cinguly aparietálneho kortexu v mozgu 24-mesačných zvierat liečených myšou protilátkou 266 počas 7 týždňov, ako je opísané. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke. Rozdiely medzi skupinami neboli štatisticky významné.

Tabuľka 2: Množstvo amy lordových plakov u APPV171F +/- my ši po liečbe myší 266 anti-Αβ protilátkou

Veľkosť plakov (%)
Pri použití 3D6	Pri použití 21F12
N	Priemer	Štandard, chyba	Priemer	Štandard, chyba
Kontrola (PBS)	7	44,3	5,93	0,77	0,14
Protilátka 266	8	38,0	2,96	0,93	0,11

Pre tieto veľmi staré zvieratá nevedie liečba myšou protilátkou 266 vo významne odlišnom množstve amyloidu v porovnaní so skupinou liečenou PBS, podľa merania buď pomocou 3D6, alebo s použitím21F12. Ďalej, množstvo Αβ bolo významne vyššie a signifikantne zvýšené v porovnaní s množstvom amyloidu pri mladších zvieratách (pozri ďalej), ktoré neboli schopné rozpoznať nový objekt od známeho objektu v teste kognitívnych funken. Prekvapivo tieto výsledky demonštrujú, že anti-Αβ protilátky môžu revertovať kognitívne defekty bez nutnostiredukovaťmnožstvo amyloidu samého osebe.

Po 7 týždňoch liečby sa index kognitívnych funken v skupine liečenej 226 štatisticky významne nelíšil od skupiny normálnych 24-mesiacov staiých myší. Toto ukazuje na kompletné vylepšenie kognitívneho deficitu pri týchto transgénny ch myšiach.

Príklad 12

Efekt podania protilátky 266 na kognitívne funkcie u mladých transgénnych lieniizygotnýcli PDAPP myší

Použilo sa 54 homozygotných, transgénnych myší (APP^V717F). 23 myší bolo na začiatku testu vo veku približne 2 mesiace. Zostávajúce my ši boli na začiatku testu vo veku približne 4 mesiace. Trvanie liečby bolo 5 mesiacov. Tak bol na konci testu vek myší približne sedem (7) mesiacov alebo približne deväť (9) mesiacov.

Všetky myši v kontrolnej ..PBS skupine dostávali raz týždenne injekciu fosfátom pufrovaného salinického roztoku (PBS; 200 ul). Všetky myši v „IgG‘ kontrolných skupinách dostávali raz týždenne injekciu IgGIkappal izotypu (100 ug/myš/týždeň). Všetky myši v „high dose“ skupinách dostávali raz týždenne injekciu 500 ug protilátky 266 rozpustenej v PBS („HD“). Všetky myši v „low dose“ skupinách dostávali raz týždenne injekciu 100 ug protilátky 266 rozpustenej v PBS („LD“). Tri dni po poslednej injekcň sa správanie myší hodnotilo s použitím testu kognitívnych funkcií, ako je opísané v príklade 10, a diskriminačný index sa vypočítal ako rozdiel medzi časom stráveným na novom objekte a časom stráveným na známom objekte. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3. Dáta sú združené podľa veku myší na konci testu.

S K 288723 B6

Tabuľka 3: Štatistika pre diskriminačný index

Diskriminačný index
	N	Priemer	Štandardná odchýlka	Štandardná chyba
7 mesiacov
PBS	7	2,12	4,22	1,59
IgG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,(M*	6,52	2,30
9 mesiacov
PBS	7	1,87	3,54	1,34
IgG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p < 0,05 ***p < 0,0001

Dohromady tieto dáta podporujú záver, že podávanie protilátky 266, protilátky namierenej proti centrálnej doméne Αβ, zmierňuje deponovanie plakov u 7-9 mesačných APP^V717F myší, rovnako ako revertuje existujúce poruchy správania. Liečba pacientov protilátkou oproti Αβ peptidu bude inhibovať alebo brániť zhoršovaniu kognitívnych fúnkcií, ktoré je obvykle spojené s progresiou ochorenia, a bude obvykle revertovať takéto zhoršenie.

Diskriminačný index pre liečené zvieratá nebol štatisticky významne odlišný od indexu myší rovnakého veku. Preto - rovnako ako pri starších zvieratách (príklad H) - liečba m266 úplne revertovala zhoršovanie kognitívnych funkcií pri týchto mladších transgénny ch zvieratách.

Príklad 13

Syntéza humanizovanej protilátky 266

Bunky a protilátky. Myšia myelómová bunková línia Sp2/0 sa získala z ATCC (Manassas, VA) a kultivovala sa v DME médiu obsahujúcom 10 % PBS (kat. # SH32661.03, HyQone, Logan, UT) pri 37 °C v CO2 inkubátore. Myšie 266 hybridómové bunky sa najprv kultivovali v RPMI-1640 médiu obsahujúcom 10 % FBS (HyCIone), 10 mM HEPES, 2 mM glutamín, 0,1 mM neesenciálne aminokyseliny, 1 mM nátriumpymvát, 25 ug/nú gentamicínu, a potom sa expandovali v bezsérom médiu (Hybridoma SFM, kat # 12045076, Llfe Technologies, Rockville, MD) obsahujúcom 2 % FBS s nízkym obsahom Ig (kat# 30151.03, HyCIone) na objem 2,5 litra vo valcových skúmavkách. Myšia monoklonálna protilátka 266 (Mu266) sa prečistila zo supematantu kultúry afinitnou chromatografiou s použitímproteín-G Sepharosovej kolóny. Biotinylovaná Mu266 sa pripravila s použitím FZ-Lmk Sulfo-NHS-LC-LC-Biotínu (kat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Klonovanie cDNA variabilného regiónu. Celková RNA sa extrahovala z približne 107 hybridómových buniek s použitím TRIzol činidla (Life Technologies) a poly(A)+ RNA sa izolovala pomocou PolyATract mRNA Isolation systému (Promega, Madison, Wl) podľa návodu výrobcu. Dvojreťazcová cDNA sa syntetizovala s použitím SMART-RACE cDNA Amplification Kitu (ClonTech, Päto Alto, CA) podľa návodu výrobcu. cDNA pre variabilné regióny pre ľahký a ťažký reťazec sa amp linkovali polymerázovou reťazcovou reakciou (PCR) s použitím 3'-primérov, ktoré sa viažu v príslušnom poradí na myšie kappa a gamma reťazce konštantných regiónov, a 5'univerzálneho priméru obsiahnutého v SMARTTM RAČE cDNA Amplification Kite. Pre VL PCR mal 3'-primér sekvenciu:

5'-TATÄGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATÄCAGTTGGTGC-3' [SEQ ID NO: 13], kde zvyšky 17-46 hybridizujú na myší Ck región. Pre VH PCR mak 3'priméry degenerovanú sekvenciu:

A G T '-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3' [SEQ ID NO: 14],

S K 288723 B6 sa zvyšky 17-50 hybridizujúcimi na myší gamma reťazec CH1. VL a VH cDNA sa subklonovali do pCR4Blunt-TOPO vektora (Invitrogen, Carlsbad, CA) na účely stanovenia sekvencie. DNA sekvencovanie sa uskutočnilo s použitím PCR cyklických sekvencovacích reakcií s fluorescentnými dideoty-reťazcovými terminátormi (Applied Biosystems, Foster City, CA) podľa návodu výrobcu. Sekvencovacie reakcie sa analyzovali na Model 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Konštrukcia variabilných regiónov humanizovanej 266 (Hu266). Humanizácia V regiónov myšej protilátky sa uskutočnila spôsobom v Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 1998)]. Pracovný región ľudského V regiónu použitý ako akceptor pre Mu266 CDR sa vybral podľa homológie sekvencie. Počítačové programy ΑβΜΟϋ a ENCAD [Levitt, M., 1. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)] sa použili na konštrukciu molekulového modelu variabilných regiónov. Aminokyseliny v humanizovanom V regióne, ktoré boh určené ako kontaktné s CDR, sa substituovah príslušnými zvyškami Mu266. Toto sa uskutočnilo vo zvyškoch 46, 47, 49 a 98 v ťažkom reťazci a so zvyškom 51 v ľahkom reťazci. Aminokyseliny v humanizovanom V regióne, ktoré boli vzácne v rovnakej podskupine V-regiónov, boli zmenené na konvenčné aminokyseliny na elimináciu potenciálnej imunogenicity. Toto sa uskutočnilo vo zvyškoch 42 a 44 v ľahkom reťazci.

Gény pre variabilné regióny ľahkého a ťažkého reťazca sa pripravili a amplifikovali s použitím 8 prekrývajúcich sa syntetických oligonukleotidov dĺžky od približne 65 do 80 báz [He, X.Y., et al., J. Immunol. 160: 029-1035 (1998)]. Oligonukleotidy sa tepelnou reakciou spárovali a predĺžili sa Klenowým fragmentom DNA polymerázy I, za získania 4 dvojreťazcových fragmentov. Získané fragmenty sa denaturovali, tepelnou reakciou sa spárovali a predĺžili sa Klenowým fragmentom za získania dvoch fragmentov. Tieto fragmenty sa denaturovali, tepelnou reakciou sa spárovali a znovu sa predĺžili za získania dvoch kompletných génov. Získaný produkt sa amplifikoval PCR s použitím Expand High Fidelity PCR Systému (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). PCR-amplifrkované fragmenty sa prečistili na géli a klonovali sa do pCR4Blunt-TOPO vektora. Po potvrdení sekvencie sa VL a VH gény trávili Mini a Xbal, prečistili sa na géli a subklonovali sa v príslušnom poradí do vektorov pre expresiu ľahkého a ťažkého reťazca za získania pVkHu266 a pVgl-Hu266 (pozri obr. 6 a 7, v príslušnom poradí). [Co. M. S., et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]. Zrelá humanizovaná 266 protilátka cxprimovaná z týchto plazmidov mala ľahkí reťazec SEQ ID NO: 11 a ťažký reťazec SEQ ID NO: 12.

Stabilná transfekcia. Stabilná transfekcia do myšej urve lomovej bunkovej línie Sp2/0 sa uskutočnila elektroporáciou s použitím Gene Pulser prístroja (BioRad, Hercules, CA) pri 360 V a 25 uF, ako je opísané (Co et al., 1992). Pred transfekciou sa pVk-Hu266 apVgl-Hu266 plazmidové DNA linearizovali s použitím Fspl. Približne 107 Sp2/0 buniek sa transfekovalo 20 ug pVk-Hu266 a 40 ug pVgl-Hu266. Transfekované bunky sa suspendovali v DME médiu obsahujúcom 10 % PBS a bunky sa umiestnili na niekoľko 96-jamkových platní. Po 48 hodinách sa pridalo selekčné médium (DME médium obsahujúce 10 % PBS, HT médiový doplnok, 0,3 mg/ml xantínu a 1 ug/ml kyseliny mykofenolovej). Približne 10 dní po začiatku selekcie sa supernatanty kultúry testovali na produkciu protilátok s použitím ELISA, ako je opísané ďalej. Klony s vysokou produkciou sa expandovali v DME médiu obsahujúcom 10 % PBS a ďalej sa analyzovali na expresiu protilátok. Selektované klony sapotom adaptovali na rast v Hybridoma SFM.

Meranie expresie protilátok ELISA. Jamky 96-jamkovej FÍÍJSA platne (Nunc-Immuno platňa, kat. # 43954, NalgeNunc, Naperville, IL) sa potiahli 100 ul 1 ug/ml kozím antiľudskýni IgG, špecifickým pre Fcgamma fragment, polyklonálnou protilátkou (kat # 109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West (love, PA) v 0,2 M pufri tvoreným uhličitanom sodným-hydrogenuhličitanom sodným (pH 9,4) cez noc pri teplote 40 °C. Po premytí premývacím pufrom (PBS obsahujúci 0,1 % Tween 20) sa jamky blokovali 400 pl Superblock Blocking Buffer (kat # 37535, Pierce) počas 30 minút, a potom sa premyli premývacím pufrom Vzorky obsahujúce Hu266 sa vhodne nariedili v ELISA pufri (PBS obsahujúci 1 % BSA a 0,1 % Tween 20) a aplikovali sa na ELISA platne (100 pl na jamku). Ako štandard sa použila humanizovaná anti-CD33 IgGI monoklonálna protilátka HuM195 (Co, et al., 1992). ELISA platňa sa inkubovala počas 2 hodín pri teplote miestnosti a jamky sa potom premyli premývacím pufrom Potom sa do každej jamky pridalo 100 ul 1/1000riedenej HRP-konjugovanej kozej anti-ľudskej kappa polyklonálnej protilátky (kat # 105 0-05, Southem Biotechnology, Birmingham, AL) v ELISA pufri. Po inkubácu počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a premytí premývacím pufrom sa do každej jamky pridalo 100 ul ΑβΤ8 substrátu (kat # 507602 a 506502, Kirkegaard a Peny LAporatories, Gaithersburg, MD). Vývíjanie farby sa ukončilo pridaním 100 ul 2 % kyseliny štaveľovej na jamku. Absorbancia sa odčítala pri 415 nm s použitím OPTImax čítačky mikroplatní (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Prečistenie Hu266. Jeden z transformantov s vysokou expresiou Hu266 označený ako Sp2/0 (kloň 1D9) sa upravil na rast v Hybridoma SFM a expandoval sa na objem 2 litre v otočných bankách. Výčerpaný supernatant kultúry sa získal potom, čo percento živých buniek dosiahlo 10 % alebo menej a vniesol sa do proteín-A Sepharosovej kolóny. Kolóna sa premyla PBS predtým, ako sa protilátka eluovala 0,1 M glycínom-HCl (pH 2,5), 0,1 M NaCI. Eluovaný proteín sa dialyzoval proti 3 výmenám 2 litrov PBS a prefiltroval sa cez 0,2 um filter pred uskladnením pri 40 °C. Koncentrácia protilátky sa určila meraním absorbancie pri 280 nM (1

S K 288723 B6 mg/ml = 1,4 A280). SDS-PAGE v Tris-glycínovom pufri sa uskutočnila štandardným spôsobom na 4 - 20 % gradientovom géli (kat # EC6025, Novex, San Diego, CA.). Prečistená humanizovaná 266 protilátka sa redukovala a spracovala sa na SDS-PAGE géli. Celá protilátka vykazuje dva prúžky približnej molekulovej hmotnosti 25 kDa a 50 kDa. Tieto výsledky sú v súlade s molekulovými hmotnosťami pre ľahký reťazec a ťažký reťazec alebo fragment ťažkého reťazca vypočítanými podľa ich anúnokyselinového zloženia.

Príklad 14

In vitro väzbové vlastnostihumanizovanej 266 protilátky

Väzbová účinnosť humanizovanej 266 protilátky, syntetizovanej a prečistenej opísaným spôsobom, sa porovnávala s my šou 266 protilátkou s použitím biotinylovanej my šej 266 protilátky v porovnávacej ELISA analýze. Jamky 96-jamkovej ELISA platne (Nunc-Imuno platňa, kat #439454, NalgeNunc) sa potiahli 100 ul 13-amyloidového peptidu (1-42) konjugovaného na BSA v 0,2 M pufri tvorenom uhličitanom sodným/hydrogenuhličitanom sodným (pH 9,4) (10 ug/nú) cez noc pri 40 °C. Konjugát ΑβΙ-42-BSA sa pripravil rozpustením 7,5 mg A|ll-42-Gys43 (C-terminálny cysteín na Αβ1-42, AnaSpec) v 500 ul dimetylsulfoxidu, a potom okamžitým pridaním 1 500 ul destilovanej vody. 2 miligramy maleimidom-aktivovaného hovädzieho sérového albumínu (Pierce) sa rozpustili v 200 ul destilovanej vody. Tieto dva roztoky sa zmiešali a nechali sa stáť pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Chromatografia na gélovej kolóne sa použila na separovanie nezreagovaného peptidu odkonjugátu ΑβΙ-42-Cys-BSA.

Na premy tie jamiek fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (PBS) obsahujúcim 0,1 % Tween 20 (piemývací pufor) s použitím piemývacieho zariadenia pre ELISA platne sa jamky blokovali pridaním 300 ul SuperBlock činidla (Pierce) na jamku. Po 30 minútach blokovania sa jamky premyli premývacím pufrom a odstránil sanadbytokkvapaliny.

Zmes biotinylovanej Mu266 (konečná koncentrácia 0,3 ug/nú) a kompetičnej protilátky (Mu266 alebo Hu266; konečná koncentrácia od 750 ul/nú a sériové 3-násobné riedenia) v ELISA pufri sa pridala v trojitom prevedení v objeme 100 ul na jamku. Ako nekompetičná kontrola sa pridalo 100 ul 0,3 ug/nú biotinylovanej Mu266. Ako základná kontrola sa pridalo 100 ul ELISA pufra. ELISA platňa sa inkubovala pri teplote núes tnosti počas 90 min. Po premy tí jamiek premývacím pufrom sa do každej jamky pridalo 100 ul 1 ul/nú HRP-konjugovaného streptavidínu (kat# 21124, Pierce). Platňa sa inkubovala pri teplote miestnosti počas 30 min. a premyla sa premývacím pufrom Na vývoj farby sa pridalo 100 ul/jamku ARTS Peroxidase Substráte (Kirkegaard & Peny Laboratories). Vývoj farby sa ukončil pridaním 2 % ky seliny šťaveľovej v dávke 100 ul/jamku. Absorbancia sa odčítala pri 415 nm Absorbancie sa zaniesli do grafu oproti logaritmu koncentrácie kompetítora, krivky sa upravili pre dáta (s použitím Prism) a určili sa IC50 pre každú protilátku s použitím spôsobov dobre známych v odbore.

Priemerná ICso pre myšiu 266 bola 4,7 ug/nú (tri samostatné pokusy, štandardná odchýlka = 1,3 ul/nú) a pre humanizovanú 266 bola 7,5 ul/nú (tri samostatné pokusy, štandardná odchýlka = 1,1 ul/nú). Bol uskutočnený dmhý súbor pokusov, v podstate tak, ako je opísané, a priemerná IC50 pre myšiu 266 bola 3,87 ul/nú (SD = 0,12 ul/nú) a pre ľudskú 266 bola ICso 4,0 ul/nú (SD = 0,5 ul/nú). Podľa týchto výsledkov možno povedať, že humanizovaná 266 má väzbové vlastnosti, ktoré sú veľnú podobné vlastnostiam myšej protilátky 266. Preto sa predpokladá, že humanizovaná 266 má veľnú podobné in vitro a in vivo aktivity v porovnaní s myšou 266 a ďalej sa predpokladá, že bude mať u človeka rovnaké účinky ako myšia 266 pri myšiach.

Príklad 15

In vitro väzbové vlastnostimyších protilátok 266 a 4G8

Afinita protilátky (KD = Kd/Ka) sa určila s použitím BIAcore biosenzora 2000 a dáta sa analyzovali BIAevaluation (v.3.1) softvérom Záchytná protilátka (králičia anti-myšia) sa naviazala prostredníctvom voľných anúnoskupín na karboxylové skupiny na prietokovej komôrke 2 biosenzorového čipu (CM5) s použitím N-etyl-N-dimetylaminopropyl-karbodiimidu a N-liydroxy sukcíniinidu (EDC/NHS). Nešpecifický králičí IgG sa naviazal na prietokovú komôrku 1 ako základná kontrola. Monoklonálne protilátky boli zachytené s dosiahnutím 300 rezonančných jednotiek (RU). Amyloid-beta 1-40 alebo 1-42 (Bioscience Intemational Inc.) sa potom nechal pretekať okolo čipu v klesajúcich koncentráciách (1000 až 0,1-násobok KD). Na regeneráciu čipu sa naviazaná anti-Αβ protilátka eluovala z čipu s použitím výplachu glycínom-HCl (pH 2). Kontrolná injekcia neobsahujúca beta-amyloid slúžila ako kontrola na odčítanie základných hodnôt. Senzorgramy ukazujúce asociačné a disociačné fázy sa analyzovali na stanovenie Kd a Ka. S použitím tohto spôsobu bola afinita myšej protilátky 266 pre Αβι.40 a Αβι.42 stanovená na 4 pM. Afinita 4G8 pre Αβι.40 bola 23 nM a pre Αβι.42 bola 24 nM. I cez 6 000-násobný rozdiel v afinitách pre Αβ tak 266, ako 4G8, ktorá sa viaže na epitopy medzi aminokyselinami 13 a 28 Αβ, účinne sekvestrujú Αβ z ľudského CSF. Preto je lokalizácia epitopu najdôležitejšia - dôležitejšia ako väzbová afinita - na stanovenie schopnosti protilátky sekvestrovať Αβ, a tým poskytovať výhody predkladaného vynálezu.

S K 288723 B6

Príklad 16

Epitopové mapovanie myšej protilátky 266 s použitím Biacoie metódy a solubilných peptidov

BIAcore je automatizovaný biosenzorový systém na meranie molekulových interakcií (Karlsson R., et al., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)). Výhody BIAcore v porovnaní s inými väzbovými testami spočívajú v tom, že väzba antigénu môže byť meraná bez značenia alebo imobilizácie antigénu (t. j. antigén je v prirodzenejšej konformácii). BIAcore metóda bola použitá na hodnotenie väzby rôznych fragmentov betaamyloidového peptidu na myšiu protilátku 266, v podstate tak, ako je to opísané v príklade 12, s tou výnimkou, že všetky riedenia boh uskutočnené s HEPES pufrovaným salinickým roztokom obsahujúcim Tween 20 a injikovali sa rôzne fragmenty Αβ (BioSource Intemational), a injikovala sa jediná koncentrácia každého fragmentu (440 nM).

Fragmenty beta-amyloidu 1-28, 12-28, 17-28 a 6-25 sa viazali na myšiu protilátku 266, zatiaľ čo Αβ fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 sa neviazali na protilátku. Fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 sa viazali na iné ητΑβ so známou epitopovou špecifickou pre tieto regióny Αβ. Podľa tejto metódy sa zdá, že väzbový epitop myšej protilátky 266 je medzi aminokyselinami 17 a 25 Αβ. Pretože sa väzba realizuje obvykle aspoň s 3 zvyškami v epitope, možno odvodiť, že epitop je obsiahnutý vo zvyškoch 19-23.

Príklad 17

In vitro väzbové vlastnostihumanizovanej protilátky 266

Afinita (KD=Kd/Ka) humanizovanej protilátky 266, syntetizovanej a prečistenej opísaným spôsobom, sa určila v podstate spôsobom opísaným v príklade 15. S použitím tohto spôsobu sa určila afinita humanizovanej 266 pre Λβ 1-42 ako 4 pM.

S K 288723 B6

ZOZNAM SEKVENCIÍ <110> Hctonan, Dávid M.

DeMsUos. Ronald Bales, Kelly R.

Paul. Steven M,

Tsurushita, Naoya

Vasquez, Maximíliano <120 Humanizovanú protilátka, jej fragment a ich použitie, poíynukleová kyselina, expresný vektor, bunka a farmaceutický prostriedok <130> 2522/18478BR <150 PCT/US01/06191 < 151 > 2001-02-26 <150> 60/184.601 <151 > 2000-02-24 <150 60/254,465 <161 > 2000-12-08 <150 00/254,498 <151 >2000-12-08 <160 18 <170> Verzia Patenih 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213 > Mus sp.

S K 288723 B6 <210* 2 <211> 7 <212* PRI <213* Mus sp.

<4002

L-ys V3I Asfi Axc? Pns S&x*

5 <210* 3 <211*9 <212* PRT <213> Mus sp.

<400* 3

Ser -Sit> Ser Thr i-šis Vsi Fro Trp Thr

Ί S <210 4 <211*S <212* PRT <213* Mus sp.

<4Q0>4

S K 288723 B6 <210 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp.

<400 δ <21 y> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Mus sp.

<40D> 6 <21O 7 <211> 113 <212> PRT <213> Umelá <220>

<223> Syntetická humanízované protilátky

S K 288723 B6 <220>

<221 > MISCJEATURE <222> (2)(2) <223> Xaa v polohe 2 je Val alebo lle <220 <221 > MISC_FEATURE <222> (7)(ľ) <223> Xaa v polohe 7 je Ser alebo Thr <220 <221 > MISCJEATURE <222> (14) .. (14) <223> Xaa v polohe 14 je Thr alebo Ser <220>

<221 > MISCJEATURE <222> (15) (15) <223* Xaa v polohe 15 je Leu alebo Pro <220 <221 > MISC.„FEATURE <222> (30) .. (30) <223> Xaa v polohe 30 je lle alebo Val <220 <221 > MISCJEATURE <222* (50)(50) <223> Xaa v polohe 50 je Arg. Gin alebo Lys <220 <221 > MISCJFEATURE <222> (83) .. (88);

<223> Xaa v polohe 88 je Val alebo Leu

S K 288723 B6 <220 <221 > MISC„FEATURE <222* (105)(105) <220 Xaa v polohe 105 je Gin alebo Gly <220 <221 > MISC_FEATURE <222* <108) „ (108) <223> Xaa v polohe 105 je Lys alebo Arg <220 <221 > MISC..FEATURE <222* (109)(109) <223> Xaa v polohe 109 je Val alebo Leu <4007

ňSp

Xaa

Val

Pat

Thr

G·.:;

Xaa

F .< <;

Leu

Sa >:

Len

PXG

Val Xaa

Xaa

Gly

1

10

s. S

Gin

Fro

Ale

Ser

íle

Sa r

Cys

Ary

Ser

Sex

Gin

Sar

Lau Xsa

Tyr

í·;·:

?C

35

30

Ä Sp

Gly

Äsn

Ma

Ty r

latu

Mi.í>

Trp

Phe

La u

Gin

Lys

Pro Gly

Gle

Sex

13

40

4S

Fro

X a a

Leu

lis

Tyx

Ly<

Var

Ser

Asn

ÄSp

Phe

Se r 01 y

Val

Íra

50

35

Ley

ÄSCÍ

Phe

Sa r

L a y

Ses

Gly

Ser

01 y

Thr

ÄS.p

Prie

TLr' lasu

Lys

Íle

S5

75

7 5

Si;

S K 288723 B6 <210 8 <211> 112 <212> PRT <213> Umelá <220 <223* Syntetické humanizované protilátky <220 <221 > MISQ„ FEATURE <222> (1).. (1) <223> Xaa v polohe 1 je Glu alebo Gin <220 <221 > MISC_FEATURE <222> (?).. (?) <223> Xaa v polohe ? je Ser alebo Leu <220 <221* MíSC„FEATURE <222> (46).. (46) <223> Xaa v polohe 46 je Glu, Val, Asp alebo Ser

S K 288723 B6 <220 <221> MISC. FEATURE <222> (63)... (63) <223> Xaa v polohe 63 je Thr alebo Ser <220 <221 > MISC_FEATURE <222> (75).. (75) <223> Xaa v polohe 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr <220 <221 > MISC.FEATURE <222> (76).. (76) <223> Xaa v polohe 76 je Lys alebo Arg <220 <221 > MISC__FEATURE <222> (89).. (89) <223> Xaa v polohe 89 je Glu alebo Asp <220 <221 > MÍSCJEATURE <222* (107).. (107) <223> Xaa v polohe 107 je Leu alebo Thr <400> 8

S K 288723 B6 al <210 9 <211> 113 <212> PRT <213> Umteá <220 <223> Syntetické humanízované protilátky <400 9

V&X Vsi Thr 6Χ.Π S$x; L<$'

S K 288723 B6 :21Ô> 10 :211> 112 :212> PRT

213> Umelá í22G>

;223> Syntetické humanizované protilátky

400 10

S K 288723 B6

Äŕ<; Leu Ser Cve Ala Ale Ser G.i.y Pha Thr Phe Ser Ary

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Alä Pro Gly Lys Gly Leu Glu Lea

Ala Gin íle Asn Ser val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr fro.Asp Thr 50 5560

Lys Gly Arg Fhe Thr Tie Ser Arg Asp Asn Ale Lys Asn Thr Leu

7075

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ale Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

00S5

A ..la Ser' Gly eep ‘syr ’rxľp e».i.y G.í. u Gay Tnr Leu val .i m Va.:. Sex

100105 <210 11 <211* 219 <212* PRT <213* Umelá <220 <223* Syntetické humanizované protilátky

S K 288723 B6

Tyr 115

Pro

Arg Glu

Ala

Lys Val 155

Gin Trp

Lys val Asp Ass> 155

Ala

Leu

Gin. 15H

Sgr

Gly

ÄSS

Sa r

Gin

Glu

Ser

val

Thr

Glu

Gls

ÄSp

šev

Lys

Asp

Ser

165

175

Thr

Tyr

Ser

Sa?:

Thr

Laa

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

125

1.55

1SG

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ald

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

155

205

255

Pro

Vsi

Thr

Lys

Ser

Vhs

Asn

Arg

Gly

Glu

Lys

210 215 <210> 12 <211 >442 <212> PRT <213> Umelá <220 <223> Syntetické humanizované protilátky <400 12

Glu Val Gls. Lea Val Glu Sa:?: Gly Gly Gly L«u Val Gin Pra Gly Gly

S 10 15

S K 288723 B6

Sex Les Are Lea Sex Cys Ala Äla

Sex Na s: Ser Trp Vsi Ary Gin Ale

3540

Ala Gin íle Ase Sex Val GI y Asn

SCS S

i.y:> Gly Gag Vie Thr íle Ger Aeg

ÍÄ?G

Leu Gin Het Asn Ser Leu Leu Ale

3L

Sex Lly Lce TL x GLe Sex Arg Tyx ú S 31

Pre Gly Lys Gly Len Gin Leu Val

S

Ssr TO x Ty x Ty x Pm Asp TAx Val

Ašp Asn Ale Lys Asn Thr Leu Tyr ?S SO

Glu Äsp Thr Ala Vssl Ty:e Tyx Gys

SS

Ala

S® r

Gly Äsp

100

Ty r

Trp Óly

Gin

Gly

105

Thr

Le a val

Thr val

Sen

110

Ale

Set

L.c

Lys

Gly

Pro

Sen

VaSne

P LA

Le a

Ala

Gro

Se r

Lys ger

Tnx

130 i?he l'xe

115

120

Sex

G Lu

1<:5

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Tyr

13S leO

Val

Thr

Val

Sen

Ä&i í

Se ľ?

Leu

150

155

100

S K 288723 B6

Gly

M Hla Tlk

Phe 165

Pre Miä Val

Lao Gin Sax' l~0

Ser

Gly Lsíx

Tyr 17 S

Sa x

La a

w

Ser

i

Val

Thr

Val

Gro

Ser

Lxsxs

Gly

Thr

Gls

Thr

aí.

100

1 00

Tyr

Ha

Cys

Asn

Val

ÄSÓ

Kis

Lys

Gro

Ser

Äsxt

lír

Lys

Val

Asp

Lys

L'V;

200

205

Lys

Val

Glu

G?XJ

Lys

Sa r

Cys

Asp

Lys

Thr

Hxs

Thr

Cys

Pru

Or u

Cys

21·;

215

2 20

Psa

šla

Gro

Glu

Leu

Gly

G t y

Pxo

Ser

Val

Ghe

Lea

óha

Pív

Pro

.225

230

235

240

Lys

Gro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

šxa

Thx-

Gro

Glu

Val

Thr

Cys

245

250

2S5

Vel

Val

Asp

Val.

Ser

Hla

Glu

Asp

Gro

Glu

Val

Lys

Oho

Äsn

Trp

200

265

27 0

Tyr

Val

Mp

Gly

Val

Glu

Val

HiS

ÄSH

A1 a

Lys

Thr

Lys

Gro

Ary

Clu

275

280

281

TI:,'

G1 n

Tyr

ô sa

ôer

Thr

Tyr

2r<·

Vaa

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Lea

2S0 295 3-00

S K 288723 B6

S K 288723 B6 <210 13 <211> 46 <212> DNA <213> Umeiá <220 <223> Syntetický oligonukteotid <400 13 <210 14 <211 >50 <212> DNA <213> Umelá <220 <223> Syntetický nligonukleotíd

400 14 :g<jatag.

<210 15 <211> 16 <212> PRT <213> Umelá <220 <223> Syntetické humanizované protilátky <400 15

S K 288723 B6 <210 16 <211> 17 <212* PRI <213> Umelá <220 <223> Syntetické humanlzované protilátky <400> 16

Ciň Xl«. Äsjj Vg.l Gly Asa Sar Thr Tys Tyr Pro Ä.sp S«.r Val Lys ä

<210 17 <211> 1950 <212> DNA <213> Umelá <220 <223> Syntetický polynukfeotíd <400 17

Aooogí.c.C3o catgaagŕtg cctottag^c tgtrggtgct artcatgcxt.

<?<;aygt«t«Ä ;:g·:.·:gtaata ssccsgsgoe eactctcce*: qcctgtcacc ctt^acaac csga a : cca t ct c t tgcs ýa tctagtešgš gccttatata t a g ŕ ga. t gga a a cg oct a 11

LN:

Sú

S K 288723 B6

<: ·;; <. v; '<: <.:; <:. v :.ý ::	atcttt^aao		tc kfttttíX’t	catttaat.aa	tí: a·: : a teta	: ?-' $
txg š -.-.4:-::	aactactcaa	x’-Xť-r <-^:-. i.·-:·.	aa$5<jae.taa	asxtgtwsts	a. t actsa-^c	ί.3ΘΟ
	r. r.^txxHXšt	ss.t.cí’’: tcat	teta 1.11 tas	oeť«t<yst-t··”	tttcícaaaaí:
aštectccxt	<?.<$<$ >:$<XX? :‘Jt \'-:a	ascst -ľc·:;??:	cct.CÄcag:;::::	CXrotXX^tČ:;;	tegtíX'SSCs	1 ííCô
gacttgcttta	i:§tttt<:<:	šstxst sagc	-äagcsstsat	a^ŕeaštttt	ääxxxteííc®	1560
gtjttttBoag	tsat.at.atec	tttxattCÄsí	t.t.ccet<g®ea	á x. s.-áa?... ;.aa:a.	gcaaaktttt	1620
CSe-äsCSÄÍJá	ascctsetat	aaaGStasätc	atxca.ttcoa	«c-stsatata	aaataac&aa.	1080
ac®at:&&aag	cssttaaa ta	a:axa a <' Oíi a t	ag§§-aaatgt	ttaggttcat	cstg^tactt	; 7 á 0
	gasitgtcatíj	set ta 11 .-š.::	atttttaaac	agqta<t:<X§	ggactcctíst	1006
stgoca»g^g	cCíjí; «tltí-sg	tasí 11 cmc	aacctaattt	aavs4^a44.a s t	stactgtqax	1060
attaaaaac®	ttsat.t.aa.a.a	t<5tt«CÄS«s	íjt.tstataa®	^Gtga§agac	aaatatattc	910
tataaetcag	castcccact	tctaggatcc				10SÔ

<2W> 18 <211> 3221 <212> DNA <213> Umslá <220 <220 Syntetický polynukleobd <400 18 acscgtocac <xtgaat.ttx gggc'tca^ct tgsttttcet tctcettgtt ttsaaa^t^

S K 288723 B6

icctgcgiga	agtgaagctg	gtggagtstg	gggcaogttt.	agtgeagocí:	ggagggtccc	1Ä0
tgsgactctc	ctgtgcagcc	tct.ggattica	cí: ·: : Ľí-gtag	gtar wca r.g	tcttgggttc	1SG
gíeaggctcc	aggcaagggc	ctggaattgg	i: cgcacaaat	taaíagtgtt	ggtsatagc«	240
cctaciatcc	agacačtgta	äagggucgas:	ccíiccatctc.	cisgagsoaa i.	gccaagaaca	300
cc.ctgtacc.t.	gcaaatgaac	ťeectgaggg	cccssagacac.	ggccgtg-NN	tacťgtgcaa	360
gcgcagacta	ctggggeeaa	ggcacecxgg	tgacagCctc	i:tcaggš-ga.g	tcctcacaac	420
ctctagagct	č fcctggggca	ggccaggcct	gaccttggct	ttggggcagg	gagggggcfca	4 80
aggcgaggca	ggtggogeca	gccsggtgca	cačccaacgc	ceatgagccc	agacactgga	54 0
cgctgaacct	cgcggacagt	É«äg:äa<xc.a	ggggcctctg	cgccctgggc	coaqctctgt	600
Kxcacaeegc	ggtcacatgg	csccaíxt.ct	cttgcagect.	ccaccaaggg	cccatcggtc	660
ttccccctgg	caccctcctc	caagagcacc	tetgggggca	cagcggocct	gggctgcctg	720
gtcaaggact	acttccccga	accggtgacg	gtgtcgtgga	actcaggcgc	cctgaccagc	730
ggcgtgcasa	cct i: cccggc	tgtcctacag	tcctcaggao	tctactccct	cagcagcgτg	84 0
gtgaccgtge	cctccagcag	ctfcgggcacc	es g äccfcaca	tetgcaacgt	q q. <s v, cš c&<& c?	900
cccŕígcaaca	ccaaggtgga	caagaaagtt	ggtgagaggc	cagcacaggq	agggagggčg	960
tgtgcOggaa	gccäggqtca	gcgútcctgc	ccggacgcat	cc.cggctatg	c ,a g cc cca g t	2020
ceagggcagc	aaggcaggcc.	ccgtctqcct	cŕKcacccgg	aggcetctgc	ccge.cce.act	2080
eatgcteagg	gagagggtet	tctggctttt	tccccag-gcr	cšgggcaggo	acaggctagg	1148

S K 288723 B6

5	Cí::<šíj<iCC€€\5	·.· ::L'.ľ<>vL: <?.<>.<> š^Q	«/í C Λ g-5555 ·5·:>	.:,Λ.€.:ί-5		;> £: f:
. ?ó::- :554:	O'?i<í;53CCC £ í?	5-5-:-.:.-::.:-:-5--.:-	Sí5.gí5í5Cí:	Í55!<s/íg:g<?<:;a:s	:Sí: 5: í: 55/::5 S 5Ϊ 55	1 s &e-
5XX51€:5/:: ·>: 55	<í<í^-:tace ·: ·:<?.	/c:, z···::;.···:···:···:.s.	:jsŕ KC<5íí«t::5	5ÄÍ5 5:/55555 s -a t <5		::/>
.·&& n C	ťtgt<?acaaa	aeLOšscäSCÄt:	Lxj	cceaggtasg	C5./íSy5.55_:55/a<J<;
c~r íľgccctc:		-5-/.; íjacagg :	gcccta^agt	;:5;.:?::t.g::-:51 c	:55:-)-5:555-5/::-:::	X ·Λ ·> ν'·
cccca^ocí^	gtíäcxg«c«c	g:: c:.·:* :5-5:: CC	atocottcct	55agc«c<:t:«';	•5-5.U::--5t 5-5-)--5	a 5.S0
Cj C;ÁiC£í3 T C« <í	tctfccctctt	ccccccaaaa	cccaaggaca	£·££. k <?·<>X í; :: tí	ct-ccc^^acc	1 \
	eatgc^tggt	ggi/ggscgtg	äí^ccas§®a§	accctgaggt	caa^ttcaac	wc
t :5Α:.<:<:·:α.:?·;5	ac^c^t^ga	ggtgcaťsat	gccaaasc/sô	agcc^c^gga	í/g/ÄgcagHi/:	1S80
aaca§«®c§t	acostgtggt.	cagcgtcoto	aoogtcct^c	ac55ftfsgaí/ŕg	555:5- gssirg-go	1740
asggagtsca	agtgcaaogt	otccaacaaa	gccctíxx:®^	cccccatega	gaaaacoatc	A. Ό· X V
tCCáÄS;«€ťIÄ	«<-5j<5tggg&í5	5/555?/qggg·: q	cgsgggccac		gccggctcgg
ccoaesjctct	^accrgagag	tgacegctgt	aooaacotct	v 0 OO C-'ä·^	íjg ¢555.5)55 55555555
a^aaccacag	gfcgtac&ece	tí ££CCCCC&tí c	s:cgg:g«tg:s<j	ctgaccaaga	Äíísjaíjíjtí/Sg	ΐθδδ
v'Cy^ <$\X? L \< C	ctggt cä.ä3«	«cttctstcc	<:ä'?«$aoatc	§ec§tggagt	^<$<Í..:i^Ä^CÄa	2>Λ δ
tgggcsgíxsg	gagaacaact	<5.ζκ<5·<5^ <$.<?.<? <$<?·	3 cct €<:<<; tsg	ct4§aot.ce<g	^555)55555:.5555/ í	2/.00
ctSí?etít;sts::	agc.aa$«ca	<:<:<rt:<í<s:a>::ss		cagcsggggs	sc5jt:ett:ct:<~	21 08
	:št<;C;st:§aíj<>	GtCťíJCSOS.®	ccsctacsog	C/Äg/s/sga 5^5555	t :5/.::5:555 Ž. 5) v 55	<í .ť. .<vV

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostriedok obsahujúci humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na použitie na prevenciu alebo liečbu piedklinickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) alebo

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a sekvenciu kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ľahkého reťazca, a

b) ťažký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) alebo

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gy (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gy Asp Tyr (SEQ ID NO: 6), a sekvenciu kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ťažkého reťazca.
2. Farmaceutický prostriedok obsahujúci humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na použitie na prevenciu, liečbu alebo reverziu kognitívneho deficitu pri subjekte, ktorému bola diagnostikovaná predklinická alebo klinická Alzheimerova choroba, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

1 5 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gy Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) alebo

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gy Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

S K 288723 B6

1 5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a sekvenciu kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulínového ľahkého reťazca, a b) ťažkí reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementárnu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) alebo

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6), a sekvenciu kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulínového ťažkého reťazca.
3. Farmaceutický prostriedok na použitie podľa nárokov 1 alebo 2, kde protilátka obsahuje CDR1 ľahkého reťazca:

15 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 ťažkého retezca:

15 10 15

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).
4. Farmaceutický prostriedok na použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilný región ľahkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu:

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 15 1015

Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser

20 2530

Asp Gly Asn Ala TyrLeu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

35 4045

Pro Xaa Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 5560

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys íle

65 70 7580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser

85 9095

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu He Lys

100 105110

Arg (SEQ ID NO: 7), kde

Xaa v pozícii 2 je Val alebo íle;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Thr,

Xaa v pozícii 14 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 15 je Leu alebo Pro;

Xaa v pozícii 30 je íle alebo Val;

Xaa v pozícii 50 je Agr, Gin alebo Lys;

Xaa v pozícii 88 je Val alebo Leu;

Xaa v pozícii 105 je Gin alebo Gly;

Xaa v pozícii 108 je Lys alebo Arg a

Xaa v pozícii 109 je Val alebo Leu;

S K 288723 B6 a variabilný región ťažkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu:

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 2530

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val

35 4045

Ala Gin He Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val

50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp AsnXaa Xaa Asn ThrLeu Tyr

65 70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 9095

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

100 105110 (SEQ ID NO: 8), kde

Xaa v pozícii 1 je Glu alebo Gin;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Leu;

Xaa v pozícii 46 je Glu, Val, Asp alebo Ser,

Xaa v pozícii 63 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr,

Xaa v pozícii 76 je Lys alebo Arg;

Xaa v pozícii 86 je Glu alebo Asp a

Xaa v pozícii 107 je Leu alebo Thr.
5. Farmaceutický prostriedok na použitie podľa nároku 4, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 9 a variabilného regiónu ťažkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 10.
6. Farmaceutický prostriedok na použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 11a variabilného regiónu ťažkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 12.
7. Použitie farmaceutického prostriedku obsahujúceho humanizovaná monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na výrobu liečiva na prevenciu alebo liečenie predkUnickej alebo klinickej Alzheimerovej choroby, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

1 5 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) alebo

1 5 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a sekvenciu kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulínového ľahkého reťazca, a

b) ťažký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

1 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

15 10 15

Gin íle Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly

S K 288723 B6 (SEQ ID NO: 5) alebo

15 10 15

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6), a sekvenciu kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ťažkého reťazca.
8. Použitie farmaceutického prostriedku obsahujúceho humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá sa špecificky viaže na epitop obsiahnutý v pozíciách 13 až 28 peptidu Αβ, na výrobu liečiva na prevenciu, liečenie alebo reverziu kognitívneho deficitu pri subjekte, ktorému bola diagnostikovaná predklinická alebo klinická A Izhe imerova choroba, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) ľahký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ľahkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ľahkého reťazca:

15 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) alebo

1 5 1015

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

- CDR2 ľahkého reťazca:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

- CDR3 ľahkého reťazca:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a sekvenciu kostrovej oblasti ľahkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ľahkého reťazca, a

b) ťažký reťazec obsahujúci tri regióny určujúce komplementaritu (CDR) ťažkého reťazca majúce ďalej uvedené aminokyselinové sekvencie:

- CDR1 ťažkého reťazca:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

- CDR2 ťažkého reťazca:

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) alebo

15 1015

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

- CDR3 ťažkého reťazca:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6), a sekvenciu kostrovej oblasti ťažkého reťazca z ľudského imunoglobulinového ťažkého reťazca.
9. Použitie farmaceutického prostriedku podľa nárokov 7 alebo 8, kde protilátka obsahuje CDR1 ľahký reťazec:

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala TyrLeu His (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 ťažký reťazec:

15 10 15

Gin íle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).
10. Použitie farmaceutického prostriedku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilný región ľahkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu:

S K 288723 B6

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly

15 1015

Gin Pro Ala Ser íle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser

20 2530

Asp Gly Asn Ala TyrLeu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

35 4045

Pro Xaa Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 5560

Asp Arg Phe Ser Gy Ser Gy Ser Gy Thr Asp Phe Thr Leu Lys He

65 70 7580

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gy Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser

85 9095

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gy Xaa Gy Thr Xaa Xaa Glu íle Lys

100 105110

Arg (SEQ ID NO: 7), kde

Xaa v pozícii 2 je Val alebo He;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Thr;

Xaa v pozícii 14 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 15 je Leu alebo Pro;

Xaa v pozícii 30 je íle alebo Val;

Xaa v pozícii 50 je Arg, Gn alebo Lys;

Xaa v pozícii 88 je Val alebo Leu;

Xaa v pozícii 105 je Gn alebo Gy;

Xaa v pozícii 108 je Lys alebo Arg a

Xaa v pozícii 109 je Val alebo Leu;

a variabilný región ťažkého reťazca obsahujúci ďalej uvedenú sekvenciu:

Xaa Val Gn Leu Val Glu Xaa Gy Gy Gy Leu Val Gn Pro Gy Gy

15 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gy Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 2530

Ser Met Ser Trp Val Arg Gn Ala Pro Gy Lys Gy Leu Xaa Leu Val

35 4045

Ala Gn He Asn Ser Val Gy Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val

50 5560

Lys Gy Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp AsnXaa Xaa Asn ThrLeu Tyr

65 70 7580

Leu Gn Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 9095

Ala Ser Gy Asp Tyr Trp Gy Gn Gy Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

100 105110 (SEQ ID NO: 8), kde

Xaa v pozícii 1 je Gu alebo Gn;

Xaa v pozícii 7 je Ser alebo Leu;

Xaa v pozícii 46 je Gu, Val, Asp alebo Ser,

Xaa v pozícii 63 je Thr alebo Ser;

Xaa v pozícii 75 je Ala, Ser, Val alebo Thr,

Xaa v pozícii 76 je Lys alebo Arg;

Xaa v pozícii 89 je Gu alebo Asp a

Xaa v pozícii 107 je Leu alebo Thr.
11. Použitie farmaceutického prostriedku podľa nároku 10, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 9 a variabilného regiónu ťažkého reťazca uvedenú v SEQ ID NO: 10.
12. Použitie farmaceutického prostriedku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 11, kde protilátka má sekvenciu variabilného regiónu ľahkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 11 a variabilného regiónu ťažkého reťazca obsahujúcu SEQ ID NO: 12.