JP7330164B2 - アミロイドベータに対する抗体 - Google Patents
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Description
本PCT出願は、2017年7月18日に出願された国際出願PCT/CA2017/050866号および2018年1月25日に出願された米国仮特許出願第62/622,126号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体に組み込まれる。
本開示は、アミロイドベータ(AベータまたはAβ)オリゴマーに対して選択的なヒト化抗体ならびにその組成物および使用に関する。
EFS-WEBから提出され、2018年7月18日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表「P50442PC02SL_asfiled.txt」(82,028バイト)が参照により本明細書に組み込まれる。
a.生体試料と、本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること;および
b.何らかの抗体複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。
a.抗体:Aベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Aベータオリゴマーに特異的かつ/または選択的な本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること;および
b.何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がAベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
本明細書には、表2に示す配列を有するCDRを含み、かつ/あるいは表4Aおよび4Bのいずれかに記載される可変領域配列を有する、キメラ抗体およびヒト化抗体、その免疫療法組成物ならびにその使用方法が提供される。前記抗体は、アルツハイマー病(AD)に関連するオリゴマー種を含めた、Aベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る。
本明細書で使用される「Aベータ」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Aベータ、Aベータまたは「Aβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、36~43個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトAベータを包含する。Aベータ40は40アミノ酸型を指し、Aベータ42は42アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Aベータ42のアミノ酸配列は配列番号73で示されるものである。
本明細書に特定の抗体およびその使用を開示する。
さらなる態様は、本明細書に記載される核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入ったi)抗体および/またはその結合フラグメント、ii)前記抗体またはその一部の核酸、iii)本明細書に記載される抗体、核酸または細胞を含む組成物あるいはiv)本明細書に記載される組換え細胞と、任意選択で参照物質および/またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
本明細書に記載される抗体を作製する方法が含まれる。
a.抗体:Aベータオリゴマー複合体の生成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のAベータオリゴマーに特異的かつ/または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること;および
b.何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がAベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
(a)抗体-抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の被験試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと;
(b)被験試料中の抗体-抗原複合体の量を測定することと;
(c)被験試料中の抗体-抗原複合体の量を対照と比較することと
を含み、
対照と比較して被験試料中に抗体-抗原複合体が検出されることにより、試料がAベータを含むことが示される。
実施例1
抗体作製
方法および材料
免疫原
シクロ(CGHHQKG)(配列番号12)ペプチド(環状および直鎖状の両方)をCPC Scientific社(サニーベール、カリフォルニア州、米国)で作製し、トリフルオロ酢酸塩対イオンプロトコルを用いてKLH(免疫感作用)およびBSA(スクリーニング用)とコンジュゲートした。同じ配列CGHHQKG(配列番号12)の直鎖状ペプチドも作製した。
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と結合したシクロ(CGHHQKG)(配列番号12)に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を作製した。
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール(PEG1500)の存在下でマウスSP2/0ミエローマ細胞と融合させた。HAT選択を用いて融合細胞を培養した。
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ELISAによりスクリーニング抗原(環状ペプチド-BSA)(一次スクリーニング)で試験し、ヤギ抗IgG/IgM(H&L)-HRP二次抗体を用いてIgG抗体およびIgM抗体の両方について探索し、TMB基質で発色させた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原(ヒトトランスフェリン)で再試験して非特異的mAbを除去し、偽陽性を除外した。選択されたクローンについて抗体捕捉ELISAによりアイソタイピングを実施して、それらがIgGアイソタイプであるのか、またはIgMアイソタイプであるのかを判定した。また、選択されたクローンを間接ELISAにより他の環状ペプチド-BSAコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド-BSAコンジュゲートで試験して、交差反応性およびリンカー反応性を評価した。抗体をSPR解析でもスクリーニングした。
ELISAプレートを1)4℃の炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)O/N中0.1ug/ウェルのシクロペプチドコンジュゲートBSA 100uL/ウェル;2)4℃の炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)O/N中0.1ug/ウェルの直鎖状ペプチドコンジュゲートBSA 100uL/ウェル;または3)4℃の炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)O/N中0.1ug/ウェルの陰性ペプチド 100uL/ウェルでコートした。37℃で振盪しながら1時間インキュベートした100uL/ウェルの一次抗体:ハイブリドーマ上清。二次抗体:37℃で1時間振盪したPBS-Tween中1:10,000の100uL/ウェルのヤギ抗マウスIgG/IgM(H+L)-HRP。全洗浄段階をPBS-Tweenで30分間実施した。基質TMBを50uL/ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の1M HClで停止させた。
抗体と環状ペプチド、Aベータモノマーおよびオリゴマーとの結合に関するSPR解析
Aベータモノマーおよびオリゴマーの調製:氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)にAベータ40およびAベータ42ペプチド(California Peptide社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国)を溶かした。一晩蒸発させることによりHFIPを除去し、SpeedVac遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をDMSOで戻して5mMとし、dH2Oでさらに100μMに希釈し、直ちに使用した。5mMのDMSOペプチド溶液を無フェノールレッドF12培地(Life Technologies社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ)で希釈して最終濃度100μMにすることによりオリゴマーを調製し、4℃で24時間~7日間インキュベートした。
重鎖および軽鎖のCDRおよび可変領域のシーケンシングを実施した。標準的なRT-PCRを用いて、ハイブリドーマが発現した免疫グロブリン遺伝子転写物をハイブリドーマ細胞から得たcDNAから増幅し、標準的なダイターミネーターキャピラリーシーケンシング法を用いてシーケンシングを実施した。
301-17のヒト化IgG4抗体構築物を調製し、シーケンシングを実施した(Abzena社、ケンブリッジ、イギリス)。
ELISA試験では、ハイブリドーマクローンが直鎖状ペプチドよりシクロペプチドと優先的に結合することがわかった。シクロ(CGHHQKG)に対して生じさせたクローン301-3、301-11および301-17をさらなる解析に選択した。
クローン301-3、301-11および301-17抗体のシーケンシングを実施した。301-3および301-11のCDR配列を表2に記載する。301-17のCDRを配列番号74~79に記載する。抗体の重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスDNA配列およびポリペプチド配列を表3に記載する。
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬(Dako Canada社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ)と1時間インキュベートすることにより非特異的染色をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した:マウスモノクローナルアイソタイプ対照IgG1、IgG2aおよびIgG2bならびに抗アミロイドβ6E10(以上、Biolegend社から購入)ならびに精製抗体301-11および301-17。いずれの抗体も1μg/mLで使用した。切片を室温で1時間インキュベートし、TBS-Tで3×5分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスIgG(1:1000)を切片に添加し、45分間インキュベートし、次いでTBS-Tで3×5分間洗浄した。DAB発色試薬(Vector Laboratories社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ)を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡(Zeiss Axiovert 200M、Carl Zeiss Canada社、トロント、オンタリオ州、カナダ)下で検査し、Leica社のDC300デジタルカメラおよびソフトウェア(Leica Microsystems Canada社、リッチモンドヒル、オンタリオ州)を用いて代表的な画像を20倍および40倍の倍率でキャプチャーした。Adobe PhotoshopでLevels Auto Correctionを用いて画像を最適化した。
SPR解析:AD患者の脳抽出物4例および同年齢対照の脳抽出物4例をプールし解析した。TBS中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第9野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるMolecular Affinity Screening System(MASS-1)(Sierra Sensors社、ハンブルク、ドイツ)を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインA誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を180秒間注入し、次いで、緩衝液で120秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照IgG参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
脳抽出物、CSFおよび免疫組織化学
死体健常対照およびADの脳の可溶性脳抽出物、CSFおよび組織試料中での抗体のAベータとの結合能を試験し、結果を表6に示す。表6の陽性強度は正符号の数で示されている。
Aベータ合成オリゴマーとの結合
Aベータ42オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、精製抗体をセンサーチップに共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なAベータ42オリゴマー(1microM)(SynAging社、ヴァンドゥーヴル=レ=ナンシー、フランス)の表面に注入した。
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
抗体301-11、301-17を用いてヒトAD脳組織切片を評価した。患者はそれまでに、(i)老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、(ii)アミロイドを示すコンゴーレッドならびに(iii)濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の3部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を10%緩衝ホルマリンで数日間固定し、Sakura VIP組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復(AR)を実施するか、または実施せずに、1μg/mlの抗体で探索した。陽性対照として汎アミロイドベータ反応性抗体6E10を選択した抗体クローンとともに含めた。抗体を抗体希釈剤(Ventana社)で希釈し、OptiView DAB(Ventana社)で発色させた。Ventana Benchmark XT IHC染色装置で染色を実施した。Olympus BX45顕微鏡で画像を取得した。神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が画像を盲検的に解析した。
組換えIgG1抗体およびIgG2a抗体
ハイブリドーマ由来301-17のCDRをマウスIgG1またはIgG2aの主鎖に移植することにより組換えIgG1およびIgG2a 301-17構築物を作製した(WuXi Biologics社)。その配列を表8に記載する。
およその動態値は次の通りであった:
ハイブリドーマ:KD=26.9nM
IgG2a-301-17抗体:KD=16.2~19.5nM
対照マウスIgGでは結合は検出されなかった。
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンT(ThT)結合アッセイを用いてアミロイドベータ(Aβ)凝集に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をin vitroで試験した。Aβ凝集は、予め形成された小さいAβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Aβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には、同時に増大するベータシート形成が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のThTによってモニターすることができ、ThTがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ385nmから450nmおよび445nmから482nmに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Aβ1~42(Bachem Americas社、トーランス、カリフォルニア州)を可溶化し、超音波処理し、トリス-EDTA緩衝液(pH7.4)で希釈し、黒色の96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio-One社、モンロー、ノースカロライナ州)のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスIgG抗体アイソタイプ対照を加え、Aβ1~42ペプチドと抗体のモル比を1:5とした。ThTを加え、プレートを室温で24時間インキュベートし、1時間毎にWallac Victor3v 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いてThT蛍光の測定値(440nmで励起、486nmで発光)を記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
毒性阻害アッセイ
抗体によるAベータ42オリゴマーの毒性阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
in vivo毒性阻害アッセイ
抗体によるAベータ42オリゴマーの毒性阻害をマウス行動試験でin vivoで試験することができる。
新奇物体認識(NOR)モデルでは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用する。この試験は、諸項目について認識記憶を評価するものであり、そのヒトに相当するものが視覚的対比較(VPC)である。げっ歯類、霊長類およびヒトでは、物体の認識は嗅周皮質を介するものである。AD病態は最初、海馬より先に嗅周皮質および嗅内皮質に発現する。VPCの作業課題は軽度認知障害(MCI)の記憶欠損を検出するものであり、この作業課題によってMCIからADへの転換が予測される(16)。
試験はSynAging社(ヴァンドゥーヴル=レ=ナンシー、フランス)で実施した。第0日、1グループ当たり12匹のC57BL6Jマウス(11~12週齢)に溶媒(Aβオリゴマー化に使用した緩衝液)またはAβO(50ピコモル)を溶媒(PBS)または抗体301-17の存在下でICV注射した。第+7日および第+8日に実施した新奇物体認識(NOR)試験により全マウスの認知能力を求めた。
・グループA(溶媒対照):溶媒のICV注射(n=12)
・グループB(AβO対照):AβOのICV注射(n=12)
・グループC(抗体対照):AβO+抗体のICV注射(n=12)
・グループD(治療):AβO+抗体のICV注射(n=12)
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー(PSD95、SNAP25、シナプトフィジン)および炎症マーカー(IL-1ベータおよびTNFアルファ)のレベルを解析することができる。オリゴマーのICV注射から約14日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで-80℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をBCAにより求める。ELISAキット(Cloud-Clone社、米国)を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。通常、Aベータオリゴマーを注射したマウスではシナプスマーカーが25~30%減少し、ヒューマニン陽性対照により90~100%に回復する。Aベータオリゴマーを注射したマウスではIL-1ベータ炎症性マーカーの濃度が約3倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。
in vivo伝播阻害アッセイ
Aベータ毒性オリゴマーのin vivoの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病(AD)げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトAPPのトランスジェニックマウス(例えば、APP23マウス)またはヒトAPPとPSEN1のトランスジェニックマウス(APPPS1マウス)は高レベルのAベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる(13、14)。これらのモデルは、脳内または全身に投与した被験抗体によるAベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
1)
HHQK(配列番号7)
CGHHQKG、シクロ(CGHHQKG)(配列番号12)
ヒトAベータ1~42
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号73)
組換え抗体(HHQK)
ハイブリドーマ由来301-17の可変領域をマウスIgG1またはIgG2aの主鎖に移植することにより組換えIgG1およびIgG2a 301-17構築物を作製した(WuXi、Biologics社)。
およその動態値は次の通りであった:
ハイブリドーマ:KD=26.9nM
IgG2a-301-17抗体:KD=16.2~19.5nM
対照マウスIgGでは結合は検出されなかった。
組換え301-17 IgG1はIgG2a組換えと同程度のKDであった。
可溶性脳抽出物中でのヒト化抗体の結合
方法
可溶性脳抽出物のプールをSuperdex 75(10/300)HPLCカラムの中に0.5ml/分で50分間注入し、0.25mlの画分を収集した。
可溶性ヒトAD脳抽出物のSEC分画により、毒性のあることが報告されている二量体、四量体および十二量体の存在と一致するLMWピークがあり、再現性のあるパターンが得られた。301-17のヒト化抗体(VH2Vk5)(配列番号45、46および配列番号65、66)をマウスモノクローナル型(301-17;表3)およびその他のAベータ抗体と比較した。
方法:凍結ヒトAD脳切片をヒト化301-17およびその他のAベータに対する抗体で染色して、実質のAベータ斑および血管のAベータ沈着物との結合の程度を評価した。
Aβのモノマーおよびオリゴマー
組換えAβ42ペプチド(California Peptide社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国)を氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に溶かした。一晩蒸発させることによりHFIPを除去し、SpeedVac遠心機で乾燥させた。モノマーを調製するため、ペプチド膜をDMSOで戻し5mMとし、さらに蒸留水(dH2O)で100μMに希釈し、直ちに使用した。5mMのDMSOペプチド溶液を無フェノールレッドF12培地(Life Technologies社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ)で最終濃度100μMに希釈することによりオリゴマーを調製し、4℃で24時間インキュベートした後、直ちに使用するか、-80℃で保管した。
メリーランド大学のBrain and Tissue Bankおよびケース・ウェスタン・リザーブ大学(クリーブランド、オハイオ州、米国)のJiri Safar博士から11例の異なるヒトAD患者の脳組織を入手した。ADの臨床診断はNINCDS-ADRDA基準に基づくものであった。前頭皮質の試料の重量を量り、次いで、脳組織の最終濃度が20%(w/v)になる体積の新鮮な氷冷TBS緩衝液およびロシュ・ダイアグノスティックス社(ラバル、ケベック州、カナダ)のEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルに浸漬した。機械的プローブホモジナイザーを用いて、組織をこの緩衝液中でホモジナイズした(間に30秒の休止を挟んだ3×30秒のパルス、いずれも氷上で実施)。次いで、TBSホモジナイズ試料を超遠心分離に90分間供した。上清(可溶性抽出物)を収集し、一定分量ずつに分け、-80℃で保管した。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を求めた。各解析に3~8例の患者の脳抽出物のプールを使用した。
プールした可溶性脳抽出物をSuperdex 75(10/300)HPLCカラムの中に0.5ml/分で50分間注入し、0.25mlの画分を収集した。分子量(MW)マーカーを別個に流した。O.D.280nmでの吸光度によりタンパク質ピークをモニターした。約8kDa~約70kDaのMWに対応する画分を低分子量(LMW)画分にプールした。Aβモノマー(MW約4.5kDa)をLMW画分から排除した。70kDa超~約700kDaのMWに対応する画分を高分子量(HMW)画分にプールした。LMW画分およびHMW画分を濃縮し、BCAアッセイで総タンパク質濃度を求めた。次いで、表面プラズモン共鳴(SPR)解析用に画分をPBS-EP、BSA(2mg/ml)緩衝液で100μg/mlに希釈した。
プールしたヒトAD可溶性脳抽出物(3例の脳からのプール)のLMW画分およびHMW画分中の凝集Aβおよび総Aβ(モノマーおよび凝集体)の量をQPS(グランバッハ、オーストラリア)で測定した。市販の免疫吸着アッセイ(MSD社、ロックビル、メリーランド州、米国)にペプチド標準品を用いてAβ38、Aβ40およびAβ42の総量を求めた。Amorfix Aggregated Aβ Assay(A4)を用いて凝集Aβのレベルを測定した。簡潔に述べれば、Amorfix Disaggregation Plateのマトリックスで凝集AβをモノマーAβから分離した。マトリックスにはオリゴマーが付着し、フロースルー中にはモノマーがみられる。2回の洗浄段階の後、付着したAβ凝集体をモノマー化し、HFIPで溶出させた。HFIPが完全に蒸発するまでHFIP溶出液中のモノマー化Aβをドラフト下で乾燥させ、アッセイ緩衝液に再懸濁させた。分解されたモノマー化Aβ凝集体について、MSDアッセイでAβ38、Aβ40およびAβ42の測定を実施した。LMW脳画分およびHMW脳画分中の総タンパク質濃度をBCAにより測定し、その結果を総タンパク質1mg当たりのAβ種のpgとして表す。
Molecular Affinity Screening System(Sierra Sensors社、ハンブルク、ドイツ)を用いて表面プラズモン共鳴を実施した。精製抗体をセンサーチップ上に固定化した。Aβペプチドモノマー、合成Aβオリゴマーまたはプールした可溶性ヒトAD脳抽出物の調製物(100μg/ml)を表面に注入した後、解離相に移った。センサグラムを二重参照で減算した。示されるSPRの結果は、2~8回の独立した試験で反復したものである。
新鮮な凍結AD脳切片を抗原回復クエン酸緩衝液(Target Retrieval Solution、Dako社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)に20分間曝露し、加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬(Dako社)と1時間インキュベートして非特異的染色をブロックした。切片を1μg/mlの一次抗体(mu301-17、hu301-17、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、アイソタイプ対照)と4℃で一晩インキュベートし、0.1%TritonX-100(TBS-T)緩衝液を含有するトリス-緩衝生理食塩水で5分間、3回洗浄した。切片に二次HRPコンジュゲートウサギ抗ヒトIgG(0.4μg/ml;Abcam社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国)またはヒツジ抗マウスIgG(1:1000希釈;GE Healthcare社、シカゴ、イリノイ州、米国)抗体を加え、1時間インキュベートした後、TBS-T緩衝液で3回洗浄した。陰性対照として、一次抗体に曝露していない切片にも二次抗体を加えた。次いで、切片にHRP酵素基質、ビアミノベジジン(biaminobezidine)(DAB)発色原試薬(Vector Laboratories社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国)を加えた後、蒸留水ですすいだ。切片をヘマトキシリンQS(Vector Laboratories社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国)で対比染色した。スライドを光学顕微鏡(Zeiss Axiovert 200M、Carl Zeiss Toronto社、トロント、オンタリオ州、カナダ)下で観察し、Leica DC300デジタルカメラおよびソフトウェア(Leica Microsystems Canada社、ヴォーン、オンタリオ州、カナダ)を用いて代表的な画像を取得した。示される画像は、3例の異なるAD脳で得られた結果の代表的なものである。
老齢APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)マウスおよび野生型(WT)の同腹子(54~71週齢)に30mg/kgのhu301-17、アデュカヌマブまたは陰性対照の溶媒(PBS)を腹腔内(i.p.)注射した。治療前ならびに第1日、第7日、第14日および第21日、ヒトIgGの循環血中レベルを評価するため血漿を採取した。血漿採取およびPBS灌流直後にマウスを屠殺した。次いで、脳を採取し、急速冷凍した。脳および血漿を使用まで-80℃で保管した。Omni組織ホモジナイザー(Omni International社、ケネソー、ジョージア州、米国)を半分の電力で30秒間、3回用いて、脳ホモジネート(10%w/v)をRIPA緩衝液で作製した。次いで、ホモジネートを半分の電力で15秒間超音波処理した後、遠心分離(2,000×g)により残屑を除去した。Human IgG Immunotek ELISA(Zeptomatrix社、バッファロー、ニューヨーク州、米国)を製造業者の指示通りに用いて、個々のマウスの血漿(1:10,000希釈)および脳ホモジネート(1:5希釈)中のヒトIgGレベルを測定した。結果を平均μg/ml(血漿)またはng/g(脳)±SEMで表す。
ヒト化301-17と他のAβに対する抗体の結合プロファイルの比較
IgG4アイソタイプ(S241Pヒンジ変異)ヒト化抗体VH2Vκ5と他の抗体とを比較した。ヒト化抗体には、SPRによる評価で合成AβO対Aβモノマーの選択的結合が保持されていたほか、凍結AD脳切片での免疫組織化学により斑との結合もみられなかった。図3に示されるように、Aβに対する抗体であり、線維に結合することがわかっているバピネオズマブおよびアデュカヌマブでは、実質のAβ斑および血管沈着物に対して強い染色が見られたが、親モノクローナル(mu301-17)およびヒト化301-17ではバックグラウンドを上回る染色は一切見られなかった。老齢トランスジェニックAPP/PS1トランスジェニックマウスの脳切片でも同じような結果が得られた。ADに関する臨床試験では、斑および血管沈着物との結合により、浮腫(ARIA-E)および微小出血(ARIA-H)によるアミロイド関連画像異常が誘発されることがわかっている。
AD脳抽出物中の可溶性Aβ種が複数の研究者によって検討されたことにより、神経毒性活性は主としてAβO(二量体、三量体、四量体、十二量体)の低分子量(LMW)画分中に存在し、高分子量(HMW)凝集体はLMW種に解離し得ることが報告されているものの、ほとんどが不活性であることがわかっている。このため、AD脳からプールした可溶性抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を実施した。可溶性AD脳抽出物のSEC分画により、LMW AβOを含有することが予想されるMW領域にタンパク質ピークのある再現性の高いパターンが得られた(図4a)。約8~70kDaに対応する画分を、二量体~十二量体の範囲内にあり、モノマーを含まないAβOを含有すると予想されるLMW画分にプールした。70-700kDa超に対応する画分をHMW画分にプールした。総Aβ38、Aβ40、Aβ42の測定(MSDアッセイ)により、3種ともLMW画分およびHMW画分の両方に存在し、Aβ42が主要な凝集Aβ種である(A4アッセイ)ことがわかった。
老齢野生型マウス(15~17か月齢)を用いて、hu301-17が末梢から血液脳関門(BBB)を通過して中枢神経系(CNS)に入る能力を評価し、アデュカヌマブのものと比較した。マウスに30mg/kg抗体の単回腹腔内(i.p.)注射を実施し、24時間後、血漿および灌流脳中に存在するヒトIgGのレベルをELISAにより測定した。図5に示されるように、血漿と脳で等しい量のhu301-17およびアデュカヌマブが検出され(図5a)、これまでにアデュカヌマブで報告されている[18]ように、CNSへの浸透度が約0.3%の範囲で同程度である(図5b)ことが明らかになった。予想された通り、陰性対照としてPBS単独を注射したマウスではヒトIgGが検出されなかった(図5a)。
Claims (30)
- アミロイドベータ(Aベータ)に結合するヒト化抗体であって、
配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
配列番号52で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
とを含み、前記ヒト化抗体がヒト定常ドメインを含む、ヒト化抗体。 - 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号43で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号63で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号43で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号65で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号43で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号67で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号45で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号63で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号45で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号65で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号45で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号67で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号47で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号63で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号47で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号65で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号47で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号67で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号49で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号67で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;または
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号51で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号67で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる;
請求項1に記載のヒト化抗体。 - 前記抗体が、IgG1またはIgG4アイソタイプである、請求項1~2のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号46で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号46で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号46で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号48で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号48で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号48で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号50で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖可変領域が、配列番号52で示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質と、を含むイムノコンジュゲート。
- 前記検出可能な標識が、任意選択でPET撮像などの対象の撮像に使用するためのものであってもよい、陽電子放出放射性核種を含む、請求項15に記載のイムノコンジュゲート。
- 任意選択で希釈剤とともに、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体あるいは請求項15もしくは16に記載のイムノコンジュゲートを含む、組成物。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体をコードする、核酸分子。
- 請求項18に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体を発現する、細胞。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体、請求項18に記載の核酸分子、請求項19に記載のベクターまたは請求項20に記載の細胞を含む、キット。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体を作製する方法であって、
前記ヒト化抗体を請求項20に記載の細胞内で発現させることと、
当該ヒト化抗体を単離することと、
を含む、方法。 - 生体試料がAベータを含むかどうかを判定する方法であって、
a.前記生体試料を、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体あるいは請求項15もしくは16に記載のイムノコンジュゲートと接触させることと、
b.抗体-Aベータ複合体の存在を検出することと、
を含む、方法。 - アルツハイマー病(AD)を有するリスクもしくは疑いがある、またはアルツハイマー病(AD)を有する対象の、Aベータのレベルを測定する方法で使用するための請求項15または16に記載のイムノコンジュゲートであって、
前記ヒト化抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされており、
前記方法が、前記標識を検出することと、任意選択で前記標識を定量的に検出することとを含む、イムノコンジュゲート。 - 前記標識が陽電子放出放射性核種である、請求項24に記載のイムノコンジュゲート。
- それを必要とする対象にアルツハイマー病(AD)および/またはその他のAベータアミロイド関連疾患を治療する方法で使用するための、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体、請求項15または16に記載のイムノコンジュゲート、請求項17に記載の組成物、請求項18に記載の核酸分子、あるいは請求項19に記載のベクター。
- 前記方法が、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体を用いて、治療する前記対象由来の生体試料をAベータの有無またはレベルに関して評価することを含む、請求項26に記載のヒト化抗体、イムノコンジュゲート、組成物、核酸分子、あるいはベクター。
- 脳またはCNSの他の部分に直接使用するためのものである、請求項26または27に記載のヒト化抗体、イムノコンジュゲート、組成物、核酸分子、あるいはベクター。
- それを必要とする対象におけるアルツハイマー病(AD)および/またはその他のAベータアミロイド関連疾患の治療用医薬の製造のための、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体、請求項15または16に記載のイムノコンジュゲート、請求項17に記載の組成物、請求項18に記載の核酸分子、あるいは請求項19に記載のベクター。
- IgG1アイソタイプである、請求項1~14のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
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