KR101892837B1 - B 림프구 상에서 CD23을 가교시키지만 비만 세포는 감작하지 않는 인간화된 항-IgE 항체 - Google Patents

Abstract

신규 인간화된 항-IgE 항체가 기재된다. 상기 항체는 자유 IgE, B 림프구 상의 막 결합된 IgE, CD23에 의해 결합된 IgE에는 결합할 수 있지만 비만 세포 상에서 고 친화성 IgE.Fc 리셉터에 의해 결합된 IgE와는 결합할 수 없다. 본 발명은 본 발명의 항-IgE 항체를 투여하는 것에 의해 앨러지성 천식, 앨러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식 앨러지, 만성 자발성(특발성) 두드러기, 만성 비부비동염, 전신 비만세포증, 피부 비만세포증, 앨러지성 기관지폐 아스페르질루스증, 재발되는 특발성 혈관부종, 및 호산구 관련 위장관 질병을 비롯한 IgE-매개 질환을 치료하는 것에 관한 것이다.

Description

B 림프구 상에서 CD23을 가교시키지만 비만 세포는 감작하지 않는 인간화된 항-IgE 항체{HUMANIZED ANTI-IgE ANTIBODIES THAT CROSSLINK CD23 ON B LYMPHOCYTES BUT DO NOT SENSITIZE MAST CELLS}

관련 출원의 교차참조

본 출원은 2014년 6월 17일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/013196호를 우선권 주장하며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 자유 IgE, B 림프구 상의 막-결합된 IgE, CD23에 의해 결합된 IgE에는 결합할 수 있지만, 비만 세포 상의 고 친화성 IgE.Fc 리셉터(receptor)에 의해 결합된 IgE에는 결합할 수 없는 인간화된(humanized) 항체의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 앨러지성 천식, 앨러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식 앨러지, 만성 자발성(특발성) 두드러기, 만성 비부비동염, 전신 비만세포증, 피부 비만세포증, 앨러지성 기관지폐 아스페르질루스증, 재발되는 특발성 혈관부종, 및 호산구 관련 위장관 질병을 비롯한 IgE-매개 질환을 치료함에 있어서 상기 항체의 치료 적용에도 관한 것이다.

앨러지는 외래의 무해 항원에 대한 과잉 면역반응에 의해 유도된 과민 상태이다. 즉각적 과민 반응은 FcεRI-결합된 IgE와 반응할 수 있는 알레르겐(allergen) 존재하에서 비만 세포 및 호염기구의 표면 상에 존재하는 면역글로불린 E(IgE)와 고 친화성 IgE.Fc 리셉터(receptor)(FcεRI)의 상호작용을 통하여 생겨서, 이들 염증성 세포로부터 실시되어 새로이 합성된 매개체(mediator)의 방출을 유발한다. 대부분의 앨러지성 질환은 IgE-매개된다. 외래 항원에 대한 면역 반응을 포함하지 않는 다수의 비-앨러지성 질환, 특히 염증성 피부 질환도 또한 IgE-매개되는 것으로 잘 알려져 있다.

IgE에 대해서는 2개의 주요한 리셉터, 즉 FcεRI 및 저 친화성 IgE.Fc 리셉터 FcεRII(CD23라고도 칭함)가 있다. FcεRI은 인간의 비만 세포 및 호염기구의 표면 상에서 주로 우세하게 발현되며, 1개의 α-사슬, 1개의 β-사슬, 및 2개의 디설피드-결합된 γ-사슬로 구성된 4량체 복합체이다. 비만 세포 및 호염기구 상에서 알레르겐에 의한 FcεRI의 활성화는 탈과립반응(degranulation)을 초래하는 반면에, 수지상 세포(dendritic cells) 상에서 FcεRI의 활성화는 IgE-매개된 알레르겐 제시를 초래한다.

CD23은 C-형 렉틴-유사 도메인(lectin-like domain)에 이어, CC(코일드코일, coiled-coil) 삼량체를 형성하는 추정 로이신 지퍼(putative leucine zipper)로 작용하는 몇 개의 반복체를 갖는 줄기 영역(stalk region), 단일 막-관통 영역, 및 짧은 N-말단 세포질 도메인을 포함하는 대략 45kDa 분자량의 II형 막통과(transmembrane) 당단백질이다. 실제로, 단량체성 CD23의 IgE에 대한 친화성(KD=10^-6-10^-7 M)은 FcεRI의 친화성(KD= 약 10^-10 M)보다 훨씬 더 낮지만, 그의 삼량체성 형태에서는 실질적으로 증가한다(KD=10^-8-10^-9 M). CD23 폴리펩티드를 암호화하는 FCER2 유전자는 N-말단 세포질 테일(tail)의 첫번째 7번(CD23a) 및 6번(CD23b) 아미노산이 상이한 2개의 CD23 아이소폼 생성을 초래하는 2개의 mRNA 변이체의 합성을 구동하는 2개의 선택적 전사 개시 부위를 보유한다. CD23a는 B 세포에 의해 배타적으로 또 연속적으로 발현되는 반면에, CD23b는 단구/대식세포, B 세포, T 세포, 호산구, 수지상 세포, 및 상피 세포의 표면 상에서 IL-4에 의해 유도된다. B 세포 상의 CD23은 IgE 생산 및 항원 제시(antigen presentation)의 조절에 관여하는 것으로 생각되는 반면에, 대식세포 및 수지상 세포 상의 CD23은 식균작용/내포작용(endocytosis), 항원-IgE 복합체의 제거 및 항원 제시에 관여한다. 상피 세포 상의 CD23의 부가적 작용은 IgE의 수송을 포함한다. 항원-IgE 복합체는 상피를 지나 내강 공간(lumen space)으로 및 그 역으로 직접 침투한다. CD23은 또한 37, 33, 25, 및 16 kDa의 자유 용해성 CD23(sCD23) 단백질 범위로서 세포 표면으로부터 방출될 수 있다. 생체내에서 CD23 탈락에 관여하는 주된 금속단백질분해효소(metalloprotease)는 ADAM10 유전자이며, 이는 삼량체 형태의 37 kDa 또는 35kDa sCD23 종(species)을 생성한다. 또한 천연 산출 sCD23는 집먼지 진드기인 유럽진드기(dermatophagoides pteronyssinus)의 배설물에서 발견되는 Der p1 프로테아제의 작용으로 생성된 derCD23이다. Der p1에 의한 CD23의 분해로 16 kDa 단량체성 derCD23를 얻는다. 삼량체성 sCD23 단편은 자발성 IgE 합성을 강화하는 주된 분자로 관찰된 반면에, 더 소형인 단량체성 sCD23은 IL-4 자극된 IgE 합성을 하향조절(down-regulate)하는 것으로 보인다.

IgE는 분비된 형태 및 스플라이싱(splicing) 변이체로 보이는 막 결합된 형태로 존재한다. IgE의 분비된 형태의 ε 사슬의 불변 영역(constant region)은 C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 도메인을 포함하는 반면에, 막 결합된 IgE(mIgE)를 갖는 IgE의 막 결합된 형태의 ε 사슬은 인간에서 선택적 스플라이싱의 결과로서 2개의 아이소폼으로 발견된다. 인간 mIgE의 양쪽 아이소폼의 ε 사슬은 migis-ε 및 막-고정 펩티드를 함유한다. 1개 아이소폼은 C_H4 도메인과 상기 막-고정 펩티드 사이에 migis-ε 펩티드(15 아미노산 길이) 만을 함유("짧은 형태"라고도 칭함) 하는 반면에, 두번째 아이소폼은 C_H4 도메인과 상기 migis-ε 펩티드 사이에 추가의 52개 아미노산 길이 도메인(CεmX 도메인이라고도 칭함)을 추가로 함유("긴 형태"라고도 칭함) 한다.

IgE는 대부분의 앨러지성 질환을 매개하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 체내에서 IgE 양을 제어하기 위한 또는 항-IgE, 항-IL-4/IL-13 및 항-CD23과 같은 IgE 합성을 조절하기 위한 몇 가지 전략이 제안되어 있다. 오말리주맙(Omalizumab)(Xolair^®)은 혈청에서 순환하는 자유 IgE 및 B 세포 상의 막 결합된 IgE와는 결합하지만 세포 표면 상에서 FcεRI-결합된 및 CD23-결합된 IgE와는 반응하지 않는 재조합 인간화된 단일클론성 항-IgE 항체이다. 오말리주맙은 앨러지 환자에서 혈청 자유 IgE의 현저한(99% 까지) 감소를 유발하여, IgE가 FcεRI에 결합하는 것을 억제하며 호염기구 및 비만 세포 상에서 FcεRI의 하향조절을 초래한다. 앨러지성 천식, 만성 두드러기, 앨러지성 비염, 아토피성 피부염, 등과 같은 다수의 IgE-매개 질환에서 수많은 임상 시험으로 오말리주맙이 이들 질환을 치료하는데 효과적이고 안전하다는 것이 밝혀졌다. 오말리주맙은 많은 국가에서 심각한 앨러지성 천식 및 만성 특발성 두드러기 치료용으로 승인되어 있다. 또한, 영장류(cynomolgus macaque) 가변 영역(variable region) 및 인간 불변 영역으로 이루어지는 항-CD23 단일클론성 항체인 루밀리시맙(Lumiliximab)은 IgE가 CD23에 결합하지 않게 하는 C-형 렉틴 도메인에 결합하여, 표면 CD23의 안정화 및 CD23의 단백질분해성 절단의 감소를 초래하는 것으로 밝혀져 있다. 루밀리시맙은 생식세포계 ε 전사를 억제하고, 배양액에서 인간 말초혈액 단핵성 세포(PBMCs)의 IgE 생산을 감소시키며, 앨러지 환자에서 혈액 IgE 양을 감소시키는 것으로 보고되어 있다.

1990년 특허(US 특허번호 4,940,782호)에서, CD23-결합된 IgE에는 결합할 수 있지만 FcεRI에 결합된 IgE에는 결합할 수 없는 래트(rat) IgE에 대하여 특이적인 쥐 IgG 단일클론성 항체 44.7b가 개시되었다. 이 항체 44.7b는 IgE-매개 질환을 치료하기 위한 치료 후보로 결코 고려되지 않았다. 2012년에 공개된 논문(Shiung 일행, Immunobiology, 2012, 217:676-683)은 CD23-결합된 IgE에는 결합할 수 있지만 FcεRI와 결합된 IgE에는 결합할 수 없는 쥐 항-인간 IgE 단일클론성 항체, 8D6의 발견을 보고하였다. 저자들은 상기 항체가 비만 세포 및 호염기구를 감작시키지 않고 IgE를 중화시키는 오말리주맙의 중요한 약리학적 특성뿐만 아니라 CD23에 결합된 IgE를 가교시키는 것을 통하는 루밀리시맙의 특성을 또한 보유한다는 것을 제시하였다. 그러나, 상기 쥐 항체는 면역원성일 수 있어서 IgE-매개 질환을 치료하는데에 이용될 수 없다. 사람에서 치료용의 쥐 항체는 쥐 항체에 대한 환자에 의한 면역 반응에 의해 제한되는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 쥐 항체의 인간화는 인간 수혜자에서 면역원성을 감소시키는 것이 필요하다.

요약

본 발명은 (1) 분비된 자유 형태의 인간 IgE, (2) B 림프구 상의 막 결합된 IgE, 및 (3) B 세포 상의 CD23에 의해 또 용액 중의 자유 CD23에 의해 결합된 IgE에 결합하는 인간화된 항체에 관한 것이다. 이러한 항-IgE 항체는 비만 세포 및 호염기구 상의 FcεRI에 의해 결합된 IgE에는 결합하지 않으므로 염증성 세포를 활성화하지 않는다. 본 발명은 또한 IgE의 생합성, IgE가 다양한 세포 및 분자 성분에 결합하는 것, 및 알레르겐(allergen)의 잠재적 제거 효과에서 이들 인간화된 항-IgE 항체의 생물학적 특성에도 관한 것이다. 또한 본 발명은 IgE-매개된 앨러지성 및 비-앨러지성 질환 치료에 이러한 항체를 적용하는 것에도 관한 것이다.

본 발명자들은 항-M1' 항체, MEMP1972A(Gauvreau 일행, Science Translation Medicine, 2014, Vol. 6: 243ra85)의 Ib 상 및 IIa 상 시험의 최근 결과를 인지하였는데, 이들 결과는 새로운 IgE 합성을 억제함으로써, IgE-매개된 증상이 감소될 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 hu8D6:IgE 복합체가 CD23에 결합할 수 있고 또 CD23가 다수의 세포 유형에서 발현되기 때문에(Acharya 일행 Clin. Exp. Immunol., 2010, 162:12-23), hu8D6:IgE 복합체를 세포 표면 CD23에 흡수시키는 것이 생체내 순환에서 전체 IgE 양(자유 및 hu8D6-결합된 IgE)을 감소시킬 수 있을 것이라 생각한다. 또한 점막내층을 따른 상피세포는 CD23-의존적 통과세포외배출(transcytosis)(Tu 일행 Gastroenterology, 2005, 129:928-940)을 통하여 세포-결합된 물질을 제거할 수 있고, hu8D6은 hu8D6:IgE 복합체가 위장관 및 기관지폐세포관의 내강 공간(lumen space)으로 수송될 때 유입 알레르겐 및 내생성 IgE-결합 자가항원의 소탕 및 제거를 용이하게 할 수 있다. 본 발명자들은 또한 CD23-결합된 IgE에 대한 hu8D6의 결합이 B 림프구 상에서 CD23을 효과적으로 가교시킬 수 있어, 특정 항원에 의해 활성화될 때 B 세포에 의한 항원-특이적 IgE 생산 억제를 초래하는 것으로 해석한다. hu8D6의 이들 특성은 동일 세트의 IgE-결합 특이성을 갖는 hu8D6 및 기타 인간화된 항체는 IgE-매개 질환 환자에서 항원-특이적 IgE 생산을 억제할 수 있고 또 따라서 이들 질환을 완화시킬 수 있다는 잠재적 유용성을 지지해야 한다. 쥐 8D6 항체를 예로 사용하여, 본 발명자들은 상기 항체의 인간화된 형태를 제조하였다. 이 인간화된 항체는 상기 논의된 모든 결합 및 생물학적 특성을 보유한다.

참고자료

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(3) Gail M. Gauvreau, Jeffrey M. Harris, Louis-Philippe Boulet, Heleen Scheerens, J. Mark Fitzgerald, Wendy S. Putnam, Donald W. Cockcroft, Beth E. Davis, Richard Leigh, Yanan Zheng, Barbro Dahlen, Yehong Wang, Romeo Maciuca, Irvin Mayers, X. Charlene Liao, Lawren C. Wu, John G. Matthews, Paul M. O’Byrne1, “Targeting membrane-expressed IgE B cell receptor with an antibody to the M1 prime epitope reduces IgE production”, Science Translation Medicine., Vol. 6: 243ra85 (2014)

(4) M Acharya, G Borland, A L Edkins, L M MacLellan, J Matheson, B W Ozanne, and W Cushley, “CD23/FcεRII: molecular multi-tasking”, Clin. Exp. Immunol., 162(1): 12-23 (2010)

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(6) Jiun-Bo Chen, Pheidias C. Wu, Alfur Fu-Hsin Hung, Chia-Yu Chu, Tsen-Fang Tsai, Hui-Ming Yu, Hwan-You Chang, and Tse Wen Chang, “Unique epitopes on CεmX in IgE-B cell receptors are potentially applicable for targeting IgE-committed B cells”, J. Immunol., 184: 1748-1756 (2010)

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본 발명의 설명은 첨부한 도면을 참조하여 이하의 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 인간 생식세포계 V_H1-69 및 J_H4 서열(V_H1-69/J_H4)를 비롯한 가변 중쇄, 쥐 항-IgE 항체 8D6(mu8D6), 및 8D6-그라프팅된 인간화된 8D6(hu8D6)의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 상보성 결정 영역(Complementarity determining region: CDR)은 밑줄로 표시되어 있다. hu8D6에 유지된 쥐 V_H 프레임워크(framework)의 아미노산은 별표로 라벨링되어 있다.
도 2는 인간 생식세포계 Vκ1-39 및 Jκ1 서열(Vκ1-39/Jκ1)을 비롯한 가변 경량 사슬, 쥐 항-IgE 항체 8D6(mu8D6), 및 8D6-그라프팅된 인간화된 8D6(hu8D6)의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 상보성 결정 영역은 밑줄로 표시되어 있다. hu8D6에 유지된 쥐 Vκ 프레임워크 아미노산은 별표로 라벨링되어 있다.
도 3은 hu8D6의 적정 곡선(실선) 및 ELISA에 의해 인간 IgE에 대한 양친(parent) c8D6 항체(점선) 결합을 도시한다.
도 4는 ELISA에 의해 인간 IgE와 결합하는 HRP-콘쥬게이트된 c8D6와 경쟁하는 hu8D6(실선) 및 키메라 8D6(c8D6, 점선)의 억제 곡선을 도시한다.
도 5는 BIAcore 분석에 의해 인간 IgE에 대한 hu8D6 Fab의 표면 플라스몬 공명(SPR) 곡선을 도시한다. RU: 반응 단위.
도 6a 및 6b는 플로우 사이토메트리 분석(flow cytometric analysis)에 의한 mIgE.Fc-발현성 Ramos 세포주에 대한 hu8D6 및 c8D6의 결합을 도시한다. 긴 형태의 인간 막 결합된 IgE.Fc를 발현하는 mIgE.Fc_L Ramos: Ramos 세포(도 6a); 짧은 형태의 인간 막 결합된 IgE.Fc를 발현하는 mIgE.Fc_S Ramos: Ramos 세포(도 6b).
도 7은 인간 FcεRI의 IgE-포화된 재조합 α 사슬에 대한 hu8D6의 결합을 도시한다.
도 8a 내지 8e는 인간 IgE가 미리-로딩된 인간 FcεRI-발현성 RBL SX-38 세포에 대한 hu8D6의 결합을 도시한다.
도 9는 ELISA에 의해 인간 IgE에 결합하는 재조합 FcεRIa-Fc 단백질과 경쟁하는 hu8D6 및 오말리주맙의 억제 곡선을 도시한다.
도 10은 플로우 사이토메트리 분석에 의해 인간 IgE 결합을 위해 RBL SX-38 세포 상에서 본래의 FcεRI 리셉터와 경쟁하는 hu8D6 및 오말리주맙의 억제 곡선을 도시한다.
도 11은 hu8D6이 IgE-감작된 RBL SX-38 세포의 탈과립반응을 활성화 및 유발하지 못함을 도시한다.
도 12는 IgE-포화된 재조합 삼량체성 인간 CD23에 대한 hu8D6의 결합을 도시한다.
도 13a 내지 13d는 인간 CD23-발현성 SKW6.4 세포에 대한 hu8D6의 결합을 도시한다.
도 14a 내지 14e는 hu8D6:IgE 면역 복합체가 인간 FcεRI-발현성 RBL SX-38 세포에 결합하지 못함을 도시한다.
도 15는 hu8D6:IgE 면역 복합체가 IgE-감작된 RBL SX-38 세포의 탈과립반응을 활성화 및 유도하지 못함을 도시한다.
도 16a 내지 16d는 인간 CD23-발현성 SKW6.4 세포에 대한 hu8D6:IgE 면역 복합체의 결합을 도시한다.
도 17a 및 17b는 시험관 내에서 신규(de novo) IgE 합성에 대한 오말리주맙(도 17a) 또는 hu8D6(도 17b)의 억제 효과를 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 (1) 분비된 자유 형태의 인간 IgE, (2) B 림프구 상의 막 결합된 IgE, 및 (3) B 세포 상의 CD23에 의해 또 용액 중의 자유 CD23에 의해 결합된 IgE에 결합하는 인간화된 항체에 관한 것이다. 상기 항-IgE 항체는 비만 세포 및 호염기구 상의 FcεRI에 의해 결합된 IgE에는 결합하지 않으므로 그러한 염증성 세포를 활성화하지 않는다. 넓은 정의에서, 인간화된 항체는 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인 및 V_H 및 V_L 도메인의 프레임워크 영역이 인간 기원인 항체이다.

인간 B 림프구의 V_H 및 V_L 절편을 포함하는 단일 사슬 항체 라이브러리(libraries)를 나타내는 파아지, 효모 또는 리보솜을 이용한 다양한 방법들은 인간 세포 표면 항원 또는 세포 인자에 대한 항체 스크리닝에 성공적으로 사용되어 왔다. 이러한 방법들은 또한 본 발명의 독특한 세트의 IgE-결합 특이성을 갖는 인간 항체를 스크리닝하기 위해서도 이용될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 항체는 인간 면역글로불린 V_H 및 V_L 유전자 풀(pool)을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서도 얻어질 수 있다.

예로서, 본 발명은 상술한 세트의 결합 특이성을 보유하는 쥐 항-IgE 단일클론성 항체, 8D6의 인간화된 버젼을 제조하는 상세한 설명을 제공한다. 본 설명은 중쇄 가변 영역(SEQ ID NO(서열번호): 2) 및 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 4)을 포함하는 인간화된 항-인간 IgE 항체, hu8D6를 제공한다. hu8D6의 초가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같이 확인된다: CDR-H1은 GYTFNGYWMH (SEQ ID NO: 5)을 포함하고; CDR-H2는 YINPTTGHTEYNQKFKD (SEQ ID NO: 6)을 포함하며; CDR-H3은 ARQEYRHSWFAY (SEQ ID NO: 7)을 포함하고; CDR-L1은 QSVDYDGDTY (SEQ ID NO: 8)을 포함하며; CDR-L2는 AASNLDS (SEQ ID NO: 9)를 포함하고; CDR-L3은 QQTNEDPWT (SEQ ID NO: 10)를 포함한다.

본 발명은 인간화된 항-인간 IgE 항체, hu8D6,를 제공하며, 이때 인간 IgE에 대한 2가 형태의 항체의 결합 활성은 EC₅₀ = ~10^-10 M이다. 인간 IgE에 대한 1가 Fab 형태의 항체의 친화성은 KD = ~10^-11 M이다.

이하의 실시예에서, 본 발명은 자유 인간 IgE(그의 2개 리셉터에 의해 결합되지 않음), B 림프구 상의 막 결합된 IgE(긴 형태 및 짧은 형태), 및 CD23-결합된 IgE와는 결합할 수 있지만 FcεRI-결합된 IgE에는 결합할 수 없고 또 비만 세포 또는 호염기구로부터 헥소사미니다제 방출을 유도할 수 있는 인간화된 항-IgE 항체, hu8D6,를 제공한다. 뿐만 아니라, hu8D6은 IgE가 FcεRI에 결합하는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. hu8D6 및 인간 IgE의 면역 복합체는 CD23에는 결합할 수 있지만 FcεRI에 결합할 수 없고 또 비만 세포 또는 호염기구로부터 헥소사미니다제 방출을 유도할 수 있다. 또한, hu8D6은 막 결합된 IgE 및 B 세포 상의 가교 CD23-결합된 IgE를 모두 결합할 수 있으므로 시험관내 배양계에서 인간 말초 단핵성 세포로부터 IgE 생산의 신규 합성을 억제할 수 있다.

일 요지로서, 상기 인간화된 항-IgE 항체, hu8D6,는 전장(full-length) 항체(예를 들어, IgG 분자), 항원-결합 단편(예를 들어, Fab 또는 F(ab')₂), 또는 단일 사슬 Fv일 수 있다.

다른 요지로서, 본 발명의 인간화된 항-IgE 항체, hu8D6,는 치료 특성을 나타내고 또 치료를 필요로 하는 환자에게 항체 또는 항원-결합 단편인 본원에 기재된 유효량의 인간화된 항-IgE 항체를 투여하는 것을 포함하는 IgE-매개 질환을 치료하는 방법을 제공한다. IgE-매개 질환은 앨러지성 천식, 앨러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식 앨러지, 만성 자발성(특발성) 두드러기, 만성 비부비동염, 전신 비만세포증, 피부 비만세포증, 앨러지성 기관지폐 아스페르질루스증, 재발되는 특발성 혈관부종, 및 호산구 관련 위장관 질병을 포함한다. 만성 자발성 두드러기, 전신 비만세포증, 및 재발되는 특발성 혈관부종과 같이 상기 질환 중의 일부는 앨러지성 질환이 아니며 외부 알레르겐을 포함하지 않는 것을 알 수 있다.

실시예 1 인간화된 항- IgE 항체의 생성

CDR 그라프팅 (grafting)

8D6으로부터의 V_H(SEQ ID NO: 1) 및 Vκ(SEQ ID NO: 3) 도메인의 아미노산 서열을, 인간 생식세포계 V_H1-69/JH4 및 Vκ1-39/Jκ1 대립유전자(alleles)의 아미노산 서열과 정렬시켰다. CDR 그라프팅을 하기 위하여, 4개 위치 M48I, R66K, V67A, 및 S76N에서 인간 생식세포계 V_H1-69 대립유전자와 상이한 억셉터(acceptor) V_H 프레임워크를 사용하였다. 8D6의 위치 26-35(CDR-H1, SEQ ID NO: 5), 50-56(CDR-H2, SEQ ID NO: 6), 및 93-104(CDR-H3, SEQ ID NO: 7)에 있는 CDR들은 억셉터 V_H 프레임워크로 엔지니어링되어 도 1에 도시된 바와 같이 8D6 V_H의 직접적 CDR-그라프트를 생성하였다. Vκ 도메인에서, 위치 27-34(CDR-L1, SEQ ID NO: 8), 50-56(CDR-L2, SEQ ID NO: 9), 및 89-97(CDR-L3, SEQ ID NO: 10)의 CDR들은 위치 M4L에서 인간 생식세포계 Vκ1-39 대립유전자와 상이한 억셉터 Vκ 프레임워크에 그라프팅하였다(도 2). 8D6 V_L 의 직접적 CDR-그라프트를 hu8D6 V_L (SEQ ID NO: 4)이라 칭하였다.

IgG 생산

인간화된 8D6(hu8D6) 및 키메라 8D6(c8D6) 항체를 얻기 위하여, Expi293^TM 발현계(Invitrogen)를 일과성 발현용으로 사용하였다. 형질감염은 125 mL 플라스크 중의 30 mL 배양액에서 ExpiFectamine™ 293 시약(Invitrogen)을 사용하여 실시하였다. 형질감염하기 하루 전에, Expi293F ™ 세포는 Exppi293^TM 발현 배지(Invitrogen)에 의해 2 x 10⁶ 세포/mL 밀도로 희석하였다. 형질감염일에, 배양액을 카운트(count)하고 원심분리에 의해 2.5 x 10⁶ 세포/mL 밀도로 농축시키고, 오래된 배지를 제거하고, 새로운 배지를 부가하였다. 80 μL의 ExpiFectamine 293을 1.5 mL의 OPTI-MEM(Invitrogen)로 희석하고 또 5 분 후 상기 희석된 ExpiFectamine 293™ 용액을 30 μg 플라스미드 DNA에 부가하여 형질감염 복합체들을 제조하였다. 3 mL DNA-형질감염 시약 복합체 용액을 실온에서 20분간 배양하고 또 현탁 배양액에 서서히 부가하면서 플라스크를 서서히 교반하였다. 형질감염된 세포를 37℃ 배양기 중의 오비탈 진탕기 상에 위치시키고 또 16시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 150 μL의 ExpiFectamine 293™ 형질감염 증강제 1 및 1.5 mL의 ExpiFectamine 293™ 형질감염 증강제 2를 상기 배양액에 부가하였다. 형질감염된 후 7일째에 배양을 종료하고 또 항체 정제를 위해 수집하였다. rProtein-A Sepharose™ 친화성 크로마토그래피(GE Healthcare)를 이용하여 상기 상청액으로부터 항체들을 정제하였다. 최종 생성물은 크기 배제 신속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 결정되는 바와 같이 약 M_r 150,000의 단일 피크로서 용출되는 단백질의 >99%를 가져 균질하였다.

결합 분석( EC50 )

Wan 일행(Nature Immunol., 2002, 3:681-686)에 의해 이전에 기재된 바와 같은 번호부여 시스템에 따라 Ser²²⁶ 내지 Gly⁵⁹⁹ 에서 시작되고 또 2개의 돌연변이 N265Q 및 N371Q를 함유하는 인간 IgE(ε.Fc 2-4)의 Fc 영역을 Expi293F™ 세포에서 발현시키고 또 오말리주맙-결합된 NHS-활성화된 Sepharose™ 수지(GE Healthcare)를 이용한 항-IgE 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. hu8D6의 EC₅₀ 결정을 위하여, ε.Fc 2-4 단백질을 코팅 완충액(15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6) 중 50 ng/웰로 96-웰 플레이트 상에 고정화시키고 또 4℃에서 철야로 배양하였다. 코팅된 웰은 200 μL/웰의 에세이 희석제(PBS 중의 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.01% 티메로살)에 의해 실온에서 1 시간 동안 블로킹되었다. 플레이트들은 200 μL/웰의 세정 완충액(PBS with 0.05% Tween-20)에 의해 3회 세정되었다. 100 μL의 항체 희석제(0.1 mg/ml로부터 1:3 단계로 계열 희석됨)를 상기 코팅된 웰에 부가하였다. 배양은 실온에서 2시간 동안 실시하였다. 모든 웰을 통기시키고 또 200 μL/웰의 세정 완충액에 의해 6회 세정하였다. 플레이트를 HRP(horse radish peroxidase)-콘쥬게이트된 염소 항-쥐 IgG-Fc 항체(Jason ImmunoResearch)의 1:10,000 희석에 의해 1시간 동안(100 μL/웰) 배양하였다. 이어 모든 웰을 200 μL/웰의 세정 완충액에 의해 6회 세정하였다. 마지막으로, 50 μL/웰의 NeA-Blue TMB 기질(Clinical Science Products)에 의해 웰을 반응시키고 또 50 μL/웰의 1N HCl을 부가하는 것에 의해 반응을 중지시켰다. 흡수는 ELISA 판독기 상에서 OD₄₅₀ 로 측정하였다. EC₅₀는 프리즘 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 산출하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, hu8D6 및 c8D6의 EC₅₀는 1.48 x 10^-10 및 1.16 x 10^-10 M이다. 결과는 hu8D6의 결합 활성이 CDR 그라프팅 처리된 후에도 거의 완전하게 보존되었음을 나타낸다.

경쟁분석( IC50 )

경쟁성 ELISA 시험은 인간 IgE에 대한 결합에서 HRP-콘쥬게이트된 c8D6과 경쟁하는 hu8D6 및 c8D6의 효능을 비교하기 위해 실시하여 hu8D6의 결합 특성을 결정하였다. ELISA 플레이트의 웰을 코팅 완충액 중 50 ng의 ε.Fc 2-4 단백질에 의해 4℃에서 철야로 코팅하고 또 에세이 희석제와 배양하는 것에 의해 블로킹하였다. 별도로, HRP-c8D6의 저장 용액을 에세이 희석제로 1:1,000 희석하고 또 분취량을 0.1 mg/ml로부터 1:3 단계로 계열희석된 비콘쥬게이트된 c8D6 또는 hu8D6와 혼합하였다. 양쪽 시리즈의 혼합물을 ELISA 웰에 부가하고 또 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 PBST에 의해 세정하고, TMB 및 이들의 OD₄₅₀과 배양하였다. 프리즘 소프트웨어를 이용하여 IC₅₀을 산출하였다. 비콘쥬게이트된 hu8D6 및 c8D6의 IC₅₀은 도 4에 도시된 바와 같이 1.79 x 10^-9 및 2.28 x 10^-9 M 이었다. 결과는 hu8D6가 8D6에 대한 동일 에피토프(epitope)에 결합함을 나타내었다.

표면 플라스몬 공명( SPR ) 분석에 의한 KD 결정

hu8D6 Fab를 생산하기 위하여, hu8D6 항체의 V_H 및 V_k DNA 절편의 cDNA를 전체 C 1 불변 영역을 C 1-CH1 도메인으로 치환하는 것에 의해 pIgG1( ) 벡터로부터 변형된 Fab 발현 벡터의 인간 C1-CH1 도메인 및 인간 C 영역에 결합시켰다(Chen 일행 J Immunol. 184:1748-1756). 일과성 발현을 위해 Expi293^TM 발현계(Invitrogen)를 사용하였다. KappaSelect Sepharose™ 친화성 크로마토그래피(GE Healthcare)를 이용하여 상기 상청액으로부터 Hu8D6 Fab를 정제하였다. 최종 생성물은 크기 배제 신속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 결정되는 바와 같이 약 M_r 50,000의 단일 피크로서 용출되는 단백질의 >99%를 가져 균질하였다.

hu8D6의 KD 결정을 위해, Biacore X 인스트루먼트(GE Healthcare)를 이용하여 SPR 에세이를 실시하였다. Hu8D6 Fab는 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하는 것에 의해 CM5 칩(GE Healthcare) 상에 고정시켰다. 커플링 밀도는 <500 공명 단위로 제한되었다. ε.Fc 2-4 단백질은 센서 칩 위에 HBS-P 완충액(GE Healthcare) 중 25, 12.5, 6.25 및 3.125 nM의 농도로 30 μl min^-1 유동 속도로 주입하였다. 모든 샘플은 유동 세포에 120초간 25℃에서 720초의 해리 시간으로 주입하였다. 센서 표면의 재생은 10 mM 글리신-HCl(pH 2.5)의 30-초 주사를 2회 실시하여 행하였다. 서로 다른 농도에서 고정된 hu8D6 Fab에 결합하는 ε.Fc 2-4의 소노그램(sonogram)은 도 5에 도시하였다. BIAevalution 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 친화성 및 속도 상수를 산출하였고, hu8D6 Fab의 ε.Fc 2-4에 대한 k_on 및 k_off는 1.23±0.17x10⁶ M^-1s^-1 및 5.79±0.03x10^-5 s^-1이고, hu8D6의 KD는 4.8±0.7 x10^-11 M이다.

FACS 분석

mIgE.Fc_L(긴 형태의 막 ε 사슬의 C_H2-세포질 테일) 또는 mIgE.Fc_S(짧은 형태의 막 ε 사슬의 C_H2-세포질 테일)를 암호화하는 재조합 DNA에 의해 형질감염된 Ramos 세포주는 Chen 일행(Chen 일행 J Immunol. 184:1748-1756)에 의해 생성하였고 또 hu8D6의 결합 활성을 결정하기 위하여 사용되었다. mIgE.Fc_L 또는 mIgE.Fc_S를 발현하는 Ramos 세포는 2 x 10⁶ 세포/mL의 세포 밀도로 FACS 완충액(1x PBS 중의 1% FBS 및 0.1% 아지드화 나트륨)에 재현탁시켰다. 100 μL의 FACS 완충액 중의 2 x10⁵ 세포를 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001μg/mL의 농도로 hu8D6 또는 c8D6와 얼음 상에서 30분간 배양한 다음, FACS 완충액으로 세정하였다. 결합된 항체는 인간 IgG-Fc(Caltag Laboratories)에 대해 특이적인 FITC-라벨링된 염소 IgG 에 의해 검출하였다. 염색된 세포는 FACS Canto II 플로우 사이토미터(BD Biosciences) 상에서 분석하였다. Ramos 세포주에 대한 항체의 결합에 대한 형광 세기의 기하학적 수단은 FCSExpress 소프트웨어(DeNono 소프트웨어)를 이용하여 분석하였다. EC₅₀은 프리즘 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이 mIgE.Fc_L-발현성 Ramos 세포에 대하여 결합하는 hu8D6 및 c8D6의 EC₅₀은 2.21 x 10^-10 및 2.0 x 10^{- 10} 이었고 또 mIgE.Fc_S-발현성 Ramos 세포에 대한 hu8D6 및 c8D6의 EC₅₀은 3.86 x 10^-10 및 3.0 x 10^-10이었다. 이들 결과는 2개의 mIgE 아이소폼에 대한 hu8D6 및 c8D6의 결합 활성이 거의 동일하다는 것을 나타낸다.

실시예 2 인간 Fc εRI- 결합된 IgE 에 대한 hu8D6 의 결합무능

인간 Fc εRI의 IgE - 포화된 재조합 사슬에 대한 hu8D6 의 결합무능

인간 γ1(Shiung 일행, Immunobiology, 2012, 217:676-683)의 인간 FcεRIα(Val²⁶ 내지 Leu²⁰⁴) 및 힌지-C_H2-C_H3 부분의 세포외 영역으로 구성된 고상 재조합 FcεRIα 융합 단백질(huFcεRIα-huFcγ1, FcεRIα-Fc라 칭함)에 대한 hu8D6의 결합을 결정하기 위하여 ELISA를 이용하였다. FcεRIα-Fc 단백질은 FreeStyl™ 393F 시스템(Invitrogen)에 의해 발현되었고 또 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. ELISA 플레이트의 웰을 4℃ 코팅 완충액 중 FcεRIα-Fc 2 μg/mL로 철야로 코팅하고 또 에세이 희석제(PBS 중의 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.01% 티메로살)에 의해 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이어, 코팅된 FcεRIα-Fc 단백질을 1 μg/mL IgE로 포화시키고, 항-IgE 크로마토그래피에 의해 U266 세포의 배양 배지로부터 정제하였다. 상기 웰을 세정 완충액에 의해 6회 세정한 후, 포획된 IgE를 10, 1, 0.1, 및 0.01 μg/mL의 인간 IgE(Sigma), hu8D6, c8D6, 오말리주맙 및 쥐 항-인간 IgE mAb 5H2(AbD Serotec)와 함께 배양하였다. 결합된 인간 IgE 및 쥐 IgG는 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-인간 kappa 경쇄(GeneTex) 및 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-쥐 IgG.Fc(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 검출하였다. 인간화된 8D6, c8D6, 및 오말리주맙은 IgE-포화된 재조합 FcεRIα 융합 단백질과 결합하지 않은 반면에, 5H2는 도 7에 도시된 바와 같이 모든 농도에서 결합하였다.

호염기구 상의 IgE 에 대한 hu8D6 의 결합 무능

인간 FcεRI(Wiegand 일행, J. Immunol., 1996, 157:221-230)의 α, β, 및 γ 사슬을 암호화하는 유전자에 의해 형질감염된 RBL SX-38 세포, 래트 호염기구 백혈병 세포는 세포 표면 FcεRI의 풀로서 사용하였다. 1 mL의 FACS 완충액 중의 2 x 10⁶ RBL SX-38 세포를 3 μg/mL 농도로 30 분간 얼음 상에서 IgE와 함께 배양하였다. 상기 세포들을 FACS 완충액에 의해 세척하여 미결합 IgE를 제거한 다음 100 ml FACS 완충액 중의 2 x 10⁵ 세포를 10 μg/mL 농도의 hu8D6, c8D6, 오말리주맙, 및 5H2 항체와 30분간 얼음 상에서 배양한 다음 FACS 완충액으로 세척하였다. 결합된 항체를 인간 IgG-Fc 또는 FITC-라벨링된 F(ab)’2 토끼 항-쥐 IgG(AbD Serotec)에 대해 특이적인 FITC-라벨링된 염소 IgG에 의해 검출하였다. 염색된 세포는 FACS Canto II 상에서 분석하였다. 도 8a 내지 도 8e에 도시된 바와 같이, 인간화된 8D6, c8D6, 및 오말리주맙은 IgE-포화된 RBL SX-38 세포와 결합할 수 없었던 반면, 5H2는 RBL SX-38 세포와 결합하였다.

Fc εRIα- Fc 단백질에 대한 경쟁 분석

FcεRIα-Fc 단백질(Shiung et al)에 대한 결합에서 HRP-콘쥬게이트된 IgE와 경쟁하는 hu8D6 및 오말리주맙의 효능을 비교하기 위하여 경쟁성 ELISA 시험을 실시하였다. ELISA 플레이트의 웰을 코팅 완충액 중의 U266 IgE 단백질 100 ng에 의해 4℃에서 철야로 코팅하고 또 에세이 희석제(PBS 중의 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.01% 티메로살)와 배양하는 것에 의해 블로킹하였다. 이와 별도로, HRP-IgE 저장 용액을 에세이 희석제로 1:6000로 희석시키고 또 그 분취량을 0.1 mg/ml로부터 1:3 단계로 계열 희석된 콘쥬게이트되지 않은 hu8D6 또는 오말리주맙과 혼합하였다. 양쪽 시리즈의 혼합물을 ELISA 웰에 부가하고 또 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 웰을 PBST에 의해 세척하고, TMB 및 이들의 OD₄₅₀과 배양하였다. IC₅₀은 프리즘 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. 음성 대조군으로서 인간 HER2 단백질을 표적으로 하는 트라츠주맙(Trastuzumab)(Herceptin^TM)은 FcεRIα-Fc 에 대한 IgE의 결합을 억제하지 않았다. FcεRIα-Fc에 대한 IgE 결합을 억제하는 hu8D6 및 오말리주맙의 IC₅₀ 은 도 9에 도시된 바와 같이 9.4 및 25.9 x 10^-10 M 이었고, 이는 hu8D6가 리셉터에 대한 IgE의 결합을 억제함에 있어서 오말리주맙보다 더 우수함을 나타낸다.

세포 표면 Fc εRI에 대한 경쟁 분석

0.1 mL의 FACS 완충액 중의 2 x 10⁵ RBL SX-38 세포를 서로 다른 농도 45, 30, 13.3, 8.9, 5.93, 3.95, 2.63, 1.76, 1.17, 0.78, 0.52 및 0.35 μg/mL의 hu8D6, 오말리주맙 또는 트라츠주맙뿐만 아니라 FITC-라벨링된 IgE(4.5 μg/mL)와 30분간 얼음 상에서 배양하였다. 이들 세포를 FACS 완충액에 의해 세정하여 미결합 IgE를 제거하였다. 염색된 세포를 FACS Canto II 상에서 분석하였다. IC₅₀은 프리즘 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 트라츠주맙은 SX-38 세포에 대한 IgE의 결합에 영향은 주지 않았다. SX-38 세포에 대한 IgE 결합을 억제하는 hu8D6 및 오말리주맙의 IC₅₀은 도 10에 도시된 바와 같이 18.8 x 10^-9 및 24.7 x10^-9 M이었고, 이는 hu8D6이 FcεRI-발현성 세포에 대한 IgE의 결합을 억제함에 있어서 오말리주맙보다 우수함을 나타낸다.

실시예 3 RBL SX -38 세포에 대한 hu8D6 의 감작 무능

탈과립반응의 정도는 과립에 저장된 리소좀 효소인 β-헥소사미니다제의 배양 배지로의 방출을 측정하는 것에 의해 평가하였다. RBL SX-38 세포를 0.5 mL의 배양 배지 중에 3 x 10⁵ 세포/웰로 37℃에서 철야로 24-웰 플레이트에 파종하였다. 하루 후에, 배지를 제거하고 또 1 μg/mL 인간 IgE를 함유하는 0.25 mL의 예열(pre-warmed) 배양 배지를 각 웰에 부가하였다. 37℃ 배양기에서 2시간 배양한 후, 각 웰을 0.5 mL의 티로드 완충액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM 글루코오스, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 및 0.5 mg/mL BSA, pH 7.3)를 사용하여 2회 세정한 다음 10, 1, 0.1, 또는 0.01 μg/mL의 항체 또는 1% Triton X-100를 함유하는 0.25 mL의 예열된 티로드 완충액을 부가하였다. 37℃ 배양기에서 30분간 배양한 후, 그 상청액을 수집하였고 또 실온에서 5분간 300xg에서 원심분리시켰고 또 50 μL 투명 상청액을 각 웰로부터 새로운 96웰 블랙 OptiPlate™(Perkin-Elmer)의 웰로 전달하였다. 0.1 M 시트르산 완충액(pH 4.5) 중의 50 mL의 기질 용액(80 μM 4-MUG(4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-d-글루코사미니드), Sigma)을 각 웰에 부가하고 또 상기 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 100 μL 글리신 완충액(0.2 M 글리신, 0.2 M NaCl, pH 10.7)을 부가하는 것에 의해 반응을 종료하였다. 생성한 형광(여기 355 nm; 방출 460 nm)은 각 웰의 상부에서 Victor™ 3 형광 리더(Perkin-Elmer)에 의해 측정하였다. 측정된 값은 세포를 1% Triton X-100에 의해 용균시켜 얻은 방출값(100%)에 대한 퍼센트로서 표시하였다. 인간화된 8D6, c8D6, 및 오말리주맙은 IgE-감작된 RBL SX-38 세포의 탈과립반응을 유도하지 않은 반면, 5H2는 유도하였다(도 11).

실시예 4 인간 CD23 - 결합된 IgE 에 대한 hu8D6 의 결합능

IgE - 포화된 재조합 삼량체성 인간 CD23 에 대한 hu8D6 의 결합능

N-말단 이소로이신 지퍼(ILZ) 및 인간 CD23의 세포외 영역(Asp⁴⁸ 내지 Ser³²¹)을 함유하여 ILZ 모티프(Shiung 일행, Immunobiology, 2012, 217:676-683)를 통하여 비공유 삼량체를 형성하는 고상 재조합 인간 CD23 융합 단백질(ILZ-CD23)에 대한 hu8D6의 결합능을 결정하기 위하여 ELISA를 이용하였다. 폴리히스티딘-태그된 ILZ-CD23은 FreeStyle™ 293F 시스템에 의해 발현되고, 니켈 Sepharose™ 크로마토그래피(GE Healthcare)를 이용하여 형질감염 배양 배지로부터 정제한 다음, 2 mM CaCl₂를 갖는 1x HBSS 완충액에 저장하였다. ELISA 플레이트는 정제된 ILZ-CD23 5 μg/mL를 사용하여 코팅하여 블로킹하였고, 상기 코팅된 ILZ-CD23은 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 에세이 희석제(PBS 중의 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 및 0.01% 티메로살) 중의 3 μg/mL의 정제된 인간 IgE를 사용하여 포화시켰다. 상기 웰을 세정 완충액을 사용하여 6회 세정한 후, 포획된 IgE를 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 에세이 희석제 중의 10, 1, 0.1, 및 0.01 μg/mL의 hu8D6, c8D6, 오말리주맙 및 5H2와 배양하였다. 결합된 인간 IgG 및 쥐 IgG는 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG.Fc 및 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-쥐 IgG.Fc를 사용하여 검출하였다. 인간화된 8D6, c8D6 및 5H2 항체는 고체 표면 상에 코팅된 인간 IgE-포화된 재조합 CD23와 반응할 수 있는 반면에, 오말리주맙은 도 12에 도시된 바와 같이 아이소타입-제어 인간 IgG 항체에 필적하는 결합 활성을 갖지 않는다.

IgE -펄스처리된 SKW6 .4 B 세포에 대한 hu8D6 의 결합능

고 수준의 CD23(Pathan 일행, Blood, 2008, 111:1594-1602)를 발현하는 인간 B 세포주는 IgE와 배양하는 것에 의해 CD23 펄스처리하였다. 1 mL의 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} FACS 완충액(1X PBS 중의 1mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 1% FBS 및 0.1% 아지드화 나트륨) 중의 2 x 10⁶ SKW6.4 세포를 3 μg/mL 농도의 IgE와 함께 얼음 상에서 30분간 배양하였다. Ca^{2 +}/Mg^{2 +} FACS 완충액을 사용하여 세포를 세정하고, 10 μg/mL 농도의 hu8D6, c8D6, 오말리주맙, 및 항-CD23 항체(클론: EBVCS2, eBioscience)와 얼음 상에서 30분간 배양한 다음, Ca^{2 +}/Mg^{2 +} FACS 완충액을 사용하여 세정하였다. 결합된 항체는 인간 IgG-Fc 또는 FITC-라벨링된 F(ab)'₂ 토끼 항-쥐 IgG에 대해 특이적인 FITC-라벨링된 염소 IgG에 의해 검출하였다. 염색된 세포는 FACSCanto™ II 플로우 사이토미터 상에서 분석하였다. 항-CD23은 양성 대조군으로서 skw6.4 B 세포에 잘 결합하는 것으로 밝혀졌다. 오말리주맙은 CD23에 의해 결합된 IgE에 결합되지 않은 반면에, hu8D6 및 c8D6은 도 13a 내지 13d에 도시된 바와 같이 SKW6.4 세포 상에서 IgE에 효과적으로 결합할 수 있었다.

실시예 5 인간 Fc εRI에 대한 hu8D6 및 IgE 의 면역 복합체의 결합무능

hu8D6 및 IgE 의 면역 복합체의 제조

정제된 인간 IgE(약 190 kDa), hu8D6, c8D6, 오말리주맙, 및 5H2(약 150 kDa)을 1X PBS에서 1 mg/mL로 희석하였다. 95 μL의 1 mg/mL 인간 IgE, 75 μL의 1 mg/mL 항-IgE mAbs를 혼합하는 것에 의해 항-IgE:IgE 면역 복합체를 함유하는 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양하고 이후에 사용하기 위해 사용하였다.

RBL SX -38 세포에 대한 hu8D6 및 IgE 의 면역 복합체의 결합 무능

100 L FACS 완충액 중의 2 x 10⁵ RBL SX-38 세포를 10 μg/mL 농도의 hu8D6:IgE, c8D6:IgE, 오말리주맙:IgE, 및 5H2:IgE 면역 복합체와 얼음 상에서 30분간 배양한 다음, FACS 완충액에 의해 세정하였다. 결합된 항체는 인간 IgG-Fc 또는 FITC-라벨링된 F(ab)'₂ 토끼 항-쥐 IgG에 대하여 특이적인 FITC-라벨링된 염소 IgG에 의해 검출하였다. 염색된 세포는 FACSCanto™ II 플로우 사이토미터 상에서 분석하였다. 도 14a 내지 14e에 도시된 바와 같이, hu8D6:IgE, c8D6:IgE, 및 오말리주맙:IgE 면역 복합체는 RBL SX-38 세포와 결합할 수 없는 반면에, 항-FcεRI 및 5H2:IgE는 결합하였다.

hu8D6 및 IgE 의 면역 복합체의 RBL SX -38 세포 활성화 무능

3 x 10⁵ RBL SX-38 세포를 37℃ 배양기 중의 0.5 mL의 배양 배지 내 24-웰 플레이트에 철야로 파종하였다. 그 다음 날, 각 웰을 0.5 mL의 티로드 완충액을 사용하여 2회 세척한 다음, 10 μg/mL의 항-IgE:IgE 면역 복합체 또는 1% Triton X-100을 함유하는 0.25 mL의 예열된 티로드 완충액을 부가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 그 상청액을 수집하고 또 실온에서 5분간 300xg에서 원심분리시키며 또 50 μL 투명 상청액을 상기 각 웰로부터 신규 96-웰 블랙 OptiPlate™(Perkin-Elmer)의 각 웰로 전달하였다. 50 μL의 4-MUG 기질 용액을 각 웰에 부가하고 또 상기 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 100 μL 글리신 완충액을 부가하는 것에 의해 반응을 종료시켰다. 도 15에 도시된 바와 같이, hu8D6:IgE, c8D6:IgE, 및 오말리주맙:IgE 면역 복합체는 RBL SX-38 세포의 탈과립반응을 유도하지 않은 반면에 5H2:IgE는 유도하였다.

실시예 6 인간 CD23 에 대한 hu8D6 및 IgE 의 면역 복합체 결합 능력

100 μL의 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} FACS 완충액 중의 2 x 10⁵ SKW6.4 세포를 10 μg/mL 농도의 hu8D6:IgE, c8D6:IgE, 오말리주맙:IgE 면역 복합체 및 항-CD23와 얼음 상에서 30분간 배양한 다음, Ca^{2 +}/Mg^{2 +} FACS 완충액을 사용하여 세정하였다. 결합된 항-IgE:IgE 면역 복합체는 인간 IgG-Fc 또는 FITC-라벨링된 F(ab)'₂ 토끼 항-쥐 IgG에 대해 특이적인 FITC-라벨링된 염소 IgG에 의해 검출하였다. 염색된 세포는 FACS Canto™ II 플로우 사이토미터 상에서 분석하였다. 도 16a 내지 16d에 도시된 바와 같이, 오말리주맙:IgE 면역 복합체는 표면 CD23에 결합할 수 없었던 반면에, hu8D6:IgE, c8D6:IgE 면역 복합체 및 항-CD23는 SKW6.4 세포에 효과적으로 결합할 수 있었다.

실시예 7 PBMC 의 IgE 생산을 억제하기 위한 hu8D6 의 능력

건강한 제공자 또는 아토피성 환자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 Ficoll-Paque® PLUS(GE Healthcare) 밀도 구배로 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정제하였다. 단리된 PBMC는 완전 IMDM 배지(Invitrogen) 내에 10⁶ 세포/mL로 100 ng/mL 인간 IL-4(R&D 시스템스) 및 100 ng/mL 마우스 항-CD40 단일클론성 항체(BioLegend, 클론: G28-5)와 함께 현탁되었다. 인간화된 8D6, 오말리주맙 및 트라츠주맙을 10 μg/ml 농도로 배지에 부가하였다. 7-, 11- 및 14-일 배양 후, 무세포 상청액을 수집하고 또 -20℃에서 저장하였다. 이 상청액에 방출된 IgE는 포획 항체로서 항-인간 IgE, HP6061(Abcam) 및 검출 항체로서 비오틴-라벨링된 항-인간 IgE, HP6029(Abcam)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히, HP6061은 코팅 완충액(15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6) 중의 100 ng/웰로 96-웰 플레이트 상에서 고정시키고 또 4℃에서 철야로 배양하였다. 코팅된 웰은 200 μL/웰의 에세이 희석제(PBS 중의 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.02% ProClin 300)에 의해 실온에서 1시간 동안 블록킹하였다. 플레이트는 200 μL/웰의 세정 완충액(0.05% Tween-20을 갖는 PBS)을 사용하여 3회 세정하였다. 정제된 U266 IgE를 사용하여 표준 곡선(800 내지 3.125 ng/ml 범위, 2-배 계열 희석)을 생성하였다. IgE 자격의 정확성을 개선하기 위하여, IgE 표준은 완전 IMDM 배지에서 제조하고, 여기에 10 μg/ml 농도의 hu8D6, 오말리주맙 또는 트라츠주맙을 스파이킹(spiked)하였다. 100 μL의 투명 상청액 및 표준을, 코팅된 웰에 부가하였다. 실온에서 1시간 동안 배양을 실시하였다. 모든 웰을 통기시키고 또 200 μL/웰의 세정 완충액에 의해 6회 세정하였다. 포획된 IgE는 100 μL의 검출 항체 용액(에세이 희석제 중의 50 ng/mL의 비오틴 라벨링된 HP6029)과 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어, 결합된 비오틴-HP6029는 스트렙트애비딘 폴리-HRP(1:10,000 희석, Thermo Pierce)를 사용하여 1시간(100 μL/웰) 동안 검출하였다. 모든 웰을 통기시키고 또 200 μL/웰의 세정 완충액으로 6회 세정하였다. 마지막으로, 100 μL/웰의 NeA-Blue TMB 기질(Clinical Science Products)에 의해 웰을 반응시키고 또 그 반응은 100 μL/웰의 1M H₂SO₄를 부가하는 것에 의해 중지시켰다. SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하는 것에 의해 표준 곡선을 만들어 4개 변수 로지스틱 곡선-피트(logistic curve-fit)를 생성하고 또 모든 시험된 샘플에서 IgE의 농도를 산출하였다. 스투덴트(Student) t 시험을 이용하여 프리즘 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 데이터를 비교하였다. 도 17a 및 도 17b에 도시된 바와 같이, 배양 개시시에 10 mg/ml의 hu8D6는 배양액 IgE 수준을 88.1%, 93.4 %, 및 88.6% 감소시킨 반면에, 오말리주맙은 7-, 11- 및 14-일 배양시 IgE 수준을 각각 21.3%, 26.4, 및 30%로 감소시켰다. 이들 결과는 B 세포 상에서 막 결합된 및 CD23-결합된 IgE를 결합할 수 있는 hu8D6이, CD23에 의해 이미 결합된 IgE를 결합하지 않는 오말리주맙보다, 훨씬 더 우수하여, 신규 IgE 합성을 억제함을 제시한다.

SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> HUMANIZED ANTI-IgE ANTIBODIES THAT CROSSLINK CD23 ON B LYMPHOCYTES BUT DO NOT SENSITIZE MAST CELLS <130> P2800-PCT <150> US62013196 <151> 2014-06-17 <160> 12 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> variable region of heavy chain derived from 8D6 hybridoma <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Met Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Glu Tyr Arg His Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized variable region of heavy chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Glu Tyr Arg His Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> variable region of light chain derived from 8D6 hybridoma <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Met Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized variable region of light chain <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 1 derived from the heavy chain of mu8D6 antibody <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 2 derived from the heavy chain of mu8D6 antibody <400> 6 Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 3 derived from the heavy chain of mu8D6 antibody <400> 7 Ala Arg Gln Glu Tyr Arg His Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 1 derived from the light chain of mu8D6 antibody <400> 8 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 2 derived from the light chain of mu8D6 antibody <400> 9 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <223> complementarity determining region 3 derived from the light chain of mu8D6 antibody <400> 10 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> the germline VH1-69/JH4 sequence of human immunoglobulin gene <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> the germline Vk1-39/Jk1 sequence of human immunoglobulin gene <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (17)

1. 자유 IgE, B 림프구 상의 막 결합된 IgE, 또는 CD23에 의해 결합된 IgE와는 결합하지만, FcεRI에 의해 결합된 IgE와는 결합하지 않는 인간화된 항체로서,
   이 때, 상기 인간화된 항체는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 경쇄 가변 영역 (V_L)를 포함하고,
   상기 V_H는 서열번호: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
   상기 V_H의 초가변 영역이 위치 26-35(CDR-H1; 서열번호: 5), 50-65(CDR-H2; 서열번호: 6) 및 93-104(CDR-H3; 서열번호: 7)이고,
   상기 V_L은 서열번호: 4와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
   상기 V_L의 초가변 영역이 위치 27-34(CDR-L1; 서열번호: 8), 50-56(CDR-L2; 서열번호: 9), 및 89-97(CDR-L3; 서열번호: 10)인 인간화된 항체.
   
2. 제1항에 있어서, B 림프구 상에서 IgE-결합된 CD23을 가교하는 인간화된 항체.
3. 제1항에 있어서, B 림프구에 의해 전체 IgE 생산을 감소시키는 인간화된 항체.
4. 제1항에 있어서, 항원-활성화된 B 림프구에 의해 항원-특이적 IgE 생산을 감소시키는 인간화된 항체.
5. 제1항에 있어서, 인간화된 항체에 의해 치료된 환자에서 IgE 생산을 감소시키는 인간화된 항체.
6. 제1항에 있어서, 항체는 항원-결합 단편인 인간화된 항체.
7. 제6항에 있어서, 항원-결합 단편이 Fab, F(ab')2, 또는 단일 사슬 Fv인 인간화된 항체.
8. IgE-매개된 질환의 치료를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 치료적으로 유효량의 인간화된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고,
   IgE-매개된 질환은 앨러지성 천식, 앨러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식 앨러지, 만성 자발성(특발성) 두드러기, 만성 비부비동염, 전신 비만세포증, 피부 비만화세포증, 앨러지성 기관지폐 아스페르질루스증, 재발되는 특발성 혈관부종, 및 호산구 관련 위장관 질병인 약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, 인간화된 항체는 FcεRI-결합된 IgE에는 결합할 수 없고 비만 세포 및 호염기구의 탈과립반응을 유도할 수 없는 약학적 조성물.
10. 제8항에 있어서, 인간화된 항체 및 IgE는 면역복합체를 형성하며, 면역복합체는 CD23에 결합하고 CD23을 가교할 수 있지만; FcεRI에는 결합할 수 없고 비만 세포 및 호염기구의 탈과립반응을 유도할 수 없는 약학적 조성물.
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