CN112552403A

CN112552403A - 一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN112552403A
Application number: CN202011560869.3A
Authority: CN
Inventors: 李冬冬; 訾红彦
Original assignee: Nanjing Yinghins Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Yinghins Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-03-26

Abstract

本发明公开了一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用。包括轻链V区和重链V区，轻链V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该Fab片段可以特异性识别人CD23，且具有较高的亲和力，且该Fab片段可以用于调控CD23的活性，从而控制介导细胞粘着、调节IgE和组胺的释放，通过调控CD23的活性也可以使B细胞免于凋亡以及调节骨髓细胞生长。由人源抗人CD23抗体的Fab片段可以用于制备治疗淋巴相关疾病的药物。

Description

一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种人源抗人 CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用。

背景技术

CD23也称FcεRII，是人和脊椎动物的IgE低亲和力受体，即 IgE的II型受体；它是一种广泛分布于B细胞、嗜酸粒细胞(EOS)、激活的单核/巨噬细胞、血小板、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、表皮角细胞、胸腺上皮细胞、部分T细胞、自然杀伤细胞等细胞膜表面的跨膜糖蛋白，分子量为45kDa。

CD23是人类B淋巴细胞表面的一种分化抗原。CD23属于典型 II型穿膜糖蛋白，由321个氨基酸组成，包括由23个氨基酸残基组成的胞内N-末端、21个氨基酸残基组成的穿膜区及277个氨基酸残基组成的的C-末端膜外区；其羧基末端位于细胞外，氨基末端位于细胞内，属于C型动物凝集素超家族。

人CD23基因位于19号染色体上，是单拷贝基因，有两种类型，由于它们的启动基因不同造成所编码的CD23分子氨基末端的6个氨基酸不同，形成了两种CD23：CD23a和CD23b。细胞膜表面CD23 可由自身或被蛋白水解酶裂解为多种大小不等的可溶性片段，称为可溶性CD23(sCD23)，这些片段大部分仍可与IgE结合，且表现出与 IgE无关的多种功能。

CD23是多功能受体分子/细胞因子，它参与调节IgE的合成、促进B细胞激活、增殖和分化，并通过与膜CD21的结合介导B-T细胞相互作用、增强B细胞向T细胞提呈抗原，促进T细胞成熟。

目前，B淋巴细胞的具体活化过程及IgE生成调节机制尚不清楚，提供一种人源抗人CD23抗体的Fab片段对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源抗人CD23抗体的Fab片段、药物组合物及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种人源抗人CD23抗体的Fab片段，包括轻链V 区和重链V区，轻链V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链 V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的轻链V区的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的重链V区的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种表达载体，含有编码轻链V区的核苷酸序列和/或编码重链V区的核苷酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有表达载体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的宿主细胞为大肠杆菌或真核细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的人源抗人CD23 抗体的Fab片段。

本发明还提供了一种人源抗人CD23抗体的Fab片段在制备及作为治疗如下疾病的药物中的应用，上述的疾病为如下疾病中的任意一种：

肿瘤性疾病选自复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病。

本发明提供了一种治疗淋巴相关疾病的药物，其包括上述的人源抗人CD23抗体的Fab片段。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述治疗淋巴相关疾病的药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料，优选地，药物组合物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的人源抗人CD23抗体的Fab片段，为全人源并无 Fc段，该Fab片段可以特异性识别人CD23，且具有较高的亲和力，且该Fab片段可以用于调控CD23的活性，从而控制介导细胞粘着、调节IgE和组胺的释放，通过调控CD23的活性也可以使B细胞免于凋亡以及调节骨髓细胞生长。由人源抗人CD23抗体的Fab片段可以用于制备治疗淋巴相关疾病的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为重组人CD23的蛋白片段PAGE图。

具体实施方式

本发明提供的人源抗人CD23抗体选自天然人源免疫球蛋白基因文库，经过ELISA测序分析等从文库中筛选得到抗人CD23抗体的Fab片段。经过表达纯化及鉴定，证实本发明提供的人源抗人CD23 抗体的Fab片段能特异性识别人CD23，且人源抗人CD23抗体的Fab 片段与人CD23的亲和力较高。

可选的，上述的表达载体可以同时含有编码轻链V区的核苷酸序列和编码重链V区的核苷酸序列。可选的，编码轻链V区的核苷酸序列作为插入片段，在插入片段的两端分别设置有启动子和终止子；编码重链V区的核苷酸序列的两端设置有相应的启动子和终止子。上述的表达载体还设置有相应的抗性筛选位点以及酶切位点。

本发明还提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有表达载体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的宿主细胞为大肠杆菌或真核细胞。可选的，上述宿主细胞包括并不限于JM109。

可选的，上述人源抗人CD23抗体的Fab片段作为有效成分。

可选的，上述药物组合物用于靶向调控CD23的活性，该药物组合物包括并不限于介导细胞粘着、调节IgE和组胺的释放、控制B 细胞免于凋亡以及调节骨髓细胞生长等。

可选的，上述药物组合物可以用于治疗B淋巴细胞相关疾病。

可选的，上述的人源抗人CD23抗体的Fab片段也可用于治疗费 IgE介导的疾病，例如可以用于溃疡性结肠炎的治疗和预防，也可应用于节段性肠炎的治疗和预防。

可选的，上述的人源抗人CD23抗体的Fab片段既可以单独使用，也可以与免疫抑制剂结合使用，如甾类或抗淋巴细胞抗体等抗体，或者与耐受性诱导剂、抗自身免疫制剂或抗炎症剂结合使用。如抗CD4 抗体等CD4+T细胞抑制剂、抗CD8抗体、抗TNF抗体等TNF拮抗剂等。

可选的，本发明提供的药物组合物可特别有效地用于皮下、肌肉或静脉内给药。

本发明提供的人源抗人CD23抗体的Fab片段可被冻干以便储存，并在使用前重构于适当的载体中。冻干并重构会导致抗体的活性有不同程度的损失，因而需调整使用量以对此进行适应性的补偿。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了人源抗人CD23抗体的Fab片段的筛选方法。其包括：

(1)构建抗体筛选库。具体的，选择健康人270名，各取5ml 外周抗凝血，以Ficoll-Paque分离淋巴细胞，混合后用于抗体库的构建，提取总RNA。将总RNA用全式基因的反转录试剂盒以Oligo(dT)16逆转录成cDNA，并以人CD23轻重链可变区保守序列的上下游引物进行免疫球蛋白γ、κ、λ链基因的PCR扩增。

PCR产物经提纯后，双酶切κ链和λ链产物。酶切后的κ链和λ链产物与人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2连接，随后电转入JM109感受态细胞中，构成轻链库。分别以BamH I和HindⅢ对轻链库及γ链PCR产物进行酶切修饰，连接反应后，电转导入大肠杆菌 JM109中，构成8×10⁸的非依赖性克隆滴度的抗体库，取1ulDNA 进行酶切电泳。

(2)人CD23的蛋白片段的重组表达。

抗CD23受体能与造血细胞上表达的CD23的结合。

首先，合成编码人CD23蛋白片段所需的cDNA，通过PCR扩增人CD23的蛋白片段的基因片段；该基因片段经过BamH I和Hind Ⅲ酶切纯化后，与pET19b(Novagen)载体相连接，转化入大肠杆菌 JM109中，将获得的阳性克隆进行序列分析，将正确序列的质粒转入表达宿主菌BL21star(DE3)plysS感受态细胞(Novagen)，经异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，提取包涵体蛋白，并进行蛋白复性(根据Novagen的包涵体蛋白提纯方法)，其分子量为28kDa(图1)。以提纯的人CD23的蛋白片段每点2μg点于硝酸纤维素膜上，检测重组蛋白的特异性和敏感性。

结果显示，重组人CD23的蛋白片段可与抗人CD23抗体特异性反应。

(3)抗人CD23的人免疫球蛋白G的筛选取8×10⁸的非依赖性克隆滴度的抗体库DNA10ng，转化100μl的大肠杆菌JM109，将菌液涂布在平板上，37℃培养7小时，待克隆直径为0.3mm左右时，以直径为82mm硝酸纤维素膜覆于平板上，待克隆完全转移至膜上，将膜置于含1.0mM IPTG的LB平板上，30℃诱导表达6小时，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白对膜进行溶菌；接着采用克隆印迹法筛选膜上深染的阳性克隆。

从抗体库中取10ng DNA，转化100μlJM109大肠杆菌，挑取转化所得的每3个单个克隆至2ml含氨苄青霉素的培养基中，待OD600 为0.6～0.8时加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，30℃诱导表达10～ 12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入100μl含 1mM PMSF的PBS，悬浮细菌，4℃进行超声粉碎，而后14000rpm 离心10分钟，取100μl/孔细菌超声裂解后上清或用菌液稀释过的 CD23 Ab 1或3％BSA稀释过的CD23 Ab 1，加入包被有0.5μg天然 CD23(10ng/孔)的酶标板上，进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人 IgGFab为二抗，以邻苯二胺显色。

经过筛选获得1个阳性克隆，可与人CD23的蛋白片段特异性结合。

(4)抗人CD23的抗体Fab片段重轻链基因的特性分析

取阳性克隆的质粒，分别以限制性内切酶酶切，获得轻链和重链基因，再与经酶切修饰的测序载体CV-2和CV-1连接，转化大肠杆菌JM109，分别提取含轻链或重链基因的质粒DNA，以M13Reverse 为引物，进行测序，并以Vector NTI 10软件推算氨基酸序列，以IgBlast 进行同源性分析，并根据Kabat系统对阳性克隆的轻链可变区和重链可变区的CDR、FR进行划分。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人源抗人CD23抗体的Fab片段，其特征在于，包括轻链V区和重链V区，所述轻链V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链V区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的人源抗人CD23抗体的Fab片段，其特征在于，所述的轻链V区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的人源抗人CD23抗体的Fab片段，其特征在于，所述的重链V区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种表达载体，其特征在于，含有编码轻链V区的核苷酸序列和/或编码重链V区的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌或真核细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的人源抗人CD23抗体的Fab片段。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的人源抗人CD23抗体的Fab片段在制备及作为治疗如下疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为如下疾病中的任意一种：

9.一种治疗淋巴相关疾病的药物，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的人源抗人CD23抗体的Fab片段。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述治疗淋巴相关疾病的药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料，优选地，所述药物组合物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。