CN106573972A - 交联B淋巴细胞的CD23但不致敏肥大细胞的人源化抗‑IgE抗体 - Google Patents

交联B淋巴细胞的CD23但不致敏肥大细胞的人源化抗‑IgE抗体 Download PDF

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Abstract

揭露一种新的交联B淋巴细胞的CD23但不致敏肥大细胞的人源化抗‑IgE抗体。此抗体可结合至游离的IgE、位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE、或与CD23结合的IgE，而非位于肥大细胞上与高亲和力IgE.Fc受体结合的IgE。本发明关于藉由投予本发明抗‑IgE抗体对IgE介导疾病的治疗，IgE介导疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、食物过敏、慢性自发性(特发性)荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲菌病、复发性特发性血管性水肿，以及和嗜酸性粒细胞有关的肠胃疾病。

Description

交联B淋巴细胞的CD23但不致敏肥大细胞的人源化抗-IgE 抗体
技术领域
本发明关于制备人源化抗体，其可结合至游离的IgE、位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE、或是CD23结合的IgE，而非位于肥大细胞上与高亲和力IgE.Fc受体结合的IgE。本发明也关于此种抗体在治疗IgE介导疾病上的治疗应用，所述IgE介导疾病包括，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、食物过敏、慢性自发性(特发性)荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲菌病、复发性特发性血管性水肿，以及和嗜酸性粒细胞有关的肠胃疾病。
背景技术
过敏是一种对外来、无害的抗原的过度免疫反应所引起的超敏状态。立即的超敏反应(hypersensitivity)是在抗原存在下发生，透过免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)和呈现在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE.Fc受体(FcεRI)的交互作用产生，此抗原可和与FcεRI结合的IgE反应，造成发炎细胞所执行的和新合成的介质被释出。大多数过敏性疾病是IgE介导的。众所周知，一些非过敏性疾病，其不涉及对外来抗原的免疫反应，特别是发炎性皮肤疾病，也是IgE介导的。
IgE有两种主要的受体，FcεRI和低亲和力IgE.Fc受体FcεRII(也称为CD23)。FcεRI于人类主要表达在肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面，在此，它是一个四聚体复合物，其包含一个α链、一个β链，和两个以双硫键结合的γ链。由过敏原所引起位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcεRI的活化，会导致去颗粒作用(degranulation)，而树突状细胞上的FcεRI活化，则会导致IgE介导的过敏原被呈现。
CD23是一种分子量约45kDa的第二型穿膜糖蛋白，包含一个C型类凝集素功能区块(C-type lectin-like domain)，之后为一个茎部区域(其具有多个重复区可作为预测性的亮氨酸拉链(putative leucine zipper)以形成卷曲螺旋三聚体(coiled-coiltrimers))，一个膜跨越区域，以及一个短的氨基端细胞质功能区块。实际上，单体CD23对IgE的亲和力(KD＝10-6-10-7M)比对FcεRI(KD＝约10-10M)低得多，但对其三聚体形式的亲和力则高出许多(KD＝10-8-10-9M)。编码CD23多肽的FcεRII基因具有驱使两种mRNA变异体合成的两个替代的转录起始位点，两种mRNA变异体导致产生两种CD23同型异构物，其在氨基端细胞质尾端的前七(CD23a)和六(CD23b)个氨基酸不同。CD23a是被B细胞专门地和连续地表达，而CD23b是由位于单核球/巨噬细胞、B细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和上皮细胞表面上的IL-4所诱导。位在B细胞上的CD23被认为有助于IgE生成和抗原呈现的调控，而位在巨噬细胞和树突状细胞上的CD23涉及吞噬作用/内噬作用、抗原-IgE复合物的清除和抗原呈现。位于上皮细胞上的CD23的附加功能包括IgE的运输。抗原-IgE复合物可直接跨越上皮细胞穿透至内腔的空间，且反之亦然。CD23也可以是37、33、25和16kDa的游离的可溶性CD23(sCD23)蛋白形式，由细胞表面释出。在体内负责CD23脱落(CD23 shedding)的主要金属蛋白酶是ADAM10基因，其以三聚体形式产生37kDa或35kDa的sCD23。另一种自然产生的sCD23是derCD23，其乃藉由在尘螨(dermatophagoides pteronyssinus)粪便发现的Der p1蛋白酶作用所产生。利用Der p1裂解CD23产生16kDa单体的derCD23。其显示可观察到三聚体sCD23片段作为促进自发性IgE合成的关键分子，而较小的单体sCD23似乎可向下调节(down-regulate)IL-4刺激的IgE合成。
IgE以分泌的形式和与膜结合的形式存在，其似乎是因剪接所产生的变异体(splicing variants)。分泌形式IgE的ε链的恒定区域存在CH1-CH2-CH3-CH4功能区块，然而于人体中发现具有与膜结合的IgE(mIgE)的与膜结合形式IgE的ε链有两种同型异构物，其为选择性剪接的结果。人类mIgE的两种同型异构物的ε链包含一个migis-ε肽和一个膜锚定肽(membrane-anchoring peptide)。一个同型异构物在CH4功能区块和膜锚定肽间只包含migis-ε肽(长度为15个氨基酸)(称为“短型”)，然而第二个同型异构物在CH4功能区块和migis-ε肽间还包含一个额外长度为52个氨基酸的功能区块(称为CεmX功能区块)(称为“长型”)。
因为IgE在介导大多数过敏性疾病中扮演重要的角色，目前已有多种策略以控制体内的IgE浓度或调控IgE合成，例如抗-IgE、抗-IL-4/IL-13和抗-CD23。Omalizumab是一种重组人源化单克隆抗-IgE抗体，其可以和血清中循环的游离IgE以及位于B细胞上与膜结合的IgE结合，而非位于细胞表面上与FcεRI结合以及与CD23结合的IgE。Omalizumab可显著地降低(高达99％)过敏患者中的血清游离IgE，抑制IgE结合至FcεRI，以及后续向下调节嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI的量。在许多IgE介导疾病(例如：过敏性哮喘、慢性荨麻疹、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎等)中的大量临床试验已经显示，Omalizumab在这些疾病的治疗上是有效且安全的。Omalizumab在许多国家已被批准用于治疗重度过敏性哮喘和慢性特发性荨麻疹。此外，Lumiliximab，其为一种抗-CD23单克隆抗体，包含灵长类动物(食蟹猴)的可变区域和人类的恒定区域。Lumiliximab可结合至C型凝集素功能区块，以避免IgE与CD23结合，因此可使表面CD23稳定并减少CD23的蛋白酶切割。已有文献报导Lumiliximab可抑制生殖细胞系ε转录本，降低培养的人类外周血单个核细胞(PBMCs)中的IgE生成，并减少过敏患者血液的IgE浓度。
在1990年的专利(美国专利第4,940,782号)揭露，对大鼠IgE具有专一性的小鼠IgG单克隆抗体44.7b，其可结合至与CD23结合的IgE，而非与FcεRI结合的IgE。这种抗体44.7b从未用来作为治疗IgE介导疾病的治疗性候选药物。发表于2012年的一篇论文(Shiung et al.，Immunobiology，2012，217：676-683)指出，小鼠抗-人IgE单克隆抗体(即，8D6)，能够结合至与CD23结合的IgE，而非与FcεRI结合的IgE。作者认为此抗体不只具有Omalizumab的主要药理学特性以中和IgE而未使肥大细胞和嗜碱性粒细胞致敏化，还具有Lumiliximab的特性以交联与CD23结合的IgE。然而，鼠源抗体可能具有免疫原性且不能应用于治疗IgE介导的疾病。已发现鼠源抗体在人类的治疗应用受限于患者对鼠源抗体产生的免疫反应。因此，鼠源抗体的人源化是必需的，可减少其在人类接受者的免疫原性。
发明内容
本发明关于人源化抗体，其结合至(1)分泌游离形式的人类IgE，(2)位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE，(3)位于B细胞上与CD23结合的IgE，或与溶液中游离的CD23结合的IgE。此种抗-IgE抗体不结合至位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上与FcεRI结合的IgE，因此不会活化这些发炎细胞。本发明也关于在IgE生合成中那些人源化抗-IgE抗体的生物学特性、IgE对各种细胞和分子组成物的结合，以及可能的清除过敏原的效应。它还涉及这种抗体于IgE介导的过敏性和非过敏性疾病治疗中的应用。
我们已经确认MEMP1972A(一种抗-M1’抗体)的第Ib和IIa期试验的最新结果(Gauvreau et al.，Science Translation Medicine，2014，Vol.6：243ra85)，其指出藉由抑制新的IgE合成可减少IgE介导的症状。我们推论，因为hu8D6：IgE复合物可结合至CD23，且因为CD23可表达在许多种类的细胞上(Acharya et al.Clin.Exp.Immunol.，2010，162：12-23)，hu8D6：IgE复合物吸附到细胞表面的CD23，可降低体内循环的总IgE浓度(游离的和与hu8D6结合的IgE)。此外，沿着黏膜内衬的上皮细胞能够透过CD23依赖性胞吞转运(CD23-dependent transcytosis)清除与细胞结合的物质(Tu et al.Gastroenterology，2005，129：928-940)，当hu8D6：IgE复合物运送至胃肠道和支气管管道管内腔时，hu8D6可能可协助处理并移除进入的过敏原和内源性的IgE结合的自体抗原(IgE-bindingautoantigens)。Hu8D6结合至与CD23结合的IgE可有效地交联位于B淋巴细胞上的CD23，以造成藉由B细胞的抗原专一性IgE生成的抑制，其发生于藉由特定抗原活化之时。Hu8D6的上述性质可支持hu8D6和具有相同IgE结合特性的其他人源化抗体的潜在用途，能于具有IgE介导疾病的患者身上抑制抗原专一性的IgE生成，因此能改善这些疾病病况。利用小鼠8D6抗体作为一个例子，我们已制备此抗体的人源化形式。此人源化抗体具有以上所讨论的所有结合特性和生物学特性。
附图说明
依据附图从以下详细说明可对于本发明有更佳理解，在此：
图1显示可变重链的氨基酸序列的比对，可变重链包含人类生殖细胞系VH1-69和JH4序列(VH1-69/JH4)、小鼠抗-IgE抗体8D6(mu8D6)，以及8D6-接枝人源化8D6(hu8D6)，图中以底线表示互补决定区(CDR)，以星号标示保留在hu8D6的鼠源VH框架的氨基酸；
图2显示可变轻链的氨基酸序列的比对，可变轻链包含人类生殖细胞系Vκ1-39和Jκ1序列(Vκ1-39/Jκ1)、小鼠抗-IgE抗体8D6(mu8D6)，以及8D6-接枝人源化8D6(hu8D6)，图中以底线表示互补决定区(CDR)，以星号标示保留在hu8D6的鼠源Vκ框架的氨基酸；
图3是利用ELISA测定的hu8D6(实线)和亲本c8D6抗体(虚线)结合至人类IgE的滴定曲线；
图4是利用ELISA测定的hu8D6(实线)和嵌合8D6(c8D6，虚线)去与HRP结合的c8D6竞争以结合人类IgE的抑制曲线；
图5是利用表面电浆共振式生物分子传感器(BIAcore)分析hu8D6 Fab对人类IgE的表面电浆共振(SPR)曲线。RU：共振单位；
图6a和图6b是利用流式细胞仪分析hu8D6和c8D6对mIgE.Fc-表达Ramos细胞株的结合，图中mIgE.FcL Ramos：表达长型人类与膜结合的IgE.Fc的Ramos细胞(图6a)，以及mIgE.FcS Ramos：表达短型人类与膜结合的IgE.Fc的Ramos细胞(图6b)；
图7显示hu8D6对IgE-饱和重组人类FcεRIα链的结合；
图8a至图8e显示hu8D6对人类FcεRI-表达RBL SX-38细胞(将人类IgE预先给予人类FcεRI-表达RBL SX-38细胞)的结合；
图9是利用ELISA测定的hu8D6和Omalizumab与重组FcεRIα-Fc蛋白竞争以结合人类IgE的抑制曲线；
图10是利用流式细胞仪分析hu8D6和Omalizumab去与位于RBL SX-38细胞上的天然FcεRI受体竞争人类IgE结合的抑制曲线；
图11显示hu8D6无法活化和引发IgE-致敏化RBL SX-38细胞的去颗粒作用；
图12显示hu8D6对IgE-饱和重组三聚体人类CD23的结合；
图13a至图13d显示hu8D6对人类CD23-表达SKW6.4细胞的结合；
图14a至图14e显示hu8D6：IgE免疫复合物无法结合至人类FcεRI-表达RBL SX-38细胞；
图15显示hu8D6：IgE免疫复合物无法活化和引发IgE-致敏化RBL SX-38细胞的去颗粒作用；
图16a至图16d显示hu8D6：IgE免疫复合物对人类CD23-表达SKW6.4细胞的结合；以及
图17a和图17b显示Omalizumab(图17a)或hu8D6(图17b)在体外对IgE从头合成(denovo IgE synthesis)的抑制效果。
具体实施方式
本发明是关于人源化抗体，其结合至(1)分泌游离形式的人类IgE，(2)位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE，(3)位于B细胞上与CD23结合的IgE，或是(4)与溶液中游离的CD23结合的IgE。此种抗-IgE抗体不结合至位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上与FcεRI结合的IgE，因此不会活化这些发炎细胞。在广泛的定义中，人源化抗体其中重链和轻链的恒定区域以及VH和VL功能区块的框架区域均为人类来源。
利用噬菌体、酵母菌或核糖体表达单链抗体库(单链抗体库包含人类B淋巴细胞的VH和VL部分)的各种方法已成功地用于筛选针对人类细胞表面抗原或细胞因子的抗体。这种方法也可用来筛选具有本发明独特IgE结合特性的人类抗体。或者，本发明抗体可以于具有人类免疫球蛋白VH和VL基因库的基因转殖小鼠中获得。
在一实施例中，本发明提供制备具有上述结合特性的人源化型式小鼠抗-IgE单克隆抗体(8D6)的详细说明。本发明提供一种人源化抗-人类IgE抗体，hu8D6，其包含一个重链可变区域(SEQ ID NO：2)和一个轻链可变区域(SEQ ID NO：4)。确认hu8D6的高度可变区域的氨基酸序列如下：CDR-H1包含GYTFNGYWMH(SEQ ID NO：5)；CDR-H2包含YINPTTGHTEYNQKFKD(SEQ ID NO：6)；CDR-H3包含ARQEYRHSWFAY(SEQ ID NO：7)；CDR-L1包含QSVDYDGDTY(SEQ ID NO：8)；CDR-L2包含AASNLDS(SEQ ID NO：9)；CDR-L3包含QQTNEDPWT(SEQ ID NO：10)。
本发明提供一种人源化抗-人类IgE抗体(即，hu8D6)，其中此抗体于其二价型式对人类IgE的结合活性为EC50＝～10-10M。抗体于其一价Fab型式对人类IgE的亲和力为KD＝～10-11M。
在以下实施例中，本发明提供一种人源化抗-IgE抗体，hu8D6，其可结合至游离人类IgE(未被其两个受体结合)、位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE(长型和短型)，或是与CD23结合的IgE上，但无法结合至与FcεRI结合的IgE和引发由肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)。此外，hu8D6可有效地抑制IgE结合至FcεRI。Hu8D6和人类IgE的免疫复合物可结合至CD23，但无法结合至FcεRI和引发由肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶。再者，hu8D6可结合与膜结合的IgE和位于B细胞上与交联CD23结合的IgE，且因此可于体外培养系统抑制来自人类外周血单个核细胞的IgE生成的从头合成(denovo synthesis)。
在本发明一范畴，人源化抗-IgE抗体(即，hu8D6)，可以是全长抗体(例如，IgG分子)、抗原结合片段(例如，Fab或F(ab’)2)，或单链Fv。
在本发明另一范畴，本发明人源化抗-IgE抗体，hu8D6，展现治疗特性，且可提供用以治疗IgE介导疾病的方法，包含投予有需要的患者有效剂量的此人源化抗-IgE抗体，在此所述的人源化抗-IgE抗体为抗体或抗原结合片段。IgE介导疾病包含过敏性哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、食物过敏、慢性自发性(特发性)荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲菌病、复发性特发性血管性水肿，以及和嗜酸性粒细胞有关的肠胃疾病。值得注意的是，其中的一些疾病(例如慢性自发性荨麻疹、系统性肥大细胞增生症，以及复发性特发性血管性水肿)并非过敏性疾病，且不涉及外部过敏原。
实施例
实施例1人源化抗-IgE抗体的产生
1.1 CDR接枝(CDR grafting)
将来自8D6的VH(SEQ ID NO：1)和Vκ(SEQ ID NO：3)功能区块的氨基酸序列与人类生殖细胞系VH1-69/JH4(SEQ ID NO：11)和Vκ1-39/Jκ1(SEQ ID NO：12)等位基因做比对。为制造CDR接枝，使用接受体VH框架，其在四个位置M48I、R66K、V67A和S76N有别于人类生殖细胞系VH1-69等位基因。将互补决定区(CDRs)(其为8D6的位置第26-35位氨基酸(CDR-H1，SEQID NO：5)、第50-65位氨基酸(CDR-H2，SEQ ID NO：6)以及第93-104位氨基酸(CDR-H3，SEQID NO：7))利用基因工程置入接受体VH框架，以产生如图1所示8D6 VH的直接CDR-接枝。在Vκ功能区块，将位置为第27-34位氨基酸(CDR-L1，SEQ ID NO：8)、第50-56位氨基酸(CDR-L2，SEQ ID NO：9)以及第89-97位氨基酸(CDR-L3，SEQ ID NO：10)的CDRs接枝至接受体Vκ框架，其在位置M4L有别于人类生殖细胞系Vκ1-39等位基因(图2)。将8D6 VL的直接CDR-接枝称为hu8D6 VL(SEQ ID NO：4)。
1.2 IgG制造
为了获得人源化8D6(hu8D6)和嵌合8D6(c8D6)抗体，利用Expi293TM表达系统(Invitrogen)暂时表达。利用ExpiFectamineTM 293试剂(Invitrogen)于125毫升细胞培养瓶内在30毫升培养物中进行转染。在转染的前一天，以Expi293TM表达培养基(Invitrogen)稀释Expi293FTM细胞至密度为2x106细胞/毫升。在转染的当天，对培养物进行细胞计数，并利用离心将其浓缩至2.5x106细胞/毫升，移除旧的培养基，并加入新鲜的培养基。藉由将80微升的ExpiFectamine 293在1.5毫升的OPTI-MEM(Invitrogen)中稀释以形成转染复合物，并在5分钟后加入稀释的ExpiFectamine 293TM溶液到30微克的质粒DNA中。之后将3毫升的DNA-转染试剂复合物溶液在室温下培养20分钟，并缓慢将其加入悬浮液中培养，同时缓慢地旋动细胞培养瓶。将转染的细胞置于37℃培养箱的回转式振荡器的摇床上，并培养16小时。培养后，将150微升的ExpiFectamine 293TM转染增强剂1和1.5毫升的ExpiFectamine293TM转染增强剂2加到培养物中。在转染后第7天终止培养并进行收集以供抗体纯化。利用rProtein-A琼脂糖凝胶TM亲和层析(GE Healthcare)由悬浮液纯化抗体。如同利用尺寸排阻快速蛋白质液相层析(size exclusion fast protein liquid chromatography)所测定，最终产物为尺寸均一的，其具有＞99％的蛋白质是以相对分子量(Mr)约150,000的单一波峰冲提出来。
1.3结合分析(EC50)
将人类IgE的Fc区域(ε.Fc 2-4)(根据先前由Wan等人(Nature Immunol.，2002，3：681-686)所述的编码系统，其起始于Ser226至Gly599，且包含两个突变N265Q和N371Q)表达于Expi293FTM细胞，并藉由利用Omalizumab偶联的NHS-活化的琼脂糖凝胶TM树脂(GEHealthcare)的抗-IgE免疫亲和性层析加以纯化。对于hu8D6的EC50测定，将ε.Fc 2-4蛋白配制于涂覆液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中以50纳克/孔洞的量固定于96孔盘上，并于4℃下隔夜培养。以200微升/孔洞的测定稀释剂(含0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS))于室温下反应1小时以封阻涂覆的孔洞。以200微升/孔洞的洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)清洗微量盘三次。将100微升的抗体稀释液(于1∶3步骤从0.1毫克/毫升连续稀释)加入涂覆的孔洞中。于室温下培养2小时。吸干所有孔洞，并以200微升/孔洞的洗涤缓冲液清洗所有孔洞6次。将微量盘与1：10,000比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)结合的山羊抗-小鼠IgG-Fc抗体(Jason ImmunoResearch)培养1小时(100微升/孔洞)。之后，以200微升/孔洞的洗涤缓冲液清洗所有孔洞6次。最后，利用50微升/孔洞的NeA-Blue TMB受质(Clinical Science Products)进行呈色，且藉由加入50微升/孔洞的1N氢氯酸终止反应。在ELISA分析仪测定在OD450的吸光值。利用Prism软件(GraphPad)计算EC50。如图3所示，hu8D6和c8D6的EC50为1.48x10-10和1.16x10-10M。结果指出在CDR接枝的过程后几乎完全地保留了hu8D6的结合活性。
1.4竞争分析(IC50)
执行竞争性ELISA试验以比较hu8D6和c8D6与HRP结合的c8D6竞争对人类IgE的结合的效率，以测定hu8D6的结合特性。以隔夜培养的方式于4℃下利用配制于涂覆液的50纳克的ε.Fc 2-4蛋白涂覆ELISA微量盘的孔洞，并将涂覆的孔洞与测定稀释剂培养以进行封阻。另外，以1∶1000的比例将HRP-c8D6的原液稀释于测定稀释剂中，且于1∶3步骤中将溶液与从0.1毫克/毫升连续稀释的未结合的c8D6或hu8D6混合。将这两个系列的混合物加至ELISA的孔洞中，并在室温下培养1小时。然后利用PBST洗涤孔洞，将孔洞与TMB培养，并测定其OD450。利用Prism软件计算IC50。如图4所示，未结合的hu8D6和c8D6的IC50为1.79x10-9和2.28x10-9M。结果指出hu8D6和8D6结合至相同的抗原表位。
1.5利用表面电浆共振(SPR)分析测定KD
为了产生hu8D6 Fab，将hu8D6抗体VH和Vk的DNA片段的cDNAs分别地连接至Fab表达载体的人类Cγ1-CH1功能区块和人类Cκ区域，此Fab表达载体是来自pIgG1(κ)载体，利用Cγ1-CH1功能区块取代整个Cγ1恒定区域修饰而成(Chen et al.J Immunol.184：1748-1756)。利用Expi293TM表达系统(Invitrogen)供暂时表达。利用KappaSelect琼脂糖凝胶TM亲和层析(GE Healthcare)由悬浮液纯化Hu8D6 Fabs。如同利用尺寸排阻快速蛋白质液相层析所测定，最终产物为尺寸均一的，其具有＞99％的蛋白质是以相对分子量(Mr)约50,000的单一波峰冲提出来。
对hu8D6的KD测定而言，SPR测定是利用Biacore X仪器(GE Healthcare)进行。利用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare)将Hu8D6 Fab固定于CM5芯片(GE Healthcare)上。偶联密度限制于＜500共振单位。于流速为30微升/分钟下，将配制于HBS-P缓冲液(GEHealthcare)中浓度为25、12.5、6.25和3.125nM的ε.Fc 2-4蛋白注射到感测芯片上。将所有样品注射至流路(flow cell)中达120秒，其于25℃下具有720秒的解离时间。利用10mMglycine-HCl(pH 2.5)的两次为时30秒的注入执行传感器表面的再生。ε.Fc 2-4于不同浓度下结合至固定的hu8D6 Fab的声谱图(sonograms)如图5所示。利用BIAevalution软件(GEHealthcare)计算亲和力和速率常数，显示hu8D6 Fab对ε.Fc 2-4的结合速率(kon)和解离速率(koff)为1.23±0.17x106M-1s-1和5.79±0.03x10-5s-1，导致hu8D6的KD为4.8±0.7x10-11M。
1.6流式细胞仪(FACS)分析
以编码mIgE.FcL(细胞膜ε链的长型的CH2-细胞质尾端)或mIgE.FcS(细胞膜ε链的短型的CH2-细胞质尾端)的重组DNA转染的Ramos细胞株是由Chen等人产生(Chen et al.JImmunol.184：1748-1756)，并用以测定hu8D6的结合活性。以细胞密度为2x106细胞/毫升，将表达mIgE.FcL或mIgE.FcS的Ramos细胞再悬浮于流式细胞缓冲液(FACS buffer)(含1％胎牛血清和0.1％迭氮化钠的1xPBS)。将于100微升流式细胞缓冲液中的2x105细胞与10、1、0.1、0.01和0.001微克/毫升的hu8D6和c8D6于冰上培养30分钟，之后以流式细胞缓冲液洗涤。利用对人类IgG-Fc具有专一性的FITC标志的山羊IgG(Caltag Laboratories)侦测结合的抗体。以FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)分析染色的细胞。利用FCSExpress软件(DeNono software)分析抗体对Ramos细胞株结合的荧光强度的几何平均。利用Prism软件计算EC50。如图6a和图6b所示，hu8D6和c8D6对mIgE.FcL-表达Ramos细胞结合的EC50为2.21x10-10和2.0x10-10，且hu8D6和c8D6对mIgE.FcS-表达Ramos细胞的EC50为3.86x10-10和3.0x10-10。结果指出hu8D6和c8D6对两个mIgE同型异构物的结合活性大致相等。
实施例2 Hu8D6无法结合至与人类FCεRI结合的IgE
2.1 Hu8D6无法结合至IgE-饱和的重组人类FcεRI的α链
利用ELISA测定hu8D6对固相重组FcεRIα融合蛋白(huFcεRIα-huFcγ1，称为FcεRIα-Fc)的结合，其由人类FcεRIα的细胞外区域(从Val26至Leu204)和人类γ1的绞链-CH2-CH3部分构成(Shiung et al.，Immunobiology，2012，217：676-683)。利用FreeStylTM 293F系统(Invitrogen)表达FcεRIα-Fc蛋白质，并以蛋白质A层析加以纯化。利用于4℃下隔夜培养的方式，以2微克/毫升的FcεRIα-Fc涂覆ELISA微量盘的孔洞，并利用测定稀释剂(含0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，0.01％硫柳汞的PBS)于室温下处理1小时。之后以1微克/毫升IgE(IgE是利用抗-IgE层析由U266细胞的培养基中纯化出来)使涂覆的FcεRIα-Fc蛋白饱和。在以洗涤缓冲液洗涤孔洞6次后，将捕获的IgE与10、1、0.1以及0.01微克/毫升的人类IgE(Sigma)、hu8D6、c8D6、Omalizumab和小鼠抗-人类IgE单克隆抗体5H2(AbD Serotec)进行培养。利用HRP结合的山羊抗-人类kappa轻链(GeneTex)和HRP结合的山羊抗-小鼠IgG.Fc(Jackson ImmunoResearch)侦测结合的人类IgE和小鼠IgG。人源化8D6、c8D6和Omalizumab不结合至IgE-饱和的重组FcεRIα融合蛋白，然而5H2于所有浓度下并非如此(如图7所示)。
2.2 Hu8D6无法结合至位于嗜碱性粒细胞上的IgE
使用RBL SX-38细胞，其为转置编码人类FcεRI的α、β和γ链基因的大鼠嗜碱性白血病细胞(Wiegand et al.，J.Immunol.，1996，157：221-230)，以作为细胞表面FcεRI的储库。将配制于1毫升流式细胞缓冲液的2x106RBL SX-38细胞与3微克/毫升的IgE于冰上培养30分钟。利用流式细胞缓冲液洗涤细胞以移除未结合的IgE，且之后将配制于100微升流式细胞缓冲液的2x105细胞与10微克/毫升的hu8D6、c8D6、Omalizumab和5H2抗体于冰上培养30分钟，之后利用流式细胞缓冲液洗涤。利用对人类IgG-Fc或FITC标志的F(ab)’2兔抗-小鼠IgG具有专一性的FITC标志的山羊IgG(AbD Serotec)侦测结合的抗体。以FACSCanto II流式细胞仪分析染色的细胞。如图8a至图8e所示，人源化8D6、c8D6和Omalizumab无法结合至IgE-饱和的RBL SX-38细胞，且5H2可结合至RBL SX-38细胞。
2.3对FcεRIα-Fc蛋白的竞争分析
执行竞争性ELISA试验以比较hu8D6和Omalizumab与HRP结合的IgE竞争对FcεRIα-Fc蛋白的结合的效率(Shiung et al)。以隔夜培养的方式于4℃下利用配制于涂覆液的100纳克的U266 IgE蛋白涂覆ELISA微量盘的孔洞，并将涂覆的孔洞与测定稀释剂(含0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，0.01％硫柳汞的PBS)培养以进行封阻。另外，以1∶6000的比例将HRP-IgE的原液稀释于测定稀释剂中，且于1∶3步骤中将溶液与从0.1毫克/毫升连续稀释的未结合的hu8D6或Omalizumab混合。将这两个系列的混合物加至ELISA的孔洞中，并在室温下培养1小时。然后利用PBST洗涤孔洞，将孔洞与TMB培养，并测定其OD450。利用Prism软件计算IC50。以目标为人类HER2蛋白的Trastuzumab(HerceptinTM)作为阴性对照组，其并不会抑制IgE对FcεRIα-Fc的结合。如图9所示，hu8D6和Omalizumab用以抑制IgE结合至FcεRIα-Fc的IC50为9.4和25.9x10-10M，其指出hu8D6于抑制IgE结合至其受体的能力上优于Omalizumab。
2.4对细胞表面FcεRI的竞争性分析
将配制于0.1毫升流式细胞缓冲液的2x105RBL SX-38细胞与不同浓度(浓度为45、30、13.3、8.9、5.93、3.95、2.63、1.76、1.17、0.78、0.52和0.35微克/毫升)的hu8D6、Omalizumab或Trastuzumab，以及FITC-标志的IgE(浓度为4.5微克/毫升)，于冰上培养30分钟。利用流式细胞缓冲液洗涤细胞以移除未结合的IgE。以FACSCanto II流式细胞仪分析染色的细胞。利用Prism软件计算IC50。Trastuzumab并不会影响IgE对SX-38细胞的结合。如图10所示，hu8D6和Omalizumab用以抑制IgE结合至SX-38细胞的IC50为18.8x10-9和24.7x10- 9M，其指出hu8D6于抑制IgE结合至FcεRI-表达细胞的能力上优于Omalizumab。
实施例3 Hu8D6无法使RBL SX-38细胞致敏化
利用测定β-氨基己糖苷酶(一种储存于颗粒的溶解体酵素)释放进入培养基中的量，以评估去颗粒作用的程度。以隔夜培养的方式于37℃下，以于0.5毫升培养基内含有3x105细胞/孔洞的量将RBL SX-38细胞接种培养于24孔盘。在第二天，移除培养基，并加入内含1微克/毫升人类IgE的0.25毫升预热的培养基至每一孔洞中。在于37℃培养箱培养2小时后，每个孔洞利用0.5毫升的Tyrode’s缓冲液(含135mM氯化钠，5mM氯化钾，5.6mM葡萄糖，1.8mM氯化钙，1mM氯化镁，20mM HEPES以及0.5毫克/毫升牛血清白蛋白，pH 7.3)清洗两次，且之后加入含10、1、0.1或0.01微克/毫升抗体或1％Triton X-100的0.25毫升预热的Tyrode’s缓冲液。在于37℃培养箱培养30分钟后，收集上清液并于室温下以300xg离心5分钟，且从每个孔洞中将50微升清澈的上清液移至新的96孔黑色OptiplateTM(Perkin-Elmer)的孔洞中。将50微升的受质溶液(80μM的4-MUG((4-甲基伞形酮-N-乙酰-d-氨基葡萄糖苷)，Sigma)配制于0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中)加入每一孔洞中，并将微量盘置于37℃培养1小时。可藉由加入100微升甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸，0.2M氯化钠，pH 10.7)终止反应。利用VictorTM 3荧光读取器(Perkin-Elmer)于每一孔洞上方测定所得荧光(以波长355纳米激发；纪录发散波长460纳米的荧光强度)。以相对于100％释放的数值(利用1％Triton X-100溶解细胞以提供此数值)的百分比表示测量值。人源化8D6、c8D6和Omalizumab并不会引发IgE-致敏化的RBL SX-38细胞的去颗粒作用，但5H2会引发所述作用(图11)。
实施例4 Hu8D6可结合与人类CD23结合的IgE
4.1 Hu8D6可结合IgE-饱和的重组三聚体人类CD23
利用ELISA测定hu8D6对固相重组人类CD23融合蛋白(ILZ-CD23)的结合，重组人类CD23融合蛋白包含人类CD23的氨基端异亮氨酸拉链(isoleucine zipper(ILZ))和细胞外区域(从Asp48至Ser321)，并透过ILZ模块(ILZ motif)形成非共价三聚体(Shiung et al.，Immunobiology，2012，217：676-683)。利用FreeStyleTM 293F系统表达多聚组氨酸标签(polyhistidine-tagged)的ILZ-CD23，并以镍琼脂糖凝胶TM层析(GE Healthcare)由转染培养基加以纯化，且之后保存于具有2mM氯化钙的1x HBSS缓冲液中。将5微克/毫升的纯化ILZ-CD23涂覆于ELISA微量盘并封阻，且以配制于Ca2+/Mg2+测定稀释剂(含1mM氯化钙，0.5mM氯化镁，0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20和0.01％硫柳汞的PBS)中浓度为3微克/毫升的纯化人类IgE使涂覆的ILZ-CD23饱和。在以洗涤缓冲液洗涤孔洞6次后，于Ca2+/Mg2+测定稀释剂中，将捕获的IgE与10、1、0.1以及0.01微克/毫升的hu8D6、c8D6、Omalizumab和5H2进行培养。利用HRP结合的山羊抗-人类IgG.Fc和HRP结合的山羊抗-小鼠IgG.Fc侦测结合的人类IgG和小鼠IgG。如图12所示，相较于同型对照组人类IgG抗体，人源化8D6、c8D6和5H2抗体可结合至涂覆于固相表面的人类IgE-饱和的重组CD23，然而Omalizumab并无结合活性。
4.2 Hu8D6可结合至IgE-冲击致敏的(IgE-pulsed)SKW6.4 B细胞
将CD23高表达量的人类B细胞株(Pathan et al.，Blood，2008，111：1594-1602)与IgE一起培养，以冲击致敏(pulse)CD23。将配制于1毫升的Ca2+/Mg2+流式细胞缓冲液(含1mM氯化钙，0.5mM氯化镁，1％胎牛血清和0.1％迭氮化钠的1X PBS)中的2x106SKW6.4细胞与3微克/毫升的IgE于冰上培养30分钟。将以Ca2+/Mg2+流式细胞缓冲液洗涤的细胞与10微克/毫升的hu8D6、c8D6、Omalizumab和抗-CD23抗体(Clone：EBVCS2，eBioscience)于冰上培养30分钟，之后以Ca2+/Mg2+流式细胞缓冲液洗涤细胞。利用对人类IgG-Fc或FITC标志的F(ab)’2兔抗-小鼠IgG具有专一性的FITC标志的山羊IgG侦测结合的抗体。以FACSCanto II流式细胞仪分析染色的细胞。发现抗-CD23可良好地结合至SKW6.4 B细胞上以作为阳性对照组。如图13a至图13d所示，Omalizumab对与CD23结合的IgE的结合受到妨碍，然而hu8D6和c8D6可有效地结合至位于SKW6.4细胞上的IgE。
实施例5 Hu8D6和IgE的免疫复合物无法结合至人类FcεRI
5.1 Hu8D6和IgE的免疫复合物的制备
将纯化的人类IgE(分子量约190kDa)、hu8D6、c8D6、Omalizumab和5H2(分子量约150kDa)以1X PBS稀释至浓度为1毫克/毫升。藉由混合95微升的1毫克/毫升的人类IgE和75微升的1毫克/毫升的抗-IgE单克隆抗体，以制备包含抗-IgE：IgE免疫复合物的混合物。于室温下培养此混合物2小时并供进一步的使用。
5.2 Hu8D6和IgE的免疫复合物无法结合至RBL SX-38细胞
将配制于100微升流式细胞缓冲液中的2x105RBL SX-38细胞与10微克/毫升的hu8D6：IgE、c8D6：IgE、Omalizumab：IgE和5H2：IgE免疫复合物于冰上培养30分钟，之后以流式细胞缓冲液洗涤细胞。利用对人类IgG-Fc或FITC标志的F(ab)’2兔抗-小鼠IgG具有专一性的FITC标志的山羊IgG侦测结合的抗体。以FACSCanto II流式细胞仪分析染色的细胞。如图14a至图14e所示，hu8D6：IgE、c8D6：IgE和Omalizumab：IgE免疫复合物无法结合至RBLSX-38细胞，但是抗-FcεRI和5H2：IgE可结合至RBL SX-38细胞。
5.3 Hu8D6和IgE的免疫复合物无法活化RBL SX-38细胞
以隔夜培养方式于37℃培养箱内，以于0.5毫升培养基内含3x105RBL SX-38细胞的量接种培养于24孔盘。在第二天，利用0.5毫升的Tyrode’s缓冲液清洗每个孔洞两次，且之后加入内含10微克/毫升抗-IgE：IgE免疫复合物或1％Triton X-100的0.25毫升预热的Tyrode’s缓冲液。在37℃下培养30分钟后，收集上清液并于室温下以300xg离心5分钟，且从每个孔洞中将50微升清澈的上清液移至新的96孔黑色OptiplateTM(Perkin-Elmer)的孔洞中。将50微升的4-MUG受质溶液加入每一孔洞中，并将微量盘置于37℃培养1小时。可藉由加入100微升甘氨酸缓冲液终止反应。如图15所示，hu8D6：IgE、c8D6：IgE和Omalizumab：IgE免疫复合物不会引发RBL SX-38细胞的去颗粒作用，但是5H2：IgE会引发所述作用。
实施例6 Hu8D6和IgE的免疫复合物能够结合至人类CD23
将配制于100微升的Ca2+/Mg2+流式细胞缓冲液中的2x105SKW6.4细胞与10微克/毫升的hu8D6：IgE、c8D6：IgE、Omalizumab：IgE免疫复合物和抗-CD23于冰上培养30分钟，之后以Ca2+/Mg2+流式细胞缓冲液洗涤细胞。利用对人类IgG-Fc或FITC标志的F(ab)’2兔抗-小鼠IgG具有专一性的FITC标志的山羊IgG侦测结合的抗-IgE：IgE免疫复合物。以FACSCanto II流式细胞仪分析染色的细胞。如图16a至图16d所示，Omalizumab：IgE免疫复合物无法结合至表面CD23，然而hu8D6：IgE、c8D6：IgE免疫复合物和抗-CD23可有效地结合至SKW6.4细胞。
实施例7 Hu8D6能够抑制PBMCs的IgE生成
利用离心透过Ficoll-PLUS(GE Healthcare)密度梯度纯化健康的供血者或特异反应性患者的血液样本中的外周血单个核细胞(PBMCs)。将分离的PBMCs以106细胞/毫升量悬浮于含100纳克/毫升人类IL-4(R&D systems)和100纳克/毫升小鼠抗-CD40单克隆抗体(BioLegend，clone：G28-5)的完全IMDM培养基(Invitrogen)中。将10微克/毫升的人源化8D6、Omalizumab和Trastuzumab加入培养基中。分别于第7、11和14天培养后，收集无细胞上清液(cell-free supernatants)并储存于-20℃。藉由利用捕获抗体(抗-人类IgE、HP6061(Abcam))和侦测抗体(生物素标志的抗-人类IgE、HP6029(Abcam))的ELISA测定释放进入上清液中的IgE。简而言之，将HP6061以配制于涂覆液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH9.6)中100纳克/孔洞的量固定于96孔盘上，并于4℃下隔夜培养。以200微升/孔洞的测定稀释剂(含0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，0.02％液体生物防腐剂ProClin 300的PBS)于室温下反应1小时以封阻涂覆的孔洞。以200微升/孔洞的洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)清洗微量盘三次。利用纯化的U266 IgE以产生标准曲线(两倍连续稀释范围由800至3.125纳克/毫升)。为改善IgE定量的准确性，于完全IMDM培养基中制备IgE标准品，并掺有10微克/毫升的hu8D6、Omalizumab或Trastuzumab。将100微升清澈的上清液和标准品加入涂覆的孔洞中。于室温下培养1小时。吸干所有孔洞，并以200微升/孔洞的洗涤缓冲液清洗所有孔洞6次。将捕获的IgE与100微升的侦测抗体溶液(含50纳克/毫升的生物素标志的HP6029的测定稀释剂)于室温下培养1小时。之后，为时1小时，利用链抗生物素蛋白(streptavidin)poly-HRP(1∶10,000稀释，Thermo Pierce)(100微升/孔洞)侦测结合的生物素-HP6029。吸干所有孔洞，并以200微升/孔洞的洗涤缓冲液清洗所有孔洞6次。最后，利用100微升/孔洞的NeA-Blue TMB受质(Clinical Science Products)进行呈色，且藉由加入100微升/孔洞的1M硫酸终止反应。藉由利用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)以产生的4-参数罗吉特曲线拟合(four parameter logistic curve-fit)而产出标准曲线，并用其计算在所有试验样本中的IgE浓度。藉由Prism软件使用司徒顿t检验(Student ttests)比较数据。如图17a和图17b所示，分别于7、11和14天培养中，培养开始的浓度为10毫克/毫升的hu8D6可使培养物IgE浓度减少了88.1％、93.4％和88.6％，然而Omalizumab可使IgE浓度减少了21.3％、26.4％和30％。于抑制IgE从头合成上，此结果指出hu8D6结合与膜结合的IgE和位于B细胞上与CD23结合的IgE的能力优于Omalizumab(Omalizumab不会结合已被CD23结合的IgE)。
参考文献
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<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> variable region of heavy chain derived from 8D6 hybridoma
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Val Met Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Tyr Arg His Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> humanized variable region of heavy chain
<400> 2
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Tyr Arg His Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> variable region of light chain derived from 8D6 hybridoma
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Met Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> humanized variable region of light chain
<400> 4
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
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100 105 110
<210> 5
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<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> complementarity determining region 1 derived from the heavy chain
of mu8D6 antibody
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> complementarity determining region 2 derived from the heavy chain
of mu8D6 antibody
<400> 6
Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly His Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 7
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<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> complementarity determining region 3 derived from the heavy chain
of mu8D6 antibody
<400> 7
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1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> complementarity determining region 1 derived from the light chain
of mu8D6 antibody
<400> 8
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1 5 10
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<220>
<223> complementarity determining region 2 derived from the light chain
of mu8D6 antibody
<400> 9
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<220>
<223> complementarity determining region 3 derived from the light chain
of mu8D6 antibody
<400> 10
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> the germline VH1-69/JH4 sequence of human immunoglobulin gene
<400> 11
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> the germline Vk1-39/Jk1 sequence of human immunoglobulin gene
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

Claims (17)

1.一种人源化抗体，其结合至游离的IgE、位于B淋巴细胞上与膜结合的IgE、及与CD23结合的IgE，而非与FcεRI结合的IgE。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其可交联位于B淋巴细胞上的与IgE结合的CD23。
3.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其可减少藉由B淋巴细胞的总IgE生成。
4.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其可减少藉由抗原活化的B淋巴细胞的抗原专一性的IgE生成。
5.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其可减少以该人源化抗体治疗的患者中IgE的生成。
6.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其中该抗体为一抗原结合片段。
7.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其中该抗原结合片段为Fab、F(ab’)2或单链Fv。
8.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其VH和VL衍生自人类B淋巴细胞。
9.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，其具有小鼠8D6抗体的IgE结合特性。
10.如权利要求1所述的一种分离的人源化抗体，其特征在于，该抗体包含一重链可变区域(VH)，其包含与SEQ ID NO:2相同的一氨基酸序列，或SEQ ID NO:2之一或多个框架区域之一或多个突变所构成的与SEQ ID NO:2具有至少90％相似性的一氨基酸序列；以及一轻链可变区域(VL)，其包含与SEQ ID NO:4相同的一氨基酸序列，或SEQ ID NO:4之一或多个框架区域之一或多个突变所构成的与SEQ ID NO:4具有至少90％相似性的一氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的分离的人源化抗体，其特征在于，VH的高度可变区域位于第26‐35位氨基酸(CDR‐H1；SEQ ID NO:5)、第50‐65位氨基酸(CDR‐H2；SEQ ID NO:6)，以及第93‐104位氨基酸(CDR‐H3；SEQ ID NO:7)。
12.如权利要求10所述的分离的人源化抗体，其特征在于，VL的高度可变区域位于第27‐34位氨基酸(CDR‐L1；SEQ ID NO:8)、第50‐56位氨基酸(CDR‐L2；SEQ ID NO:9)，以及第89‐97位氨基酸(CDR‐L3；SEQ ID NO:10)。
13.一种医药组成物，包含权利要求1所述的分离的抗体以及一药物学上可接受的载体。
14.一种用以治疗IgE介导疾病的方法，包含投予有需要的患者有效剂量的权利要求1所述的抗体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该IgE介导疾病为过敏性哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、食物过敏、慢性自发性(特发性)荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲菌病、复发性特发性血管性水肿，以及和嗜酸性粒细胞有关的肠胃疾病。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，投予患者有效剂量的该抗体，该抗体可结合至IgE、与膜结合的IgEs，以及与CD23结合的IgE；但无法结合至与FcεRI结合的IgE与引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞的去颗粒作用。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，当投予患者有效剂量的该抗体时，该抗体与IgE的免疫复合物可结合至CD23并交联CD23；但无法结合至FcεRI与引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞的去颗粒作用。
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