ES2811303T3 - Anticuerpos anti-IGE humanizados que entrecruzan CD23 en linfocitos B pero no sensibilizan los mastocitos - Google Patents

Anticuerpos anti-IGE humanizados que entrecruzan CD23 en linfocitos B pero no sensibilizan los mastocitos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que tiene una actividad de unión a IgE humana libre, IgE unidas a la membrana en linfocitos B e IgE unida a CD23, pero que es incapaz de unirse a IgE unida a FcεRI, en donde dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena pesada (VH) comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 2; y en donde la región variable de cadena ligera (VL) comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-IGE humanizados que entrecruzan CD23 en linfocitos B pero no sensibilizan los mastocitos
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a la preparación de anticuerpos humanizados que son capaces de unirse a IgE libre, a IgE unida a la membrana en linfocitos B, a IgE unida por CD23, pero no a la IgE unida por los receptores IgE.Fc de alta afinidad en los mastocitos. La invención también se refiere a las aplicaciones terapéuticas de dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE, incluyendo asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, alergia alimentaria, urticaria (idiopática) espontánea crónica, rinosinusitis crónica, mastocitosis sistémica, mastocitosis cutánea, aspergilosis broncopulmonar alérgica, angioedema idiopático recurrente y trastorno gastrointestinal asociado con los eosinófilos.
2. Descripción de la técnica relacionada
La alergia es un estado hipersensible inducido por una respuesta inmunitaria exagerada a un antígeno inofensivo foráneo. Se produce una respuesta de hipersensibilidad inmediata a través de la interacción de la inmunoglobulina E (IgE) y del receptor de IgE.Fc de alta afinidad (FceRI) presente en la superficie de los mastocitos y basófilos en presencia de alérgenos capaces de reaccionar con la IgE unida a FceRI, causando la liberación de mediadores realizados y recién sintetizados a partir de estas células inflamatorias. La mayoría de las enfermedades alérgicas están mediadas por la IgE. Es bien sabido que una serie de enfermedades no alérgicas, que no implican una respuesta inmunitaria a un antígeno foráneo, particularmente, enfermedades inflamatorias de la piel, también están mediadas por la IgE.
Hay dos receptores principales para la IgE, FceRI y el receptor de IgE.Fc de baja afinidad FceRII (también denominado CD23). FceRI se expresa predominantemente en la superficie de los mastocitos y basófilos en los seres humanos, donde es un complejo tetramérico que consiste en una cadena a, una cadena p y dos cadenas y unidas por disulfuro. La activación de FceRI en los mastocitos y basófilos por alérgenos conduce a la desgranulación, mientras que la activación de FceRI en las células dendríticas conduce a la presentación de alérgenos mediada por IgE.
CD23 es una glicoproteína transmembrana de tipo II de aproximadamente 45 kDa de peso molecular que comprende un dominio similar a la lectina de tipo C, seguido de una región de tallo, que porta varias repeticiones que sirven como una supuesta cremallera de leucina para formar recortadores superenrollados, una sola región que abarca la membrana y un dominio citoplasmático N-terminal corto. De hecho, la afinidad de la CD23 monomérica hacia IgE (KD = 10'6-10'7 M) es mucho menor que la de FceRI (KD = aproximadamente 10'10 M), pero aumenta sustancialmente en su forma trimérica (KD = 10-8-10-9 M). El gen FCER2 que codifica el polipéptido CD23 posee 2 sitios de inicio de la transcripción alternativos que conducen la síntesis de dos variantes de ARNm que conducen a producir dos isoformas CD23 que difieren en los primeros siete (CD23a) y seis (CD23b) aminoácidos de la cola citoplasmática N-terminal. CD23a es expresada exclusiva y contiguamente por los linfocitos B, mientras que CD23b es inducida por IL-4 en la superficie de monocitos/macrófagos, linfocitos B, linfocitos T, eosinófilos, células dendríticas y células epiteliales. Se cree que CD23 en los linfocitos B contribuye a la regulación de la producción de IgE y la presentación del antígeno, mientras que CD23 en macrófagos y células dendríticas participa en la fagocitosis/endocitosis, el aclaramiento del complejo antígeno-lgE y la presentación del antígeno. La función adicional de CD23 en las células epiteliales incluye el transporte de IgE. El complejo antígeno-lgE penetra directamente a través del epitelio hasta el espacio de la luz y viceversa. CD23 también se puede liberar de las superficies celulares como un intervalo de proteínas CD23 solubles libres (sCD23) de 37, 33, 25 y 16 kDa. La metaloproteasa predominante responsable del desprendimiento de CD23 in vivo es el gen ADAM10, que genera especies de sCD23 de 37 kDa o 35 kDa en una forma trimérica. Otra sCD23 natural es derCD23 producida por la acción de la proteasa Der p1 que se encuentra en las heces del ácaro del polvo doméstico, dermatophagoides pteronyssinus. La escisión de CD23 por Der p1 produce derCD23 monomérica de 16 kDa. Se muestra que se observó que los fragmentos triméricos de sCD23 son moléculas clave para potenciar la síntesis espontánea de IgE, mientras que sCD23 monomérica de menor tamaño parece regular por disminución la síntesis de IgE estimulada por lL-4.
IgE existe en forma secretada y en forma de membrana, lo que parece ser variantes de corte y empalme. Las regiones constantes de la cadena £ de forma secretada de IgE albergan dominios Chi-Ch2-Ch3-Ch4, mientras que la cadena £ de la forma de IgE unida a la membrana que tiene una IgE unida a la membrana (mlgE) se encuentra en dos isoformas como resultado de un corte y empalme alternativo en los seres humanos. La cadena £ de ambas isoformas de mlgE humana contiene un péptido de anclaje a la membrana y un péptido migis-£. Una isoforma contiene solo el péptido migis-£ (15 aminoácidos de longitud) entre el dominio Ch4 y el péptido de anclaje a la membrana (denominado "forma corta"), mientras que la segunda isoforma contiene adicionalmente un dominio largo de 52 aminoácidos más (denominado dominio C£mX) entre el dominio Ch4 y el péptido migis-£ (denominado "forma larga").
Dado que la IgE desempeña un papel central en la mediación de la mayoría de las enfermedades alérgicas, se han propuesto varias estrategias para controlar los niveles de IgE en el organismo o para regular la síntesis de IgE, tal como anti-IgE, anti-IL-4/IL-13 y anti-CD23. Omalizumab (Xolair®) es un anticuerpo anti-IgE monoclonal humanizado recombinante que se une a la IgE libre que circula en el suero y a la IgE unida a la membrana en los linfocitos B, pero no a la IgE unida a FceRI y unida a CD23 en la superficie celular. Omalizumab causa una reducción significativa (de hasta el 99 %) de IgE libre en suero en pacientes alérgicos, que conduce a inhibir la unión de IgE a FceRI y, posteriormente, una regulación por disminución de FceRI en basófilos y mastocitos. Numerosos ensayos clínicos en muchas enfermedades mediadas por IgE, tales como asma alérgica, urticaria crónica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, etc., han demostrado que Omalizumab es eficaz y seguro en el tratamiento de estas enfermedades. Omalizumab ha sido aprobado para tratar el asma alérgica grave y la urticaria idiopática crónica en muchos países. Por otra parte, lumiliximab, que es un anticuerpo monoclonal anti-CD23 que consiste en regiones variables de primates (macaco cangrejero) y regiones constantes humanas, ha resultado unirse al dominio de lectina de tipo C evitando que la IgE se una a CD23, conduciendo así a la estabilización de CD23 superficial y a la reducción de la escisión proteolítica de CD23. Se ha informado que Lumiliximab inhibe las transcripciones de la línea germinal £, reduce la producción de IgE de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en cultivo y reduce los niveles de IgE en sangre en pacientes alérgicos.
Las publicaciones de Belliveau (en Medscape General Medicine, vol. 7, n.° 1,2005, páginas 27 - 41) y Holgate et al. (en Respiratory Medicine, vol. 103, n.° 8, 2009, páginas 1098 - 1113) enseñan que el omalizumab se une a la IgE humana libre, pero no se une a Fc-épsilon-RI en basófilos o IgE que ya está unida a Fc-épsilon-RI en basófilos o Fcépsilon-RII en otras células (por ejemplo, linfocitos, monocitos, eosinófilos, plaquetas).
En una patente de 1990 (Patente de EE.UU. n° 4.940.782), se desveló un anticuerpo monoclonal IgG murino 44.7b específico de la IgE de rata, que es capaz de unirse a IgE unida a CD23, pero no a IgE unida a FceRI. Este anticuerpo 44.7b nunca tuvo un seguimiento como un candidato terapéutico para el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE. Un artículo publicado en 2012 (Shiung et al., Immunobiology, 2012, 217:676-683) informó sobre el descubrimiento de un anticuerpo monoclonal murino anti-IgE humana, 8D6, que es capaz de unirse a IgE unida a CD23, pero no a IgE unida a FceRI. Los autores sugirieron que este anticuerpo no solo posee las principales propiedades farmacológicas del Omalizumab para neutralizar la IgE sin sensibilizar los mastocitos y los basófilos, sino también la propiedad del lumiliximab a través del entrecruzamiento de la IgE unida a CD23. Sin embargo, el anticuerpo murino puede ser inmunogénico y no puede aplicarse para tratar enfermedades mediadas por IgE. Se ha encontrado que el anticuerpo murino para aplicaciones terapéuticas en el ser humano está limitado por las respuestas inmunitarias generadas por los pacientes hacia los anticuerpos murinos. Por lo tanto, la humanización de los anticuerpos murinos es necesaria para reducir la inmunogenicidad en los receptores humanos.
Sumario
La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados que se unen a (1) IgE humana en su forma libre secretada, a (2) IgE unida a la membrana en linfocitos B y a (3) IgE unida por CD23 en linfocitos B y por CD23 libre en solución. Dichos anticuerpos anti-IgE no se unen a IgE unida por FceRI en mastocitos y basófilos y, por lo tanto, no activan esas células inflamatorias como se reivindica en la reivindicación 1. La presente divulgación también se refiere a las propiedades biológicas de esos anticuerpos anti-IgE humanizados en la biosíntesis de IgE, a la unión de IgE a distintos componentes celulares y moleculares, y a los posibles efectos de eliminación de alérgenos. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo humanizado como se reivindica en la reivindicación 4 y se refiere además al uso de dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades alérgicas y no alérgicas mediadas por IgE como se reivindica en la reivindicación 5. Otros modos de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.
Los presentes inventores han reconocido que los últimos resultados de los ensayos de fase Ib y lia del anticuerpo anti-M1', MEMP1972A (Gauvreau et al., Science Translation Medicine, 2014, Vol. 6: 243ra85), sugirieron que al inhibir la nueva síntesis de igE, pueden disminuirse los síntomas mediados por igE. También conceptualizaron que, dado que los complejos de hu8D6:lgE pueden unirse a CD23 y dado que CD23 se expresa en numerosos tipos de células (Acharya et al. Clin. Exp. Immunol., 2010, 162:12-23), la absorción de los complejos de hu8D6 :lgE en CD23 de la superficie celular puede reducir los niveles totales de igE (igE libre y unida a hu8D6) en circulación in vivo. Además, las células epiteliales a lo largo del revestimiento de la mucosa son capaces de eliminar sustancias unidas a las células a través de la transcitosis dependiente de CD23 (Tu et al. "Gastroenterology", 2005, 129:928-940), hu8D6 puede facilitar la limpieza y eliminación de los alérgenos entrantes y los autoantígenos de unión a igE endógenos cuando los complejos de hu8D6:lgE se transportan al espacio de la luz de los tractos gastrointestinal y broncoalveolar. Los presentes inventores también racionalizan que la unión de hu8D6 a igE unida a CD23 puede entrecruzar eficazmente CD23 en linfocitos B, produciendo la inhibición de la producción de igE específica del antígeno por los linfocitos B tras la activación por un antígeno específico. Esas propiedades de hu8D6 deberían respaldar la posible utilidad de que hu8D6 y otros anticuerpos humanizados con el mismo conjunto de especificidades de unión a igE pueden inhibir la producción de igE específica del antígeno en pacientes con enfermedades mediadas por igE y, por lo tanto, mejorar esas enfermedades. Usando el anticuerpo 8D6 murino como ejemplo, se ha preparado una forma humanizada del anticuerpo. Este anticuerpo humanizado posee todas las propiedades de unión y biológicas mencionadas anteriormente.
REFERENCIAS
(1) Bonita J. Rup, Larry E. Kahn, "Monoclonal antibodies against IgE-associated determinaos, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore" Patente de EE.UU. n.° 4.940.782 (1990).
(2) Yu-Yu Shiung, Chen-Yi Chiang, Jiun-Bo Chen, Pheidias C. Wu, Alfur Fu-Hsin Hung, Donic Chien-Sheng Lu, Rong-Long Pan, Tse Wen Chang. "An anti-IgE monoclonal antibody that binds to IgE on CD23 but not on highaffinity IgE.Fc receptors, FcRn", Immunobiology., 217:676-683-9 (2012)
(3) Gail M. Gauvreau, Jeffrey M. Harris, Louis-Philippe Boulet, Heleen Scheerens, J. Mark Fitzgerald, Wendy S. Putnam, Donald W. Cockcroft, Beth E. Davis, Richard Leigh, Yanan Zheng, Barbro Dahlen, Yehong Wang, Romeo Maciuca, Irvin Mayers, X. Charlene Liao, Lawren C. Wu, John G. Matthews, Paul M. O'Byrnel, "Targeting membrane-expressed IgE B cell receptor with an antibody to the M1 prime epitope reduces IgE production", Science Translation Medicine, Vol. 6: 243ra85 (2014)
(4) M. Acharya, G. Borland, A. L Edkins, L. M. MacLellan, J. Matheson, B. W. Ozanne y W. Cushley, "CD23/Fc£RII: molecular multi-tasking", Clin. Exp. Immunol., 162(1): 12-23 (2010)
(5) Yahong Tu, Saad Salim, Jackie Bourgeois, Vincenza Di Leo, E. Jan Irvine, John K. Marshall, Mary H. Perdue, "CD23-Mediated IgE Transport Across Human Intestinal Epithelium: Inhibition by Blocking Sites of Translation or Binding", Gasgtroenterology, 129(3): p928-940(2005)
(6) Jiun-Bo Chen, Pheidias C. Wu, Alfur Fu-Hsin Hung, Chia-Yu Chu, Tsen-Fang Tsai, Hui-Ming Yu, Hwan-You Chang y Tse Wen Chang, "Unique epitopes on CsmX in IgE-B cell receptors are potentially applicable for targeting IgE-committed B cells", J. Immunol., 184: 1748-1756 (2010)
(7) Wiegand T. W., Williams P. B., Dreskin S. C., Jouvin M. H., Kinet J. P., Tasset D., "High-affinity oligonucleotide ligands to human IgE inhibit binding to Fc epsilon receptor I", J. Immunol., 157: p221-230 (1996)
(8) Pathan N. I., Chu P., Hariharan K., Cheney C., Molina A., Byrd J., "Mediation of apoptosis by and antitumor activity of lumiliximab in chronic lymphocytic leukemia cells and CD23+ lymphoma cell lines", Blood, 111(3):p1594-1602 (2008)
(9) Wan T., Beavil R. L., Fabiane S. M., Beavil A. J., Sohi M. K., Keown M., Young R. J., Henry A. J., Owens R. J., Gould H. J., Sutton B. J., "The crystal structure of IgE Fc reveals an asymmetrically bent conformation", Nature Immunol, 3(7):681-6 (2002).
Breve descripción de los dibujos
La presente descripción se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada leída a la luz de los dibujos adjuntos, donde:
La Figura 1 ilustra la alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas variables que incluyen secuencias de Vh 1-69 y JH4 (Vh 1-69/JH4) de la línea germinal humana, anticuerpo anti-IgE murino 8D6 (mu8D6) y 8D6 humanizado injertado con 8D6 (hu8D6). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están subrayadas. Los aminoácidos del marco Vh murino retenido en hu8D6 están marcados con una estrella.
La Figura 2 ilustra la alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras variables que incluyen secuencias de Vk1-39 y Jk1 (Vk1-39/Jk1) de la línea germinal humana, anticuerpo anti-IgE murino 8D6 (mu8D6) y 8D6 humanizado injertado con 8D6 (hu8D6). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están subrayadas. Los aminoácidos del marco Vk murino retenido en hu8D6 están marcados con una estrella.
La Figura 3 ilustra las curvas de titulación de hu8D6 (línea continua) y la unión del anticuerpo c8D6 progenitor (línea de puntos) a la IgE humana mediante ELISA.
La Figura 4 ilustra las curvas de inhibición de hu8D6 (línea continua) y de 8D6 quimérico (c8D6, línea de puntos) para competir con c8D6 conjugado con HRP por la unión a IgE humana mediante ELISA.
La Figura 5 ilustra las curvas de resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance) de Fab hu8D6 a IgE humana mediante análisis BIAcore. UR: Unidad de respuesta.
Las Figuras 6a y 6b ilustran la unión de hu8D6 y c8D6 a las estirpes celulares de Ramos que expresan mIgE.Fc mediante análisis de citometría de flujo. mIgE.FcL Ramos: células de Ramos que expresan la forma larga de IgE.Fc unida a la membrana humana (Fig. 6a); mIgE.FcS Ramos: células de Ramos que expresan la forma corta de IgE.Fc unida a la membrana humana (Fig. 6b).
La Figura 7 ilustra la unión de hu8D6 a la cadena a recombinante saturada de IgE de FceRI humano.
Las Figuras 8a a 8e ilustran la unión de hu8D6 a células RBL SX-38 que expresan FceRI humano que se cargaron previamente con IgE humana.
La Figura 9 ilustra las curvas de inhibición de hu8D6 y Omalizumab para competir con la proteína recombinante FcsRIa-Fc para unirse a la IgE humana mediante ELISA.
La Figura 10 ilustra las curvas de inhibición de hu8D6 y Omalizumab para competir con el receptor nativo de FceRI en células RBL SX-38 por la unión de IgE humana mediante análisis de citometría de flujo.
La Figura 11 ilustra la incapacidad de hu8D6 para activar y desencadenar la desgranulación de células RBL SX-38 sensibilizadas con IgE.
La Figura 12 ilustra la unión de hu8D6 a CD23 humana trimérica recombinante saturada con IgE.
Las Figuras 13a a 13d ilustran la unión de hu8D6 a células SKW6.4 que expresan CD23 humana.
Las Figuras 14a a 14e ilustran la incapacidad de los complejos inmunitarios hu8D6: IgE para unirse a células RBL SX-38 que expresan FceRI humano.
La Figura 15 ilustra la incapacidad de los complejos inmunitarios de hu8D6: IgE para activar e inducir la desgranulación de células RBL SX-38 sensibilizadas con IgE.
Las Figuras 16a a 16d ilustran la unión de los complejos inmunitarios de hu8D6: IgE a las células SKW6.4 que expresan CD23 humana.
Las Figuras 17a y 17b ilustran los efectos inhibidores de Omalizumab (Fig. 17a) o hu8D6 (Fig. 17b) en la síntesis de IgE de novo in vitro.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanizados que se unen a (1) IgE humana en su forma libre secretada, a (2) IgE unida a la membrana en linfocitos B y a (3) IgE unida por CD23 en linfocitos B y (4) por CD23 libre en solución. Los anticuerpos anti-IgE no se unen a IgE unida por FceRI en mastocitos y basófilos y, por lo tanto, no activan esas células inflamatorias. En una definición amplia, un anticuerpo humanizado es aquel en el que los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras, y las regiones marco de los dominios Vh y Vl son de origen humano.
Diferentes metodologías que emplean fagos, levadura o ribosomas para mostrar bancos de anticuerpos monocatenarios que comprenden los segmentos Vh y Vl de los linfocitos B humanos, se han usado con éxito para la detección de anticuerpos para antígenos de superficie celular o factores celulares humanos. Dichas metodologías también pueden emplearse para detectar anticuerpos humanos de la presente invención con el conjunto único de especificidades de unión a IgE. Como alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden obtenerse en ratones transgénicos que portan combinaciones de genes de VH y VL de inmunoglobulina humana.
A modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona la descripción detallada de la preparación de una versión humanizada del anticuerpo monoclonal anti-IgE murino, 8D6, que posee el conjunto anterior de especificidades de unión. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-IgE humana humanizado, hu8D6, que comprende una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 2) y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4). Las secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables de hu8D6 se identifican de la siguiente manera: CDR-H1 comprende GYTFNGYWMH (SEQ ID NO: 5); CDR-H2 comprende YINPTTGHTEYNQKFKD (SEQ ID NO: 6); CDR-H3 comprende ARQEYRHSWFAY (SEQ ID NO: 7); CDR-L1 comprende QSVDYDGDTY (SEQ ID NO: 8); CDR-L2 comprende AASNLDS (SEQ ID NO: 9); CDR-L3 comprende QQTNEDPWT (SEQ ID NO: 10).
Se proporciona el anticuerpo anti-IgE humana humanizado, hu8D6 , en donde las actividades de unión del anticuerpo en su forma bivalente a IgE humana es CE50 = ~10' 10 M. La afinidad del anticuerpo en su forma Fab monovalente a IgE humana es KD = ~10' 11 M.
En los siguientes ejemplos, la divulgación se refiere al anticuerpo anti-IgE humanizado, hu8D6, que es capaz de unirse a la IgE humana libre (no unida por sus dos receptores), las IgE unidas a membrana (formas largas y cortas) en linfocitos B e la IgE unida a CD23, pero que es incapaz de unirse a IgE unida a FceRI e inducir la liberación de hexosaminidasa de mastocitos o basófilos. Además, hu8D6 es capaz de inhibir eficazmente la unión de IgE a FCERI. El complejo inmunitario de hu8D6 e IgE humana es capaz de unirse a CD23, pero incapaz de unirse a FceRI e inducir la liberación de hexosaminidasa de los mastocitos o basófilos. Además, hu8D6 puede tanto unirse a IgE unida a la membrana como entrecruzar la IgE unida a CD23 en los linfocitos B y, por lo tanto, puede inhibir la síntesis de novo de la producción de IgE de las células mononucleares periféricas humanas en un sistema de cultivo in vitro.
El anticuerpo anti-IgE humanizado, hu8D6, puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, una molécula de IgG), un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, Fab o F(ab')2) o un Fv monocatenario.
El presente anticuerpo anti-IgE humanizado, hu8D6, presenta propiedades terapéuticas y puede usarse para tratar enfermedades mediadas por IgE mediante la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz del anticuerpo anti-IgE humanizado descrito en el presente documento, ya sea el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno. Las enfermedades mediadas por IgE incluyen asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, alergia alimentaria, urticaria (idiopática) espontánea crónica, rinosinusitis crónica, mastocitosis sistémica, mastocitosis cutánea, aspergilosis broncopulmonar alérgica, angioedema idiopático recurrente y trastorno gastrointestinal asociado con los eosinófilos. Se observa que algunas de esas enfermedades, tales como la urticaria espontánea crónica, mastocitosis sistémica y angioedema idiopático recurrente, no son enfermedades alérgicas y no implican alérgenos externos.
Ejemplo 1 Generación de un anticuerpo anti-IgE humanizado
Injerto de CDR
Se alinearon las secuencias de aminoácidos de los dominios Vh (SEQ ID NO: 1) y Vk (SEQ ID NO: 3) de 8D6 con las de los alelos Vh 1-69/JH4 y Vk1-39/Jk1 de la línea germinal humana. Para fabricar el injerto de CDR, se usó el marco de Vh aceptor, que difiere del alelo Vh 1-69 de la línea germinal humana en 4 posiciones M48I, R66K, V67A y S76N. Las CDR, que son las posiciones 26-35 (CDR-H1, SEQ ID NO: 5), 50-56 (CDR-H2, SEQ ID NO: 6) y 93-104 (CDR-H3, SEQ ID NO: 7) de 8D6 se diseñaron en el marco de Vh aceptor para generar un injerto de CDR directo de Vh de 8D6 como se muestra en la Fig. 1. En el dominio Vk, las CDR de las posiciones 27-34 (CDR-L1, SEQ ID NO: 8), 5056 (CDR-L2, SEQ ID NO: 9) y 89-97 (CDR-L3, SEQ ID NO: 10) se injertaron en el marco de Vk receptor, que difiere del alelo Vk1-39 de la línea germinal humana en una posición M4L (Fig. 2). El injerto de CDR directo de Vl de 8D6 se denominó Vl de hu8D6 (SEQ ID NO: 4).
Producción de IgG
Para obtener anticuerpos 8D6 humanizados (hu8D6) y anticuerpos 8D6 quiméricos (c8D6), se usó el sistema de expresión Expi293™ (Invitrogen) para la expresión transitoria. La transfección se realizó en 30 ml de cultivo en matraces de 125 ml usando el reactivo ExpiFectamine™ 293 (Invitrogen). Un día antes de la transfección, se diluyeron células Expi293F™ con medio de expresión Exppi293™ (Invitrogen) a una densidad de 2 x 106 células/ml. En el día de la transfección, se contaron los cultivos y se concentraron a 2,5 x 106 células/ml mediante centrifugación, eliminando los medios viejos y añadiendo medio nuevo. Se prepararon complejos de transfección diluyendo 80 pl de ExpiFectamine 293 en 1,5 ml de OPTI-MEM (Invitrogen) y 5 minutos después de añadir la solución diluida de ExpiFectamine 293™ a 30 pg de ADN plasmídico. Luego, se incubaron 3 ml de solución de complejo de reactivo de transfección de ADN a temperatura ambiente durante 20 minutos y se añadieron lentamente al cultivo en suspensión mientras se agitaba con vórtice lentamente el matraz. Las células transfectadas se volvieron a colocar en el agitador orbital en una incubadora a 37 °C y se incubaron durante 16 horas. Después de la incubación, se añadieron al cultivo 150 pl de potenciador de la transfección ExpiFectamine 293™ 1 y 1,5 ml de potenciador de la transfección ExpiFectamine 293™ 2. Los cultivos se terminaron el día 7 después de la transfección y se cosecharon para la purificación de los anticuerpos. Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes usando cromatografía de afinidad rProtein-A Sepharose™ (Ge Healthcare). El producto final resultó ser homogéneo según lo determinado mediante cromatografía líquida de proteína rápida de exclusión por tamaño, eluyéndose >99 % de la proteína como un máximo único de aproximadamente Mr de 150.000.
Análisis de unión (CE^)
La región Fc de IgE humana (£.Fc 2-4), que comienza en Ser226 hasta Gly599 de acuerdo con el sistema de numeración descrito previamente por Wan et al. (Nature Immunol., 2002, 3:681-686) y que contiene dos mutaciones N265Q y N371Q, se expresó en células Expi293F™ y se purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad anti-IgE usando resina Sepharose™ activada con NHS acoplada a Omalizumab (GE Healthcare). Para la determinación de la CE50 de hu8D6, se inmovilizó la proteína £.Fc 2-4 en placas de 96 pocillos a 50 ng/pocillo en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) y se incubó a 4 °C durante la noche. Se bloquearon los pocillos recubiertos con 200 pl/pocillo de diluyentes de ensayo (BSA al 0,5 %, Tween-20 al 0,05 %, timerosal al 0,01 % en PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las placas 3 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado (PBS con Tween-20 al 0,05 %). Se añadieron 100 pl de diluyentes de anticuerpos (diluidos en serie desde 0,1 mg/ml en 1:3 etapas) a los pocillos recubiertos. La incubación se realizó a temperatura ambiente durante 2 horas. Todos los pocillos fueron aspirados y lavados 6 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado. Las placas se incubaron con una dilución 1:10.000 de anticuerpo IgG-Fc anti-murino de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jason ImmunoResearch) durante 1 hora (100 pl/pocillo). Luego, todos los pocillos se lavaron seis veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado. Finalmente, los pocillos se desarrollaron con 50 pl/pocillo de sustrato NeA-Blue TMB (Clinical Science Products) y la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl/pocillo de HCl 1 N. Se midió la absorbancia a DO450 en un lector de ELISA. La CE50 se calculó utilizando el software Prism (GraphPad). Como se muestra en la Fig. 3, las CE50 de hu8D6 y c8D6 fueron 1,48 x 10' 10 y 1,16 x 10' 1t) M. Los resultados indican que la actividad de unión de hu8D6 se conservó casi por completo después del proceso de injerto de CDR.
Análisis de competencia (CI^)
Se realizaron pruebas ELISA competitivas para comparar la eficacia de hu8D6 y c8D6 para competir con c8D6 conjugado con HRP en la unión a IgE humana para determinar la propiedad de unión de hu8D6. Se recubrieron los pocillos de las placas de ELISA con 50 ng de proteína £.Fc 2-4 en tampón de recubrimiento durante la noche a 4 °C y se bloquearon incubando con diluyentes de ensayo. Por separado, se diluyó una solución madre de HRP-c8D61:1.000 en diluyentes de ensayo y las alícuotas se mezclaron con c8D6 o hu8D6 sin conjugar diluido en serie desde 0,1 mg/ml en 1:3 etapas. Se añadieron ambas series de mezclas a los pocillos de ELISA y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBST, se incubaron con TMB y su DO450. La CI50 se calculó usando el software Prism. Las CI50 de hu8D6 y c8D6 sin conjugar resultaron ser de 1,79 x 10' 9 y 2,28 x 10' 9 M como se muestra en la Fig. 4. Los resultados indicaron que hu8D6 se unió a un epítopo idéntico a 8D6.
Determinación de KD mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR)
Para producir Fab de hu8D6, Se unieron respectivamente ADNc de los segmentos de ADN de Vh y Vk del anticuerpo hu8D6 a un dominio C 1-CH1 humano y a una región C humana de un vector de expresión de Fab que se modificó del vector pIgG1() reemplazando toda la región constante C 1 por el dominio C 1-CH1 (Chen et al. J Immunol.
184:1748-1756). Se usó el sistema de expresión Expi293™ (Invitrogen) para la expresión transitoria. Los Fab de Hu8D6 se purificaron de los sobrenadantes usando cromatografía de afinidad KappaSelect Sepharose™ (GE Healthcare). El producto final resultó ser homogéneo según lo determinado mediante cromatografía líquida de proteína rápida de exclusión por tamaño, eluyéndose >99 % de la proteína como un máximo único de aproximadamente Mr de 50.000.
Para la determinación de KD de hu8D6, se realizaron los ensayos de SPR con un instrumento Biacore X (GE Healthcare). Se inmovilizó Fab de Hu8D6 en un chip CM5 (GE Healthcare) usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). La densidad de acoplamiento se limitó a < 500 unidades de resonancia. Se inyectó proteína £.Fc 2­ 4 sobre el chip sensor a concentraciones de 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM en tampón HBS-P (GE Healthcare) a un caudal de 30 pl.min-1. Todas las muestras se inyectaron en la celda de flujo durante 120 s con un tiempo de disociación de 720 s a 25 °C. La regeneración de la superficie del sensor se realizó con dos inyecciones de 30 segundos de glicina-HCl 10 mM (pH 2,5). Los sonogramas de £.Fc 2-4, a diferentes concentraciones, en unión a Fab de hu8D6 inmovilizado se mostró en la Fig. 5. Las constantes de afinidad y velocidad se calcularon usando el software BIAevalution (GE Healthcare), mostrando que la constante de asociación y la constante de disociación de Fab de hu8D6 a £.Fc 2-4 son de 1,23±0,17 x 106 M 'V 1 y 5,79±0,03 x 10'5 s'1, Haciendo que KD de hu8D6 sea de 4,8 ± 0,7 x 10'11 M.
Análisis de FACS
Las estirpes celulares de Ramos que se transfectaron con ADN recombinante codificante de mIgE.FcL (cola citoplasmática-CH2 de la forma larga de la cadena £ de membrana) o mIgE.FcS (cola citoplasmática-CH2 de la forma corta de la cadena £ de la membrana) fueron generadas por Chen et al. (Chen et al. J Immunol. 184: 1748-1756) y se usaron para determinar la actividad de unión de hu8D6. Se volvieron a suspender células de Ramos que expresaban mIgE.FcL o mIgE.FcS en tampón FACS (FBS al 1 % y azida de sodio al 0,1 % en 1 x PBS) a una densidad celular de 2 x 106 células/ml. Se incubaron 2 x 105 células en 100 pl de tampón FACS con hu8D6 o c8D6 a la concentración de 10, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 pg/ml, durante 30 minutos en hielo, seguido del lavado con tampón FACS. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante IgG de cabra marcada con FITC específica de IgG-Fc de ser humano (Laboratorios Caltag). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences). Se analizaron las medias geométricas de la intensidad de fluorescencia para la unión de anticuerpos a estirpes celulares de Ramos usando el software FCSExpress (software DeNono). La CE50 se calculó usando el software Prism. Como se muestra en las Fig. 6a y 6b, las CE50 de hu8D6 y c8D6 para unirse a las células de Ramos que expresaban mIgE.FcL fueron de 2,21 x 10‘ 10 y de 2,0 x 10‘ 10, y las CE50 de hu8D6 y c8D6 a células Ramos que expresaban mIgE.FcS fueron de 3,86 x 10‘ 10 y de 3,0 x 10-10. Los resultados indicaron que las actividades de unión de hu8D6 y c8D6 a dos isoformas de mlgE fueron aproximadamente iguales.
Ejemplo 2 Incapacidad de hu8D6 para unirse a la IgE unida a FC£RI humano
Incapacidad de hu8D6 para unirse a la cadena recombinante saturada de IgE de Fc£RI humano
Se utilizó un ELISA para determinar la unión de hu8D6 a la proteína de fusión de Fc£RIa recombinante en fase sólida (huFc£RIa-huFcY1, denominada Fc£RIa-Fc), que comprendía la región extracelular de Fc£RIa humano (de Val26 a Leu204) y la porción bisagra-CH2-CH3 de y1 humana (Shiung et al., Immunobiology, 2012, 217:676-683). La proteína Fc£RIa-Fc se expresó mediante el sistema FreeStyl™ 393F (Invitrogen) y se purificó mediante cromatografía de proteína A. Se recubrieron los pocillos de las placas de ELISA con 2 pg/ml de Fc£RIa-Fc en tampón de recubrimiento a 4 °C durante la noche y se trataron con diluyentes de ensayo (BSA al 0,5 %, Tween-20 al 0,05 %, timerosal al 0,01 % en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se saturaron las proteínas Fc£RIa-Fc recubiertas con 1 pg/ml de IgE, que se purificó del medio de cultivo de células U266 mediante cromatografía anti-IgE. Tras lavar los pocillos 6 veces con tampón de lavado, se incubó la IgE capturada con IgE humana (Sigma), hu8D6, c8D6, Omalizumab y un anticuerpo monoclonal anti-IgE humana murino 5H2 (AbD Serotec) a 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml. La IgE humana unida y la IgG murina se detectaron usando la cadena ligera anti-kappa humana de cabra conjugada con HRP (GeneTex) y IgG.Fc anti-murino de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch). 8D6 humanizado, c8D6 y Omalizumab no se unieron a la proteína de fusión Fc£RIa recombinante saturada de IgE, mientras que 5H2 lo hizo a todas las concentraciones como se muestra en la Fig. 7.
Incapacidad de hu8D6 para unirse a IgE en basófilos
Se usaron células RBL SX-38, células de leucemia basófila de rata transferidas con genes codificantes de las cadenas a, p y y de Fc£RI humano (Wiegand et al., J. Immunol., 1996, 157:221-230) como una combinación de Fc£RI de la superficie celular. Se incubaron 2 x 106 células RBL SX-38 en 1 ml de tampón FACS con IgE a una concentración de 3 pg/ml durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron con tampón FACS para eliminar la IgE no unida y luego se incubaron 2 x 105 células en 100 ml de tampón FACS con hu8D6, c8D6, Omalizumab y anticuerpo 5H2 a una concentración de 10 pg/ml durante 30 minutos en hielo, seguido del lavado con tampón FACS. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante IgG de cabra marcada con FITC específica de IgG-Fc humano o IgG anti-murina de conejo F(ab)'2 marcada con FITC (AbD Serotec). Las células teñidas se analizaron en FACS Canto II. Como se muestra en las Fig. 8a a 8e, 8D6 humanizado, c8D6 y Omalizumab no pudieron unirse a las células RBL SX-38 saturadas de IgE, y 5H2 se unió a las células RBL SX-38.
Análisis competitivo de la proteína Fc£RIa-Fc
Se realizaron pruebas ELISA competitivas para comparar la eficacia de hu8D6 y Omalizumab para competir con IgE conjugada con HRP en la unión a la proteína FcsRIa-Fc (Shiung et al). Se recubrieron los pocilios de las placas ELISA con 100 ng de proteína IgE U266 en tampón de recubrimiento durante la noche a 4 °C y se bloquearon incubando con diluyentes de ensayo (BSA al 0,5 %, Tween-20 al 0,05 %, timerosal al 0,01 % en PBS). Por separado, se diluyó una solución madre de HRP-IgE 1:6000 en diluyentes de ensayo y las alícuotas se mezclaron con hu8D6 u Omalizumab sin conjugar diluido en serie desde 0,1 mg/ml en 1:3 etapas. Se añadieron ambas series de mezclas a los pocillos de ELISA y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBST, se incubaron con TMB y su DO450. La CI50 se calculó usando el software Prism. Trastuzumab (Herceptin™), que se dirigió a la proteína HER2 humana como control negativo, no inhibió la unión de IgE a FcsRIa-Fc. La CI50 de hu8D6 y Omalizumab para inhibir la unión de IgE a FcsRIa-Fc fue de 9,4 y 25,9 x 10-10 M como se muestra en la Fig. 9, indicando que hu8D6 es superior a Omalizumab en la inhibición de la unión de IgE a su receptor.
Análisis competitivo de FcsRI de la superficie celular
Se incubaron 2 x 105 células RBL SX-38 en 0,1 ml de tampón FACS con hu8D6 , Omalizumab o Trastuzumab a diferentes concentraciones de 45, 30, 13,3, 8,9, 5,93, 3,95, 2,63, 1,76, 1,17, 0,78, 0,52 y 0,35 pg/ml, así como IgE marcada con FITC (4,5 pg/ml) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron con tampón FACS para eliminar la IgE no unida. Las células teñidas se analizaron en FACS Canto II. La CI50 se calculó usando el software Prism. Trastuzumab no afectó a la unión de IgE a las células SX-38. Las CI50 de hu8D6 y Omalizumab para inhibir la unión de IgE a las células SX-38 fueron de 18,8 x 10-9 y 24,7 x10-9 M como se muestra en la Fig. 10, indicando que hu8D6 es superior a Omalizumab en la inhibición de la unión de IgE a las células que expresan FcsRI.
Ejemplo 3 Incapacidad de hu8D6 para sensibilizar las células RBL SX-38
Se evaluó el grado de desgranulación midiendo la liberación de p-hexosaminidasa, una enzima lisosómica almacenada en gránulos, al medio de cultivo. Se sembraron células RBL SX-38 en una placa de 24 pocillos a 3 x 105 células/pocillo en 0,5 ml de medio de cultivo durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se retiró el medio y se añadieron a cada pocillo 0,25 ml de medio de cultivo previamente calentado que contenía 1 pg/ml de IgE humana. Tras 2 horas de incubación en una incubadora a 37 °C, cada pocillo se lavó dos veces con 0,5 ml de tampón de Tyrode (NaCl 135 mM, KCI 5 mM, glucosa 5,6 mM, CaCh 1,8 mM, MgCl 2 1 mM, HEPES 20 mM y 0,5 mg/ml de BSA, pH 7,3) y luego 0,25 ml de tampón Tyrode previamente calentado que contenía 10, 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de anticuerpos o Triton X-100 al 1 %. Tras una incubación de 30 minutos en una incubadora a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se transfirieron 50 pl de sobrenadantes transparentes de cada pocillo a una nueva placa OptiPlate™ negra de 96 pocillos (Perkin-Elmer). Se añadieron 50 ml de solución de sustrato (80 pM de 4-MUG (4-metilumbeliferil-W-acetil-d-glucosaminida), Sigma) en tampón de ácido cítrico 0,1 M (pH 4,5) a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. La reacción se terminó añadiendo 100 pl de tampón de glicina (glicina 0,2 M, NaCl 0,2 M, pH 10,7). Se midió la fluorescencia resultante (excitación a 355 nm; emisión a 460 nm) en la parte superior de cada pocillo mediante un lector de fluorescencia Victor™ 3 (Perkin-Elmer). Los valores medidos se expresaron como porcentajes relativos al valor de liberación (100 %) obtenido al lisar las células con Triton X-100 al 1 %. 8D6 humanizado, c8D6 y Omalizumab no indujeron la desgranulación de las células RBL SX-38 sensibilizadas con IgE, mientras que 5H2 lo hizo (Fig. 11).
Ejemplo 4 capacidad de hu8D6 para unirse a IgE humana unida a CD23
Capacidad de hu8D6 para unirse a CD23 humana trimérica recombinante saturada de IgE
Se usó un ELISA para determinar la unión de hu8D6 a la proteína de fusión CD23 humana recombinante en fase sólida (ILZ-CD23), que contiene cremallera de isoleucina N-terminal (ILZ) y región extracelular (Asp48 a Ser321) de CD23 humana y forma un trímero no covalente a través del motivo ILZ (Shiung et al., Immunobiology, 2012, 217:676-683). La ILZ-CD23 marcada con polihistidina fue expresada por el sistema FreeStyle™ 293F, se purificó del medio de cultivo de transfección usando cromatografía Sepharose™ de níquel (GE Healthcare), y luego se conservó en 1 x tampón HBSS con CaCh 2 mM. Se recubrieron placas de ELISA con ILZ-CD23 purificada a 5 pg/ml y se bloquearon, y se saturó la ILZ-CD23 recubierta con 3 pg/ml de IgE humana purificada en diluyentes de ensayo de Ca2+/Mg2+ (CaCh 1 mM, MgCl20,5 mM, BSA al 0,5 %, Tween-20 al 0,05 % y timerosal al 0,01 % en PBS). Tras lavar los pocillos 6 veces con tampón de lavado, se incubó la IgE capturada con hu8D6, c8D6, Omalizumab y 5H2 a 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml en diluyentes de ensayo de Ca2+/Mg2+. La IgG humana y la IgG murina unidas se detectaron usando anticuerpo anti-IgG.Fc humano de cabra conjugado con HRP y anticuerpo anti-IgG.Fc murino de cabra conjugado con HRP. 8D6 humanizado, c8D6 y anticuerpo 5H2, pudieron unirse a CD23 recombinante saturada de IgE humana recubierta sobre una superficie sólida, mientras que Omalizumab no tiene actividad de unión, comparable a los anticuerpos anti-IgG humana de control de isotipo como se muestra en la Fig. 12.
Capacidad de hu8D6 para unirse a linfocitos B SKW6.4 pulsados con IgE
Se usó una estirpe de linfocitos B humanos que expresaba un alto nivel de CD23 (Pathan et al., Blood, 2008, 111:1594-1602) para pulsar CD23 mediante la incubación con IgE. Se incubaron 2 x 106 células SKW6.4 en 1 ml de tampón FAc S Ca2+/Mg2+ (CaCh 1 mM, MgCh 0,5 mM, FBS al 1 % y azida de sodio al 0,1 % en 1 x PBS) con IgE a una concentración de 3 pg/ml durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron con tampón FACS Ca2+/Mg2+ incubado con hu8D6, c8D6, Omalizumab y anticuerpo anti-CD23 (Clon: EBVCS2, eBioscience) a una concentración de 10 |jg/ml durante 30 minutos en hielo, seguido del lavado con tampón FACS Ca2+/Mg2+. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante IgG de cabra marcada con FITC específica de IgG-Fc humano o anticuerpo anti-IgG murina de conejo F(ab)'2 marcado con FITC. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto™ II. Se descubrió que anti-CD23 se unió bien a los linfocitos B skw6.4 como control positivo. Se impidió que Omalizumab se uniera a IgE unida por CD23, mientras que hu8D6 y c8D6 pudieron unirse eficazmente a IgE en células SKW6.4 como se muestra en las Fig. 13a a 13d.
Ejemplo 5 Incapacidad del complejo inmunitario de hu8D6 E IgE para unirse a FceRI humano
Preparación del complejo inmunitario de hu8D6 e IgE
IgE humana purificada (aproximadamente 190 kDa), hu8D6, c8D6 , Omalizumab y 5H2 (aproximadamente 150 kDa) se diluyeron a 1 mg/ml en 1 x PBS. Se prepararon mezclas que contenían complejos inmunitarios de anti-lgE:lgE mezclando 95 j l de IgE humana a 1 mg/ml, 75 j l de anticuerpos monoclonales anti-lgE a 1 mg/ml. Las mezclas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se usaron para un uso adicional.
Incapacidad del complejo inmunitario de hu8D6 e lgE para unirse a células RBL SX-38
Se incubaron 2 x 105 células RBL SX-38 en 100 l de tampón FACS con complejos inmunitarios de hu8D6 :lgE, c8D6 :lgE, omalizumab:lgE y 5H2lgE a una concentración de 10 jg/m l durante 30 minutos en hielo, seguido del lavado con tampón FACS. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante IgG de cabra marcada con FITC específica de IgG-Fc humano o anticuerpo anti-lgG murina de conejo F(ab)'2 marcado con FITC. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto™ ll. Como se muestra en las Fig. 14a a 14e, los complejos inmunitarios de hu8D6:lgE, c8D6 :lgE y Omalizumab:lgE no pudieron unirse a las células RBL SX-38 mientras que anti-FcsRl y 5H2:lgE sí se unieron.
Incapacidad del complejo inmunitario de hu8D6 e lgE para activar las células RBL SX-38
Se sembraron 3 x 105 células RBL SX-38 en una placa de 24 pocillos en 0,5 ml de medio de cultivo durante una noche en una incubadora a 37 °C. Al día siguiente, se lavó cada pocillo dos veces con 0,5 ml de tampón Tyrode y luego se añadieron 0,25 ml de tampón Tyrode previamente calentado que contenía 10 jg/m l de los complejos inmunitarios de anti-lgE:lgE o Triton X-100 al 1 %. Tras 30 minutos de incubación a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se transfirieron 50 j l de sobrenadante transparente de cada pocillo a una nueva placa OptiPlate™ negra de 96 pocillos (Perkin-Elmer). Se añadieron 50 j l de solución de sustrato 4-MUG a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora. La reacción se terminó mediante la adición de 100 j l de tampón de glicina. Como se muestra en la Fig. 15, los complejos inmunitarios de hu8D6:lgE, c8D6:lgE y Omalizumab:lgE no indujeron la desgranulación de las células RBL SX-38 mientras que sí lo hizo 5H2:lgE.
Ejemplo 6 Capacidad del complejo inmunitario de hu8D6 e lgE para unirse A CD23 humana
Se incubaron 2 x 105 células SKW6.4 en 100 j l de tampón FACS Ca2+/Mg2+ con complejos inmunitarios de hu8D6 :lgE, c8D6 :lgE, Omalizumab:lgE y anti-CD23 a una concentración de 10 jg/m l durante 30 minutos en hielo, seguido del lavado con tampón FACS Ca2+/Mg2+. Los complejos inmunitarios de anti-lgE:lgE unidos se detectaron mediante IgG de cabra marcada con FITC específica de IgG-Fc humano o anticuerpo anti-lgG murina de conejo F(ab)'2 marcado con FITC. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Canto™ ll. Como se muestra en las Fig. 16a a 16d, el complejo inmunitario de Omalizumab:lgE no pudo unirse a CD23 de la superficie, mientras que los complejos inmunitarios de hu8D6 :lgE, c8D6 :lgE y anti-CD23 fueron capaces de unirse eficazmente a las células SKW6.4.
Ejemplo 7 Capacidad de hu8D6 para inhibir la producción de lgE de PBMC
Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de muestras de sangre de donantes sanos o pacientes atópicos mediante centrifugación sobre un gradiente de densidad Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare). Las PBMC aisladas se suspendieron a 106 células/ml en medio IMDM completo (Invitrogen) con lL-4 humana a 100 ng/ml (sistemas de l D) y 100 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD40 de ratón (BioLegend, clon: G28-5). Se añadieron 8D6 humanizado, Omalizumab y Trastuzumab al medio a una concentración de 10 jg/ml. Tras un cultivo de 7, 11 y 14 días, se cosecharon los sobrenadantes libres de células y se almacenaron a -20 °C. La lgE liberada en los sobrenadantes se midió mediante ELISA usando anticuerpo anti-lgE humana, HP6061 (Abcam), como anticuerpo de captura y anticuerpo anti-lgE humana marcado con biotina, HP6029 (Abcam), como anticuerpo de detección. Brevemente, se inmovilizó el HP6061 en placas de 96 pocillos a 100 ng/pocillo en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO335 mM, pH 9,6) y se incubó a 4 °C durante la noche. Se bloquearon los pocillos recubiertos con 200 jl/pocillo de diluyentes de ensayo (BSA al 0,5 %, Tween-20 al 0,05 %, ProClin 300 al 0,02 % en PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las placas 3 veces con 200 jl/pocillo de tampón de lavado (PBS con Tween-20 al 0,05 %). Se usó lgE U266 purificada para generar una curva patrón (intervalo de 800 a 3,125 ng/ml

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado que tiene una actividad de unión a IgE humana libre, IgE unidas a la membrana en linfocitos B e IgE unida a CD23, pero que es incapaz de unirse a IgE unida a FceRI, en donde dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada (Vh ) y una región variable de cadena ligera (Vl ), en donde la región variable de cadena pesada (Vh ) comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 2; y en donde la región variable de cadena ligera (Vl ) comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 4.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un fragmento de unión al antígeno.
3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 2, en donde el fragmento de unión al antígeno es Fab, F(ab')2 o Fv monocatenario.
4. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Un anticuerpo humanizado para usar en el tratamiento de una enfermedad mediada por IgE, en donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la enfermedad mediada por IgE es asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, alergia alimentaria, urticaria (idiopática) espontánea crónica, rinosinusitis crónica, mastocitosis sistémica, mastocitosis cutánea, aspergilosis broncopulmonar alérgica, angioedema idiopático recurrente y trastorno gastrointestinal asociado con los eosinófilos.
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