KR101529160B1 - Ｂ 림프구 상의 인간 ｍＩｇＥ에 결합 가능한 항-ＣεｍＸ 항체 - Google Patents

Ｂ 림프구 상의 인간 ｍＩｇＥ에 결합 가능한 항-ＣεｍＸ 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 B 림프구들의 표면 상에 발현되는 멤브레인-결합 IgE(mIgE) 상의 CεmX 도메인에 효과적으로 결합할 수 있는 항체들의 생성 및 활용에 관한 것이다. 52 아미노산 잔기들의 CεmX 도메인은 인간 멤브레인-결합 ε 사슬 상의 CH4 도메인 및 C-말단 멤브레인-앵커 펩티드 사이에 위치하며, mIgE를 발현하는 B 세포들의 면역 타겟팅을 위한 항원 사이트로서 제시되어왔다. a20을 포함하며 CεmX의 C-말단의 RADWPGPP(SEQ ID NO: 1) 펩티드에 결합하는 이전에 보고된 단일클론 항체들은 인간 B 세포들 상의 mIgE에 잘 결합하지 못함이 밝혀졌다. 본 출원인들은 CεmX의 GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2) 및 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)과 같은 특정한 세그먼트들에 특이적인 단일클론 항체들만이 인간 B 세포들 상의 mIgE에 효과적으로 결합할 수 있으며, 따라서 IgE에 의해 매개되는 질환들의 치료를 위해 B 세포들을 타겟팅하는데 활용될 수 있음을 발견하였다.

Description

Ｂ 림프구 상의 인간 ｍＩｇＥ에 결합 가능한 항-ＣεｍＸ 항체{ANTI-CεmX ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO HUMAN mIgE ON B LYMPHOCYTES}
본 발명은 B 림프구 상의 인간 mIgE에 결합 가능한 항-CεmX 항체에 관한 것이다.
IgE는 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등의 알레르기성 질환을 유발하는 타입 I의 과민 반응을 중재하는 중심 역할을 수행한다. 알레르기성 반응들은 집먼지 진드기, 나무 및 잔디의 꽃가루, 특정 음식 및 약품, 벌 및 불개미 조각 등과 같은 무해한 환경 물질들에 대한 면역계의 반응들이다. 상기의 반응들에 있어서, 알레르겐(allergen)이 호염구(basophil) 및 비만 세포(mast cell) 표면 상의 IgE에 결합하면, IgE의 가교 및 하부의 IgE.Fc의 리셉터, 즉 타입 I IgE.Fc 리셉터들의 응집을 야기한다. 이러한 리셉터 응집은 이어서 그래뉼의 세포외방출(exocytosis) 및 히스타민, 류코트리엔(leukotrienes), 트립타제(tryptase), 시토킨(cytokines) 및 케모카인(chemokine)과 같은 약리학적 매개체들의 방출을 인도하는 신호 경로를 활성화한다. 호염구 및 비만 세포들로부터의 상기의 매개체들의 방출은 알레르기의 다양한 병적 현상들을 유발한다.
혈액 및 간질액(interstitial fluid)내의 자유 IgE 및 B 세포 상의 mIgE에 결합하며, 호염구 및 비만 세포들 상의 FcεRI에 의해 결합된 IgE에는 결합하지 않는 항-IgE 항체들이 IgE-매개 알레르기 질환들을 치료하기 위해 개발되어 왔다. 인간화된 항-IgE 항체인 오말리쥬마브(omalizumab, 상표명: Xolair)가 다양한 알레르기성 현상들에 있어서 타입 I 과민 반응을 약화시키는 다수의 약리학적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 항체는 FcεRI의 결합 사이트와 중첩하는 Fc의 CH3 도메인 내의 사이트에서 고친화도로 IgE에 결합한다. 따라서, 상기의 치료는 자유 IgE 및 B 림프아구(lymphoblast) 및 기억 B 세포 상의 mIgE에 결합하는 상기 항체에 근거하며, 이는 혈액 및 간질액 내의 전체 자유 IgE 레벨을 감소시킨다.
또한, 항-IgE 항체의 자유 IgE에의 결합은 호염구 및 비만 세포들의 표면 상의 FcεRI에의 IgE 결합을 억제한다. IgE가 결합되지 않은 FcεRI은 불안정하여 내부화 및 분해되므로 항-IgE 결합에 의한 자유 IgE의 감소는 점진적으로 호염구 및 비만 세포들 상의 FcεRI을 하향 조절한다. 시토킨 활성의 중화, 전체적인 염증 활성의 약화 및 가능하게는 IgE-항-IgE 면역 착체들의 축적을 통한 알레르겐들의 처리 등을 포함하는 상기 항체 치료의 다른 효과들의 증거들이 발견되었다.
본 발명의 한 발명자(T.W. Chang)는 오말리쥬마브가 결합하는 IgE의 CH3 상의 항원 사이트에 부가하여, CεmX로 지칭되는 또 다른 항원 사이트를 발견하였으며, 이는 mIgE-발현 B 림프구들의 타겟팅을 위한 인간 mIgE 상에 존재한다. CεmX는 인간 멤브레인-결합 ε 사슬(mε)의 CH4 도메인 및 C-말단 멤브레인-앵커링 세그먼트(C-terminal membrane-anchoring segment) 사이에 위치한 52-아미노산 세그먼트이다. 연구된 대부분의 인간에 있어서, CεmX가 없는 mε(mεs)는 미세한 비율을 차지하는 반면, CεmX가 있는 mε 사슬(mεL)은 우세하게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 자유 분비 IgE의 ε 사슬 및 mIgE의 mεs 및 mεL 에 대한 mRNA들은 모두 ε RNA 전사체의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로부터 유래한다. CεmX의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들은 전체 단백질 및 DNA 데이터베이스들 내에서 고유한 것이다. 그러므로, CεmX는 mIgE 및 mIgE-발현 B 세포들의 타겟팅을 위한 고유한 항원 사이트를 제공한다.
Chang의 연구 그룹은 이전에 a20을 포함하는 일부 CεmX-특이성 마우스 단일클론 항체들을 개발하여 발표한 바 있으며, 이들은 CεmX 세그먼트를 함유하는 재조합 단백질들 및 인간 mIgE를 발현하는 인간 골수종-유래 세포주였던 SKO-007 세포주의 세포들 및 mεL 의 세포질 말단(mεL(CH2-CM); CM: 세포질)을 통해 CH2 도메인으로부터의 세그먼트에 대응하는 유전자로 형질주입된 CHO 세포주의 세포들에 결합할 수 있다. 상기 단일클론 항체 a20 및 이전에 개발된 모든 항체들은 52 a. a. CεmX 도메인의 C-말단에 8-a. a. 펩티드 영역, RADWPGPP(SEQ ID NO:1), 잔기 #45-52에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
[관련 특허문헌]
US5,091,313 2/1992 Chang
US5,254,671 10/1993 Chang
US5,260,416 11/1993 Chang
US5,274,075 12/1993 Chang
US5,292,867 3/1994 Chang
US5,342,924 8/1994 Chang
US2009/0010924A1 Wu
[기타 참조문헌]
Davis FM, Gossett LA, Chang TW (1991) An epitope on membrane-bound but not secreted IgE: implications in isotype-specific regulation. Bio/Technology 9: 53-56.
Peng C, Davis FM, Sun LK, Liou RS, Kim YW, Chang TW (1992) A new isoform of human membrane-bound IgE. J Immunol 148: 129-136.
Chen, H.Y., Liu, F.T., Hou, C.M.H., Huang, J.S.W., Sharma, B.B., and Chang, T.W. (2002) Monoclonal antibodies against CemX domain in human membrane-bound IgE and their potential on targeting IgE-expressing B cells. Int. Archives Allergy & Immunol. 128, 315-324.
본 발명은 인간 mIgE의 CεmX 도메인에 특이성을 가지며, 인간 B 림프구들 상의 mIgE에 결합할 수 있는 항체들의 개발 및 발견에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체들의 알레르기 및 IgE에 의해 매개되는 기타 질환들을 치료에 있어서의 활용에 관한 것이다.
Chang 연구 그룹에 의해 개발된 항-CεmX 단일클론 항체 a20을 연구하면서, a20은 Igα(CD79a), Igβ(CD79b), CD21, CD19, CD81 및 B 세포 리셉터(B cell receptor: BCR)와 연관된 기타 단백질들을 발현하지 않는 CHO 세포주 또는 NS0 세포주와 같은 mεL(CH2-CM) 유전자-형질주입 세포주들에 잘 결합함이 밝혀졌다. 그러나, a20은 Igα, Igβ 및 Ramos 세포주와 같은 기타 BCR-연관 단백질들을 발현하는 mεL(CH2-CM) 유전자-형질주입 세포주들에는 잘 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 본 출원인들은 a20에 의해 인식되는 CεmX 상의 항원 에피토프(epitope)가 특정한 BCR-연관 단백질(들)에 의해 차단될 수 있다고 추정하였다. 따라서, a20 단일클론 항체 및 이의 키메릭(chimeric) 또는 인간화된 버젼들은 B 림프아구 및 기억 세포들을 발현하는 mIgE 타겟팅의 목적으로 생체 내에서 인간 환자들에 사용하는 것은 부적절할 수 있다.
펩티드 에피토프인 RADWPGPP(SEQ ID NO:1)가 항체 반응을 유도하는 유일한 에피토프인 경우, 인간 CεmX-함유 단백질들로 면역화된 쥐를 사용하여 하이브리도마(hybridoma) 방법론으로부터 생성된 단일클론 항체들은 모두 이러한 펩티드 영역에 특이적이다. 그러나, 이러한 에피토프가 지배적인 에피토프이나, 유일한 면역성 에피토프는 아닌 경우, CεmX 상의 다른 항원 에피토프들에 대해 특이적인 단일클론 항체들이 더 개발될 수 있다. 항체 결합에 대해 BCR-연관 단백질들에 의해 차단되지 않는 CεmX 상의 에피토프(들)가 존재할 수 있다. 그렇다면, B 세포들 상의 IgE에 결합하며, 이러한 B 세포들의 타겟팅에 사용될 수 있는 항체가 개발될 수 있다.
하기에 설명되는 실시예들에 따르면, 본 출원인들은 RADWPGPP(SEQ ID NO:1) 가 지배적인 에피토프일지라도, CεmX 상의 유일한 면역성 및 항원성 에피토프는 아님을 성공적으로 밝혀냈다. 더욱이, 본 출원인들은 RADWPGPP(SEQ ID NO:1) 영역에 위치하지 않는 항원 에피토프들 상의 CεmX에 결합하는 단일클론 항체들인 4B12 및 26H2를 발견하였다. 이러한 단일클론 항체들은 CεmX에 결합함에 있어서 a20 항체와 경쟁하지 않는다. 이들은 a20 보다 더욱 강하게 B 세포들 상의 mIgE에 결합하며, 항체-의존성 세포용해(cytolysis) 및 mIgE-발현 세포들의 세포사멸(apoptosis)을 유도함에 있어 a20 보다 더욱 효과적이다.
본 실시예들은 4B12 및 26H2와 같은 단일클론 항체들은 인간 B 림프구들 상의 mIgE에 결합할 수 있으며, IgE 합성의 하향 조절을 위해 mIgE-발현 B 림프아구들 및 기억 B 세포들을 타겟팅 하는데 적합함을 나타낸다. 키메릭 혹은 인간화된 형태의 상기 항체들은 알레르기성 천식, 알레르기성 비염 및 아토피성 피부염 등과 같은 IgE-매개 알레르기성 질환을 앓고 있는 환자들에게 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 항-IgE에 의한 IgE의 중화는 한랭 유발 두드러기(cold-induced urticaria), 만성 두드러기, 콜린성 두드러기(cholinergic urticaria), 만성 부비동염(chronic rhinosinusitis), 전신비만세포증(systemic mastocytosis), 피부 비만세포증(cutaneous mastocytosis), 알레르기성 기관지 폐 아스페르질루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 특발성 혈관부종(recurrent idiopathic angioedema) 및 간질성 방광염(interstitial cystitis) 또는 호산성구-연관 위장 장애(eosinophil-associated gastrointestinal disorder)를 효과적으로 치료할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 4B12 및 26H2와 같은 항체들은 또한 상기의 다양한 질환들을 치료하기 위해 적용될 수 있다.
추가적으로, 본 실시예들은 CεmX 에 대한, 이에 따라 mIgE-발현 B 세포들에 대한 면역 반응을 유도함에 있어서, 4B12 및 26H2에 의해 인식되는 펩티드들의 잠재적 활용을 제시한다, 상기 펩티드들 및 유사한 항원성 특성들, 즉 4B12 및 26H2와 같은 항-CεmX 항체들에 대한 결합 활성을 갖는 이들의 유사체들은 단독으로 혹은 T-세포 도움을 유도할 수 있는 잔기들을 함유하는 분자 설계물로 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 설계물들은 mIgE-발현 B 세포들에 대한 활발한 면역반응을 유도하며, 따라서 총 IgE 합성량의 하향 조절 효과를 획득할 수 있다.
도 1은 CεmX 의 연속적인 세그먼트들을 나타내는 3 개의 합성 펩티드들 및 상기의 펩티드들을 갖는 다양한 항-CεmX mAbs들의 반응성을 나타내는 도면이다. CεmX 도메인의 아미노산 잔기들은 볼드체로 표시하였다(CH4-migis: SEQ ID NO:11; P1: SEQ ID NO:12; P2: SEQ ID NO:3; P4: SEQ ID NO:13)
도 2는 다양한 항-CεmX mAbs의 mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS를 발현하는 CHO 또는 Ramos 세포주들에의 결합을 나타내는 도면이다.
도 3a는 키메릭 c4B12 및 c26H2가 복수의 E/T 비율들에서 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들에 대한 ADCC를 유도하는 것을 나타내는 도면이다.
도 3b는 키메릭 c4B12 및 c26H2가 투약량-반응성(dose-responsive) 방식으로mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들에 대해 ADCC를 유도하는 것을 나타내는 도면이다.
도 4a는 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들 내에서 키메릭 c4B12 및 c26H2에 의해 유도된 PS 노출이 투약량 의존적임을 나타내는 도면이다.
도 4b는 세포사멸 핵이 키메릭 c4B12 및 c26H2 처리된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들 내에서 관찰됨을 나타내는 도면이다.
도 4c는 카스파제 3(caspase 3) 및 PARP의 분해가 키메릭 c4B12 및 c26H2 처리된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들 내에서 관찰됨을 나타내는 도면이다.
도 5는 모체 마우스 4B12 의 VL 및 VH, VL 및 VH 각각에 대한 선택된 인간 생식선 템플레이트들인 KV2 및 HV4, 및 "Replace"로 표시된 인간화된 4B12(hu4B12)의 아미노산 서열 배열을 나타내는 도면이다. hu4B12는 CεmX 재조합 단백질들 및 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들에 대해 키메릭 4B12(c4B12)와 동일한 결합 친화도를 갖는다(4B12 경쇄(Light chain): SEQ ID NO:5; 4B12 중쇄(Heavy chain): SEQ ID NO:8; KV2 경쇄: SEQ ID NO:6; HV4 중쇄: SEQ ID NO:9; Hu4B12(Replace) 경쇄: SEQ ID NO:7; Hu4B12(Replace) 중쇄: SEQ ID NO:10).
실시예 1: RADWPGPP(SEQ ID NO:1) 외에 다른 항원 사이트들에 결합하는 신규한 항-CεmX 단일클론 항체들
항-CεmX 면역 반응을 유도하기 위해, BALB/c 마우스들이 TiterMax Gold 보조제(Sigma-Aldrich) 내에서 제조자의 제안에 따라 2주 간격으로 유화된 50㎍의 n-운데실-β-d-말토피라노시드(n-undecyl--d-maltopyranoside (UDM; Anatrace))에 용해된 mIgE.FcL 재조합 단백질들로 경피적으로 2회 면역화되었다. 본 출원인들은 상기 마우스들이 오로지 지배적인 RADWPGPP 에피토프에 대해서만 항체들을 생산하지 않도록, 과민-면역 프로토콜을 회피하였다. 최종 증폭이 보조제 없이 0.1mg의 UDM 용해된 mIgE.FcL 재조합 단백질들로 복막에 제공되었다. 융합 하루 전에, NS0 세포들이 10%의 열-불활성화된 소태아 혈청(fetal bovine serum)(FBS; Invitrogen) 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 혼합물(100X Pen-Strep 용액; Invitrogen)이 5x105 cells/ml 의 세포 밀도로 첨가된 신선한 DMEM 배지(Invitrogen) 내에 재씨드(reseed)되었다. 상기 최종 증폭 3일 후에, 두 면역화된 마우스들로부터 비장 세포들이 수득되어 혈청 제거된 DMEM 배지에서 2회 세척되었다. 5x107 의 NS0 세포들이 수득되어 혈청 제거된 DMEM 배지에서 2회 세척되었다. 세척 후에, 비장 세포들 및 NS0 세포들은 1ml의 예비-승온된 50% 폴리에틸렌글리세롤 1500(polyethyleneglycerol 1500(PEG 1500), Roche Applied Science)을 투입하여 융합되었으며, 이 때 지속적으로 1분 동안 피펫 팁으로 서서히 세포들을 저어주고, 1분 동안 추가로 저어주고, 2분 동안 2ml의 예비-승온된 혈청 제거 DMEM을 첨가하고, 마지막으로 8ml의 혈청 제거 DMEM을 2분 동안 첨가하였다. 10분 동안 200×g 에서 원심분리 후에, 융합된 세포들은 600ml의 HAT 배지[2%의 hypoxanthine-aminopterin-thymidine 혼합물(50 HAT 용액; Invitrogen), 10%의 BM-Condimed H1(Roche Applied Science), 10%의 열-불활성화된 FBS 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신 혼합물이 첨가된 DMEM 배지]에 다시 서스펜딩되었으며, 200㎕/웰(well)로 30 96-웰 배양 플레이트들에 분배되었다. 3일 째에, 100㎕의 HAT 배지가 각 웰에 추가되었다. 7일 및 10일 째에, 배지는 각 웰 부피의 반을 새로 HAT 배지로 교체함으로써 청정화되었다. 14일 째에, 하이브리도마 상징액(hybridoma supernatant)이 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 UDM-용해 mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS 단백질들에 결합하기 위한 항-CεmX mAbs를 스크린하는데 사용되었다.
ELISA에 의해 항-CεmX mAbs를 분비하는 하이브리도마들을 스크린하기 위해 정제된 UDM-용해 mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS 단백질들이 96-웰 MaxiSorp 플레이트들(Nunc) 상에서 50ng/well로 4℃의 0.1M NaCO3(pH 9.6)내에서 하룻밤 동안 코팅되었다. 코팅된 웰들은 상온에서 1시간 동안 PBS 내의 1% BSA의 200㎕/well 에 의해 차단되었다. 플레이트들은 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 3회 세척되었으며, 이어서 웰들에 100㎕의 하이브리도마 상징액을 첨가하였다. 상온에서 2 시간동안 인큐베이션이 수행되었다. 모든 웰들에 대해 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 6회 세척하였다. 플레이트들은 1시간 동안 HRP-콘쥬게이티드 염소 항-마우스 IgG 항체(Chemicon)의 1:10,000 희석액(100㎕/well)으로 배양되었다. 이어서, 모든 웰들에 대해 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 6회 세척하였다. 최종적으로, 웰들은 50㎕/well의 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine, TMB) 기질 용액(SureBlueTM, KPL)으로 현상되었으며, 반응은 1N HCl의 50㎕/well 첨가에 의해 중단되었다. ELISA 리더 상에서 흡광도는 OD450으로 측정되었다. ELISA에 의해 결정된 바에 의하면, 4000이상의 두 융합물로부터 스크린된 하이브리도마 클론들 중에서, 17개의 클론들이 UDM-용해 mIgE.FcS 보다 UDM-용해 mIgE.FcL 에 특이성을 보였다.
항-CεmX mAbs의 CεmX 에 대한 특이성을 관찰하기 위해, 다양한 CεmX-특이성 클론들이 CεmX의 3개의 연속 세그먼트들을 나타내며, 잔기 #18에 위치한 C 잔기 및 잔기 #39-41의 CHC 세그먼트에 의해 분리되는 3개의 합성 펩티드들과의 반응성에 대해 시험하였다. 구체적으로, P1 펩티드는 mε 의 CH4의 마지막 4개의 아미노산 잔기들 및 CεmX의 처음의 17개의 아미노산 잔기들(#1-17), 즉, GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)을 함유한다. P2 펩티드는 CεmX의 20개의 아미노산 잔기들(#19-38), 즉, HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)를 포함한다. P3 펩티드는 CεmX의 말단의 11개의 아미노산 잔기들(#42-52), 즉 GAGRADWPGPP(SEQ ID NO:4), 및 연속적인 migis 영역의 처음 4개의 아미노산 잔기들, 즉 mε 사슬의 멤브레인 앵커 펩티드의 N-말단 세포외 영역을 함유한다. 모든 펩티드들은 대만 타이페이의 Genomics Research Center, Academia Sinica에서 합성되었다. 상기 펩티드들은 10mg/ml 농도의 PBS로 재구성되었다. 모든 펩티드들은 96-웰 MaxiSorp 플레이트들(Nunc) 상에서 500ng/well로 4℃의 0.1M NaCO3(pH 9.6)내에서 하룻밤 동안 코팅되었다. 코팅된 웰들은 상온에서 1시간 동안 PBS 내의 1% BSA의 200㎕/well 에 의해 차단되었다. 플레이트들은 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 3회 세척되었으며, 이어서 웰들에 1㎍/ml의 항-CεmX mAbs 100㎕를 첨가하였다. 상기 인큐베이션은 상온에서 2시간 동안 수행되었다. 모든 웰들에 대해 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 6회 세척하였다. 플레이트들은 1시간 동안 HRP-콘쥬게이티드 염소 항-마우스 IgG 항체의 1:10,000 희석액으로 배양되었다. 0.05% Tween-20을 갖는 PBS의 200㎕/well로 6회 세척후에. 50㎕/well의 TMB 기질 용액이 상기 웰들에 첨가되었다. 반응은 1N HCl의 50㎕/well 첨가에 의해 중단되었다. ELISA 리더 상에서 흡광도는 OD450으로 측정되었다. 본 실험에서 제조된 다수의 CεmX-특이성 단일클론 항체들 중에서, 4B12 및 26H2 만이 RADWPGPP-함유 P3 펩티드와 반응하지 않았다. 4B12는 P1 펩티드와 반응하였으며, 26H2는 P2 펩티드와 반응하였다. 다른 모든 CεmX-특이성 단일클론 항체들은 P3과 반응하였다(도 1). 따라서, RADWPGPP(SEQ ID NO:1)는 지배적인 면역성 에피토프이나, 유일한 면역성 에피토프는 아니다.
실시예 2: mIgE-발현 B 세포들 상의 mIgE에 결합하는 4B12 및 26H2
본 출원인들은 추가적으로 다양한 CεmX-특이성 단일클론 항체들의 mεL(CH2-CM) 혹은 mεS(CH2-CM) 을 인코딩하는 재조합 DNA로 형질주입된 CHO 및 Ramos 세포주들에 결합하는 능력을 테스트하였다. 두 형질주입된 CHO 세포주들은 각각 mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS을 생산하였으며, 이들은 Igα 및 Igβ와 같은 코리셉터(coreceptor)들을 갖는 완전한 B 세포 리셉터를 형성하지 않았다. 이는 상기 CHO 세포주들은 이러한 단백질들을 발현하지 않기 때문이다. 두 형질주입된 Ramos 세포주들은 각각 mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS을 생산하였으며, 이들은 이들의 고유의 코리셉터들과 착체를 형성하였다. 항-CεmX mAbs의 고유의 CεmX에 대한 결합을 조사하기 위해, mIgE.FcL 혹은 mIgE.FcS을 발현하는 CHO 혹은 Ramos 세포들이 FACS 버퍼[PBS, 1% FBS, 0.1% 소듐 아자이드 및 2mM EDTA(pH 8.0)] 내에서 107 cells/ml 의 세포 밀도로 다시 서스펜딩 되었다. 106 개의 세포들이 100㎕의 하이브리도마 상징액으로 얼음 상에서 30분 동안 배양되었고, 이어서 FACS 버퍼로 세척하였다. 결합된 항체들이 마우스 IgG(AbD Secrotec)에 특이적인 FITC-라벨링된 토끼 F(ab')2 절편으로 얼음 상에서 30분간 배양되어 검측되었다. 이어서, 분석 전에 FACS 버퍼로 2회 세척하였다. 유동 세포 분석(flow cytometry) 실험들이 FACSCanto II 유동 세포분석기(BD Bioscience)를 사용하여 수행되었으며, FCSExpress 소프트웨어(De Novo Software)를 사용하여 분석되었다. 모든 CεmX-특이성 단일클론 항체들은 mIgE.FcS을 발현하는 CHO 및 Ramos 세포들에 결합하지 않음이 밝혀졌다. 모든 CεmX-특이성 단일클론 항체들은 mIgEL을 발현하는 CHO 세포들에 결합하는 것으로 발견되었다. 그러나, 오직 4B12 및 26H2 만이 mIgE.FcL 을 발현하는 Ramos 세포들에 결합할 수 있었다. 반면, 모든 다른 CεmX-특이성 단일클론 항체들은 mIgE.FcL 을 발현하는 Ramos 세포들에 결합할 수 없었다(도 2).
실시예 3: mIgE-발현 B 세포들에 대해 항체-의존성 세포독해성(ADCC)을 유도하는 4B12 및 26 H2
키메릭 항-CεmX mAbs 의 ADCC 활성을 조사하기 위해, 본 출원인들은 주변 혈액 단일핵 세포들(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)을 이펙터 세포들로 사용하여 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들을 타겟팅하였다. PBMCs 는 건강한 도너들(Taiwan Blood Service Foundation)의 버피 코트(buffy coat)들로부터 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare) 밀도 구배로 원심분리에 의해 정제되어 90% FBS/10% DMSO (Hybri-MaxTM Sigma-Aldrich) 내에서 극저온냉동되었다. 사용 전에, PBMCs는 해동되어 2×106 cells/ml로 하룻밤동안 10% 열-불활성화된 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물이 첨가된 IMDM 배지(Invitrogen) 내에서 배양되었다. PBMCs 공배양액 내에서 타겟 세포들을 식별하기 위해, mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들이 2.5μM의 5-(및-6)-카르복시플루오레세인 디아세테이트(5-(and -6)-carboxyfluorescein diacetate), 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester (CFDA, SE; Invitrogen))로 0.1% BSA/PBS 내에서 37℃에서 10분 동안 라벨링되었다. 10% FBS를 함유하는 차가운 RPMI 배지(Invitrogen)로 3회 세척 후에, 세포들은 105 cells/ml로 조절되었다. 이펙터-타겟(effector-target, E/T) 비율 적정을 위해, 완전한 RPMI 배지 200㎕ 내에서 20,000 개의 라벨링된 세포들이 30분 동안 37℃ 에서 1㎍/ml 의 항체들로 코팅되었고, 이어서 50 내지 3.125의 복수의 E/T 비율들에서 동일한 부피의 PBMCs와 결합되었다. 항체 적정을 위해, 완전한 RPMI 배지 200㎕ 내의 20,000 개의 라벨링된 세포들은 30분 동안 37℃에서 다양한 농도(1000 내지 0.01ng/ml)의 항체로 옵소닌화(opsinized)되었다. 이어서, 25:1의 E/T 비율에서 PBMCs와 결합되었다. 항체-비의존성 사살(anitibody-independent killing)을 측정하기 위해, 라벨링된 타겟 세포들은 또한 주어진 E/T 비율들에서 항체들의 부재하에 PBMCs로 배양되었다. 24 시간의 배양의 말미에, 사살된 세포들은 2.5㎍/ml 의 7-아미노 악티노마이신(7-amino actinomycin (7-AAD Invitrogen))으로 얼음 상에서 15분 동안 염색되었다. 세포들은 Becton Dickinson FACSCanto II 유동 세포분석기 상에서 분석되었다. 살아있는 타겟 세포들은 닷-플롯(dot-plot) 분석 상에서 CFSE-양성/7-AAD-음성 세포들의 퍼센트로 정의되었다. 주어진 E/T 비율에서 사살된 세포들의 퍼센트는 다음의 공식에 의해 계산되었다.
100 × [(항체-비의존성 조절 내의 살아있는 타겟 세포들의% - 샘플 내의 살아있는 타겟 세포들의%)/항체-비의존성 조절 내의 살아있는 타겟 세포들의%]
c4B12, c26H2 및 오말리쥬마브의 ADCC 활성은 복수의 E/T 비율들에서 관찰되었다. E/T 비율 50에서, c4B12, c26H2 및 오말리쥬마브는 60%의 특이적 용균(lysis)을 나타냈다. 이와 대조적으로 ca20은 작은 활성을 가지며, 단지 10-20%의 특이적 용균을 나타냈다(도 3a). 추가적으로, 상당한 ADCC가 c4B12 및 c26H2의 농도가 0.01㎍/ml보다 높을 때 관찰되었다. 10㎍/ml의 최대 투약량에서, c4B12 및 c26H2에 의한 타겟 세포들의 특이적 용균은 80% 내지 90% 범위로 나타났으며, 반면에 ca20은 50%의 특이적 용균을 나타냈다(도 3b). CD20으로 인도되는 rituximab 및 오말리쥬마브의 양성 조절은 복수의 E/T 비율들에서 투약량-의존적 방식으로 효과적으로 ADCC 를 유도하였다. 따라서, 본 출원인들은 c4B12 및 c26H2은 ADCC를 매개함에 있어서 ca20 보다 더욱 효과적인 항-CεmX mAbs이며, 효율적으로 생체 내에서 mIgE-발현 B 세포들을 타겟팅하는데 이펙터 세포들을 사용할 수 있다고 결론지었다.
실시예 4: 멤브레인-결합 IgE.Fc L -발현 Ramos 세포들의 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는 키메릭 항-CεmX mAbs
포스파티딜세린(phosphatidylserin, PS) 노출을 검측하기 위해, mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들(5x105 cell/ml)이 키메릭 항-CεmX mAbs, 오말리쥬마브 혹은 조절 항체들로 지시된 농도들에서 1시간 동안 37℃로 완전한 배양 배지에서 배양되었다. 세포들은 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)의 Fc 절편에 특이적인 염소 F(ab')2 절편으로 10㎍/ml의 농도로 처리되었으며, 이어서 24시간 동안 37℃에서 추가로 배양되었다. PS 노출의 검측은 1/200으로 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)-라벨링된 Annexin V (BioVision) 및 2.5㎍/ml의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide(PI), Sigma-Aldrich)을 함유하는 200㎕의 Annexin 버퍼[10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2]로 상온의 암실에서 15분 동안 염색함으로써 수행되었다. 세포들은 FACSCanto II 유동 세포 분석기 상에서 분석되었다. 세포사멸 세포들은 닷-플롯 분석 상에서 Annexin V-양성/PI-음성 세포들의 퍼센트로 정의되었다. 대략 80%의 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들이 1㎍/ml의 최고 주입량으로 c4B12, c26H2 혹은 오말리쥬마브의 농도를 높이고 ca20의 농도는 높이지 않음으로써 세포사멸을 통해 사멸되었다.
세포사멸 핵의 검측을 위해, mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들(5x105 cell/ml)이 키메릭 항-CεmX mAbs, 오말리쥬마브 혹은 조절 항체들로 1㎍/ml의 농도에서 1시간 동안 37℃로 완전한 배양 배지에서 배양되었다. 세포들은 인간 IgG의 Fc 절편에 특이적인 염소 F(ab')2 절편으로 최종 농도 10㎍/ml로 처리되었으며, 이어서 48시간 동안 37℃에서 추가로 배양되었다. 5x105 개의 세포들이 0.5ml의 프포피디움 요오드화물(PI)/Triton 용액(0.1% 소듐 시트레이트(sodium citrate), 0.1% Triton X-100, 15㎍/ml PI 및 100㎍/ml PBS 내의 RNase A; Sigma-Aldrich)내에서 얼음 상에서 암실 내 1시간 동안 배양되었다. PI 형광은 FACSCanto II 유동 세포분석기 상에서 결정되었다. 손상되지 않은 핵의 DNA 함량은 선형 스케일로 기록되었다. G0/G1 피크 아래의 채널 내에서 형광을 방출하는 저이배체(hypodiploid) DNA를 함유하는 세포사멸 핵은 총 개체수 중의 퍼센트로 열거되었다. 저이배체 DNA를 갖는 세포 개체수의 상당한 증가가 c4B12, c26H2 혹은 오말리쥬마브-처리된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들 내에서 관찰되었다(도 4b).
카스파제 3 및 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제(poly(ADP-ribose) polymerase; PARP) 분해를 검측하기 위해, mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들(5x105 cell/ml)이 키메릭 항-CεmX mAbs, 오말리쥬마브 혹은 조절 항체들로 1㎍/ml의 농도에서 1시간 동안 37℃로 완전한 배양 배지에서 배양되었다. 세포들은 인간 IgG의 Fc 절편에 특이적인 염소 F(ab')2 절편으로 최종 농도 10㎍/ml로 처리되었으며, 이어서 24시간 동안 37℃에서 추가로 배양되었다. 5x106 개의 세포들은 얼음 냉각된 PBS 내에서 세척되었고 100㎕ 의 얼음 냉각 변형된 RIPA 용균 버퍼[20 mM Tris(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 0.5% 디옥시콜레이트(deoxycholate), 0.1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS), 5 mM EDTA, 및 프로테아제 억제제(protease inhibitor); Sigma-Aldrich] 내에서 다시 서스펜딩 되었다. 상기의 용균액은 얼음 상에서 20분 동안 배양되었다. 샘플들은 20분 동안 4℃에서 16000×g 로 원심분리되었다. 상징액은 깨끗한 1.5ml 튜브에 전송되어 -80℃ 로 저장되었다. 분류된 각 용균액 내의 단백질 함량은 Protein DC 분석기(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정량되었다. 각 샘플은 총 단백질 함량에 대해 표준화되고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 수행 후, PVDF 멤브레인(GE Healthcare)에 전송되었다. 카스파제-3 및 PARP에 대한 토끼 다중클론 항체들이 세포 신호 기술(Cell Signaling Techonology)를 통해 수득되었으며, 1:500 희석되어 사용되었다. HRP-콘쥬게이티드 염소 항-토끼 IgG 2차 항체(Sigma-Aldrich)가 1:10,000 희석되어 사용되었다. 멤브레인들은 ECL 제제(ImmobilonTM Western; Millipore)로 현상되었다. 균등한 단백질 로딩이 블롯(blot)을 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 항체로 검지함으로써 확인되었다. mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들을 ca20이 아닌, c4B12, c26H2 및 오말리쥬마브로 처리한 24시간 후에, 카스파제-3의 M r 19- 및 17-kDa 절편들로의 분해가 명백히 나타났다. 추가적으로, PARP의 분해가 c4B12, c26H2 및 오말리쥬마브-처리된 mIgE.FcL-발현 Ramos 세포들 내에서 M r 116 kDa 미손상 PARP 및 M r 89 kDa 분해 산물을 인식하는 항체를 사용하여 관측가능하였다(도 4c).
SEQUENCE LISTING <110> CHANG, Tsewen CHEN, Jiun-bo WU, Pheidias C HUNG, Alfur F <120> ANTI-C(epsilon)mX ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO HUMAN mIgE <130> A0988.70036US01 <140> US 13/203,483 <141> 2011-08-25 <150> 61/155,224 <151> 2009-02-25 <150> PCT/CN2010/000232 <151> 2010-02-25 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(8) <223> residues 45-52 from the C-terminal end of the C(epsilon)mX domain located between the CH4 domain and the C-terminal membrane-anchoring segment of human membrane-bound (epsilon) chain <400> 1 Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <400> 2 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <400> 3 His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Pro His Pro Arg 20 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <400> 4 Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Ile Gln Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse 4B12 light chain variable region <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(113) <223> humanized mouse 4B12 light chain variable region <400> 7 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr Asp Gly Leu Ala Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 9 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Ile Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse 4B12 heavy chain <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(117) <223> humanized mouse 4B12 heavy chain region <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Gly Tyr Asp Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 1 5 10 15 Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg 20 25 30 Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly 35 40 45 Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val 50 55 60 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 12 Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala 1 5 10 15 Pro Asp Arg Val Leu 20 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 13 Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val 1 5 10 15

Claims (19)

  1. GLAGGSAQSQRAPDRVL (SEQ ID NO:2)에 결합하며,
    (a) RSSQSIVHSNGNTYLE의 경쇄(light chain) 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)1, KVSNRFS의 경쇄 CDR2, 및 FQGSHVPPT의 경쇄 CDR3, 및 (b) GYSITSDYAWN의 중쇄(heavy chain) CDR1, SISYSGITGYNPSLKS의 중쇄 CDR2, 및 RMGYDGLAY의 중쇄 CDR3을 포함하는,
    CεmX-특이적 항체 또는 이의 절편.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 마우스(mouse) 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 마우스 단일클론 항체의 가변 영역들 및 인간 항체들의 불변 영역들을 포함하는 키메릭 항체인 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 필수적으로 인간 항체의 프레임워크 영역들을 포함하는 인간화된 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 절편은 Fab, F(ab)'2, 또는 단일-사슬 Fv인 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:8로 주어지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO:5로 주어지는 경쇄 가변 영역, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:10으로 주어지는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO:7로 주어지는 경쇄 가변 영역, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 CεmX-특이적 항체.
  18. 알레르기성 천식, 알레르기성 비염 또는 아토피성 피부염을 포함하는 IgE-매개 질환 치료를 위한 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항, 제 16 항 또는 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 절편.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 IgE-매개 질환은 한랭 유발 두드러기(cold-induced urticaria), 만성 두드러기, 콜린성 두드러기(cholinergic urticaria), 만성 부비동염(chronic rhinosinusitis), 전신비만세포증(systemic mastocytosis), 피부 비만세포증(cutaneous mastocytosis), 알레르기성 기관지 폐 아스페르질루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 특발성 혈관부종(recurrent idiopathic angioedema) 및 간질성 방광염(interstitial cystitis) 또는 호산성구-연관 위장 장애(eosinophil-associated gastrointestinal disorder)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 절편.

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