BRPI1008317B1

BRPI1008317B1 - Anticorpo cemx-específico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uso do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno para tratar doenças mediadas por ige e uso de um imunogênico ou um análogo com propriedade antigênica similar para induzir uma resposta imune em um paciente

Info

Publication number: BRPI1008317B1
Application number: BRPI1008317-0A
Authority: BR
Inventors: Tsewen Chang; Jiun-bo Chen; Pheidias C. Wu; Alfur F. Hung
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2022-05-03
Also published as: JP2013520396A; EP2401300A1; RU2550270C2; RU2015109110A; RU2011139083A; MX2011008971A; US8741294B2; US20120207746A1; AU2010217100B2; DK2401300T3; CN102482351A; PT2401300T; AU2010217100A8; WO2010097012A1; SG174161A1; EP2401300A4; US20130302314A1; ES2665495T3; KR101529160B1; US20140220042A1

Abstract

ANTICORPO C?mX-ESPECÍFICO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, USO DOS MESMOS e USO DE IMUNOGÊNICOS. A invenção está relacionada à geração e utilidade de anticorpos que podem eficazmente se ligar ao domínio C?mX em IgE ligado a membrana (mlgE) expressos na superfície de linfócitos B humanos. O domínio C?mX de 52 resíduos de aminoácidos, localizado entre o domínio CH4 e o peptídeo de ancoragem de membrana C-terminal na cadeia epsiIon ligada à membrana humana. foi sugerido como um sítio antigênico para alvo imunológico de células B expressando mIgE. Anticorpos monoclonais anteriormente reportados, incluindo a20, que se liga ao peptídeo RADWPGPP no C-terminal de C?mX, foram verificados que se ligam fracamente a mIgE em células B humanas. Os presentes inventores verificaram agora que apenas anticorpos monoclonais específicos para certos segmentos, tais como GLAGGSAQSQRAPDRVL e HSGQQQGLPRAAGGSVPHPRde C?mX podem se ligar eficazmente a mIgE sobre as células B humanas e, portanto, terem utilidade para atingir aquelas células B para o tratamento de doenças mediadas por IgE.

Description

Fundamentos da Invenção

[001]IgE tem um papel central na mediação reações de hipersensibilidade do tipo I, que são responsáveis por causar doenças alérgicas, incluindo asma alérgica, rinite alérgica, dermatite atópica, entre outros. Reações alérgicas são as respostas do sistema imunológico contra inofensivas substâncias ambientais, tais como ácaros da poeira de árvores, grama e pólen, certos alimentos e drogas, e abelhas e picadas de formiga. Em tais reações, a ligação de um alergênio a IgE na superfície de células basófilas e mastócitas induz a ligação cruzada de IgE e a agregação dos receptores subjacentes de IgE. Fc, o tipo I dos receptores IgE.Fc, ou FcεRI. Esta agregação re-ceptora subsequentemente, ativa a via de sinalização que leva à exocitose de grânu-los e liberação de mediadores farmacológicos, como a histamina, leucotrienos, trip- tase, citocinas e quimiocinas. A liberação dos mediadores dos mastócitos e basófilos induz as diversas manifestações patológicas da alergia.

[002]Anticorpos Anti-IgE que se ligam a IgE livre no sangue e no líquido in-tersticial e a mIgE sobre as células B, mas não a IgE ligados por FcεRI em basófilos e mastócitos, têm sido desenvolvidos para tratar doenças alérgicas mediadas por IgE. O tratamento com um anticorpo anti-IgE humanizado, omalizumab (nome comercial Xolair), mostrou vários efeitos farmacológicos na atenuação de hipersensibilidade do tipo I em várias indicações alérgicas. O anticorpo se liga a IgE com alta afinidade a um sítio no domínio CH3 de Fc que se sobrepõe com o sítio de ligação da FcεRI. Assim, a terapêutica é baseada na ligação do anticorpo a IgE livre e a mlgE em linfo- blastos B e em células B de memória, o que leva à redução do nível de IgE total livre no sangue e no líquido intersticial.

[003]A ligação do anti-IgE a IgE livre ainda impede ligação de IgE a FcεRI na superfície de basófilos e mastócitos. Como o FcεRI desocupado por IgE é instável e em seguida internalizado e degradado, o esgotamento de IgE livre com ligação anti- IgE também gradualmente sub-regula FcεRI em basófilos e mastócitos. Evidências quanto a outros efeitos da terapia de anticorpos foram encontradas, incluindo a neu-tralização das atividades citocinérgicas, a atenuação da atividade inflamatória em ge-ral, e, possivelmente, a varredura de alergênios através da acumulação de imuno- complexos IgE-anti-IgE.

[004]Um dos inventores (TW Chang) da presente invenção descobriu que, adicionalmente ao sítio antigênico em CH3 de IgE que o omalizumab se liga, um outro sítio antigênico, referido como CεmX, existe no mlgE humanos para ter por alvo linfó- citos B expressando mlgE. CεmX é um segmento de 52 aminoácidos, situado entre o domínio CH4 e o segmento de ancoragem membrana C-terminal da cadeia ε de ligação à membrana humana (mε). Foi demonstrado que na maioria dos indivíduos humanos estudados mε sem CεmX (mεs) concorre para diminutas proporções, enquanto a cadeia mε com CεmX (mεL) é predominantemente expressa. Os mRNAs para a cadeia ε do IgE livre, secretada e para mεs e mεL de mlgE são todos derivados da junção alternativa do transcrito ε RNA. As sequências aminoácidos e nucleotídeos de CεmX são únicos nas proteínas completas e nas bases de dados do DNA. Portanto, CεmX fornece um sítio antigênico único para a segmentação mlgE e células B expres- sando-mlgE.

[005]O grupo de pesquisa de Chang relatou anteriormente o desenvolvimento de diversos anticorpos CεmX-especificos de camundongos, incluindo a20, que pode se ligar a proteínas recombinantes contendo segmento CεmX e a células da linhagem de células SKO-007, que era uma linha celular derivada de mieloma humano expressando mlgE humana, e a células de uma linhagem de células CHO, que foi transfectada com o gene correspondente ao segmento proveniente do domínio CH2 através da terminação citoplasmática de mεL (mεL (CH2-CM); CM: citoplasma). O an-ticorpo monoclonal a20 e todos os anticorpos desenvolvidos anteriormente foram descobertos se ligarem a uma região 8-a. a. região peptídica, RADWPGPP, resíduos # 45-52, na extremidade C-terminal do domínio 52 a. a. CεmX.

Sumário da Invenção

[006]Essa invenção está relacionada ao desenvolvimento e a identificação de anticorpos que são específicos para domínio CεmX de mlgE humano e que pode se ligar ao mlgE nos linfócitos B humanos. Ele também pertence à utilidade destes anticorpos no tratamento de doenças alérgicas e outras que são mediadas por IgE.

[007]No estudo do anticorpo monoclonal anti-CεmX a20, que foi desenvolvido pelo grupo de pesquisa de Chang, verificou-se que a20 tem boa ligação com a linhagem celular gene-transfectadas mεL (CH2-CM), tais como linhagens de células CHO ou NSO , que não expressam Igα (CD79a), Igβ (CD79b), CD21, CD 19, CD81, e outras proteínas associadas com receptores de células B (BCR). No entanto, a20 foi descoberta se ligar mal às linhagens genéticas transfectadas mεL (CH2-CM) que expressam Igα, Igβ, e outras proteínas BCR-associadas, tais como linhagens celulares Ramos. Temos por hipótese que o epítopo antigênico em CεmX reconhecido por a20 pode ser bloqueado por certas proteínas BCR-associadas. Portanto, um anticorpo monoclonal a20 e suas versões quiméricas ou humanizadas não seriam adequadas para uso em pacientes humanos in vivo com o propósito de atingir linfoblastos B expressando mlgE e células de memória.

[008]Se o epítopo peptídico, RADWPGPP, é o único epítopo a induzir res-posta de anticorpos, anticorpos monoclonais gerados a partir de metodologia hibri- doma usando camundongos que são imunizados com proteínas contendo CεmX hu-manas seriam todos específicos para esta região peptídica. No entanto, se esse epí- topo é um epítopo dominante, mas não o único epítopo imunogênico, os anticorpos monoclonais específicos para epítopos antigênicos outros CεmX podem ser ainda desenvolvidos. É possível que exista um epítopo(s) em CεmX que não esteja bloqueado por proteínas BCR-associadas para ligação anticorpo. Se assim for, um anticorpo que se liga a IgE em células B e que pode ser usado para alvejar as células B podem ainda ser desenvolvidos.

[009]Nos exemplos a seguir, foi demonstrado de forma bem sucedida que embora RADWPGPP seja um epítopo dominante, ele não é o único epítopo imunogênico e antigênico em CεmX. Além disso, foi verificado que os anticorpos monoclonais, 4Bl 2 e 26H2, que se ligam a CεmX em epítopos antigênicos não situados na região de RADWPGPP. Esses anticorpos monoclonais não competem com o anticorpo a20 na ligação a CεmX. Eles se ligam a mlgE nas células B muito mais fortemente do que a20 e são muito mais eficazes do que a20 em causar a citólise anticorpo-dependente e a apoptose de células que expressam-mlgE.

[0010]Os exemplos indicam que os anticorpos monoclonais, tais como 4Bl 2 e 26H2, podem se ligar a mlgE nos linfócitos B humanos e são adequados para uso com o objetivo de atingir linfoblastos B expressando-mlgE e células B de memória para a sub-regulação da síntese de IgE. Os anticorpos quiméricos ou em formas hu-manizadas serão úteis para uso em pacientes afetados com Doenças alérgicas medi-adas por IgE, como asma alérgica, rinite alérgica e dermatite atópica. Uma vez que a neutralização de IgE por anti-IgE foi demonstrado tratar eficazmente urticária induzida pelo frio, urticária crônica, urticária colinérgica, rinossinusite crônica, mastocitose sistêmica, mastocitose cutânea, aspergilose broncopulmonar alérgica, angioedema idio- pática recorrente, e cistite intersticial, ou distúrbios gastrintestinais associados aos eo- sinófilos, os anticorpos, como 4Bl 2 e 26H2, também pode ser aplicados para tratar essas doenças diversas.

[0011]Os exemplos sugerem ainda a utilidade potencial dos peptídeos reco-nhecidos por 4Bl 2 e 26H2 na indução de resposta imune contra CεmX e, portanto, células B expressando mlgE. Os peptídeos e seus análogos com propriedades anti- gênicas semelhantes, ou seja, com atividade de ligação aos anticorpos anti-CεmX, tais como 4Bl 2 e 26H2, podem ser usados individualmente ou em combinação mole-cular em construções que também contêm frações que podem induzir ajuda por célu- las-T. Tais construções podem induzir a imunização ativa contra a células B expres-sando mlgE e, assim, atingir os efeitos do sub-regulação da síntese de IgE total.

[0012]Exemplo 1: Novos anticorpos monoclonais anti-CεmX ligantes a sítios antigênicos outros que RADWPGPP

[0013]Para induzir imuno respostas anti-CεmX, camundongos BALB/c foram imunizados duas vezes por via subcutânea com 50 mg de proteínas mlgE.FcL recom- binantes solubilizadas em n-undecila-β-d-maltopiranosida (UDM; Anatrace) que foram emulsionadas em adjuvante TiterMax Gold (Sigma-Aldrich) de acordo com sugestões do fabricante em intervalos de 2 semanas. Evitamos o protocolo de hiper-imunização, tal que os camundongos não puderam produzir anticorpos somente no sentido do epí- topo dominante RADWPGPP. Um reforço final foi dado intraperitonealmente com 0,1 mg de Proteínas recombinantes mlgE.FcL UDM-solubilizadas sem adjuvante. Um dia antes da fusão, as células NSO foram ressemeadas em meio DMEM fresco (Invitro- gen) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS; Invitrogen), e 1% de mistura penicilina-estreptomicina (100x solução Pen-Strep; Invitrogen) em uma densidade celular de 5X105 células/mL. Três dias após o impulso final, as células do baço de dois camundongos imunizados foram colhidas e lavadas com meio DMEM livre de soro duas vezes. 5X107 células NSO foram colhidos e lavados com soro meio sem DMEM duas vezes. Após a lavagem, as células do baço e células NSO foram fundidas, adicionando 1 mL de polietilenoglicerol 1500 pré-aquecido (PEG 1500, Roche Applied Science), enquanto agitando continuamente as células delicadamente com a ponta da pipeta por mais 1 min, agitando as células por mais 1 minuto, adicionando 2 mL de DMEM pré-aquecido sem soro por mais 2 min e, finalmente, adicionando 8 mL de DMEM livre de soro por mais 2 min. Após centrifugação a 200 xg por 10 min, as células foram fundidas ressuspensas com 600 mL de meio HAT [meio DMEM suplementado com 2% mistura hipoxantina-aminopterin-timidina (solu-ção HAT de 50 x; "Invitrogen), 10% BM-Condimed H1 (Roche Ciências Aplicadas), 10% FBS inativado pelo calor e 1% de mistura penicilina-estreptomicina], distribuídos em 30 placas de 96 cavas de cultura a 200 mL/cava. Nos dias 3, 100 μL do meio HAT foi adicionado a cada cava. Em dias 7 e 10, o meio era refrescado mediante aspiração da metade do volume de cada cava e substituição com meio HAT. Nos dias 14, os sobrenadantes hibridoma foram usados para triagem de mAbs anti-CεmX quanto a ligação às proteínas mlgE.Fcs ou mlgE.FcL UDM-solubilizadas através de ensaio imu- nosorvente articulado por enzima (ELISA).

[0014]Para a triagem de hibridomas secretores de anti-CεmX mAbs por ELISA, purificadas proteínas mlgE.FcL ou mlgE.Fcs UDM-solubilizadas foram reves-tidas em placas de 96 cavas Maxisorp (Nunc) a 50 ng/cava em 0,1 M NaCO3 (pH 9,6) a 40 °C durante a noite. Cavidades foram bloqueadas por 200 μL/cava de 1% BSA% em PBS à temperatura ambiente por 1 hora. Placas foram lavadas três vezes com 200 μL/cava de PBS com 0,05% Tween-20, seguido pela adição de 100μl de sobrenadante hibridoma às cavas. A incubação foi realizada à temperatura ambiente por 2 horas. Todos os cavas foram aspirados e lavados seis vezes com 200 μL/cava de PBS com 0,05% Tween-20. As placas foram incubadas com uma diluição de 1:10.000 do conjugado de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo HRP-conjugado (Chemicon) por 1 hora (100 μL/cava). Em seguida, todas as cavas foram aspiradas e lavadas seis vezes com 200 μL/cava de PBS com 0,05% Tween-20. Finalmente, as cavas foram desenvolvidas por 50 μL/cava de solução de substrato tetrametil benzidina (TMB) (Su- reBlue ™, KPL) e a reação foi interrompida pela adição de 50 μL/cava de HCl 1N. A absorbância foi medida em OD450 em um leitor de ELISA. Dos > de 4000 clones hibridoma ensaiados a partir de duas fusões, 17 cones apresentaram especificidade para mlgE.FcL UDM-solubilizado em lugar de mlgE.Fcs conforme determinado por ELISA.

[0015]Para explorar a especificidade do anti-CεmX mAbs relativamente a CεmX, os diversos clones CεmX-especificos foram então testados quanto a reativi- dade com três peptídeos sintéticos, o que representa três segmentos consecutivos de CεmX, dividido por resíduo C localizado no resíduo # 18 e um segmento de CHC nos resíduos # 39-41. Especificamente, o peptídeo Pl contém os últimos quatro resíduos de aminoácidos de CH4 e de mε e os primeiros 17 resíduos de aminoácidos (# 17/01), a saber, GLAGGSAQSQRAPDRVL, de CεmX; peptídeo P2 contém 20 resíduos de aminoácidos # 19-38, ou seja, HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR, de CεmX; peptídeo P3 contém os 11 resíduos aminoácidos terminais (# 42-52), ou seja, GAGRAD WPGPP, de CεmX e os 4 primeiros resíduos aminoácidos da região migis consecutivos, ou seja, a região extracelular N-terminal do peptídeo âncora da membrana da cadeia mε. Todos os peptídeos foram sintetizados em Genomics Research Center, Academia Sinica (Taipei, Taiwan). Os peptídeos foram reconstituídos com PBS na concentração de 10 mg/mL. Todos os peptídeos foram revestidos em placas de 96 cavas Maxisorp a 500 ng/cava em 0,1 M NaCO3 (pH 9,6) a 40 °C durante a noite. Cavidades foram bloqueados por 200 mL/cava de uma BSA% em PBS à temperatura ambiente por 1 hora. Placas foram lavadas três vezes com 200 μL/cava de PBS com 0,05% Tween-20, seguido pela adição de 100 μL de 1 mg/mL anti-CεmX mAbs aos cavas. A incubação foi realizada à temperatura ambiente por 2 horas. Todas as cavas foram aspiradas e lavadas seis vezes com 200 mL/cava de PBS com 0,05% Tween- 20. As placas foram incubadas com um 1:10.000 diluição de anticorpo de cabra anti- IgG de camundongo HRP-conjugado por 1 hora. Depois de seis vezes com 200 μL/cava de PBS com 0,05% Tween-20, 50 μL/cava de solução de substrato TMB foi adicionado nas cavas. A reação foi interrompida pela adição de 50 μL/cava de HCl 1N. A absorbância foi medida em OD4S0 em um leitor ELISA. Dos muitos anticorpos CεmX-monoclonais específicos preparados em nossos experimentos, apenas 4Bl 2 e 26H2 não reagem com RADWPGPP contendo peptídeo e o P3. 4BL dois reagiram com peptídeo P1, e 26H2 com peptídeo P2. Todos os demais anticorpos monoclonais CεmX-especificos reagiram com P3 (Figura 1). Assim, RADWPGPP é realmente um epítopo imunogênico dominante. No entanto, ele não é o único epítopo imunogênico.

[0016]Exemplo 2: 4Bl 2 e 26H2 se ligam a mlgE em células B que expressam mlgE

[0017]Foi ainda testada a capacidade dos diversos anticorpos CεmX- mono- clonais específicos para ligar às linhagens celulares de CHO e Ramos que foram transfectadas com DNA recombinante ou codificação mεL(CH2-CM) ou mεs(CH2- CM). As duas linhagens de células CHO transfectadas respectivamente produziram respectivamente mlgE.FcL ou mlgE.Fcs, ambas as quais não formam receptores cé-lulas B com co-receptores tais como Igα e Igβ, porque as células CHO não expressam essas proteínas. As duas transfectadas linhagens de células produziram respectiva-mente mlgE.FcL ou mlgE.Fcs, ambas as quais formam complexos com seus co-re- ceptores naturais. Para investigar a ligação do anti-CεmX mAbs aos nativos CεmX, células CHO ou Ramos que expressam mlgE.FcL ou mlgE.Fcs foram ressuspensas em tampão FACS [PBS, 1% FBS, azida de sódio a 0,1%, e 2 mM EDTA (pH 8,0)] a uma densidade de células de 107 células/mL. 106 células foram então incubadas por 30 min no gelo com 100 μL de sobrenadante hibridoma, seguido por lavagem com tampão FACS. Anticorpos ligados foram detectados por incubação por 30 minutos no gelo com fragmento F(ab’)2 FITC-marcado de coelho específico para IgG (ABD Se- crotec), seguido de lavagem por duas vezes com tampão FACS antes da análise. Experimentos de citometria de fluxo foram realizados usando um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Bioscience) e analisados utilizando software FCSExpress (Software De Novo). A Au dos anticorpos monoclonais CεmX-específicos não foram encontrados para se ligar a células CHO e Ramos que expressam mlgE.Fcs. Todos os anticorpos monoclonais CεmX-especificos foram verificados se ligarem a células CHO expressando mIgEL. No entanto, apenas 4Bl 2 e 26H2 puderam se ligar a células Ramos expressando mlgE.FcL, enquanto todos os outros anticorpos monoclonais CεmX-específicos não puderam se ligar a células Ramos expressando mlgE.FcL (Figura 2).

[0018]Exemplo 3: 4Bl 2 e 26H2 induzir anticorpos contra a citotoxicidade ce-lular dependente células B expressando mlgE

[0019]Para investigar a atividade ADCC de anti-CεmX mAbs quimérico, usa-mos células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) como células efetoras para atingir células mlgE.FcL que expressam Ramos. PBMCs foram purificados a partir de revestimentos de células brancas de doadores saudáveis (Banco de Sangue de Taiwan) por centrifugação em um gradiente de densidade em placa de Ficoll- Plus (GE Healthcare) e criopreservados em 90% FBS/10% DMSO (Hybri-Max ™; Sigma-Aldrich). Antes do uso, PBMCs foram descongeladas e cultivadas em 2x106 células/mL durante a noite em meio IMDM (Invitrogen) suplementado com 10% inativado pelo calor FBS e 1% de mistura penicilina-estreptomicina. Para identificar as células-alvo em co-cultura com PBMCs, células mlgE.FcL expressando Ramos foram marcadas com 2,5 μM diacetato de 5-(e -6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidila (CFDA, SE; Invitrogen) em 0,1% BS A/PBS por 10 min a 37 °C. Após três lavagens com meio RPMI em água fria (Invitrogen), contendo 10% FBS, as células foram ajustadas a 105 células/mL. Para as efetivas titulações de relações (E/T), 20.000 células marcadas em 200 μL de meio RPMI completo foram revestidas com anticorpos de 1 μg/mL por 30 min a 37 °C, em seguida, combinados com um volume igual de PBMCs em várias relações E/T de 50 a 3,125. Para titulações de anticorpos, 20.000 células marcadas em 200 μL em meio RPMI completo foram opsonizadas com anticorpos em várias concentrações (1.000-0,01 ng/mL) durante 30 minutos a 37 °C, e então combinados com PBMCs em uma relação E/T de 25:1. Para medir a morte independentemente de anticorpos, as células-alvo marcadas também foram incubadas com PBMCs na au-sência de anticorpos em dadas relações E/T. No final de 24 horas de incubação, as células mortas foram coradas com 2,5 mg/mL 7-amino actinomicina (7-AAD; Invitro- gen) por 15 min no gelo. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo FACS- Canto II Becton Dickinson. Células-alvo vivas foram definidas como a percentagem de células CFSE-positivas/7-AAD-negativa em análises do tipo “dot-plot”. A percentagem de células mortas em uma dada relação E/T foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: 100 x [(% de células-alvo vivas no controle anticorpo-independente - % de células vivas alvo na amostra)/% das células alvo vivas no controle anticorpo- independente]. A atividade de ADCC c4B12, c26H2 e omalizumabe foi observada em várias relações E/T. Em uma relação E/T de 50, c4B12, c26H2 omalizumab e deu até 60% de lise específica, em contraste, CA20 foi menos ativo e deu apenas 10-20% de lise específica (Figura 3A). Além disso, uma significativa ADCC foi observada quando a concentração de c4B12 e c26H2 foi superior a 0,01 μg/mL. Na dose máxima de 10 μg/mL, a lise específica de células-alvo por c4B12 e c26H2 variou de 80% a 90%, enquanto CA20 deu até 50% de lise específica (Figura 3B). O controle positivo rituximab, que direcionou a CD20, e omalizumab efetivamente induziu a ADCC em várias relações E/T e em modo dose-resposta. Assim, concluímos que c4B12 e c26H2 são mAbs anti-CεmX mais potentes que CA20 em mediar ADCC e podem recrutar de modo eficiente células efetoras para atingir células B que expressam mlgE in vivo.

[0020]Exemplo 4: Quimérico anti-CεmX mAbs induzir a apoptose de ligada à membrana IgE. FcL células que expressam Ramos

[0021]Para detectar a exposição de fosfatidilserina (PS), células Ramos ex-pressando mIgE. FcL (5x105 células/mL) foram incubadas com anti-CεmX mAbs qui-mérico, os anticorpos omalizumab ou controle em concentrações indicadas em meio de cultura completo por uma hora a 37 °C. As células foram então tratadas com frag-mento F(ab')2 de cabra específico para o fragmento Fc da IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) na concentração de 10 μg/mL e incubadas por mais 24 horas a 37 °C. A detecção da exposição a fosfatidilserina (PS) foi avaliada pela coloração de células em 200 μL de tampão anexina [10 mM HEPES/NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2] contendo fluoresceína isotiocianato (FITC) marcado com anexina V (Bio Vision), diluído 1/200 e 2,5 mg/mL de iodeto de propídio (PI, Sigma-Aldrich) por 15 min no escuro à temperatura ambiente. As células foram anali-sadas em um citômetro de fluxo FACSCanto II. Células apoptóticas foram definidas como a percentagem de células anexina V-positiva/PI-negativa em análises de mar-cação por pontos. Aproximadamente 80% das células Ramos que expressam mlgE.FcL foram mortas através da apoptose pelo aumento da concentração de c4B12, c26H2, ou omalizumab, mas não com CA20, com indução máxima em 1 μg/mL (Figura 4A).

[0022]Para a detecção de núcleos apoptóticos, células Ramos expressando mlgE.FcL (5x105 células/mL) foram incubadas com anti-CεmX mAbs quimérico, os anticorpos omalizumab ou controle em uma concentração de 1 μg/mL em meio de cultura completo para uma hora a 37 °C. As células foram então tratadas com frag-mento F(ab')2 de cabra específico para o fragmento Fc de IgG humana em uma con-centração final de 10 μg/mL e incubadas por mais 48 horas a 37 °C. 5X105 células foram incubadas em 0,5 mL de iodeto de propídio solução (PI)/Triton (citrato de sódio 0,1%, 0,1% Triton X-100, 15 mg/mL PI, e 100 mg/mL em PBS RNase A, todos da Sigma-Aldrich) por uma hora no escuro sobre o gelo. A fluorescência PI foi determi-nada em um citômetro de fluxo FACSCanto II. O conteúdo de DNA intacto dos núcleos foi registrado em uma escala linear. Núcleos apoptóticos contendo emissores hipodi- plóides de fluorescência de DNA nos canais abaixo do pico G0ZG1 foram enumerados como uma porcentagem da população total. Um aumento significativo na população de células com DNA hipodiplóides foi observada em c4B12, c26H2, ou em células Ramos expressando mlgE.FcL tratadas com omalizumab (Figura 4B).

[0023]Para a detecção de caspase 3 e clivagem poli(ADP-ribose)polimerase (PARP), células Ramos expressando mlgE.FcL (5x105 células/mL) foram incubadas com anti-CεmX mAbs quimérico, anticorpos omalizumab ou controle em uma concentração de 1 μg/mL em meio de cultura completo por uma hora a 37 °C. As células foram então tratadas com fragmento F(ab')2 de cabra específico para o fragmento Fc de IgG humana em uma concentração final de 10 μg/mL e incubadas por mais 24 horas a 37 °C. 5x106 células foram lavadas em PBS gelado e ressuspensas em 100 μL de tampão de lise RIPA modificado resfriado em gelo [20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, desoxicolato 0,5%, sulfato de sódio a 0,1% dodecil (SDS), 5 mM inibidor EDTA, e protease (Sigma-Aldrich)]. Os lisados foram incubados por 20 min no gelo. Amostras foram centrifugadas por 20 min em 16000xg e 4 °C. Os sobre- nadantes foram transferidos para um tubo de 1,5 mL fresco e armazenado a -80 °C. A quantidade de proteína em cada lisado clarificado foi quantificada usando o ensaio Protein DC (Bio-Rad Laboratories) de acordo com sugestões do fabricante. Cada amostra foi normalizada quanto ao teor de proteína total e foi submetido a SDS- eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido de transferência para membranas PVDF (GE Healthcare). Anticorpos policlonais de coelho para caspase-3 e PARP foram obtidos a partir de Cell Signaling Techonology e foram usados em 1:500 diluições. Anticorpos secundários de cabra anti-IgG de coelho HRP-conjugado (Sigma-Aldrich) foi usado em 1:10.000 diluições. Membranas foram desenvolvidas com um reagente ECL (Immobilon ™ ocidental; Millipore). A carga de proteína equivalente foi verificada examinando o borrão com um anticorpo para β-actina (Sigma- Aldrich). 24 horas após mIgE.FcL células que expressam Ramos foram tratados por c4B12, c26H2 e omalizumab, ao invés de CA20, a clivagem da caspase-3 como fragmentos Mx 19- e 17-kDa ficou evidente. Além disso, a clivagem de PARP foi detectável em c4B12, c26H2, e tratados com células Ramos expressando mlgE.FcL tratadas com omalizumabe usando um anticorpo reconheceu o PARP MX 116 kDa intacto e o produto de clivagem Mx 89 kDa (Figura 4C).

Breve Descrição das Figuras

[0024]A Figura 1 mostra os três peptídeos sintéticos representando os seg-mentos consecutivos de CεmX e a reatividade de vários anti-CεmX mAbs com os pep- tídeos. Os resíduos de aminoácidos do domínio CεmX são mostrados em negrito.

[0025]A Figura 2 mostra a ligação de vários anti-CεmX mAbs de linhagens de células CHO ou Ramos que expressam mlgE.FcL ou mlgE.Fcs.

[0026]A Figura 3 mostra que c4B12 quimérico e c26H2 induzem ADCC contra células Ramos que expressam mlgE.FcL em várias relações E/T. Figura 3B mostra que quiméricos c4B12 e c26H2 induzem ADCC contra células Ramos que expressam mlgE.FcL de maneira dose-resposta.

[0027]A Figura 4 mostra que a exposição PS induzida por quiméricos c4B12 e c26H2 em células Ramos que expressam mlgE.FcL é dose-dependente. Figura 4B mostra que os núcleos apoptóticos foram observados em quiméricos c4B12 e c26H2 tratados com células Ramos expressando mlgE.FcL. A Figura 4C mostra que a cliva-gem da caspase 3 e PARP foram observados em quiméricos c4B12 e c26H2 tratados com células Ramos expressando mlgE.FcL.

[0028]Figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos de VL e VH de mouse gerador 4B1 2, os escolhidos modelos de linhagens germinativas hu-manas KV2 e HV4 para VL e VH, respectivamente, e o 4BL humanizado 2 (hu4B12), rotulados como "Replace" nos alinhamentos. Este hu4B12 tem a mesma afinidade de ligação para proteínas recombinantes CεmX e células Ramos que expressam mlgE.FcL como 4B 12 quimérico (C4b 12). Referências mencionadas a documentos de Patentes Relacionados US 5,091,313 2/1992 Chang US 5,254,671 10/1993 Chang US 5,260,416 11/1993 Chang US 5,274,075 12/1993 Chang US 5,292,867 3/1994 Chang US 5,342,924 8/1994 Chang US 2009/0010924A1 Wu

Outras referências

[0029]Davis FM, Gossett LA, Chang TW (1991) An epitope on membrane-bound but not secreted IgE: implications in isotype-specific regulation. Bio/Technology 9: 53-56.

[0030]Peng C, Davis FM, Sun LK, Liou RS, Kim YW, Chang TW (1992) A new isoform of human membrane-bound IgE. J Immunol 148: 129-136.

[0031]Chen, H.Y., Liu, F.T., Hou, C.M.H., Huang, J.S.W., Sharma, B.B., and Chang, TW. (2002) Monoclonal antibodies against CεmX domain in human mem-brane-bound IgE and their potential on targeting IgE-expressing B cells. Int. Archives Allergy & Immunol. 128, 315-324.

Claims

1. Anticorpo CεmX-especifico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que é capaz de se ligar a IgE ligada à membrana de linfócitos B humanos e incapaz de se ligar ao peptídeo RADWPGPP, e ainda é capaz de se ligar a GLAGGSAQSQRAPDRVL (SEQ ID NO: 2), em que o anticorpo compreende as regiões hipervariáveis de cadeia leve apresentadas pelos aminoácidos nas posições 24 a 39 da SEQ ID NO: 5 (CDRL1), os aminoácidos nas posições 55 a 61 da SEQ ID NO: 5 (CDRL2) e os aminoácidos nas posições 94 a 102 da SEQ ID NO: 5 (CDRL3), e as regiões hipervariáveis de cadeia pesada apresentadas pelos amino- ácidos nas posições 26 a 36 da SEQ ID NO: 8 (CDRH1), os aminoácidos nas posições 51 a 66 da SEQ ID NO: 8 (CDRH2) e os aminoácidos nas posições 98 a 106 da SEQ ID NO: 8 (CDRH3).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo as regiões variáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo e regiões constantes de anticorpos huma-nos.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado que compreende essen-cialmente as regiões hipervariáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo e as regiões framework e regiões constantes de anticorpos humanos.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento é um Fab, F(ab)’2 ou Fv de cadeia única.

7. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme defi-nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um medicamento para tratar doenças mediadas por IgE.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que as doenças mediadas por IgE são asma alérgica, rinite alérgica ou dermatite atópica.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que as doenças mediadas por IgE são urticária induzida pelo frio, urticária crônica, urticária colinérgica, rinossinusite crônica, mastocitose sistêmica, mastocitose cutânea, asper- gilose broncopulmonar alérgica, angioedema idiopática recorrente, cistite intersticial ou distúrbios gastrointestinais associados aos eosinófilos.

10. Uso de um imunogênico contendo GLAGGSAQSQRAPDRVL (SEQ ID NO: 2) ou um análogo com propriedade antigênica similar, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um medicamento para induzir resposta imune em pacientes in vivo, em que o imunogênico compreende as regiões hipervariáveis de cadeia leve apresentadas pelos aminoácidos nas posições 24 a 39 da SEQ ID NO: 5 (CDRL1), os aminoácidos nas posições 55 a 61 da SEQ ID NO: 5 (CDRL2) e os ami- noácidos nas posições 94 a 102 da SEQ ID NO: 5 (CDRL3), e as regiões hipervariá- veis de cadeia pesada apresentadas pelos aminoácidos nas posições 26 a 36 da SEQ ID NO: 8 (CDRH1), os aminoácidos nas posições 51 a 66 da SEQ ID NO: 8 (CDRH2) e os aminoácidos nas posições 98 a 106 da SEQ ID NO: 8 (CDRH3).

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindi-cação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga a IgE ligada à mem-brana de linfócitos B humanos.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindi-cação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.