CZ20013082A3 - Peptid - Google Patents

Peptid Download PDF

Info

Publication number
CZ20013082A3
CZ20013082A3 CZ20013082A CZ20013082A CZ20013082A3 CZ 20013082 A3 CZ20013082 A3 CZ 20013082A3 CZ 20013082 A CZ20013082 A CZ 20013082A CZ 20013082 A CZ20013082 A CZ 20013082A CZ 20013082 A3 CZ20013082 A3 CZ 20013082A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ige
peptide
mimotope
seq
epitope
Prior art date
Application number
CZ20013082A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Dyson
Martin Friede
Judith Greenwood
Ellen Hewitt
Alan Lamont
Sean Mason
Roger Randall
William Gordon Turnell
Mechelen Marcelle Paulette Van
De Bassols Carlota Vinalsy
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Peptide Therapeutics Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9904405.9A external-priority patent/GB9904405D0/en
Priority claimed from GBGB9907151.6A external-priority patent/GB9907151D0/en
Priority claimed from GBGB9910537.1A external-priority patent/GB9910537D0/en
Priority claimed from GBGB9910538.9A external-priority patent/GB9910538D0/en
Priority claimed from GBGB9918603.3A external-priority patent/GB9918603D0/en
Priority claimed from GBGB9918594.4A external-priority patent/GB9918594D0/en
Priority claimed from GBGB9921047.8A external-priority patent/GB9921047D0/en
Priority claimed from GBGB9921046.0A external-priority patent/GB9921046D0/en
Priority claimed from GBGB9925619.0A external-priority patent/GB9925619D0/en
Priority claimed from GBGB9927698.2A external-priority patent/GB9927698D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A., Peptide Therapeutics Limited filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ20013082A3 publication Critical patent/CZ20013082A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká poskytnutí nových léků pro léčení, prevenci nebo zmírnění alergického onemocnění. Novými léky jsou konkrétně izolované peptidy obsahující epitopy nebo mimotopy povrchových oblastí domény Cc2 IgE. Autoři vynálezu zjistili, že tyto nové oblasti mohou být cílové jak pro pasivní, tak i aktivní imunoprofylaxi nebo imunoterapii. Vynález se dále týká způsobů výroby těchto léků, farmaceutických prostředků s jejich obsahem a jejich použití v lékařství. Jedno provedení předkládaného vynálezu se také týká ligandů, zvláště monoklonálních protilátek, které jsou schopny vazby na povrchové oblasti IgE podle předkládaného vynálezu, a jejich použití v lékařství pro pasivní imunoterapii nebo při imunoprofylaxi. Jedním provedením předkládaného vynálezu jsou také nepeptidové mimotopy.
Dosavadní stav techniky
Při alergické odpovědi jsou příznaky běžně spojované s alergií způsobeny uvolňováním alergických mediátorů, jako je histamin, z imunitních buněk do obklopujících tkání a cévních struktur. Histamin se normálně uchovává v žírných buňkách a basofilech, do té doby, než se interakcí s IgE specifickým pro alergen spustí jeho uvolňování. Úloha IgE při vyvolávání alergických odpovědí jako je astma, alergie na potraviny, atopické dermatitidy, hypersenzitivita typu-l a alergická rýma, je dobře známa. Při styku s antigenem jako je pyl nebo prach obsahující alergeny roztočů provádějí B-buňky syntézu IgE specifických pro alergen. IgE specifický pro alergen se potom váže na receptor FcsRI (receptor pro IgE s vysokou afinitou) na basofilech ·· · · ·· · • · ·· ·· · ··· • · · · · · ·· · 9 9 9 9 9 • · · · · · ···· ··· 999 99 999 a žírných buňkách. Jakékoli další setkání s alergenem vede ke spuštění uvolňování histaminu ze žírných buněk nebo basofilů přemostěním sousedících komplexů IgE/FccRI (Sutton a Gould, Nátuře, 1993, 366: 421 - 428; EP 0 477 231 B1).
IgE jako všechny imunoglobuliny obsahuje dva těžké a dva lehké řetězce. Těžký řetězec ε se skládá z pěti domén: jedné variabilní domény (VH) a čtyř konstantních domén (Cs1 až Cs4). Molekulová hmotnost IgE je přibližně 190 000 Da (190 000), těžký řetězec má délku přibližně 550 aminokyselin. Struktura IgE je diskutována v io článku Padlan a Davis (Mol. Immunol., 23, 1063 - 75, 1986) a Helm a další (struktura modelu 2lgE uložena 2/10/90 u PDB (Protein Data Bank, Research Collabarotory for Structural Bioinformatics; http:\pdbbrowsers.ebi.ac.uk)). Druhá doména, Cs2, obsahuje přibližně aminokyseliny 226 - 328 IgE (Flanagan J. G. a Rabbitts, T. H., 1982, 15 EMBO J., 1, 655 - 660; Kenten a další, 1982, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79, 6661 - 6665), ale může zahrnovat další aminokyseliny. Porovnáním známé struktury lgG1 lze odvodit, že počáteční místo domény Οε3 je Ser337.
V minulosti byl se střídavými úspěchy prováděn velký počet pasivních nebo aktivních imunoterapeutických přístupů navržených pro intervefenci s mechanismem uvolňování histaminu zprostředkovaným IgE. Tyto přístupy zahrnují interferenci s IgE nebo komplexy alergen/lgE, které se vážou na FcsRI nebo Fc8RII (receptor IgE s nízkou afinitou), buď s pasivně podávanými protilátkami, nebo pasivně podávanými peptidy odvozenými z IgE, pro kompetitivní vazbu na receptory. Navíc někteří autoři popsali použití specifických peptidů odvozených od IgE při aktivní imunizaci pro stimulaci imunitních odpovědí inhibujících uvolňování histaminu.
Bylo uváděno, že domény IgE, které se účastní vazby IgE na receptor pro IgE, jsou Οε3 a Οε4 (Sutton, B. J. a Gould, H. J., Nátuře,
1993, 366: 421 - 428; WO 97/31948), a dosavadní strategie při léčení se tedy soustředily na části těchto dvou domén.
V průběhu těchto výzkumů se pracovníci v tomto oboru setkali s řadou podmínek a potíží, které je nutno brát v úvahu při navrhování nových antialergických terapií. Jeden z nejnebezpečnějších problémů se týká účasti přemostění IgE v signálu uvolňujícím histamin. Nejčastěji se stává, že protilátky anti-lgE vytvořené při aktivní vakcinaci jsou schopny spustit uvolňování histaminu samy o sobě, zesítěním sousedících komplexů IgE-receptor v nepřítomnosti alergenu. Tento jev se nazývá anafylaktogenicita. Mnoho komerčně dostupných monoklonálních protilátek anti-lgE, které se normálně používají pro detekci IgE, jsou ovšem anafylaktogenní, a jsou tedy nepoužitelné a potenciálně nebezpečné při podávání pacientovi.
Zda protilátka anafylaktogenní je nebo není, závisí na umístění cílového epitopu na molekule IgE. Na základě současného stavu znalostí v této oblasti a přes enormní vědecký zájem a úsilí však je pouze malá nebo vůbec žádná možnost předpovědět, jaké vlastnosti může mít nějaká protilátka nebo epitop, a zda by mohly mít kladný nebo záporný klinický účinek na pacienta.
Proto se musí z důvodu bezpečnosti a účinnosti vázat pasivně podávané nebo vakcínami indukované protilátky v oblasti IgE, která je schopna interferovat s biochemickou cestou spouštění histaminu, aniž by byly samy o sobě anafylaktické. Předkládaný vynález dosahuje všech těchto cílů a poskytuje farmaceutické prostředky, které jsou schopny vyvolat tvorbu neanafylaktických protilátek, které inhibují uvolňování histaminu. Tyto farmaceutické prostředky mohou tvořit základ aktivní vakcíny nebo mohou být použity pro vyvolání tvorby příslušných protilátek pro pasivní imunoterapii, nebo mohou být samotné pasivně podávány pro terapeutický účinek.
Odborníci v oboru již provedli mnoho práce pro identifikaci specifických protilátek anti-lgE, které mají nějaké prospěšné účinky •· » · ·· ·· ···· • · ♦ · · ·· • «· * · · · ··
4· · · · · ··
- ··· ···· ··· «·· ·· ·»· proti alergické reakci zprostředkované IgE (WO 90/15878, WO 89/04834, WO 93/05810). Byly také prováděny pokusy o identifikaci epitopů rozpoznávaných těmito použitelnými protilátkami pro vytvoření peptidových mimotopů těchto epitopů a pro jejich použití jako 5 imunogenů pro produkci protilátek anti-lgE.
WO 97/31948 popisuje příklad tohoto typu práce a dále poskytuje peptidy IgE z domén Cs3 a Cs4 konjugovaných na nosné molekuly pro účely aktivní vakcinace. Tyto imunogeny mohou být použity při studiích vakcinace a uvádí se, že jsou schopny vytvořit io protilátky, které následně inhibují uvolňování histaminu in vivo. Při této práci byla popsána monoklonální protilátka (BSW17), o které se uvádělo, že je schopna vázat se na peptidy IgE obsažené uvnitř domény Cs3, které jsou použitelné pro účely aktivní vakcinace.
EP 0 477 231 B1 popisuje imunogeny odvozené od domény Cs4 15 IgE (zbytky 497 - 506, známé také jako Stanworthův dekapeptid), konjugované k látce Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) používané při aktivní vakcinační imunoprofylaxi. WO 96/14333 pokračuje v práci popisované v EP 0 477 231 B1.
Další přístupy jsou založeny na identifikaci peptidů, které samy 20 soutěží o vazbu IgE na receptory s vysokou nebo nízkou afinitou na basofilech nebo žírných buňkách (WO 93/04173, WO 98/24808, EP 0 303 625 B1, EP 0 341 290).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález identifikuje nové epitopy exponované na povrchu domény Ce2 IgE, které mohou být použity jako cíl pro aktivní nebo pasivní imunoprofylaxi nebo terapii alergických stavů onemocnění. Předkládaný vynález poskytuje peptidy zahrnující izolované epitopy jako takové, a dále poskytuje mimotopy těchto nově
3o identifikovaných epitopů, které mohou být jako takové použity při ♦
r- » · · · · ♦ 9
-Q - ······· «99 «99 9 · 999 léčení alergie, nebo mohou být použity v imunogenech při aktivní vakcinační imunoprofylaxi nebo terapii. Izolované epitopy nebo mimodopy podle předkládaného vynálezu se s výhodou používají v imunogenech pro aktivní vakcinační protokoly pro indukci vlastních protilátek anti-lgE, které samy omezují, snižují nebo odstraňují alergické odpovědi nebo příznaky u vakcinovaných pacientů. Alternativně mohou být mimotopy imunogenů podle předkládaného vynálezu pasivně podávány pacientovi pro omezení, snížení nebo odstranění alergických odpovědí nebo příznaků u vakcinovaných subjektů.
Peptidy, které obsahují izolované epitopy podle předkládaného vynálezu jsou imunogenní, jestliže se vhodně podávají (například na nosiči), a jsou schopny indukovat vlastní protilátky anti-lgE, které jsou neanafylaktogenní a fungují při zmírňování alergických odpovědí in vivo. Epitopy nebo mimotopy podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou odvozeny výlučně z domény Cs2, tím, že nejsou odvozeny z jiné domény, tj. nenacházejí se v doménách Οε1, Οε3 nebo Cs4. Ve výhodném provedení jsou odvozeny zvláště od domény kódované zbytky Ser222-Ala329 lidského IgE.
Specifické epitopy domény Cε2, u kterých se zjistilo, že jsou zvláště vhodné pro použití v mimotopech nebo imunogenech podle předkládaného vynálezu, jsou ty epitopy, u kterých autoři předkládaného vynálezu zjistili, že jsou exponovány na povrchu. Expozice oblasti IgE na povrchu může být určena z modelové struktury (Padlan a Davies, Mol. Immunol., 23, 1063 - 75, 1986; Helm a další, modelová struktura 2lgE uložená 2/10/90 u PDB (Protein Data Bank, Research Collabarotory for Structural Bioinformatics)). Autoři předkládaného vynálezu zjistili, že epitopy použitelné v rámci předkládaného vynálezu jsou také vysoce exponovány na povrchu. Z tohoto pozorování autoři vynálezu navrhli způsob poskytnutí dalších vhodných epitopů, tedy epitopů s vysoce dostupnými oblastmi vypočtenými na základě posouvajícího se okénka pěti zbytků. Autoři vynálezu zjistili, že výhodné oblasti domény Οε2 mají přístupný povrch vypočtený pomocí posuvného okénka pěti zbytků, s použitím softwaru Molecular Simulations Software (MSI), větší než 50 A2, a s výhodou větší než 80 A2 (0,5, popřípadě 0,8 nm2).
Příklady těchto Cs2 IgE epitopů exponovaných na povrchu jsou:
Název peptidu Sekvence Umístění sekvence a domény IgE SEQ ID No.
P1 EDGQVMDVD Ce2 (Glu270-Asp278) 1
P2 STTQEGEL Ce2 (Ser283-Leu290) 2
P3 SQKHWLSDRT Ce2 (Ser300-Thr309) 3
P4 GHTFEDSTKK Ce2 (Gly318-Lys327) 4
P5 GGGHFPPT Ce2 (Gly245-Thr250) 5
P6 PGTINI Ce2 (Pro262-lle267) 6
P7 FTPPT Ce2 (Phe231-Thr235) 7
Peptidy obsahující tyto epitopy tvoří výhodné provedení předkládaného vynálezu. Část předkládaného vynálezu tvoří také mimotopy, které mají stejné vlastnosti jako epitopy, a imunogeny obsahující tyto mimotopy, které vytvářejí imunitní odpověď křížově reagující s epitopem IgE Οε2 v souvislosti s molekulou IgE.
Předkládaný vynález proto zahrnuje izolované peptidy obsahující nativní IgE epitopy jako takové, a jakýkoli jejich mimotop. Význam slova mimotop je definován jako jednotka, která je dostatečně podobná nativnímu epitopu IgE, takže je schopná být rozpoznána protilátkami, které rozpoznávají nativní epitop IgE; (Gheysen, Η. M., a další, 1986, Synthetic Peptids as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, str. 130 - 149; Gheysen, Η. M., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709 - 715); nebo jsou schopné vyvolávat
tvorbu protilátek, jestliže jsou navázány na vhodný nosič, kde tyto protilátky křížově reagují s nativním epitopem IgE.
Mimotopy podle předkládaného vynálezu mohou být peptidické nebo nepeptidické. Peptidický mimotop epitopů IgE exponovaných na povrchu definovaných výše může mít sekvenci, která se liší od nativního epitopu, ale může mít také úplně stejnou sekvenci jako nativní epitop. Taková molekula se popisuje jako mimotop epitopu, protože i když tyto dvě molekuly sdílejí stejnou sekvenci, mimotop nebude prezentován v souvislosti s úplnou strukturou domény Cs2, a mimotop jako takový může mít mírně odlišnou konformaci od konformace nativního epitopu IgE. Odborníkovi v oboru bude také zřejmé, že výše identifikované přímé sekvence (P1 až P7), jestliže mají terciární strukturu IgE, leží v sousedství jiných oblastí, které mohou být vzdálené od primární sekvence IgE. Například mimotop peptidů P1 může být jako takový kontinuální nebo diskontinuální, v tom, že obsahuje úseky napodobující P1 a úseky vytvořené z těchto vzdálených aminokyselinových zbytků.
Výhodné oblasti exponované na povrchu, které mohou být použity v předkládaném vynálezu obsahují oblasti, které jsou spojené smyčkovou strukturou. Peptidy nebo mimotopy podle předkládaného vynálezu mohou proto obsahovat smyčku s N- nebo C-koncovými prodlouženími, které mohou být přirozené zbytky aminokyselin ze sousedících β-listů. Příklady tohoto jevu jsou peptid P1 obsahující smyčku C-D, P2 obsahující smyčku D-E, P3 obsahující smyčku E-F, P4 obsahující smyčku F-G, P5 obsahující smyčku A-B a P6 obsahující smyčku B-C domény Cs2 IgE. Mimotopy těchto smyček tedy tvoří provedení předkládaného vynálezu.
Zvláště výhodné farmaceutické prostředky jsou založeny na epitopu P1 a jeho mimotopech. Peptidy obsahující tento epitop a jeho mimotopy jsou po navázání na nosič schopné indukovat silné imunitní odpovědi anti-lgE, které jsou schopné inhibovat uvolňování histaminu « ·· · · ··φ • φ · φ φφ ·· ···· • · · ♦ φ φ· φ · φ φ · φ · φ· • « « · · ·· ··· ···< φφφ ··· φ» «·Φ z lidských basofilů. Navíc jsou tyto imunitní odpovědi neanafylaktogenní. Mimotopy P1 se primárně popisují jako jakákoli jednotka, která byla formulována za vytvoření imunogenu, je schopna indukovat imunitní odpověď, kde tato odpověď je schopná rozpoznávat P1, jestliže je v souvislosti domény Ce2 IgE.
Peptid P1 odpovídá smyčce C-D domény Cs2. Struktura smyčky C-D záhybů imunoglobulinu odpovídá propojovacímu řetězci mezi koncem beta-řetězce C a počátkem beta-řetězce D (Introduction to protein Structure, str. 304, 2. vydání, Branden a Tooze, Garland Publishing, New York, ISBN 0 8153 2305-0), odpovídajícímu přibližně zbytkům aminokyselin Trp268-Ser280 molekuly IgE. Mimotopy smyčky C-D IgE Cs2 a ligandy jsou tedy schopny vázat se na smyčku C-D IgE Cs2 a tvoří také výhodné provedení předkládaného vynálezu.
Peptidové mimotopy výše uvedených epitopů IgE mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, delecí nebo substitucí vybraných aminokyselin. Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být tedy modifikovány pro účely usnadnění konjugace na proteinový nosič. Pro některé metody chemické konjugace může být například vhodné, jestliže obsahují na epitopu IgE koncový cystein. Navíc může být vhodné, aby peptidy konjugované na proteinový nosič obsahovaly hydrofóbní konec vzdálený od konjugovaného konce peptidů tak, že volný nekonjugovaný konec peptidů zůstává spojený s povrchem nosného proteinu. To snižuje stupeň konformační volnosti peptidů a tím zvyšuje pravděpodobnost, že bude peptid předkládán v takové konformaci, která nejblíže napodobí konformaci peptidů IgE, tak jako se nalézá v souvislosti s celou molekulou IgE. Peptidy mohou být například změněny tak, aby obsahovaly N-koncový cystein a Ckoncový hydrofóbní amidovaný konec, alternativně může být provedena adice nebo substituce D-stereoisomerní formy jedné nebo více aminokyselin pro vytvoření výhodného derivátu, například pro zvýšení stability peptidů. Odborníci v oboru zjistí, že takto
modifikované peptidy nebo mimotopy by mohly být úplně nebo z části nepeptidové mimotopy, jestliže zbytky, které je tvoří, nejsou nutně omezeny na dvacet aminokyselin vyskytujících se v přírodě. Navíc mohou být tyto látky cyklizovány metodami známými v oboru pro 5 přivedení peptidů do konformace, která blízce napodobuje tvar peptidové sekvence v souvislosti s úplnou molekulou IgE. Příklady výhodných cyklických peptidů, které obsahují pár cysteinových zbytků pro umožnění vytvoření disulfidické vazby jsou PT1079 (SEQ ID No. 14), PT1079GS (SEQ ID No. 15), PT1078 (SEQ ID No. 16) a P15q io (SEQ ID No. 11).
Navíc bude odborníkům v oboru zřejmé, že mimotopy nebo imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou být delší než izolované epitopy a mohou obsahovat tam popisované sekvence. Mimotopy podle předkládaného vynálezu mohou tedy obsahovat adice 15 N a/nebo C-koncových prodloužení z celé řady dalších přírodních zbytků na jednom nebo na obou koncích. Peptidové mimotopy mohou také být retrosekvence přírodních sekvencí IgE, tj. sekvence s opačnou orientací; nebo mohou být alternativně tyto sekvence úplně nebo z části tvořeny D-stereoisomerními aminokyselinami (sekvence 20 inverso). Peptidové sekvence mohou být také povahy retro-inverso tím, že je opačná orientace sekvence a aminokyseliny jsou formy Dstereoisomeru. Tyto retro nebo retro-inverso peptidy mají výhodu v tom, že nejsou organismu vlastní a mohou tedy předcházet problémům tolerance vlastního imunitního systému (například P 15r, 25 viz níže).
Peptidové mimotopy mohou být alternativně identifikovány použitím protilátek, které jsou schopny samostatné vazby na epitopy IgE podle předkládaného vynálezu použitím technik jako je „phage display technology“ (EP 0 552 267 B1). Tato technika vytváří velký 30 počet peptidových sekvencí, které napodobují strukturu přirozených peptidů a jsou proto schopny vázat se na anti-nativní peptidové protilátky, ale nemusí nezbytně samy sdílet významnou sekvenční « 9 · · 9 999 • 9 · 9 9 9 9 9* «··
9 9 ·· · 9
99 99999»
9 9 9 · 9· _ 10 -·· “· homologii s nativním peptidem IgE. Tento přístup může mít významné výhody v tom, že dovolí možnost identifikace peptidu se zlepšenými imunogenními vlastnostmi (jako jsou vazebné vlastnosti s vyšší afinitou na receptory IgE nebo protilátky anti-lgE nebo schopnost 5 indukce polyklonální imunitní odpovědi, která poskytuje vazbu na IgE s vyšší afinitou), nebo může předcházet problémům s tolerancí k vlastním antigenům, které mohou být spojeny s použitím přírodních peptidových sekvencí. Tato technologie navíc umožní identifikaci rozpoznávacího schématu pro každý nativní peptid z hlediska jeho io sdílených chemických vlastností mezi sekvencemi rozpoznávaných mimotopů.
Mezi výhodné příklady modifikovaných peptidových mimotopů a příklady mimotopů odvozených od bakteriofágů patří:
Peptid Sekvence Popis SEQ ID No.
P15 cledgqvmdvdll-nh2 P1 mimotop 8
P15r lldvdmvqgdelc-nh2 P1 retro mimotop 9
P15p WLEDGQVMDVDLC P1 mimotop 10
P15q CLEDGQVMDVDLC P1 mimotop 11
C67/8 CFINKQMADLELCPRE P1 mimotop 12
C67 CFMNKQLADLELCPRE P1 mimotop 13
PT1079 CLEDGQVMDVDLCPREAAEGDK P1 mimotop 14
PT1079GS CLEDGQVMDVDLCGGSSGGP P1 mimotop 15
PT1078 CLEDGQVMDVDCPREAAEGDK P 1 mimotop 16
P15s QVMDVDL P1 mimotop 17
EEC39-I KCREVWLGESETIMDECE P1 mimotop 18
EEC39-J ACREVWLGESETIMDCD P1 mimotop 19
EEC39-10 SCREVWLGESEETVMDCG P1 mimotop 20
EEC40-9 NCQDLMLREDAGCWSKM P1 mimotop 21
EEC47-3 DCEEPMCSPVLLQQLKL P1 mimotop 22
P15t LEDGQVMDVD P1 mimotop 23
P16 csttqegela-nh2 P2 mimotop 24
P2sh TTQEGE P2 mimotop 25
P17 CSQKHWLSDRT-NH2 P3 mimotop 26
P4ex TYQGHTFEDSTKKCADSNPRGV P4 mimotop 27
P5sh GGHFPP P5 mimotop 28
P5long1 CSSCDGGGHFPPTIQC P5 mimotop 192
Pslong2 CLQSSCDGGGHFPPTIQLLC P5 mimotop 193
V dalších mimotopech mohou být aminokyselinové zbytky P1, P2, P3, P4, P4, P5, P6 nebo P7 každý nezávisle nahrazeny aminokyselinou, která nejblíže napodobuje tuto aminokyselinu.
Například A může být nahrazeno V, L nebo I, tak jak se popisuje v následující tabulce.
Původní zbytek Příklad substitucí Výhodná substituce
A V, L, I V
R K, Q, N K
N Q, Η, K, R Q
D E E
C S S
Q N N
E D D
G P, A A
H N, Q, K, R R
I L, V, M, A, F L
«· Φ
L l,V, M,A, F I
K R, Q, N R
M L, F, I L
F L, V, I, A, Y L
P A A
S T T
T s s
W Y, F Y
Y W, F, T, S F
V I, L, M, F, A L
Ligandy, které jsou schopny vázat se na epitopy Cs2 IgE exponované na povrchu a farmaceutické prostředky s jejich obsahem tvoří také provedení předkládaného vynálezu. Tyto ligandy jsou 5 použitelné při pasivní profylaxi nebo terapii podáváním ligandů pacientovi, pro zmírnění alergického onemocnění. Příklady těchto použitelných ligandů zahrnují monoklonální nebo polyklonální protilátky. Například protilátky indukované v jednom živočichovi mohou být purifikovány a pasivně podávány jinému živočichovi pro prevenci 10 nebo léčení alergie. Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro vytvoření hybridomů monoklonální protilátky (s použitím známých technik, např. Kohler a Milstein, Nátuře, 1975, 256, str. 495), humanizovaných monoklonálních protilátek nebo CDR roubovaných monoklonálních protilátek, metodami známými v oboru. 15 Souvisejícím aspektem předkládaného vynálezu jsou tedy ligandy schopné vazby na epitopy exponované na povrchu domény Cs2 IgE. Příklady těchto ligandů jsou protilátky (nebo Fab fragmenty). Tyto protilátky mohou být použity při pasivní imunoprofylaxi nebo imunoterapii nebo mohou být jako takové použity při identifikaci 20 peptidových mimotopů IgE.
• · · ♦ · · · «»φφ ·· ·· · ♦ • « · · · · » ή^·····** · · ♦ ··· · · ·Φ·
Termín „protilátka“, jak se zde používá, označuje molekulu s použitelnou specificitou vazby na antigen. Odborníkům v oboru bude jasně zřejmé, že tento termín může také zahrnovat polypeptidy, které jsou fragmenty nebo deriváty protilátek, avšak přesto mohou poskytnout stejnou nebo blízce podobnou funkčnost. Tyto fragmenty protilátek nebo deriváty jsou rovněž zahrnuty pod pojem protilátky, tak jak se zde používá.
Výhodnými ligandy jsou monoklonální protilátky. Zvláště výhodné ligandy jsou ligandy P1, a s výhodou monoklonální protilátky. Například PTmAbOOH je referenční název pro myší monoklonální protilátku typu lgG1 uloženou v souladu s pravidly Budapešťské úmluvy v ECACC (European Collection of Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, UK) 8. března 1999 pod depozitním číslem 99030805.
Například PTmAbOOH rozpoznává smyčku C-D Ce2 a sama o sobě je schopna rozpoznat IgE, jestliže je navázán na svůj vysoce afinitní receptor na lidských basofilech, aniž by způsobila degranulaci, a navíc je schopna blokovat pasivní senzitizaci nealergických basofilů prevencí vazby IgE na FcsRla, a inhibovat uvolňování histaminu spouštěné LolP1 v alergických basofilech. Další monoklonální protilátka, která rozpoznává smyčku C-D Cs2, je PTmAb0005 (dostupná u firmy Sigma Chemicals katalogové číslo 16510, číslo klonu GE-1). Předkládaný vynález poskytuje tuto monoklonální protilátku ve farmaceutickém prostředku.
Ligandy P1 byly používány v technologiích „bacteriophage panning“ pro identifikaci nových mimotopů P1. Například monoklonální protilátka, která je schopná rozpoznávat P1, se váže na bakteriofágy exprimující následující sekvence:
SEQ ID Sekvence
29 C F I N K Q M A D L E L c
30 C F M N K Q L A D L E L c
31 K C R E v W L G E S E T I M D C
Další peptidové mimotopy smyčky C-D Όε2 IgE byly identifikovány technologií bacteriophage panning s protilátkami PTmAbOOH a PTmAb0005. Příklady těchto mimotopů zahrnují:
Mimotop peptidu P1 (PTmAbOOl 1 phage panning) SEQ NO.
HCQQVFFPQDYLWCQRG SEQ ID No.32
SCREVWLGGSEMIMDCE SEQ ID No.33
ECNQNLSGSLRHVDLNC SEQ ID No.34
DCEEPMCSPVLLQKLKP SEQ ID No.35
SCREVWLGGSEMIMDCE SEQ ID No.36
RCDQQLPRDSYTFCMMS SEQ ID No.37
SCPAFPREGDLCAPPTV SEQ ID No.38
FCPEPICSPPLSRMTLS SEQ ID No.39
VCDECVSRELAL SEQ ID No.40
WCLEPECAPGLL SEQ ID No.41
VCDECVSRELAL SEQ ID No.42
DCLSKGQMADLC SEQ ID No.43
SCQGREVRRECW SEQ ID No.44
WCREVWLGESETIMDCE SEQ ID No.45
ACREVWLGESETIMDCD - SEQ ID No.46
GCAEPKCWQALHQKLKP - SEQ ID No.47
Mimotop peptidu P1 (PTmAb0005 phage panning) SEQ NO.
- 15 *
ECRGPNMQMQDHCPTTD SEQ ID No.48
QCNAVLEGLQMVDHCWN SEQ No. 49
CCVADPETQMTPSSEMF SEQ ID No.50
HCKNEFKKGQWTYSCSD SEQ ID No.51
QCRQFVMNQSEKEFGQC SEQ ID No.52
NCFMNKQLADLELCPRE SEQ ID No.53
SCAYTAQRQCSDVPNPG SEQ ID No.54
GCFMNKQMADLELCPRTAA SEQ ID No.55
ACFMNKQMADLELCPRVAA SEQ ID No.56
GCFINKQLADLELCPRVAA SEQ ID No.57
GCFMNKQLADWELCPRAAA SEQ ID No.58
ECFMNKQLADSELCPRVAA SEQ ID No.59
GCFMNKQLADPELCPREAE SEQ ID No.60
GCFMNKQLVDLELCPRGAA SEQ ID No.61
GCFMNKQLADLELCPREAA SEQ ID No.62
GCFMNKQQADLELCPRGAA SEQ ID No.63
GCFINKQMADLELCPREAA SEQ ID No.64
Proto tvoří další důležité provedení vynálezu mimotopy IgE Cs2, které jsou schopné vázat se na PTmAb0005 nebo PTmAbOOll, a imunogeny obsahující tyto mimotopy.
Bez omezení na širší definici mimotopů P1 bylo z těchto a dalších fágových sekvencí identifikováno uspořádání jádra pro podmnožinu peptidů podobných P1. Toto uspořádání je podmnožinou mimotopů P1 a popisuje jeho mimotopy z hlediska chemických vlastností aminokyselin v každé polote, které jsou požadovány pro rozpoznání konkrétní monoklonální protilátkou anti-P1:
- 16 -·
yhxdhhananxy kde:
y......y může být cyklizováno h hydrofobní (cys; pro; gly; ala; val; ile; leu; trp; met; phe) d donory iontové vazby (arg; lys; his; gin; asn; trp; tyr; thr;
ser) a kyselé (asp; glu) n iontově neutrální/nepolární (všechny kromě asp, glu, lys, arg) x jakákoli aminokyselina (n = 0 - 3)
V jednom provedení mohou být tedy mimotopy P1 popsány obecným uspořádáním jádra yhxdhhananxy uvedeným výše. Peptid P1 nebo jeho mimotop mohou být popřípadě obklopeny na obou koncích dalšími aminokyselinami, aby byla usnadněna konjugace nebo pro jiný účel.
Zvláště výhodný mimotop P1 je P15s (SEQ ID No. 17), jehož zbytky Q, M a první D byly ukázány jako kritické pro vazebnou aktivitu PTmAbOOH a PTmAb0005 (viz příklady). Proto by byl vzorec mimotopu pro P15s, ve kterém byly zbytky, které nejsou nezbytné, nahrazeny podobnými aminokyselinami (jak je uvedeno výše) následující:
Q, Xj, M, D, Xf, X2, X3, kde Xi je zvoleno z V, I, L, M, F nebo A; X2 je zvoleno z D nebo E; a X3 je zvoleno z L, I, V, M, A nebo F.
Důležité provedení předkládaného vynálezu je také použití PTmAb0005 a PTmAbOOH při identifikaci nových mimotopů IgE pro další použití při léčení alergie. Protože protilátka PTmAb0005 je
- 17 • Φ φ · ♦· φ* φφ φ φ ·♦· φ φφφφ φ φ φ φφφφ komerčně dostupná, tento ligand netvoří prostředek podle předkládaného vynálezu, ale dvě důležitá provedení předkládaného vynálezu tvoří farmaceutické prostředky obsahující PTmAb0005 a jeho použití při identifikaci mimotopů P1.
Důležité provedení předkládaného vynálezu také tvoří mimotopy
P2, P3, P4 a P5. Například P16 a P17 jsou mimotopy P2, popřípadě P3. Tyto peptidy, jestliže jsou vhodně předkládány na nosičích, jsou oba schopny indukovat silné protilátkové odpovědi anti-lgE, které nejsou anafylaktogenní.
Ve výhodném provedení budou mít peptidy obsahující výše identifikované epitopy nebo peptidické nebo nepeptidické mimotopy podle předkládaného vynálezu malou velikost, takže napodobují oblast zvolenou z celé domény Cs2. Je zřejmé, že peptidové mimotopy by měly proto mít délku menší než 100 aminokyselin, s výhodou by měly 15 být kratší než 75 aminokyselin, výhodněji menší než 50 aminokyselin a nejvýhodněji v rozmezí délky 4 až 25 aminokyselin, specifické příklady výhodných peptidových mimotopů jsou PT1079 a P15q, které jsou dlouhé 21, popřípadě 13 aminokyselin. Předpokládá se, že nepeptidové mimotopy budou mít podobnou velikost z hlediska objemu
2o molekuly, jako jejich peptidové protějšky.
Odborníkům v oboru bude zřejmé, že mohou být použity metody pro potvrzení statutu konkrétního konstruktu jako mimotopů. Mezi tyto techniky patří následující: domnělý mimotop může být testován pro zjištění imunogenicity konstruktu tím, že antiséra vytvořená tímto 25 domnělým mimotopem křížově reagují s nativní molekulou IgE, a jsou také funkční při blokování uvolňování alergického mediátoru z alergických efektorových buněk. Specificita těchto odpovědí může být potvrzena kompetitivními experimenty blokováním aktivity antiséra samotným mimotopem nebo nativním IgE, a/nebo specifickými 3o monoklonálními protilátkami, o kterých je známo, že se vážou na epitop exponovaný na povrchu v rámci Cs2 IgE. Mezi specifické
• 4 •4 •· • · · • 4* 4 4 příklady těchto monoklonálních protilátek pro použití v kompetitivních testech patří například PTmAb0005 a PTmAbOOH, které by potvrdily status domnělého mimotopů jako mimotopů smyčky C-D domény Cc2 IgE.
V jednom provedení předkládaného vynálezu se váže alespoň jeden peptid definovaný výše, který obsahuje epitop nebo mimotop IgE, na nosné molekuly za vytvoření imunogenů pro vakcinační protokoly. Nosné molekuly nejsou s výhodou příbuzné s nativní molekulou IgE. Peptidy nebo mimotopy mohou být navázány chemicky kovalentním spojením nebo expresí fúzních partnerů získaných metodami genetického inženýrství, popřípadě prostřednictvím propojovací sekvence.
Kovalentní vazba peptidu na imunogenní nosič může být prováděna způsobem dobře známým v oboru. Tak například pro přímou kovalentní vazbu je možné používat karbodiimid, glutaraldehyd nebo (N-[y-maleimidobutyryloxy])sukcinimidester, použitím běžných komerčně dostupných heterobifunkčních propojovacích skupin jako je CDAP a SPDP (viz doporučení výrobce). Po vazebné reakci může být imunogen snadno izolován a čištěn pomocí dialýzy, gelové filtrace, frakcionace atd.
Typy nosičů používané u imunogenů podle předkládaného vynálezu budou známé odborníkům v oboru. Funkcí nosiče je poskytnout pomoc cytokinu při indukci imunitní odpovědi proti peptidu IgE. Nevyčerpávající seznam nosičů, které mohou být použity v rámci předkládaného vynálezu zahrnuje: Keyhole limpet Haemocyanin (KLH), sérové albuminy jako je bovinní sérový albumin (BSA), inaktivoané bakteriální toxiny, jako jsou toxiny tetanu nebo záškrtu (TT a DT), nebo jejich rekombinantní fragmenty (např. doména 1 fragmentu C TT nebo translokační doména DT), nebo purifikovaný proteinový derivát tuberkulinu (PPD). Alternativně mohou být mimotopy nebo epitopy přímo konjugovány k liposomovým nosičům,
- 19 • · 9 · · · · 9 • · 9 9 9 ·
999 999 999 99 999 které mohou dále obsahovat imunogeny schopné poskytnout pomoc Tbuňkám. S výhodou je poměr peptidů k nosiči řádově 1:1 až 20 : 1 a s výhodou by každý nosič měl nést mezi 3 až 15 peptidy.
Ve výhodném provedení podle vynálezu je nosič protein D Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1). Protein D je protein, který se váže na IgD pocházející z Haemophilus influenzae, který byl patentován Forsgrenem (WO 91/18926, udělený EP 0 594 610 B1). V některých případech, například v rekombinantních systémech pro expresi imunogenů může být žádoucí používat fragmenty proteinu D, například Protein D 1/3rd (obsahující 100 až 110 N-koncových aminokyselin proteinu D (GB 9717953.5)).
Další výhodný způsob předkládání peptidů IgE podle předkládaného vynálezu je v kontextu s rekombinantní fúzní molekulou. Například EP 0 421 635 B popisuje použití částic antigenu chimérního jádra hepadnaviru pro prezentaci cizích peptidových sekvencí v částici podobné viru. Jako takové mohou imunogeny podle předkládaného vynálezu obsahovat peptidy IgE prezentované v chimérních částicích složených z antigenu jádra hepatitidy B. Navíc mohou rekombinantní fúzní proteiny obsahovat mimotopy podle předkládaného vynálezu a nosný protein jako je NS1 viru chřipky. Pro jakýkoli rekombinantně exprimovaný protein, který je částí předkládaného vynálezu, tvoří provedení předkládaného vynálezu také nukleová kyselina kódující uvedený imunogen.
Peptidy použité v předkládaném vynálezu je možno snadno syntetizovat postupy na pevné fázi, které jsou v oboru dobře známy. Vhodné syntézy mohou být prováděny s použitím postupů „T-boc“ nebo „F-moc“. Cyklické peptidy mohou být syntetizovány na pevné fázi použitím známého postupu „F-moc“ a polyamidové pryskyřice na plně automatickém zařízení. Alternativně bude odborníkům v oboru známo, které nezbytné postupy je třeba použít pro provádění způsobu manuálně. Technologie a postupy pro syntézu na pevné fázi se
- 20 ·popisují v publikaci „Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach“ autorů E. Atherton a R. C. Sheppard, publikováno IRL v Oxford University Press (1989). Alternativně je možno peptidy vyrábět rekombinantními metodami s použitím molekul nukleových kyselin vhodných pro expresi kódujících mimotopy v bakteriální nebo savčí buněčné linii s následným čištěním exprimovaného mimotopu. Technologie pro rekombinantní expresi peptidů a proteinů jsou v oboru známé a popisují se v knize Maniatis, T., Fritsch, E. F. a Sambrook a další, Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
Imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat peptidy jak bylo popsáno výše, včetně mimotopů, nebo mohou být jejich reaktivními deriváty nebo fragmenty. Část předkládaného vynálezu tvoří také části nukleové kyseliny, které kódují imunogeny podle předkládaného vynálezu nebo peptidy, mimotopy nebo jejich deriváty. Navíc mohou imunogeny podle předkládaného vynálezu obsahovat více než jeden typ epitopu, tj. P1 a P2, ve stejném imunogenu, nebo může samotný mimotop obsahovat více než jeden typ epitopu.
Předkládaný vynález proto poskytuje použití nových peptidů zahrnující epitopy nebo mimotopy podle předkládaného vynálezu (jak bylo definováno výše), při výrobě farmaceutických prostředků pro prevenci nebo léčení alergií. Imunogeny obsahující mimotopy nebo peptidy podle předkládaného vynálezu a nosné molekuly jsou rovněž poskytovány pro použití ve vakcínách pro imunoprofylaxi nebo terapii alergií. Mimotopy, peptidy nebo imunogeny podle předkládaného vynálezu se tedy poskytují pro použití v lékařství a při léčení nebo prevenci alergického onemocnění. Poskytuje se tedy způsob léčení alergie zahrnující podávání pacientovi trpícímu nebo vnímavému k alergii vakcíny nebo farmaceutického prostředku podle předkládaného vynálezu.
- 21 Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou také s výhodou obsahovat adjuvans. vhodná adjuvans pro vakcíny podle předkládaného vynálezu zahrnují ta adjuvans, která jsou schopná zvyšovat odpovědi protilátek proti imunogenu peptidů IgE. Adjuvans 5 jsou v oboru dobře známá (Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, díl 6, ed. Powell, M. F., a Newman, M. J., Plenům Press, New York a London, ISBN 0-30644867-X). Výhodná adjuvans pro použití s imunogeny podle předkládaného vynálezu zahrnují hlinité nebo vápenaté soli (například io hydroxidy nebo fosfátové soli). Mezi další adjuvans patří saponinová adjuvans jako je QS21 (US 5,057,540) a 3D-MPL (GB 2220 211).
Vakcíny podle předkládaného vynálezu se budou obecně podávat jak pro aktivační, tak i zesilující (boosting) dávky. Očekává se, že zesilující dávky budou přiměřeně vzdálené nebo se budou podávat 15 ročně nebo v takových časech, kdy hladina cirkulující protilátky klesne pod požadovanou úroveň. Zesilující dávky se mohou skládat z peptidů bez přítomnosti původní nosné molekuly. Tyto zesilující konstrukty mohou obsahovat alternativní nosič nebo nemusí být nosič vůbec přítomen.
V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje vakcína jak bylo popsáno výše pro použití v lékařství.
Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu může být použit pro ochranu nebo léčení savce vnímavého k nebo trpícího alergií prostřednictvím podávání uvedené vakcíny systémově nebo 25 přes sliznice. Tato podávání mohou zahrnovat intramuskulární, intraperitoneální, intradermální nebo subkutánní injekce, nebo podávání přes sliznice do orálního/alimentárního, respiračního nebo urogenitálního traktu. Výhodný způsob podávání je transdermálně, například náplastmi na kůži.
Množství proteinu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez výrazných nepříznivých vedlejších účinků v typických vakcínách. Toto množství se bude lišit v závislosti na konkrétním použitém imunogenu a na jeho předkládání. Obecně se předpokládá, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 1 až 500 pg, s výhodou 1 až 100 pg, přičemž 1 až 50 pg je nejvýhodnější rozmezí. Optimální množství pro určitou vakcínu je možno zjistit standardními studiemi zahrnujícími pozorování příslušných imunitních odpovědí u pacientů. Po počáteční vakcinaci mohou dostat pacienti ve vhodných časových intervalech jednu nebo několik zesilujících imunizačních dávek.
Farmaceutické prostředky obsahující ligandy popisované výše tvoří také provedení předkládaného vynálezu. Poskytují se také použití ligandů v lékařství a při výrobě farmaceutických prostředků pro léčení alergií.
Některá provedení předkládaného vynálezu mohou být také využita v diagnostických testech. Například panely ligandů, které rozpoznávají různé peptidy podle předkládaného vynálezu, mohou být použity při zjišťování titrů anti-lgE přítomné v séru pacientů. Navíc mohou být peptidy samy o sobě použity pro typizaci cirkulujících antilgE. Za některých okolností může být vhodné zjišťovat hladiny anti-lgE v oběhu, například u atopických pacientů, a peptidy a poly/monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být tedy použity při diagnóze atopie. Navíc mohou být peptidy použity pro afinitní odstraňování cirkulujících anti-lgE z krve pacientů před reinfuzí zpět do krve pacienta.
Část předkládaného vynálezu také tvoří způsob identifikace peptidových imunogenů pro imunoprofylaxi nebo terapii alergie zahrnující použití počítačového modelu struktury IgE a identifikaci těch peptidů v IgE, které jsou exponovány na povrchu. Tyto oblasti mohou potom být formulovány do imunogenů a použity v lékařství. Další součást předkládaného vynálezu tedy tvoří použití PTmAb0005 a • ·* · ♦ ♦· • 4 · 9 9 · · · 9 9
9 ♦ · 9 · 9 • 99 9 9999*9 • <·
PTmAbOOH při identifikaci peptidů pro použití při imunoprofylaxi nebo terapii alergií.
Příprava vakcín se obecně popisuje v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA,1978. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje v Likhite, US patent 4,372,945 a Armor a další, US patent 4,474,757.
Pro zbytky aminokyselin IgE se často používá systém číslování popsaný v Dorrington, K. J. a Bennich, H. (1978), Immunol. Rev. 41, 3 - 25; a také v Bennich, H. a Bahr-Lindastrom, H. von (1978), Prog. Immunol. 11, 49 - 58. Další určování sekvence genu a cDNA lidského IgE však ukázalo (Max, E. E. a další, 1982, Cell 29, 691 - 699; Flanagan, J. G. a Rabbitts, T. H., 1982, výše; Kenten, J. H. a další, 1982, výše) další leucin v poloze 273 (Kabatovo číslování) v Cs2, který nebyl v dřívějších dokumentech uváděn. Schéma číslování používané u autorů předkládaného vynálezu se proto může odlišovat od číslování použitého v Dorrington, K. J. a Bennich.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1, povrchová expozice aminokyselin IgE stanovená použitím modelu Padlana a Daviese 1986.
Obr. 2, reakční schéma 1, syntéza peptidů na pevné fázi.
Obr. 3, reakční schéma 2 a schéma 3, příprava modifikovaného nosiče.
Obr. 4, reakční schéma 4, konjugace peptid/nosič.
Obr. 5, údaje pro anti-lgE C67-8. (A) Reaktivita proti IgE navázanému na destičky séra myší Balb C imunizovaných 25 pg BSAIgE C67-8 (konjugováno použitím chemické reakce PTL) nebo 3 pg konstruktu jádra HepB-lgE C67-8. (B) Reaktivita proti IgE navázanému
ΦΦ * φ ·· • · · · φφ Φ·· φ φφφφ
- 24 na receptor séra myší Balb C imunizovaných 25 pg BSA-lgE C67-8 (konjugováno použitím chemické reakce PTL) nebo 3 pg konstruktu jádra HepB-lgE C67-8.
Obr. 6, kompetitivní test s rozpustným IgE a peptidem IgE C675 8. Séra myší imunizovaných BSA-lgE C67-8 nebo HBC-lgE C67-8 byla předinkubována rozpustným IgE (10 pg/ml) nebo peptidem IgE C67-8 (25 M) nebo irelevantním peptidem PT326 (25 pM) a přidána k destičkám ELISA potaženým IgE. Údaje jsou ve formě střední hodna ± S.E.M (n = 10).
io Obr. 7, údaje anti-lgE pro PT1079. (A) Reaktivita proti IgE navázanému na destičky ze séra myší Balb C imunizovaných 25 pg BSA-PT1079 (konjugováno použitím chemické reakce PTL) nebo 3 pg konstruktu jádro HepB-1079. (B) Reaktivita proti IgE navázanému na receptor séra myší Balb C imunizovaných 25 pg BSA-1079 (konjugováno použitím chemické reakce PTL) nebo 3 pg konstruktu jádro HepB-1079.
Obr. 8, kompetitivní test s rozpustným IgE a peptidem PT1079. Séra myší imunizovaných BSA-1079 nebo HBC-1079 byla předinkubována s rozpustným IgE (10 pg/ml) nebo peptidem PT1079 20 (25 pM) nebo nebo irelevantním peptidem PT326 (25 pM) a přidána k destičkám ELISA potaženým IgE. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M (n = 10).
Obr. 9, údaje anti-lgE pro PT1078. (A) Reaktivita proti IgE navázanému na destičky séra z myší Balb C imunizovaných 25 pg 25 BSA-PT1078 (konjugováno s použitím chemické reakce PTL).
(B) Reaktivita proti IgE navázanému na receptor séra myší Balb C imunizovaných 25 pg BSA-1078 (konjugováno s použitím chemické reakce PTL).
Obr. 10, kompetitivní test s rozpustným IgE a peptidem PT1078.
Séra myší imunizovaných BSA-1078 byla předinkubována s rozpustným IgE (10 pg/ml) nebo peptidem PT1078 (25 pM) nebo
- 25 ί
• ·· ·
• « · ·· ·· • • ··
• · • • • •
• · · • • • · •
• · • ·«· 9 ··· • >· • 99
irelevantním peptidem PT326 (25 pM) a přidána do destiček ELISA potažených IgE. Data jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M (n = 10).
Obr. 11, údaje antí-lgE pro PT1079gs. (A) Reaktivita proti IgE navázanému na destičky ze séra myší Balb C imunizovaných 3 pg HBC-1079gs, (B) Reaktivita proti IgE navázanému na receptor ze séra myší Balb C imunizovaných 3 pg HBC-1079gs.
Obr. 12, kompetitivní test s rozpustným IgE a peptidem PT1079. Séra myší imunizovaných HBC-1079gs byla předinkubována s rozpustným IgE (10 pg/ml) nebo peptidem PT1079 (25 pM) nebo irelevantním peptidem PT326 (25 pM) a přidána do destiček ELISA potažených IgE. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M (n = 10).
Obr. 13, inhibiční aktivita antiséra myši indukovaného BSA-C67-
8. Buňky z dárce citlivého na LolP1 byly smíchány s myším sérem (ředění 1/50) a potom spuštěny LolP1 pro uvolnění histaminu. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M. (n = 10).
Obr. 14, inhibiční aktivita myšího antiséra indukovaného BSA1078 a BSA 1079. Buňky dárce citlivého na LolP1 byly smíchány s myším sérem (BSA a BSA1078 antiséra zředěná 1/50; BSA-1079 antisérum zředěné 1/1250) a potom rozpuštěny LolP1 pro uvolnění histaminu. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M. (n = 10).
Obr. 15, inhibiční aktivita myšího antiséra indukovaného HBCC67-8, HBC-1078, HBC-1079 a HBC-1079gs. Buňky dárce citlivého na LolP1 byly smíseny s myším sérem (HBC standardního typu (wild type, wt)) a HBC-lgEC67-8 antiséra zředěná 1/50; HBC1079 a HBC-1079gs antiséra ředěná 1/1250) a potom bylo spuštěno uvolňování histaminu pomocí LolP1. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M. (n = 10).
Obr. 16 ukazuje vazbu závislou na koncentraci protilátky PTmAb0005 a PTmAbOOH na IgE.
-26 t
44 • • ··
• 4 • 4 44 • • 44
• 4 • 4 4
• 4 4 • • 4 •
4 4 • 4 4
4·· 444 ·· >4
Obr. 17 ukazuje inhibici závislou na koncentraci vazby IgE na konstrukt FcsRla/lgG protilátkou PTmAb0005 a PTmAbOOH ve srovnání s kontrolou.
Obr. 18 ukazuje koncentračně závislou inhibici vazby IgE na ektodoménu FccRla navázanou přímo na plastové destičky protilátkou PTmAb0005 ve srovnání s kontrolou.
Obr. 19 ukazuje vazbu IgE na FcsRII (CD23) protilátkou PTmAb0005 (GE-1) a PTmAbOOH.
Obr. 20 ukazuje koncentračně závislé blokování uvolňování histaminu z krevních basofilů alergického člověka protilátkou PTmAb0005 a PTmAbOOH ve srovnání s kontrolou.
Obr. 21, inhibice uvolňování histaminu spouštěného LolP1 v basofilech alergického člověka PTmAb0005 i PTmAbOOH.
Obr. 22, vazba PTmAbOOH na různé IgE; (A) vazba PTmAb0011 na chimérní IgE; (B) vazba PTmAbOOH na myelomový IgE; (C) vazba PTmAbOOH na IgE orientovaný antigenem; (D) vazba PTmAbOOl 1 na IgE denaturovaný teplem.
Obr. 23, inhibice vazby IgE na FcsRla způsobená PTmAbOOH.
Obr. 24, vazba PTmAbOOH na IgE navázaný na receptor.
Obr. 25, (A) vliv PTmAbOOH na vazbu IgE na FcsRII na buňkách RPMI 8866. Buňky RPMI 8866 (1 x 106/ml) byly inkubovány 1 hod na ledu s chimérním IgE (1 pg/ml) a anti-lgE mAb (10 až 0 pg/ml). IgE a anti-lgE byly předinkubovány 1 hod při laboratorní teplotě před přidáním k buňkám. Navázaný IgE byl detekován FITCkozím antisérem proti lidskému IgE. Výsledky ukazují střední fluorescenci v kanálu (mean channel fluorescence, MCF) u zdvojených vzorků při stanovení analýzou průtokovou cytometrií pro 10 000 signálů sepnutých pro živé buňky. (B) Protilátka PTmAbOOl7 nespecifická pro P1.
-27Obr. 26, vliv PTmAbOOH na vazbu IgE na FcsRII na primárních lidských B-buňkách. Mononukleární buňky periferní krve (1 x 106/ml) byly inkubovány 1 hod na ledu s chimérním IgE (1 pg/ml) a anti-lgE mAb (10 až 0 pg/ml; otevřená) nebo ekvivalentními koncentracemi 5 isotypově shodné kontrolní mAb (pevná látka). IgE a anti-lgE byly předinkubovány 1 hod při laboratorní teplotě před přidáním k buňkám. Navázaný IgE byl detekován FITC-kozím antisérem proti lidskému IgE a primární B-buňky byly zviditelněny PE-konjugovanou anti-CD 19. Výsledky ukazují střední fluorescenci kanálu (MCF) zdvojených vzorků io při stanovení analýzou průtokovou cytometrií 5000 signálů sepnutých pro živé buňky.
Obr. 27, vlivy PTmAbOOH na sekreci IgE z primárních lidských B-buněk. Mononukleární buňky z periferní lidské krve (2 x 105/jamka) byly kultivovány v médiu doplněném IL-4 (10 ng/ml) a protilátkou anti15 CD40 (1 pg/ml). Po dobu 14 dnů byly přidávány PTmAbOOH nebo isotypově shodné kontrolní mAb (1 pg/ml) a buněčné supernatanty byly odebírány a analyzovány na celkový obsah IgE metodou ELISA. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento množství IgE sekrenovaného v nepřítomnosti jakékoli protilátky.
Obr. 28, anafylaktogenicita monoklonálních protilátek proti lidskému IgE v basofilech alergického (A) a nealergického (B) člověka. PBMC od alergických dárců nebo nealergických dárců pasivně senzitizované 1 pg/ml chimérního IgE byly smíchány s protilátkami mAbs na 30 min při 37 °C. Uvolňování histaminu bylo stanoveno specifickou EIA. Data jsou střední hodnoty ze tří nezávislých experimentů, každý s odlišnými dárci.
Obr. 29, anafylaktogenicita protilátek proti lidskému IgE v senzitizovaných (A) a nesenzitizovaných (B) žírných buňkách lidských plic. Senzitizované nebo nesenzitizované surové suspenze lidských plicních žírných buněk byly inkubovány s protilátkami 45 min při 37 °C. Uvolňování tryptázy v supernatantech bylo určováno • ·· · · ·· •· · · ·· ·· ·
- 28 kolorimetricky. Údaje jsou střední hodnoty zdvojených stanovení z jediného reprezentativního experimentu.
Obr. 30, anafylaktogenicita protilátek proti lidskému IgE v buňkách RBL J41 vyvolaná lidským FcsRI (A) a myším FcsRI (B). Buňky RBL J41 byly senzitizovány buď lidským chimérním IgE nebo myším IgE a inkubovány s protilátkami 30 min při 37 °C. Uvolňování βhexosaminidázy bylo zjišťováno v supernatantech kolorimetrickým testem. Údaje jsou střední hodnoty trojnásobných stanovení z jediného reprezentativního experimentu.
Obr. 31, inhibice uvolňování histaminu spouštěného alergenem v lidských basofilech protilátkou PTmAbOOH. PBMC byly inkubovány s PTmAbOOH buď přímo (alergický test (A)) nebo spolu s IgE (test blokování (B)) 30 min při 37 °C. Buňky byly potom spuštěny antigenem 30 min při 37 °C a uvolňování histaminu bylo určováno specifickou EIA. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M. ze tří rozdílných experimentů od různých dárců.
Obr. 32, inhibice pasivní kožní anafylaxe v kůži opice protilátkami PTmAbOOH a PTmAb0005. Monoklonální protilátka Dec7B (dekapeptid Stanworth) byla použita jako kontrola.
Předkládaný vynález je ilustrován následujícími neomezujícími příklady.
Příklady provedení vynálezu
Část 1 Mimotopy a imunoqeny podle předkládaného vynálezu
- 29 Příklad 1
1,1 Identifikace, chemická konjugace a séroloqické metody u epitopu exponovaného na povrchu
Epitopy vystavené na povrch domény Cc2 IgE byly identifikovány použitím modelové struktury IgE popsané autory Padlan a Davies (Mol. Immunol., 23, 1063 - 75, 1986). Byly identifikovány peptidy, které byly jak spojité, tak i vystavené rozpouštědlu. Toho bylo dosaženo použitím softwaru Molecular Simulations software (MSI) pro výpočet dostupnosti pro každou aminokyselinu IgE, dostupný povrch byl io zprůměrován v rámci posuvného okénka pěti zbytků a tím byly identifikovány oblasti peptidů IgE, které měly průměr pro tento 5-mer vyšší než 80 A2 (0,8 nm2). Výsledky testu jsou ukázány na obr 1.
Výsledky
Z obr. 1 a také z opakování stejných postupů použitím modelu z roku 1990, Helm a další (model 2lgE struktury uložený 2/10/90 v PDB (Protein Data Bank, Research Collabarotory for Structural Bioinformatics)), vyplývá celá řada nativních peptidů, které mohou být použity jako imunogeny pro vyvolání protilátek proti IgE.
Tabulka 1: Nativní peptidy IgE vystavené na povrchu a spojité
Název peptidu Sekvence Umístění sekvence a doména IgE SEQ ID No.
P1 EDGQVMDVD Cs2 (Glu270-Asp278) 1
P2 STTQEGEL Ce2 (Ser283-Leu290) 2
P3 SQKHWLSDRT Cs2 (Ser300-Thr309) 3
P4 GHTFEDSTKK Cs2 (Gly318-Lys327) 4
P5 GGGHFPPT Cs2 (Gly245-Thr250) 5
P6 PGTINI Cs2 (Pro262-lle267) 6
P7 FTPPT Cs2 (Phe231-Thr235) 7
Tyto peptidy nebo jejich mimotopy byly syntetizovány a buď konjugovány s nosnými proteiny, nebo vloženy do konstruktů jaderného antigenu hepatitidy za vytvoření částic podobných viru, exprimujících rekombinantní peptid.
1.2 Syntéza konjugátů peptid IgE /protein D s použitím sukcinimidového-maleimidového zesíťujícího činidla
Protein D může být konjugován přímo k peptidům IgE za vytvoření antigenů podle předkládaného vynálezu použitím maleimidsukcinimidového zesíťujícího činidla. Tato chemická reakce umožní řízenou aktivaci skupin NH2 nosných zbytků fixací sukcinimidové skupiny. Maleimidová skupina je vzebné místo pro cystein. Proto vyžadují pro účely následujících příkladů peptidy IgE pro konjugaci přídavek N-koncového cysteinu.
Vazebné činidlo je selektivní heterobifunkční zesíťující činidlo, na jednom konci sloučeniny aktivující aminoskupinu proteinového nosiče sukcinimidylesterem a na druhém konci vázající sulfhydrylovou skupinu peptidů maleimidovou skupinou. Schéma reakce je následující:
a. Aktivace proteinu reakcí mezi lysinem a sukcinimidylesterem:
b. Vazba mezi aktivovaným proteinem a cysteinem peptidu reakcí s maleimidovou skupinou:
1,3 Příprava konjuqátu peptid IqE-protein D
Protein D se rozpustí ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem při pH 7,2 na koncentraci 2,5 mg/ml. K roztoku proteinu se přidá vazebné činidlo, (N-[y-maleimidobutyryloxy]sukcinimidester GMBS) rozpuštěné v koncentraci 102,5 mg/ml v DMSO. Použije se 1,025 mg GMBS na 1 mg proteinu D. Reakční roztok se inkubuje 1 hod při laboratorní teplotě. Vedlejší produkty se odstraní odsolením na permeačním gelu Sephacryl 200HR. Jako eluent se použije roztok Tweenu 80 s koncentrací 0,1% ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem pH 6,8. Aktivovaný protein se oddělí a jednotlivé podíly se spojí. Peptidy (identifikované v tabulce 1 nebo jejich deriváty nebo mimotopy) se rozpustí na koncentraci 4 mg/ml v 0,1 M kyselině octové, aby se zabránilo tvorbě disulfidické vazby. Pro vazbu se použije molární poměr mezi 2 až 20 peptidy na 1 molekulu aktivovaného proteinu D. Roztok peptidu se pomalu přidává k proteinu a směs se inkubuje 1 hod při 25 °C. pH se udržuje v průběhu vazebné fáze na hodnotě 6,6. Krok ukončení reakce se provede přidáním cysteinu (0,1 mg cysteinu na mg aktivovaného PD rozpuštěného na koncentraci 4 mg/ml v kyselině octové 0,1 M) na 30 min při 25 °C a pH 6,5. Pro
- 32 odstranění nadbytečného cysteinu nebo peptidů se provede dialýza proti roztoku NaCl 150 mM, Tween 80 0,1 %.
Poslední krok je sterilizace filtrací na membráně 0,22 pm. Hotový produkt je čirý filtrovatelný roztok zakonzervovaný při 4 °C. Konečný poměr peptid/PD může být zjištěn analýzou aminokyselin.
Analogickým způsobem mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu konjugovány s jinými nosiči včetně BSA.
Byl syntetizován mimotop peptidů P1, CLEDGQVMDVDLL (SEQ ID No. 8), který byl konjugován jak s proteinem D, tak i BSA, použitím výše popsaného způsobu.
1,4 Metody ELISA
ELISA antipeptidu nebo antipeptidového nosiče
Imunitní odpovědi antipeptidu a antinosiče byly vyšetřovány s použitím metody ELISA popsané dále. Mikrotitrační destičky (Nunc) se potáhnou specifickým antigenem v PBS (4 °C přes noc) s následujícími látkami: Streptavidinem v koncentraci 2 pg/ml (s následnou inkubací s biotinylovaným peptidem (1 μΜ) 1 hod při 37 °C), následné promytí 3 x PBS-Tween 20 0,1%. Destičky se nasytí PBS-BSA 1% - Tween 20 0,1% (pufr Sat) 1 hod při 37 °C. Přidá se 1. protilátka = séra v dvoustupňovém ředění (v pufru Sat), a provede se inkubace 1 hod 30 min při 37 °C a trojnásobné promytí. 2. přidá se antimyší Ig (nebo antimyší isotyp specifické monoklonální protilátky) navázaný na HRP. Inkubuje se 1 hod při 37 °C. Provede se pětinásobné promytí. Vyvolání se provede TMB (BioRad) 10 min při teplotě místnosti v temnu. Reakce se blokuje 0,4N H2SO4.
• · · · · · · • · · · · · ·· · «·
- 33 Způsob detekce reaktivity antilidského IgE v myším séru (ELISA s IgE navázaným na destičku)
Destičky ELISA se potáhnou lidským chimérním IgE v koncentraci 1 pg/ml v potahovacím pufru karbonát/bikarbonát s pH
9,6 1 hod při 37 °C nebo přes noc při 4 °C. Nespecifická vazebná místa se blokují PBS/0,05% Tween-20 s obsahem 5 % hmotnost/objem sušeného mléka Marvel 1 hod při 37 °C. Provedou se sériová ředění myšího séra v PBS/0,05% Tween-20/1% hmotnost/objem BSA/4% fetální telecí sérum a roztoky se přidávají na io 1 hod při 37 °C. Vazba polyklonálního séra se detekuje kozím antimyším IgG-Biotinem (1/2000) a potom se přidá Streptavidin-HRP (1/1000). Konjugovaná protilátka se detekuje substrátem TMB při 450 nm. Na každou destičku se přidá standardní křivka pro PTmAbOOH tak, že reaktivitu anti-lgE ve vzorcích séra je možno vypočíst v pg/ml.
Způsob detekce reaktivity antilidský receptor - navázaný IgE v myším séru
Destičky ELISA se potáhnou rekombinantním lidským FceRla při 0,5 pg/ml v karbonátovém/bikarbonátovém potahovacím pufru pH 20 9,6 1 hod při 37 °C nebo přes noc při 4 °C. Nespecifická vazebná místa se blokují PBS/0,05% Tween-20 s obsahem 5% hmotnost/objem nízkotučného sušeného mléka Marvel 1 hod při 37 °C. Potom se přidá lidský IgE v koncentraci 1 pg/ml na 1 hod při 37 °C. Potom se přidávají sériová ředění myšího séra v PBS/0,05% Tween-20/1% hmotnost/objem BSA/4% fetální telecí sérum na 1 hod při 37 °C. Vazba polyklonálního séra se detekuje kozím antimyším IgG-Biotinem (1/2000) a potom se přidá Streptavidin-HRP (1/1000). Konjugovaná protilátka se detekuje substrátem TMB při 450 nm. Na každou destičku se přidá standardní křivka PTmAbOOH, takže reaktivitu anti-lgE ve 30 vzorcích séra je možno vypočíst v pg/ml.
- 34 Soutěžení o vazbu IgE mimotopovymi peptidy, rozpustným IgE nebo PTmAbOOl 1
Jediná ředění polyklonálního myšího séra se smíchají s jedinými koncentracemi buď mimotopového peptidu nebo lidského IgE v předem blokované polypropylenové 96-jamkové destičce. Směsi se inkubují 1 hod při 37 °C a potom se přidají na destičky ELISA potažené IgE na 1 hod při 37 °C. Vazba polyklonálního séra se detekuje kozím antimyším IgG Biotinem (1/2000) a potom se přidá io Streptavidin-HRP (1/1000). Konjugovaná protilátka se detekuje substrátem TMB při 450 nm. Pro soutěžení mezi sérem a PTmAbOOH o vazbu IgE se přidávají směsi séra a PTmAbOOl 1-biotin na destičky ELISA potažené IgE. Vazba PTmAbOOl 1 se detekuje StreptavidinemHRP (1/1000).
1.5 Testy lidských basofilů
S lidskými basofily (HBA) se provádí dva typy testů, jeden pro stanovení anafylaktogenicity monoklonálních protilátek, který spočívá v přidání protilátek k izolovaným PBMC; a druhý pro měření inhibice 20 Lol P I (silný alergen) spouštěného uvolňování histaminu s předinkubací HBA s monoklonálními protilátkami.
Z žíly alergických dárců se odebírá krev do zkumavek obsahujících 0,1 objemu 2,7% EDTA, pH 7,0. Potom se provede ředění 1/2 stejným objemem média HBH s obsahem 0,1% lidského 25 sérového albuminu (HBH/HSA). Získaná buněčná suspenze se převrství na 50 % obj. Ficoll-Paque a centrifuguje se při 400 g 30 min při teplotě místnosti. Vrstva na rozhraní mononukleárních buněk (PBMC) periferní krve se oddělí a usazené buňky se vylijí do odpadu. Buňky se jednou promyjí v HBH/HSA, počítají se a resuspendují 30 v HBH/HSA s buněčnou densitou 2,0 x 106 na ml. Do jamek 96- 35 jamkové destičky se dnem ve tvaru V obsahujících 100 μΙ zředěného testovaného vzorku nebo monoklonální protilátky se přidá 100 μΙ buněčné suspenze. Každý testovaný vzorek se testuje v několika ředěních s šesti jamkami pro každé ředění. Obsahy jamek se krátce 5 promíchají použitím třepačky na destičky před inkubací při 37 °C 30 min při třepání 120 ot/min.
Pro každé ředění séra se provede spuštění ve třech jamkách přidáním 10 μΙ extraktu Lol p I (konečné ředění 1/10 000) a do tří jamek se přidá 10 μΙ HBH/HSA pro testování anafylaktogenicity. io Obsahy jamek se znovu krátce promíchají na třepačce na destičky před inkubací při 37 °C dalších 30 min za třepání při 120 ot/min. Inkubace se zakončí centrifugací při 500 g 5 min. Supernatanty se oddělí pro testování histaminu použitím běžně dostupného kitu EIA pro měření histaminu (Immunotech). Běžně se přidávají kontrolní jamky 15 obsahující buňky bez testovaného vzorku pro zjištění spontánního a spouštěného uvolňování. Přidávají se také jamky obsahující buňky + 0,05% detergent Igepal pro zjištění celkového obsahu histaminu v buňkách.
Výsledky jsou vyjádřeny následujícím způsobem:
Test anafylaktogenicity
Uvolňování histaminu způsobené testovanými vzorky = % uvolňování histaminu z buněk s přidaným testovaným vzorkem - % spontánního uvolňování histaminu.
Test blokování
Stupeň inhibice uvolňování histaminu může být vypočten podle následujícího vzorce:
- 36 % inhibice = 1 - (uvolňování histaminu z buněk testovaným vzorkem*) x -jqO (uvolňování histaminu z buněk stimulovaných antigenem*)
Hodnoty jsou korigovány na spontánní uvolňování.
Příklad 2
Imunizace myší konjugáty P15 (P15-BSA nebo P15-PD) indukuje produkci protilátek proti lidskému IgE
Konjugáty obsahující mimotop P15 (25 pg proteinu/dávku) popsané v části 1.4, byly podávány skupinám deseti myší BalbC, přičemž jako adjuvans byla použita emulze olej ve vodě obsahující QS21 a 3D-MPL podle popisu ve WO 95/17210. Zesilující dávka byla podána v den 21 a 42 a séra byla odebírána v den 42 a 56. Imunitní odpověď proti peptidu a IgE navázanému na destičky byla sledována metodami popsanými v příkladu 1.
Výsledky
Výsledky odpovědí proti peptidu a IgE měření 14 dní po třetí vakcinaci jaou ukázány v tabulce 2.
Taulka 2 Výsledky imunogenicity P 15
Mimotopový konjugát Odpovědi proti peptidu (titr středního bodu) Odpovědi proti IgE (pg/ml (PTmAbOCH 1)
průměr stand. odch. geom. střed průměr stand. odch. geom. střed
P15-PD (n=16) 41391 26858 36154 1,6 4,5 0,3
P15-BSA (n=10) 49591 9259 48719 2,2 2,5 1,0
- 37 Příklad 3
Anti-lqE indukované u myší po imunizaci konjuqátem nejsou anafylaktoqenní
Několik ředění kompletního séra nebo IgG vyčištěný z konjugátu imunizovaných myší je možno testovat v přítomnosti basofilů z čerstvě odebrané periferní krve alergických pacientů.
Anafylaktogenicita může být vyhodnocována měřením uvolňování histaminu indukovaného testovanými protilátkami podle následujícího popisu:
Z periferní krve se odstraní erythrocyty na gradientu glukózadextran.
Buňky se promyjí a vysejí spolu s testovanými vzorky (například alergen, protilátky, alergen + protilátky, ...).
Po inkubaci se oddělí supernatanty a uvolňování histaminu se měří podle doporučení výrobce (Immunotech, imunologický kit pro stanovení histaminu).
Bylo ukázáno, že žádné ze sér vytvořených pomocí P15-BSA nebo P15-PD není anafylaktogenní.
Příklad 4
Anti-lqE indukované u myší po imunizací konjugátem jsou schopné blokovat uvolňování histaminu zprostředkované IgE indukované spuštěním lerqenem v basofilech alergického pacienta
Uvolňování histaminu je možno měřit ve vzorcích basofilů spouštěných různými koncentracemi alergenu v přítomnosti nebo nepřítomnosti několika ředění úplného séra nebo IgG vyčištěného z myší imunizovaných konjugátem. Blokující aktivita protilátek anti-P15 v antiséru byla vyhodnocována měřením inhibice uvolňování histaminu
- 38 indukovaného alergenem. Uvolňování histaminu a inhibice byly měřeny podle popisu v příkladu 3. Protože P15 je mimotop P1, jako kontrola byla použita protilátka PTmAbOOH, protože je známo, že se váže na stejný epitop (P1). Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.
Tabulka 3 Inhibice uvolňování histaminu z basofilů alergických pacientů
Antisérum Ředění % inhibice uvolňování histaminu
P15-PD (myš 4.12) 1/30 79
P15-PD (myš 4.5) 1/30 57
P15-BSA (myš 7.3) 1/30 67
P15-BSA (myš 7.5) 1/30 57
PTmAb0011 0,1 μς/Γπ! 56
PTmAb0011 1 gg/ml 90
anti-BSA sérum 1/30 40
anti-PD sérum 1/30 40
Příklad 5 io Imunoqenicita mimotopů P2 a P3
Následující mimotopy byly konjugovány s BSA s použitím technik popsaných v příkladu 1.2, a myši byly imunizovány těmito konjugáty s použitím stejných směsí a stejného postupu jak bylo popsáno v příkladu 2.
P 16 csttqegela-nh2 P2 mimotop SEQ ID No.24
P17 csqkhwlsdrt-nh2 P3 mimotop SEQ ID No.26
- 39 φ.φ Φ Φ φφ φφ « φ φφ • φ φ · φ φ φ • · · · φ · · φ · • φ φφφ·· • ΦΦ ···· ··· ··· φφ φφφ
Myším byla po poslední imunizaci odebrána krev a byly prováděny testy na reaktivitu anti-lgE metodou ELISA IgE navázaného na destičky. V následující tabulce jsou shrnuty jednotlivé výsledky, průměry (Av), geometrické střední hodnoty (GM); (SD = standardní 5 odchylka).
Tabulka 4 Výsledky imunoqenicity P 16 a P 17
Imunitní odpovědi proti peptidům u myší (14 dnů po třetí vakcinaci),
titry střednic o bodů
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Av SD GM
P 16 1891 649 1299 2349 591 1474 4605 918 4177 865 1882 1436 1478
P 17 100 4349 2850 3434 6133 2231 5085 2991 13070 8874 5446 3515 4656
Příklad 6 io Produkce mímotopů P1 a jejich aktivita z hlediska imunogenicíty/ funkce
6.1 Produkce imunogenů
Mimotopy P1 byly odvozovány buď technologií phage display nebo teoretickým návrhem molekulárním modelováním smyčky C-D domény Cs2 IgE. Byly syntetizovány následující peptidy, které byly formulovány jak do konjugátů BSA-peptid, tak i do rekombinantních konstruktů antigenu jádra HepB.
Název peptidu Sekvence SEQ ID No.
C67/8 CFINKQMADLELCPRE P1 mimotop 12
PT1079 CLEDGQVMDVDLCPREAAEGD P1 mimotop 14
PT1079GS CLEDGQVMDVDLCGGSSGGP P1 mimotop 15
PT1078 CLEDGQVMDVDCPREAAEGDK P1 mimotop 16
- 40 Konstrukty peptidy/proteinový nosič byly produkovány následovně. Acylhydrazinové deriváty peptidů byly připraveny na pevné fázi jak je ukázáno ve schématu 1 (obr 2). Tyto deriváty peptidů mohou být snadno připraveny s použitím známého postupu „Fmoc“ využívajícího buď polyamidové nebo polyethylenglykolpolystyrenové (PEG-PS) nosiče v úplně automatickém zařízení pomocí postupů dobře známých v oboru (způsoby a postupy pro syntézu na pevné fázi se popisují v publikaci ‘Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach’, E. Atherton a R. C. Sheppard, publ. IRL, Oxford University Press (1989). Odštěpení kyselinou poskytlo přímý modifikovaný peptid zbavený ochranných skupin. Ten by mohl být snadno oxidován a čištěn za získání epitopu modifikovaného disulfidickými můstky použitím metod uvedených v „Methods in Molecular Biology, díl 35: Peptide Synthesis Protocols“ (ed. M. W. Pennington a Β. M. Dunn), kapitola 7, str. 91 - 171, D. Andreau a další.
Takto syntetizované peptidy mohou být potom konjugovány k nosným proteinům (v tomto případě bovinní sérový albumin, BSA) použitím následujícího postupu:
6.2 Syntéza modifikovaného nosiče
K zavádění arylaldehydové funkční skupiny bylo použito sukcinimidového aktivního esteru (BAL-OSu) připraveného jak je ukázáno na schématu 2 (obr. 3, viz WO 98/17628, kde jsou uvedeny další podrobnosti). Substituce aminových funkčních skupin BSA (bovinní sérový albumin) z přibližně 50 % rutinně poskytovala rozpustný modifikovaný protein. Vyšší substituce BSA vedla k nerozpustným konstruktům. BSA a BAL-OSu byly smíseny v ekvimolární koncentraci v pufru s DMSO (viz schéma 3, obr. 3). 2 hod. Tento protokol založený na experimentech poskytl přibližně
-41 50% substituci BSA, jak bylo zjištěno fluorescaminovým testem na volné aminové skupiny.
6.3 Konstrukt peptid-BSA
Jednoduché kombinace modifikovaného peptidů a derivatizovaného BSA poskytly konstrukty peptid-BSA, které byly snadno izolovány dialýzou (schéma 4, obr. 4). Pro potvrzení zvýšení molekulové hmotnosti byla použita SDS-PAGE.
6.4 Konstrukty antiqenu jádra hepatitidy
Rekombinantní konstrukty antigenu jádra hepatitidy (HBC) byly také připraveny s použitím postupů molekulární biologie popsaných v EP 0 421 635 B. V těchto experimentech HBC byl PT1079 modifikován pro odstranění koncového lysinu.
Peptid Sekvence SEQ NO.
PT1078HBC CLEDGQVMDVDCPREAAEGD 65
PT1079HBC CLEDGQVMDVDLCPREAAEGD 66
Exprese P1-mimotopových peptidů byla potvrzena experimenty BlAjádra s PTmAb0005 a PTmAbOOH. Byly vytvořeny výsledky pro imunogenicitu s použitím dávek použe 3 pg/dávku HBC.
6.5 Studie imunoqenicity
Konstrukty mimotop/HBC a mimotop/BSA byly čištěny a formulovány do fakcín, kde jako adjuvans byla použita emulze olej ve vodě obsahující QS21 a 3D-MPL popsaná ve WO 95/17210 (dávka konjugátu BSA 25 pg). Tyto vakcíny byly podávány skupinám deseti myší BalbC a zesilující dávky byly podány v den 14 a 28 a séra byla odebírána v den 42. Imunitní odpovědi proti IgE navázanému na
destičky a receptorově orientovanému IgE byly sledovány použitím technik popsaných v příkladu 1.4. Byla také měřena aktivita antiséra při inhibici uvolňování histaminu z alergických basofilů způsobem popsaným v 1.5.
6.6 Výsledky
Všechny konstrukty BSA a HBC indukovaly vysoké litry protilátek anti-lgE, jestliže byl IgE navázán přímo na destičku ELISA, a jestliže byl orientován na receptor s vysokou afinitou. Navíc se io potvrdilo, že všechny tyto odpovědi byly specifické tím způsobem, že bylo sledováno soutěžení volného IgE a jeho mimotopů a nikoli nespecifických peptidů. Protilátky proti IgE indukované těmito imunogeny byly schopny inhibovat uvolňování histaminu z lidských basofilů odvozených z alergického dárce (jílek vytrvalý, LOLP1).
Výsledky pro C67-8 je možno nalézt na obr. 5, 6, 13 a 15. Pro výsledky pro PT1078 viz obr. 9, 10, 14 a 15. Pro výsledky pro PT1079 viz obr. 7, 8, 14 a 15. Pro výsledky pro PT1079GS viz obr. 11, 12 a 15.
Navíc nebyly imunitní odpovědi vyvolané těmito peptidovými mimotopy anafylaktogenní.
Tabulka 5
Anafylaktoqenicita P1 mimotopovych antisér
Imunogen Ředění séra % uvolňování histaminu
Spontánní uvolňování 0,25 ± 0,06
Prosté sérum 1/50 1,9 ± 0,4
BSA 1/50 2,15 ± 0,65
BSA-lgE C67-8 1/50 2,9 ± 1,1
BSA-1078 1/50 5,00 ± 1,40
• 9· • * ·· ·
♦ · · ·· ·· * • ··
• · • • • 9
• · » ♦ • • · •
• · • • ··· • ·· •
BSA-1079 1/1250 0,43 ± 0,04
HBCwt 1/50 3,5 ± 1,0
HBC-1079 1/1250 0,12 ±0,04
HBC-1079gs 1/1250 0,02 ± 0,02
HBC-lgE C67-8 1/50 2,14 ± 0,26
Poznámka k tabulce: Buňky dárce citlivého na LolP1 byly smíchána se zředěným myším sérem na 30 min. Uvolňování histaminu bylo zjišťováno komerčně dostupným EIA specifickým pro histamin. Údaje jsou ve formě střední hodnota ± S.E.M. (n = 10).
část 2_____Liqandy, které se vážou na epitopy a mimotopy podle předkládaného vynálezu
V části 1 jsou popsány peptidové imunogeny, které po podání savci ve formě vakcíny indukují imunitní odpovědi které (a) rozpoznávají IgE, a (b) jsou schopny inhibovat uvolňování histaminu in vitro. Část 2 popisuje ligandy, které jsou schopné vázat se na epitopy nebo mimotopy podle předkládaného vynálezu a popisuje jejich funkci. Byly identifikovány dvě monoklonální protilátky, PTmAb0005 a PTmAbOOH, které rozpoznávají smyčku c-d Cs2 IgE. Bylo zjištěno, že mimotopy tohoto peptidů jsou, jak je ukázáno v části 1, imunogenní a funkční při aktivní vakcinaci. Tato část popisuje charakterizaci těchto monoklonálních protilátek a poskytuje důkaz jejich využitelnosti při pasivní vakcinaci.
Cílový epitop těchto protilátek byl identifikován použitím technologie fágového panningu (phage panning), tedy sekvenčního uspořádání většího počtu bakteriofágových cílů a následné vyčištění a potvrzení mapováním domén a místně specifickou mutagenezí. Funkční aktivita protilátek byla potvrzována nejen in vitro testováním rozpoznávání anti-lgE a inhibicí uvolňování alergických mediátorů, ale
-44- ··’···*·· také in vivo na studiích pasivní kožní anafylaxe (Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA) u opice.
Příklad 7
7,1 Mapování cíle pro monoklonální protilátku pomocí fáqu
Pro mapování vazebných míst monoklonálních protilátek byly použity knihovny získané metodou phage display, při použití tří rozdílných fágových knihoven, které zviditelňují buď peptidové sekvence XCX15, XCX10 nebo XAX10 (kde X je jakákoli aminokyselina) na N-konci fága gVlllp. Tabulky 6 a 7 ukazují výsledky selekce peptidových ligandů monoklonálními protilátkami PTmAb0005 proti lidskému IgE a . Podobnosti rozložení aminokyselin mezi peptidy a lidským IgE odhalily silnou homologii se smyčkou c-d v doméně Cs2 IgE. Rozložení homologie získané z fága bylo: Q h h a h a h (kde h = hydrofobní aminokyselina a a = kyselá aminokyselina), což bylo souhlasné uspořádání se sekvencí QVMDVDL (SEQ ID No.17) ve smyčce C-D domény Cs2 lidského IgE.
Bylo také provedeno epitopové mapování lgEC67, což je peptid odvozený z experimentů metodou phage panning, který měl nejvyšší aktivitu k PTmAb0005. To bylo provedeno zavedením náhodných mutací mutagenezí PCR a subklonováním do vektoru Fuse 5 pro zobrazení menšího vláknitého fágového proteinu glllp. Mutanty lgEC67 byly hodnoceny z hlediska vazby na PTmAb0005 jak je ukázáno v tabulce 8. Tyto a jiné výsledky potvrdily důležitost aminokyselin uvnitř lgEC67, které souhlasily s epitopem Cs2. Například mutanty L8P, D10G, L11M, E12G a L13R všechny snižovaly vazbu PTmAb0005 na anti-lgE (údaje nejsou ukázány). Mutace na jiných místech měly na afinitu k PTmAb0005 malý vliv.
Z PTmAb0005 s nejvyšší afinitou byly vytvořeny náhodné vedlejší knihovny a technikou fágového zobrazení odvozené peptidy
- 45 PTmAbOOll pro zvýšení afinity peptidů k protilátkám úpravou výše popsaných metod (Yu, J. a Smith, G. P. (1996), „Affinity maturation of phage-displayed peptide ligands“. Methods in Enzymology, 267, 3 27). Metoda zahrnovala přenos subklonováním DNA z vláknitého 5 fágového zobrazovacího vektoru hlavního povlakového proteinu (gVlllp) do vektoru pro zobrazení vedlejšího fágového povlakového proteinu (glIIp) náhodným krokem PCR. Z několika fágových sekvencí byly vytvořeny vedlejší knihovny včetně ligandů PTmAb0005 s nejvyšší afinitou lgEC67 a IgE C67-8. Afinity zralých sekvencí pro C67 a C67-8 io jsou ukázány v tabulkách 8 a 9. V tabulkách jsou uvedeny hodnocení pořadí a také afinity k jádru BIA tam, kde byly dostupné. Jako imunogen byl použit lgEC67-8 schopný indukovat odpověď proti lidskému IgE u myší, jestliže byl jako imunogen použit fág exprimující peptid.
7.2 Potvrzení cíle mapováním domén
Byla vytvořena řada konstruktů s cílem mapovat vazebně specifické části PTmAb0005 a PTmAbOOll s ohledem na konstantní domény IgE. Byly vytvořeny následující konstrukty: Cc2+-4, Οε2-3, 20 Οε3-4, Οε3-4Ι_ (Οε3-4 plus propojovací sekvence mezi doménami Οε2 a Οε3) a samotný Οε2.
Fragmenty obsahující různé domény lidského IgE Fc byly klonovány s použitím cDNA odvozené z hybridomové linie JW8/5/13, které exprimují chimérní lidský IgE (Neuberger, M. S. a další (1985), 25 Nátuře 314 268 - 270; Bruggemann, M. a další (1987), J. Exp. Med.
166, 1351 - 61). Fragmenty IgE Fc byly amplifikovány použitím vhodných párů primerů a JW8/5/3 cDNA jako templátu. Fragment οε24 kóduje aminokyseliny (aa) S225-K547. Fragment οε3-4 kóduje aminokyseliny G335-547. Fragment cc-3-4L (domény 3-4 plus 30 propojovací sekvence, která spojuje οε2 s οε3) kóduje aminokyseliny
E322-K547. Fragment οε2-3 kóduje aminokyseliny S225-G436.
- 46 Fragment ce2 kóduje aminokyseliny S225-S324. Všechny konstrukty obsahují na konci COOH hexahistidinové zakončení pro detekci a purifikaci. Tyto fragmenty byly klonovány do eukaryotického expresního vektoru v rámci s úvodní kódující sekvencí odvozenou 5 z CD33 pro přímou sekreci exprimovaného fragmentu. To umožnilo expresi v savčích buněčných liniích. Vektor byl odvozen z pcDNA3.1 + (Invitrogen). Pro expresi klonovaných fragmentů byly vhodné klony transfekovány do buněk COS-7 a získané kondicionované médium bylo sklizeno 48 až 60 hod po transfekci.
io Vazba PTmAb0005 a PTmAbOOH na exprimované domény IgE byla sledována testem ELISA, vazbou konstruktů na destičku ELISA s následnou inkubací s monoklonálními protilátkami a vyvíjením antimyšími protilátkami. Známou technologií westernového přenosu byla také testována vazba na denaturované konstrukty.
Výsledky pro PTmAb0005 ukázaly silnou vazbu na Ce2-4, Cs2-3 a Ce2 v jejich nativních formách a také vazbu na Ce2-4 a C2 po denaturaci metodou westernového přenosu. Při tomto testu nebyla pozorována vazba na Ce3-4 nebo Ce3-4L.
PTmAbOOH se také váže na Ce2-4, Ce2-3 a Ce2 v jejich 20 nativních formách; a váže se také na Ce2-4 a Ce2 a Ce2 v jejich denaturovaných formách.
Je proto jasné, že obě protilátky rozpoznávaly cílový epitop přítomný v doméně Ce2 IgE.
7.3 Potvrzení cíle místně specifickou mutaqenezí
Studie mapování domén ukázala, že obě mAb byly schopny vazby na samotnou doménu Ce2. Analýza sekvencí získaná metodou biopanningu peptidových knihoven zobrazených fágem ukázala, že sekvence odvozené od PTmAb0005 ukázaly významnou podobnost 30 k P1. Tato oblast vytváří smyčku mezi řetězci C-D β domény Ce2 ve struktuře modelu IgE. Místně specifická mutageneze byla prováděna pro ověření, že tato sekvence je epitopem pro PTmAb0005 a PTmAb0011.
Analýza fágem zpřístupněných sekvencí a porovnání struktury modelu IgE (Helm, a další 1990, výše) se známou strukturou Fc lidského lgG1 (Deisenhoffer, J., 1981, Biochemistry, 20, 2361 - 2370) vedla k identifikaci tří zbytků, které se pravděpodobně účastnily rozpoznávání protilátky. Těmito zbytky jsou glutamin (Q) 273, methionin (M) 275 a aspartát (D) 276. Každý z těchto zbytků byl změněn na alanin (A) a alespoň jeden další zbytek aminokyseliny jak je ukázáno níže.
Q273: A a E (glutamát)
M275: A; Q a K (lysin)
D276: A a N (asparagin)
Mutace alaninu změnila jak strukturu, tak i chemickou povahu cílového zbytku, zatímco jiné mutace zachovaly strukturu (pokud možno co nejblíže), ale změnily náboj, například Q273E. Glutamát měl v tomto případě v podstatě stejnou strukturu jako glutamin, ale je negativně nabitý místo neutrálního náboje.
Každá mutace byla vytvořena nezávisle v konstruktu Cs2-4. Každý mutantní polypeptid byl exprimován na podobnou hladinu jako standardní typ (WT) Cs2-4 a každý byl schopen vazby na rekombinantní ektodoménu FcsRla stejně účinně jako standardní typ produktu ce2-4, přičemž pro stanovení byly používány testy na bázi ELISA. Tyto údaje tedy v souhrnu ukázaly, že mutace neměly žádný vliv na produkci/sekreci polypeptidů v expresním systému a neovlivňovaly ve větší míře strukturu fragmentu ce2-4.
Všechny mutace v podstatě zrušily vazbu jak na PTmAb0005, tak i PTmAbOOH kromě D276N, který snížil vazbu na PTmAb0005 pouze o přibližně 50 % (tabulka 10). Jako kontrola k těmto
-48 experimentům byla provedena mutace alternativního glutaminového zbytku uvnitř Cs2, Q317. Byly vytvořeny mutanty Q317E a Q317K a bylo zjištěno, že vůbec neovlivňují schopnost PTmAb0005 a PTmAbOOll rozpoznávat Ce2-4. Podobně nebylo ovlivněno 5 rozpoznávání FcsRla.
Vazebné aktivity PTmAb0005 a PTmAbOOll jsou tedy specificky ovlivňovány mutacemi uvnitř smyčky C-D domény Cs2.
Sekvence P1 tedy obsahuje hlavní vazebnou determinantu jak pro PTmAb0005, tak i pro PTmAbOOll.
Tabulka 10 Rozpoznávání konstruktů domény IgE protilátkami
PTmAb0005 a PTmAbOOll
Mutace Rozpoznávání PTmAb0005 Rozpoznávání PTmAbOOll Rozpoznávání ektodoménou FcsR1a
WtC82-4 ++++ ++++ ++++
Q273A - - ++++
Q273E - - + + + +
M275A ± + +++ +
M275Q + + ++++
M275K + ± + + + 4-
D276A - - ++++
D276N ++ - ++++
Q317E ++++ ++++ ++++
Q317K ++++ ++++ + + + +
-49- ·
7.4 Zpřesněné modelování smyčky C-D domény Cs2 IgE
Protože dosud nebyla zjištěna přesná struktura lidského IgE (ačkoli je dostupný model), pravděpodobně se v této modelové struktuře při jejím podrobném zkoumání vyskytnou chyby. Autoři 5 předkládaného vynálezu proto zpřesňovali tento model v oblasti smyčky Cs2 IgE mapováním této smyčky do ekvivalentní oblasti Cy2 lidského lgG1(Deisenhoffer, J., 1981 výše).
Na základě této nové informace o omezeních týkajících se strukturních vlastností byl navržen cyklizovaný peptid, který by při io syntéze měl přijmout konformaci, která těsně napodobuje konformaci smyčky C-D domény Cs2 v kontextu s úplnou molekulou IgE. Tento peptid, Ac-CLEDGVQMDVDLCPREAAEGDK(Ac)-NH2, byl pojmenován PT1079 (SEQ ID No.14).
Afinita PT1079 k PTmAb0005 a PTmAbOOH byla měřena 15 použitím technologie BIAcore a bylo zjištěno, že jsou velmi silně rozpoznávány obě tyto monoklonálni protilátky (rozpoznávané oběma protilátkami PTmAb0005 a PTmAbOOH se zdánlivými afinitami ~20nM, popřípadě ~250nM). Kontrolní deriváty peptidu PT1079, kde bylo místo cyklizace posunuto pouze o jediný zbytek aminokyseliny, 20 čímž došlo ke snížení délky peptidu mezi místy cyklizace o jeden zbytek aminokyseliny (PT1078) snížily vazbu peptidu jak na PTmAb0005, tak na PTmAbOOH. PT1078 byl modifikován tak, že byl přidán další zbytek takovým způsobem, že oblast smyčky měla stejný počet zbytků jako PT1079, ale tato modifikace nedokázala obnovit 25 vazbu na PTmAb0005 nebo PTmAbOOH. To ukazuje důležitost správného předkládání peptidů podle předkládaného vynálezu, aby přijaly tvar, který blízce napodobuje přirozený cíl v souvislosti s úplnou molekulou IgE.
- 50 sp' 1 poloha
C67-8
C67
D C EEC39-I
PT1079
Epitop Mimotopy model | fág
C
C
K c
M y h(x x :<; d b h'ÍT/:ay.(7. x x) y ( 0-3 ) ( 0-3 ) rozložení (5/i)
Ce2 c__d smyčka
Podtržené údaje ověřeny místně specifickou mutagenezí
Souhrn
Výše popsané experimenty ukazují, že monoklonálni protilátky PTmAb0005 a PTmAbOOl 1 specificky rozpoznávají P1. Tyto látky byly 15 použity ve studiích zobrazení fágem pro identifikaci mimotopu smyčky c-d domény Cs2 IgE, které jsou rozpoznávány monoklonálními protilátkami s vysokou afinitou.
7,5 Funkční charakterizace vlastností PTmAb0005 a PTmAbOOl 1
Následující experimenty popisují funkční vlastnosti PTmAb0005 a PTmAbOOl 1. Použití cílů těchto protilátek bude indukovat imunitní odpovědi podobné PTmAb0005 a PTmAbOOl 1. Vakcinace s použitím těchto imunogenů na bázi peptidů bude tedy mít stejné funkční vlastnosti.
- 51 - ·
Příklad 8
8.1 Materiály a metody
8.1.1 Test vazby FcsRla (destičky s proteinem A)
V tomto testu se používá rekombinantní forma ektodomény alfařetězce receptoru s vysokou afinitou pro IgE (alfa-ektodoména) pro vazbu chimérního IgE. Karboxylový konec alfa-ektodomény se fúzuje k lidské sekvenci Fc lgG1. To umožňuje vazbu rekombinantní molekuly na mikrotitrační destičky potažené proteinem A prostřednictvím oblasti Fc. Většina molekul alfa-ektodomény by tedy měla být dostupná pro vazbu ligandu a poskytuje se tak systém pro analýzu interakcí IgEreceptor. Dále popsané experimenty mají za úkol detekovat blokující aktivitu protilátek anti-lgE na (vysoce afinitní) receptor.
8.1.2 Protokol ELISA pro detekci vazby IgE na ektodoménu alfa- řetězce vysoce afinitního receptoru
Destičky se potáhnou proteinem A a přidá se 100 pl/jamku fúzního proteinu α-ecto-lg zředěného na 0,25 pg/ml v blokovacím pufru (PBS/5% BSA/0,05% Tween-20). Provede se inkubace 1 hod při 37 °C. Chimérní IgE se zředí na koncentraci 0,03125 pg/ml v 10% prasečím séru. Protilátka anti-lgE se zředí na vhodné koncentrace tohoto roztoku IgE pro test. Inkubuje se 1 hod při teplotě místnosti. Destičky se třikrát promyjí PBS/0,05% Tween-20 s použitím zařízení na promývání destiček. Přidá se 100 pl/jamku roztoku IgE : anti-lgE (čtyřnásobné paralelní stanovení každé koncentrace anti-lgE). Směs se inkubuje 1 hod při 37 °C. Destičky se třikrát promyjí PBS/0,05% Tween-20 s použitím zařízení na promývání destiček. Přidá se 100 pl/jamku konjugované kozí protilátky proti myšímu lambda-řetězci HRPO v ředění 1 : 6000 v blokovacím pufru. Směs se inkubuje 1 hod při 37 °C. Destičky se třikrát promyjí PBS/0,05% Tween-20 s použitím zařízení na promývání destiček. Přidá se 200 pl/jamku substrátu OPD
- 52 a inkubuje se při laboratorní teplotě v temnu 2 až 10 min. Reakce se ukončí přidáním 25 μΙ 25% H2SO4. Zastavené reakční směsi se míchají na třepačce na destičky při pomalé rychlosti. Odečítání OD se provádí při 490 nm.
Je možno vypočíst procenta inhibice vazby IgE na jeho receptor.
Maximální hodnota vazby pro IgE se vypočte z průměru souboru jamek, které obsahovaly IgE v samotném 10% prasečím séru (tj. bez přídavku anti-IgE).
Hodnota procenta inhibice se vypočte:
(maximální hodnota IgE - průměr paralelních stanovení anti-IgE) / maximální hodnota IgE x 100
8.1.3 Test vazby FcsRla (sestřižená ektodoména)
Tento test je v podstatě stejný jako předcházející test s tím 15 rozdílem, že na konstrukt ektodoména FcsR1a/lgG se působí proteolytickým enzymem faktor X pro rozštěpení těchto dvou částí. Část IgG Fc se odstraní použitím kuliček s proteinem A a faktor X se odstraní pomocí straptavidinových kuliček, takže se získá v podstatě čistý alfa-řetězec vyrobené ektodomény.
8.1.4 Vazebný test CD23 (FcsRII, receptor s nízkou afinitou)
Tento test byl prováděn jak na buňkách RPMI 8866, tak i na primárních lidských B-buňkách; mohou být použity dva formáty, jeden pro detekci protilátek, které se vážou na IgE asociovaný s FccRII, a 25 druhý pro analýzu, zda mAb interferovaly s asociací IgE s FcRII. Pro první test byl na buňky nanesen chimérní IgE (1 pg/ml) na 1 hod na ledu v PBS, 1% FBS, 0,1% NaN3. Nadbytečný IgE byl odstraněn a byla přidána anti-IgE mAb. Navázaná mAb byla zviditelněna krysí protilátkou proti myšímu IgGi s konjugovaným FITC. Pro druhý test byl ·· · · ·· • · ♦· ·♦ « · « • · · · «
- 53 chimérní IgE (1 pg/ml) předinkubován s IgE mAb 1 hod při teplotě místnosti za mírného míchání, před přidáním k buňkám. Tato směs byla inkubována s buňkami 1 hod na ledu a potom promyta pro odstranění nenavázaného IgE. Navázaný IgE byl detekován 5 konjugátem FITC - kozí antimyší IgE nebo navázaná mAb byla detekována konjugátem krysí protilátky proti myšímu IgGi konjugované s FITC. Když byly studie prováděny na buňkách PBMC, B-buňky byly identifikovány protilátkou proti CD19 konjugovanou s PE. Vzorky byly identifikovány průtokovou cytometrií.
8.2 Výsledky
Výsledky pro PTmAb0005 a PTmAbOOH jsou ukázány v obr. 16 až 21. Obr. 16 ukazuje koncentračně závislou vazbu monoklonální protilátky na IgE navázaný na destičky. Obr. 17 ukazuje koncentračně 15 závislou inhibici vazby IgE na konstrukt FcsR1a/lgG protilátkami PTmAb0005 a PTmAbOOH. Obr, 18 ukazuje inhibici vazby IgE na sestřiženou ektodoménu FcsRla navázanou přímo na plastické destičky protilátkami PTmAb0005 a PTmAbOOH. Obr. 19 ukazuje nepřítomnost inhibice vazby IgE na FcsRII (CD23) protilátkou 20 PTmAb0005 (klon GE-1) a PTmAbOOH. Obr. 20 a 21 ukazují koncentračně závislé blokování uvolňování histaminu z krevních basofilů alergického člověka protilátkami PTmAb0005 a PTmAbOOH.
PTmAbOOH je myší monoklonální protilátka se specificitou pro lidský IgE, která nevykazuje žádnou zkříženou reaktivitu s jinými 25 isotypy lidského IgE nebo krysího/myšího IgE. PTmAbOOl 1 se váže jak k nativnímu, tak i teplem zpracovanému IgE, jestliže se váže na destičkách ELISA v náhodné orientaci, což ukazuje, že její rozpoznávací místo na IgE není tepelně labilní. PTmAbOOH také rozpoznává IgE, jestliže je navázaný přes antigen na destičku ELISA. 30 Je důležité, že tato mAb může úplně blokovat interakci mezi lidským IgE a alfa-řetězcem vazebné složky vysoce afinitního receptoru IgE
- 54 (FcsRI). Tato mAb však stále rozpoznává IgE, jestliže byla předem navázána na FcsRI, což ukazuje, že vazebné místo pro mAb se po navázání receptorů neztrácí.
Příklad 9
9.1 Analýza vazebných vlastostí IgE pro protilátku PTmAbOOH normální ELISA a ELISA s orientovaným antigenem
Jak je popsáno v příkladu 1, byla prováděna metoda ELISA s normální vazbou IgE potažením destiček lidským chimérním IgE, io myelomovým IgE, isotypy lidských Ig nebo IgE hlodavců (1 pg/ml v karbonátovém/bikarbonátovém potahovacím pufru pH 9,6). Pro ELISA s orientovaným antigenem bylo před přidáním chimérního IgE (1 pg/ml) použito potažení NP-BSA v saturační koncentraci. Alternativně bylo provedeno potažení rozpustným lidským alfa15 řetězcem FcsRI (0,25 pg/ml) s následným potažením chimérním IgE.
Metoda ELISA byla dále prováděna jak bylo popsáno v experimentu 1 (protokol ELISA pro detekci myších protilátek proti lidskému IgE).
9.2 Výsledky
Obr. 22 ukazuje, že PTmAbOOH se váže jak na lidský/myší chimérní IgE, tak i na lidský myelomový IgE, jestliže jsou navázány na destičku ELISA v náhodné orientaci. Podobně vazba na IgE s orientovaným antigenem (tj. IgE navázaný na destičku s navázaným NP-BSA) je závislá na dávce. PTmAbOOH byla také analyzována na 25 schopnost rozpoznávat chimérní IgE po tepelném působení při 56 °C v různých časových obdobích. Obr. 22 také ukazuje, že vazebná schopnost PTmAb0011 pro IgE není ovlivněna působením tepla.
Charakterizace mAb byla dále rozšířena pro zjištění, zda byla PTmAbOOH schopna inhibovat interakci IgE se složkou alfa-řetětzce 30 receptorů IgE s vysokou afinitou (obr. 23). Předinkubace IgE
- 55 ·· · 9 ·· · • ·· ·· · · ·« • · · 9 9 » • · · » · · 9 9 • · · · · ·
999 · · 9 999 9 9 9 9 9 sPTmAbOOH před přídavkem k alfa-řetězci FcsRI navázanému na destičky vedla k inhibici interakce IgE s alfa-řetězcem FcsRI závislé na dávce. PTmAbOOH také rozpoznává (obr. 24) IgE asociovaný s alfařetězcem FcsRI v závislosti na dávce.
Příklad 10
10.1 Analýza sekrece IgE z primárních lidských B-buněk
Buňky PBMC byly vysety v koncentraci 2 x 105 buněk/jamku v 96-jamkových destičkách s jamkami ve tvaru U, v médiu doplněném io jak IL-4, tak anti-CD40. Byly přidány PTmAbOOH nebo isotypově shodná kontrolní mAb a buňky byly inkubovány 14 dnů před sklizením supernatantů pro analýzu IgE. Celkové hladiny IgE byly měřeny potažením destiček ELISA králičí protilátkou proti lidskému IgE (10 pg/ml) v 0,5M karbonátovém/bikarbonátovém pufru (pH 9,6).
Promyté destičky byly blokovány PBS, 0,05% Tween 20,5% BSA. Buněčné supernatanty i standardy IgE byly inkubovány se saturačními množstvími PTmAbOOH (10 pg/ml) 1 hod při laboratorní teplotě před přidáním na destičky ELISA, kde se mohou vytvořit komplexy IgE/antiIgE. Po inkubaci a promývacích krocích byl navázaný IgE detekován
HRP - ovčí protilátka proti lidskému IgE a potom substrátem OPD. Hladiny IgE v buněčných supernatantech potom byly odhadnuty na základě standardní křivky.
10.2 Výsledky
IgE byl předinkubován s PTmAbOOH v rozmezí dávek od pg/ml do 0,5 pg/ml a vyšetřován na vliv na následnou vazbu IgE na FceRIl na linii lidských B-buněk RPMI8866. Obr. 25 ilustruje, že předinkubace IgE s PTmAbOOH zvyšuje vazbu IgE na FcsRII. Monoklonální protilátka, která není specifická pro P1 (PTmAb0017)
- 56 vazbu IgE na receptor FcsRII nezvyšovala. PTmAbOOH také zvyšuje vazbu IgE na FcsRII na primárních B-buňkách (obr. 26).
10.3 Účinky PTmAbOOH na sekreci IgE z primárních lidských B- buněk
Mononukleární buňky periferní krve byly kultivovány s PTmAbOOH v přítomnosti dalšího IL-4 a protilátky anti-CD40, aby se podpořilo přepnutí isotypu B-buněk na sekreci IgE. Byl vyvinut test ELISA, který umožnil měření celkových hladin IgE, tj. volného IgE io a komplexu PTmAbOOH a IgE. Pro zjištění tohoto množství byl sekrenovaný IgE předinkubován se saturačními hladinami PTmAbOOH pro umožnění převedení veškerého IgE do komplexu. Celkový IgE v supernatantu tkáňové kultury byl kvantifikován na základě standardní křivky pro IgE, který byl rovněž v komplexu se saturačními hladinami 15 PTmAbOOH. Obr. 27 ilustruje, že u tří různých dárců vedla inkubace primárních B-buněk s PTmAbOOH (1 pg/ml) k podstatnému snížení celkových hladin sekrenovaného IgE. Žádná taková inhibice nebyla pozorována s isotypově shodnou kontrolní protilátkou.
10.4 Stanovení uvolňování histaminu z lidských basofílů
Byly použity dva formáty testu. PBMC od nealergických dárců byly pasivně senzitizovány 1 pg/ml chimérního IgE 30 min při 37 °C, promyty a smíchány s monoklonálními protilátkami na 30 min při 37 °C. alternativně bylo na PBMC od dárců citlivých na LolP1 přímo 25 smícháno s monoklonálními protilátkami na 30 min při 37 °C. Reakce byly zakončeny centrifugací. Uvolňování histaminu v buněčných supernatantech bylo zjišťováno specifickým imunologickým testem (Immunotech 2562). Celkový obsah buněčného histaminu byl stanoven v buňkách lysovaných 0,5% detergentem Igepal.
- 57 ·· · Φ ·Μ · * · ·· ·· ΦΦΦ» .· - · · » · · • · * ·»·· · * φφφφφ • ••φ φφφ φφ» φφ ΦΦ·
10.5 Test blokování basofilů
Schopnost protilátek anti-lgE blokovat vazbu chimérního IgE na FcsRI na lidských basofilech byla zjišťována inkubací PBMC od nealergických dárců s chimérním IgE v přítomnosti monoklonálních 5 protilátek a IL-3 po dobu 30 min při 37 °C. Buňky byly promyty a uvolňování histaminu bylo spuštěno NP-BSA na dalších 30 min při 37 °C. Reakce byly zakončeny centrifugací a uvolňování histaminu bylo měřeno výše popsaným způsobem.
io 10.6 Test inhibice alergických basofilů
Schopnost protilátek anti-lgE inhibovat degranulaci spouštěnou alergenem byla zjišťována předinkubací PBMC od dárců citlivých na LolP1 s monoklonálními protilátkami po dobu 30 min při 37 °C před spuštěním pomocí LolP1.
10.7 Zjišťování uvolňování tryptázy z lidských plicních žírných buněk
Surové suspenze žírných buněk byly připraveny z lidské plicní tkáně enzymatickým trávením směsí obsahující hyaluronidázu, pronázu a DNAázu. Buňky byly buď použity přímo nebo byly předem 20 aktivovány chimérním IgE před smícháním s protilátkami anti-lgE. Degranulace žírných buněk byla zjišťována kolorimetrickým testem granulačního enzymu tryptázy.
10.8 Stanovení uvolňování β-hexosaminídázy z buněk RBL transfekovanych lidským FcsRlcc
Transfekovaná buněčná linie RBL J41 byla získána od Dr B. Helma, University of Sheffield. Buňky byly pasivně senzitizovány buď myším monoklonálním IgE anti-DNP nebo lidským chimérním IgE anti- 58 - • *·· «9 ·«· »· 9 · ·· *· · ·»· • · · · 9· φ • ·· ·4···· • · · 9 · ·· ··· ·«·· «·· ·4«««
ΝΡ a spuštěny protilátkami proti lidskému IgE. Degranulace byla měřena kolorimetrickým testem uvolňování β-hexosaminidázy.
10.9 Výsledky
10.9.1 Anafylaktoqenicita monoklonálních protilátek anti-lqE v lidských basofilech
Řada různých monoklonálních protilátek proti IgE byla testována na svou schopnost spouštěn uvolňování histaminu jak z alergických, tak i nealergických basofilů (obr. 28). Na rozdíl od ostatních protilátek io nebyla PTmAbOOH opakovaně schopna vyvolat významné uvolňování histaminu.
10.9.2 Anafylaktoqenicita monoklonálních protilátek proti IgE v lidských plicních žírnych buňkách
Protilátka PTmAbOOH nebyla rovněž schopna uvolňovat významná množství tryptázy jak v senzitizovaných, tak i nesenzitizovaných lidských plicních žírných buňkách (obr. 29). Polyklonální protilátka proti lidskému IgE poskytla v těchto buňkách uvolňování 60 až 70 %.
10.9.3 Anafylaktoqenicita monoklonálních protilátek proti IgE v buňkách RBL transfekovaných lidským FceRla
Buňky RBL J41, pasivně senzitizované chimérním lidským IgE anti-NP, by mohly být spouštěny antigenem NP-BSA a polyklonální 25 protilátkou proti lidskému IgE, ale nikoli PTmAbOOH (obr. 30).
Naopak, jestliže jsou buňky senzitizovány myším IgE anti-DNP, byly bez účinku obě protilátky proti lidskému IgE. Tyto buňky mohly být stále spouštěny antigenem DNP-BSA.
10.9,4 Test blokování basofilů
Protilátka PTmAbOOll byla schopna blokovat vazbu IgE na FcsRI v nealergických basofilech a tak inhibovat následné spouštění antigenem NP-BSA. Hodnota IC5o této aktivity byla přibližně 60 ng/ml (obr. 31). PTmAbOOll byla také schopna účinně inhibovat uvolňování histaminu spouštěné LolP1 z alergických basofilů s hodnotou IC50 40 ng/ml (obr. 31).
Příklad 11
Studie pasivní kožní anafylaxe u opice
Protilátky PTmAb0005 a PTmAbOOll byly také testovány na aktivitu in vivo. Stručně řečeno, místní kožní žírné buňky opice kočkodana bělozeleného (Cercopithecus aethiops) byly oholeny a senzitizovány intradermálním podáním 100 ng IgE proti haptenu NP (lidský IgE anti-nitrofenylacetyl(NP) firmy Serotech) do obou paží. Po 24 hod bylo do stejného místa na jedné paži vstříknuto rozmezí množství monoklonálních protilátek, které byly testovány. Do kontrolních míst na druhé paži stejných vzířat byl vstříknut buď fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (PBS) nebo nespecifický lidský IgE (specifický pro lidský cytomegalovirus ((CMV) nebo virus lidského imunodeficitu (HIV)). Po 5 hod bylo intravenózní injekcí podáno 10 mg konjugátu BSA-NP (firmy Biosearch Laboratories). Po 15 až 30 min se u kontrolních zvířat vyvinul snadno pozorovatelný přibližně kruhový otok z anafylaxe, který je možno měřit v milimetrech. Výsledky jsou vyjádřeny buď jako střední průměr otoku skupin tří opic nebo jako procento inhibice ve srovnání s kontrolami PBS. Dec7B byla použita jako pozitivní kontrola a je popsaná v EP 0 477 231 B a rozpoznává peptid 496-506 v doméně Ce4 lidského IgE.
Množství testovaného vzorku (pg) Střední průměr otoku (mm)
mAb0005 rnAbOOH Dec7B IgEa-CMV kontrola IgEa-HIV kontrola
20 0 0 0 19,5 21
10 0 0 20 20,7 22
1 4 4,5 25 22,7 23
0,1 14,8 15,7 20 21,8 22,5
0,05 17,8 18,7 22,5 21,5 22,8
PBS 23,2 28,2 26 24,5 22,5
Procenta inhibice anafylaxe jsou ukázána na obr 32.
Tabulka 6 - Liqandy peptidů PTmAb0005 identifikované metodou primárního biopanninqu fáqového zobrazení ó z
O
LU ω
Q > o > o 0
Q LU
LU
O jC 'Φ Lxí ω σ
CM ω
O
SEQ ID No. co l·*· CD co CD CD CD o b- b- CM b- CO b- M b- uo b- <o bb-
χ—'
o O O
o _Q co O o O O O o O O co 1
(μΜ) PTmA sf CO LO <o Λ LO Λ co* X- Λ X“ Λ CD
<
ca
m
< lo
E o
H o a
CL as u. “O o < E o CO >600 19,4 9'9 KJO K 09 1 78 1
'05 H
-7 cl
(Z
Q
X
—1
o LO
LU O
o
Έ o _Q co CO o LO X“ o LO o O o o o
(D o < CM X- x—
o E
c 1—
Ό 0.
o
T
UJ gc z § LL 5 0 CL Q hl·- iWP o a Q CD GQ 0 CL
o LU cc Z H 0 O O < -J Q
I a. Q_ MQMQDHCI 0 LL CD CL CD
LADLELCF EGLQMVD ETQMTPSI UJ > Q < O σ □ RQCSDVI QMADCAA LU X LU CD O Z S KKGQWTy QTTNMDV IPPPDYEQ UPLNELHAL
o —1 CL o < z 0 LL > O
x > Q LU I— CL >- LL LU Q 1— a
z < < >- 0 > O z 1— > CD
s z > _l < ct —J x X O UJ
LL o O o o o o o o o O o
o σ O LU CD LU LU o T o 1- o
05 C lo LO LO m LO LO LO LO LO LO LO LO
> X“ v“ T“ x— T— X“ x— X~“ x—
o X X X X X X X X X X X X
JZ o o o o o o o o o o o o
Kn X X X X X X X X X X X X
b- CD o CM CD CD co CD co co o
Z-* CD CM CM co x~ LO co co b-
<D N o o o o O O o O o o o o
'05 UJ UJ LU LU LU LU LU LU LU LU LU LU
Z m U) CD O CD CD CD CD CD CD CD
I
Ol
CO
c > O >o
CG
Jsi O
Q.
CO
CG
Z5
CG h-
SEQ ID No. 00 b- σ> b- o 00 V“ b- CM 00 CO 00 xr co LO co CD 00 bco co 00 CD CO O O) CM CD
t—
O
O o O
X> o ( O í t
< 1 CD co
n. E ΙΟ. Λ A
<
s
m
< LO
Ξ O
)— o
n o O O
JO o ( o ( l 1 l
ω < 1 co co
ΙΌ Ξ A A
'05 H
' CL
ž
0
X
-J
o LO
LU O
O
X — o
c Φ JO < o O o O O o O o O o o O o O
o o E
c H
Ό CL
O
X
X > m § Q NN £Z Qí rn LR < z
VTQFNTMI QPGINDLH ISRLPVPD: DPNRGLPI fLPVRR IGVMYKGSP FSDSPLLR IDPNSTWA IYTNSTWA SGLAMRVÍ THHPGWT CDIPPVKQ .DLGHNAA ASGF
CL X Q < Ol _1 Z X co _-J —!
CO X X X < o X X X X a LU LU
CL > H co Q X o Q Q 1— Q T O _J
Q Q O Q Q > Q Q Q o Q z Q Q
CO CO co co CD Q > H 1— Q > —1 < S
X σ Σ S _J 1— X Σ > LU z SE >
O o O o o o o O O O O o o O
O o O o o o LU O o o O co o o
05 C LO LO LO LO m in LO LO LO LO LO LO LO o
> r— T“ T~ T- v— v-· T“ T- X“ v V“
o X X X X X X X X X X X X X X
-C o CJ o o o o o o o o o o o o
c X X X X X X X X X X X X X X
zev xť CD CO r- CM b- co CD LO b> co LO CM V” co ’Μ’ o co LU ESC4 CD o CM CD CO
o O o o o o o o o o o Q
•ro LU LU LU LU LU co (Λ co co co co CO
z CD □) O CD CD LU LU LU LU LU LU LU
co co
Tabulka 6 - pokračování
SEQ ID No. CO CT TT CT) LO CT to CT CO CT bCT CO CT CT CT 100 O Y~ 102 103 104 105
X“
V
o O O O
O O O O O
i 1 1 1 O O o O t í t 1 1 1
< Γ'- χ— χ— V“
ZL PTm A A A
<
m
tn
< LO
E O
H o
Ol 2 o _Q < 1 1 1 1 o b- O CO 139 257 1 1 > 1 1
Ό E
-CO H
CL
£
Q
X
_l
o LO
LU O
O
» — O
<D n < O O o o o o o o o o o O O O
O O E
c h-
n CL
O
X
VIDIEVRGSA RDVELVFGS ADFEVGNGG SDEPAGVRD WQEKDKELR TAGQLSDLP GQVVDRELK EQAMDMELR NQIMDLEI IDRQIDTLL QISDVPRV > σ z —1 LU < Q 1MDTELLNR > o Q cr > O 0
> O QC > 0 5 0 0 o < LIJ
O O o O < < < < 0 LU O o s
O o o O 0 0 > X cr a cr O 0 to
CO c o o O o o O o o O O o o o o
> V χ— Τ'— χ— x—· X- v“ χ— V“ X*“ X“ χ—
o X X X X X X X X X X X X X X
JZ o o o o < < < < < < < < < <
Kni X X X X X X X X X X X X X X
o xt LO CO co co o
zev ^r Q D38 D15 δ B25 10/3 ESB8 29/3 B15 CD CM CQ CM s 1/6e b- 0Q co
ro co to to co CQ to m m to to to CQ LU
z LU LU LU O C/) LU to co LU LU UJ to
to LU LU LU UJ
LU
sj· co c -CO > O >o
CO
u.
o Q.
SEQ ID No. 106 107 108 109 O T— 112 113
KD Rel jádra PTmAB BIA (μΜ) PTmAbOOll i 1 1 1 1 1 1
PTmAb0005 1 1 1 1 l J 1 1
Hodnocení (ECL) PTmAb0005 o o O O O o O o
YQQRDLELLAE SMGQKVDRELV SMGQEVDRELV AENDQMVDWEI GGWQESDIPGR GGWQEKDKELR HCCRIDREVSGA CAPGMGCWESVK
Knihovna XAX10 XAX10 XAX10 XAX10 XAX10 XAX10 XAX10 XAX10
Název ESB18 ESB9 ESB40 SB21/33/31 ESB32 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 ESB4/35 ESB24 ESB13
CO co o
-O co
I—
Tabulka 7 - Ligandy peptidu PTmAbOOH identifikované metodou primárního biopanningu fáqového zobrazení ó
Z □
σ LU W
Q > Q > σ o Q
LU
LU σ>
o x: 'CD X
W T3
CM ω
O
4—' tfí 05 n O
SEQ ID No. 114 UD CO 117 00 119 120 CM 122 123 124 125
X“
o O o O
X3 < E >100 >100 1 1 1 i 1 1 1 o co Λ 1 t
<
co CL
co
<
E H LO O o
CL o
— _Q CN j | l 1 b- 1 í
o: < CN Μ-
Q Tm
CL
o LO
ni O
O
ocení o _Q < Ξ 1611 910 883 547 438 158 147 O co LO co co CO CD
c I-
Ό CL
O
X
MDCE > Ια. CL Slil DLNC CMMS 0 X O O KLKP X to 5 o 0 FCGR WKDT ’HSCY WPVP
Z LCAI 2 Cč > X TF § σ —l > HF LL > —I O
LU ÍD C3 > > <. 1— CL Q X
to Q _J _J to □ > lO < CL H Q
0 0 LU CL to Q σ CL UJ □_ Q > Z
0 CL 0 X CL to Qí to CL σ CL
—I Ct Q_ to to CL LL 0 >- CL 0 X
§ 0 —1 —J LL :> LU Z z CL
> LL □_ z o CL o CL £ X >
LU < LU σ σ o LU Q LU to H
X CL CL z Q σ LU σ LU O LL CL
O O O o o o O o O o o O
to to LL LU X X Q z X Q < X
05 C LO LO LO ΙΩ LQ m m LO LO LÍD LO LÍD
> v— τ— v- x—* X“· X“ x~ X“ x~ x— v
o X X X X X X X X X X X X
_C o o o o o o o o o o o o
c X X X X X X X X X X X X
CN
CD 00 in co CO
CN sr CM LQ X-
Název EEC39/50/1 EEC131 sr o LU LU EEC40 EC115/3/ EEC36 x— o LU EEC40A EC51/48/ co CM CM O EEC41 EEC135
LU LU LU EE
I co co
Tabulka 7 - pokračování
SEQ ID No. 126 127 128 129 130 l CO 132 133 134 135 136 138 139
T-
’Γ
o
s o XJ CD o o >- 1 1
ZL < 1 xr co
E Λ
< h-
CQ CL
ca
<
E H in o o
CL o 00
Φ (X Q TmAb 1 CN t 1 χ- t 1 1 J 1 1 1 t
CL
Zj
o ΙΩ
LU O
O
ocení O _Q < E CO o O ΙΌ 596 330 330 281 118 CN LO CN CO v CO CO CN
c H
Ό CL
o
X
> CL > co
Q CL X ω
Z < X §
O —1 O a LL < CL < X DASLET DCMPA RARA § O LU X ELAL PGLL ADLC ELAL o X Q 0 PECW GYKG PDDEC
o Q. OC § X X < 2 X > X > 0 O
LU o < > ω O <3 ω > Q X
CL >- —I 5 SE NP tr LLl LIJ X > o LLl X 0 X cv 5 X < 0 ω B
LU σ Q Q 0 LU LLl ω LU H CD X ZŠ
Q_ LU o Z a Q —J Q X o < o_
o O Q O < o O Q o O O o υ O
> x h- z Q ω > B Q > 0 X U) 0
05 C Lí) LO LO m O O O o O O O o o o
> T“ X— V” V“ T“ T- T“ V v~
o X X X X X X X X X X X X X X
x: o o o o < o o o o o o o 0 o
c X X X X X X X X X X X X X X
CN
EED147/173 st o co
Název EEC116 EEC21/19 EEC55 EEC5 EEB33 EED183 EED35/53/16 EED38 EED35/53/16 EED36 00 co V“ co Q LLl EED18/47/41 EED132
LU
Tabulka 7 - pokračování
SEQ ID No. 140 141 142 143 144 145 146 147
o
z o -Q
ΣΣ <
< E l·
co CL
co
<
E H CO O O
CL O
— _Q !
Ct <
Q kí Tm
CL
_j
o m
LU o
o
o
c Φ _Q < co CM ^r T“ r- co CO o O O
o o E
c H
Ό CL
o
X
o LU 5 o > Q 1 LU z
0 01 O o 0 o o
Q o > > > 0 Ul
0 Z > X 01 ω LU —1 HÍ O 01 —i z ω >
_l H σ Q LU
CL LU 0 0 < § 0
§ 0 Q Q Q 0 o
01 > CH > > σ CL
CL a > > LU CL o
o o O o O o O o
LU 0 o H Q 01 > z
m c O O o O O o O o
> χ— T“ X- T- T-
o X X X X X X X X
o o o o o o o o
c X X X X X X X X
> σ> co co co co o LO Tt O v 1/56 io >m
Názť Q Ul UJ EED1 EED EED EED34 sr O LU Ul EED EED
Tabulka 8 - Mutanty lqEC67 se zvýšenou afinitou pro PTmAb0005 a PTmAbOOH ώ >1— Ό
O
E >> c '05 N '05
O ω
Φ o c Φ >
Φ ω c T5
O > «3
CL
ó
Z
Q σ LU co
Q > Q >
O
Q LU
SEQ ID No. co CM 148 1 149 150 LQ 152 153 154 155 156
2 CO
ZL X- O co 90' 1 1 1 1 l I 1 1 1
< O o
CQ
05
L_
Ό
•ra
LO o
Φ o o t ] i
ŮL o o o
o
n r~ sf CO CN co r-~ CD co CD CD_
< E H O O CN CM CM v CN X“ X”
CL
Έ
Φ
O
O c “0 LO O co co CN CN co co b- CT) o
o I O O xr CO CM CN v*
< < < < < < < LU
LU LU LU < < LU LU LU <
< < < LU LU < LU <
< < < < < Q < < < 05 n
LU H > < < □ LU 0
05 Cd Cd > LU 05 Cd Cd
Dl CL CL 05 Cd CL CL CL O _ 1
υ O O a. CL O Q o
_l _1 —1 O O Σ —1 _! LI 1
LU LU LU _l _J LU LU LU £
LU LU —1 _J —1 LU LU _J □_ _1
Cd Q5 a 0 0 —1 —I o O 0 0
CL Q_ < < < o 0 < < > <
O o < <
—1 —1 σ o O -J —I σ σ σ σ
—1 LU 54 54 σ o 54 54 54 z
—1 Z Z z 54 54 Z z Z z
< o < Σ S Σ Z Z S s S 5
LL LL LL LL LL LL LL LL LU
σ «sS O o Q O O O O o o
σ O o < O 0 0 0 0 0
z 54 < < < < < < < < <
s z 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LL LL O 0 o O 0 0 O 0 O
o o < < < < < < < < <
> Φ N ‘OJ <0 O LU CO 1 Nco O o X- b- co O LL1 C67-1 CM 1 >CO O C67-3 CN 1 bco O LU C67-9 Ν’ 1 bCO O LO 1 bCO O CD 1 bCO O
z O) LU LU LU LU LU LU LU LU
O) O) O) O) O) O) O) CD CD
Tabulka 8 - pokračování
SEQ ID No. 157 158 159 160
s X-
ZL X“ 1 1 1
O
< o
m
ra
ό
•ra
·—? LO
o O
01 O
Q O
.Q < X“ O σ> 6'0 8'0
E o
H
CL
Έ
(D
o
o
c m CXI
“D o CO
o o X“ x—
X o
<
LU < < LU < LIJ < LU
< < < < < < < <
CH 0 > LU
CL Cd Cd Cd
O CL CL CL
O O O
LU u -J —1
LU —1 LU CD LU
Q Q Q Q
< < < <
σ
σ σ σ σ
1SÍ
z Z z z
s Σ s Σ
LL LL LL LL
O O O o
0 0 LU 0
< < < <
0 0 0 0
Q Q Q Q
< < < <
CO r-
X“ X X-
> Φ b- b- b-
N <o co (0 o LU CD
-«5 O O o
Z LU LU LU
□) O) □)
• ·
Tabulka 9 Mutanty lgEC67-8 se zvýšenou afinitou pro PtmAb0005
Q
O
LU ω
Q > Q > O O Q LU
SEQ ID NO. CN 5“ 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 b-
Hodnocení B O o CO 2,14 2,02 1,85 1,32 1,70 1,39 1,83 CN LO V“ 1,50
Hodnocení A 1,00 1,73 1,56 1,54 1,54 LO Ti V“ 1,44 1,38 bCO r— 1,29 Ν’ CN V 1,22
GCFINKQMADLELCPRE Mutanty se zvýšenou afinitou pro PTmAb0005 ADGAGCFINMQMADQELCPRAAAEA ADGAGCFINKQMSDFELCPREAGEA ADGAGCFINKQMADLELCTREAAEA < LU < < σ ai £L o —I LU —I Q < a Z LL o o < 0 Q < ADGAGCFINNQMADLELCPRGGAEA ADGAGCFINKQMADWELCPREGAEA ADGAGCFINKQMADLELCPSQAAEA ADGAGCFINKQMADLELCPREGAEA ADGAGCFINKQMADSELCPREPAEA ADGAGCFINKQMADLELCPREAWEA ..... ADGAGCFINKQMADRELCAREVAEA
Klon lgEC67-8 1-3 2-13 3-11 3-1, 3-9, 3-10 1-11 2-15 4-9 1-4, 1-2, 1-12 5-16 2-12
ΓΌ i OO 1 CO l —X _x 1 2-3 —X 1 -A 5-2 5-10 -Λ. 1 00 5-11 Mutanty s podobnou afinitou pro PTmAb0005 1 O 4-2, 4-3 1-5 1-16 2-9, 2-6 1-9, 2-5 lgEC67-8 Klon
ADGAGCFINKQMADLELCPREAAEA ADGAGCFINKQMADMELCPREAAEA ADGAGCF1EKQMADMELCQRETAEA ADGAGCFINNQMADLELCPREAAEA ADGAGCFINKQMADWELCPREAAEA ADGAGCFIEKQMADMELCQARAAEA ADGAGCFINRQMADPELCPREAAEA ADGAGCFINKQMADSELCPAAAAEA ADGAECFINKQRADLELCPGEAAEA ADGAGCFQNKQMADLELCPREAAEA ADGAGCFKNKQMVDSELCARQAAEA ADGAGCF1NKQMADLELCRREAGEA ADGAGCFINDKQMADLELCPRAAAEA GCFINKQMADLELCPRE
1,00 1,03 1,04 1,04 1,05 O 00 1,09 o —X 1,13 φ. 1,19 1,21 1,00 Hodnocení A
—X o o 1,31 1,29 1,24 1,83 1,32 1,97 1,08 1,60 ω 1,17 1,54 —X —X O O Hodnocení B
00 183 182 181 180 179 178 177 i 176 175 174 173 172 ro SEQ ID NO.
Tabulka 9 - pokračování
6-10 6-12, 5-8 6-9,5-1,6-2,6-8, 6-4 Mutanty s afinitou pro streptavidin 4-4 2-11,2-4,2-10,2-7 1-7 1-6 lgEC67-8 Klon
ADGAGCSIHRQMADWERCLREGAEA ADGAGCSIHTQMADWERCLREGAEA ADGAGCFISPQLADWKRCMREAAEA ADGAECFINRQMADLELCGREAAEA ADGAGCFINRQLADMELCSRGAAEA ADGAGCFINKQMADLELCPARAAEA ADGAGCFRNKQMADLELCPREAAEA GCFINKQMADLELCPRE
0,91 O co OJ 1,53 0,69 0,79 0,91 i 0,95 1,00 Hodnocení A
0,69 0,67 1,19 1,03 1,39 1,25 1,16 1,00 Hodnocení B
CO 190 189 00 00 187 186 185 —i. NO SEQ ID NO.
Tabulka 9 - pokračování
• · • ♦ • · • • 99 • 999 9 9
• ♦ · • · • • • • · • · 9
♦ · ♦ · • 9 9 9 • · • * · ·
•
· • ·
Údaje o uloženém mikroorganismu nebo jiném biologickém materiálu
a. i ne indications ataae beiow relate to tne aepasttcd mtcroorszntsm orocner btoiagicci nutertcx retcrred to in the aescnptson on pase ^2____ . line . 12-17_____________________
B. IDE?ÍTIFICATION OF DEPOSIT Fwtftcr dsscsis iro id^íiiiňei on on oddicionoi snes: j |
Nontc oťasposicnry tnsmuuon
European Collection of Cell Cultures
Aaoress oc aepcsiary insíirution (inciuáingpostat cade aná coumrt)
Vaccine Research and Production Laboratory Public Health Laboratory Service
Centre For AppLied Microbiology Research
Porton Down, Salisbury
Wiltshire SP4 OJG, GB
Ooic oc dsoostc 08 March 1999 (08/03/99) Acczssion Nutrsber 99030805
G aDOCTTONAL INDíCATIONS (leove birmk if nat ozpiiczšit) This tnfonazáau ts oonánued on an addítiocuf sheot U
In nespeče of those designations where a European Patent is sought, a sample of the deposited nxcroorganisni wi.ll be nade available until the publication of the mencian af the grant of the European Patent or 1 the data on which the application has been refused or withdrawn, anly by issue of such a sample co an expert notninated by the persoc requesting the saeple.
0. DESIGN ATED STATíS FOR WHICH ÍNDICATIONS ARE ůtADE (tf the ináteations cre not for ail dai^natedStatek) — SEFARATs. FURNISHINC OF INDíCATIONS flesvt biamc if not aapiicsaíe)
Tne tnaicsaons lutea oetow wtH be suotnittea to tne Intemtmor.ai 3ureou \2t=r iVumcero/Dwoá '
For reeeivtng Office use only [~j This sňect.was recetvsd wtth tfte intečnaáonal appiicůon
Awnortzed otticer — . — súf interncsicttal Bureau use only | | This snést wos reesived by the intecsadaaal Bureau βα·
Autnanzei aťficcr

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Peptid obsahující izolovaný povrchově exponovaný epitop domény Cs2 IgE, nebo jeho mimotop.
2. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Ce2 je P1 (SEQ ID No. 1) nebo jeho mimotop.
3. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Ce2 je P2 (SEQ ID No. 2) nebo jeho mimotop.
4. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Cs2 je P3 (SEQ ID No. 3) nebo jeho mimotop.
5. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Ce2 je P4 (SEQ ID No. 4) nebo jeho mimotop.
6. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Cs2 je P5 (SEQ ID No. 5) nebo jeho mimotop.
7. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Ce2 je P6 (SEQ ID No. 6) nebo jeho mimotop.
8. Peptid podle nároku 1, kde povrchově exponovaným epitopem Cs2 je P7 (SEQ ID No. 7) nebo jeho mimotop.
9. Mimotop podle některého z nároků 1 až 8, kde tímto mimotopem je peptid.
10. Peptid podle nároku 1, kde izolovaný epitop je odvozený ze struktury smyčky domény Cs2 IgE.
11. Peptid podle nároku 10, kde struktura smyčky domény Cs2 IgE je smyčka A-B nebo smyčka C-D.
12. Peptid podle nároku 2, kde mimotopem P1 je peptid obecného vzorce: hxdhhananxy;
kde h je zbytek hydrofobní aminokyseliny; d je zbytek aminokyseliny schopné poskytnout iontovou vazbu; a je zbytek kyselé aminokyseliny; n je zbytek iontově neutrální/nepolární aminokyseliny; a x je nějaká aminokyselina.
13. Peptid podle nároku 2, kde mimotopem P1 je peptid obecného vzorce:
Q, Xn M, D, Xf, X2, X3 kde Xi je zvoleno z V, I, L, M, F nebo A; X2 je zvoleno z D nebo E; a X3 je zvoleno z L, I, V, M, A nebo F.
14. Peptid podle nároku 2, kde mimotop P1 je zvolen ze skupiny P15q (SEQ ID No. 11), PT1079 (SEQ ID No. 13), PT1079GS (SEQ ID No. 15), PT1078 (SEQ ID No. 16), PT15 (SEQ ID No.
8).
15. Peptid podle nároku 3, kde mimotopem P2 je P16 (SEQ ID No. 24).
16. Peptid podle nároku 4, kde mimotopem P3 je P17 (SEQ ID No. 26).
17. Imunogen pro léčení alergie, který obsahuje peptid nebo mimotop podle některého z nároků 1 až 16 a navíc obsahuje nosnou molekulu.
18. Imunogen podle nároku 17, kde nosná molekula je zvolená z proteinu D nebo jaderného antigenu hepatitidy B.
19. Imunogen podle nároku 17 nebo 18, kde imunogen je chemický konjugát peptidů nebo mimotopu podle některého z nároků 1 až 16, nebo kde imunogen je exprimován jako fúzní protein.
20. Imunogen podle některého z nároků 17 až 19, kde peptid nebo mimotop peptidů je přítomen uvnitř primární sekvence nosiče.
21. Vakcína pro léčení alergie, vyznačující se tím, ž e obsahuje imunogen podle některého z nároků 17 až 20 a dále obsahuje adjuvans.
22. Ligand schopný rozpoznávat povrchově exponovaný epitop domény Cs2 IgE, vyznačující se tím, že tímto ligandem není PTmAb0005.
23. Ligand podle nároku 22, kterým je ligand PTmAbOOH uložený podle Budapešťské úmluvy u ECACC 8. března 1999 pod depozitním číslem No. 99030805.
24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje ligand schopný rozpoznávat povrchově exponovaný epitop domény Cs2 IgE.
25. Farmaceutický prostředek podle nároku 24, vyznačující se tím, že ligand je schopný rozpoznávat smyčku C-D domény Ce2 IgE.
26. Farmaceutický prostředek podle nároku 25, vyznačující se tím, že ligand je monoklonáJní protilátka zvolená z PTmAb0005 nebo PTmAbOOH.
27. Peptid podle některého z nároků 1 až 16 pro použití v lékařství.
28. Vakcína podle nároku 21 pro použití v lékařství.
29. Imunogen podle některého z nároků 17 až 20 pro použití v lékařství.
30. Použití peptidu podle některého z nároků 1 až 16 při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci alergie.
31. Ligand schopný rozpoznávat povrchově exponovaný epitop domény Οε2 IgE pro použití v lékařství.
32. Použití ligandu schopného rozpoznávat povrchově exponovaný
5 epitop domény Ce2 IgE při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení alergie.
33. Použití ligandu podle některého z nároků 31 nebo 32, kde ligandem je PTmAb0005 nebo PTmAbOOl 1.
o
34. Použití PTmAb0005 nebo PTmAbOOl 1 při identifikaci mimotopů P1.
35. Peptid rozpoznatelný PTmAb0005 nebo PTmAbOOl 1.
36. Imunogen obsahující peptid podle nároku 35.
37. Použití peptidů podle některého z nároků 1 až 16 při diagnóze nebo při afinitní purifikaci cirkulujících protilátek anti-lgE z krve.
o
38. Způsob výroby vakcíny, vyznačující se tím, ž e zahrnuje výrobu imunogenu podle některého z nároků 17 až 20 a formulaci imunogenu s adjuvans.
39. Způsob léčení pacienta trpícího nebo vnímavého k alergii, který zahrnuje podávání peptidů podle některého z nároků 1 až 16 pacientovi.
40. Způsob léčení pacienta trpícího nebo vnímavého k alergii, který zahrnuje podávání vakcíny podle nároku 21 pacientovi.
5 41. Způsob léčení pacienta trpícího nebo vnímavého k alergii, který zahrnuje podávání farmaceutického prostředku podle některého z nároků 24 až 26 pacientovi.
CZ20013082A 1999-02-25 2000-02-22 Peptid CZ20013082A3 (cs)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9904405.9A GB9904405D0 (en) 1999-02-25 1999-02-25 Vaccine
GBGB9907151.6A GB9907151D0 (en) 1999-03-29 1999-03-29 Therapeutic antibody composition and use
GBGB9910537.1A GB9910537D0 (en) 1999-05-07 1999-05-07 Therapeutic antibody, Immunogenic compositions and uses
GBGB9910538.9A GB9910538D0 (en) 1999-05-07 1999-05-07 Therapeutic antibody, Immunogenic compositions ansd uses
GBGB9918603.3A GB9918603D0 (en) 1999-08-07 1999-08-07 Novel peptides
GBGB9918594.4A GB9918594D0 (en) 1999-08-07 1999-08-07 Novel peptides
GBGB9921047.8A GB9921047D0 (en) 1999-09-07 1999-09-07 Therapeutic antibody, immunogenic compositions & uses
GBGB9921046.0A GB9921046D0 (en) 1999-09-07 1999-09-07 Therapeutic antibody composition & use
GBGB9925619.0A GB9925619D0 (en) 1999-10-29 1999-10-29 Vaccine
GBGB9927698.2A GB9927698D0 (en) 1999-11-23 1999-11-23 Therapeutic antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013082A3 true CZ20013082A3 (cs) 2002-02-13

Family

ID=27579426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013082A CZ20013082A3 (cs) 1999-02-25 2000-02-22 Peptid

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1155037A1 (cs)
JP (1) JP2004538238A (cs)
KR (1) KR20020007313A (cs)
CN (1) CN1348466A (cs)
AR (1) AR029336A1 (cs)
AU (1) AU2672700A (cs)
BR (1) BR0008963A (cs)
CA (1) CA2363637A1 (cs)
CO (1) CO5210906A1 (cs)
CZ (1) CZ20013082A3 (cs)
HK (1) HK1044004A1 (cs)
HU (1) HUP0200049A2 (cs)
IL (1) IL145024A0 (cs)
MX (1) MXPA01008613A (cs)
NO (1) NO20014130L (cs)
NZ (1) NZ513679A (cs)
PL (1) PL350993A1 (cs)
TR (1) TR200102506T2 (cs)
WO (1) WO2000050460A1 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9913327D0 (en) * 1999-06-08 1999-08-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6787524B2 (en) 2000-09-22 2004-09-07 Tanox, Inc. CpG oligonucleotides and related compounds for enhancing ADCC induced by anti-IgE antibodies
JP4229704B2 (ja) * 2001-04-18 2009-02-25 ダイアックス、コープ Ｆｃ領域ポリペプチドの結合分子
GB0209878D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AR065368A1 (es) * 2007-02-15 2009-06-03 Astrazeneca Ab Anticuerpos para moleculas de ige
JP2010519194A (ja) * 2007-02-15 2010-06-03 アストラゼネカ・アクチエボラーグ ＩｇＥ分子に対する結合要素
ES2615881T3 (es) 2009-05-07 2017-06-08 Stallergenes Uso de inmunoglobulinas igg1 y/o de ligandos del receptor cd32 para el tratamiento de enfermedades y manifestaciones inflamatorias por vía mucosa.
EP3882274A4 (en) * 2018-09-21 2022-06-29 Riken Anti-ige antibody specifically binding to membrane-bound ige antibody of ige antibody-producing b cells and method for diagnosing and treating allergic symptoms using the same
US20240245190A1 (en) 2023-01-19 2024-07-25 Sharkninja Operating Llc Identification of hair care appliance attachments

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4171299A (en) * 1975-04-04 1979-10-16 The Regents Of The University Of California Polypeptide agents for blocking the human allergic response
WO1998024808A2 (en) * 1996-12-06 1998-06-11 THE UNITED STATES OF AMERICA represented by THE SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, THE NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH INHIBITION OF IgE-MEDIATED ALLERGIES BY A HUMAN IgE-DERIVED OLIGOPEPTIDE
EP0996857B1 (en) * 1997-07-17 2009-09-09 Ludwig Institute For Cancer Research Cancer associated nucleic acids and polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
PL350993A1 (en) 2003-02-24
HUP0200049A2 (en) 2002-05-29
IL145024A0 (en) 2002-06-30
BR0008963A (pt) 2001-11-27
AU2672700A (en) 2000-09-14
WO2000050460A1 (en) 2000-08-31
TR200102506T2 (tr) 2002-06-21
KR20020007313A (ko) 2002-01-26
JP2004538238A (ja) 2004-12-24
MXPA01008613A (es) 2003-06-24
NZ513679A (en) 2001-09-28
NO20014130D0 (no) 2001-08-24
CA2363637A1 (en) 2000-08-31
EP1155037A1 (en) 2001-11-21
NO20014130L (no) 2001-09-13
CO5210906A1 (es) 2002-10-30
HK1044004A1 (zh) 2002-10-04
AR029336A1 (es) 2003-06-25
CN1348466A (zh) 2002-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3421970B2 (ja) ペプチド免疫原
CA2329754C (en) Peptide composition as immunogen for the treatment of allergy
US8741294B2 (en) Anti-CεmX antibodies capable of binding to human mIgE on B lymphocytes
CZ20013081A3 (cs) Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití
KR100492202B1 (ko) 면역글로불린과 그의 고친화성 수용체와의 결합을 억제하는 항체에 대한 항-이디오타입 항체
CZ20013082A3 (cs) Peptid
AU2012277491B2 (en) Contiguous overlapping peptides for treatment of ragweed pollen allergy
US20040115220A1 (en) Vaccine
US20030147906A1 (en) Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses
US20050214285A1 (en) Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses
US20030170229A1 (en) Vaccine
WO2003092714A2 (en) Peptide variants of ige constrained by beta-lactam bond
CA2329152A1 (en) Peptide vaccine for canine allergy
ZA200107016B (en) Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses.
MXPA00011938A (en) Peptide composition as immunogen for the treatment of allergy