ES2615881T3 - Uso de inmunoglobulinas igg1 y/o de ligandos del receptor cd32 para el tratamiento de enfermedades y manifestaciones inflamatorias por vía mucosa. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-IgE de tipo IgG1 con la capacidad de unir las IgE fijadas a los receptores de la superficie de un mastocito o basófilo sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores de la superficie de un mastocito o basófilo, para usarlo en el tratamiento de una hipersensibilidad de tipo 1, dicho anticuerpo anti-IgE se administra por vía mucosa.

Description

DESCRIPCION

Uso de inmunoglobulinas iggl y/o de ligandos del receptor cd32 para el tratamiento de enfermedades y manifestaciones inflamatorias por via mucosa 5

[0001] La presente invencion se refiere al uso de anticuerpos anti-IgE de tipo IgGi con capacidad para unir las IgE a la superficie de los mastocitos o basofilos sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores de la superficie de un mastocito o un basofilo, para el tratamiento de hipersensibilidades de

10 tipo I.

[0002] Las alergias son reacciones de hipersensibilidad anormales, inadaptadas y excesivas del organismo provocadas por un contacto con un elemento, que suele ser externo, el alergeno. Estas reacciones se clasifican en cuatro grupos en funcion de los mecanismos de dichas reacciones, que derivan en sintomas alergicos. La alergia

15 inmediata, o hipersensibilidad de tipo 1, se caracteriza por la liberacion por los mastocitos y los basofilos de mediadores proinflamatorios, como la histamina, citocinas proinflamatorias y leucotrienos (Mobs et al. (2008) Int. Arch. Allergy Immunol. 147: 171-178) despues de una estimulacion inducida por el entrecruzamiento de IgE en la superficie de dichas celulas.

20 [0003] La aparicion de una hipersensibilidad de tipo 1 esta provocada por una serie de acontecimientos que

implican a diferentes actores del sistema inmunitario. En primer lugar, las celulas presentadoras del antigeno y los linfocitos B especificos del alergeno se encargan del alergeno. Despues algunos fragmentos de este alergeno se presentan a traves del complejo mayor de histocompatibilidad, o CMH, a linfocitos T lo que induce la activacion de los linfocitos T especificos del alergeno y a la secrecion de IL-4 por estos. La activacion de linfocitos B por estos 25 linfocitos T en presencia de IL-4 y del alergeno induce la diferenciacion de dichos linfocitos B en plasmocitos secretores de IgE especificas del alergeno. Las IgE asi producidas se van a fijar por su fragmento Fc a la superficie de mastocitos y basofilos. El alergeno, en un segundo contacto, entrecruza dichas IgE e induce la liberacion de sustancias proinflamatorias por los basofilos y los mastocitos, en concreto a traves de un fenomeno de desgranulacion (Bush et al. (2004) Treat. Respir. Med. 3: 45-57; Strunck et al. (2006) N. Engl. J. Med. 354: 268930 2695). Estas sustancias son responsables de los sintomas de la alergia como el asma, la rinitis o la conjuntivitis.

[0004] Las IgE son conocidas por ser capaces de fijarse por su fragmento Fc a dos tipos de receptores, el receptor de alta afinidad RFceI y el receptor de baja afinidad RFceII, o CD23 (Klubal et al. (1997) J. Invest. Dermatol. 108: 336-342, Dierks et al. (1993) J. Immunol. 150: 2372-2382), los mastocitos y basofilos expresan fuertemente el

35 RFceI.

[0005] Se ha considerado el uso de diferentes inmunoglobulinas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y de alergias.

40 [0006] Asi, Nimmerjahn y Ravetch indican que las Ig intravenosas (IVIG) administradas en dosis elevadas

permitian tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Nimmerjahn y Ravetch (2007) JEM 204:11-15). Segun los autores, el efecto antinflamatorio observado con las IVIG puede estar relacionado con una poblacion de IgG que transporta acidos sialicos en los polisacaridos N- unidos al residuo Asn297 de la region Fc de dichas IgG. Mas precisamente, esta actividad antinflamatoria es dependiente de la sialilacion por enlaces 2,6 de la antepenultima 45 galactosa de la cadena de N-glicosilaciones unidas al residuo Asn297 (Anthony et al. (2008) Science 320:373-376). En esta ultima publicacion se propone administrar las IVIG por via intravenosa para tratar enfermedades inflamatorias.

[0007] La solicitud internacional WO 2008/057634 por su parte propone utilizar un polipeptido que comprenda 50 al menos una region Fc de IgG con un nivel de sialilacion superior al de una preparacion de anticuerpos no

purificada, para tratar una enfermedad inflamatoria. En este tipo de estrategia, la sialilacion de las IgG aparece como particularmente importante para obtener una mayor eficacia en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.

[0008] La solicitud internacional WO 2009/079382 describe el uso de un polipeptido que comprende al menos 55 una region Fc de IgG con un nivel de sialilacion superior al de una preparacion de anticuerpos no purificada para el

tratamiento de enfermedades inflamatorias. En ese caso tambien es necesaria la sialilacion de las IgG para observar una actividad antinflamatoria. Se han definido tres estados diferentes de las IgG segun el nivel de sialilacion de su region Fc (Anthony et al. (2008) Science 320:373-376). En su estado desialilado, las IgG conferirian una actividad citotoxica por su union a los receptores de Fc activadores. Las IgG perderian su capacidad citotoxica por sialilacion

del polisacarido unido a Fc, transformando as! las IgG a un estado no reactivo, no inflamatorio, reduciendo la union al receptor FcR. Ademas, las IgG se convertirlan en antinflamatorias por union del acido sialico 2,6 al receptor correspondiente. Se ha mostrado mas precisamente que el efecto antinflamatorio de estas IVIG en forma sialilada se debla a su union con el receptor SIGNR, correspondiente al receptor humano DC-SIGN (Anthony et al. (2008) Proc. 5 Natl. Acad. Science 105:19571-19578). El receptor SIGN-R1 esta localizado, en el raton, en los macrofagos de la zona marginal del bazo, mientras que su homologo humano DC-SIGN se encuentra en las celulas dendrlticas.

[0009] Para obtener un efecto antinflamatorio optimo, es necesario por tanto que los receptores SIGN- R1/DCSIGN sean directamente accesibles a las inmunoglobulinas administradas. Sin embargo, los presentes

10 inventores han mostrado que dichos receptores solo se encontraban en el tejido muscular de la lengua, lejos del lugar de administration en caso de administration por via sublingual. Por consiguiente, el uso de las IVIG no es apropiado para el tratamiento de enfermedades inflamatorias por via mucosa.

[0010] Por ultimo, la solicitud internacional WO 2003/041731 describe el uso para el tratamiento de la alergia 15 de un compuesto que comprende un dominio Fc de IgG, especlfico del receptor FCy, y un dominio de fijacion a un

alergeno.

[0011] De forma sorprendente, los inventores han observado una mejora de los slntomas del asma alergica administrando por via sublingual anticuerpos de tipo IgG1, en forma sialilada o no, y sin que dicha mejora este

20 relacionada con un idiotipo particular. Paralelamente han puesto demostrado que los tejidos de las enclas humanas comprenden una proportion mas importante de receptores CD32 que de receptores activadores CD16, en particular, en las papilas dermicas. Sin estar unido por un mecanismo de action, el efecto antinflamatorio observado con los anticuerpos de tipo IgG1 (algunos de los cuales no son sialilados) administrados por via sublingual podrla mediarse por su union a los receptores CD32.

25

[0012] Ademas, una estrategia de terapia de la alergia descrita en la tecnica anterior consiste en centrarse especlficamente en las IgE.

[0013] Por tanto se ha planteado la disminucion de linfocitos B secretores de IgE. En la solicitud de patente 30 WO2008116149, se han preparado anticuerpos anti-IgE capaces de reconocer epltopos particulares de las IgE de

superficie de linfocitos B. Dichos anticuerpos producen el entrecruzamiento de las IgE de superficie e inducen, a falta de otras senales, la apoptosis de los linfocitos B. Otra particularidad de dichos anticuerpos anti-IgE es que no reconocen las IgE en la superficie de los basofilos y de los mastocitos, para evitar el entrecruzamiento de dichos anticuerpos en la superficie de dichas celulas, entrecruzamiento que conllevarla la liberation de sustancias 35 proinflamatorias.

[0014] En WO2010033736 se describe una alternativa que consiste en inhibir los linfocitos B secretores de IgE utilizando moleculas capaces de unir a la vez las IgE de superficie y CD32B. En particular se han utilizado anticuerpos anti-IgE mutados para aumentar la afinidad de la region Fc con CD32B.

40

[0015] Otras investigaciones tambien han intentado evitar las manifestaciones cllnicas de la alergia, impidiendo la fijacion de las IgE a la superficie de los basofilos y de los mastocitos.

[0016] Asl, un anticuerpo anti-IgE humana de tipo IgG1 k humanizado al 95 % ha sido desarrollado y utilizado 45 en terapia con el nombre de Omalizumab, comercializado con la marca Xolair (Genentech/Novartis). Dicho

anticuerpo ha sido producido de forma que presenta dos caracterlsticas esenciales. En primer lugar inhibe la union de las IgE a los receptores RFceI que se encuentran en la superficie de los mastocitos y de los basofilos, uniendose a un epltopo de la molecula de IgE circulante que esta implicado en dicha union (Presta et al. (1993) J. Immunol. 151: 2623-2632). Seguidamente, y por consiguiente, dicho anticuerpo es incapaz de reconocer los anticuerpos IgE 50 fijados a los basofilos o los mastocitos, porque el punto de fijacion esta oculto. Esta ultima caracterlstica parecla esencial para evitar la activation de dichas celulas que se producirla si el anti-IgE fuera capaz de reconocer las IgE de superficie y por consiguiente de entrecruzarlas, a la manera de un alergeno.

[0017] El uso de dicho anticuerpo ha permitido disminuir la intensidad de los slntomas alergicos secuestrando 55 y produciendo la elimination de las IgE circulantes, lo que, a traves de un retrocontrol, induce el descenso del

numero de receptores RFceI en los mastocitos de los basofilos (Bush et al. (2004) Treat. Respir. Med. 3: 45-57, Saini et al. (1999) J. Immunol. 162: 5624-5630). Sin embargo, la indication de Omalizumab sigue estando limitada al tratamiento de adolescentes (de 12 anos o mas) y de adultos que sufran un asma persistente moderada a severa, que presenten igualmente una prueba cutanea positiva o una reactividad in vitro a un aeroalergeno peranual, y en

quienes un tratamiento por corticoides inhalados no permite controlar dicho asma (Bang et al. (2004) BioDrugs 18: 415-418). Esta limitacion en el uso se debe en particular a un cierto numero de efectos secundarios y defectos del Omalizumab, as! como a la falta de information sobre el efecto del Omalizumab a largo plazo. Entre los efectos secundarios se puede citar en particular las reacciones locales en el punto de inyeccion (Omalizumab: new drug 5 (2007) Prescrire Int. 16: 179-182), la reaparicion de una poliposis nasal (Tonnel et al. (2006) N. Engl. J. Med. 355: 1282), una insuficiencia suprarrenal subaguda (Tonnel et al. (2006) N. Engl. J. Med. 355:1282), y la induction posible de un slndrome de Churg y Strauss (Winchester et al. (2006) N. Engl. J. Med. 355: 1281-1282). Se han observado asimismo reacciones de anafilaxia (Omalizumab: new drug (2007) Prescrire Int. 16: 179-182), de forma que el producto debe administrarse obligatoriamente bajo un estricto control medico. Ademas, el paciente debe ver a

10 un medico cada dos o cuatro semanas para recibir entre una y tres inyecciones subcutaneas del producto. Teoricamente el tratamiento debe tomarse de por vida, en la medida en que los efectos que conducen a la mejorla de los slntomas (disminucion de las IgE circulantes y disminucion del numero de receptores en la superficie de los basofilos) son reversibles cuando se deja el tratamiento (Saini et al. (1999) J. Immunol. 162: 5624-5630).

15 [0018] Tambien es posible que la elimination de mas del 95 % de las IgE circulantes sea problematica en la

medida en que las IgE pueden desempenar una funcion importante en la lucha contra las parasitosis (Cooper et al. (2008) Allergy 63: 409-417) y/o contra los canceres (Gould et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3527-3537, Karagiannis et al. (2003) Eur. J. Immunol. 33: 1030-1040, Karagiannis et al. (2007) J. Immunol. 179: 2832-2843, Karagiannis et al. (2008) Cancer Immunol. Immunother. 57: 247-263). De hecho, los estudios cllnicos han mostrado que en los

20 pacientes tratados por Omalizumab aumentaban sus probabilidades de contraer canceres de diferentes tipos (0,5 %), en comparacion con pacientes que tomaban placebo (0,2 %).

[0019] Por ultimo, el tratamiento con Omalizumab puede ser oneroso.

25 [0020] Para reducir las cantidades de anticuerpos anti-IgE administrados durante el tratamiento, se han

descrito anticuerpos mejorados dirigidos contra las IgE con una alta afinidad con estas. As! la solicitud de patente EP2000481 ha descrito anticuerpos anti-IgE que bloquean la union de las IgE a su receptor de alta afinidad RFceI para un uso en terapia as! como para el diagnostico de la alergia.

30 [0021] En la solicitud WO2008123999, los anticuerpos anti-IgE utilizados son anticuerpos humanos, lo que

permite evitar el riesgo de una reaction inmunitaria dirigida contra anticuerpos murinos humanizados.

[0022] La solicitud EP0550020 describe por su parte anticuerpos capaces de reconocer las IgE fijadas a la superficie de los mastocitos y basofilos y disociarlas de sus receptores en la superficie de dichas celulas. Asl, estos

35 anticuerpos no inducen el entrecruzamiento de las IgE y por tanto la liberation de mediadores proinflamatorios.

[0023] Otros anticuerpos capaces de unir las IgE fijadas a la superficie de los mastocitos y basofilos sin entrecruzarlos se describen en la solicitud WO0050460.

40 [0024] El conjunto de estos estudios relativos a los anticuerpos anti-IgE como vectores de tratamiento de las

alergias inmediatas coincide en el hecho de que dichos anticuerpos anti-IgE deben ser necesariamente incapaces de entrecruzar las IgE en la superficie de los mastocitos y basofilos, para evitar la liberacion de mediadores proinflamatorios inducida por dicho entrecruzamiento. Ademas, algunos de estos estudios, si no todos, conducen a la eliminacion de la totalidad de las IgE circulantes, lo que, como se ha mencionado anteriormente, puede tener

45 efectos secundarios molestos.

[0025] Los metodos actuales de tratamiento de las alergias con ayuda de anticuerpos anti-IgE por tanto son

insatisfactorios, habida cuenta de las desventajas mencionadas anteriormente.

50 [0026] Actualmente los inventores han mostrado que una inmunoglobulina de tipo IgG1, en particular anti-IgE,

y en particular una IgG1 anti-IgE con capacidad de entrecruzar las IgE en la superficie de los mastocitos y basofilos, induce de manera sorprendente una mejora de los slntomas del asma alergica cuando se administra por via sublingual.

55 Definiciones

[0027] En la presente solicitud los terminos «anticuerpo» e «inmunoglobulina» tienen el mismo significado y

se utilizan indistintamente. Un anticuerpo corresponde a una inmunoglobulina asl como a las porciones inmunologicamente activas de las inmunoglobulinas, siendo estas moleculas que contienen los puntos de fijacion

especlficos de un antlgeno dado.

[0028] El termino anticuerpo abarca el anticuerpo completo as! como las variantes del anticuerpo, incluyendo derivados como los anticuerpos humanizados. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas estan unidas una

5 a la otra por puentes disulfuro y cada cadena pesada esta unida a una cadena ligera tambien por un puente disulfuro. Hay dos tipos de cadenas ligeras: las cadenas ligeras lambda (A) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadenas pesadas que determinan la actividad funcional del anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios diferentes. La cadena ligera contiene dos dominios: un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada contiene cuatro o cinco dominios segun las clases de anticuerpos: un dominio 10 variable (VH) y de tres a cuatro dominios constantes (CH1, CH2 y CH3 y eventualmente CH4, agrupados bajo la denominacion de CH). Las regiones variables de cada una de las cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) determinan la especificidad del antlgeno y el punto de fijacion en este antlgeno.

[0029] Los dominios constantes de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren al anticuerpo 15 propiedades biologicas importantes, como la asociacion de cadenas de anticuerpos entre ellas, la movilidad a traves

de la placenta, la fijacion del complemento y/o la union a los receptores Fc (FcR). El fragmento Fv corresponde a la parte N-terminal del fragmento Fab, descrito mas adelante, de la inmunoglobulina, y comprende las porciones variables de una cadena ligera y de una cadena pesada (VL y VH). La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el punto de reconocimiento del anticuerpo y el determinante antigenico. El 20 punto de reconocimiento del anticuerpo esta constituido esencialmente por residuos que provienen de regiones hipervariables o que determinan la complementariedad (CDRs). Ocasionalmente, los residuos que provienen de las regiones no hipervariables o regiones estructurales o de armazon («framework» o FR) influyen en la estructura general del dominio y por tanto en los puntos de reconocimiento. El termino «regiones de complementariedad» (CDR) se refiere a las secuencias de aminoacidos, que juntas, definen la afinidad de la fijacion y la especificidad de 25 la region Fv natural del punto de fijacion de una inmunoglobulina nativa.

[0030] Cada una de las cadenas pesadas y cada una de las cadenas ligeras de una inmunoglobulina posee tres regiones CDR, designadas como L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 respectivamente. El punto de fijacion del antlgeno incluye por tanto estas seis CDRs, que comprenden las CDRs de cada una de las

30 cadenas pesadas y ligeras de una region variable.

[0031] Las regiones estructurales (FRs) corresponden a las secuencias de aminoacidos situadas en las

regiones CDR, es decir, porciones de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de las

35 inmunoglobulinas que estan relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas de una misma especie (Kabat et al. (1991) National Institutes of Health, Bethesda, Md). El termino «region estructural humana» se utiliza para designar una region estructural que es esencialmente identica (aproximadamente el 85 %, preferiblemente el 90 %, 95 % o 100 %) a la region estructural de un anticuerpo humano natural.

40 [0032] Como el experto en la materia sabe, se pueden distinguir cuatro subclases de anticuerpos de tipo IgG:

IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Estas subclases de distinguen por las regiones constantes de sus cadenas y (y1 a y4). Si no hay menos del 95 % de identidad de secuencia entre los dominios, las regiones bisagra son notablemente diferentes, lo que determina comportamientos fisicoqulmicos y propiedades efectoras diversas.

45 [0033] El termino «anticuerpo monoclonal» o «mAb» (de «monoclonal Antibody») designa un anticuerpo con

composition de aminoacidos unica, que se dirige contra un antlgeno especlfico y que puede producirse por un solo clon de celulas B, o hibridoma. Los anticuerpos monoclonales tambien pueden ser recombinantes, es decir, producirse por tecnicas de ingenierla de protelnas.

50 [0034] El termino «anticuerpo antidiotlpico» designa un anticuerpo dirigido contra los determinantes

antigenicos presentes en los dominios variables de otra inmunoglobulina, ya sea en las CDR o en el exterior.

[0035] El termino «anticuerpo quimerico» significa un anticuerpo recombinante que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo que proviene de un animal no humano, asociado con un dominio CH y un

55 dominio CL de otro anticuerpo, en particular de un anticuerpo humano. El animal no humano puede ser un raton, una rata, un conejo, un hamster, etc. El termino «anticuerpo quimerico» tambien puede utilizarse para describir un anticuerpo multiespeclfico, es decir, especlfico de al menos dos antlgenos diferentes.

[0036] El termino «anticuerpo humanizado» significa un anticuerpo humano (anticuerpo aceptador) en el que

las regiones de complementariedad (CDR) se sustituyen por regiones CDRs, que constituyen el punto de union al antlgeno, y que tienen como origen un anticuerpo donante especlfico del antlgeno. Eventualmente, el anticuerpo humano aceptador recibe, ademas de las regiones CDRs, aminoacidos de la region estructural del anticuerpo donante.

5

IgGi y ligandos del receptor CD32

[0037] La invencion se refiere a una inmunoglobulina de tipo IgGi para un uso para el tratamiento de una hipersensibilidad de tipo 1, en el que la inmunoglobulina se administra por via mucosa, en particular por via

10 sublingual. La inmunoglobulina de tipo IgGi es un anticuerpo anti-IgE con capacidad para unir las IgE a la superficie de los mastocitos o los basofilos sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores a la superficie de los mastocitos o los basofilos.

[0038] Las inmunoglobulinas de tipo IgGi segun la invencion pueden encontrarse en particular en, o en forma 15 de, una composicion de inmunoglobulinas intravenosas, tambien llamadas IgIV o IVIG.

[0039] Como el experto en la materia sabe, las inmunoglobulinas intravenosas son preparaciones terapeuticas de IgG humanas normales obtenidas a partir de una mezcla de plasmas provenientes de mas de 1000 individuos sanos. Generalmente se trata cuasiexclusivamente de IgG intactas de una semivida de 3 a 4 semanas y

20 de repartos en subclases similares a las observadas en el suero humano normal. Las IVIG contienen tlpicamente menos del 5 % de IgG agregadas, del 0 al 7 % de fragmentos F(ab')2 de IgG, y segun las preparaciones comerciales, de 0,06 a 40 mg de IgA por gramo de protelnas. Las IgG comprendidas en las IVIG tienen un largo espectro de reactividades y se dirigen por tanto contra antlgenos exogenos, autoantlgenos y anticuerpos.

25 [0040] Ademas, como los inventores han detectado una elevada densidad de receptores CD32 en las papilas

dermicas, que corresponden a la zona en la que las inmunoglobulinas y las protelnas, en general, se difunden cuando son administradas por via sublingual, han concluido que cualquier ligando de CD32 era utilizable por via sublingual para inducir tratar enfermedades y manifestaciones inflamatorias. Mas generalmente, cualquier ligando de CD32 puede utilizarse por via mucosa para tratar enfermedades y manifestaciones inflamatorias, en la medida en 30 que esta mucosa presenta una fuerte densidad de receptores CD32.

[0041] La demanda describe igualmente una IgG1, ligando del receptor CD32, preferentemente un ligando del receptor CD32B, para un uso en el tratamiento de una enfermedad o manifestation inflamatoria, de la alergia o de una enfermedad autoinmunitarias, el ligando administrado por via mucosa, en particular por via sublingual.

35

[0042] Los terminos «receptor CD32» y «receptor FcyRII» se utilizan indistintamente y hacen referencia a una protelna receptora de superficie presente en la mayorla de las celulas inmunitarias y que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas. Como sabe el experto en la materia, los receptores CD32 comprenden un grupo de receptores que incluyen las isoformas CD32A, y CD32B y CD32C, todas presentan dos dominios extracelulares. CD32A se

40 expresa en los monocitos, los macrofagos, los neutrofilos y las plaquetas. CD32C se expresa en las celulas NK. CD32B por ultimo, que incluye dos isoformas CD32B1 y CD32B2, se expresa en los linfocitos B, los basofilos, los mastocitos, los monocitos, los macrofagos y las celulas dendrlticas.

[0043] CD32A inicia la endocitosis, la fagocitosis, la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos y la 45 liberation de los mediadores de la inflamacion. CD32B transduce senales inhibidoras que regulan a la baja las

funciones inmunitarias desencadenadas por los receptores activadores. En particular CD32b inhibe la activation de los mastocitos, de los basofilos, de los linfocitos B y de los linfocitos T. Se compone de 2 dominios extracelulares de tipo Ig, que unen la region Fc de las IgG, un dominio transmembranario y una cola intracitoplasmica con un motivo inhibidor basado en las estructuras tiroslnicas del receptor inmunitario (ITIM). La activacion de CD32B lleva al 50 reclutamiento de fosfatasas en el motivo ITIM, que inhiben la activacion de la senal que viene de otros receptores activadores.

[0044] Preferentemente, el receptor CD32 corresponde a la isoforma CD32B.

55 [0045] Por «ligando del receptor CD32», se entiende aqul las moleculas que se unen de forma especlfica al

receptor CD32 e inducen preferentemente la senal mediada por CD32.

[0046] El experto en la materia conoce tecnicas que permiten identificar ligandos del receptor CD32, en

particular ligandos del receptor CD32B. Incluyen en particular las tecnicas que comprenden:

a) la puesta en contacto del ligando candidato con (i) un receptor CD32, en particular un receptor CD32B, recombinante o un peptido derivado del receptor CD32, en particular del receptor CD32B; o con (ii) una celula indicadora proveniente de estirpes celulares que expresan CD32, en particular CD32B, en su superficie; y 5 b) la determination de la induction de la senal mediada por CD32 en particular por CD32B.

[0047] Las celulas indicadoras pueden ser por ejemplo celulas IIA1.6 CD32 positivas (Van den Herik-Oudjik

et al. (1995) Blood. 85:2202-11).

10 [0048] La determinacion de la induccion de la senal mediada por CD32, en particular mediada por CD32B,

puede por ejemplo consistir en determinar el perfil de fosforilacion del motivo ITIM del receptor CD32, en particular del receptor CD32B, despues de ponerse en contacto con el ligando candidato. Puede comprender igualmente pruebas de inhibicion de la movilizacion del calcio y/o pruebas de inhibition de la secretion de citocinas, como IL-2.

15 [0049] Asl, los ligandos candidatos que inducen una desfosforilacion del motivo ITIM del receptor CD32, en

particular del receptor CD32B, y/o que inhiben la movilizacion del calcio y/o inhiben la secrecion de IL-2 pueden considerarse como ligandos del receptor CD32, en particular ligandos del receptor CD32B.

[0050] Por ejemplo, en la solicitud americana US2007/0135621 tambien se describen ejemplos de tecnicas 20 de identification de ligandos del receptor CD32.

[0051] El ligando del receptor CD32 segun la invention es una IgG1 anti-IgE con capacidad para unir las IgE a la superficie de los mastocitos o basofilos sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas en los receptores a la superficie de los mastocitos o basofilos.

25

[0052] Una inmunoglobulina de tipo IgG1 puede en particular ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado, como los que se han definido anteriormente.

[0053] Segun un modo de realization preferido, cuando la inmunoglobulina segun la invencion es un 30 anticuerpo quimerico como el que se ha definido mas arriba, los dominios CH y CL asociados a los dominios VH y

VL provienen de una inmunoglobulina humana de tipo IgG1.

[0054] Segun otro modo de realizacion particularmente preferido, la inmunoglobulina que se une al receptor CD32 se une al receptor a traves de su region Fc.

35

[0055] Los inventores han mostrado que, de forma sorprendente, las inmunoglobulinas de cualquier idiotipo, y no solamente de los anticuerpos anti-IgE, eran capaces de inducir una mejora de los slntomas de asma alergica cuando se administraban por via sublingual.

40 [0056] Por «alergeno» se entiende aqul cualquier sustancia que desencadene una alergia. Algunos ejemplos

de alergenos pueden ser, a tltulo no limitativo, alergenos de polen (de arboles, de gramlneas, etc.), alergenos de acaros (de polvo domestico o de almacenamiento), alergenos de insecto (de himenopteros, de cucarachas, etc.), alergenos de animales (de perro, de gato, de caballo, de rata, de raton, etc.), alergenos de enmohecimiento y alergenos alimentarios. El alergeno puede ser por ejemplo uno de los alergenos enumerados en la section 45 «Aplicaciones terapeuticas».

[0057] Por «antlgeno» se entiende cualquier sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria con el objetivo de eliminarlo del organismo. Se trata generalmente de una sustancia ajena al organismo. En el caso de las enfermedades autoinmunitarias, el antlgeno puede ser un antlgeno propio reconocido erroneamente como

50 extrano por el organismo (autoantlgeno).

[0058] Por «citocina» se entiende aqul cualquier protelna, que no sea un anticuerpo, secretada por una celula en contacto con un antlgeno especlfico y que tenga una funcion de mediador celular en la generation de una respuesta inmunitaria. Algunos ejemplos de citocinas pueden ser, a tltulo no limitativo, interferones, como FN-a, IFN-

55 p, IFN-w e IFN-y; interleucinas, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 e IL-23; quimiocinas como las quimiocinas de la familia CXC, las quimiocinas de la familia CC, las quimiocinas de la familia CX3C y las quimiocinas de la familia C; el TNF, los CSF y los TGF.

[0059] La inmunoglobulina segun la invencion es un anticuerpo anti-IgE de tipo IgG1 con capacidad para unir

las IgE a la superficie de los mastocitos o basofilos sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores en la superficie de los mastocitos o basofilos.

[0060] Los inventores han mostrado ademas de forma sorprendente que era posible inducir una mejora de 5 los slntomas alergicos utilizando inmunoglobulinas, en particular IgGi, estuvieran estas en forma sialilada o no

sialilada.

[0061] Asl, segun un modo de realizacion particularmente preferido de la invencion, las inmunoglobulinas segun la invencion no se encuentran en forma sialilada.

10

[0062] Por «sialilacion» se entiende aqul la adicion de un residuo de acido sialico en una protelna, que puede ser en particular una glicoprotelna.

[0063] En el contexto de la invencion, el termino «acido sialico» incluye una familia de azucares que 15 contienen 9 atomos de carbono o mas, que comprende un grupo carboxilo. Una estructura generica que engloba

todas las formas naturales de acido sialico se muestra en la siguiente formula (I):

imagen1

20 en la que

los grupos R1 con posiciones variadas sobre una sola molecula pueden ser identicos o diferentes unos de otros. R1 puede ser un hidrogeno o un grupo acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, anhidro, acido sialico, fucosa, glucosa o galactosa; R2 puede ser un grupo N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo o N-glicolil-O-metilo; R3 25 representa el residuo de azucar precedente en un oligosacarido al que el acido sialico esta unido en el contexto de una glicoprotelna. R3 puede ser una galactosa (conectada en posicion 3, 4, 5 o 6), una N-acetilgalactosamina (conectada en posicion 6), una N-acetilglucosamina (conectada en posicion 4 o 6), un acido sialico (conectado en posicion 8 o 9) o un acido 5-N-glicolil-neuramlnico.

30

[0064] Se encuentran mas de 40 formas de acido sialico en la naturaleza entre los cuales estan el acido N- acterilneuramlnico, el acido N-glicolilneuramlnico y sus derivados O-acetilados, en particular el acido N-acetil-9-O- acetilneuramlnico. La forma de acido sialico mas comun es el acido N-acetilneuramlnico, en el que R1 es un hidrogeno en todas las posiciones y R2 es un grupo N-acetileno.

35

[0065] En el contexto de la invencion se entiende por «inmunoglobulina en forma sialilada» una inmunoglobulina que contiene al menos un acido sialico como el que se ha definido mas arriba.

[0066] En el contexto de la invencion se entiende por «inmunoglobulina que no esta en forma sialilada» o 40 «inmuniglobulina en forma no sialilada» una inmunoglobulina que no contiene acido sialico como el que se ha

definido mas arriba.

Anticuerpos anti-IgE con capacidad para unir las IgE fijadas a sus receptores a la superficie de un mastocito y/o basofilo

[0067] La invention se refiere ademas a un anticuerpo anti-IgE de tipo IgGi con capacidad de unir las IgE fijadas a sus receptores a la superficie de un mastocito o basofilo sin disociar dichas IgE de sus receptores y con capacidad de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores en la superficie de los mastocitos o basofilos, destinado a

5 ser utilizado en el tratamiento de una alergia inmediata o hipersensibilidad de tipo 1.

[0068] Por «receptor en las IgE» se entiende el receptor RFcsI, presente en la superficie de un mastocito y/o un basofilo.

10 [0069] Un anticuerpo anti-IgE segun la invencion puede en particular ser un anticuerpo monoclonal, un

anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado, como los que se han definido anteriormente.

[0070] Mas particularmente, el anticuerpo anti-IgE segun la invencion puede ser un anticuerpo antidiotlpico o no. Asl, el anticuerpo anti-IgE segun la invencion puede unirse a cualquier IgE, sea cual sea la especificidad de

15 dicha IgE, o al contrario, el anticuerpo anti-IgE solo puede unirse a una IgE especlficamente dirigida contra un antlgeno o un alergeno particular.

[0071] Segun un modo de realization preferido, cuando el anticuerpo anti-IgE segun la invencion es un anticuerpo quimerico como el que se ha definido mas arriba, los dominios VH y VL asociados a los dominios CH y

20 CL provienen de un anticuerpo dirigido contra las IgE humanas.

[0072] Segun otro modo de realizacion preferido, cuando el anticuerpo anti-IgE segun la invencion es un anticuerpo humanizado como el que se ha definido mas arriba, el anticuerpo donante es un anticuerpo de raton, de rata, de conejo, de hamster, etc. y es especlfico de las IgE humanas. Por ejemplo, se pueden injertar CDRs de un

25 anticuerpo de raton especlfico de las IgE humanas en la region estructural de un anticuerpo humano para preparar un «anticuerpo humanizado» especlfico de las IgE humanas.

[0073] Preferentemente, el anticuerpo anti-IgE segun la invencion es un anticuerpo humano o humanizado.

30 [0074] Las IgE son capaces de unirse por sus fragmentos constantes Fc a los receptores RecsI presentes en

la superficie de los mastocitos y basofilos. El anticuerpo anti-IgE segun la invencion tiene la capacidad de unirse a las IgE fijadas a los receptores RFceI de un mastocito o basofilo sin disociar dichas IgE de sus receptores.

[0075] Se han hecho investigaciones previas sobre las regiones implicadas en la union de IgE con los 35 receptores RFcsI. Dichas regiones han sido identificadas como el dominio Ce3 y parcialmente el dominio Ce4

(Schwarzbaum et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1015-1023), o el dominio Ce2, Ce3 y la region entre los dominios Ce2 y Ce3 (Takemoto et al. (1994) Microbiol. Immunol. 38: 63-71).

[0076] Por tanto es preferible, segun la invencion, que el anticuerpo anti-IgE reconozca una parte de la IgE no 40 implicada en la fijacion de la IgE a su receptor en los mastocitos o basofilos. De forma preferente, el anticuerpo anti-

IgE segun la invencion puede reconocer las partes de los dominios Ce2, Ce3 Ce4 no implicadas en la union al receptor RfcsI, el dominio Ce1, los dominios variables de la cadena pesada (VH) o de la cadena ligera (VL) asl como el dominio constante de la cadena ligera de las IgE (CL).

45 [0077] De forma general, el experto en la materia puede comprobar la capacidad de un anticuerpo dado para

fijarse a las IgE unidas al receptor RFcsI mediante metodos habituales en el ambito tecnico. Por ejemplo, el experto en la materia puede comprobar que la adicion de anticuerpos anti-IgE no impide la fijacion de la IgE a los receptores RFcsI a la superficie de basofilos o mastocitos. Segun su especificidad, el anticuerpo anti-IgE segun la invencion puede eventualmente impedir el reconocimiento del alergeno por la IgE, por ejemplo creando un impedimento 50 esterico en el punto de reconocimiento del antlgeno.

[0078] El anticuerpo anti-IgE tiene la capacidad de entrecruzar las IgE fijadas en sus receptores a la

superficie de un mastocito y de un basofilo.

55 [0079] El termino «entrecruzamiento de las IgE» se refiere al establecimiento de uniones cruzadas entre dos

IgE unidas cada una a un receptor RFceI en la superficie de un mastocito o de un basofilo. Dichas uniones cruzadas estan provocadas por el reconocimiento de al menos dos IgE, unidas a receptores RFceI en la misma celula, por una misma molecula entrecruzante (alergeno, anticuerpo anti-IgE) e inducen la activation de mastocitos o basofilos.

[0080] Cuando se entrecruza una cantidad suficiente de IgE de superficie, es decir, cuando esta presente una

cantidad suficiente, llamada «cantidad optima», de moleculas entrecruzantes, los enlaces cruzados pueden inducir la desgranulacion de los mastocitos y basofilos y conducir a la liberacion de mediadores proinflamatorios.

5 [0081] Dicha capacidad entrecruzante de las IgE puede ser evaluada por el experto en la materia, por

ejemplo, mediante un analisis celular que permita detectar la desgranulacion o la activacion de los mastocitos o los basofilos en presencia de una cantidad optima de anticuerpos anti-IgE. La desgranulacion puede por ejemplo estimarse a traves de la medicion de la cantidad de histamina o de p-hexosaminidasa liberada durante dicha desgranulacion o por la medicion, en citometrla de flujo por ejemplo, de la presencia de CD63 y/o de CD107a en la 10 superficie de los mastocitos o los basofilos.

[0082] Alternativamente, tambien se puede medir la activacion de las celulas tras el entrecruzamiento en presencia de anticuerpos anti-IgE en citometrla de flujo, midiendo la presencia de CD203c en la superficie de los mastocitos o los basofilos. El anticuerpo anti-IgE puede analizarse en ese caso con una concentracion «suboptima»

15 que se refiere aqul a una concentracion de anticuerpos anti-IgE insuficiente para inducir la desgranulacion de los mastocitos o basofilos.

[0083] Los anticuerpos anti-IgE segun la invencion son especlficos de una IgE y capaces de unirse a IgE fijadas a los receptores RFceI de un mastocito o de un basofilo sin disociar dichas IgE de sus receptores, y

20 preferentemente capaces de inducir el entrecruzamiento de las IgE fijadas en los receptores RFceI de los mastocitos y basofilos.

[0084] El anticuerpo anti-IgE segun la invencion puede en particular ser un anticuerpo con la capacidad de unirse al receptor CD32, en particular al receptor CD32B, como el que se ha definido anteriormente. El anticuerpo

25 anti-IgE segun la invencion es un anticuerpo de tipo IgGi.

[0085] A modo de ejemplo de anticuerpos especlficos de IgE murinas, se puede citar la IgGiK del clon R35- 72 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU), la IgGiK del clon 23G3 (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL. Posner et al. (2004) Biochemestry 43: 11352-11360, Keegan et al. (1991) Mol.

30 Immunol. 28: 1149-1154), las IgG2a de los clones E11AC2IIC3, E11BA1ID1, E11BA3ID4, E9AD2IIA5, E11BB5IA6, E5BB3IIA4 y la IgG1 del clon E5AA1IA6 (Hook et al (1991) Mol. Immunol. 6: 631-639), la IgG2a del clon C12B9 (Keegan et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 1149-1154), la IgG2a del clon LO-ME-2 (Kang et al. (2007) Immune Network 7: 141-148) o un fragmento o una forma humanizada de estos.

35 [0086] A modo de ejemplo de anticuerpo entrecruzante especlfico de IgE humanas, se puede citar la IgG1 del

clon E124.2.8 (Beckman Coulter).

[0087] Los anticuerpos pueden, en un modo de realizacion preferido, ser anticuerpos quimericos o humanizados derivados del anticuerpo citado anteriormente.

40

[0088] Los anticuerpos anti-IgE segun la invencion se administran por via mucosa. De forma preferida ventajosamente, los anticuerpos anti-IgE segun la invencion se administran por via sublingual.

Metodos de production de anticuerpos 45

[0089] Los anticuerpos segun la invencion pueden producirse por medio de cualquier tecnica conocida, como por ejemplo, tecnicas qulmicas, biologicas, geneticas, enzimaticas o combinaciones de estas.

[0090] Los anticuerpos quimericos o humanizados segun la invencion pueden obtenerse por cualquier medio 50 conocido del experto en la materia, en particular por ingenierla genetica de anticuerpos.

[0091] La construccion de un anticuerpo quimerico consiste en aislar el ADN codificante de la region VH y la region VL de un anticuerpo monoclonal donante y unirlo al ADN codificante de las regiones CH y CL de una inmunoglobulina humana.

55

[0092] Un anticuerpo humanizado se obtiene sustituyendo las regiones hipervariables de un anticuerpo monoclonal receptor por las regiones hipervariables de un anticuerpo donante («CDR grafting») y puede necesitar eventualmente las siguientes etapas:

i) Diseno del anticuerpo humanizado:

- determinacion de las regiones CDRs del anticuerpo donante que tienen que ser transferidas y finalmente, identification de los residuos de las regiones estructurales del anticuerpo donante que tambien van a transferirse

5 segun sus funciones en el mantenimiento de la estructura de las CDRs, o de sus contribuciones en el punto de union del antlgeno. Dichas regiones o residuos pueden identificarse durante la construction de un modelo 3D de las regiones variables del anticuerpo y por utilization de programas informaticos como el RASMOL,

- identificacion en las bases de datos del anticuerpo humano mas apropiado para la humanization y election del isotipo humano. Por ejemplo, un anticuerpo apropiado para la humanizacion puede ser un anticuerpo con regiones

10 estructurales cercanas a las del anticuerpo donante.

ii) slntesis de las regiones variables as! disenadas por ejemplo mediante amplification PCR de las secuencias superpuestas y obtencion de los anticuerpos humanizados.

15 [0093] El experto en la materia que conoce la composition de aminoacidos de la secuencia deseada es

capaz de producir anticuerpos mediante tecnicas estandarizadas de production de polipeptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse en fase solida, preferentemente usando un aparato de slntesis de peptidos comercializado, como el que fabrica Applied Biosystems, California (EE.UU), y siguiendo las instrucciones del fabricante.

20 [0094] Alternativamente, los anticuerpos segun la invention pueden producirse por tecnicas de ADN

recombinante en un sistema de expresion adaptado. El termino «sistema de expresion» significa un anfitrion celular y un vector compatible en condiciones apropiadas, es decir, condiciones que permitan la expresion de la protelna codificada por el por el ADN exogeno transportado por el vector e introducido en la celula anfitriona. Tlpicamente, la secuencia de acidos nucleicos que codifican un anticuerpo puede insertarse en un vector de expresion apropiado 25 que se introducira en un anfitrion procariota o eucariota adecuado que producira el anticuerpo deseado.

[0095] Los terminos «vector», «vector de clonado» y «vector de expresion» se refieren a vehlculos gracias a los cuales las secuencias de ADN o de ARN codificante del anticuerpo pueden introducirse en una celula anfitriona

30 de forma que la transformen y permita la expresion (es decir la transcription y la traduction) de la secuencia introducida. Tlpicamente, un vector de expresion es un plasmido, un cosmido, un episoma, un cromosoma artificial, un fago o un vector viral.

[0096] A tltulo de vectores virales se pueden citar los adenovirus, los retrovirus, los virus del herpes y los 35 vectores derivados del virus adenoasociado (AAV). Dichos virus recombinantes pueden producirse por tecnicas

conocidas, como la transinfeccion de estirpes celulares que permiten su encapsidacion o por transinfeccion transitoria con plasmidos o virus auxiliares de complementation que expresen las funciones necesarias que faltan. Se puede citar por ejemplo, las estirpes celulares que permiten la encapsidacion PA317, PsiCRIP, GPenv+, 293, etc. Los protocolos detallados que permiten producir dichos virus recombinantes defectuosos para la multiplication estan 40 disponibles en las solicitudes de patente WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 y WO 94/19478.

[0097] Las celulas anfitrionas son transinfectadas, infectadas o transformadas por un acido nucleico o un vector apropiado como el que se ha descrito anteriormente. El termino de transformation se refiere a la introduction

45 de un gen exogeno (extrlnseco o extracelular), de una secuencia de ADN o de ARN en una celula anfitriona de forma que dicha celula anfitriona exprese el gen introducido, la secuencia de ADN o de ARN para producir la sustancia deseada, tlpicamente la protelna codificada por el gen o la secuencia introducida.

[0098] Los sistemas de expresion habituales incluyen celulas anfitrionas y vectores plasmldicos de E. coli, 50 celulas anfitrionas de insecto y vectores de tipo Baculovirus y celulas y vectores de mamlferos.

[0099] Un metodo de produccion a partir de una celula anfitriona que expresa un anticuerpo segun la invencion puede comprender las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un acido nucleico recombinante o un vector como el que se ha descrito mas arriba en una celula anfitriona competente, (ii) cultivar in

55 vitro la celula anfitriona recombinante as! obtenida y (iii) por ultimo seleccionar las celulas que expresan y/o secretan dicho anticuerpo o polipeptido.

[0100] Ademas, un metodo de produccion del anticuerpo segun la invencion puede comprender las etapas que consisten en: (i) cultivar la celula transformada descrita anteriormente en condiciones apropiadas para la

expresion del anticuerpo; y (ii) recuperar el anticuerpo as! expresado.

[0101] Los anticuerpos pueden separarse del medio de cultivo por metodos convencionales de purification de las inmunoglobulinas como, por ejemplo, purificacion con protelna A-sefarosa, por cromatografla sobre

5 hidroxilapatita, por electroforesis en gel, por dialisis o por cromatografla de afinidad.

Compuestos terapeuticos

[0102] La presente invention se refiere igualmente a compuestos farmaceuticos para el tratamiento de una 10 hipersensibilidad de tipo 1 por via mucosa, de forma mas preferida por administration por via sublingual, que

comprende un anticuerpo anti-IgE con la capacidad de unir las IgE fijadas a sus receptores a la superficie de un mastocito o basofilo sin disociar dichas IgE de sus receptores y la capacidad de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores en la superficie de los mastocitos o basofilos, como se ha definido mas arriba.

15 [0103] Segun un modo de realization particular, el compuesto farmaceutico segun la invencion pueden

comprender ademas un alergeno como el que se ha definido anteriormente, o un antlgeno.

[0104] Los anticuerpos segun la invencion pueden combinarse con excipientes farmaceuticamente

aceptables, y eventualmente, con matrices de liberation prolongada como, por ejemplo, pollmeros biocompatibles 20 para formar compuestos terapeuticos. Dichos pollmeros por ejemplo pueden ser polisacaridos como el almidon, las pectinas, las amilopectinas, el quitosano o partlculas o partlculas polisacarldicas (PSC) como las que se describen en Razafindratsita et al. (2007, J. Allergy Clin Immunol. 120: 278-285) y pueden estar en forma de nanopartlculas o de micropartlculas.

25 [0105] Para las terapias combinadas, los compuestos farmaceuticos pueden comprender a la vez los

anticuerpos segun la invencion y un tratamiento de desensibilizacion especlfica y/o un tratamiento sintomatico de la alergia. A modo de ejemplo de tratamiento de desensibilizacion especlfica se puede citar cualquier tratamiento que comporte la administracion de extractos alergenicos. Los tratamientos sintomaticos pueden comprender sustancias antinflamatorias (como corticoesteroides o antihistamlnicos), inhibidores de leucotrienos, broncodilatadores, el 30 cromoglicato de sodio, la teofilina.

[0106] El termino «farmaceuticamente aceptable» se refiere a moleculas y compuestos que no inducen una reaction adversa, alergica o no deseada cuando se administran a un mamlfero, en particular a un humano. Un vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable puede ser un solido o un semisolido, un llquido, un diluyente, un

35 material encapsulado o cualquier otra formulation.

[0107] La forma del compuesto farmaceutico, el modo de administracion, la dosis y la posologla pueden depender por supuesto de la enfermedad que se va a tratar, de sus slntomas, de su gravedad, de la edad, del peso y del sexo del paciente.

40

[0108] El compuesto farmaceutico o terapeutico segun la invencion esta formulado de forma que puede administrarse por via mucosa, sublingual, oral, nasal, vaginal, rectal, bronquial, auricular, conjuntiva. Preferentemente, el compuesto farmaceutico o terapeutico se administra por via sublingual, oral, nasal, vaginal, rectal, bronquial, auricular, o conjuntiva. De forma preferida, el compuesto farmaceutico o terapeutico se administra

45 por via mucosa, en particular por via bucal, sublingual, nasal, oral, bronquial, rectal, vaginal o auricular. De forma preferida sobre las demas, el compuesto farmaceutico o terapeutico se administra por via sublingual.

[0109] Los compuestos farmaceuticos segun la invencion pueden contener excipientes farmaceuticamente aceptables apropiados para poder ser inyectados (en particular estos pueden ser soluciones salinas isotonicas y

50 esteriles, fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o una mezcla de dichas sales). Dichos compuestos pueden ser igualmente compuestos secos, en particular compuestos secos y congelados, liofilizados o refrigerados, que, tras adicion, segun el caso, de agua esteril o de agua fisiologica, constituyen soluciones inyectables.

55 [0110] Las dosis utilizadas pueden adaptarse en funcion de diferentes parametros, como, en particular, el

modo de administracion, el tipo de patologla o alternativamente, la duration del tratamiento considerado. Preferentemente la dosis se adapta para permitir un tratamiento en una sola vez por monodosis.

[0111] Para preparar los compuestos farmaceuticos, se puede disolver o dispersar una cantidad suficiente de

anticuerpos en un vehlcuio farmaceuticamente aceptable o en un medio acuoso.

[0112] Las formas farmaceuticas apropiadas para un uso por inyeccion comprenden las soiuciones de agua

esterii, las dispersiones, las formuiaciones que inciuyen el aceite de sesamo, o el propiiengiicoi acuoso, as! como ios 5 poivos esteriles para la preparacion extemporanea de soiuciones inyectabies esteriles. En todos ios casos, la forma utiiizada debe ser esterii y debe ser io suficientemente fiuida como para poder inyectaria facilmente con una jeringuiiia. Debe ser estabie en las condiciones de produccion y de aimacenamiento y estar protegida de las contaminaciones por microorganismos, como las bacterias o ios hongos.

10 [0113] Las soiuciones de ios compuestos activos, esten en forma iibre o como sales aceptabies desde un

punto de vista farmaceutico, pueden prepararse con agua mezciada con un tensioactivo como la hidroxipropiiceiuiosa. Las dispersiones pueden hacerse en giiceroi, en poiietiiengiicoies ilquidos, en una mezcia de ios dos o en aceites. Estas preparaciones generaimente contienen un agente conservador para impedir el crecimiento de microorganismos en condiciones normaies de aimacenamiento y de uso.

15

[0114] Tras su formulacion en forma de medicamento, las soiuciones pueden administrarse de un modo

compatible con la dosis de la formulacion y en una cantidad terapeuticamente activa. Los medicamentos pueden ser administrados como se ha descrito anteriormente, pero tambien en forma de capsulas que ios iiberen.

20 [0115] Se prefiere particularmente la administracion por via sublingual. En una administracion sublingual, el

compuesto farmaceutico aicanza las celulas de la mucosa y finaimente las celulas de la submucosa. Dicho modo de administracion tiene la ventaja de ser senciiio, rapido y de evitar el paso por el tracto gastrointestinal donde el compuesto farmaceutico corre el riesgo de que las enzimas digestivas io degraden. Un compuesto farmaceutico para administracion por via sublingual puede estar formuiado preferentemente en forma de gotas (que pueden contener 25 giiceroi) o comprimidos.

[0116] Preferentemente, cuando ios anticuerpos y/o ios compuestos farmaceuticos segun la invencion se adminsitran por via mucosa, en particular por via sublingual, no son directamente accesibie a ios receptores DC- SIGN. Por «DC-SIGN» (en ingles «Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin»),

30 o «CD209», se entiende aqul una iectina de tipo C con una aita afinidad para el acido sialico.

[0117] Las inmunogiobuiinas segun la invencion pueden anadirse a una mezcia terapeutica en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 1000 miiigramos o aproximadamente 0,01 a 500 miiigramos o aproximadamente 1 a 200 miiigramos, aproximadamente 10 a 100 miiigramos por dosis, preferentemente del orden de 100 miiigramos.

35 Asimismo pueden administrarse dosis multiples.

[0118] De forma preferida, la inmunogiobuiina segun la invencion se administra con una concentracion suboptima, es decir con una concentracion insuficiente para inducir la desgranulacion de ios mastocitos o basofilos. El experto en la materia puede determinar facilmente la concentracion suboptima de un anticuerpo segun la

40 invencion. Por ejempio, puede anaiizar el efecto de diferentes concentraciones de anticuerpos sobre mastocitos y basofilos. La concentracion suboptima corresponded a todas las concentraciones inferiores a la concentracion minima (concentracion optima) que inducen la desgranulacion. Preferentemente, la concentracion suboptima se determina durante ensayos cilnicos en personas o animaies.

45 [0119] Se aceptan otras formas farmaceuticas que inciuyen por ejempio ios comprimidos u otras formas

solidas de administracion, capsulas de liberacion retardada o cuaiquier otra forma utiiizabie.

[0120] En ciertos modos de realizacion de la invencion, el uso de iiposomas y/o de micropartlcuias y/o de nanopartlcuias puede piantearse para introducir anticuerpos en el anfitrion. El experto en la materia conoce el uso y

50 la formacion de iiposomas y/o de micropartlcuias y/o de nanopartlcuias.

Aplicaciones terapeuticas

[0121] La soiicitud describe inmunogiobuiinas utiiizadas para tratar enfermedades y manifestaciones 55 infiamatorias.

[0122] Por «enfermedad inflamatoria» se entiende aqul una enfermedad asociada a una inflamacion. El experto en la materia conocera ejempios de enfermedades infiamatorias que inciuyen en particular el asma, las hipersensibiiidades, las aiergias.

[0123] Las «manifestaciones inflamatorias» designan reacciones inflamatorias que se producen durante

enfermedades que no son propiamente dichas inflamatorias, como las parasitosis o las mastocitosis.

5 [0124] Las inmunoglobulinas que tienen la capacidad de unir las IgE a la superficie de los mastocitos o

basofilos sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los receptores en la superficie de los mastocitos o basofilos para su uso segun la invencion, y los compuestos o los medicamentos que las comprenden se utilizan para tratar las alergias inmediatas.

10 [0125] El termino «alergia inmediata» o «hipersensibilidad de tipo I», tal y como se utiliza aqul, significa una

respuesta humoral en respuesta a un alergeno que se diferencia de una respuesta humoral normal por el hecho de que los plasmocitos secretan IgE.

[0126] Entre las manifestaciones cllnicas debidas a las alergias inmediatas que se pueden tratar con el 15 anticuerpo segun la invencion se pueden citar, a tltulo de ejemplo, la anafilaxia sistemica, la anafilaxia localizada

(atopia), la rinitis alergica, el asma, las alergias alimentarias, la dermatitis atopica, la conjuntivitis, el eccema, la mastocitosis inducida por un choque anafilactico, las manifestaciones alergicas causadas por las IgE secretadas como respuesta a una infeccion por un parasito. De forma particularmente preferida, en el marco de la invencion, las alergias inmediatas se manifiestan a traves del asma.

20

[0127] En el marco de la invencion la alergia puede estar causada por la exposicion de un individuo a cualquier alergeno.

[0128] Algunos ejemplos de alergenos pueden ser, a tltulo no limitativo, alergenos de polen (de arboles, de 25 gramlneas, etc.), alergenos de acaros (polvo domestico o de almacenamiento), alergenos de insecto (de

himenopteros, de cucarachas, etc.), alergenos de animales (de perro, de gato, de caballo, de rata, de raton, etc.), alergenos de enmohecimiento y alergenos alimentarios.

[0129] Por ejemplo, el alergeno puede seleccionarse en el grupo que consiste en las protelnas alergenas del 30 genero Dermatophagoides, las protelnas alergenas del genero Felis, las protelnas alergenas del genero Ambrosia,

las protelnas alergenas del genero Lolium, las protelnas alergenas del genero Cryptomeria, las protelnas alergenas del genero Alternaria, las protelnas alergenas del genero Alder, las protelnas alergenas del genero Betula, las protelnas alergenas del genero Blomia, las protelnas alergenas del genero Quercus, las protelnas alergenas del genero Olea, las protelnas alergenas del genero Artemisia, las protelnas alergenas del genero Plantago, las 35 protelnas alergenas del genero Parietaria, las protelnas alergenas del genero Canis, las protelnas alergenas del genero Blattella, las protelnas alergenas del genero Apis, las protelnas alergenas del genero Cupressus, las protelnas alergenas del genero Thuya, las protelnas alergenas del genero Chamaecyparis, las protelnas alergenas del genero Periplaneta, las protelnas alergenas del genero Agropyron, las protelnas alergenas del genero Secale, las protelnas alergenas del genero Triticum, las protelnas alergenas del genero Cynorhodon, las protelnas alergenas 40 del genero Juniperus, las protelnas alergenas del genero Dactylis, las protelnas alergenas del genero Festuca, las protelnas alergenas del genero Poa, las protelnas alergenas del genero Avena, las protelnas alergenas del genero Holcus, las protelnas alergenas del genero Anthoxanthum, las protelnas alergenas del genero Arrhenatherum, las protelnas alergenas del genero Agrostis, las protelnas alergenas del genero Phleum, las protelnas alergenas del genero Phalaris, las protelnas alergenas del genero Paspalum, las protelnas alergenas del genero Sorghum. 45 Algunos ejemplos de protelnas alergenas conocidas derivadas de protelnas de generos enumerados anteriormente incluyen: Cynorhodon Cyn d 1; Dermatophagoides (pteronyssinus o farinae) Der p 1; Der p 2; Der p 3; Der p 5; Der p 7; Der f 1; Der f 2; Der f 3; Der f 5; Der f 7; Felis (domesticus) Fel d 1; Ambrosia (artemisiifolia) Amb a 1; Amb a 2; Amb a 3; Amb a 4; Lolium (perenne) Lol p 1; Lol p 2; Lol p 3; Lol p 4; Lol p 5; Lol p 9; Cryptomeria (japonica) Cry j 1; Cry j 2; Juniperus (sabinoides o virginiana) Jun s 1; Jun v 1; Juniperus (ashei) Jun a 1; Jun a 2; Dactylis (glomerata) 50 Dac g 1; Dac g 5; Poa (pratensis) Poa p 1; Poa p 5; Phleum (pratense) Phl p 1; Phl p 5; Anthoxanthum (odoratum) Ant o 1; Ant o 5; Betula (verrucosa) Bet v 1; Bet v 2; Bet v 4 y Sorghum (halepensis) Sor h 1.

[0130] Los alergenos alimentarios pueden provenir de la leche, huevos, legumbres (como el cacahuete y la soja), nueces y avellanas, trigo, crustaceos, pescados y moluscos y sus productos derivados. En particular, los

55 alergenos alimentarios pueden ser la ovoalbumina o el gluten.

[0131] En el contexto de la invencion, el termino «tratar» o «tratamiento» significa suprimir, aliviar o impedir la progresion de un trastorno o evitar la aparicion de dicho trastorno o de uno o varios slntomas relacionados con ese trastorno. En particular, el tratamiento de las alergias inmediatas puede consistir en reducir o incluso

preferiblemente en suprimir la inflamacion excesiva debida a la liberacion por los mastocitos y basofilos de moleculas proinflamatorias mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente activa de anticuerpos segun la invencion.

5 [0132] El termino «paciente» o «individuo» segun la invencion se utiliza para designar un humano o un

mamlfero no humano (como por ejemplo un roedor (raton, rata), un felido, un canido o un primate) que desarrolle o sea susceptible de desarrollar una alergia inmediata. Preferentemente, el sujeto es un humano.

[0133] El termino «cantidad terapeuticamente activa» significa una cantidad de anticuerpo suficiente para 10 tratar una alergia inmediata y que tenga una relacion beneficio/riesgo aceptable para un tratamiento farmacologico.

La cantidad de anticuerpos y de compuestos segun la invencion as! como la frecuencia de administracion sera determinada por estudios cllnicos, por el medico o por el farmaceutico. La dosis «terapeuticamente activa» especlfica para cada uno de los pacientes podra depender de un cierto numero de factores como la naturaleza y la gravedad del trastorno que se va a tratar, la actividad del anticuerpo utilizado, el compuesto utilizado, la edad, el 15 peso, el estado general de salud, el sexo y el regimen del paciente, el modo de administracion, la duracion del tratamiento (en monodosis o en varias dosis), los medicamentos utilizados en combinacion y otros factores que los especialistas medicos conocen.

[0134] La invencion tambien esta descrita en las figuras y ejemplos siguientes, que no tienen caracter 20 limitativo.

FIGURAS

[0135]

25

La Figura 1 representa el efecto, sobre la hiperreactividad bronquial (medida en valor Penh o «enhanced pause»), de la estimulacion con metacolina de un grupo de tres ratones BALB/c no sensibilizados con ovoalbumina (grupo 1) y de grupos de cinco ratones tras sensibilizacion con ovoalbumina y desensibilizacion con:

30 - grupo 2: PBS;

- grupo 3: ovoalbumina a razon de 500 mg por administracion sublingual, dos veces por semana, durante dos meses;

- grupo 4: el isotipo de control de rata de tipo IgG1K a razon de 25 pg por administracion sublingual, dos veces por semana, durante dos meses;

35 - grupo 5: el anticuerpo de rata anti-IgE de raton de clon R35-72 a razon de 25 pg por administracion sublingual, dos veces por semana, durante dos meses;

- grupo 6: el anticuerpo de rata anti-IgE de raton de clon R35-72 a razon de 10 pg por administracion sublingual, dos veces por semana, durante dos meses.

40 La Figura 2 muestra la reactividad de las vlas respiratorias por medicion del valor Penh en respuesta a una administracion de metacolina (100 mg/ml). Se han analizado ocho ratones en cada grupo. Las barras horizontales representan la respuesta media en cada grupo, cada punto representa el valor Penh obtenido para un animal en concreto. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

45 La Figura 3 muestra el recuento de macrofagos y eosinofilos en los lavados broncoalveolares de los ratones que reciben diversos tratamientos. Los resultados se representan en forma de media ± error estandar de la media. N = 8 ratones por grupo. * p< 0,05 en comparacion con ratones desensibilizados con PBS (placebo). Los datos se han comparado utilizando la prueba no parametrica (Kruskal-Wallis).

50 EJEMPLO 1:

Materiales y metodos

Sensibilizacion y desensibilizacion de los ratones.

55

[0136] Se han sensibilizado ratones BALB/c con ovoalbumina (OVA) como se describe en Razafindratsita et al. (2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120: 278-285).

[0137] A continuacion se han tratado por via sublingual grupos de 5 ratones, dos veces por semana, durante

dos meses con:

- 500 |jg de OVA por administracion;

- 10 o 25 jg de IgG-iK de rata anti-IgE de raton (clon R35-72; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) por 5 administracion;

- 25 jg de IgGiK de rata no especlfica (isotipo de control; eBioscience, San Diego, CA, USA) por administracion o

- PBS para el grupo de ratones testigo.

[0138] Se somete a los ratones a una provocacion alergenica con los aerosoles de OVA (1 % 10 masa/volumen), dos veces durante dos dlas consecutivos.

[0139] Paralelamente, se utiliza un grupo de tres ratones sanos no sometidos a la ovoalbumina como grupo testigo.

15 [0140] El anti-IgE utilizado, del clon R35-72, es un anticuerpo de rata de tipo IgGiK conocido por su

capacidad para unirse a las IgE en la superficie de los mastocitos y/o basofilos e inducir as! la liberacion por dichas celulas de mediadores proinflamatorios (Kubo et al. (2003) J. Immunol. 170: 775-780, Zhou et al. (2007) J. Exp. Med. 204: 2797-2802).

20 [0141] El anticuerpo monoclonal IgG1K de rata no especlfico no tiene especificidad para las IgE murinas.

Determination de la hiperreactividad bronquial.

[0142] La medicion de la hiperreactividad bronquial se efectua 24 horas despues de la ultima provocacion por 25 una pletismografla de cuerpo entero (Buxco Europe Ltd, Winchester, UK) como se describe en Hamelmann et al.

(1997, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 766-775) y se estima la resistencia bronquial por medicion del PenH (enhanced pause). El Indice de PenH se ha obtenido por determinacion de la relacion entre los valores de PenH medidos tras exposicion a una inhalacion de metacolina USA y tras exposicion a PBS nebulizado.

30 Resultados

[0143] Para determinar el efecto de un anticuerpo anti-IgE que tenga la capacidad de unir y de entrecruzar las IgE murinas a la superficie de mastocitos y basofilos sobre la respuesta alergica, se han sensibilizado ratones con ovoalbumina y despues se han desensibilizado con dicho anticuerpo anti-IgE. Se comparan estos ratones con

35 ratones sensibilizados con ovoalbumina y despues desensibilizados con la misma ovoalbumina, o desensibilizados con un isotipo de control, o no desensibilizados. Todos estos ratones se comparan con ratones no sensibilizados con ovoalbumina.

[0144] La hiperreactividad bronquial con la metacolina aumenta en los ratones sensibilizados con 40 ovoalbumina y tratados con PBS (FIG. 1, grupo 2), segun traduce el valor elevado del parametro «PenH» en

comparacion con el valor obtenido para los ratones no sensibilizados con ovoalbumina (FIG. 1, grupo 1).

[0145] Se observa una mejora de la hiperreactividad bronquial en los ratones sensibilizados y despues desensibilizados con ovoalbumina (FIG. 1, grupo 3).

45

[0146] Se observa una mejora aun mas importante de la hiperreactividad bronquial en los ratones sensibilizados con ovoalbumina y despues desensibilizados con, por orden creciente de mejora:

- el anti-IgE a razon de 10 jg por administracion (FIG. 1, grupo 6);

50 - el isotipo de control a razon de 25 jg por administracion (FIG. 1, grupo 4);

- el anti-IgE a razon de 25 jg por administracion (FIG. 1, grupo 5).

[0147] Este ejemplo muestra de forma muy sorprendente que la administracion de un anticuerpo anti-IgE que

tenga la capacidad de unirse a las IgE a la superficie de los mastocitos y basofilos sin disociar dichas IgE de sus

55 receptores permite inducir una disminucion muy sustancial de la hiperreactividad bronquial de los ratones sensibilizados con la ovoalbumina.

[0148] Dicha disminucion depende de la cantidad de anti-IgE administrada y es mucho mas eficaz que una desensibilizacion con ovoalbumina gracias a las concentraciones molares al menos 60 veces inferiores (sabiendo

que las masas moleculares de la ovoalbumina y de una inmunoglobulina son respectivamente de 45 kDa (Nisbet et al. (1981) Eur. J. Biochem. 115: 335-345) y de 150 kDa aproximadamente.

[0149] Al menos una parte del efecto esta relacionada con la especificidad de los anti-IgE, como indica la 5 diferencia del valor Penh observado en 25 pg por administracion entre el anti-IgE y el isotipo de control, que es del

mismo orden que la diferencia observada entre el alergeno (ovoalbumina) y el placebo (PBS). El efecto obtenido con el isotipo de control puede eventualmente ser explicado por la induccion de senales no especlficas que reduzcan la reaccion anafilactica durante la fijacion de dicho anticuerpo al receptor en IgG inhibidor, el RFcYlIb (Kang et al. (2007) Immune Network 7: 141-148).

10

EJEMPLO 2:

[0150] El presente estudio muestra el efecto del anticuerpo anti-IgE de entrecruzante o no entrecruzante as! como del anticuerpo de tipo IgG1 administrados por via sublingual en inmunoterapia utilizando un modelo murino in

15 vivo de asma alergico.

Material y metodos

Ratones, reactivos y anticuerpos

20

[0151] Se han conseguido ratones hembra de entre 6 y 8 semanas de edad, de Charles River (L'Arbresle, Francia). La solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) proviene de Invitrogen (Carslbad, CA). La ovoalbumina (OVA) nivel V con un bajo contenido en endotoxina se ha conseguido en Sigma (St. Louis, MO) y ademas se ha purificado con un gel que elimina las endotoxinas (Pierce, Rockford, IL). Las concentraciones de endotoxina residual,

25 determinadas por analisis con Endochromo K (R1708K, Charles River, Wilmington, MA) siempre eran inferiores a 0,1 unidad enzimatica (UE)/pg de protelna. Una forma polimerizada de maltodextrina de malz (polisacarido capsular o PSC) se ha utilizado como sistema de administracion de antlgeno particular mucoadhesivo (Baudner et al. (2002) Infect. Immun. 70:4785-4790; Razafindratsita et al. (2007) J. Allergy Clin. Immunol. 120:278-285)

30 [0152] Los anticuerpos monoclonales (mAB) citados en la tabla 1 se han utilizado como anticuerpos

purificados para una administracion sublingual.

Tabla 1: Lista de anticuerpos utilizados.

Anticuerpo

Antlgeno Especie/Isotipo Fabricante

LO-ME-2

IgE (entrecruzante) Rata IgG2a/K Invitrogen, ref: 04-7000

Isotipo de control

IgE Rata IgG2a e-biosciences, ref: 14-4321

R35-92

IgE (no entrecruzante) Rata IgG1/K BD Biosciences, ref: 553416

R35-72

IgE (entrecruzante) Rata IgG1/K BD Biosciences, ref: 553413

Isotipo de control

IgE Rata IgG1/K e-biosciences, ref: 14-4301

35

Purificacion de los anticuerpos

[0153] Para obtener todos los anticuerpos en una solucion amortiguadora identica, las muestras de anti-IgE se han dializado contra 10 volumenes de PBS, utilizando membranas de 30 kD (Amicon Ultra-4, Millipore Corp.).

40 Ademas las muestras desaladas se han filtrado (Millex 0,22 pm, Millipore Corp.) para impedir cualquier crecimiento bacteriano en ausencia de aziduro de sodio. Por ultimo, se han determinado las concentraciones proteicas utilizando la densidad optica a 280 nm (OD280) (Secoman XL, Uvikon) antes y despues del filtrado.

Inmunoterapia sublingual en los ratones BALB/c 45

[0154] Para la sensibilizacion, se han inmunizado ratones por via intraperitoneal (i.p.) los dlas 0 y 14 con 10 pg de OVA adsorbidos en 2 mg de Al(OH)3, administrados en 100 ml de PBS. El dla 21, se ha realizado una prueba de provocacion de 20 min por aerosol con un 1 % (peso/volumen) de OVA durante 4 dlas consecutivos utilizando un sistema de administracion de aerosol (Buxco Europe Ltd, Winchester, UK). Para la induccion de la tolerancia, se han

50 aplicado los anticuerpos anti-IgE (10 mg y 25 mg por dosis) por via sublingual a grupos de 8 ratones, dos veces por semana durante 2 meses. Los ratones testigos se han tratado por via sublingual con PBS o anticuerpo isotlpico

(IgGi/K e IgG2a). Como control positivo de la eficacia, se han tratado ratones por via sublingual con PSC-OVA (500 pg). Se han realizado mediciones de hiperreactividad de las vlas respiratorias (AHR) por pletismografla de cuerpo entero (Puxco Europe Ltd, Winchester, UK) y los resultados se han expresado con pausa mejorada («enhanced pause» o Penh). El Indice Penh, expresado como un aumento respecto de la resistencia basal de las vlas 5 respiratorias, se ha obtenido dividiendo el valor Penh medido tras exposicion por inhalacion a dosis crecientes de metacolina (de 0 a 100 mg) entre el valor Penh medido tras inhalacion de PBS nebulizado, como se describe en Razafindratsita et al. 2007).

[0155] Para el analisis de las celulas inflamatorias en los lavados broncoalveolares (BAL), los ratones se han 10 anestesiado por inyeccion intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg de masa corporal), y se han realizado los BAL

con 3 x 400 pl de PBS. El fluido de los BAL se ha centrifugado a 800 g durante 10 min a 4°C. Los residuos celulares se han resuspendido en PBS, puesto a girar en laminas de cristal por citocentrifugado, fijado y marcado con May/Grunwald Giema (Reactifs RAL, Martillac, Francia). Los eosinofilos y los macrofagos se han contado con un microscopio optico utilizando un aumento de 200 veces.

15

Respuesta anticuerpos

[0156] Se han recogido muestras de sangre en el seno retroorbital para evaluar los niveles de anticuerpos especlficos de OVA por ELISA. Se han recogido los sueros despues de centrifugarlos a 10000 rpm durante 10 min.

20 Para la deteccion de los anticuerpos IgG1 e IgG2a, se ha extendido OVA purificada (0,2 pg) durante la noche a 4°C sobre placas ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Despues de las etapas de lavado y de saturacion, se han incubado sueros de raton (1/100 a 1/12800 para IgG1 y 120 a 1/12560 para IgG2a) durante 1 h a 37°C. Se han lavado las placas y se han anadido IgG1 de rata biotiniladas antirraton (dilucion 1/100, BD Pharmingen, San Jose, CA) o anticuerpos IgG2a (dilucion 1/200, BD Pharmingen) durante 1 h a 37°C. Para la deteccion se han utilizado 25 anticuerpos IgG de rata antirraton conjugados con estreptavidina-peroxidasa (dilucion 1/400, BD Pharmingen), utilizando ortofenilenediamina (OPD) como sustrato (Sigma Chemicals Aldrich). La reaccion se ha detenido con HCI 3N y las densidades opticas se han determinado utilizando un lector de placas ELISA a 492 nm (Labsystems, Helsinki, Finlandia).

30 [0157] Para la deteccion de los tltulos de anticuerpos IgE, se han extendido anticuerpos IgE antirraton (1

mg/pocillo, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas) sobre placas ELISA. Despues de las etapas de lavado y de saturacion, se han incubado las diluciones de suero de raton (1/10 a 1/320) durante 1 h a 37°C. Se ha incubado digoxigenina-OVA (a una dilucion 1/10) durante 1 h a 37°C y se han utilizado fragmentos Fab de anticuerpos de ratones antidigoxigenina conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP) (Roche) para la deteccion a una 35 dilucion de 1/1000. Se ha anadido un sustrato acido 2,2'azinobis(3-3-etilbenzotiazolin 6-acido sulfonico) (ABTS) (Roche). Se han determinado las densidades opticas utilizando un lector de placas ELISA a 405 nm.

[0158] Los tltulos de anticuerpos se han definido como la inversa de la ultima dilucion en la que el valor de la densidad optica esta 2 veces por encima del ruido de fondo.

40

[0159] Para determinar los niveles de anticuerpos especlficos del alergeno en las superficies mucosas, se han recogido muestras de saliva para hacer una determinacion del nivel de IgA mediante ELISA. Brevemente, las microplacas se han recubierto con IgA de cabra antirraton (0,1 mg/pocillo, Bethyl Laboratories), lavado, y se han incubado diluciones del sobrenadante (1/20 a 1/320) durante 1 h a 37°C, seguido por dioxigenina-OVA (dilucion

45 1/100). Se han lavado la placas y se han utilizado anticuerpos de conejo anti-digoxigenina conjugados con HRP (Roche) para la deteccion, como se ha descrito mas arriba.

Analisis estadfstico

50 [0160] Los datos se han comparado utilizando la prueba no parametrica (Kruskal-Wallis). Los resultados se

han considerado como estadlsticamente significativos con un valor p inferior a 0,05.

Resultados:

55 Los anti-IgE de los clones R35-72 y R35-92 asf como los isotipos IgGi/K correspondientes mejoran la eficacia clfnica en ratones sensibilizados especificamente con OVA y en la inflamacion pulmonar.

[0161] Como se ha descrito mas arriba, los ratones sensibilizados con OVA desarrollan una hiperreactividad

de las vlas respiratorias (AHR) asociada a valores Penh elevados detectables por pletismografla de cuerpo entero,

as! como signos de inflamacion de los pulmones con infiltraciones celulares. Se han probado anticuerpos anti-IgE (clones LO-ME-2, R35-72 y R35-92) como candidatos para la inmunoterapia en este modelo murino in vivo de asma estable. Se han utilizado anticuerpos del isotipo correspondiente y PSC-OVA como controles en estos experimentos.

5 [0162] Como se muestra en la Fig. 2, y como se esperaba, los ratones sanos (es decir, no sensibilizados)

presentaban valores Penh bajos mientras que los ratones sensibilizados con OVA tratados por via sublingual con PBS (placebo) presentaban una AHR elevada. Los ratones sensibilizados con OVA tratados por via sublingual con PSC-OVA se han utilizado como control positivo y mostraban valores Penh bajos. Un tratamiento sublingual con el control isotlpico IgG2a/K o con anticuerpos anti-IgE (isotipo IgG2a/K) del clon LO-ME-2 (10 o 25 pg) no ha tenido 10 impacto en la AHR. Al contrario, un tratamiento sublingual con anti-IgE (isotipo IgGi) de los clones R35-72 y R35-92 ha inducido una reduccion de la AHR en la mayorla de los animales frente a los ratones tratados con PBS. De forma sorprendente, el control isotlpico IgGi ha inducido una reduccion similar de la AHR, sugiriendo que los mecanismos inmunitarios no especlficos del antlgeno estan implicados en la induccion de la tolerancia en este modelo.

15 [0163] La disminucion de la AHR observada tras el tratamiento con los anti-IgE correspondientes a los clones

R35-72 y R35-92 (10 o 25 pg) y el control isotlpico IgGi correspondiente se ha asociado a una disminucion significativa (p<0,05) del numero de eosinofilos en los BAL, como se ha observado con el control positivo PSC-OVA (Fig. 3).

20 La administracion sublingual terapeutica de anticuerpo anti-IgE no altera las respuestas IgG, IgE o IgA.

[0164] La inmunoterapia sublingual (SLIT) con los anticuerpos anti-IgE del clon LO-ME-2 (isotipo IgG2a/K) ha aumentado las IgG1 e IgE especlficas de OVA solamente en la dosis de 10 pg. En todos los demas grupos experimentales no se ha producido un cambio detectable en el anticuerpo sericos IgE o IgG especlficos de OVA. Los

25 niveles de anticuerpos salivares IgA especlficos de OVA aumentaban en los ratones tratados con PSC-OVA frente a los ratones que recibieron PBS. En cambio, ninguno de los anticuerpos anti-IgE ni los anticuerpos de control con los isotipos correspondientes han alterado el nivel de anticuerpos IgA especlficos de OVA.

[0165] As! este estudio muestra que los anticuerpos anti-IgE de isotipo IgG1/K de los clones R35-72 y R35-92 30 permiten aumentar la induccion de la tolerancia. Ademas, los anticuerpos de control isotlpicos IgG1/K promueven

igualmente la induccion de la tolerancia. Al contrario, los anticuerpos anti-IgE de isotipo IgG2a/K del clon LO-ME-2 y los anticuerpos de control isotlpicos IgG2a/K no alteran la funcion pulmonar en los ratones sensibilizados con OVA. As! estos datos sugieren que el efecto inductor de tolerancia de los anticuerpos anti-IgE de los clones R35-72 o R35- 92 podrla implicar la region Fc de los isotipos IgG1/K. Esto desvela la posibilidad de que dichos anticuerpos anti-IgE 35 podrlan mediar su efecto inductor de tolerancia uniendose a la vez a las IgE unidas a FcsRI por sus regiones Fab, y uniendose al receptor regulador FcYRIIb, a traves de su region Fc.

EJEMPLO 3

40 [0166] Este estudio muestra la distribucion de los receptores Fc de las IgG en los tejidos linguales del raton y

la caracterizacion de la N-glicosilacion de las regiones Fc de los anticuerpos utilizados en el ejemplo 2.

Material y metodos

45 Inmunohistologfa

[0167] Para la inmunohistologla, se han extraldo tejidos del bazo y de la lengua de ratones no sometidos a

tratamiento y congelados a -80°C. Se han cortado en serie secciones de tejidos (4-6 mm de longitud), secado al aire durante al menos 30 min, fijado en acetona durante 1-2 minutos, e incubado durante 10 min en 3 % de peroxido de 50 hidrogeno (Sigma) para bloquear la actividad peroxidasa endogena. Tras lavado en solucion amortiguadora Tris (TBS: 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4), se han anadido los anticuerpos primarios es decir anti-CD16/32 (clon 2.4G2, BD Biosciences) o anti-SIGN-R1 (clon ERTRP9, Abcam) (dilucion 1/100 en TBS) a las muestras y se han incubado durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se han lavado en TBS y se han incubado con anticuerpos secundarios IgG de conejo anticaprino biotinilados (Sigma 1/400) durante 30 min antes de anadir 55 peroxidasa de rabano picante biotina-estreptavidina (SA-HRP, Sigma). Pasados 30 min, se han lavado las muestras y se ha visualizado el marcado especlfico utilizando la diaminobencidina (DAB, Sigma) como sustrato. Se han incluido secciones de tejido realizadas en ausencia del anticuerpo primario como controles negativos.

Analisis de la N-glicosilacion de los anticuerpos utilizando LC-ESIMS

[0168] Los anticuerpos IgG de rata anti-IgE (R35-72 y R35-92 de BD Biosciences, eBRGI y eBR2 de eBiosciences, LOME2 de Invitrogen) se han desnaturalizado (urea 6 M) y reducido (75 mM DTT, 50°C, 15 min) antes del analisis por LC-ESIMS. El analisis de cadenas pesadas reducidas por ESIMS se ha hecho despues de la

5 separacion cromatografica de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas. Las IgG tambien se han sometido a la LC- ESIMS tras deglicosilacion (tratamiento PNGase F, Glycoprofile II, Sigma) o eliminacion enzimatica del acido sialico (sialidasa Au, QA Bio) segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se han inyectado 2 mg aproximadamente de anticuerpo reducido en una Acquity C4, cm x 2,1 mm, 1,7 mm (BEH300, Waters) termostada a 80°C y conectada a un sistema RS-HPLC (Dionex). Se ha hecho un gradiente de CH3CN (con 0,1% v/v de acido formico) a una 10 velocidad de flujo de 400 ml/min para asegurar una deteccion UV correcta a 210 nm. Un espectometro de masa Qq- TOF (Maxis, Bruker) estaba conectado al RS-HPLC para una medicion de masa correcta y operaba en modo de ionizacion positiva. La deconvolucion del espectro de masa se ha realizado utilizando el algoritmo MaxEnt (Waters Corp.) utilizando los siguientes parametros: 45000-55000 Da, autoespaciado de los puntos de datos, resolution 40000. Asl, se han obtenido las masas de cadenas pesadas intactas, desialiladas y deglicosiladas para identificar 15 los perfiles de glicosilacion.

Resultados:

Identificacion de las celulas que transportan los receptores Fc de las IgG en los tejidos de la lengua de los ratones 20 BALB/c no sometidos a tratamiento y sensibilizados con OVA

[0169] Para determinar la distribucion del tejido del receptor Fc de las IgG, los inventores han analizado los tejidos linguales de raton BALB/c no sometidos a tratamiento y sensibilizados con OVA por inmunohistologla utilizando anticuerpos especlficos es decir CD16/CD32 y SIGN-R1. CD16/CD32 se ha detectado en la interfaz

25 mucosa/submucosa a la vez en puntos de tejido ventral y dorsal de la lengua asl como en la zona muscular, a la vez en los ratones no sometidos a tratamiento y los ratones sensibilizados con OVA. En cambio, SIGN-R1 solo se ha detectado en el tejido muscular (tanto en los ratones no sometidos a tratamiento como en los sensibilizados con OVA), lejos del punto de administration sublingual.

30 Analisis de la N-glicosilacion de los anticuerpos por LC-ESIMS

[0170] Las IgG se han desnaturalizado y reducido antes del analisis por LC-ESIMS de las cadenas pesadas intactas, desialiladas y deglicosiladas, para identificar sus perfiles de glicosilacion respectivos.

35 [0171] Las diferentes estructuras oligosacarldicas han sido determinadas por LC-ESIMS, a la vez antes y

despues de las digestiones enzimaticas (es decir desglicosilacion y eliminacion del acido sialico). El anticuerpo R35- 92 presentaba una heterogeneidad estructural de las glicoformas de cadenas pesadas, con la adicion sucesiva de diferentes monosacaridos con oligosacarido unido en N. El espectro de masa del anticuerpo R35-92 desglicolisado muestra la masa (49075 Da) del polipeptido de la cadena pesada mientras que el espectro de masa de la cadena 40 pesada nativa muestra un aumento de masa de 1298 Da correspondiente a la adicion de una estructura no fucosilada, no galactosilada, no sialilada, biantenaria (masa observada 50373 Da). Tambien se han destacado polisacaridos biantenarios sialilados, galactosilados y fucosilados. El tratamiento con sialidasa ha confirmado la presencia de estructuras biantenarias fucosiladas a la vez mono y bisialiladas. Se han realizado experimentos similares en cada anticuerpo. Los resultados estan resumidos en la tabla 2 que aparece a continuacion.

45

Tabla 2: Resumen de la caracterizacion de la N-glicosilacion de las cadenas pesadas

Clon

Isotipo Actividad Sialilacion Fucosilacion

R35-72

IgG1 + ND 40%

R35-92

IgG1 + 30% 50%

eBRG1

IgG1 + ND ND

eBRG2

IgG2a - ND 100%

LO-ME*

IgG2a - ND 50%

ND: no detectado *: el anticuerpo LO-ME presenta un perfil de espectro de masa no habitual

[0172] Segun la RS-HPLC seguida del analisis ESIMS de alta resolucion y de alta precision, todos los

anticuerpos monoclonales IgG de rata anti-IgE analizados (R35-72, R35-92, eBRG1, eBRG2 y LO-ME2) presentan

cadenas pesadas N-glicosiladas. Se han observado estructuras oligosacarldicas regulares, la mayorla biantenarias no galactosiladas. La glicosilacion es diferente entre los anticuerpos porque una sializacion significativa (aproximadamente 30 %) solo se ha observado en la muestra R35-92. Ademas, tambien se ha comprobado la ausencia de fucosa corazon (muestra eBRGI) y una fucosilacion parcial o total (muestras R35-92 y eBRG2 5 respectivamente). Asl, ni la sializacion ni la fucosilacion tienen una funcion crltica en lo que respecta a la actividad de induccion de la tolerancia.

EJEMPLO 4

10 [0173] Este estudio presenta la identificacion de los receptores del fragmento Fc de las IgGi en los tejidos

bucales humanos.

[0174] Los anticuerpos anti-CD32 (clon AT10, ref ab41899, Abcam) reconocen la familia de los receptores inhibidores CD32.

15

[0175] La presencia de celulas que expresan CD32 se detecta por inmunohistoqulmica en la union mucosa/submucosa del tejido de las enclas humanas.

[0176] Los inventores han observado un marcado de intensidad moderada a marcada de celulas inmunitarias en cantidad muy importante en las papilas dermicas (cara bucal).

20

[0177] Los anticuerpos anti-CD16 (clon 2H7, ref ab74512, Abcam) reconocen la familia de los receptores activadores CD16.

[0178] La presencia de celulas que expresan CD16 se detecta por inmunohistoqulmica en la union 25 mucosa/submucosa del tejido de las enclas humanas.

[0179] Los inventores han observado un marcado de intensidad moderada a marcada de celulas inmunitarias en baja cantidad en las papilas dermicas (cara bucal).

30 [0180] Asl, los inventores han mostrado que en las enclas humanas, el equilibrio entre los receptores

activadores CD16 y receptores CD32 (que comprenden receptores inhibidores) favorecla a estos ultimos. Se han detectado en mayor cantidad en las papilas dermicas. Por consiguiente, la presencia de un mayor numero de receptores CD32 favorece la utilizacion de ligandos de CD32, y en particular de inmunoglobulina IgG1, por via mucosa, en particular por via sublingual, en el hombre para tratar enfermedades y manifestaciones inflamatorias.

35

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo anti-IgE de tipo IgGi con la capacidad de unir las IgE fijadas a los receptores de la

   superficie de un mastocito o basofilo sin disociar dichas IgE de sus receptores y de entrecruzar las IgE fijadas a los 5 receptores de la superficie de un mastocito o basofilo, para usarlo en el tratamiento de una hipersensibilidad de tipo

   1. dicho anticuerpo anti-IgE se administra por via mucosa.
2. 2. Anticuerpo anti-IgE para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo anti-IgE reconoce una parte de la IgE no implicada en la fijacion de la IgE a su receptor en el mastocito o basofilo.

   10
3. 3. Anticuerpo anti-IgE para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo anti-IgE es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humano o humanizado.
4. 4. Anticuerpo anti-IgE para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo 15 anti-IgE se administra por via sublingual.
5. 5. Anticuerpo anti-IgE para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la hipersensibilidad de tipo 1 se manifiesta por una anafilaxia sistemica, una anafilaxia localizada, una rinitis alergica, asma, dermatitis atopica, una conjuntivitis, eccema, una mastocitosis inducida por un choque anafilactico, una

   20 manifestacion alergica asociada a una parasitosis.
6. 6. Compuesto farmaceutico para un uso en el tratamiento de una hipersensibilidad de tipo 1 por via mucosa, que comprende un anticuerpo anti-IgE como el que se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

   25
7. 7. Compuesto farmaceutico para su uso segun la reivindicacion 6 que comprende ademas un alergeno o un antlgeno.
8. 8. Compuesto farmaceutico para su uso segun la reivindicacion 6 o 7, en el que el compuesto se 30 administra por via sublingual.