KR102576252B1 - 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 면역조절 기능 이상 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 예방 또는 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인위적으로 산화를 유도한 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 알레르기질환, 만성염증성 질환, 자가면역질환 또는 악성종양질환 치료용 약학적 조성물과 상기 질환을 가진 환자들에게 상기 조성물을 투여함으로써 기존의 면역글로불린 치료제들과 차별화되고 더욱 효과적인 새로운 면역조절치료법을 제공할 수 있다.

Description

산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 면역조절 기능 이상 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases associated with immune dysregulation comprising oxidized immunoglobulin}

본 발명은 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 면역조절 기능 이상과 관련된 질환들의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.

알레르기질환, 만성염증성질환 또는 자가면역질환, 그리고 악성종양질환의 발병기전에 과민한 면역반응(알레르기 반응) 혹은 자신의 항원에 대한 과도한 면역반응(자가면역반응) 혹은 종양 세포에 대한 낮아진 면역반응(악성종양 질환에서)을 포함한 면역조절 기능 이상(immune dysregulation)이 핵심적인 역할을 함이 잘 알려져 있다. 이에 상기 면역조절 기능 이상 관련 질환들을 앓고 있는 환자들에서 단클론항체 치료제들을 포함한 여러 종류의 면역글로불린 치료제들의 면역조절치료 효과가 확인되어 실제로 임상에서 사용되고 있다.

현재 알레르기질환, 만성염증성 질환 또는 자가면역질환, 그리고 악성종양질환의 예방 또는 치료를 위해서 사용되고 있는 면역글로불린 치료제들은 면역 반응에 관여하는 특정 표적항원과 특이적으로 반응하는 단클론항체(monoclonal antibody) 혹은 다수의 건강한 혈액 공여자들로부터 얻어진 모듬 혈장(plasma pool)으로부터 분리된 다가형 혹은 다클론 면역글로불린 제제(polyvalent or polyclonal immunoglobulin preparation)의 두 가지의 형태로 생산되어 사람 혹은 포유동물에서 발생한 다양한 면역조절 기능 이상과 관련된 질환들(diseases associated with immune dysregulation)의 예방 또는 치료목적으로 사용되고 있다. 하지만 다수의 건강한 헌혈자들의 모듬 혈장으로부터 분리된 다가형 혹은 다클론 면역글로불린 제제가 상기 질환에서 면역조절 치료효과를 나타내는 기전은 현재까지 명확하게 밝혀져 있지 않다.

현재 일반적으로 사용되고 있는 면역글로불린 제제는 주로 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사로 투여할 경우 상기 질환들에서 예방효과 및 치료효과를 나타낸다. 면역반응에 관여하는 특정 단백질에 대한 단클론항체의 경우 질환을 앓고 있는 포유동물에게 주사할 경우 그 단백질이 관여하는 특정 면역 반응 경로(specific immune pathway)의 활성화를 특이적으로 억제하여 면역조절 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 일부 연구자들은 다수의 건강한 공여자들의 혈액으로부터 분리된 다가형의 면역글로불린 제제에는 자연적으로 생성되어진 질병 발생에 기여하는 병적인 항체들(pathogenic antibodies)의 항원결합 부위와 반응하는 항이디오타입(anti-idiotype) 항체들이 존재하여 환자들에게 투여될 경우 질병의 발생에 핵심적인 역할을 하는 병적인 항체들인 알레르겐에 대한 면역글로불린E (IgE) 혹은 자가항원에 대한 면역글로불린G (IgG)와 반응하여, 항원-항체 면역복합체를 형성하여 병적인 면역항체들의 기능을 억제함으로써 질병을 호전시킬 가능성에 대한 가설(hypothesis of passive anti-idiotype therapy)을 제시한 바 있다.

본 발명자는 상기한 기존의 가설(hypothesis of passive anti-idiotype therapy)과는 다르게 면역글로불린 단백질을 항원으로 사용하여 능동적 항이디오타입 면역치료 효과를 유도하기 위해서 면역글로불린 단백질의 산화현상을 인위적으로 유도하여, 면역글로불린의 면역원성을 높여서 능동적 항이디오타입 면역치료의 효과를 효과적으로 발생시킬 수 있다는 가설(hypothesis of active anti-idiotype therapy)을 세우고 본 발명을 고안하였다. 현재 당업계에서는 면역글로불린 치료제(특히 단클론항체 치료제)의 생산 공정에서 상기 면역글로불린 단백질의 산화현상을 최대한 차단하기 위해 노력하고 있는데, 이는 산화된 면역글로불린 단백질을 인체에 투여 시 치료제로 사용한 면역글로불린의 항원반응부위에 대한 항이디오타입 항체(즉, anti-drug antibody)의 생성이 증가되어 치료 항체의 작용을 억제할 수 있고, 또 다량체(polymer)의 형성을 통해서 단백질 응집현상이 발생하여 단백질의 손실과 더불어 응집된 면역글로불린을 투여 받은 환자에서 보체 활성화로 인한 염증반응을 포함한 부작용이 발생할 위험성이 증가하기 때문이다.

발명자는 본 발명을 통해서 현재 사람의 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환들의 치료에 사용되고 있는 면역글로불린 제제들이 목표로 하는 단클론항체를 이용하여 특정 면역반응 경로를 차단하는 효과 혹은 다가형 면역글로불린을 이용한 다수의 병적인 항체들을 차단하는 효과를 유도하는 수동적인 면역치료법(passive immunotherapy) 이외에 면역글로불린 자체를 항원으로 사용하여 포유동물에 투여할 경우 면역글로불린의 항원반응 부위(idiotype)에 대한 능동적인 면역반응을 유도(active anti-idiotype immunotherapy)하고자 하였다. 이에 발명자는 본 발명에서 산화된 면역글로불린을 사용하여 면역조절 기능 이상 관련 질환들을 기존의 면역글로불린 치료제들보다 더 효과적으로 예방 혹은 치료할 수 있는 새로운 면역조절치료용 약학적 조성물과 이를 이용한 새로운 치료방법을 제시하였다.

대한민국 공개특허 제10-2021-0122185호 (2021.10. 08. 공개)

본 발명은 면역조절 기능 이상과 관련된 질환들을 앓고 있는 환자들에게 투여할 경우 기존에 사용되는 면역글로불린보다 더 뛰어난 면역조절효과를 나타내는 새로운 면역조절치료용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물을 이용하여 면역조절 기능 이상 관련 질환들의 예방 또는 치료방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 산화된 면역글로불린은 오존(ozone, O₃), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 차아염소산나트륨(Sodium hypochlorite, NaClO)등의 산화제로 이루어진 군에서 하나 이상의 산화제와 면역글로불린을 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 산화된 면역글로불린은 면역글로불린 1 mg에 대하여 오존을 0.1 내지 4 ㎍로 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 면역글로불린은 IgG인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 IgG는 포유동물의 혈액으로부터 분리된 면역글로불린G인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 IgG는 포유동물 자신의 혈액으로부터 분리된 IgG이거나, 타포유동물의 혈액으로부터 분리된 IgG인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기한 IgG는 동물세포의 배양액으로부터 분리한 IgG인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환은 알레르기질환, 만성염증성 질환, 자가면역질환 및 악성종양질환으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 알레르기질환은 기관지 천식, 알레르기성비염, 알레르기성결막염, 아토피피부염, 두드러기, 음식물 알레르기, 아나필락시스 및 약물알레르기로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 만성염증성 질환 또는 자가면역질환은 퇴행성관절염, 만성 염증성 위장관염, 강직성 척추염, 만성 농포성 피부염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천포창, 자가면역 갑상선염, 자가면역 간염, 만성 염증성 장질환, 자가면역성 신장염, 만성 염증성 위장관염, 쇼그렌 증후군, 공피증 및 건선으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 악성종양질환은 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 갑상선암, 유방암, 간암, 신장암, 전립선암 및 중피종으로 이루어진 군에서 선택된 고형암이거나, 백혈병, 임파종 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 혈액암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 산화된 면역글로불린은 세포독성 T세포의 활성화를 통한 면역조절에 의한 항암면역치료 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 산화된 면역글로불린에 추가로 면역보강제를 혼합하는 것을 특징으로 하는 새로운 면역조절치료용 약학적 조성물과 이의 제조 방법을 제공한다. 상기한 약학적 조성물에 포함되는 면역보강제는 현재 백신제형이나 면역조절치료제들에서 면역보강을 목적으로 현재 사람에서 통상적으로 사용되고 있는 수산화알루미늄(aluminum hydroxide), 인산화칼슘(calcium phosphate), 타이로신(tyrosine), 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A, MPL), 또는 히스타민(histamine) 일 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물 자신의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하거나, 타포유동물의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하는 단계(제1단계), 상기 분리된 면역글로불린을 산화제와 혼합하여 반응시켜 산화된 면역글로불린을 제조하는 단계(제2단계) 및 상기 산화된 면역글로불린을 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환을 앓고 있는 개체에게 투여하는 단계(제3단계)를 포함하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

상기한 산화제는 오존, 과산화수소, 차아염소산나트륨 등에서 선택된 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 제2단계는 분리된 면역글로불린 1 mg에 대하여 오존을 0.1 내지 4 ㎍ 을 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물 자신의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하거나, 타포유동물의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하는 단계(제1단계), 상기 분리된 면역글로불린을 산화제와 혼합하여 반응시켜 산화된 면역글로불린을 제조하는 단계(제2단계) 를 포함하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기한 산화제는 오존, 과산화수소, 차아염소산나트륨 등에서 선택된 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 제2단계는 분리된 면역글로불린 1 mg에 대하여 오존을 0.1 내지 4 ㎍ 을 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 인위적으로 산화를 유도하여 면역원성(immunogenicity)를 증가시킨 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 하는 본 발명의 면역조절 기능 이상 관련 질환 관련 약학적 조성물을 면역조절기능 이상 관련 질환 환자들에게 투여하는 경우, 산화처리하지 않은 면역글로불린을 유효성분으로 하는 기존 치료제를 투여했을 때와 비교하여 현저하게 향상된 면역조절 치료효과를 나타내어 면역조절 기능 이상 관련 질환에 대한 예방 및 치료효과가 우수한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 Kaplan-Meier 분석을 통하여 원격 전이를 동반한 진행성 고형암 환자들에서 오존과 반응시켜 산화시킨 자가 전체 면역글로불린G (IgG) 근육주사요법 치료군과 산화처리를 하지 않은 자가 전체 면역글로불린G (IgG) 근육주사처치군의 생존기간과 누적생존률 및 임상시험 대상자들에서 상기한 치료를 받기 시작한 후 1개월, 3개월, 6개월 시점의 생존율을 비교·분석한 결과 그래프이다.
도 2는 산화된 자가 전체 IgG 근육주사를 시행 받은 진행성 고형암 환자 2명에서 첫 번째 주기의 치료시작 시점(week 0)과 치료 종료 후 4주 경과시점(week 8)에 말초혈액 CD8+ T세포들 중에서 IFN-γ를 생산하는 세포들의 비율(%)의 변화를 flow cytometry로 분석한 결과이다.
도 3은 상품화된 근육주사용 면역글로불린을 오존과 차아염소산나트륨과 혼합하여 산화시킨 후, 상기 면역글로불린의 산화 여부를 항DNP항체를 이용한 immunoblot방법으로 확인한 결과이다.
도 4는 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린과 정맥주사용 사람 면역글로불린을 오존과 혼합하여 산화시킨 후, 상기 면역글로불린의 산화 여부를 항DNP항체를 이용한 immunoblot방법으로 확인한 결과이다.
도 5는 건강한 정상인 1명에서 시판 중인 다수의 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리하여 제조한 근육주사용 IgG를 근육 주사한 경우와 상기한 IgG를 오존과 혼합하여 산화시킨 IgG를 근육 주사한 경우의 면역 조절 효과의 차이를 확인하기 위해서 시행한 임상시험 연구 디자인을 나타낸 것이다.
도 6은 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후에 얻어진 배양액내의 IL-10 농도를 비교한 그래프이다.
도 7은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후에 얻어진 배양액내의 IL-10 농도를 비교한 그래프이다.
도 8은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 다양한 조건으로 산화시킨 사람 IgG들을 반응시킨 경우 사람 IgG를 산화 정도의 변화에 따른 배양액내의 IL-10 농도의 차이를 분석한 그래프이다.
도 9는 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후에 얻어진 배양액내의 IL-8 농도를 비교한 그래프이다.
도 10은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후에 얻어진 배양액내의 IL-8 농도를 비교한 그래프이다.
도 11은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 다양한 조건으로 산화시킨 사람 IgG들을 반응시킨 경우 사람 IgG의 산화 정도 변화에 따른 배양액내의 IL-8 농도의 차이를 비교한 그래프이다.
도 12는 Ovalbumin (OVA) 알레르기 마우스 모델에서 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 피하 주사한 후에 얻어진 마우스들의 혈청 검체들에서 OVA-특이 IgG 항체 역가를 비교한 그래프이다.
도 13은 사람 IgG와 산화된 사람 IgG를 rat basophilic leukemia 세포에서 처리하였을 때 IgE-항원매개 자극에 의한 β-hexosaminidase 분비 유리율(% release)의 차이를 비교분석한 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 본 발명의 실시예들에서 면역조절 기능 이상 관련 질환을 앓고 있는 환자들로부터 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하여 인위적으로 산화를 유도하여 산화된 면역글로불린을 다시 환자 자신에게 근육주사로 투여한 경우 산화처리를 하지 않은 자신의 면역글로불린을 근육주사로 투여한 경우와 비교하여 유의하게 뛰어난 질병치료효과를 보임을 확인하였고, 정상인과 실험동물에서도 산화된 면역글로불린이 기존의 산화처리하지 않은 면역글로불린과 비교하여 유의하게 향상된 면역조절 효과를 유도함을 확인하였으며, 실험실 조건에서 배양된 면역세포들에서도 산화된 면역글로불린이 기존의 산화처리하지 않은 면역글로불린과 비교하여 유의하게 향상된 면역조절 치료효과를 낼 수 있다는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 산화된 면역글로불린(oxidized immunoglobulin)을 주된 유효성분으로 포함하는 면역조절 기능 이상 관련 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 발명이다.

본 발명은 산화된 면역글로불린(oxidized immunoglobulin)을 이용한 면역조절 기능 이상 관련 질환에 대한 예방 또는 치료방법에 대한 발명이다.

본 발명의 명세서에서 사용된 용어 “조성물”은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 각각의 활성 성분은 본 발명의 조성물, 본 발명의 조성물을 용해시킨 주사용 제제 또는 생체 내 어느 하나 이상에서 존재할 수 있으며, 특히 면역보강제 또는 히스타민은 각각 면역글로불린과 공유적 또는 비공유적으로 결합된 복합체의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 활성 성분 하나가 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 형태인 조성물, 모든 활성 성분이 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 염의 형태인 조성물, 하나 이상의 활성 성분이 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 염의 형태이고, 다른 활성 성분들이 자유 염기의 형태인 조성물 또는 하나 이상의 활성 성분의 복합체가 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 염의 형태인 조성물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 활성성분들은 투여를 위해 필요한 제제의 형태에 따라 다양한 형태의 약학적으로 허용되는 담체와 친밀히 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 단위 투여량 형태일 수 있으며, 의사의 판단에 따라 투여량을 조절하여 사용할 수 있도록 희석하여 사용하는 것이 가능한 것일 수 있다.

본 발명의 “면역글로불린”은 혈청 성분 중 면역에 중요한 역할을 하고, 항체 작용을 하는 특정한 물리적, 구조적, 아미노산 서열 등의 공통적 특징으로 한정지워질 수 있는 당단백질을 의미한다. 면역글로불린의 기본구조는 분자량 약 2만 3000의 L사슬(경쇄) 1쌍과 분자량 약 5만 내지 7만의 H사슬(중쇄) 1쌍이 S-S 결합에 의해 연결되어 있으며, H 사슬의 종류 γ, α, μ, δ, ε에 의해 각각 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE로 분류된다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 또는 그들의 혼합물일 수 있으며 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 그들의 단편 또는 그들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 면역글로불린은 포유동물의 혈액으로부터 분리된 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함하는 전체 면역글로불린일 수 있다. 자세하게는 상기 면역글로불린은 면역조절 기능 이상 관련 질환을 앓고 있는 포유동물의 혈액으로부터 분리된 IgG일 수 있다.

본 발명의 조성물, 예방방법 혹은 치료방법에서 사용되는 면역글로불린은 예를 들어 다음과 같은 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 포유동물의 혈액 혹은 혈장으로부터 전체 면역글로불린을 분리하기 위해서 당 업계에 통상적으로 사용되는 에탄올 침전법, 이온교환수지 흡착크로마토그래피법 또는 Protein A 또는 Protein G 컬럼을 이용한 흡착크로마토그래피법을 포함한 다양한 방법으로 분리할 수 있다. 한편, 당 업계에 공지된 방법에 따라 포유동물의 말초혈액 단핵구로부터 얻어진 항체 단백질에 대한 유전정보를 간직한 cDNA library로부터 면역글로불린에 대한 정보를 얻은 후에 이를 토대로 유전공학적으로 조작된 배양된 동물세포를 이용하여 제조한 것을 사용할 수도 있다. 이렇게 제조한 유전자 재조합 면역글로불린은 포유동물의 면역글로불린의 아미노산 염기서열이나 이를 일부 변화시켜 사람 면역글로불린을 산화시킨 유전자 조작 재조합 면역글로불린 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 면역글로불린은 면역글로불린 단백질 중 알레르겐과 반응할 수 있는 F(ab)’2 또는 Fab분절과 같이 알레르겐과 결합하는 면역글로불린의 일부분일 수 있다.

또한 본 발명의 조성물에서 사용되는 면역글로불린은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 포유동물과는 다른 종의 동물로부터 얻어진 것일 수 있다. 특히 면역글로불린은 이종 간의 상동성이 높아 한 종의 포유동물로부터 얻은 면역글로불린을 인간을 포함한 다른 종류의 포유동물에게 투여하더라도 유사한 약리효과를 나타낼 수 있음은 이미 당업계에 널리 알려진 사실이다. 따라서, 본 발명의 조성물 투여에 의한 면역기능 이상질환의 예방 또는 치료 효과는 본 발명의 약학적 조성물이 최종적으로 면역조절 기능 이상반응의 억제를 위한 목적으로 투여되는 동물과 다른 종의 포유동물로부터 얻어진 경우에도 동일하게 작용할 수 있다.

여기에서 사용된 용어 “포유동물”은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 의미하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 산화된 면역글로불린은 포유동물에게 투여할 경우 그 자체가 항원으로 사용되어 병적인 면역항체의 항원결합 부위와 반응하는 항이디오타입 항체들이 자연적으로 생성되어 항원-항체 면역복합체를 형성할 수 있는 항체를 의미하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 면역조절 기능 이상 관련 질환은 알레르기질환, 만성염증성 질환, 자가면역질환 또는 악성종양 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 알레르기질환은 외부적 환경에 존재하는 항원들에 대한 알레르기 반응으로 인해서 발병된다고 알려진 기관지천식, 알레르기성비염, 알레르기성결막염, 아토피피부염, 두드러기, 음식물 알레르기, 아나필락시스 및 약물알레르기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 만성염증성 질환 또는 자가면역질환은 퇴행성관절염, 만성 염증성 위장관염, 강직성 척추염, 만성 농포성 피부염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천포창, 자가면역 갑상선염, 자가면역 간염, 만성 염증성 장질환, 자가면역성 신장염, 만성 염증성 위장관염, 쇼그렌 증후군, 공피증 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 악성종양질환은 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 갑상선암, 유방암, 간암, 신장암, 전립선암 및 중피종으로 이루어진 군에서 선택된 고형암이거나, 백혈병, 임파종 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 혈액암 중 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 산화된 면역글로불린에 추가로 면역보강제를 혼합한 것을 특징으로 하는 새로운 면역조절치료용 약학적 조성물과 이의 제조 방법을 제공한다.

상기 약학적 조성물에 포함되는 면역보강제는 현재 백신제형이나 면역조절 치료제들에서 면역보강을 목적으로 현재 사람에서 통상적으로 사용되고 있는 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide), 인산화칼슘(calcium phosphate), 타이로신(tyrosine), 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A, MPL), 또는 히스타민(histamine)일 수 있다.

본 발명은 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 알레르기질환, 만성염증성 질환, 자가면역질환 또는 악성종양 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물 자신 혹은 타포유동물의 혈액으로부터 면역글로불린을 분리하는 단계(제1단계), 상기 분리된 면역글로불린을 산화제와 혼합하여 반응시켜 산화된 면역글로불린을 제조하는 단계(제2단계) 및 상기 산화된 면역글로불린을 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환을 앓고 있는 개체에게 투여하는 단계(제3단계)를 포함하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서 산화된 면역글로불린은 면역글로불린과 산화제를 혼합하여 반응시켜 제조되며, 상기 산화제는 산소 자유 라디칼(oxygen free radical) 혹은 활성산소(reactive oxygen species)를 발생시킬 수 있다고 알려진 오존(O₃), 과산화수소(H₂O₂), 차아염소산나트륨(NaClO)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 산화된 면역글로불린은 액체 상태의 면역글로불린과 액체 상태의 과산화수소 또는 차아염소산나트륨을 사용하거나 기체 상태의 오존가스를 혼합하여 반응시켜 제조한 것일 수 있다. 상기 반응은 4 내지 95 ℃의 온도 조건에서 1 분 내지 24 시간동안 반응한 것일 수 있다.

이 때, 사람 IgG (hIgG) 1 mg에 대하여 상기 오존가스의 사용량은 0.01 내지 10 ㎍일 수 있으며, 자세하게는 0.1 내지 4 ㎍이 사용되는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 피하 주사를 위한 것이다. 그러나 본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해서도 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 현재 사용 중인 면역글로불린 제형을 이용한 치료 시에 사용되는 면역글로불린의 투여량을 고려하여 결정할 수 있다. 일반적인 약학적 조성물의 경우 증상의 경중도, 환자의 나이, 체중 등에 따라 조성물의 투여량을 결정하나, 본 발명의 치료 방법에서는 상기한 조건 뿐만 아니라 산화된 면역글로불린에 대한 환자의 민감도에 따라 결정되는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1회 투여 시, 산화된 면역글로불린의 투여량은 0.001 내지 1000 mg일 수 있고, 자세하게는 10 내지 50 mg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 바람직하게는 용액 또는 동결건조된 분말의 형태로 존재할 수 있으며, 1회 투여 시 0.5 내지 2 ㎖의 주사용 완충액에 포함된 형태로 사용할 수 있다.

또한, 별도의 바이알에 담긴 주사용 완충액에 용해시켜 사용할 수 있도록 면역글로불린과 면역반응을 증가시키기 위해서 통상적으로 사용되는 수산화알루미늄(aluminum hydroxide), 인산화칼슘(calcium phosphate), 타이로신(tyrosine), 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A, MPL) 등을 포함한 면역보강제 또는 히스타민(histamine)이 혼합된 형태로 제형화되어 제공될 수 있으며, 투여 전 의사가 환자의 증상에 따라 투여량을 결정하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 주사용 제제로 제제화하기 위해 사용되는 주사용 완충액 및 기타 보조제 성분은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 대한 주사용 제제는 주사용 완충액 외에, 예를 들어 용해보조제, pH 조정제, 현탁제 등의 기타 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사용 완충액은 생리식염수 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분 또는 그들을 포함하는 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 쉽게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 유효 성분, 투여의 방식, 제제의 효과 및 질환 상태의 발전에 따라 변화할 수 있을 것이다. 또한, 환자의 나이, 체중, 식이 및 투여의 시간을 포함한 치료받는 환자 개개인의 인자들에 따라 적절한 치료적 수준에 따른 투여량 조절이 필요할 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 >

발명자는 하기 다양한 실시예들을 통해서 산화된 면역글로불린의 제조방법을 제시하고, 면역세포 배양실험, 동물실험, 사람을 대상으로 한 임상시험을 통해 산화된 면역글로불린이 기존의 면역글로불린과 비교해서 뛰어난 면역조절 효과와 알레르기질환, 만성염증성 질환, 자가면역질환 및 악성종양 질환을 포함하는 면역조절 기능 이상 질환들에 대해서 뛰어난 면역조절 치료효과를 나타낼 수 있음을 입증하였다.

<실시예 1> 진행성 고형암 환자들에서 산화된 면역글로불린의 항암면역치료효과에 대한 임상시험

본 발명자는 기관윤리위원회로부터 임상시험에 대한 허가를 받은 후에 기대여명 6개월 미만의 진행성 고형암 환자들, 더 구체적으로는 기존의 표준적인 항암 치료들에 의해서 질병이 조절되지 않는 원격부위에 암의 전이를 동반한 4기 폐암, 대장암, 난소암, 중피종, 유방암, 위암 또는 전립선암 등의 고형암 환자들을 대상으로 ‘자가 전체 IgG 근육주사요법’의 항암면역치료효과와 안정성을 검증하는 임상시험을 진행하였다.

상기 임상시험에 참여한 환자들로부터 치료 시작 전에 항응고제가 포함된 헌혈용 이중백을 사용하여 정맥혈 400 ml을 채혈한 후 원심분리하여 환자 자신의 혈장 200 ml를 분리하였다. 상기 혈장에서 Protein A bead를 이용한 흡착크로마토그래피법으로 무균무독성 상태로 분리하여 얻어진 액체상태의 자가 IgG를 1회당 50 mg으로 하여 4주간 8회 근육주사로 투여한 후 4주간의 휴지기를 갖는 것을 1 치료 주기로 하였다.

상기 1 치료 주기가 끝날 때마다 환자의 임상적인 상태를 점검하여 임상시험을 지속할 수 없을 만큼 환자의 전신 건강상태가 악화되지 않고, 환자가 치료를 지속하는 것에 대하여 동의할 경우 상기 1 치료 주기를 반복하여 최대 4주기까지 임상시험치료를 반복하면서 고형암의 임상적인 상태를 진찰소견, X선 검사, 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI) 검사, 동위원소 검사 및 혈액 검사 등을 통하여 관찰하였다.

상기 환자들 중에서 초기 임상시험에 참여한 4명의 환자들은 분리된 자가 전체 IgG를 산화처리 없이 근육주사로 투여하였으나, 초기에 임상시험에 참여한 4명의 환자들 모두가 임상적으로 유의한 치료효과를 경험하지 못하고 목표한 4주기의 치료를 시도하지 못한 상태에서 연구참여 시작 후 6개월 시점 이내에 사망하였다.

이에 발명자는 새롭게 임상시험에 참여하는 악성종양 환자들에게 기존보다 더 효과적인 항암면역치료 효과를 얻기 위하여 면역치료의 재료인 면역글로불린이 더 강한 항원성(면역원성)을 갖도록 변형시킬 필요가 있다고 판단하였다.

이에 발명자는 면역글로불린 단백질의 면역원성을 높여서 능동적 항이디오타입 면역치료 효과를 높이기 위해서 방법으로서 면역글로불린 단백질의 산화현상을 인위적으로 유도하여, 능동적 항이디오타입 면역치료의 효과를 높이고자 본 발명을 고안하였다. 한편, 현재 당업계에서는 면역글로불린 치료제(특히 단클론항체 치료제) 생산 공정에서 상기 면역글로불린 단백질의 산화현상을 최대한 차단하고자 노력하고 있는데, 이는 산화된 면역글로불린 단백질을 인체에 투여 시 치료제로 사용한 면역글로불린의 항원반응부위에 대한 항이디오타입 항체(즉, anti-drug antibody)의 생성이 증가되어 치료 항체의 작용을 억제할 수 있고, 또 다량체(polymer)가 형성을 통해서 단백질 응집현상이 발생하여 단백질의 손실과 보체활성화로 인한 염증반응을 포함한 부작용이 발생할 위험성이 증가하기 때문이다.

이에 초기 임상시험에 참여한 4명의 진행성 고형암 환자들에서 임상시험 이후에 새롭게 임상시험에 참여한 총 8명의 진행성 고형암 환자들에게 액체상태의 자가 전체 IgG 50 mg과 의료용 고압 순수산소를 오존가스발생기에 연결하여 얻어진 기체 상태의 오존가스 200 ㎍을 주사기에서 혼합(즉 IgG 1mg 당 4 microgram의 오존가스를 혼합)하여 5분 동안 반응시킨 후 가스는 제거하고 액상의 산화처리된 자가 IgG 50mg을 근육주사로 투여하였다. 산화된 자가 IgG 근육주사 치료를 받은 8명의 고형암 환자들에서는 초기 임상시험에 참여한 4명의 진행성 고형암 환자들에서와 동일한 주사용량, 주사 간격, 그리고 주사 횟수로 산화된 자가 IgG 근육주사를 시행하였다.

1-1. 진행성 고형암 환자들의 생존기간 분석

상기 임상시험 연구결과 산화된 자가 전체 IgG 근육주사를 투여받은 8명의 진행성 고형암 환자들(oxidized autologous IgG treatment group)에서 산화처리를 하지 않은 자가 전체 IgG를 투여받은 4명의 진행성 고형암 환자들(autologous IgG treatment group)과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 생존기간과 3개월 생존율 및 6개월 생존율을 나타냄을 확인하였다(표1, 도 1). 또한, 상기 임상연구에 참여한 총 12명의 진행성 고형암 환자들 모두에서 연구기간동안 임상연구와 관련된 심각한 부작용(severe adverse event)은 관찰되지 않았다.

	임상시험 연구참여 환자 수(n)	전체 생존기간 중앙값, Weeks (95% Ci)	1개월 시점 생존자 수/생존율(%)	3개월 시점 생존자 수/생존율(%)	6개월 시점 생존자 수/생존율(%)
자가 IgG 근육주사군	4	14. 2 (5. 8, 22. 5)	2/50 %	1/25 %	0/0 %
산화된 자가 IgG 근육주사군	8	33. 0 (28. 5, 37. 4)*	0/100 %	0/100 %**	7/86 %**

Kaplan-Meier analysis, *P<0.005; Fisher’s exact test, **P<0.05

상기 표 1은 원격전이를 동반한 진행성 고형암 환자들에게 근육주사로 투여한 자가 전체 IgG의 산화여부에 따른 사망자 수 및 생존율 분석 결과이다. 도 1 및 표 1에서 사용된 산화된 자가 IgG는 오존과 반응시켜 산화시킨 것이고, 자가 전체 IgG 근육주사 시작 후 1개월, 3개월, 6개월 시점의 사망자 수 및 생존율을 분석한 결과 자가 IgG 근육주사를 시행받은 환자들에 비하여 산화된 자가 IgG 근육주사를 시행받은 환자들에서 생존률과 생존기간이 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있다.

1-2. 산화된 자가 전체 IgG 근육주사치료를 투여받은 진행성 고형암 환자에서 치료 시작 전과 치료 종료 후에 말초혈액 CD8+ T세포들 중 interferon-gamma (IFN-γ) 생산 세포분획 비율(%)의 변화 분석

상기 임상시험 연구에 참여하였던 산화된 자가 전체 IgG 근육주사 치료를 투여 받은 8명의 진행성 고형암 환자들에서 치료 전·후의 말초혈액 T 세포의 변화를 관찰하기 위하여 말초혈액단핵구세포를 분리하여 flow cytometry 분석을 수행하였다. 임상시험 연구 참여 후에 전신상태의 악화로 flow cytomerty 분석을 위한 정맥혈액의 채취가 불가능하였던 3명의 환자들을 제외한 총 5명의 환자들에서 1 치료 주기 시작 직전(0주)과 종료시점(8주)에 정맥혈을 채취하여 flow cytometry 분석을 시행하였다.

Patients. No	Interferon-gamma (IFN-γ) cells in CD8+ T cells (%)
	Baseline (week 0)	Week 8
5	9.3	14.7
6	7.6	16.4
9	5.2	4.6
10	50	47.7
11	32.4	36.3

표 2는 오존과 반응시켜 산화시킨 자가 전체 IgG 근육주사를 투여받은 진행성 고형암 환자 5명에서 치료 시작 직전(0주), 4주, 그리고 8회의 산화된 IgG 근육주사종료 후 4주 후(즉, 8주 시점)에 채혈한 혈액으로부터 분리한 말초혈액 CD8+ T 세포들 중에서 IFN-γ를 생산하는 세포의 분획비율(%)을 나타낸 데이터이다. 표 2를 참고하면, 상기 5명의 환자들 중 3명의 환자들에서 전체 말초혈액 CD8+ T 세포(cytotoxic T cell)들 중에서 암세포를 죽이는 역할을 담당한다고 알려진 IFN-γ를 생산하는 T 세포의 분획(%)의 증가가 관찰되었다. 또한, 산화된 자가 전체 IgG 근육주사를 투여 받은 5명의 환자들 중 기저시점(0주)에 비교하여 1주기 치료 종료시점 (8주)에 말초혈액 CD8+ T세포들 중 IFN-γ를 생산하는 세포의 분획비율(%)이 50% 이상 증가된 소견을 보인 2명의 환자들(표 2의 No. 5, No. 6)은 1주기의 산화된 자가 전체 IgG 근육주사요법 종료 후 상기 치료 이후에 환자의 임상경과와 전신상태가 매우 양호하고 영상검사(CT와 MRI검사)상 전체 종양의 크기와 전이된 병변의 수가 치료 시작 전과 비교하여 증가하지 않는 상태(stable disease 상태)를 유지하는 임상적으로 유의한 항종양치료효과(8명중에 2명으로 25%의 clinical response rate)를 나타내고 이러한 종양이 더 진행되지 않는 안정된 질병상태를 총 관찰기간동안 지속적으로 유지하여 총 4주기의 반복치료를 시행할 수 있었다.

도 2는 산화된 자가 전체 IgG 근육주사를 투여받은 진행성 고형암 환자 2명의 말초혈액 CD8+ T 세포들 중 IFN-γ를 생성하는 세포분획의 비율(%)에 대한 flow cytometry 분석 결과이다. 상기 결과는 산화된 자가 전체 IgG 근육주사 시작 직전(baseline, 0주) 시점과 1 치료 주기가 지난 시점(8주)에 채혈한 혈액으로 분석한 것이다.

표 2 및 도 2를 참고하면, 상기 산화된 자가 IgG 근육주사치료를 4 치료 주기를 반복하여 실시할 수 있었던 2명의 환자(No. 5, No. 6)의 경우 모두에서 산화된 자가 IgG 근육주사 1 치료주기 종료 시점(8주)에서 치료 시작 시점(0주)와 비교하여 CD8+ T 세포들 중 IFN-γ를 생성하는 세포분획의 비율(%)이 50% 이상 증가되는 세포독성 T 세포(CD8+ T세포)의 현저한 활성화를 보임을 확인할 수 있다. 이를 통해 산화된 자가 전체 IgG 근육주사 치료가 진행성 고형암 환자들에서 IFN-γ 분비 CD8+ T 세포(즉, cytotoxic T 세포)의 활성화를 통해 항암 면역치료효과를 나타내었음을 알 수 있다.

따라서, 최근 전 세계적으로 진행성 고형암 환자들에서 가장 많이 사용되고 있는 항암면역치료용 Anti-PD1 단클론항체 치료제인 pembrolizumab(상품명, Keytruda, Merk, USA)의 경우 여러 종류의 진행성 고형암 환자들에서 종양의 크기가 더 이상 증가지 않는 안정된 상태(stable disease)를 유지하거나 현저히 종양의 크기가 감소하는 유의한 항종양치료효과를 보이는 비율(clinical response rate)이 약 10%-30% 정도라고 발표된 결과(Chang E, et al. The Oncologist 2021;26:e1786-e1799)를 고려할 경우 본 발명의 실시예 1에서 관찰된 산화된 자가 전체 IgG 근육주사 치료를 받은 8명의 진행성 고형암 환자들에서 대조군인 산화처리되지 않은 자가 전체 IgG 근육주사 치료를 받은 환자들 4명과 비교하여 유의하게 긴 생존기간과 유의하게 높은 3개월 생존율과 6개월 생존율을 보인 사실은 본 발명의 ‘산화된 면역글로불린을 유효성분으로 하는 약학적 조성물’이 진행성 고형암 환자들에서 항암면역치료제로서의 임상적인 유용성을 가짐을 알 수 있다. 또한 기존의 Anti-PD1 항체치료제의 경우 치료 받은 환자들 중에 상당수의 환자들에서 전신부작용으로 자가면역질환이 발생한다고 알려져있다. 하지만 본 발명의 산화된 면역글로불린 근육주사의 경우 치료 받은 환자들 모두에서 전신부작용이 관찰되지 않았다. 따라서 진행성 고형암 환자들에서 본 발명의 약학적 조성물을 이용한 치료법이 기존의 Anti-PD1 항체를 이용한 항암면역치료법과 비교해서 유사한 정도의 항종양치료효과(clinical response rate)와 더불어 전신부작용 관점에서 더욱 안전하다는 장점을 가진 새로운 항암면역치료법으로 판단된다.

<실시예 2> 산화된 면역글로불린을 주성분으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법 1

단백질을 산화시키기 위한 방법으로 가장 많이 활용되고 있는 산소 자유 라디칼(oxygen free radical)을 발생시키는 오존(O₃)과 차아염소산나트륨(NaClO)을 IgG 와 반응시켜 단백질의 산화를 유도하고, 산화 여부와 산화 정도를 immunoblot으로 확인하였다. 시판 중인 다수의 건강공여자들의 혈액으로부터 분리된 근육주사용 면역글로불린(감마글로불린, 녹십자, 한국) 혹은 정맥주사용 면역글로불린(10% 아이비글로불린SN주, 녹십자, 한국)을 각각 오존 가스 또는 액상의 차아염소산 나트륨과 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응시킨 후, 면역글로불린의 산화 여부를 확인하기 위해서 검출하기 위해서 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)가 산화된 단백질에 생성된 카보닐 그룹(carbonyl group)과 반응하여 화학적으로 dinitrophenylhydrazone (DNP)로 변화되는 성질을 이용하여 DNP에 대한 항체를 이용하여 산화된 단백질을 검출하는 실험을 Oxyblot^TM Protein Oxidation Detection Kit (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 SDS-PAGE와 immunoblot으로 실시하였다.

2-1. 실험 재료의 분석

시판 중인 다수의 건강공여자들의 혈액으로부터 분리된 근육주사용 면역글로불린 주사약제(감마글로불린, 녹십자, 한국)는 제조사의 약제 설명서에 사람 IgG 165 mg/mL 가 포함되어 있다고 기술되어 있으며, 상기 제제는 용액 상태로 주사용 유리 바이알에 담긴 형태로 공급되고 있다.

상기 약제에 포함된 면역글로불린 성분의 재확인을 위하여 근육주사용 사람 면역글로불린 주사약제(감마글로불린, 녹십자, 한국)를 10 mg/mL로 증류수로 희석한 후에 희석한 용액 내의 IgG, IgM, IgA 및 albumin의 농도를 Nephelometry 측정기기(Cobas 8000 series, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 정량한 결과 IgG 9.41 mg/mL이 포함된 것으로 측정되었으며, IgA, IgM과 albumin은 상기 기기를 이용한 측정방법의 측정 가능 최소 한계치보다 낮은 농도(IgA < 20 mg/dL, IgM < 13 mg/dL, albumin < 100 mg/dL)로 존재하여 검출되지 않았다. 또한 ImmunoCAP assay (Phadia US, Portage, MI, USA)시스템을 이용한 형광효소면역측정법으로 측정한 IgE의 농도는 2.54 kU/L로 측정되었다.

2-2. 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린을 이용한 단백질 산화 유도 검증

도 3은 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린을 오존과 차아염소산나트륨으로 산화시킨 후, 면역글로불린의 산화 여부를 항DNP항체를 이용한 immunoblot방법으로 확인한 결과이다. 상기 면역글로불린G 1 mg을 실온에서 5분간 하기 조건에 따라 산화시켰으며, 전기영동 시 각 lane 당 4 ㎍의 IgG를 첨가하였다. 각 lane의 조건은 lane 1은 분자량 마커, lane 2는 산화시키지 않은 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린G (hIgG), lane 3은 IgG 1 mg 당 0.25 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 4는 IgG 1 mg 당 0.5 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 5는 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 6은 IgG 1 mg 당 2 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 7은 IgG 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 8은 IgG 1 mg 당 8 ㎍의 오존을 처리한 hIgG, lane 9는 IgG 1 mg 당 275 ㎍의 액상의 차아염소산나트륨과 5분간 반응시켜 처리한 hIgG이다.

도 4는 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린과 정맥주사용 사람 면역글로불린을 오존으로 산화시킨 후, 상기 면역글로불린의 산화 여부를 항DNP항체를 이용한 Immunoblot방법으로 확인한 결과이다. 면역글로불린G 1 mg과 실온에서 5분간 하기 조건에 따라 오존과 혼합하여 산화시켰으며, 전기영동 시 각 lane 당 4 ㎍의 IgG를 첨가하였다. 각 lane의 조건은 lane 1은 분자량 마커, lane 2는 산화시키지 않은 상품화된 근육주사용 사람 면역글로불린G, lane 3은 산화시키지 않은 상품화된 정맥주사용 사람 면역글로불린G, lane 4는 IgG 1 mg 당 5 ㎍의 오존과 반응시켜 산화시킨 근육주사용 사람 면역글로불린G, lane 5는 IgG 1 mg 당 5 ㎍의 오존과 반응시켜 산화시킨 정맥주사용 사람 면역글로불린G이다.

도 3과 도 4를 참고하면, 실험결과 산소 자유 라디칼을 발생시킨다고 알려진 오존이나 차아염소산나트륨 모두에 의해서 면역글로불린의 유의한 산화가 유도될 수 있을 확인하였다. 또한, 처리한 산소 자유 라디칼의 양이 많아질수록 면역글로불린의 산화가 용량의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 시판되는 근육주사용 혹은 정맥주사용 면역글로불린 G제제는 산화되지 않은 면역글로불린을 원료로 사용하고 있으며, 오존 혹은 차아염소산나트륨과 혼합하여 반응시킬 경우 면역글로불린을 효과적으로 산화시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 3> 산화된 면역글로불린을 주성분으로 하는 약학적 조성물의 제조방법 2

면역글로불린의 산화에 따른 다량체 형성에 따른 응집과 침전 현상에 의한 단백질의 손실을 최소화할 수 있는 적절한 산화 조건을 찾고자 다양한 정도의 산화 조건들로 면역글로불린을 산화시킨 후에 산화된 면역글로불린이 포함된 용액을 원심분리하여 상층액에 포함된 단백질 농도를 정량하여 단백질의 손실량을 하기 <식 1>을 이용하여 계산함으로써 면역글로불린의 응집에 의한 손실량을 최소화하면서 적절하게 산화가 이루어지는 면역글로불린 산화조건을 찾고자 실험을 진행하였다. 시판중인 근육주사용 사람 IgG(감마글로불린, 녹십자, 한국)를 증류수를 이용하여 10 mg/ml로 희석한 후에 다양한 농도의 오존 가스와 혼합하여 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응 후, 13,000 g에서 15분간 원심분리하고 상층액에 존재하는 면역글로불린의 농도를 Bradford 측정법 시약(Biorad사, 미국)을 이용하여 측정하였다. 참고로 본 실시예들에서는 산화된 IgG는 주사기에서 액체상태의 IgG와 기체상태의 오존을 혼합하여 5분간 반응시킨 후 가스는 주사기로부터 제거한 후에 얻어진 액체상태의 산화된 IgG를 실험에 사용하였으며, 하나의 오존처리 조건당 각각 4 반복(quadruplicate)을 하여 실험을 진행하고 결과를 평균 ± 표준편차로 표기하여 하기 [표 3]에 나타내었다.

<식 1>

IgG 단백질의 손실비율(%) = (산화처리하지 않은 IgG 단백질 농도 - 산화처리한 후에 원심분리한 상층액에 존재하는 IgG 단백질 농도)/산화처치하지 않은 IgG 단백질 농도 x 100

사람 IgG 1 mg과 5분간 반응시킨 오존의 양	산화처리후 원심분리 상층액에 존재하는 IgG 농도(mg/mL)	산화처리로 인한 IgG 단백질 손실율(%)
0 ㎍	10.9 ± 0.1	-
0.5 ㎍	10.8 ± 0.03	0.9 ± 0.9
1 ㎍	10.4 ± 0.1	4.4 ± 1.4
2 ㎍	10.2 ± 0.1	5.9 ± 1.9
4 ㎍	10.1 ± 0.2	7.6 ± 2.1
8 ㎍	9.0 ± 0.2	18.2 ± 0.3
16 ㎍	7.9 ± 0.1	27.1 ± 1.1

Data are presented as mean± standard deviation from quadruplicate experiments

표 3은 시판 중인 다수의 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리하여 제조된 사람 IgG 근육주사액을 오존 가스와 혼합하여 산화시킨 IgG의 응집과 침전에 의한 IgG 단백질 손실율을 계산한 결과이다. 상기 표 3을 참고하면, 상기 실험결과와 같이 산화를 더 많이 유도할수록(즉, 반응시킨 산소라디칼의 양이 증가할수록) 용액 상태에 존재하는 면역글로불린이 더 많이 응집되어 침전됨을 확인하였다. 즉, 산화의 정도와 면역글로불린의 응집과 침전 현상 사이에 용량 의존적인 효과가 존재함을 확인할 수 있다.

따라서, 면역글로불린의 산화는 유도하되 면역글로불린의 응집에 의한 손실은 최소화 할 수 있는 조건으로 면역글로불린을 적절하게 산화시켜서 면역조절 치료를 위한 약학적 조성물로 만드는 것이 합리적임을 확인할 수 있었다. 상기 조건은 면역글로불린의 손실율이 10 % 미만이거나 사람 IgG 1 mg당 처리하는 오존의 양이 0.1 내지 4 ㎍인 것일 수 있다.

<실시예 4> 정상인에서 산화된 면역글로불린을 근육주사로 투여하였을 때에 면역조절 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 임상시험으로 확인

건강한 정상인에서도 산화된 면역글로불린이 산화처리되지 않은 무처치 면역글로불린 단백질과 비교해서 더 뛰어난 면역치료효과를 나타낼 수 있는지를 임상시험으로 확인하였다. 건강한 정상인 성인 1명에게 4주간 8회 산화되지 않은 액체상태의 시판중인 근육주사용 사람 IgG 제제(감마글로불린, 녹십자, 한국)를 50 mg씩 근육주사로 투여하고 4주간의 휴지기를 가졌다. 휴지기를 가진 후, 액체상태의 시판중인 근육주사용 사람 IgG 제제 50 mg을 근육주사 직전에 오존 400 ㎍과 주사기에서 혼합(즉, 사람 IgG 1mg 당 8 ㎍의 오존)하여 5분 동안 반응시킨 후에 주사기에서 오존 가스는 제거시킨 액상의 산화된 IgG를 근육주사하는 치료를 4주간 8회 시행하고 다시 4주간의 휴지기를 가졌다. 이러한 처치들에 대한 임상연구 디자인을 도 5에 나타내었다. 또한, 최초로 사람 IgG를 근육주사 직전 시점으로부터 16주 시점까지 4주 간격으로 정맥혈액을 채취한 후에 얻은 혈청을 영하 20℃에 냉동 보관 하였다가 다시 실온에서 해동하여 혈청 내 Interleukin-10 (IL-10)과 IFN-γ 농도를 시판 중인 효소면역법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 측정키트(BD PharMingen, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시점	혈청 내 Interleukin-10 농도 (pg/mL)	혈청 내 Interferon-gamma농도 (pg/mL)
0 주(베이스라인)	15.5	Undetectable (<4 pg/mL)
4 주	19.0	Undetectable (<4 pg/mL)
8 주	18.3	Undetectable (<4 pg/mL)
12 주	18.9	Undetectable (<4 pg/mL)
16 주	28.9	15.0

상기 표 4는 건강한 정상인 1명에서 사람 IgG와 산화된 사람 IgG 근육주사의 면역조절효과를 비교하기 위하여 혈청 내 IL-10과 IFN-γ 농도 측정으로 확인한 임상실험 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 건강한 정상인 1명에서 시판 중인 사람 IgG를 근육주사한 경우와 오존을 이용하여 산화처리된 사람 IgG를 근육주사한 경우의 면역조절 효과의 차이를 확인하기 위해서 시행한 임상시험 연구 디자인을 나타낸 것이다.

상기 표 4 및 도 5를 참고하면, 사람 IgG 50mg를 근육주사로 투여한 후 4주가 경과한 시점(8주시점)과 비교하여 산화시킨 사람 IgG 50 mg을 근육주사로 4주간 8회 실시한 후 4주가 경과한 시점(16주시점)에 혈청 내 IL-10 과 IFN-γ 농도가 현저하게 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 임상시험 결과를 통해 정상인에서도 산화처리된 면역글로불린이 산화처리되지 않은 면역글로불린에 비해 현저하게 높은 면역조절효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 상기 정상인에서 임상시험 기간 중에 임상시험과 관련된 부작용은 관찰되지 않았다.

<실시예 5> 사람의 말초혈액 단핵구세포에서 산화된 면역글로불린의 면역조절효과 검증

산화된 면역글로불린의 면역조절효과를 검증하기 위해서 신약후보물질의 면역조절 효능을 확인하기 위해서 통상적으로 사용하고 있는 말초혈액단핵구세포 배양 모델을 사용하였다. 정상인의 정맥혈액으로부터 density gradient를 이용한 원심분리법으로 분리한 말초혈액단핵구세포들(peripheral bloold mononuclear cells; PBMCs)을 배양한 후에 면역글로불린이 포함된 배양액으로 치환하여 반응시킨 후에 배양액을 채취하여 배양액에 존재하는 면역반응 주요 매개물질인 사이토카인(cytokine)들의 농도를 측정하여 산화시킨 면역글로불린과 산화처리하지 않은 면역글로불린의 면역조절 효과를 비교분석하였다.

건강한 정상인 성인 2명(혈액공여자 1, 혈액공여자 2)에서 Cell Preparation Tubes^TM(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 density gradient centrifugation에 의해 각각의 공여자의 정맥혈로부터 분리된 PBMCs를 10 % fetal calf serum, 2 mM glutamate, 50 ㎍/㎖의 penicillin strptomycin, 10 mM HEPES가 포함된 RPMI 배양액 1 ㎖에 PBMCs 5 ×10⁶ cells가 되도록 24 well tissue culture plate에 분주하여 24 시간동안 37 ℃에서 CO₂ incubator에 배양하였다. 배양 후, culture plate를 원심분리한 후에 기존의 배양액을 제거하고 well당 1 ㎖의 배양액만 처리한 경우(음성대조; Media only), 사람 IgG(human IgG; hIgG) 80 ㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우, hIgG 1 mg당 1 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우(O₃-hIgG), 사람혈청알부민(human serum albumin; HSA) 80 ㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우, HSA 1 mg당 1 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우(O₃-HSA), hIgG 1 mg당 275㎍ 차아염소산나트륨(NaClO)을 5분간 반응시킨 hIgG 80㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우, HSA 1 mg당 275 ㎍을 차아염소산나트륨과 5분간 반응시켜 산화시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 ㎖로 처리한 경우(NaClO-hIgG), 양성대조 실험으로 Lipopolysaccharide(LPS, Sigma-aldrich Co., USA) 10ng이 포함된 배양액 1 ㎖ 로 처리한 경우의 조건들로 24 시간동안 37 ℃에서 CO₂ incubator에 다시 배양한 후에 culture plate를 원심분리한 후에 배양액 상층액을 채취하였다. 상기 실험에서 한 가지 조건당 각각 4회 반복실험(quadruplicate)을 하여 실험을 진행하였다. 상기와 같은 실험으로 얻어진 상층액을 분주하여 냉동보관하였다가 실온에서 해동하여 상층액에 존재하는 IL-10과 IL-8 cytokine의 농도를 cytokine ELISA set (BD PharMingen, San Diego, CA, USA)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라서 측정하였다.

5-1. 말초혈액단핵구 배양 실험실 모델에서 산화된 면역글로불린에 의한 배양액 내의 IL-10 농도 증가 유도 효과 확인

Conditions	Stimulants contained in 1ml of culture media/well	Concentration of IL-10 (pg/mL) (mean±SEM)	*Significant increase compared to media only (p<0.05)	**p-value compared to condition 2
1	Media only	11.4 ± 0.6
2	hIgG 80 ㎍	11.2 ± 0.4	-
3	O3 treated (1 ㎍ O3 / 1mg hIgG) hIgG 80 ㎍	14.4 ± 0.3	*	0.001
4	HSA 80 ㎍	6.4 ± 0.2	-
5	O3 treated (1 ㎍ O3 / 1 mg HSA) HSA 80 ㎍	7.0 ± 0.6	-
6	NaClO treated (275 ㎍ NaClO / 1 mg hIgG) hIgG 80 ㎍	16.6 ± 0.5	*	<0.001
7	NaClO treated (275 ㎍ NaClO / 1 mg HSA) HSA 80 ㎍	5.3 ± 0.4	-
8	LPS 10 ng	108.8 ± 4.9	*	<0.001

Interleukin-10(IL-10); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Sodium hypochlorite (NaClO); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *Student t-test (independent sample test)로 비교시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함. **p-value는 hIgG가 처치된 군들만을 비교하였을 때, 산화처리하지 않은 hIgG군(condition 2) 측청치 결과와 Student t-test(independent sample test)로 비교 시의 p-value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 5는 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후 채취한 배양액내의 IL-10 농도를 비교한 것이고 이를 그래프로 도식화하여 도 5에 나타내었다.

표 5 및 도 6을 참고하면, 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 정맥혈액을 이용하여 실험한 결과, 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리한 면역세포들(말초혈액단핵구들; PBMCs)을 오존 또는 차아염소산나트륨으로 산화시킨 사람 IgG와 반응시킨 경우(oxidized hIgG)에 음성대조인 배양액만 처치한 경우 (media only) 또는 산화처리를 하지 않은 사람 IgG와 반응시킨 경우와 비교하여 배양상층액의 IL-10 농도가 유의하게 높음을 확인할 수 있다(p<0.05). 한편, 산화처리하지 않은 hIgG 또는 산화된 HSA를 처치한 조건은 음성대조인 배양액만 처치한 경우와 비교하여 배양 상층액의 IL-10 농도의 유의한 증가가 없었다.

또한 오존 또는 차아염소산나트륨으로 산화시킨 사람 IgG와 반응시킨 경우(oxidized hIgG)에 산화처리하지 않은 hIgG와 비교하여 배양상층액의 IL-10 농도가 유의하게 높음을 확인할 수 있다(p<0.001). 양성대조로 사용한 LPS를 처치한 경우 배양액 상층액에 다른 조건들과 비교해서 유의하게 높은 농도의 IL-10이 측정되어(p<0.05) 배양된 사람 말초혈액단핵구들(PBMCs)을 이용한 본 실험이 적절하게 이루어졌음을 확인할 수 있다.

Conditions	Stimulants contained in 1ml of culture media/well	Concentration of IL-10(pg/mL) (mean±SEM)	*Significant increase compared to media only (p<0.05)	**p-value compared to condition 2
1	Media only	7.7 ± 0.6
2	hIgG 80 ㎍	7.6 ± 0.7	-
3	O3 treated (1 ㎍ O3 / 1 mg hIgG) hIgG 80 ㎍	17.8 ± 0.5	*	<0.001
4	HSA 80 ㎍	4.9 ± 0.4	-
5	O3 treated (1 ㎍ O3 / 1 mg HSA) HSA 80 ㎍	3.7 ± 0.2	-
6	LPS 10 ng	455.4 ± 11.2	*	<0.001

Interleukin-10(IL-10); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Sodium hypochlorite (NaClO); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean(SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *Student t-test(independent sample test)로 비교시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함. **p-value는 hIgG가 처치된 군들만을 비교하였을 때, 산화처리하지 않은 hIgG군(condition 2) 측청치 결과와 Student t-test (independent sample test)로 비교 시의 p-value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 6은 또 다른 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 IgG 혹은 산화된 IgG를 반응시킨 후에 채취한 배양액내의 IL-10 농도를 비교한 것이고 이를 그래프로 도식화하여 도 7에 나타내었다.

표 6 및 도 7을 참고하면, 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액을 이용하여 실험한 결과 건강한 정상인으로부터 분리한 면역세포들(말초혈액단핵구들; PBMCs)을 오존으로 산화시킨 사람 IgG와 반응시킨 경우(oxidized hIgG)에 음성대조인 배양액만 처리한 경우(media only) 또는 산화처리를 하지 않은 사람 IgG와 반응시킨 경우와 비교하여 배양액 상층액의 IL-10의 농도가 유의하게 높았다(p<0.05). 한편, 산화처리하지 않은 사람 IgG를 반응시킨 경우 음성대조인 배양액만 처치한 경우와 비교하여 배양액 상층액의 IL-10 농도의 유의한 증가가 없었다.

또한 오존으로 산화시킨 사람 IgG와 반응시킨 경우(oxidized hIgG)에 산화처리하지 않은 hIgG와 비교하여 배양상층액의 IL-10 농도가 유의하게 높음을 확인할 수 있다(p<0.001). 양성대조로 사용한 LPS를 처치한 경우 배양액 상층액에 다른 조건들과 비교해서 유의하게 높은 농도의 IL-10이 측정되었음을 확인하여(p<0.05), 본 배양된 사람 말초혈액단핵구들(PBMCs)을 이용한 본 실험이 적절하게 이루어졌음을 확인할 수 있다.

5-2. 말초혈액단핵구 배양 실험실 모델에서 면역글로불린을 산화시키는 오존 용량의 변화에 따른 배양액내 IL-10 농도의 변화

건강한 정상인 1명(혈액공여자 2)의 정맥혈액으로부터 분리된 PBMCs를 상기와 동일한 방법으로 배양한 후에 Well 당 hIgG 1 mg당 1 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, hIgG 1 mg당 4 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, hIgG 1 mg 당 16 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 16 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우의 조건들로 24시간 동안 37 ℃에서 CO₂ incubator에 다시 배양한 후에 culture plate를 원심분리한 후에 배양액 상층액을 채취하였다. 상기 실험에서 하나의 조건당 각 4회 반복실험(quadruplicate)을 하여 실험을 진행하였다. 상기와 같은 실험으로 얻어진 상층액을 분주하여 영하 20 ℃에 냉동보관하였다가 실온에서 해동하여 상층액이 존재하는 IL-10 cytokine의 농도를 cytokine ELISA set (BD, USA)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라 측정하였다.

Amount of O3 reacted with 1mg of hIgG or HSA	Concentration of IL-10 (pg/mL) (mean±SEM)		P value*
	hIgG 80 ㎍ treatment (1mL/well)	HSA 80 ㎍ treatment (1mL/well)
1 ㎍	17.8 ± 0.5	3.7 ± 0.2	<0.001*
4 ㎍	4.5 ± 0.9	5.1 ± 1.3	0.754
16 ㎍	1.5 ± 0.4	1.1 ± 0.03	0.320

Interleukin-10(IL-10); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *Student t-test (independent sample test)로 비교 시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 7은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 다양한 조건으로 산화시킨 사람 IgG들을 반응시켜서 사람 IgG의 산화 정도의 변화에 따른 배양액내의 IL-10 농도의 차이를 비교한 것이며, 이를 그래프로 도식화하여 도 8에 나타내었다.

표 7 및 도 8을 참조하면, 상기 실험 결과 사람 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을처리한 hIgG 80 ㎍과 HSA 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 HSA 80 ㎍간에 배양액내의 IL-10 농도에 유의한 차이를 관찰할 수 있었다(*p<0.001, Inter-group differences were analyzed by the Student t-test).

또한 산화시킨 사람 IgG (hIgG)의 경우 사람 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 처리한 hIgG 80 ㎍의 경우는 hIgG 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 처리한 hIgG 80 ㎍의 경우나 hIgG 1 mg 당 16 ㎍의 오존을 처리한 hIgG 80 ㎍의 경우와 비교하였을 때 오존의 농도가 처리 농도가 높을수록 IL-10의 분비를 자극하는 면역조절효과가 감소됨을 확인할 수 있다(p<0.05, Student t-test로 사람 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 처리한 경우와 비교함).

이러한 결과는 본 발명이 실시예 3의 표 3에서 확인한 면역글로불린을 산화시키는 조건에서 배양된 사람 면역세포와 반응시키는 hIgG 1 mg과 반응시키는 오존의 양이 4 ㎍이상일 경우(즉, 지나치게 많은 산화)는 단백질의 면역조절 효과를 오히려 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

5-3. 말초혈액단핵구 배양 실험실 모델에서 산화된 면역글로불린에 의한 IL-8 분비 증가 유도 효과

Conditions	Stimulants contained in 1ml of culture media/well	Concentration of IL-8 (pg/ml) (mean±SEM)	*Significant increase compared to media only (p<0.05)	p-value compared to media only	**p-value compared to condition 2
1	Media only	107.6 ± 0.8
2	hIgG 80 ㎍	83.9 ± 2.0	-	<0.001
3	O3 treated ( 1 ㎍ O3 / 1 mg hIgG) hIgG 80 ㎍	132.5 ± 0.7	*	<0.001	<0.001
4	HSA 80 ㎍	94.3 ± 2.0	-	0.001
5	NaClO treated (275 ㎍ NaClO / 1 mg hIgG) hIgG 80 ㎍	252.7 ± 2.8	*	<0.001	<0.001
6	LPS 10 ng	253.9 ± 2.8	*	<0.001	<0.001

Interleukin-10 (IL-10); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Sodium hypochlorite (NaClO); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *Student t-test(independent sample test)로 비교시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함. **p-value는 hIgG가 처치된 군들만을 비교하였을 때, 산화처리하지 않은 hIgG군(condition 2) 측청치 결과와 Student t-test (independent sample test)로 비교 시의 p-value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 8은 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후 채취한 배양액내의 IL-8 농도를 비교한 것이고 이를 그래프로 도식화하여 도 9에 나타내었다.

표 8 및 도 9를 참고하면, 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액을 이용하여 실험한 결과 건강한 정상인(혈액공여자 1)의 말초혈액으로부터 분리한 면역세포들(말초혈액단핵구들; PBMCs)은 오존 혹은 차아염소산나트륨으로 산화시킨 사람 IgG와 반응시킨 경우(oxidized hIgG)의 조건들에서 음성대조인 배양액만 처치한 경우(media only) 또는 산화처리를 하지 않은 사람 IgG와 반응시킨 경우와 비교하여 배양액에 IL-8의 농도가 유의하게 증가됨을 확인할 수 있다(p<0.05). 한편, 산화처리하지 않은 hIgG와 HSA를 처치한 조건은 음성대조인 배양액만 처치한 경우와 비교하여 세포배양 상층액의 IL-8 농도가 유의한 증가가 없음을 확인할 수 있었다.

또한 양성대조로 사용한 LPS를 처치한 경우 세포배양액 상층액에는 다른 조건들과 비교해서 유의하게 높은 농도의 IL-8이 분비되었음을 확인하여(p<0.05), 본 배양된 사람 말초혈액단핵구들(PBMCs)을 이용한 본 실험이 적절하게 이루어졌음을 확인할 수 있다.

Conditions	Stimulants contained in 1ml of culture media/well	Concentration of IL-8 (mean±SEM) (pg/mL)	*Significant increase compared to media only (p<0.05)	**p-value compared to condition 2
1	Media only	556.6 ± 24.2
2	hIgG 80 ㎍	563.7 ± 20.4	-
3	O3 treated ( 1 ㎍ O3 / 1 mg hIgG) hIgG 80 ㎍	1079.7 ± 26.3	*	<0.001
4	HSA 80 ㎍	552.0 ± 19.6	-
5	O3 treated ( 1 ㎍ O3 / 1 mg HSA) HSA 80 ㎍	581.2 ± 8.5	-
6	LPS 10 ng	1528.3 ± 68.8	*	<0.001

Interleukin-8(IL-8); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *Student t-test (independent sample test)로 비교시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함. **p-value는 hIgG가 처치된 군들만을 비교하였을 때, 산화처리하지 않은 hIgG군(condition 2) 측청치 결과와 Student t-test (independent sample test)로 비교 시의 p-value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 9는 또 다른 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG를 반응시킨 후 채취한 배양액내의 IL-8 농도를 비교한 것이고 이를 그래프로 도식화하여 도 10에 나타내었다.

표 9 및 도 10을 참조하면, 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액을 이용하여 실험한 경과 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리한 면역세포들(말초혈액단핵구들; PBMCs)은 오존으로 산화시킨 사람 IgG (oxidized hIgG)와 반응시킨 경우 음성대조인 배양액(media only)만 처치한 경우 혹은 산화처리를 하지 않은 사람 IgG로 처치한 경우와 비교하여 배양액내의 IL-8의 농도가 유의하게 증가됨을 확인할 수 있다(p<0.05).

또한 양성대조로 사용한 LPS를 처치한 배양액에 다른 처치 조건들과 비교하여 유의하게 높은 농도의 IL-8이 분비되었음을 확인하여(p<0.05), 본 배양된 사람 말초혈액단핵구들(PBMCs)을 이용한 본 실험이 적절하게 이루어졌음을 확인할 수 있다.

5-4. 말초혈액단핵구 배양 실험실 모델에서 면역글로불린을 산화시키는 오존 용량의 변화에 따른 배양액내의 IL-8 분비 양의 변화

건강한 정상인(혈액공여자 2)의 정맥혈액으로부터 분리된 PBMCs를 상기와 동일한 방법으로 배양한 후에 Well 당 hIgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 5 분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, hIgG 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 5 분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, hIgG 1 mg 당 16 ㎍의 오존을 5분간 반응시킨 hIgG 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 5 분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 5 분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우, HSA 1 mg 당 16 ㎍의 오존을 5 분간 반응시킨 HSA 80 ㎍을 포함한 배양액 1 mL로 처리한 경우의 조건들로 24 시간 동안 37 ℃에서 CO₂ incubator에 다시 배양한 후에 culture plate를 원심분리한 후에 배양액 상층액을 채취하였다. 상기 실험에서 한가지 조건당 각각 4회 반복실험(quadruplicate)을 하여 실험을 진행하였다. 상기와 같은 실험으로 얻어진 상층액을 분주하여 영하 20 ℃에 냉동보관하였다가 실온에서 해동하여 상층액에 존재하는 IL-8 cytokine의 농도를 cytokine ELISA set (BD, USA)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라서 측정하였다.

Amount of O3 reacted with 1mg of hIgG or HSA	Concentration of IL-8(pg/mL) (mean±SEM)		P value*
	hIgG 80 ㎍ treatment (1 mL/well)	HSA 80 ㎍ treatment (1 mL/well)
1 ㎍	1079.9 ± 26.3	581.2 ± 8.5	<0.001
4 ㎍	975.3 ± 20.8	583.6 ± 12.4	<0.001
16 ㎍	943.8 ± 49.2	597.4 ± 10.3	<0.001

Interleukin-8 (IL-8); human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); Human serum albumin (HSA); Lipopolysaccharide (LPS); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *각기 다른 오존 용량으로 처치한 hIgG 처치군과 HSA 처치군 간에 배양액 상층액에 존재하는 IL-8 농도가 student t-test (independent sample test)로 비교 시의 p value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함.

상기 표 10은 건강한 정상인(혈액공여자 2)의 말초혈액으로부터 분리하여 배양된 사람 말초혈액단핵구 세포와 다양한 조건으로 산화시킨 사람 IgG들을 반응시켜서 사람 IgG의 산화 정도 변화에 따른 배양액내의 IL-8 농도를 비교한 것이고 이를 도식화하여 도 11에 나타내었다.

표 10 및 도 11을 참고하면, IgG 또는 HSA에 각각 다른 용량의 오존을 처리한 동일한 3가지 조건(IgG 1 mg 또는 HSA 1 mg 각각에 1 ㎍, 4 ㎍, 16 ㎍을 처치)을 비교한 결과, 각각 다른 3가지의 조건들 모두에서 산화된 IgG를 처치한 경우가 산화된 HSA를 처치한 경우와 비교하여 배양액내의 IL-8의 농도가 유의하게 높음을 확인할 수 있었다(*p<0.001, Inter-group differences were analyzed by the Student t-test).

또한 산화된 IgG의 경우 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존을 처리한 IgG 80 ㎍가 IgG 1 mg 당 4 ㎍의 오존을 처리한 IgG 80 ㎍와 비교해서 IL-8의 분비를 자극하는 면역조절효과가 유의하게 증가됨을 확인할 수 있다(p<0.05).

이러한 결과는 본 발명의 면역글로불린을 산화시키는 조건에서 hIgG 1 mg과 반응시키는 오존의 양이 4 ㎍이상일 경우 오존 양이 증가함에 따라 면역글로불린에 처치하는 오존의 양이 너무 많을 경우에, 면역조절 효과가 오히려 감소될 수 있음을 알 수 있다.

본 실시예 5를 통해, 산화된 면역글로불린이 유의한 면역조절효과를 나타냄을 알 수 있다. 구체적으로 산화된 면역글로불린은 사람의 말초혈액면역세포들로부터 산화되지 않은 면역글로불린이나 사람혈청알부민 또는 산화된 사람혈청알부민과 비교하여 유의하게 더 많은 양의 IL-10을 분비시키는 면역조절효과를 나타냄을 알 수 있다.

상기 IL-10은 이미 많은 수의 연구들에서 자가면역질환, 암(cancer), 만성염증질환, 자가면역질환을 포함하는 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 질환들의 호전시킬 수 있다고 알려진 면역조절효과, 항염증효과, 항알레르기효과와 항암효과를 나타냄이 확인된 중요한 면역조절 물질이다(Saralva M, et al. J Exp Med. 2020;217:e20190418, Akdis CA, et al. J Clin Invest 2014;124;4678-80). 특히 만성염증성장질환, 류마티스관절염, 건선 등을 포함한 만성염증질환들과 진행성 고형암을 앓고 있는 환자들에서 유전자 재조합 IL-10의 투여가 임상적으로 의미 있는 호전을 보였다는 임상시험 연구결과들이 발표되어 상기 질환들의 치료제로 개발되고 있는 상황이다. 한편 진행성 고형암 환자들에서 체내에서 단백질 의약품의 반감기를 늘려주는 기술인 페길화(PEGylation) 처리한 pegylated recombinant human IL-10을 피하주사로 매일 투여할 경우, 치료 전·후 채취한 혈청 검체에서 IFN-γ의 농도가 유의하게 증가되는 전신 면역항진효과, 암조직을 침윤하는 CD8+ T 세포 수의 유의한 증가와 더불어 무진행 생존기간 연장 효과가 나타남이 보고되었다(Naing A, et al. J Clin Oncol 2016, Naing A, et al. Cancer Cell 2018;34:775-79). 따라서 본 실시예 5는 산화된 사람면역글로불린이 만성염증질환, 악성종양, 알레르기질환을 앓고 있는 환자들을 호전시킬 수 있는 면역세포로부터의 IL-10의 분비를 증가시키는 면역조절치료효과, 항암면역치료효과, 항알레르기 면역조절효과를 보임을 입증할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예 5에서 확인한 산화된 면역글로불린의 면역세포로부터 IL-10의 분비를 증가시키는 면역조절효과를 통해서 본 발명의 실시예 1에서 진행성 고형암 환자들에서 임상시험을 통해서 확인한 산화된 면역글로불린 근육주사가 말초혈액 CD8+ T세포(cytotoxic T 세포)들 중 IFN-γ를 분비하는 세포의 분획비율이 증가되는 전신적인 면역조절효과를 유도하여 항암면역치료효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.

또한, 본 실시예 5에서 산화된 면역글로불린은 사람의 말초혈액면역세포들에서 산화되지 않은 면역글로불린이나 사람혈청알부민 혹은 산화된 사람혈청알부민과 비교하여 유의하게 높은 IL-8을 분비시키는 면역조절효과를 나타내었다. 상기 IL-8은 알레르기 질환의 발병기전에 중요한 역할을 하는 호염기구(basophil)로부터의 히스타민 유리를 억제하는 항알레르기 면역조절효과를 나타낸다고 보고된 바 있다(Kuna P et al. J Immunol 1991;147:1920-1924, Alam R, et al. Am J Respir Cell MolBiol 1992;7:427-433). 따라서 본 실시예 5를 통해 산화된 면역글로불린이 알레르기질환을 치료할 수 있는 항알레르기 면역조절 효과를 보임을 알 수 있다.

<실시예 6> 계란알부민 알레르기 마우스 모델에서 산화된 면역글로불린의 항알레르기 면역 조절 효과 확인

현재 해당 업계에서 알레르기 질환에 대한 신약개발시에 약물의 항알레르기 효과의 검증을 위해서 통상적으로 가장 많이 사용되고 있는 대표적인 동물모델인 계란알부민(ovalbumin; OVA) 알레르기 마우스 모델(Ayoub M, et al. Int lmmunopharmacol 2003;3:523-53)을 활용하여 본 발명의 산화된 면역글로불린의 항알레르기 면역조절 효과를 검증하였다.

OVA에 대한 알레르기 마우스 모델을 만들기 위해서 BALB/c 암컷 마우스에 OVA(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) 0.2 mg/mL을 aluminium hydroxide(Thermo scientific, Imject Alum, 77161) 20 mg/mL와 1:1 (v/v)로 혼합하여 복강 내 주사로 0 일, 7 일, 14 일의 총 3회에 걸쳐서 0.2 mL씩 투여하여 OVA에 대한 알레르기를 유발하였다. OVA에 대한 항체의 형성여부는 21일에 마우스를 희생(scarify)시키면서 심장으로부터 혈액을 채취하여 이를 원심분리하여 얻어진 혈청을 이용하여 효소면역법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 혈청 OVA-특히 IgG 항체를 측정하였다. 상기 알레르기 동물 모델에서 산화시킨 면역글로불린 단백질이 대조군으로 산화처리하지 않은 사람 면역글로불린과 비교하여 유의하게 차이나는 정도로 더 높은 항알레르기 면역조절 효과를 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로 동물 실험의 진행을 위해서 OVA-알레르기 마우스 모델을 이용하여 총 3 군으로 나누어 각각의 군당 6 마리씩 총 18 마리에서 0 일, 7 일, 14 일에 걸쳐서 3 회 아래와 같은 처치들을 시행하였다. 이 때, 제 1 군은 음성대조군으로 생리식염수(saline) 0.2 mL 피하주사를 투여하고, 제 2 군은 근육주사용 사람면역글로불린 10 mg(감마글로불린, 녹십자, 한국)(hIgG)을 피하주사로 투여하고, 제 3 군은 면역글로불린 1 mg 당 4 ㎍의 오존가스를 주사기에서 혼합하여 5분간 반응시킨 후 가스는 제거하고 액상의 산화처리된 산화시킨 사람 면역글로불린 10 mg을(O₃-hIgG) 피하주사로 투여하였다. OVA 알레르기 마우스 모델에서 산화된 사람 면역글로불린 피하주사와 산화처리하지 않은 사람 면역글로불린 피하주사의 면역조절효과를 비교하기 위해서 각 군의 마우스들에서 21 일에 채취한 혈액으로부터 원심분리하여 혈청을 채취한 후 분주하여 영하 20 ℃에 냉동보관 하였다. 실온에서 해동한 혈청 검체 내의 OVA와 특이적으로 반응하는 IgG의 역가를 효소면역법(Enzyme linked immune-sorbent assay: ELISA)으로 측정하였다. 96 well ELISA plate에 well당 0.25 ㎍의 OVA를 carbonate buffer에 희석하여 4 ℃에서 16시간동안 반응시킨 후에 3% BSA-0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS)로 상온에서 2 시간 동안 반응시켜서 비특이적인 반응을 차단시키고, 동일한 완충액으로 1:500(v:v)으로 희석한 마우스 혈청을 각 well 당 100 ㎕씩 quadruplicate로 분주하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 다시 alkaline phosphase가 부착된 anti-mouse IgG 항체를 2시간동안 반응시킨 후에, p-Nitrophenyl phosphate로 발색하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 반응 단계들 사이에 0.1 % Tween-20이 포함된 PBS (PBST)로 5회씩 세척하였다. 그리고 OVA-특이 IgG 항체의 역가는 405 nm에서 측정한 흡광도 수치로 나타내었다.

Groups	Treatments (subcutaneous injection)	Titer of OVA-specific IgG (Absorbance value) (mean±SEM)	*p-value compared to condition 1 (Saline treated OVA-sensitized mice)	**ANOVA p-value (statistical differences among 3 groups)
1	Saline	0.295 ± 0.025		0.001 (Tukey’s post hoc analysis 1군-3군: 0.013 2군-3군: 0.001)
2	hIgG 10 mg	0.252 ± 0.016	0.186
3	O3 treated (4 ㎍ O3 / 1 mg hIgG) hIgG 10 mg	0.395 ± 0.022	0.013

human immunoglobulin G (hIgG); ovalbumin (OVA); Ozone (O₃); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *p-value는 생리식염수를 피하주사한 음성대조군 마우스군의 OVA-특이 IgG항체 측정치 결과와 student t-test(independent sample test)로 비교 시의 p value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 간주함. **p-value는 one-way ANOVA test로 비교 시 p value가 0.05 미만인 경우는 3 군간에 OVA-특이 IgG 항체치의 평균값에 통계적으로 유의한 차이를 보임을 의미함.

상기 표 11은 Ovalbumin (OVA) 알레르기 마우스 모델에서 hIgG에 의한 OVA-특이 IgG 항체 유도효과(즉, 항알레르기효과)를 검증한 결과이고 이를 도식화하여 도 12에 나타내었다.

표 11 및 도 12를 참고하면, 상기 실험 결과 3 군 사이에서 OVA-특이 IgG 항체치의 평균치에 있어서 유의한 차이가 관찰되었다. OVA-특이 IgG 항체치의 평균치의 유의한 차이가 어느 군에서 발생되는지를 확인하기 위하여 Tukey 사후통계 분석을 시행한 결과, 산화시킨 hIgG 10mg을 투여한 마우스군에서 생리식염수를 투여한 음성대조인 생리식염수만 투여한 마우스군 혹은 산화시키지 않은 hIgG 10mg을 투여한 군들과 비교해서 OVA-특이 IgG 항체치의 평균치가 유의하게 증가함을 확인할 수 있다(One-way ANOVA test with Tukey’s post hoc test, p=0.013, p=0.001, respectively). 특히, 산화시키지 않은 hIgG 10 mg을 투여한 군은 생리식염수만 투여한 음성대조 마우스군과 통계적으로 유의한 차이가 발생되지 않았다(p=0.186, 표 11, 도 12). 따라서, 본 실시예 6을 통해, 산화되지 않은 IgG에 비하여 산화된 IgG를 투여 시 OVA-특이 IgG 항체역가를 증가시키는 항알레르기 면역조절효과가 발생됨을 알 수 있다.

알레르겐-특이 IgG 항체는 알레르겐-특이 IgE 항체가 알레르겐과 반응하는 것을 경쟁적으로 차단하는 항체(blocking antibody)의 역할을 한다고 알려져 왔다. 과거의 동물모델 연구와 최근에 이루어진 알레르기 환자들을 대상으로 한 임상시험 연구들에서 알레르겐-특이 IgG를 주사로 투여할 경우 알레르겐과 IgE 결합에 의한 알레르기 반응을 억제하는 유의한 항알레르기 효과와 알레르기 질환의 증상을 감소시키는 치료효과를 나타냄이 명확하게 입증되어 보고되어 있다(Flicker S, et al. Curr Top Microbiol Immunol 2011; Gevaert P, et al. J Allergy Clin Immunol 2022). 따라서, 본 실시예 6에서 보여주는 바와 같이 관찰된 산화된 hIgG의 알레르겐-특이 IgG 생산 유도효과는 산화 처치된 IgG가 의미있는 항알레르기 면역조절 효과를 유도하여 알레르기 질환 치료에 적용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 7>

제제예 7-1

산화된 면역글로불린 (혹은 IgG) 12㎎

면역보강제들(수산화 알루미늄 0.001-2㎎, 인산화칼슘 적량, 타이로신 1㎎, MPL 1㎎) 중 하나 이상의 면역보강제를 포함함

염화나트륨 4㎎

아미노초산 45㎎

D-만니톨 4㎎

수산화 나트륨 적량

주사용수 0.8-2㎖

(주사용수는 상기 다른 성분들과는 다른 별도의 바이알에 공급됨)

제제예 7-2

산화된 면역글로불린 (혹은 IgG) 12㎎

히스타민 2염산염 0.15㎍

염화나트륨 4㎎

아미노초산 45㎎

D-만니톨 4㎎

수산화 나트륨 적량

주사용수 0.8-2㎖

(주사용수는 상기 다른 성분들과는 다른 별도의 바이알에 공급됨)

상기한 제제예 7-1 혹은 7-2에서와 같이 산화된 면역글로불린의 면역조절효과를 강화시키기 위해서 당업계에서 통상적으로 실시되고 있는 바와 같이 면역보강제 혹은 히스타민을 추가로 혼합하여 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

<실시예 8> 산화된 IgG의 배양된 rat basophilic leukemia 세포주에서 IgE와 항원 결합에 의한 즉시형 알레르기반응에 대한 산화된 IgG의 억제 효과 확인

RBL-2H3 세포주(rat basophilic leukemia 세포주)는 신약후보물질의 항알레르기 효과를 확인하기 위해서 흔하게 사용되는 세포이다. 상기 RBL-2H3 세포주는 표면에 IgE항체의 수용체(FcεRI)를 갖고 있어 IgE와 항원으로 활성화될 경우 탈과립이 유도되어 알러지 반응의 매개물질을 분비하는 것으로 알려져 있는 세포이며, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)는 탈과립의 지표 물질로 알려져 있다(Planta Med. 1998;64:577-578).

산화된 IgG가 호염기구세포(basophil)로부터 IgE와 항원 결합에 의한 즉시형 알레르기반응을 억제할 수 있는지 여부를 확인하고자, RBL-2H3 세포주에서 IgE 감작 후 항원 자극에 의해서 β-hexosaminidase의 유리를 아래의 실험방법으로 측정하였다.

RBL-2H3 세포를 Dulbecco’s modified eagle medium에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 well당 0.5 mL를 추가하여 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. RBL-2H3 세포를 2 × 10⁵ cells/well로 48-well cell culture plate에 분주하여 24시간 배양한 후 well 당 20 ng/mL dinitropheny (DNP) 에 대한 특이 IgE 항체(DNP-sIgE; Sigma, St. Louis, MO, USA)가 포함된 배지 0.5 mL로 교환하여 16시간 동안 세포를 배양하여 DNP-sIgE를 감작시켰다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.2p; 이하 S 버퍼로 약칭함)로 2회 세척 후, 억제물질인 사람 IgG 2mg (hIgG; 액체상태의 시판중인 근육주사용 사람 IgG 제제, 감마글로불린, 녹십자, 한국) 혹은 산화된 사람 IgG 2mg (O₃-treated IgG 2mg; 액체상태의 시판중인 근육주사용 사람 IgG 1 mg 당 1 ㎍의 오존가스를 주사기에서 혼합하여 5분간 반응시킨 후 가스는 제거하여 산화처리 시킨 액상상태의 산화된 사람 IgG)이 포함된 S 버퍼 20 ㎕를 처치하였으며, 음성대조와 양성대조 실험조건에서는 S 버퍼 20 ㎕만을 처치한 후 상기 4가지 조건 모두 다 50분간 37℃에서 반응시켰다. 이후 음성대조 실험조건에는 S 버퍼를 180㎕ 추가하고 나머지 3 실험조건들에 대해서는 well 당 20 ng의 dinitrophenyl-human serum albumin (DNP-HSA, Sigma, St. Louis, MO, USA)이 포함된 S 버퍼를 180㎕ 추가하여(결과적으로 각 well당 최종적으로 200㎕의 버퍼가 포함됨) 40분 동안 자극 시킨 후 48-well cell culture plate를 10분간 얼음위에 두어 냉각시켜 반응을 중지하였다. 상기한 4 가지 처치 조건들은 한조건당 모두 4 반복실험(quadruplicated)을 실시하여 결과를 측정하였다.

상기에서 항원자극이 끝난 각각의 well들에서 상층액에 유리된 β-hexosaminidase의 양을 측정하기 위해서 상층액 50 μL를 96-well plate에 옮기고 50 μL의 substrate buffer (4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, 3.3 mM, sodium citrate, 0.1 M, pH 4.5)를 넣어 37℃에서 70분 동안 반응시킨 후 stop solution (0.1 M Na₂CO₃, pH 10) 100 μL를 첨가하여 반응을 중지하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포 펠렛(cell pellet)에 남아있는 β-hexosaminidase의 양을 측정하기 위해서 상기 항원자극이 끝난 각각의 well들에서 상층액을 모두 제거한 후에 세포 펠렛에 1% Triton X -100 buffer로 각 well당 200㎕를 처리한 후에 이를 피펫을 이용하여 혼합하여 얻은 세포 용해액 50 μL를 96-well plate에 옮기고 50 μL의 substrate buffer (4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, 3.3 mM, sodium citrate, 0.1 M, pH 4.5)를 넣어 37℃에서 70분 동안 반응시킨 후 stop solution (0.1 M Na₂CO₃, pH 10) 100 μL를 첨가하여 반응을 중지하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

RBL-2H3 세포로부터의 β-hexosaminidase release (%)의 정도는 기존에 발표된 논문들에서 통상적으로 사용되는 바와 같이 아래의 <식2>에 따라 산출하였다(Uermsi C, et al. Allergy. 2014;69:338-347).

<식 2>

β-hexosaminidase % release = [상층액의 흡광도 / (상층액의 흡광도 + 세포(cell pellet)의 흡광도)] × 100

본 실시예에서 DNP-특이 IgE 감작 후, DNP-HSA 항원으로 자극된 RBL-2H3 세포에서 비만세포의 탈과립 지표인 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분비에 사람 IgG 혹은 산화된 사람 IgG의 효과를 검증하고자, 상기한 계산식을 통해서 산출한 β-hexosaminidase의 유리율(% release)을 비교 분석하였다.

Conditions	Stimulants contained	β-hexosaminidase release (%) (mean±SEM)	*ANOVA p-value (statistical differences among 4 conditions)
1	Negative control (DNP-sIgE +, DNP-HSA-)	26.44 ± 0.84	< 0.001 (Tukey’s post hoc analysis showed a significant difference between condition 3 and condition 4: p <0.001 )
2	Positive control (DNP-sIgE +, DNP-HSA +)	46.48 ± 0.72
3	hIgG 2 mg (DNP-sIgE +, DNP-HSA +)	47.81 ± 1.34
4	O3 treated hIgG 2 mg (DNP-sIgE +, DNP-HSA +)	37.81 ± 0.39

human immunoglobulin G (hIgG); Ozone (O₃); dinitropheny-specific IgE (DNP-sIgE); dinitrophenyl-human serum albumin (DNP-HSA); standard error of the mean (SEM); Data are presented as mean±SEM from quadruplicate experiment. *p-value는 one-way ANOVA test로 비교 시 p value가 0.05 미만인 경우는 4 군간에 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 유리율(% release)의 평균값에 통계적으로 유의한 차이를 보임을 의미함.

상기 표 12은 사람 IgG와 산화된 사람 IgG를 rat basophilic leukemia 세포에서 처리하였을 때에 IgE-항원매개 자극에 의한 β-hexosaminidase 유리율(% release)의 차이를 비교분석한 결과이고 이를 도식화하여 도 13에 나타내었다.

상기 표 12와 도 13을 참고하면, 상기한 4 가지 실험조건(condition)들에서 β-hexosaminidase의 유리율(% release)의 평균치들의 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001). Tukey 사후통계 분석을 시행한 결과 산화된 사람 IgG를 처치한 경우 사람 IgG를 처치한 경우와 비교해서 β-hexosaminidase의 유리율의 평균치가 유의하게 낮음을 확인할 수 있었다(One-way ANOVA test with Tukey‘s post hoc test, p < 0.001). 즉, 산화된 사람 IgG가 호염기구세포로부터의 IgE-항원 결합에 의한 탈과립 현상을 효과적으로 억제시켰음을 확인할 수 있었다. 본 실시례의 실험결과는 산화된 IgG가 산화되지 않은 사람 IgG보다 더 효과적으로 IgE-매개 즉시형 알레르기 반응(IgE- mediated immediate type allergic reaction)을 억제하는 항알레르기효과를 보임을 확인할 수 있었다. 또한 상기한 실험 결과는 본 발명의 산화된 면역글로불린은 알레르기질환을 예방하거나 치료하는데 유용한 항알레르기효과를 지닌 물질임을 입증한다.

본 발명의 산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 포유동물에게 투여할 경우, 기존의 면역글로불린 제제들과 비교해서 면역조절 기능 이상 관련 질환들을 더욱 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며, 면역조절 기능 이상 관련 질환들에 대한 새로운 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

1. 오존(ozone, O₃)가스와 IgG를 혼합하여 반응시켜 생산된 산화된 IgG를 유효성분으로 포함하며, 알레르기질환, 자가면역질환 및 악성종양질환으로 이루어진 군에서 선택된 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 산화된 IgG는 IgG 1 mg에 대하여 오존을 0.1 내지 4 ㎍ 을 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG는 포유동물의 혈액으로부터 분리된 면역글로불린G인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 IgG는 포유동물 자신의 혈액으로부터 분리된 IgG이거나, 타포유동물의 혈액으로부터 분리된 IgG인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서, 상기 알레르기질환은 기관지 천식, 알레르기성비염, 알르레기성결막염, 아토피피부염, 두드러기, 음식물 알레르기, 아나필락시스 및 약물알레르기로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 자가면역질환은 강직성 척추염, 만성 농포성 피부염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천포창, 자가면역 갑상선염, 자가면역 간염, 자가면역성 신장염, 쇼그렌 증후군, 공피증 및 건선으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 악성종양질환은 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 갑상선암, 유방암, 간암, 신장암, 전립선암 및 중피종으로 이루어진 군에서 선택된 고형암이거나, 백혈병, 임파종 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 혈액암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 산화된 IgG는 세포독성 T세포의 활성화를 통한 면역조절에 의한 항암면역치료 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 오존(ozone, O₃)가스와 IgG를 혼합하여 반응시켜 생산된 산화된 IgG를 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물.
14. 삭제
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22. 포유동물 자신의 혈액으로부터 IgG를 분리하거나, 타포유동물의 혈액으로부터 IgG를 분리하는 단계(제1단계);
    상기 분리된 IgG를 산화제인 오존(ozone, O₃)가스와 혼합하여 반응시켜 산화된 IgG를 제조하는 단계(제2단계)를 포함하는, 알레르기질환, 자가면역질환 및 악성종양질환으로 이루어진 군에서 선택된 면역조절 기능 이상(immune dysregulation) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
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24. 청구항 22에 있어서, 상기 제2단계는 분리된 IgG 1 mg에 대하여 오존을 0.1 내지 4 ㎍ 을 혼합하여 반응시킨 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법.
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26. 청구항 22에 있어서, 상기 알레르기질환은 기관지 천식, 알레르기성비염, 알르레기성결막염, 아토피피부염, 두드러기, 음식물 알레르기, 아나필락시스 및 약물알레르기로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법.
27. 청구항 22에 있어서, 상기 자가면역질환은 강직성 척추염, 만성 농포성 피부염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천포창, 자가면역 갑상선염, 자가면역 간염, 자가면역성 신장염, 쇼그렌 증후군, 공피증 및 건선으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법.
28. 청구항 22에 있어서, 상기 악성종양질환은 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 갑상선암, 유방암, 간암, 신장암, 전립선암 및 중피종으로 이루어진 군에서 선택된 고형암이거나, 백혈병, 임파종 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 혈액암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조 방법.