ES2301491T3

ES2301491T3 - Anticuerpo humano de trasplante con region de determinacion de la complementariedad contra gangliosido gd3 y derivados del anticuerpo contra gangliosido gd3.

Info

Publication number: ES2301491T3
Application number: ES00962981T
Authority: ES
Inventors: Nobuo Tokyo Research Laboratories Hanai; Kenya Tokyo Research Laboratories Shitara; Kazuyasu Tokyo Research Laboratories Nakamura; Rinpei Tokyo Research Laboratories Niwa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: AU7449100A; EP1238985A1; DE60038252D1; JP4689124B2; AU784187B2; EP1238985B1; EP1238985A4; DE60038252T2; ATE388167T1; WO2001023432A1; US7253263B1; CA2386197A1

Abstract

Anticuerpo injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo, que reacciona específicamente con el gangliósido GD3, en el que: la región V de la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 9; y la región V de la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 54, y en el que: el fragmento de anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por Fab, Fab'', F(ab'')2, scFv y dsFv.

Description

Anticuerpo humano de trasplante con región de determinación de la complementariedad contra gangliósido GD3 y derivados del anticuerpo contra gangliósido GD3.

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Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo injertado con CDR humano y al fragmento de anticuerpo que reaccionan específicamente con el gangliósido GD3. Asimismo, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo o fragmento del anticuerpo. La presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de ADN y una célula transformada con el vector. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir el anticuerpo y el fragmento de anticuerpo utilizando la célula transformada, y a un agente de diagnóstico y a un agente terapéutico para cánceres que utilizan el anticuerpo y el fragmento de anticuerpo.

Antecedentes de la invención

Es conocido que, cuando un anticuerpo derivado de un animal no humano, por ejemplo un anticuerpo de ratón, se administra en un ser humano, resulta reconocido como una sustancia extraña y de esta manera induce un anticuerpo humano contra el anticuerpo de ratón en el cuerpo humano (un anticuerpo humano antirratón, en adelante denominado "HAMA"). Es conocido que HAMA reacciona con el anticuerpo de ratón administrado causando efectos secundarios (J. Clin. Oncol. 2:881, 1984; Blood 65:1349, 1985; J. Natl. Cancer Inst. 80:932, 1988; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:1242, 1985), acelerando la eliminación de la sangre del anticuerpo de ratón administrado (J. Nucl. Med. 26:1011, 1985; Blood 65:1349, 1985; J. Natl. Cancer Inst. 80:937, 1988) y reduciendo los efectos terapéuticos del anticuerpo de ratón (J. Immunol. 135:1530, 1985; Cancer Res. 46:6489, 1986).

Con el fin de resolver dichos problemas, se han realizado intentos para convertir mediante ingeniería genética un anticuerpo derivado de un animal no humano en un anticuerpo humanizado, tal como un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado con una región determinante de complementariedad humano (en adelante denominada "CDR"). El anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo en el que la "región variable" del anticuerpo (en adelante denominada "región V") procede de un anticuerpo animal no humano, y su región constante (en adelante denominada "región C") procede de un anticuerpo humano (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1984). El anticuerpo injertado con CDR humano es un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos de la CDR en la región V derivada de un anticuerpo animal no humano se injerta en una posición apropiada de un anticuerpo humano (Nature 321:522, 1986). Estos anticuerpos humanizados presentan diversas ventajas en su aplicación clínica en el ser humano, en comparación con anticuerpos de animales no humanos, tales como anticuerpos de ratón y similares. Por ejemplo, se ha informado respecto a la inmunogenicidad y estabilidad en sangre que, cuando se administra un anticuerpo quimérico humano a un ser humano, su vida media en sangre se incrementa aproximadamente seis veces comparado con un anticuerpo de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:4220, 1989). Se ha informado de que, en un ensayo de un anticuerpo injertado con CDR humano en monos, su inmunogenicidad se reducía y su vida media en sangre se incrementaba cuatro a cinco veces comparado con un anticuerpo de ratón (J. Immunol. 147:1352, 1991). Es decir, se espera que los anticuerpos humanizados presenten menos efectos secundarios y que sus efectos terapéuticos se prolonguen durante un periodo de tiempo más largo que los anticuerpos de animales no humanos. Además, al considerar aplicaciones particularmente como anticuerpos antitumorales, las actividades citotóxicas más elevadas, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (en adelante denominada "CDC"), la actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (en adelante denominada "ADCC") y similares mediante una región Fc de anticuerpo (región interior y posterior a la región bisagra de una cadena pesada de anticuerpo) resultan importantes a los efectos terapéuticos. Se ha informado con respecto a dichas actividades citotóxicas, que la región Fc de los anticuerpos humanos es superior en el ser humano a la región Fc de los anticuerpos de animales no humanos debido a que la región Fc activada más efectivamente los componentes del complemento humano y las células efectoras humanas que presentan receptores Fc de células mononucleares, macrófagos y células NK sobre la superficie celular. Por ejemplo, se ha informado de que, cuando se convierte un anticuerpo de ratón contra GD3 (en adelante denominado "anticuerpo de ratón anti-GD3") en un anticuerpo quimérico humano que presenta una región Fc de anticuerpo humano (en adelante denominado "anticuerpo quimérico anti-GD3"), se incrementa la actividad inhibidora del crecimiento de células tumorales del mismo por parte de células efectoras humanas (J. Immunol. 144:1382, 1990), y se ha informado de resultados similares en un anticuerpo injertado con CDR humano contra el antígeno CAMPATH-1 (Nature 332:323, 1988).

Dichos resultados demuestran claramente que los anticuerpos humanizados resultan preferidos en comparación con los anticuerpos no humanos, tales como los anticuerpos de ratón y similares, como anticuerpos para aplicaciones clínicas en el ser humano.

Además, con los recientes avances en la ingeniería de proteínas y genética, resulta posible producir fragmentos de anticuerpo que presentan un peso molecular inferior, tales como Fab, Fab', F(ab')_{2}, anticuerpo de una cadena (Science 242:423, 1988), un fragmento de región V estabilizada por disulfuro (Molecular Immunol. 32:249, 1995) y similares. Debido a que estos fragmentos presentan un peso molecular más reducido que las moléculas completas de anticuerpo, presentan una excelente capacidad de penetración en los tejidos diana (Cancer Res. 52:3402, 1992).

Se considera que estos fragmentos derivados de anticuerpos humanizados resultan más deseables que los derivados de anticuerpos animales no humanos, tales como anticuerpos de ratón, cuando se utilizan en aplicaciones clínicas en el ser humano.

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El gangliósido, que es uno de los glucolípidos que contiene ácido siálico, es una molécula que constituye la membrana de la célula animal y consta de una cadena de azúcar de cadena lateral hidrofílica y una esfingosina y un ácido graso como cadenas laterales hidrofóbicas. Es conocido que los tipos y niveles de expresión de gangliósido varían dependiendo del tipo celular, especie del órgano, especie animal y similares. También es conocido que la expresión del gangliósido varía cuantitativa y cualitativamente durante el proceso de transformación maligna de las células (Cancer Res. 45:2405, 1985). En particular, el GD3 de la presente invención se encuentra presente en una cantidad extremadamente reducida en células normales pero en una gran cantidad en células de cáncer, tales como melanoma, sarcoma, glioma, neuroblastoma y similares (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6114, 1980; J. Exp. Med. 155:1133, 1982; Cancer Res. 15:4401, 1985) y un anticuerpo contra GD3 (en adelante denominado "anticuerpo anti-GD3") se considera útil para el tratamiento de estos cánceres (Melanoma Research 7:S115, 1997). Ya se han llevado a cabo ensayos sobre su administración a pacientes de melanoma utilizando R24 como anticuerpo anti-GD3 de ratón, y se ha observado su efecto clínico en una parte de los pacientes, aunque no en el grado esperado debido a la desaparición considerablemente rápida del anticuerpo de la sangre debido a la inducción de HAMA (Melanoma Research 1:S115, 1997). Bajo estas circunstancias, con el fin de conseguir aplicaciones clínicas más efectivas de un anticuerpo anti-GD3 en el ser humano, los presentes inventores han intentado producir un anticuerpo quimérico anti-GD3 que presente actividad similar a la de un anticuerpo de ratón basándose en un anticuerpo KM641 anti-GD3 de ratón producido por los inventores, y han tenido éxito en la producción de un anticuerpo KM871 quimérico anti-GD3 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 304989/93). Se espera que, en comparación con el anticuerpo anti-GD3 de ratón, el anticuerpo quimérico anti-GD3 KM871 reducirá la inmunogenicidad en el ser humano, prolongará la vida media en sangre y presentará un efecto antitumoral más fuerte. Sin embargo, se ha descubierto, como resultado de los ensayos clínicos con otros anticuerpos quiméricos anti-GD3 en el ser humano, que se inducen reacciones alérgicas debido a la inducción de un anticuerpo humano contra una región V derivada de un anticuerpo de ratón en los anticuerpos quiméricos anti-GD3 (Cancer J. from Scientific American 3:S121, 1997). Incluso en el anticuerpo quimérico anti-GD3 KM871 preparado por los inventores, resulta necesario esperar a los resultados de los ensayos clínicos en seres humanos para conocer si se inducen reacciones similares o no, y con el fin de reducir la posibilidad de generar este problema lo máximo posible, resulta deseable producir un anticuerpo injertado con CDR humano contra GD3 (en adelante denominado "anticuerpo injertado con CDR anti-GD3") que se considere que presente una inmunogenicidad más reducida que la presentada por anticuerpos quiméricos anti-GD3 en el ser humano. Sin embargo, hasta el momento, no existen informes de la producción de un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR.

Con respecto a los fragmentos de anticuerpo, se ha producido un anticuerpo de una cadena derivado de un anticuerpo anti-GD2 de ratón (Hybridoma 16:335, 1997), aunque no existen informes de la producción de otros fragmentos de anticuerpo. Con respecto a los fragmentos de anticuerpo derivados de un anticuerpo anti-GD3, no existen informes de la producción de fragmentos de anticuerpo derivados de un anticuerpo de ratón y un anticuerpo humanizado. De esta manera, si resulta posible producir un fragmento de anticuerpo derivado de un anticuerpo humanizado contra GD3 (en adelante denominado "anticuerpo humanizado anti-GD3"), se espera que presente excelente penetrabilidad en el tejido diana y que la inmunogenicidad sea reducida.

Tal como se ha indicado anteriormente, se espera que un anticuerpo humanizado y el fragmento de anticuerpo presenten un efecto sobre los procedimientos diagnósticos y terapéuticos en una única utilización, aunque se ha investigado la mejora adicional de los efectos mediante la utilización de los mismos en combinación con otras moléculas. Por ejemplo, se utiliza una citoquina como una de dichas moléculas. "Citoquina" es un término general para diversos factores acuosos que controlan las reacciones intercelulares recíprocas en las interacciones inmunológicas. Debido a que las actividades citotóxicas de los anticuerpos, tales como la actividad de CDC, la actividad de ADCC y similares son conocidas y la actividad de ADCC resulta afectada por células efectoras que presentan receptores Fc sobre la superficie celular, tales como células mononucleares, macrófagos, células NK y similares (J. Immunol. 138:1992, 1987). Debido a que diversos tipos de citoquina activan estas células efectoras, se ha llevado a cabo la administración de la misma en combinación con anticuerpos con el fin de mejorar la actividad de ADCC y similar de los anticuerpos. Por ejemplo, con respecto a un anticuerpo anti-GD2 de ratón 14.G2a y un anticuerpo quimérico anti-GD2 ch14.18, se ha llevado a cabo la administración de los mismos en un ser humano en combinación con una citoquina humana interleuquina-2 (en adelante denominada "hIL-2") o un factor estimulador humano de colonias de granulocitos-macrófagos (en adelante denominado "hGM-CSF") (Cancer 80:317, 1997; Cancer J. from Scientific American 3:S121, 1997). Con respecto al anticuerpo anti-GD3 de ratón R24, también se ha llevado a cabo la terapia de combinación con diversos tipos de citoquina (Cancer Res. 50:7490, 1990; Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1186:345, 1992; J. Biol. Response Mod. 9:319, 1990; Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1182:344, 1992; Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1188:346, 1992). Sin embargo, en estas terapias de combinación no se observan los efectos esperados debido a la inmunogenicidad de los anticuerpos de ratón o a los efectos secundarios derivados de la citoquina. De esta manera, se han producido derivados mediante la conjugación de un anticuerpo o de un fragmento del mismo con un isótopo radioactivo, una proteína (citoquina, toxina, enzima o similar), un agente de bajo peso molecular y similar, mediante ingeniería química o genética, y se han examinado las aplicaciones clínicas de los mismos (New Eng. J. Med. 329:459, 1993; Anticancer Res. 17:1735, 1997; Blood 78:1173, 1991; J. Clin. Oncol. 15:723, 1997; Bioconjugate Chem. 1:606, 1997; Cancer 61:881, 1988; Jpn. J. Cancer Res. 85:167, 1994; Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 3:60, 1990; Surgery 106:533, 1989). Se espera que dichos derivados puedan acumular un isótopo radioactivo, una proteína (citoquina, toxina, enzima o similar) o un agente de bajo peso molecular o similar, en la periferia de un tejido diana según la especificidad de unión de los anticuerpos, de manera que puedan obtenerse diagnósticos y tratamientos más efectivos que presenten menos efectos secundarios. Por ejemplo, con respecto a hIL-2, que manifestó un cierto grado de efecto antitumoral de entre las citoquinas utilizadas en la terapia de combinación anteriormente indicada, se produjo mediante ingeniería genética la proteína de fusión de la misma con un anticuerpo quimérico anti-GD2 ch14.18, y se ha informado de que los efectos antitumorales del mismo en ensayos con ratones eran superiores a los resultantes de la administración simultánea de anticuerpo quimérico anti-GD2 ch14.18 y hIL-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:1428, 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9626, 1994; Cancer Immunol. Immunother. 42:88, 1996; Blood 91:1706, 1998). Sin embargo, con respecto a un anticuerpo anti-GD3, no existen informes de la producción de derivados mediante conjugación del mismo con una proteína (citoquina, toxina, enzima o similar), un isótopo radioactivo, un agente de bajo peso molecular o similar. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, también en el caso del anticuerpo humanizado anti-GD3 y el fragmento de anticuerpo de la presente invención, si pueden producirse derivados conjugados con un isótopo radioactivo, una proteína (toxina, enzima o similar), un agente de bajo peso molecular y similar, incluyendo proteínas de fusión con diversos tipos de citoquina, pueden esperarse una reducción de la inmunogenicidad, menos efectos secundarios y efectos antitumorales más potentes cuando se administren en el cuerpo humano.

Exposición de la invención

En la presente invención, se ha identificado una secuencia de aminoácidos de cada CDR a partir de las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 (solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 304989/93), los ADNc codificantes de las regiones V de cadena H y de cadena L que comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR de KM641 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco (en adelante denominadas "FR") de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpo humano, se clonaron en un vector de expresión de células animales que presentaba ADNc codificante de las regiones C de las cadenas H y L de anticuerpo humano, y después el vector de expresión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR construido de esta manera se introdujo en una célula animal con el fin de producir un transformante KM8871 (FERM BP-6790) que produce un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 en el sobrenadante de cultivo. A continuación, se purificó el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 a partir de un sobrenadante de cultivo del transformante KM8871, encontrando que el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 muestran una actividad de unión a antígeno, una especificidad de unión de antígeno y una potente actividad citotóxica contra las líneas celulares de cáncer humano, que resultan similares a las del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871.

Además, se construyó un ADNc mediante la unión de otro ADNc codificante de hIL-2 al extremo 3'-terminal del ADNc codificante de la cadena H de un anticuerpo anti-GD3, particularmente el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871, y después se clonaron el ADNc y un ADNc codificante de la cadena L de KM8871 en un vector de expresión de célula animal con el fin de construir un vector de expresión de una proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 con hIL-2 (en adelante denominado "KM8871-hIL-2"). Se produjo un transformante KM8871hIL2 (FERM BP-6791) que produce KM8871-hIL-2 en sobrenadante de cultivo mediante la introducción del vector de expresión KM8871-hIL-2 en una célula animal. Además, se purificó KM8871-hIL-2 a partir de un sobrenadante de cultivo del transformante KM8871hIL2, encontrando que KM8871-hIL-2 mostraba actividad de unión de antígeno y especificidad de unión a antígeno que resultaban similares a las del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871, y una actividad de soporte del crecimiento contra las líneas celulares que muestra un crecimiento dependiente de hIL-2 similar a la de hIL-2. A partir de lo expuesto anteriormente, se consiguió la presente invención mediante el descubrimiento de que una actividad de KM8871-hIL-2 en términos de la actividad citotóxica medida utilizando una fracción de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas resulta mejorada comparada con la del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871.

La presente invención se refiere a los puntos (1) a (12) siguientes:

(1) Anticuerpo humano injertado con CDR o fragmento del mismo, que reacciona específicamente con el gangliósido GD3, en el que:

la región V de la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 9, y

la región V de la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 54, y en la que:

el fragmento de anticuerpo se selecciona de entre el grupo constituido por Fab, Fab', F(ab')_{2}, scFv y dsFv.

(2) El anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo según el punto (1), en el que el anticuerpo injertado con CDR humano comprende además:

una región C de cadena H y una región C de cadena L de un anticuerpo humano.

(3) El anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo según el punto (1) ó (2), en el que el anticuerpo injertado con CDR humano es producido por un transformante KM8871 (FERM BP-6790).

(4) Un ADN que codifica el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo que reacciona específicamente con el gangliósido CD3 según cualquiera de los puntos (1) a (3).

(5) Un vector recombinante que comprende el ADN según el punto (4).

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(6) Un transformante que se obtiene mediante la introducción del vector recombinante según el punto (5) en una célula huésped.

(7) Un transformante KM8871 (FERM BP-6790) que produce el anticuerpo injertado con CDR humano según el punto (3).

(8) Un procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende:

cultivar el transformante según el punto (6) o (7) en un medio de cultivo para producir y acumular el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo según cualquiera de los puntos (1) a (3) en el cultivo, y

recuperar el anticuerpo o el fragmento del mismo a partir del cultivo.

(9) Un medicamento que comprende el anticuerpo injertado con CDR humano y el fragmento del mismo, según cualquiera de los puntos (1) a (3).

(10) Utilización del anticuerpo injertado con CDR humano y el fragmento del mismo, según cualquiera de los puntos (1) a (3) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

(11) Un agente de diagnóstico que comprende, como un ingrediente activo, el anticuerpo injertado con CDR humano y el fragmento del mismo, según cualquiera de los puntos (1) a (3).

(12) Utilización del anticuerpo injertado con CDR humano y el fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones (1) a (3) para la preparación de una composición diagnóstica para el diagnóstico del cáncer.

La presente invención se refiere asimismo al anticuerpo injertado con CDR humano, que reacciona específicamente con el gangliósido GD3 o con el fragmento del mismo tal como se ha indicado anteriormente, que puede conjugarse con un isótopo radioactivo, una proteína o un agente de bajo peso molecular. Dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal se incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y similares.

Un hibridoma es una célula que se obtiene sometiendo una célula B preparada mediante inmunización de un mamífero no humano con un antígeno, a fusión celular con una célula de mieloma derivado de un ratón o similar que produce un anticuerpo monoclonal deseado con una especificidad de antígeno.

Entre los ejemplos del anticuerpo humanizado se incluyen un anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo injertado con CDR humano y similares.

Un anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo que comprende una región V de cadena H (en adelante denominada "HV" o "VH") y una región V de cadena L (en adelante denominada "LV" o "VL") de un anticuerpo derivado de un animal no humano, una región C de cadena H (en adelante denominada "CH") de un anticuerpo humano y una región C de cadena L (en adelante denominada "CL") de un anticuerpo humano. Como animal no humano puede utilizarse cualquier animal, tal como ratones, ratas, hámsters, conejos o similares, con la condición de que pueda prepararse un hibridoma a partir de los mismos.

Puede producirse un anticuerpo quimérico humano mediante la obtención de los ADNc codificantes de VH y de VL a partir de un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal que reaccione específicamente con GD3, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano mediante la inserción del mismo en un vector de expresión de célula animal que presente genes codificantes de la CH y de la CL de anticuerpo humano, y expresar el vector de expresión mediante la introducción del mismo en una célula animal.

Como CH de un anticuerpo quimérico humano puede utilizarse cualquier región perteneciente a una inmunoglobulina humana (en adelante denominada "hIg"), y las de la clase hIgG resultan adecuadas y también puede utilizarse cualquiera de entre las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Además, como CL de un anticuerpo quimérico humano puede utilizarse cualquier región perteneciente a hIg, y pueden utilizarse las de la clase \kappa o \lambda.

Entre los ejemplos del anticuerpo quimérico anti-GD3 se incluye KM871, descrito en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 304989/93.

Un anticuerpo injertado con CDR humano es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las CDR en VH y en VL derivadas de un anticuerpo de animal no humano se han injertado en posiciones apropiadas de VH y de VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la presente invención puede producirse mediante la construcción de ADNc codificantes de regiones V en las que las secuencias de CDR de VH y de VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano que reaccionan específicamente con GD3 se injertan en las secuencias de CDR de VH y de VL de un anticuerpo humano opcional, construyendo un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano mediante la inserción del mismo en un vector de expresión de células animales que presente genes codificantes de CH y de CL de anticuerpo humano, y expresando el anticuerpo injertado con CDR humano mediante la introducción del vector de expresión en una célula animal.

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Como CH del anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invención, puede utilizarse cualquier región perteneciente a hIg, y resultan adecuadas las de la clase hIgG y también puede utilizarse cualquiera de entre las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Además, como la CL del anticuerpo injertado con CDR humano, puede utilizarse cualquier región perteneciente a hIg, y las de las clases \kappa o \lambda.

El anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la presente invención incluye el anticuerpo KM8871, en el que VH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 9 y la CH del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de una subclase IgG1 de anticuerpo humano, y VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 54 y la CL del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de una clase \kappa de anticuerpo humano.

Originalmente, un anticuerpo humano es un anticuerpo presente naturalmente en el cuerpo humano. También incluye anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca fágica de anticuerpos humanos y de un animal transgénico productor de anticuerpos humanos, producidos gracias a los avances recientes de las técnicas de la ingeniería genética, celular y del desarrollo.

Con respecto al anticuerpo presente en el cuerpo humano, puede cultivarse un linfocito que puede producir el anticuerpo mediante el aislamiento de un linfocito sanguíneo periférico humano y la infección del mismo por virus EB o similar con el fin de inmortalizarlo de esta manera, seguido de clonación, y el anticuerpo puede purificarse a partir del cultivo mixto.

La biblioteca fágica de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que se expresan fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, scFv y similares, sobre la superficie fágica mediante la inserción de un gen de anticuerpo preparado a partir de una célula B humana, en un gen fágico. A partir de la biblioteca, puede recuperarse un fago que expresa un fragmento de anticuerpo deseado que presenta una actividad de unión de antígeno, utilizando la actividad del mismo para ligarse a un sustrato inmovilizado con sustrato como marcador. El fragmento de anticuerpo puede manipularse genéticamente para convertirlo adicionalmente en una molécula de anticuerpo humano que presente dos cadenas H completas y dos cadenas L completas.

Un animal transgénico no humano productor de anticuerpos humanos es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las células. Específicamente, puede producirse un animal transgénico productor de anticuerpos humanos mediante la introducción de un gen de anticuerpo humano en células ES de ratón, trasplantando las células ES en un embrión de estadio temprano de otro ratón y después permitiendo que se desarrolle. Como procedimiento de preparación de un anticuerpo humano a partir del animal transgénico productor de anticuerpos humanos, el anticuerpo humano puede producirse y acumularse en un cultivo mixto mediante la obtención de un hibridoma productor de anticuerpos humanos mediante un procedimiento de producción de hibridoma, que habitualmente se lleva a cabo en mamíferos no humanos, y después cultivando el mismo.

Entre los fragmentos de anticuerpos según la presente invención se incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, scFv, dsFv, un péptido que comprende CDR y similares.

Un Fab es un fragmento de anticuerpo que presenta un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la totalidad de la cadena L, de entre los fragmentos obtenidos a partir del tratamiento de IgG con una proteasa, la papaína (que corta en el residuo aminoácido de la posición nº 244 de la cadena H), se encuentran unidos entre sí mediante un enlace disulfuro.

El fragmento Fab de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con GD3 con una proteasa, la papaína. Además, puede producirse Fab mediante la inserción de ADN codificante de Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o en un eucariota para expresar el fragmento Fab.

Un F(ab')_{2} es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión a antígenos, que es ligeramente mayor que el fragmento Fab unido mediante un enlace disulfuro de la región bisagra, de entre fragmentos obtenidos mediante tratamiento de IgG con una proteasa, la pepsina (corte en el residuo aminoácido de la posición nº 234 de la cadena H).

El fragmento F(ab')_{2} de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con GD3 con una proteasa, la pepsina. Además, el fragmento F(ab')_{2} puede producirse mediante la unión de Fab' indicado posteriormente mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.

Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígenos, que se obtiene mediante el corte de un enlace disulfuro de la región bisagra del fragmento F(ab')2.

El fragmento Fab' de la presente invención puede obtenerse tratando F(ab')_{2} que reacciona específicamente con GD3 con un agente reductor, ditiotreitol. Además, el fragmento Fab' puede producirse mediante la inserción de ADN codificante del fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o en un eucariota para llevar a cabo la expresión de dicho vector.

Un fragmento scFv es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que se encuentran unidas una cadena VH y una cadena VL utilizando un péptido conector apropiado (en adelante denominado "P"). Las cadenas VH y VL en el fragmento scFv utilizado en la presente invención puede ser cualquier anticuerpo de entre un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

El fragmento scFv de la presente invención puede producirse mediante la obtención de ADNc codificante de las cadenas VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con GD3, construyendo ADN codificante de scFv, la inserción del ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, y después la introducción del vector de expresión en un procariota o en un eucariota para expresar el fragmento scFv.

Se obtiene un fragmento dsFv mediante la unión de polipéptidos en los que se sustituye un residuo aminoácido de cada una de las cadenas VH y VL por un residuo cisteína mediante un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína. El residuo aminoácido que debe sustituirse con un residuo de cisteína puede seleccionarse basándose en una estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el procedimiento mostrado por Reiter et al. (Protein Engineering 7:697, 1994). Las cadenas VH y VL en el fragmento dsFv de la presente invención pueden ser cualquier anticuerpo de entre un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo
humano.

El fragmento dsFv de la presente invención pueden producirse mediante la obtención de ADNc codificante de las cadenas VH y VL de un anticuerpo capaz de reaccionar específicamente con GD3, construyendo ADN codificante de dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o en un eucariota para expresar el fragmento dsFv.

Un péptido que comprende CDR está constituido por, como mínimo, una región de las CDR de las cadenas H y L. Pueden unirse una pluralidad de CDR directamente o mediante un péptido conector apropiado.

El péptido que comprende CDR de la presente invención puede producirse mediante la obtención de ADNc codificante de las cadenas VH y VL de un anticuerpo que puede reaccionar específicamente con GD3, la inserción del ADNc en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, y después la introducción del vector de expresión en un procariota o en un eucariota para expresar el péptido que comprende CDR.

El péptido que comprende CDR también puede producirse mediante un procedimiento de síntesis química, tal como el procedimiento Fmoc (procedimiento del fluorenilmetoxicarbonilo) o procedimiento tBoc (procedimiento del t-butiloxicarbonilo). Puede producirse un derivado del anticuerpo de la presente invención mediante conjugación química de un isótopo radioactivo, una proteína, un agente de bajo peso molecular o similar con el extremo N-terminal o C-terminal de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo o con el fragmento de anticuerpo que reacciona específicamente con GD3, con un sustituyente apropiado o cadena lateral del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o con una cadena sacárida del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo (Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan, 1994).

Además, los derivados de anticuerpo pueden producirse genéticamente mediante la unión de un ADN codificante de un anticuerpo o del fragmento de anticuerpo que reacciona específicamente con GD3 a otro ADN codificante de una proteína destinada a unirse, la inserción del ADN en un vector de expresión y la introducción del vector de expresión en una célula huésped.

Entre los ejemplos del isótopo se incluyen ^{131}I, ^{125}I y similares, y pueden conjugarse con un anticuerpo mediante, por ejemplo, el procedimiento de la cloramina T.

Entre los ejemplos del agente de bajo peso molecular se incluyen agentes anticáncer, tales como agente alquilante (por ejemplo mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, etc.), antagonistas metabólicos (por ejemplo 5-fluorouracilo, metotrexato, etc.), antibióticos (daunomicina, bleomicina, mitomicina C, daunorrubicina, doxorrubicina, etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo vincristina, vinblastina, vindesina, etc.), fármacos hormonales (por ejemplo tamoxifeno, dexametasona, etc.) y similares (Clinical Oncology, editado por la Japanese Society of Clinical Oncology, publicada por Cancer and Chemotherapy, 1996), agentes antiinflamatorios, tales como agentes esteroides (por ejemplo hidrocortisona, prednisona, etc.), fármacos no esteroideos (por ejemplo aspirina, indometacina, etc.), inmunomoduladores (por ejemplo aurotiomalato, penicilamina, etc.), agentes inmunosupresores (por ejemplo ciclofosfamida, azatioprina, etc.), agentes antihistamínicos (por ejemplo maleato de clorfeniramina, clemastina, etc.) y similares (Inflammation and Antiinflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan, 1982) y similares. Entre los ejemplos del procedimiento para conjugar daunomicina con un anticuerpo se incluyen un procedimiento en el que se conjugan daunomicina y un grupo amino de un anticuerpo mediante glutaraldehído, un procedimiento en el que se conjugan un grupo amino de la daunomicina y un grupo carboxilo de un anticuerpo mediante una carbodiimida soluble en agua, y similares.

Como la proteína, resultan preferidas las citoquinas que activan las células inmunocompetentes, y entre los ejemplos se incluyen hIL-2, hGM-CSF, factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (en adelante denominado "hM-CSF"), interleuquina 12 humana (en adelante denominada "hIL-12") y similares. Además, con el fin de dañar las células de cáncer directamente, pueden utilizarse toxinas, tales como ricina, la toxina diftérica y similares. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo de fusión con una proteína mediante la conjugación de un ADNc codificante de un anticuerpo o del fragmento de anticuerpo con otro ADNc codificante de la proteína, la construcción de un ADN codificante del anticuerpo de fusión, la inserción del ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, y después la introducción del vector de expresión en un procariota o en un eucariota para expresar el anticuerpo de fusión.

Entre los ejemplos de proteína de fusión del anticuerpo anti-GD3 humano con citoquina se incluyen una proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 con hIL-2 y una proteína de fusión de anticuerpo quimérico anti-GD3 KM871 con hIL-2. Entre los ejemplos de proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 con hIL-2 se incluyen KM8871-hIL-2 en el que la región V de cadena H del anticuerpo conjugado con hIL-2 presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 53, la región V de cadena L del anticuerpo presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 54 y la región C de cadena L presenta una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de clase \kappa humano. Entre los ejemplos de proteína de fusión de anticuerpo quimérico anti-GD3 KM871 con hIL-2 se incluyen KM871-hIL-2 en el que la región V de cadena H del anticuerpo conjugado con hIL-2 presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 57, la región V de cadena L del anticuerpo presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 56 y la región C de cadena L presenta una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de clase \kappa humano.

A continuación se proporcionan los procedimientos para producir un anticuerpo humanizado que reacciona específicamente con GD3, y los derivados de un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que reacciona específicamente con GD3.

1. Producción de anticuerpo humanizado (1) Construcción de vector de expresión de anticuerpo humanizado

El vector de expresión de anticuerpo humanizado es un vector de expresión para células animales en el que se insertan los genes codificantes de las cadenas CH y CL de un anticuerpo humano, y pueden construirse mediante clonación de los genes que codifican las cadenas CH y CL de un anticuerpo humano en un vector de expresión para células animales. Las regiones C de un anticuerpo humano pueden ser cualquier cadena CH y CL de anticuerpo humano, y entre los ejemplos se incluyen una región C perteneciente a la subclase IgG1 en una cadena H de un anticuerpo humano (en adelante denominada "hC\gamma1") y una región C perteneciente a la clase \kappa en una cadena L de un anticuerpo humano (en adelante denominada "hC\kappa"). Puede utilizarse un ADN cromosómico que comprende un exón y un intrón como el gen codificante de CH y CL de anticuerpo humano, y también puede utilizarse ADNc. Puede utilizarse cualquier vector de expresión para células animales, con la condición de que pueda insertarse y expresarse un gen codificante de la región C de anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen pAGE107 (Cytotechnology 3:133, 1990), pAGE103 (J. Biochem. 101:1307, 1987), pHSG274 (Gene 27:223, 1984), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1527, 1981), pSG1\betad2-4 (Cytotechnology 4:173, 1990) y similares. Entre los ejemplos de promotor e intensificador utilizados en el vector de expresión para células animales se incluyen el promotor temprano y el intensificador de SV40 (J. Biochem. 101:1307, 1987), el promotor LTR y el intensificador del virus de la leucemia Moloney del ratón (Biochem. Biophys. Res. Comun. 149:960, 1987), el promotor (Cell 41:479, 1985) y el intensificador (Cell 33:717, 1983) de la cadena H de inmunoglobulina y similares.

El vector de expresión de anticuerpo humanizado puede ser de un tipo en el que un gen codificante de una cadena H de inmunoglobulina y un gen codificante de una cadena L de anticuerpo se encuentran en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes se encuentran en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpo humanizado, a la facilidad de introducción en células animales y al equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L de anticuerpo en las células animales, resulta más preferido un tipo tándem de vector de expresión de anticuerpo humanizado (J. Immunol. Methods 167:271, 1994). Entre los ejemplos del vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem se incluyen pKANTEX93 (patente WO nº 97/10354), pEE18 (HYBRIDOMA 17:559, 1998) y similares.

El vector de expresión de anticuerpo humanizado construido de esta manera puede utilizarse para la expresión del anticuerpo quimérico humano y del anticuerpo injertado con CDR humano en células animales.

(2) Preparación de ADNc codificante de región V de anticuerpo derivada de un animal no humano

Los ADNc codificantes de las cadenas VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, tal como un anticuerpo de ratón, se obtienen de la manera siguiente.

Se extrae ARNm de las células de hibridoma productoras de un anticuerpo de ratón o similar con el fin de sintetizar ADNc. El ADNc sintetizado se inserta en un vector, tal como un fago, un plásmido o similar, para preparar una biblioteca de ADNc. Se aísla un fago recombinante o plásmido recombinante que contiene ADNc codificante de VH y un fago recombinante o plásmido recombinante que contiene ADNc codificante de VL a partir de la biblioteca utilizando una parte región C o una parte región V de un anticuerpo de ratón a modo de sonda de ADN. Se determinan las secuencias de nucleótidos completas de las cadenas VH y VL del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o plásmido recombinante, y se deducen las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas VH y VL a partir de las secuencias de nucleótidos.

El animal no humano puede ser cualquier animal, tal como ratón, rata, hámster, conejo o similar, con la condición de que pueda producirse una célula de hibridoma a partir de los mismos. Entre los ejemplos de procedimiento para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluyen el procedimiento de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio (Methods in Enzymol. 154:3, 1987) y similares. Entre los ejemplos del procedimiento para preparar ARNm a partir de ARN total se incluyen el procedimiento de columna de oligo-dT celulosa inmovilizada (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989), en adelante denominada "Molecular Cloning: A Laboratory Manual") y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARNm a partir de una célula de hibridoma se incluyen el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.

Entre los ejemplos del procedimiento para sintetizar ADNc y para preparar una biblioteca de ADNc se incluyen procedimientos conocidos (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34), un procedimiento que utiliza un kit comercializado, tal como el Super Script^{TM} Plasmid System para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por GIBO BRL), el kit ZAP-cDNA (fabricado por Stratagene), etc., y similares.

El vector en el que se inserta el ADNc sintetizado utilizando ARNm extraído de célula de hibridoma como molde, que sirve para preparar una biblioteca de ADNc, puede ser cualquier vector, con la condición de que resulte posible insertar el ADNc. Entre los ejemplos se incluyen ZAP Express (Strategies 5:58, 1992), pBluescript II SK(+) (Nucleic Acids Research 17:9494, 1989), \lambdazapII (fabricado por Stratagene), \lambdagt10 y \lambdagt11 (DNA Cloning: A Practical
Approach I, 49, 1985), Lamba BlueMid (fabricado por Clontech), \lambdaExCell y pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), pUC18 (Gene 33:103, 1985), y similares.

Puede utilizarse cualquier E. coli para introducir la biblioteca de ADNc construida utilizando un vector fago o plásmido, con la condición de que resulte posible introducir, expresar y mantener la biblioteca de ADNc. Entre los ejemplos se incluyen XL1-Blue MRF' (Strategies 5:81, 1992), C600 (Genetcis 39:440, 1954), Y1088 y Y1090 (Science 222:778, 1983), NM522 (J. Mol. Biol. 166:1, 1983), K802 (J. Mol. Biol. 16:118, 1966), JM105 (Gene 38:275, 1985) y similares.

Para seleccionar clones de ADNc codificantes de cadenas VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en la biblioteca de ADNc, puede utilizarse un procedimiento de hibridación de colonias o de hibridación de placas utilizando una sonda marcada con isótopo o por fluorescencia (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989). Además, pueden prepararse los ADNc codificantes de VH y VL mediante la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante denominada "PCR"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Current Protocols in Molecular Biology) mediante la preparación de cebadores y la utilización de ADNc preparado a partir de ARNm o de una biblioteca de ADNc como molde.

La secuencia de nucleótidos del ADNc puede determinarse mediante la digestión del ADNc seleccionado mediante el procedimiento indicado anteriormente con enzimas de restricción apropiados y similares, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar, llevando a cabo la reacción mediante un procedimiento de análisis de nucleótidos utilizado habitualmente, tal como el procedimiento dideoxi de Sanger, F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977) o similar, y después analizando la secuencia utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador A.L.F. de ADN (fabricado por Pharmacia) o similar.

Puede confirmarse si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas VH y VL del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria mediante la estimación de las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL a partir de la secuencia de nucleótidos determinada, y comparándolas con las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991, en adelante denominado "Sequences of Proteins of Immunological Interest").

(3) Análisis de la secuencia de aminoácidos de la región V derivada de un animal no humano

Con respecto a las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL del anticuerpo que comprende una secuencia de señal secretoria, pueden deducirse la longitud de la secuencia de señal secretoria y las secuencias de aminoácidos N-terminales y también conocerse los subgrupos a las que pertenecen, mediante comparación con las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Además, la secuencia de aminoácidos de cada CDR de VH y VL puede obtenerse mediante comparación de la misma con secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest).

(4) Construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano mediante la clonación de ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en la región corriente arriba de los genes codificantes de CH y CL del anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo humanizado según se describe en el punto 1(1). Por ejemplo, cada uno de los ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano se encuentra ligado a un ADN sintetizado que comprende secuencias de nucleótidos en los extremos 3' terminales de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano y secuencias de nucleótidos en los extremos 5' terminales de CH y CL de un anticuerpo humano y que presenta una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en ambos extremos, y cada ADNc se clona de manera que se exprese apropiadamente corriente arriba de los genes codificantes de CH y CL del vector de expresión de anticuerpo humanizado según se describe en el punto 1(1), construyendo de esta manera un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano.

(5) Construcción de ADNc codificante de la región V de anticuerpo injertado con CDR humano

Los ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo injertado con CDR humano pueden obtenerse de la manera siguiente. En primer lugar, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de las FR en VH y VL de un anticuerpo humano al que se han injertado las secuencias de aminoácidos de CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un anticuerpo animal no humano. Puede utilizarse cualquier secuencia de aminoácidos de FR en VH y VL de un anticuerpo humano, con la condición de que ser derivan de un ser humano. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de FR en VH y VL de anticuerpos humanos registrados en una base de datos, tal como la Protein Data Bank o similar, y secuencias de aminoácidos comunes a subgrupos de FR en VH y VL de anticuerpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest) y similares. Con el fin de producir un anticuerpo injertado con CDR humano con actividad potente, preferentemente se seleccionan secuencias de aminoácidos de homología elevada (por lo menos 60% o más) con secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de un anticuerpo de interés derivado de un animal no humano. A continuación, se injertan secuencias de aminoácidos de CDR de VH y VL del anticuerpo derivado de un animal humano con las secuencias de aminoácidos seleccionadas de FR de VH y VL de un anticuerpo humano con el fin de diseñar secuencias de aminoácidos de VH y VL de un anticuerpo injertado con CDR humano. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN a partir de la consideración de la frecuencia de uso de los codones que se encuentran en las secuencias de nucleótidos de los genes de anticuerpos (Sequence of Proteins of Immunological Interest), y se diseñan las secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humano. Se sintetizan varios ADN sintéticos con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos, y se lleva a cabo PCR utilizándolos. En este caso, resulta preferido tanto para la cadena H como la cadena L que se diseñen 6 ADN sintéticos en vista de la eficiencia de reacción de la PCR y de las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.

Además, dichos ADN pueden clonarse fácilmente en el vector de expresión de anticuerpo humanizado construido en el punto 1(1) mediante la introducción de la secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en el extremo 5' terminal de los ADN sintéticos presentes en ambos extremos. Tras la PCR, se clona un producto amplificado en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar, y se determinan las secuencias de nucleótidos siguiendo el procedimiento descrito en el punto 1(2) con el fin de obtener un plásmido que presente secuencias de ADN codificantes de VH y VL de un anticuerpo injertado con CDR humano que se haya diseñado.

(6) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo injertado con CDR humano

Es conocido que, cuando se produce un anticuerpo injertado con CDR humano mediante simplemente el inferto de únicamente CDR en VH y VL, un anticuerpo derivado de un animal no humano en unos FR de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad ligante a antígeno del mismo resulta reducida en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano (BIO/TECHNOLOGY 9:266, 1991). Se cree que el motivo es que varios residuos aminoácidos no sólo en los CDR sino también en los FR se relacionan directa o indirectamente con la actividad ligante a antígeno en VH y VL del anticuerpo original derivado de un animal no humano, y que estos residuos aminoácidos resultan modificados por residuos aminoácidos diferentes derivados de FR de VH y VL del anticuerpo humano. Con el fin de resolver el problema, en anticuerpos injertados con CDR humanos se han realizado intentos para identificar, entre las secuencias de aminoácidos de las FR de VH y VL de anticuerpos humanos, un residuo aminoácido directamente relacionado con la unión a anticuerpo, un residuo aminoácido que interaccione con un residuo aminoácido de CDR o un residuo aminoácido que mantenga la estructura tridimensional del anticuerpo y que se encuentre directamente relacionado con la unión del mismo a antígeno y para incrementar la actividad ligante a antígeno reducida mediante la conversión de dichos aminoácidos en residuos aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano (BIO/TECHNOLOGY 9:266, 1991). Durante la producción de un anticuerpo injertado con CDR humano, resulta crucial identificar eficientemente dichos residuos aminoácidos de FR relacionados con la actividad ligante a antígeno, de manera que la construcción y análisis de la estructura tridimensional de los anticuerpos se han llevado a cabo mediante cristalografía de rayos X (J. Mol. Biol. 112:535, 1977), modelos informáticos (Protein Engineering 1:1501, 1994), y similares. Aunque la información de la estructura tridimensional de los anticuerpos ha resultado útil en la producción de un anticuerpo injertado con CDR humano, todavía no se ha establecido ningún procedimiento para producir un anticuerpo injertado con CDR humano que pueda aplicarse a cualquier anticuerpo. Por lo tanto, en la actualidad resultan necesarios varios intentos, por ejemplo se producen varios anticuerpos modificados de cada
anticuerpo y se examina la relación entre cada uno de los anticuerpos modificados y la actividad ligante de los mismos.

La sustitución de los residuos aminoácidos de los FR en VH y VL de un anticuerpo humano puede conseguirse llevando a cabo la PCR descrita en el punto 1(5) utilizando ADN sintético para la modificación. Con respecto a un producto amplificado obtenido mediante PCR, se determina la secuencia de nucleótidos siguiendo el procedimiento descrito en el punto 1(2), de manera que se confirme que se ha llevado a cabo la modificación objetiva.

(7) Construcción de un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo injertado con CDR humano mediante la clonación de ADNc codificantes de VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humano construido en los puntos 1(5) y 1(6) corriente arriba de los genes codificantes de CH y CL del anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo humanizado según se describe en el punto 1(1).

Por ejemplo, cuando se introducen sitios de reconocimiento para enzimas de restricción apropiados en el extremo 5' terminal de ADN sintéticos situados en ambos extremos entre ADN sintéticos utilizados en la construcción de VH y VL del anticuerpo injertado con CDR humano de los puntos 1(5) y 1(6), puede llevarse a cabo la clonación de manera que se expresen en una forma apropiada corriente arriba de genes codificantes de CH y CL del anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo humanizado según se describe en el punto 1(1).

(8) Expresión transitoria de anticuerpo humanizado

Con el fin de evaluar eficientemente la actividad ligante a antígeno de diversos anticuerpos humanizados producidos, éstos pueden expresarse transitoriamente utilizando el vector de expresión de anticuerpo humanizado según se describe en los puntos 1(4) y 1(7) o el vector de expresión modificado del mismo. Puede utilizarse cualquier célula como célula huésped con la condición de que ésta pueda expresar un anticuerpo humanizado. Generalmente se utiliza la célula COS-7 (ATCC CRL1651) en vista del elevado nivel de expresión de la misma (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283, 1991). Entre los ejemplos del procedimiento para introducir el vector de expresión en una célula COS-7 se incluye un procedimiento de DEAE-dextrano (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283, 1991), un procedimiento de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987) y similares.

Tras la introducción del vector de expresión, puede medirse el nivel de expresión y la actividad ligante de enzima del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo mediante inmunoensayo enzimático (en adelante denominado "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14, 1988, en adelante denominado "Antibodies: A Laboratory Manual", Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996, en adelante denominado "Monoclonal Antibodies", 1996), y similares.

(9) Expresión estable de anticuerpo humanizado

Puede obtenerse un transformante que produzca un anticuerpo humanizado de manera estable mediante la introducción en una célula huésped apropiada del vector de expresión de anticuerpo humanizado descrito en los puntos 1(4) y 1(7).

Entre los ejemplos del procedimiento para introducir el vector de expresión en una célula huésped se incluyen la electroporación (solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257891/90, Cytotechnology 3:133, 1990) y similares.

Puede utilizarse cualquier célula como la célula huésped en la que debe introducirse el vector de expresión de anticuerpo humanizado, con la condición de que pueda expresar el anticuerpo humanizado. Entre los ejemplos se incluyen la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), la célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), la célula CHO en la que un gen de la dihidrofolato reductasa (en adelante denominado "gen DHFR") es defectivo (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216, 1980), una célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662), en adelante denominada "célula YB2/0") y similares. La célula YB2/0 resulta preferida, debido a que la actividad de ADCC del anticuerpo humanizado se encuentra incrementada cuando se expresa en la misma.

Tras la introducción del vector de expresión, los transformantes que expresan un anticuerpo humanizado de manera estable se seleccionan de acuerdo con el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257891/90, mediante el cultivo en un medio para el cultivo de células animales que contiene un agente tal como sulfato de G418 (en adelante denominado "G418", fabricado por Sigma) o similar. Entre los ejemplos del medio para el cultivo de células animales se incluyen el medio PRMI1640 (fabricado por Nissui Pharmaceutical), el medio GIT (fabricado por Nissui Pharmaceutical), el medio EX-CELL302 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por GIBCO BRL), el medio Hibridoma-SFM (fabricado por GIBCO BRL), medios obtenidos mediante la adición de diversos aditivos, tales como el suero de feto bovino (en adelante denominado "FBS") a estos medios, y similares. El anticuerpo humanizado puede producirse y acumularse en un medio de cultivo mediante el cultivo de transformantes seleccionados en un medio. El nivel de expresión y la actividad ligante a antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante del cultivo pueden medirse mediante ELISA o similar. Además, en el transformante el nivel de expresión de anticuerpo humanizado puede incrementarse mediante la utilización de un sistema de amplificación DHFR o similar de acuerdo con el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257891/90.

El anticuerpo humanizado puede purificarse a partir del sobrenadante de cultivo del transformante mediante la utilización de una columna de proteína A (Antibodies, A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies, 1996). Puede utilizarse cualquier otro procedimiento convencional para la purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede purificarse mediante una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración y similar. El peso molecular de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo humanizado purificado o de la molécula de anticuerpo completa se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (en adelante denominada "SDS-PAGE") (Nature 227:680, 1970), transferencia western (Antibodies, A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies, 1996) y similar.

(10) Evaluación de la actividad del anticuerpo humanizado

La actividad ligante a un antígeno y la actividad ligante a líneas celulares de cáncer en cultivo del anticuerpo humanizado purificado pueden medirse mediante ELISA, un procedimiento de inmunofluorescencia (Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993) y medios similares. La actividad citotóxica contra una línea celular en cultivo antígeno-positiva puede evaluarse mediante la medición de la actividad de CDC, la actividad de ADCC o similar (Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993).

(11) Procedimiento de aplicación del anticuerpo humanizado

Se considera útil en el diagnóstico y tratamiento de cánceres humanos y similares, tales como el cáncer de pulmón, melanoma, glioma, neuroblastoma, etc., debido a que el anticuerpo humanizado se une específicamente a GD3, que se expresa en líneas de células cancerosas en cultivo derivadas de seres humanos y muestra actividades citotóxicas, tales como actividad de CDC, actividad de ADCC y similares. Además, debido a que la mayoría de los anticuerpos se derivan a partir de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano en comparación con anticuerpos de animales no humanos, se espera que muestre fuertes efectos antitumorales en el cuerpo humano sin mostrar inmunogenicidad, y que los efectos terapéuticos se mantengan durante un periodo de tiempo prolongado.

El anticuerpo humanizado de la presente invención puede administrarse solo, aunque generalmente resulta preferido proporcionarlo en la forma de una formulación farmacéutica producida mediante la mezcla del mismo con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable de acuerdo con un procedimiento bien conocido con el campo técnico de la farmacéutica.

Resulta preferido seleccionar una vía de administración que resulte la más eficaz para llevar a cabo el tratamiento pretendido, tal como la administración oral o parenteral, por ejemplo la administración intraoral, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular, intravenosa y similar. Resulta preferida la inyección intravenosa en una formulación de anticuerpo.

Entre las formas de dosificación se incluyen pulverizadores, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, esparadrapo y similares.

Entre los ejemplos de formulación adecuada para la administración oral se incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares.

Las preparaciones líquidas, tales como las emulsiones y jarabes, pueden producirse utilizando aditivos, tales como agua, sacáridos, por ejemplo sacarosa, sorbitol, fructosa, etc., glicoles, por ejemplo polietilenglicol, propilenglicol, etc., aceites, por ejemplo aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, etc., antisépticos, por ejemplo p-hidroxibenzoato, etc., sabores, por ejemplo sabor de fresa, menta, etc., y similares.

Las cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares pueden producirse utilizando aditivos, tales como rellenos, por ejemplo lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, etc., agentes desintegrantes, por ejemplo almidón, alginato sódico, etc., lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, etc., ligantes, por ejemplo alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa, gelatina, etc., surfactantes, por ejemplo éster de ácido graso, etc., plastificadores, por ejemplo glicerina, etc., y similares.

Entre los ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración parenteral se incluyen inyecciones, supositorios, pulverizadores y similares.

Las inyecciones pueden prepararse utilizando un portador, tal como una solución salina, una solución de glucosa o una mezcla de las mismas, o similares.

Los supositorios pueden prepararse utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, un ácido carboxílico o similar.

Además, los pulverizadores pueden prepararse a partir del anticuerpo o péptido mismo o utilizando un portador o similar que no estimule las membranas mucosas orales y de las vías respiratorias de los pacientes y pueda facilitar la absorción del anticuerpo o péptido mediante la dispersión del mismo en forma de partículas minúsculas.

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Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerina y similar. Dependiendo de las propiedades del anticuerpo o péptido y del portador que se utilizará, pueden producirse aerosoles, polvos secos y similares. Los aditivos ejemplificados en las preparaciones orales también pueden añadirse a las preparaciones parenterales.

La dosis y frecuencia de la administración varían dependiendo del efecto terapéutico pretendido, del procedimiento de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, peso corporal y similar, aunque la dosis se encuentra generalmente comprendida entre 10 \mug/kg y 8 mg/kg por día y adulto.

2. Producción de proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina (1) Construcción de gen codificante de proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina

Puede construirse un gen codificante de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina mediante la unión de un gen codificante de citoquina al extremo 5'-terminal o 3'-terminal de un gen codificante de la cadena H o L de un anticuerpo o del fragmento de anticuerpo mediante un ADN sintético apropiado. Además, también puede construirse un gen codificante de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina mediante la introducción de una secuencia apropiada de reconocimiento de enzima de restricción en el extremo 5'-terminal de un cebador para la amplificación cuando se amplifica mediante PCR un gen codificante de citoquina, y ligando el gen resultante con el extremo 5' o 3' de un gen codificante de la cadena H o L de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Puede utilizarse cualquier ADN o ADNc cromosómico como el gen codificante de citoquina. La secuencia de nucleótidos del gen codificante de proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina construido de esta manera se determina mediante el procedimiento descrito en el punto 1(2) con el fin de confirmar que es la secuencia de interés.

(2) Construcción de un vector de expresión de proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina

Puede construirse un vector de expresión de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina mediante la sustitución de una parte o de la totalidad de un gen codificante de la cadena H o L de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el vector de expresión de anticuerpo humanizado en los puntos 1(4) y 1(7) por el gen codificante de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina descrito en el punto 2(1). Por ejemplo, cuando se prepara una proteína de fusión en la que se encuentra conjugada la citoquina con el extremo C-terminal de la cadena H del anticuerpo, el vector de expresión puede construirse ligando un gen codificante de citoquina con el extremo 3' de un gen codificante de la CH de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, construyendo de esta manera un gen codificante de proteína de fusión del CH de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina de acuerdo con el punto 2(1), y sustituyendo, con el gen, un gen codificante de CH de un anticuer-
po o fragmento de anticuerpo en el vector de expresión de anticuerpo humanizado descrito en los puntos 1(4) y 1(7).

(3) Expresión estable de proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina

La expresión estable de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 1(9) utilizando el vector de expresión de una proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina descrito en el punto 2(2) se lleva a cabo de manera que pueda obtenerse un transformante capaz de expresar establemente la proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina, la proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina se purifica a partir del sobrenadante de cultivo de la misma, y se puede analizar el peso molecular y similares de la misma.

(4) Evaluación de la actividad in vitro de la proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina

Entre las actividades de la proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina, así purificada, pueden medirse mediante ELISA, un procedimiento de inmunofluorescencia o similar, las actividades de la fracción anticuerpo, es decir la actividad ligante a un antígeno y la actividad ligante a líneas de células de cáncer en cultivo. Además, pueden evaluarse las actividades citotóxicas contra líneas de células de cáncer en cultivo antígeno-positivas y similares. Por otra parte, puede evaluarse la actividad de la fracción citoquina, por ejemplo utilizando actividad de soporte al crecimiento de una línea celular en cultivo que muestre crecimiento dependiente de la concentración contra la citoquina, en forma de índice (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9626, 1994).

(5) Evaluación de la actividad in vivo de la proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina

El efecto antitumoral de la proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina puede evaluarse mediante la administración a un modelo de injerto singénico de ratón en el que se ha trasplantado una línea de ratón de células de cáncer que expresan antígeno a un ratón de tipo salvaje con un sistema inmunológico normal. Además su efecto antitumoral en el cuerpo in vivo puede evaluarse comparando los casos respectivos de administración del anticuerpo solo, la citoquina sola y la administración simultánea del anticuerpo y la citoquina al modelo de injerto singénico de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:7826, 1996). Hasta el momento, no existen informes sobre cultivos de líneas celulares de ratón GD2-positivas o GD3-positivas que se expresen específicamente en melanoma y neuroblastoma humanos. Sin embargo, puede producirse un transformante GD2-positivo o GD3-positivo mediante la introducción de un gen de gangliósido sintasa de interés que debe expresarse específicamente en una línea celular de ratón en cultivo que expresa GM2 o GM3 como precursor de biosíntesis de GD2 o GD3 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:10455, 1994). Puede producirse un modelo de injerto singénico mediante el trasplante de dicho transformante en un ratón de tipo salvaje con un sistema inmunológico normal.

El modelo de ratón preparado de la manera indicada anteriormente puede utilizarse en la evaluación in vivo de una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina contra un gangliósido de interés.

(6) Procedimiento de aplicación de proteínas de fusión de anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado con citoquina

Debido a que la proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con citoquina de la presente invención se une específicamente a GD3 expresado en líneas celulares de cáncer en cultivo de origen humano y muestra actividades citotóxicas, tales como actividad de CDC, actividad de ADCC y similares, se considera que resulta útil en el diagnóstico y tratamiento de cánceres humanos y similares, tales como cáncer de pulmón, melanoma, glioma, neuroblastoma, etc. Debido a que la mayor parte del anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado de la presente invención se deriva de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano en comparación con anticuerpos de animales no humanos, se espera que muestre fuertes efectos antitumorales en el cuerpo humano sin manifestar inmunogenicidad, y que los efectos terapéuticos se mantendrán durante un periodo de tiempo prolongado, y debido a que puede activar las células inmunocompetentes en la periferia de un cáncer por la actividad de la fracción citoquina conjugada, se esperan efectos antitumorales más fuertes que la administración del anticuerpo solo, que la citoquina sola o que la administración simultánea del anticuerpo y la citoquina, y se espera la reducción de efectos secundarios en comparación con la administración sistémica de citoquina.

La proteína de fusión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado con citoquina de la presente invención puede administrarse sola, aunque resulta generalmente preferido proporcionarla en la forma de una formulación farmacéutica producida mediante la mezcla de la misma con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable de acuerdo con un procedimiento bien conocido en el campo técnico de la farmacéutica.

Resulta preferido seleccionar una vía de administración que resulte la más eficaz para llevar a cabo el tratamiento pretendido, tal como la administración oral o parenteral, por ejemplo la administración intraoral, traqueal, rectal, la inyección subcutánea, intravenosa, y similares. La inyección intravenosa resulta preferida en una formulación de proteína.

Entre las formas de dosificación se incluyen pulverizadores, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, esparadrapos y similares.

Entre los ejemplos de formulación adecuados para la administración oral se incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares.

Pueden producirse preparaciones líquidas, tales como emulsiones y jarabes, utilizando aditivos, tales como agua, sacáridos, por ejemplo sacarosa, sorbitol, fructosa, etc., glicoles, por ejemplo polietilenglicol, propilenglicol, etc., aceites, por ejemplo aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, etc., antisépticos, por ejemplo p-hidroxibenzoato, etc., sabores, por ejemplo sabor de fresa, menta, etc., y similares.

Pueden producirse cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares, utilizando aditivos, tales como rellenos, por ejemplo lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, etc., agentes desintegrantes, por ejemplo almidón, alginato sódico, etc., lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, etc., ligantes, por ejemplo alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa, gelatina, etc., surfactantes, por ejemplo éster de ácido graso, etc., plastificadores, por ejemplo glicerina, etc., y similares.

Pueden prepararse inyecciones utilizando un portador, tal como solución salina, solución de glucosa o una mezcla de las mismas, o similares.

Pueden prepararse supositorios utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, un ácido carboxílico o similares.

Además, pueden prepararse pulverizadores a partir del anticuerpo o péptido mismo o utilizando un portador o similar que no estimule las membranas mucosas orales y de las vías respiratorias de los pacientes y pueda facilitar la absorción del anticuerpo o péptido mediante la dispersión del mismo en forma de partículas minúsculas.

Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerina y similares. Dependiendo de las propiedades del anticuerpo o péptido y del portador que debe utilizarse, pueden producirse aerosoles, polvos secos y similares. También pueden añadirse a las preparaciones parenterales los aditivos ejemplificados en las preparaciones orales.

La dosis y frecuencia de la administración varían dependiendo del efecto terapéutico pretendido, del procedimiento de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, peso corporal y similares, aunque la dosis generalmente se encuentra comprendida entre 10 \mug/kg y 8 mg/kg por día y adulto.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido phKM641H.

La fig. 2 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido phKM641L.

La fig. 3 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pT796H641L.

La fig. 4 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pBS641H.

La fig. 5 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pT641.

La fig. 6 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pT641HCDR.

La fig. 7 es un dibujo que representa las etapas de construcción de los plásmidos pT641LCDR y pT641HLCDR.

La fig. 8 es un dibujo que representa la evaluación de actividad de un anticuerpo quimérico anti-GD3 y de un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR a partir de la expresión transitoria de los mismos, utilizando los plásmidos pT641, pT641HCDR, pT641LCDR y pT641HLCDR. La ordenada y la abscisa representan el nombre del vector de expresión y la actividad relativa (%) cuando se define la actividad del anticuerpo quimérico anti-GD3 como 100, respectivamente.

La fig. 9 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido phKM641Lm-69.

La fig. 10 es un dibujo que representa las etapas de construcción de los plásmidos pT641HLCDRNL,
pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8,
pT641HLCDRLm-9 y pT641HLCDRLm-69.

La fig. 11 es un dibujo que representa la evaluación de actividad del anticuerpo quimérico anti-GD3 y del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR a partir de la expresión transitoria de los mismos, utilizando los plásmidos
pT641, pT641HLCDR, pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6,
pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 y pT641HLCDRLm-69. La ordenada y la
abscisa representan el nombre del vector de expresión y la actividad relativa (%) cuando la actividad del anticuerpo quimérico anti-GD3 se define como 100, respectivamente.

La fig. 12 es un dibujo que representa las etapas de construcción de los plásmidos pKANTEX641HLCDR, pKANTEX641HLCDRLm-9 y pKANTEX641HLCDRLm-69.

La fig. 13 es un dibujo que representa los patrones de la electroforesis SDS-PAGE (utilizando un gel de gradiente 4% a 15%) de los anticuerpos purificados anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871. El lado izquierdo muestra los resultados de la electroforesis realizada bajo condiciones no reductoras, y el lado derecho muestra aquellos bajo condiciones reductoras. Los carriles 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 muestra patrones de electroforesis de marcadores de elevado peso molecular, KM8869, KM8870, KM8871, marcadores de reducido peso molecular, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

La fig. 14 es un dibujo que representa la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 quimérico purificado KM871 y de los anticuerpos purificados anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 a GD3 medida por el cambio de la concentración de anticuerpo. La ordenada y la abscisa son la actividad ligante a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "\medcirc", "\medbullet", "\Box" y "\blacksquare" muestran las actividades de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

La fig. 15 es un dibujo que representa la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 quimérico purificado KM871 y de los anticuerpos purificados anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 a GD3 medida por el cambio de una cantidad de GD3 que debe ser adsorbida a una placa. La ordenada y la abscisa son la actividad ligante a GD3 y la cantidad de GD3 adsorbida a la placa, respectivamente. "\medcirc", "\medbullet", "\Box" y "\blacksquare" muestran las actividades de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

La fig. 16 es un dibujo que representa la reactividad del anticuerpo quimérico anti-GD3 purificado KM871 y de los anticuerpos purificados anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 con diversos gangliósidos. La ordenada y la abscisa son el tipo de gangliósido y la actividad ligante, respectivamente. AcGM2, GcGM2, AcGM3 y GcGM3 indican N-acetil-GM2, N-glicol-GM2, N-acetil-GM3 y N-glicolil-GM3. "\Box", "\Box", "\Box" y "\blacksquare" muestran las reactividades de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

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La fig. 17 es un dibujo que representa la reactividad del anticuerpo quimérico anti-GD3 purificado KM871 y de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR purificados KM8869, KM8870 y KM8871 con las líneas de células de melanoma humano G-361 y SK-MEL-28. La ordenada y la abscisa son el número de células y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. Los gráficos muestran las reactividades del control, de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente, de abajo a arriba.

La fig. 18 es un dibujo que representa la actividad de CDC del anticuerpo anti-GD3 quimérico purificado KM871 y de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR purificados KM8869, KM8870 y KM8871 contra las líneas de células de melanoma humano G-361 y SK-MEL-28. La ordenada y la abscisa son la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "\Box", "\Box", "\Box" y "\blacksquare" muestran las reactividades de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

La fig. 19 es un dibujo que representa la actividad de ADCC del anticuerpo anti-GD3 quimérico purificado KM871 y de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR purificados KM8869, KM8870 y KM8871 contra las líneas celulares de melanoma humano G-361 y SK-MEL-28. La ordenada y la abscisa son la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "\Box", "\Box", "\Box" y "\blacksquare" muestran las reactividades de KM871, KM8869, KM8870 y KM8871, respectivamente.

La fig. 20 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pBSA-B.

La fig. 21 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pBS\DeltahC\gamma1-IL-2.

La fig. 22 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pBShC\gamma1-IL-2.

La fig. 23 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pKANTEX8871-hIL-2.

La fig. 24 es un dibujo que representa los patrones de electroforesis SDS-PAGE (utilizando un gel de gradiente 4% a 15%) de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR purificado KM8871 y proteína de fusión purificada KM8871-hIL-2. La parte izquierda y la parte derecha son los resultados de la electroforesis llevada a cabo bajo condiciones no reductoras, y bajo condiciones reductoras, respectivamente. Los carriles 1, 2, 3, 4, 5 y 6 muestran los patrones de electroforesis de marcadores de bajo peso molecular, KM8871, KM8871-hIL-2, marcadores de bajo peso molecular, KM8871 y KM8871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 25 es un dibujo que representa la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR purificado KM8871 y de la proteína de fusión purificada KM8871-hIL-2 con GD3 medida mediante la modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y la abscisa son la actividad ligante a GD3 y la concentración de anticuerpo. "\medcirc" y "\medbullet" muestran las actividades de KM8871 y KM8871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 26 es un dibujo que representa la reactividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR purificado KM8871 y la proteína de fusión KM8871-hIL-2 purificado, con diversos gangliósidos. La ordenada y la abscisa son el tipo de gangliósido y la actividad ligante. AcGM2, GcGM2, AcGM3 y GcGM3 indican N-acetil-GM2, N-glicolilGM2, N-acetilGM3 y N-glicolilGM3, respectivamente. "\Box" y "\blacksquare" muestran las reactividades de KM8871 y de KM8871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 27 es un dibujo que representa la reactividad de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR purificado KM8871 y de proteína de fusión KM8871-hIL-2 purificada con la línea celular de melanoma humano G-361. La ordenada y la abscisa son el número de células y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. Los dibujos muestran las reactividades de KM8871 y de KM8871-hIL-2, respectivamente, desde la columna superior.

La fig. 28 es un dibujo que representa la actividad de soporte al crecimiento de hIL-2 y la proteína de fusión KM8871-hIL-2 purificada contra las células CTLL-2 dependiente de hIL-1 mediante la modificación de la concentración de cada proteína. La ordenada y la abscisa son la actividad de soporte del crecimiento y la concentración de proteína, respectivamente. "\medcirc" y "\medbullet" indican las actividades de hIL-2 y de KM8871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 29 es un dibujo que representa los resultados de la medición de la activación y actividad citotóxica acompañante de células efectoras humanas por parte del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR purificado KM8871 y la proteína d efusión KM8871-hIL-2 purificada. La ordenada y la abscisa son la actividad citotóxica y la proteína utilizada, respectivamente. "\Box" y "\blacksquare" indican las actividades de KM8871 y de KM8871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 30 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pKANTEX871-hIL-2.

La fig. 31 es un dibujo que representa los patrones de electroforesis SDS-PAGE (utilizando un gel de gradiente de 4% a 15%) de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de proteína de fusión KM871-hIL-2 purificada. La parte izquierda y la parte derecha son los resultados de la electroforesis llevada a cabo bajo condiciones reductoras y bajo condiciones no reductoras, respectivamente. Los carriles 1, 2, 3, 4, 5 y 6 muestran los patrones de electroforesis de marcadores de bajo peso molecular, KM871, KM871-hIL-2, marcadores de bajo peso molecular, KM871 y KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 32 es un dibujo que representa la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM8871 y de la proteína de fusión purificada KM871-hIL-2 con GD3 medida mediante la modificación de la concentración de proteína. La ordenada y la abscisa son la actividad ligante a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "\medbullet" y "\Box" muestran las actividades de KM871 y de KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 33 es un dibujo que representa la reactividad del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de la proteína de fusión KM871-hIL-2 purificada, con diversos gangliósidos. La ordenada y la abscisa son el tipo de gangliósido y la actividad ligante, respectivamente. AcGM2, GcGM2, AcGM3 y GcGM3 indican N-acetil-GM2, N-glicolil-GM2, N-acetil-GM3 y N-glicolil-GM3, respectivamente. "\blacksquare" y "\Box" muestran las reactividades de KM871 y de KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 34 es un dibujo que representa la reactividad de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de la proteína de fusión purificada KM871-hIL-2 con las líneas celulares de melanoma humano G-361 y SK-MEL-28. La ordenada y la abscisa son el número de células y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. Los gráficos muestran las reactividades de KM871 con las células G361, de KM871-hIL-2 con las células G361, de KM871 con SK-MEL-28 y de KM871-hIL-2 con SK-MEL-28, respectivamente, desde la columna superior.

La fig. 35 es un dibujo que representa la actividad de soporte del crecimiento de hIL-2 y de la proteína de fusión purificada KM871-hIL-2 contra las célula CTLL-2 dependientes de hIL-2 medida mediante la modificación de la concentración de cada proteína. La ordenada y la abscisa son la actividad de soporte del crecimiento y la concentración de proteína, respectivamente. "\medbullet" y "\medcirc" indican las actividades de hIL-2 y de KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 36 es un dibujo que representa los resultados de la medición de la activación y actividad citotóxica acompañante de células efectoras humanas por parte del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de la proteína de fusión purificada KM871-hIL-2. La ordenada y la abscisa son la actividad citotóxica y la proteína utilizada, respectivamente. "\blacksquare" y "\Box" indican las actividades de KM871 y de KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 37 es un dibujo que representa las etapas de construcción del plásmido pKANTEXGD3.

La fig. 38 es un dibujo que representa la reactividad del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 con las líneas celulares B16 con gen de GD3 sintasa introducido B16\cdot29-10 y B16\cdot8-3 y la línea celular parental B16\cdotF10. La ordenada y la abscisa son el número de células y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. Los dibujos muestran las reactividades de las células B16\cdotF10, B16\cdot29-10 y B16\cdot8-3, respectivamente, de columna superior a inferior.

La fig. 39 es un dibujo que representa los resultados de la medición de los efectos antimetastásicos del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de KM871-hIL-2 sobre ratones BL/6 en los que se ha trasplantado la línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10. La ordenada y las columnas de los gráficos muestran el número de focos metastásicos sobre la superficie pulmonar y el valor medio de cada grupo, respectivamente. La no administración se refiere a un grupo de control en el que no se ha administrado el anticuerpo. "\lozenge", "\medcirc" y "\medbullet" indican el número de focos metastásicos en ratones del grupo de control, en el grupo que ha recibido KM871-hIL2 y en el grupo que ha recibido KM871, respectivamente.

La fig. 40 es un dibujo que representa el resultado de la medición de los efectos antimetastásicos del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de KM871-hIL-2 sobre ratones BL/6 en los que se ha trasplantado una línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot8-3. La ordenada y las columnas del gráfico muestran el número de focos metastásicos sobre la superficie pulmonar y el valor medio de cada grupo, respectivamente. La no administración se refiere a un grupo de control en el que no se ha administrado el anticuerpo. "\lozenge", "\medcirc" y "\medbullet" indican el número de focos metastásicos en ratones del grupo de control, en el grupo que ha recibido KM871-hIL2 y en el grupo que ha recibido KM871, respectivamente.

La fig. 41 es un dibujo que representa los resultados de la medición de los efectos anti-metastásicos por la administración combinada de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y hIL-2, y por la administración de KM871-hIL-2 sobre ratones BL/6 en los que se ha trasplantado la línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10. La ordenada y las columnas del gráfico muestran el número de focos metastásicos sobre la superficie pulmonar y el valor medio de cada grupo. La no administración se refiere a un grupo de control en el que no se ha administrado el anticuerpo. "\lozenge", "\medcirc" y "\medbullet" indican el número de focos metastásicos en ratones del grupo de control, en el grupo que ha recibido KM871-hIL2 y en el grupo que ha recibido KM871, respectivamente.

La fig. 42 es un dibujo que representa los resultados de los efectos d inhibición del crecimiento de KM871-hIL-2 sobre un modelo de tumor sólido de estadio temprano de ratones BL/6 en los que se ha trasplantado subcutáneamente línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10. La ordenada y la abscisa del gráfico muestran la proporción entre el valor medio de los volúmenes de tumor en cada grupo y el valor medio de los volúmenes de tumor en el grupo de control, y los días tras el inicio de la administración de agente, respectivamente. Línea de puntos, "\Box", "\Delta" y "\medcirc" indican el control, el grupo que ha recibido KM871, el grupo que ha recibido hIL-2 y el grupo que ha recibido KM871-hIL-2, respectivamente.

La fig. 43 es un dibujo que representa los resultados de la medición de los efectos de inhibición del crecimiento de KM871-hIL-2 sobre un modelo de tumor sólido de estadio avanzado de ratones BL/6 en el que ha sido trasplantado subcutáneamente la línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10. La ordenada del gráfico muestra la proporción entre el valor medio de los valores V/V0 en cada grupo y el valor medio de los valores V/V0 en el grupo de control. V/V0 indican la proporción entre el volumen del tumo de cada ratón en cada día de medición y el volumen tumoral el día del inicio de la administración. La abscisa muestra los días tras el inicio de la administración de agente. La línea de puntos, "\Delta", "\Box", "\blacksquare", "\medcirc" y "\medbullet" indican el control, el grupo que ha recibido hIL-2, el grupo que ha recibido KM871 a una dosis de 50 \mug/día, el grupo que ha recibido KM871 a una dosis de 200 \mug/día, el grupo que ha recibido KM871-hIL-2 a una dosis de 24 \mug/día y el grupo que ha recibido KM871-hIL-2 a una dosis de 60 \mug/día.

La fig. 44 es un dibujo que representa los resultados de la medición de los efectos de inhibición del crecimiento por la administración combinada de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y KM871-hIL-2 en un modelo de tumor sólido de estadio avanzado de ratones BL/6 en el que ha sido trasplantado subcutáneamente una línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10. La ordenada del gráfico muestra la proporción entre el valor medio de los valores V/V0 en cada grupo y el valor medio de los valores V/V0 en el grupo de control. V/V0 indica la proporción entre el volumen tumoral de cada ratón en cada día de medición y el volumen tumoral el día de inicio de la administración. La abscisa muestra los días tras el inicio de la administración de agente. La línea de puntos, "\Delta", "\blacksquare", "\medcirc" y "\medbullet" indican el control, el grupo que ha recibido hIL-2, el grupo que ha recibido KM871, el grupo que ha recibido la combinación de KM871 y KM871-hIL-2 a una dosis de 15 \mug/día y el grupo de administración combinada de KM871 y KM871-hIL-2 a una dosis de 60 \mug/día.

La fig. 45 es un dibujo que representa los resultados de la medición de la activación e incremento resultante de actividad citotóxica de las células de bazo de ratón BL/6 por parte de hIL-2 o KM871-hIL-2. La ordenada y la abscisa son la actividad citotóxica y la concentración de KM871 utilizada para medir la actividad citotóxica, respectivamente. Las columnas negras, blancas, grises y sombreadas indican la actividad de células de bazo de ratones de control sin administración, la actividad de las células de bazo de ratón en las que se ha administrado hIL-2 cinco veces, la actividad de las células de bazo de ratón en las que se ha administrado KM871-hIL-2 una vez, y la actividad de las células de bazo de ratón en las que ha administrado KM871-hIL-2 cinco veces, respectivamente.

La fig. 46 es un dibujo que representa la proporción entre el número de células de cada grupo de células de entre las células de bazo de ratones BL/6 en las que se ha administrado hIL-2 o KM871-hIL-2, medido mediante un procedimiento de inmunofluorescencia. La ordenada y la abscisa son la proporción en células de bazo de cada grupo celular y cada grupo celular, respectivamente. Las columnas blancas, grises, negras y sombreadas indican la proporción de las células de bazo de los ratones de control sin administración, la proporción de las células de bazo de ratón en las que se ha administración hIL-2 cinco veces, la proporción de las células de bazo de ratón en las que se ha administrado KM871-hIL-2 cinco veces y la proporción de las células de bazo de ratón en las que se ha administrado KM871-hIL-2 dos veces, respectivamente.

La fig. 47 es un dibujo que representa el resultado de la medición de la actividad citotóxica de células de bazo cuando se administra KM871-hIL-2 a ratones BL/6 en los que se han agotado un tipo celular de entre células NK, células T CD4-positivas y células T CD8-positivas. La ordenada muestra la actividad citotóxica. Las columnas blancas, negras, grises y sombreadas indican la actividad citotóxica de células de bazo de ratón no sometidas al tratamiento de eliminación celular, la actividad citotóxica de células de bazo de ratón con eliminación de células NK, la actividad citotóxica de células de bazo de ratón con eliminación de células T CD4-positivas y la actividad citotóxica de células de bazo de ratón con eliminación de células T CD8-positivas, respectivamente.

La fig. 48 es un dibujo que representa los resultados de la medición de los efectos anti-metastásicos de KM871-hIL-2 sobre los ratones BL/6 en los que se ha trasplantado una línea celular B16 GD3-positiva B16\cdot29-10 en las que se ha eliminado un tipo celular de entre las células NK, las células T CD4-positivas y las células T CD8-positivas. La ordenada muestra el número de focos metastásicos. "\medcirc", "\medbullet", barras horizontales y el valor en el gráfico indican el número de focos metastásicos de pulmón de ratón que ha recibido KM871-hIL-2, el valor medio de cada grupo y la proporción de inhibición de la metástasis por la administración de KM871-hIL-2.

Mejor modo de poner en práctica la invención

A continuación, se muestran ejemplos de la presente invención, aunque el alcance de la presente invención no se encuentra limitado por los mismos.

Ejemplo 1 Producción de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR 1. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641

La SEC ID nº 1 representa una secuencia de aminoácidos completa de la cadena VH del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 dada a conocer en la solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 304989/93, y la SEC ID nº 2 representa una secuencia de aminoácidos completa de la cadena VL de dicho anticuerpo. Basándose en la comparación de ambas secuencias con los resultados analíticos de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest) y las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas H y L del anticuerpo anti-GD3 de ratón purificado KM641, se confirmó que las posiciones (-19) y (-1) en la secuencia de aminoácidos de la cadena H y las posiciones (-20) y (-1) en la secuencia de aminoácidos de la cadena L son las secuencias de señal secretoria. Las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas VH y VL secretorias se encuentran representadas por las secuencias SEC ID nº 55 y nº 56, respectivamente. Además, se encontró que las CDR 1, 2 y 3 de VH presentaban las secuencias de aminoácidos representadas por las secuencias SEC ID nº 3, 4 y 5, y las CDR 1, 2 y 3 de VL presentaban aquéllas representadas por las secuencias SEC ID nº 6, 7 y 8.

2. Medición de la actividad ligante a diversos gangliósidos (ELISA)

Se midió la actividad ligante de anticuerpos a diversos gangliósidos de la manera siguiente.

Se disolvió cada gangliósido (2 nmoles) en 2 ml de solución en etanol que contenía 10 \mug de dipalmitoilfosfatidilcolina (fabricada por SIGMA) y 5 \mug de colesterol (fabricado por SIGMA). En cada pocillo de una placa de 96 pocillos para la utilización en ELISA (fabricado por Greiner), se dispensaron 20 \mul e la solución (convirtiéndose en 20 pmoles/pocillo) o 20 \mul de la solución diluida con etanol, respectivamente, seguido del secado con aire, y después se añadió PBS que contenía BSA al 1% (en adelante denominado "BSA-PBS al 1%") a 100 \mul/pocillo y se dejó que reaccionase a temperatura ambiente durante 1 hora dejando de esta manera que se bloqueasen los grupos activos restantes. Tras descartar el BSA-PBS al 1%, se añadieron sobrenadantes de cultivo de transformantes o soluciones diluidas de anticuerpos humanizados 50 \mul/pocillo y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (en adelante denominada "Tween-PBS") y después se añadió una solución de anticuerpo anti-IgG(\gamma) humano de cabra marcado con peroxidasa (fabricada por Kirkegaard & Perry Laboratories) diluida 1.000 veces con BSA-PBS al 1% como solución de anticuerpo secundario a 50 \mul/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y lavado posterior con Tween-PBS, se añadió una solución de sustrato ABTS (una solución preparada mediante la disolución de 0,55 g de ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mug/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de la utilización) a 50 \mul/pocillo para el desarrollo de color y se midió la absorbancia a 415 nm (en adelante denominada "DO415").

3. Construcción de ADNc codificantes de las cadenas VH y VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR (1) Diseño de secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR

En primer lugar, se diseñó una secuencia de aminoácidos de VH de un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la manera siguiente. Con el fin de injertar las secuencias de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 identificado en el punto 1 del Ejemplo 1, se seleccionó una secuencia de aminoácidos de FR de VH de un anticuerpo humano. Kabat et al. clasificaron la cadena VH de diversos anticuerpos humanos conocidos en tres subgrupos (HSG I a III) basándose en la homología de las secuencias de aminoácidos, informando después las secuencias de consenso entre los subgrupos respectivos (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Debido a que estas secuencias de consenso presentan la posibilidad de que la inmunogenicidad se encuentre reducida en el ser humano, se decidió diseñar una secuencia de aminoácidos de VH de un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR basándose en estas secuencias de consenso. Con el fin de producir un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con actividad más elevada durante el diseño, se decidió seleccionar una secuencia de aminoácidos de FR con la homología más alta con la secuencia de aminoácidos de FR de VH de KM64, de entre las secuencias de aminoácidos de FR de las secuencias de consenso de los tres subgrupos de VH de anticuerpo humano. Los resultados de la búsqueda de homología se muestran en la Tabla 1. Tal como se muestra en la Tabla 1, la secuencia de aminoácidos de FR de VH de KM641 mostró la homología más elevada con el subgrupo III.

TABLA 1 Homología entre la secuencia de aminoácidos de FR de la secuencia de consenso de cada subgrupo de región V de cadena H de anticuerpo humano y la secuencia de aminoácidos de FR e la región V de cadena H de KM641

1

Basándose en los resultados anteriormente proporcionados, se diseñó una secuencia de aminoácidos HV.0 de VH del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR mediante el injerto de la secuencia de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 en una posición apropiada de la secuencia de aminoácidos de FR de la secuencia de consenso del subgrupo III de VH de anticuerpo humano.

A continuación, se diseñó una secuencia de aminoácidos de VL de un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la manera siguiente. Con el fin de injertar la secuencia de aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 identificada en el punto 1 del Ejemplo 1, se seleccionó una secuencia de aminoácidos de FR de VL de un anticuerpo humano. Kabat et al. han clasificado la VL de diversos anticuerpos humanos conocidos en cuatro subgrupos (HSG I a IV) basándose en la homología de las secuencias de aminoácidos, informando después las secuencias de consenso entre los subgrupos respectivos (Sequences of Proteins of Immunological Interest). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, de manera similar a la cadena H, se seleccionó una secuencia de aminoácidos de FR con la homología más alta con la secuencia de aminoácidos de FR de VL de KM641 de entre las secuencia de aminoácidos de FR de las secuencias de consenso de los cuatro subgrupos de VL de anticuerpos humanos. Se muestran los resultados de la búsqueda de homología en la Tabla 2. Tal como se muestra en la Tabla 2, la secuencia de aminoácidos de FR de VL de KM641 mostró la homología más alta con el subgrupo I.

TABLA 2 Homología entre la secuencia de aminoácidos de FR de la secuencia de consenso de cada subgrupo de región V de cadena L de anticuerpo humano y la secuencia de aminoácidos de FR de la región V de cadena L de KM641

2

Basándose en los resultados anteriormente proporcionados, se diseñó una secuencia de aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR mediante injerto de la secuencia de aminoácidos de la CDR de VL del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 en una posición apropiada de la secuencia de aminoácidos del FR de la secuencia de consenso del subgrupo I de VL del anticuerpo humano.

La secuencia de aminoácidos diseñada de esta manera HV.0 de VH y la secuencia de aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR son secuencias en las que únicamente se injerta la secuencia de aminoácidos de CDR del anticuerpo anti-GD3 de ratón con la secuencia de aminoácidos de FR del anticuerpo humano seleccionado. En general, en los anticuerpos injertados con CDR humanos, la actividad ligante a antígeno se encuentra reducida en muchos casos mediante el injerto de una secuencia de aminoácidos de CDR de anticuerpo de ratón solo. De esta manera, con el fin de evitar la reducción de la actividad ligante de antígeno de anticuerpos, entre los residuos aminoácidos de FR diferentes entre un anticuerpo humano y un anticuerpo de ratón, se injertan los residuos aminoácidos que se considera que ejercen influencias sobre la actividad ligante de antígeno, conjuntamente con una secuencia de aminoácidos de CDR. De acuerdo con lo anterior, se llevó a cabo la identificación de los residuos aminoácidos de FR que se considera que presentan influencias sobre la actividad.

En primer lugar, se construyó una estructura tridimensional de una región V de anticuerpo que consta de la secuencia de aminoácidos HV.0 de VH y la secuencia de aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR diseñada anteriormente (en adelante denominada "HV0LV0"). Se llevó cabo la producción de coordenadas de estructura tridimensional utilizando el software AbM (fabricado por Oxford Molecular) y la visualización de la estructura tridimensional se realizó utilizando el software Pro-Explore (fabricado por Oxford Molecular) siguiendo las instrucciones del fabricante respectivas. Además, de la misma manera se construyó un modelo informático de la estructura tridimensional de la región V del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641. Asimismo, también se construyó un modelo de estructura tridimensional de HV0LV0 modificado, que presentaba una secuencia de aminoácidos en la que se había sustituido en orden por lo menos un residuo aminoácido diferente del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 en las secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de HV0LV0 por los residuos aminoácidos de las posiciones correspondientes al anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641. Se compararon las estructuras tridimensionales de las regiones V del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641, de HV0LV0 y del producto modificado. Como resultado, los residuos aminoácidos que se consideró que presentaban una influencia sobre la actividad ligante de antígeno mediante la modificación de la estructura tridimensional de la región de unión a antígeno se seleccionaron de entre los residuos aminoácidos de FR de HV0LV0. Como resultado de la sustitución de los residuos aminoácidos de FR de HV0LV0 seleccionados de esta manera por los residuos aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón KM641, se diseñaron una secuencia de aminoácidos hKM641H de VH un anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR representado por la SEC ID nº 9 y una secuencia de aminoácidos hKM641L de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR representado por la SEC ID nº 10. En hKM641H, se sustituyó la 10ª posición Gly, la 11ª posición Leu, la 20ª posición Leu, la posición 28ª Thr, la posición 84ª Asn, la posición 91ª Thr, la posición 95ª Tyr, la posición 97ª Ala y la posición 115ª Val en la secuencia de aminoácidos de FR de HV.0 se sustituyeron por Asp, Phe, Val, Ala, Arg, Ser, Phe, Thr y Leu, respectivamente, como residuos aminoácidos de las posiciones correspondientes a la VH del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641. En hKM641L, la posición 49º Tyr, la posición 65º Ser y la posición 71º Phe en la secuencia de aminoácidos de FR de LV.0 se sustituyeron por Tyr, Ser y Phe, respectivamente, como residuos aminoácidos de las posiciones correspondientes a la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641.

(2) Construcción de ADNc codificante de VH del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR

Se construyó un ADNc codificante de la secuencia de aminoácidos de VH de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR hKM641H denominado el punto 3(1) del Ejemplo 1.

En primer lugar, se ligó la secuencia de aminoácidos diseñada con la secuencia de señal secretoria de la cadena H del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 representada por la secuencia de SEC ID nº 1 para producir una secuencia de aminoácidos completa del anticuerpo. A continuación, se convirtió la secuencia de aminoácidos en codones genéticos. En el caso de encontrarse dos o más codones genéticos para un residuo aminoácido, el codón genético correspondiente se determinó tomando la frecuencia de uso de codones encontrada en las secuencias de nucleótidos de los genes de anticuerpo considerados (Sequences of Proteins of Immunological Interest). Se diseñó una secuencia de nucleótidos de ADNc codificante de la secuencia de aminoácidos completa de la región V del anticuerpo mediante ligación de los codones genéticos determinados de esta manera, y se añadieron a los extremos 5' y 3' las secuencias de nucleótidos de sitio de unión de cebador para la utilización en la amplificación por PCR (incluyendo secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción para la clonación en un vector de expresión de anticuerpo humanizado). La secuencia de nucleótidos determinada de esta manera se dividió en un total de 6 secuencias de nucleótidos a partir del lado 5'-terminal, presentando cada uno aproximadamente 100 bases (las secuencias de nucleótidos contiguas se diseñaron de manera que los extremos presentasen una secuencia solapante de aproximadamente 20 bases) y se sintetizaron en orden alternante de las cadenas sentido y antisentido utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems).

Específicamente, se sintetizaron 6 fragmentos de ADN de las secuencias SEC ID nº 11 a nº 16. Se añadió ADN a 50 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, 0,001% de gelatina, dNTPs 200 \muM, 0,5 \muM de cebador RV de M13 (fabricado por Takara Shuzo), 0,5 \muM de cebador M4 de M13 (fabricado por Takara Shuzo) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq TaKaRa (fabricado por Takara Shuzo), proporcionando una concentración final de 0,1 \muM, y la solución se cubrió con 50 \mul de aceite mineral y se colocó en un ciclador térmico de ADN (PJ480, fabricado por Perkin Elmer) para llevar a cabo 30 ciclos de la reacción, incluyendo cada ciclo 2 minutos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. La solución de reacción se purificó utilizando el kit de purificación por PCR QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se preparó en 30 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y 10 unidades de un enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo) se añadieron adicionalmente al mismo para llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01% y 10 unidades del enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo) se añadieron adicionalmente para llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 0,44 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug de un plásmido pBluescript SK(-) a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron además 10 unidades de un enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo) a la mezcla con el fin de llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y se añadieron además 10 unidades de un enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo) a la mezcla con el fin de llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 2,95 kb utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI del producto PCR de VH del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR y 0,1 \mug del fragmento Apa-NotI del plásmido pBluescript SK(-), ambos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó la línea HB101 de Escherichia coli. Se produjo cada plásmido ADN a partir de 10 clones de los transformantes, se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, y como resultado se obtuvo el plásmido phKM641H mostrado en la fig. 1 con la secuencia de nucleótidos de interés.

(3) Construcción de ADNc codificante de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR

Se construyó un ADNc codificante de la secuencia de aminoácidos hKM641L de la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR, diseñado en el punto 3(1) del Ejemplo 1, utilizando un PCR similar al utilizado con VH. En este caso, se utilizó la secuencia de aminoácidos de la cadena L del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 representada por la SEC ID nº 2 como la secuencia de señal secretoria.

En primer lugar, se sintetizaron 6 fragmentos de ADN sintético de las secuencias SEC ID nº 17 a nº 22 utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems). Se añadió cada uno de los fragmentos de ADN sintetizados de esta manera a 50 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), cloruro de potasio 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 200 \muM de dNTPs, 0,5 \muM de cebador M13 RV (fabricado por Takara Shuzo), 05 \muM de cebador M13M4 (fabricado por Takara Shuzo) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq TaKaRa (fabricada por Takara Shuzo), proporcionando una concentración final de 0,1 \muM, y la solución se cubrió con 50 \mul de aceite mineral y se introdujo en un ciclador térmico de ADN (PJ480, fabricado por Perkin Elmer) para llevar a cabo 30 ciclos de la reacción, incluyendo cada ciclo 2 minutos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. La solución de reacción se purificó utilizando el kit de purificación por PCR QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se añadió a 30 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y 100 \mug/ml de BSA, y se añadieron además 10 unidades de un enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y un enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo) para llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 0,39 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSL3 indicado en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257893/98 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml, y se añadieron además 10 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando 2 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 2,95 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del producto PCR de la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del plásmido pBSL3, ambos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ligasa de ADN de T4 Ready-To-Go (fabricado por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó la línea HB101 de E. coli. Cada plásmido ADN se preparó a partir de 10 clones de los transformantes, se dejó que reaccionase siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos y, como resultado, se obtuvo el plásmido phKM641L mostrado en la fig. 2, que presentaba la secuencia de nucleótidos de interés.

4. Evaluación de la actividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR mediante expresión transitoria utilizando células animales

Con el fin de llevar a cabo la evaluación de actividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con mayor rapidez, se llevó a cabo la expresión transitoria del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la manera siguiente utilizando células COS-7 (ATCC CRL 1651).

(1) Construcción del vector pT641 de expresión transitoria de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871

Con el fin de ser utilizado como control positivo en la evaluación de actividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR mediante expresión transitoria, se construyó el vector pT641 de expresión transitoria para el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 de la manera siguiente.

Debido a que la eficiencia de la expresión transitoria utilizando células animales depende generalmente del número de copia del vector de expresión introducido, se consideró que un vector de expresión de menor tamaño presentaba una eficiencia de expresión más alta. De acuerdo con lo anterior, se construyó el vector de expresión transitoria pT641 para el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 de la manera siguiente, utilizando el vector pT796 de expresión transitoria para el anticuerpo anti-gangliósido GM2 quimérico KM966 indicado en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257893/98 y el plásmido pKM641HF1 con la cadena VH de anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 y el plásmido pKM641LA2 con la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 indicado en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 304989/93.

En primer lugar, se añadieron 3 \mug del plásmido pKM641LA2 con la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 de ratón KM641 indicado en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 304989/93 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro sódico 50 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y la solución se mezcló adicionalmente con 10 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron además 10 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento HindIII-EcoRI de aproximadamente 0,35 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del vector pT796 de expresión transitoria para el anticuerpo anti-gangliósido GM2 quimérico KM966 indicado en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257893/98 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 9,20 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se sintetizaron fragmentos de ADN sintéticos que presentaban, respectivamente, las secuencias de nucleótidos representadas por las secuencias SEC ID nº 23 y nº 24 utilizando un secuenciador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems). Se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los fragmentos de ADN sintético obtenidos de esta manera a 15 \mul de agua estéril y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. Tras dejar reposar la solución de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, ésta se mezcló con 2 \mul de un solución de tampón 10 x (Tris-HCl 500 mM, pH 7,6), cloruro de magnesio 100 mM, DTT 50 mM) y 2 \mul de ATP 10 mM y se mezcló además con 10 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (fabricada por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 30 minutos para fosforilar de esta manera el extremo 5'-terminal.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento HindIII-EcoRI derivado del plásmido pKM641LA2, 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI derivado del plásmido pT796 y 0,05 \mug del ADN sintético fosforilado, obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101, obteniendo el plásmido pT796H641L mostrado en la fig. 3. El plásmido obtenido de esta manera (10 \mug) se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a una electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de los nucleótidos, y como resultado, se confirmó que se había obtenido un plásmido en el que se había clonado el ADN de interés.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro sódico 50 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml y la solución se mezcló adicionalmente con 10 unidades de un enzima de restricción XbaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 30 \mul de un tampón que comprendía acetato sódico 30 mM (pH 5,0), cloruro sódico 100 mM, acetato de cinc 1 mM y glicerol al 5%, y se mezcló adicionalmente con 30 unidades de un enzima modificado nucleasa Mung Bean (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 25ºC durante 15 minutos. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento extremo romo-ApaI de aproximadamente 2,95 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pKM641HF1 a 10 \mu de un tampón que comprende Tris-Hcl 50 mM (pH 7,5), cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 10mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de un enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) para llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, y el extremo en resalte 5' formado por la digestión de la enzima de restricción se convirtió en un extremo romo utilizando el kit para enronar (fabricado por Takara Shuzo). La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-Hcl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se mezcló además con 10 unidades de un enzima d rest4ricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo) para llevar a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante una electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento extremo romo -ApaI de aproximadamente 0,44 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN) según las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug de fragmento extremo romo-ApaI derivado del plásmido pBluescript SK(-) y 0,1 \mug del fragmento extremo romo-ApaI derivado del plásmido pKM641HF1, obtenido tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101, obteniendo el plásmido pBS641H mostrado en la fig. 4.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pT796H641L obtenido tal como se ha indicado anteriormente a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 9,16 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pBS641H obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 0,44 kb utilizando kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug de fragmento ApaI-NotI derivado del plásmido pT796H641L y 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI derivado del plásmido pBS641H, obtenido tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101, obteniendo el plásmido pT641 mostrado en la fig. 5.

(2) Construcción de un vector de expresión transitoria de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM871

Se construyó un vector de expresión transitoria para el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de la manera siguiente utilizando el vector de expresión transitoria pT641 para el anticuerpo anti-GD3 quimérico indicado en el punto 4(1) del Ejemplo 1 y los plásmidos phKM641H y phKM641L indicados en los puntos 3(2) y (3) del Ejemplo 1.

En primer lugar, se añadieron 3 \mug del plásmido phKM641H obtenido en el punto 3(2) del Ejemplo 1 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 0,44 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pT641 obtenido en el punto 4(1) del Ejemplo 1 y el plásmido pT641HCDR obtenido anteriormente a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento ApaI-NotI de aproximadamente 9,16 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI derivado del plásmido phKM641H y 0,1 \mug del fragmento ApaI-NotI derivado del plásmido pT641 a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricado por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101 para obtener el plásmido pT641HCDR mostrado en la fig. 6.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido phKM641L obtenido en el punto 3(3) del Ejemplo 1 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 0,39 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pT641 obtenido en el punto 4(1) del Ejemplo 1 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 9,20 kb derivado de cada plásmido utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI derivado del plásmido phKM641L y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI derivado del plásmido pT641, obtenido tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricado por Pharmacia). Además, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI derivado del plásmido phKM641L y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI derivado del plásmido pT641HCDR, obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasas de T4 Ready-To-Go (fabricado por Pharmacia). Utilizando cada una de las soluciones de plásmido ADN recombinante obtenidas de esta manera, se transformó E. coli HB101 para obtener los plásmidos pT641LCDR y pT641HLCDR mostrados en la fig. 7.

(3) Evaluación de actividad del anticuerpo anti-GD3 quimérico y del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR mediante expresión transitoria utilizando células animales

Se llevó a cabo la expresión transitoria de los anticuerpos utilizando el vector de expresión transitoria pT641 para el anticuerpo anti-GD3 quimérico, el vector de expresión transitoria pT641HLCDR para el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR y pT641LCDR para los anticuerpos anti-GD3 híbridos con regiones V de los anticuerpos de ratón e injertado con CDR humano, obtenidos en los puntos 4(1) y (2) del Ejemplo 1.

Se dispensaron células COS-7 (ATCC CRL 1651) en volúmenes de 2 ml a una densidad de 1x10^{5} células/ml en una placa de 6 pocillos (fabricada por Falcon) y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Mediante la adición de 2 \mug de cada vector de expresión a 100 \mul de medio OPTI-MEM (fabricado por GIBCO BRL) y añadiendo además una solución en la que se habían añadido 10 \mul de reactivo Lipofectamina (fabricado por GIBCO BRL) a 100 \mul del medio OPTI-MEM, se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 40 minutos con el fin de formar un complejo de ADN-liposoma. Las células COS-7 cultivadas durante la noche se lavaron dos veces con 2 ml de medio OPTI-MEM (fabricado por GIBCO BRL), se mezclaron con una solución preparada mediante la adición de 0,8 ml de medio OPTI-MEM a la solución que contenía complejo y se cultivaron a 37ºC durante 7 horas, la solución se descartó y después las células se mezclaron con 2 ml de medio DME que contenía FBS al 10% (fabricado por GIBCO BRL) y se cultivaron a 37ºC. Tras la introducción de cada vector de expresión, se recuperó el sobrenadante del cultivo 72 horas después y se realizó la concentración del mismo según necesidad, y después se midió la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 humanizado para GD3 (fabricado por DIA-IATRON) en el sobrenadante de cultivo mediante el procedimiento ELISA descrito en el punto 2 del Ejemplo 1, midiendo la concentración de anticuerpo anti-GD3 humanizado en el sobrenadante de cultivo mediante el procedimiento ELISA descrito en el punto 4, que se describirá a continuación, y mediante el cálculo de la actividad a partir de los valores medidos como actividad relativa (%), definiendo la actividad del anticuerpo anti-GD3 quimérico de control positivo en 100. Se muestran los resultados en la fig. 8. Tal como se muestra en la fig. 8, el anticuerpo anti-GD3 híbrido derivado del vector de expresión transitoria pT641HCDR (la cadena VH se deriva de un anticuerpo injertado con CDR humano y la cadena VL se deriva de un anticuerpo quimérico) mostró prácticamente la misma actividad ligante que la del anticuerpo anti-GD3 híbrido derivado del vector de expresión transitoria pT641, aunque el anticuerpo anti-GD3 híbrido derivado del vector de expresión transitoria pT641LCDR (la cadena VH se derivó de un anticuerpo quimérico y la cadena VL se derivó de un anticuerpo injertado con CDR humano) mostró una actividad ligante de aproximadamente 50% de la del anticuerpo anti-GD3 quimérico. Además, el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR derivado del vector de expresión transitoria pT641HLCDR mostró una actividad ligante de sólo aproximadamente 5% de la del anticuerpo anti-GD3 quimérico, mostrando una reducción considerable de la actividad.

Basándose en los resultados proporcionados anteriormente, la actividad ligante del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con cadenas VH y VL diseñados en el punto 3(1) del Ejemplo 1 se encuentra considerablemente reducida y se considera que la causa principal de reducción de la actividad se debe a VL, aunque debido a que aproximadamente 50% de la actividad se encuentra por su combinación con la cadena VH del anticuerpo anti-GD3 quimérico, se ha sugerido que existe un problema particularmente en la región de interacción con VH. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se intentó incrementar la actividad del anticuerpo modificando adicionalmente los residuos aminoácidos de la cadena VL en el punto 3(1) del Ejemplo 1.

(4) Medición de la concentración de anticuerpo humanizado en sobrenadante de cultivo de expresión transitoria mediante el procedimiento ELISA

Se dispensó en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para la utilización en ELISA (fabricado por Greiner) una solución (50 \mul) preparada diluyendo un anticuerpo anti-IgG (cadena \gamma) humano (fabricado por Medical & Biological Laboratories) 400 veces con PBS, y se dejó reaccionar a 4ºC durante la noche. Tras descartar la solución de anticuerpo, se añadieron 100 \mul/pocillo de BSA-PBS al 1%, y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para de esta manera bloquear los grupos activos restantes. Tras descartar el BSA-PBS al 1%, se añadieron 50 \mul/pocillo de los sobrenadantes de cultivo de expresión transitoria obtenidos en el punto 4(3) del Ejemplo 1 o de soluciones diluidas del anticuerpo anti-GD3 quimérico purificado KM871 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, cada pocillo se lavó con Tween-PBS y después se preparó una solución diluyendo anticuerpo de ratón anti-cadena L de anticuerpo \kappa humano marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed) 500 veces con PBS y añadiéndola a 50 \mul/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con Tween-PBS, se añadieron 50 \mul/pocillo de una solución de sustrato ABTS (una solución preparada mediante la disolución de 0,55 g de ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y la adición de 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de la utilización), para el desarrollo del color, y se midió la DO415.

5. Incremento de la actividad ligante mediante la modificación de residuos aminoácidos de la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR

Se incrementó la actividad ligante mediante la modificación de los residuos aminoácidos de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR en el punto 3(1) del Ejemplo 1 de la manera siguiente.

(1) Modificación de los residuos aminoácidos de la cadena VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR y construcción de ADNc codificante de VL modificado

En primer lugar, se identificaron los residuos aminoácidos situados en la región de interacción de VH y VL, y los residuos aminoácidos que se consideraba que ejercían una influencia sobre la estructura tridimensional de cada CDR de VL y que también eran diferentes de los residuos aminoácidos del anticuerpo de ratón en la cadena VL del anticuerpo humano injertado con CDR, a partir de modelos informáticos de las estructuras tridimensionales de diversos anticuerpos construidos en el punto 3(1) del Ejemplo 1. Como resultado, se identificaron la posición 7ª Ser, la posición 8ª Pro, la posición 12ª Ser, la posición 41ª Gly, la posición 44ª Pro, la posición 72ª Thr, la posición 77ª Ser, la posición 83ª Phe y la posición 87ª Tyr de hKM641L como la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR representado por la SEC ID nº 10. Mediante la sustitución de estos residuos aminoácidos por residuos aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón, se diseñaron 8 cadenas VL de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR modificado. Es decir, la posición 8ª Pro, la posición 12ª Ser, la posición 44ª Pro y la posición 87ª Tyr de la secuencia de aminoácidos hKM641L se sustituyeron respectivamente por Ala, Pro, Val y Phe en el caso de hKM641NL, y la posición 7º Ser, la posición 8ª Pro y la posición 12º Ser de la secuencia de aminoácidos hKM641L se sustituyeron respectivamente por Thr, Ala y Pro en el caso de hKM641Lm-1, la posición 87ª Tyr de la secuencia de aminoácidos hKM641L por Phe en el caso de hKM641Lm-4, la posición 41ª Gly y la posición 44ª Pro de la secuencia de aminoácidos hKM641L, respectivamente por Asp y Val en el caso de hKM641Lm-6, la posición 72ª Thr, la posición 77ª Ser y la posición 83ª Phe de la secuencia de aminoácidos hKM641L respectivamente por Ser, Asn e Ile en el caso de hKM641Lm-7, la posición 77ª Ser de la secuencia de aminoácidos de hKM641L por Asn en el caso de hKM641Lm-8, la posición 83ª Phe y la posición 87ª Tyr de la secuencia de aminoácidos hKM641L respectivamente por Ile y Phe en el caso de hKM641Lm-9, y la posición 41ª Gly, la posición 44ª Pro y la posición 83ª Phe de la secuencia de aminoácidos de hKM641L respectivamente por Asp, Val e Ile en el caso de hKM641Lm-69. De entre estas cadenas VL modificadas, se construyó ADNc codificante de cada una de 6 cadenas VL modificadas, excluyendo hKM641NL y hKM641Lm-69, de la manera indicada posteriormente, mediante mutagénesis asistida por PCR. Es decir, se sintetizaron los cebadores de ADN de cadena antisentido y de cadena sentido utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems) para introducir mutaciones, y se llevó a cabo una primera PCR siguiendo el procedimiento descrito en el punto 3(2) del Ejemplo 1, utilizando 1 ng del plásmido phKM641L como el molde y 0,5 \muM concentración final de cebador M13 RV (fabricado por Takara Shuzo) y la cadena antisentido del cebador de ADN y del cebador M13 M4 (fabricado por Takara Shuzo) y el cebador de ADN de cadena sentido. Se purificó cada una de las soluciones de reacción utilizando el kit de purificación por PCR QIAQuick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante mediante la elución con 20 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y después se llevó a cabo una segunda PCR utilizando 5 \mul de cada eluido siguiendo el procedimiento descrito en el punto 3(2) del Ejemplo 1. La solución de reacción se purificó utilizando el kit de purificación por PCR QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se introdujo en 30 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 0,39 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del producto PCR de cadena VL del anticuerpo anti-GD3 modificado injertado con CDR obtenido anteriormente y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del plásmido pBSL3 obtenido en el punto 3(3) del Ejemplo 1 a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101. Se produjo cada plásmido ADN a partir de 10 clones de los transformantes, se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, obteniendo un plásmido con ADNc al que se aplicó la modificación pretendida.

Específicamente, se obtuvo un plásmido phKM641Lm-1 con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 27 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 25 como el cebador de ADN cadena antisentido y el ADN sintético de SEC ID nº 26 como el cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-1 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 27.

Se obtuvo un plásmido phKM641Lm-4 que presenta la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 30 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 28 como cebador de ADN de cadena antisentido y el ADN sintético de la SEC ID nº 29 como cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-4 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 30.

Se obtuvo un plásmido phKM641Lm-6 con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 33 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 31 como el cebador de ADN de cadena antisentido y el ADN sintético de la SEC ID nº 32 como el cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-6 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 33.

Se obtuvo un plásmido phKM641Lm-7 con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 36 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 34 como el cebador de ADN de cadena antisentido y el ADN sintético de la SEC ID nº 35 como el cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-7 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 36.

Se obtuvo un plásmido phKM641Lm-8 con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 39 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 37 como el cebador de ADN de cadena antisentido y el ADN sintético de la SEC ID nº 38 como el cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-8 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 39.

Se obtuvo un plásmido phKM641Lm-9 con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 42 llevando a cabo una serie de las operaciones indicadas anteriormente utilizando el ADN sintético de la SEC ID nº 40 como el cebador de ADN de cadena antisentido y el ADN sintético de la SEC ID nº 41 como el cebador de ADN de cadena sentido. La secuencia hKM641Lm-9 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 42.

Entre las cadenas VL modificadas, se construyó el ADNc codificante de hKM641NL sintetizando 6 fragmentos de ADN sintético de secuencias SEC ID nº 17, 22 y 43 a 46 utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems) y llevando a cabo el procedimiento descrito en el punto 3(3) del Ejemplo 1 utilizando estos fragmentos. Como resultado, se obtuvo el plásmido phKM641NL con la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 47 en el que se realizó la modificación de interés. La secuencia hKM641NL como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 47.

De entre las cadenas VL modificadas, se construyó el ADNc codificante de hKM64Lm-69 de la manera siguiente, utilizando los plásmidos phKM641Lm-6 y phKM641Lm-9 que presentaban el ADNc de la cadena VL modificada obtenida tal como se ha indicado anteriormente.

En primer lugar, se añadieron 3 \mug del plásmido phKM641Lm-6 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y además se añadieron 10 unidades de los enzimas de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y PstI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,3 \mug de fragmento EcoRI-PstI de aproximadamente 0,30 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido phKM641Lm-9 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y además se añadieron 10 unidades de los enzimas de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y PstI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento EcoRI-PstI de aproximadamente 3,05 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-PstI derivado del plásmido phKM641Lm-6 y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-PstI derivado del plásmido phKM641Lm-9, ambos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli HB101, obteniendo el plásmido phKM641Lm-69 mostrado en la fig. 9. La reacción se llevó a cabo utilizando 10 \mug del plásmido obtenido de esta manera, siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después la mezcla resultante se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, y como resultado, se confirmó que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 48 en el que se llevó a cabo la modificación de interés. La secuencia hKM641Lm-69 como secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos también se encuentra representada por la SEC ID nº 48.

(2) Construcción de vector de expresión transitoria para los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR que presentan VL modificada

Se construyeron vectores de expresión transitoria para los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR que presentaban diversas cadenas VL modificadas, de la manera siguiente, utilizando los plásmidos con las moléculas de ADNc codificantes de diversas VL modificadas, obtenidas en el punto 5(1) del Ejemplo 1, y el vector de expresión transitoria pT641HCDR para los anticuerpos anti-GD3 híbridos obtenidos en el punto 4(2) del Ejemplo 1.

En primer lugar, se añadieron 3 \mug de cada uno de los plásmidos phKM641NL, phKM641Lm-1, phKM641Lm-4, phKM641Lm-6, phKM641Lm-7, phKM641Lm-8, phKM641Lm-9 y phKM641Lm-69 obtenidos en el punto 5(1) del Ejemplo 1, a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y BSA 100 \mug/ml, y además se añadieron 10 unidades de los enzimas de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) y SplI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 0,2 \mug de fragmento EcoRI-SplI de aproximadamente 0,39 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug de cada uno de los fragmentos EcoRI-SplI obtenidos de esta manera de diversas VL modificadas, y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SplI del vector de expresión transitoria pT641HCDR para el anticuerpo anti-GD3 híbrido obtenido en el punto 4(2) del Ejemplo 1, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando las soluciones respectivas de plásmido ADN recombinante obtenidas de esta manera, se transformó E. coli HB101, obteniendo los vectores de expresión transitoria para los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR que presentan diversas VL modificadas, pT641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT64HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 y pT641HLCDRLm69, mostrados en la fig. 10.

(3) Evaluación de la actividad de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR que presenta VL modificadas, mediante expresión transitoria utilizando células animales

Se llevó a cabo la expresión transitoria y evaluación de la actividad de cada anticuerpo siguiendo el procedimiento descrito en el punto 4(3) del Ejemplo 1 utilizando el vector de expresión transitoria pT641 para el anticuerpo anti-GD3 quimérico y el vector de expresión transitoria p5641HLCDR para el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR, ambos obtenidos en el punto 4(2) del Ejemplo 1, y los vectores de expresión transitoria p5641HLCDRNL, pT641HLCDRLm-1, pT641HLCDRLm-4, pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-8, pT641HLCDRLm-9 y
pT641HLCDRLm-69, para los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR que presentan diversas VL modificadas, obtenidos en el punto 5(2) del Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la fig. 11. Tal como se muestra en la fig. 11, los anticuerpos anti-GD3 modificados injertados con CDR derivados de los vectores de expresión transitoria pT641HLCDRLm-6, pT641HLCDRLm-7, pT641HLCDRLm-9 y pT641HLCDRLm-69, mostraron una actividad ligante incrementada en comparación con los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR antes de la modificación, particularmente el anticuerpo anti-GD3 modificado injertado con CDR derivado del vector de expresión transitoria pT641HLCDRLm-69 mostró una actividad ligante de aproximadamente 80% de la del anticuerpo anti-GD3 quimérico. Por otra parte, los anticuerpos anti-GD3 modificados injertados con CDR derivados de otros vectores de expresión transitoria no mostraron ningún incremento de la actividad ligante en comparación con los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR antes de la modificación. Basándose en estos resultados, se descubrió que, entre los residuos aminoácidos modificados de VL identificados en el punto 5(1) del Ejemplo 1, la posición 41ª, 44ª, 83ª y 87ª de residuos aminoácidos contribuyen en gran medida al incremento de la actividad ligante. También se descubrió que la sustitución simultánea de los dos residuos aminoácidos en las posiciones 41ª y 44ª, o en las posiciones 83ª y 87ª, contribuyen al incremento sinérgico de la actividad, y la modificación simultánea de los cuatro residuos aminoácidos de las posiciones 41ª, 44ª, 83ª y 87ª también contribuyen al incremento sinérgico de la actividad. Basándose en modelos informáticos de las estructuras tridimensionales de las regiones V de diversos anticuerpos construidos en el punto 3(1) del Ejemplo 1, se sugirió que los residuos aminoácidos de las posiciones 41ª y 44ª ejercen influencia sobre la interacción con VH, y que las posiciones 83ª y 87ª ejercen influencia sobre la estructura tridimensional de CDR3 de VL, y se consideró que la estructura tridimensional de un anticuerpo en su globalidad se mantiene convenientemente modificando dichos residuos aminoácidos por residuos aminoácidos presentes en un anticuerpo de ratón y, como resultado, se incrementa su actividad ligante. Esta información muestra que resulta necesario considerar también las regiones de interacción de VH y VL durante la preparación de anticuerpos humanos injertados con CDR y que resulta necesario llevar a cabo diversos exámenes durante la identificación de estas regiones de interacción basándose en las estructuras tridimensionales de las regiones V de los anticuerpos. Con respecto a estas regiones de interacción, resulta fácil inferir que son diferentes en cada anticuerpo individual y que resulta difícil encontrar una ley general en la actualidad, por lo que resulta necesario llevar a cabo ensayos de prueba y error de la respuesta de cada anticuerpo de interés.

6. Expresión estable de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR utilizando células animales

Basándose en los resultados descritos en el punto 5(3) del Ejemplo 1, se sugirió que los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR derivados de vectores de expresión transitoria pT641HLCDRLm-9 y pT641HLCDRLm-69 presentan una actividad ligante de aproximadamente 20% y 80% para GD3 respectivamente, comparado con los anticuerpos anti-GD3 quiméricos. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, con el fin de evaluar la actividad de dichos anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR con mayor detalle, se obtuvieron líneas celulares transformadas que pueden expresar establemente anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR mediante el procedimiento siguiente, y se llevó a cabo la purificación de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR a partir de sobrenadantes de cultivo de las líneas celulares transformadas. Además, a título comparativo, se llevó a cabo de la misma manera la expresión estable y la purificación del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR derivado del vector de expresión transitoria pT641HLCDR.

(1) Construcción del vector de expresión estable para el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR

Se construyeron vectores de expresión estable mediante la introducción de un gen de resistencia contra un agente G418 y el gen dhfr en diversos vectores de expresión transitoria construidos en el punto 5(2) del Ejemplo 1.

En primer lugar, se añadieron 3 \mug del vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 descrito en la patente WO 97/10354 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción XhoI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 1 \mug de fragmento BamHI-XhoI de aproximadamente 8,68 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

\newpage

A continuación, se añadieron 3 \mug de cada uno de los vectores de expresión transitoria, pT641HLCDRLm-9, pT641HLCDRLm-69 y pT641HLCDR a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y se además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), enzima de restricción XhoI (fabricado por Takara Shuzo) y enzima de restricción StuI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 1 \mug de fragmento BamHI-XhoI de aproximadamente 4,90 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento BamHI-XhoI derivado del plásmido pKANTEX93 y 0,1 \mug del fragmento BamHI-XhoI derivado de cada uno de los vectores de expresión transitoria, obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 20 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4 Ready-To-Go (fabricada por Pharmacia). Utilizando cada una de las soluciones de plásmido ADN recombinante obtenidas de esta manera, se transformó E. coli HB101 para obtener los vectores de expresión estable de anticuerpo anti-GD3 injertados con CDR pKANTEX641HLCDRLm-9, pKANTEX641HLCDRLm-69 y pKANTEX641HLCDR, mostrados en la fig. 12.

(2) Expresión estable de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR utilizando células animales

Utilizando los diversos vectores de expresión estable para los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR obtenidos en el punto 6(1) del Ejemplo 1, se llevó a cabo la expresión de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR en células animales de la manera siguiente.

Cada uno de los vectores de expresión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR (4 \mug) se introdujo en 4x10^{6} células de la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662) mediante el procedimiento de electroporación (Cytotechnology 3:133, 1990), y las células se suspendieron en 40 ml de RPMI1640-FBS (19) (medio RPMI1640 que contiene 10% de suero de feto bovino (FBS)) y se dispensaron 200 \mul/pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo Bakelite). Tras cultivar a 37ºC durante 24 horas en un incubador de 5% de CO_{2}, se añadió G418 para proporcionar una concentración de 0,5 mg/ml, seguido de cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperaron sobrenadantes de cultivo de los pocillos en los que se habían formado colonias de transformantes que mostraban resistencia a G418 y que habían confluido, y se midió la actividad ligante a antígeno de diversos anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR en los sobrenadantes mediante la ELISA mostrada en el punto 2 del Ejemplo 1 (se utilizó un anticuerpo IgG(\gamma) antihumano de cabra marcado con peroxidasa como el anticuerpo secundario).

Con respecto a los transformantes de los pocillos en los que se detectó expresión de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de expresión de anticuerpo utilizando un sistema de amplificación del gen dhfr, se suspendieron en el medio RPMI1640-FBS(10) que contenía 0,5 mg/ml de G418 y metotrexato 50 nM (en adelante denominado "MTX", fabricado por Sigma) como inhibidor del producto del gen dhfr, dihidrofolato reductasa (en adelante denominado "DHFR"), proporcionando una densidad de 1 a 2x10^{5} células/ml, y se dispensaron en volúmenes de 2 ml en una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Mediante el cultivo a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador de 5% de CO_{2}, se indujeron transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM. Al alcanzar la confluencia los transformantes, se midió la actividad ligante de antígeno de diversos anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR en los sobrenadantes mediante la ELISA mostrada en el punto 2 del Ejemplo 1. Con respecto a los transformantes de los pocillos en los que se detectó expresión de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR en los sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM mediante un procedimiento similar al anterior, y finalmente se obtuvieron transformantes capaces de crecer en el medio RPMI1640-FBS(10) que contenía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM, y de elevada expresión de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR. Con respecto a los transformantes obtenidos de esta manera, se llevó a cabo el aislamiento de células individuales (clonación) dos veces mediante análisis de dilución limitante. Los clones de células transformadas obtenidos mediante la introducción de los vectores de expresión estable pKANTEX641HLCDRLm-9, pKANTEX641HLCDRLm-69 y pKANTEX641HLCDR se denominaron KM8870, KM8871 y KM8869, respectivamente, y los niveles de expresión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR de los clones de células transformadas fueron de aproximadamente 5 \mug/10^{6} células/24 horas, aproximadamente 10 \mug/10^{6} células/24 horas y aproximadamente 30 \mug/10^{6} células/24 horas, respectivamente.

(3) Purificación de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR a partir de filtrado de cultivo

Se suspendió en medio GIT (fabricado por Nippon Pharmaceutical) que contenía MTX 200 nM cada uno de los clones de células transformadas KM8870, KM8871 y KM8869, obtenidos en el punto 6(2) del Ejemplo 1, que expresaban diversos anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR, proporcionando una densidad de 1 a 2x10^{5} células/ml, y se dispensaron en volúmenes de 200 ml en matraces de 175 cm^{2} (fabricados por Greiner). Las células se cultivaron a 37ºC durante 5 a 7 días hasta la confluencia y después se recuperaron los sobrenadantes de cultivo. Se purificó cada anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricado por Bioprocessing) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron aproximadamente 3 mg del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8870 a partir de 500 ml del sobrenadante de cultivo de KM8870, y aproximadamente 25 mg del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 a partir de 1.600 ml del sobrenadante de cultivo de KM8871 y aproximadamente 65 mg del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8869 a partir de 1.000 ml del sobrenadante de cultivo de KM8869. Se sometieron a electroforesis aproximadamente 4 \mug de cada uno de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR obtenidos de esta manera siguiendo el procedimiento conocido (Nature 227:680, 1970) con el fin de examinar el peso molecular y el grado de purificación. Se muestran los resultados en la fig. 13. Tal como se muestra en la fig. 13, el peso molecular de cada anticuerpo anti-GD3 purificado injertado con CDR era de aproximadamente 150 kilodaltons (en adelante denominado "Kd") bajo condiciones no reductoras, y se identificaron dos bandas de aproximadamente 50 Kd y aproximadamente 25 Kd bajo condiciones reductoras. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos del ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd, cadena L: aproximadamente 24 Kd, molécula completa: aproximadamente 146 Kd) y también coincidieron con los informes de que el anticuerpo de tipo IgG presenta un peso molecular de aproximadamente 150 Kd bajo condiciones no reductoras y resulta degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 Kd y en cadenas L con un peso molecular de aproximadamente 25 Kd bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace disulfuro (en adelante denominado "enlace S-S") en la molécula (Antibodies: A Laboratory Manual, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), de manera que se confirmó que cada anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR se expresaba en forma de molécula de anticuerpo de estructura correcta. Además, al analizar las secuencias N-terminales de aminoácidos de las cadenas H y L de cada uno de los anticuerpos anti-GD3 purificados injertados con CDR mediante degradación Edman utilizando un secuenciador de proteínas (470A, fabricado por Applied Biosystems), se confirmó que coincidían con las secuencias N-terminales de aminoácidos de las cadenas H y L deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos respectivas de ADNc.

7. Evaluación de actividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR (1) Reactividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con GD3 (ELISA)

Se midió la reactividad con GD3 (fabricado por DIA-IATRON) de los anticuerpos anti-GD3 purificados injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 mediante la ELISA mostrada en el punto 2 del Ejemplo 1. La fig. 14 muestra el resultado del examen de reactividad llevado a cabo fijando la cantidad de GD3 que debía adsorberse en cada pocillo de una placa de ELISA en 20 pmoles/pocillo y modificando la concentración añadida de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871. Tal como se muestra en la fig. 14, entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR, KM8871 mostró la actividad ligante más elevada, que era aproximadamente 1/2 de la del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871. La fig. 15 muestra el resultado del examen de la reactividad de una concentración constante (10 \mug/ml) de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871, llevado a cabo modificando la cantidad de GD3 que debía adsorberse a cada pocillo de una placa para la utilización en una ELISA. Tal como se muestra en la fig. 15, entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR, KM8871 mostró la actividad ligante más alta, equivalente a la del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871. La fig. 16 muestra el resultado del examen de la reactividad de una concentración constante (10 \mug/ml) de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871, llevado a cabo mediante la modificación del tipo de gangliósido que debía adsorberse a cada pocillo de una placa para la utilización en una ELISA (cantidad de adsorción: 20 pmoles/pocillo). Se utilizó un total de 11 tipos de gangliósido: GM1, N-acetil-GM2 (fabricado por Boehringer Mannheim, en adelante denominado "AcGM2"), N-glicolil-GM2 (en adelante denominado "GcGM2"), N-acetil-GM3 (en adelante denominado "AcGM3"), N-glicolil-GM3 (en lo sucesivo denominado "GcGM3"), GD1a y GD1b (fabricados por DIA-IATRON), GD2 y GD3 (fabricados por DIA-IATRON) GQ1b (fabricado por DIA-IATRON) y GT1b (fabricado por Funakoshi). En este caso, se purificaron GM1 y GD1a a partir de cerebro bovino, y N-glicolil-GM2 y N-glicolil-GM3 a partir de hígado de ratón, N-acetil-GM3 a partir de eritrocito canino y GD2 a partir de la línea celular de cultivo de neuroblastoma humano IMR32 (ATCC CCL 127), respectivamente, siguiendo el procedimiento conocido (J. Biol. Chem. 263:10915, 1988). Tal como se muestra en la fig. 16, cada uno de entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 se unen fuertemente a GD3 y débilmente a GQ1b, de manera similar al caso del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871, pero no se unieron a otros gangliósidos. De esta manera, se demostró que mantienen la especificidad de unión del anticuerpo quimérico KM871.

(2) Reactividad del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con las células humanas de cáncer (procedimiento de inmunofluorescencia)

La reactividad de los anticuerpos anti-GD3 purificados injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 con las células humanas de cáncer se midió de la manera siguiente. Es decir, se suspendieron 1x10^{6} células de cada una de las líneas celulares de cultivo de melanoma humano G-361 (ATCC CRL 1424) y SK-MEL-28 (ATCC HTB72) en PBS, se introdujeron en microtubos y se centrifugaron (2.000 rpm durante 2 minutos), y las células lavadas de esta manera se agitaron tras añadir 50 \mul del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 o los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 o KM8871 (solución ajustada a 5 \mug/ml con BSA-PBS al 1%) y después se dejaron reaccionar a 4ºC durante 1 hora. Tras la reacción, seguido de centrifugación tres veces con PBS para el lavado, se añadieron 20 \mul de solución de F(ab')_{2} de IgG (H+L) antihumano de conejo (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, utilizada diluyendo 30 veces con BSA-PBS al 1%) marcada por fluorescencia con isotiocianato de fluoresceína (en adelante denominada "FITC"), seguido de agitación, y después se llevó a cabo la reacción a 4ºC durante 1 hora. Tras la reacción, seguido de centrifugación tres veces con PBS para el lavado, las células se suspendieron nuevamente en PBS para llevar a cabo el análisis utilizando un citómetro de flujo EPICS Elite (fabricado por COULTER). Como control, el análisis se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento pero sin añadir anticuerpos. Se muestran los resultados en la fig. 17. Tal como se muestra en la fig. 17, la totalidad de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 mostraron reactividad con ambas líneas celulares. Entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR, KM8871 mostró la reactividad más fuerte. Los resultados anteriores demuestran que los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR resultan útiles en el diagnóstico, tratamiento y similar de los tumores humanos GD3-positivos, incluyendo el melanoma.

(3) Actividad citotóxica in vitro de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR (actividad CDC)

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los anticuerpos anti-GD3 purificados injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871, se midió la actividad CDC mediante el procedimiento siguiente.

a. Preparación de suspensión celular diana

Se cultivó cada una de las líneas celulares de cultivo de melanoma humano G-361 (ATCC CRL 1424) y SK-MEL-28 (ATCC HTB72) en medio RPMI1640-FBS(10) y se ajustaron a 5x10^{6} células, y las células se marcaron isotópicamente mediante la adición de 3,7 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na_{2}^{51}CrO_{4}, llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces mediante suspensión en medio RPMI1640-FBS(10), centrifugación y resuspensión en el medio, y después se incubaron en hielo a 4ºC durante 30 minutos para liberar espontáneamente de esta manera la sustancia radioactiva. Tras centrifugar, el precipitado se ajustó a 1x10^{6} células/ml mediante la adición de 5 ml de medio RMPI1640-FBS(10) y se utilizó como la suspensión celular diana.

b. Preparación de solución de complemento

Se mezclaron sueros de tres personas sanas y se utilizaron como la fuente humana del complemento. En el momento de su utilización, se diluyó hasta el 15% v/v con medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como la solución de complemento.

c. Medición de la actividad CDC

A cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon), se añadieron 50 \mul de la suspensión celular diana preparada en "a" (5x10^{4} células/pocillo), y después se añadió el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 o el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8869, KM8870 o KM8871, proporcionando una concentración final de 0,05 a 50 \mug/ml y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la reacción, la placa se centrifugó para eliminar el sobrenadante, y se añadieron a la misma 150 \mul de la solución de complemento humano preparada en "b" y se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Tras la centrifugación, se midió la cantidad de ^{51}Cr liberado en el sobrenadante con un contador \gamma. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento pero utilizando el medio solo en lugar de la solución de anticuerpo y la solución de complemento, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento y añadiendo medio solo en lugar de la solución de anticuerpo, e hidróxido sódico 5 N en lugar de la solución de complemento, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad CDC utilizando la ecuación siguiente:

3

Se muestran los resultados en la fig. 18. Tal como se muestra en la fig. 18, se encontró que la totalidad de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 mostraban actividad CDC para ambas líneas celulares, mostrando particularmente una actividad citotóxica notablemente fuerte para la línea celular G-361 de cultivo de melanoma humano. De entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR, KM8871 mostró la actividad citotóxica más fuerte, que era aproximadamente 1/3 de la del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871.

(4) Actividad citotóxica in vitro del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDC (actividad ADCC)

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los anticuerpos anti-GD3 purificados injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871, se midió la actividad ADCC mediante el procedimiento siguiente.

a. Preparación de suspensión celular diana

Cada una de las líneas celulares de cultivo de melanoma humano G-361 (ATCC CRL 1424) y SK-MEL-28 (ATCC HTB72) se cultivó en medio RPMI1640-FBS(10) y se ajustó a 1x10^{6} células, y las células se marcaron isotópicamente mediante la adición de 1,85 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na_{2}^{51}CrO_{4} y llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces mediante suspensión en medio RPMI1640-FBS(10) y centrifugación, resuspensión en el medio y después incubando en hielo a 4ºC durante 30 minutos para liberar espontáneamente de esta manera la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, el precipitado se ajustó a 2x10^{5} células/ml mediante la adición de 5 ml de medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como la suspensión celular diana.

b. Preparación de suspensión de células efectoras

Se recolectó sangre venosa humana sana (50 ml) y se añadieron suavemente a la misma 0,5 ml de heparina sódica (fabricada por Takeda Pharmaceutical). La mezcla resultante se centrifugó (1.500 a 1.800 x g durante 30 minutos) utilizando Polymorphprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) siguiendo las instrucciones del fabricante para separar una capa de células mononucleares. Las células separadas se centrifugaron tres veces (1.500 a 1.800 x g durante 5 minutos) con medio RPMI1640-FBS(10) y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 5x10^{6} células/ml destinada a la utilización como suspensión de células efectoras.

c. Medición de la actividad CDC

En cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon) se dispensaron 50 \mul de la suspensión celular diana preparada en "a" (1x10^{4} células/pocillo). A continuación, se añadieron 100 \mul de la suspensión de células efectoras preparada en "b" (5x10^{5} células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana es de 50:1). Después, se añadieron cada uno de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871, proporcionando una concentración final de 0,05 a 50 \mug/ml y se dejaron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Tras la reacción, la placa se centrifugó y se midió la cantidad de ^{51}cr en el sobrenadante utilizando un contador \gamma. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento pero utilizando el medio solo en lugar de la suspensión de células efectoras y solución de anticuerpo, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento pero añadiendo el medio solo en lugar de la solución de anticuerpo, e hidróxido sódico 5 N en lugar de la suspensión de células efectoras, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad ADCC utilizando la ecuación siguiente:

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Se muestran los resultados en la fig. 19. Tal como se muestra en la fig. 19, se encontró que la totalidad de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871 mostraban fuerte actividad ADCC para ambas líneas celulares. No se encontraron diferencias de actividad citotóxica entre el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR KM8869, KM8870 y KM8871.

Los resultados anteriores demuestran que los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR resultan útiles en el diagnóstico, tratamiento y similar de los tumores humanos GD3-positivos, de manera similar al anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871. Además, se espera que la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR sea reducida en el ser humano y que se prolongue adicionalmente su efecto.

El clon de células transformadas KM8871 capaz de producir KM8871 que mostró la actividad más alta de entre los anticuerpos anti-GD3 injertados con CDR fue depositado el 22 de julio de 1999 como FERM BP-6790 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón).

Ejemplo 2 Preparación de proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR con citoquina humana

A título de ejemplo de proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR y citoquina humana, se preparó una proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 e IL-2 humana, KM8871-hIL-2, de la manera siguiente y se llevó a cabo una evaluación de la actividad.

1. Construcción de ADNc codificante de proteína de fusión de hC\gamma1 con hIL-2 (1) Construcción del plásmido pBS\DeltahC\gamma1-IL-2 que presenta un ADNc que comprende aproximadamente 65 bases de ADNc 3'-terminal de hC\gamma1 y ADNc de longitud completa de hIL-2 de tipo maduro

Se añadió un plásmido pBluescript SK(-) (3 \mug, fabricado por Stratagene) a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 2,95 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se sintetizaron fragmentos sintéticos de ADN que presentaban respectivamente las secuencias de nucleótidos representadas por las secuencias SEC ID nº 49 y nº 50 utilizando un sintetizador automático de ADN (380A, fabricado por Applied Biosystems). Se añadieron 0,3 \mug de cada uno de los fragmentos sintéticos de ADN obtenidos de esta manera a 15 \mul de agua estéril y se calentaron a 65ºC durante 5 minutos. Tras dejar reposar la solución de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, se mezcló con 2 \mul de una solución tampón 10x (Tris-HCl 500 mM, (pH 7,6), cloruro de magnesio 100 mM, DTT 50 mM) y 2 \mul de ATP 10 mM y se mezcló además con 10 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (fabricada por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 30 minutos, para fosforilar de esta manera el extremo 5'-terminal.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI derivado del plásmido pBluescript SK(-) y 0,05 \mug del ADN sintético fosforilado, ambos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó la línea DH5\alpha de E. coli (fabricada por Stratagene), obteniendo el plásmido pBSA-B mostrado en la fig. 20. El plásmido obtenido de esta manera (10 \mug) se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, y como resultado, se confirmó que se había obtenido un plásmido en el que se había clonado el ADN de interés.

Seguidamente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBSA-B obtenido de esta manera a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-Acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 0,5 mM y BSA 100 \mug/ml, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción SmaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento EcoRI-SmaI de aproximadamente 3,00 kb mediante la utilización del kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después, se llevó a cabo la PCR siguiente utilizando el plásmido pILL4 que contenía ADNc de longitud completa de hIL-2 de tipo maduro (Agric. Biol. Chem. 51:1135, 1987) como molde. Se añadió el plásmido pILL4 (1 ng) a 100 \mul de solución de reacción (1 x concentración de tampón Ex Taq (fabricado por Takara Shuzo), dNTPs 200 \muM, cebador rev1 1,0 \muM (SEC ID nº 51), cebador fw2 1,0 \muM (SEC ID nº 52) y 2,5 unidades de ADN polimerasa Ex Taq TaKaRa (fabricado por Takara Shuzo)), y la solución se cubrió con 100 \mul de aceite mineral y se introdujo en un ciclador térmico de ADN (PJ480, fabricado por Perkin Elmer), llevando a cabo la reacción a 94ºC durante 3 minutos, después 30 ciclos de cada ciclo a 96ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y finalmente 72ºC durante 7 minutos. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 30 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 0,5 mM y BSA 100 \mug/ml, y se mezcló adicionalmente con 10 unidades de enzima de restricción SmaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 1 \mug de fragmento EcoRI-SmaI de aproximadamente 0,41 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SmaI obtenido de esta manera del plásmido pBSA-B y 0,1 \mug del fragmento EcoRI-SmaI del producto PCR del ADNc de longitud completa de hIL-2 de tipo maduro a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli DH5\alpha. Se preparó cada plásmido ADN a partir de 10 clones de los transformantes, se dejaron reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas en el kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometieron a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos del ADNc insertado, y como resultado, se obtuvo el plásmido pBS\DeltahC\gamma1-IL-2 mostrado en la fig. 21 que presentaba la secuencia de nucleótidos de interés.

(2) Construcción de un plásmido pBShC\gamma1-IL-2 que presenta un ADNc que comprende ADNc de longitud completa de hC\gamma1 y ADNc de longitud completa de hIL-2 de tipo maduro

En primer lugar, se añadieron 3 \mug del plásmido pBShC\gamma1 descrito en la solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 257893/98 a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y se mezcló además con 10 unidades del enzima de restricción EcoT22I (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 1 \mug de fragmento ApaI-EcoT22I de aproximadamente 0,92 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Seguidamente, se añadieron 3 \mug del plásmido pBS\DeltahC\gamma1-IL-2 obtenidos en el punto 1(1) del Ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro sódico 100 mM, y además se mezcló con 10 unidades de enzima de restricción EcoT22I (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de un fragmento ApaI-EcoT22I de aproximadamente 3,40 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-EcoT22I de pBShC\gamma1 obtenido de esta manera y 0,1 \mug de ApaI-EcoT22I de pBS\DeltahC\gamma1-IL-2 a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli DH5\alpha, obteniendo el plásmido pBShC\gamma1-IL-2 mostrado en la fig. 22. El plásmido obtenido de esta manera (10 \mug) se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos del ADNc insertado, y como resultado, se confirmó que se había obtenido un plásmido que presentaba la secuencia de nucleótidos de interés.

2. Expresión estable de KM8871-hIL-2 utilizando células animales (1) Construcción del vector de expresión estable para KM8871-hIL-2

Se construyó un vector de expresión estable para KM8871-hIL-2 de la manera siguiente, utilizando el vector pKANTEX641HLCDRLm-69 obtenido en el punto 6(1) del Ejemplo 1 para la expresión estable del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 y el plásmido pBShC\gamma1-IL-2 obtenido en el punto 1(2) del Ejemplo 2 que presentaba el ADNc codificante de la proteína de fusión de hC\gamma1 y hIL-2.

Se añadió el plásmido pKANTEX641HLCDRLm-69 (3 \mug) obtenido en el punto 6(1) del Ejemplo 1 a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 12,57 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante).

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pBShC\gamma1-IL-2 obtenido en el punto 1(2) del Ejemplo 2 a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y la solución se mezcló además con 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 1,45 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante).

Seguidamente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pKANTEX641HLCDRLm-69 obtenido de esta manera y 0,1 \mug de fragmento ApaI-BamHI del plásmido pBShC\gamma1-IL-2 a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli DH5\alpha, obteniendo el vector pKANTEX8871-hIL2 de expresión estable de KM8871-hIL-2 mostrado en la fig. 23. El plásmido obtenido de esta manera (10 \mug) se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, y como resultado, se confirmó que se había obtenido un plásmido en el que se había clonado el ADN de interés.

(2) Expresión de KM8871-hIL-2 en células animales

Utilizando 4 \mug del vector pKANTEX8871-hIL-2 de expresión estable de KM8871-hIL-2 obtenido en el punto 2(1) del Ejemplo 2, se transformaron células YB2/0 (ATCC CRL 1581) siguiendo el procedimiento descrito en el punto 6(2) del Ejemplo 1, y se llevó a cabo selección finalmente con G418 (0,5 mg/ml) y MTX (200 nM) para obtener el clon de células transformadas KM8871hIL2, que mostraba un nivel de expresión de aproximadamente 4 \mug/10^{6} células/24 horas. Además, KM8871hIL2 fue depositado el 22 de julio de 1999 con número FERM BP-6791 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón).

(3) Purificación de KM8871-hIL-2 a partir de sobrenadantes de cultivo

Siguiendo el procedimiento descrito en el punto 6(3) del Ejemplo 1, se cultivó el clon de células transformadas KM8871hIL2 obtenido en el punto 2(2) del Ejemplo 2 capaz de expresar KM8871-hIL-2, obteniendo aproximadamente 10,0 mg de KM8871-hIL-2 purificado a partir de aproximadamente 3 litros de sobrenadante de cultivo. Se muestra el resultado del SDS-PAGE de KM8871-hIL-2 purificado en la fig. 24. Tal como se muestra en la fig. 24, el peso molecular del KM8871-hIL-2 purificado era de aproximadamente 180 Kd bajo condiciones no reductoras, y se encontraron dos bandas de aproximadamente 65 Kd y aproximadamente 25 Kd bajo condiciones reductoras. Estos pesos moleculares prácticamente coincidían con los pesos moleculares deducidos a partir de las secuencias de nucleótidos del ADNc de la cadena H de KM8871-hIL-2 y de hIL-2 y de la cadena L (cadena H y hIL-2: aproximadamente 64 Kd, cadena L: aproximadamente 24 Kd; molécula completa: aproximadamente 176 Kd), y se confirmó que la estructura de molécula de anticuerpo se mantenía tras la fusión de hIL-2.

3. Evaluación de la actividad de KM8871-hIL-2 (1) Reactividad de KM8871-hIL-2 con GD3 (procedimiento ELISA)

Se midió la reactividad con GD3 de KM8871-hIL-2 purificado (fabricado por DIA-IATRON) siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2 del Ejemplo 1. En este caso se utilizó un anticuerpo IgG (H & L) antihumano de cabra marcado con peroxidasa (fabricado por American Qualex, utilizado tras diluir 3.000 veces con BSA-PBS al 1%) como la solución de anticuerpo secundario. La fig. 25 muestra el resultado del examen de reactividad llevado a cabo fijando la cantidad de GD3 que debía adsorberse a cada pocillo de una placa para ELISA en 20 pmoles/pocillo y modificando la concentración de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 y de KM8871-hIL-2 que debía añadirse. Tal como se muestra en la fig. 25, se encontró que KM8871-hIL-2 presentaba una actividad ligante de GD3 similar o superior a la del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871. La fig. 26 muestra el resultado del examen de la reactividad de una concentración constante (10 \mug/ml) de anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 y de KM8871-hIL-2, llevado a cabo modificando los tipos de gangliósido que debían adsorberse a cada pocillo de una placa para la utilización en ELISA (cantidad de adsorción: 20 pmoles/pocillo). Tal como se muestra en la fig. 26, se encontró que KM8871-hIL-2 se une fuertemente a GD3, de manera similar al caso del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871, y se ha observado que KM8871-hIL-2 también se une fuertemente a GD2. Puede considerarse como causa de la reactividad cruzada de KM8871-hIL-2 con GD2, una posibilidad de la unión de hIL-2 a GD2, así como una posibilidad del cambio de especificidad de unión causado por una modificación de la estructura tridimensional de la región V del anticuerpo debido a la fusión a hIL2, un cambio de la reactividad del anticuerpo secundario causada por una modificación de la estructura tridimensional de la región C del anticuerpo debido a la fusión de hIL2, y similares.

(2) Reactividad de KM8871-hIL-2 con GD3 de superficie celular (procedimiento de inmunofluorescencia)

Se midió la reactividad de KM8871-hIL-2 purificado con células humanas de cáncer siguiendo el procedimiento descrito en el punto 7(2) del Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la fig. 27. Tal como se muestra en la fig. 27, KM8871-hIL-2 mostró una fuerte reactividad con la línea de cultivo celular de melanoma humano G361, que era prácticamente idéntica a la del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871. Este resultado demuestra que KM8871-hIL-2 resulta útil en el tratamiento y similares de los tumores humanos GD3-positivos, incluyendo el melanoma.

(3) Evaluación de la actividad hIL-2 de KM8871-hIL-2

Se midió la actividad de KM8871-hIL-2 purificado como hIL-2 siguiendo el procedimiento siguiente. Se suspendió la línea de células T de ratón CTLL-2 (ATCC TIB214), cuyo crecimiento depende de la concentración de hIL-2, en medio RPMI1640-FBS(10) a una densidad de 2x10^{5} células/ml y se dispensó en una cantidad de 50 \mul/pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo Bakelite). Se añadió una solución (50 \mul) preparada mediante la dilución de hIL-2 (fabricado por R & D SYSTEMS) o KM8871-hIL-2 purificado a diversas concentraciones con medio RPMI1640-FBS(10) a cada pocillo y se cultivó a 37ºC durante 30 horas en un incubador de 5% de CO_{2}. Tras el cultivo, se realizó un recuento del número de células intactas utilizando el kit de recuento celular (fabricado por Dojindo Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se muestran los resultados en la fig. 28. Tal como se muestra en la fig. 28, KM8871-hIL-2 mostró una actividad biológica de soporte al crecimiento de CTLL-2 similar a la de hIL-2. Estos resultados demuestran que la actividad de KM8871-hIL-2 como hIL-2 se mantuvo constante tras su fusión con el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871.

(4) Activación de células efectoras humanas e incremento de la actividad citotóxica por KM8871-hIL-2

Con el fin de evaluar la activación de las células efectoras humanas y el incremento concurrente de actividad citotóxica por parte del fragmento hIL-2 de KM8871-hIL-2 in vitro, se midió la actividad citotóxica mediante el procedimiento siguiente.

a. Preparación de suspensión celular diana

Siguiendo el procedimiento descrito en "a" del punto 7(4) del Ejemplo 1, se ajustó la línea de cultivo celular de melanoma humano G-361 a una densidad de 2x10^{5} células/ml y se utilizó como la suspensión celular diana.

b. Preparación de suspensión de células efectoras humanas

Siguiendo el procedimiento descrito en "b" del punto 7(4) del Ejemplo 1, se separaron las células mononucleares de la sangre venosa de una persona sana y se resuspendieron a una densidad de 5x10^{6} células/ml para utilizarlas como la suspensión de células efectoras.

c. Activación de células efectoras humanas

La suspensión de células efectoras (100 \mul) preparada en "b" se dispensó en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon) (5x10^{4} células/pocillo). Además, se añadieron 50 \mul del anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871 o KM8871-hIL-2 a la misma, proporcionando una concentración final de 11,1 nM, y se dejó reaccionar a 37ºC durante 24 horas en un incubador de 5% de CO_{2}.

d. Medición de la actividad citotóxica

La suspensión celular diana (50 \mul) preparada en "a" se añadió a cada pocillo de la placa preparada en "c" (1x10^{4} células/pocillo). En este caso la proporción de células efectoras a células diana era de 5:1. Tras reaccionar a 37ºC durante 4 horas, la placa se centrifugó y se midió la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante con un contador \gamma. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento con el medio solo en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento aunque añadiendo medio solo en lugar de la solución de anticuerpo, y ácido hidroclórico 1 N en lugar de la suspensión de células efectoras, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad citotóxica con la ecuación siguiente.

5

Se muestran los resultados en la fig. 29. Tal como se muestra en la fig. 29, se encontró que la actividad citotóxica inducida por KM8871-hIL-2 era más fuerte que la inducida por el anticuerpo anti-GD3 injertado con CDR KM8871. Este resultado demuestra que las células efectoras humanas pueden activarse y que puede incrementarse la actividad citotóxica mediante la utilización de KM8871-hIL-2. De esta manera, se indicó que podían esperarse resultados similares en la aplicación clínica de los mismos en el ser humano.

Ejemplo 3 Producción de proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 quimérico y citoquina humana

A título de ejemplo de proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 quimérico y citoquina humana, se preparó una proteína de fusión de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 e IL-2 humano, KM871-hIL-2, de la manera siguiente, para llevar a cabo una evaluación de la actividad.

1. Expresión estable de KM871-hIL-2 utilizando células animales (1) Construcción de un vector de expresión estable para KM871-hIL-2

Se construyó un vector de expresión estable para KM871-hIL-2 de la manera siguiente, utilizando el vector pKANTEX641 para la expresión estable del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 (solicitud de patente publicada japonesa no examinada nº 304989/93) y el plásmido pBShC\gamma1-IL-2 obtenido en el punto 1(2) del Ejemplo 2 con ADNc codificante de la proteína de fusión de hC\gamma1 e hIL-2.

Se añadió el plásmido pKANTEX641 (3 \mug) obtenido en el punto 6(1) del Ejemplo 1 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y se añadieron además 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 30ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 12,57 kb mediante la utilización del kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, se añadieron 3 \mug del plásmido pBShC\gamma1-IL-2 obtenido en el punto 1(2) del Ejemplo 2 a 10 \mul de un tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento ApaI-BamHI de aproximadamente 1,45 kb mediante la utilización del kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Seguidamente, se añadieron 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pKANTEX641 obtenido de esta manera y 0,1 \mug del fragmento ApaI-BamHI del plásmido pBShC\gamma1-IL-2 a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron mediante la utilización del kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli DH5\alpha, obteniendo el vector pKANTEX871-hIL2 de expresión estable de KM871-hIL-2 mostrado en la fig. 30. El plásmido (10 \mug) obtenido de esta manera se dejó reaccionar siguiendo las instrucciones del fabricante, adjuntas al kit de secuenciación AutoRead (fabricado por Pharmacia) y después se sometió a electroforesis utilizando el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) para determinar la secuencia de nucleótidos, y como resultado, se confirmó que se había obtenido un plásmido en el que se había clonado el ADN de interés.

(2) Expresión de KM871-hIL-2 en células animales

Utilizando 4 \mug del vector pKANTEX871-hIL-2 de expresión estable de KM871-hIL-2 obtenido en el punto 1(1) del Ejemplo 3, se transformaron células YB2/0 (ATCC CRL 1581) siguiendo el procedimiento descrito en el punto 6(2) del Ejemplo 1, y finalmente se llevó a cabo selección con G418 (0,5 mg/ml) y MTX (200 nM) para obtener un clon de células transformadas KM871hIL2 que mostraba un nivel de expresión de aproximadamente 4 \mug/10^{6} células/24 horas. Además, KM871hIL2 fue depositado el 19 de octubre de 1999 con el número FERM BP-6918 en el National Institutes of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Highashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón).

(3) Purificación de KM871-hIL-2 a partir de sobrenadantes de cultivo

Siguiendo el procedimiento descrito en el punto 6(3) del Ejemplo 1, se cultivó el clon de células transformadas KM871hIL2 obtenido en el punto 1(2) del Ejemplo 3 que expresa KM871-hIL-2, obteniendo aproximadamente 10,0 mg de KM871-hIL-2 purificado a partir de aproximadamente 3 litros de sobrenadante de cultivo. Se muestra el resultado de la SDS-PAGE de KM871-hIL-2 purificado en la fig. 31. Tal como se muestra en la fig. 31, el peso molecular del KM871-hIL-2 purificado era de aproximadamente 180 Kd bajo condiciones no reductoras, y se encontraron dos bandas de aproximadamente 65 Kd y aproximadamente 25 Kd bajo condiciones reductoras. Estos pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos a partir de las secuencias de nucleótidos de ADNc de la cadena H de KM871-hIL-2, de hIL-2 y de la cadena L (cadena H y hIL-2: aproximadamente 64 Kd; cadena L: aproximadamente 24 Kd; molécula completa: aproximadamente 176 Kd), y se confirmó que la estructura de molécula de anticuerpo se había mantenido tras la fusión de hIL-2.

2. Evaluación in vitro de KM871-hIL-2 (1) Reactividad de KM871-hIL-2 con GD3 (procedimiento ELISA)

Se midió la reactividad de KM871-hIL-2 purificado con GD3 (fabricado por DIA-IATRON) siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2 del Ejemplo 1. En este caso se utilizó un anticuerpo IgG (H&L) antihumano de cabra marcado con peroxidasa (fabricado por American Qualex, utilizado tras diluir 3.000 veces con BSA-PBS al 1%) como la solución de anticuerpo secundario. La fig. 32 muestra los resultados del examen de reactividad llevado a cabo fijando la cantidad de GD3 que debía adsorberse en cada pocillo de una placa para ELISA en 20 pmoles/pocillo y modificando la concentración del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y KM871-hIL-2 que debía añadirse. Tal como se muestra en la fig. 32, se encontró que KM871-hIL-2 presentaba una actividad ligante de GD3 similar o superior a la del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871. La fig. 33 muestra los resultados del examen de la reactividad de una concentración constante (6,7 nM) de anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 y de KM871-hIL-2, llevada a cabo mediante la modificación de los tipos de gangliósido que debían adsorberse en cada pocillo de una placa para la utilización en ELISA (cantidad de adsorción: 20 pmoles/pocillo). Tal como se muestra en la fig. 33, se encontró que KM871-hIL-2 se une fuertemente a GD3 de manera similar al anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871, y se confirmó que la adición de hIL-2 no presentaba una gran influencia sobre la especificidad de antígeno de KM871.

(2) Reactividad de KM871-hIL-2 con GD3 de superficie celular (procedimiento de inmunofluorescencia)

Se midió la reactividad de KM871-hIL-2 purificado con células humanas de cáncer siguiendo el procedimiento descrito en el punto 7(2) del Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la fig. 34. Tal como se muestra en la fig. 34, KM871-hIL-2 mostró una fuerte reactividad con la línea de cultivo celular de melanoma humano G361 y con SK-MEL-28, que era prácticamente idéntica a la del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871. Los resultados demuestran que KM871-hIL-2 resulta útil en el tratamiento y similar de los tumores humanos GD3-positivos, incluyendo el melanoma.

(3) Evaluación de la actividad hIL-2 de KM871-hIL-2

Se midió la actividad de KM871-hIL-2 purificado como hIL-2 de acuerdo con el punto 3(2) del Ejemplo 2, y se muestran los resultados en la fig. 35. Tal como se muestra en la fig. 35, KM871-hIL-2 mostró una actividad biológica de soporte del crecimiento de CTLL-2 similar a la de hIL-2. Los resultados demuestran que la actividad de KM871-hIL-2 como hIL-2 se mantiene tras su fusión con el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871.

(4) Activación de los linfocitos humanos por KM871-hIL-2

Con el fin de evaluar la activación de los linfocitos humanos y el incremento concurrente de actividad citotóxica por parte del fragmento hIL-2 de KM871-hIL-2 in vitro, se midió la actividad citotóxica mediante el procedimiento siguiente, en el que se modificó parcialmente el procedimiento descrito en el punto 7(4) del Ejemplo 1.

a. Preparación de la suspensión celular diana

Siguiendo el procedimiento descrito en "a" del punto 7(4) del Ejemplo 1, se ajustó la línea de cultivo celular de melanoma humano G-361 para conseguir una densidad de 2x10^{5} célula/ml y se utilizó como la suspensión celular diana.

b. Preparación de la suspensión de células efectoras

Siguiendo el procedimiento descrito en "b" del punto 7(4) del Ejemplo 1, se separaron células mononucleares de la sangre venosa de personas sanas y se resuspendieron para conseguir una densidad de 1x10^{7} células/m que se utilizaría como suspensión de células efectoras.

c. Activación de los linfocitos

La suspensión de células efectoras (50 \mul) preparada en "b" se dispensó en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon) (5x10^{4} células/pocillo). Además, se añadieron 50 \mul de medio RPMI1640-FBS(10) al que se había añadido anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 o KM871-hIL-2, proporcionando una concentración final de 1 nM (se calculó el peso molecular de KM871 en 150 Kd, y el peso molecular de KM871-hIL-2 en 180 Kd) y se incubó a 37ºC durante 72 horas en un incubador de 5% de CO_{2}.

d. Medición de la actividad citotóxica

La suspensión celular diana (50 \mul) preparada en "a" se añadió a cada pocillo de la placa preparada en "c" (1x10^{4} células/pocillo). En este caso la proporción de células efectoras a células diana era de 5:1. Además, se añadieron a dicha suspensión 50 \mul de medio RPMI1640-FBS(10) al que se había añadido anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 o KM871-hIL-2 para conseguir una concentración final de 1 nM, llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 4 horas, y después la placa se centrifugó y se midió la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante con un contador \gamma. Se calculó la cantidad deCr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento aunque con medio solo en lugar de la suspensión de células efectoras y solución de anticuerpo, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento aunque añadiendo el medio solo en lugar de la solución de anticuerpo, y ácido hidroclórico 1 N en lugar de la suspensión de células efectoras, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad citotóxica mediante el procedimiento descrito en "b" del punto 7(4) del Ejemplo 1, y los resultados se muestran en la fig. 36. Tal como se muestra en la fig. 36, se encontró que la actividad citotóxica inducida por KM871-hIL-2 era más fuerte que la inducida por KM871. Basándose en estos resultados se espera que KM871-hIL-2 también incrementará los efectos terapéuticos de KM871 en la aplicación clínica en tumores GD3-positivos humanos mediante la activación de los linfocitos humanos mediante el fragmento hIL-2.

3. Evaluación in vivo de KM871-hIL-2 (1) Producción de células B16 transfectantes con introducción de gen de GD3 sintasa para el modelo singénico de ratón a. Construcción de un vector de expresión estable del gen de la GD3 sintasa

Se añadió un vector pAMo-GD3 (3 \mug; documento WO nº 94/23020 para expresar el gen de la GD3 sintasa en células animales a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro sódico 50 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron además 10 unidades de enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol y se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 \mug/ml y Triton X-100 al 0,01%, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, y el extremo 5' protuberante formada por la digestión con enzima de restricción se convirtió en un extremo romo utilizando el kit de formación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo). La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento HindIII-NotI de extremos romos de aproximadamente 2,1 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

\newpage

A continuación, se añadieron 3 \mug del vector de expresión pKANTEX641 de anticuerpo anti-GD3 quimérico a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y además se añadieron 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), llevando a cabo la reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se precipitó con etanol, y el extremo 5' protuberante formado por la digestión con enzima de restricción se convirtió en extremo romo utilizando el kit de formación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo). La solución de reacción se precipitó con etanol, se añadió a 10 \mul de tampón que comprendía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y cloruro de magnesio 10 mM, y la solución se mezcló adicionalmente con 10 unidades de un enzima de desfosforilación de extremo 5', fosfatasa alcalina derivada de intestino bovino (fabricada por Takara Shuzo), y se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora para desfosforilar el extremo 5'. La solución de reacción se sometió a tratamiento con fenol y después se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa, recuperando aproximadamente 2 \mug de fragmento EcoRI-NruI de extremo romo desfosforilado de aproximadamente 9,4 kb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después, se añadieron 0,1 \mug de fragmento EcoRI-NruI derivado del plásmido pKANTEX641 y 0,1 \mug del fragmento HindIII-NotI derivado del plásmido pAMoGD3, ambos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, a 10 \mul de volumen total de agua estéril y se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando la solución de plásmido ADN recombinante obtenido de esta manera, se transformó E. coli DH5\alpha, obteniendo el vector pKANTEXGD3 de expresión estable de GD3 sintasa mostrado en la fig. 37.

b. Introducción del vector de expresión de GD3 sintasa en células B16

Utilizando 4 \mug del vector pKANTEXGD3 de expresión estable de gen de GD3 sintasa, obtenido en "a" del punto 3(1) del Ejemplo 3, se transformaron células B16\cdotF10 (ATCC CRL 1581) siguiendo el procedimiento descrito en el punto 6(2) del Ejemplo 1, y finalmente se llevó a cabo la selección con G418 (0,5 mg/ml), obteniendo los clones transfectantes B16\cdot8-3 y B16\cdot29-10.

c. Análisis del nivel de expresión de GD3 de la línea de expresión de GD3 mediante el procedimiento de inmunofluorescencia

Se suspendieron en PBS cada uno de 1x10^{6} células de los transfectantes de gen de GD3 sintasa B16\cdot8-3 y B16\cdot29-10 obtenidos en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 y la línea parental B16\cdotF10, se introdujeron en microtubos y se centrifugaron (2.000 rpm durante 2 minutos), y las células lavadas de esta manera se agitaron tras añadir 50 \mul del anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 (una solución preparada ajustando a 5 \mug/ml con BSA-PBS al 1%; el control negativo era BSA-PBS al 1% solo) y después se dejó reaccionar a 4ºC durante 1 hora. Tras la reacción, seguida de centrifugación tres veces con PBS para el lavado, las células se mezclaron con 100 \mul de solución de IgG (H+L) antihumano de cabra marcado con biotina (fabricada por VECTOR, utilizada tras diluir 400 veces con BSA-PBS al 1%), se agitó y después se dejó reaccionar a 4ºC durante 1 hora. Tras centrifugar tres veces con PBS para el lavado, se añadieron 100 \mul de una solución de pigmento Cy5 marcado con estreptoavidina (Streptavidin-RED670, fabricado por GIBCO, utilizado tras diluir 100 veces con BSA-PBS al 1%) y se agitó y después se dejó reaccionar a 4ºC durante 1 hora. Tras la reacción, seguido de centrifugación tres veces con PBS para el lavado, las células se suspendieron nuevamente en PBS para llevar a cabo el análisis con un citómetro de flujo EPICS Elite (fabricado por COULTER). Se muestran los resultados en la fig. 38. Tal como se muestra en la fig. 38, el anticuerpo anti-GD3 quimérico KM871 reaccionó únicamente con B16\cdot8-3 y con B16\cdot29-10, pero no mostró reactividad con las células de la línea parental B16\cdotF10. Los resultados anteriores demuestran que ambos transfectantes, B16\cdot8-3 y B16\cdot29-10, expresan GD3 sobre la superficie y pueden utilizarse como modelo para medir los efectos antitumorales in vivo de KM871-hIL-2 mediante el trasplante de los mismos en ratones C57 BL/6 como origen de células B16.

(2) Medición de los efectos antitumorales in vivo de KM871-hIL-2 a. Evaluación con ratones trasplantados con transformante B16\cdot29-10 que expresa GD3

Se suspendieron células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 en PBS, proporcionando una densidad de 2,5x10^{6} células/ml, y se inyectaron 100 \mul de la suspensión en ratones C57 BL/6 Cr slc (hembras, 8 semanas de edad, disponibles de Japan SLC) en la vena de la cola. Además, a partir del día del trasplante del tumor, se administraron intravenosamente una vez al día continuamente durante 5 días, 50 ó 200 \mug/día de KM871, o 20 ó 50 \mug/día de KM871-hIL-2. Se extirparon los pulmones el día 15º tras el trasplante de tumor, y se contaron los focos metastásicos negros visibles sobre la superficie. Se muestran los resultados en la Tabla 3 y en la fig. 39.

TABLA 3

6

Tal como se muestra en la Tabla 3 y en la fig. 39, KM871-hIL-2 mostró un efecto antimetastásico claramente más potente que el de KM871 en el modelo de ratón de clon B16\cdot29-10.

b. Evaluación con ratones trasplantados transformante B16\cdot8-3 que expresa GD3

Utilizando células B16 de la línea B16\cdot8-3 que expresa GD3 obtenida en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3, se midió el efecto antimetastásico de KM871-hIL-2 siguiendo el procedimiento descrito en "a" del punto 3(2) del Ejemplo 3. La dosis era de 40 ó 100 \mug/día tanto para KM871 como KM871-hIL-2. Los resultados se indican en la tabla 4 y en la Fig. 40.

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TABLA 4

7

Tal como se muestra en la Tabla 4 y en la fig. 40, KM871-hIL-2 mostró un efecto antimetastásico más potente que el de KM871 en el modelo de ratón del clon B16\cdot8-3.

c. Comparación con la administración combinada de KM871 y hIL-2

Las células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 se suspendieron en PBS para proporcionar una densidad de 2,5x10^{6} células/ml, y se inyectaron 100 \mul de la suspensión en ratones C57 BL/6 Cr slc (hembras, 8 semanas de edad, disponibles de Japan SLC) en la vena de la cola. Además, a partir del día del trasplante del tumor, se administraron intravenosamente una vez al día continuamente durante 5 días, 6 \mug/día (0,0333 nmoles) o 18 \mug/día (0,1 nmoles) de KM871-hIL-2. En otros grupos se administró una solución mixta de KM871 y hIL-2 (fabricada por Peprotech) correspondiente a la cantidad de KM871-hIL-2 administrado (5 \mug (0,0333 nmoles) de KM871 y 1 \mug (0,0667 nmoles) de hIL-2, o 15 \mug (0,1 nmoles) de KM871 y 3 \mug (0,2 nmoles) de hIL-2), en la vena de la cola una vez al día continuamente durante 5 días a partir del día del trasplante del tumor. Los pulmones se extirparon el día 15º tras el trasplante de los tumores, y se contaron los focos metastásicos negros visibles sobre la superficie. Se muestran los resultados en la Tabla 5 y en la fig. 41.

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TABLA 5

8

Tal como se muestra en la Tabla 5 y en la fig. 41, KM871-hIL-2 mostró un efecto antimetastásico más potente que el de la administración combinada de la cantidad equivalente de KM871 y hIL-2 en el modelo de ratón de clon B16\cdot29-10. Los resultados demuestran que el efecto antitumoral in vivo mostrado por KM871-hIL-2 no es un simple efecto aditivo de KM871 y hIL-2 sino el resultado de la inducción eficiente de la inmunidad antitumoral debido a la activación de linfocitos periféricos por el fragmento hIL-2 de KM871-hIL-2 acumulado en el tumor, mostrando de esta manera la posibilidad de que KM871-hIL-2 se convierta en un agente terapéutico con un efecto terapéutico superior al de la administración convencional de hIL-2 solo o de su utilización combinada con un anticuerpo, y que también presenta menos efectos secundarios derivados de hIL-2.

d. Evaluación mediante el modelo temprano de tumor sólido de células B16\cdot29-10

Se suspendieron en PBS células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresa GD3 obtenida en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 para conseguir una densidad de 1x10^{7} células/ml, y se trasplantaron subcutáneamente 50 \mul de la suspensión en ratones C57 BL/6 (macho, 7 semanas de edad, disponibles de Charles River Japan). Tras establecer los grupos de administración siguientes, se administró intravenosamente cada agente una vez al día continuamente durante 5 días a partir del día del trasplante de tumores.

\bullet Grupo no administrado

\bullet hIL-2:: 10 \mug/día (0,667 nmoles)

\bullet KM871:: 50 \mug/día (0,333 nmoles)

\bulletKM871-hIL-2:: 60 \mug/día (0,333 nmoles)

El ensayo se llevó a cabo utilizando 5 animales en cada grupo. Se preparó cada agente para proporcionar una concentración de 200 \mul/animal mediante dilución con un tampón citrato. Cinco días tras el trasplante, se midió periódicamente el diámetro de los tumores utilizando un compás de corredera, y el efecto antitumoral se evaluó basándose en la proporción entre el valor medio de los volúmenes tumorales en cada grupo administrado y el valor medio de los volúmenes tumorales en el grupo no administrado y el número de días de supervivencia tras el inicio de la administración. El volumen tumoral se calculó con la ecuación siguiente.

Volumen tumoral = (anchura)^{2} x longitud x 0,5

El valor medio de los volúmenes tumorales en cada grupo se muestra en la Tabla 6; los resultados de la proporción entre el valor medio de los volúmenes tumorales en cada grupo y el valor medio de los volúmenes tumorales en el grupo no administrado se muestran en la Tabla 7 y en la fig. 42, y los resultados del número de días de supervivencia se muestran en la Tabla 8.

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TABLA 6

9

TABLA 7

10

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TABLA 8

11

Tal como se muestra en las Tablas 6, 7 y 8 y en la fig. 42, KM871-hIL-2 mostró efectos de inhibición del crecimiento y de prolongación de la vida más potentes que aquellos de hIL-2 solo o de anticuerpo solo.

e. Evaluación mediante un modelo de tumor sólido de estadio avanzado de células B16\cdot29-10

Se suspendieron en PBS células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 hasta una densidad de 1x10^{8} células/ml, y se trasplantaron subcutáneamente 50 \mul de la suspensión en ratones C57 BL/6 (macho, 7 semanas de edad, disponibles de Charles River Japan). Tras establecer los grupos de administración siguientes, se calcularon los volúmenes tumorales el día 6º tras el trasplante de los tumores mediante el procedimiento de medición descrito en "d" del punto 3(2) del Ejemplo 3 para seleccionar los individuos comprendidos dentro del intervalo de entre 10 y 80 mm^{3}, y después se administró intravenosamente cada uno de los agentes siguientes una vez al día continuamente durante 8 días.

\bullet Grupo no administrado

\bullet hIL-2:: 10 \mug/día (0,667 nmoles)

\bullet KM871:: 50 \mug/día (0,333 nmoles)

\bullet KM871:: 200 \mug/día (1,33 nmoles)

\bullet KM871-hIL-2:: 24 \mug/día (0,133 nmoles)

\bullet KM871-hIL-2:: 60 \mug/día (0,333 nmoles)

El ensayo se llevó a cabo utilizando únicamente 3 animales en el grupo de administración de 60 \mug/día de KM871-hIL-2 y 5 animales para cada uno de los demás grupos. Se preparó cada agente a una concentración de 200 \mul/animal mediante dilución con tampón citrato. A partir del día del trasplante, se midió periódicamente el diámetro tumoral utilizando un compás de corredera, y se evaluó el efecto antitumoral basándose en la proporción entre el valor medio de los volúmenes tumorales el día de la medición y los volúmenes tumorales el día de inicio de la administración a cada ratón en cada grupo tratado (en adelante denominada "V/V0") respecto a la V/V0 del grupo no administrado y respecto al número de días de supervivencia tras el inicio de la administración.

Los resultados de la V/V0 en cada grupo se muestran en la Tabla 9, los resultados de la proporción entre la V/V0 en cada grupo y la V/V0 en el grupo no administrado se muestran en la Tabla 10 y en la fig. 43, y los resultados del número de días de supervivencia se muestran en la Tabla 11.

TABLA 9

12

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TABLA 10

14

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TABLA 11

15

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Tal como se muestra en las Tablas 9, 10 y 11, y en la fig. 43, KM871-hIL-2 mostró efectos de inhibición del crecimiento y de prolongación de la vida más potentes que aquellos de hIL-2 solo o de anticuerpo solo.

f. Efecto de la utilización combinada de KM871 y KM871-hIL-2 en el modelo de tumor sólido de estadio avanzado de células B16\cdot29-10

Las células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 se suspendieron en PBS para proporcionar una densidad de 1x10^{8} células/ml, y se trasplantaron subcutáneamente 50 \mul de la suspensión en ratones C57 BL/6 (macho, 7 semanas de dad, disponibles de Charles River Japan). Tras establecer los grupos de administración siguientes, se calcularon los volúmenes tumorales el día 6º tras el trasplante de los tumores (día 0) mediante el procedimiento de medición descrito en "d" del punto 3(2) del Ejemplo 3, con el fin de seleccionar los individuos comprendidos dentro del intervalo de entre 10 y 100 mm^{3}, y después se administró intravenosamente cada uno de los agentes siguientes.

\bullet Grupo no administrado

\bullet hIL-2:: 100 \mug/día x 5 días de administración continua (días 0 a 4º)

\bullet KM871:: 800 \mug/día x administración única (día 0)

\bullet KM871 + KM871 -hIL-2:: 800 \mug/día x administración única (día 0) + 15 \mug/día x 5 días de administración única (días 0 a 4º)

\bullet KM871 + KM871 -hIL-2:: 800 \mug/día x administración única (día 0) + 60 \mug/día 5 días de administración única (días 0 a 4º)

El ensayo se llevó a cabo utilizando 5 animales para cada grupo. Se preparó cada agente para proporcionar una concentración de 200 \mul/animal mediante dilución con tampón citrato. A partir del día de los trasplantes, se midió periódicamente el diámetro tumoral utilizando un compás de corredera, y se evaluó el efecto antitumoral basándose en la proporción entre la V/V0 en cada grupo tratado y la V/V0 en el grupo no administrado y en el número de días de supervivencia tras el inicio de la administración. Los resultados de la V/V0 en cada grupo se muestran en la Tabla 12, los resultados de la proporción entre la V/V0 en cada grupo y la V/V0 en el grupo no administrado se muestran en la Tabla 13 y en la fig. 44, y los resultados del número de días de supervivencia se muestran en la Tabla 14.

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TABLA 12

16

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TABLA 13

17

TABLA 14

18

Tal como se muestra en las Tablas 12 y 13, en la fig. 44 y en la Tabla 14, la administración combinada de KM871 y KM871-hIL-2 mostró efectos de inhibición del crecimiento y de prolongación de la vida más potentes que aquellos de hIL-2 solo o de anticuerpo solo. Los resultados demuestran que existe la posibilidad de que la administración combinada de KM871-hIL-2 y KM871 se convierta en un excelente procedimiento terapéutico para los cánceres GD3-positivos.

4. Análisis del mecanismo antitumoral in vivo de KM871-hIL-2 (1) Activación de las células efectoras de ratón e incremento de la actividad citotóxica por parte de KM871-hIL-2

Con el fin de evaluar la activación de las células efectoras de ratón debida al fragmento hIL-2 de KM871-hIL-2 y el incremento concurrente de actividad citotóxica, se midió la actividad citotóxica siguiendo el procedimiento que se muestra a continuación.

a. Preparación de una suspensión de células efectoras de ratón

Se establecieron los grupos de administración siguientes utilizando ratones C57 BL/6 (hembras, 8 semanas de edad, Japan SLC) y se administró cada agente intravenosamente.

\bullet Grupo no administrado

\bullet hIL-2:: 10 \mug (0,667 nmoles)/día x 5 días de administración continua (días 0 a 4º)

\bullet KM871-hIL-2:: 60 \mug (0,333 nmoles)/día x administración única (día 2º)

\bullet KM871-hIL-2:: 60 \mug (0,333 nmoles)/día x dos administraciones (día 0 y día 2º)

Tras completar todas las administraciones el día 4º, se extirparon los bazos, se aplastaron utilizando un portaobjetos de vidrio en 6 ml de medio RPMI1640-FBS(10) y después se pasaron a través de una malla de nilón de 70 \mum (fabricada por Falcon) para preparar una suspensión de esplenocitos. Se introdujo un medio de separación por densidad para linfocitos de ratón (5 ml), Lympholite-M, en un tubo de 15 ml, se cubrió suavemente con 5 ml de la suspensión de esplenocitos obtenida de esta manera y después se centrifugó a temperatura ambiente durante 20 minutos a 1.000 x g. La capa de linfocitos de la interfase se recuperó utilizando una pipeta Pasteur, se añadieron 10 ml de medio RPMI1640-FBS(10) a la misma, y la mezcla se centrifugó (800 x g, 4ºC, 10 minutos) y después se descartó el sobrenadante para el lavado. Tras repetir nuevamente el procedimiento de lavado, se preparó una suspensión de células efectoras, proporcionando una densidad final de 2x10^{7} células/ml mediante la adición de medio RPMI1640-FBS(10).

b. Preparación de la suspensión celular diana

Siguiendo el procedimiento descrito en "a" del punto 7(4) del Ejemplo 1, las células B16 de línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 se marcaron con ^{51}Cr, proporcionando 2x10^{5} células/ml de una suspensión celular diana.

c. Medición de la actividad citotóxica

Se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U, 100 \mul de la suspensión de células efectoras preparada en "a", 50 \mul de la suspensión celular diana preparada en "b" (1x10^{4} células/pocillo) y KM871 diluido seriadamente con medio RPMI1640-FBS(10), proporcionando una concentración final de 0, 0,05, 0,5, 5 ó 50 \mug/ml. En este caso la proporción entre células efectoras y células diana era de 200:1. Tras la reacción a 37ºC durante 10 horas, la placa se centrifugó y se midió la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante con un contador \gamma. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento aunque utilizando medio solo en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. La cantidad de ^{51}Cr disociado total se calculó llevando a cabo el mismo procedimiento aunque añadiendo medio solo en lugar de la solución de anticuerpo, y ácido hidroclórico 1 N en lugar de la suspensión de células efectoras, y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad citotóxica mediante el procedimiento descrito en "b" del punto 7(4) del Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la fig. 45. Tal como se muestra en la fig. 45, se encontró que KM871-hIL-2 inducía una actividad citotóxica superior a la administración de 5 veces de hIL-2, tanto en la administración única como en la de dos veces.

(2) Análisis de células efectoras activadas por KM871-hIL-2 (procedimiento de inmunofluorescencia)

Con el fin de medir la influencia de la administración de KM871-hIL-2 sobre las células efectoras relacionada con el efecto antitumoral en el modelo de ratón, se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo mediante el procedimiento siguiente. Se suspendieron en PBS las células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3, hasta una densidad de 1x10^{7} células/ml, y se trasplantaron 50 \mul de la suspensión bajo la piel ventral de ratones C57 BL/6 (machos, 7 semanas de dad, disponibles de Charles River Japan). Tras establecer los grupos de administración siguientes, se administró intravenosamente cada agente una vez al día continuamente durante 5 días, a partir del día del trasplante de los tumores.

\bullet Grupo no administrado

\bullet hIL-2:: 10 \mug/día (0,667 nmoles)

\bullet KM871-hIL-2:: 60 \mug/día (0,333 nmoles)

Con respecto a KM871-hIL-2 (60 \mug/día), también se estableció un grupo en el que se había reducido la frecuencia de administración a dos veces (el día del trasplante y el tercer día tras el trasplante). Se llevó a cabo el ensayo utilizando dos animales para cada grupo. Tras completar todas las administraciones el 4º día tras el trasplante, se extirparon los bazos, se aplastaron utilizando un portaobjetos e vidrio en 6 ml de medio RPMI1640-FBS(10) y después se pasaron a través de una malla de nilón de 70 \mum de diámetro (fabricada por Falcon) para preparar una suspensión de esplenocitos. Se introdujo un medio de separación por densidad para linfocitos de ratón (5 ml), Lympholite-M, en un tubo de 15 ml, se cubrió suavemente con 5 ml de la suspensión de esplenocitos obtenida de esta manera y después se centrifugó a temperatura ambiente durante 20 minutos a 1.000 x g. La capa de linfocitos de la interfase se recuperó utilizando una pipeta Pasteur, se añadieron 10 ml de medio RPMI1640-FBS(10) a la misma, y la mezcla se centrifugó (800 x g, 4ºC, 10 minutos) y después el sobrenadante se descartó para el lavado. Tras repetir nuevamente el procedimiento de lavado, se preparó una suspensión de linfocitos de bazo, proporcionando una densidad final de 3x10^{7} células/ml mediante la adición de BSA-PBS al 1% que contenía suero de ratón al 5% (fabricado por Chemicon). Se dispensaron 50 \mul de suspensión de linfocitos en una placa de 96 pocillos de fondo en U y además se añadió cada uno de los anticuerpos marcados por fluorescencia siguientes para llevar a cabo la reacción a 4ºC durante 1 hora.

\bullet Anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón marcado con ficoeritrina (en adelante {}\hskip0.28cm denominada "PE") (fabricado por Cederlane):: {}\hskip2.5cm 3 \mul

\bullet Anticuerpo de rata anti-CD8 de ratón marcado con FITC (fabricado por Serotec):: {}\hskip2.5cm 5 \mul

\bullet Anticuerpo de rata anticélulas NK de ratón marcado con FITC (fabricado por {}\hskip0.26cm Serotec):: {}\hskip2.5cm 15 \mul

\bullet Anticuerpo de rata anti-macrófago de ratón marcado con FITC (fabricado por {}\hskip0.26cm Serotec):: {}\hskip2.5cm 10 \mul

\bullet Anticuerpo de rata antineutrófilo de ratón marcado con PE (fabricado por Caltac):: {}\hskip2.5cm 5 \mul

Mediante el análisis con un citómetro de flujo EPICS ELITE (fabricado por Coulter), se calculó la proporción entre la proporción de un grupo teñido con cada anticuerpo y el número total de células intactas. Se muestran los resultados en la Tabla 15 y en la fig. 46. Cada numeral en la tabla muestra el valor medio de dos animales en cada grupo (unidad: %).

TABLA 15

19

Tal como se muestra en la Tabla 15 y en la fig. 46, se observó un incremento de la proporción de células NK de los linfocitos del bazo con la administración de hIL-2 y KM871-hIL-2. Los resultados demuestran que existe la posibilidad de incrementar el efecto antitumoral de KM871-hIL-2 mediante la proliferación de las células NK.

(3) Análisis de células efectoras del efecto antitumoral con un procedimiento de reducción in vivo (actividad citotóxica in vitro)

Se llevó a cabo un análisis del mecanismo del efecto antitumoral de KM871-hIL-2 mediante el procedimiento descrito a continuación, utilizando ratones preparados mediante la administración de anticuerpos contra células NK, células T CD4-positivas (células T ayudantes) y células T CD8-positivas (células T citotóxicas), como células efectoras sensibles a IL-2 en la inmunidad antitumoral, en ratones, con el fin de reducir de esta manera el grupo celular respectivo en el cuerpo del animal. Se suspendieron en PBS las células B16 de la línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del ejemplo 3 hasta una densidad de 5x10^{6} células/ml, y se inyectaron intravenosamente 100 \mul de la suspensión en cada uno de los ratones C57 BL/6 (machos, 7 semanas de edad, disponibles de Charles River Japan). Además, se administró intravenosamente KM871-hIL-2 a una dosis de 24 \mug/día una vez al día continuamente durante 5 días (día 0 a día 4º) a partir del día del trasplante de los tumores (día 0). Simultáneamente, se estableció como grupo de control un grupo de no administración. Además, también se establecieron grupos de administración de KM871-hIL-2 y de no administración de la misma manera en ratones en los que se había administrado mediante inyección intraperitoneal cada uno de los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-NK1.1 de ratón, anticuerpo anti-CD4 de ratón y anticuerpo anti-CD8 de ratón, a una dosis de 0,5 mg/día tres veces (día -3, primer día y día 3). Cinco días tras el trasplante de los tumores, se extirparon los bazos y se midió la actividad citotóxica mediante el procedimiento descrito en el punto 4(1) del Ejemplo 3. En este caso se fijó la concentración de KM871 en el momento del ensayo en 10 \mug/ml y la duración del ensayo en 4 horas. Se muestran los resultados en la fig. 47. Tal como se muestra en la fig. 47, se encontró que la célula efectora principal del efecto antitumoral de KM871-hIL-2 en el modelo de ratón era la célula NK.

(4) Análisis de células efectoras del efecto antitumoral mediante un procedimiento de reducción in vivo (actividad antitumoral in vivo)

Se llevó a cabo el análisis del mecanismo del efecto antitumoral de KM871-hIL-2 mediante el procedimiento mostrado a continuación, utilizando ratones preparados mediante la administración de anticuerpos contra células NK, células T CD4-positivas (células T ayudante) y células T CD8-positivas (células T citotóxicas), como células efectoras sensibles a IL-2 en la inmunidad antitumoral, en ratones, para de esta manera reducir el grupo celular respectivo en el cuerpo del animal. Se suspendió en PBS las células B16 de línea B16\cdot29-10 que expresan GD3 obtenidas en "b" del punto 3(1) del Ejemplo 3 para proporcionar una densidad de 5x10^{6} células/ml, y se inyectaron intravenosamente 100 \mul de la suspensión en cada uno de los ratones C57 BL/6 (machos, 7 semanas de edad, obtenidos de Charles River Japan). Además, se administró intravenosamente KM871-hIL-2 a una dosis de 24 \mug/día una vez al día continuamente durante 5 días (día 0 a día 4º) a partir del día del trasplante de tumores (día 0). Simultáneamente, también se estableció como grupo de control un grupo de no administración. Además, también se establecieron los grupos de administración de KM871-hIL-2 y de no administración de la misma manera en ratones en los que se habían administrado mediante inyección intraperitoneal cada uno de los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-NK1.1 de ratón, anticuerpo anti-CD4 de ratón y anticuerpo anti-CD8 de ratón, a una dosis de 0,5 mg/día cuatro veces (día -3, día 1º, día 3º y día 7º). El día 15º tras el trasplante de tumores, se extirparon los tumores y se contaron los focos metastásicos negros visibles sobre la superficie. Se muestran los resultados en la Tabla 16 y en la fig. 48.

TABLA 16

20

Tal como se muestra en la Tabla 16 y en la fig. 48, se encontró que la célula efectora principal del efecto antitumoral de KM871-hIL-2 en los modelos animales era la célula NK. Además, debido a que se observó la inhibición parcial del efecto antitumoral al eliminar las células T CD4-positivas, se sugiere la posibilidad de que las células T CD4-positivas se encuentran indirectamente relacionadas con el efecto antitumoral de KM871-hIL-2 a través de la activación de las células NK.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se proporcionan un anticuerpo injertado con CDR humano o un fragmento de anticuerpo del mismo, que reacciona específicamente con GD3, y derivados de un anticuerpo o un fragmento de los mismos, contra el gangliósido GD3.

Texto libre de listado de secuencias

SEC ID nº 9 -: explicación de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos obtenida a partir de ADN sintético.

SEC ID nº 10 -: explicación de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos obtenida a partir de ADN sintético.

SEC ID nº 11 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

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SEC ID nº 29 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

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SEC ID nº 47 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

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SEC ID nº 50 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

SEC ID nº 51 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

SEC ID nº 52 -: explicación de secuencia artificial: ADN sintético.

SEC ID nº 53 -: explicación de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos obtenida a partir de ADN sintético.

SEC ID nº 54 -: explicación de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos obtenida a partir de ADN sintético.

SEC ID nº 57 -: explicación de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos obtenida a partir de ADN sintético.

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<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.

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<120> ANTICUERPO HUMANO DE TRASPLANTE CON REGIÓN DE DETERMINACIÓN DE LA COMPLEMENTARIEDAD CONTRA GANGLIÓSIDO GD3 Y DERIVADOS DEL ANTICUERPO CONTRA GANGLIÓSIDO GD3

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<130> G 1599 EP

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<160> 57

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 138

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 1

21

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<210> 2

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<211> 128

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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23

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<210> 3

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 3

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\sa{His Tyr Ala Met Ser}

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<210> 4

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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\sa{Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly}

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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\sa{Val Lys Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Ser}

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<210> 6

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 6

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\sa{Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn}

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<210> 7

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 7

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\sa{Tyr Ser Ser Asn Leu His Ser}

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

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\sa{His Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr}

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<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttccatg gacgttcggt ggaggcacca agctggaaat caaac

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgtttga tttccagctt ggtgcctcca ccgaacgtcc atgga

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaggca gggaggatgc agtctgggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acccagactg catcctccct gcctgcatc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgatgaca gaaataagtt gcaaaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgcaact tatttctgtc atcagt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagcttaac ggctttgtct ggtttctg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaaaccag acaaagccgt taagctcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgcgatat cttcaggctg cagattgctg atggtgagac tataatct

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agattatagt ctcaccatca gcaatctgca gcctgaagat atcgcaac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaggctgc agattgctga tggtg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccatcagc aatctgcagc ctgaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacagaaata agttgcgata tcttcaggct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctgaaga tatcgcaact tatttctgtc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctcccggg aaagcaccta ctagtagttc tacaaag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgatcaa tgaattcaag tcagtgttga gatgatgc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 582

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

58

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 582

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

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69

Claims

1. Anticuerpo injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo, que reacciona específicamente con el gangliósido GD3, en el que:

la región V de la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 9; y

la región V de la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 54, y en el que:

2. Anticuerpo injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo injertado con CDR humano comprende además una región C de cadena H y una región C de cadena L de un anticuerpo humano.

3. Anticuerpo injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo injertado con CDR humano es producido por un transformante KM8871 (FERM BP-6790).

4. ADN que codifica el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento de anticuerpo del mismo que reacciona específicamente con el gangliósido GD3 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector recombinante que comprende el ADN según la reivindicación 4.

6. Transformante que es obtenido mediante la introducción del vector recombinante según la reivindicación 5 en una célula huésped.

7. Transformante KM8871 (FERM BP-6790) que produce el anticuerpo injertado con CDR humano según la reivindicación 3.

8. Procedimiento para la producción de un anticuerpo, que comprende:

cultivar el transformante según la reivindicación 6 ó 7 en un medio de cultivo para producir y acumular el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el cultivo, y

recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo a partir del cultivo.

9. Medicamento que comprende el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Utilización del anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

11. Agente de diagnóstico que comprende, como un ingrediente activo, el anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Utilización del anticuerpo injertado con CDR humano o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de una composición diagnóstica para el diagnóstico del cáncer.