ES2309050T3 - Anticuerpo anti-ccr4 y su fragmento. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 humano, siendo reconocido dicho epítopo por el anticuerpo KM 2760 producido por el transformante KM2760 que tiene el número de depósito FERM BP-7054.

Description

Anticuerpo anti-CCR4 y su fragmento.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo recombinante y a un fragmento de anticuerpo del mismo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular del receptor 4 de la quimiocina CC humana (denominado en lo sucesivo "CCR4"). Además, la presente invención se refiere a un anticuerpo recombinante tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y similares y un fragmento de anticuerpo del mismo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representa por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, presentan actividad citotóxica y actividad de inhibición de la producción de citocina por las células Th2, y comprenden una zona determinante de complementariedad específica (denominada en lo sucesivo "CDR"). Además, la presente invención se refiere a un ADN que codifica el anticuerpo mencionado anteriormente. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector que comprende el ADN, y a un transformante transformado con el vector. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir el anticuerpo mencionado anteriormente utilizando el transformante, y a un medicamento tal como un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y similares, para enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 tales como las enfermedades alérgicas y similares, que comprende la utilización del anticuerpo. Además todavía, la presente invención se refiere a un medicamento tal como un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y similares, para cánceres tales como cánceres de sangre, por ejemplo, leucemia, que comprende la utilización del anticuerpo.

Antecedentes de la técnica

Varios factores tales como los eosinófilos, los mastocitos, la IgE y similares, se relacionan con enfermedades alérgicas tales como el asma bronquial. Los eosinófilos se infiltran en una parte inflamatoria, liberan una proteína básica endotóxica tal como MBP (proteína básica principal) o similares, mediante desgranulación para provocar de este modo la lesión de los tejidos circundantes. Los mastocitos liberan histamina uniéndose a un complejo inmunitario del antígeno con IgE producida a partir de los linfocitos T para provocar de este modo una reacción alérgica inmediata. Son controlados por moléculas biológicamente funcionales tales como la citocina, la quimiocina y similares, que toman parte en la transducción de señal entre las células. Los eosinófilos se someten a inducción de diferenciación y prolongan la vida por IL-5, y la desgranulación se produce además. La IgE es producida en los linfocitos T activados por IL-4 y se convierte en un complejo inmunitario con el antígeno para acelerar la desgranulación de los mastocitos. Se ha descubierto que IL-4, IL-13 y similares se producen también en los mastocitos y contribuyen a la producción de IgE en los linfocitos, y se ha confirmado la presencia de un bucle que refuerza la alergia (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152: 2059 (1995), Immunol. Today, 15: 19 (1994)). De este modo, una red intrincada de citocina-quimiocina está presente entre las células inflamatorias y mantiene equilibrios complicados.

La citocina y la quimiocina son producidas por los linfocitos T colaboradores que expresan a CD4 en la superficie celular (denominadas en lo sucesivo "células CD4+Th"). Realmente, se ha descubierto que la inflamación de los linfocitos T cooperadores se encuentra principalmente en la parte de la inflamación de las vías respiratorias de pacientes con asma bronquial, en los que un número considerablemente mayor de linfocitos T están activados y que el grado de severidad e hipersensibilidad de las vías respiratorias se correlaciona con el número de linfocitos T activados, así como los linfocitos T activados aumentan también en la sangre periférica (Am. Rev. Respir. Dis., 145: 522 (1992)).

Los linfocitos T cooperadores se clasifican en células Th1 y células Th2, dependiendo del tipo de citocina producido por éstas (Annu. Rev. Immunol., 7: 145 (1989)). Ejemplos de citocina producida por células Th2 incluyen a IL-4, IL-5, IL-13 y similares.

Se ha descubierto que un clon de linfocito T específico para el antígeno aislado de un paciente con enfermedad atópica libera citocina de Th2 cuando se estimula in vitro (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4538 (1991)), y las células Th2 están presentes en el fluido de lavado broncoalveolar (denominado en lo sucesivo "BAL") y en la mucosa de las vías respiratorias de pacientes de asma (N. Engl. J. Med., 326: 298 (1992), Eur. J. Immunol., 23: 1445 (1993)). La
IL-4 y la IL-5 de las citocinas de Th2 aumentan cuando se examina la expresión de ARNm en BAL utilizando un modelo de animal de inflamación alérgico (Clin. Immunol. Immunopathol., 75:75 (1995)). Asimismo, cuando se administran células Th2 inducidas en ratones dentro de la vena y de la cavidad nasal, se produce un síntoma inflamatorio asmatoide específico del antígeno en los pulmones (J. Exp. Med., 186: 1737 (1997), J. Immunol., 160: 1378 (1998)) y produce eosinofilia (J. Immunol., 161: 3128 (1998)). La expresión de IL-5 se observa en la membrana de la mucosa de las vías respiratorias de pacientes de asma y las lesiones de pacientes con dermatitis atópica (J. Clin. Invest., 87: 1541 (1991), J. Exp. Med., 173: 775 (1991)), y el nivel de expresión de IL-13 en la membrana de la mucosa de la rinitis alérgica continua se correlaciona bien con las cantidades de IgE en el suero completo e IgE específica para el antígeno (Therapeutics, 32: 19 (1998)).

La quimiocina es un término general para las proteínas básicas que llevan heparina que tienen migración de leucina y funciones de activación de leucocitos, y se clasifican en subfamilias de CXC, CC, C y CX_{3}C dependiendo de la posición del residuo de cisteína que conserva la estructura primaria. Hasta la fecha, se han identificado 16 tipos de receptores de quimiocina (Curr. Opi. Immunol., 11: 626 (1999)), y se ha demostrado que la expresión de cada receptor de quimiocina es diferente en la superficie de cada leucocito tal como la célula Th1, la célula Th2 o similares (Cell Engineering, 17: 1022 (1998)).

La CCR4 humana es un receptor transmembranario siete acomplejado con la proteína G, clonado como K5-5 de una estirpe celular KU-812 basófila inmadura humana y presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17. Como las zonas transmembranarias de CCR4 se consideran que son posiciones 40-67, posiciones 78-97, posiciones 113-133, posiciones 151-175, posiciones 207-226, posiciones 243-270 y posiciones 285-308, se considera que los dominios extracelulares son las posiciones 1 a 39, las posiciones 98-112, las posiciones 176-206 y las posiciones 271-284 en la secuencia de aminoácidos, y que las zonas intracelulares son las posiciones 68-77, las posiciones 134-150, las posiciones 227-242 y las posiciones 309-360 (J. Biol. Chem., 270: 19495 (1995)). Cuando se llevó a cabo la clonación, se informó que el ligando de CCR4 es MIP-1\alpha (proteína 1\alpha inflamatoria de macrófago), RANTES (regulada en linfocitos T normales de activación expresados y segregados) o MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocito) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 218: 337 (1996), documento WO 96/23068). Sin embargo, después de esto, se ha descubierto que TARC (quimiocina del timo y con activación regulada) producida a partir de células mononucleares de la sangre periférica humana estimuladas (J. Biol. CheM., 271: 21514 (1996)) específicamente se une a CCR4 (J. Biol. Chem., 272: 15036 (1997)). Se ha descrito también que MDC (quimiocina obtenida del macrófago) aislada del macrófago (J. Exp. Med., 185: 1595 (1997)), conocida también como STCP-1 (proteína 1 quimiotáctica estimulada por linfocitos T) (J. Biol. Chem., 272: 25229 (1997)), se une a CCR4 de manera más fuerte que TARC (J. Biol. Chem., 273: 1764 (1998)).

Se ha demostrado que CCR4 se expresa en células CD4+Th que producen citocina y/o quimiocina (J. Biol. Chem., 272: 15036 (1997)), y se ha descrito que CCR4 se expresa selectivamente en las células Th2 entre las células CD4+Th (J. Exp. Med., 187: 129 (1998), J. Immunol., 161: 5111 (1998)). Además, se ha descubierto que las células CCR4+ descubiertas en un grupo de linfocitos T efectores/de memoria (CD4+/CD45RO+), y cuando se estimularon las células CCR4+, se produjeron IL-4 e IL-5 pero no se produjo IFN-\gamma (Int. Immunol., 11: 81 (1999)). Asimismo, se ha descrito que las células CCR4+ pertenecen a un CLA (antígeno de linfocitos cutáneos)-positivo y el grupo negativo a la integrina \alpha4\beta8 entre los linfocitos T de memoria, y CCR4 se expresa en los linfocitos T de memoria no relacionados con la inmunidad intestinal sino con la inmunidad generalizada de la piel y similares (Nature, 400: 776 (1999)). Estos resultados sugieren fuertemente una posibilidad de que los linfocitos T de memoria que son activados por la producción de inflamación expresen a CCR4, migran al punto inflamatorio por ligandos, MDC y TARC y aceleren la activación de otras células inflamatorias.

Como procedimiento actual para tratar las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2, se han desarrollado los siguientes: (1) antagonistas para citocina y quimiocina tales como un anticuerpo anti-IL-5 humanizado (SB-240563: Smith Kline Beecham, Sch-55700 (CDP-835): Schering Plough/Celltech), un anticuerpo IL-4 humanizado (patente US nº 5.914.110), un receptor de quimiocina soluble (J. Immunol., 160: 624 (1998)), etc.; (2) los inhibidores de la producción de citocina quimiocina tal como un inhibidor de la producción de IL-5 (solicitud de patente japonesa publicada y no examinada nº 53355/96), un antagonista retinoide (documento WO 99/24024), tosilato de splatast (IPD-1151T, fabricado por Taiho Pharmaceutical), etc.; (3) agentes para eosinófilos, mastocitos y similares como células inflamatorias finales, tal como el anticuerpo receptor de IL-5 humanizado (documento WO 97/10354), un antagonista del receptor 3 de CC quimiocina (CCR3) (solicitud de patente japonesa no examinada y publicada nº 147872/99), etc.; (4) inhibidores de moléculas inflamatorias tales como un anticuerpo humanizado anti-IgE (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157: 1429 (1998)), etc.; y similares. Pero inhiben únicamente una parte de la red elaborada frente a citocina, quimiocina y células inflamatorias y por consiguiente no son radicales. Los anticuerpos anti-CD4 tienen capacidad para controlar los linfocitos T, y presentan efectos sobre el asma grave dependiente de asteroides. Sin embargo, dado que la molécula CD4 se expresa ampliamente en varias células inmunitarias, carecen de especificidad y adolecen del inconveniente de que acompañan al efecto inmunosupresor fuerte (Int. Arch. Aller. Immunol., 118: 133 (1999)).

Por lo tanto, con el objetivo de inhibir todas ellas, se requiere controlar específicamente, corriente arriba de la reacción alérgica problemática, a saber las células Th2.

El procedimiento principal utilizado actualmente para tratar pacientes de enfermedades inmunitarias graves mediadas por Th2 es la administración de esteroides, pero los efectos secundarios por los esteroides no puede evitarse. Asimismo, existen inconvenientes de que las enfermedades de cada paciente vuelvan a la patología original cuando se suspende la administración del esteroide, y que se adquiera resistencia a los fármacos cuando se administre el esteroide durante un tiempo prolongado.

Hasta la fecha, no se ha comprobado ningún anticuerpo monoclonal que pueda detectar células que expresan a CCR4 y también tenga citotoxicidad contra las células que expresan a CCR4. Además, hasta ahora no se ha conocido ningún agente terapéutico que pueda inhibir la producción de citocina de Th2.

Aunque se ha publicado que CCR4 se expresa también en la leucemia (Blood, 96: 685 (2000)), no se ha conocido ningún agente terapéutico que lesione las células leucémicas.

Es sabido en general que cuando un anticuerpo obtenido de un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se administra a un ser humano, se reconoce como sustancia extraña y produce un anticuerpo humano contra el anticuerpo de ratón (anticuerpo anti-ratón humano: denominado en lo sucesivo "HAMA") en el cuerpo humano. Es sabido que el HAMA reacciona con el anticuerpo de ratón administrado para producir efectos secundarios (J. Clin. Oncol., 2: 881 (1984), Blood, 65: 1349 (1985), J. Natl. Cancer Inst., 80: 932 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 1242 (1985)), para acelerar la desaparición del anticuerpo de ratón administrado procedente del cuerpo (J. Nucl. Med., 26: 1011 (1985), Blood, 65: 1349 (1985), J. Natl. Cancer Inst., 80: 937 (1988)), y para reducir los efectos terapéuticos del anticuerpo de ratón (J. Immunol., 135: 1530 (1985), Cancer Res., 46: 6489 (1986)).

Con el objetivo de resolver estos problemas, se ha intentado convertir un anticuerpo obtenido de un animal no humano en un anticuerpo humanizado tal como un anticuerpo híbrido humano, un anticuerpo injertado en la zona determinante de complementariedad humana (denominada en lo sucesivo "CDR") o similares utilizando técnicas de ingeniería genética. El anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo en el que su zona variable de anticuerpo (denominada en lo sucesivo "zona V") es un anticuerpo obtenido de un animal no humano y su zona constante (denominada en lo sucesivo "zona C") se obtiene de un anticuerpo humano (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851 (1984)). El anticuerpo humano injertado con la CDR es un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos de la CDR en la zona V obtenida de un anticuerpo animal no humano se injerta en una posición apropiada de un anticuerpo humano (Nature, 321: 522 (1986)). En comparación con los anticuerpos obtenidos de animales no humanos tales como los anticuerpos de ratón y similares, estos anticuerpos humanizados presentan varias ventajas para aplicaciones clínicas. Por ejemplo, en cuanto a la inmunogenicidad y estabilidad en la sangre, se ha descrito que la vida media en sangre de un anticuerpo híbrido humano llega a ser de aproximadamente 6 veces con tal que se administre un anticuerpo de ratón a un ser humano (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 4220 (1989)). En el caso de un anticuerpo injertado con la CDR, se ha descrito que se redujo su inmunogenicidad y su vida media en el suero llegó a ser 4 a 5 veces con tal que se emplee un anticuerpo de ratón en el experimento utilizando un mono (J. Immunol., 147: 1352 (1991)). Por lo tanto, es de esperar que los anticuerpos humanizados presenten menos efectos secundarios y sus efectos terapéuticos continúen durante un periodo mayor que los anticuerpos obtenidos de animales no humanos. Asimismo, en el tratamiento particularmente para reducir el número de células que expresan a CCR4, la actividad citotóxica mayor tal como la actividad citotóxica dependiente del complemento (denominada en lo sucesivo "actividad CDC"), la actividad citotóxica mediada por las células dependientes del anticuerpo (denominado en lo sucesivo "actividad ADCC") y similares, a través de la zona Fc (zona en la zona bisagra y después de ella de una cadena pesada de anticuerpo) de un anticuerpo son importantes por los efectos terapéuticos. Se ha descrito que en dichas actividades citotóxicas, los anticuerpos humanos son superiores a los anticuerpos obtenidos de animales no humanos ya que la zona Fc de los anticuerpos humanos activa de manera más eficaz los componentes del complemento humano y las células efectoras humanas que tienen receptor Fc en la superficie celular tales como los monocitos, los macrófagos, las células NK y similares, que la zona Fc de anticuerpos obtenidos de animales no humanos. Por ejemplo, se ha publicado que la actividad citotóxica tumoral por células efectoras humanas aumentó en un anticuerpo híbrido humano preparado convirtiendo la zona Fc de un anticuerpo de ratón para GD2 en la zona Fc de un anticuerpo humano (J. Immunol., 144: 1382 (1990)) y se han descrito resultados similares también en un anticuerpo humano injertado con la CDR para el antígeno CAMPATH-1 (Nature, 332: 323 (1988)).

Estos resultados demuestran claramente que los anticuerpos humanizados son preferidos a los anticuerpos obtenidos de animales no humanos tales como anticuerpos de ratón y similares, como anticuerpos para aplicaciones clínicas a un ser humano.

Además, según los avances recientes en la ingeniería de proteínas y la ingeniería genética, pueden producirse fragmentos de anticuerpo que tienen un peso molecular más pequeño tales como Fab, Fab', F(ab')_{2}, una cadena sola (denominada en lo sucesivo "scFv") (Science, 242: 423 (1988)), un fragmento de la zona V estabilizado con disulfuro (denominado en lo sucesivo "dsFv") (Molecular Immunol., 32: 249 (1995)) y similares. Ya que los fragmentos son más pequeños en el peso molecular que en las moléculas de anticuerpo completo, son excelentes en la capacidad de transición en tejidos diana (Cancer Res., 52: 3402 (1992)). Se considera que estos fragmentos obtenidos de anticuerpos humanizados son más deseables que los procedentes de anticuerpos obtenidos de animales no humanos tales como los anticuerpos de ratón, cuando se utilizan en aplicaciones clínicas a seres humanos.

Como se ha descrito anteriormente, pueden esperarse efectos de diagnóstico y terapéuticos de los anticuerpos humanizados y de los fragmentos de los mismos cuando se utilizan solos, pero se ha intentado mejorar más los efectos utilizando otras moléculas en combinación. Por ejemplo, puede utilizarse citocina como una de tales moléculas. Citocina es un término general para varios factores solubles que controlan funciones mutuas intercelulares en reacciones inmunitarias. La actividad de CDC y la actividad de ADCC, por ejemplo, son conocidas como actividades citotóxicas de los anticuerpos, y la actividad ADCC es controlada por las células efectoras con receptores Fc sobre la superficie celular tales como monocitos, macrófagos, células NK y similares (J. Immunol., 138: 1992 (1987)). Dado que varias citocinas activan estas células efectoras, pueden administrarse en combinación con un anticuerpo con objeto de mejorar la actividad de ADCC del anticuerpo y similares.

Sumario de la invención

Los anticuerpos se unen al antígeno correspondiente mediante las CDR de las zonas V de la cadena pesada (denominada en lo sucesivo "cadena H") y una cadena ligera (denominada en lo sucesivo "cadena L") y la secuencia de aminoácidos de la CDR regula la reactividad de unión y la especificidad de unión del anticuerpo (J. Exp. Med., 132: 211 (1970)). Por lo tanto, hay demanda de anticuerpos anti-CCR4 que contienen las CDR que tienen una nueva secuencia de aminoácidos y que se unen específicamente al CCR4 humano que presenta determinadas propiedades tales como la reactividad de enlace, la actividad citotóxica y similares, que son diferentes de las de los conocidos anticuerpos CCR4. Además, existe una demanda de un anticuerpo que puede agotar selectivamente las células Th2 que expresan a CCR4 como células productoras de citocina, un anticuerpo que inhibe la producción de citocina de Th2 y un agente de diagnóstico y un agente terapéutico que utiliza el anticuerpo. Además, existe una demanda de un procedimiento útil en el diagnóstico y el tratamiento de los cánceres de sangre tal como la leucemia que es una enfermedad producida por la transformación tumorígena de las células hematopoyéticas, y similares.

Los presentes inventores han obtenido los ADNc que codifican la cadena H y la cadena L del anticuerpo a partir del hibridoma KM2160 que produce un anticuerpo monoclonal de ratón para CCR4 que pertenece a la clase IgG1, han descubierto que las CDR de la zona V tienen nuevas secuencias de anticuerpo y han construido un vector de expresión del anticuerpo humanizado clonando los ADNc que codifican la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L que tienen los nuevos CDR en un vector de expresión de la célula animal que tiene los ADNc que codifican la zona C de la cadena H del anticuerpo humano y la zona C de la cadena L del anticuerpo humano. El anticuerpo híbrido KM2760 anti-CCR4 se expresó y se purificó introduciendo el vector de expresión en células animales. La presente invención se ha llevado a cabo confirmando que este anticuerpo reacciona específicamente con CCR4 humano y reduce el número de células positivas al antígeno mediante su potente actividad citotóxica y demostrando la utilidad del anticuerpo en la utilización en el cuerpo humano.

Además, los presentes inventores han realizado la presente invención confirmando que un anticuerpo recombinante para CCR4 reacciona con las células de leucemia, específicamente las células de leucemia linfocitos T, con alta frecuencia y reduce el número de células de leucemia positivas a CCR4 mediante su potente actividad citotóxica y demostrando utilidad del anticuerpo en el diagnóstico y tratamiento de los cánceres de sangre tal como la leucemia humana y similares.

La presente invención se describe a continuación de (1) a (42).

(1) Un anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 humano, siendo reconocido dicho epítopo por el anticuerpo KM2760 producido por el transformante KM2760 que tiene el número de registro FERM BP-7054.

(2) El anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según (1) o (2), que reacciona específicamente con una célula que expresa a CCR4.

(3) El anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según (1) o (2), que presenta actividad citotóxica contra una célula que expresa a CCR4.

Ejemplos de actividad citotóxica incluyen la actividad de CDC, actividad de ADCC y similares.

(4) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según (3), en el que la actividad citotóxica contra la célula que expresa a CCR4 es mayor que la de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma obtenido de un animal no humano.

La expresión "actividad citotóxica mayor que la de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma obtenido de un animal no humano" significa que la actividad citotóxica del anticuerpo recombinante obtenido es mayor que la de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma obtenido por un animal no humano, que reacciona específicamente con el CCR4 utilizado en la producción de un anticuerpo recombinante que se describirá más adelante.

(5) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según (3), en el que la actividad citotóxica es la actividad citotóxica mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC).

(6) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según (5), en la que la actividad citotóxica mediada por la célula dependiente del anticuerpo es la actividad de la producción de apoptosis de una célula Th2.

(7) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (6), que presenta actividad de agotamiento de una célula Th2.

(8) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (7), que presenta actividad de inhibición de la producción de una célula Th2.

(9) El anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo del mismo según (8), en el que la citocina de Th2 es IL-4, IL-5 o IL-13.

(10) El anticuerpo recombinante según cualquiera de entre (1) a (9), en el que el anticuerpo recombinante se selecciona de entre un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

(11) El anticuerpo recombinante según (10), en el que el anticuerpo humanizado es un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo injertado a CDR humano.

(12) El anticuerpo recombinante según cualquiera de entre (1) a (11), que pertenece a un anticuerpo IgG humano.

(13) El anticuerpo recombinante según (10), en el que el anticuerpo humanizado comprende:

la zona determinante de complementariedad (CDR) 1, CDR2 y CDR3 de una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo que presenta las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente; y

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

(14) El anticuerpo recombinante según (11), en el que el anticuerpo híbrido humano comprende:

una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4; y

una zona constante (zona C) de la cadena H y la zona C de la cadena L de un anticuerpo humano.

(15) El anticuerpo recombinante según (14), en el que el anticuerpo híbrido humano comprende:

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos 20 a 138 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos 20 a 132 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

(16) El anticuerpo recombinante según (11), en el que el anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo KM2760 producido por un transformante KM2760 que tiene el número de registro FERM BP-7054, y en el que su zona C de la cadena H del anticuerpo pertenece a la subclase IgG1 humana.

(17) El anticuerpo recombinante según (10), en el que el anticuerpo humano comprende una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo.

(18) El anticuerpo recombinante según (17), en el que las zonas determinantes de complementariedad (CDR) de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo humano comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales a las secuencias de aminoácidos de las CDR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

(19) El anticuerpo recombinante según (18), en el que el anticuerpo humano comprende:

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena H que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente, y

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

(20) El anticuerpo recombinante según (17), en el que la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L del anticuerpo humano comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales a las secuencias de aminoácidos de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

(21) El anticuerpo recombinante según (20), en el que el anticuerpo humano comprende:

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 132 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

(22) El anticuerpo recombinante según cualquiera de (17) a (21), en el que el anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido a partir de un banco de fagos de anticuerpos humanos o de un animal transgénico que produce un anticuerpo humano.

(23) Un ADN que codifica el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22).

(24) Un vector recombinante que comprende el ADN según (23) y un vector en tándem para la expresión humanizada del anticuerpo.

(25) Un transformante en el que se introduce el vector recombinante según (24) en una célula hospedadora.

(26) El transformante según (25), en el que el transformante es KM2760 que tiene el número de depósito FERM BP-7054.

(27) Un procedimiento para producir un anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo, que comprende cultivar el transformante según (25) ó (26) para producir y acumular el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo en un medio de cultivo, y recuperar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo del medio de cultivo.

(28) El fragmento de anticuerpo según cualquiera de (1) a (9), que es Fab, Fab', F(ab')_{2}, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de la zona V estabilizada con disulfuro o un péptido que comprende las zonas determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo.

(29) El fragmento de anticuerpo según (28), que comprende una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo de un anticuerpo.

(30) El fragmento de anticuerpo según (29), en el que las zonas determinantes de complementariedad (CDR) de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del fragmento de anticuerpo comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales que las secuencias de aminoácidos de las CDR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

(31) El fragmento de anticuerpo según (30), que comprende:

CDR1, CDR2 y CDR3 de la zona V de la cadena H que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente, y

CDR1, CDR2 y CDR3 de la zona V de la cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

(32) El fragmento de anticuerpo según (29), en el que la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L del fragmento de anticuerpo comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales que las secuencias de aminoácidos de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

(33) El anticuerpo recombinante según (32), que comprende:

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 132 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

(34) Un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo, que es el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y (28) a (33) que está conjugado química o genéticamente con un radioisótopo, una proteína o un agente.

(35) Un procedimiento in vitro para detectar inmunológicamente CCR4, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

Por ejemplo, CCR4 puede detectarse inmunológicamente en una muestra permitiendo al anticuerpo recombinante o al fragmento del anticuerpo del mismo ponerse en contacto con la muestra.

(36) Un procedimiento in vitro para detectar inmunológicamente una célula que expresa a CCR4 sobre la superficie celular, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

Por ejemplo, una célula que expresa a CCR4 sobre la superficie celular puede detectarse inmunológicamente permitiendo al anticuerpo recombinante o al fragmento de anticuerpo del mismo ponerse en contacto con la célula.

(37) Procedimiento in vitro para reducir o eliminar una célula que expresa a CCR4 sobre la superficie celular, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

Por ejemplo, la célula que expresa a CCR4 sobre la superficie celular puede reducirse o eliminarse administrando una cantidad eficaz del anticuerpo recombinante o del fragmento de anticuerpo del mismo a un ser humano o a un animal.

(38) Procedimiento in vitro para inhibir la producción de citocina de Th2, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

Por ejemplo, la producción de citocina de Th2 puede inhibirse administrando una cantidad eficaz del anticuerpo recombinante o del fragmento de anticuerpo del mismo a un ser humano o a un animal.

(39) Medicamento que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

(40) Agente terapéutico o de diagnóstico para enfermedades inmunitarias mediadas por Th2, que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y de (28) a (34).

Por ejemplo, una enfermedad inmunitaria mediada por Th2 puede tratarse administrando una cantidad eficaz del anticuerpo recombinante o del fragmento de anticuerpo del mismo a un ser humano o a un animal, y una enfermedad inmunitaria mediada por Th2 puede diagnosticarse permitiendo al anticuerpo recombinante o al fragmento de anticuerpo del mismo ponerse en contacto con una muestra que ha de analizarse.

(41) Agente terapéutico o de diagnóstico para un cáncer de la sangre, que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de (1) a (22) y (28) a (34).

Por ejemplo, puede tratarse un cáncer de sangre administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo recombinante o de un fragmento de anticuerpo del mismo a un ser humano o a un animal, y puede diagnosticarse un cáncer de sangre permitiendo al anticuerpo recombinante o al fragmento de anticuerpo del mismo ponerse en contacto con una muestra que ha de analizarse.

(42) Agente terapéutico o de diagnóstico según (41), en el que el cáncer de sangre es la leucemia.

Ejemplos de enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 en la presente invención incluyen la hipersensibilidad aguda o crónica de las vías respiratorias o el asma bronquial, las enfermedades atópicas de la piel incluyendo la dermatitis atópica, la rinitis alérgica, la polinosis y similares.

Ejemplos del cáncer en la presente invención incluyen los cánceres de sangre y particularmente la leucemia.

Puede utilizarse cualquier anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según la presente invención (denominado en lo sucesivo "anticuerpo de la presente invención"), con tal que pueda reaccionar específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular del CCR4 humano. Los anticuerpos más preferidos son los anticuerpos que comprenden CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena H que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7 respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena L con las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente; y un anticuerpo que comprende una zona V de la cadena H con los aminoácidos en las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representa por la SEC. ID. nº: 15 y una zona V de la cadena l con los aminoácidos en las posiciones 20 a 132 en la secuencia de aminoácidos representa por la SEC. ID. nº:16. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en los que se eliminan, añaden, sustituyen y/o insertan uno o más aminoácidos en estas secuencias de aminoácidos y que reaccionan específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 se incluyen también dentro del alcance de la presente
invención.

En la presente invención, una o más deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos significa que uno o más aminoácidos se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos. La deleción, sustitución, inserción y/o adición pueden producirse en la misma secuencia de aminoácidos simultáneamente. Asimismo, el resto de aminoácido sustituido, insertado o añadido puede ser natural o artificial. Ejemplos de residuos de aminoácidos naturales incluyen L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, L-cisteína y similares.

A continuación, se presentan ejemplos de restos de aminoácidos que se sustituyen entre sí. Los restos de aminoácidos en el mismo grupo pueden sustituirse entre sí.

Grupo A:

leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina;

Grupo B:

ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosubérico;

\newpage

Grupo C:

asparagina, glutamina;

Grupo D:

lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropiónico;

Grupo E:

prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina;

Grupo F:

serina, treonina, homoserina;

Grupo G:

fenilalanina, tirosina.

Ejemplos de anticuerpos de la presente invención incluyen un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y el fragmento de anticuerpo del mismo tal como se describe a continuación.

Ejemplos de anticuerpo humanizado incluyen un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo humano injertado por CDR.

Un anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo que comprende una zona V de la cadena H del anticuerpo (denominado también en lo sucesivo "VH") y una zona V de la cadena L del anticuerpo (denominado también en lo sucesivo "VL") de un animal no humano, una zona C de la cadena H del anticuerpo humano (denominado también en lo sucesivo "CH") y una zona C de la cadena H del anticuerpo humano (en lo sucesivo denominado también "CL"). El animal no humano puede ser cualquiera de entre ratón, rata, hámster, conejo y similares, con tal que pueda prepararse un hibridoma a partir del mismo.

El anticuerpo híbrido humano de la presente invención puede producirse obteniendo los ADNc que codifican a VH y VL de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, insertando los ADNc en un vector de expresión de la célula animal con genes que codifican un anticuerpo CH humano y un anticuerpo CL humano para construir un vector de expresión del anticuerpo híbrido humano e introduciendo el vector en una célula animal para expresar el anticuerpo.

Puede utilizarse cualquier CH de un anticuerpo híbrido humano, con la condición de que pertenezca a la inmunoglobulina humana (denominada en lo sucesivo "hIg"), pero se prefieren los de clase hIgG, y puede utilizarse cualquiera de las subclases que pertenecen además a hIgG tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Asimismo, puede utilizarse cualquier CL de un anticuerpo híbrido humano, con tal que pertenezca a hIg, y pueden utilizarse los de clase \kappa o a la clase \lambda.

Ejemplos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 incluyen a KM2760 en el que VH del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15, CH del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la subclase hIgG1, VL del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones 20 a 132 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16, y CL del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de la clase \kappa del anticuerpo humano.

Un anticuerpo humano injertado con CDR es un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos CDR de VH y VL de un anticuerpo obtenido de un animal no humano se injertan en las posiciones apropiadas de VH y VL de un anticuerpo humano.

El anticuerpo humano injertado con CDR de la presente invención puede producirse injertando las secuencias CDR de VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 de un animal no humano en las secuencias CDR de VH y VL de un anticuerpo humano opcional para construir los ADNc que codifican las zonas V obtenidas, insertando los ADNc en un vector de expresión de la célula animal con genes que codifican el anticuerpo CH humano y el anticuerpo CL humano para construir un vector de expresión del anticuerpo humano injertado
con CDR y a continuación introduciendo el vector de expresión en una célula animal para expresar el anticuerpo.

Puede utilizarse cualquier CH de anticuerpo humano injertado con CDR, con tal que pertenezca a hIg, pero se prefieren los de la clase hIgG y puede utilizarse cualquiera de las subclases que pertenecen además a hIgG tales como hIgG1, hIgG2, hIgG3 e hIgG4. Asimismo, puede utilizarse cualquier CL de anticuerpo humano injertado con CDR con tal que pertenezca a hIg, y pueden utilizarse los de clase \kappa o los de clase \lambda.

En principio, un anticuerpo humano es un anticuerpo que existe en la naturaleza en el cuerpo humano, pero también incluye anticuerpos obtenidos de un banco de fagos de anticuerpo humano y de un animal transgénico que produce el anticuerpo humano, preparados basándose en el avance reciente en las técnicas de ingeniería genética, ingeniería celular e ingeniería de desarrollo.

El anticuerpo existente en el cuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, aislando un linfocito humano de la sangre periférica, inmortalizándolo mediante inyección con virus EB o similares, seguido de clonación, cultivo de un linfocito que produce el anticuerpo y purificación del anticuerpo en el sobrenadante del cultivo.

El banco de anticuerpos humano es un banco en el que se expresa un fragmento de anticuerpo tal como Fab, scFv o similares, en la superficie de un fago insertando un gen del anticuerpo preparado a partir de linfocitos B humanos en el gen del fago. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo con la actividad de unión del antígeno deseada puede recuperarse del banco utilizando la actividad de unión para un substrato inmovilizado por el antígeno como índice. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humana que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.

Un animal transgénico que produce anticuerpos humanos es un animal no humano en el que se introduce un gen del anticuerpo humano en sus células. Específicamente, un animal transgénico que produce anticuerpos humanos puede producirse introduciendo un gen del anticuerpo humano en una célula ES de ratón, inoculando la célula ES en un embrión en la etapa inicial de otro ratón y desarrollando un animal. El anticuerpo humano puede producirse y acumularse obteniendo un hibridoma que produce un anticuerpo humano según un procedimiento de preparación de hibridomas realizado normalmente en mamíferos distintos del ser humano y a continuación cultivando el hibridoma para obtener el anticuerpo en un sobrenadante del cultivo.

Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, scFv, dsFv, un péptido que comprende las CDR de un anticuerpo según la presente invención.

Un Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al antígeno, en el que se unen mediante un enlace disulfuro aproximadamente la mitad del lado del terminal N de la cadena H y la cadena L entera, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papaína (corte en el resto de aminoácido de la posición 224º de la cadena H).

El Fab de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representa por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, con una proteasa, papaína. Alternativamente, el Fab puede producirse insertando ADN que codifica al Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab.

Un F(ab')_{2} es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión al antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido mediante un enlace disulfuro de la zona bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando la IgG con una proteasa, pepsina (corte en el resto aminoácido de la posición 234º de la cadena H).

El F(ab')_{2} de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representa por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, con una proteasa, pepsina. Alternativamente, puede producirse uniendo el Fab' descrito a continuación mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.

Un Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión del antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la zona bisagra del F(ab')_{2}.

El Fab' de la presente invención puede obtenerse tratando el F(ab')_{2} que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, con un agente reductor, ditiotreitol. Alternativamente, el Fab' puede producirse insertando el ADN que codifica el Fab' del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab'.

Un scFv es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que una cadena VH y una cadena VL se unen utilizando un enlazador de péptidos apropiado (denominado en lo sucesivo "P"). VH y VL en el scFv de la presente invención puede ser cualquier anticuerpo de la presente invención que reaccione específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 tal como un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

El scFv de la presente invención puede producirse obteniendo los ADNc que codifican a VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, construyendo el ADN que codifica a scFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el scFv.

Un dsFV se obtiene uniendo polipéptidos en los que un resto de aminoácido de cada uno de VH y VL se sustituye con un resto de cisteína mediante un enlace disulfuro entre los restos de cisteína. El resto de aminoácido que debe sustituirse por un resto de cisteína puede seleccionarse basándose en la estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo según el procedimiento presentado por Reiter et al. (Protein Engineering, 7: 697 (1994)). Como VH y VL contenidos en el dsFv de la presente invención, puede utilizarse cualquier anticuerpo de la presente invención que reaccione específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 tal como un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

El dsFv de la presente invención puede producirse obteniendo los ADNc que codifican a VH y VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, construyendo el ADN que codifica a dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el dsFv.

Un péptido que comprende las CDR de un anticuerpo de la presente invención está constituido incluyendo por lo menos una zona de las CDR con cadena H y cadena L. Varias CDR pueden unirse directamente o mediante un enlazador de péptidos apropiado.

El péptido que comprende las CDR puede producirse obteniendo el ADNc que codifica a VH o VL de un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, construyendo el ADN que codifica a CDR, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el péptido.

El péptido que comprende las CDR de un anticuerpo de la presente invención puede producirse también por un procedimiento de síntesis química tal como un procedimiento Fmoc (procedimiento de fluorenilmetoxicarbonilo), un procedimiento tBoc (procedimiento de t-butiloxicarbonilo) o similares.

El anticuerpo de la presente invención incluye derivados de anticuerpo en el que un radioisótopo, una proteína o un agente está conjugado química o genéticamente con un anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo del mismo.

Los derivados del anticuerpo de la presente invención pueden producirse conjugando químicamente un radioisótopo, una proteína o un agente con el lado del terminal N o el lado del terminal C de una cadena H o una cadena L de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4, con un grupo sustituyente apropiado o la cadena lateral del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo o con una cadena de azúcar en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo (Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)).

Alternativamente, puede producirse genéticamente uniendo un ADN que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 con otro ADN que codifica una proteína que ha de unirse, insertando el ADN en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión en una célula hospedadora.

Ejemplos del isótopo incluyen ^{131}I, ^{125}I y similares, y pueden conjugarse con anticuerpos por, por ejemplo, un procedimiento con cloramina T.

Como agente, se prefiere un compuesto de bajo peso molecular. Los ejemplos incluyen agentes anticancerosos tales como los agentes alquilantes (por ejemplo, mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, etc.), antagonistas metabólicos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, metotrexato, etc.), antibióticos (por ejemplo, daunomicina, bleomicina, mitomicina C, daunorrubicina, doxorrubicina, etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, etc.), fármacos hormonales (por ejemplo, tamoxifeno, dexametasona, etc.) y similares (Clinical Oncology, editada por la Japanese Society of Clinical Oncology, publicada por Cancer and Chemotherapy (1996)); agentes antiinflamatorios tales como los agentes esteroides (por ejemplo, hidrocortisona, prednisona, etc.), fármacos no estereoideos (por ejemplo, aspirina, indometacina, etc.), inmunomoduladores (por ejemplo, aurotiomalato, penicilamina, etc.), agentes inmunosupresores (por ejemplo, ciclofosfamida, azatioprina, etc.), agentes antihistamínicos (por ejemplo, maleato de clorfeniramina, clemastina, etc.) y similares (Inflammation and Antiinflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)); y similares. Ejemplos del procedimiento para conjugar la daunomicina con un anticuerpo incluyen un procedimiento en el que la daunomicina y un grupo amino de un anticuerpo se conjugan mediante el glutaraldehído, un procedimiento en el que un grupo amino de la daunomicina y un grupo carboxilo de un anticuerpo se conjugan mediante una carbodiimida soluble en agua y similares.

\newpage

Como proteína, se prefiere la citocina que activa las células inmunitarias. Los ejemplos incluyen la interleucina 2 humana (denominada en lo sucesivo "hIL-2"), el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (denominado en lo sucesivo "hGM-CSF"), el factor estimulante de colonias de macrófagos humano (denominado en lo sucesivo "hM-CSF"), la interleucina 12 humana (denominada en lo sucesivo "hIL-12"), y similares. Asimismo, para inhibir las células cancerosas directamente, puede utilizarse una toxina tal como el ricino, la toxina de la difteria y similares. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo de fusión con una proteína uniendo un ADNc que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con otro ADNc que codifica la proteína, construyendo el ADN que codifica el anticuerpo de fusión, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciéndolo en un procariota o eucariota para expresar el anticuerpo de
fusión.

Los procedimientos para producir un anticuerpo híbrido humano que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 y que tiene nuevas secuencias de aminoácidos en las zonas V de la cadena H y de la cadena L se explican a continuación basándose en ejemplos.

1. Producción del anticuerpo monoclonal anti-CCR4 producido por el hibridoma (1) Preparación del antígeno

Se obtiene una proteína CCR4 recombinante introduciendo un vector de expresión que contiene el ADNc que codifica el CCR4 en una célula hospedadora tal como Escherichia coli, levadura, una célula de insecto, una célula de animal o similares. Alternativamente, una célula tumoral cultivada que expresa a CCR4, una proteína CCR4 purificada de la célula o un péptido sintético que tiene una secuencia de CCR4 parcial puede utilizarse como antígeno.

Una secuencia parcial de proteína que tiene aproximadamente 5 a 30 restos se selecciona como péptido parcial para un antígeno. Para obtener un anticuerpo que reconoce la proteína que presenta una estructura natural inalterada, es necesario seleccionar una secuencia parcial existente en la superficie de la estructura tridimensional de la proteína como péptido del antígeno. La parte existente en la superficie de la estructura tridimensional de la proteína puede esperarse estimando una secuencia parcial que tiene gran hidrofilia utilizando un programa de análisis de la secuencia proteica disponible en el comercio tal como Genetyx Mac o similares. En general, las partes que presentan baja hidrofilia están en su mayoría presentes dentro de la estructura proteica tridimensional, mientras que las partes que presentan gran hidrofilia están en su mayoría presentes en la superficie de la proteína. Asimismo, el terminal N y el terminal C de una proteína están presentes en la superficie de la proteína en muchos casos. Sin embargo, un péptido parcial seleccionado en este procedimiento no siempre funciona como antígeno que crea el anticuerpo diana.

Para reticular el péptido parcial con la proteína, se añade un resto de cisteína a la zona terminal del péptido parcial. Cuando se selecciona una secuencia interna de la proteína, el terminal N y el terminal C del péptido se acetilan y se amidan, respectivamente, si es necesario.

El péptido parcial puede sintetizarse mediante un procedimiento de síntesis de péptido en fase líquida habitual o en fase sólida, el procedimiento combinado de los mismos o el procedimiento modificado de los mismos (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 1, editado por Erhard Gross y Johannes Meinhofer, Academic Press (1979), vol. 2 (1980), vol. 3 (1981); Fundamentals and Experiments on Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya, Maruzen (1985); Development of Drugs - Second Series, vol. 14, Peptide Synthesis, editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten (1991); International Journal of Peptide Protein Research, 35: 161 (1990)).

Asimismo, puede utilizarse un sintetizador de péptidos automático. Un péptido puede ser sintetizado por un sintetizador de péptidos utilizando aminoácidos con cadenas laterales protegidas apropiadas tales como N\alpha-Fmoc-aminoácido, N\alpha-Boc-aminoácido y similares, en un sintetizador de péptidos disponible en el mercado, por ejemplo, un sintetizador de péptidos fabricado por Shimadzu, un sintetizador de péptidos fabricado por Applied Biosystems, Inc., EUA (denominado en lo sucesivo "ABI"), un sintetizador de péptidos fabricado por Advanced ChemTech Inc., EUA (denominado en lo sucesivo "ACT"), o similares, según el programa de síntesis de cada sintetizador.

Los aminoácidos protegidos y las resinas portadoras como materiales de partida pueden adquirirse en ABI, Shimadzu, Kokusan Kagaku, Nova Biochem, Watanabe Kagaku, ACT, Peptide Institute o similares. Asimismo, los aminoácidos protegidos, los ácidos orgánicos protegidos y las aminas orgánicas protegidas como materiales de partida pueden sintetizarse por procedimientos de síntesis conocidos o los procedimientos modificados de los mismos (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 1, editado por Erhard Gross y Johannes Meinhofer, Academic Press (1979), vol. 2 (1980), vol. 3 (1981); Fundamentals and Experiments on Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya, Maruzen (1985); Development of Drugs - Second Series, vol. 14, Peptide Synthesis, editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten (1991); International Journal of Peptide Protein Research, 35: 161 (1990)).

(2) Inmunización del animal y preparación de la célula productora de anticuerpos

En la inmunización puede utilizarse cualquier animal tales como ratones, ratas, hámsteres, conejos y similares, con tal que pueda producirse un hibridoma. Se describe a continuación un ejemplo que utiliza ratones y ratas.

Se inmuniza un ratón de 3 a 20 semanas de vida con el antígeno preparado en el apartado anterior 1(1), y las células productoras de anticuerpo se recogen en el hígado, ganglio linfático o sangre periférica del animal. La inmunización se realiza administrando el antígeno al animal varias veces por inyección subcutánea, intravenosa o intraperitoneal con un adyuvante apropiado. Ejemplos de adyuvante incluyen un adyuvante completo de Freund, una combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna contra la tosferina y similares. Cuando el antígeno es un péptido parcial, se produce un conjugado con una proteína portadora tal como BSA (albúmina de suero bovino), KLH (hemocianina de la lapa californiana) o similares, que se utiliza como antígeno. Tres a siete días después de cada administración, se extrae una muestra de sangre del fondo del ojo o de la vena caudal del animal, se determina la reactividad con el antígeno utilizado, CCR4, por ejemplo, mediante inmunoanálisis enzimático (Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), publicado por Igaku Shoin (1976)), y a continuación como fuente de suministro de células productoras de anticuerpos se utiliza un ratón o rata que presenta un título de anticuerpo suficiente en su suero. Al 3^{er} a 7º días después de la administración final del antígeno, se extrae el bazo del ratón o rata inmunizado para realizar la fusión de las células del bazo con las células de mieloma según el procedimiento conocido (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Preparación de la célula de mieloma

Puede utilizarse cualquier célula de mieloma, con tal que prolifere in vitro. Los ejemplos incluyen las estirpes celulares creadas obtenidas del ratón tales como la estirpe celular P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) de mieloma de ratón (BALB/c) resistente a la 8-azaguanina (Europ. J. Immunol. 6: 511 (1976)), SP2/0-Ag14 (SP-2) (Nature, 276: 269 (1978)), P3-X63-Ag8653 (653) (J. Immunol., 123: 1548 (1979)), P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256: 495 (1975)), y similares. Estas estirpes celulares se cultivan y se subcultivan según el procedimiento conocido (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) y 2\times10^{7} o más de las células se aseguran hasta la fusión celular.

\vskip1.000000\baselineskip

(4) Fusión celular

Se lavan las células productoras de anticuerpos obtenidas anteriormente, se añade a esto un medio de agregación de células tal como polietilenglicol-1000 (PEG-1000) o similar para fusionar las células, y las células se ponen en suspensión en el medio. Para lavar las células, puede utilizarse medio MEM, PBS (1,83 g de fosfato ácido disódico, 0,21 g de fosfato dibásico de potasio, 7,65 g de cloruro sódico, 1 litro de agua destilada, pH 7,2) o similares. Asimismo, con objeto de obtener las células diana fusionadas selectivamente, medio HAT {medio normal (medio preparado añadiendo glutamina (1,5 mM), 2-mercaptoetanol (5\times10^{-5} M), gentamicina (10 \mug/ml) y suero de ternero fetal (FCS) (10%, preparado por CSL) al medio RPHT-1640 enriquecido más con hipoxantina (10^{-4} M), timidina (1,5\times10^{-5} M) y aminopterina (4\times10^{-7} M)} puede utilizarse como medio para poner en suspensión las células fusionadas.

Después del cultivo, se toma una muestra de una parte del sobrenadante del cultivo y se selecciona una muestra que reacciona con una proteína antigénica pero que no reacciona con una proteína no antigénica mediante inmunoanálisis enzimático. Después de esto, se realiza la clonación por un método de dilución limitativo y un hibridoma que presenta un título de anticuerpo muy estable se selecciona como hibridoma monoclonal productor de anticuerpos.

\vskip1.000000\baselineskip

(5) Selección del hibridoma que produce anticuerpo antimonoclonal anti-CCR4

Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti-CC4 se selecciona por el ensayo descrito a continuación según el procedimiento descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) o similares. Según el ensayo, puede determinarse la actividad de unión del anticuerpo humano anti-CCR4 contenida en un sobrenadante del cultivo de un transformante que produce el anticuerpo híbrido humano anti-CCR4 descrito a continuación o el fragmento de anticuerpo o todos los anticuerpos anti-CCR4 purificados.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunoanálisis enzimático

Se recubre un antígeno en una placa ELISA de 96 pocillos. Se lleva a cabo una reacción utilizando un sobrenadante de cultivo de hibridoma o un anticuerpo purificado obtenido en el procedimiento anterior como primer anticuerpo.

Después de la reacción del primer anticuerpo, se lava la placa y se añade a ésta un segundo anticuerpo.

El segundo anticuerpo se obtiene marcando un anticuerpo que puede reconocer inmunoglobulina del primer anticuerpo con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un compuesto radioactivo o similares. Si se utiliza un ratón para la producción del hibridoma, como segundo anticuerpo se utiliza un anticuerpo que puede reconocer la inmunoglobulina de ratón.

Tras la reacción, se lleva a cabo una reacción adecuada para la sustancia utilizada para marcar el segundo anticuerpo para seleccionar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con el antígeno.

Ejemplos de hibridoma incluyen el hibridoma KM2160.

(6) Purificación del anticuerpo monoclonal

Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal anti-CCR4 obtenido en el apartado 1(4) anterior se administran por inyección intraperitoneal en ratones de 8 a 10 semanas de edad o ratones atímicos tratados con pristano (0,5 ml de 2, 6, 10, 14-tetrametilpentadecano (pristano) se administra por vía intraperitoneal, seguido de alimentación durante 2 semanas) a una dosis de 2\times10^{7} a 5\times10^{6} células/animal. El hibridoma produce tumor ascítico en 10 a 21 días. Se recoge el fluido ascítico de los ratones o de los ratones atímicos, se centrifuga, se somete a salificación con sulfato amónico saturado del 40 al 50% o a precipitación con ácido caprílico, y a continuación se pasa a través de una columna de DEAE-Sepharose, una columna de proteína A o Cellulofine GSL 2000 (fabricada por Seikagaku Corporation) para recoger una fracción de IgG o IgM como anticuerpo monoclonal purificado.

La subclase del anticuerpo monoclonal purificado puede determinarse utilizando un kit de tipificación del anticuerpo monoclonal de ratón o un kit de tipificación del anticuerpo monoclonal de rata. La cantidad de proteína puede determinarse por el procedimiento de Lowry o por absorbancia a 280 nm.

La subclase de un anticuerpo significa los isótopos comprendidos en la clase tal como IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en el caso de ratón, e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en el caso del hombre.

Los tipos IgG2a, IgG3b e IgG3 de ratón e IgG1 e IgG3 del hombre presentan actividad citotóxica relativamente alta tales como la actividad de CDC, la actividad de ADCC y similares, de modo que son útiles en su aplicación a tratamientos médicos.

2. Producción de anticuerpo humanizado (1) Construcción del vector de expresión del anticuerpo humanizado

Un vector de expresión del anticuerpo humanizado es un vector de expresión para células de animales en la que se han insertado los genes que codifican una zona C de la cadena H y una zona C de la cadena L de un anticuerpo humano, y se construye clonando cada zona C de la cadena H y cada zona C de la cadena L de un anticuerpo humano en un vector de expresión para la célula animal.

La zona C de un anticuerpo humano puede ser una zona C de la cadena H y una zona C de la cadena L de cualquier anticuerpo humano. Los ejemplos incluyen una zona C que pertenece a una subclase IgG1 de una cadena H de un anticuerpo humano (denominado en lo sucesivo "hC\gamma1"), una zona C que pertenece a la clase \kappa de una cadena L de un anticuerpo humano (denominado en lo sucesivo "hC\kappa"), y similares. Como gen que codifica a la zona C de la cadena H y a la zona C de la cadena L de un anticuerpo humano, puede utilizarse un ADN cromosómico que comprende un exón y un intrón o ADNc.

Como vector de expresión para la célula animal, puede utilizarse cualquier vector de expresión, con tal que pueda insertarse en éste una zona C de un anticuerpo humano y expresarse en el mismo. Los ejemplos incluyen pAGE107 (Cytotechnology, 3: 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101: 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27: 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)), pSGI \betad2-4 (Cytotechnology, 4: 173 (1990)), y similares. Ejemplos de activador y potenciador utilizados para un vector de expresión para una célula animal incluyen un activador precoz SV40 y potenciador (J. Biochem., 101: 1307 (1307 (1987)), un activador LTR del virus de la leucemia de ratón de Moloney y potenciador (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149: 960 (1987)), un actividad de la cadena H de inmunoglobulina (Cell, 41: 479 (1985)) y potenciador (Cell, 33: 717 (1983)), y similares.

El vector de expresión del anticuerpo humanizado puede ser cualquiera de un tipo en el que un gen que codifica una cadena H de anticuerpo y un gen que codifica una cadena L de anticuerpo existe en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión del anticuerpo humanizado, a la facilidad de introducción en las células animales y al equilibrio entre las cantidades de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células animales, es más preferible un tipo tándem del vector de expresión del anticuerpo humanizado (J. Immunol. Methods, 167: 271 (1994)). Ejemplos del tipo tándem del vector de expresión del anticuerpo humanizado incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 (HYBRIDOMA, 17: 559 (1998)), y similares.

El vector de expresión del anticuerpo humanizado construido puede utilizarse para la expresión de un anticuerpo híbrido humano y de un anticuerpo injertado en CDR humano en las células animales.

(2) Preparación del ADNc que codifica la zona V del anticuerpo extraído de un animal no humano y análisis de la secuencia de aminoácidos

Los ADN que codifican la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano tal como un anticuerpo de ratón se obtienen de la manera siguiente.

Se extrae el ARNm de las células de hibridoma que producen un anticuerpo de ratón o similares para sintetizar el ADNc. El ADNc sintetizado se inserta en un vector tal como un fago, un plásmido o similares, para preparar el banco de ADNc. Cada fago recombinante o plásmido recombinante que contienen el ADNc que codifica una zona V de la cadena H y un fago recombinante o un plásmido recombinante que contiene el ADNc que codifica una zona V de la cadena L se aísla del banco utilizando una parte de la zona C o la zona V de un anticuerpo de ratón como sonda. Se determinan las secuencias nucleotídicas completas de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o en el plásmido recombinante, y las secuencias de aminoácidos completas de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L se deducen de las secuencias nucleotídicas.

El animal no humano puede ser cualquier animal tal como un ratón, rata, hámster, conejo o similares, con tal que pueda producirse la célula de hibridoma a partir de éste.

Ejemplos del procedimiento para preparar el ARN completo de una célula de hibridoma incluyen un procedimiento con tioacetato-cesio-trifluoroacetato (Methods in Enzymol., 154: 3 (1987)) y similares. Ejemplos del procedimiento para preparar el ARNm del ARN completo incluyen un procedimiento en columna de celulosa inmovilizada por oligo (dT) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York (1989)) y similares. Asimismo, ejemplos de un kit para preparar el ARNm de una célula de hibridoma incluyen el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.

Ejemplos del procedimiento para sintetizar el ADNc y preparar un banco de ADNc incluyen los procedimientos conocidos (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York (1989); Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34); un procedimiento que utiliza un kit disponible en el mercado tal como Super Script^{TM} Plasmid System para la síntesis de ADNc y Plasmid Cloning (fabricado por GIBCO BRL), el kit ZAP-cDNA (fabricado por Stratagene), etc.; y similares.

El vector en el que el ADNc sintetizado que utiliza el ARNm extraído de una célula de hibridoma como plantilla se inserta para preparar el banco de ADNc puede ser cualquier vector, con tal que pueda insertarse el ADNc. Los ejemplos incluyen ZAP Express (Strategies, 5: 58 (1992)), pBluescript II SK(+) (Nucleic Acids Research, 17: 9494 (1989)), \lambdazapII (fabricado por Stratagene), \lambdagt10 y \lambdagt11 (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)), Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), \lambdaExCell y pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3: 280 (1983)), pUC18 (Gene, 33: 103 (1985)), y similares.

Puede utilizarse cualquier E. coli para introducir el banco de ADNc construido por un fago o vector plásmido, con tal que pueda introducirse, expresarse y mantenerse el banco de ADNc. Los ejemplos incluyen XL1-Blue MRF' (Strategies, 5: 81 (1992)), C600 (Genetics, 39: 440 (1954)), Y1088 y Y1090 (Science, 222: 778 (1983)), NM522 (J. Mol. Biol., 166: 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol., 16: 118 (1966)), JM105 (Gene, 38: 275 (1985)), y similares.

Un procedimiento de hibridación de colonias o de hibridación en placa que utiliza una sonda de isótopo o marcada por fluorescencia puede utilizarse para seleccionar los clones de ADNc que codifican una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano en el banco de ADNc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York (1989)). Asimismo, los ADNc que codifican una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L pueden prepararse por la reacción en cadena de la polimerasa (denominada en lo sucesivo "PCR"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) preparando cebadores y utilizando el ADNc preparado a partir del ARNm o del banco de ADNc como plantilla.

La secuencia nucleotídica del ADNc puede determinarse digiriendo el ADNc seleccionado por el procedimiento anterior con las enzimas de restricción apropiadas y similares, clonando los fragmentos en un plásmido tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similares, realizando la reacción por un procedimiento de análisis de nucleótidos utilizado habitualmente tal como el procedimiento didesoxi de Sanger, F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977)) o similares, y a continuación analizando la secuencia que utiliza un analizador de secuencias nucleotídicas automático tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) o similares.

Si los ADNc obtenidos codifican las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo que contiene una secuencia señal secretora puede confirmarse estimando las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de la secuencia nucleotídica determinada y comparándolas con las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de los anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep.. Health and Human Services (1991)). La longitud de la secuencia señal secretora y de la secuencia de aminoácidos del terminal N puede deducirse comparando las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo que comprende una secuencia señal secretora con las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de los anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep.. Health and Human Services (1991)), y puede conocerse el subgrupo al que pertenecen. Además, puede encontrarse la secuencia de aminoácidos de cada uno de las CDR de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L comparando las secuencias de aminoácidos obtenidas con las secuencias de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de los anticuerpos conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)).

Además, lo nuevo de la secuencia puede examinarse realizando una búsqueda de homología con las secuencias en cualquier base de datos, por ejemplo, SWISS-PROT, PIR-Protein o similares utilizando las secuencias completas de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L, por ejemplo, según el procedimiento BLAST (J. Mol.. Biol., 215: 403 (1990)) o similar.

(3) Construcción del vector de expresión del anticuerpo híbrido humano

Puede construirse un vector de expresión del anticuerpo híbrido humano clonando los ADNc que codifican una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L del anticuerpo extraído de un animal no humano en una zona corriente arriba de los genes que codifican una zona C de la cadena H y una zona C de la cadena L de un anticuerpo humano en el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado 2(1) anterior. Por ejemplo, cada uno de los ADNc que codifica una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano se une a un ADN sintetizado que comprende las secuencias nucleotídicas en los extremos 3' de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano y las secuencias nucleotídicas en los extremos 5' de una zona C de la cadena H y de una zona C de la cadena L de un anticuerpo humano y que presenta una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción apropiada en ambos extremos, y cada ADNc se clona de modo que se expresa apropiadamente corriente arriba de los genes que codifican la zona C de la cadena H y la zona C de la cadena L del vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado 2(1) anterior para construir de este modo un vector de expresión del anticuerpo híbrido humano. Asimismo, los ADNc de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano se amplían por PCR utilizando un ADN sintético con una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción apropiada en ambos extremos, y puede clonarse cada uno en el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado 2(1) anterior.

(4) Construcción del ADNc que codifica la zona V del anticuerpo injertado con CDR humano

Los ADNc que codifican una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L de un anticuerpo humano injertado con CDR pueden obtenerse de la manera siguiente. En primer lugar, se injertan y seleccionan las secuencias de aminoácidos de los FR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de un anticuerpo humano al que las secuencias de aminoácidos de las CDR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano. Puede utilizarse cualquier secuencia de aminoácidos de los FR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de un anticuerpo humano, con tal que se extraigan de un ser humano. Los ejemplos incluyen secuencias de aminoácidos de los FR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de los anticuerpos humanos registrados en la base de datos tal como Protein Data Bank o similares, y las secuencias de aminoácidos comunes a los subgrupos de FR en la zona V de la cadena H y en la zona V de la cadena L de los anticuerpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.. Health and Human Services (1991)), y similares. Con objeto de producir un anticuerpo injertado a CDR humano con potente actividad, las secuencias de aminoácidos que presentan gran homología (por lo menos del 60% o más) con la secuencia de aminoácidos de los FR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L de un anticuerpo diana extraído de un animal no humano se selecciona preferentemente. A continuación, las secuencias de aminoácidos de las CDR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L del anticuerpo extraído de un animal no humano se injertan a las secuencias de aminoácidos seleccionadas de los FR de una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L del anticuerpo humano para diseñar las secuencias de aminoácidos de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de un anticuerpo injertado a CDR humano. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN considerando la frecuencia de utilización del codón hallado en las secuencias nucleotídicas de los genes de anticuerpos (Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dep.. Health and Human Services (1991)), y se diseñan las secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de la zona V de la cadena H y en la zona V de la cadena L de un anticuerpo humano injertado a CDR. Se sintetizan varios ADN sintéticos que tienen una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y se realiza la PCR utilizándolos. En este caso, es preferible en cada cadena H y cadena L que se diseñen 6 ADN sintéticos a la vista de la eficacia de la reacción de PCR y a las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.

Además, pueden clonarse fácilmente en el vector de expresión del anticuerpo humanizado construido en el apartado 2(1) anterior introduciendo la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción apropiada en el extremo 5' de los ADN sintéticos presentes en ambos extremos. Después de la PCR, un producto ampliado se clona en un plásmido tal como pBluescript SK (-) (fabricado por Stratagene) o similares, y las secuencias nucleotídicas se determinan según el procedimiento descrito en el apartado 2(2) anterior para obtener un plásmido que tiene secuencias de ADN que codifican la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L de un anticuerpo humano injertado a la CDR diseñada.

(5) Modificación de la secuencia de aminoácidos de la zona V del anticuerpo injertado a la CDR

Es conocido que cuando un anticuerpo humano injertado a la CDR se produce simplemente injertando solamente las CDR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de un anticuerpo extraído de un animal no humano en las FR de una zona V de la cadena H y una zona V de la cadena L de un anticuerpo humano, su actividad de unión al antígeno es inferior a la del anticuerpo original extraído de un animal no humano (BIO/TECHNOLOGY, 9: 266 (1991)). Como razón, se considera que varios residuos de aminoácidos no solamente en las CDR sino también en las FR directa o indirectamente se relacionan con la actividad de unión al antígeno en la zona V de la cadena H y en la zona V de la cadena L del anticuerpo original extraído de un animal no humano, y que se cambian a diferentes restos de aminoácidos de diferentes FR en la zona V de la cadena H y en la zona V de la cadena L de un anticuerpo humano. Con objeto de resolver el problema, en los anticuerpos humanos injertados a CDR, entre las secuencias de aminoácidos de las FR en una zona V de la cadena H y en una zona V de la cadena L de un anticuerpo humano, un resto de aminoácido que se relaciona directamente con la unión a un antígeno, o un residuo de aminoácidos que se relaciona directamente con la unión a un antígeno interactuando con un residuo de aminoácidos en CDR o manteniendo la estructura tridimensional de un anticuerpo se identifica y se modifica en un residuo de aminoácidos que se encuentra en el anticuerpo animal no humano original para aumentar de este modo la actividad de unión al antígeno que ha disminuido (BIO/TECHNOLOGY, 9: 266 (1991)). En la producción de un anticuerpo humano injertado a CDR, lo más importante es cómo identificar con eficacia los residuos de aminoácidos que se relacionan con la actividad de unión al antígeno en FR, de modo que la estructura tridimensional de un anticuerpo se construye y se analiza por cristalografía de rayos X (J. Mol. Biol., 112: 535 (1977)), diseño por ordenador (Protein Engineering, 7: 1501 (1994)) o similares. Aunque la información de la estructura tridimensional de los anticuerpos ha sido útil en la producción de un anticuerpo humano injertado a CDR, no se ha creado todavía ningún procedimiento para producir un anticuerpo humano injertado a CDR que pueda aplicarse a cualquier anticuerpo. Por consiguiente, deben ser necesarios actualmente varios intentos, por ejemplo, se producen varios anticuerpos modificados de cada anticuerpo y la relación entre cada uno de los anticuerpos modificados y se examina su actividad de unión al anticuerpo.

La modificación de la secuencia de aminoácidos de FR en la zona V de la cadena H y en la zona V de la cadena L de un anticuerpo humano puede llevarse a cabo utilizando varios ADN sintéticos para la modificación según la PCR descrita en el apartado 2(4) anterior. Con respecto al producto ampliado obtenido mediante la PCR, se determina la secuencia nucleotídica según el procedimiento descrito en el apartado 2(2) anterior de modo que se confirma si se ha realizado la modificación objetivo.

(6) Construcción del vector de expresión del anticuerpo injertado a CDR humano

Puede construirse un vector de expresión del anticuerpo injertado al CDR humano clonado los ADNc que codifican la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L del anticuerpo injertado al CDR humano construido en los apartados 2(4) y 2(5) anteriores corriente arriba de los genes que codifican la zona C de la cadena H y la zona C de la cadena L del anticuerpo humano en el vector de expresión del anticuerpo humanizado como se describe en el apartado 2(1) anterior.

Por ejemplo, cuando las secuencias de reconocimiento de unas enzimas de restricción apropiadas se introducen en el terminal 5' de los ADN sintéticos colocados a ambos extremos entre los ADN sintéticos utilizados en la construcción de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo injertado a CDR en los apartados 2(4) y 2(5), puede realizarse la clonación de modo que se expresen en una forma apropiada corriente arriba de los genes que codifican la zona C de la cadena H y la zona C de la cadena L del anticuerpo humano en el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en el apartado anterior 2(1).

(7) Expresión transitoria de los anticuerpos humanizados

Con el objetivo de evaluar de manera eficaz la actividad de unión del antígeno de varios anticuerpos humanizados producidos, los anticuerpos humanizados pueden expresarse transitoriamente utilizando el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en los apartados 2(3) y 2(6) o el vector de expresión modificado de los mismos. Puede utilizarse cualquier célula como célula hospedadora, con tal que la célula hospedadora pueda expresar un anticuerpo humanizado. Generalmente, se utiliza la célula COS-7 (ATCC CRL1651) en vista de su alta cantidad de expresión (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pág. 283 (1991)). Ejemplos del procedimiento para introducir el vector de expresión en la célula COS-7 incluye un procedimiento de DEAE-dextrano (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, pág. 283 (1991)), un procedimiento de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987)), y similares.

Tras la introducción del vector, puede determinarse la cantidad de expresión y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante del cultivo por inmunoanálisis enzimático ((ELISA); Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)), y similares.

(8) Expresión estable del anticuerpo humanizado

Un transformante que produce un anticuerpo humanizado de forma estable puede obtenerse introduciendo en una célula hospedadora apropiada el vector de expresión del anticuerpo humanizado descrito en los apartados anteriores 2(3) y 2(6).

Ejemplos del procedimiento para introducir el vector de expresión en una célula hospedadora incluyen la electroporación (solicitud de patente japonesa sin examinar publicada nº 257891/90, Cytotechnology, 3: 133 (1990)) y similares.

Puede utilizarse cualquier célula como célula hospedadora en la que se haya introducido el vector de expresión del anticuerpo humanizado, con tal que pueda expresar un anticuerpo humanizado. Los ejemplos incluyen la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), la célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), la célula CHO en la que el gen con dihidrofolato reductasa (denominado en lo sucesivo "gen DHFR") es defectuoso (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4216 (1980)), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, denominada en lo sucesivo "célula YB2/0") y similares.

Una célula hospedadora para producir un anticuerpo que presenta actividad citotóxica mediada por la célula dependiente del anticuerpo es preferentemente una célula que presenta una baja actividad enzimática o ninguna actividad enzimática con respecto a una reacción en la que se añade fucosa para unir la N-acetilglucosamina a la zona Fc del anticuerpo.

Ejemplos de una enzima para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina incluyen las enzimas relacionadas con el enlace \alpha1,6 tal como la \alpha1,6-fucosiltransferasa, enzimas relacionadas con la biosíntesis de la GDP-fucosa, por ejemplo, GDP-manosa 4,6-deshidratasa, GDP-\beta-L-fucosapirofosforilasa, fococinasa y similares. Por consiguiente, las células obtenidas al someter a las células utilizadas como célula hospedadora a la mutación artificial en la que se suprime el gen de la enzima o se muta el gen para reducir o suprimir de este modo la actividad enzimática pueden utilizarse también como células hospedadoras.

Como célula hospedadora, puede utilizarse cualquier célula de bacteria, levadura, células animales, células de insecto, células de plantas y similares, con tal que pueda producirse en las mismas el anticuerpo recombinante. Se prefieren las células de animales y los ejemplos incluyen las células YB2/0, las células de mieloma de ratón tales como la célula NSO y la célula SP2/0, las células de ovario de hámster chino tales como la célula CHO/dhfr y la célula CHO/DG44, células de mono tales como la célula COS, células de mieloma humano tales como la célula Namalwa y similares.

Puede obtenerse un anticuerpo que contiene la cadena de azúcar unida a la zona Fc del anticuerpo que tiene un alto contenido de cadena de azúcar que se une al N-glucósido en la que la fucosa no se une a la N-acetilglucosamina utilizando la célula hospedadora. El anticuerpo presenta actividad citotóxica mediada por las células dependientes del anticuerpo mayor frente a las células que expresan a CCR4 que un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma obtenido de un animal no humano.

Tras la introducción del vector de expresión, los transformantes que expresan un anticuerpo humanizado de forma estable se seleccionan según el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 257891/90, cultivando en un medio para cultivo de células animales que contiene un agente tal como sulfato G418 (denominado en lo sucesivo "G418", fabricado por Sigma) o similares. Ejemplos del medio para el cultivo de células animales incluyen el medio PRMI1640 (fabricado por Nissui Pharmaceutical), medio GIT (fabricado por Nissui Pharmaceutical), medio EX-CELL302 (fabricado por JRH), medio IMDM (fabricado por GIBCO BRL), medio hybridoma-SFM (fabricado por GIBCO BRL), medio obtenido añadiendo varios aditivos tales como FCS a este medio, y similares. El anticuerpo humanizado puede producirse y acumularse en un medio de cultivo cultivando los transformantes seleccionados en un medio. La cantidad de expresión y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante del cultivo puede determinarse por ELISA o similares. Asimismo, en el transformante, puede aumentarse la cantidad de expresión del anticuerpo humanizado utilizando el sistema de ampliación dhfr según el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 257891/90.

El anticuerpo humanizado puede purificarse a partir del sobrenadante del cultivo del transformante utilizando una columna con proteína A (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)). Puede utilizarse cualquier otro procedimiento convencional para la purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede purificarse mediante una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración y similares. El peso molecular de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo humanizado purificado o la molécula de anticuerpo completa se determina por electroforesis en gel de poliacrilamida (denominado en lo sucesivo "SDS-PAGE") [Nature, 227: 680 (1970)], inmunotransferencia Western (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 12 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)) y similares.

(9) Evaluación de la actividad del anticuerpo humanizado

La reactividad de unión a un anticuerpo y la actividad de unión a una estirpe celular que expresa a CCR4 del anticuerpo humanizado purificado puede determinarse por ELISA, un método inmunofluorescente (Cancer Immuno Immunother., 36: 373 (1993)). La actividad citotóxica frente a una estirpe celular del cultivo positivo al antígeno puede evaluarse determinando la actividad de CDC, la actividad de ADCC o similares (Cancer Immuno Immunother., 36: 373 (1993)).

\vskip1.000000\baselineskip

3. Procedimiento para detectar y determinar CCR4 utilizando anticuerpo anti-CCR4

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para detectar inmunológicamente y determinar CCR4 o CCR4 que expresa una célula sobre la superficie de la misma utilizando el anticuerpo de la presente invención.

El procedimiento para detectar inmunológicamente y determinar CCR4 o a una célula que expresa a CCR4 sobre la superficie de la misma utilizando el anticuerpo de la presente invención incluye un método inmunofluorescente, un ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA), un inmunoanálisis marcado con material radioactivo (RIA), un método de tinción inmunohistoquímica tal como un procedimiento de tinción de inmunocitos, un procedimiento de tinción del inmunotejido o similares (procedimiento ABC, procedimiento CSA, etc.), el inmunoanálisis enzimático anterior, un ELISA en sandwich (Monoclonal Antibody Experiment Manual (publicado por Kodansha Scientific, 1987), Second Series Biochemical Experiment Course, vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, publicada por Tokio Kagaku Dojin (1986)).

El método inmunofluorescente comprende hacer reaccionar una célula independiente, tejido o similares con el anticuerpo de la presente invención, haciendo reaccionar el reactivo con un anticuerpo de inmunoglobulina o un fragmento de unión marcado con una sustancia fluorescente con el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o similares y a continuación midiendo la sustancia fluorescente con un citómetro de flujo.

El ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA) comprende hacer reaccionar una célula separada o una solución del triturado de ésta, el sobrenadante del cultivo celular, suero, fluido pleural, fluido ascítico, fluido ocular o similares con el anticuerpo de la presente invención, haciendo reaccionar el reactivo con un anticuerpo anti-inmunoglobulina o un fragmento de unión marcado con una enzima tal como peroxidasa, biotina o similares, y a continuación midiendo el colorante desarrollado resultante con un fotómetro de absorción.

El inmunoanálisis marcado con material radioactivo (RIA) comprende hacer reaccionar una célula independiente o una solución del triturado del mismo, el tejido o solución de triturado del mismo, el sobrenadante del cultivo celular, el suero, el fluido pleural, el fluido ascítico, el fluido ocular o similares con el anticuerpo de la presente invención, haciendo reaccionar además el reactivo con un anticuerpo anti-inmunoglobulina o un fragmento de unión marcado con radioisótopo, y a continuación midiendo la radioactividad con un contador de centelleo o similares.

Los procedimientos de tinción de inmunocitos y de tinción del inmunotejido comprenden hacer reaccionar una célula aislada, tejido o similares con el anticuerpo de la presente invención, hacer reaccionar el reactivo con un anticuerpo anti-inmunoglobulina o un fragmento marcado con una sustancia con fluorescencia tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC) o similares o con una enzima tal como la peroxidasa, biotina o similares, y a continuación observar la célula, tejido o similares al microscopio.

El ELISA en sandwich es un procedimiento que comprende absorber, en una placa, uno de los dos anticuerpos que tienen un epítopo diferente entre los anticuerpos de la presente invención; marcando otro anticuerpo con una sustancia fluorescente tal como FITC o similar, o una enzima tal como peroxidasa, biotina o similares; hacer reaccionar una célula aislada o una solución del triturado de la misma, el tejido o la solución del triturado del mismo, el sobrenadante del cultivo celular, el suero, el fluido pleural, el fluido ascítico, el fluido ocular o similares con la placa adsorbente de anticuerpos; y a continuación haciéndolo reaccionar con el anticuerpo marcado para llevar a cabo una reacción según la sustancia marcada.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Diagnóstico y tratamiento de la enfermedad inmunitaria mediada por Th2 o del cáncer

Como el anticuerpo humanizado de la presente invención se une específicamente a CCR4 que se expresa en una estirpe celular cultivada y presenta actividad citotóxica tal como actividad de CDC, actividad de ADC y similares, será útil en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades mediadas por Th2 y similares. Asimismo, dado que la proporción de secuencias de aminoácidos obtenidas de un anticuerpo humano en el anticuerpo humanizado es mayor que en los anticuerpos de un animal no humano, es de esperar que presente fuerte actividad citotóxica en el cuerpo humano, no presente inmunogenicidad, y sus efectos continúen durante un periodo prolongado.

Además, la producción de citocinas Th2 que son producidas por células tales como IL-4, IL-5, IL-13 y similares, puede inhibirse administrando el anticuerpo de la presente invención a las células o tejidos de un paciente experimental.

La célula Th2 utilizada en la presente invención es la célula Th2 activada preferentemente o la célula Th2 de la memoria. Ejemplos específicos incluyen las células que tienen propiedades de CD45RA- y CD4+.

Las actividades citotóxicas del anticuerpo recombinante de la presente invención se generan, por ejemplo, cuando el anticuerpo de la presente invención se une a una célula Th2 para producir de este modo apoptosis en la célula. Asimismo, la célula puede obstruirse y eliminarse produciendo apoptosis.

Asimismo, ejemplos del procedimiento para diagnosticar enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 o cánceres incluyen un procedimiento en el que una célula positiva a CCR4 humano que existe en las células o tejidos de un paciente experimental se detecta inmunológicamente como se ha descrito anteriormente.

Además, el anticuerpo de la presente invención puede utilizarse como agente de diagnóstico para enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 o cánceres, o enfermedades en las que los estados mórbidos avanzan debido al aumento anormal de la disminución de las células Th2.

Además, ya que el anticuerpo de la presente invención puede reducir o suprimir las células que expresan a CCR4 mediante su actividad citotóxica, puede proporcionarse un procedimiento de diagnóstico o un procedimiento terapéutico para las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 o cánceres, que utilice el anticuerpo de la presente invención, y agentes terapéuticos y preventivos para las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 o cánceres, que comprende el anticuerpo de la presente invención como ingrediente activo.

Las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 incluyen, independientemente de las enfermedades inflamatorias leves o graves tales como la hipersensibilidad aguda o crónica de las vías respiratorias o el asma bronquial, enfermedades atópicas de la piel incluyendo la dermatitis atópica, la rinitis alérgica, la polenosis, y similares; las enfermedades producidas por inflamación de las células competentes tales como eosinófilos, mastocitos y similares que pueden propagarse o activarse por la citocina o quimiocina liberadas desde las células Th2, las moléculas biológicamente funcionales tales como IgE y similares que son producidas por la citocina y la quimiocina liberadas de las células Th2, y similares; y las enfermedades inmunitarias en las que los estados mórbidos avanzan debido a los cambios anormales en las células Th2.

El anticuerpo de la presente invención puede administrarse solo, pero generalmente se prefiere proporcionarlo en forma de una formulación farmacéutica producida mezclándolo con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable según el procedimiento bien conocido en el campo técnico de los productos farmacéuticos.

Es preferible seleccionar una vía de administración que sea la más efectiva para realizar el tratamiento deseado tal como la administración oral o la administración parenteral, por ejemplo, la administración intraoral, la administración traqueal, la administración rectal, la inyección subcutánea, la inyección intramuscular, la inyección intravenosa y similares. La inyección intravenosa se prefiere en una formulación con anticuerpo o péptido.

La forma farmacéutica incluye pulverizadores, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, tiras y similares.

Ejemplos de formulación adecuada para su administración oral incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares.

Pueden producirse preparaciones líquidas tales como emulsiones y jarabes, utilizando aditivos tales como agua; sacáridos, por ejemplo, sacarosa, sorbitol, fructosa, etc.; glicoles, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, etc.; aceites, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, etc.; antisépticos, por ejemplo, p-hidroxibenzoato, etc.; saborizantes, por ejemplo, saborizante de fresa, menta, etc.; y similares.

Pueden producirse cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares utilizando aditivos tales como cargas, por ejemplo, lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, etc.; agentes disgregadores, por ejemplo, almidón, alginato sódico, etc.; lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, etc.; aglutinantes, por ejemplo, alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa, gelatina, etc.; tensioactivos, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos, etc.; plastificantes, por ejemplo, glicerina, etc.; y similares.

Ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen inyecciones, supositorios, pulverizadores y similares.

Pueden prepararse inyecciones utilizando un portador tal como una solución salina, solución de glucosa o una mezcla de las mismas, o similares.

Pueden prepararse supositorios utilizando un portador tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, un ácido carboxílico o similares.

Asimismo, pueden prepararse pulverizadores a partir del anticuerpo o del propio péptido o utilizando un portador o similar que no estimule las membranas mucosas orales y de las vías respiratorias de los pacientes y puede facilitarse la absorción del anticuerpo o péptido dispersándolo en forma de partículas diminutas.

Ejemplos de portador incluyen la lactosa, la glicerina y similares. Dependiendo de las propiedades del anticuerpo o péptido y del portador que ha de utilizarse, pueden producirse aerosoles, polvos secos y similares. Los aditivos a título de ejemplo en las preparaciones orales pueden añadirse también a las preparaciones parenterales.

La dosis y frecuencia de administración varían dependiendo del efecto terapéutico pretendido, del procedimiento de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similares, pero la dosis está comprendida generalmente entre 10 \mug/kg a 8 mg/kg al día para adultos.

Breve explicación de los dibujos

La Fig. 1 es un dibujo que presenta la reactividad de KM2160 con un compuesto según ELISA.

La Fig. 2 es un dibujo que presenta las etapas de construcción de los plásmidos pKM2160VH41 y pKM2160VL61.

La Fig. 3 es un dibujo que presenta la etapa de construcción de un plásmido pKANTEX2160H.

La Fig. 4 es un dibujo que presenta la etapa de construcción de un plásmido pKANTEX2160.

La Fig. 5 es un dibujo que presenta un modelo de electroforesis de SDS-PAGE (gel con gradiente 5 al 20%) del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado. La parte izquierda presenta un resultado de electroforesis realizado en condiciones no reductoras, y la parte derecha en condiciones reductoras. Las bandas 1, 2, 3 y 4 presentan patrones de electroforesis de marcadores de alto peso molecular, KM2760, marcadores de bajo peso molecular y KM2760, respectivamente.

La Fig. 6 es un dibujo que presenta la actividad de un anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado para unirse al péptido parcial CCR4 medido cambiando la concentración de anticuerpo. La ordenada y la abscisa representan la actividad de unión a CCR4 y la concentración de anticuerpo, respectivamente.

La Fig. 7 es un dibujo que presenta la reactividad de KM2760 con las células que expresan alto contenido en CCR4 (CCR4/EL-4) medidas con un clasificador de células que se activan por inmunofluorescencia.

La Fig. 8 es un dibujo que presenta la citotoxicidad por actividad de ADCC para las células CCR4/EL-4 (gráfico superior) y las células EL-4 (gráfico inferior).

La Fig. 9 es un dibujo que presenta la citotoxicidad por actividad de ADCC para PBMC humano, medido como relación positiva de anexina V en 4 fracciones que tienen diferentes capacidades de tinción de CD4 y CD45RA.

La Fig. 10 es un dibujo que presenta el efecto de inhibición de la producción de IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-\gamma de PBMC humano.

La Fig. 11 es un dibujo que presenta la reactividad del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 con las estirpes celulares de leucemia de linfocito T humano.

La Fig. 12 es un dibujo que presenta la citotoxicidad por el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 para las estirpes celulares de leucemia de linfocitos T humanos, cuya reactividad con el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 se confirmó.

La Fig. 13 es un dibujo que presenta los cambios en las características con el tiempo en una cantidad producida de IL-4 cuando se administró anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a Macaca fascicularis.

La Fig. 14 es un dibujo que presenta los cambios con el tiempo en una cantidad producida de IL-13 cuando se administró anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a Macaca fascicularis.

La Fig. 15 es un dibujo que presenta los cambios en las características con el tiempo en una cantidad producida de IL-\gamma cuando se administró anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a Macaca fascicularis.

La Fig. 16 es un dibujo que presenta los cambios en las características con el tiempo en el valor medio de los volúmenes del tumor cuando se administraba un anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a ratones a los que se había injertado por vía subcutánea células CCR4/EL-4 obtenidas de ratones que expresan gran cantidad de hCCR4.

La Fig. 17 es un dibujo que presenta la relación del valor medio de los volúmenes del tumor en un grupo administrado al valor medio de los volúmenes del tumor en un grupo no administrado cuando un anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 se administraba a ratones a los que se había injertado por vía subcutánea células CCR4/EL-4 obtenidas de ratones que expresan gran cantidad de hCCR4.

La Fig. 18 es un dibujo que presenta los cambios en las características con el tiempo en el valor medio de los volúmenes del tumor cuando se administraba un anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a ratones a los que se había injertado por vía subcutánea células CCRF-CEM (ATCC CCL-119) de la estirpe de leucemia de linfocitos T humanos que expresan a CCR4.

Formas de realización para llevar a cabo la invención

Se presentan a continuación ejemplos de la presente invención, si bien la presente invención no se limita a los mismos.

Ejemplo 1 Producción de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales anti-CCR4 de ratón

Se produjeron células de hibridoma que producen anticuerpos KM2160 monoclonales anti-CCR4 de ratón (Int. Immunol., 11: 81 (1999)) según el procedimiento siguiente.

(1) Preparación del antígeno

Se analizó la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. nº: 17) de proteína CCR4 humana (denominada en lo sucesivo "hCCR4") utilizando Genetyx Mac, y el Compuesto 1 (SEC. ID. nº: 1) se seleccionó como secuencia parcial considerada por ser apropiada como antígeno entre las porciones que presentan gran hidrofilia, terminal N y terminal C. Asimismo, una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína CCR4 de ratón (denominada en lo sucesivo "mCCR4") (BBRC, 218: 337 (1996)) correspondiente al Compuesto 1 se seleccionó como Compuesto 2 (SEC. ID. nº: 2). Las SEC. ID. nº: 1 y nº: 2 corresponden a las posiciones 2 a 29 de los aminoácidos del terminal N de la CCR4 humana y la CCR4 de ratón, respectivamente.

Las abreviaturas de los aminoácidos y sus grupos protectores utilizados en la presente invención se utilizaron según la recomendación de la IUPAC-IUB Joint Comission on Biochemical Nomenclature (European Journal of Biochemistry, 138: 9 (1984)).

A menos que se indique de otro modo, las siguientes abreviaturas representan los siguientes aminoácidos.

Ala:

L-alanina

Asn:

L-asparagina

Asp:

L-ácido aspártico

Asx:

L-ácido aspártico o L-asparagina

Cys:

L-cisteína

Gln:

L-glutamina

Glu:

L-ácido glutámico

Glx:

L-ácido glutámico o L-glutamina

Gly:

Glicina

Ile:

L-isoleucina

Leu:

L-leucina

Lys:

L-lisina

Met:

L-metionina

Phe:

L-fenilalanina

Pro:

L-prolina

Ser:

L-serina

Thr:

L-treonina

Tyr:

L-tirosina

Val:

L-valina

\vskip1.000000\baselineskip

Las siguientes abreviaturas representan grupos protectores de los aminoácidos correspondientes y de los aminoácidos protectores de la cadena lateral.

Fmoc:

9-fluorenilmetiloxicarbonilo

tBu:

t-butilo

Trt:

Tritilo

Boc:

t-butiloxicarbonilo

Fmoc-Thr(tBu)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t-butil-L-treonina

Fmoc-Ser(tBu)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t-butil-L-serina

Fmoc-Tyr(tBu)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-O-t-butil-L-tirosina

Fmoc-Lys(Boc)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-N\varepsilon-t-butiloxicarbonil-L-lisina

Fmoc-Asn(Trt)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-N\gamma-tritil-L-asparagina

Fmoc-Gln(Trt)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-N\delta-tritil-L-glutamina

Fmoc-Asp(OtBu)-OH:

Éster \beta-t-butílico del ácido N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-L-aspártico

Fmoc-Glu(OtBu)-OH:

Éster \gamma-t-butílico del ácido N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-L-glutámico

Fmoc-Cys(Trt)-OH:

N\alpha-9-fluorenilmetiloxicarbonil-S-tritil-L-cisteína

\vskip1.000000\baselineskip

Las siguientes abreviaturas representan los correspondientes disolventes de la reacción y reactivos de la reacción.

PyBOP:

Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinfosfonio

HOBt:

N-hidroxibenzotriazol

DMF:

N,N-dimetilformamida

DCM:

Diclorometano

TFA:

Ácido trifluoroacético

NMM:

N-metilmorfolina

DTT:

Ditiotreitol

\vskip1.000000\baselineskip

(i) Síntesis del Compuesto 1 (SEC. ID. nº: 1) (H-Asn-Pro-Thr-Asp-Ile-Ala-Asp-Thr-Thr-Leu-Asp-Glu-Ser-Ile-Tyr-Ser-Asn-Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Ser-Ile-Pro-Lys-Pro-Cys-OH)

En un vaso de reacción de un sintetizador automático (fabricado por Shimadzu), se colocaron 30 mg de una resina portadora (resina de clorotritilo, fabricada por AnaSpec) al que se habían añadido 16,8 \mumoles de H-Cys(Trt), se añadió a esto 1 ml de DCM/DMF (1:1), seguido de agitación durante 10 minutos, se purgó la solución, se añadió además 1 ml de DMF, seguido de agitación durante 1 minuto, se purgó la solución, y a continuación se llevó a cabo el siguiente procedimiento según el programa de síntesis proporcionado por Shimadzu.

(a) Fmoc-Pro-OH (168 \mumoles), PyBOP (168 \mumoles), HoBt\cdot1H_{2}O (168 \mumoles) y NMM (252 \mumoles) se agitaron en DMF (588,2 \mul) durante 5 minutos, la solución resultante se añadió a la resina, seguido de agitación durante 60 minutos y a continuación la solución se purgó.

(b) Se lavó la resina portadora durante 1 minuto con 707 \mul de DMF, y esta etapa se repitió 5 veces. De esta manera, se sintetizó Fmoc-Pro-Cys(Trt) sobre el portador.

A continuación, se llevaron a cabo las siguientes etapas de desprotección del grupo Fmoc.

(c) Se añadieron 707 \mul de solución de piperidina al 30%-DMF, seguido de agitación durante 4 minutos, y a continuación se purgó la solución y se repitió este procedimiento otra vez.

(d) Se lavó la resina portadora durante 1 minuto con 707 \mul de DMF y a continuación se purgó la solución y se repitió 5 veces esta etapa.

De este modo, se obtuvo la resina portadora a la que se había unido H-Pro-Cys(Trt) con el grupo Fmoc eliminado.

Después, se llevó a cabo una reacción de condensación en la etapa (a) utilizando Fmoc-Lys(Boc)-OH, y a continuación se sintetizó H-Lys(Boc)-Pro-Cys(Trt) sobre el portador mediante la etapa de lavado de (b) y las etapas de desprotección de (c) y (d). A continuación, se repitieron las etapas (a) a (d) utilizando Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Tyr(tBu)-OH en este orden en la etapa (a). A continuación se llevó a cabo la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH, se realizó la etapa de lavado (b), la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH y se repitió la etapa de lavado de (b) y a continuación se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d). Posteriormente, se repitieron las etapas (a) a (d) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH en este orden. A continuación, se llevó a cabo la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Leu-OH, se realizó la etapa de lavado de (b), se repitieron la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Leu-OH y la etapa de lavado de (b) y a continuación se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d). Después, se repitieron dos veces las etapas de la reacción de condensación de (a) y (b) utilizando Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH y Fmoc-Asn(Trt)-OH en este orden en la etapa (a) y se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d), y a continuación, después de la repetición de una serie de estas etapas, se lavó la mezcla con metanol y éter butílico en este orden y se secó a presión reducida durante 12 horas para obtener la resina portadora a la que se había unido un péptido con la cadena lateral protegida. Se añadió a esto una solución mezclada (1 ml) de TFA (90%), tioanisol (5%) y 1,2-etanoditiol (5%), y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas para separar de este modo los grupos protectores de la cadena lateral y simultáneamente cortar el péptido de la resina. Después de eliminar la resina por filtración, se añadieron aproximadamente 10 ml de éter a la solución resultante, y el precipitado formado de este modo se recuperó por centrifugación y decantación y se secó a presión reducida para obtener 63,7 mg del péptido en bruto. El producto en bruto se disolvió en 2 ml de DMF en presencia de 60 mg de DTT y a continuación se purificó por HPLC utilizando una columna en fase inversa (CAPCELL PAK C18, 30 MM I.D. \times 25 mm, fabricada or Shiseido). Se llevó a cabo la elución según el procedimiento del gradiente de densidad lineal en el que la solución acuosa de acetonitrilo al 90% que contiene TFA al 0,1% se añadió a una solución acuosa de TFA al 0,1% y se realizó la detección a 220 nm para obtener una fracción que contenía el Compuesto 1. Después de la liofilización de esta fracción, se obtuvieron 2,5 mg del Compuesto 1.

Espectrometría de masas (FAB MS): m/z = 3227,5 (M+H^{+})

Análisis de aminoácidos: Asx 4,8 (5), Glx 2,7 (2), Ser 3,1 (3), Thr 2,0 (3), Ala 1,1 (1), Pro 3,1 (3), Tyr 3,8 (4), Leu 2,2 (2), Lys 1,2 (1), Ile 3,0 (3), Cys 1,2 (1).

\vskip1.000000\baselineskip

(ii) Síntesis del compuesto 2 (SEC. ID. nº: 2) (H-Asn-Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Asp-Thr-Thr-Gln-Asp-Glu-Thr-Val-Tyr-Asn-Ser-Tyr-Tyr-Phe-Tyr-Glu-Ser-Met-Pro-Lys-Pro-Cys-OH)

Utilizando 50 mg de una resina portadora (resina de clorotritilo, fabricada por AnaSpec) a la que se habían unido 28,0 \mumoles de H-Cys(Trt) como material de partida, se repitieron las etapas (a) a (d) utilizando Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-Tyr(tBu)-OH en este orden en la etapa (a) de la misma manera que en (i). A continuación se llevó a cabo la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH, se realizó la etapa de lavado (b), la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH y se repitió la etapa de lavado de (b) y a continuación se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d). A continuación, se llevó a cabo la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Asn(Trt)-OH, se llevó a cabo la etapa de lavado de (b), la reacción de condensación de la etapa (a) que utiliza Fmoc-Asn(Trt)-OH y la etapa de lavado de (b) se repitieron y a continuación se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d). Posteriormente, se repitieron las etapas (a) a (d) utilizando Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH en este orden. A continuación, se llevó a cabo la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc-Gln(Trt)-OH, se realizó la etapa de lavado de (b), se repitieron otra vez la reacción de condensación de la etapa (a) utilizando Fmoc- Gln(Trt)-OH y la etapa de lavado de (b) y a continuación se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d). Después, se repitieron dos veces las etapas de la reacción de condensación de (a) y (b) utilizando Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Fmoc-Asn(Trt)-OH en este orden en la etapa (a) y se llevaron a cabo las etapas de desprotección de (c) y (d), y a continuación, después de la repetición de una serie de estas etapas, se lavó la mezcla y se secó para obtener la resina portadora a la que se había unido un péptido con la cadena lateral protegida. Se obtuvo un péptido (96,3 mg) eliminando los grupos protectores de la cadena lateral y cortando el péptido de la resina de la misma manera que en (i) y además se purificó por HPLC utilizando una columna en fase inversa para obtener 5,8 mg del Compuesto 2.

Espectrometría de masas (TOFMS): m/z = 3297,7 (M+H^{+})

Análisis de aminoácidos: Asx 4,1 (5), Glx 4,3 (4), Ser 2,0 (2), Thr 4,6 (5), Ala 1,0 (1), Pro 2,2 (2), Tyr 3,9 (4), Val 1,9 (2), Met 1,0 (1), Phe 1,0 (1), Lys 1,1 (1), Cys 1,1 (1).

(2) Preparación del inmunógeno

El péptido parcial hCCR4 obtenido en el Ejemplo 1(1) se utilizó como inmunógeno después de preparar su conjugado con KLH (Calbiochem) mediante el siguiente procedimiento para aumentar su inmunogenicidad. Es decir, se disolvió KLH en PBS para obtener 10 mg/ml, y un volumen 1/10 de 25 mg/ml de MBS (Nakalai Tesque) se añadió gota a gota a esto, seguido de agitación durante 30 minutos. Se eliminó el MBS libre mediante una columna de filtración en gel tal como una columna Sephadex G-25 que había sido equilibrada de antemano con PBS o similares, y 2,5 mg del KLH-MB resultante se mezclaron con 1 mg del péptido disuelto en tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 7,0), seguido
de agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la reacción, se dializó la mezcla frente a PBS.

(3) Inmunización de animales y producción de células productoras de anticuerpos

Se administraron 100 \mug del conjugado péptido-KLH preparado en el Ejemplo 1(2) a ratas (Balb/c) hembra de 5 semanas de vida junto con 2 mg de gel de aluminio y 1\times10^{9} células de vacuna contra la tos ferina (preparada por Chiba FERUM Institute), y 2 semanas después, se administraron 100 \mug del conjugado una vez a la semana un total de 4 veces. Se tomó una muestra de sangre de cada animal del plexo venoso del fondo del ojo, se examinó su título de suero por un inmunoanálisis enzimático descrito a continuación, y se extirpó el bazo 3 días después de la inmunización final de un ratón que presentaba un título de anticuerpos suficiente. Se extirpó el bazo de un ratón el 3^{er} día después de la administración final y se cortó en piezas en MEM (preparado por Nissui Pharmaceutical) y las células se desligaron un par de fórceps y se centrifugaron (1.200 rpm, 5 minutos), se eliminó el sobrenadante seguido de tratamiento con 3 ml de un tampón de Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 ó 2 minutos para eliminar los eritrocitos. Las células restantes se lavaron más tres veces con MEM y se utilizaron para la fusión celular.

(4) Preparación de células de mieloma de ratón

Se cultivó una estirpe celular de mieloma de ratón resistente a la 8-azaguanina, P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL-1597, denominada en lo sucesivo "P3-U1") y se utilizó como línea progenitora en la fusión celular.

(5) Preparación de células de hibridoma

Las células de bazo y las células de mieloma obtenidos en el Ejemplo 1(3) y (4) se mezclaron en una proporción de 10:1, seguido de centrifugación (1.200 rpm, 5 minutos) para eliminar el sobrenadante, se añadieron a las células precipitadas de este modo 0,5 ml de una solución de polietilenglicol (solución que contiene 2 g polietilenglicol-1000, 2 ml de MEM y 0,7 ml de DMSO) por cada 10^{8} células de bazo en condiciones de 37ºC, seguido de suspensión a fondo. Después, se añadieron 1 a 2 ml de MEM varias veces a intervalos de 1 a 2 minutos, y se ajustó el volumen final a 50 ml con MEM. Después de eliminar el sobrenadante por centrifugación (900 rpm, 5 minutos), se puso en suspensión el precipitado en 100 ml de medio HAT, se colocó en 100 \mul/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo Bakelite), seguido de cultivo en una incubadora con 5% de CO_{2} a 37ºC durante 10 a 14 días. Utilizando los pocillos en los que se observaba propagación de la célula fusionada, se determinó la actividad de unión del péptido parcial hCCR4 (compuesto 1) en el sobrenadante del cultivo mediante el ELISA descrito en 2(3) del Ejemplo 2. Cada pocillo en el que se confirmó que la actividad se clonó en un total de 2 veces de dilución limitativa, cambiando una vez el medio a medio HT y a continuación cambiando el medio a medio normal. De esta manera, se obtuvo una célula KM2160 de hibridoma que produce el anticuerpo KM2160 de ratón. Como se muestra en la Fig. 1, KM2160 reaccionó específicamente con el péptido parcial hCCR4 (Compuesto 1).

Ejemplo 2 Preparación de anticuerpo híbrido anti-CCR4: 1. Aislamiento y análisis del ADNc que codifica a la zona V del anticuerpo anti-CCR4 de ratón (1) Preparación del ARNm de células de hibridoma que produce el anticuerpo anti-CCR4 de ratón

Se preparó un ARNm de la célula KM2160 de hibridoma descrita en el Ejemplo 1. Se prepararon aproximadamente 48 \mug de ARNm de 8\times10^{7} células de la célula KM2160 de hibridoma utilizando un kit para preparación de ARNm, Fast Track ARNm Isolation Kit (fabricado por Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

(2) Producción del banco de ADNc con cadena H y cadena L del anticuerpo anti-CCR4 de ratón

Se sintetizó el ADNc que tiene adaptadores EcoRI-NotI en ambos terminales a partir de 5 \mug del ARNm de KM2160 obtenido en 1(1) del Ejemplo 2 utilizando el kit de síntesis de ADNc (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante. El ADNc preparado de este modo se disolvió en 20 \mul de agua esterilizada y se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y los fragmentos de ADNc de aproximadamente 1,5 kb correspondientes a la cadena H del anticuerpo de tipo IgG y aproximadamente los fragmentos del ADNc de 1,0 kb correspondientes a la cadena L del tipo \kappa se recubrieron respectivamente utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). A continuación, utilizando el kit del vector tratado con EcoRi/CIAP digerido previamente con \lambdaZAPII (fabricado por Stratagene), cada 0,1 \mug de los fragmentos de ADNc de 1,5 kb y cada 0,1 \mug de los fragmentos de ADNc de aproximadamente 1,0 kb se ligó a 1 \mug del vector \lambdaZAPII que se había digerido con una enzima de restricción EcoRI y se desfosforiló el terminal con fosfatasa alcalina de intestino de ternero según las instrucciones del fabricante. Una fracción de 2,5 \mul de cada solución de reacción después de la ligadura se empaquetó en el fago \lambda utilizando GigapackIII Gold Packaging Extract (fabricado por Stratagene) según las instrucciones del fabricante, y a continuación se infectó la estirpe XL1-Blue de Escherichia coli (Biotechniques, 5: 376 (1987)) con una cantidad apropiada del fago para obtener 9,3\times10^{4} de clones del fago como el banco de ADNc con cadena H de KM2160 y 7,4\times10^{4} de clones del fago como banco de ADNc con cadena L. A continuación, cada fago se fijó en un filtro Hybond-N+
de membrana de nilón (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante.

(3) Clonación de los ADNc con cadena H y cadena L del anticuerpo anti-CCR4 de ratón

Utilizando el ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech), según las instrucciones del fabricante, se detectaron los clones en los filtros de la membrana de nilón del banco de ADNc con cadena H KM2160 y el banco de ADNc con cadena L preparados en 1(2) del Ejemplo 2 utilizando ADNc de la zona C de un anticuerpo de ratón (la cadena H es un fragmento BamHI-EcoRI del ADNc de C\gamma1 de ratón (EMBO J., 3: 2047 (1984)), la cadena L es un fragmento de HpaI-EcoRI del ADNc de C\kappa (Cell, 22: 197 (1980)) como sonda, y se obtuvieron los clones del fago unidos fuertemente a la sonda como 10 clones para cada una de las cadenas H y L. A continuación, cada clon del fago se convirtió en plásmido por el procedimiento de escisión in vivo utilizando el kit de clonación \lambdaZAPII según las instrucciones del fabricante (fabricado por Stratagene). Utilizando el BigDye Terminador Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems), se analizó la secuencia nucleotídica del ADNc contenida en cada plásmido obtenido de esta manera con un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 del mismo fabricante según las instrucciones del fabricante. Como resultado, se obtuvieron un plásmido pKM2160H4 que contiene un ADN con cadena H completo funcional y un plásmido pKM2160L6 que contiene un ADN con cadena L completo, en el que una secuencia de ATG considerada que es el codón de iniciación está presente en el extremo 5' del ADNc.

(4) Análisis de la secuencia de aminoácidos de la zona V del anticuerpo anti-CCR4 de ratón

En las SEC. ID. nº: 3, nº: 15, nº: 4 y nº: 16, se presentan respectivamente una secuencia nucleotídica completa de la zona V de la cadena H contenida en el plásmido pKM2160H4, una secuencia completa de aminoácidos de la zona V de la cadena H deducida a partir de ésta, una secuencia nucleotídica completa de la zona V de la cadena L contenida en el plásmido pKM2160L6 y una secuencia de aminoácidos completa de la zona V de la cadena H deducida a partir de ésta. Asimismo, existen muchas secuencias nucleotídicas que corresponden a las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 15 y nº: 16 aparte de las representadas por la SEC. ID. nº: 3 y nº: 4, y todas ellas están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Basándose en la comparación con los datos de la secuencia de los anticuerpos de ratón conocidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)) y la comparación con los resultados del análisis de las secuencias de aminoácidos del terminal N con cadena H y cadena L del anticuerpo KM2160 de ratón anti-CCR4 purificado realizado utilizando un secuenciador de proteínas (PPSQ-10, fabricado por Shimadzu), se descubrió que cada ADNc aislado de este modo es un ADNc completo que codifica el anticuerpo KM2160 de ratón anti-CCR4 que contiene las secuencias señal secretoras que son aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 15 en la cadena H y los aminoácidos de las posiciones 1 a 19 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 16 en la cadena L.

A continuación, se examinó la novedad de las secuencias de aminoácidos de las zonas V de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo KM2160 de ratón anti-CCR4. Utilizando el paquete GCG (versión 9.1, fabricado por Genetics Computer Group) como sistema analizador de secuencias, se investigó la base de datos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas conocidas por el procedimiento BLAST (Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997)). Como resultado, no se encontraron secuencias que coincidieran completamente tanto para la cadena H como para la cadena L, de modo que se confirmó que la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L del anticuerpo KM2160 anti-CCR4 de ratón son secuencias nuevas de aminoácidos.

Asimismo, las CDR de la zona V de la cadena H y de zona V de la cadena L del anticuerpo KM2160 de ratón anti-CCR4 se identificaron comparando con las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos conocidos. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la zona V de la cadena H del anticuerpo KM2160 anti-CCR4 de ratón se presentan en la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la zona V de la cadena L en la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

2. Expresión estable del anticuerpo híbrido anti-CCR4 utilizando células de animales (1) Construcción del vector de expresión pKANTEX2160 del anticuerpo anti-CCR4 híbrido

Se construyó el vector de expresión pKANTEX2160 del anticuerpo anti-CCR4 híbrido de la manera siguiente, utilizando un vector de expresión pKANTEX93 del anticuerpo humanizado que expresa un IgG1 humano y un anticuerpo de tipo \kappa y los plásmidos pKM2160H4 y pKM2160L6 obtenidos en 1(3) del Ejemplo 2.

Un ADN sintético que tiene las secuencias nucleotídicas mostradas en las SEC. ID. nº: 11 y nº: 12 se diseñó con objeto de obtener el ADN con zona V de la cadena H de KM2160 por PCR, y otro ADN sintético que tiene las secuencias nucleotídicas mostradas en la SEC. ID. nº: 13 y nº: 14 para obtener el ADN con la zona V de la cadena L. Cada ADN sintético contiene una enzima de restricción que reconoce la secuencia en su extremo 5' para su clonación en pKANTEX93, y la síntesis del ADN se encargó a Genset Inc. El plásmido pKM2160H4 (20 ng) obtenido en 1(3) del Ejemplo 2 se añadió a un tampón que contenía 50 \mul del tal como nº 1 para PCR unido a la KOD ADN polimerasa (fabricado por TOYOBO), dNTP 0,2 mM, cloruro de magnesio 1 mM y 0,5 \muM del ADN sintético que tiene las secuencias nucleotídicas representadas por la SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, y la mezcla se calentó a 94ºC durante 3 minutos. Después, se añadieron 2,5 unidades de KOD ADN polimerasa (fabricada por TOYOBO), se sometió la mezcla a 25 ciclos de reacción incluyendo cada ciclo calentamiento a 94ºC durante 30 segundos a 58ºC durante 30 segundos y a 74ºC durante 1 minuto, utilizando un DNA termal cycler GeneAmp PCR System 9600 (fabricado por PERKIN ELMER). De la misma manera, se añadieron 20 ng del plásmido pKM2160L6 obtenido en el apartado 1(3) del Ejemplo 2 a un tampón que contenía 50 \mul de tampón nº 1 para PCR acoplado a la KOD ADN polimerasa (fabricado por TOYOBO), dNTP 0,2 mM, cloruro de magnesio 1 mM y 0,5 \muM del ADN sintético que presenta las secuencias nucleotídicas representas por la SEC. ID. nº: 13 y nº: 14, y se llevó a cabo la PCR de la misma manera que la descrita anteriormente. La solución de reacción (10 \mul) se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y a continuación un producto de PCR de la zona V de la cadena H de aproximadamente 0,46 kb y un producto de PCR de la zona V de la cadena L de aproximadamente 0,43 kb se recuperaron cada uno utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

A continuación, 0,1 \mug del ADN obtenido digiriendo un plásmido pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) con una enzima de restricción SmaI (fabricado por Takara Shuzo) y aproximadamente 0,1 \mug de cada uno de los productos de la PCR obtenidos anteriormente se añadieron para dar 7,5 \mul de volumen final de agua esterilizada y 7,5 \mul de la solución I del TAKARA DNA Ligation Kit Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo) y 0,3 \mul de una enzima de restricción SmaI se añadieron a esto, y la mezcla se dejó reaccionar a 22ºC durante la noche. Utilizando la solución de ADN del plásmido recombinante, se transformó el DH5\alpha de E. coli (fabricado por TOYOBO). Cada ADN plásmido se preparó a partir de los clones transformantes y se sometió a la reacción utilizando el BigDye Terminador Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems), según las instrucciones del fabricante, y se analizó la secuencia nucleotídica con un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 del mismo fabricante. De este modo, se obtuvieron los plásmidos pKM2160VH41 y pKM2160VL61 mostrados en la Fig. 2 que tienen las secuencias nucleotídicas deseadas.

A continuación, 3 \mug del vector de expresión pKANTEX93 del anticuerpo humanizado y 3 \mug del pKM2160VH41 obtenidos anteriormente se añadieron a un tampón que contenía 30 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, 10 unidades de una enzima de restricción ApaI (fabricado por Takara Shuzo) se añadieron a esto, y la mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se sometió a precipitación con etanol, y el precipitado resultante se añadió a un tampón que contenía 10 \mul de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, 100 \mug/ml de BSA y Triton X-100 al 0,01%, 10 unidades de una enzima de restricción NotI (fabricado por Takara Shuzo) se añadieron a esto y la mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y se recuperaron aproximadamente 12,75 kb y aproximadamente 0,44 kb de fragmentos de ApaI-NotI de pKANTEX93 y pKM2160VH41, respectivamente. Los dos fragmentos obtenidos de este modo se ligaron utilizando DNA Ligation Kit de TAKARA Ver. 2 según las instrucciones del fabricante, y el DH5\alpha de E. coli (fabricado por TOYOBO) se transformó utilizando la solución de ADN plásmido recombinante resultante. Se preparó cada ADN plásmido a partir de los clones transformantes y se confirmó mediante un tratamiento con enzima de restricción para de este modo obtener un plásmido pKANTEX2160H mostrado en la Fig. 3, en la que aproximadamente se habían insertado 0,44 kb del fragmento ApaI-NotI deseado.

A continuación, 3 \mug del pKANTEX2160H y 3 \mug del pKM2160VL61 obtenido anteriormente se añadieron a un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y 100 \mug/ml de BSA, se ajustó la solución para dar un volumen total de 30 \mul, se añadieron a ésta 10 unidades de una enzima de restricción BsiWI (fabricada por New England Biolabs) y la mezcla se dejó reaccionar a 55ºC durante 1 hora. A continuación, se añadió a esto una enzima de restricción EcoRI (fabricada por Takara Shuzo) y la mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción fue fraccionada por electroforesis en gel de agarosa y se recuperaron aproximadamente 13,20 kb y aproximadamente 0,41 kb de los fragmentos EcoRI-BsiWI de pKANTEX2160H y pKM2160VL61, respectivamente. Los dos fragmentos obtenidos de este modo se ligaron utilizando el kit de ligadura TAKARA DNA Ver. 2 según las instrucciones del fabricante, y DH5\alpha de E. coli (fabricado por TOYOBO) se transformó utilizando la solución del ADN plásmido recombinante resultante. Cada ADN plásmido se preparó a partir de los clones transformantes y se confirmó mediante un tratamiento con enzima de restricción para obtener de este modo un plásmido pKANTEX2160 mostrado en la Fig. 4, en el que se había insertado 0,41 kb del fragmento EcoRI-BsiWI deseado. Cuando el plásmido se sometió a la reacción utilizando el BigDye Terminador Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (fabricado por PE Biosystems) según las instrucciones del fabricante, y se analizó la secuencia nucleotídica con un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 del mismo fabricante, se confirmó que se obtuvo el plásmido deseado en el que se habían clonado el ADNc que codifica las zonas V de la cadena L y la cadena H de KM2160.

(2) Expresión estable del anticuerpo híbrido anti-CCR4 utilizando células de animales

El anticuerpo anti-CCR4 híbrido se expresó en células de animales tal como se describe a continuación utilizando el vector de expresión pKANTEX2160 del anticuerpo anti-CCR4 híbrido obtenido en el apartado 2(1) del Ejemplo 2.

El plásmido pKANTEX2160 se transformó en una forma lineal por digestión con una enzima de restricción AatII (preparada por TOYOBO) y se introdujeron 10 \mug de ésta en 4\times10^{6} células de la estirpe celular YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL1662) por electroporación (Cytotechnology, 3: 133 (1990)), y las células se pusieron en suspensión en 40 ml de medio H-SFM (fabricado por GIBCO-BRL) (enriquecido con FCS al 5%) y se distribuyeron en 200 \mul/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos (fabricada por Sumitomo Bakelite). Veinticuatro horas después de la incubación a 37ºC en una incubadora con CO_{2} al 5%, se añadió G418 para dar una concentración de 1 mg/ml, seguido de cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó un sobrenadante del cultivo de un pocillo en el que apareció una colonia de transformante resistente a G418 y se volvió confluente, y se determinó por ELISA la actividad de fijación del antígeno del anticuerpo anti-CCR4 híbrido en el sobrenadante mostrado en el apartado 2(3) del Ejemplo 2 (un anticuerpo IgG(\gamma) anti-humano de cabra marcado con peroxidasa se utilizó como anticuerpo secundario).

Para aumentar la cantidad expresada de anticuerpo utilizando un sistema de ampliación del gen dhfr, se puso en suspensión el transformante en un pocillo en el que se encontraba la expresión del anticuerpo anti-CCR4 híbrido en el sobrenadante del cultivo para dar una densidad de 1 a 2\times10^{5} células/ml en el medio H-SFM que contenía 1 mg/ml de G418 y metotrexato 50 nM (denominado en lo sucesivo "MTX": preparado por Sigma) que es el inhibidor de una dihidrofolato reductasa producto génico de DHFR (denominado en lo sucesivo "DHFR") y la suspensión se distribuyó en 1 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). La mezcla se cultivó a 37ºC durante 1 a 2 semanas en una incubadora con CO_{2} al 5%, de modo que se produjo un transformante que presenta resistencia a MTX 50 nM. Cuando el transformante se volvió confluente en un pocillo, la actividad de fijación del antígeno del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en el sobrenadante del cultivo se determinó por ELISA mostrado en el apartado 2(3) del Ejemplo 2. En cuanto a los transformantes en los pocillos en los que la expresión del anticuerpo anti-CCR4 híbrido se encontró en los sobrenadantes del cultivo, la concentración de MTX aumentó hasta 100 nM y después hasta 200 nM de la misma manera hasta obtener finalmente un transformante que puede desarrollarse en el medio H-SFM que contiene 1 mg/ml de G418 y 200 nM de MTX y puede también expresar en gran medida el anticuerpo anti-CCR4 híbrido. El transformante obtenido de este modo se sometió a aislamiento de una sola célula (clonación) dos veces de ensayo de dilución limitado y un clon transformante que tiene la expresión más alta del anticuerpo anti-CCR4 híbrido se denominó KM2760. La cantidad expresada del anticuerpo anti-CCR4 híbrido por KM2760 fue aproximadamente de 5 \mug/10^{6} de células/24 horas. Además, la zona C de la cadena H del anticuerpo de KM2760 pertenece a la subclase de IgG1 humana. KM2760 se ha depositado internacionalmente como FERM BP-7054 el 24 de febrero de 2000, en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (denominación actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japón).

(3) Medición de la actividad de fijación del anticuerpo al péptido parcial CCR4 (ELISA)

El péptido parcial hCCR4 (Compuesto 1) obtenido en el Ejemplo 1(1) se conjugó con tiroglobulina (denominada en lo sucesivo "THY") y se utilizó como antígeno para el ensayo. El procedimiento de producción fue como se describe en el Ejemplo 1(2), excepto que se utilizó como agente reticulante el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxílico (SMCC, fabricado por Sigma) en lugar de MBS. El conjugado preparado de la manera anterior se distribuyó a razón de 10 \mug/ml y 50 \mul/pocillo en un placa de 96 pocillos para EIA (fabricada por Greiner) y se adhirió a ésta incubándolo a 4ºC durante la noche. Después de lavar con PBS, se añadió PBS que contiene BSA al 1% (denominado en lo sucesivo "BSA-PBS al 1%") a razón de 100 \mul/pocillo, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear los grupos activos restantes. Después de eliminar la BSA-PBS al 1%, las soluciones diluidas de un sobrenadante del cultivo transformante, un anticuerpo de ratón purificado o un anticuerpo híbrido humano purificado se distribuyó a razón de 50 \mul/pocillo, y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reacción, cada pocillo se lavó con PBS que contiene Tween 20 al 0,05% (denominado en lo sucesivo "Tween-PBS"), una solución de anticuerpo Ig anti-ratón de conejo marcada con peroxidasa (preparada por DAKO) se diluyó 400 veces con BSA-PBS al 1% y una solución de anticuerpos IgG(\gamma) anti-humanos de cabra marcados con peroxidasa (preparada por American Qualex) se diluyó 3.000 veces con BSA-PBS al 1% se distribuyeron en los pocillos añadidos con anticuerpo de ratón y los pocillos añadidos con anticuerpo híbrido humano, respectivamente, como solución de anticuerpo secundario a razón de 50 \mul/pocillo, y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reacción, se lavó cada pocillo con Tween-PBS, solución de ABTS (solución preparada disolviendo 0,55 g de 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)amonio en 1 litro de tampón de citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno justo antes de su utilización) se distribuyó a razón de 50 \mul/pocillo para desarrollo de color, y se midió la absorbancia a 415 nm (denominado en lo sucesivo "D.O._{415}").

(4) Purificación del anticuerpo híbrido anti-CCR4 procedente del sobrenadante del cultivo

El clon KM2760 de la célula transformante que expresa el anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido en el apartado 2(2) del Ejemplo 2 se puso en suspensión en H-SFM (fabricado por GIBCO-BRL) que contenía MTX 200 nM y GF21 al 5% de Daigo (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) para dar una densidad de 1 a 2\times10^{5} células/ml, y se distribuyó a razón de 100 ml en matraces de 175 cm^{2} (fabricados por Greiner). Se cultivaron las células a 37ºC durante 5 a 7 días en una incubadora con 5% de CO_{2} y se recuperó el sobrenadante del cultivo cuando se volvieron confluentes. El anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido se purificó en aproximadamente 200 ml del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) según las instrucciones del fabricante para obtener de este modo aproximadamente 1,9 mg de la proteína purificada. Se aplicaron aproximadamente 3 \mug del anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido resultante a la electroforesis según el procedimiento conocido (Nature, 227: 680 (1970)) para examinar su peso molecular y el grado de purificación. En la Fig. 5 se presentan los resultados. Como se muestra en la Fig. 5, el anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido purificado era aproximadamente de 150 kilodaltons (denominados en lo sucesivo "Kd") en condiciones no reductoras, y se observaron dos bandas de aproximadamente 50 Kd y aproximadamente 25 Kd en condiciones reductoras. Los tamaños de las proteínas coincidieron casi con los pesos moleculares deducidos de las secuencias nucleotídicas del ADNc de la cadena H y de la cadena L de KM2760 (cadena H: 49.226, cadena L: 24.168) y coincidieron también con los informes que dan a conocer que el anticuerpo tipo IgG tiene un peso molecular de aproximadamente 150 Kd en condiciones no reductoras y se degrada en una cadena H que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 Kd y una cadena L que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 Kd en condiciones reductoras debido al corte del enlace disulfuro intramolecular (denominado en lo sucesivo "enlace S-S") (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)), de modo que se confirmó que el anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido se expresaba como la molécula de anticuerpo que tiene una estructura correcta. Asimismo, se analizaron las secuencias de aminoácidos del terminal N de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido purificado utilizando un secuenciador de proteínas (PPSQ-10, fabricado por Shimadzu), se confirmó que coinciden con las secuencias de aminoácidos del terminal N de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo KM2160 anti-CCR4 de ratón.

3. Creación de la célula de expresión rica en hCCR4 (1) Construcción del vector de expresión CAG-pcADN3 para células de animales

Se construyó un vector de expresión como se describe a continuación produciendo un vector de expresión (CAG-pcADN3) en el que la zona activadora de un vector de expresión para la célula de animales, pcADN3 (fabricado por INVITROGEN), se cambió desde el activador de citomegalovirus (CMV) al activador de CAG (AG (\beta actina de pollo modificada) con el potenciador CMV-IE) e insertando el gen CCR4 en el vector.

Se dejó reaccionar el pcADN3 (5 \mug) con una enzima de restricción NruI (preparada por Takara Shuzo) a 37ºC durante 1 hora y a continuación se recuperaron los fragmentos de ADN por precipitación con etanol. A continuación, se dejaron reaccionar con una enzima de restricción HindIII (preparada por Takara Shuzo) a 37ºC durante 1 hora y a continuación se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de ADN de aproximadamente 5,8 kb que no contenía ninguna zona del activador CMV. Se dejó reaccionar el plásmido CAG-pBluescript IIKS(+) (3 \mug) que tiene el activador CAG (Nucleic Acids Res., 23: 3816 (1995)) se dejó reaccionar la zona con una enzima de restricción SalI (preparada por Takara Shuzo) a 37ºC durante 1 hora y se recuperaron los fragmentos de ADN por precipitación con etanol. Se truncaron los extremos con el DNA Blunting Kit (fabricado por Takara Shuzo), se dejaron reaccionar más con HindIII a 37ºC durante 1 hora, y a continuación se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa para recuperar el fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb que contenía la zona CAG activadora. Los fragmentos de ADN respectivos recuperados de este modo se ligaron utilizando el DNA Ligation Kit (fabricado por Takara Shuzo) y el DH5\alpha de E. coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante resultante para obtener el plásmido CAG-pcADN3.

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Construcción del vector de expresión hCCR4

Se construyó un vector de expresión hCCR4 como se describe a continuación utilizando el CAG-pcDNA3 obtenido en 3(1) del Ejemplo 2 y el pcADN3 insertado en el ADN del hCCR4 (CCR4/pcADN3). Se dejaron reaccionar tanto el CAG-pcADN3 como el CCR4/pcADN3 con HindIII a 37ºC durante 1 hora y se recuperaron los fragmentos de ADN por precipitación con etanol. A continuación se dejaron reaccionar con BglII (preparado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 1 hora y a continuación se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de ADN de aproximadamente 2,0 kb que contenía la zona activadora CAG y un fragmento de ADN de aproximadamente 5,5 kb que contenía la zona del gen hCCR4. A continuación, se obtuvo el plásmido CAG-CCR4/pcADN3 utilizando ambos fragmentos de ADN de la misma manera que en el apartado 3(1) del Ejemplo 2.

\vskip1.000000\baselineskip

(3) Expresión de hCCR4 en células de animales

Se introdujo el plásmido en células de animales por electroporación de la misma manera que se describe en el apartado 2(2) del Ejemplo 2. Se pusieron en suspensión las células EL-4 (ATCC TIB-39) en PBS(-) (preparado por GIBCO-BRL) para dar una densidad de 1\times10^{7} células/500 \mul, se añadió a esto el CAG-CCR4/pcADN3 obtenido en el apartado 3(2) del Ejemplo 2 y se incubó la mezcla en hielo durante 10 minutos y a continuación se colocó en una cubeta para uso exclusivo (fabricada por Bio-Rad) para llevar a cabo la introducción del gen a 260 V y 500 \muFD. Una vez incubada más la mezcla en hielo durante 10 minutos, las células se pusieron en suspensión en 200 ml de medio FCS-RPMI al 10% y se distribuyó a razón de 200 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos de cultivo celular. Veinticuatro horas después del cultivo, se extrajeron 100 \mul del sobrenadante del cultivo de cada pocillo y medio FCS-RPMI al 10% que contenía 1 mg/ml de G418 se distribuyó a razón de 100 \mul/pocillo para dar una concentración final de 0,5 mg/ml. Dos semanas después, los clones aislados de entre 10 y 100 se seleccionaron y se cultivaron de nuevo.

\vskip1.000000\baselineskip

(4) Selección de la célula de expresión rica en hCCR4

Éstas se seleccionaron por un método inmunofluorescente utilizando KM2160 preparado en el Ejemplo 1(5). En una placa de 96 pocillos en forma de U, se distribuyeron 2\times10^{5} células de cada una de las varias decenas seleccionadas de los clones introducidos del gen. El KM2160 marcado con biotina por un procedimiento conocido (Enzyme Antibody Method, publicado por Gakusai Kikaku) se diluyó hasta 5 \mug/ml con un tampón para FACS (BSA-PBS al 1%, EDTA al 0,02%, NaN_{3} al 0,05%, pH 7,4), IgG humana (preparada por Welfide) se diluyó hasta 3,75 mg/ml para impedir la tinción no específica, cada una de las soluciones diluidas de este modo del anticuerpo se distribuyó a razón de 200 \mul/pocillo y la mezcla se dejó reaccionar en hielo durante 30 minutos. Como referencia negativa, se utilizó anticuerpo anti-IL-5R biotinilado (documento WO 97/10354) a la misma concentración. Después de lavar dos veces con 200 \mul/pocillo del tampón, se distribuyó estreptoavidina-PE (preparada por Becton Dickinson Japón) a razón de 200 \mul/pocillo. Treinta minutos después la reacción en hielo a la oscuridad, se lavaron las células tres veces con 200 \mul/pocillo y se pusieron en suspensión por último a 500 \mul, y se midió la intensidad de la fluorescencia con un citómetro de flujo para seleccionar una estirpe celular con la intensidad de fluorescencia mayor.

Ejemplo 3 Análisis de la función del anticuerpo anti-CCR4 híbrido 1. Evaluación de la actividad del anticuerpo anti-CCR4 híbrido (1) Reactividad del anticuerpo anti-CCR4 híbrido para CCR4 humano y de ratón (ELISA)

La reactividad del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado para CCR4 humana y del CCR4 de ratón se midió por ELISA mostrado en el apartado 2(3) del Ejemplo 2. El péptido parcial hCCR4 (Compuesto 1) y el péptido parcial mCCR4 (Compuesto 2) obtenido en el Ejemplo 1(2) se conjugaron con THY y se utilizaron como antígeno. La preparación se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1(2), excepto que se utilizó SMCC (preparado por Sigma) en lugar de MBS como agente reticulador. La Fig. 6 presenta un resultado del examen de la reactividad en el que el conjugado del péptido CCR4 que debe adherirse se fijó a cada pocillo de una placa ELISA hasta 10 \mug/ml y 50 \mul/pocillo y se cambió la concentración del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 que ha de añadirse. Como se muestra en la Fig. 6, el anticuerpo híbrido KM2760 anti-CCR4 presentaba casi la actividad de unión a un péptido parcial hCCR similar. Basándose en este resultado, se descubrió que el anticuerpo KM2760 anti-CCR4 híbrido reconoce al epítopo que existe en una zona de las posiciones 2 a 29 de aminoácidos del terminal N del CCR4 humano y de CCR4 de ratón.

(2) Reactividad del anticuerpo anti-CCR4 híbrido con las células de expresión ricas en hCCR4 (método inmunofluorescente)

Se determinó la reactividad del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado con la célula de expresión rica en hCCR4 (denominada en lo sucesivo "CCR4/EL-4") producida en el apartado 3(4) del Ejemplo 2 de la misma manera que en el apartado 3(4) del Ejemplo 2. Como se muestra en la Fig 7, el anticuerpo KM2760 anti-CCR híbrido presentaba fuerte reactividad con las células CCR4/EL-4.

2. Actividad citotóxica in vitro del anticuerpo anti-CCR4 híbrido (actividad de ADCC)

Con el objetivo de evaluar la actividad citotóxica in vitro del anticuerpo híbrido CCR4 purificado obtenido en el apartado 2(4) del Ejemplo 2, se determinó la actividad de ADCC como se describe a continuación.

(1) Preparación de la suspensión de células diana

La célula CCR4/EL-4 de expresión rica en hCCR4 obtenida en el apartado 3(4) del Ejemplo 2 se cultivó en medio FCS-RPMI 1640 al 10% que contenía 0,5 mg/ml de G418 para dar una densidad de 1\times10^{6} células/0,5 ml, se añadieron a esto 1,85 MBq equivalentes de cromato sódico radioactivo (Na_{2}^{51}CrO_{4}) (preparado por Daiichi Pure Chemicals) y la mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 1,5 horas para de este modo marcar con isótopo las células. Después de la reacción, las células se lavaron tres veces mediante su suspensión en el medio RPMI 1640 y centrifugación, se volvieron a poner en el medio y a continuación se incubaron en hielo a 4ºC durante 30 minutos para de este modo liberar espontáneamente la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se añadieron a esto 5 ml de medio FCS-RPMI 1640 al 10% para dar una densidad de 2\times10^{5} células/ml, y se utilizó la mezcla como suspensión de células diana.

(2) Preparación de la suspensión de células efectoras

Se extrajo sangre periférica de seres humanos sanos (60 ml) utilizando una jeringuilla que contenía 200 unidades (200 \mul) de una inyección de heparina sódica (preparada por Takeda Pharmaceutical). La cantidad completa se rellenó hasta 120 ml diluyéndola dos veces con el mismo volumen de solución salina fisiológica (preparada por Otsuka Pharmaceutical). Se distribuyó Lymphoprep (preparada por NYCOMED) a razón de 5 ml en 12 tubos de centrifugación 15 ml de capacidad (fabricados por Sumitomo Bakelite), la sangre periférica diluida sobrenadó en éstos a razón de 10 ml, y la mezcla se centrifugó a temperatura ambiente y 800 \times g durante 20 minutos. Las fracciones de PBMC entre la capa de plasma sanguíneo y la capa Lymphoprep se recogió de todos los tubos de centrifugación, se puso en suspensión en FCS al 1% que contiene medio RPMI 1640 (preparado por GIBCO) (denominado en lo sucesivo "FCS-RPMI al 1%"), se lavó dos veces por centrifugación a 400 \times g y 4ºC durante 5 minutos y a continuación se volvió a poner en suspensión para dar una densidad de 5\times10^{6} células/ml que debe utilizarse como células efectoras.

(3) Medición de la actividad de ADCC

La suspensión de célula diana preparada en el apartado 2(1) del Ejemplo 3 se distribuyó a razón de 50 \mul (1\times10^{4} células/pocillo) en pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, la suspensión de células efectoras preparada en el apartado 2(2) del Ejemplo 3 se distribuyó a razón de 100 \mul (5\times10^{5} células/pocillo, la relación de células efectoras a células diana fue de 50:1). Ulteriormente, se añadió cada anticuerpo anti-CCR4 híbrido para dar una concentración final de 0,01 a 10 \mug/ml y la mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Después de la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de ^{51}Cr en 100 \mul de sobrenadante en cada pocillo con un contador \gamma. La cantidad de ^{51}Cr disociado espontáneamente se calculó de la misma manera que anteriormente utilizando medio solo en lugar de la suspensión celular del efector y solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de ^{51}Cr total disociado de la misma manera que anteriormente añadiendo el medio solo en lugar de la solución del anticuerpo, y ácido clorhídrico 1 N en lugar de la suspensión de células efectoras y midiendo la cantidad de ^{51}Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad de ADCC mediante la siguiente ecuación:

1

En la Fig. 8 se presentan los resultados. Como se muestra en la Fig. 8, el anticuerpo híbrido anti-CCR4 presentaba fuerte actividad citotóxica dependiente de la concentración del anticuerpo dentro de un intervalo de 0,01 a 10 \mug/ml. Cuando se midió la actividad de ADCC de una estirpe celular en la que no se incorporó ningún gen, células EL-4, de la misma manera que una referencia negativa, no se encontró actividad, de modo que se confirmó que la actividad citotóxica es específica para CCR4. Los resultados anteriores demuestran que el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 puede reducir o eliminar las células Th2 expresadas en CCR4 activando de manera eficaz las células efectoras humanas y por consiguiente es útil para el diagnóstico o tratamiento de las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 en seres humanos tales como el asma bronquial, la inflamación cutánea atópica y similares.

Ejemplo 4 Efecto del anticuerpo híbrido anti-CCR4 sobre la sangre periférica humana (1) Medición de la actividad de ADCC sobre PBMC humano

Se aisló PBMC de la misma manera que en el apartado 2(2) del Ejemplo 3 y se puso en suspensión para dar una densidad final de 1\times10^{7} células/ml. La mezcla se distribuyó a razón de 100 \mul/pocillo en la placa con forma de U utilizada en el apartado 2(3) del Ejemplo 3 para dar una densidad de 1\times10^{6} células/pocillo. Cada una de las KM2760 y un anticuerpo receptor anti-IL-5 con referencia negativa (documento WO 97/10354) se diluyó para una concentración de 20 \mug/ml y se distribuyó a razón de 100 \mul/pocillo en los pocillos con células distribuidas. Veinticuatro horas después del cultivo a 37ºC en una corriente de CO_{2} al 5%, se recuperaron las células. Se detectó toxicidad utilizando el Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit (fabricado por MBL) y las células positivas a la anexina V se consideraron que eran células muertas. Se centrifugaron las células a 4ºC durante 3 minutos a 400 \times g y se pusieron en suspensión en el tampón de fijación acoplado al kit para dar una densidad de 5\times10^{5} células/200 \mul. Se mezcló la suspensión con 1 \mul del reactivo Annexin V-EGFP, seguido de pipeteado varias veces y a continuación se dejó reaccionar la mezcla durante 5 minutos a la sombra. Después de la reacción, se centrifugó la mezcla a 4ºC durante 3 minutos a 400 \times g, y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se puso en suspensión agitando ligeramente en un mezclador de vórtice, se añadió a esto 100 \mul de metanol que contenía CaCl_{2} 2,5 mM que había sido enfriado en hielo, y se incubó la mezcla a 4ºC durante 10 minutos. Se centrifugó la mezcla durante 30 segundos a 8.000 \times g, y se eliminó el sobrenadante. Se puso en suspensión el precipitado en 200 \mul del tampón de fijación y se lavó dos veces por centrifugación. Al sedimento restante después de eliminar el sobrenadante, se añadieron 10 \mul de anticuerpo anti-CD4 marcado con PC5 (fabricado por Coulter), 20 \mul del anticuerpo anti-CD45RA marcado con PE (fabricado por Coulter) y 20 \mul de tampón FACS que contenía CaCl_{2} 2,5 mM y se dejó reaccionar la mezcla a 4ºC durante 30 minutos. A continuación, se lavó la mezcla tres veces por centrifugación utilizando el tampón FACS que contenía CaCl_{2} 2,5 mM y se analizó con un citómetro de flujo (fabricado por Coulter). En primer lugar, se fraccionó el grupo de células en 4 fracciones (CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, CD4-CD45RA+ y CD4-CD45RA-) basándose en la diferencia en las propiedades de tinción entre CD4 y CD45RA. A continuación se midió la relación positiva a la ANEXINA V en cada fracción y se representó como % de toxicidad. En la Fig. 9 se presentan los resultados. La citotoxicidad de PBMC se observó solamente cuando se cultivaba junto con KM2760 y la toxicidad se detectó específicamente en la fracción CD4+CD45RA- a la que pertenecen las células positivas a CCR4.

(2) Efecto de inhibición de la producción de citocina de PBMC humano

De la misma manera que se describe en el apartado 2(3) del Ejemplo 3, se produjo actividad de ADCC cultivando conjuntamente PBMC y KM2760 (concentración final: 10 \mug/ml) durante 24 horas. Después del cultivo, se extrajeron 100 \mul del sobrenadante y 100 \mul de un medio que contenía 1 \mug/ml de PMA (miristato acetato de forbol) y 200 ng/ml de A23187 (calcimicina: preparada por RBI) se añadieron en lugar de ésta, de modo que las concentraciones finales de PMA y A23187 fueron de 0,5 \mug/ml y 100 ng/ml, respectivamente, y a continuación se provocó la producción de citocina estimulando las células (condición (i)). Como otras condiciones de estimulación, se provocó la producción de citocina utilizando 50 ng/ml a una concentración final de un anticuerpo anti-CD3 OKT-3 (ATCC CRL-8001) en lugar de A23187 (condición (ii)). Se introdujo cada agente de estimulación, y a continuación, 24 horas después del cultivo, se recuperó el sobrenadante del cultivo para medir IL-4, IL-5, IL-13 e interferón (IFN)-\gamma utilizando un kit de medición de citocina (fabricado por BioSource). Como se muestra en la Fig. 10, la producción de una citocina de Th2 IL4, IL-5 o IL-13 se inhibió en el grupo al que se añadió KM2760, pero la producción de la citocina de Th1 IFN-\gamma' no estaba influida.

Ejemplo 5 Reactividad del anticuerpo híbrido anti-CCR4 con la estirpe celular de leucemia de linfocitos T humanos (1) Capacidad de fijación a la superficie de la membrana (método inmunofluorescente)

De la misma manera que en el apartado 3(4) del Ejemplo 2 se midió la reactividad del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a las 8 estirpes celulares de leucemia de linfocitos T humanos siguientes: HPB-ALL (Cancer Research, 54: 1511 (1994); leucemia aguda de linfocitos T), HSB-2 (ATCC CCL-120.1; leucemia (linfocitos T)), MOLT-4 (JCRB9031); linfoma (linfocitos T)), TALL-1 (JCRB 0086; leucemia (linfocitos T)), Jurkat (ATCC TIB-152; leucemia aguda de linfocitos T), CCRF-CEM (ATCC CCL-119; leucemia aguda de linfocitos T), PEER (JCB 0830; leucemia (linfocitos T)) y Hut78 (ATCC TIB-161; linfoma cutáneo de linfocitos T). En este caso, la concentración de la KM2760 biotinilada se cambió a 10 \mug/ml. Como se muestra en la Fig. 11, el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 presentaba fuerte reactividad con 5 estirpes (HPB-ALL, Jurkat, CCRF-CEM, PEER y Hut78) entre las 8 estirpes ensayadas.

(2) Actividad de ADCC

La actividad de ADCC para las cinco estirpes celulares cuya reactividad con el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 se había confirmado en el apartado 1 del Ejemplo 5 se midió de la misma manera que en el apartado 2 del Ejemplo 3. Como se muestra en la Fig. 12, el anticuerpo híbrido KM2760 anti-CCR4 dañó a todas las células ensayadas en función de la concentración.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Evaluación de la actividad in vivo del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 (inhibición de la producción de citocina de Th2)

Con el objetivo de evaluar la actividad in vivo del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado obtenido en el apartado 2(4) del Ejemplo 2, se administró el anticuerpo a Macaca facicularis mediante una sola inyección intravenosa y se extrajeron muestras de sangre periódicamente durante aproximadamente 1 mes, se provocó la producción de citocina en los leucocitos periféricos por estimulación con PMA (12-miristato 13-acetato de forbol, fabricado por Sigma) y IONOMYCIN (preparada por Sigma), y se determinaron las citocinas de Th2, IL-4 e IL-13, y la citocina de Th1, IFN-\gamma. Los procedimientos y resultados se describen a continuación.

La dosis (contenido en proteína) del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 purificado fue de 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg o 10 mg/kg, y se administró el anticuerpo a 2 animales de Macaca fascicularis macho de cuatro años de vida mediante una sola inyección intravenosa en cada uno de los grupos de dosis. Se extrajeron muestras de sangre de la vena femoral antes de la administración y a la 1ª, 2ª, 3ª y 4ª semanas después de la administración. Se utilizó heparina (inyección de heparina sódica, 1.000 unidades/ml, preparada por Shimizu Pharmaceutical) como anticoagulante y se añadió a 1 ml de sangre para dar una concentración de 25 unidades/ml. Utilizando una placa de 24 pocillos de fondo plano, se distribuyó la sangre periférica de cada individuo a razón de 500 \mul/pocillo en 2 pocillos. Se añadió a un pocillo un medio que contiene el agente estimulante (concentración final de PMA de 50 ng/ml, concentración final de IONOMYCIN de 1 \mug/ml) y el medio que no contenía agente estimulante a otro pocillo, cada uno a razón de 500 \mul/pocillo, y se agitó la mezcla ligeramente y se cultivó a 37ºC, 5% de CO_{2} y 95% de aire durante 24 horas. También, se preparó el medio utilizado añadiendo 0,5 ml de una solución de penicilina-estreptomicina (fabricada por GIBCO BRL) y 5,6 ml de suero de ternero fetal inmovilizado (fabricado por PAA Laboratories) hasta 100 ml de RPMI 1640 (GIBCO BRL). Después de la terminación del cultivo, el caldo de cultivo que contenía células de sangre se recuperó de cada pocillo y se centrifugó (6.700 \times g, 5 minutos, 4ºC) para obtener un sobrenadante. IL-4, IL-13 e IFN-\gamma contenidas en el sobrenadante del cultivo resultante se determinaron utilizando los kits de medición de citocinas respectivos (IL-4: OptEIA Human IL-4 Kit, fabricado por PharMingen; IL-13: Cyto screen Human IL-13 Immunoassay Kit, fabricado por BioSource International; IFN-\gamma: Cyto screen Human IFN-\gamma Immunoassay Kit, fabricado por BioSource International). La cantidad de citocina producida por cada individuo es un valor calculado sustrayendo la cantidad obtenida no añadiendo el agente estimulante de la cantidad obtenida añadiendo el agente estimulante (0,1 mg/kg del grupo, nº L-1 y nº L-2; 1,0 mg/kg del grupo, nº M-1 y nº M-2; 10 mg/kg del grupo, nº H-1 y nº H-2). En las Figs. 13 a 15 se presentan los resultados. En estos dibujos, el valor de cada uno de IL-4, IL-13 e IFN-\gamma en cada individuo antes de la administración se utilizó como 100%, y la cantidad producida después de la administración se presentó en porcentaje. Las citocinas de Th2, IL-4 (Fig. 13) e IL-13 (Fig. 14), disminuyeron significativamente en la 1ª semana tras la administración en todos los grupos administrados, y la inhibición continuó incluso la 4ª semana después de la administración. Por otra parte, la influencia en la citocina de Th1, IFN-\gamma (Fig. 15), fue sumamente pequeña.

Basándose en estos resultados, se observó que la producción de citocina de Th2 de las células mononucleares de la sangre periférica se inhibe por lo menos durante 4 semanas cuando se administra el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 a Macaca fascicularis. Se demostró también que el anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 se reducía o se eliminaba en las células Th2 que expresan a CCR4 en la sangre periférica en el cuerpo de Macaca fascicularis.

Ejemplo 6 Actividad antitumoral in vivo del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (1) Efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 sobre el modelo sinérgico de injerto intraperitoneal

Se determinó el efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 sobre un modelo de tumor sinérgico de ratón en el que las células CCR4/EL-4 obtenidas de ratón que expresan en hCCR4 ricas obtenidas en el apartado 2(4) del Ejemplo 2 se injertaron en la cavidad abdominal de ratón. Se utilizaron ratones C57BL/6 macho de ocho semanas de vida (CLEA Japón). Las células CCR4/EL-4 se pusieron en suspensión en PBS(-) (preparadas por Gibco BRL) hasta dar una densidad de 1\times10^{5} células/ml y se injertaron en la cavidad abdominal de cada uno de los 10 ratones C57BL/6 a una dosis de 200 \mul/animal. Cuatro horas, tres días, seis días y diez días tras el trasplante, 200 \mul de KM2760 diluida hasta 2 mg/ml con un tampón de citrato (solución acuosa de 10 mmoles/l de ácido cítrico y 150 mmoles/l de cloruro sódico, ajustado a pH 6) se administraron en la cavidad abdominal de cada uno de los 5 animales entre ellos. Los 5 animales restantes se utilizaron como grupo de referencia negativa al que no se administró anticuerpo híbrido. El número de días desde el día del trasplante hasta que los ratones de cada grupo murieron debido a la proliferación de células tumorales acompañada de ascitis se presenta en la Tabla 1. El número medio de días de supervivencia fue de 16,4 días en el grupo de referencia negativo, mientras que el número medio de días de supervivencia en el grupo administrado con KM2760 fue de 26,2 días. Ya que el 59,8% de prolongación del periodo de supervivencia se observó mediante la administración de KM2760, el KM2760 tiene un efecto de prolongación de la vida en el modelo sinérgico de injerto intraperitoneal de las células de leucemia que expresan CCR4.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 sobre el modelo sinérgico de injerto subcutáneo

Se midió el efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 en un modelo de tumor sinérgico de ratón en el que las células CCR4/EL-4 obtenidas de ratón que expresan a hCCR4 rico obtenidas en el apartado 2(4) del Ejemplo 2 se injertaron por vía subcutánea en un ratón. Las células CCR4/EL-4 se pusieron en suspensión en PBS(-) (preparado por Gibco BRL) para dar una densidad de 1\times10^{6} células/ml y se injertaron bajo la piel del lado ventral de cada uno de los 18 ratones C57BL/6 a una dosis de 50 \mul/animal. Observando los 5 animales entre ellos, 100 \mul de KM2760 diluido hasta 2 mg/ml con un tampón de citrato (solución acuosa de 10 mmoles/l de ácido cítrico y 150 mmoles/l de cloruro sódico, ajustado a pH 6) se administraron en la vena de la cola después de 4 horas del trasplante una vez al día durante 5 días consecutivos. En este caso, la dosis para la administración es de 200 \mug/animal. Observando otros 6 animales, 4 horas, 7 días y 14 días después del trasplante, 200 \mul de KM2760 diluida a 2 mg/ml con el tampón de citrato se administró en la vena de la cola. En este caso, la dosis por administración es de 400 \mug/animal. Los 7 animales restantes se utilizaron como grupo de referencia negativo al que no se administró el anticuerpo híbrido. Seis días después del trasplante, se midió periódicamente el diámetro del tumor utilizando calibres de portaobjetos, y el efecto antitumoral se interpretó por la relación del valor medio del volumen del tumor en cada grupo administrado al valor medio de volumen tumoral en cada grupo no administrado y por los días de supervivencia después del comienzo de la administración. El volumen del tumor se calculó mediante la siguiente ecuación:

Volumen del tumor = (anchura)^{2} \times longitud \times 0,5

El valor medio de los volúmenes del tumor en cada grupo se muestra en la Tabla 2 y en la Fig. 16, y los resultados de la relación del valor medio de los volúmenes del tumor en cada grupo administrado al valor medio de los volúmenes del tumor en el grupo no administrado se presentan en la Tabla 3 y en la Fig. 17. La relación del valor medio de los volúmenes del tumor en el grupo no administrado el día 18º después del trasplante fue de 0,356 en el grupo en el que se administraron 200 \mug continuamente durante 5 días y 0,257 en el grupo en el que se administraron 400 \mug tres veces, de modo que KM2760 presentaba un efecto de inhibición del crecimiento en el modelo de injerto subcutáneo sinérgico de las células de leucemia positivas a CCR4 por cada uno de los programas de administración.

TABLA 2

3

TABLA 3

4

(3) Efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 sobre el modelo de xenotrasplante

Se midió el efecto antitumoral del anticuerpo KM2760 híbrido anti-CCR4 sobre un modelo de xenotrasplante de tumor subcutáneo de ratón en el que se injertó por vía subcutánea células CCRF-CEM (ATCC CCL-119) de la estirpe de leucemia de linfocitos T humanos que expresan a hCCR4 en un ratón atímico. Se utilizaron ratones atímicos Balb/c macho de ocho semanas de vida (CLEA Japón). Las células CCRF-CEM se pusieron en suspensión en medio RPMI 1640 (fabricado por Gibco BRL) para dar una densidad de 1\times10^{8} células/ml y se injertaron bajo la piel del lado ventral de cada uno de los 20 ratones atímicos Balb/c a una dosis de 200 \mul/animal. A continuación, se dividieron en 4 grupos de 5 animales por grupo, y se administró 200 \mul de KM2760 diluido hasta 2 mg/ml, 0,5 mg/ml ó 0,2 mg/ml con el tampón citrato a los tres grupos en la vena de la cola después de 4 horas, 3 días y 6 días del trasplante. En este caso, las dosis administradas de KM2760 en los respectivos grupos son de 400 \mug/animal/día, 100 \mug/animal/día y 40 \mug/animal/día. El grupo restante se utilizó como grupo de referencia negativo administrando 200 \mug de inmunoglobulina G humana (denominada en lo sucesivo "hIgG", preparada por Welfide) diluida a 2 mg/ml con el tampón citrato en la vena de la cola (400 \mug/animal/día). Cuatro días después del trasplante, se midió periódicamente el diámetro del tumor utilizando calibres de portaobjetos, y el efecto antitumoral se interpretó por el volumen del tumor en cada grupo. Se calculó el volumen del tumor mediante la ecuación siguiente:

Volumen del tumor = (anchura)^{2} \times longitud \times 0,5

En la Tabla 4 y Fig. 18, se presentan los cambios con el tiempo en los valores medios del volumen tumoral en cada grupo. Se observó inhibición completa del crecimiento del tumor en todos los grupos administrados con KM2760, de modo que KM2760 presentaba un efecto de inhibición del crecimiento en el modelo de xenotrasplante tumoral subcutáneo de las células de leucemia positivas a CCR4.

TABLA 4

5

Aplicación industrial

Como se expuso anteriormente, según la presente invención, se proporcionan un anticuerpo recombinante y un fragmento de anticuerpo del mismo, que se une específicamente a un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 humano y que contiene nuevas CDR para CCR4. El anticuerpo de la presente invención es útil para la detección inmunológica para una célula Th2 humana por tinción con inmunocitos y para el diagnóstico o tratamiento de todas las enfermedades inmunitarias mediadas por Th2 incluyendo el asma bronquial y las enfermedades atópicas de la piel, enfermedades en las que los estados mórbidos avanzan debido al balance anormal de las células Th2 y de los cánceres incluyendo los cánceres de sangre tales como la leucemia.

Texto libre de los listados de secuencias

SEC IF NO:11 - Explicación de la secuencia sintética; ADN sintético

SEC ID NO: 12 - Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético

SEC ID NO: 14 - Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético.

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpo anti-CCR4 y su fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P-36976

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-59508

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-03

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-401563

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-12-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(414)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

<221 > CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(396)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211>16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggaaaaaa gcggccgcga cccctcacca tgaacctcg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattcg cctcctcaaa atgaagttgc c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccaccgta cgtctgattt ccagcctggt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm18

\hskip1cm19

Claims (44)

1. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo que reacciona específicamente con un epítopo presente en las posiciones 2 a 29 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº: 17 del dominio extracelular de CCR4 humano, siendo reconocido dicho epítopo por el anticuerpo KM 2760 producido por el transformante KM2760 que tiene el número de depósito FERM BP-7054.

2. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que reacciona específicamente con una célula que expresa CCR4.

3. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 1 ó 2, que presenta actividad citotóxica contra una célula que expresa CCR4.

4. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 3, en el que la actividad citotóxica contra una célula que expresa CCR4 es mayor que la de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma obtenido de un animal no humano.

5. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 3, en el que la actividad citotóxica es la actividad citotóxica mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC).

6. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 5, en la que la actividad citotóxica mediada por la célula dependiente del anticuerpo es una actividad de la inducción de apoptosis de una célula Th2.

7. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que presenta actividad de agotamiento de una célula Th2.

8. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta actividad de inhibición de la producción de citocina de Th2.

9. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según la reivindicación 8, en el que la citocina de Th2 es IL-4, IL-5 o IL-13.

10. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo recombinante se selecciona de entre un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

11. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo humanizado es un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo injertado a CDR humana.

12. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que pertenece a un anticuerpo IgG humano.

13. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo humanizado comprende:

\quad

la zona determinante de complementariedad (CDR) 1, CDR2 y CDR3 de una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo que presenta las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente; y

\quad

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

14. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo híbrido humano comprende:

\quad

una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4;

\quad

y

\quad

una zona constante (zona C) de la cadena H y la zona C de la cadena L de un anticuerpo humano.

15. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo híbrido humano comprende:

\quad

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

\quad

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos 20 a 132 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

\newpage

16. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo KM2760 producido por un transformante KM2760 que tiene el número de depósito FERM BP-7054, y en el que su zona C de la cadena H del anticuerpo pertenece a la subclase IgG1 humana.

17. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo humano comprende una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo.

18. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 17, en el que las zonas determinantes de complementariedad (CDR) de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L del anticuerpo humano comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales a las secuencias de aminoácidos de las CDR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

19. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 18, en el que el anticuerpo humano comprende:

\quad

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena H que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente, y

\quad

CDR1, CDR2 y CDR3 de una zona V de la cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

20. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 17, en el que la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L del anticuerpo humano comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales a las secuencias de aminoácidos de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

21. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 20, en el que el anticuerpo humano comprende:

\quad

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

\quad

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 132 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

22. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido a partir de un banco de fagos de anticuerpos humanos o de un animal transgénico que produce un anticuerpo humano.

23. ADN que codifica el anticuerpo recombinante o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Vector recombinante que comprende el ADN según la reivindicación 23 y un vector en tándem para la expresión humanizada del anticuerpo.

25. Transformante en el que se introduce el vector recombinante según la reivindicación 24 en una célula hospedadora.

26. Transformante según la reivindicación 25, en el que el transformante es KM2760 que tiene el número de depósito FERM BP-7054.

27. Procedimiento para producir un anticuerpo recombinante o un fragmento del mismo, que comprende cultivar el transformante según la reivindicación 25 ó 26 para producir y acumular el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo en un medio de cultivo, y recuperar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo del medio de cultivo.

28. Fragmento de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es un Fab, un Fab', un F(ab')_{2}, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de la zona V estabilizada con disulfuro o un péptido que comprende las CDR de un anticuerpo.

29. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 28, en el que dicho fragmento comprende una zona variable (zona V) de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo y una zona V de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo de un anticuerpo.

30. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 29, en el que las zonas determinantes de complementariedad (CDR) de la zona V de la cadena H y de la zona V de la cadena L de dicho fragmento comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales que las secuencias de aminoácidos de las CDR de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

31. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 30, que comprende:

\quad

CDR1, CDR2 y CDR3 de la zona V de la cadena H que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 5, nº: 6 y nº: 7, respectivamente; y

\quad

CDR1, CDR2 y CDR3 de la zona V de la cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos representadas por la SEC. ID. nº: 8, nº: 9 y nº: 10, respectivamente.

32. Fragmento del anticuerpo según la reivindicación 29, en el que la zona V de la cadena H y la zona V de la cadena L de dicho fragmento comprenden secuencias de aminoácidos que son iguales que las secuencias de aminoácidos de una zona V de la cadena H y de una zona V de la cadena L, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con CCR4.

33. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 32, que comprende:

\quad

una zona V de la cadena H que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 138 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 15; y

\quad

una zona V de la cadena L que tiene los aminoácidos de las posiciones 20 a 132 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº: 16.

34. Anticuerpo recombinante o fragmento del mismo, que es el anticuerpo recombinante o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 33 que está conjugado química o genéticamente con un radioisótopo, una proteína o un agente.

35. Procedimiento in vitro para detectar inmunológicamente CCR4, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o un fragmento del mismo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

36. Procedimiento in vitro para detectar inmunológicamente una célula que expresa CCR4 sobre la superficie celular, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

37. Procedimiento in vitro para reducir o eliminar una célula que expresa CCR4 sobre la superficie celular, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

38. Procedimiento in vitro para inhibir la producción de citocina de Th2, que comprende utilizar el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

39. Medicamento que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

40. Agente terapéutico o de diagnóstico para enfermedades inmunitarias mediadas por Th2, que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

41. Agente terapéutico o de diagnóstico para el cáncer de la sangre, que comprende, como ingrediente activo, el anticuerpo recombinante o el fragmento de anticuerpo del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34.

42. Agente terapéutico o de diagnóstico según la reivindicación 41, en el que el cáncer de sangre es la leucemia.

43. Utilización de un anticuerpo recombinante o de un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y 28 a 34 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres de sangre incluyendo la leucemia, las enfermedades mediadas por Th2 incluyendo las enfermedades inflamatorias tales como la hipersensibilidad aguda o crónica de las vías respiratorias o el asma bronquial, las enfermedades atópicas de la piel incluyendo la dermatitis atópica, la rinitis alérgica, la polinosis y las enfermedades producidas por la inflamación de células competentes tales como los eosinófilos o los mastocitos.

44. Utilización según la reivindicación 43, en la que la enfermedad se trata reduciendo o eliminando las células que expresan CCR4 sobre la superficie celular o que puede tratarse inhibiendo la producción de citocina de Th2.