PT2305282E

PT2305282E - Prevenção e tratamento de doença amiloidogénica

Info

Publication number: PT2305282E
Application number: PT101825750T
Authority: PT
Inventors: Dale B Schenk
Original assignee: Janssen Alzheimer Immunotherap
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2013-09-27
Also published as: WO1999027944A9; ES2310017T3; ES2262460T1; US20090191231A1; KR100936419B1; EE200000379A; ATE435659T1; JP4677334B2; US20040228865A1; JP4677094B2; EE05377B1; SI1033996T1; NO20002784L; SG111083A1; DE69840922D1; US8034348B2; CY1109368T1; WO1999027944A1; CY1111370T1; HUP0100627A1

Description

DESCRIÇÃO

PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇA AMILOIDOGÉNICA

CAMPO TÉCNICO A invenção situa-se nos campos técnicos da imunologia e da medicina.

ANTECEDENTES A doença de Alzheimer (AD) é uma doença progressiva que resulta em demência senil. Ver, de um modo geral, Selkoc, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et ai., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et ai., Nature 373, 476-477 (1995); Games et ai., Nature 373,5 523 (1995). Falando de um modo genérico, a doença pode dividir-se em duas categorias: a de aparecimento tardio, que ocorre em idade avançada (+ de 65 anos) e a de aparecimento precoce, que se desenvolve muito antes do periodo senil, i. e., entre os 35 e os 60 anos. Em ambos os tipos de doença, a patologia é a mesma mas as anormalidades tendem a ser mais graves e disseminadas nos casos do inicio numa idade mais precoce. A doença caracteriza-se por dois tipos de lesões no cérebro, placas senis e novelos neurofibrilhares. As placas senis são áreas de neurópilo desorganizado até 150 ym de comprimento com depósitos amilóides extracelulares no centro visíveis por análise microscópica de cortes de tecido do cérebro. Os novelos neurofibrilhares são depósitos intracelulares de proteínas tau consistindo em dois filamentos enrolados um à volta do outro, aos pares. 0 principal constituinte das placas é um péptido designado péptido amilóide β ou Αβ. 0 péptido Αβ é um fragmento interno de 39-43 aminoácidos de uma proteína precursora designada proteína precursora amilóide (APP). Várias mutações dentro da proteína APP têm sido correlacionadas com a presença de doença de Alzheimer. Ver, e. g., Goate et al., Nature 349, 704) (1991) (valina717 para isoleucina) ; Chartier Harlan et al., Nature 353, 844 (1991)) (valina717 para glicina); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valina717 para fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (uma dupla mutação que altera lisina595-metionina596 para asparagina595-leucina596) . Pensa-se que tais mutações causem a doença de Alzheimer através do aumento ou da alteração do processamento de APP para Αβ, particularmente o processamento de APP para quantidades maiores da forma longa de Αβ (í. e., Αβ1-42 e Αβ1-43). Pensa-se que mutações noutros genes, tais como os genes da presenilina, PS1 e PS2, afectem indiretamente o processamento de APP para gerar quantidades crescentes da forma longa Αβ (ver Hardy, TNS 20, 154 (1997)). Estas observações indicam que Αβ e, particularmente, a sua forma longa são um elemento etiológico na doença de Alzheimer. A EP-A-0683234 revela anticorpos que possuem especificidade de ligação para β-amilóide. Combinando estes anticorpos proporciona-se um método de ensaio segundo a qual β-amilóide pode ser especificamente determinada com uma alta sensibilidade. Este método é útil para o diagnóstico de doenças nas quais a β-amilóide ou um derivado participa, tal como a doença de Alzheimer, e os anticorpos são úteis para o desenvolvimento de agentes preventivos ou terapêuticos para a doença de Alzheimer. A WO-A-91/16819 descreve um método e composição para redução dos estados de doença associados com a acumulação anormal e/ou organização molecular da proteina beta-amilóide, tal como se manifesta na doença de Alzheimer e outras desordens amilóides do SNC. A invenção compreende a administração de um nivel baixo de proteina beta-amilóide, ou um seu derivado, o que atrasa ou inverte a perda da função neuronal. A WO-A-95/23166 descreve análogos sintéticos de epitopos de células T dos epitopos de células T nativas, que são parcialmente ou completamente inversos ou retro inversos modificados no que respeita ao epitopo de célula T nativa que são mostradas ser eficazes como epitopos de células-T. Estes epitopos de células T análogos estimulam a resposta imunitária quando usados no lugar dos epitopos de células T nativas em vacinas. A invenção refere-se ainda à utilização destes análogos de epitopos de células T, em vacinas compreendendo os análogos de epitopos de células T, aos métodos de preparação de vacinas compreendendo esses análogos de epitopos de células T, e a anticorpos gerados utilizando estes epitopos de células T análogos.

Johnson-Wood et al (Proc Natl Acad Sei USA, 18 de fevereiro 1997, 94(4):1550-5) mediram os níveis de APP e os seus metabólitos amiloidogénicos em regiões cerebrais de ratos transgénicos que superexpressam PDAPP (proteína precursora amilóide humana APP717V-> F) entre 4 e 18 meses de idade. Os autores concluíram que as semelhanças observadas entre os ratos PDAPP e a doença de Alzheimer humana, no que diz respeito à deposição Αβ42 ocorrendo de forma temporal e regionalmente específica, e, ainda, validar o uso do modelo PDAPP na compreensão dos processos relacionados com a doença.

McMichael, documento EP 526511, propõe a administração de dosagens homeopáticas (menores ou iguais a 10”2 mg/dia) de Αβ aos doentes com AD pré-estabelecida. Num humano típico, com cerca de 5 litros de plasma, espera-se que mesmo o limite superior desta dosagem dê origem a uma concentração não superior a 2 pg/mL. A concentração normal de Αβ no plasma humano é tipicamente na gama de 50-200 pg/mL (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)). Devido à dose proposta no documento EP 526511 dificilmente alterar o nível de Αβ endógena em circulação e devido ao documento EP 526511 não recomendar a utilização de um adjuvante, parece pouco plausível que resulte em qualquer benefício terapêutico.

Pelo contrário, a presente divulgação é dirigida ao tratamento de Alzheimer e de outras doenças amiloidogénicas através da administração de um anticorpo Αβ, a um doente em condições que originam uma resposta imunitária benéfica no doente. Assim, a invenção vem preencher uma necessidade, há muito sentida, de regimes terapêuticos para a prevenção ou alívio da neuropatologia da doença de Alzheimer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA

Num aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 2, para uso em terapia. A composição farmacêutica é útil em métodos de prevenção ou tratamento de uma doença caracterizada pela deposição amilóide num paciente. Tais métodos envolvem a indução de uma resposta imune contra um componente de péptido de um depósito amilóide no paciente. Esta indução pode ser ativa por administração de um imunogénio ou passiva, por administração de um anticorpo. Em alguns pacientes, o depósito amilóide é péptido Αβ agregado e a doença é a doença de Alzheimer. Em alguns métodos, o paciente é assintomático. Em alguns métodos, o paciente tem menos de 50 anos de idade. Em alguns métodos, o paciente tem factores de risco herdados indicando susceptibilidade à doença de Alzheimer. Esses fatores de risco incluem alelos variantes em presenilin do gene PS1 ou PS2 e formas variantes de APP. Em outros métodos, o paciente não tem fatores de risco conhecidos para a doença de Alzheimer.

Para o tratamento de pacientes que sofrem de doença de Alzheimer, um regime de tratamento envolve a administração de uma dose de péptido Αβ ao doente para induzir a resposta imune. Em alguns métodos, o péptido Αβ é administrado com um adjuvante que aumenta a resposta imunitária ao péptido Αβ. Em alguns métodos, o adjuvante é alúmen. Em alguns métodos, o adjuvante é MPL. A dose de péptido Αβ administrada ao paciente é tipicamente pelo menos 1 ou 10 yg, se administrado com adjuvante e pelo menos 50 yg, se administrada sem adjuvante. Em alguns métodos, a dose é de pelo menos 100 yg.

Em alguns métodos, o péptido é Αβ1-42. Em alguns métodos, o péptido Αβ é administrado na forma agregada. Em outros métodos, o péptido Αβ é administrado na forma dissociada.

Em alguns métodos a resposta imunitária é dirigida para a agregação do péptido Αβ sem ser dirigida para o péptido Αβ dissociado. Por exemplo, os anticorpos ligam-se ao péptido Αβ agregado sem se ligarem ao péptido Αβ dissociado. A resposta imunitária é induzida por administração de um anticorpo contra Αβ ao doente. 0 agente terapêutico é tipicamente administrado oralmente, intranasalmente, intradermicamente, subcutaneamente, intramuscularmente, topicamente ou intravenosamente. Em alguns métodos, o doente é monitorizado após administração para avaliar a resposta imunitária. Se a monitorização indicar uma redução da resposta imunitária ao longo do tempo, o doente pode receber uma ou mais doses do anticorpo. São descritas composições farmacêuticas compreendendo Αβ e um excipiente adequado para a via oral ou outras de administração. As composições farmacêuticas compreendendo um agente eficaz para induzir uma resposta imunogénica contra ο Αβ num paciente, e um adjuvante farmaceuticamente aceitável, são também descritos. Em algumas de tais composições, o agente é Αβ ou um seu fragmento ativo. Em algumas composições, o adjuvante compreende alúmen. Em algumas composições, o adjuvante compreende uma emulsão de óleo em água. Em algumas composições, ο Αβ ou o fragmento ativo é um componente de um copolímero polilactido poliglicolido (GPLP) ou outras partículas. A invenção proporciona ainda composições compreendendo Αβ ou um fragmento ativo ligado a uma molécula de conjugado que promove a entrega de Αβ na corrente sanguínea de um paciente e/ou promove uma resposta imunitária contra Αβ. Por exemplo, o conjugado pode servir para promover uma resposta imunitária contra Αβ. Em algumas composições, o conjugado é a toxina da cólera. Em algumas composições, o conjugado é uma imunoglobulina. Em algumas composições, o conjugado é a toxina da difteria atenuada CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-3 (1997).

As composições farmacêuticas são também descritas compreendendo um agente de efeito para induzir uma resposta imunogénica contra ο Αβ num paciente com a condição de que a composição esteja livre de adjuvante completo de Freund.

As composições da invenção são úteis em proporcionas ainda métodos de prevenção ou de tratamento da doença de Alzheimer. Em tais métodos, uma dose eficaz do péptido Αβ é administrado a um paciente. A descrição tem ainda por objecto a utilização de Αβ, ou de um anticorpo, no fabrico de um medicamento para a prevenção ou tratamento da doença de Alzheimer.

Noutro aspecto, a revelação providencia métodos para avaliar a eficácia do método de tratamento de Alzheimer num doente. Nestes métodos, a quantidade de linha de base de anticorpo especifico para o péptido Αβ é determinado numa amostra de tecido do doente antes do tratamento com um agente. Uma quantidade de anticorpo especifico para 0 péptido Αβ na amostra de tecido do paciente após o tratamento com o agente é comparada com o valor da linha de base de anticorpo especifico para o péptido Αβ. Uma quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ medida após o tratamento que seja significativamente maior do que a quantidade de linha de base de anticorpo especifico para o péptido Aβindica um resultado positivo do tratamento.

Noutros métodos descritos para a avaliação da eficácia do método de tratamento de Alzheimer num doente, é determinada uma quantidade de linha de base de anticorpo especifico para o péptido Αβ numa amostra de tecido de um doente antes do tratamento com um agente. Uma quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ na amostra de tecido do indivíduo após o tratamento com o agente é comparada com o valor da linha de base de anticorpo especifico para o péptido Αβ. A redução ou ausência de diferença significativa entre a quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ medida após o tratamento comparado com o valor da linha de base de anticorpo especifico para o péptido Αβίηάίθ3 um resultado de tratamento negativo.

Noutros métodos descritos para a avaliação da eficácia do método de tratamento da doença de Alzheimer num paciente de uma quantidade de um anticorpo especifico para o péptido Αβ é determinada em amostras de tecido a partir de uma população de controlo. Uma quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ numa amostra de tecido do próprio paciente após a administração de um agente é comparada com a quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ. Uma quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ medida após o tratamento que seja significativamente maior do que a quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ de controlo indica um resultado positivo do tratamento.

Outros métodos descritos para a monitorização da doença de Alzheimer ou a susceptibilidade à mesma num doente, compreendem a detecção de uma resposta imunitária contra o péptido Αβ numa amostra do paciente. Nalguns desses métodos, está a ser administrado ao paciente um agente eficaz para tratar ou prevenir a doença de Alzheimer, e o nivel da resposta determina o futuro regime de tratamento do doente.

Noutros métodos descritos para a avaliação da eficácia do método de tratamento de Alzheimer num doente é determinado um valor para uma quantidade de anticorpo especifico para o péptido Αβ em amostra de tecido de um paciente que foi tratado com um agente. 0 valor é comparado com um valor de controlo determinado a partir de uma população de pacientes que experimenta melhoria de, ou ausência de, os sintomas da doença de Alzheimer devido ao tratamento com o agente. Um valor no doente pelo menos igual ao valor de controlo indica uma resposta positiva ao tratamento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1: Titulo de anticorpos após injecção de murganhos transgénicos com Αβ1-42.

Fig. 2: Aumento da quantidade de amilóide no hipocampo. A percentagem da área da região do hipocampo ocupada pelas placas amilóides, definida pela reactividade com ο ιηΑβ 3D6 especifico de Αβ, foi determinada por análise quantitativa de imagens auxiliada por computador das secções de cérebro imuno-reactivas. Os valores para murganhos individuais estão listados por grupo de tratamento. A linha horizontal para cada agrupamento indica o valor médio da distribuição.

Fig. 3: Distrofia neuritica no hipocampo. A percentagem da área da região do hipocampo ocupada pelas neurites distróficas, definidas pela sua reactividade com ο ιηΑβ 8ES especifico de APP humana, foi determinada por análise quantitativa, auxiliada por computador, de imagens das secções de cérebro imuno-reactivas. Os valores para murganhos individuais são mostrados para o grupo tratado com AN1792 e para o grupo de controlo tratado com PBS. A linha horizontal para cada agrupamento indica o valor médio da distribuição.

Fig. 4: Astrocitose no córtex retroesplenial. A percentagem da área da região cortical ocupada pelos astrócitos positivos para a proteína acídica fibrilhar da glia ("GFAP") foi determinada por análise quantitativa, auxiliada por computador, de imagens de secções de cérebro imuno-reactivas. Os valores para murganhos individuais são mostrados de acordo com o grupo de tratamento e os valores médios dos grupos estão indicados por linhas horizontais.

Fig. 5: Média geométrica dos títulos de anticorpos contra Αβ1-42 após imunização com uma gama de oito doses de AN1792 com 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 ou 300 pg.

Fig. 6: Cinética da resposta de anticorpos à imunização com AN1792. Os títulos são expressos como médias geométricas de valores para 6 animais de cada grupo.

Fig. 7 Análise quantitativa de imagens do aumento amilóide cortical em murganhos tratados com PBS e m AN1792.

Fig. 8: Análise quantitativa de imagens do aumento de placas neuríticas em murganhos tratados com PBS e com AN1792.

Fig. 9: Análise quantitativa de imagens da percentagem de córtex retroesplenial ocupado por astrocitose em murganhos tratados com PBS e com AN1792.

Fig. 10: Ensaio de proliferação de linfócitos das células do baço de murganhos tratados com AN1792 (painel superior) ou tratados com PBS (painel inferior).

Fig. 11: Niveis totais de Αβ no cortéx. Um gráfico de perfis de Αβ individuais em murganhos imunizados com derivados de Αβ ou de APP combinados com adjuvante de Freund.

Fig. 12: O desenvolvimento amilóide no córtex foi determinado por análise quantitativa de imagens de secções de cérebro imuno-reactivas para murganhos imunizados com os conjugados dos péptidos Αβ1-5, Αβ1-12 e Αβ13-28; os agregados Αβ de tamanho completo AN1792 (Αβ1-42) e AN1528 (Αβ1-40) e o grupo de controlo tratado com PBS.

Fig. 13: Média geométrica dos titulos de anticorpos específicos de Αβ para grupos de murganhos imunizados com Αβ ou com derivados de APP combinados com adjuvante de

Freund.

Fig. 14: Média geométrica dos títulos de anticorpos específicos de Αβ para grupos de cobaios imunizados com AN1792, ou com um seu derivado palmitoilado, combinado com vários adjuvantes.

Fig. 15 Níveis de Αβ no córtex de murganhos PDAPP de 12 meses de idade tratados com AN1792 ou com AN1528 com diferentes adjuvantes.

DEFINIÇÕES 0 termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando optimamente alinhadas, tal como através dos programas GAP e BESTFIT utilizando pesos dos intervalos por defeito, partilham, pelo menos, 65 por centro de identidade de sequências, de um modo preferido, pelo menos, 80 ou 90 por cento de identidade de sequências, de um modo mais preferido, pelo menos, 95 por cento de identidade de sequências ou mais (e. g., 99 por cento ou mais de identidade). De um modo preferido, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem em substituições conservadas de aminoácidos.

Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência actua como uma sequência de referência, com a qual são comparadas as sequências a testar. Quando se utiliza um algoritmo para comparação de sequências, as sequências a testar e a referência são introduzidas num computador, são designadas as coordenadas das subsequências, se necessário, e designados os parâmetros do programa do algoritmo de comparação das sequências. O algoritmo para comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequências para a(s) sequência(s) a testar relativamente à sequência de referência, baseado nos parâmetros do programa designados. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, e. g., através dos algoritmos de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de homologias de alinhamentos de Needleman & Wunsch, J. Moí. Biol. 48:443 (1970), através da pesquisa pelo método de semelhaça de Pearson & Lipman, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), através de implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics

Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI) ou através da inspecção visual (ver, de um modo geral, Ausubel et al., supra) . Um exemplo de algoritmo que é adequado para a determinação da percentagem de identidade de sequências e semelhaça de sequências é o algoritmo BLAST, o qual está descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para a realização das análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Tipicamente, podem ser utilizados os parâmetros do programa por defeito para realizar a comparação de sequências, ainda que possam também ser utilizados parâmetros personalizados. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como base um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10915 (1989)).

Para fins de classificação das substituições de aminoácidos como conservadas ou não conservadas, os aminoácidos são agrupados como se segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas) norleucina, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas) : asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; Grupo IV (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservadas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservadas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de uma outra.

Os agentes terapêuticos da invenção são, tipicamente, substancialmente puros. Isto significa que um agente tem, pelo menos, 50% p/p (peso/peso) de pureza, assim como está substancialmente livre de proteínas interferentes e contaminantes. Por vezes, os agentes terão, pelo menos, 80% p/p e, de um modo mais preferido, pelo menos, 90 ou cerca de 95% p/p de pureza. No entanto, através da utilização de técnicas convencionais de purificação de proteínas, podem ser obtidos péptidos homogéneos com, pelo menos, 99% p/p de pureza. A ligação especifica entre duas entidades significa uma afinidade de, pelo menos, ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 ou IO10 M"1. São preferidas afinidades superiores a 108 M”1. O termo "anticorpo" é usado para incluir anticorpos intactos e fragmentos de ligação do mesmo. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto a partir do qual eles são derivados de ligação específica a um antigénio. Opcionalmente, os anticorpos ou os fragmentos de ligação do mesmo, podem ser conjugados quimicamente, ou expressos como, proteínas de fusão com outras proteínas. APP695, APP751 e APP770 referem-se, respectivamente a polipéptidos longos com 695, 751 e 770 resíduos de aminoácidos codificados pelo gene APP humano. Ver Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); e Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Os aminoácidos dentro da proteína precursora amilóide humana (APP) são numerados de acordo com a sequência da isoforma APP770. Termos tais como Αβ39, Αβ40, Ap41, Αβ42 e Αβ43 referem-se a um péptido Αβ contendo os resíduos de aminoácidos 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 e 1-43. O termo "epítopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um local num antigénio ao qual respondem as células B e/ou

T. Os epítopos das células B podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pelo enrolamento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidos quando expostos a solventes desnaturantes, enquanto que os epítopos formados por enrolamento terciário são tipicamente perdidos quando submetidos a tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui, tipicamente, pelo menos, 3, e mais geralmente, pelo menos, 5 ou 8-10 aminoácidos numa conformação espacial única. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, e. g., Epitop Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996) . Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados num imunoensaio simples que demonstra a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de um outro anticorpo a um antigénio alvo. As células T reconhecem epítopos contínuos de aproximadamente nove aminoácidos para as células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para as células CD4 . As células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente de antigénio, conforme determinado pela incorporação de 3H-timidina pelas células T estimuladas como resposta a um epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), através da morte dependente de antigénio (ensaio de linfócitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) ou através da secreção de citocinas.

O termo resposta "imunológica" ou "imune" é o desenvolvimento de uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpos) e/ou celular (mediada por células T específicas de antigénio ou seus produtos de secreção) dirigida contra um péptido amilóide num doente recipiente. Tal resposta pode ser uma resposta activa induzida pela administração de imunogénio ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpo ou de células T estimuladas. Uma resposta imunitária celular é induzida pela apresentação de epítopos polipeptídicos em associação com moléculas de MHC Classe I ou Classe II para activar células T CD4+ auxiliadoras e/ou células T citotóxicas CD8+ específicas do antigénio. A resposta pode também envolver activação de monócitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendítricas, astrócitos, células da microglia, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata. A presença de uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada através de ensaios de proliferação (células T CD4+) ou ensaios de CTL (linfócitos T citotóxicos) (ver Burke, supra; Tigges, supra). As contribuições relativas das respostas humoral e celular para o efeito terapêutico de um imunogénio podem ser distinguidas isolando separadamente IgG e células T, de um animal singénico imunizado e medindo o efeito protector ou terapêutico num segundo indivíduo.

Um "agente imunogénico" ou "imunogénio" é capaz de induzir uma resposta imunológica contra ele próprio, aquando da administração a um doente, opcionalmente, em conjunto com um adjuvante. 0 termo "polinucleótido nu" refere-se a um polinucleótido não complexado com materiais coloidais. Os polinucleótidos nus estão por vezes clonados num vector plasmídico. 0 termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunto com um antigénio aumenta a resposta imunitária ao antigénio, mas quando administrado sozinho não origina uma resposta imunitária ao antigénio. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imunitária através de vários mecanismos, incluindo o recrutamento de linfócitos, a estimulação de células B e T e a estimulação de macrófagos. 0 termo "doente" inclui humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico. Αβ desagregado ou monomérico significa unidades monoméricas solúveis do péptido Αβ. Um método para preparar Αβ monomérico é dissolver o péptido Αβ liofilizado em DMSO com sonicação. A solução resultante é centrifugada para remover quaisquer partículas não solúveis. 0 Αβ agregado é uma mistura de oligómeros em que as unidades monoméricas são mantidas em conjunto através de ligações não covalentes.

Composições ou métodos "compreendendo" um ou mais elementos referidos podem incluir outros elementos não especificamente referidos. Por exemplo, uma composição que compreende o péptido Αβ, inclui um péptido Αβ isolado e um péptido Αβ como um componente de uma sequência polipeptídica maior. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral A invenção proporciona composições farmacêuticas para utilização em terapia, que são úteis em métodos para o tratamento profilático e terapêutico de doenças caracterizadas pela acumulação de depósitos amilóides. Os depósitos amilóides compreendem um péptido agregado numa massa insolúvel. A natureza do péptido varia entre diferentes doenças mas, na maioria dos casos, o agregado tem uma estrutura em folha plissada β e cora com o corante Vermelho de Congo. As doenças caracterizadas pelos depósitos amilóides incluem a doença de Alzheimer (AD) , aquando do aparecimento tardio e precoce. Em ambas as doenças, o depósito amilóide compreende um péptido designado Αβ, o qual se acumula no cérebro de indivíduos afectados. Exemplos de algumas outras doenças caracterizadas pelos depósitos amilóides são amiloidose SAA, sindrome hereditário Islandês, mieloma múltiplo e encefalopatias espongiformes, incluindo a doença das vacas loucas, a doença de Creutzfeuld Jakob, o "scrapie" dos carneiros e a encefalopatia espongiforme da marta (ver Weissmann et al., Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits et al., Veterinary Quaterly 19, 101-105 (1997); Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 145, 959-969 (1997)). Nestas doenças, os péptidos formadores dos agregados são o péptido amilóide sérico A, cistatina C, cadeia leve kapa de IgG, respectivamente para os três primeiros, e a proteína do prião para os outros. II. Agentes terapêuticos 1. Doença de Alzheimer

Os agentes terapêuticos para utilização na presente invenção induzem uma resposta imunitária contra o péptido Αβ. Estes agentes incluem o próprio péptido Αβ e fragmentos destes, e anticorpos intactos reativos com o péptido Αβ. A indução de uma resposta imunitária pode ser ativa como um imunogénio, quando é administrada para induzir anticorpos ou células T reativas com Αβ num paciente, ou passiva, como quando se administra um anticorpo que se liga ao próprio Αβ em pacientes. Αβ, também conhecido como péptido β-amilóide ou péptido A4 (ver documento US 4666829; Glenner & Wong, Biochem Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), é um péptido de 39-43 aminoácidos, que é o principal componente de placas caracteristicas da doença de Alzheimer. Αβ é gerado pelo processamento de uma proteína maior, APP, por duas enzimas, designadas secretases β e y (ver Hardy, TINS 20, 154 (1997)). As mutações conhecidas em APP associadas à doença de Alzheimer ocorrem perto do local de clivagem pela secretase β ou γ, ou dentro de Αβ. Por exemplo, a posição 717 está próxima do local de clivagem de APP pela secretase γ quando do seu processamento para originar Αβ, e as posições 670/671 estão próximas do local de clivagem de APP pela secretase β. Pensa-se que as mutações causem doença AD por interacção com as reacções de clivagem através das quais se forma Αβ, de forma a aumentar a quantidade da forma de 42/43 aminoácidos de Αβ gerada. Αβ tem a propriedade invulgar de poder fixar e activar as cascatas do complemento clássica e alternativa. Em particular, liga-se a Clq e finalmente a C3bi. Esta associação facilita a ligação a macrófagos conduzindo à activação de células B. Além disso, C3bi é posteriormente processada e, depois, liga-se a CR2 nas células B numa forma dependente de células T, conduzindo a um aumento de 10000 na activação destas células. Este mecanismo faz com que Αβ dê origem a uma resposta imunitária superior relativamente a outros antigénios. O agente terapêutico utilizado nos métodos reivindicados pode ser qualquer uma das formas que ocorrem naturalmente de péptido Αβ, e particularmente as formas humanas (i. e., Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 ou Αβ43) . As sequências destes péptidos e a sua relação com o precursor APP são ilustradas pela Fig. 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1977) . Por exemplo, Αβ42 tem a sequência: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gli-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH. : um fragmen to ati vo d.e um epítopo que induz ou terapêut .ica se smelha Αβ41, Αβ40 e Αβ39 diferem de Αβ42 pela omissão de Ala, Ala-Ile e Ala-Ile-Val, respectivamente, da extremidade C-terminal. Αβ43 difere de Αβ42 pela presença de um residuo de treonina na extremidade C. O agente terapêutico pode também ser ui contenha um epítcpo que induz uma resposta imunitária >u terapêutica semelhante na ser humano * Fragmentos imunogénicos têm tipicamente uma sequência de pelo menos 3, 5, 6, 10 ou 20 aminoácidos contíguos de um péptido natural. Fragmentos imunogénicos incluem Αβ1-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 e 35-42 * Fragmentos da metade N-t.erm.inal de Αβ são preferidos em certos métodos. Os análogos incluem variantes alélicas, espécies e variantes induzidas. Análogos tipicamente diferem dos péptidos que ocorrem naturalmente numa ou em mas posi coes, muitas vezes, e m virtude de substituições ervadora s. Os análogos apr esentam t .ipicamente pelo s 8 0 ou 90% de identidade de sequência com os péptidos .rais. Al _guna análogos tambén i incluem aminoácidos não — O- J_ o L. i modificações no terminal N ou C dos O Cl C .·. o o s . Exemplos de amino cl C .i. G ϋ S .Γ.Ι cí o n a t u r a .r s s a o .cá eidos a,a-bi ssubstitu ido, aminoác; Ldos N-alquilo, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, γ-carboxyglutamate, ε-Ν, N,h-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina, o-fosfoserina, N- acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, hidroxi1isina, to-N-meti 1 argin ,ina. Os fragmentos podem. pesquisados quanto à eficácia profilát ica ou terapêutic modelos animar s transgénicos, tal como descrito abaixo. 5- :,er em

Os péptidos Αβ e seus fragmentos podem ser sintetizados através da síntese de péptidos em fase sólida ou da expressão recombinante, ou podem ser obtidos a partir de fontes naturais. Os sintetizadores automáticos de péptidos podem ser comprados a numerosos fornecedores, tal como Applied Biosystems, Foster City, Califórnia. A expressão recombinante pode ser em bactérias, tais como E. coli, leveduras, células de insecto ou células de mamífero. Os processos para a expressão recombinante estão descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2a ed., 1989). Algumas formas do péptido Αβ estão igualmente disponíveis comercialmente (e. g., American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA e Califórnia Peptide Research, Inc. Napa, CA).

Os agentes terapêuticos da invenção incluem anticorpos humanos IgGl que se ligam especificamente a Αβ. Tais anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Alguns destes anticorpos ligam-se especificamente à forma agregada de Αβ sem se ligarem à forma dissociada. Alguns ligam-se especificamente à forma dissociada sem se ligarem à forma agregada. Alguns ligam-se a ambas as formas, agregada e dissociada. A produção de anticorpos monoclonais não-humanos, e. g., murinos ou ratos, pode ser efectuada por, por exemplo, imunizando o animal com Αβ. Ver Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Tal imunogénio pode ser obtido a partir de uma fonte natural, por sintase peptídicas ou por expressão recombinante.

As formas humanizadas de anticorpos de murganhos podem ser geradas por ligação das regiões CDR de anticorpos não-humanos a regiões constantes humanas através de técnicas de ADN recombinante. Ver Queen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029-10033 (1989) e documento WO 90/07861.

Os anticorpos humanos podem ser obtidos utilizando métodos de apresentação de fago. Ver, e. g., Dower et ai., documento WO 91/17271; McCafferty et ai., documento WO 92/01047. Nestes métodos, são produzidas bibliotecas de fagos nas quais os membros apresentam diferentes anticorpos à sua superfície. Os anticorpos são normalmente apresentados como fragmentos de Fv ou Fab. Os anticorpos apresentados nos fagos com uma especificidade desejada são seleccionados por enriquecimento por afinidade ao Αβ ou seus fragmentos. Os anticorpos humanos contra Αβ podem também ser produzidos a partir de mamíferos transgénicos não humanos com transgenes codificando, pelo menos, um segmento do locus da imunoglobulina humana e um locus de imonoglobulina endógena inactivado. Ver, e. g., Lonberg et ai., documento W093/12227 (1993); Kucherlapati, documento WO 91/10741 (1991) . Os anticorpos humanos podem ser seleccionados por experiências de ligação competitivas ou, de outra forma, como tendo a mesma especificidade pelo epitopo como um anticorpo de murganho particular. Tais anticorpos têm particularmente uma grande probabilidade de partilhar as propriedades funcionais úteis dos anticorpos do murganho. Os anticorpos policlonais humanos podem também ser proporcionados na forma de soro de humanos imunizados com um agente imunogénico. Opcionalmente, tais anticorpos policlonais podem ser concentrados por purificação de afinidade utilizando Αβ ou outro péptido amilóide como um reagente de afinidade.

Os anticorpos humanos ou humanizados podem ser concebidos com uma região constante IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isotipo, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Os anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, como cadeias pesadas separadas, cadeias leves, como Fab, Fab' F(ab')2 e Fv ou como anticorpos de cadeia simples nos quais os domínios variáveis da cadeia leve e pesada estão ligados através de um espaçador. 2. Outras Doenças

Os mesmos princípios ou outros análogos determinam a produção de agentes terapêuticos para o tratamento de outras doenças amiloidogénicas. No geral, os agentes referidos atrás para utilizar no tratamento da doença de Alzheimer podem também ser utilizados para o tratamento do aparecimento precoce da doença de Alzheimer associada à síndrome de Down. Na doença das vacas loucas, é utilizado péptido prião, fragmentos activos e análogos e anticorpos contra o péptido prião em vez do péptido Αβ, fragmentos activos, análogos e anticorpos contra o péptido Αβ no tratamento da doença de Alzheimer. No tratamento do mieloma múltiplo, é utilizada a cadeia leve da IgG e análogos e anticorpos do mesmo, e assim por diante noutras doenças. 3. Proteínas de Transporte

Alguns agentes para induzir uma resposta imunitária adequada que contém o epítopo para induzir uma resposta imunológica contra os depósitos amilóides, mas são demasiado pequenos para ser imunogénicos. Nesta situação, um imunogénio de péptido pode ser ligado a um veículo adequado para ajudar a induzir uma resposta imune. Os transportadores adequados incluem albuminas de soro, hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide tetânico, ou toxóide de outras bactérias patogénicas, tais como difteria, E. coli, cólera, ou H. pylori, ou um derivado atenuado da toxina. Outros transportadores para estimular ou reforçar uma resposta imunitária incluem citoquinas, tais como IL-1, IL-1 e péptidos β oí, IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF e quimiocinas, tais como MlPla e β e RANTES. Agentes imunogénicos também podem ser ligadas a péptidos que aumentam o transporte através dos tecidos, tal como descrito em Mahony, WO 97/17613 e WO 97/17614.

Agentes imunogénicos podem ser ligados a transportadores por reticulação quimica. As técnicas para a ligação de um imunogénio a um transportador incluem a formação de ligações dissulfureto usando N-succinimidil-3-(2-piridil-tio) propionato (SPDP) e succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) (se o péptido não tem um grupo sulfidrilo, este pode ser proporcionado pela adição de um residuo de cisterna). Estes reagentes criam uma ligação dissulfureto entre si e a cisterna peptidica reside numa proteina e uma ligação amida através de ε-amino com lisina, ou outro grupo livre de aminoácidos. Uma variedade de tais agentes de formação dissulfureto/amida são descritos por Immun. Rev. 62, 185 (1982). Outros agentes de acoplamento bifuncionais formam um tioéter e não uma ligação dissulfureto. Muitos destes agentes de formação de tio-éter estão comercialmente disponíveis e incluem ésteres reativos de ácido 6-maleimidocapróico, ácido 2-bromoacético, e ácido 2-iodoacético, 4-(N-maleimido-metil) ciclohexano-l-carboxilico. Os grupos carboxilo podem ser ativados combinando-os com succinimida ou ácido 1-hidroxi-2-nitro-4-sulfónico, sal de sódio. Péptidos imunogénicos podem também ser expressas como proteínas de fusão com os transportadores. 0 peptideo imunogénico pode ser ligado no terminal amino, no terminal carboxilo, ou internamente ao transportador. Opcionalmente, repetições múltiplas do péptido imunogénico podem estar presentes na proteína de fusão. III. Doentes Adeguados para o Tratamento

Os doentes adequados para o tratamento incluem os indivíduos que estão em risco de doença mas sem sintomas, assim como doentes que apresentem sintomas. No caso da doença de Alzheimer, virtualmente qualquer um que esteja em risco de sofrer da doença de Alzheimer se viver o tempo suficiente. Deste modo, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente à população em geral sem qualquer avaliação do risco do doente. Os presentes métodos são especialmente úteis para os indivíduos que possuam um risco genético conhecido de doença de Alzheimer. Tais indivíduos incluem os que têm familiares que sofreram desta doença e aqueles cujo risco é determinado através da análise de marcadores genéticos ou bioquímicas. Os marcadores genéticos de risco contra a doença de Alzheimer incluem mutações no gene APP, particularmente mutações na posição 717 e nas posições 670 e 671 referidas como mutações Hardy e Swedish, respectivamente (ver Hardy, TINS, supra). Outros marcadores de risco são mutações nos genes da presenilina, PS1 e PS2 e ApoE4, história familiar de AD, hipercolesterolémia ou aterosclerose. Os indivíduos que actualmente sofrem da doença de Alzheimer podem ser reconhecidos pela demência caracteristica, assim como pela presença de factores de risco atrás descritos. Além disso, uma série de testes de diagnóstico está disponível para identificação de indivíduos que possuam AD. Estes incluem medição dos níveis de tau e Αβ42 no CSF. Níveis elevados de tau e diminuição dos níveis de Αβ42 significam a presença de AD. Os indivíduos que sofram da doença de Alzheimer podem também ser diagnosticados por critérios de MMSE ou ADRDA como discutido na secção dos Exemplos.

Em doentes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (e. g., 10, 20, 30) . No entanto, normalmente, não é necessário começar o tratamento até o doente atingir os 40, 50, 60 ou 70 anos. Tipicamente, o tratamento inclui múltiplas dosagens ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorizado testando as respostas de anticorpos ou de células T ou B activadas ao agente terapêutico (e. g., péptido Αβ) ao longo do tempo. Se a resposta falhar, é indicada uma dosagem de reforço. No caso de potenciais doentes com síndrome de Down, o tratamento pode começar antes do nascimento, através da administração do agente terapêutico à mãe, ou pouco depois do nascimento. IV. Regimes de Tratamento

Nas aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um doente susceptível a uma doença particular, ou de outra forma em risco de, numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou retardar o estabelecimento da doença. Nas aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos são administrados a um doente suspeito ou já a sofrer de tal doença numa quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, interromper parcialmente, os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma dose eficaz em termos terapêuticos ou farmacêuticos. Nos regimes profiláticos e terapêuticos, os agentes são, de um modo geral, administrados em várias dosagens até que uma resposta imunitária suficiente tenha sido atingida. Tipicamente, a resposta imunitária é monitorizada e são administradas dosagens repetidas se a resposta imunitária começar a esvanecer-se.

Doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento dos estados atrás descritos variam de acordo com muitos factores diferentes, incluindo meios de administração, local alvo, estado fisiológico do doente, se o doente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. De um modo geral, o doente é um humano mas, em algumas doenças, tal como na doença das vacas loucas, o doente pode ser um mamifero não humano, tal como um bovino. As dosagens de tratamento necessitam de ser tituladas para optimizar a segurança e eficácia. A quantidade de imunogénio depende se é também administrado adjuvante, sendo necessárias doses mais elevadas na ausência de adjuvante. A quantidade de um imunogénio para administração por vezes varia entre 1 pg e 500 pg por doente e mais geralmente entre 5-500 pg por injecção para administração humana. Ocasionalmente, é utilizada uma dose mais elevada de 1-2 mg por injecção. Tipicamente, é utilizado cerca de 10, 20, 50 ou 100 pg por cada injecção no homem. O esquema das injecções pode variar significativamente entre uma vez por dia e uma vez por ano, até uma vez por década. No dia em que é administrada uma dosagem de imunogénio, a dosagem é superior a 1 pg/doente e, geralmente, superior a 10 pg/doente se o adjuvante for também administrado e superior a 10 pg/doente e geralmente superior a 100 pg/doente na ausência de adjuvante. Um regime tipico consiste numa imunização seguida de injecções de reforço com intervalos de 6 semanas. Um outro regime consiste numa imunização seguida de injecções de reforço 1, 2 e 12 meses mais tarde. Um outro regime inclui uma injecção de dois em dois meses para o resto da vida. Como alternativa, as injecções de reforço podem ser dadas numa base irregular como indicado pela monitorização da resposta imunitária. Para a imunização passiva com um anticorpo, as gamas de dosagem variam de cerca de 0, 0001 a 100 mg/Kg e, mais geralmente, 0,01 a 5 mg/Kg do peso do corpo do hospedeiro.

Os agentes para indução de uma resposta imunitária podem ser administrados por via parentérica, tópica, oral, subcutânea, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular para o tratamento profilático e/ou terapêutico. A via de administração mais comum é a subcutânea, ainda que outras possam ser igualmente eficazes. A segunda via mais comum é a injecção intramuscular. Este tipo de injecção é, de um modo tipico, mais efectuado nos músculos do braço ou da perna. As injecções intravenosas assim como as injecções intraperitoneais, intra-arteriais, intracraniais ou intradérmicas são também eficazes na geração de uma resposta imunitária. Em alguns métodos os agentes podem ser injectados directamente num tecido particular onde se acumularam os depósitos.

Os agentes da invenção podem ser administrados, opcionalmente, em combinação com outros agentes que são, pelo menos, parcialmente eficazes no tratamento de doença amiloidogénica. No caso da sindrome de Alzheimer e de Down, em que os depósitos amilóides ocorrem no cérebro, os agentes da invenção podem igualmente ser administrados conjuntamente com outros agentes que aumentam a passagem dos agentes da invenção através da barreira hematocefálica.

Os agentes imunogénicos da presente invenção, tais como os peptideos, são por vezes administrados em combinação com um adjuvante. Uma variedade de adjuvantes pode ser utilizada em combinação com um péptido, tal como Αβ, para induzir uma resposta imune. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta intrínseca a um imunogénio, sem causar alterações conformacionais no imunogénio que afectem a forma qualitativa da resposta. Os adjuvantes preferidos incluem alúmen, lipido A 3-De-O-acilado monofosforil (MPL) (ver GB 2220211). QS21 é um glicosideo triterpeno ou saponina isolada da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver Kensil et al, em Vaccine design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, Nova Iorque, 1995); Patente US 5057540). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tais como esqualeno ou o óleo de amendoim) , opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tais como lipido A monofosforil (ver Stoute et al., N. Engl. J. Med. Chem. 336, 86-91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, 15 de novembro, 1998). Alternativamente, Αβ pode ser acoplado a um adjuvante. Por exemplo, uma versão de Αβ lipopéptido pode ser preparada por acoplamento do ácido palmitico ou outros lipidos diretamente para o terminal N de Ap, tal como descrito para vacinação contra o antigénio da hepatite B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). No entanto, tal acoplamento não deve alterar substancialmente a conformação de Αβ, de modo a afectar a natureza da resposta imune aos mesmos. Os adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica com um agente ativo ou podem ser administrados separadamente, antes, simultaneamente com, ou após a administração do agente terapêutico.

Uma classe preferida de adjuvantes são os sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como MPL ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos tais como ácido glutâmico ou polilisina. Uma outra classe de adjuvantes são formulações de emulsões de água-em-óleo. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como péptidos de muramilo (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida™), ou outros componentes da parede celular bacteriana. As emulsões óleo-em-água incluem (a) MF59 (WO 90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo diversas quantidades de MTP-PE), formulado em partículas submicrónicas utilizando um microfluidificador como o Modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, contendo 10% de esqualano, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero plurónico bloqueado L121, e thr- MDP, quer microfluidizado numa emulsão submicrónica ou vortex para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana a partir do grupo consistindo em monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS) , de preferência MPL + CWS (Detox”) . Uma outra classe de adjuvantes preferidos são os adjuvantes de saponina, tais como Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, MA) ou partículas geradas daí tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem o adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Outros adjuvantes incluem citoquinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF).

Um adjuvante pode ser administrado com um imunogénio como uma única composição, ou pode ser administrado antes de, em simultâneo com ou após a administração do imunogénio. O imunogénio e o adjuvante podem ser embalados e fornecidos no mesmo frasco ou podem ser embalados em frascos separados e misturados antes da utilização. 0 pmunogénio e o adjuvante são tipicamente embalados com uma etiqueta que indica a aplicação terapêutica a que se destina. Se o imunogénio e o adjuvante forem embalados separadamente, a embalagem tipicamente inclui instruções para a mistura antes da utilização. A escolha de um adjuvante e/ou veículo depende da estabilidade da vacina contendo o adjuvante, da via de administração, do esquema de administração, da eficácia do adjuvante para a espécie a ser vacinada, e, em seres humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é um que tenha sido aprovado ou é aprovável para administração a seres humanos pelos órgãos reguladores pertinentes. Por exemplo, o adjuvante completo de Freund não é adequado para administração a seres humanos. Alúmen, MPL e QS21, são os preferidos. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usados simultaneamente. As combinações preferidas incluem alúmen com MPL, alúmen com QS21, MPL com QS21 e alúmen, QS21 e MPL em conjunto. Além disso, o adjuvante incompleto de Freund pode ser usado (Chang et al., A Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente em combinação com gualquer um dos alúmenes, QS21 e MPL e todas as suas combinações.

Agentes da invenção são muitas vezes administrados na forma de composições farmacêuticas que compreendem um agente terapêutico ativo, ou seja, e uma variedade de outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15 ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1980). A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições podem também incluir, dependendo da formulação pretendida, transportadores não-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes, que estão definidos como os veículos habitualmente utilizados para formular composições farmacêuticas para administração a seres humanos ou animais. 0 diluente é selecionado de modo a não afectar a atividade biológica da combinação. Exemplos desses diluentes são água destilada, solução fisiológica salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode também incluir outros transportadores, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogénicos, e semelhantes. No entanto, alguns reagentes adequados para administração a animais, tais como o adjuvante completo de Freund não são normalmente incluídos em composições para uso humano.

As composições farmacêuticas podem também incluir macromoléculas qrandes, metabolizadas lentamente tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólico e copolímeros (tais como sefarose funcionalizada de látex, agarose, celulose, e semelhantes), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, e os agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes transportadores podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).

Para administração parentérica, os agentes da invenção podem ser administrados como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância num diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, solução salina óleos, glicerol, ou etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, tensioativos, substâncias tamponantes de pH e similares podem estar presentes nas composições. Outros componentes das composições farmacêuticas são os de petróleo, de origem animal, vegetal, ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, e óleo mineral. Em geral, os glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são os veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis.

Tipicamente, as composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micro-partículas, tais como polilactido, poliglicolido, ou copolímero para efeito adjuvante reforçado, como discutido acima (ver Langer, Science 249, 1527 (1990 ) e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Os agentes desta invenção podem ser administrados sob a forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que pode ser formulado de tal modo a permitir uma libertação controlada ou pulsátil do ingrediente ativo.

Formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem formulações orais, intranasais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas.

Para supositórios, aglutinantes e transportadores incluem, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na gama de 0,5% a 10%, preferivelmente l%-2%. As formulações orais incluem excipientes, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós e contêm 10%-95% de ingrediente ativo, de preferência 25%-70%. A aplicação tópica pode resultar na distribuição transdérmica ou intradérmica. A administração tópica pode ser facilitada pela co-administração do agente com a toxina da cólera ou seus derivados desintoxicados ou subunidades da mesma ou outras toxinas bacterianas similares (Ver Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). A co-administração pode ser conseguida usando os componentes como uma mistura ou como moléculas ligadas obtidos por reticulação química ou expressão de uma proteína de fusão.

Alternativamente, a administração transdérmica pode ser conseguida utilizando um caminho de pele ou utilizando transferosomes (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Ceve et al. Biochem. Biophvs. Acta 1368, 201-15 (1998)). V. Diagnóstico A divulgação proporciona métodos de detecção de uma resposta imunitária contra o péptido Αβ num doente que sofra ou seja susceptivel à doença de Alzheimer. Os métodos são particularmente úteis para a monitorização do curso de um tratamento a ser administrado a um doente. Os métodos podem ser utilizados para monitorizar o tratamento terapêutico em doentes sintomáticos e o tratamento profilático em doentes assintomáticos.

Alguns métodos englobam a determinação de um valor da linha de base, de uma resposta imunitária num doente, antes da administração de uma dosagem de um agente e comparação deste com um valor para a resposta imunitária após o tratamento. Um aumento significativo (í. e., superior à margem típica de erro experimental em medições repetidas na mesma amostra, expresso como um desvio padrão da média de tais medições) no valor da resposta imunitária indicia um desfecho positivo para o tratamento (i. e., que a administração do agente induziu ou aumentou uma resposta imunitária) . Se o valor da resposta imunitária não alterar significativamente ou diminuir, é indicativo de um desfecho negativo para o tratamento. Em geral, espera-se que os doentes que passem por um curso inicial de tratamento com um agente apresentem um aumento da resposta imunitária com dosagens sucessivas que, eventualmente, atinge um patamar. A administração do agente é, de um modo geral, continuada durante o aumento da resposta imunitária. 0 atingir do patamar é um indicador de que o tratamento administrado pode ser descontinuado ou reduzido na dosagem ou frequência.

Noutros métodos, um valor de controlo (i. e., uma média e desvio padrão) da resposta imunitária é determinado para uma população de controlo. Tipicamente, os indivíduos na população de controlo não receberam qualquer tratamento anterior. Os valores da resposta imunitária medidos num doente após administração de um agente terapêutico são então comparados com o valor de controlo. Um aumento significativo relativamente ao valor de controlo (e. g., superior a um desvio padrão da média) indicia um desfecho positivo para o tratamento. A não observação de um aumento significativo ou de um decréscimo sugere um desfecho negativo para o tratamento. A administração do agente é, de um modo geral, continuada enquanto a resposta imunitária cresce relativamente ao valor do controlo. Como anteriormente, o atingir de um patamar relativamente aos valores de controlo é um indicador de que a administração do tratamento pode ser descontinuada ou reduzida na dosagem ou frequência.

Noutros métodos, um valor de controlo da resposta imunitária (e. g., uma média e desvio padrão) foi determinado a partir de uma população de controlo de indivíduos que foram submetidos a tratamento com um agente terapêutico e cujas respostas imunitárias atingiram um patamar de resposta ao tratamento. Os valores medidos da resposta imunitária num doente são comparados com o valor de controlo. Se o nível medido num doente não for significativamente diferente e. g., mais de um desvio padrão) do valor de controlo, o tratamento pode ser descontinuado. Se o nível num doente for significativamente abaixo do valor de controlo, é assegurada administração continuada do agente. Se o nível no doente persistir abaixo do valor de controlo, então pode ser indicada uma alteração no regime de tratamento, por exemplo, a utilização de um adj uvante.

Noutros métodos, um doente que não esteja a receber tratamento mas que tenha sido submetido a um tratamento é monitorizado relativamente à resposta imunitária para determinar se é necessário recomeçar o tratamento. 0 valor da resposta imunitária medido no doente pode ser comparado com um valor de resposta imunitária previamente atingido no doente após um tratamento anterior. Um decréscimo significativo relativamente à medição anterior (í. e., superior a uma margem de erro típica em medições repetidas da mesma amostra) é uma indicação que o tratamento pode ser retomado. Como alternativa, o valor medido no doente pode ser comparado com um valor de controlo (média mais desvio padrão) determinado na população de doentes após o tratamento. Como alternativa, o valor medido num doente pode ser comparado com um valor de controlo em populações de doentes tratados profilaticamente que permanecem sem sintomas de doença ou em populações de doentes tratados terapeuticamente que apresentem melhoria das características da doença. Em todos estes casos, um decréscimo significativo relativamente ao nível do controlo (í. e., mais do que o desvio padrão) é um indicador de que o tratamento deverá ser retomado num doente. A amostra de tecido para análise é tipicamente sangue, plasma, soro, muco ou fluido cerebroespinal do doente. A amostra é analisada relativamente a indícios de uma resposta imunitária contra qualquer forma de péptido Αβ, ser tipicamente Αβ42. A resposta imunitária pode determinada a partir da presença de e. g., anticorpos ou células T que se ligam especificamente ao péptido Αβ. OS métodos de ELISA para a detecção de anticorpos específicos contra Αβ estão descritos na secção dos Exemplos. Os métodos de detecção de células T reactivas foram descritos atrás (ver Definições).

EXEMPLOS

I. Eficácia Profilática de Αβ Contra AD

Estes exemplos descrevem a administração do péptido Αβ42 a murganhos transgénicos que sobreexpressam APP com uma mutação na posição 717 (APP7i7v_F) que os predispõe para desenvolver neuropatologia do tipo Alzheimer. A produção e características destes murganhos (murganhos PDAPP) estão descritas em Games et ai., Nature, supra. Estes animais, na sua forma heterozigótica, começam a depositar Αβ dos seis meses de idade em diante. Aos quinze meses de idade apresentam níveis de deposição de Αβ equivalente ao observado na doença de Alzheimer. Os murganhos PDAPP foram injectados com Αβ42 agregada (Αβ42 agregada) ou solução salina tamponado com fosfatos. 0 Αβ42 agregado foi escolhido devido à sua capacidade para induzir anticorpos contra múltiplos epítopos de Αβ. A. Métodos 1. Fonte de murganhos

Trinta murganhos fêmea PADPP heterogénicos foram divididos aleatoriamente pelos seguintes grupos: 10 murganhos para serem injectados com Αβ42 agregado (um morreu em trânsito), 5 murganhos para serem injectados com PBS/adjuvante ou PBS e 10 para controlos não injectados. Cinco murganhos foram injectados com proteina amilóide do soro (SAP). 2. Preparação de imunogénios

Preparação de Αβ42 agregado: duas miligramas de Αβ42 (US Peptides Inc., lote K-42-12) foram dissolvidas em 0,9 mL de água e ajustadas a 1 mL pela adição de 0,1 mL de PBS 10X. Isto foi agitado com vórtex e deixado a incubar, de um dia para o outro, a 37 °c, condições em que o péptido agregou. Qualquer Αβ não utilizado foi guardado como pó seco liofilizado a -20 °C até à injeção seguinte. 3. Preparação de injeções

Foram emulsionadas 100 pg de Αβ42 agregado em PBS por murganho a 1:1 com adjuvante completo de Freund (CFA) num volume final de 400 pL de emulsão para a primeira imunização, seguido de um reforço da mesma quantidade de imunogénio em adjuvante incompleto de Freund (IFA) às 2 semanas. Duas doses adicionais em IFA foram administradas com intervalos mensais. As imunizações subsequentes foram feitas com intervalos mensais em 500 pL de PBS. As injeções foram administradas intaperitonealmente (i.p.)

As injeções de PBS seguiram o mesmo esquema e os murganhos foram injetados com uma mistura a 1:1 de PBS/adjuvante a 400 pL por murganho, ou a 500 pL de PBS por murganho. As injeções SAP seguiram igualmente o mesmo esquema utilizando uma dose de 100 pL por injeção. 4. Titulação de Colheitas de Sangue de Murganho, Preparação de Tecido e Imuno-histoguimica

Os métodos atrás referidos estão descritos abaixo em Materiais e Métodos Gerais. B. Resultados

Os murganhos PDAPP foram injetados com Αβ42 agregado (Αβ42 agregado), péptidos SAP ou solução salina tamponado com fosfatos. Um grupo de murganhos PDAPP foi também deixado como controlo positivo não injetado. Os titulos dos murganhos contra o AB42 agregado foram monitorizados mês sim mês não, a partir do quarto reforço, até os murganhos terem um ano de idade. Os murganhos foram sacrificados aos treze meses. Em todos os pontos do tempo analisados, oito dos nove murganhos que receberam AB42 agregado desenvolveram um titulo de anticorpos elevado, o qual permaneceu elevado ao longo da série de injeções (titulos superiores a 1/10000) . O nono murganho tinha um titulo baixo mas mensurável de aproximadamente 1/1000 (Figura 1, Tabela 1). Os murganhos injetados com SAPP tiveram titulos de 1:1000 a 1:30000 contra este imunogénio com apenas um murganho excedendo 1:10000.

Os murganhos tratados com PBS foram titulados contra Αβ42 agregado aos seis, dez e doze meses. Numa diluição de 1/100 os murganhos que receberam PBS, quando titulados contra AB42 agregado, apenas excederam 4 vezes o fundo num ponto de tempo, sendo sempre inferior a 4 vezes o fundo nos restantes pontos do tempo (Tabela 1). A resposta especifica de SAP foi negligivel nestes pontos com todos os titulos inferiores a 300.

Sete de nove murganhos no grupo de AB42 agregado não tinham amilóide detectável nos seus cérebros. Pelo contrário, o tecido do cérebro dos murganhos nos grupos SAP e PBS continham numerosos depósitos amilóides positivos para 3D6 no hipocampo, assim como nos córtex frontal e cingulato. O padrão de deposição foi semelhante ao dos controlos não tratados, com envolvimento caracteristico de sub-regiões vulneráveis, tais como a camada molecular externa do giro dentado do hipocampo. Um murganho do grupo injectado com Αβ 1-42 tinha um desenvolvimento amilóide grandemente reduzido, confinado ao hipocampo. Uma placa isolada foi identificada num outro murganho tratado com Αβ 1-42.

Análises quantitativas de imagens do desenvolvimento amilóide no hipocampo confirmaram a dramática redução conseguida nos animais tratados com AN1792 (Fig. 2). Os valores médios do desenvolvimento amilóide para o grupo do PBS (2,22%) e para o grupo controlo não tratado (2,65%) foram significativamente superiores do que para os imunizados com AN1792 (0,00%, p=0,0005). Pelo contrário, o valor médio do grupo imunizado com péptidos SAP (SAPP) foi de 5,74%. O tecido cerebral dos murganhos de controlo não tratados continha numerosos depósitos amilóides Αβ, visualizados com o anticorpo monoclonal especifico de Αβ (mAb) 3D6, no hipocampo assim como no córtex retroesplenial. Um padrão semelhante de deposição amilóide foi igualmente observado em murganhos imunizados com SAPP ou PBS (Fig. 2) . Além disso, nestes três últimos grupos, houve um envolvimento caracteristico de sub-regiões vulneráveis do cérebro classicamente observado em AD, tal como a camada molecular externa do giro dentado do hipocampo, na totalidade destes três grupos.

Os cérebros que não continham depósitos de Αβ também não possuiam placas neuriticas que são tipicamente visualizadas em murganhos PDAPP com o anticorpo 8ES contra APP humano. Todos os cérebros dos restantes grupos (murganhos injetados com SAP, PBS e não injetados) tinham numerosas placas neuriticas, típicas de murganhos PDAPP não tratados. Um pequeno número de placas neuriticas estava presente num murganho tratado com AN1792 e foi encontrado um único grupo de neurites distróficas num segundo murganho tratado com AN1792. As análises de imagens do hipocampo e mostradas na Fig. 3, demonstraram a eliminação virtual de neurites distróficas em murganhos tratados com AN1792 (média 0,00%) comparativamente com os que receberam PBS (média 0,28%, p=0,0005) A astrocitose característica de inflamação associada a placas também estava ausente nos cérebros do grupo injectado com Αβ1-42. 0 cérebro dos murganhos nos outros grupos continha astrócitos positivos para GFAP abundantes e agrupados típicos de gliose associada a placas Αβ. Uma subsérie de lâminas que reagiram com GFAP foi contrastada com Tioflavina S para localizar os depósitos de Αβ. Os astrócitos positivos para GFAP foram associados a placas Αβ nos murganhos de SAP, PBS e controlos não tratados. Não foi encontrada esta associação nos murganhos tratados com Αβί-42 negativos relativamente a placas, enquanto foi identificada gliose mínima associada a placas num murganho tratado com AN1792.

As análises de imagens, mostradas na Fig. 4 para o córtex retroesplenial, confirmaram que a redução de astrocitose foi significativa, com um valor médio de 1,56% para os murganhos tratados com AN1792 versus valores médios superiores a 6% para grupos imunizados com péptidos SAP, PBS ou não tratados (p=0,0017).

Resultados de uma subsérie dos murganhos injectados com Αβ1-42 e com PBS indicaram ausência de imuno-reactividade MHC II associada às placas nos murganhos injectados com Αβ1-42, consistente com ausência de uma resposta inflamatória relacionada com Αβ.

As secções de cérebros de murganhos também foram reagidas com um ιηΑβ especifico de MAC-1, uma proteína da superfície celular. MAC-1 (CDllb) é um membro da família das integrinas e existe como um heterodímero com CD18. 0 complexo CDllb/CD18 está presente em monócitos, macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais (Mak e Simard).0 tipo de células residente reativo para MAC-1 é provavelmente a microglia, com base em morfologia fenotípica semelhante nas secções que apresentam reatividade imunológica com MAC-1. A marcação de MAC-1 associada a placas foi mais baixa nos cérebros de murganhos tratados com AN1792 comparativamente com o grupo de controlo que recebeu PBS, um resultado consistente com a ausência de uma resposta inflamatória induzida por Αβ. C. Conclusão A ausência de placas Αβ e as alterações de reatividade neuronal e gliótica nos cérebros de murganhos injetados com Αβ1-42 indicam que nenhuma, ou extremamente pouca, amilóide foi depositada nos seus cérebros e a ausência de consequências patológicas, tais como gliose e patologia neurítica. Os murganhos PDAPP tratados com Αβ1-42 apresentaram essencialmente a mesma ausência de patologia dos murganhos de controlo não transgénicos. Assim, as injeções de Αβ1-42 foram altamente eficazes na prevenção da deposição ou eliminação de Αβ humano do tecido cerebral e na eliminação de subsequentes alterações degenerativas neuronais e inflamatórias. Assim, a administração do péptido Αβ apresenta beneficio terapêutico na prevenção de AD. II. Estudo da Resposta à Dose

Grupos de murganhos Swiss Webster, fêmeas, com cinco semanas de idade (n=6 por grupo) foram imunizados com 300, 100, 33, 11, 3, 7, 1,2, 0,4 ou 0,13 pg de Αβ formulado em CFA/IFA e administrado intraperitonealmente. Foram dadas três doses com intervalos de duas semanas, seguido de uma quarta dose um mês mais tarde. A primeira dose foi emulsionada com CFA e as restantes doses foram emulsionadas com IFA. Os animais foram sangrados 4-7 dias após cada imunização começando após a segunda dose para medição dos títulos de anticorpos. Os animais numa subsérie de três grupos, imunizados com 11, 33 ou 300 pg de antigénio, foram ainda submetidos a colheitas de sangue, aproximadamente com intervalos mensais, durante quatro meses após a quarta imunização para monitorizar o decaimento da resposta de anticorpos para uma série de doses de vacina. Estes animais receberam uma quinta imunização final aos sete meses após o início do estudo. Os animais foram sacrificados uma semana mais tarde para medir as respostas de anticorpos contra AN1792 e para realizar análises toxicológicas.

Uma dose resposta proporcional foi observada a partir de 300 até 3,7 μg sem qualquer resposta nas duas doses mais baixas. A média dos títulos de anticorpos é cerca de 1:1000 após 3 doses e cerca de 1:10000 após 4 doses de 11-300 pg de antigénio (ver Fig. 5)

Os títulos de anticorpos subiram dramaticamente para todos os grupos, exceptuando o grupo da dose mais baixa, após a terceira imunização com GMT crescentes, variando entre 5 e 25 vezes. Respostas baixas de anticorpos foram então detectáveis mesmo nos animais que receberam 0,4 pg. Os grupos que receberam 1,2 e 3,7 pg tiveram títulos comparáveis com GMT de aproximadamente 1000 e as quatro doses mais elevadas formaram um grupo com GMT de aproximadamente 25000, com exceção do grupo da dose de 33 pg com um GMT mais baixo de 3000. Após a quarta imunização, o aumento de título foi mais modesto para a maioria dos grupos. Houve uma clara dose resposta nos grupos com doses de antigénio mais baixas entre 0,14 pg e 11 pg variando entre anticorpo não detectável para os recipientes de 0,14 pg até uma GMT de 36000 para os recipientes de 11 pg. Novamente, os títulos para os quatro grupos com doses mais elevadas de 11 a 300 pg formaram um conjunto. Assim, após duas imunizações, o título de anticorpos mostrou-se dependente da dose de antigénio ao longo da gama larga entre 0,4 e 300 pg. Quando da terceira imunização, os títulos das quatro doses mais elevadas eram todos comparáveis e permaneceram num patamar após mais uma imunização.

Um mês após a quarta imunização, os títulos foram 2 a 3 vezes mais elevados no grupo das 300 pg do que os medidos no sangue colhido cinco dias após a imunização (Fig. 6) . Esta observação sugere que o pico de resposta anamnéstica de anticorpos ocorreu mais tarde do que 5 dias pós- imunização. Um aumento mais modesto (50%) foi observado nesta altura no grupo das 33 pg. No grupo da dose de 300 pg aos dois meses após a última dose, os GMT baixaram abruptamente em cerca de 70%. Após mais um mês, o declínio foi menos acentuado sendo de 45% (100 pg) e cerca de 14% para as doses de 33 e 11 pg. Assim, a velocidade de diminuição dos títulos de anticorpos circulantes, após cessação da imunização, parece ser bifásico com um declínio abrupto no primeiro mês após o pico da resposta, seguido de um decréscimo a uma velocidade mais modesta a partir de então.

Os títulos de anticorpos e as cinéticas da resposta destes murganhos Swiss Webster são semelhantes aos de murganhos transgénicos PDAPP heterozigóticos jovens imunizados de forma semelhante. As dosagens eficazes para induzir uma resposta imunitária em humanos são tipicamente semelhantes às dosagens eficazes em murganhos.

III. Rastreio da Eficácia Terapêutica Contra AD

Estabelecida

Este ensaio foi desenhado para testar agentes imunogénicos relativamente à atividade na interrupção ou reversão das características neuropatológicas de AD em animais idosos. As imunizações com Αβ de 42 aminoácidos de comprimento (AN1792) começaram quando as placas amilóides já estavam presentes nos cérebros dos murganhos PDAPP.

Durante este estudo, os murganhos PDAPP não tratados desenvolveram uma série de alterações neurodegenerativas que se assemelhavam às encontradas em AD (Games et al., supra e Johnson-Wood et al., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 94, 1550-1555 (1997)). A deposição de Αβ em placas amilóides está associada a uma resposta neuronal degenerativa consistindo em elementos axonais e dendriticos aberrantes, designadas neurites distróficas. Os depósitos amilóides que estão rodeados e contêm neurites distróficas são designados placas neuriticas. Tanto em AD como em murganhos PDAPP, as neurites distróficas possuem uma estrutura globular distinta, são imunorreativas com um painel de anticorpos que reconhecem APP e componentes do citosqueleto e apresentam alterações degenerativas subcelulares complexas ao nivel ultra-estrutural. Estas caracteristicas permitem medições seletivas e reprodutíveis, importantes para a doença, da formação de placas neuriticas nos cérebros PDAPP. 0 componente neuronal distrófico das placas neuriticas PDAPP é facilmente visualizado com um anticorpo especifico de APP humano (ιηΑβ 8E5) e é facilmente mensurável através da análise de imagens auxiliada por computador. Assim, além da medição dos efeitos de AN1792 na formação de placas amilóides, monitorizou-se os efeitos deste tratamento no desenvolvimento de distrofia neuritica.

Os astrócitos e microglia são células não neuronais que respondem e reflectem o grau de lesão neuronal. Astrócitos GFAP-positivos e microglia positiva para MHC II são normalmente observadas em AD e a sua activação aumenta com a gravidade da doença. Assim, também se controlou o desenvolvimento de astrocitose e microgliose reactiva nos murganhos tratados com AN1792. A. Materiais e métodos

Quarenta e oito murganhos PDAPP fêmeas, heterozigóticos, com 11 a 11,5 meses de idade, obtidos à Charles River, foram divididos aleatoriamente em dois grupos: 24 murganhos para serem imunizados com 100 pg de AN17 92 e 24 murganhos para serem imunizados com 100 pg PBS, cada um combinado com adjuvante de Freund. Os grupos de AN17 92 e de PBS foram novamente divididos quando atingiram aproximadamente 15 meses de idade. Aos quinze meses de idade aproximadamente metade de cada grupo dos animais tratados com AN1792 e PBS foram eutanasiados (n = 10 e 9, respectivamente), os restantes continuaram a receber imunizações até ao final de ~ 18 meses (n = 9 e 12, respectivamente) . Um total de 8 animais (5 AN1792, 3 PBS) morreu durante o estudo. Além dos animais imunizados, murganhos PDAPP com um ano de idade (n = 10), 15 meses (n = 10) e 18 meses (n = 10) não tratados foram incluídos para comparação no ELISA para medir os níveis de Αβ e APP no cérebro; os animais com um ano de idade foram igualmente incluídos nas análises imuno-histoquímicas. A metodologia foi a como no Exemplo 1, a menos que indicado de outro modo. Péptidos US lote 12 e Péptidos Califórnia lote ME0339 de AN1792 foram utilizados para preparar o antigénio para as seis imunizações administradas antes dos 15 meses. Os péptidos Califórnia lotes ME0339 e ME0439 foram utilizados nas três imunizações adicionais administradas entre os 15 e os 18 meses.

Para as imunizações, 100 pg de AN1792 em 200 pL de PBS ou PBS sozinho foi emulsionado a 1:1 (vol:vol) com adjuvante completo de Freund (CFA) ou adjuvante incompleto de Freund (IFA) ou PBS num volume final de 400 pL. A primeira imunização foi administrada com CFA como adjuvante, as quatro doses seguintes foram administradas com IFA e as quatro doses finais com PBS sozinho sem adjuvante adicionado. Um total de nove imunizações foi administrado ao longo do período de sete meses num esquema bi-semanal durante as primeiras três doses, seguido de um intervalo de quatro semanas para as restantes injeções. 0 grupo de quatro meses de tratamento foi eutanizado aos 15 meses de idade, recebeu apenas as 6 primeiras imunizações. B. Resultados 1. Efeitos do Tratamento com AN17 92 no Desenvolvimento Amilóide

Os resultados do tratamento com AN1792 no desenvolvimento amilóide cortical determinados pela análise quantitativa de imagens são mostrados na Fig. 7. 0 valor médio do desenvolvimento cortical foi de 0,28% num grupo de murganhos PDAPP de 12 meses de idade não tratado, um valor representativo da carga de placas presentes nos murganhos no início do estudo. Aos 18 meses, o desenvolvimento amilóide aumentou mais de 17 vezes até 4,87% em murganhos tratados com PBS, enquanto os murganhos tratados com AN1792 tiveram um desenvolvimento amilóide grandemente reduzido de apenas 0,01%, notoriamente inferior aos grupos de 12 meses não tratados e aos grupos de 15 e 18 meses tratados com PBS. O desenvolvimento amilóide foi significativamente reduzido nos recipientes de AN1792 aos 15 (96% de redução; p=0,003) e aos 18 meses (>99% de redução; p=0,0002).

Tipicamente a deposição amilóide cortical em murganhos PDAPP inicia-se nos córtexes frontal e retroesplenial (RSC) e progride numa direcção ventral-lateral para envolver os córtexes temporal e entorrinal (EC). Pouco ou nenhum amilóide é encontrado no EC dos murganhos com 12 meses de idade, a idade aproximada a que AN1792 foi primeiro administrado. Após 4 meses de tratamento com AN1792, a deposição amilóide foi grandemente diminuida no RSC e o envolvimento progressivo do EC foi totalmente eliminado pelo tratamento com AN1792. Esta última observação mostrou que AN1792 parou a progressão amilóide que normalmente invadiria os córtexes temporal e ventral, assim como parou ou possivelmente reverteu a deposição no RSC.

Os efeitos profundos do tratamento com AN1792 no desenvolvimento amilóide cortical nos murganhos PDAPP foram ainda demonstrados pelo grupo de 18 meses de idade, o qual foi tratado durante sete meses. Uma ausência quase completa de amilóide cortical foi encontrado no murganho tratado com AN1792, com uma ausência total de placas difusas, assim como uma redução nos depósitos compactados. 2. Alterações Celulares e Morfológicas Associadas ao Tratamento com AN1792

Uma população de células positivas para Αβ foi encontrada nas regiões cerebrais que contêm tipicamente depósitos amilóides. É notável que, em vários cérebros de recipientes de AN1792, foram encontradas muito poucas ou nenhumas placas amilóides corticais extracelulares. A maioria da imuno-reatividade com Αβ parecia estar dentro das células com grandes corpos lobulares ou agregados. Fenotipicamente, estas células assemelham-se a microglia ou a monócitos ativados. Elas foram imuno-reactivas com anticorpos que reconhecem ligandos expressos pelos monócitos e microglia ativados (MHC II e CDllb) e foram ocasionalmente associados à parede ou ao lumén dos vasos sanguíneos. A comparação de secções quase adjacentes marcadas com anticorpos específicos de Αβ e de MHC II revelaram padrões semelhantes destas células que foram reconhecidas por ambas as classes de anticorpos. A análise detalhada dos cérebros tratados com AN1792 revelou que as células positivas para MHC II estavam restringidas à vizinhança da amilóide limitada que restava nestes animais. Nestas condições de fixação empregues, as células não foram imunorreativas com anticorpos que reconhecem os ligandos das células T (CD3, CD3e) ou das células B (CD45RA, CD45RB) ou o antigénio comum de leucócitos (CD45), mas foram reactivos com um anticorpo que reconhece leucossialina (CD43) que dá reação cruzada com monócitos. Não foram encontradas estas células em qualquer dos murganhos tratados com PBS.

Os murganhos PDAPP invariavelmente desenvolveram fortes depósitos amilóides na camada molecular externa do giro dentado do hipocampo. Os depósitos formam um riscado distinto dentro da via perforante, uma sub-região que classicamente contém placas amilóides em AD. 0 aspecto caracteristico destes depósitos em murganhos tratados com PBS assemelhou-se ao previamente caracterizado em murganhos PDAPP não tratados. A deposição amilóide consistiu em placas difusas e compactas numa banda continua. Pelo contrário, numa série de cérebros de murganhos tratados com AN1792 este padrão foi drasticamente alterado. A deposição amilóide no hipocampo deixou de conter amilóides difusas e o padrão em banda foi completamente destruído. Pelo contrário, estava presente uma série de estruturas pontuadas reactivas com anticorpos anti-Αβ, várias delas surgiram como células contendo amilóides. Células positivas para MHC II foram frequentemente observadas na vizinhança de amilóide extracelular em animais tratados com AN1792. 0 padrão de associação de células positivas para Αβ com amilóide foi muito semelhante em vários cérebros de murganhos tratados com AN1792. A distribuição destas células monociticas foi restringida à proximidade do amilóide depositado e estava totalmente ausente das regiões do cérebro sem placas Αβ. A análise quantitativa de imagens de secções marcadas para MHC II e MAC I revelou uma tendência no sentido do aumento da imuno-reactividade no RSC e hipocampo de murganhos tratados com AN1792, comparativamente com o grupo que recebeu PBS, o qual atingiu significância com a medição da reactividade de MAC-1 no hipocampo.

Estes resultados são um indicador de remoção activa, mediada por células, do amilóide nas regiões do cérebro com placas. 3. Efeitos de AN17 92 nos Níveis de Αβ: Determinações por ELISA (a) Níveis Corticais

Em murganhos PDAPP não tratados, o nível médio de Αβ total no córtex aos 12 meses foi de 1600 ng/g, que aumentou para 8,700 ng/g aos 15 meses (Tabela 2). Aos 18 meses o valor foi de 22000 ng/g, um aumento superior a 10 vezes durante a experiência. Os animais tratados com PBS tinham 8600 ng/g de Αβ total aos 15 meses que aumentou para 19000 ng/g aos 18 meses. Pelo contrário, os animais tratados com AN1792 tiveram 81% menos Αβ total aos 15 meses (1600 ng/g) do que o grupo imunizado com PBS. Significativamente menos (p=0,0001) Αβ total (5200 ng/g) foi encontrado aos 18 meses quando os grupos AN1792 e PBS foram comparados (Tabela 2), representando uma redução de 72% em que de outra forma estaria presente. Resultados semelhantes foram obtidos quando os niveis corticais de Αβ foram comparados, nomeadamente o grupo tratado com AN1792 continha muito menos Αβ42, mas neste caso as diferenças entre os grupos AN1792 e PBS foram significativos aos 15 meses (p=0,04) e aos 18 meses (p=0,0001, Tabela 2).

Tabela 2: Niveis médios de Αβ (ng/g) no córtex NÃO TRATADO PBS ΑΝ1792 Idade Αβ Αβ42 (η) Total Αβ Αβ42 (η) Total Total Αβ42 (η) 12 15 18 1600 1300 (10) 8700 8300 (10) 22200 18500 (10) 8600 7200 (9) 19000 15900 (12) 1600 1300* (10) 5200** 4000** (9) *p = 0,0412 **p = 0,0001 (b) Níveis do Hipocampo

Nos murganhos PDAPP não tratados, os níveis médios no hipocampo de Αβ total, aos doze meses de idade, foram 15000 ng/g que aumentou para 51000 ng/g aos 15 meses e para 81000 ng/g aos 18 meses (Tabela 3). De forma semelhante, os murganhos imunizados com PBS apresentaram valores de 40000 ng/g aos 15 meses e aos 18 meses, respectivamente. Os animais imunizados com AN1792 apresentaram menos Αβ total, especificamente 25000 ng/g e 51000 ng/g aos 15 e 18 meses respectivamente. Aos 18 meses o valor do grupo tratado com AN1792 foi significativamente inferior ao do grupo tratado com PBS (p=0,0105; Tabela 3). A medição de Αβ42 deu o mesmo padrão de resultados, nomeadamente os níveis no grupo tratado com AN1792 foram significativamente inferiores ao grupo de PBS (39000 ng/g vs 57000 ng/g, respectivamente; p=0,0022) aos 18 meses de avaliação (Tabela 3).

Tabela 3: Níveis médios de Αβ (ng/g) no hipocampo NÃO TRATADO PBS AN1792 Idade Αβ total Αβ42 (n) Αβ total Αβ42 (n) Total Αβ42 (n) 12 15500 11100 (10) 15 51500 44400 (10) 40100 35700 (9) 24500 22100* (10) 18 80800 64200 (10) 65400 57100 (12) 50900* 38900** (9) *p = 0,0105 * *p = 0, 0022 (c) Níveis Cerebelares

Aos 12 meses nos murganhos PDAPP não tratados, o nível médio cerebelar de Αβ total foi de 15 ng/g (Tabela 4) . Aos 15 meses, esta média aumentou para 28 ng/g e aos 18 meses aumentou para 35 ng/g. Os animais tratados com PBS apresentaram valores médios de Αβ total de 21 ng/g aos 15 meses e de 43 ng/g aos 18 meses. Verificou-se que os animais tratados com AN1792 possuem 22 ng/g de Αβ total aos 15 meses e significativamente menos (p=0,002) Αβ total aos 18 meses (25 ng/g) do que o correspondente grupo PBS (Tabela 4).

Tabela 4: Nivels médios de Αβ (ng/g) no cerebelo NÃO TRATADO PBS AN1792 Idade Αβ (n) total Αβ (n) total Αβ (n) total 12 15,6 (10) 15 27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10) 18 35,0 (10) 43,1 (12) 24,8* (9) *p = 0,0018

4. Efeitos do Tratamento com AN1792 nos Níveis de APP AAP-oí e a molécula de APP de tamanho completo possuem ambas a totalidade ou parte da sequência Αβ e assim podem ser potencialmente afectadas pela geração de uma resposta imunitária dirigida contra AN1792. Nos estudos realizados até à data, foi observado um ligeiro aumento dos níveis de APP à medida que a neuropatologia aumenta no murganho PDAPP. No córtex, os níveis de ΑΑΡ-α/FL (tamanho completo) ou de AAP-oí permaneceram essencialmente inalterados pelo tratamento, com exceção de AAP-oí ser reduzida em 19% aos 18 meses no grupo tratado com AN17 92 vs. no grupo tratado com PBS. Os valores de APP tratado com AN1792 aos 18 meses não foram significativamente diferentes dos valores do grupo não tratado aos 12 meses e aos 15 meses e do grupo tratado com PBS aos 15 meses. Em todos os casos os valores de APP mantiveram-se dentro das gamas que são normalmente encontradas em murganhos PDAPP. 5. Efeitos do Tratamento com AN17 92 na Patologia

Neurodegenerativa e Gliótica 0 desenvolvimento de placas neuríticas foi significativamente reduzido no córtex frontal de murganhos tratados com AN1792 comparativamente com o grupo de PBS aos 15 (84%; p=0,03) e 18 (55%; p=0,01) meses de idade (Fig. 8) . 0 valor médio do desenvolvimento de placas neuríticas aumentou de 0,32% para 0,49% no grupo tratado com PBS entre os 15 e os 18 meses de idade. Isto contrastou com o desenvolvimento grandemente reduzido de placas neuríticas no grupo de AN1792, com valores médios de desenvolvimento de placas neuríticas de 0,05% e 0,22% nos grupos de 15 e 18 meses, respectivamente.

As imunizações com AN1792 pareceram serem bem toleradas e a astrocitose reactiva foi também significativamente reduzida no RSC dos murganhos tratados com AN1792, quando comparado com o grupo de PBS, aos 15 (56%; p=0,011) e aos 18 (39%; p=0,028) meses de idade (Fig. 9). Os valores médios da percentagem de astrocitose no grupo de PBS aumentaram entre os 15 e os 18 meses de 4,26% para 5,21%. O tratamento com AN1792 suprimiu o desenvolvimento de astrocitose em ambos os pontos de tempo para 1,89% e 3,2% respectivamente. Isto sugere que o neurópilo não foi lesado pelo processo de eliminação. 6. Respostas de Anticorpos

Como descrito atrás, os murganhos PDAPP heterozigóticos com onze meses de idade (n=24) receberam uma série de 5 imunizações de 100 pg de AN1792 emulsionado com adjuvante de Freund e administrado intraperitonealmente nas semanas 0, 2, 4, 8 e 12 e uma sexta imunização com PBS sozinho (sem adjuvante de Freund) na semana 16. Como controlo negativo, uma série paralela de 24 murganhos transgénicos com a mesma idade recebeu imunizações de PBS emulsionado com os mesmos adjuvantes e administrado segundo o mesmo esquema. Os animais foram sangrados três a sete dias após cada imunização, começando após a segunda dose. As repostas de anticorpos contra AN1792 foram medidas por ELISA. As médias geométricas dos titulos (GMT) para os animais que foram imunizados com AN1792 foram de aproximadamente 1900, 7600 e 45000 após a segunda, a terceira e a última (sexta) doses, respectivamente. Não foram medidos anticorpos específicos de Αβ nos animais controlo após a sexta imunização.

Aproximadamente metade dos animais foi tratada durante mais três meses, recebendo imunizações aproximadamente às 20, 24 e 27 semanas. Cada uma das doses foi administrada no veículo PBS sozinho sem adjuvante de Freund. As médias dos títulos de anticorpos permaneceram inalteradas ao longo deste período de tempo. De facto, os títulos de anticorpos pareceram manter-se estáveis desde a quarta colheita de sangue até à oitava correspondendo a um período que vai da quinta à nona injeção.

Para determinar se os anticorpos específicos de Αβ, induzidos por imunização, que foram detectados nos soros de murganhos tratados nos com AN1792 também estavam associados a amilóide depositado no cérebro, uma subsérie de secções de murganhos tratados com AN1792 e com PBS, reagiram com um anticorpo específico para IgG de murganho. Ao contrário do grupo tratado com PBS, as placas Αβ nos cérebros tratados com AN1792 foram revestidas com IgG endógena. Esta diferença entre os dois grupos foi observada em grupos com 15 e 18 meses de idade. Foi particularmente notória a ausência de marcação no grupo PBS, apesar da presença de um forte desenvolvimento amilóide nestes murganhos. Estes resultados mostram que a imunização com uma proteína Αβ sintética origina anticorpos que reconhecem e se ligam in vivo a Αβ nas placas amilóides. 7. Respostas Imunitárias Mediadas por Células

Os baços foram removidos de nove murganhos PDAPP, de 18 meses de idade, imunizados com AN1792 e 12 imunizados com PBS, 7 dias após a nona imunização. Os esplenócitos foram isolados e cultivados durante 72 horas na presença de Αβ40, Αβ42 ou Αβ40-1 (proteína com ordem reversa). 0 mitogénio Con A serviu como controlo positivo. Respostas óptimas foram obtidas com > 1,7 μΜ de proteína. As células dos nove animais tratados com AN1792 proliferaram como resposta à proteína Αβ1-40 ou Αβ1-42, com iguais níveis de incorporação para ambas as proteínas (Fig. 10, Painel superior). Não houve resposta à proteína reversa Αβ40-1. As células dos animais de controlo não responderam a qualquer uma das proteínas Αβ (Fig. 10, Painel inferior). C. Conclusão

Os resultados deste estudo mostram que a imunização com AN1792 de murganhos PDAPP possuindo já depósitos amilóides reduz a velocidade de aparecimento e inibe a deposição progressiva de amilóide e retarda consequentes alterações neuropatológicas no cérebro de murganhos PDAPP idosos. As imunizações com AN1792 essencialmente pararam o desenvolvimento amilóide em estruturas que normalmente sucumbiriam à amiloidose. Assim, a administração do péptido Αβ possui benefício terapêutico no tratamento de AD. IV. Rastreio de Fragmentos Αβ 100 murganhos PDAPP de 9-11 meses de idade foram imunizados com 9 regiões diferentes de APP e Αβ para determinar quais os epitopos adequados à resposta. Os 9 imunogénios diferentes e um controlo foram injetados i.p. como descrito atrás. Os imunogénios incluem quatro péptidos Αβ humanos conjugados 1-12, 13-28, 32-28, 32-42, 1-5, todos acoplados a imunoglobulinas de carneiro anti-IgG de murganho através de uma ligação cistina; um polipéptido APP aa 592695, Αβ 1-40 humano agregado e Αβ 25-35 humano agregado e Αβ42 de roedor agregado. Αβ42 agregado e PBS foram utilizados como controlos. Foram utilizados dez murganhos por grupo de tratamento. Os titulos foram monitorizados como atrás e os murganhos foram eutanasiados ao fim de 4 meses de injeções. A histoquimica, os niveis de Αβ e a toxicologia foram determinados post mortem. A. Materiais e Métodos 1. Preparação de Imunogénios

Preparação de péptidos Αβ acoplados: quatro conjugados de péptidos Αβ humanos (residuos de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28 e 33-42, cada conjugado com IgG de carneiro anti- murganho) foram preparados através da junção com uma cisterna artificial adicionada ao péptido Αβ utilizando o reagente de ligação cruzada sulfo-EMCS. Os derivados do péptido Αβ foram sintetizados com as sequências de aminoácidos finais que se seguem. Em cada caso, a localização do resíduo de císteina inserido está indicado a sublinhado. O derivado do péptido AB13-28 também tinha dois resíduos de glicina adicionados antes da cisteína no extremo carboxilo como indicado.

Péptido Αβ-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC COOH

Péptido Αβ1-5 NH2-DAEFRC COOH

Péptido Αβ33-42 NH2-C-ácido amino-heptanóico-GLMVGGVVIA

COOH

Péptido AB13-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH

Para preparar a reação de acoplamento, dez mg de IgG de carneiro anti-murganho (Jackson ImmunoResearch Laboratories) foram dialisados, de um dia para o outro, contra tampão borato de sódio 10 mM, pH 8,5. O anticorpo dialisado foi então concentrado para um volume de 2 mL utilizando um tubo Amicon Centriprep. Dez mg de sulfo-EMCS [N(ε-maleimidocuproiloxi)succinimida] (Molecular Sciences Co.) foram dissolvidas em um mL de água desionizada. Um excesso molar de 40 vezes de sulfo-EMCS foi adicionado gota a gota, com agitação, aos IgG de carneiro anti-murganho e depois a solução foi agitada durante mais dez minutos. Os IgG de carneiro anti-murganho ativados foram purificados e trocado o tampão através da passagem por uma coluna de filtração em gel de 10 mL (Pierce Presto Column, adquirida à Pierce Chemicals) equilibrada com NaP04 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 6,5. As fracções contendo anticorpos, identificadas pela absorvância a 280 nm, foram reunidas e diluídas para uma concentração de aproximadamente 1 mg/mL, utilizando 1,4 mg por OD como coeficiente de extinção. Um excesso molar de 40 vezes do péptido Αβ foi dissolvido em 20 mL de NaPCU 10 mM, pH 8,0, com excepção do péptido Αβ33-42 para o qual 10 mg foram primeiro dissolvidas em 0,5 mL de DMSO e depois diluídas para 20 mL com tampão NaPCq 10 mM. As soluções de péptidos foram cada adicionadas a 10 mL de IgG de carneiro anti-murganho ativados e agitadas à temperatura ambiente durante 4 h. Os conjugados resultantes foram concentrados para um volume final inferior a 10 mL utilizando um tubo Amicon Centriprep e depois dialisados contra PBS para trocar de tampão e remover o péptido livre. Os conjugados foram passados através de filtros de 0,22 μ de poro para esterilização e depois divididos em fracções de 1 mg e guardados congelados a -20 °C. As concentrações dos conjugados foram determinadas utilizando o ensaio de proteínas BCA (Pierce Chemicals) , com IgG de cavalo para a curva padrão. A conjugação foi documentada pelo aumento do peso molecular dos péptidos conjugados relativamente ao dos IgG de carneiro anti-murganho ativados. O conjugado de Αρβ1-5 e IgG de carneiro anti-murganho foi uma mistura de duas conjugações, o resto derivou de uma única preparação. 2. Preparação de Péptidos Αβ Agregados

Os péptidos humanos 1-40 (AN1528; Califórnia Peptides Inc., Lote ME0541), 1-42 (AN1792; Califórnia Peptides Inc., Lotes ME0339 e ME0439), 25-35 e de roedor 1-42 (Califórnia Peptides Inc., Lote ME0218) foram solubilizados de fresco para a preparação de cada das séries de injeções derivadas de pós liofilizados que tinham sido guardados na ausência de humidade a -2 0 °C. Para este fim, duas mg de péptido foram adicionadas a 0,9 mL de água desionizada e a mistura foi submetida a vórtex para dar origem a uma solução ou suspensão relativamente uniforme. Dos quatro, AN1528 foi o único péptido solúvel neste passo. Uma alíquota de 100 yL de PBS 10X (PBS IX: NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,5) foi então adicionada, altura em que AN1528 começou a precipitar. A suspensão foi submetida a vórtex novamente e incubada de um dia para o outro a 37 °C, para utilizar no dia seguinte.

Preparação da proteína pBx6: Um plasmídeo de expressão codificando pBx6, uma proteína de fusão consistindo na sequência líder N-terminal de 100 aminoácidos da polimerase do bacteriófago MS-2 seguida dos aminoácidos 592-695 de APP (βΑΡΡ) foi construída como descrito por Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492 4497 (1990). O plasmídeo foi utilizado para transfectar E. coli e a proteína foi expressa após indução do promotor. As bactérias foram lisadas em ureia 8 M e pBx6 foi parcialmente purificada através de SDS-PAGE preparativa. As fracções contendo pBx6 foram identificadas em transferência de Western utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-pBx6, reunidas, concentradas utilizando um tubo Amicon Centriprep e dialisadas contra PBS. A pureza da preparação, estimada por coloração de SDS-PAGE com Azul Coomassie, foi de aproximadamente 5 a 10%. B. Resultados e Discussão 1. Desenho do estudo

Cem murganhos transgénicos PDAPP heterozigóticos, com nove a onze meses de idade, machos e fêmeas, foram adquiridos a Charles River Laboratory e a Taconic Laboratory. Os murganhos foram separados em dez grupos para serem imunizados com diferentes regiões de Αβ ou APP combinado com adjuvante de Freund. Os animais foram distribuídos, tanto quanto possível, de acordo com o sexo, idade, progenitores e fonte dos animais dentro de cada grupo. Os imunogénios incluíram quatro péptidos Αβ derivados da sequência humana, 1-5, 1-12, 13-28 e 33-42, cada um conjugado com IgG de carneiro anti-murganho, quatro péptidos Αβ agregados, 1-40 humano (AN1528), humano 1-42 (AN1792), humano 25-35 e roedor 1-42; e um polipéptido de fusão, designado como pBx6, contendo os resíduos de aminoácidos 592-695 de APP. Um décimo grupo foi imunizado com PBS combinado com adjuvante como controlo.

Para cada imunização, 100 pg de cada péptido Αβ em 200 pL de PBS ou 200 pg do pBx6 derivado de APP no mesmo volume de PBS ou PBS sozinho foi emulsionado a 1:1 (vol:vol) com adjuvante completo de Freund (CFA) num volume final de 400 pL para a primeira imunização, seguido de um reforço da mesma quantidade de imunogénio em adjuvante incompleto de Freund (IFA) para as quatro doses subsequentes e com PBS para a dose final. As imunizações foram administradas intraperitonealmente, num esquema bi-semanal para as três primeiras doses, depois seguiu-se um esquema mensal. Foi recolhido sangues dos animais quatro a sete dias após cada imunização, começando após a segunda dose, para medição dos títulos de anticorpos. Os animais foram eutanasiados aproximadamente uma semana após a dose final. 2. Níveis de Αβ e APP no Cérebro

Após aproximadamente quatro meses de imunização com os vários péptidos Αβ ou o derivado de APP, os cérebros foram removidos dos animais sob perfusão de solução salina. Um hemisfério foi preparado para análise imuno-histoquímica e o segundo foi utilizado para a quantificação dos níveis de Αβ e APP. Para medir as concentrações de várias formas do péptido amilóide beta e da proteína precursora beta, o hemisfério foi dissecado e os homogenatos das regiões do hipocampo, cortical e cerebelar foram preparados em guanidina 5 M. Estes foram diluídos e o nível de amilóide ou de APP foi quantificado por comparação com uma série de diluições de padrões do péptido Αβ ou APP de concentrações conhecidas num formato de ELISA. A concentração média de Αβ total para o grupo de controlo imunizado com PBS foi 5,8 vezes superior no hipocampo relativamente ao córtex (média de 24,318 ng/g de tecido de hipocampo comparado com 4221 ng/g para o córtex) . 0 nivel médio no cerebelo do grupo de controlo (23,4 ng/g de tecido) foi cerca de 1000 vezes inferior relativamente ao hipocampo. Estes niveis são semelhantes aos que foram descritos anteriormente para os murganhos transgénicos PDAPP heterozigóticos desta idade (Johnson-Woods et al., 1997, supra).

Para o córtex, uma subsérie de grupos de tratamento teve niveis médios de Αβ e Αβ1-42 total que diferiram significativamente dos do grupo de controlo (p<0,05), esses animais receberam AN1792, Αβ1-42 de roedor ou o conjugado do péptido Αβ1-5 como mostrado na Fig. 11. Os niveis médios de Αβ total foram reduzidos em 75%, 79% e 61%, respectivamente, comparativamente com o controlo para estes grupos de tratamento. Não houve correlações discerniveis entre os titulos de anticorpos específicos de Αβ e os níveis de Αβ na região cortical do cérebro para qualquer um dos grupos.

No hipocampo, a redução média de Αβ total associada ao tratamento com AN1792 (46%, P=0,0543) não foi superior ao observado no córtex (75%, P=0,0021). No entanto, a ordem de grandeza da redução foi muito superior no hipocampo relativamente ao córtex, uma redução de 11186 ng/g de tecido no hipocampo versus 3171 ng/g de tecido no córtex. Para os grupos de animais que receberam Αβ1-42 ou Αβ1-5 de roedor, os níveis médios totais de Αβ foram reduzidos em 36% e 26%, respectivamente. No entanto, dado o pequeno tamanho dos grupos e a elevada variabilidade dos níveis de péptido amilóide de animal para animal dentro de ambos os grupos, estas reduções não foram significativas. Quando os níveis de Αβ1-42 foram medidos no hipocampo, nenhuma das reduções induzidas pelo tratamento atingiu significância. Assim, devido ao menor aparecimento de Αβ no córtex, as alterações nesta região são um indicador mais sensível dos efeitos do tratamento. As alterações nos níveis de Αβ medidas por ELISA no córtex são semelhantes, mas não idênticas, aos resultados da análise imuno-histoquímica (ver abaixo) .

Foi também medido ο Αβ total no cerebelo, uma região tipicamente não afectada na patologia AD. Nenhuma das concentrações médias de Αβ de qualquer um dos grupos imunizados com os vários péptidos Αβ ou derivado de APP diferiu do grupo controlo nesta região do cérebro. Este resultado sugere que os níveis não patológicos de Αβ não sejam afectados pelo tratamento. A concentração de APP foi também determinada por ELISA no córtex e cerebelo de murganhos tratados e de controlo. Foram utilizados dois ensaios de APP diferentes. 0 primeiro, designado ΑΑΡ-α/FL, reconhece APP-alfa (a, a forma secretada de APP que foi clivada dentro da sequência Αβ) e formas de tamanho completo (FL) de APP, enquanto o segundo reconhece apenas AAP-α. Ao contrário da diminuição de Αβ associada ao tratamento numa subsérie de grupos de tratamento, os níveis de APP ficaram inalterados em todos os animais tratados comparativamente com os animais de controlo. Estes resultados indicam que as imunizações com os péptidos Αβ não eliminam APP, mas antes o efeito do tratamento é específico de Αβ.

Resumidamente, os níveis totais de Αβ e Αβ1-42 foram significativamente reduzidos no córtex através do tratamento com AN1792, Αβ1-42 de roedor ou conjugado de Αβ1-5. No hipocampo, Αβ total foi significativamente reduzido apenas por tratamento com AN1792. Não foram significativas as alterações associadas ao tratamento nos niveis de Αβ ou APP nas regiões do hipocampo, cortical ou cerebelar. 2. Análises Histoquímicas

Os cérebros de uma subsérie de seis grupos foram preparados para análise imuno-histoquímica, três grupos imunizados com os conjugados do péptido Αβ, Αβ1-5, Αβ1-12 e Αβ13-28; dois grupos imunizados com os agregados Αβ de tamanho completo AN17 92 e AN1528 e o grupo de controlo tratado com PBS. Os resultados das análises de imagens do desenvolvimento amilóide nas secções de cérebro destes grupos são mostrados na Fig. 12. Houve reduções significativas do desenvolvimento amilóide nas regiões corticais dos grupos de tratamento versus animais de controlo. A maior redução do desenvolvimento amilóide foi observada no grupo que recebeu AN1792, em que o valor médio foi reduzido em 97% (p=0,001). Foram também observadas reduções significativas para os animais tratados com AN1528 (95%, p=0,005) e com o conjugado do péptido Αβ1-5 (67%, p=0,02).

Os resultados obtidos pela quantificação de Αβ ou de Αβ1-42 total por ELISA e o desenvolvimento amilóide por análise de imagens diferem até certo ponto. 0 tratamento com AN1528 teve um impacto significativo no nivel de desenvolvimento amilóide cortical quando medido através da análise quantitativa de imagens mas não na concentração de Αβ total na mesma região quando medido por ELISA. A diferença entre estes dois resultados é provavelmente devido às especificidades dos ensaios. A análise de imagens mede apenas ο Αβ insolúvel agregado em placas, o ELISA mede todas as formas de Αβ, tanto solúveis como insolúveis, monoméricas e agregadas. Uma vez que se pensa que a patologia da doença esteja associada à forma insolúvel associada a placas de Αβ, a técnica de análise de imagens pode ter mais sensibilidade para revelar os efeitos do tratamento. No entanto, uma vez que o ELISA é um ensaio mais rápido e mais fácil, é muito útil para fins de rastreio. Além disso, pode revelar que a redução de Αβ associada ao tratamento é superior para Αβ associada a placas do que para Αβ total.

Para determinar se os anticorpos específicos de Αβ induzidos por imunização nos animais tratados reagiam com amilóide depositada no cérebro, uma subsérie das secções dos animais tratados e dos murganhos de controlo foi incubada com um anticorpo específico de IgG de murganho. Ao contrário do grupo de PBS, as placas contendo Αβ foram revestidas com IgG endógeno para os animais imunizados com os conjugados do péptido Αβ, Αβ1-5, Αβ1-12 e Αβ13-28; e os agregados de Αβ de tamanho completo AN1792 e AN1528. Os cérebros dos animais imunizados com os outros péptidos Αβ ou com o péptido APP pBx6 não foram analisados neste ensaio. 3. Medição dos Títulos de Anticorpos

Foi recolhido sangue aos murganhos quatro a sete dias após cada imunização, começando após a segunda imunização, num total de cinco recolhas. Os títulos de anticorpos foram medidos como anticorpo de ligação a Αβ1-42 utilizando um ELISA tipo sanduíche em placas de plástico multi-poços revestidas com Αβ1-42. Como mostrado na Fig. 13, os títulos dos picos de anticorpos foram induzidos após a quarta dose para as quatro vacinas, as quais induziram os titulos mais elevados de anticorpos específicos de AN1792: AN1792 (pico GMT: 94647), AN1528 (pico GMT: 88231), conjugado de Αβ1-12 (pico GMT: 47216) e Αβ1-42 de roedor (pico gMT: 10766). Os títulos para estes grupos baixaram após a quinta e a sexta doses. Para os restantes cinco imunogénios, os títulos do pico foram atingidos após a quinta e a sexta doses e estes foram de uma ordem de grandeza mais baixa do que a dos quatro grupos com títulos mais elevados: conjugado de Αβ1-5 (pico GMT; 2356), pBx6 (pico GMT:1986), conjugado Αβ13-28 (pico GMT: 1183), conjugado Αβ33-42 (pico GMT: 658), Αβ25-35 (pico GMT: 125). Os títulos de anticorpos foram igualmente medidos contra os péptidos homólogos utilizando o mesmo formato de ELISA tipo sanduíche para uma subsérie dos imunogénios, os grupos imunizados com Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 ou Αβ1-42 de roedor. Estes títulos foram aproximadamente os mesmos medidos contra Αβ1-42 excepto para o imunogénio Αβ1-42 de roedor em que os títulos de anticorpos contra o imunogénio homólogo foram cerca de duas vezes mais altos. A grandeza do título de anticorpos específicos para AN1792 de animais individuais ou os valores médios dos grupos de tratamento não estão correlacionados com a eficácia medida pela redução de Αβ no córtex. 4. Respostas Linfoproliferativas grupos foram também cultivadas na presença do péptido reverso, Αβ40-1. Como controlo positivo, células adicionais foram cultivadas com o mitogénio de células T, PHA, e como controlo negativo, as células foram cultivadas sem péptido adicionado.

Os linfócitos da maioria dos animais proliferaram como resposta a PHA. Não houve respostas significativas ao péptido reverso Αβ40-1. As células dos animais imunizados com os maiores péptidos Αβ agregados, AN1792, Αβ1-42 de roedor e AN1528 proliferaram de forma robusta quando estimuladas com Αβ1-40 com os cpm mais elevados nos recipientes de AN1792. Um animal em cada um dos grupos imunizados com o conjugado de Αβ1-12, conjugado de AB13-28 e Αβ25-35 proliferaram como resposta a Αβ1-40. Os restantes grupos receberam conjugado de Αβ1-5, pBx6 conjugado com Αβ33-42 ou PBS não tinham animais com uma resposta estimulada por Αβ. Estes resultados estão resumidos na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5

Imunogénio Conj ugado Aminoácidos Αβ Reactivos Αβ1-5 sim 5-mero 0/7 Αβ1-12 sim 12-mero 1/8 AB13-28 sim 16-mero 1/9 Αβ25-35 11-mero 1/9 Αβ33-42 sim 10-mero 1/9 Αβ1-40 40-mero 5/8 Αβ1-42 42-mero 9/9 ηΑβ1-42 42-mero 8/8 ρΒχβ 0/8 PBS 0-mero 0/8

Estes resultados mostram que AN1792 e AN1528 estimulam fortes respostas de células T, muito provavelmente do fenótipo CD4+. A ausência de uma resposta de células T especifica de Αβ em animais imunizados com Αβ1-5 não é surpreendente uma vez que os epítopos peptidicos reconhecidos pelas células T CD4+ têm geralmente 15 aminoácidos de comprimento, se bem que péptidos mais pequenos possam por vezes funcionar com menos eficiência. Assim a maioria dos epítopos das células T auxiliares para os quatro péptidos conjugados residem provavelmente no parceiro do conjugado de IgG, não na região Αβ. Esta hipótese é apoiada pela baixa incidência de respostas proliferativas dos animais de cada um destes grupos de tratamento. Uma vez que o conjugado Αβ1-5 foi eficaz na redução significativa do nivel de Αβ no cérebro, na aparente ausência de células T específicas de Αβ, a resposta imunitária efectora chave induzida pela imunização com este péptido parece ser do tipo anticorpo. A ausência de células T e a baixa resposta de anticorpos relativamente ao péptido de fusão pBx6, incluindo os aminoácidos 592-695 de APP, incluindo todos os resíduos Αβ, pode ser devido à fraca imunogenicidade desta preparação particular. A fraca imunogenicidade do Αβ25-35 agregado é provavelmente devido ao péptido ser muito pequeno para poder conter um bom epítopo de células T para auxiliar a indução de uma resposta de anticorpos. Se este péptido for conjugado com uma proteína transportadora, será provavelmente mais imunogénico. V. Preparaçao de Anticorpos Policlonais para Protecção Passiva

Foram imunizados 20 murganhos não-transgénicos com Αβ ou outro imunogénio, opcionalmente com adjuvante e foram eutanasiados após 4-5 meses. Foi recolhido sangue dos murganhos imunizados. Opcionalmente, a IgG é separada dos outros componentes sanguíneos. Os anticorpos específicos para o imunogénio podem ser parcialmente purificados por cromatografia de afinidade. É obtida uma média de cerca de 0,5-1 mg de anticorpo específico do imunogénio por murganho, proporcionando um total de 5-10 mg. VI. Imunização Passiva com Anticorpos contra Αβ

Grupos de murganhos PDAPP, com 7-9 meses de idade, foram injectados com 0,5 mg de anti-Αβ policlonal em PBS ou anti-Αβ monoclonais específicos, como mostrado abaixo. Todas as preparações de anticorpo são purificadas para terem níveis de endotoxina baixos. Os monoclonais podem ser preparados contra um fragmento por injeção do fragmento ou forma mais longa de Αβ num murganho, preparando hibridomas e rastreando os hibridomas para um anticorpo que se liga especificamente a um fragmento desejado de Αβ sem se ligar a outros fragmentos não sobrepostos de Αβ.

Tabela 6

Anticorpo Epitopo 2H3 Αβ 1-12 10D5 Αβ 1-12 266 Αβ 13-28 21F12 Αβ 33-42 Policlonal Αβ42 de Αηίί-Αβ42 murganho anti-humano Agregado

Os murganhos foram injetados i.p., consoante necessário, ao longo de um periodo de 4 meses para manter uma concentração de anticorpo em circulação, medido por titulo de ELISA, superior a 1/1000, definido por ELISA para Αβ42 ou outro imunogénio. Os titulos são monitorizados como acima e os murganhos são eutanasiados ao fim de 4 meses de injeções. A histoquímica, níveis de Αβ e toxicologia são efectuadas post mortem. São utilizados dez murganhos por grupo. VII. Comparação de Diferentes Adjuvantes

Este exemplo compara CFA, alúmen, uma emulsão de óleo em água e MPL relativamente à capacidade de estimular uma resposta imunitária. A. Materiais e Métodos 1. Desenho do Estudo

Uma centena de cobaias fêmeas, estirpe Hartley, com seis semanas de idade, adquiridas a Elm Hill, foi distribuída por dez grupos a serem imunizados com AN17 92 ou um seu derivado palmitoilado combinado com vários adjuvantes. Sete grupos receberam injeções de AN1792 (33 pg, a menos que seja especificado de outra forma) combinado com a) PBS, b) adjuvante de Freund, c) MPL, d) esqualeno, e) MPL/esqualeno, f) dose baixa de alum ou g) dose elevada de alum (300 pg de AN1792) . Dois grupos receberam injeções de um derivado palmitoilado de AN1792 (33 pg) combinado com a) PBS ou b) esqualeno. Um grupo final de dez recebeu PBS sem antigénio ou adjuvante adicional. Para o grupo que recebeu adjuvante de Freund, a primeira dose foi emulsionada com CFA e as restantes quatro doses com IFA. O antigénio foi administrado numa dose de 33 pg para todos os grupos excepto o grupo da dose elevada com alúmen, que recebeu 300 pg de AN1792. As injeções foram administradas intraperitonealmente para CFA/IFA e intramuscularmente nos quadricepes dos membros traseiros, alternadamente no lado direito e esquerdo, para todos os outros grupos. As três primeiras doses foram administradas num esquema bi-semanal seguido de duas doses com um intervalo mensal. Colheu-se sangue seis a sete dias após cada imunização, começando após a segunda dose, para medição dos títulos de anticorpos. 2. Preparação de Imunogénios

Foram adicionadas duas mg de Αβ42 (Califórnia Peptide, Lote ME0339) a 0,9 mL de água desionizada e a mistura foi submetida a vórtex para proporcionar uma suspensão relativamente uniforme. Adicionou-se uma aliquota de PBS 10X (1XPBS, NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,5). A suspensão foi de novo submetida a vórtex e incubada, de um dia para o outro, a 37°C para ser utilizada no dia seguinte. Ο Αβ1-42 não utilizado foi guardado com excicante, como pó liofilizado, a -20 °C. 0 derivado palmitoilado de AN1792 foi preparado através do acoplamento de anidrido palmitico, dissolvido em dimetilformamida, ao residuo do terminal amina de AN1792, antes da remoção do péptido nascente da resina, através do tratamento com ácido hidrofluórico.

Para preparar as doses de vacina com adjuvante completo de Freund (CFA) (grupo 2), 33 pg de AN1792 em 200 pL de PBS foi emulsionado a 1:1 (vol:vol) com CFA num volume final de 400 pL para a primeira imunização. Para as imunizações subsequentes, o antigénio foi emulsionado de forma semelhante com adjuvante incompleto de Freund (IFA).

Para preparar as doses de vacinas com MPL para os grupos 5 e 8, foi adicionado pó liofilizado (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT) a 0,2% de trietilamina aquosa para uma concentração final de 1 mg/mL e submetido a vórtex. A mistura foi aquecida entre 65 e 70°C durante 30 segundos para proporcionar uma suspensão uniforme de micelas ligeiramente opaca. A solução foi preparada de fresco para cada série de injeções. Para cada injeção no grupo 5, 33 pg de AN17 92 em 16,5 pL de PBS, 50 pg de MPL (50 pL) e 162 pL de PBS foram misturados num tubo de boro-silicato imediatamente antes de serem utilizados.

Para preparar as doses de vacinas com a emulsão fraca de óleo em água, AN1792 foi adicionado a 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80, 0,5% de Span 85 em PBS para atingir uma concentração final de dose única de 33 pg de AN1792 em 250 pL (grupo 6) . A mistura foi emulsionada por passagem através de um sistema manual de duas câmaras, 15 a 20 vezes, até surgirem goticulas de emulsão que parecem ter um diâmetro aproximadamente igual ao de esferas de látex padrão com 1, o pm de diâmetro quando observado ao microscópio. A suspensão resultante era branca leitosa opalescente. As emulsões foram preparadas de fresco para cada série de injeções. Para o grupo 8, MPL em trietilamina a 0,2% foi adicionado numa concentração de 50 pg por dose à mistura de esqualeno e detergente para emulsão como referido atrás. Para o derivado palmitoilo (grupo 7), foram adicionadas 33 pg por dose de ρ3ΐιηίΡοϋ-ΝΗ-Αβ1-42 a esqualeno e submetidas a agitação com vórtex. Foram depois adicionados Tween 80 e Span 85 com vórtex. Esta mistura foi adicionada a PBS para atingir concentrações finais de esqualeno a 5%, Tween 80 a 0,5%, Span 85 a 0,5% e a mistura foi emulsionada como referido atrás.

Para preparar as doses de vacina com alum (os grupos 9 e 10), AN1792 em PBS foi adicionado a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio, Accurate, Westbury, NI) para atingir concentrações de 33 pg (dose baixa, grupo 9) ou 300 pg (dose elevada, grupo 10) de AN1792 por 5 mg de alum num volume final de dose de 250 pL. A suspensão foi suavemente misturada durante 4 h à temperatura ambiente. 3. Medição dos Títulos de Anticorpos

Colheu-se sangue dos cobaios seis a sete dias após imunização, começando após a segunda imunização, num total de quatro recolhas. Os títulos de anticorpos contra Αβ42 foram medidos por ELISA como descrito em Materiais e Métodos Gerais. 4. Preparação de Tecidos

Após cerca de 14 semanas, todas as cobaias receberam C02. 0 fluido cerebroespinal foi recolhido e os cérebros foram removidos e três regiões do cérebro (hipocampo, córtex e cerebelo) foram dissecadas e utilizadas para medir a concentração de proteína Αβ total utilizando ELISA. B. Resultados 1. Respostas de Anticorpos

Houve uma larga gama na potência dos vários adjuvantes quando medida como resposta de anticorpos contra AN1792 após a imunização. Como mostrado na Fig. 14, quando AN1792 foi administrado em PBS, não foram detectados anticorpos após duas ou três imunizações e respostas negligíveis foram detectadas após a quarta e a quinta doses com títulos de médias geométricas (GMT) de apenas cerca de 45. A emulsão de óleo em água induziu títulos modestos após a terceira dose (GMT 255) , que foram mantidos após a quarta dose (GMT 301) e caíram após a quarta dose (GMT 54) . Houve uma clara resposta dependente da dose de antigénio para AN1792 ligado a alúmen, com 300 pg sendo mais imunogénico em todos os pontos de tempo do que 33 pg. Nos picos da resposta de anticorpos, após a quarta imunização, a diferença entre as duas doses foi de 43% com GMT de aproximadamente 194 0 (33 pg) e 3400 (300 pg) . A resposta de anticorpos a 33 pg de AN1792 mais MPL foi muito semelhante à proporciona com uma dose quase dez vezes superior de antigénio (300 pg) ligado a alúmen. A adição de MPL a uma emulsão de óleo em água baixou em 75% a potência da vacina relativamente à que inclui MPL como único adjuvante. Um derivado palmitoilado de AN1792 foi completamente não imunogénico quando administrado em PBS e proporcionou títulos modestos quando apresentado numa emulsão de óleo em água, com GMT de 340 e 105 para a terceira e quarta colheitas de sangue. Os títulos de anticorpos mais elevados foram proporcionados com adjuvante de Freund com um pico GMT de aproximadamente 87000, um valor quase 30 vezes superior ao dos GMT das duas vacinas a seguir mais potentes, MPL e a dose mais elevada de AN1792/alúmen.

Os adjuvantes mais promissores identificados neste estudo são MPL e alúmen. Destes dois, MPL parece preferível devido a ser necessária uma dose de antigénio 10 vezes mais baixa para proporcionar a mesma resposta de anticorpos obtida com alúmen. A resposta pode ser aumentada através do aumento da dose de antigénio e/ou adjuvante e através da optimização do esquema de imunização. A emulsão de óleo em água foi um adjuvante muito fraco para AN1792 e a adição de uma emulsão de óleo em água ao adjuvante MPL diminuiu a actividade intrínseca do adjuvante MPL por si só. 2. Níveis de Αβ no Cérebro

Por volta das 14 semanas as cobaias foram anestesiadas profundamente, foi removido o líquido cerebroespinal (CSF) e os cérebros foram removidos dos animais numa subsérie de grupos, os imunizados com o adjuvante de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5) , alúmen com uma dose elevada, 300 pg, de AN1792 (grupo 10) e o grupo de controlo imunizado com PBS (grupo 3) . Para medir o nível de péptido Αβ, foi dissecado um hemisfério e os homogenatos das regiões do hipocampo, cortical e cerebelar foram preparados em guanidina 5 M. Estas foram diluídas e quantificadas por comparação com uma série de diluições de padrões da proteina Αβ de concentrações conhecidas num formato de ELISA. Os niveis da proteina Αβ no hipocampo, no córtex e no cerebelo foram muito semelhantes para os quatro grupos, apesar da larga gama de respostas de anticorpos contra Αβ induzida por estas vacinas. Niveis médios de Αβ de aproximadamente 25 ng/g de tecido foram medidos no hipocampo, 21 ng/g no córtex e 12 ng/g no cerebelo. Assim, a presença de um titulo elevado de anticorpos circulantes contra Αβ durante quase três meses nalguns destes animais não alterou os niveis de Αβ nos seus cérebros. Os niveis de Αβ no CSF foram também muito semelhantes entre os grupos. A ausência de um grande efeito da imunização de AN17 92 sobre ο Αβ endógeno indica que a resposta imunitária é focada nas formações patológicas de Αβ. VIII. Resposta Imunitária a Diferentes Adjuvantes em Murganhos

Foram utilizados murganhos Swiss Webster fêmeas de seis semanas de idade, para este estudo, com 10-13 animais por grupo. Foram feitas imunizações nos dias 1, 14, 28, 60, 90 e 20, administradas subcutaneamente num volume de dose de 200 yL. O PBS foi utilizado como tampão para todas as formulações. Recolheu-se sangue dos animais sete dias após cada imunização começando após a segunda dose para análise dos titulos de anticorpos por ELISA. O regime de tratamento de cada grupo está resumido na Tabela 7.

Tabela 7

Desenho experimental do estudo Betabloc 010 Grupo Na Adj uvante13 Dose Antigénio Dose (pg) 1 10 MPL 12,5 pg AN1792 33 2 10 MPL 25 pg AN1792 33 3 10 MPL 50 pg AN1792 33 4 13 MPL 12 5 pg AN1792 33 5 13 MPL 5 0 pg AN1792 150 6 13 MPL 5 0 pg AN1528 33 7 10 PBS AN1792 33 8 10 PBS nenhum 9 10 Esqualeno emulsionado 5% AN1792 33 10 10 Esqualeno misturado 5% AN1792 33 11 10 Alum 2 mg AN1792 33 12 13 MPL + Alum 50 pg/2 mg AN1792 33 13 10 QS21 5 pg AN1792 33 14 10 QS21 10 pg AN1792 33 15 10 QS21 25 pg AN1792 33 16 13 QS21 25 pg AN1792 150 17 13 QS21 25 pg AN1528 33 18 13 QS21 + MPL 25 pg/ 150 pg AN1792 33 19 13 QS21 + Alum 25 pg/2 mg AN1792 33 Notas de rodapé: aNúmero de murganhos em cada grupo no início da experiência. b Estão referidos os adjuvantes. 0 tampão para todas estas formulações foi PBS. Para o grupo 8, não houve adjuvante ou antigénio.

Os títulos de ELISA dos anticorpos contra Αβ42 em cada grupo estão apresentados na Tabela 8 abaixo.

Tabela 8 Média geométrica dos títulos de anticorpos Semana da recolha de sangue Grupo de tratamento 2,9 5, 0 8,7 12,9 16,7 1 248 1797 2577 6180 4177 2 598 3114 3984 5287 6878 3 1372 5000 7159 12333 12781 4 1278 20791 14368 20097 25631 5 3288 26242 13229 9315 23742 6 61 2536 2301 1442 4504 7 37 395 484 972 2149 8 25 25 25 25 25 9 25 183 744 952 1823 10 25 89 311 513 817 11 29 708 2618 2165 3666 12 198 1458 1079 612 797 13 38 433 566 1080 626 14 104 541 3247 1609 838 15 212 2630 2472 1224 1496 16 183 2616 6680 2085 1631 17 28 201 375 222 1540 18 31699 15544 23095 6412 9059 19 63 243 554 299 441 A tabela mostra que os títulos mais elevados foram obtidos para os grupos 4, 5 e 18, em que os adjuvantes foram 125 pg de MPL, 50 pg e QS21 mais MPL. IX. Eficácia Terapêutica de Diferentes Adjuvantes

Foi efectuado um estudo de eficácia terapêutica em murganhos transgénicos PDAPP com uma série de adjuvantes adequados para utilizar em humanos para determinar a sua capacidade para potenciar as respostas imunes contra Αβ e para induzir a eliminação de depósitos amilóides no cérebro mediada pela resposta imunitária.

Cento e oitenta murganhos transgénicos PDAPP heterozigóticos, machos e fêmeas, com 7,5-8,5 meses de idade foram adquiridos à Charles River. Os murganhos foram distribuídos por nove grupos contendo 15 a 23 animais por grupo para serem imunizados com AN1792 ou com AN1528 combinado com vários adjuvantes. Os animais foram distribuídos para combinar o género, a idade e os progenitores dos animais dentro dos grupos tanto quanto possível. Os adjuvantes incluíram alúmen, MPL e QS21, cada um deles combinado com ambos os antigénios e adjuvante de Freund (FA) combinado com apenas AN1792. Um grupo adicional foi imunizado com AN1792 formado em tampão PBS mais o conservante timerosal sem adjuvante. Um nono grupo foi imunizado com PBS apenas como controlo negativo.

Preparação de péptidos Αβ agregados: os péptidos Αβ1-40 humano (AN1528; Califórnia Peptids Inc., Napa, CA; Lote ME0541) e Αβ1-42 humano (AN1792; Califórnia Peptides Inc., Lote ME0439) foram solubilizados de fresco para a preparação de cada uma das séries de injeções derivadas de pós liofilizados que tinham sido guardados secos a -20 °C. Para este fim, foram adicionadas duas mg de péptidos a 0,9 mL de água desionizada e a mistura foi agitada com vórtex para gerar uma solução ou suspensão relativamente uniforme. AN1528 mostrou-se solúvel neste passo, ao contrário de AN1792. Uma aliquota de 100 pL de PBS 10X (PBS IX: NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,5) foi então adicionada, altura em que AN1528 começou a precipitar. As suspensões foram submetidas a vórtex novamente e incubadas de um dia para o outro a 37°C para utilizar no dia seguinte.

Para preparar doses de vacina com alúmen (Grupos 1 e 5), o péptido Αβ em PBS foi adicionado a Alhydrogel (gel aquoso de hidróxido de aluminio a dois por cento, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) para atingir concentrações de 100 pg de péptido Αβ por 1 mg de alúmen, adicionou-se PBS 10X para um volume de dose final de 200 pL em PBS lx. A suspensão foi então suavemente misturada durante aproximadamente 4 h, à temperatura ambiente, antes da injeção.

Para preparar as doses de vacina com MPL (grupos 2 e 6) , foi adicionado pó liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) a 0,2% de trietilamina aquosa para uma concentração final de 1 mg/mL e agitado com vórtex. A mistura foi aquecida a 65 a 70°C durante 30 s para criar uma suspensão uniforme de micelas ligeiramente opaca. A solução foi guardada a 4°C. Para cada série de injeções, foram misturados 100 pg de péptido por dose em 50 pL de PBS, 50 pg de MPL por dose (50 pL) e 100 pL de PBS por dose num tubo de boro-silicato imediatamente antes de utilizar.

Para preparar doses de vacina com QS21 (Grupos 3 e 7), foi adicionado pó liofilizado (Aquila, Framingham, MA; Lote A7018R) a PBS, pH 6, 6-6,7 para uma concentração final de 1 mg/mL e agitado com vórtex. A solução foi guardada a -20 °C. Para cada série de injeções, 100 pg de péptido por dose em 50 pL de PBS, 25 pg de QS21 por dose em 25 pL de PBS e 125 pL de PBS por dose foram misturados num tubo de boro-silicato imediatamente antes de utilizar.

Para preparar doses de vacina com adjuvante de Freund (Grupo 4), foram emulsionadas 100 pg de AN1792 em 200 pL de PBS a 1:1 (volrvol) com adjuvante completo de Freund (CFA) num volume final de 400 pL, para a primeira imunização.

Para subsequentes imunizações, o antigénio foi emulsionado de forma semelhante com adjuvante incompleto de Freund (IFA). Para as vacinas contendo os adjuvantes alum, MPL ou QS21, 100 pg por dose de AN1792 ou de AN1528 foi combinado com alúmen (1 mg por dose) ou MPL (50 pg por dose) ou QS21 (25 pg por dose) num volume final de 200 pL em PBS e administrado por inoculação subcutânea no dorso entre as espáduas. Para o grupo que recebeu FA, 100 pg de AN1792 foi emulsionado a 1:1 (vol:vol) com adjuvante completo de Freund (CFA) num volume final de 400 pL e administrado intraperitonealmente para a primeira imunização, seguido de um reforço da mesma quantidade de imunogénio em adjuvante incompleto de Freund (IFA) para as cinco doses subsequentes. Para o grupo que recebeu AN1792 sem adjuvante, foram combinadas 10 pg de AN1792 com 5 pg de timerosal num volume final de 50 pL de PBS e administrado subcutaneamente. O nono grupo de controlo recebeu apenas 200 pL de PBS administrado subcutaneamente. As imunizações foram administradas num esquema bi-semanal para as primeiras três doses, em seguida num esquema mensal nos dias O, 16, 28, 56, 85 e 112. Recolheu-se sangue dos animais seis a sete dias após cada uma das imunizações, começando após a segunda dose, para a medição dos titulos de anticorpos. Os animais foram eutanasiados aproximadamente uma semana após a dose final. Os resultados foram medidos através do ensaio de ELISA para os niveis de Αβ e APP no cérebro e por avaliação imuno-histoquimica da presença de placas amilóides nas secções de cérebro. Além disso, foram determinados os titulos de anticorpos especificos de Αβ e as respostas proliferativas e de citoquinas dependentes de Αβ. A Tabela 9 mostra que os titulos mais elevados de anticorpos contra Αβ1-42 foram induzidos com FA e AN1792, os títulos que atingiram o máximo após a quarta imunização (pico GMT: 75386) e depois baixou em 59% após a sexta imunização final. 0 título médio de pico induzido por MPL com AN1792 foi 62% mais baixo do que o gerado com FA (pico GMT: 28867) e foi também atingido mais cedo no esquema de imunização, após 3 doses, seguido de um declínio até 28% do valor do pico após a sexta imunização. 0 título médio do pico gerado com QS21 combinado com AN1792 (GMT: 1511) foi cerca de 5 vezes mais baixo do que o obtido com MPL. Além disso, as cinéticas da resposta foram mais lentas, uma vez que foi necessária mais uma imunização para atingir a resposta do pico. Os títulos gerados por AN1792 ligado a alum foram marginalmente superiores aos obtidos com QS21 e as cinéticas de resposta foram mais rápidas. Para AN1792 administrado em PBS com timerosal a frequência e tamanho dos títulos foram ligeiramente superiores às de PBS sozinho. Os títulos dos picos gerados com MPL e AN1528 (pico/GMT 3099) foram cerca de 9 vezes mais baixos do que os proporcionados com AN1792. O NA-1528 ligado a alúmen foi muito pouco imunogénico, com títulos baixos proporcionados em apenas alguns dos animais. Não foram observadas respostas de anticorpos nos animais de controlo imunizados apenas com PBS.

Tabela 9 Média geométrica dos títulos de anticorposa Semana da colheita de sangue Tratamento 3,3 5,0 9,0 13,0 17,0 Alum/AN17 92 102 (12/21)b 1081 (17/20) 2366 (21/21) 1083 (21/21) 572 (18/21) MPL/AN1792 6241 (21/21) 28867 (21/21) 11242 (21/21) 5665 (20/20) 8204 (20/20) QS21/AN17 92 30 (1/20) 227 (10/19) 327 (10/19) 1511 (17/18) 1188 (14/18) CFA/AN1792 10076 (15/15) 61279 (15/15) 75386 (15/15) 41628 (15/15) 30574 (15/15) Alum/AN1528 25 (0/21) 33 (1/21) 39 (3/20) 37 (1/20) 31 (2/20) MPL/AN1528 184 (15/21) 2591 (20/21) 1653 (21/21) 1156 (10/20) 3099 (20/20) QS21/AN1528 29 (1/22) 221 (13/22) 51 (4/22) 820 (20/22) 2994 (21/22) PBS mais Timerosal 25 (0/16) 33 (2/16) 39 (4/16) 37 (3/16) 47 (4/16) PBS 25 (0/16) 25 (0/16) 25 (0/15) 25 (0/12) 25 (0/16) Notas de rodapé: a Média geométrica dos títulos de anticorpos contra Αβ1-42 b Número de elementos que responderam por grupo

Os resultados do tratamento com AN1792 ou AN1592, com vários adjuvantes ou timerosal, no desenvolvimento amilóide cortical em murganhos com 12 meses de idade, determinados por ELISA, são mostrados na Fig. 15. Nos murganhos PDAPP de controlo que receberam PBS, o nivel médio de Αβ total no córtex aos 12 meses foi de 1,817 ng/g. Foram observados niveis fortemente reduzidos de Αβ em murganhos tratados com AN1792 mais CFA/IFA, AN1792 mais alúmen, AN1792 mais MPL e QS21 mais AN1792. A redução atingiu significância estatística (p < 0,05) apenas para AN1792 mais CFA/IFA. No entanto, como se mostra nos Exemplos I e III, os efeitos de imunização na redução dos niveis de Αβ tornou-se substancialmente maior em murganhos com 15 meses e 18 meses de idade. Assim, espera-se que pelo menos as composições AN1792 mais alúmen, AN1792 mais MPL e AN1792 mais QS21 atinjam significância estatística no tratamento de murganhos mais velhos. Ao contrário, ο AN1792 mais o conservante timerosal apresentou aproximadamente o mesmo nivel médio de Αβ dos murganhos tratados com PBS. Resultados semelhantes foram obtidos quando os niveis corticais de Αβ42 foram comparados. 0 nivel médio de Αβ42 nos controlos de PBS foi de 1624 ng/g. Foram observados niveis médios fortemente reduzidos de 403, 1149, 620 e 714 nos murganhos tratados com AN1792 mais CFA/IFA, AN1792 mais alúmen, AN1792 mais MPL e AN1792 mais QS21 respectivamente, com a redução a atingir significância estatística (p=0,05) para o grupo de tratamento AN1792CFA/IFA. O nível médio nos murganhos tratados com AN1792 timerosal foi de 1619 ng/g Αβ42 . X. Análise de Toxicidade

Foram recolhidos tecidos para análise histopatológica no final dos estudos descritos nos Exemplos 2, 3 e 7. Ainda, a hematologia e a química clínica foi realizada nas amostras de sangue terminais dos Exemplos 3 e 7. A maior parte dos órgãos principais foram avaliados, incluindo cérebro, pulmão, tecido linfóide, tecido gastrointestinal, fígado, rim, glândulas suprarrenais e gónadas. Se bem que fossem observadas lesões esporádicas nos animais do estudo, não houve diferenças óbvias, nos tecidos afectados ou na gravidade das lesões, entre animais tratados com AN1792 e animais não tratados. Não se observaram lesões histopatológicas isoladas em animais imunizados com NA1782 comparativamente com animais tratados com PBS ou não tratados. Também não houve diferenças no perfil de química clínica entre grupos de adjuvante e os animais tratados com PBS no Exemplo 7. Apesar se observar aumentos significativos em vários parâmetros da hematologia entre animais tratados com AN1792 e adjuvante de Freund no Exemplo 7 relativamente aos animais tratados com PBS, este tipo de efeitos são esperados do tratamento com adjuvante de Freund e na peritonite que o acompanha e não indica quaisquer efeitos adversos derivados do tratamento com AN1792. Ainda que não fazendo parte da avaliação toxicológica, a patologia do cérebro de murganhos PDAPP foi extensivamente avaliada como parte da eficácia final. Não foram observados sinais de efeitos adversos relacionados com o tratamento na morfologia do cérebro em qualquer um dos estudos. Estes resultados indicam que o tratamento com AN1792 é bem tolerado e pelo menos não implica efeitos secundários. XI. Prevenção e Tratamento dos Indivíduos

Realizou-se a fase I de um ensaio clínico com uma única dose para avaliar a segurança. Foi administrado um agente terapêutico em dosagens crescentes a diferentes doentes, começando a partir de aproximadamente 0,01 do nível de presumível eficácia e aumentando por um factor de três até ser atingível um nível de aproximadamente 10 vezes a dosagem eficaz no murganho.

Realizou-se a fase II de um ensaio clínico para determinar a eficácia terapêutica. Foram selecionados doentes com doença de Alzheimer precoce a média definida utilizando os critérios da Associação da Doença de Alzheimer e Distúrbios Relacionadas (ADRDA) relativamente a AD provável. Os doentes adequados foram avaliados na gama de 12-26 no Mini-Exame do Estado Mental (MMSE). Outros critérios de selecção são que os doentes tenham probabilidade de sobreviver durante a duração do estudo e não possuam outras complicações, tal como a utilização concomitante de medicações que possam interferir. As avaliações na linha de base da função do doente são feitas utilizando medições psicométricas clássicas, tais como a MMSE e a ADAS, que é uma escala compreensiva para avaliação do estatuto e função dos doentes com Doença de Alzheimer. Estas escalas psicométricas proporcionam uma medida de progressão da condição de Alzheimer. Escalas de vida qualitativas adequadas podem igualmente ser utilizadas para monitorizar o tratamento. A progressão da doença pode também ser monitorizada por MRI. Os perfis sanguíneos dos doentes podem também ser monitorizados, incluindo ensaios de anticorpos específicos de imunogénios e respostas de células T.

Após as medições de linha de base, os doentes começaram a receber tratamento. Foram distribuídos aleatoriamente e tratados com agente terapêutico ou placebo de forma cega. Os doentes foram monitorizados pelo menos de seis em seis meses. A eficácia foi determinada através de uma redução significativa na progressão de um grupo de tratamento relativamente ao grupo placebo.

Foi realizado um segundo ensaio clínico de fase II para avaliar a conversão de doentes com perda de memória precoce não atribuída a Doença de Alzheimer, muitas vezes referido como perda de memória associada à idade (AAMI), para provável Doença de Alzheimer como definido pelos critérios de ADRDA. Os doentes com risco elevado de conversão em Doença de Alzheimer foram selecionados de uma população não clínica através do rastreio de populações de referência relativamente a ensaios precoces de perda de memória ou outras dificuldades associadas a sintomatologia pré-Alzheimer, uma história familiar de Doença de Alzheimer, factores de risco genéticos, idade, sexo e outras características que se observou prenunciarem elevado risco de Doença de Alzheimer. Foram feitas avaliações da linha de base com parâmetros adequados incluindo os de MMSE e ADAS juntamente com outros parâmetros destinados a avaliar uma população mais normal. Estas populações de doentes foram divididas em grupos adequados, com comparação do placebo contra alternativas de dosagem com o agente. Estas populações de doentes foram seguidas com intervalos de cerca de seis meses e ponto terminal para cada doente e quando da conversão em provável Doença de Alzheimer, conforme definido pelos critérios de ADRDA no final da observação. XII. Materiais e Métodos Gerais 1. Medição de Títulos de Anticorpos

Recolheu-se sangue dos murganhos fazendo-se uma pequena incisão na veia da cauda e recolhendo cerca de 200 yL de sangue para um tubo de microcentrífuga. Foi recolhido sangue das cobaias barbeando primeiro a área do dorso e depois utilizando uma agulha de calibre 18 para perfurar a veia do metatarso e recolher o sangue em tubos de microcentrífuga. Deixou-se o sangue coagular durante uma hora à temperatura ambiente (T.A.), agitado com vórtex, depois centrifugado a 14000 xg durante 10 min para separar o coágulo do soro. O soro foi então transferido para um tubo de microcentrí fuga limpo e guardado a 4°C até ser titulado .

Os títulos de anticorpos foram medidos por ELISA. Placas de microtitulação de 96 poços (placas de EIA Costar) foram revestidas com 100 pL de uma solução contendo 10 pg/mL de Αβ42 ou SAPP ou outros antigénios conforme observado em cada uma das descrições individuais em Tampão de Revestimento de Poços (fosfato de sódio 0,1 M, pH 8,5, azida de sódio a 0,1%) e mantidas de um dia para o outro à TA. Os poços foram aspirados e os soros foram adicionados numa diluição de 1/100 em Diluente da Amostra (fosfato de sódio 0,014 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, de albumina sérica bovina a 0,6%, timerosal a 0,05%). Foram feitas sete diluições em série das amostras, directamente nas placas, em passos de três vezes até atingir uma diluição final de 1/218700. As diluições foram incubadas em poços de placas revestidas durante uma hora à TA. As placas foram então lavadas quatro vezes com PBS contendo Tween 20 a 0,05%. O segundo anticorpo, IgG de cabra anti-murganho conjugados com peroxidase de rábano (adquirido à Boehringer Mannheim) , foram adicionados aos poços como 100 pL de uma diluição de 1/3000 em Diluente da Amostra e incubados durante uma hora à TA. As placas foram novamente lavadas quatro vezes em PBS, Tween 20. Para o desenvolvimento da cor, foram adicionados 100 pL de TMB Lento (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina adquirida à Pierce Chemicals) a cada poço e foram incubados durante 15 min à TA. A reacção foi parada pela adição de 25 pL de H2S04 2 Μ. A intensidade da cor foi então lida num leitor Molecular Devices Vmáx (a 450 nm-650 nm).

Os títulos foram definidos como o inverso da diluição de soro que proporciona metade da DO máxima. A DO máxima foi geralmente retirada a partir de uma diluição inicial de 1/100, excepto nos casos com títulos muito elevados, situação em que foi necessário uma diluição inicial mais elevada para estabelecer a DO máxima. Se o valor correspondente a 50% diminuiu entre duas diluições, foi feita uma extrapolação linear para calcular o título final. Para calcular a média geométrica dos títulos de anticorpos, aos títulos inferiores a 100 foi atribuído arbitrariamente um valor de título de 25. 2. Ensaio de Proliferação de Linfócitos

Os murganhos foram anestesiados com isoflurano. Os baços foram removidos e lavados duas vezes com 5 mL de PBS contendo soro bovino fetálico a 10% inativado pelo calor (PBS-FBS) e depois homogeneizado numa unidade Centricon de 50 ym (Dako Ais, Dinamarca) em 1,5 mL de PBS-FBS durante 10 seg, a 100 rpm, num Medimachine (Dako) , seguido de filtração através de uma rede de nylon de 100 ym de poro. Os esplenócitos foram lavados uma vez com 15 mL de PBS-FBS, depois sedimentados por centrifugação a 200 x g durante 5 min. Os eritrócitos foram lisados ressuspendendo o sedimento em 5 mL de tampão contendo NH4C1 0,15 M, KHCO3 1 M, NaEDTA 1,1 M, pH 7,4 durante cinco min à TA. Os leucócitos foram então lavados como atrás. Células do baço foram isoladas de fresco (105 células por poço), foram cultivadas em triplicado em placas de microtitulação de 96 poços de fundo em U, tratadas para cultura de tecidos (Corning, Cambridge, MA) , em meio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado com glutamina 2,05 mM, 1% de Penicilina/Estreptomicina e 10% de FBS inativado pelo calor, durante 96 h, a 37 °C. Os vários péptidos Αβ, Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 ou a proteína com a sequência reversa Αβ40-1 foram também adicionados em doses que variam entre 5 ym e 0,18 ym em quatro passos. As células nos poços de controlo foram cultivadas com Concanavalina A (Com A) (Sigma, cat. N° C-5275, a 1 μg/mL) sem adicionar proteína. As células foram incubadas durante as últimas 24 h com 3H-timidina (1 yCi/poço adquirido à Amersham Corp., Arlington Heights IL) . As células foram então colhidas em placas UniFilter e contadas num contador de cintilação Top Count Microplate (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Os resultados são expressos como contagens por minuto (cpm) de radioactividade incorporada em macromoléculas solúveis. 4. Preparação de Tecido Cerebral

Após eutanásia, os cérebros foram removidos e um hemisfério foi preparado para análise imuno-histoquímica, enquanto três regiões do cérebro (hipocampo, córtex e cerebelo) foram dissecadas do outro hemisfério e utilizadas para medir a concentração de várias proteínas Αβ e formas de APP utilizando ELISA específico (Johnson-Wood et al., supra).

Os tecidos destinados a ELISA foram homogeneizados em 10 volumes de tampão guanidina arrefecido em gelo (guanidina-HCl 5,0 mM, Tris-HCI 50 mM, pH 8,0). Os homogenatos foram misturados por agitação suave utilizando um Adams Nutator (Fisher) , durante três a quatro h, à TA, depois guardados a -20°C antes da quantificação de Αβ e APP. Experiências anteriores demonstraram que os analitos eram estáveis nestas condições de armazenamento e que a proteína sintética Αβ (Bachem) poderá ser quantitativamente recuperada quando dispersa em homogenatos de tecido cerebral de controlo derivado de ninhadas de recém-nascidos (Johnson-Wood et al., supra). 5. Medição dos Níveis de Αβ

Os homogenatos de cérebro foram diluídos a 1:10 com Diluente de Caseína arrefecido em gelo (caseína a 0,25%, PBS, azida de sódio a 0,05%, aprotinina a 20 pg/mL, EDTA 5 mM, pH 8, 0,10 pg/mL de leupeptina) e depois centrifugados a 16000 x g durante 20 min a 4°C. Os padrões de proteína Αβ sintética (1-42 aminoácidos) e os padrões de APP foram preparados para incluir guanidina 0,5 M e albumina sérica bovina a 0,1% (BSA) na composição final. A sanduíche "total" de Αβ utiliza o anticorpo monoclonal (mAp) 266, específico para os aminoácidos 13-28 de Αβ (Seubert, et al.) , como anticorpo de captura e o mAp 3D6 biotinilado, específico para aminoácidos 1-5 de Αβ (Johnson-Wood, et al.), como anticorpo repórter. Ο ιηΑβ 3D6 não reconhece APP secretado ou APP de tamanho completo, mas detecta apenas espécies Αβ com um ácido aspártico no terminal amina. Este ensaio tem um limite inferior de sensibilidade de ~50 pg/mL (11 pM) e não apresenta reatividade cruzada com a proteína Αβ endógena murina a concentrações de 1 ng/mL (Johnson-Wood et al., supra) .

O ELISA tipo sanduíche específico de Αβ emprega ο ιηΑβ 21F12, específico dos aminoácidos 33-42 de Αβ (Johnson-Wood, et al.), como anticorpo de captura. Ο ιηΑβ 3D6 biotinilado é igualmente o anticorpo repórter neste ensaio que tem um limite inferior de sensibilidade de aproximadamente 125 pg/mL (28 pM, Johnson-Wood et al.). Para os ELISA de Αβ, 100 pL do ιηΑβ 266 (a 10 pg/mL) ou do ιηΑβ 21F12 (a 5 pg/mL) foi utilizado para revestir os poços de placas de imunoensaio de 96 poços (Costar) através de incubação de um dia para o outro, à TA. A solução foi removida por aspiração e os poços foram bloqueados pela adição de 200 pL de albumina sérica bovina em tampão PBS durante pelo menos 1 h à TA. A solução de bloqueio foi removida e as placas foram guardadas na ausência de humidade a 4°C até serem utilizadas. As placas foram re-hidratadas com Tampão de Lavagem [solução salina tamponado com Tris (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5), mais 0,05% de Tween 20 antes de utilizar. As amostras e padrões foram adicionados em triplicados de aliquotas de 100 pL por poço e depois incubados, de um dia para o outro, a 4 °C. As placas foram lavadas, pelo menos, três vezes com Tampão de Lavagem entre cada passo do ensaio. Ο ιηΑβ 3D6 biotinilado, diluído para 0,5 pg/mL em Tampão de Ensaio com Caseína (caseína a 0,25%, PBS, Tween 20 a 0,05%, pH 7,4) foi adicionado e incubado nos poços durante 1 h à TA. Um conjugado de avidina-peroxidase de rábano, (Avidin-HRP adquirido à Vector, Burlingame, CA), diluído a 1:4000 em Tampão de Ensaio com Caseína, foi adicionado aos poços durante 1 h à TA. O substrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce), foi adicionado e deixado a reagir durante 15 minutos à TA, após o que a reação enzimática foi parada pela adição de 25 pL de H2S04 2 N. O produto de reacção foi quantificado utilizando o equipamento Molecular Devices Vmax que mede a diferença na absorvância a 450 nm e a 650 nm.

6. Medição dos Níveis de APP

Foram utilizados dois ensaios de APP diferentes. O primeiro, designado ΑΑΡ-α/FL, reconhece AAP-alfa (a) e as formas de tamanho completo (FL) de APP. O segundo ensaio é específico de ΑΑΡ-α. O ensaio de ΑΑΡ-α/FL reconhece APP segregada incluindo os 12 primeiros aminoácidos de Αβ. Uma vez que o anticorpo repórter (2H3) não é específico do local "α-clip", ocorrendo entre os aminoácidos 612-613 de ΑΡΡ695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); este ensaio também reconhece APP de tamanho completo (APP-FL) . Experiências preliminares, utilizando anticorpos APP imobilizados contra a cauda citoplasmática de APP-FL imobilizados para remover APP-FL dos homogenatos de cérebro, sugerem que aproximadamente 30-40% do AAP-a/FLAPP é FL (dados não mostrados) . O anticorpo de captura para os ensaios APP-a/FL e os ensaios AAP-α é ο ιηΑβ 8E5, induzido contra os aminoácidos 444 a 592 da forma APP695 (Games et al., supra) . Ο ιηΑβ repórter para o ensaio ΑΑΡ-α/FL é ο ιηΑβ 2H3, especifico dos aminoácidos 597-608 de APP695 (Johnson-Wood et al., supra) e o anticorpo repórter para o ensaio de APP-α é um derivado biotinilado de ιηΑβ 16H9, induzido contra os aminoácidos 605 a 611 de APP. O limite inferior de sensibilidade do ensaio ΑΑΡ-α/FL é cerca de 11 ng/mL (150 pM) (Johnson-Wood et al.) e o do ensaio especifico de AAP-α é 22 ng/mL (0,3 nM) . Para ambos os ensaios APP, ο ιηΑβ 8E5 foi utilizado para revestir os poços de placas de EIA de 96 poços como descrito atrás para ο ιηΑβ 266. AAP-oí recombinante, secretado e purificado foi utilizado como padrão de referência para o ensaio de AAP-α e o ensaio de ΑΡΡ-α/FL (Esch et. al., supra). As amostras de homogenato de cérebro, em guanidina 5 M, foram diluídas, a 1:10, em Diluente da Amostra para ELISA (tampão de fosfatos 0,014 M, pH 7,4, albumina sérica bovina a 0,6%, timerosal a 0,05%, NaCl 0,5 Μ, NP40 a 0,1%). Foram depois diluídas a 1:4 em Diluente da Amostra contendo guanidina 0,5 M. Os homogenatos diluídos foram então centrifugados a 16000 x g durante 15 segundos à TA. Os padrões de APP e as amostras foram adicionadas à placa em duplicado e incubados durante 1,5 h à TA. O anticorpo repórter biotinilado 2H3 ou 16H9 foi incubado com amostras durante 1 h à TA. A estreptavidina-fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim), diluída a 1:1000 em diluente da amostra, foi incubada nos poços durante 1 h à TA. 0 substrato fluorescente 4-metil-umbeliferil-fosfato foi adicionado para uma incubação durante 30 min à TA e as placas foram lidas num fluorimetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a 365 nm de excitação e 450 nm de emissão. 7 . Imuno-histoquimica

Os cérebros foram fixados durante três dias em paraformaldeido a 4% em PBS e depois guardados de um a sete dias a 4 °C em paraf ormaldeido a 1% até serem cortados. Secções coronais de quarenta micrones de espessura foram cortadas num vibratomo à TA e guardadas em crioprotector (glicerol a 30%, etilenoglicol a 30% e tampão de fosfatos) a -20 °C antes do processamento histoquimico. Para cada cérebro, seis secções ao nível do hipocampo dorsal, cada uma delas separada por intervalos consecutivos de 240 pm, foram incubadas, de um dia para o outro, com um dos seguintes anticorpos: (1) um anticorpo anti-Αβ biotinilado (ιηΑβ, 3D6, específico para Αβ humano) diluído para uma concentração de 2 pg/mL em PBS e de soro de cavalo a 1%; ou (2) um ιηΑβ biotinilado específico de APP humano, 8E5, diluído para uma concentração de 3 pg/mL em PBS e soro de cavalo a 1,0%; ou (3) um ιηΑβ específico da proteína acídica fibrilhar da glia (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluída a 1:500 com 0,25% de Triton X-100 e soro de cavalo a 1%, em solução salina tamponado com Tris, pH 7,4 (TBS); ou (4) um ιηΑβ específico de CDllb, antigénio MAC-1), (Chemicon International) diluído a 1:100 com Triton X-100 a 0,25% e soro de coelho a 1% em TBS; ou (5) um ιηΑβ específico para o antigénio MHC II, (Pharmingen) diluído a 1:100 com Triton X-100 a 0,25% e soro de coelho a 1% em TBS; ou (6) um ιηΑβ de rato específico para CD43 (Pharmingen) diluído a 1:100 com soro de coelho a 1% em PBS ou (7) um ιηΑβ de rato específico para CD 45RA (Pharmingen) diluído a 1:100 com soro de coelho a 1% em PBS; ou (8) um Αβ monoclonal de rato específico para CD45RB (Pharmingen) diluído a 1:100 com soro de coelho a 1% em PBS; ou (9) um Αβ monoclonal de rato específico para CD45 (Pharmingen) diluído a 1:100 com soro de coelho a 1% em PBS; ou (10) um Αβ policlonal biotinilado de cobaio específico para CD3e (Pharmingen) diluído a 1:100 com soro de coelho a 1% em PBS ou (11) um ιηΑβ de rato específico para CD3 (Serotec) diluído a 1:200 com soro de coelho a 1% em PBS; ou com (12) uma solução de PBS sem um anticorpo primário contendo soro normal de cavalo a 1%.

As secções reagiram com as soluções de anticorpos referidas em 1,2 e 6-12 atrás foram pré-tratadas com 1,0% de Triton X-100, peróxido de hidrogénio a 0,4% em PBS durante 20 min, à TA, para bloquear a peroxidase endógena. Foram em seguida incubadas de um dia para o outro a 4 °C com anticorpo primário. As secções que reagiram com os ιηΑβ 3D6 ou 8E5 ou CD3e reagiram então durante uma hora à TA com um complexo de peroxidase de rábano -avidina-biotina com os componentes do kit "A" e "B" diluídos a 1:75 em PBS (vector Elite Standard kit, Vector Labs, Burlingame, CA) . As secções reagiram com anticorpos específicos para CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 e a solução de PBS sem o anticorpo primário, foram incubados durante 1 hora, à TA, com anti-IgG de rato biotinilado (Vector) diluído a 1:75 em PBS ou anticorpos anti-IgG de murganho biotinilados (Vector) diluído a 1:75 em PBS, respectivamente. As secções foram então incubadas durante uma hora à TA com o complexo peroxidase de rábano-avidina-biotina com os componentes do kit "A" e "B" diluídos a 1:75 em PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

As secções foram reveladas em peróxido de hidrogénio a 0,01%, 3,3'-diaminobenzidina (DAB) a 0,05% à TA. As secções destinadas à incubação com os anticorpos específicos de GFAP, NAC-1 e MHC II foram pré-tratadas com peróxido de hidrogénio a 0,6% à TA para bloquear a peroxidase endógena, depois incubadas durante a noite com o anticorpo primário a 4 °C. As secções que reagiram com o anticorpo GFAP foram incubadas durante 1 h à TA com anticorpos anti-IgG de murganho biotinilados preparados em cavalo (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) diluído a 1:200 com TBS. Em seguida, as secções foram reagidas durante uma h com um complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC kit) diluído a 1:1000 com TBS. As secções incubadas com os πιΑβ específicos de MAC-1 ou MHC II como o anticorpo primário reagiram subsequentemente durante 1 h à TA com anticorpos anti-IgG de rato biotinilados produzidos em coelho, diluídos a 1:200 com TBS, seguido de incubação durante uma hora com o complexo de avidina-biotina-peroxidase diluído a 1:1000 com TBS. As secções incubadas com anticorpos específicos de GFAP, MAC-1 e MHC II foram então visualizados por tratamento à TA com DAB a 0,05%, peróxido de hidrogénio a 0,01%, cloreto de níquel a 0,04%, TBS durante 4 e 11 min, respectivamente.

As secções marcadas imunologicamente foram montadas em lâminas de vidro (VWR, lâminas Superfrost), secas ao ar durante a noite, mergulhadas em Propar (Anatech) e cobertas com lamelas utilizando Permount (Fisher) como meio de montagem.

Para contrastar as placas Αβ, uma subsérie das secções positivas para GFAP foi montada em lâminas Superfrost e incubadas em Thioflavin S a 1% aquoso (Sigma) durante 7 min após processamento imuno-histoquímico. As secções foram então desidratadas e mergulhadas em Propar, depois cobertas com lamelas montadas com Permount. 8. Análise de Imagens

Utilizou-se um sistema de análise de imagens Video-metric 150 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) ligado a um microscópio Nikon Microphot-FX através de uma câmara de video CCD e de um monitor Sony Trinitron para a quantificação das lâminas com reatividade imunológica. A imagem da secção foi guardada num tampão de video e determinado um patamar baseado em cor e saturação para selecionar e calcular a área total de pixéis ocupada pelas estruturas marcadas imunologicamente. Para cada uma das secções, o hipocampo foi marcado manualmente e calculada a área total de pixéis ocupada pelo hipocampo. A percentagem de desenvolvimento amilóide foi medida como: (a fracção da área do hipocampo contendo depósitos Αβ que reagiram imunologicamente com o ιηΑβ 3D6) x 100. De forma semelhante, a percentagem de desenvolvimento neuritico foi medida como: (a fracção da área do hipocampo contendo neurites distróficas reactivas com ιηΑβ 8E5) x 100. O C-Imaging System (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) funcionando com o programa Simple 32 Software Application foi ligado a um microscópio Nikon Microphot-FX através de uma câmara Optronics e utilizado para quantificar a percentagem de córtex retroesplenial ocupado por astrócitos positivos para GFAP e MAC-1 e microglia positiva para MHC II. A imagem da secção que reagiu imunologicamente foi guardada num tampão de video e determinado um patamar baseado em monocromo para selecionar e calcular a área total de pixéis ocupada pelas células marcadas imunologicamente. Para cada secção, o córtex retroesplenial (RSC) foi marcado manualmente e a área total de pixéis ocupada pelo RSC foi calculada. A percentagem de astrocitose foi definida como: (a fracção de RSC ocupada por astrócitos reativos com GFAP) x 100. De forma semelhante, a percentagem de microgliose foi definida como: (a fracção da RSC ocupada por microglia que reage com MAC-1 ou MHC II) x 100. Para todas as análises de imagens, seis secções ao nível do hipocampo dorsal, cada separada por intervalos consecutivos de 240 ym, foram quantificadas para cada animal. Em todos os casos, o estatuto de tratamento dos animais não era conhecido do observador. tenha sido descrita em detalhe e compreensão, será óbvio que modificações dentro do âmbito

Embora a presente invenção com objectivos de clareza podem ser efectuadas certas das reivindicações em anexo

Tabela 1 Título a 50% da DO máxima Αβ agregado injectado em murganhos idade de PDAPP Murganho 100 Murganho 101 Murganho 102 Murganho 103 Murganho 104 Murganho 105 Murganho 10 6 Murganho 107 Murganho 108 4 70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 80000 100000 6 15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000 8 20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000 10 40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000 12 25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000

Murganhos injectados com PBS em ambos os imunogénios a 1/100 Idade de PDAPP Murganho 113 Murganho 114 Murganho 115 Murganho 116 Murganho 117 6 <4x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg 10 5 x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg 12 <4x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg <4x bKg

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo um agente eficaz para induzir uma resposta imune contra ο Αβ num paciente, para utilização em terapia, em que o agente é: (i) Αβ ou um seu fragmento, em que o fragmento está ligado a um suporte que ajuda a provocar a resposta imune e/ou ο Αβ ou um seu fragmento seja administrado em combinação com um adjuvante que aumenta a resposta imune; (ii) um multimero de (i) ; ou (iii) um anticorpo intacto para Αβ.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (iii), para a utilização da referida reivindicação, em que a composição compreende um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (iii), para a utilização da referida reivindicação, em que a composição compreende um anticorpo humanizado ou anticorpo humano para Αβ, o anticorpo humanizado ou humano possuindo isótipo IgGl.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (i), para a utilização da referida reivindicação, em que é administrado um adjuvante antes ou depois da composição farmacêutica.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (i), para a utilização da reivindicação, em que o fragmento de Αβ compreende pelo menos cinco aminoácidos contíguos a partir de um peptídeo Αβ natural. 1
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, para a utilização da referida reivindicação, em que o fragmento de Αβ é Αβ1-5 ou Αβ1-6.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (i), para a utilização da reivindicação, em que o fragmento de Αβ está ligado ao transportador por reticulação quimica ou é expresso como uma proteina de fusão com o transportador.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (i), para a utilização da reivindicação, em que o veiculo é uma albumina, hemocianina de soro, uma molécula de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, ou um toxóide a partir de uma bactéria patogénica, opcionalmente, em que o transportador da proteina é a toxina da difteria CRM 197 atenuada, toxóide tetânico, toxóide diftérico, toxóide E. coli ou toxóide H. pylori.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (i), para a utilização da referida reivindicação, em que o adjuvante é alúmen, MPL, QS-21 ou o adjuvante incompleto de Freund.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 (iii), para a utilização da referida reivindicação, em que o anticorpo se liga: (i) especificamente com a forma agregada do peptideo Αβ sem ligação à forma dissociada; (ii) especificamente na forma dissociada do péptido Αβ sem ligação à forma agregada; ou (iii) ambas as formas agregada e dissociada do péptido Αβ. 2
11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação anterior, para a utilização da reivindicação, em que: (i) o paciente é um ser humano; e/ou (ii) o tratamento previne ou trata uma doença associada com depósitos amilóides de Αβ, opcionalmente, a doença de Alzheimer, opcionalmente, em que o paciente está abaixo de 50 anos, e/ou tem factores de risco herdados indicando susceptibilidade à doença de Alzheimer.
12 . Composição farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação anterior, para a utilização da referida reivindicação, em que a composição é administrada oralmente, subcutaneamente, intramuscularmente, topicamente ou intravenosamente.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, para a utilização da referida reivindicação, em que: (i) uma dose maior do que 10 pg de Αβ ou um seu fragmento seja administrado; ou (iii) o anticorpo é administrado a uma dosagem desde cerca de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal do hospedeiro.
14 . Composição farmacêutica de acordo com reivindicação 1, para a utilização da referida reivindicação, em que a composição é administrada por uma primeira imunização seguidas de reforços a intervalos de 6 semanas, ou que é administrado por uma primeira imunização seguida de reforços 1, 2 e 12 meses mais tarde, ou que é administrado a cada dois meses. 3
15. Composição farmacêutica da reivindicação 1 (i), para a utilização da referida reivindicação, em que o agente é Αβ ou um seu fragmento, e a resposta imunitária é uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpos). 4