KR101215821B1 - 아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위한 펩타이드, 그것에 대한 항체, 및 그 사용방법 - Google Patents

아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위한 펩타이드, 그것에 대한 항체, 및 그 사용방법 Download PDF

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Abstract

적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산을 가지는 펩타이드가 제공된다. 펩타이드는 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X를 포함하고, 식 중, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다. 또 이러한 펩타이드를 포함하는 의약 조성물 및 키트 및 아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위한 그 사용방법도 제공된다.
펩타이드, 아밀로이드, 방향족, 아미노산, 조성물, 키트, 치료, 진단

Description

아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위한 펩타이드, 그것에 대한 항체, 및 그 사용방법{PEPTIDES ANTIBODIES DIRECTED THEREAGAINST AND METHODS USING SAME FOR DIAGNOSING AND TREATING AMYLOID-ASSOCIATED DISEASES}
본 발명은 II형 당뇨병 및 알츠하이머병 등의 아밀로이드 관련 질환을 진단, 예방, 및 처치하기 위해 사용하는 것이 가능한 펩타이드 및 그것에 대한 항체에 관한 것이다.
아밀로이드 물질 침착(이것은 또 아밀로이드 플레이크 형성으로도 부른다)은 알츠하이머병, 프리온(prion) 관련된 뇌장해, II형 당뇨병, 가족성 아밀로이도시스 및 경쇄 아밀로이도시스를 포함하는 관련성이 없는 다양한 병리학적 상태의 중심적인 특징이다.
아밀로이드 물질은 직경이 약 80Å-100Å인 일정하지 않은 길이의 견고한 비분기 단백질성 원섬유(fibrils)의 조밀한 망상구조로 구성된다. 아밀로이드 원섬유는 그 장축이 원섬유의 장축에 직교하는 역평행 또는 평행의 β-플리티드 시이트에 배치된 폴리펩타이드 쇄의 코어 구조를 함유한다[Both외(1997), Nature, 385:787-93; Glenner(1980), N. Eng. J. Med., 302:1283-92; Balbach 외(2002), Biophys J. 83:1205-16].
약 20 개의 아밀로이드 원섬유 단백질이 지금까지 인비보에서 동정되고, 특이적인 질환과 상관되었다. 이들 단백질은 상호 아미노산 배열 상동성을 거의 가지고 있지 않지만, 아밀로이드 원섬유의 코어 구조는 본질적으로는 동일하다. 아밀로이드 원섬유의 이 공통하는 코어 구조, 및 아밀로이드 침착물에 있어서의 공통물질의 존재는 아밀로이드 물질의 특정의 형태를 특징으로 하는 데이터가 아밀로이드 물질의 다른 형태에도 관계하는 일이 있고, 따라서 II형 당뇨병, 알츠하이머치매 또는 알츠하이머병, 및 프리온에 관련된 뇌장해 등의 아밀로이드 관련 질환에 대한 약물을 개발하기 위한 주형 설계에 있어서 구체화될 수 있는 것을 시사하고 있다.
더욱, 아밀로이드 침착물은 인비보에서는 불활성은 아닌 것 같고, 오히려, 대사회전(turnover)의 동적 상태에 있고, 그리고, 원섬유의 형성이 정지되는 경우, 퇴행하는 것도 있을 수 있다[Gillmore외(1997), Br. J. Haematol., 99:245-56].
따라서 아밀로이드 폴리펩타이드의 생산을 저해하거나, 또는 아밀로이도시스를 저해하기 위해 설계된 치료는 아밀로이드 관련 질환을 처치하기 위해 유용할 수 있다.
아밀로이드 폴리펩타이드의 생산의 억제
아밀로이드 폴리펩타이드의 생산의 직접적인 억제는 예를 들면, 인간 소도(islet) 아밀로이드 폴리펩타이드의 메신저 RNA(mRNA)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 달성될 수 있다. 인비트로에서는 소도 아밀로이드 폴리펩타이드의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가 또는 안티센스 상보적 DNA의 발현은 세포의 인슐린의 mRNA 함유량 및 단백질 함유량을 증대시키고 있고, 이것에 의해 이 방법의 잠재적인 유효성이 밝혀졌다[Kulkarni외(1996), J. Endocrinol., 151:341-8; Novials외(1998), Pancreas, 17:182-6]. 그러나, 그와 같은 안티센스 분자의 인비보 유효성을 입증하는 실험 결과는 어떤 입증도 되어 있지 않다.
아밀로이드 원섬유의 형성의 억제
소도 아밀로이드를 포함하는 아밀로이드는 혈청 아밀로이드 P성분, 아폴리포 단백질 E 및 펄리칸(perlecan) 등의 잠재적인 안정화 물질 또는 보호물질을 함유한다. 발달 중의 아밀로이드 원섬유에 대한 그러한 결합을 저지하는 것에 의해, 아밀로이드 형성 단백질의 특정 부분에 대하여 특이적인 항체에 의한 처치 [Solomon외(1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4109-12]가 가능하도록 아밀로이드 형성을 억제할 수 있었다[Kahn외(1999), Diabetes, 48:241-53].
다음은 아밀로이드 구조를 탈안정화하는 능력을 가지는 약물을 엔지니어링(engineering) 하기 위한 현재의 시도가 정리되어 있다.
탈안정화 화합물
헤파린 황산이 모든 아밀로이드의 성분으로서 동정되어 있고, 헤파린 황산은 또 염증에 관련되는 아밀로이드 유도의 극히 초기단계에서도 관계하고 있다. Kisilevsky 및 공동연구자(Mature Med., 1:143-148, 1995) 는 헤파린 황산이 염증관련의 아밀로이드 전구체 및 알츠하이머병(AD)의 β-펩타이드와 상호작용하는 것을 방해하는 저분자량의 아니온성(anionic)의 설포네이트 화합물 또는 설페이트 화합물의 사용을 기재하였다. 헤파린 황산은 아밀로이드의 단백질 접힘 패턴(protein-folding pattern)에 특징적인 증대된 β-시이트 구조를 받아들이기 위해서 가용성 아밀로이드 전구체(SAA2)에 특이적인 영향을 미친다. 이들 아니온성의 설포네이트 화합물 또는 설페이트 화합물은 전자현미경사진에 의해 모니터되었을 때, 헤파린에 의해 가속되는 Aβ 원섬유 형성을 억제하는 것이 보여지고, 또 사전에 형성된 원섬유를 인비트로로 분해할 수 있다. 더욱, 이들 화합물은 급성 모델 및 만성 모델에서 인비보에서 마우스의 비장에서의 염증관련의 아밀로이드의 진행을 실질적으로 정지시켰다. 그러나, 가장 강력한 화합물[즉, 폴리(비닐설포네이트) ]은 급성 독성을 보였다. 유사한 독성이 면역글로블린 경쇄 아밀로이도시스(AL) 환자에 있어서 아밀로이드 재흡수를 유도하는 것이 관찰되고 있는 다른 화합물IDOX(안트라사이클린 4'-요오드-4'-데옥시-독소루비신)에 관하여 관측되어 있다[Merlini외(1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2959-63].
탈안정화 항체
항β-아밀로이드 모노클로날 항체가 인비트로에서 β-아밀로이드 플레이크의 분해 및 β-아밀로이드 플레이크의 형성을 예방하는 것에 있어서 효과적이라는 것이 입증되었다(미국특허 제5688561호) . 그러나, 그와 같은 항체의 인비보에서의 유효성을 입증하는 실험 결과는 전혀 입증되지 않았다.
탈안정화 펩타이드
β-플리티드 시이트를 파괴하는 합성 펩타이드("β-시이트 파괴제")를 가하는 것에 의해 원섬유가 해리되고, 아밀로이도시스가 방지된다고 하는 발견[Soto외(1998), Nat. Med., 4:822-6]은 임상적 관점에서 특히 유망하다. 간단히 기재하면, 5-잔기의 펩타이드에 의해 아밀로이드β-단백질의 원섬유 형성이 억제되고, 사전에 형성된 원섬유가 인비트로로 분해되고, 그리고 세포배양에 있어서 원섬유에 의해 유도되는 뉴런의 사(neuronal death) 가 방지되었다. 더욱, 이 β-시이트 파괴제 펩타이드는 아밀로이드β-단백질의 침착을 인비보에서 현저하게 감소시키고, 그리고 아밀로이도시스의 랫(rat)의 뇌 모델에서 아밀로이드 원섬유의 형성을 완전히 저지하였다.
소분자
아밀로이드 폴리펩타이드와 결합하고, 이것에 의해 단백질의 본래의 접힘을 안정화시키는 소분자의 사용의 가능성이 트랜스티레틴(TTR) 단백질의 경우에 시도되어 있다[Peterson(1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12965-12960; Oza(1999), Bioorg. Med. Chem. Lett., 9:1-6]. 지금까지, 티록신 및 플루페남산 등의 분자가 아밀로이드 형성을 유발하는 입체배좌 변화를 방지할 수 있다는 것이 입증되어 있다. 그러나, 동물 모델에서의 이들 화합물의 사용은 아직 입증되지 않고, 또 이들 리간드와 결합할 수 있는 TTR이 아닌 다른 단백질이 혈액 중에 존재하는 것에 의해 손상될 수 있다.
항산화제
다른 제안된 치료는 산화 스트레스를 회피하고, 아밀로이드 단백질을 그 환원상태(즉, 모노머 및 다이머)에서 유지하기 위해 항산화제를 섭취하는 것이었다. 아 황산염의 사용은 TTR의 보다 안정한 모노머를 인비트로 및 인비보의 양자에서 유발하는 것을 보여주었다[Altland(1999), Neurogenetics, 2:183-188]. 그러나, 항산화작용의 완전한 특징화는 여전히 얻을 수 없고, 가능한 치료법에 관한 결과의 해석은 여전히 곤란하다.
본 발명을 실시할 때, 본 발명자들은 미국특허 제6359112호(Kapurniotu)의 교시에 반하여 아밀로이드 원섬유에의 펩타이드 응집이 방향족 상호작용에 의해 지배되는 것을 입증하고 있다. 그와 같은 발견은 아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위해 사용하는 것이 가능한 펩타이드를 효율적으로 그리고 정확하게 설계하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X를 포함하는 펩타이드로서, X가 방향족 아미노산이고, Y가 글리신 이외의 아미노산이고, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 의하면, 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125 및 127로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열을 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125 및 127로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열을 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125 및 127로 이루어지는 군에서 선택되는 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 개체에서의 아밀로이드 관련 질환을 처치 또는 예방하는 방법로서, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드의 치료 유효량을 개체에 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
이하에 기재되는 본 발명의 바람직한 실시태양에서의 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 생리학적으로 수용 가능한 캐리어도 포함하는 약학적 조성물의 유효성분이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 핵산 구축물로부터 발현된다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드를 유효성분으로서 포함하고, 또 약학적으로 수용 가능한 캐리어 또는 희석제를 포함하는 아밀로이드 관련 질환을 처치 또는 예방하기 위한 약학적 조성물이 제공된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드의 적어도 1 개의 아미노산은 D 입체이성체이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드의 적어도 1 개의 아미노산은 L 입체이성체이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 2 개의 아미노산 길이이고, Y는 β-시이트 파괴제 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 배열번호 145에 기술된 바와 같은 것이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 3 개의 아미노산 길이이고, Y는 방향족 아미노산이고, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X에 결합된 아미노산 잔기는 β-시이트 파괴제 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 펩타이드의 C 말단에 있다. 기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산 길이를 가지고, 또 그 N 말단에서 티올화 아미노산을 포함한다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함하는 핵산 구축물이 제공된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 핵산 구축물은 프로모터를 더 포함한다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드와 결합하는 것이 가능한 항원 인식 영역을 포함하는 항체 또는 항체 프래그먼트가 제공된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, Y는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 및 그러한 천연의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 극성의 전하를 가지지 않는 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, Y는 β-시이트 파괴제 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 천연에 존재하는 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 천연에 존재하는 아미노산은 플로린, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 리신 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 합성 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 합성 아미노산은 Cα-메틸화 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, Cα-메틸화 아미노산은 α-아미노이소부틸산이다. 기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 직쇄상 또는 환상 펩타이드이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125 및 127로 이루어지는 군에서 선택된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 적어도 4 개의 아미노산 길이를 가지고, 또 그 C 말단에 적어도 2 개의 세린 잔기를 포함한다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산 길이를 가지고, X-Y 이외의 펩타이드 중의 적어도 1 개의 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 및 그러한 천연의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 극성의 전하를 가지지 않는 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산 길이를 가지고, X-Y 이외의 펩타이드 중의 적어도 1 개의 아미노산은 β-시이트 파괴제 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 천연에 존재하는 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 천연에 존재하는 아미노산은 플로린, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 리신 및 세린으로 이루어지는 군에서 선택된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 합성 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 합성 아미노산은 Cα-메틸화 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, Cα-메틸화 아미노산은 α-아미노이소부틸산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 펩타이드에서의 X-Y의 하류에 위치된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 펩타이드에서의 X-Y의 상류에 위치된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산 길이를 가지고, 펩타이드 중의 적어도 1 개의 아미노산은 정전하를 가지는 아미노산이고, 펩타이드 중의 적어도 1 개의 아미노산 잔기는 음전하를 가지는 아미노산이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 정전하를 가지는 아미노산은 리신, 아르기닌, 및 그 천연 및 합성의 유도체로 이루어지는 군에서 선택된다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 음전하를 가지는 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산, 및 그 천연 및 합성의 유도체로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드와 결합할 수 있는 항원 인식 영역을 가지는 항체 또는 항체 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하고, 또 약학적으로 수용 가능한 캐리어 또는 희석제를 포함하는 아밀로이드 관련 질환을 처치 또는 예방하기 위한 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 개체에서의 아밀로이드 관련 질환을 처치 또는 예방하는 방법로서, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드로서, 적어도 2 개, 15 개 이하의 아미노산 길이를 가지는 펩타이드와 결합할 수 있는 항원 인식 영역을 가지는 항체 또는 항체 프래그먼트의 치료적으로 유효한 양을 개체에 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 하기 일반식을 가지는 펩타이드가 제공된다:
Figure 112005078237310-pct00001
식 중, C*는 D 배치를 가지는 키랄 탄소이다.
R1 및 R2는 각각 독립하여, 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 카르복시, C-티오카르브로 이루어지는 군에서 선택되고;
R3은 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오히드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 할로 및 아민으로 이루어지는 군에서 선택되고; 그리고
R4는 알킬이다.
본 발명의 추가의 관점에 의하면, 개체에서의 아밀로이드 관련 질환을 처치 또는 예방하는 방법로서, 하기 일반식을 가지는 펩타이드의 치료 유효량을 개체에 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다:
Figure 112005078237310-pct00002
식 중, C*는 D 배치를 가지는 키랄 탄소이다.
R1 및 R2는 각각 독립하여, 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 카르복시, C-티오카르브로 이루어지는 군에서 선택되고;
R3는 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오히드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 할로 및 아민으로 이루어지는 군에서 선택되고; 그리고
R4는 알킬이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, R4는 메틸이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, R1 및 R은 각각 수소이고, R3는 히드록시이다.
기재되는 바람직한 실시태양에서의 또한 추가의 특징에 의하면, 펩타이드는 환상 펩타이드이다.
본 발명은 II형 당뇨병 등의 아밀로이드 관련 질환을 진단 및 처치하기 위해 사용하는 것이 가능한, 신규한 펩타이드, 조성물 및 방법을 제공하는 것에 의해, 현재 알려져 있는 형태의 다양한 결점에 대처하는 것에 성공하고 있다.
본 명세서에서 사용되는 기술용어와 과학용어는 전부, 특히 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자가 공통으로 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 본 명세서에 기재되고 있는 것과 유사한 또는 균등한 방법과 재료는 본 발명을 실시 또는 시험하는 것에 사용될 수 있으나 적절한 방법과 재료는 이하에 기술된다. 다툼이 있는 경우, 정의를 포함하여 본 특허명세서가 기준이다. 더욱, 본 명세서의 재료, 방법 및 실시예는 예시를 목적으로 하고 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에서는 일례로서 첨부 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다. 도면에 도시된 상세는 일례로서, 본 발명의 바람직한 태양의 구체예를 보이기 위한 것으로서, 본 발명의 원리 및 개념적 특징을 가장 유효하고 이해하기 쉬운 것으로 생각되는 것으로 설명하기 위해 기재한 것이다. 이 점에 관하여, 본 발명의 구성 상의 상세는 본 발명의 기본적 이해에 필요한 정도 보다 상세하게 설명하지 않으나, 도면을 참조한 본 명세서를 검토하는 것에 의해, 당업자에게는 본 발명의 다수의 형태를 실제로 구체화하는 방법이 명확해질 것이다.
도면에서,
도 1은 다수의 아밀로이드 단백질에 유래하는 펩타이드 군의, Kyte 및 Dolittle의 척도를 사용하여 추정되는 바와 같은 자기조합능(self-assembly) 과 그 소수성을 보이는 모식도이다. 분석된 펩타이드의 소수성과 아밀로이드 형성능과의 사이에는 상관이 관찰되지 않는 것에 유의해야 한다. 이 펩타이드 군에서의 잠재적인 아밀로이드 원섬유 형성능에 대한 유일한 명백한 표시는 방향족성과 최소길이의 조합이다.
도 2a-2c는 억제성 방향족 시약의 Ro47-1816/001(도 2a), 티오플라빈T(도 2b) 및 CR색소(도 2c)와의 아밀로이드 결합을 모식적으로 도시한다.
도 3a-3c는 인간 IAPP 및 설치류IAPP와 본 발명의 합성 펩타이드와의 사이에서의 일차 배열 비교의 모식도이다. 도 3a는 인간 IAPP 및 설치류IAPP의 배열 얼라이먼트다. 블록부는 배열 사이에서 큰 불일치를 보이는 7 개의 아미노산의 부분배열을 도시한다. "기본 아밀로이드 형성 유닛"이 굵은 글씨체에 의해 표시되고, 밑줄이 그어져 있다. 도 3b는 야생형 IAPP 펩타이드(배열번호 1)의 화학구조를 나타낸다. 도 3c는 기본 아밀로이드 형성 유닛에 유래하는 펩타이드의 일차 배열 및 배열번호를 나타낸다.
도 4a-b는 원섬유 형성 중의 시간을 함수로 하는 405 nm에서의 광의 흡광도, 따라서 IAPP 유래 펩타이드의 응집 속도론을 반영하는 흡광도를 보이는 그래프이다. 하기의 기호가 사용된다: 흑사각-N1A, 백색원-G3A, 흑색원-야생형, 백색삼각-L6A, 백색사각-I5A, 및 흑색삼각-F2A.
도 5는 광산란에 의해 측정되었을 때의 조합된 IAPP 펩타이드 및 유도체의 평균 입자 크기를 보이는 히스토그램이다. 각각의 기둥은 3회-5회의 독립된 측정의 결과를 표시한다.
도 6a-6n은 사전에 조합된 IAPP 펩타이드에의 콩고 레드(Congo Red)의 결합을 보이는 현미경사진이다. 통상장 및 편광장에서의 현미경사진이 하기의 시효(aging) 된 펩타이드 현탁물의 각각에 대하여 각각 도시된다: N1A 펩타이드(6a-b), F2A 펩타이드(6c-d), G3A 펩타이드(6e-f), 야생형 펩타이드(6g-h), I5A 펩타이드(6i-j), 및 L6A 펩타이드(6k-l).
도 7a-7f는 "시효된" IAPP 펩타이드 및 유도체의 전자현미경사진이다: N1A 펩타이드(도 7a), F2A 펩타이드(도 7b), G3A 펩타이드(도 7c), 야생형 펩타이드(도 7d), I5A 펩타이드(도 7e), 및 L6A 펩타이드(도 7f) . 표시되는 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 8a는 야생형 hIAPP와, 세균의 코돈(codon) 사용빈도에 따라 개변된 대응하는 배열과의 핵산배열 얼라이먼트이다. 개변된 염기에는 밑줄이 그어져 있다.
도 8b는 48 kDa의 MBP-IAPP 단백질의 세포질 발현을 위해 사용되는 pMALc2x-NN 벡터의 모식도이다. V8 Ek 절단부위 및 (His) 6 태그가 malE 태그의 벡터 배열의 C 말단에 융합되어 있다. MBP 태그를 제거하기 위한 Xa 인자 절단부위가 표시되어 있다.
도 9는 MBP 및 MBP-IAPP 융합 단백질의 세균발현 및 정제를 보이는 단백질 겔 GelCode Blue 염색이다. 세균세포 추출물이 조제되고, 단백질이 아밀로즈 수지 컬럼에서 정제되었다. 25μg의 단백질을 포함하는 샘플이 레인 1-3의 각각에 가해지고, 이것에 대하여, 5μg의 단백질이 레인 4-5의 각각에 가해졌다. 단백질이 12% SDS-PAGE 상에서 분리되고, GelCode Blue 염색에 의해 가시화되었다. 분자량 마아커를 좌측에 도시한다. 레인 1-0.5 mM의 IPGT로 유도된 MBP 가용성 추출물, 레인 2-0.1 mM의 IPGT로 유도된 MBP-IAPP 가용성 추출물, 레인 3-0.5 mM의 IPGT로 유도된 MBP-IAPP 가용성 추출물, 레인 4-정제 MBP, 레인 5-정제 MBP-IAPP. 화살표는 MBP-IAPP를 표시한다.
도 10a-10b는 hIAPP에서의 추정되는 아밀로이드 형성 배열을 보이는 닷-블롯 이미지(dot-blot image; 도 10a) 및 그 덴시토메트리 정량(densitometric quantitation; 도 10b) 이다.
도 11은 원섬유 형성 중의 시간을 함수로 하는 405 nm에서의 광의 흡광도, 따라서 IAPP 유래 펩타이드(배열번호 14-19)의 응집 속도론을 반영하는 흡광도를 보이는 그래프이다.
도 12a-12f는 사전에 조합된 IAPP 펩타이드에의 콩고 레드의 결합을 보이는 현미경사진이다. 편광장에서의 현미경사진이 하기의 1일 시효된 펩타이드 현탁물의 각각에 대하여 도시된다: NFLVHSSNN 펩타이드(도 12a), NFLVHSS(도 12b), FLVHSS(도 12c), NFLVH(도 12d), FLVHS(도 12e), 및 FLVH(도 12f).
도 13a-f는 "시효된" IAPP 펩타이드의 전자현미경사진이다. NFLVHSSNN 펩타이드(도 13a), NFLVHSS(도 13b), FLVHSS(도 13c), NFLVH(도 13d), FLVHS(도 13e), 및 FLVH(도 13f). 표시되는 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 14a-14f는 퓨리에 변환 적외 분광법에 의해 측정되었을 때의 불용성 IAPP 응집물에서의 이차 구조를 보이는 그래프이다. NFLVHSSNN 펩타이드(도 14a), NFLVHSS(도 14b), FLVHSS(도 14c), NFLVH(도 14d), FLVHS(도 14e), 및 FLVH(도 14f).
도 15는 메딘(Medin)의 이전에 보고된 아밀로이드 형성 펩타이드 프래그먼트의 화학구조이다[Haggqvist(1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 8669-8674].
도 16a-16b는 원섬유 형성 중의 시간을 함수로 하는 405 nm에서의 광의 흡광도, 따라서 메딘 유래 펩타이드의 응집 속도론을 반영하는 흡광도를 보이는 그래프이다. 도 16a는 단기간의 속도론 시험을 도시한다. 도 16b는 장기간의 속도론 시험을 도시한다.
도 17a-17f는 "시효된" 메딘 유래 펩타이드의 전자현미경사진이다. NFGSVQFA-도 17a, NFGSVQ-도 17b, NFGSV-도 17c, FGSVQ-도 17d, GSVQ-도 17e, 및 FGSV-도 17f. 도시되는 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 18a-f는 사전에 조합된 메딘 유래 펩타이드에의 콩고 레드의 결합을 보이는 현미경사진이다. 편광장에서의 현미경사진이 하기의 시효된 펩타이드 현탁물의 각각에 대하여 도시된다: NFGSVQFA-도 18a, NFGSVQ-도 18b, NFGSV-도 18c, FGSVQ-도 18d, GSVQ-도 18e, 및 FGSV-도 18f.
도 19a-c는 메딘의 헥사펩타이드의 아밀로이드 형성 프래그먼트의 아밀로이드 형성 특성에 대한 알라닌 변이의 영향을 도시한다. 도 19a는 원섬유 형성 중의 시간을 함수로 하는 405 nm에서의 광의 흡광도, 따라서 메딘 유래알라닌 변이형의 응집 속도론을 반영하는 흡광도를 보이는 그래프이다. 도 19b는 "시효된" 메딘 유래의 알라닌 변이형의 전자현미경사진이고, 스케일 바아는 100 nm를 표시한다. 도 19c는 사전에 조합된 메딘 유래 펩타이드 변이형에의 콩고 레드의 결합을 보이는 현미경사진이다.
도 20a-20b는 인간 칼시토닌의 아미노산 배열(도 20a) 및 인간 칼시토닌의 아밀로이드 형성 펩타이드 프래그먼트의 화학구조(도 20b) 이다. 칼시토닌의 올리고머화 상태 및 호르몬 활성에 대해 중요한 잔기 17 및 잔기 18에는 밑줄이 그어져 있다[Kazantzis(2001), Eur. J. Biochem., 269: 780-791].
도 21a-21d는 "시효된" 칼시토닌 유래 펩타이드의 전자현미경사진이다. DFNKF-도 21a, DFNK-도 21b, FNKF-도 21c, 및 DFN-도 21d. 도시되는 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 22a-22d는 사전에 조합된 칼시토닌 유래 펩타이드에의 콩고 레드의 결합을 보이는 현미경사진이다. 편광장에서의 현미경사진이 하기의 시효된 펩타이드 현탁물의 각각에 대하여 도시된다: DFNKF-도 22a, DFNK-도 22b, FNKF-도 22c, 및 DFN-도 22d.
도 23은 퓨리에 변환 적외 분광법에 의해 측정되었을 때의 불용성 칼시토닌 응집물에서의 이차 구조를 보이는 그래프이다.
도 24a-24c는 칼시토닌의 펜타펩타이드의 아밀로이드 형성 프래그먼트의 아밀로이드 형성 특성에 대한 알라닌 변이의 영향을 도시한다. 도 24a는 "시효된" 칼시토닌 유래의 알라닌 변이형의 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다. 도 24b는 사전에 조합된 칼시토닌 유래의 펩타이드 변이형에의 콩고 레드의 결합을 보이는 현미경사진이다. 도 24c는 퓨리에 변환 적외 분광법에 의해 측정되었을 때의 변이형 펩타이드에서의 이차 구조를 보이는 그래프이다.
도 25는 "시효된" 락토트랜스페린 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 26은 "시효된" 혈청 아밀로이드 A 단백질 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 27은 "시효된" BriL 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 28은 "시효된" 겔솔린 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 29는 "시효된" 혈청 아밀로이드 P 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 30은 "시효된" 면역글로블린 경쇄 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 31은 "시효된" 시스타틴 C 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 32는 "시효된" 트랜스티레틴 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 33은 "시효된" 리소짐 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 34는 "시효된" 피브리노겐 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 35는 "시효된" 인슐린 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 36은 "시효된" 프로락틴 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 37은 "시효된" β2 마이크로글로블린 유래 펩타이드의 자기조합을 보이는 전자현미경사진이다. 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 38은 IAPP의 자기조합에 대한 억제 펩타이드의 작용을 보이는 그래프이다. 사각-야생형(wt) IAPP 펩타이드; 삼각-wt-IAPP+억제 펩타이드; 원-펩타이드 없음.
도 39는 원섬유 형성 중의 시간을 함수로 하는 405 nm에서의 광의 흡광도, 따라서 IAPP 유래 펩타이드(배열번호 46-49)의 응집 속도론을 반영하는 흡광도를 보이는 그래프이다.
도 40은 7 일간 시효된 후의 IAPP 아날로그(analogues)의 탁도를 보이는 히스토그램을 나타낸다.
도 41a-f는 "시효된" IAPP 아날로그의 전자현미경사진이다. NFGAILSS-도 41a, NFGAILSS-도 41b, NIGAILSS-도 41c, NLGAILSS-도 41d, NVGAILSS-도 41e, 및 NAGAILSS-도 41f. 도시되는 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 42a-c는 최소의 아밀로이드 형성 배열 SNNXGAILSS(X=시스테인 이외의 임의의 천연 아미노산)의 아날로그에 대한 IAPP-NFGAILSS의 결합을 도시한다. 도 42a는 결합된 펩타이드 배열의 단기간의 노출을 도시한다. 도 42b는 결합된 펩타이드 배열의 장기간의 노출을 도시한다. 도 42c는 덴시토메트리 및 임의 단위를 사용하는 단기간의 노출(도 42a)의 정량을 도시한다.
도 43a는 모든 잔기에 대하여(황색은 충분히 가능, 오렌지색은 부분적으로 가능), L-플로린에 대하여(청색), 및 아키랄 Aib 잔기에 대하여(마젠타)의 가능한 입체 배치를 보이는 라마찬드란 플롯(Ramachandran plot) 이다.
도 43b-43c는 긴 야생형 IAPP 펩타이드의 화학구조(ANFLVH, 배열번호 124, 도 43b) 및 그 Aib개변된 구조의 펩타이드(Aib-NF-Aib-VH, 배열번호 125, 도 43c)를 보이는 모식도이다. 개변을 위해 적합한 관능기는 청색으로 마아크되어 있고(도 43b), 한편, 개변된 기는 적색으로 마아크되어 있다(도 43c).
도 44a-44d는 "시효된" IAPP 아날로그의 전자현미경사진이다. 도 44a-ANFLVH; 도 44b-ANFLV; 도 44c-Aib-NF-Aib-VH; 도 44d-Aib-NF-Aib-V. 도시된 스케일 바아는 100 nm를 표시한다.
도 45a-45d는 사전에 조합된 야생형 및 Aib개변된 IAPP 펩타이드에 결합하는 콩고 레드를 보이는 현미경사진이다. 편광장 현미경사진이 이하의 시효된(즉, 11 일째의) 펩타이드 현탁물의 각각에 대하여 도시된다. 도 45a-ANFLVH; 도 45b-ANFLV; 도 45c-Aib-NF-Aib-VH; 도 45d-Aib-NF-Aib-V.
도 46a-b는 퓨리에 변환 적외선 분광분석(FI-IR)에 의해 결정된 바와 같은 불용성 야생형 및 Aib개변된 hIAPP 응집물의 이차 구조를 보이는 그래프이다. 도 46a-야생형 펩타이드ANFLVH 및 화살표에 의해 도시되는 바와 같은 대응하는 Aib 개변 펩타이드. 도 46b-야생형 ANFLVH 및 화살표에 의해 도시되는 바와 같은 대응하는 Aib 개변 펩타이드.
도 47은 아밀로이드 원섬유 형성에 대한 Aib 개변 펩타이드의 억제 효과를 보이는 그래프이다. 야생형 IAPP는 단독으로 또는 본 발명의 다양한 펩타이드와 공동으로 인큐베이션되었다. 시간의 함수로서의 원섬유 형성은 ThT 형광을 이용하여 결정되었다.
도 48은 IAPP-자기조합에 대한 짧은 방향족 배열(배열번호 112-123)의 억제 효과를 보이는 히스토그램이다.
도 49a-49d는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택의 반복 사이클을 나타내는 그래프이다. 원섬유화는 ThT 형광 시험에 의해 모니터되었다. IAPP 단독(4μM)의 형광치 또는 시험되는 화합물(40μM)의 존재에서의 IAPP의 형광치가 시험되었다. 측정은 IAPP 형광이 평탄상태(plateau)에 달성된 후에 행해졌다. IAPP 형광은 임의로 100으로서 설정되었다. 도 49a는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택의 제1 라운드의 결과를 나타낸다. EG1=D-Phe-D-Phe-D-Pro; EG2=Aib-D-Phe-D-Asn-Aib; EG3=D-Phe-D-Asn-D-Pro; EG4=Aib-Asn-Phe-Aib; EG5=Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe; EG6=Tyr-Tyr; EG7=Tyr-Tyr-NH2; EG8=Aib-Phe-Phe. 도 49b는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택의 제2 라운드의 결과를 나타낸다. EG13=Asn-Tyr-Aib; EG14=Asn-Tyr-Pro; EG15=D-Pro-D-Tyr-D-Asn; EG16=D-Tyr-Aib; EG17=D-Pro-D-Tyr; EG18=D-Tyr-D-Pro. 도 49c는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택의 제3 라운드의 결과를 나타낸다. d-F-P=D-Phe-Pro; P-d-F=Pro-D-Phe; EG19=Asn-Tyr-Tyr-Pro; EG20=Tyr-Tyr-Aib; EG21=Aib-Tyr-Tyr; EG22=Aib-Tyr-Tyr-Aib; EG23=D-Asn-Tyr-Tyr-D-Pro. 도 49d는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택의 제4 라운드의 결과를 나타낸다. EG24=Pro-Tyr-Tyr; EG25=Tyr-Tyr-Pro; EG26=Pro-Tyr-Tyr-Pro; EG27=D-Tyr-D-Tyr; EG28=D-Pro-Aib; EG29=D-Phe-D-Pro; EG30=D-Trp-Aib; EG31=D-Trp-D-Pro.
도 50은 D-Trp-Aib에 의한 Aβ(1-40) 원섬유 형성의 억제를 보이는 그래프이다. Aβ1-40 스톡 용액은 100 mM의 NaCl,10 mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 중에 5μM의 최종농도로, 10μM의 D-Trp-Aib(삼각형) 로 또는 어떤 첨가제도 없이(사각형) 희석되었다. 형광치는 각 샘플에 0.3μM의 Tht를 첨가한 후에 측정되었다. 결과는 2 개의 독립된 측정의 평균을 나타낸다.
도 51a-c는 TEM에 의해 가시화되는 바와 같이 Aβ의 원섬유화에 대한 D-Trp-Aib의 억제 효과를 나타내는 현미경사진이다. 도 51a는 Aβ 단독을 도시한다. 도 51b-c는 억제제의 존재 하에서 Aβ 인큐베이션된 2 개의 상이한 시야를 나타낸다.
본 발명은 II형 당뇨병 등의 아밀로이드 관련 질환을 진단 또는 처치하기 위한 신규한 펩타이드, 그것에 대한 항체, 이들을 포함하는 조성물, 및 각각의 사용방법에 관련된다.
본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 부수하는 설명을 참조하여 보다 양호하게 이해할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용에 있어서, 하기의 설명에 보이거나, 또는 도면에 보이는 각 구성 성분의 구축 및 배치의 세부에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시형태가 가능하고, 또는 다양한 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 또는 다양한 방법으로 실시되는 것이 가능하다. 또 본 명세서 중에서 사용되는 표현 및 용어는 설명을 위한 것이고, 한정적인 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
아밀로이드 원섬유 형성을 방해하거나, 또는 아밀로이드 물질을 분해하기 위한 수많은 치료방법이 선행 기술에 기재되어 있다. 그러나, 현재의 치료방법은 세포독성, 비특이성 및 송달(delivery) 이라는 벽에 의해 제한되어 있다.
본 발명을 실시하는 중에, 또 II형 당뇨병 등의 아밀로이드 관련 질환에 대한 신규한 치료 양식에 대하여 탐구하고 있는 사이에, 본 발명자는 원섬유 형성을 실행하는 아밀로이드 형성의 펩타이드에 특징적인 배열을 동정하였다. 이 발견은 질서가 있는 아밀로이드 형성에는 비특이적인 소수성 상호작용을 수반하는 이전에 기재된 기구[Petkova(2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 16742-16747]가 아니고, 오히려 분자 상호작용의 특이적인 패턴이 관계하고 있다는 것을 시사하고 있다. 본 명세서 중 하기에 그리고 하기의 실시예의 절에 더 예시되는 바와 같이, 본 발명자는 아밀로이드 형성에서의 방향족 잔기에 대한 매우 중요한 역할을 생각하고 있었다. 아밀로이드 형성 프로세스에서의 방향족 잔기의 관여는 분자인식 및 자기조합에서의 π 스태킹 상호작용의 충분히 확립된 역할과 일치하고 있다[Gillard외(1997), Chem. Eur. J., 3: 1933-40; Claessens 및 Stoddart(1997), J. Phys. Org. Chem., 10: 254-72; Shetty외(1996), J. Am. Chem. Soc., 118: 1019-27; McGuaghey외(1998), π 스태킹 상호작용: 단백질에서의 기능, J. Biol. Chem., 273, 15458-15463; Sun 및 Bernstein(1996), J. Phys. Chem., 100: 13348-66]. π 스태킹 상호작용은 평면의 방향족 고리의 사이에서 형성되는 비결합의 상호작용이다. 그와 같은 질서 있는 스태킹 구조의 형성에 수반하는 입체적인 제약이 초분자 구조의 형성을 유발하는 자기조합 프로세스에 있어서 기본적인 역할을 가지고 있다. 그와 같은 π 스태킹 상호작용은 아마도 엔트로피 구동에 의한 것이지만, DNA의 이중나선 구조의 안정화, 단백질의 3차 구조의 코어 충전 및 안정화, 호스트-게스트 상호작용, 및 용액 중에서의 포르필린 응집 등의 많은 생물학적 프로세스에 있어서 중심적인 역할을 달성하고 있다[아밀로이드 원섬유의 자기조합에서의 π 스태킹 상호작용의 가능한 역할에 대한 추가의 총설에 대해서는 Gazit(2002), FASEB J., 16: 77-83을 참조할 것].
본 발명자는 아밀로이드 플레이크의 형성에 의해 특징이 부여되는 질환을 처치 또는 진단하기 위해 이용하는 것이 가능한 매우 유효한 진단용 펩타이드, 예방용 펩타이드 및 치료용 펩타이드를 제조하는 것이 최초로 가능하게 되는 디-펩타이드(실시예 45-47 참조) 와 같은 짧은 방향족 펩타이드의 분자인식을 개재하는 능력을 증명하였다.
따라서 본 발명의 하나의 관점에 의하면, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X(단, X는 방향족 아미노산이고, Y는 글리신 이외의 아미노산이다)를 포함하는 펩타이드가 제공된다. 이 배열을 포함하는 펩타이드의 예는 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125 및 127에 기술된다. 후술하는 실시예의 절의 실시예 36-39에 제시된 결과에 의해 보여지는 바와 같이, 본 발명자는 종래 기술의 교시에 반하여 아밀로이드 자기조합을 규정하고 있는 것은 소수성(hydrophobicity) 보다는 오히려 방향족성(aromaticity) 인 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 펩타이드의 방향족 아미노산은 아밀로이드 원섬유의 형성에 있어서 매우 중요하다.
방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 트리프토판, 페닐글리신, 또는 그러한 수식체, 전구체 또는 기능적인 방향족 부분을 포함하는(그러나 이들에 한정되지 않는다) 임의의 천연에 존재하는 방향족 잔기 또는 합성된 방향족 잔기일 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 일부의 형성할 수 있는 방향족 잔기의 예를 하기의 표 2에 제시한다.
하기의 실시예의 절에 보이는 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명은 다양한 정도의 자기응집 속도론 및 응집물 구조를 보이는 펩타이드의 설계를 용이하게 한다.
본 명세서 중에서 사용되는 표현 "자기응집(self-aggregation) "은 수용액 중에서 응집물(예를 들면, 원섬유)을 형성하는 펩타이드의 능력을 나타낸다. 자기응집하는 펩타이드의 능력, 및 그와 같은 자기응집의 속도론 및 유형(type)에 의해, 아밀로이드 질환의 처치 또는 진단에서의 펩타이드의 사용이 결정된다.
응집 속도론 및 응집물 구조는 제조된 펩타이드의 특이적인 잔기조성 및 아마도 길이(참조)에 의해 주로 결정되므로, 본 발명은 배열번호 4,12-19,27-45,112-123,125,127,128-147 또는 148에 보이는 배열을 포함하는 보다 긴 펩타이드(예를 들면, 10 개의 아미노산 -50 개의 아미노산), 또는 바람직하게는 이들 배열의 어느 것을 포함하는 보다 짧은 펩타이드(예를 들면, 2 개-15 개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 8 개, 적어도 10 개, 예를 들면 12 개의 아미노산, 바람직하게는 15 개 이하의 아미노산)의 양자를 포함한다.
아밀로이드 형성의 속도를 빠르게 하기 위해, 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 적어도 하나의 극성의 전하를 가지지 않는 아미노산을 더 포함하고, 그와 같은 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 또는 그러한 천연의 유도체 또는 합성 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다(표 2 참조).
본 발명의 이 관점의 일 실시태양에 의하면, 아미노산 잔기Y는 극성의 전하를 가지지 않는 아미노산이다.
본 발명의 이 관점의 다른 실시태양에 의하면, 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산, 위에서 기재된 X-Y/Y-X 아미노산 배열 및 X-Y/Y-X배열의 상류(N-말단) 또는 하류(C-말단)의 어느 것에 위치되는 추가의 극성의 전하를 가지지 않는 아미노산을 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산 길이인 것이 가능하고, 또 적어도 한 쌍의 정전하를 가지고 있는 아미노산 (예를 들면 리신 및 아르기닌) 및 음전하를 가지고 있는 아미노산(예를 들면 아스파라긴산 및 글루타민산)을 포함하는 것이 가능하다(예를 들면 배열번호 27-29). 그와 같은 아미노산 조성은 적합할 수 있다. 이것은 실시예의 절의 실시예 21에 보이는 바와 같이, 반대의 전하의 사이에서의 정전적 상호작용에 의해 질서가 있는 역평행 구조의 형성이 유도될 수 있다.
더욱, 본 발명의 펩타이드는 4 개의 아미노산 길이인 것이 가능하고, 또 X-Y/Y-X배열의 C-말단에 2 개의 세린 잔기를 포함한다.
더욱, 본 발명의 펩타이드는 3 개의 아미노산 길이인 것이 가능하고, 티올화 아미노산 잔기(즉, 황 이온을 포함한다)를 바람직하게는 그 N-말단에 포함한다(예를 들면, 배열번호 149 및 150, 각각 D-Cys-D-Trp-Aib 및 L-Cys-D-Trp-Aib, 및 그러한 아실화 및 아미드화 형). 이와 같은 펩타이드 형태는 매우 가치가 있다. 왜냐하면, 그것은 환원특성을 펩타이드에 부여하고, 그것에 의해 환원제 및 산화방지제로서(양자는 신경보호작용을 위해 중요할 수 있다) (Offen외(2004), J Neurochem. 89: 1241-51); 및 아밀로이드 억제제로서의 양자에서 작용할 수 있다. 티올화 아미노산의 예는 천연에 존재하는 아미노산 시스테인 및 메티오닌 및 Tyr(SO3H) 과 같은 합성 아미노산을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 원섬유 형성을 지배하는 배열특징을 동정하였으므로, 본 발명의 교시는 또 원섬유에는 응집하지않고, 원섬유 형성을 방지 또는 감소시키는 것, 또는 이전에 형성된 원섬유를 파괴하는 것의 어느 것이 가능이고, 따라서 치료약으로서 사용하는 것이 가능한 펩타이드의 설계를 가능하게 한다.
예를 들면, 배열번호 9, 배열번호 10, 배열번호 11, 배열번호 17, 배열번호 19, 배열번호 25 또는 배열번호 30에 의해 포함되는 펩타이드를 치료를 위해 이용할 수 있다. 왜냐하면, 이것은 하기의 실시예의 절에 보이는 바와 같이, 그와 같은 펩타이드는 야생형 펩타이드와 비교되었을 때, 응집을 표시하지 않고(배열번호 9), 또는 지연된 응집 속도론을 보이기(배열번호 9 및 배열번호 10) 때문이다. 아밀로이드 형성은 매우 지연된 프로세스이므로, 이들 펩타이드 배열은 생리학적 조건의 하에서 아밀로이도시스를 완전히 억제하거나, 또는 현저하게 지연시키는 것으로 생각된다.
본 명세서에 이용되는 용어 "펩타이드"는 천연 펩타이드(분해 산물, 합성 펩타이드 또는 재조합 펩타이드의 어느 것) 및 펩타이드를 생체 중에서 보다 안정하도록 또는 보다 세포 내에의 침투가 가능하도록 수식될 수 있는 펩타이드 유사체(펩타이드 아날로그) 인 펩토이드(peptoids) 및 세미펩토이드(semipeptoids) 등의 펩타이드 의사체(전형적으로는 합성 펩타이드)를 포함한다. 이와 같은 수식으로서는 N 말단수식, C 말단수식, 펩타이드 결합 수식이 포함되지만 이들에 한정되지 않고, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH, 골격수식 및 잔기수식이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 펩타이드 의사체 화합물을 조제하는 방법은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있고, 예를 들면 Quantitative Drug Design,C. A. Ramsden Gd., Chapter 17.2,F. Choplin Pergamon 출판(1992)에 특정되고, 이것은 본 명세서 중에 완전히 기재되어 있는 것과 같이 참고문헌으로서 원용되어 있다. 이것에 관한 더욱 상세를 이하에 기재한다.
펩타이드 내의 펩타이드 결합(-CO-NH-)을, 예를 들면 N-메틸화 결합(-N(CH3) -CO-), 에스테르 결합(-C(R) H-C-O-O-C(R) -N-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-), α-아자 결합(-NH-N(R) -CO-) (식 중, R은 예를 들면 메틸 등의 알킬기), 카르바 결합(-CH2-NH-), 히드록시에틸렌 결합(-CH(OH) -CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중결합(-CH=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩타이드 유도체(-N(R) -CH2-CO-) (식 중, R은 탄소원자 상에 천연에 존재하는 "통상의" 측쇄)에 의해 치환될 수 있다.
이들 수식은 펩타이드 쇄에 따른 결합의 어느 것에 있어서 발생할 수 있고, 동시에 수 개의 부분(2-3개 부분)에서 발생될 수 있다.
천연 방향족 아미노산, Trp, Tyr 및 Phe가 페닐글리신, Tic, 나프틸알라닌(Nal), 페닐이소세린, 트레오니놀, Phe의 환상 메틸화 유도체, Phe 또는 o-메틸-TyR의 할로겐화 유도체 등의 합성 비천연산(non-natural acid)에 의해 치환될 수 있다.
상기에 더하여, 본 발명의 펩타이드는 하나 이상의 수식된 아미노산 또는 하나 이상의 비아미노산 모노머(예를 들면 지방산, 탄수화물 복합체 등) 도 포함할 수 있다.
본 명세서 중 및 청구의 범위의 부분 중에 이용되는 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 (복수) "는 20 개의 천연에 발생하는 아미노산으로서, 이들 아미노산은 종종 번역 후에 인비보에서 수식되고, 예를 들면 히드록시플로린, 포스포세린 및 포스포트레오닌이 포함되고, 및 2-아미노아디핀산, 히드록시리신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-루신 및 오르니틴 등의, 그러나 이들에 한정되지 않는 다른 특별한 아미노산을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산의 양자를 포함한다.
이하의 표 1 및 2는 본 발명에서 사용되는 천연에 발생하는 아미노산(표 1) 및 관용되지 않는 또는 수식 아미노산(표 2)을 포함한다.
[표 1]
아미노산 3글자 약어 1글자 약어
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파리긴 Asn N
아스파르트산 Asp D
시스테인 Cys C
글루타민 Gln Q
글루타민산 Glu E
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소루신 Iie I
루신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
위와 같은 어느 하나의 아미노산 Xaa X
[표 2]
관용이 아닌 아미노산 코드 관용이 아닌 아미노산 코드
α-아미노부틸산 Abu L-N-메틸알라닌 Nmala
α-아미노-α-메틸부티레이트 Mgabu L-N-메틸아르기닌 Nmarg
아미노시클로프로판 Cpro L-N-메틸아스파라긴 Nmasn
카르복시레이트 L-N-메틸아스파르트산 Nmasp
아미노이소부틸산 Aib L-N-메틸시스테인 Nmcys
아미노노르보르닐 Norb L-N-메틸글루타민 Nmgin
카르복시레이트 L-N-메틸글루타민산 Nmglu
시클로헥실알라닌 Chexa L-N-메틸히스티딘 Nmhis
시클로펜틸알라닌 Cpen L-N-메틸이소루신 Nmile
D-알라닌 Dal L-N-메틸루신 Nmleu
D-아르기닌 Darg L-N-메틸리신 Nmlys
D-아스파라긴산 Dasp L-N-메틸메티오닌 Nmmet
D-시스테인 Dcys L-N-메틸노르루신 Nmnle
D-글루타민 Dgln L-N-메틸노르발린 Nmnva
D-글루타민산 Dglu L-N-메틸오르니틴 Nmorn
D-히스티딘 Dhis L-N-메틸페닐알라닌 Nmphe
D-이소루신 Dile L-N-메틸프롤린 Nmpro
D-루신 Dleu L-N-메틸세린 Nmser
D-리신 Dlys L-N-메틸트레오닌 Nmthr
D-메티오닌 Dmet L-N-메틸트립토판 Nmtrp
D-오르니틴 Dorn L-N-메틸티로신 Nmtyr
D-페닐알라닌 Dphe L-N-메틸발린 Nmval
D-프롤린 Dpro L-N-메틸에틸글리신 Nmetg
D-세린 Dser L-N-메틸-t-부틸글리신 Nmtbug
D-트레오닌 Dtyr L-노르루신 Nle
D-트립토판 Dtyr L-노르발린 Nva
D-티로신 Dval α-메틸-아미노이소부티레이트 Maib
D-발린 Dval α-메틸-γ-아미노부티레이트 Mgabu
D-α-메틸알라닌 Dmala α-메틸시클로헥실알라닌 Mchexa
D-α-메틸아르기닌 Dmarg α-메틸시클로펜틸알라닌 Mcpen
D-α-메틸아스파라긴 Dmasn α-메틸-α-나프틸알라닌 Manap
D-α-메틸아스파르테이트 Dmasp α-메틸페니실아민 Mpen
D-α-메틸시스테인 Dmcys N-(4-아미노부틸)글리신 Nglu
D-α-메틸글루타민 Dmgln N-(2-아미노에틸)글리신 Naeg
D-α-메틸히스티딘 Dmhis N-(3-아미노프로필)글리신 Norn
D-α-메틸이소루신 Dmile N-아미노-α-메틸부티레이트 Nmaabu
D-α-메틸루신 Dmleu α-나프틸알라닌 Anap
D-α-메틸리신 Dmlys N-벤질글리신 Nphe
D-α-메틸메티오닌 Dmmet N-(2-카르바밀에틸)글리신 Ngln
D-α-메틸오르니틴 Dmorn N-(카르바밀메틸)글리신 Nasn
D-α-메틸페닐알라닌 Dmphe N-(2-카르복시에틸)글리신 Nglu
D-α-메틸프롤린 Dmpro N-(카르복시메틸)글리신 Nasp
D-α-메틸세린 Dmser N-시클로부틸글리신 Ncbut
D-α-메틸트레오닌 Dmthr N-시클로헵틸글리신 Nchep
D-α-메틸트립토판 Dmtrp N-시클로헥실글리신 Nchex
D-α-메틸티로신 Dmty N-시클로데실글리신 Ncdec
D-α-메틸발린 Dmval N-시클로도데클글리신 Ncdod
D-α-메틸알라닌 Dnmala N-시클로옥틸글리신 Ncoct
D-α-메틸아르기닌 Dnmarg N-시클로프로필글리신 Ncpro
D-α-메틸아스파라긴 Dnmasn N-시클로운데실글리신 Ncund
D-α-메틸아스파르테이트 Dnmasp N-(2,2-디페닐에틸)글리신 Nbhm
D-α-메틸시스테인 Dnmcys N-(3,3-디페닐프로필)글리신 Nbhe
D-N-메틸루신 Dnmleu N-(3-인돌릴에틸)글리신 Nhtrp
N-메틸리신 Dnmlys N-메틸-γ-아미노부티레이트 Nmgabu
N-메틸시클로헥실알라닌 Nmchexa D-N-메틸메티오닌 Dnmmet
D-N-메틸오르니틴 Dnmorn N-메틸시클로펜틸알라닌 Nmcpen
N-메틸글리신 Nala D-N-메틸페닐알라닌 Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트 Nmaib D-N-메틸프롤린 Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸세린 Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸세린 Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신 Nleu D-N-메틸트레오닌 Dnmthr
D-N-메틸트립토판 Dnmtrp N-(1-메틸에틸)글리신 Nva
D-N-메틸티로신 Dnmtyr N-메틸나프틸알라닌 Nmanap
D-N-메틸발린 Dnmval N-메틸페니실아민 Nmpen
γ-아미노부틸산 Gabu N-(p-히드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-t-부틸글리신 Tbug N-(티오메틸글리신) Ncys
L-에틸글리신 Etg 페니실아민 Pen
L-호모페닐알라닌 Hphe L-α-메틸알라닌 Mala
L-α-메틸아르기닌 Marg L-α-메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸아스파르테이트 Masp L-α-메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸시스테인 Mcys L-메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α-메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α-메틸호모페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸이소루신 Mile N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
D-N-메틸글루타민 Dnmgln N-(3-구아니디노프로필)글리신 Narg
D-N-메틸글루타메이트 Dnmgln N-(1-히드록시에틸)글리신 Nthr
D-N-메틸히스티딘 Dnmhis N-(히드록시에틸)글리신 Nser
D-N-메틸이소루신 Dnmile N-(이미다졸릴에틸)글리신 Nhis
D-N-메틸루신 Dnmleu N-(3-인돌릴에틸)글리신 Nhtrp
D-N-메틸리신 Dnmlys N-메틸-γ-아미노부티레이트 Nmgabu
N-메틸시클로헥실알라닌 Nmchexa D-N-메틸메티오닌 Dnmmet
D-N-메틸오르니틴 Dnmorn N-메틸시클로펜틸알라닌 Nmcpen
N-메틸글리신 Nala D-N-메틸페닐알라닌 Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트 Nmaib D-N-메틸프롤린 Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸세린 Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신 Nleu D-N-메틸트레오닌 Dnmthr
D-N-메틸트립토판 Dnmtrp N-(1-메틸에틸)글리신 Nval
D-N-메틸티로신 Dnmtyr N-메틸나프틸알라닌 Nmanap
D-N-메틸발린 Dnmval N-메틸페니실아민 Nmpen
γ-아미노부틸산 Gabu N-(p-히드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-t-부틸글리신 Tbug N-(티오메틸)글리신 Ncys
L-에틸글리신 Etg 페니실아민 Pen
L-호모페닐알라닌 Hphe L-α-메틸알라닌 Mala
L-α-메틸아르기닌 Marg L-α-메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸아스파르테이트 Masp L-α-메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸시스테인 Mcys L-메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α-메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α-메틸호모페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸이소루신 Mile N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
L-α-메틸루신 Mleu L-α-메틸리신 Mlys
L-α-메틸메티오닌 Mmet L-α-메틸노르루신 Mnle
L-α-메틸노르발린 Mnva L-α-메틸오르니틴 Morn
L-α-메틸페닐알라닌 Mphe L-α-메틸프롤린 Mpro
L-α-메틸세린 mser L-α-메틸트레오닌 Mthr
L-α-메틸발린 Mtrp L-α-메틸티로신 Mtyr
L-α-메틸루신 Mval Nnbhm L-N-메틸호모페닐알라닌 Nmhphe
N-(N-(2,2-디페닐에틸) N-(N-(3,3-디페닐프로필)
카르바밀메틸글리신 Nnbhm 카르바밀메틸(1)글리신 Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판 Nmbc
본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 펩타이드가 가용성의 형태인 것이 요구되는 치료약 또는 진단약에서 이용되므로, 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 하나 이상의 비천연형 또는 천연형의 극성 아미노산을 포함하고, 그와 같은 아미노산에는 그 히드록실 함유 측쇄에 의해 펩타이드의 용해성을 증대시키는 것이 가능한 세린 및 트레오닌이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
치료용의 경우, 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 적어도 하나의 β-시이트 파괴제 아미노산 잔기를 포함하고, 그것은 이하에 기재되는 바와 같은 펩타이드 배열에 위치된다. 그와 같은 β-시이트 파괴제 아미노산을 포함하는 펩타이드는 아밀로이드 폴리펩타이드의 인식을 유지하지만, 그 응집을 예방한다(이하의 실시예의 절의 실시예 40-45 참조). 본 발명의 이 관점의 하나의 바람직한 실시태양에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산은 약 -120도 내지 - 140 도의 전형적인 β-시이트 φ각이 아니고, 약 - 60 도 내지 + 25 도의 한정된 φ각에 의해 특징이 부여되고, 그것에 의해 아밀로이드 원섬유의 β-시이트 구조를 파괴하는 플로린과 같은 천연에 존재하는 아미노산이다(예를 들면, 배열번호 45, 112, 119, 120, 122, 123, 128, 130, 134, 138, 139, 140, 141, 143, 144, 146, 147 및 148, "배경기술"의 절을 참조). 다른 β-시이트 파괴제 아미노산은 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 리신 및 세린을 포함하지만, 이것에 한정되지 않는다(Chou 및 Fasman(1978),Annu. Rev. Biochem. 47,258에 의함).
본 발명의 이 관점의 다른 바람직한 실시태양에 의하면, β-시이트 파괴제 아미노산 잔기는 Cα-메틸화 아미노산과 같은 합성 아미노산이고, 그 입체구조 조건이 제한된다 [Balaram,(1999),J. Pept. Res. 54,195-199]. 천연의 아미노산과 달리, Cα-메틸화 아미노산은 Cα에 결합된 수소원자를 가지고, 그것은 아미드 결합의 φ 및 ψ각에 관한 그 입체특성에 광범위하게 영향을 준다. 따라서 알라닌은 넓은 범위의 가능한 φ 및 ψ 입체구조를 가지지만, α-아미노이소부틸산(Aib, 상기 표 2 참조) 은 제한된 φ 및 ψ 입체구조를 가진다. 따라서 적어도 하나의 Aib 잔기에 의해 치환되는 본 발명의 펩타이드는 아밀로이드 폴리펩타이드를 결합할 수 있으나, 그 응집을 방지한다(실시예 40-44 참조). 이와 같은 펩타이드는 배열번호 113, 114, 117, 118, 121, 135, 136, 137, 143, 145, 149, 129 및 131에 기재되어 있다.
본 발명의 이 관점의 β-시이트 파괴제 아미노산은 펩타이드의 X-Y/Y-X 아미노산 배열의 위치 Y에 위치되는 것이 가능하다(예를 들면, 배열번호 123,143,144,145,146,147,148 참조). 또는 본 발명의 이 관점의 펩타이드는 적어도 3 개의 아미노산일 수 있고, 또 X-Y/Y-X 아미노산 배열 이외의 임의의 위치에 파괴제 아미노산을 포함한다(예를 들면 배열번호 117 참조).
β-시이트 파괴제 아미노산은 방향족 잔기의 상류에(배열번호 122 참조) 또는 그 하류에(배열번호 123 참조) 위치될 수 있다.
본 발명의 이 관점의 하나의 바람직한 실시태양에 의하면, 펩타이드는 3 개의 아미노산 길이이고, Y는 방향족 아미노산이고, 아미노산 배열 X-Y 또는 Y-X에 결합된 아미노산 잔기는 β-시이트 파괴제 아미노산이고, 그것은 펩타이드의 C 말단에서 결합되는 것이 바람직하다(예를 들면 배열번호 135 및 140).
본 발명의 이 관점의 다른 바람직한 실시태양에 의하면, 펩타이드는 2 개의 아미노산 길이이고, 또 Y는 β-시이트 파괴제 아미노산이다(예를 들면 배열번호 121, 143-148).
본 발명의 이 관점의 가장 바람직한 실시태양에 의하면, 펩타이드는 하기 일반식을 가지는 디-펩타이드이다:
Figure 112005078237310-pct00003
식 중, C*는 D 배치(R 배치라고도 한다)를 가지는 키랄 탄소이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 카르복시, 티오카르복시, C-카르복실레이트 및 C-티오카르복실레이트로 이루어지는 군에서 선택되고;
R3는 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오히드록시, 티오알콕시, 티오아릴옥시, 할로 및 아민으로 이루어지는 군에서 선택되고; 그리고
R4는 알킬이다.
본 명세서 중에서 사용되는 용어 "알킬"은 직쇄기 및 분지쇄기를 포함하는 포화된 지방족 탄화수소를 나타낸다. 바람직하게는 알킬기는 1 개-20 개의 탄소원자를 가진다. 수치범위, 예를 들면 "1 - 20 개"가 본 명세서에서 기술되는 경우는 언제나 그것은 기(이 경우는 알킬기) 가 1 개의 탄소원자, 2 개의 탄소원자, 3 개의 탄소원자 등의 20 개까지의 탄소원자를 포함한다는 것을 의미한다. 더 바람직하게는 알킬기는 1 개-10 개의 탄소원자를 가지는 중간 정도의 크기의 알킬이다. 가장 바람직하게는 다르게 표시되지 않는 한, 알킬기는 1 - 4 개의 탄소원자를 가지는 저급 알킬이다. 알킬기는 치환 또는 비치환일 수 있다. 치환되었을 때, 치환기는 예를 들면, 할로, 히드록시, 시아노, 니트로 및 아미노일 수 있다.
"시클로알킬"기는 고리의 하나 또는 복수가 완전공액의 π 전자계를 가지지 않는 모두 탄소로 이루어지는 단고리기 또는 축합고리(즉, 인접 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 나타낸다. 시클로알킬기의 비한정적인 예에는 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로펜텐, 시클로헥산, 시클로헥사디엔, 시클로헵탄, 시클로헵타트리엔 및 아다만탄이 있다. 시클로알킬기는 치환 또는 비치환일 수 있다. 치환되었을 때, 치환기는 예를 들면, 알킬, 할로, 히드록시, 시아노, 니트로 및 아미노일 수 있다.
"아릴"기는 완전공액의 π 전자계를 가지는 모두 탄소로 이루어지는 단환기 또는 축합다중고리(즉, 인접탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 나타낸다. 아릴기의 비한정적인 예에는 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이 있다. 아릴기는 치환 또는 비치환일 수 있다. 치환되었을 때, 치환기는 예를 들면, 알킬, 시클로알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 티오히드록시, 티오알콕시, 시아노, 니트로 및 아미노일 수 있다.
"히드록시"기는 -OH기를 나타낸다.
"알콕시"기는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같이, -O-알킬기 및 -O-시클로알킬기의 양자를 나타낸다.
"아릴옥시"기는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같이, -O-아릴기를 나타낸다.
"티오히드록시"기는 -SH기를 나타낸다.
"티오알콕시"기는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같이, -S-알킬기 및 -S-시클로알킬기의 양자를 나타낸다.
"티오아릴옥시"기는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같이, -S-아릴기를 나타낸다.
"카르복시"기는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같이, -C(=O) -R'기(식 중, R'은 수소, 할로, 알킬, 시클로알킬 또는 아릴을 나타낸다.
"티오카르복시"기는 -C(=S) -R'기(식 중, R'은 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같다)를 나타낸다.
"C-카르복실레이트"기는 -C(=O) -O-R'기(식 중, R'는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같다)를 나타낸다.
"O-티오카르복실레이트"기는 -C(=S) -O-R'기(식 중, R'는 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같다)를 도시한다.
"할로"기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 나타낸다.
"아민"기는 -NR'R''기(식 중, R'은 본 명세서 중에서 정의되는 바와 같고, R''는 R'에 대하여 규정되는 바와 같다)를 나타낸다.
"니트로"기는 -NO2기를 나타낸다.
"시아노"기는 -C=N기를 나타낸다.
바람직하게는 R4는 메틸이고, 따라 상기 화합물은 D-트리프토판-α-아미노부틸산(D-Trp-aib 또는 D-트리프토판-α-메틸-알라닌이라고도 한다), 또는 그 유도체이다.
개변되지 않은 디-펩타이드, L-배치를 가지는 펩타이드, 역전된 배치를 가지는 펩타이드(즉, 트리프토판(D/L)의 C-N배열 및 α-메틸알라닌), 또는 상기 펩타이드 배열을 포함하는 거대 분자(예를 들면, 펩타이드, 고정된 펩타이드) 가 알려져 있는 것이 인식될 것이다(예를 들면, WO 02/094857,WO 02/094857,EP 특허 No. 966975,US 특허 No. 6255286,6251625,6162828 및 5304470). 그러나, 이와 같은 분자는 위에서 기재된 펩타이드와 화학적으로 또 생물학적으로 상이하고, 그 독자의 활성은 그 구조에 엄격하게 의존한다.
본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 직쇄상 형태로 이용되지만, 환화(cyclization) 가 펩타이드 특성을 크게 방해하지 않는 경우에는 환상 형태의 펩타이드도 이용될 수 있는 것이 이해된다.
환상 펩타이드는 환상 형태로 합성될 수 있거나, 또는 소망되는 조건(예를 들면, 생리학적 조건) 하에서 환상 형태를 취하도록 구성될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 교시에 의한 펩타이드는 코어펩타이드 배열에 인접하는 적어도 2 개의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 이 경우에 있어서, 환화는 2 개의 Cys 잔기 사이의 S-S결합의 형성에 의해 생성되는 것이 가능하다. 측쇄와 측쇄의 환화는 또 식 -(-CH2-) n-S-CH2-C-(단, n=1 또는 2이다)의 상호작용 결합의 형성에 의해 생성되는 것이 가능하고, 그것은 예를 들면 Cys 또는 호모Cys의 함유 및 그 자유 SH기와 예를 들면 브로모아세틸화 Lys,Orn,Dab 또는 DaP의 반응에 의해 가능하다. 더욱, 환화는 예를 들면 아미드 결합형성에 의해, 예를 들면 Glu,Asp,Lys,Orn,디아미노부틸(Dab) 산, 디아미노프로피온(Dap) 산을 고리(-CO-NH 또는 -NH-CO결합)의 다양한 위치에 포함시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 골격과 골격의 환화는 또 식 H-N((CH2) n-COOH) -C(R) H-COOH 또는 H-N((CH2) n-COOH) -C(R) H-NH2(식 중, n=1-4이고, 더 R은 아미노산의 천연 또는 비천연의 측쇄이다)의 개변된 아미노산에 의해 얻을 수 있다.
따라서 본 발명은 원섬유의 조합을 유도하는 아밀로이드 펩타이드의 구조적 결정 인자의 정체(identity)에 관한 결론적 데이터를 제공한다.
그러므로, 본 발명에 의해 아밀로이도시스의 예방/처치 또는 진단을 위해 이용할 수 있는 다양한 펩타이드 배열의 설계가 가능해진다.
실시예 6-35에 기재되어 있는 바와 같이, 본 발명자는 수많은 아밀로이드 관련 단백질에서 본 발명의 컨센서스 방향족 배열(배열번호 7)을 동정하였다. 따라서 본 발명에 의해, 본질적으로 모든 아밀로이드 형성 단백질의 아밀로이드 형성 프래그먼트를 정확하게 동정할 수 있다.
더욱, 작은 방향족 분자, 예를 들면, Ro47-1816/001[Kuner외(2000), J. Biol. Chem., 275: 1673-8, a 참조] 및 3-p-톨로오일-2-[4'-(3-디에틸아미노프로폭시) 페닐]벤조푸란[Twyman(1999), Tetrahedron Letters, 40: 9383-9384]등이 알츠하이머병의 β-폴리펩타이드의 중합을 억제하는 것에서 유효한 것이 입증되어 있고[Findeis외(2000), Biochem. Biophys. Acta, 1503: 76-84], 그 한편으로, 방향족 원소를 함유하는 아밀로이드 특이적 색소, 예를 들면, 콩고 레드(도 2b) 및 티오플라빈T(도 2c) 등이 일반적인 아밀로이드 형성 억제제라는 사실은 본 발명의 인식 모티브를 아밀로이드의 자기조합을 위해 충분하다는 것을 실증하고 있다.
본 발명의 펩타이드를 얻을 수 있는 것에 의해, 아밀로이드 플레이크를 해리시키기 위해, 또는 아밀로이드 플레이크의 형성을 예방하기 위해 사용할 수 있는 본 발명의 펩타이드에 대한 항체를 제조하는 것이 가능해진다(미국특허 제5688561호).
용어 "항체"는 완전한(intact) 항체 분자, 및, 대식세포에 결합할 수 있는 기능적 프래그먼트, 예를 들면, Fab, F(ab')2 및 Fv등을 나타낸다. 이들 기능적인 항체 프래그먼트는 하기와 같이 정의된다: (i) Fab, 항체 분자의 1가의 항원결합 프래그먼트를 함유하는 프래그먼트이고, 완전한 항체를 효소 파파인으로 소화하여, 완전한 경쇄와, 중쇄의 일부를 생성시키는 것에 의해 제조할 수 있는 프래그먼트; (ii) Fab', 완전한 항체를 펩신으로 처리하고, 그 후 환원하여 완전한 경쇄와 중쇄의 일부를 생성시키는 것에 의해 얻을 수 있는 항체 분자의 프래그먼트; 항체 분자1 개당 2개의 Fab' 프래그먼트가 얻어질 수 있다; (iii) F(ab')2, 완전한 항체를, 후속 환원을 수반하지 않고, 효소 펩신으로 처리하는 것에 의해 얻을 수 있는 항체의 프래그먼트; F(ab')2는 2개의 Fab' 프래그먼트가 2개의 디설파이드 결합에 의해 상호 결합하고 있는 이량체이다; (iv) Fv, 이것은 2개의 쇄로서 발현된 경쇄의 가변영역 및 중쇄의 가변영역을 함유하는 유전자 조작된 프래그먼트로서 규정된다; 및 (v) 단쇄항체("SCA"), 유전자 융합된 단일쇄 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변영역 및 중쇄의 가변영역을 함유하는 유전자 조작된 분자.
이들 프래그먼트를 제조하는 다양한 방법이 이 분야에서는 알려져 있다(예를 들면, Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988(이것은 참고로서 도입된다)를 참조할 것).
항체(즉, 모노클로날 및 폴리클로날)를 제조하는 다양한 방법이 이 분야에서는 광범위하게 알려져 있다. 항체는 이 분야에서 알려져 있는 몇 개의 방법 중 어느 하나에 의해 제조할 수 있다. 그와 같은 방법에서는 항체 분자의 인비보 생산의 유도, 개시되어 있는 바와 같이 면역글로블린 라이브러리 또는 매우 특이적인 결합시약의 패널(panels)을 스크리닝하는 것[Orlandi D. R. 외(1989), Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 3833-3837; Winter G. 외(1991), Nature, 349: 293-299], 또는 배양에서의 연속된 세포주에 의한 모노클로날 항체 분자의 제조를 이용할 수 있다. 이들에 한정되지 않지만, 하이브리도마 기술, 인간 B세포 하이브리도마 기술, 및 엡스타인-바르-바이러스(EBV) -하이브리도마 기술이 포함된다[Kohler G. 외(1975), Nature, 256: 495-497; Kozbor D. 외(1985), J. I mMunol. Methods, 81: 31-42; Cote R. J. 외(1983), Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026-2030; Cole S. P. 외(1984), Mol. Cell. Biol., 62: 109-120].
본 발명에 의한 항체 프래그먼트는 항체의 단백질 분해적 가수분해에 의해 또는 프래그먼트를 코드하는 DNA의 대장균 또는 포유동물 세포(예를 들면, 차이니즈햄스터 난소세포 배양물 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조할 수 있다.
항체 프래그먼트는 종래의 방법에 의한 완전한 항체의 펩신소화 또는 파파인 소화에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 프래그먼트는 F(ab') 2로서 표시되는 5S 프래그먼트를 얻기 위해 펩신에 의한 항체의 효소절단에 의해 제조할 수 있다. 이 프래그먼트는 3.5S의 Fab'1가 프래그먼트를 제조하기 위해, 티올 환원제와, 그리고 필요한 경우에는 디설파이드 결합의 절단에 의해 발생하는 설피드릴기에 대한 보호기를 사용하여 더 절단할 수 있다. 또는 펩신을 사용하는 효소절단에서는 2개의 1가Fab' 프래그먼트 및 하나의 Fc 프래그먼트가 직접 발생한다. 이들 방법은 예를 들면, Goldenberg의 미국특허 제4036945호 및 동 제4331647호, 및 이들에 포함된 참고문헌에 기재되어 있다(그와 같은 특허는 그 전체가 참고로서 본 명세서에 의해 도입된다). Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959도 참조할 것. 프래그먼트가 완전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들면, 1가의 경-중쇄 프래그먼트를 형성시키기 위한 중쇄의 분리, 프래그먼트의 추가 절단, 또는 다른 효소적 기술, 화학적 기술 또는 유전학적 기술 등도 사용할 수 있다.
Fv 프래그먼트는 VH쇄 및 VL쇄의 조합을 포함한다. 이 조합은 Inbar 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69: 2659-62, 1972에 기재되는 바와 같이 비공유결합일 수 있다. 또는 가변쇄를 분자간 디설파이드 결합에 의해 연결하거나, 또는 클루타르알데히드 등의 화학시약에 의해 가교할 수 있다. 바람직하게는 Fv 프래그먼트는 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH쇄 및 VL쇄를 포함한다. 이들 단쇄의 항원결합 단백질(sFv) 은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 구조유전자를 구축하는 것에 의해 조제된다. 구조유전자는 발현 벡터에 삽입되고, 그 후, 발현 벡터는 대장균 등의 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포에 의해, 링커 펩타이드가 2개의 V 도메인을 연결하고 있는 단일의 펩타이드 쇄가 합성된다. sFv를 제조하기 위한 다양한 방법이, 예를 들면, Whitlow 및 Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird외, Science, 242: 423-426, 1988; Pack외, Bio/Technology, 11: 1271-77, 1993; Ladner외, 미국특허 제4946778호(이들은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 의해 도입된다)에 의해 기재된다.
다른 형태의 항체 프래그먼트는 하나만의 상보성 결정영역(CDR)을 코드하는 펩타이드이다. CDR펩타이드("최소인식 유닛") 는 목적으로 하는 항체의 CDR을 코드하는 유전자를 구축하는 것에 의해 얻을 수 있다. 그와 같은 유전자는 예를 들면 항체 생산 세포의 RNA로부터 가변영역을 합성하기 위해 폴리메라제 연쇄반응을 사용하여 조제된다. 예를 들면, Larrick 및 Fry, Methods, 2: 106-10, 1991를 참조할 것.
인간에의 적용의 경우, 본 발명의 항체는 바람직하게는 인간화된다. 비인간(예를 들면, 마우스) 항체의 인간화 형태는 비인간 면역글로블린에 유래하는 최소한의 배열을 함유하는 면역글로블린, 면역글로블린쇄 또는 그 프래그먼트(예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원결합성의 부분배열 등)의 키메라 분자이다. 인간화 항체에는 리시피언트(recipient)의 상보적 결정영역(CDR)에 유래하는 잔기가 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 랫 또는 토끼 등의 비인간 종(도우너(donor) 항체)의 CDR에 유래하는 잔기에 의해 치환되어 있는 인간 면역글로블린(리시피언트 항체)이 포함된다. 경우에 따라, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 잔기가 대응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 인간화 항체는 또 리시피언트 항체 또는 도입된 CDR 배열 또는 프레임워크 배열의 어느 것에도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 가변 도메인, 또는 적어도 하나의 가변 도메인, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함하고, 이 경우 CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두가 비인간 면역글로블린의 CDR 영역에 대응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두가 인간 면역글로블린의 컨센서스 배열의 FR 영역이다. 인간화 항체는 또 가장 적합하게는 면역글로블린 정상영역(Fc)의 적어도 일부를 포함하고, 전형적으로는 인간 면역글로블린의 정상영역의 적어도 일부를 포함한다[Jones외, Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann외, Nature, 332: 323-329(1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992) ].
비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 이 분야에서는 광범위하게 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비인간인 공급원으로부터 그 중에 도입되어 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 도입 가변 도메인으로부터 전형적으로 선택되는 도입 잔기로서 표시되는 것이 많다. 인간화는 본질적으로는 설치류의 CDR 또는 CDR 배열을 인간 항체의 대응하는 배열에 치환하는 것에 의해, Winter 및 공동 연구자의 방법[Jones외, Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann외, Nature, 332: 323-327(1988); Verhoeyen외, Science, 239: 1534-1536(1988) ]에 따라 행할 수 있다. 따라서 그와 같은 인간화 항체는 실질적으로는 완전하지 않은 인간 가변 도메인이 비인간 종(species) 유래의 대응하는 배열에 의해 치환된 키메라 항체이다(미국특허 제4816567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로는 몇 개의 CDR 잔기 및 몇 개의 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사 부위에 유래하는 잔기에 의해 치환된 인간 항체일 가능성이 있다.
인간 항체는 또 파아지 디스플레이 라이브러리[Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381(1991); Marks외, J. Mol. Biol., 222: 581(1991)를 포함하는 이 분야에서 알려져 있는 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. Cole외 및 Boerner다른 기술도 인간 모노클로날 항체를 조제하기 위해 이용할 수 있다[Cole외, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77쪽(1985); Boerner외, J. I mMunol., 147(1) : 86-95(1991) ]. 마찬가지로, 인간 항체는 인간 면역글로블린 유전자 좌를 내인성의 면역글로블린 유전자가 부분적 또는 완전히 불활성화된 유전자 재조합 동물(예를 들면, 마우스)에 도입하는 것에 의해 제조할 수 있다. 항원 자극되었을 때, 인간 항체의 생산이 관측되고, 그 항체 생산은 유전자 재배치, 조립(assembly) 및 항체 레퍼터리를 포함하는 모든 것에 있어서 인간에서 발견되는 항체 생산과 매우 유사하다. 이 방법은 예를 들면, 미국특허 제5545807호, 동 제5545806호, 동 제5569825호, 동 제5625126호, 동 제5633425호, 동 제5661016호에 기재되고, 또 하기의 과학적 간행물에 기재된다: Marks외, Bio/Technology, 10, 779-783(1992); Lonberg외, Nature, 368: 856-859(1994); Morrison, Nature, 368: 812-13(1994); Fishwild외, Nature Biotechnology, 14, 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14, 826(1996); Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. I mMunol., 13: 65-93(1995).
본 명세서 중 상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드에 대한 하나의 구체적인 사용은 아밀로이드 플레이크 형성에 관련되는 질환의 예방 또는 처치이다.
따라서 본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 개체에서의 아밀로이드 관련 질환을 처치하는 방법이 제공된다. 본 발명에 의한 바람직한 개체 대상은 포유동물이고, 예를 들면, 개, 고양이, 양, 돼지, 말, 소, 인간 등이다.
용어 "처치하는"은 아밀로이드 플레이크 형성을 감소시키거나, 또는 예방하는 것, 또는 병에 걸린 조직에서의 플레이크의 출현을 실질적으로 감소시키는 것을 나타낸다. 표현 "아밀로이드 플레이크"는 원섬유 아밀로이드 및 응집되었으나, 원섬유가 아닌 아밀로이드(이하, "프로토원섬유(prorofibrillar) 아밀로이드", 이것도 병원성일 수 있다)을 나타낸다. 예를 들면, 응집되었으나, 반드시 원섬유인 것은 아닌 형태의 IAPP가 배양에서 독성인 것이 발견되었다. Anaguiano 및 공동연구자[(2002), Biochemistry, 41: 11338-43]에 의해 입증되는 바와 같이, 프로토원섬유IAPP는 파킨슨병의 병리발생에 관계하고 있는 프로토원섬유 α-시누세린과 마찬가지로 합성된 소포를 세공 형태(pore-like)의 기구에 의해 투과하였다. IAPP아밀로이드 세공의 형성은 조기의 IAPP올리고머의 형성 및 그 소실로부터 아밀로이드 원섬유의 출현까지와 일시적으로 상관되었다. 이들 결과는 프로토원섬유IAPP는 다른 프로토원섬유 단백질이 알츠하이머병 및 파킨슨병의 발증에 있어서 중요한 만큼, II형 당뇨병에서 중요할 수 있다는 것을 시사하고 있다.
본 발명에 따라 처치되는 아밀로이드 관련 질환에는 II형 당뇨병, 알츠하이머병(AD), 조발형 알츠하이머병, 지발형 알츠하이머병, 전징(presymptomatic) 알츠하이머병, 파킨슨병, SAA 아밀로이도시스, 유전성 아이스랜드 증후군, 다발성 골수종, 수양암, 대동맥의 의학적 암종, 인슐린 주사 아밀로이도시스, 프리온 전신성 아밀로이도시스, 만성 염증 아밀로이도시스, 헌팅톤병, 노년성 전신성 아밀로이도시스, 하수체 아밀로이도시스, 유전성 신장 아밀로이도시스, 가족성 영국 치매, 핀란드 유전성 아밀로이도시스, 가족성 비신경 장해성 아밀로이도시스[Gazit(2002), Curr. Med. Chem., 9: 1667-1675], 그리고 프리온병(양 및 염소의 스크래피, 및 소류의 소 해면상 뇌증(BSE)을 포함한다) [Wilesmith 및 Wells(1991), Curr. Top. Microbiol. I mMunol., 172: 21-38], 그리고 인간의 프리온병(이것에는 (i) 쿠루, (ii) 크로이츠펠트-제이코프병(CJD), (iii) 게르스트만-스트로우슬러-쉐인커병(GSS) 및 (iv) 치사성 가족성 불면증(FFI)이 포함된다) [Gajdusek(1977), Science, 197: 943-960; Medori, Tritschler외(1992), N Engl J Med, 326: 444-449]가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명의 펩타이드의 치료 유효량을 개체에 제공하는 것을 포함한다. 펩타이드는 다양한 송달방법의 어느 하나를 사용하여 제공할 수 있다. 다양한 송달방법 및 적합한 배합물이 약학적 조성물에 관하여 본 명세서 중 이하에 기재된다.
아밀로이드 질환을 처치하기 위해 이용되었을 때, 본 발명의 펩타이드는 원섬유 형성을 방지하기 위해, 또는 원섬유 형성을 감소시키기 위해, 또는 사전에 형성된 응집물을 경합적으로 탈안정화시키는 것에 의해, 형성된 응집물을 분해하기 위해 적합한 아미노산 배열을 포함하는 것이 이해된다. 예를 들면, 배열번호 45,112-123,125,127,128-149 및 150은 아밀로이드 질환(특히 II형 당뇨병)을 처치하기 위해 이용할 수 있다. 이것은 하기의 실시예의 절의 실시예 35 및 실시예 45에 보이는 바와 같이, 그와 같은 배열이 억제 펩타이드의 존재 하에서는 티오플라빈T와 결합하는 아밀로이드 형성 펩타이드의 능력이 낮은 것에 의해 입증되는 바와 같이, IAPP의 자기조합을 방해하기 때문이다.
또는 배열번호 10 또는 배열번호 11에 보이는 펩타이드는 하기의 실시예의 절에 보이는 바와 같이, 펩타이드에서의 로이신 또는 이소로이신 중의 어느 것의 치환에 의해, 매우 지연된 응집 속도론이 유발되므로, II형 당뇨병의 강력한 억제제로서 할 수 있다. 인비보에서의 아밀로이드 형성은 매우 지연된 프로세스이므로, 생리학적 조건 하에서는 전장 IAPP의 장면에 있어서 이소로이신 또는 로이신을 알라닌으로 치환했을 때에는 원섬유화가 발생하지 않는 것으로 생각된다.
또는 자기응집성 펩타이드, 예를 들면, 배열번호 17, 배열번호 19 및 배열번호 28-30에 보이는 펩타이드 등을 아밀로이드 원섬유화의 강력한 억제제로서 사용할 수 있다. 이것은 그와 같은 펩타이드는 아밀로이드 프래그먼트에 의해 형성되는 호모분자 조합체 만큼은 질서를 가지지 않는 헤테로분자 복합체를 형성할 수 있는 때문이다.
짧은 펩타이드 프래그먼트를 치료에 사용할 때의 큰 장해의 하나는 입체특이적인 세포 프로테아제에 의한 그 단백질 분해적 분해이므로, 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 천연 아미노산의 D-이성체로부터 합성되는 것이 이해된다[즉, 인베르소(inverso) 펩타이드 아날로그, Tjernberg(1997), J. Biol. Chem., 272: 12601-5; Gazit(2002), Curr. Med. Chem., 9: 1667-1675].
더욱, 본 발명의 펩타이드에는 그 레트로 아날로그, 인베르소 아날로그 및 레트로-인베르소 아날로그가 포함된다. 호르몬의 완전한 레트로-인베르소 아날로그 또는 연장된 부분적인 레트로-인베르소 아날로그는 생물학적 활성을 유지 또는 증강하는 것이 일반적으로 발견되어 있다는 것이 이해된다. 레트로-반전화(retor-inversion)는 또 효소억제제의 합리적인 설계의 분야에 적용되고 있다(미국특허 제6261569호를 참조할 것).
본 명세서 중에서 사용되는 "레트로펩타이드"는 본래의 펩타이드 배열과는 반대방향으로 조립되는 L-아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드를 나타낸다.
천연에 존재하는 폴리펩타이드의 레트로 인베르소 개변에서는 α-탄소 입체화학이 대응하는 L-아미노산의 α-탄소 입체화학에 대해 역인 아미노산(즉, D-아미노산 또는 D-allo-아미노산)의 본래의 펩타이드 배열에 대해 역순의 합성적인 조립이 수반된다. 따라서 레트로 인베르소 아날로그는 반전된 말단 및 역방향의 펩타이드 결합을 가지고, 그 한편으로 본래의 펩타이드 배열에서와 같은 측쇄의 토폴로지를 본질적으로 유지하고 있다.
더욱, 아밀로이드 원섬유 형성에서의 주요 논점의 하나는 본래의 형태로부터 적중된 β쇄 구조에의 아밀로이드 폴리펩타이드의 이행이므로, 억제 펩타이드는 바람직하게는 입체효과를 위해 펩타이드 골격을 제약하는 N-메틸화 아미노산을 포함한다[Kapurniotu(2002), 315: 339-350]. 예를 들면, 아미노이소락산(Aib 또는 메틸알라닌)은 짧은 천연 펩타이드에서의 α-나선구조를 안정화하는 것이 알려져 있다. 더욱, N-메틸화는 또 분자 사이의 NH로부터 CO에의 H결합능에 영향을 미치고, 따라서 H결합을 형성하는 상호작용에 의해 안정화되는 다층 β쇄의 형성을 억제한다.
코릴기 등의 유기기를 본 발명의 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 부가하는 것은 치료 펩타이드의 효력 및 생물 이용성(예를 들면, 신경변성질환의 경우에서 혈액 뇌관문의 횡단)을 개선하는 것이 입증되어 있으므로 바람직한 것으로 이해된다[Findeis(1999), Biochemistry, 38: 6791-6800]. 더욱, 전하를 가지고 있는 아미노산을 인식 모티브에 도입하는 것에 의해, 아밀로이드 원섬유의 추가 성장을 억제하는 정전적 반발(electrostatic repulsion)을 생성시킬 수 있다[Lowe(2001), J. Mol. Biol., 40: 7882-7889].
본 명세서 중 상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 또 아밀로이드 관련 질환을 처치하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및/또는 항체는 그 자체로서, 또는 약학적으로 수용 가능한 캐리어와 혼합되어 있는 약학적 조성물의 일부로서 개체에 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 "의약 조성물"은 본 명세서에 기재하는 유효성분의 하나 또는 복수와, 다른 화학성분(예를 들면 생리학적으로 적절한 캐리어 및 부형제)와의 제제를 지칭한다. 의약 조성물의 목적은 생물에의 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본 명세서에 있어서 "유효성분"이라는 용어는 생물학적 효과를 설명할 수 있는 펩타이드 또는 항체 조제물을 지칭한다.
이하, 상호 교환적으로 사용되는 "생리학적으로 수용 가능한 캐리어" 및 "의약적으로 허용 가능한 캐리어"라는 용어는 생물에 대해 현저한 자극의 원인이 되지 않고, 또 투여되는 화합물의 생물활성 및 특성을 억지하지 않는 캐리어 또는 희석제를 지칭한다. 보조제가 이들 용어에 포함된다. 의약적으로 허용 가능한 캐리어에 포함된 성분의 하나는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 유기매체 및 수성매체의 양자에서 광범위한 가용성을 가지는 생체적합성 폴리머일 수 있다[Mutter 등(1979)].
본 명세서에 있어서 "부형제"라는 용어는 유효성분의 투여를 더 용이하게 하기 위해 의약 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류, 다양한 유형의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌글리콜 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
약물의 제제 및 투여에 관한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. (Easton, PA)의 최신판에서 발견할 수 있고, 그것은 참조로서 본 명세서에 도입되었다.
적합한 투여경로로서는 예를 들면 경구 송달, 직장 송달, 경점막 송달, 특히 경비강 송달, 장관 송달 또는 장관외 송달(근육내 주사, 피하 주사, 및 골수내 주사, 및 수강내 주사, 직접 뇌실내 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 비강내 주입, 또는 안내 주사를 포함한다) 등을 포함할 수 있다.
또 전신적인 방법보다도 오히려, 예를 들면 환자의 신체의 특정의 영역에 직접 조제물을 주사하는 국소적인 방법으로 조제물이 투여될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 당 기술분야에서 주지의 방법에 의해, 예를 들면 통상의 혼합, 용해, 조립(granulating), 당의정 제조, 연화(levigating), 유화, 캡슐화, 포괄화(entraping) 또는 동결건조법 등을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 의약 조성물은 유효성분을 의약으로서 사용될 수 있는 제제로 가공하기 쉽게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 또는 복수의 생리학적으로 허용 가능한 캐리어를 사용하여, 재래식 방법에 의해 제제화할 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여경로에 의존한다.
주사의 경우는 수성 용액(바람직하게는 행크스액 또는 생리식염수 완충액 등의 생체적합 완충액)에서 본 발명의 유효성분을 제제화할 수 있다. 경점막 투여의 경우는 침투되는 벽에 적절한 침투제를 제제 중에 첨가한다. 그와 같은 침투제는 당 기술분야에서는 광범위하게 알려져 있다.
경구 투여의 경우는 활성 화합물을 당 기술분야에서 주지된 의약적으로 허용 가능한 캐리어와 혼합하는 것에 의해, 화합물을 용이하게 제제화할 수 있다. 상기 캐리어를 사용하는 것에 의해, 본 발명의 화합물을 환자에 의한 경구 섭취용 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로서 제제화할 수 있다. 경구용 약품은 고형의 부형제를 사용하고, 필요에 따라 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 소망에 의해 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정의 코어를 얻는 것에 의해 제조할 수 있다. 적절한 부형제는 충전제이다. 당류(예를 들면, 락토오스, 스쿠로스, 마니톨 또는 소르비톨), 셀룰로오스 조제물(예를 들면, 옥수수 전분, 소맥 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸드 고무, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 소디움 카르보메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피로리돈(PVP) 등의 생리적으로 허용 가능한 폴리머가 있다. 필요 시, 가교-폴리비닐피로리돈, 한천, 아르긴산 또는 그 염(예를 들면 아르긴산소디움) 등의 붕괴제를 첨가될 수 있다.
당의정의 코어에는 적합한 코팅이 실시된다. 이 목적을 위해 농축 당용액을 사용할 수 있고, 그 당용액은 소망에 의해, 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐피로리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌글리콜, 티타늄 다이옥사이드, 락커 용액, 및 적합한 유기용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 식별을 위해 또는 활성성 분량의 다양한 조합을 특징으로 하기 위해, 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료를 가열 수 있다.
경구 사용이 가능한 의약 조성물에는 젤라틴제의 압입식 캡슐제 및 젤라틴과 가소제(글리세롤 또는 소르비톨 등)로 된 연밀봉 캡슐제가 포함된다. 압입식 캡슐제는 락토오스 등의 충전제, 전분 등의 결합제, 탈크 또는 스테아린산 마그네슘 등의 윤활제, 및 소망에 의해 안정제와 혼합한 유효성분을 포함할 수 있다. 연캡슐제의 경우는 유효성분을 적합한 액체(지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌글리콜 등)에 용해 또는 현탁할 수 있다. 또 안정제를 가할 수 있다. 경구 투여용 제제는 모두 선택된 투여경로에 적합한 투여량이어야 한다.
경구강 점막 투여의 경우, 본 조성물은 재래식 방법에 의해 제제화된 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태를 취할 수 있다.
비강흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 유효성분은 적합한 분사제(예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 또는 이산화탄소)를 사용하여, 가압용기 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 송달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 밸브를 설치하여 계량된 양을 송달하는 것에 의해 결정할 수 있다. 본 화합물과 적합한 분말기제(락토오스 또는 전분 등)와의 분말 혼합물을 포함하는 디스펜서의(예를 들면 젤라틴제) 캡슐 및 카트리지를 처방하는 것도 가능하다.
본 명세서에 기재된 조제물은 예를 들면 볼라스 주사(bolus injection) 또는 지속 주입 등에 의한 비경구 투여용으로 제제화하는 것도 가능하다. 주사용 제제는 예를 들면 앰플 등으로 일회용량 형으로서, 또는 다회용량 용기에 넣어서, 필요에 따라 보존제를 첨가하여 제공할 수 있다. 본 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼인 것이 가능하고, 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제 등의 조제용 약제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 의약 조성물로서, 수용성 활성 조제물의 수용액이 포함된다. 또 유효성분의 현탁액을 적합한 유성 또는 수성 주사 현탁액으로서 조제하는 것도 가능하다. 적절한 친유성의 용매 또는 비히클에는 참기름 등의 지방유, 올레인산 에틸 등의 합성 지방산 에스테르, 트리글리세리드 또는 리포솜 등이 있다. 수용성 주사현탁제는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란 등을 포함할 수 있다. 필요에 따라, 본 현탁제는 고농도 용액의 조제물을 얻을 수 있도록 유효성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 화합물을 더 포함할 수 있다.
또 유효성분은 사용 전에 적절한 비히클(예를 들면 멸균 파이로젠-프리 수(pyrogen-free water)로 구성되는 분말 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 조제물은 예를 들면 통상의 좌약용 기제(카카오 버터 또는 다른 글리세리드 등)을 사용하여, 좌약 또는 정류 관장제 등의 직장용 조성물로 제제화할 수도 있다.
본 발명에서 사용하는 것에 적합한 의약 조성물은 유효성분이 의도된 목적을 달성하는 것에 유효한 양으로 포함된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로는 치료 유효량은 병의 증상을 예방, 완화 또는 개선하는 것에 유효한, 또는 처치되는 대상의 생존을 연장시키는 것에 유효한 유효성분의 양을 의미한다.
치료 유효량을 결정하는 것은 당업자의 능력 범위에 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 조제물에 관하여, 치료 유효량 또는 용량은 우선 인비트로 시험에 의해 추정할 수 있다. 예를 들면, 용량을 동물 모델로 책정할 수 있고, 그와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유효한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재하는 유효성분의 독성 및 치료효력은 표준적인 인비트로 약학적 수법에 의해, 세포배양 또는 실험동물에서 결정할 수 있다. 이들 인비트로, 세포배양 시험 및 동물실험에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 용량범위의 책정에 이용할 수 있다. 투여량은 이용하는 투여경로에 의존하여, 이 범위 내에서 변동할 수 있다. 개개의 의사는 환자의 상태를 고려하여 정확한 처방, 투여경로 및 투여량을 선택할 수 있다(예를 들면 "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (1975) 제1장, 제1쪽의 Fingl 등의 기사를 참조).
처치 대상의 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여는 단회 투여 또는 복수회 투여로 할 수 있다. 이 경우, 처치는 수일-수주간 또는 치유가 달성되거나 질환상태의 경감이 달성될 때까지 지속한다.
투여될 조성물의 양은 물론 처치대상, 병의 중증도, 투여방법, 처방의의 판단 등에 의존될 것이다.
또 적합한 의약 캐리어 내에 조제된 본 발명의 조제물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적합한 용기에 넣고, 표시된 상태의 처치에 관한 라벨을 붙일 수 있다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라, 유효성분을 포함하는 하나 또는 복수의 단위 제형을 함유하는 팩(pack) 또는 디스펜서 장치, 예를 들면 FDA 인가 키트로서 제공할 수 있다. 팩은 예를 들면 블리스터 팩과 같은 금속박 또는 플라스틱 박을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 설명서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 지정된 형식으로 용기에 첨부된, 조성물의 형상 또는 인간 또는 동물에의 투여에 관한 당국의 인가를 보이는 통지가 첨부될 수 있다. 그와 같은 통지는 예를 들면 처방약에 관하여 미국 식품 의약품국에 의해 허가된 라벨, 또는 허가된 첨부 서류일 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 항체는 또 본 명세서 중 상기에 기재되는 임의의 적합한 투여 양식을 이용하여 개체에 투여된 핵산 구축물로부터 발현시킬 수 있다는 것이 이해된다(즉, 인비보 유전자 치료). 또는 핵산 구축물이 적절한 유전자 송달 비히클/방법(트랜스펙션, 형질도입, 상동 재조합 등) 및 필요에 따라 발현 시스템에 의해 적합한 세포에 도입되고, 그 후 개변된 세포가 배양액 중에서 확대되고, 개체로 복귀된다(즉,엑스비보 유전자 치료).
본 발명의 펩타이드 또는 항체의 세포발현이 가능해지도록, 본 발명의 핵산 구축물은 더욱 적어도 하나의 시스 작용(cis acting) 조절 엘리먼트를 포함한다. 본 명세서 중에서 사용되는 표현 "시스 작용 조절 엘리먼트"는 트랜스 작용 조절 인자와 결합하고, 그 하류에 위치하는 코드 배열의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 배열(바람직하게는 프로모터)을 나타낸다.
임의의 이용 가능한 프로모터가 본 발명의 방법론에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 핵산 구축물에 의해 이용되는 프로모터는 형질전환된 특정의 세포집단에 있어서 활성을 가진다. 세포 유형 특이적 및/또는 조직 특이적인 프로모터의 예에는 간장 특이적인 알부민 등의 프로모터[Pinkert외(1987), Genes Dev., 1: 268-277], 임파구 특이적 프로모터[Calame외(1988), Adv. I mMunol., 43: 235-275], 특히 T세포 수용체의 프로모터[Winoto외(1989), EMBO J., 8: 729-733] 및 면역글로블린의 프로모터[Banerji외(1983), Cell, 33729-740], 뉴런 특이적 프로모터, 예를 들면, 뉴로필라멘트 프로모터[Byrne외(1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5473-5477] 등, 췌장 특이적 프로모터[Edlunch외(1985), Science, 230: 912-916], 또는 유선 특이적 프로모터, 예를 들면, 유청(milk whey) 프로모터(미국특허 제4873316호 및 유럽 특허출원 공개 제264166호) 등이 포함된다. 본 발명의 핵산 구축물은 더 인핸서(enhancer)를 포함할 수 있고, 인핸서는 프로모터 배열의 근접부 또는 원거리에 존재시키는 것이 가능하고, 프로모터로부터의 전사를 업레귤레이션(up regulation)하도록 기능할 수 있다.
본 발명의 방법론의 구축물은 바람직하게는 적절한 선택 마아커 및/또는 복제 기점을 더 포함한다. 바람직하게는 이용되는 구축물은 셔틀 벡터(shuttle vector)고, 이것은 대장균(이 경우, 구축물은 적절한 선택 마아커 및 복제 기점을 포함한다)에서 함께 증식할 수 있고, 세포에서의 증식, 선택된 유전자 및 조직에서의 융합을 위한 적합성을 가질 수 있다. 본 발명에 의한 구축물은 예를 들면, 플라스미드, 백미드, 파지미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다.
현재 바람직한 인비보 핵산 도입기술에는 아데노 바이러스, 렌티 바이러스, I형 단순 헤르페스 바이러스 또는 아데노 수반 바이러스(AAV), 및 지질에 기초한 시스템 등의 바이러스 구축물 또는 비바이러스 구축물에 의한 트랜스펙션이 포함된다. 유전자의 지질 매개 도입을 위한 유용한 지질은 예를 들면 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다[Tonkinson외, Cancer Investigation, 14(1) : 54-65(1996) ]. 유전자 치료에 있어서 사용되는 가장 바람직한 구축물은 바이러스이고, 가장 바람직하게는 아데노 바이러스, AAV, 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스이다. 레트로 바이러스 구축물 등의 바이러스 구축물은 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자 좌규정(locus-defining) 엘리먼트(하나 또는 복수), 또는 선택적 스플라이싱(splicing), 핵RNA의 핵외 수송(export), 또는 메신저의 번역 후 수식 등의 다른 수단에 의해 유전자 발현을 조절하는 다른 엘리먼트를 포함한다. 그와 같은 벡터 구축물은 또 바이러스 구축물에 이미 존재하지 않는 경우, 패키징 시그널(packaging signal), 장말단반복(long terminal repeats; LTRs) 또는 그 일부, 그리고 사용되는 바이러스에 대하여 적절한 플러스 쇄 프라이머(positive strand primer) 결합부위 및 마이너스 쇄 프라이머 결합부위를 포함한다. 더욱, 그와 같은 구축물은 전형적으로는 펩타이드 또는 항체를 이들이 존재하는 숙주 세포로부터 분비시키기 위한 시그널 배열을 포함한다. 바람직하게는 이 목적을 위한 시그널 배열은 포유동물의 시그널 배열이다. 경우에 따라, 구축물은 또 폴리아데닐화를 실행하는 시그널, 및 하나 이상의 제한부위, 및 번역 종결 배열을 포함할 수 있다. 예로서, 그와 같은 구축물은 전형적으로는 5'LTR, tRNA 결합부위, 패키징 시그널, 제2쇄 DNA합성의 기점, 및 3'LTR 또는 그 일부를 포함한다. 비바이러스인 다른 벡터를 사용할 수 있다(예를 들면, 캐티온성 지질, 폴리리신 및 덴드리머 등).
본 발명의 펩타이드의 자기응집성을 위해, 그와 같은 펩타이드는 또 생물학적 샘플에서의 아밀로이드 원섬유/플레이크의 강력한 검출제로서 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 이것은 특징적인 신경원섬유 변화(NFT) 및 신경염성 플레이크에 대하여 뇌 조직의 사후조사(postmortem examination) 후에만 명확한 진단이 가능한 알츠하이머병 등의 아밀로이드 관련 질환에 있어서 특히 중요하다.
따라서 본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 생물학적 샘플에서의 아밀로이드 원섬유의 존재 또는 존재하지 않는 것을 검출하는 방법이 제공된다.
이 방법은 생물학적 샘플을 아밀로이드 원섬유와 공응집(co-aggregating)할 수 있은 본 발명의 펩타이드와 함께 인큐베이션하고, 그 후 그 펩타이드를 검출함으로써 생물학적 샘플에서의 아밀로이드 원섬유의 존재 또는 비존재를 검출하는 것에 의해 실행된다.
입체배좌적인 집합체(conformational ensembles)를 인식할 수 있는 다양한 펩타이드 시약이 이 분야에서 공지되어 있고, 그 일부가 Bursavich(2002), J. Med. Chem., 45(3) : 541-58; Baltzer, Chem. Rev., 101(10) : 3153-63에 총설되어 있다.
검출을 위해 이용되는 생물학적 샘플은 임의의 신체 샘플, 예를 들면 혈액(혈청 또는 혈장 등), 타액, 복수, 흉수, 소변, 생검시료, 단리된 세포, 및/또는 세포막 조제물 등일 수 있다. 조직 생검물 및 체액을 포유동물로부터 얻는 다양한 방법이 이 분야에서는 광범위하게 알려져 있다.
본 발명의 펩타이드는 응집물 형성을 위해 적합한 조건(즉, 완충액, 온도, 인큐베이션 시간 등) 하에서 생물학적 샘플과 접촉된다. 예를 들면, 적합한 조건이 실시예의 절의 실시예 2에 기재된다. 생물학적 샘플과의 인큐베이션 전에 펩타이드를 사전에 응집시키지 않기 위한 다양한 대책이 취해진다. 이 목적을 위해 새로운 조제된 펩타이드 스톡이 바람직하게 사용된다.
생물학적 샘플 내의 단백질 복합체를 이 분야에서 알려져 있는 몇 개의 방법 중의 어느 하나에 의해 검출할 수 있고, 그와 같은 방법에서는 생화학적 및/또는 광학적인 검출 방법을 이용할 수 있다.
복합체의 검출을 용이하게 하기 위해, 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 태그 또는 항체에 의해 표지(highlighted)된다. 표지화는 표지화방법에 의존하여 응집체 형성 전에, 또는 응집체 형성과 동시에, 또는 응집체 형성의 후에 실행할 수 있다는 것이 이해된다. 본 명세서 중에서 사용되는 용어 "태그"는 정량 가능한 활성 또는 특성을 보이는 분자를 말한다. 태그는 플루오레세인(fluorescein) 등의 화학적 형광체, 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질 등의 폴리펩타이드 형광체(www. clontech. com)를 포함하는 형광성 분자일 수 있다. 이 경우, 태그는 적합한 여기광(excitatory light)을 적용할 때에 발생하는 그 형광에 의해 정량할 수 있다. 또는 태그는 에피토프 태그, 즉 특이적인 항체가 다른 세포 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않고 결합할 수 있는 극히 특유의 폴리펩타이드 배열일 수 있다. 그와 같은 에피토프 태그에는 Myc 태그, Flag 태그, His 태그, 로이신 태그, IgG 태그, 스트렙타비딘 태그 등이 포함된다.
또는 응집물의 검출을 본 발명의 항체에 의해 행할 수 있다.
따라서 본 발명의 이 관점에 의해, 아밀로이드 원섬유를 포함하는 것이 의심되는 신체 조직 또는 체액 등의 생물학적 샘플을 시험 또는 스크리닝하는 방법이 제공된다.
그와 같은 검출방법은 또 아밀로이드 침착의 예방 또는 분해에 있어서 유용한 강력한 약물을 발견하기 위한 시험에서 이용될 수 있는 것이 이해된다. 예를 들면, 본 발명은 시험 화합물의 고처리능(high throughput) 스크리닝을 위해 할 수 있다. 전형적으로는 본 발명의 공응집하는 펩타이드는 시험체적을 감소시키기 위해 방사표지(radiolabeled)된다. 그 후, 경합 시험이 시험 화합물에 의한 표지의 치환을 모니터하는 것에 의해 행해진다[Han(1996), J. Am. Chem. Soc., 118: 4506-7; Esler(1996), Chem. 271: 8545-8].
본 발명의 펩타이드는 또 인비보에서의 아밀로이드 침착의 강력한 검출제로서 사용될 수 있는 것이 이해된다. 아밀로이드 침착물과 결합할 수 있는 설계된 펩타이드는 비방사능적으로 표지되거나, 또는 방사성 동위체로 표지되고, 이 분야에서 광범위하게 알려져 있는 바와 같이, 본 명세서 중 상기에 논의된 아밀로이드 관련 질환의 발증 또는 존재를 진단하기 위해 개체에 투여할 수 있다. 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드양(amyloid-like) 침착물에 대한 그와 같은 표지된 펩타이드의 투여 후의 결합을 이 분야에서 알려져 있는 인비보 이미지화 기술에 의해 검출할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 진단 키트 또는 치료 키트에 포함될 수 있다. 예를 들면, 특정의 질환관련 단백질 또는 그것에 대한 항체의 펩타이드 세트를 적절한 완충액 및 보존제와 함께 하나 이상의 용기에 포장할 수 있고, 그리고 진단을 위해, 또는 치료적 처치를 행하기 위해 사용할 수 있다.
따라서 펩타이드는 각각을 단일의 용기에서 혼합할 수 있고, 또는 각각을 개개의 용기에 넣는 것이 가능하다. 바람직하게는 용기는 라벨을 포함한다. 적합한 용기로서는 예를 들면 병, 바이얼, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 재료로 형성될 수 있다.
더욱, 안정화제, 완충제, 차단제 등의 다른 첨가제도 가할 수 있다.
그와 같은 키트의 펩타이드는 또 비이즈(beads), 어레이 기체(array substrate; 예를 들면, 칩) 등의 고체 지지체에 결합시키는 것이 가능하고, 진단목적을 위해 사용할 수 있다.
키트에 포함되거나, 또는 기체에 고정화되는 펩타이드는 본 명세서 중 상기에 기재되는 바와 같은 검출가능한 표지에 결합시킬 수 있다.
키트는 또 시험된 대상이 목적으로 하는 아밀로이드 폴리펩타이드에 관련되는 상태, 이상 또는 질환에 걸려 있는지의 여부, 또는 그와 같은 상태, 이상 또는 질환을 발증하는 위험성을 가지는지의 여부를 입증하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적, 이점, 및 신규의 특징은 제한을 의도하지 않는 이하의 실시예의 실험에 의해 당업자에게 자명하다. 더욱, 상기의 본 발명 및 이하의 특허청구의 범위에 기재된 각각의 다양한 실시형태 및 태양은 이하의 실시예의 실험에 의해 지지된다.
실시예
여기서는 상기 설명과 함께 이하의 실시예를 참조하여 비한정적 형식으로 본 발명을 예시한다.
일반적으로, 본 명세서 중에서 사용된 용어 및 본 발명에서 사용된 실험 수순에는 분자, 생화학, 미생물학, 및 재조합 DNA의 기술이 포함된다. 이와 같은 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들면, "Molecular Cloning: A laboratory Manual", Sambrook외, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology", 제I-III권, Ausubel,R. M. 편(1994); Ausubel외, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland, (1989); Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley&Sons, New York, (1988); Watson외, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 외편, "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 제1-4권, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1998); 미국특허 제4666828호, 동 제4683202호, 동 제4801531호, 동 제5192659호, 및 동 제5272057호에 기재된 방법; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", 제I-III권, Cellis,J. E. 편, (1994); "Current Protocols in I mMunology", 제I-III권, Coligan J. E. 편, (1994); Stites 외편, "Basic and Clinical I mMunology", 제8판, Appleton&Lange, Norwalk,CT, (1994); Mishell and Shiigi 편, "Selected Methods in Cellular I mMunology", W. H. Freeman and Co., New York, (1980)을 참조할 것; 이용 가능한 면역 시험은 특허 및 화학 논문에 광범위하게 기재되어 있고, 예를 들면, 미국특허 제3791932호, 동 제3839153호, 동 제3850752호, 동 제3850578호, 동 제3853987호, 동 제3867517호, 동 제3879262호, 동 제3901654호, 동 제3935074호, 동 제3984533호, 동 제3996345호, 동 제4034074호, 동 제4098876호, 동 제4879219호, 동 제5011771호, 및 동 제5281521호; "Oligonucleotide Synthesis", Gait,M. J. 편, (1984); "Nucleic Acid Hybridization", Hames,B. D. and Higgins S. J. 편, (1985); "Transcription and Translation", Hames,B. D. and Higgins S. J. 편, (1984); "Animal Cell Culture", Freshney,R. I. 편, (1986); "I mMobilized Cells and Enzymes", IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning", Perbal,B., (1984) 및 "Methods in Enzymology", 제1-317권, Academic Press, "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego,CA, (1990); Marshak외, "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual", CSHL Press, (1996) (그 전체가 본 명세서 중에 완전히 기재되어 있는 것과 같은 참조로서 원용된다)를 참조할 것. 다른 일반적 인용례를, 본 명세서 중에 기재한다. 인용례 중의 수순은 당해 분야에서 주지인 것으로 생각되고, 독자의 편의를 위해 기재한다. 인용례 중에 포함된 모든 정보는 본 명세서 중에서 참고로서 원용된다.
(실시예 1)
hIAPP기본 아밀로이드 형성 유닛의 알라닌 스캔-원리 및 펩타이드 합성
췌장 아밀로이드는 II형 당뇨병 환자의 95% 이상에 발견된다. 췌장 아밀로이드는 37 아미노산 길이의 소도 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP, GenBank 억세션 번호gi: 4557655)의 응집에 의해 형성되고, 그 세포독성이 질환의 발달에 직접 적으로 관련하고 있다. IAPP아밀로이드의 형성은 가용성 IAPP로부터 응집β-시이트에의 입체배좌의 이행을 개재하여 진행하는 핵 형성에 의존된 중합 프로세스에 따른다. 근년, IAPP의 헥사펩타이드(22-27) (NFGAIL, 배열번호 111) (이것은 또 "기본 아밀로이드 형성 유닛"이라 불린다.)가 β-시이트 함유 아밀로이드 원섬유의 형성에 충분하다는 것이 설명되어 있다[Konstantinos외(2000), J. Mol. Biol., 295: 1055-1071].
이 "기본 아밀로이드 형성 유닛"을 구성하는 잔기의 특이적인 역할에 대한 더욱 통찰을 얻기 위해, 체계적인 알라닌 스캔을 행하였다. 그 소수성 또는 β-시이트 구조를 형성하는 경향을 크게 변화시키지 않고, 펩타이드의 분자 경계를 특이적으로 변화시키기 위해 아미노산을 알라닌으로 치환하였다. 알라닌 스캔이 인간 IAPP에 특유한 구역(block)에 대해 실행되었다(도 3a). 이 구역에는 전장 폴리펩타이드에 있어서 NFGAIL모티브의 후에 2개의 세린 잔기가 포함된다. 이들 8 개의 아미노산의 펩타이드 배열이 사용되었다. 이것은 이것보다도 짧은 펩타이드는 소수성이고, 그러므로 용해성이 낮기 때문이다. 도 3b는 야생형 펩타이드의 화학구조의 개략도를 도시하고, 한편, 도 3c는 제조된 다양한 변이형 펩타이드에서의 아미노산 치환을 나타낸다.
방법 및 시약 - 펩타이드 합성을 PeptidoGenic Research&Co. Inc. (Livermore, CA, 미국)에 의해 실행하였다. 펩타이드 배열 동일성이 Perkin Elmer Sciex API I분광계를 사용하여 이온 스프레이 질량분석법에 의해 확인되었다. 펩타이드의 순도를, 물 및 0.1% 트리플루오로 초산(TFA)에서의 10%로부터70%에의 아세토니트릴의 직선구배를 사용하여, C18컬럼에서의 역상 고압액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 확인하였다.
(실시예 2)
탁도측정에 의해 모니터되었을 때의 IAPP 펩타이드 프래그먼트 및 변이형유도체의 응집의 속도론
IAPP 펩타이드유래 프래그먼트의 자기조합을 연구하기 위해, 응집 및 불용화의 속도론을 405 nm에서의 탁도 측정을 사용하여 모니터하였다.
속도론적 응집 시험 - 새로운 펩타이드 스톡 용액을 동결건조 형태의 펩타이드를 DMSO(분해용매)에 100 mM의 농도로 용해시키는 것에 의해 조제하였다. 모든 사전 응집을 피하기 위해 새로운 스톡 용액을 실험 전에 매회 그리고 모든 실험에 대해 조제하였다. 펩타이드 스톡 용액은 시험 완충액에 희석되고, 96웰 플레이트에 하기와 같이 넣었다: 2μl의 펩타이드 스톡 용액이 98μl의 10 mM Tris(pH 7.2)에 가해지고, 2% DMSO의 존재 하에서의 펩타이드의 2 mM의 최종농도로 하였다. 탁도 데이터를 405 nm에서 측정하였다. 2% DMSO를 포함하는 완충 용액이 블랭크(blank)로서 사용되었다. 탁도가 수 개의 시간점에 대하여 실온에서 측정되었다.
결과 - 도 4a에 보이는 바와 같이, 야생형 펩타이드 프래그먼트(배열번호 1)는 접종되지 않은 hIAPP 헥사펩타이드에 대하여 이전에 보고된 프로필과 매우 유사한 응집 속도론 프로필을 보였다[Tenidis외(2000), J. Mol. Biol., 295: 1055-71]. 그와 같은 프로필은 핵 형성에 의존된 중합기구[Jarrett 및 Lansbury(1992), Biochemistry, 31: 6865-70]를 강하게 나타낸다. 20 분의 지연시간의 후, 야생형 펩타이드는 불용성 원섬유에 자기조합하였다. 펩타이드G3A(배열번호 4)는 야생형 펩타이드의 프로필과 본질적으로 동일한 프로필을 보였다. N1A 펩타이드(배열번호 2)는 야생형 펩타이드의 프로필과 비교한 경우, 상이한 속도론 프로필을 가짐에도 불구하고, 보다 큰 응집 속도론을 매개하였다. 흥미롭게도, N1A의 응집은 핵 형성 의존성이 보다 작은 것 같았다. 이소로이신 또는 로이신의 알라닌에의 치환(각각, 펩타이드I5A(배열번호 5) 및 펩타이드L6A(배열번호 6))은 응집 속도론을 저하시켰으나, 응집 속도론을 완전히 폐지하지는 않았다. 페닐알라닌 잔기의 알라닌에의 치환(펩타이드 F2A, 배열번호 3)은 펩타이드의 응집능의 완전한 상실을 초래하였다. F2A 펩타이드는 수계 시험 완충액에서 완전히 가용성이었다.
정리하면, 아밀로이드 형성 프래그먼트의 속도론적 응집연구에 의해, IAPP의 활성 프래그먼트에 의한 아밀로이드 형성 프로세스에서의 페닐알라닌 잔기에 대한 큰 역할이 시사되었다.
(실시예 3)
응집물의 평균 입자 크기의 측정
탁도 시험은 다양한 펩타이드의 응집능 및 속도론에 관하여 중요한 평가를 제공하는 한편, 형성된 실제의 응집물의 크기에 관한 정보를 제공하지 않았다. 아밀로이드 구조의 겉보기 유체역학적 직경은 아밀로이드 구조의 불규칙성을 위해 변화하지만, 그것에도 불구하고, 형성된 구조의 크기의 정도에 관한 명백한 표시(indication)를 제공할 수 있고, 또 다양한 펩타이드에 의해 형성되는 구조를 비교하기 위한 양적인 기준을 제공할 수 있다.
따라서 다양한 펩타이드에 의해 형성된 응집물의 평균크기를 동적 광산란(DLS) 실험을 사용하여 측정하였다.
방법 - 농도가 10 mM로 새롭게 조제된 펩타이드 스톡 용액을 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에 희석하고, 더욱 0.2μm의 필터로 여과하여, 100μM 펩타이드 및 1% DMSO의 최종농도로 하였다. 입자 크기 측정이 레이저광원의 ALV-NIBS/HPPS 비침습적 후방산란장치를 이용하여 실행되었다. 자동보정 데이터가 평균 겉보기 유체역학적 직경을 얻기 위해, ALV-NIBS/HPPS 소프트웨어를 사용하여 적합(fit)되었다.
결과 - 다양한 펩타이드에 의해 형성된 구조체의 평균 겉보기 유체역학적 직경을 도 5에 도시한다.
정리하면, 다양한 펩타이드에 의해 형성된 구조체의 겉보기 유체역학적 직경은 탁도 시험에 의해 얻어진 결과와 일치하고 있는 것 같았다. 탁도 시험의 경우와 같은 야생형 펩타이드 및 G3A 펩타이드는 매우 유사한 유체역학적 직경의 입자를 형성시켰다. 보다 작은 구조를 N1A, I5A 및 L6A의 유도체 펩타이드에 관하여 관측하였다. 따라서 탁도 시험과 일치하여 DLS실험은 큰 입자가 표시된 실험조건 하에서 F2A 펩타이드에 의해 형성되지 않았다는 것을 명료하게 보여준다.
(실시예 4)
콩고 레드(CR) 결합 시험에 의한 야생형 펩타이드 및 유도체의 아밀로이드 형성능의 시험
편광현미경 관찰과 조합된 콩고 레드(CR) 염색을 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 형성성을 시험하기 위해 사용하였다. 아밀로이드 원섬유는 일반적으로 특히 원섬유IAPP는 CR과 결합하고, 금색/녹색의 복굴절을 편광 하에서 나타낸다[Cooper(1974), Lab. Invest., 31: 232-8; Lansbury(1992), Biochemistry, 31: 6865-70].
방법 및 시약 - 10 mM의 Tris 완충액(pH 7)으로 4 일간 인큐베이션된 펩타이드 용액을 유리제의 현미경 슬라이드 유리 위에서 건조시켰다. 염색을 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2) 내에 1 mM의 CR을 가하고, 그 후 1 분간 인큐베이션하는 것에 의해 실행하였다. 과잉의 CR을 제거하기 위해, 슬라이드 유리를 2회 증류수로 세정하고, 건조시켰다. 80% 에탄올(v/v)에 용해시킨 포화 CR 용액을 응집성이 나쁜 펩타이드에 대하여 사용하였다. 이 경우, 염색은 세정하지 않고 실행하였다. 복굴절이 편광 스테이지를 구비한 WILD Makroskop m420(x70)를 사용하여 측정되었다.
결과 - 야생형, N1A 및 G3A의 펩타이드는 CR과 결합하여, 특징적인 녹색/금색의 복굴절을 보였다(통상의 장(field)에 대하여는 도 6g, 도 6a 및 도 6e를, 그리고 편광 하에서의 현미경 관찰에 대하여는 도 6h, 도 6b 및 도 6f를 각각 참조할 것). I5A 및 L6A의 펩타이드는 CR과 결합하고, 그리고 드물기는 했지만 특징적인 복굴절을 보였다(통상의 장에 대하여는 각각 도 6i 및 도 6k, 그리고 편광에 대하여는 각각 도 6j 및 도 6l를 참조할 것). 펩타이드 F2A(NAGAIL)는 CR 결합능을 보이지 않았다(통상의 장에 대하여 도 6c, 그리고 편광에 대하여는 도 6d). CR로 염색한 건조 후의 완충 용액이 음성 대조(negative control)로서 사용되었다(통상의 광 및 편광에 대하여 도 6m 및 도 6n을 각각 참조할 것). 흥미롭게도, 결합성의 큰 차이가 음성 대조 및 F2A 펩타이드에 대하여는 관찰되지 않았다.
F2A 펩타이드는 원섬유를 형성할 수 없는 것을 실증하기 위해, 14 일간 인큐베이션된 펩타이드 용액을 결합 시험에서 사용하였다. 어느 정도의 응집이 2 주간에 걸친 펩타이드의 "시효(aging)" 후에 육안에 의해 관찰되었으나, CR 염색은 아밀로이드 구조를 전혀 보이지 않았다(결과는 생략). 동일한 조건의 하에서 야생형 펩타이드의 인큐베이션은 현저한 CR 복굴절을 초래하였다.
(실시예 5)
원섬유 형성의 펩타이드 및 변이형의 초미세 구조분석
다양한 펩타이드의 잠재적 원섬유 형성능을 전자현미경 관찰분석에 의해 평가하였다.
방법 - 펩타이드 용액(10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 2 mM의 펩타이드)을 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 원섬유 형성을 200 메시의 구리 그리드(grids)에 설치하고, 카본 안정화 포름바르 필름(SPI Supplies, West Chester, PA)으로 피복된 10μl의 샘플을 사용하여 평가하였다. 20-30 초의 인큐베이션 후, 과잉의 액체를 제거하고, 그리드를 2% 초산 우라닐 수용액으로 네거티브 염색하였다. 샘플을 80kV로 가동하는 JEOL 1200EX 전자현미경으로 조사하였다.
결과 - 다양한 펩타이드에 의해 형성된 구조를 추가의 특징이 되도록 하기 위해, 네거티브 염색의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 이전의 결과와 일치하여, 필라멘트 구조가 무정형(amorphous)의 원섬유를 발생시킨 F2A(도 7b)를 제외하고 모든 펩타이드에 대하여 관찰되었다(도 7a - 도 7f). I5A 펩타이드 및 L6A 펩타이드에 의해 형성된 원섬유(각각, 도 7e 및 도 7f)의 출현빈도는 야생형 펩타이드(도 7d), N1A 펩타이드 및 G3A 펩타이드(각각, 도 7a 및 도 7c)의 출현빈도와 비교하여 낮았다. F2A, I5A 및 L6A의 펩타이드에 대하여 보여지는 EM장은 드물게 관찰되지 않았지만, 이들 이미지에 의해 제시된 결과는 앞에 제시된 양적 결과를 지지하고, 따라서 원섬유 형태학의 정성적 분석을 제공하고 있다.
야생형, N1A 및 G3A의 펩타이드에 대하여 관찰된 뒤얽힌 망상구조는 이들 원섬유의 신속한 형성 속도론에 의해 설명될 수 있다 (실시예 2 참조). 보다 명확한 구조 및 보다 긴 원섬유가 낮은 빈도에도 불구하고, I5A 펩타이드 및 L6A 펩타이드에 대하여 관찰되었다. 이들보다 긴 원섬유는 보다 질서있는 원섬유의 조직화를 가능에 하는 보다 지연된 속도론의 결과일 수 있다.
정리하면, 전자현미경 관찰 및 CR분석의 정성적 결과는 헥사아밀로이드 펩타이드에서의 페닐알라닌 잔기가 그 아밀로이드 형성능을 위해 매우 중요하다는 것을 강하게 시사하고 있다.
(실시예 6)
hIAPP의 기본 아밀로이드 형성 유닛에서의 인식 도메인의 매핑(mapping)-원리 및 MBP-IAPP 융합 단백질 합성
잠재적인 인식 도메인을 체계적으로 매핑 및 비교를 위해, hIAPP의 배열 전체에 걸친 28 개의 멤브레인 스폿(membrane-spotted)의 중복하는 펩타이드(즉, hIAPP1-10, hIAPP2-11,..., hIAPP28-37)의 어레이와 상호작용하는 hIAPP(GenBank 억세션 번호gi: 4557655)의 능력을 검토하였다[Mazor(2002), J. Mol. Biol., 322: 1013-24].
재료 및 실험 수순
세균주 - 대장균주TG-1(Amersham Pharmacia, 스웨덴)을 분자 클로닝 및 플라스미드 증식을 위해 사용하였다. 세균주BL21(DE3) (Novagen, 미국)을 단백질 과발현을 위해 사용하였다.
합성 IAPP 및 MBP-IAPP 융합 단백질의 조작 - 세균의 코돈 사용을 포함하도록 개변된 인간 IAPP의 합성 DNA 배열(배열번호 58)이 8 개의 중복하는 프라이머(배열번호 50-57)를 어닐링하는 것에 의해 제조되었다. PCR이 95℃에서 1 분간, 55℃에서 1 분간 및 72℃에서 1 분간의 30 사이클에 의해 실행되었다. 어닐링 생성물을 연결하고, IAPP1프라이머(배열번호 50) 및 IAPP8프라이머(배열번호 57)를 사용하여 증폭하였다. 그 후, MBP-IAPP(MBP GenBank 억세션 번호gi: 2654021) 융합배열을 IAPP합성 펨플레이트를 사용하여 구축하고, 그 후 이 펨플레이트를 YAR2(배열번호 60) 프라이머 및 YAR1프라이머(배열번호 59)를 사용하여 증폭하고, 그것에 의해 V8 Ek 절단부위 및 (His)6 태그를 IAPP의 N 말단에 삽입하였다. 2개의 프라이머는 NotI 및 NcoI의 클로닝 부위를 각각 포함하였다. 얻어진 PCR산물을 NcoI 및 NotI로 소화하고, pMALc2x-NN 발현 벡터에 연결하였다. pMALc2x-NN 발현 벡터는 pMALc-NN19의 폴리 링커 부위를 pMALc2x(New England Biolabs, 미국)에 클론화하는 것에 의해 구축하였다[BACH(2001), J. Mol. Biol., 312: 79-93].
단백질의 발현 및 정제 - 강한 Ptac 프로모터의 하류에 MBP-IAPP를 코드하는 발현 플라스미드 pMALc2x-IAPP에 의해 형질전환된 대장균 BL21 세포를 100μg/ml의 암피실린 및 1% (W/V)의 글루코스를 보충한 200ml의 LB배지에서 생육시켰다. A600=0.8의 광학밀도에 도달하면 단백질의 발현이 30℃에서 3 시간의 0.1 mM 또는 0.5 mM의 IPTG에서 유도되었다.
세포 추출물을 이전의 기재[Gazit(1999), J. Biol. Chem., 274: 2652-2657]와 같은 동결-융해, 그 후의 단시간의 초음파처리를 사용하여 20 mM의 Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM의 EDTA, 200 mM의 NaCl, 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma) 내에서 조제하였다. 단백질 추출물을 20,000g에서의 원심분리에 의해 청징화하고, 4℃에서 보존하였다. MBP-IAPP 융합 단백질을 추출물을 아밀로즈 수지 컬럼(New England Biolabs, 미국)에 통과시키는 것에 의해 정제하고, 동일한 완충액에서의 20 mM의 말토오스에 의한 용출에 의해 회수하였다. 정제된 MBP-IAPP는 4℃에서 보존하였다. 단백질농도를 BSA 표준의 Pierce Coomassie 플러스 시약(Pierce, 미국)을 사용하여 측정하였다. MBP 및 MBP-IAPP의 단백질 획분을 SDS/12% 폴리아크릴 아미드겔로 분석하고, 겔을 GelCode Blue(Pierce, 미국)로 염색하였다.
MBP-IAPP 내의 디설파이드 결합이 산화되어 있는지의 여부를 조사하기 위해 정제된 MBP단백질 및 MBP-IAPP 단백질을 5 당량의 N-요오드아세틸-N'-(8-설포-1-나프틸)에틸렌디아민(IAEDANS) (Sigma, Rehovot, 이스라엘)과 암실에서 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 유리된 색소를 표지된 단백질로부터 QuickSpin G-25 Sephadex 컬럼에서의 겔여과 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 그 후, MBP 및 MBP-IAPP의 형광을 측정하였다. 작은 형광 표지화만이 검출되었다(평균하여, 단백질 분자당 0.1 미만의 프로브 분자). MBP 및 MBP-IAPP의 표지화의 사이에는 큰 차는 확인되지 않았다. 이것은 발현된 IAPP분자에서의 디설파이드 가교는 대부분이 산화되어 있다는 것을 시사하였다.
결과
재조합 MBP-IAPP의 발현 및 정제 - 완전한 hIAPP를 세균에서 발현시키는 이전의 시도는 성공하지 못했으므로, 단백질은 hIAPP를 발현시에 불필요한 응집으로부터 보호하는 MBP 융합체로서 발현되었다[Bach(2001), J. Mol. Biol., 312: 79-93]. 융합 단백질의 합성은 도 8a에 보이는 바와 같은 세균의 코돈 사용빈도를 사용하여 실행되었다. 얻어진 융합배열을, 도 8b에 보이는 바와 같은 pMALc2x-NN에 클론화하여, 대장균BL21(DE3)에 도입하였다. 생육조건, 세포 추출물 조제 및 단백질 정제는 본 명세서 중 상기에 기재한 바와 같이 실행하였다. IPTG에 의한 유도에 의해 가용성 획분에서의 고 레벨의 MBP-IAPP의 축적이 초래되고, 5% 미만의 MBP-IAPP 융합 단백질이 세포 추출물의 불용성 획분에서 발견되었다(데이터는 표시되지 않음). MBP 및 MBP-IAPP의 전형적인 정제공정으로부터 얻어진 일부분을 도 9에 도시한다. 도시되는 바와 같이, GelCode Blue로 염색한 SDS/폴리아크릴 아미드겔을 덴시토미터로 스캔하는 것에 의해 계산하면, 48 kDa의 MBP-IAPP가 총 가용성 단백질의 25%까지 축적되었다. 진동 플라스크에서 30℃에서 유도하면(A600=2.0), MBP-IAPP가 1L의 세포배지 당 약 150 mg의 레벨로 세포질에 가용성 단백질로서 축적되었다. 정제시의 상실에도 불구하고, MBP-IAPP가 80 mg/l세포의 수율(yield)로 거의 균일하게 정제되었다. IAPP의 추가 적용 및 편리한 균일성 정제를 위해, MBP 태그를 제거하기 위한 Xa 인자 절단부위에 더하여, His-Tag도 포함되었다(도 8b). 이 His-Tag는 IAPP배열의 N 말단의 Lys 잔기에서의 EkV8 절단에 의해 제외할 수 있고, 이것에 의해 야생형 IAPP의 방출이 얻어질 수 있다.
(실시예 7)
hIAPP 폴리펩타이드에서의 분자 인식 배열의 동정
IAPP 펩타이드 배열의 구축 - hIAPP1-37의 연속된 중복 배열에 대응하는 데카마(배열번호 61-88)를 SPOT 기술(Jerini AG, Berlin, 독일)을 사용하여 셀룰로오스 멤브레인 매트릭스 위에서 합성하였다. 펩타이드는 C 말단의 아미노산을 개재하여 Whatman50셀룰로오스 지지체(Whatman, Maidstone, 영국)에 공유결합시켰다. 펩타이드 분해에 대한 안정성이 보다 크고, 생래적인 인식 모티브의 제시가 보다 양호하므로, N 말단의 아세틸화는 펩타이드스캔을 위해 사용되었다.
펩타이드 합성 - 펩타이드 합성이 Peptron,Inc. (Taejeon, 한국)에 의해 실행된 고상 합성법을 사용하여 실행되었다. 펩타이드 배열의 정확성을 HP1100 시리이즈 LC/MSD[Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA]를 사용하여 이온 스프레이 질량분석법에 의해 확인하였다. 펩타이드의 순도를 물 및 0.1% 트리플루오로 초산(TFA)에서의 0% - 100%의 아세토니트릴의 30 분 직선구배를 1ml/분의 유속으로 사용하여, C18 컬럼에서의 역상 고압액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 확인하였다.
결합연구 - 셀룰로오스 상에서의 펩타이드 배열을 최초로 Tris 완충화 생리적 식염수(TBS, 20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl)에서의 5% (V/V)의 탈지유로 블로킹하였다. 그 후, 셀룰로오스 멤브레인을 동일한 블로킹 완충액에서 4℃에서 12 시간, 10μg/ml의 MBP-IAPP1-37의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 다음에, 셀룰로오스 멤브레인을 TBS에서의 0.05% Tween 20으로 반복 세정하였다. 셀룰로오스 멤브레인에 결합한 MBP-IAPP1-37를 항MBP 모노클로날 항체(Sigma, 이스라엘)에 의해 검출하였다. HRP결합 양(HRP-CONJUGATED GOAT) 항마우스 항체(Jackson Laboratories, 미국)을 이차 항체로서 사용하였다. 면역블롯을 Renaissance 웨스턴 블롯 화학발광 시약(NEN, 미국)을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 발색시키고, 시그널을 덴시토메트리를 사용하여 정량하였다. 재사용을 위해 셀룰로오스 멤브레인의 재생을 62.5 mM의 Tris, 2%의 SDS, 100 mM의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 재생 완충액I(pH 6. 7)과, 8M의 요소, 1%의 SDS, 0.1%의 2-메르캅토에탄올을 포함하는 재생 완충액II로 순차 세정하는 것에 의해 실행하였다. 세정공정의 효율을 기재된 바와 같이 멤브레인을 화학발광 시약과 접촉하는 것에 의해 모니터하였다.
결과
IAPP 폴리펩타이드에서의 결합성배열의 동정 - hIAPP분자 사이의 분자간 인식을 개재하는 IAPP분자에서의 구조 모티브를 동정하기 위해, hIAPP1-37분자의 아미노산 1-10으로부터 아미노산 28-37에 대응하는 28 개의 가능한 중복하는 데카마를 셀룰로오스 멤브레인 매트릭스 위에서 합성하였다. 셀룰로오스 멤브레인에 결합된 펩타이드를 MBP-hIAPP1-37과 하룻밤 인큐베이션하였다. 셀룰로오스 멤브레인을 고염완충액(high-salt buffer)으로 세정한 후, 셀룰로오스 멤브레인 상의 면역블롯을 분석하고, 결합을 덴시토메트리에 의해 정량하였다(도 10b). 합성 시의 펩타이드 커플링 효율이 변화할 수 있으므로, 측정된 결합은 반정량적(semiquantitative)이라는 것이 이해된다.
도 10a - 도 10b에 보이는 바와 같이, 다수의 펩타이드 세그먼트가 MBP-IAPP에 대한 결합을 보였다. IAPP 폴리펩타이드의 중심에 위치하는 아미노산 배열(즉, hIAPP7-16-hIAPP12-21)이 MBP-hIAPP1-37에 대한 가장 현저한 결합을 보였다. 다른 결합성 영역을 IAPP의 C 말단부분(hIAPP19-28-hIAPP21-30)에서 동정되었으나, 이 경우의 결합은 그만큼 현저하지 않았다. 제3의 결합 스폿(spot)이 IAPP의 N 말단부분(hIAPP2-11)에 존재했으나, 이 경우 중심의 모티브의 부근에서의 전형적인 분포는 분명하지 않았다. 이것은 이 결과가 잘못된 것임을 시사하고 있다. 블롯을 과도하게 감광시킨 후에도(데이터는 생략됨), (hIAPP1-10 또는 hIAPP3-12의 어느 것에 대해서도) 이 펩타이드의 부근에서의 결합은 검출되지 않았다. 더욱, 디설파이드 가교에 대하여 2-11의 영역의 매우 가까운 곳에서는 생리학적 조건 하에서의 원섬유화의 프로세스가 가능하지 않은 것으로 생각된다.
어레이화된(arrayed) 펩타이드와 결합할 때의 MBP 자체의 관여를 제외하기 위해, 펩타이드가 결합한 셀룰로오스 멤브레인을 MBP와만 인큐베이션하고, 면역블로팅(immunobloting)에 의해 분석하였다. 결합은 멤브레인의 발색 후에는 확인되지 않았다(표시생략).
이들 결과에 의해, hIAPP의 이전에 정의된 결합 모티브[즉, 기본 아밀로이드 형성 유닛, hIAPP20-29, Westermark(1990), Proc. Natl. Acad. Sci., 13: 5036-40; Tenidis(2000), J. Mol. Biol., 295: 1055-1071; Azriel 및 Gazit(2001), J. Biol. Chem., 276: 34156-34161]에 더하여, hIAPP 내에서의 분자인식의 주요 중심 도메인을 동정하였다. 펩타이드 배열의 결합분포의 프로필(도 10b)은 NFVLH(배열번호 17)가 코어의 인식 모티브로서 작용하는 것을 시사하고 있다.
(실시예 8)
탁도측정에 의해 모니터했을 때의 hIAPP 펩타이드 프래그먼트의 응집 속도론의 특징 부여
hIAPP 펩타이드 배열에 대한 재조합 MBP-hIAPP 융합 단백질의 결합분석(실시예 7)에 의해, 추정의 자기조합 도메인을 hIAPP 단백질의 중심부분에서 동정하였다.
아밀로이드 원섬유를 형성할 수 있는 최소의 구조 모티브를 동정하기 위해, 이 추정의 자기조합 도메인에 포함된 일련의 펩타이드를 405 nm에서의 탁도 측정을 사용하여 모니터했을 때의 응집에 대하여 시험하였다.
하기의 표 3은 조사된 펩타이드를 나타낸다.
[표 3]
hIAPP 펩타이드 단편(hIAPP 좌표) 배열번호 펩타이드 서열
14-22 14 NFLVHSSNN
14-20 15 NFLVHSS
15-20 16 FLVHSS
14-18 17 NFLVH
15-19 18 FLVHS
15-18 19 FLVH
재료 및 실험 수순
속도론적 응집 시험 - 새롭게 조제된 펩타이드 스톡 용액이 동결건조 형태의 펩타이드를 디메틸 설폭시드(DMSO)에 100 mg/ml의 농도로 용해하는 것에 의해 제조되었다. 모든 사전 응집을 피하기 위해 새로운 스톡 용액을 각각의 실험을 위해 조제하였다. 펩타이드 스톡 용액을 효소결합 면역흡착 시험(ELISA) 플레이트의 웰에서, 하기와 같은 시험 완충액에 희석하였다. 8μl의 펩타이드 스톡 용액을 92μL의 10 mM Tris(pH 7.2)에 가하였다(따라서 펩타이드의 최종농도는 8%의 DMSO의 존재 하에서 8 mg/ml였다). 탁도 데이터를 405 nm에서 수집하였다. 시험 샘플과 동일한 양의 DMSO를 함유하는 완충 용액을 블랭크로서 사용하고, 블랭크를 결과로부터 빼냈다. 탁도를 THERMOmax ELISA플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 실온에서 연속적으로 측정하였다.
결과
탁도 시험을 수성매체에서 응집하는 다양한 펩타이드(표 3)의 능력을 측정하기 위해 실행하였다. 다양한 펩타이드 프래그먼트의 새로운 스톡 용액을 DMSO에서 제조하고, 그 후 Tris 완충 용액에 희석하고, 단백질 응집의 특징으로서의 탁도를 2 시간에 걸쳐 모니터하였다. 도 11에 보이는 바와 같이, NFLVHSS, FLVHSS 및 FLVHS의 펩타이드는 큰 탁도를 보였다. NFGAIL의 짧은 펩타이드에 의한 아밀로이드 형성에 대하여 이전[Tenidis(2000), 상기 참조]에 보고된 바와 같이 지연시간은 매우 짧거나 전혀 없고, 따라서 이들 실험조건 하에서는 검출되지 않고, 그러나 응집 속도론 프로필은 헥사펩타이드hIAPP22-27(NFGAIL)에 대하여 관측된 응집 속도론 프로필과 유사한 것이 이해된다. 다른 한편, 펩타이드NFLVHSSNN은 매우 지연된 탁도를 나타내고, 한편 NFLVH 및 FLVH는 거의 전혀 탁도를 나타내지 않는다. 현저하게 긴 인큐베이션의 후에도, 의미있는 탁도는 후자의 2 개의 펩타이드에 관하여는 관측되지 않았다. 아밀로이드 원섬유 형성이 없는 것은 부분적으로 하전된 히스티딘 잔기의 정전적 반발이 원인인 것으로 생각된다.
(실시예 9)
콩고 레드(CP) 결합 시험에 의한 hIAPP 펩타이드의 아밀로이드 형성의 시험
편광현미경 관찰과 조합된 콩고 레드(CP) 염색을 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 형성성을 시험하기 위해 이용하였다. 아밀로이드 원섬유는 CR과 결합하여, 금색/녹색의 복굴절을 편광 하에서 보인다[Puchtler(1966), J. Histochem. Cytochem., 10: 355-364].
재료 및 실험 수순
콩고 레드 염색 및 복굴절 - 적어도 1 일간 시효된 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 8 mg/ml의 펩타이드 용액의 10μL의 현탁물을 유리제의 현미경 슬라이드 유리 위에서 하룻밤 건조시켰다. 염색을 이전의 기재[Puchtler(1966), 상기 참조]과 같은 80% 에탄올(v/v) 용액에서의 포화 콩고 레드(CR) 및 NaCl의 10μL의 현탁액을 가하는 것에 의해 실행하였다. 용액을 0.45μm의 필터에 의해 여과하였다. 그 후, 슬라이드 유리를 수시간 건조시켰다. 복굴절을 직교 편광자를 구비한 SZX-12 실체현미경(Olympus, Hamburg, 독일)을 이용하여 측정하였다.
결과
콩고 레드 염색 및 복굴절 - 탁도 시험(실시예 8 참조)에서 형성된 응집물의 모든 가능한 아밀로이드 특성을 입증하기 위해, CR 복굴절 시험을 행하였다. 펩타이드 프래그먼트를 CR에 의한 염색, 및 직교 편광자를 구비한 광학현미경 하에서의 시험에 의해 아밀로이드 형성성에 대하여 조사하였다. 속도론적 시험의 결과와 일치하여, 또 도 12b-c 및 도 12e에 보이는 바와 같이, NFLVHSS, FLVHSS 및 FLVHS의 펩타이드는 전형적인 복굴절을 보였다. 이것에 대하여, NFLVHSSNN, NFLVH 및 FLVH의 펩타이드는 매우 약한 복굴절을 보이거나, 또는 복굴절을 전혀 보이지 않았다(도 12a, 도 12d 및 도 12f). 펩타이드NFLVHSSNN은 보다 약한 특징적인 복굴절을 보였다(도 12a). 펩타이드NFLVH는 샘플의 연부(edge)에서 강한 불선명한 염색을 보였다(도 12d). 펩타이드 FLVH는 복굴절을 보이지 않았다(도 12f). FLVH 펩타이드가 긴 지연시간으로 인해 아밀로이드 원섬유를 형성하지 않는지의 여부를 시험하기 위해, 5 일간 시효된 펩타이드 용액의 샘플을 조사하였다. 동일한 펩타이드를 또 수용액에서 매우 고농도(10 mg/ml)로 시험되었으나, 복굴절은 모든 경우에서 검출되지 않았다. 이것은 이 펩타이드는 아밀로이드를 형성하지 않는다는 것을 나타낸다(데이터는 생략됨).
(실시예 10)
원섬유 형성hIAPP 펩타이드의 초미세 구조분석
다양한 펩타이드의 잠재적 원섬유 형성능을 전자현미경 관찰분석에 의해 평가하였다.
재료 및 실험 수순
투과전자현미경 관찰- 적어도 1 일간 시효된, 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 8 mg/ml의 펩타이드 용액의 10μL 샘플을 400 메시의 구리 그리드(SPI supplies, West Chester, PA)에 설치하고, 카본 안정화 포름바르 필름에 의해 피복하였다. 1 분 후, 과잉의 액체를 제거하고, 그 후 그리드를 2% 초산 우라닐 수용액으로 2 분간 네거티브 염색하였다. 샘플을 80kV로 가동하는 JOEL 1200EX 전자현미경으로 조사하였다.
결과
다양한 펩타이드에 의해 형성된 구조를 추가 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색의 현미경 관찰을 행하였다. 이전의 결과와 일치하여, 무정형의 응집물만이 발견되는 FLVH 펩타이드를 제외하고, 모든 펩타이드 프래그먼트가 원섬유 구조를 보였다(도 13a-f). NFLVHSSNN 펩타이드는 상기에 기재하는 바와 같이, 전장(full-length) 펩타이드에 의해 형성되는 필라멘트와 유사한 길고 얇은 코일상 필라멘트를 나타냈다( 도 13a). NFLVHSS, FLVHSS, FLVHS의 펩타이드는 NFGAIL 프래그먼트에 대하여 기재되는 바와 같이, 긴 광폭의 리본양(ribbon-like) 원섬유를 보였다[Tenidis(2000), 상기 참조; 각각, 도 13c-e]. NFLVH 펩타이드에 의해 형성된 원섬유는 얇고 짧은 필라멘트라기보다는 프로토필라멘트로 볼 수 있다. 그 출현은 매우 낮은 빈도이고, EM 사진은 일반적인 시야는 아니고, 상당히 드문 사상(event)를 나타내고 있다(도 13d). 도 13f에 보이는 바와 같이, FLVH 펩타이드는 무정형 응집물의 형성을 매개하였다.
(실시예 11)
hIAPP 펩타이드 프래그먼트의 이차 구조분석
퓨리에 변환 적외 분광법(FT-IR)을 hIAPP아밀로이드 형성 펩타이드 원섬유 및 비원섬유 펩타이드의 이차 구조를 입증하기 위해 실행하였다.
재료 및 실험 수순
퓨리에 변환 적외 분광법 - 적외 스펙트럼을 DTGS 검출기를 구비한 Nicolet사의 Nexus470FT-IR 분광계를 사용하여 기록하였다. 시효된 펩타이드 용액의 샘플을 탁도 시험으로부터 채취하고, 그 후 CaF2 윈도우(Sigma) 플레이트 상에 현탁하고, 진공 건조시켰다. 펩타이드 침착물을 2회 증류수로 재현탁하고, 이어서 건조시키고, 얇은 필름을 형성시켰다. 이 재현탁 수순을 2회 반복하여, 수소로부터 중수소에의 교환이 최대로 되는 것을 확실하게 하였다. 측정치를 4cm-1의 분해능 및 2000회의 주사 평균화(scans averaging)를 사용하여 얻었다. 투과율 극소치를 OMNIC 분석 프로그램(Nicolet)에 의해 결정하였다.
결과
FT-IR연구 - 도 14a-f에 보이는 바와 같이, 원섬유 펩타이드는 모두가 β-시이트 구조에 대하여 전형적인 충분히 명확한 극소 밴드를 1620cm-1-1640cm-1 부근에 가지는 FT-IR 스펙트럼을 보였다. 반면, 다른 방법에 의해 원섬유에 대하여 출현을 가지지 않는 테트라펩타이드 FLVH의 스펙트럼은 랜덤 코일구조의 전형이다. NFLVHSSNN 펩타이드의 스펙트럼은 β-시이트 함유량이 큰 것을 보이는 1621cm-1에서 투과율극소를 보이고, 비β구조의 존재를 시사하는 1640cm-1 및 1665cm-1에서 극소를 보였다. 다른 작은 극소가 역평행의 β-시이트를 보이는 1688cm-1에서 관측되었다(도 14a). NFLVHSS 펩타이드의 스펙트럼은 큰 극소 밴드를 1929cm-1 및 1675cm-1에서 보였다. 이 스펙트럼은 역평행의 β-시이트 구조의 전형이다(도 14b). 유사한 스펙트럼이 1625cm-1에서 큰 극소 및 1676cm-1에서 작은 극소를 수반하여 펩타이드 FLVHS에 대하여 관측되었다(도 14e). FLVHSS 펩타이드의 스펙트럼은 또 큰 극소를 1626cm-1에서 보였다. 이 스펙트럼은 또 몇 개의 작은 극소를 1637cm-1-1676cm-1 부근에 가졌으나, 이들은 시그널 보다도 노이즈에 유사한 형상을 가졌다(도 14c). NFLVH 펩타이드의 스펙트럼은 1636cm-1에서의 극소(이것도 β-시이트를 나타냈다)를 보였으나, 그것 이외의 스펙트럼과 비교되었을 때, 비β구조의 존재를 표시할 수 있는 이 밴드는 1654cm-1 및 1669cm-1에서 관측된 극소와 마찬가지로 이동되었다(도 14d). 대조적으로, FLVH 펩타이드의 스펙트럼은 1620cm-1-1640cm-1에 극소를 보이지 않지만, 랜덤 코일구조에 전형적인 1646cm-1-1675cm-1의 부근에 다수의 극소를 보였다(도 14f).
FLVH 테트라펩타이드가 아밀로이드 원섬유를 전혀 형성할 수 없거나, 검출할 수 없는 원섬유 형성이 지연된 속도론의 결과인지를 조사하기 위해 동일한 실험조건에서 펩타이드의 용액을 2 개월간에 걸쳐 인큐베이션하고, 원섬유의 존재를 조사하였다. 그러나, 아밀로이드 원섬유 형성의 증거는 EM현미경 관찰, CR 염색 또는 FT-IR 분광법을 사용하여 검출되지 않았다. 이들 결과는 에너지를 고려하는 것에 의해 테트라펩타이드가 원섬유를 형성할 수 없다는 것을 시사할 수 있다. 즉, 3 개의 펩타이드 결합으로 구성되는 쇄의 스태킹의 에너지 기여는 올리고머화의 엔트로피 손실보다 작다.
정리하면, 초미세 구조의 관찰 결과는 탁도 시험 및 콩고 레드 복굴절 시험에 의해 입증되는 바와 같은 발견과 일치하고 있다. 동시에, 실험 데이터에 의해 아밀로이드 형성능이 강한 hIAPP 펩타이드 내의 신규의 펜타펩타이드 엘리먼트, 즉 FLVHS 펩타이드를 동정하였다. 흥미롭게도, hIAPP 폴리펩타이드의 동일한 중심 도메인에서 발견된 NFLVH 펩타이드가 아밀로이드 형성성인 것이 발견되었으나, 원섬유를 형성하는 그 능력은 다소 낮았다.
(실시예 12)
메딘의 최소아밀로이드 형성 펩타이드 프래그먼트의 동정
배경
메딘(GenBank 억세션 번호gi: 5174557)은 대동맥 중막 아밀로이드 침착물의 주요 구성 성분이다[Haeggqvist(1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 8674-8669]. 이전의 연구에서는 대동맥 중막 아밀로이드가 50 세를 초과하는 환자의 97%에서 발견되었다[Mucchiano(1992), Am. J. Pathol., 140: 811-877]. 그러나, 그와 같은 아밀로이드 침착물의 병리학적 역할은 여전히 밝혀지지 않았다. 이들 아밀로이드는 노령에 관계되는 대동맥 혈관의 저하된 탄성에 서 역할을 하는 것이 시사되었다[Mucchiano(1992), 상기 ; Haeggqvist(1999), 상기 참조]. 본 연구에서는 트리프신 소화펩타이드NFGSVQFV가 중막 아밀로이드 형성 펩타이드로서 명료하게 동정되었으나, 여전히 아밀로이드 형성성인 펩타이드의 최소배열, 및 아밀로이드 형성 프로세스를 개재하는 분자적 결정 인자는 결정되지 않았다. 그와 같은 정보는 메딘의 특정의 경우에서 원섬유화 프로세스를 진정으로 이해하기 위해 중요하지만, 일반적으로는 아밀로이드 원섬유의 프로세스에 대한 패러다임으로서도 중요하다.
메딘의 최소의 활성 프래그먼트를 발표된 옥타펩타이드에 유래하는 단축화된 아날로그의 기능적 및 구조적인 분석을 사용하여 결정하였다[Haeggqvist(1999), 상기 참조].
재료 및 실험 수순
펩타이드 합성은 실시예 7에 기재하였다.
하기의 표4는 조사된 펩타이드를 나타낸다.
펩타이드 서열 배열번호
NH2-NFGSVQVF-COOH 20
NH2-NFGSVQ-COOH 21
NH2-NFGSV-COOH 22
NH2-FGSVQ-COOH 23
NH2-GSVQ-COOH 24
NH2-FGSV-COOH 25
NH2-NAGSVQ-COOH 26
결과
분자인식 및 자기조합의 프로세스를 매개하기 위해 필요해지는 분자 정보를 유지하는 메딘의 구조 엘리먼트에 대해 더욱 통찰을 얻기 위해, 인비트로로 아밀로이드 원섬유를 형성하는 메딘의 짧은 펩타이드 프래그먼트 및 그 아날로그의 능력을 조사하였다. 도 15a에 조사된 가장 큰 펩타이드 프래그먼트의 화학구조의 개략도를 나타낸다.
(실시예 13)
메딘 유래 펩타이드 프래그먼트의 응집의 속도론
탁도 시험을 실시예 8에 기재된 바와 같이 실행하였다.
다양한 메딘 유래 펩타이드의 응집능에 관한 최초의 통찰을 얻기 위해, 탁도 시험을 행하였다. 아밀로이드 형성 옥타펩타이드 및 그 단축화 아날로그의 새롭게 제조된 스톡 액을 DMSO에서 조제하였다. 그 후, 펩타이드를 수용액에 희석하고, 탁도를 시간의 함수로서 405 nm에서의 흡광도를 추적하는 것에 의해 모니터하였다. 도 16a에 보이는 바와 같이, NFGSV 펜타펩타이드는 인큐베이션의 수분 이내에 가장 큰 정도의 응집을 보였다. 용액의 물리적 시험에 의해 펩타이드는 겔구조를 형성한 것을 보였다. NFGSVQV 옥타펩타이드의 응집의 속도론은 너무 빨라서 측정할 수 없었다. 이것은 탁도가 수용액에의 희석에 의해 직접 이미 관측되었기 때문이다(도 16a-b). 유사한 신속 속도론이 GSVQ 테트라펩타이드에 관해서도 관측되었다. NFGSVQ, FGSVQ 및 FGSV의 단축화 펩타이드는 약 30 분에 걸쳐 탁도의 점차적인 증대를 보였고(도 16b), 그 후 약간 감소하였다. 이것은 큰 응집물의 침강에 의해 설명할 수 있다. 정리하면, 그와 같은 속도론 및 탁도치는 유사한 크기의 아밀로이드 형성 펩타이드에 관하여 이전에 관측된 것과 유사하였다(Azriel 및 Gazit, 2001).
(실시예 14)
메딘 유래 펩타이드 프래그먼트의 초미세 구조분석
전자현미경 관찰분석을 실시예 10에 기재된 바와 같이 실행하였다.
메딘 유래 펩타이드 프래그먼트의 원섬유화 능을 네거티브 염색을 사용하는 전자현미경 관찰(EM)에 의해 실행하였다. 펩타이드 프래그먼트의 스톡 용액을 현탁하고, 4 일간 시효시켰다. 원섬유 구조가 NFGSVQFA 옥타펩타이드를 함유하는 용액(도 17a) 및 단축화NFGSVQ를 함유하는 용액(도 17b)의 양자에서 명료하게 인정되었다. 양자의 경우에서, 구조는 IAPP 폴리펩타이드 및 β-아밀로이드(Aβ) 폴리펩타이드와 같은 매우 긴 폴리펩타이드에 관하여 관측된 구조와 유사하였다. 보다 짧은 겔 형성의 NFGSV 펜타펩타이드는 전형적인 아밀로이드 구조를 형성하지 않았지만, 섬유상 구조의 망상구조를 형성하였다(도 17c). 섬유상 망상구조가 최근 글루타티온 펩타이드의 겔화 시에 관측된 것에 유의해야 한다[Lyon 및 Atkins(2001), J. Am. Chem. Soc., 123: 4408-4413]. 전형적인 원섬유를 광범위한 조사에도 불구하고 FGSVQ펜타펩타이드, GSVQ 테트라펩타이드 또는 FGSV 테트라펩타이드를 함유하는 용액으로는 검출할 수 없었다. FGSVQ 펩타이드의 경우(도 17d), 다소의 원섬유적인 질서있는 구조를 볼 수 있는 한편으로, 전형적인 아밀로이드 형성 펩타이드에 의해 형성된 구조와는 현저히 다르지만, GSVQ 펩타이드 및 FGSV 펩타이드의 경우, 원섬유 구조를 발견할 수 없었다(각각, 도 17e 및 도 17f).
(실시예 15)
콩고 레드(CR) 결합 시험에 의한 메딘 유래 펩타이드의 아밀로이드 형성능의 시험
CR 염색을 실시예 9에 기재된 바와 같이 실행하였다.
CR 염색을 다양한 메딘 유래 펩타이드에 의해 형성된 구조가 전형적인 복굴절을 보이는지의 여부를 입증하기 위해 실행하였다. 도 18b에 보이는 바와 같이, NFGSVQ 헥사펩타이드는 CR과 결합하고, 특징적인 밝고 강한 녹색-금색의 복굴절을 보였다. NFGSVQFV 옥타펩타이드도 헥사펩타이드에 관하여 관측된 복굴절보다도 전형적은 아니지만, 현저한 복굴절을 보였다(도 18a). 겔 형성의 NFGSV 펩타이드 침전물은 매우 낮은 정도의 복굴절을 보였다(도 18c). FGSVQ 및 FGSV의 펩타이드는 CR에 의해 염색해도, 복굴절을 보이지 않았다(각각, 도 18d 및 도 18f). 그러한 2개의 펩타이드와 음성 대조 (즉, 펩타이드를 포함하지 않는 완충 용액)과의 사이에는 현저한 차는 명확하게 나타나지 않았다. 흥미롭게도, 예상 외의 고 레벨의 복굴절이 GSVQ 테트라펩타이드에 관하여 관측되고(도 18e), 한편으로 그것으로부터 형성된 구조의 형태(도 18e)는 아밀로이드 원섬유의 형태와는 명확하게 달랐다. 이것은 이들 구조가 강한 복굴절에서 반영되는 현저한 정도의 질서를 가질 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 16)
메딘의 자기조합에 대한 페닐알라닌 치환의 영향
최소의 아밀로이드 형성 헥사펩타이드에 의한 아밀로이드 원섬유 형성의 프로세스에서의 페닐알라닌 잔기에 대하여 생각되는 역할을 해명하기 위해, 페닐알라닌의 아미노산을 알라닌으로 치환하였다. 알라닌 치환 펩타이드를 조제하고, 메딘의 다양한 프래그먼트에 대하여 기재된 것과 동일한 방법으로 조사하였다. 도 19a에 보이는 바와 같이, 현저하게 저하된 탁도가 야생형의 헥사펩타이드와 비교되었을 때, 알라닌 치환 펩타이드에 관하여 관측되었다. NAGSVQ 펩타이드의 시효된 용액을 EM에 의해 가시화해도, 명백한 원섬유 구조를 검출할 수 없었다(도 19b). 이것은 야생형 펩타이드(도 17b)에 관하여 입증되는 매우 많은 원섬유 구조와는 완전히 대조적이다. 더욱, 가시화된 구조는 상기에 기재된 바와 같은 NFGSV 펩타이드 및 FGSVQ 펩타이드(도 17c-d)에 관하여 관측된 바와 같은 질서도를 전혀 보이지 않았으나, FGSV 테트라펩타이드(도 17e)에 관하여 관측된 바와 같은 완전히 비원섬유의 구조와 매우 유사하였다. 흥미롭게도, 어느 정도의 복굴절을 (GSVQ 펩타이드(도 18e)에 관하여 관측된 바와 같은) 알라닌 치환 펩타이드에 의해서도 여전히 검출할 수 있었다(도 19c). 이들 결과는 CR 염색이 아밀로이드 형성의 단독의 지표(indicator)로서 사용되는 것에 관해 더욱 의심을 일으키고 있다[Khurana(2001), J. Biol. Chem., 276: 22715-22721].
정리하면, 이들 결과는 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 있는 메딘의 단축화 프래그먼트가 헥사펩타이드NFGSVQ(배열번호 21)인 것을 보이고 있다. 그러나, 보다 짧은 펜타펩타이드 프래그먼트의 NFGSV(배열번호 22)가 아밀로이드에 전형적이지 않은 섬유상 구조의 망상구조를 보였다. 아밀로이드 형성의 NFGSVQ 헥사펩타이드는 소도 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP, 실시예 1-5를 참조할 것)의 최소의 아밀로이드 형성 프래그먼트와 현저히 유사하다. 종합하면, 결과는 아밀로이드 원섬유의 형성을 유발하는 자기조합 프로세스에서의 스태킹 상호작용의 가정된 역할과 일치하고, 또 아밀로이드 원섬유와 β-나선구조와의 사이의 시사된 상관과 일치하고 있다.
(실시예 17)
인간 칼시토닌의 최소아밀로이드 형성 펩타이드 프래그먼트의 동정
인간 칼시토닌(hCT, GenBank 억세션 번호gi: 179880)은 갑상선의 C 세포에 의해 생산되는 칼슘의 항상성에 관여하는 32 개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드 호르몬 이다[Austin 및 Health(1981), N. Engl. J. Med., 304: 269-278; Copp(1970), Annu. Rev. Physiol., 32: 61-86; Zaidi(2002), Bone, 30: 655-663]. hCT로 /구성되는 아밀로이드 원섬유가 갑상선의 수양암과 관련되는 것이 발견되어 있다[Kedar(1976), Isr. J. Sci., 12: 1137; Berger(1988), Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol., 412: 543-551; Arvinte(1993), J. Biol. Chem., 268: 6415-6422]. 흥미롭게도, 합성hCT는 갑상선에서 발견되는 침착물과 유사한 형태를 가지는 아밀로이드 원섬유를 인비트로로 형성하는 것이 발견되어 있다[Kedar(1976), 상기 참조 ; Berger(1988), 상기 참조; Arvinte(1993), 상기 참조; Benvenge(1994), J. Endocrinol. Invest., 17: 119-122; Bauer(1994), Biochemistry, 33: 12276-12282; Kanaori(1995), Biochemistry, 34: 12138-43; Kamihara(2000), Protein Sci., 9: 867-877]. 아밀로이드 형성의 인비트로 프로세스는 매체의 pH에 의해 영향을 받는다[23]. 전자현미경 관찰실험에 의해, hCT에 의해 형성된 원섬유는 직경이 약80Å이고, 길이가 수 마이크로미터에 이르는 것이 해명되어 있다. 원섬유는 상호 조합하고 있는 것이 많고, 인비트로에서의 아밀로이드 형성은 매체의 pH에 의해 영향을 받는다[Kamihara(2000), 상기 참조].
칼시토닌은 파젯병 및 골다공증을 포함하는 다양한 질환에 대한 약물로서 사용되어 있다. 그러나, hCT가 생리학적 pH의 수용액에서 조합하여 아밀로이드 원섬유를 형성하기 쉬운 경향은 약물로서의 그 효율적인 사용에 대한 큰 제한이다[Austin(1981), 상기 ; Copp(1970), 상기 ; Zaidi(2002), 상기 참조]. 연어CT[Zaidi(2002), 상기 참조]는 임상적으로 사용되어 온 hCT의 대체물이지만, 배열 상동성이 낮으므로 처치된 환자에 있어서 면역원 반응을 발생시킨다. 따라서 hCT에 의한 아밀로이드 형성의 기구를 이해하고, 또 이 프로세스를 억제하는 것은 아밀로이드 형성기구의 관련에 있어서 만이 아니고, 칼시토닌의 개선된 치료적 사용에 대한 스텝으로서도 매우 중요하다.
원편광 이색성(Circular dichroims; CD) 연구에 의해, 물 중에서는 단량체 hCT는 실온에서 질서가 있는 이차 구조를 거의 가지지 않는 것이 밝혀졌다[Arvinte(1993), 상기 참조]. 그러나, 원편광 이색성, 형광 및 적외 분광법을 사용하는 hCT원섬유의 연구에 의해, 원섬유화된 hCT 분자가 α-나선 및 β-시이트의 양자의 이차 구조 성분을 가지는 것이 해명되었다[Bauer(1994), 상기 참조]. NMR 분광법에 의한 연구에서는 TFE/H2O와 같은 다양한 구조를 촉진하는 용매에 있어서, hCT가 주로 잔기 범위 8-22에 있어서 양친성의 α-나선의 입체배좌를 취하고 있는 것이 보여졌다[Meadows(1991), Biochemistry, 30: 1247-1254; Motta(1991), Biochemistry, 30: 10444-10450]. DMSO/H2O 중에서는 중심영역에서의 짧은 이중쇄의 역평행의 β-시이트 형태가 잔기 16-21에 의해 제조된다[Motta(1991), Biochemistry, 30: 2364-71].
이 구조 데이터, 및 아밀로이드 형성 프로세스에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 본 발명자는 칼시토닌의 자기조합을 매개하기 위해 충분한 짧은 펩타이드 프래그먼트를 동정하였다[Reches(2002), J. Biol. Chem., 277: 35475-80].
조사된 펩타이드 - 산성pH에 대한 아밀로이드 형성의 이전에 보고된 감수성[Kanaori(1995), 상기 참조]에 기초하여, 낮은 pH에서 프로톤화를 겪는 음전하를 가지고 있는 아미노산이 아밀로이드 형성 프로세스에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것이 시사되었다. hCT에서 유일한 음전하를 가지고 있는 아미노산은 Asp15이다(도 20a). 더욱, hCT의 올리고머화 상태 및 생물활성에서의 Lys18 및 Phe19의 잔기에 대한 매우 중요한 역할이 최근 입증되었다[Kazantzis(269), Eur. J. Biochem., 269: 780-91]. 2개의 페닐알라닌 잔기가 그 영역에 존재하는 것과 함께, hCT에서의 아밀로이드 형성 결정 인자의 구조분석이 아미노산 15-19에 초점이 맞추어졌다. 도 20b는 최장 펩타이드의 화학구조의 개략도를 보이고, 하기의 표 5는 이 연구에서 사용된 다양한 펩타이드 프래그먼트를 나타낸다.
hCT 상의 아미노산 좌표 펩타이드 서열 배열번호
15-19 NH2-DFNKF-COOH 27
16-19 NH2-FNKF-COOH 28
15-18 NH2-DFNK-COOH 29
15-17 NH2-DFN-COOH 30
F>A 15-19 NH2-DANKF-COOH 31
(실시예 18)
칼시토닌 유래 펩타이드 프래그먼트의 초미세 구조분석
전자현미경 관찰분석을 실시예 10에 기재된 바와 같이 실행하였다.
칼시토닌 유래 펩타이드 프래그먼트의 원섬유화 능을 네거티브 염색을 사용하여 전자현미경 관찰(EM)에 의해 실행하였다. 펩타이드 프래그먼트의 스톡 용액을 0.02M NaCl, 0.01M Tris(pH 7.2)에 현탁하고, 2 일간 시효시키고, 네거티브 염색하였다. 전장 폴리펩타이드에 의해 형성되는 원섬유 구조[Arvinte(1993), 상기 참조; Benvenge(1994), 상기 참조; Bauer(1994), 상기 참조; Kanaori(1995), 상기 참조; Kamihara(2000), 상기 참조]와 유사한 원섬유 구조가 DFNKF 펜타펩타이드를 함유하는 용액에서 고빈도로 명료하게 확인되었다(도 21a). 보다 짧은 DFNK 테트라펩타이드도 원섬유 구조를 형성하였다(도 21b). 그러나, 형성된 구조는 DFNKF 펜타펩타이드에 의해 형성된 원섬유 구조와 비교한 경우, 그만큼 질서를 가지지 않았다. DFNK에 의해 형성된 원섬유 구조의 양도 DFNKF 펜타펩타이드와 비교하여 적었다. 명백한 원섬유는 광범위한 조사에도 불구하고, FNKF 테트라펩타이드 및 DFN 트리펩타이드를 함유하는 용액을 사용하면 검출할 수 없었다. FNKF 테트라펩타이드의 경우, 무정형의 응집물만을 발견할 수 있었다(도 21c). DFN 트리펩타이드는 겔 형성의 트리펩타이드에 의해 형성되는 구조[Lyon(2001), 상기 참조]와 유사한, 보다 큰 질서를 가지는 구조를 형성하였다(도 21d). FNKF 테트라펩타이드 및 DFN 트리펩타이드의 펩타이드가 원섬유를 일체 형성할 수 있는지의 여부, 또는 관측 결과가 지연된 속도론의 결과인지의 여부를 조사하기 위해 동일한 실험조건에서 펩타이드의 용액을 2 주간에 걸쳐 인큐베이션하였다. 이 경우도 명백한 원섬유 구조를 검출할 수 없었다(데이터는 생략됨).
(실시예 19)
콩고 레드(CR) 결합 시험에 의한 칼시토닌 유래 펩타이드의 아밀로이드 형성능의 시험
CR 염색을 실시예 9에 기재된 바와 같이 실행하였다.
CR 염색을 다양한 hCT 유래 펩타이드에 의해 형성된 구조가 전형적인 복굴절을 보이는지의 여부를 입증하기 위해 실행하였다. 도 22a-d에 보이는 바와 같이, 모든 조사된 펩타이드가 어느 정도의 복굴절을 보였다. 그러나, 녹색의 복굴절이 DFNKF 펜타펩타이드에 관하여 관측되고, 이 복굴절은 명료하고, 또 강했다(도 22a). 그것 이외의 펩타이드에 관하여 관측된 복굴절의 레벨은 보다 낮지만, 펩타이드를 함유하지 않는 대조 용액을 사용하여 복굴절을 검출할 수 없었으므로, 유의미하였다. DFNK 테트라펩타이드의 보다 낮은 레벨의 복굴절(도 22b)은 EM을 사용하여 관측되는 바와 같이(도 21b), 보다 낮은 정도의 원섬유화와 일치하였다. 그러나, FNKF 테트라펩타이드 및 DFN 트리펩타이드에 관하여 관측되는 복굴절은 어느 정도의 질서있는 구조를 나타낼 수 있는 것이 이해된다[Lyon(2001) 상기 참조].
(실시예 20)
응집된 hCT 유래 펩타이드의 이차 구조
FT-IR 분광법을 실시예 11에 기재된 바와 같이 실행하였다.
아밀로이드 침착물은 β-플리티드 시이트 구조가 많은 원섬유에 특징적이다. 다양한 펩타이드 프래그먼트에 의해 형성된 이차 구조에 관한 양적인 정보를 얻기 위해, FT-IR 분광법을 사용하였다. 시효된 펩타이드 용액을 실시예 11에 기재된 바와 같이 CaF2 플레이트 위에서 건조시키고, 얇은 필름을 형성시켰다. 도 23에 보이는 바와 같이, DFNKF 펜타펩타이드는 (1639cm-1 및 1669cm-1에서) 이중의 극소를 보이고, 그리고 역평행의 β-시이트 구조와 일치하고, 또 소도 아밀로이드 폴리펩타이드의 아밀로이드 형성의 헥사펩타이드 프래그먼트의 스펙트럼[Tenidis(2000), 상기 참조]과 현저하게 유사한, 아미드I의 FT-IR 스펙트럼을 보였다. DFNK 테트라펩타이드에 관하여 관측된 아미드I의 스펙트럼(도 23)은 β-시이트 구조에 대해 그만큼 전형적인 것은 아니었다. DFNK 테트라펩타이드는 역평행의 β-시이트를 반영할 수 있는 1666cm-1에서의 극소를 보인 한편, β-시이트 구조에 관하여 전형적으로 관측되는 1620cm-1-1640cm-1 부근의 전형적인 극소를 가지지 않았다. FNKF 테트라펩타이드는 질서가 없는 구조에 전형적이고, 또 소도 아밀로이드 폴리펩타이드의 짧은 비아밀로이드 형성 프래그먼트의 스펙트럼[Tenidis(2000), 상기 참조]과 유사한 FT-IR 스펙트럼을 보였다(도 23). DFN 트리펩타이드는 (1642cm-1 및 1673cm-1에서) 이중의 극소를 보이고(도 23), 그리고 β-시이트 구조 및 랜덤 구조의 혼합과 일치하는 아미드I의 FT-IR 스펙트럼을 보였다. 이것은 더욱 EM 가시화에 의해 관측되는 구조가 β-시이트 구조 엘리먼트로부터 주로 구성된 어느 정도의 질서있는 구조를 나타낼 수 있다는 것을 보이고 있다.
(실시예 21)
칼시토닌 유래 펩타이드의 자기조합에 대한 페닐알라닌 치환의 영향
칼시토닌의 자기조합 프로세스에서의 페닐알라닌 잔기에 대해 가능한 역할을 통찰하기 위해, 페닐알라닌의 아미노산을 펜타펩타이드(배열번호 31)에 관련하여 알라닌으로 치환하였다. DANKF 펜타펩타이드의 시효된 용액을 EM에 의해 가시화해도, 명백한 원섬유 구조를 검출할 수 없었다(도 24a). 가시화된 구조는 (FNKF 테트라펩타이드에 관하여 확인되는 무정형의 응집물과 비교했을 때) 어느 정도의 질서를 보였으나, 녹색-금색의 복굴절을 관측할 수 없었다(도 24b). DANKA 펜타펩타이드의 FT-IR 스펙트럼은 FNKF 테트라펩타이드 및 다른 짧은 비아밀로이드 형성 펩타이드의 FT-IR 스펙트럼(이것은 질서가 없는 구조에 전형적이다[Tenidis(2000), 상기 참조])과 유사하였다. 정리하면, 페닐알라닌로부터 알라닌에의 치환의 영향은 소도 아밀로이드 폴리펩타이드의 짧은 아밀로이드 형성의 프래그먼트와 관련하여 그와 같은 변화의 영향[Azriel(2001), 상기 참조]과 매우 유사하다.
정리하면, hCT 유래 펜타펩타이드(배열번호 27)는 충분히 질서있는 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 있는 것이 입증되었다. 전자현미경 관찰의 가시화에 의해 확인되는 바와 같은 전형적인 원섬유 구조(도 21a), CR에 의해 염색했을 때의 매우 강한 녹색의 복굴절(도 22a), 및 전형적인 역평행 β-시이트 구조(도 23a), 이들 모두가 DFNKF 펜타펩타이드가 매우 강력한 아밀로이드 형성 인자인 것을 보이고 있다. 자기조합할 수 있는 다른 펜타펩타이드를 본 명세서의 상기에서 보였다. 그것에서도, 복굴절의 정도 및 전자현미경 관찰에 의한 형태학에 관하여, hCT 프래그먼트는 β-아밀로이드(Aβ) 폴리펩타이드의 강력한 아밀로이드 형성 프래그먼트의 KLVFFAE[Balbach(2000), Biochemistry, 39: 13748-59]와 유사한 가장 큰 아밀로이드 형성능을 가지는 펜타펩타이드인 것 같다. 리신 및 아스파라긴산에서의 반대의 전하 사이에서의 정전기적 상호작용에 의해 질서있는 역평행 구조의 형성이 유도되는 것으로 생각된다. 흥미롭게도, DFNK 폴리펩타이드는 DFNKF 펩타이드와 비교한 경우, 현저하게 저하된 아밀로이드 형성능을 보였다. 펜타펩타이드가 강력한 아밀로이드 형성 인자를 위한 하한인 것으로 생각된다. 이것은 IAPP의 2개의 펜타펩타이드(NFLVH 및 FLVHS)가 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 있으나, 그러한 공유하는 공통부분(테트라펩타이드 FLVH) 는 그와 같은 원섬유를 형성할 수 없다는 것을 입증하는 최근의 결과와 일치하고 있다(실시예 1-5를 참조할 것).
(실시예 22)
락토트랜스페린으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
락토트랜스페린(GenBank 억세션 번호gi: 24895280)에 의한 아밀로이드 원섬유 형성은 가족성 상피하 각막 아밀로이드 형성에 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 락토트랜스페린 유래 펩타이드의 LFNQTG(배열번호 32)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 락토트랜스페린 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 25에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 락토트랜스페린의 LFNQTG가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 23)
혈청 아밀로이드 A 단백질로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
혈청 아밀로이드 A 단백질(GenBank 억세션 번호gi: 134167)의 단편은 만성 염증 아밀로이도시스의 증례의 아밀로이드 상태에서 발견되어 있다[Westermark외(1992), Biochem. Biophys. Res. Co mMun., 182: 27-33]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 혈청 아밀로이드 A 단백질 유래 펩타이드의 SFFSFL(배열번호 33)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 혈청 아밀로이드 A 단백질 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 26에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 혈청 아밀로이드 A 단백질의 SFFSFL이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 24)
BriL로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
인간 BRI유전자는 제13 염색체 상에 위치한다. BriL유전자 생성물(GenBank 억세션 번호gi: 12643343)의 아밀로이드 원섬유는 뉴런의 기능부전 및 치매와 관련된다(Vidal외(1999), Nature, 399, 776-781). 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, BriL 유래 펩타이드의 FENKF(배열번호 34)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 BriL 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 27에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 BriL의 FENKF가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 25)
겔솔린으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
겔솔린 단백질(GenBank 억세션 번호gi: 4504165)의 단편은 핀란드 유전성 아밀로이도시스의 증례의 아밀로이드 상태에서 발견되어 있다[Maury 및 Nurmiaho-Lassila(1992), Biochem. Biophys. Res. Co mMun., 183: 227-31]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 겔솔린 유래 펩타이드의 SFNNG(배열번호 35)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 겔솔린 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 28에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 BriL의 SFNNG가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 26)
혈청 아밀로이드 P로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
베타아밀로이드에 의한 아밀로이드 원섬유 형성은 혈청 아밀로이드 P(GenBank 억세션 번호gi: 2144884)와의 상호작용에 의해 촉진된다. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 혈청 아밀로이드 P 유래 펩타이드의 LQNFTL(배열번호 36)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 혈청 아밀로이드 P 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 29에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 혈청 아밀로이드 P의 LQNFTL이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 27)
면역글로블린 경쇄로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
면역글로블린 경쇄(GenBank 억세션 번호gi: 625508)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 일차 전신성 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 면역글로블린 경쇄 유래 펩타이드의 TLIFGG(배열번호 37)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 면역글로블린 경쇄 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 30에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 면역글로블린 경쇄의 TLIFGG가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 28)
시스타틴 C로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
시스타틴 C(GenBank 억세션 번호gi: 4490944)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 유전성의 뇌의 아밀로이드 안기오퍼시와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 시스타틴 C 유래 펩타이드의 RALDFA(배열번호 38)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 시스타틴 C 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 31에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 시스타틴 C의 RALDFA가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 29)
트랜스사이레틴으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
트랜스사이레틴(GenBank 억세션 번호gi: 72095)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 가족성 아밀로이드 다발신경장해와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 트랜스사이레틴 유래 펩타이드의 GLVFVS(배열번호 39)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 트랜스사이레틴 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 32에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 트랜스사이레틴의 GLVFVS가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱, 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 30)
리소짐으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
리소짐(GenBank 억세션 번호gi: 299033)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 가족성 비신경 장해성 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 리소짐 유래 펩타이드의 GTFQIN(배열번호 40)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 리소짐 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 33에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 리소짐의 GTFQIN이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 31)
피브리노겐으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
피브리노겐(GenBank 억세션 번호gi: 11761629)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 유전성 신장 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 피브리노겐 유래 펩타이드의 SGIFTN(배열번호 41)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 피브리노겐 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 34에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 피브리노겐의 SGIFTN이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 32)
인슐린으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
인슐린(GenBank 억세션 번호gi: 229122)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 주사국재(injection-localized) 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 인슐린 유래 펩타이드의 ERGFF(배열번호 42)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 인슐린 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 35에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 인슐린의 ERGFF가 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 33)
프로락틴으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
프로락틴(GenBank 억세션 번호gi: 4506105)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 하수체 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 프로락틴 유래 펩타이드의 RDFLDR(배열번호 43)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 프로락틴 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 36에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 프로락틴의 RDFLDR이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 33)
프로락틴으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
프로락틴(GenBank 억세션 번호gi: 4506105)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 하수체 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 프로락틴 유래 펩타이드의 RDFLDR(배열번호 43)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 프로락틴 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 36에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 프로락틴의 RDFLDR이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 33)
베타-2-마이크로튜블린으로부터의 아밀로이드 형성 펩타이드의 동정
베타-2-마이크로튜블린(GenBank 억세션 번호gi: 70065)에 의한 아밀로이드 원섬유의 형성은 혈액 투석 관계의 아밀로이도시스와 관련된다[Sacchettini 및 Kelly(2002), Nat Rev Drug Discov, 1: 267-75]. 아밀로이드의 자기조합에서의 방향족 잔기의 제안된 역할에 기초하여, 베타-2-마이크로튜블린 유래 펩타이드의 SNFLN(배열번호 44)의 아밀로이드 형성 특성을 조사하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 7 및 실시예 10에 기재하였다.
결과 - 원섬유 초분자의 초미세 구조를 형성하는 베타-2-마이크로튜블린 유래 펩타이드의 능력을 특징으로 하기 위해, 네거티브 염색에서의 전자현미경 관찰분석을 행하였다. 도 37에 보이는 바와 같이, 온화한 조건의 하에서 필라멘트상 구조를 선택된 펩타이드에 대하여 관측하였다. 이것은 베타-2-마이크로튜블린의 SNFLN이 폴리펩타이드의 자기조합을 위해 중요하다는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 더욱 본 발명에 의해 아밀로이드 형성 펩타이드의 배열을 예측할 수 있다는 것을 실증하고 있다.
(실시예 35)
본 발명의 교시에 따라 동정한 아밀로이드 형성 펩타이드의 아밀로이드 형성의 억제
전장 폴리펩타이드에 의한 아밀로이드 형성을 억제하는 본 발명의 교시에 따라 동정한 IAPP의 아밀로이드 형성 펩타이드의 능력을 펩타이드 배열NFLVHPP(배열번호 45)에 보이는 바와 같이, β-파괴제의 플로린 잔기를 인식배열에 부가하는 것에 의해 조사하였다.
억제제의 존재 하 및 비존재 하에서의 아밀로이드 원섬유 형성의 정도를 분자 지시제로서 티오플라빈T(ThT)을 사용하여 평가하였다. ThT색소의 형광의 정도는 용액 중의 아밀로이드 원섬유의 양에 직접 적으로 상관된다[LeVine H 3rd. (1993), Protein Sci., 2: 404-410]. IAPP용액(10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 4μM의 hIAPP)을 40μM의 개변 펩타이드(즉, NFLVHPP)의 존재 하 또는 비존재 하에서 실온에서 인큐베이션하였다. 이 용액을 50 mM 인산나트륨 (pH 6. 0)에 3μM의 티오플라빈T(ThT)을 함유하는 용액에 10배 희석하고, LS50B 분광 형광계(Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 사용하여 450 nm에서의 여기에 의한 480 nm에서의 형광을 측정하는 것에 의해 원섬유 형성을 측정하였다. 대조로서, 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)을 ThT 용액에 희석하고, 형광을 기재된 바와 같은 측정하였다.
결과 - 도 38에 보이는 바와 같이, IAPP는 단독에서는 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 예상되는 바와 같이 고 레벨의 ThT의 형광을 보였으나, 억제 펩타이드의 존재 하에서는 형광이 현저하게 증대하였다. 따라서 이들 결과에 의해, NFLVH배열이 IAPP 폴리펩타이드에서의 아밀로이드 형성 결정 인자로서 확인된다.
(실시예 36)
아밀로이드의 조합에서의 소수성 잔기의 중요성
IAPP의 기본 아밀로이드 형성 유닛에서의 방향족 잔기의 중요성을 실시예 1-실시예 5에서 입증하였다. 기재된 바와 같은, 페닐알라닌을 알라닌으로 치환하면, 아밀로이드 형성 프래그먼트(NAGAIL, 배열번호 9)가 인비트로로 아밀로이드 원섬유를 형성하는 능력이 없어진다. 이 관측 결과, 다른 짧은 아밀로이드 관련 배열에서의 방향족 잔기의 현저한 존재(실시예 12-실시예 35), 및 화학 및 생화학에서의 자기조합 프로세스에서의 π 스태킹의 광범위하게 알려져 있는 역할에 기초하여, 방향족 잔기의 스태킹이 아밀로이드 원섬유 형성 프로세스에서 역할을 수행할 수 있다는 것이 시사되었다[Gazit(2002), FASEB J., 16: 77-83].
연구를 페닐알라닌 잔기가 그 방향족성(aromaticity)에 기인되어 중요한지 또는 그 소수적 성질에 기인되어 중요하지를 나타내기 위해 더욱 확장하였다. IAPP의 기본 아밀로이드 형성 유닛(즉, NFGAIL펩타이드)의 자기조합에 대한 소수성 잔기에 의한 페닐알라닌 치환에 의한 영향을 검토하였다.
이 연구에서 사용된 펩타이드 및 그 표시의 일람을 하기의 표 6에 나타낸다.
아미노산 치환 및 hIAPP상의 좌표 펩타이드 서열 배열번호
WT 22-29 NH2-NFGAILSS-COOH 46
F>I 22-29 NH2-NIGAILSS-COOH 47
F>L 22-29 NH2-NLGAILSS-COOH 48
F>V 22-29 NH2-NVGAILSS-COOH 49
F>A 22-29 NH2-NAGAILSS-COOH 89
이들 소수성 아미노산은 페닐알라닌과 유사의 소수성을 가지거나, 또는 페닐알라닌보다도 더욱 약간 소수성이 크지만[Wolfenden(1981), Biochemistry, 20: 849-855; Kyte(1982), J. Mol. Biol., 157: 105-132; Radzicka(1988) ], 이들은 방향족성이 아닌 것이 이해된다. 더욱, 발린 및 이소로이신은 β-시이트가 많은 아밀로이드 원섬유의 형성에서 중요한 것으로 추정되는 매우 강한 β-시이트 형성 인자인 것으로 간주된다[Chou(1974), Biochemistry, 13: 211-222; Chou(1978), Annu. Rev. Biochem., 47: 251-276].
(실시예 37)
탁도측정에 의해 모니터했을 때의, 소수성에 개변된 hIAPP 펩타이드 프래그먼트의 응집 속도론의 특징 부여
실험 수순 - 실시예 8에 기재된 바와 같이 실행하였다.
결과
소수성으로 개변된 IAPP 유래 펩타이드 아날로그의 응집능에 대한 통찰을 얻기 위해, 탁도 시험을 행하였다. 야생형 펩타이드 및 다양한 펩타이드 변이형의 새롭게 제조된 스톡 용액을 DMSO 중에서 제조하였다. 그 후, 펩타이드를 완충 용액에 희석하고, 탁도를 시간의 함수로서 405 nm에서의 흡광도를 추적하는 것에 의해 모니터하였다. 도 39에 보이는 바와 같이, 탁도의 현저한 증대가 수용액에의 희석후 수분 이내에 야생형의 NFGAILSS 옥타펩타이드에 대하여 관측되었다. 응집곡선의 형상은 탁도의 급속한 증대가 최초의 1 시간 내에 존재하고, 그 후 모니터된 인큐베이션 시간 전체에 걸친 탁도의 매우 지연된 증대를 수반하는 포화곡선의 형상과 유사하였다. 이것은 아마도 자유로운 구성 블록의 수를 율속 인자로 하는 신속한 응집 프로세스를 반영하고 있다. 대조적으로, 아날로그펩타이드는 어떤 것도 임의의 의미있는 응집거동을 드러내지 않고, 또 모든 소수성 아날로그 및 알라닌 치환 아날로그의 탁도는 적어도 24 시간에 걸쳐 매우 낮은 상태를 유지하였다(도 39).
소수성 아날로그의 비응집 거동이 극히 지연된 속도론의 결과인지의 여부를 입증하기 위해, 펩타이드 아날로그의 용액을 동일한 실험조건에서 1 주간에 걸쳐 인큐베이션하고, 종점의 탁도치를 측정하였다. 도 30에 보이는 바와 같이, 다소 낮은 정도의 탁도가 NIGAILSS에 관하여 관측되고, 보다 낮은 정도가 탁도의 저하 순서로, NLGAILSS, NAGAILSS 및 NVGAILSS의 펩타이드에 대하여 관측되었다. 그러나, NIGAILSS의 경우에서 조차, 탁도의 정도는 야생형의 NFGAILSS단백질과 비교하여 현저하게 저하하고 있다(도 40). 더욱, 보다 낮은 정도의 응집이 소수성이 큰 β-시이트 형성 인자의 발린에의 치환에 관하여 관측되었으므로, 응집능과 소수성 또는 β-시이트 형성경향과의 사이에는 상관이 전혀 확인되지 않았다. NFGAILSS야생형 펩타이드의 종점 탁도치의 약간의 저하는 24 시간의 인큐베이션의 후에 얻어진 값과 비교한 경우, 큐벳(cuvette) 표면에 부착하는 매우 큰 응집물이 형성한 것을 반영하는 것일 수 있다.
(실시예 38)
소수성에 개변된 hIAPP 펩타이드 프래그먼트의 초미세 구조분석
전자현미경 관찰분석을 실시예 10에 기재된 바와 같이 실행하였다.
다양한 아날로그펩타이드에 의해 형성된 모든 가능한 구조의 초미세 구조가시화를 5일 사이의 인큐베이션의 후에 행하였다. 이 구조분석은 다양한 응집물을 개별적으로 가시화하였으므로, 가장 고감도의 방법을 표시한다. 그 목적을 위해 형성된 구조의 존재 및 특징을 응집 시험(실시예 32)에서 인큐베이션된 동일한 펩타이드 용액을 이용하여 네거티브 염색을 사용하여 전자현미경 관찰에 의해 조사하였다. 예상된 바와 같이, 충분한 질서를 가지는 원섬유가 야생형 펩타이드의 NFGAILSS 펩타이드 프래그먼트에 관하여 관측되었다(도 41a-도 41b). 몇 개의 무정형의 응집물도 개변된 프래그먼트에 관하여 확인될 수 있었다(도 41c-도 41f). 그러나, 그러한 구조는 현미경 그리드에서는 현저하게 많지 않았다. 보다 큰 응집성 구조가 알라닌 아날로그와 비교한 경우, 더욱 소수성인 치환체에 관하여 관측되었다. 또한, 상기에 기술된 바와 같이, NFGAILSS 펩타이드에 관하여 확인된 질서있는 원섬유 구조와는 달리, 이들 응집물은 극히 희박(rare)하고, 질서있는 구조를 가지지 않았다(도 41c-도 41f). 그러한 불규칙하고 산발적인 구조는 상당히 소수성인 분자를 오래 인큐베이션한 후에 예상되는 바와 같은 어느 정도의 비특이적인 응집과 일치하고 있다.
(실시예 39)
IAPP의 자기조합에서의 페닐알라닌의 특이적인 기능의 결정
IAPP의 자기조합에서의 페닐알라닌 잔기의 특이적인 역할을 결정하기 위해, 멤브레인형 결합 시험을 "기본 아밀로이드 형성 유닛"을 인식하는 전장 hIAPP의 능력을 촉진시키는 분자결정 인자를 체계적으로 조사하기 위해 실행하였다. 이 목적을 위해 페닐알라닌 위치를 체계적으로 변화시킨 펩타이드(배열번호 91-110)의 어레이와 상호작용하는 MBP-IAPP(실시예 6 참조)의 능력을 검토하였다.
재료 및 실험 수순 - 실시예 6-실시예 7을 참조할 것.
결과
SNNXGAILSS모티브(배열번호 90) (식 중, X는 시스테인을 제외하고 임의의 천연 아미노산이다)에 대응하는 펩타이드 배열을 구축하였다. 도 42a에 보이는 바와 같이, MBP-IAPP의 결합을 방향족성의 트리프토판 잔기 및 페닐알라닌 잔기를 X 위치에 함유하는 펩타이드에 대하여 명료하게 관측하였다(도 42a). 흥미롭게도, 결합은 또 페닐알라닌이 아르기닌 및 리신 등의 염기성아미노산으로 치환했을 때에도 관측되었다. 대조적으로, 그 위치의 소수성 치환체의 어느 것에 관하여도, 결합은 멤브레인에 장시간 노출된 후에도 관측되지 않았다(도 42b).
단시간의 노출에서의 결합을 덴시토메트리를 사용하여 평가하였다(도 42c). 그러나, 합성 시의 커플링 효율, 따라서 스폿 당 펩타이드의 양이 변화할 수 있으므로, 측정한 결합은 반정량적(semiquantitative)으로서 해석해야 하는 것이 이해된다. 그러나, 이 경우 다양한 펩타이드 변화체 사이의 결합의 차가 현저한 것이 매우 분명하였다.
정리하면, 이들 관측 결과의 모두가 아밀로이드 형성 프로세스의 촉진에서의 방향족 잔기의 역할을 실증하고 있다.
(실시예 40)
α-아미노이소부틸산(Aib) 치환 아밀로이드 형성 펩타이드의 설계 및 입체배좌
IAPP 폴리펩타이드(즉, IAPP14-20, 상기 표 3 참조)의 최소아밀로이드 형성영역은 그것에 결합하고, 그것을 블록하고, 그 응집을 방지할 수 있는 억제제를 설계하기 위한 타겟배열로서 선택되었다.
실험 방법
아밀로이드 형성 펩타이드의 응집능력을 없애기 위해, β-시이트 파괴제를 타겟배열에 결합시킴으로써, 원섬유를 형성하기 위해 모노머가 함께 스태킹 되는 β-시이트 배좌를 펩타이드가 표시할 수 없도록 한다. α-아미노이소부틸산(Aib)은 카르복실기의 Cα에 결합된 2 개의 메틸 잔기를 함유하는 비천연의 아미노산이다. 천연의 아미노산과 달리, 이 분자는 Cα에 결합된 수소원자를 가지지 않는다. 이것은 특히 아미드 결합의 φ 및 ψ각에 관한 아미노산의 입체특성에 광범위하게 영향을 준다. 알라닌은 넓은 범위의 가능한 φ 및 ψ입체배좌를 가지만, α-메틸화 알라닌인 Aib는 제한된 φ 및 ψ입체배좌를 가진다. 도 43a는 L-알라닌 및 D-알라닌의 라마찬드란 플롯의 중첩(superposition)으로부터 유도되는 Aib의 입체배좌 맵을 나타낸다. 도 43a에 대하여 명백한 바와 같이, 가능한 각도는 작은 영역에 제한되고, 전체의 구조는 β-쇄 입체배좌 보다 오히려 α-나선 입체배좌를 위해 더욱 적합하다.
따라서 Aib는 아밀로이드 응집의 중심인 β-시이트 입체배좌를 예방하기 위해 사용할 수 있다. 특히, Aib와 플로린의 라마찬드란 플롯 사이의 비교는 Aib가 플로린보다 강력한 β-시이트 파괴제인 것을 보여준다(도 43a).
IAPP아밀로이드 형성영역을 포함하는 2 개의 펩타이드(즉, ANFLVH 및 ANFLV, 각각 배열번호 124 및 126)를 합성하여 알라닌 및 로이신 잔기를 치환하는 Aib를 포함시켰다. 다음의 아미노산 배열, 즉 Aib-NF-Aib-VH(배열번호 125) 및 Aib-NF-Aib-V(배열번호 127)를 포함하는 새로운 합성된 펩타이드를 각각 도 43b-c에 도시한다.
펩타이드 합성 - 고상기술을 사용하여 Peptron,Inc. (Taejeon, 한국)에 의해 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드의 정확한 정체는 HP1100 시리이즈 LC/MSD를 사용하여 이온 스프레이 질량분석법에 의해 확인되었다. 펩타이드의 순도를 물 및 0.1% 트리플루오로 초산(TFA)에서 0% - 100%의 아세토니트릴의 30 분의 직선구배를 1ml/분의 유속으로 사용하여, C18컬럼에서의 역상 고압액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 확인하였다.
펩타이드 용액 - 새로운 조제된 스톡 용액을 동결건조 형태의 펩타이드를 디메틸 설폭시드(DMSO)에 100 mM의 농도로 용해하는 것에 의해 제조하였다. 모든 사전 응집을 피하기 위해 새로운 스톡 용액을 각각의 실험을 위해 조제하였다. 펩타이드 스톡 용액을 하기와 같은 마이크로 튜브에 희석하였다. 5μl의 펩타이드 스톡 용액을 95μL의 10 mM Tris(pH 7.2)에 가하였다(따라서 펩타이드의 최종농도는 5%의 DMSO의 존재 하에서 5 mM이었다).
(실시예 41)
야생형 및 Aib개변hIAPP 펩타이드의 초미세 구조분석
상기 실시예 40에 기재된 펩타이드의 원섬유 형성능을 전자현미경 분석에 의해 평가하였다.
재료 및 실험 수순
투과전자현미경 - 4 일간 (wt펩타이드) 및 10 일간 (개변 펩타이드) 시효된, 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2) 내의 5 mM 펩타이드 용액의 10μL 샘플을 400 메시의 구리 그리드(SPI Supplies,West Chester PA) 상에 설치하고, 카본 안정화 포름바르 필름에 의해 피복하였다. 1 분 후, 과잉의 액체를 제거하고, 다음에 그리드를 2% 초산 우라닐 수용액으로 2 분간 더 네거티브 염색하였다. 샘플을 80kV로 가동하는 JEOL 1200EX 전자현미경으로 조사하였다.
결과
Aib 함유 펩타이드의 아밀로이드 원섬유를 형성하는 능력을 천연의 IAPP 펩타이드와 비교하여 조사하였다. Aib개변 및 야생형 펩타이드의 시효된 용액을 네거티브 염색을 사용하여 전자현미경(EM) 하에서 조사하였다. 도 44a-b에 보이는 바와 같이, 양 천연 펩타이드, 즉 ANFLVH(도 44a) 및 ANFLV(도 44b)는 전장 IAPP 단백질에 의해 형성된 원섬유에 대하여 높은 유사성을 가지는 원섬유 구조를 형성하였다. 다른 한편, Aib 함유 펩타이드, 즉 Aib-NF-Aib-VH(도 44c) 및 Aib-NF-Aib-V(도 44d)에 대하여, 보다 긴 인큐베이션 기간 후에도 원섬유 구조는 전혀 존재하지 않았지만, 무정형의 응집물은 여전히 존재하였다. 이것은 본 발명의 Aib치환 펩타이드가 원섬유를 형성할 수 없다는 것을 시사하고 있다.
(실시예 42)
콩고 레드결합 시험에 의한 야생형 및 Aib치환IAPP 펩타이드의 아밀로이드 형성능의 시험
재료 및 실험 수순
콩고 레드 염색 및 복굴절 - 10 일간 시효된 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 5 mM 펩타이드 용액의 10μL현탁액을 유리제의 현미경 슬라이드 유리 위에서 하룻밤 건조시켰다. 염색을 80% 에탄올(v/v) 용액에서의 포화 콩고 레드(CR) 및 NaCl의 10μL현탁액을 가하는 것에 의해 실행하였다. 용액을 0.2μm필터에 의해 여과하였다. 그 후, 슬라이드 유리를 수 시간 건조시켰다. 복굴절을 직교 편광자를 구비한 SZX-12 실체현미경(Olympus,Hamburg, 독일)을 이용하여 측정하였다. 100 배율로 표시되었다.
결과
콩고 레드 염색을 사용하여 Aib 개변 펩타이드의 아밀로이드 형성능을 평가하였다. 슬라이드 유리를 직교 편광자를 사용하는 현미경의 하에서 조사하였다. 도 45a-b는 ANFLVH 및 ANFLV 펩타이드(각각 도 45a 및 b)의 양자에게 대하여 전형적인 황녹의 복굴절을 나타낸다. 그러나, EM연구에 의하면 Aib 개변 펩타이드, 즉 Aib-NF-Aib-VH 및 Aib-NF-Aib-V는 복굴절을 전혀 보이지 않았다. 이것은 Aib 개변 펩타이드가 아밀로이드 원섬유를 전혀 형성할 수 없다는 것을 시사하고 있다(도 45c-d).
(실시예 43)
Aib개변IAPP 펩타이드 프래그먼트의 이차 구조분석
퓨리에 변환 적외 분광법(FT-IR)을 Aib개변hIAPP의 이차 구조를 결정하기 위해 실행하였다.
재료 및 실험 수순
퓨리에 변환 적외 분광법 - 적외 스펙트럼을 DTGS 검출기를 구비한 Nicolet사의 Nexus470FT-IR 분광계를 사용하여 기록하였다. 2 주간 시효된 펩타이드 용액의 샘플을 CaF2 플레이트 상에 현탁하고, 진공 건조시켰다. 펩타이드 침착물을 D2O로 재현탁하고, 이어서 건조시키고, 얇은 필름을 형성시켰다. 이 재현탁 수순을 2회 반복하여 수소로부터 중수소로의 교환이 최대로 되는 것을 확실하게 하였다. 측정치를 4cm-1 의 분해능 및 2000회의 주사 평균화를 사용하여 얻었다. 투과율 극소치를 OMNIC 분석 프로그램(Nicolet)에 의해 결정하였다.
결과
FT-IR 분광법을 사용하여, 관찰된 구조의 내부 입체배좌를 해명하였다(상기 실시예 42 및 43 참조). Aib의 함유 시의 도 46a-b에 보이는 바와 같이, IAPP 펩타이드는 IR 스펙트럼에 있어서 급격한 변화를 보였다. ANFLVH 및 ANFLV 펩타이드 스펙트럼은 1630cm-1 및 1632cm-1의 각각에 극소를 가지는 β-시이트 스펙트럼의 전형이지만, Aib-NF-Aib-VH 및 Aib-NF-Aib-V 펩타이드는 1670cm-1 및 1666cm-1의 각각에 극소를 보이고, 그것은 무질서한 코일 입체배좌를 특징으로 한다.
정리하면, 이들 결과는 천연의 IAPP 펩타이드와 Aib 함유 펩타이드의 사이의 근본적인 차이를 시사한다. 천연의 펩타이드는 고도로 아밀로이드 형성성이지만, 개변 Aib 함유 펩타이드는 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 없다(실시예 41-43).
(실시예 44)
Aib 개변 펩타이드는 IAPP 폴리펩타이드에 의한 아밀로이드 형성을 억제한다
Aib억제제 존재 하 및 비존재 하에서의 아밀로이드 원섬유 형성의 정도를 분자 지시제로서 티오플라빈T(ThT)를 사용하여 평가하였다. ThT색소의 형광의 정도는 용액 중의 아밀로이드 원섬유의 양이 직접 적으로 상관한다[LeVine H 3rd. (1993),Protein Sci. 2: 404-410].
재료 및 실험 수순
퓨리에 변환 적외 분광법 - IAPP용액(10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)에서의 4μM 펩타이드)를 40μM의 다양한 펩타이드 용액의 존재 하 또는 비존재 하에서 실온에서 인큐베이션하였다. 용액을 50 mM 인산나트륨 (pH 6. 0)에 3μM의 티오플라빈T(ThT)을 함유하는 용액에 10배 희석하고, Perkin Elmar LS50B 분광 형광계를 사용하여 450 nm에서의 여기에 의한 480 nm에서의 형광을 측정하는 것에 의해 원섬유 형성을 측정하였다. 대조로서, 10 mM의 Tris 완충액(pH 7.2)을 ThT 용액에 희석하고, 형광을 기재된 바와 같은 측정하였다.
결과
도 47에 보이는 바와 같이, 모든 Aib 개변 펩타이드는 전장 IAPP 폴리펩타이드의 조합을 억제할 수 있다. 이것은 아밀로이드 형성 펩타이드의 Aib개변이 다양한 치료용도에서 강력한 억제 툴로서 작용할 수 있다는 것을 시사하고 있다.
(실시예 45)
디- 및 트리-방향족 펩타이드는 IAPP 폴리펩타이드의 응집을 억제할 수 있다
짧은 방향족 아미노산 배열이 아밀로이드 폴리펩타이드의 조합을 억제하는 능력을 연구하고, β-시이트 파괴제 아미노산이 이와 같은 억제를 용이하게 하는 능력을 검토하기 위해, 테트라-, 트리- 및 디-펩타이드의 어레이를 합성 및 평가하였다.
실험 수순
펩타이드 합성 - 실시예 45 및 실시예 46-47에 사용된 펩타이드 및 그 표시의 일람을 하기의 표 7에 나타낸다. 펩타이드 합성은 이하의 실시예 46-47에 기재되어 있다.
동정 아미노산 배열 배열번호
EG01 D-Phe-D-Phe-D-Pro 128
EG02 Aib-D-Phe-D-Asn-Aib 129
EG03 D-Phe-D-Asn-D-Pro 130
EG04 Aib-Asn-Phe-Aib 131
EG05 Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe 132
EG06 Tyr-Tyr 133
EG07 D-Phe-D-Phe-D-Pro 112
EG08 Aib-D-Phe-D-Asn-Aib 113
EG09 Aib-Asn-Phe-Aib 114
EG10 Tyr-Tyr 115
EG11 Tyr-Tyr-NH2 116
EG12 Aib-Phe-Phe 117
EG13 Asn-Tyr-Aib 118
EG14 Asn-Tyr-Pro 119
EG15 β-아미노이소부틸산 (Aib) D-Pro-D-Tyr-D-Asn 120
EG16 D-Tyr-Aib 121
EG17 D-Pro-D-Tyr 122
EG18 D-Tyr-D-Pro 123
EG19 Asn-Tyr-Tyr-Pro 134
EG20 Tyr-Tyr-Aib 135
EG21 Aib-Tyr-Tyr 136
EG22 Aib-Tyr-Tyr-Aib 137
EG23 D-Asn-Tyr-Tyr-D-Pro 138
EG24 Pro-Tyr-Tyr 139
EG25 Tyr-Tyr-Pro 140
EG26 Pro-Tyr-Tyr-Pro 141
EG27 D-Tyr-D-Tyr 142
EG28 D-Pro-Aib 143
EG29 D-Phe-D-Pro 144
EG30 D-Trp-Aib 145
EG31 D-Trp-D-Pro 146
d-F-P D-Phe-Pro 147
P-d-F Pro-D-Phe 148
ThT 형광 시험 - 상기 실시예 44 참조
결과
억제 펩타이드를 (기재된 바와 같은) 표준ThT 형광 시험을 사용하여 평가하였다. 도 48은 142 시간의 인큐베이션 후, IAPP응집이 평탄상태에 도달한 후의 종점치를 나타낸다. 응집 시험을 IAPP 폴리펩타이드(4μM) 및 억제 펩타이드(40μM)의 존재 하에서 실행하였다.
도 48에 명확하게 보이는 바와 같이, 짧은 방향족 아미노산 배열은 그 응집을 억제하면서 IAPP 폴리펩타이드에 대한 인식을 매개한다. 가장 우수한 억제제는 Aib-Phe-Phe펩타이드(EG12)이고, 여기서 Aib 잔기는 아밀로이드 관련구조를 형성할 수 있는 최단의 인식 엘리먼트에 결합되어 있다[Reches and Gazit,Science(2003),300(2619) : 625-7]. D-Tyr-D-Pro(EG18) 및 D-Tyr-D-Aib(EG16)는 IAPP응집에 대하여 의미있는 억제 효과를 보이고, 이것은 단일 방향족 잔기가 분자인식을 개재하는 능력을 실증한다. 흥미롭게도, Aib는 플로린보다 높은 억제활성을 보였다. 더욱, 방향족 아미노산에 대한 β-시이트 파괴제 아미노산의 위치에서 상이한 펩타이드EG17과 EG18의 사이의 활성의 의미있는 차는 펩타이드의 조성만이 아니고, 순서에 대한 역할을 시사한다.
(실시예 46)
최상으로 실시하는 IAPP 원섬유화 억제제의 선택 및 그것을 선택하는 기준
펩타이드 합성-펩타이드 합성(EG5,EG6 및 EG7,D-Phe-Pro, 및 D-Pro-Phe를 제외하고)을 고상 합성(Peptron,Inc.,Taejeon, 한국)을 사용하여 실행하였다. 펩타이드의 동정은 이온 스프레이 질량분석법에 의해 확인되었다. 펩타이드의 순도를 역상 고압액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 확인하였다. EG5, EG6, 및 EG7, D-Phe-Pro, 및 D-Pro-Phe를 Bachem(Bubendorf, 스위스)로부터 구입하였다. 소도 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP)를 CalBiochem(La Jolla CA, 미국)으로부터 구입하였다.
티오플라빈 형광 시험 - hIAPP 원섬유화는 티오플라빈 T 색소결합 시험에 의해 모니터되었다. hIAPP1-37 스톡 용액을 억제제(40 μM)가 있는 상태 또는 없는 상태의 10 mM 초산소디움 완충액(pH 6. 5)에서 4μM의 최종농도로 그리고 1% (vol)의 HFIP의 최종농도로 희석하였다. 희석 직후, 샘플을 4℃에서 20,000 x g에서 20 분간 원심분리하고, 상징(supernatant) 획분을 형광 측정을 위해 사용하였다. 각 측정마다 Tht를 3 μM의 최종농도로 1mL 샘플에 첨가하고, 측정을 Perkin-Elmer(여기(excitation) 450 nm, 2.5 nm 슬릿; 발광 480 nm, 10 nm 슬릿)를 사용하여 실행하였다. 백그라운드 방사선은 모든 샘플로부터 제거하였다.
결과
잠재적인 억제제의 동정 및 억제제 설계를 위한 규칙 - IAPP 원섬유화의 작은 펩타이드 억제제를 동정하고, 억제제의 최소길이 및 그 최대 안정성을 최적화하기 위해, 펩타이드 선택의 반복 사이클을 D-아미노산 배열 아날로그를 사용하여 실행하였다.
도 49a에 도시된 선택의 제1 라운드는 트리펩타이드와 같은 짧은 펩타이드가 IAPP에 의한 아밀로이드의 형성을 효율적으로 억제할 수 있는 것을 증명하였다. EG01과 EG03의 비교는 짧은 펩타이드 내의 Asn잔기의 존재가 아밀로이드 형성의 억제에 공헌하지 않는 것을 시사하고, 더 적절한 억제를 위해 β-파괴제와 함께 방향족 부분을 사용하는 것을 지지한다. EG05, 아밀로이드 형성을 위해 공지의 억제제[Tjernberg외(1996), J. Biol. Chem. 271: 8545-854]에 의한 IAPP 원섬유화의 효과적인 억제는 방향족 잔기에 의한 아밀로이드 형성의 일반적인 억제를 시사한다. 실제로, EG05 및 훨씬 짧은 EG08(Phe-Phe에 결합한 Aib) 엘리먼트의 유사한 활성은 EG05의 일반적인 억제가 그 방향족의 성질에 유래하는 것을 명확하게 시사한다.
도 49b에 도시된 선택의 제2 라운드는 효과적인 억제가 트리펩타이드에 의해서 뿐만 아니라 디-펩타이드(EG16,EG17,EG18)에 의해서도 달성될 수 있는 것을 증명하였다. 모든 경우에 있어서 방향족 부분에의 D-이성체의 결합을 사용하였다. EG16과 EG17의 사이의 차는 억제제의 설계를 위한 규칙을 확립하기 위해 다음의 라운드에서 더 연구되었다. 도 49c는 선택의 제3 라운드의 결과를 나타낸다. EG20 대 EG21(d-F-P 대 P-d-F)의 제3 라운드에서의 비교(도 49c)는 제2 라운드에서의 EG16과 EG17을 비교하는 것에 의해 얻어진 결과, 및 EG24와 EG35를 비교하는 것에 의해 얻어진 결과(제4 라운드에 있어서 -도1d)와 함께 (방향족 D 또는 L) -(β-파괴제)에 기술된 바와 같은 디-펩타이드 억제제의 설계를 위한 일반식을 시사한다. 이들 선택스텝은 (방향족 D 또는 L) -(방향족 D 또는 L) -(β-파괴제)에 기술된 바와 같은 트리펩타이드 억제제를 위해 일반식을 더 제공하였다.
제4 라운드는 또 4개의 추정되는 대사적으로 안정한 디-펩타이드 EG28, EG29, EG30, EG31의 억제능력을 증명하였다. 다시, 억제배열을 위해 방향족 아미노산 및 베타 파괴제의 유용성이 강조된다.
(실시예 47)
D-Trp-Aib에 의한 β-아밀로이드 폴리펩타이드 원섬유 형성의 억제
펩타이드 합성 - 상기 실시예 46 참조. 재조합 β-아밀로이드(Aβ1-40, >98% 순도)를 rPeptide(Athens GA, 미국)로부터 구입하였다.
티오플라빈 T 형광 시험 - Aβ1-40의 원섬유화를 티오플라빈 T 색소결합 시험에 의해 모니터하였다. Aβ1-40 스톡 용액을 억제제가 있는 상태 또는 없는 상태의 100 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 5μM의 최종농도로 희석하였다. 각 측정마다 Tht를 0.1mL 샘플에 첨가하고, 0.3μM의 ThT 및 0.4μM의 폴리펩타이드의 최종농도로 하였다. 측정을 Jobin Yvon FluroMax-3(여기450 nm,2.5 nm 슬릿; 발광480 nm,5 nm 슬릿, 적분시간 1 초)을 사용하여 실행하였다. 백그라운드 방사선을 모든 샘플로부터 제거했다.
투과전자현미경 관찰 - 10μL 샘플을 400 메시의 구리 그리드(SPI supplies,West Chester PA)에 설치하고, 카본 안정화 포름바르 필름에 의해 피복시켰다. 1 분 후, 과잉의 액체를 제거하고, 그 후 그리드를 2% 초산 우라닐 수용액으로 2 분간 더 네거티브 염색하였다. 샘플을 80kV로 가동하는 JOEL 1200EX 전자현미경으로 조사하였다.
결과
억제의 형광 측정 - D-Trp-Aib가 IAPP 이외의 분자에 의해 아밀로이드 형성을 억제할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 알츠하이머의 β-아밀로이드1-40(Aβ)를 모델계로서 사용하였다. 도 50에 보이는 바와 같이, 억제제의 부존재 하에서는 Aβ는 약 100 시간의 원섬유화에서의 지연단계를 보이고, 그 후 형광 레벨에서의 급속한 증가를 보였다. 10 μM의 EG30의 존재 하에서는 지연시간은 의미있게 증가되고, 평탄상태에 도달했을 때의 형광 전체는 억제제가 없는 상태에서 관찰되는 것보다 의미있게 낮았다.
이것은 더욱 방향족 억제제가 일반적인 아밀로이드 억제제 및 조합의 공통의 메카니즘으로서 작용할 수 있는 것을 시사한다[Gazit(2002),FASEB J. 16,77-83].
초미세 구조분석 - 억제의 메카니즘의 정보를 얻기 위해, 그 말단(termination) 시험 시의 형광 시험으로부터 취한 시료를 전자현미경에 의해 조사하였다(도 51a-c). 억제제를 포함하지 않는 Aβ의 샘플에는 명확하게 양호하게 규정된 아밀로이드 섬유가 존재하고 있다(도 51a). 대조적으로, EG30의 존재 하에서는 Aβ는 거의 무정형 응집체(도 51b)로서 또는 분단된 원섬유(도 51c)로서 검출되었다. 이것은 억제제의 존재 하에서 형성된 그러한 원섬유인 경우에도 짧고, 기능부전의 가능성이 있다는 것을 시사하고 있다.
따라서 D-Trp-Aib 화합물은 극히 작은 분자에서 약학적 특성의 독자적인 조합을 제공한다:
1. 헤테로 방향족 상호작용: 증식하는 아밀로이드 원섬유(Gazit,2002)의 방향족 인식계면(recognition interfaces)과 트리프토판 인돌의 사이의 상호작용은 증식하는 쇄의 더욱 호모분자 자기조합을 직접적으로 그리고 정확하게 블록하는 특정의 배향된 결합을 가능하게 한다.
2. Aib입체배좌 제한: β-아미노이소부틸산(Aib), 즉 예외적으로 기하학적인 제약을 가지는 아미노산의 결합은 극히 강한 β-시이트 파괴효과를 유도하고, 아밀로이드 원섬유의 증식을 정지시키는 주요 수단이다. 이 β-파괴 전략은 분자의 크기 및 복잡성에 관하여 종래 기술(플로린 도입)과 비교하면 명백한 이점을 나타낸다.
3. 안정한 D-이성체 입체배좌: 억제제는 D-아미노산 및 비키랄(non-chiral)의 Aib부분으로부터 구축된다. 이것에 의해 개열할 수 없는(non-cleabable) 펩타이드 결합의 형성을 발생하고, 따라서 추정상 높은 생리학적 안정성을 발생한다.
4. 펩타이드 결합 스태킹: 그 작은 크기에 불구하고, 전형적인 펩타이드 결합(이성체적으로 안정한 것이지만)은 분자 내에 유지된다. 그러한 펩타이드 결합의 독자적인 평면의 특성은 β-쇄 상호작용과 일치하는 정확한 기하학 형태를 가지는 그러한 부분적으로 평면의 공명 구조에 기인되어, 증식하는 아밀로이드 쇄 상의 분자의 특정의 기하학적으로 제약된 스태킹을 가능하게 한다.
5. 정전기 반발: 전하를 가지는 말단의 존재는 더욱 결합 모노머의 정전 반발을 유발한다. 이와 같은 반발은 다른 펩타이드 억제제에서 전하를 가지는 아스파라긴산을 도입하는 것에 의해 달성된다[Soto외(2003), J. Biol. Chem 278: 13905]. 이것은 단백질 분해를 감소하기 위해 이들 펩타이드의 말단을 블록하는 필요성이 있기 때문이다. D-Trp-Aib의 비천연의 안정한 이성체 형태는 의미 있게 작은 분자를 발생하는 최소의 프레임워크 내에서 전하를 가지는 말단의 유지를 가능하게 한다.
6. 부피가 큰(bulky) 소수성 부분: 트리프토판 인돌기는 극히 작은 분자계에서 독자의 큰 부피 및 소수성의 특성을 제공한다. 트리프토판 부분은 가장 높은 막 분배 계수(membrane partition coefficient)를 가지는 것이 충분히 확립되어 있다. 이 특성은 경구 생물학적 이용성(oral bioavailability) 및 혈액 뇌관문(BBB) 이행을 위한 주요 이점을 가져야 하는 것으로 생각된다.
7. 산화방지 활성: 인돌기는 프리-라디칼의 제거에 의해 산화방지제로서 작용하는 것으로도 알려져 있다. 실제로, AD를 처치하기 위한 약제 후보의 일부는 이 특성에 기초하고 있다(예를 들면, MindSeT의 인돌-3-프로피온산). 그러나, 이와 같은 분자는 AD 관련 산화 스트레스로부터 신경세포의 보호에 유효하지만, 이들은 D-Trp-Aib 분자 프레임의 독자의 원섬유화 억제특성이 결여되어 있다.
8. 작은 크기: D-Trp-Aib는 현저하게 작은 활성분자이다. 이전의 문단(1-7)에 기재된 독자의 특성의 전부는 300Da 미만의 분자 내에서 유지된다. 이 개열할 수 없는 분자의 작은 크기는 낮은 면역원성을 유지하면서, 경구 생물학적 이용성, 긴 반감기, 및 BBB의 이행을 시사한다.
명확화를 위해 별개의 실시태양으로 기재된 본 발명의 특정의 특징은 단일의 실시태양으로 조합하여 제공될 수 있고, 반대로 간단화를 위해 단일의 실시태양으로 기재된 본 발명의 다양한 특징은 별개로 또는 어떤 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명을 그 특정 태양에 관하여 설명하였으나, 많은 대체, 변경 및 변형태양이 당업자에 있어서 명백하다는 것이 분명하다. 따라서, 특허청구의 범위의 정신 및 그 넓은 범위에 포함되는 그러한 대체, 변경 및 변형태양은 전체가 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 본 명세서에 언급된 간행물, 특허 및 특허출원은 모두 각 개개의 간행물, 특허, 또는 특허출원이 구체적 또 개별적으로 참조로서 본 명세서에 도입되는 정도로 그 전체를 이 명세서 중에 참조로서 도입하였다. 더욱, 본원에서 행한 참고문헌의 인용 및 기재는 당해 참고문헌을 본 발명에 대한 선행 기술으로서 이용될 수 있다는 것을 인정하는 것으로 해석되면 안 된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Tel Aviv University Future Technology Development L.P. <120> PEPTIDES ANTIBODIES DIRECTED THEREAGAINST AND METHODS USING SAME FOR DIAGNOSING AND TREATING AMYLOID-ASSOCIATED DISEASES <130> IL-P05154 <160> 150 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Ala Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Asn Ala Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Asn Phe Ala Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Asn Phe Gly Ala Ala Leu Ser Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Asn Phe Gly Ala Ile 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10 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 89 Asn Ala Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide array consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, but cysteine <400> 90 Ser Asn Asn Xaa Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 91 Asn Ala Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 92 Asn Ala Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 93 Asn Asp Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 94 Asn Glu Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 95 Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 96 Asn Gly Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 97 Asn His Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 98 Asn Ile Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 99 Asn Lys Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 100 Asn Leu Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Asn Met Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 102 Asn Asn Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 103 Asn Pro Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 104 Asn Gln Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 105 Asn Arg Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 106 Asn Ser Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 107 Asn Thr Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 108 Asn Val Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 109 Asn Trp Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 110 Asn Tyr Gly Ala Ile Leu Ser Ser 1 5 <210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 111 Asn Phe Gly Ala Ile Leu 1 5 <210> 112 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> D-Stereoisomer <400> 112 Phe Phe Pro 1 <210> 113 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthtic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D and L methyl alanine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> D and L methyl alanine <400> 113 Xaa Phe Asn Xaa 1 <210> 114 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D and L methyl alanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> D and L methyl alanine <400> 114 Xaa Asn Phe Xaa 1 <210> 115 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 115 Tyr Tyr 1 <210> 116 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> amidated amino acid <400> 116 Tyr Tyr 1 <210> 117 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D and L methyl alanine <400> 117 Xaa Phe Phe 1 <210> 118 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> D and L methyl alanine <400> 118 Asn Tyr Xaa 1 <210> 119 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 119 Asn Tyr Pro 1 <210> 120 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> D-Stereoisomer <400> 120 Asn Tyr Pro 1 <210> 121 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> D and L methyl alanine <400> 121 Tyr Xaa 1 <210> 122 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 122 Pro Tyr 1 <210> 123 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 123 Tyr Pro 1 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 124 Ala Asn Phe Leu Val His 1 5 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D and L methyl alanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> D and L methyl alanine <400> 125 Xaa Asn Phe Xaa Val His 1 5 <210> 126 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 126 Ala Asn Phe Leu Val 1 5 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D and L methyl alanine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> D and L methyl alanine <400> 127 Xaa Asn Phe Xaa Val 1 5 <210> 128 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> D-Stereoisomer <400> 128 Phe Phe Pro 1 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 129 Xaa Phe Asn Xaa 1 <210> 130 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> D-Stereoisomer <400> 130 Phe Asn Pro 1 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 131 Xaa Asn Phe Xaa 1 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 132 Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 133 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 133 Tyr Tyr 1 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 134 Asn Tyr Tyr Pro 1 <210> 135 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 135 Tyr Tyr Xaa 1 <210> 136 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 136 Xaa Tyr Tyr 1 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 137 Xaa Tyr Tyr Xaa 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> D-Stereoisomer <400> 138 Asn Tyr Tyr Pro 1 <210> 139 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 139 Pro Tyr Tyr 1 <210> 140 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 140 Tyr Tyr Pro 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 141 Pro Tyr Tyr Pro 1 <210> 142 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 142 Tyr Tyr 1 <210> 143 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 143 Pro Xaa 1 <210> 144 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 144 Phe Pro 1 <210> 145 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 145 Trp Xaa 1 <210> 146 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 146 Trp Pro 1 <210> 147 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> D-Stereoisomer <400> 147 Phe Pro 1 <210> 148 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> D-Stereoisomer <400> 148 Pro Phe 1 <210> 149 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 149 Cys Trp Xaa 1 <210> 150 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> D-Stereoisomer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <400> 150 Cys Trp Xaa 1

Claims (162)

  1. SEQ ID NOs: 122, 123, 144 내지 148로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 선형 디펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 디펩타이드의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 D-입체이성질체인 디펩타이드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 디펩타이드의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 L-입체이성질체인 디펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 145에 개시된 바와 같은 디펩타이드.
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  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 2형 당뇨병, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병, SAA 아밀로이드증, 유전성 아이슬란드 증후군, 다발성 골수종, 골수암종, 대동맥 아밀로이드, 인슐린 주사 아밀로이드증, 프리온 계통 아밀로이드증, 만성 염증 아밀로이드증, 헌팅턴병, 노인성 전신 아밀로이드증, 뇌하수체 아밀로이드증, 유전성 신장 아밀로이드증, 가족성 영국 치매, 핀란드 유전성 아밀로이드증, 가족성 비신경병 아밀로이드증 및 프리온 질병으로 구성된 군에서 선택된 질환을 치료 또는 예방하기 위한,
    유효 성분으로 SEQ ID NOs: 122, 123, 144 내지 148로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 선형 디펩타이드, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 디펩타이드가 SEQ ID NO: 145에 개시된 바와 같은 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 디펩타이드의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 D-입체이성질체인 약학적 조성물.
  15. 제 11 항에 있어서,
    상기 디펩타이드의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 L-입체이성질체인 약학적 조성물.
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