CN112279889B - 一种多肽、衍生物及其在制备抗肿瘤药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽、衍生物及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。本发明提供了一种多肽，该多肽具有一定的抗肿瘤活性，具有开发成抗肿瘤药物的前景；本发明还提供了上述多肽的两种衍生物，这两种衍生物的抗肿瘤活性显著提高，更具有开发成抗肿瘤药物的前景。

Description

一种多肽、衍生物及其在制备抗肿瘤药物方面的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及多肽药物的研究开发，具体涉及一种多肽、衍生物及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康，其发病率和死亡率呈持续上升的趋势。2019年国家癌症中心最新数据表明，2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人，防控形势严峻。尽管近年来免疫治疗取得了突破性进展，手术、放疗和化疗仍然是临床上普遍采用的肿瘤治疗方法，寻找安全、合理、有效的肿瘤治疗方法是目前肿瘤治疗领域亟待解决的问题。
多肽由几个到几十个天然或非天然氨基酸缩合而成，能够通过天然产物提取、基因重组和化学合成等方式获得。多肽药物具有免疫原性低、组织渗透性好、易于合成和改造、安全性好、不易在组织中蓄积等优点，在抗肿瘤、抗菌、慢性代谢性疾病、心血管疾病、免疫疾病等方面都表现出显著的疗效，目前有80余种多肽药物上市，150余种多肽药物正在开展临床试验。多肽药物的抗肿瘤机制具有多样性，它们可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、激活机体抗肿瘤免疫反应等机制抑制肿瘤的发生发展。由于多肽药物易于改造，人们通常将其进行修饰或融合以增加其肿瘤靶向性和口服给药的顺应性。
由此可见，多肽及其衍生物在抗肿瘤方面具有重要的开发价值。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种多肽，第二目的在于提供所述多肽的衍生物，第三目的在于提供所述多肽及其衍生物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种多肽，其氨基酸序列为：
SNNFGAILSS。
上述多肽用于制备抗肿瘤药物的医药用途。
一种上述多肽的衍生物，其氨基酸序列为：
RGDSNNFGAILSS。
上述衍生物用于制备抗肿瘤药物的医药用途。
一种上述多肽的衍生物，将上述多肽的N端用叶酸修饰，N端与叶酸之间通过酰胺键连接，结构如下：
Figure BDA0002745503590000021
上述衍生物用于制备抗肿瘤药物的医药用途。
有益效果：
本发明提供了一种多肽，该多肽具有一定的抗肿瘤活性，具有开发成抗肿瘤药物的前景；本发明还提供了上述多肽的两种衍生物，这两种衍生物的抗肿瘤活性显著提高，更具有开发成抗肿瘤药物的前景。
附图说明
图1为多肽的质谱图；
图2为多肽衍生物1的质谱图；
图3为多肽、多肽衍生物1和多肽衍生物2的HPLC检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：多肽及其衍生物的制备
多肽序列：SNNFGAILSS(Sequence NO.1)。
多肽衍生物1序列：RGDSNNFGAILSS(Sequence NO.2)。
多肽衍生物2序列：
Figure BDA0002745503590000022
其中，多肽和多肽衍生物1采用常规的固相合成法合成，N末端和C末端都没有经过化学修饰，纯度≥98％。步骤为：
(1)树脂的溶胀
称取0.172g取代度为0.58mmol/g的氯树脂(最终需要合成的多肽摩尔数0.1mmol，树脂的取代度0.058mmol/g，即0.1/0.58＝0.172g)加入10ml规格的合成管中，按照加入合成管体积一半的5ml二氯甲烷(DCM)，溶胀树脂(放置于旋转摇床上20rpm旋转过夜)。
(2)氨基酸缩合
先后按照SSLIAGFNNSDGR的序列顺序，通过技术人员所熟知的保护氨基酸耦合-去保护的过程，将序列加载到树脂上，并去除最后一个氨基酸R的Fmoc保护。
(4)树脂去溶胀及干燥
用5ml DCM及甲醇分别洗树脂两次，使树脂从溶胀状态变回稳定状态(加入甲醇后树脂体积明显减少，降至之前的一半左右)，把甲醇抽干后将树脂转移至10ml EP管中，放置于真空干燥器中用循环水泵或油泵抽至树脂完全干燥。
(5)切落
树脂完全干燥后于天平上称重，计算树脂增量，按照1g干燥后树脂对应10ml切落液来配制切落液，普通多肽可以用95％的TFA/水来切落，对于序列中存在Arg的多肽，使用TFA：水：苯酚：Tis：EDT＝82.5：5：5：5：2.5的切落液来切落。将树脂转移至反应管中，加入切落液，放置于旋转摇床上低速旋转反应0.5h-1h。反应完后用砂芯漏斗将树脂与切落液通过过滤分离，树脂用5ml DCM+TFA(体积比2:8)洗2次，合并切落液，通过旋转蒸发除去切落液中大部分TFA(旋蒸至切落液体积的1/5左右)。
(6)乙醚沉淀多肽
在切落液中加入10倍切落液体积的冰乙醚，可以看到大量白色絮状沉淀，将液体转移至50ml离心管中，用冷冻离心机4℃离心5min，转速为10000rpm，然后弃去上清，加入一定量的冰乙醚重旋沉淀，再次离心，此步骤重复三次，然后弃去上清，装有沉淀的离心管置于真空干燥器中用循环水泵或油泵抽至固体完全干燥。
(7)粗肽的纯化
冻干，即得粗肽，粗肽经HPLC纯化即得多肽、多肽衍生物1。
图1、图2分别为多肽、多肽衍生物1的质谱鉴定图谱。
多肽衍生物2的制备方法为：
通过SPPS标准FMOC化学合成多肽序列2，其中叶酸(Fa)作为非常见氨基酸的形式添加于合成的N端，合成后，将粗制肽冻干并重新溶解，最后通过HPLC纯化，获得了高于95％的纯度，所有产物都通过MALDI-TOF MS进行进一步鉴定。
(1)树脂的溶胀
称取0.172g取代度为0.58mmol/g的氯树脂(最终需要合成的多肽摩尔数0.1mmol，树脂的取代度0.058mmol/g，即0.1/0.58＝0.172g)加入10ml规格的合成管中，按照加入合成管体积一半的5ml二氯甲烷(DCM)，溶胀树脂(放置于旋转摇床上20rpm旋转过夜)。
(2)氨基酸缩合
先后按照SSLIAGFNNS的序列顺序，通过技术人员所熟知的保护氨基酸耦合-去保护的过程，将序列加载到树脂上，并去除最后一个氨基酸S的Fmoc保护。
(3)称取叶酸0.099g(0.3mmol)，加入5ml N’N二甲基甲酰胺(DMF)使之完全溶解，然后加入0.12ml DIEA(0.6mmol)，混匀后加入反应管中，放置于旋转摇床上旋转反应2h。
(4)树脂去溶胀及干燥
用5ml DCM及甲醇分别洗树脂两次，使树脂从溶胀状态变回稳定状态(加入甲醇后树脂体积明显减少，降至之前的一半左右)，把甲醇抽干后将树脂转移至10ml EP管中，放置于真空干燥器中用循环水泵或油泵抽至树脂完全干燥。
(5)切落
树脂完全干燥后于天平上称重，计算树脂增量，按照1g干燥后树脂对应10ml切落液来配制切落液，普通多肽可以用95％的TFA/水来切落，对于序列中存在Arg的多肽，使用TFA：水：苯酚：Tis：EDT＝82.5：5：5：5：2.5的切落液来切落。将树脂转移至反应管中，加入切落液，放置于旋转摇床上低速旋转反应0.5h-1h。反应完后用砂芯漏斗将树脂与切落液通过过滤分离，树脂用5ml DCM+TFA(体积比2:8)洗2次，合并切落液，通过旋转蒸发除去切落液中大部分TFA(旋蒸至切落液体积的1/5左右)。
(6)乙醚沉淀多肽
在切落液中加入10倍切落液体积的冰乙醚，可以看到大量白色絮状沉淀，将液体转移至50ml离心管中，用冷冻离心机4℃离心5min，转速为10000rpm，然后弃去上清，加入一定量的冰乙醚重旋沉淀，再次离心，此步骤重复三次，然后弃去上清，装有沉淀的离心管置于真空干燥器中用循环水泵或油泵抽至固体完全干燥。
(7)粗肽的纯化
冻干，即得粗肽，粗肽经HPLC纯化即可得到纯度较高的多肽样品，MALDI-TOF MS质谱显示其分子量为1432.78。
图3中，A、B、C分别为上述多肽、多肽衍生物2、多肽衍生物1的HPLC图谱。
实施例2：抗肿瘤活性测试
一、实验材料
肿瘤细胞系为实验室液氮冻存，按常规方法复苏后使用，胎牛血清FBS、DMEM无酚红培养基购自于美国Gibco公司。多肽、多肽衍生物1、多肽衍生物2按实施例1制备。
二、实验方法
1、细胞培养
HepG2细胞在不含酚红的DMEM培养基中培养，该培养基含有10％FBS、1％丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和50μMβ-巯基乙醇。使用前，将96孔板用0.1％明胶包被。
2、MTT法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制活性
将细胞以5×104个细胞/ml(100μl/孔)的密度铺板。在5％CO2下于37℃孵育24小时，吸出培养基并换成含有不同浓度药物的培养基，再孵育48小时。未经处理的孔用作阴性对照。孵育后，将20μl MTT(5mg/ml)添加到每个孔中，并进一步孵育4小时，溶解形成的紫色晶体，并在570nm处测量吸光度，计算不同浓度药物对肿瘤细胞的抑制率，计算IC50值。
3、数据处理和统计学分析
使用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验评估统计学显着性。所有结果均表示为平均值±SD，P<0.05的差异被认为具有统计学意义。
三、实验结果
多肽、多肽衍生物1和多肽衍生物2对人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制活性的IC50值如表1所示。多肽具有一定的抗肝癌细胞的活性，多肽衍生物1和多肽衍生物2的抗肿瘤活性显著强于多肽。
表1药物对人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制活性的IC50值
Figure BDA0002745503590000051
综上，本发明提供的多肽具有一定的抗肿瘤活性，具有开发成抗肿瘤药物的前景；本发明提供的该多肽的两种衍生物具有显著更强的抗肿瘤活性，更具有开发成抗肿瘤药物的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
序列表
<110> 泰州学院
<120> 一种多肽、衍生物及其在制备抗肿瘤药物方面的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Gly Asp Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser
1 5 10

Claims (2)

1.一种多肽衍生物，其特征在于：
其氨基酸序列为：RGDSNNFGAILSS；
或其结构如下：
Figure FDA0003796705690000011
2.权利要求1所述多肽衍生物用于制备抗肝癌的药物的用途。
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