ES2847930T3 - Vacunas terapéuticas para el tratamiento de las infecciones por el virus del herpes simple de tipo 2 - Google Patents

Abstract

Un vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2 bajo el control de un promotor y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas para su uso en un método para tratar una infección por VHS-2 o para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VHS-2 en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero: (a) una preparación de sensibilización que comprende el vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2; (b) después de la etapa (a), administrar al mamífero una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas; y (c) después de la etapa (b), administrar al mamífero una segunda preparación de refuerzo que comprende el vector plásmido que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas, en donde en el método, el vector plasmídico se administra por vía intramuscular y el antígeno encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas terapéuticas para el tratamiento de las infecciones por el virus del herpes simple de tipo 2

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos de la inmunología, virología y desarrollo de vacunas. En particular, la invención se refiere a un protocolo de inmunización heteróloga que comprende una dosis de sensibilización intramuscular compuesta por una vacuna de ADN que codifica un antígeno, una dosis de refuerzo intranasal compuesta por la forma proteica del antígeno encapsulado en liposomas, y una segunda dosis de refuerzo compuesta tanto por la vacuna de ADN como por el antígeno proteico encapsulado en liposomas. Este protocolo es particularmente eficaz para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica al virus del herpes simple que reduce los síntomas clínicos asociados con la reactivación vírica en sujetos infectados.

Antecedentes de la invención

El virus del herpes simple de tipo 2 (VHS-2) es endémico en la población humana y frecuente en todo el mundo. La Organización Mundial de la Salud estimó en 2003 que más de 300 millones de mujeres y más de 200 millones de hombres estaban infectados con VHS-2 (Cohen (2010) Science, Vol. 330: 304). Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés), aproximadamente el 20 % de la población adulta de EE. UU. está infectada con VHS-2 (1), lo que puede provocar una morbilidad y sufrimiento psicológico significativos. Después de la replicación inicial en células epiteliales, el virus entra en las neuronas que inervan el sitio de la infección y entra en estado latente. Periódicamente, VHS-2 se reactivará, replicará, formará nuevas partículas víricas y viajará por el axón hasta el sitio infectado original donde experimentará otra ronda de replicación lítica en el epitelio de la mucosa. Las recidivas de úlceras genitales suelen producirse 4 veces al año (2). La diseminación asintomática del virus en ausencia de formación de vesículas también es un suceso común. Se informa que hasta el 70 % de los nuevos casos de VHS-2 se adquieren de parejas con diseminación asintomática (3) y se estima que las mujeres infectadas con VHS-2 diseminan el virus del tracto genital un total de 15-20 % de los días. (4). Aunque el VHS-2 generalmente da como resultado lesiones de la mucosa, las infecciones por VHS-2 que afectan a otros órganos y superficies no son infrecuentes (5). Por ejemplo, la infección por VHS-2 puede afectar al sistema nervioso central donde induce la aparición repentina de fiebre y síntomas neurológicos focales. Además, la transmisión vertical del virus de madre a hijo y las infecciones en individuos inmunodeprimidos pueden provocar encefalitis vírica y/o diseminación del virus por todo el cuerpo (6). En ausencia de tratamiento con análogos de nucleósidos, la tasa de mortalidad de estos lactantes es del 50 % (6). Además de provocar la enfermedad primaria por sí solo, el VHS-2 también es un cofactor positivo para la transmisión del VIH-1 y se ha asociado con un riesgo de 2-4 veces mayor de contraer el VIH-1 (7).

Si bien debería ser factible desarrollar inmunidad protectora contra VHS-2, sigue siendo difícil de conseguir una vacuna exitosa contra el VHS-2. Esto se debe principalmente a las diversas formas en que VHS-2 interactúa con el sistema inmunitario del hospedador a lo largo de su complicado ciclo de replicación. Se han desarrollado muchas estrategias diferentes de inmunización contra el VHS-2, incluido el uso de virus inactivados completos, virus vivo atenuado, virus vivo de replicación defectuosa, vacunas de subunidades y vacunas de ADN (Bernstein y Stanberry (1999) Vaccine, Vol. 17(13-14): 1681-1689; Krause y Straus (1999) Infect Dis Clin North Am., Vol. 13(1):61-81; McKenzie y Straus (1996) Rev Med Virol., Vol. 6:85-96). Hasta la fecha, la única vacuna experimental que demostró alguna eficacia en seres humanos proporcionó solamente una protección limitada contra el VHS-2, y únicamente en pacientes mujeres que son seronegativas para el virus del herpes simple de tipo 1 (VHS-1) (8). Los resultados recientemente publicados de un ensayo de seguimiento indicaron que esta vacuna de subunidades fue en gran medida ineficaz, contradiciendo los resultados del ensayo anterior (Cohen (2010) Science, Vol. 330: 304). Por lo tanto, todavía falta una vacuna segura y eficaz para el VHS-2.

Los ensayos clínicos y los estudios en animales han indicado que cualquier candidato a vacuna contra el VHS-2 exitoso debe iniciar la protección de múltiples formas. La inmunidad humoral es importante para la protección contra las partículas extracelulares del virión durante la exposición inicial, durante la transmisión vertical del virus de madre a hijo y durante la reactivación del virus cuando las partículas extracelulares se transmiten de la neurona a la célula epitelial (9, 10). Las infecciones en ratones con deficiencia de linfocitos B indican que, si bien el anticuerpo específico del VHS limita la infección, se necesitan otros órganos del sistema inmunitario para prevenir infecciones (11). La inmunidad celular es necesaria para la eliminación de las células epiteliales infectadas por virus durante las infecciones primarias y recurrentes, para la resolución de infecciones líticas en los ganglios sensoriales y posiblemente en la prevención de la reactivación (12-18). Los estudios de agotamiento han demostrado que la protección contra la reinfección por VHS-2 está controlada principalmente por linfocitos T CD4+ en lugar de linfocitos T CD8+ o anticuerpos (19-21). Adicionalmente, la inmunidad a largo plazo parece depender de la inmunización de mucosas más que sistémica, destacando la importancia de las respuestas inmunitarias locales de las mucosas (22). Es bien sabido que un candidato a vacuna contra el VHS-2 capaz de proteger contra enfermedades puede no contener por completo la infección y la replicación del virus. Por lo tanto, ha sido un verdadero desafío para una vacuna exitosa contra el VHS-2 proporcionar protección tanto contra las enfermedades agudas causadas por la infección primaria por VHS-2 como contra el desarrollo posterior de latencia y recidiva. En estudios con animales, algunos candidatos previos a la vacuna contra el VHS-2 han reducido sustancialmente la replicación vírica en el tracto genital y han prevenido significativamente los síntomas de la enfermedad resultante de la infección primaria. Sin embargo, la inmunidad provocada por estas vacunas solamente puede proteger parcialmente contra la infección latente y la enfermedad recurrente (3-10). Las respuestas inmunitarias del hospedador inducidas por la vacuna pueden actuar en una o más etapas clave para prevenir o limitar la infección genital por VHS. Para prevenir tanto la enfermedad aguda como el establecimiento de latencia, idealmente, las respuestas inmunitarias provocadas por una vacuna contra el VHS-2 podrían contener eficazmente la replicación del virus VHS-2 en las mucosas genitales y prevenir con éxito la transmisión del virus a las terminaciones nerviosas sensoriales. Para obtener la máxima protección contra la replicación vírica inicial, lo más probable es que una vacuna necesite inducir una inmunidad protectora amplia y potente, especialmente respuestas inmunitarias de la mucosa fuertes en los sitios genitales. Una vacuna terapéutica para tratar a aquellos que ya están infectados con VHS-2 provocaría idealmente respuestas inmunitarias capaces de contener la diseminación vírica y controlar las recidivas clínicas. Como mínimo, una vacuna terapéutica debería reducir la frecuencia, duración y gravedad de las recidivas clínicas y de la diseminación vírica.

Por lo tanto, sigue existiendo una clara necesidad en la técnica del desarrollo de una vacuna terapéutica y profiláctica segura y eficaz para el VHS-2 debido a la magnitud del problema de salud pública y al fracaso de los fármacos antivíricos para prevenir su propagación.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un nuevo régimen de inmunización heteróloga que induce una inmunidad terapéutica contra el VHS-2 y trata eficazmente a sujetos con una infección establecida por VHS-2. Esta vacuna terapéutica comprende una dosis de sensibilización de un ácido nucleico que codifica un antígeno de VHS-2, una dosis de refuerzo inicial o primera que comprende la forma proteica del antígeno encapsulado en liposomas, y una o más dosis de refuerzo posteriores que comprenden tanto el ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 como el antígeno proteico encapsulado en liposomas. Este protocolo de inmunización induce títulos elevados de anticuerpos IgG e IgA específicos de antígenos de mucosa y una respuesta eficaz de linfocitos T, que reduce la diseminación vírica del tracto genital y reduce significativamente la recidiva de lesiones herpéticas en sujetos infectados. En consecuencia, la presente invención proporciona el tratamiento de una infección por VHS-2 en un animal (p. ej., mamífero), en particular, un ser humano.

La invención proporciona un vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2 bajo el control de un promotor y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas para su uso en un método para tratar una infección por VHS-2 o para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VHS-2 en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero:

(a) una preparación de sensibilización que comprende el vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2; (b) después de la etapa (a), administrar al mamífero una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas; y

(c) después de la etapa (b), administrar al mamífero una segunda preparación de refuerzo que comprende el vector plásmido que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas, en donde en el método, el vector plasmídico se administra por vía intramuscular y el antígeno encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal.

La primera preparación de refuerzo se puede administrar de aproximadamente 2 a 4 semanas, por ejemplo, de 7 a 18 días, después de la administración de la preparación de sensibilización. En realizaciones similares, la segunda preparación de refuerzo se puede administrar de aproximadamente 2 a 4 semanas, tal como de 7 a 18 días, después de la administración de la primera preparación de refuerzo.

Se pueden mejorar uno o más síntomas de infección por VHS-2 en el animal después de la administración de la segunda preparación de refuerzo. Por ejemplo, en una realización, la recidiva de lesiones herpéticas se reduce y/o previene en el animal en comparación con un animal no tratado o un animal inmunizado con una vacuna no por vía mucosa. En otra realización, la diseminación vírica del tracto genital se reduce en el animal en comparación con un animal no tratado o un animal inmunizado con una vacuna no por vía mucosa. Un enfoque comprende además administrar al animal una combinación del ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas ante el signo de recidiva de lesiones herpéticas. En dicho enfoque, el ácido nucleico se administra preferentemente por vía intramuscular y el antígeno encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal.

La presente divulgación también proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra VHS-2 en un animal (p. ej., mamífero), en particular, un ser humano, antes de la infección con el virus. Un enfoque comprende administrar al animal una preparación de sensibilización que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de VHS-2, una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas y una segunda preparación de refuerzo que comprende el ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas. En algunos enfoques, el ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 se administra por vía intramuscular y el antígeno encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal. La respuesta inmunitaria protectora puede estar sesgada hacia una respuesta inmunitaria de tipo Th1 y puede comprender anticuerpos neutralizantes en el suero y las secreciones vaginales, respuestas de IgA de mucosas y/o IgG de mucosas, y un aumento en la eliminación vírica.

En determinados enfoques, el ácido nucleico en la preparación de sensibilización y segundo refuerzo es un vector que codifica un antígeno de VHS-2 bajo el control de un promotor, tal como un promotor de citomegalovirus. En un enfoque, el antígeno de VHS-2 codificado por el vector es una glucoproteína gD. La glucoproteína gD puede ser la proteína de longitud completa o una proteína truncada que comprende un fragmento o dominio inmunogénico. En algunos enfoques, la secuencia que codifica el antígeno de VHS-2 (p. ej., glucoproteína gD) tiene un codón optimizado para su expresión en células de mamífero, en particular, células humanas.

En otro enfoque proporcionado por la divulgación, el antígeno de VHS-2 en las preparaciones de refuerzo primera y segunda se encapsula en liposomas aniónicos. Los liposomas pueden tener un diámetro medio de aproximadamente 0,5-5 pm. En determinadas realizaciones, el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas en las preparaciones de refuerzo es una glucoproteína gD, que puede ser la proteína de longitud completa o un fragmento inmunogénico de la misma. En un enfoque particular, el antígeno de VHS-2 es un dominio extracelular de una glucoproteína gD (p. ej., los aminoácidos 1-314 de la glucoproteína gD). En un enfoque, los liposomas utilizados en las preparaciones de refuerzo consisten en lípidos, es decir, los liposomas no contienen proteínas, ligandos o adyuvantes adicionales. En otro enfoque, los liposomas son liposomas no fusogénicos (es decir, no contienen proteínas víricas incorporadas a la membrana liposómica).

La presente divulgación también proporciona kits para provocar una respuesta inmunitaria terapéutica o protectora contra VHS-2 en un animal (p. ej., un ser humano). En un enfoque, el kit comprende un primer componente inmunizante que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica un antígeno de VHS-2 (p. ej., glucoproteína gD), un segundo componente inmunizante que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas, y una instrucción para que un usuario administre al animal el primer componente inmunizante, seguida de la administración del segundo componente inmunizante, seguida de la administración de una combinación del primer y segundo componentes inmunizantes para provocar la respuesta inmunitaria terapéutica en el animal. En algunos enfoques, el primer componente inmunizante se formula para administración intramuscular y el segundo componente inmunizante se formula para administración intranasal. En algunos enfoques, el animal es un ser humano. En un enfoque particular, el ser humano está infectado con VHS-2. En otra realización, el ser humano está en riesgo de infección con VHS-2.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Recidivas de puntuaciones clínicas acumuladas en cobayas 15 a 28 días después de la infección con VHS-2 antes del tratamiento. Los animales infectados con VHS-2 se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento (vacuna BRM, control de vehículo y vacuna de referencia). No hubo diferencias significativas entre los tres grupos en la tasa de recidivas antes del tratamiento (p = 0,95; pendientes de los días 15-28: vacuna BRM = 0,08646 ± 0,008142; control del vehículo = 0,08989 ± 0,009964; vacuna de referencia = 0,08992 ± 0,008480). Eje Y: número acumulado de lesiones herpéticas recurrentes por animal (en cada grupo); eje X: días después de la infección.

Figura 2. Esquema que muestra el protocolo de inmunización y el mismo programa de recogida en tres grupos de tratamiento (vacuna BRM, control de vehículo, vacuna de subunidades de VHS-2) de cobayas infectados con VHS-2. Cuatro semanas después de la infección intravaginal con VHS-2, se inyectó una sensibilización de vector de ADN de gD (grupo de vacuna BRM) o control de vector (grupo de control) por vía intramuscular durante dos días (28 y 30). Dos semanas más tarde se administró un refuerzo de liposoma con gD intranasal (grupo de vacuna BRM) o liposoma vacío (grupo de control). Dos semanas después del primer refuerzo, se administró un segundo refuerzo de ADN de gD i.m. y de liposomas con gD i.n. (grupo de vacuna BRM) o de vector y liposomas vacíos (grupo de control). En el grupo de vacunas de subunidades de VHS-2, la vacuna contra gD de VHS-2 se administró por vía subcutánea los días 29 (sensibilización), 44 (primer refuerzo) y 58 (segundo refuerzo) después de la infección por VHS-2. Se recogieron muestras de suero los días 21, 42, 56, 77 y 83; se recogieron muestras de frotis vaginales los días 2, 4, 21, 42, 56, 77 y 83; los ganglios de la raíz dorsal se recogieron al final del estudio para determinar el número de copias de a Dn de VHS-2 latente.

Figura 3. A. IgG sérica específica de antígeno (gD de VHS-2) en cobayas no vacunadas (control de vehículo) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM) o con una vacuna de subunidades de gD de v HS-2 (vacuna de control). La flecha indica los días en que se recibieron las inmunizaciones. Asterisco = p < 0,05. B. IgG vaginal específica de antígeno (gD de VHS-2) el día 83 después de la infección por VHS-2 en cobayas no vacunadas (control de vehículo; n = 9) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM; n = 11) o con una vacuna de subunidades gD de VHS-2 (vacuna de referencia; n=12).

Figura 4. IgA vaginal específica de antígeno (gD de VHS-2) en cobayas no vacunadas (control de vehículo) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM) o con una vacuna de subunidades de gD de v HS-2 (vacuna de control). Asterisco = p < 0,05.

Figura 5. Detección de copias de ADN de VHS-2 vaginal mediante qPCR en tiempo real el día 83 después de la infección en cobayas no vacunadas (control de vehículo; n = 9) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM; n = 11) o con una vacuna de subunidades gD de VHS-2 (vacuna de referencia; n=12). Las muestras se consideraron positivas si contenían más de 5 copias de ADN de VHS-2.

Figura 6. Recidiva acumulada por animal por grupo en cobayas no vacunadas (control de vehículo) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM) o con una vacuna de subunidades de gD de VHS-2 (vacuna de referencia) desde el día 15 hasta el día 42 después de la infección con VHS -2. Se observaron los animales para determinar evidencia de lesiones herpéticas recurrentes espontáneas y los episodios recurrentes se enumeraron como recidivas acumuladas (aparición de lesiones) por cobaya para cada grupo, ajustados por el número de días en que se observaron las recidivas. La flecha indica el día en que se administró la dosis de sensibilización en los grupos de vacuna.

Figura 7. Recidiva acumulada por animal por grupo en cobayas no vacunadas (control de vehículo) o cobayas vacunadas ya sea con la vacuna de mucosas (vacuna BRM) o con una vacuna de subunidades de gD de VHS-2 (vacuna de referencia) desde el día 28 hasta el día 83 después de la infección con VHS -2. Se observaron los animales para determinar evidencia de lesiones herpéticas recurrentes espontáneas y los episodios recurrentes se enumeraron como recidivas acumuladas (aparición de lesiones) por cobaya para cada grupo, ajustados por el número de días en que se observaron las recidivas. La tabla enumera las pendientes de la regresión lineal para períodos seleccionados de días posteriores a la infección para cada grupo de tratamiento.

Descripción detallada de la invención

Se han desarrollado y evaluado muchas estrategias diferentes de inmunización contra el VHS-2, incluido el uso de virus inactivados completos, virus vivo atenuado, virus vivo de replicación defectuosa, vacunas de subunidades y vacunas de ADN. Sin embargo, todavía no se dispone de una vacuna segura y eficaz para el VHS-2. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una nueva vacuna contra el VHS-2 que provoca inmunidad protectora y terapéutica contra VHS-2. Como se describe en detalle en el presente documento, los inventores han desarrollado un protocolo de inmunización heteróloga compuesto por una dosis de sensibilización intramuscular de un vector de ADN que codifica un antígeno de VHS-2, seguida de un refuerzo inicial de una forma proteica encapsulada en liposomas del antígeno suministrado por vía mucosa (p. ej., por vía intranasal), seguida de uno o más refuerzos posteriores tanto con el vector de ^a Dⁿ como con el antígeno encapsulado en liposomas. Este protocolo es particularmente eficaz para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica para tratar a sujetos que ya están infectados con VHS-2. La vacuna terapéutica induce una respuesta inmunitaria sinérgica compuesta de inmunidad humoral, de linfocitos T y de mucosas. Específicamente, la vacuna estimula altos títulos de anticuerpos IgG e IgA específicos de antígeno vaginales, una respuesta inmunitaria sesgada a Th1 y títulos elevados de IgG sérica específica de antígeno. Además, la vacuna terapéutica es superior a una vacuna administrada por vía subcutánea que comprende un antígeno gD de VHS-2 en su capacidad para prevenir o reducir las recidivas de lesiones herpéticas y reducir la diseminación vírica.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la materia objeto definida por la reivindicación 1. El objetivo de la vacunación terapéutica es dirigir las respuestas inmunitarias en un individuo infectado para erradicar las células ya infectadas con el virus o evitar que los virus latentes se reactiven y se desplacen de nuevo a los sitios de infección originales. Como se usa en el presente documento, "inmunidad terapéutica" o una "respuesta inmunitaria terapéutica" se refiere a inmunidad o provocar una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso que mejora o elimina una infección o reduce al menos un síntoma de la misma. Específicamente, la inducción de una respuesta inmunitaria terapéutica a partir de la administración de la vacuna es evidente mediante la eliminación o reducción de la presencia de uno o más síntomas de la enfermedad inducida por el agente infeccioso o una reducción en la duración o gravedad de tales síntomas. Por ejemplo, en un enfoque, la inmunidad terapéutica contra el VHS-2 se refiere a la inmunidad que reduce la gravedad o la duración de una infección por VHS-2. La inmunidad terapéutica, en algunos enfoques, se manifiesta por la eliminación o reducción de la presencia de uno o más síntomas de la enfermedad inducida por VHS-2. Los síntomas clínicos de la enfermedad inducida por VHS-2 incluyen llagas o ulceraciones similares a ampollas alrededor de las áreas genital y/o rectal (p. ej., lesiones herpéticas), una erupción o pequeñas protuberancias en la piel en las áreas genital y/o rectal, dolor al orinar, secreción de líquido vaginal y síntomas parecidos a los de la gripe (p. ej., fiebre e inflamación de los ganglios linfáticos de la ingle). En algunos enfoques, una respuesta inmunitaria terapéutica eficaz reduce la cantidad de virus que se disemina a partir de la mucosa genital.

El antígeno de VHS-2 puede ser una glucoproteína gD.

Preferentemente, uno o más síntomas de la infección por VHS-2 se alivian, mejoran, reducen o curan después de la administración de la vacuna contra VHS-2 heteróloga de sensibilización y refuerzo, en particular después de la administración de la segunda preparación de refuerzo. Por ejemplo, el número, gravedad o frecuencia de las lesiones genitales (es decir, lesiones herpéticas) se reduce significativamente en un animal inmunizado en comparación con un animal no tratado o un animal vacunado con una vacuna no por vía mucosa. En una realización, la recidiva de las lesiones herpéticas se reduce o se previene completamente en el animal inmunizado en comparación con un animal no tratado o un animal vacunado con una vacuna no por vía mucosa. En otra realización, la diseminación vírica del tracto genital se reduce en el animal inmunizado en comparación con un animal no tratado o un animal vacunado con una vacuna no por vía mucosa. Como se usa en el presente documento, "vacuna no por vía mucosa" se refiere a cualquier vacuna contra VHS-2 que se administra al sujeto por una vía distinta a la vía mucosa. En algunas realizaciones, una vacuna no por vía mucosa comprende un antígeno proteico de VHS-2 o un ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 que se administra por vía intramuscular, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica o por vía subcutánea. En una realización, una vacuna no por vía mucosa comprende una proteína gD de VHS-2 truncada (p. ej., dominio extracelular de gD) formulada para administración subcutánea.

Otros virus que establecen infecciones a largo plazo, que se pueden tratar con los métodos y kits de la presente divulgación, incluyen el virus del papiloma humano (VPH), los virus de la hepatitis B y C (VHB, VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El desarrollo de vacunas terapéuticas para virus se ha centrado en la activación de CTL para reconocer y destruir células infectadas y/o controlar la propagación del virus. Los métodos de la divulgación son eficaces para potenciar las respuestas inmunitarias celulares, haciéndolos adecuados para proporcionar vacunación terapéutica. La eficacia de los métodos puede potenciarse adicionalmente mediante la inclusión de adyuvantes de citocinas y motivos CpG que han demostrado ser en particular prometedores en el desarrollo de vacunas contra el cáncer (Belardelli et al., Cancer Res. 64:6827-6830 (2004)).

La presente divulgación también proporciona un kit para provocar una respuesta inmunitaria terapéutica contra VHS-2 en un animal (p. ej., mamífero). En un enfoque, el kit comprende un primer componente inmunizante que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica un antígeno de VHS-2, un segundo componente inmunizante que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas, y una instrucción para que un usuario administre al animal el primer componente inmunizante, seguida de la administración del segundo componente inmunizante, seguida de la administración de una combinación del primer y segundo componentes inmunizantes para provocar la respuesta inmunitaria terapéutica en el animal. En algunos enfoques, el primer componente inmunizante se formula para administración intramuscular y el segundo componente inmunizante se formula para administración a mucosas, por ejemplo, por vía intranasal, por vía oral, por vía intravaginal, por vía rectal, por vía sublingual, por vía bucal o por inhalación. En determinados enfoques, el segundo componente inmunizante está formulado para administración intranasal. En otro enfoque, los kits comprenden además un dispositivo de suministro para administrar el primer componente inmunizante, el segundo componente inmunizante, o ambos. El dispositivo de suministro puede ser cualquiera de los dispositivos de suministros descritos infra, incluyendo goteros, hisopos, aerosolizadores, insufladores, nebulizadores, inhaladores, jeringas equipadas con agujas o autoinyectores.

Los métodos y kits de la divulgación también son útiles para vacunación profiláctica (es decir, para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal). La presente divulgación contempla provocar una respuesta inmunitaria protectora contra VHS-2 en un animal, tal como un mamífero. En un enfoque, el método comprende administrar al mamífero una preparación de sensibilización que comprende un ácido nucleico (p. ej., un vector) que codifica un antígeno de v HS-2, una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas y una segunda preparación de refuerzo que comprende el ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas. En determinados enfoques, el ácido nucleico (p. ej., vector) que codifica el antígeno de VHS-2 se administra por vía intramuscular y el antígeno proteico del VHS-2 encapsulado en liposomas se administra por vía mucosa, tal como por vía intranasal, por vía oral, por vía intravaginal, por vía rectal, por vía sublingual, por vía bucal o por inhalación. En un enfoque particular, el antígeno proteico de VHS-2 encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal. En tales enfoques, el método induce altos títulos de anticuerpos séricos y vaginales con alta actividad neutralizante, una respuesta sesgada de tipo Th1 y una potente inmunidad protectora en la cavidad vaginal, la puerta de entrada del virus VHS-2.

Como se usa en el presente documento, una "respuesta inmunitaria protectora" o "inmunidad protectora" se refiere a inmunidad o provocar una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso, que se muestra en un vertebrado (p.ej., un ser humano), que previene o protege contra la infección. Una respuesta inmunitaria protectora que previene o protege contra la aparición de síntomas de la enfermedad reducirá o detendrá la propagación del VHS-2 en una población al reducir la diseminación vírica. En algunos enfoques, la inmunidad protectora inducida por la vacuna de la presente invención es una inmunidad esterilizante. La "inmunidad esterilizante" es una respuesta inmunitaria que elimina por completo o previene una infección o se elimina rápidamente, sin dejar rastro detectable.

La presente divulgación proporciona además la modulación de las respuestas inmunitarias de manera que se pueda provocar en un animal una respuesta inmunitaria deseada sesgada hacia una respuesta de T auxiliares de tipo 1 (Th1). El método comprende administrar al animal una preparación de sensibilización que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica un antígeno, tal como un antígeno de VHS-2, administrar al animal una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno encapsulado en liposomas, y posteriormente administrar una segunda preparación de refuerzo que comprende una combinación del ácido nucleico que codifica el antígeno y el antígeno proteico encapsulado en liposomas. En determinados enfoques, el ácido nucleico que codifica el antígeno se administra por vía intramuscular y el antígeno proteico encapsulado en liposomas se administra por vía mucosa (p. ej., por vía intranasal). "Sesgada hacia" se refiere a la situación en la que la respuesta inmunitaria observada está más cerca de una respuesta Th1 o de T auxiliares de tipo 2 (Th2) en comparación con la respuesta antes de la inmunización. En determinados enfoques, la inmunización cambiará completamente una respuesta Th2 a una respuesta Th1. En otros enfoques, la inmunización puede no cambiar completamente una respuesta Th2 a una respuesta Th1, pero en cambio, da como resultado una respuesta mixta o equilibrada o una respuesta Th2 más débil.

La mayoría de las respuestas inmunitarias están reguladas por linfocitos T, que inician y dan forma a la naturaleza de la respuesta. A medida que maduran las respuestas inmunitarias, los linfocitos T CD4+ pueden polarizarse hacia respuestas inmunitarias de T auxiliares de tipo 1 (Th1) o de T auxiliares de tipo 2 (Th2). La evidencia de las respuestas de tipo Th1 y Th2 es el patrón predominante de las citocinas que están presentes. Las respuestas Th1 se caracterizan por niveles altos de IFN-^y y niveles bajos de IL-4 e IL-10, mientras que las respuestas Th2 se caracterizan por niveles bajos de IFN-^y y niveles altos de IL-4 e IL-10. Estas citocinas desempeñan un papel importante en la determinación de las capacidades funcionales de los linfocitos T. Las respuestas de tipo Th2 conducen a la producción preferida de anticuerpos de la subclase IgG1, con poca o ninguna generación de CTL. Las respuestas de tipo Th1 conducen a la producción preferida de anticuerpos de la subclase IgG2a y a la inducción de CTL que pueden destruir eficazmente células infectadas con virus u otros organismos.

La Tabla 1 a continuación resume las características inmunitarias de las respuestas inmunitarias Th1 y Th2 polarizadas. Las respuestas Th1 polarizadas se generan en general, durante infecciones con virus o bacterias. Por el contrario, las respuestas Th2 polarizadas se observan con frecuencia en infecciones parasitarias, en respuestas alérgicas, y mediante vacunas proteicas convencionales basadas en alumbre suministradas por vía intramuscular que se utilizan en seres humanos. La genética también puede determinar el tipo de respuestas inmunitarias generadas. Por ejemplo, las respuestas Th1 predominan en la cepa C57BL/6 de ratón, mientras que las respuestas Th2 predominan en la cepa Balb/c de ratón. Las respuestas inmunitarias también pueden consistir en componentes Th1 y Th2, proporcionando protección por los órganos de respuesta inmunitaria tanto humoral como mediada por células. La determinación directa de las frecuencias de las células productoras de citocinas se logra mediante el uso de ELISPOT (ensayos SPOT de inmunoabsorción ligada a enzimas) o mediante tinción por inmunofluorescencia para revelar la producción de citocinas intracelulares. Las proporciones de IgG1:IgG2a en suero también son criterios ampliamente aceptados y seguidos para determinar los tipos de T auxiliares (Tabla 1). Una relación de IgG1 a IgG2a para una respuesta Th1 y Th2 equilibrada estaría entre 0,5 y 2,0.

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Como se usa en el presente documento, "respuesta de T auxiliares de tipo 1" y "respuesta Th1" se usan indistintamente para referirse a un intervalo de respuestas del animal hospedador que incluyen una o más, normalmente todas las características enumeradas en la columna central de la Tabla 1 anterior. Estas características incluyen una relación IgG1:IgG2a no mayor de 0,5; secreción de IFN-^y (y otras citocinas Th1) por los linfocitos T auxiliares 1 aumentada y secreción de IL-10 e IL4 (y otras citocinas Th2) por los linfocitos T auxiliares 2 disminuida; y alta actividad CTL.

De manera similar, como se usa en el presente documento, "respuesta de T auxiliares de tipo 2" y "respuesta Th2" se usan indistintamente para referirse a un intervalo de respuestas del animal hospedador que incluyen una o más, generalmente todas las características enumeradas en la columna derecha de la Tabla 1 anterior. Estas características incluyen una relación IgG1:IgG2a de no menos de 2,0; secreción de IFN-^y (y otras citocinas Th1) por los linfocitos T auxiliares 1 disminuida y secreción de IL-10 e IL-4 (y otras citocinas Th2) por los linfocitos T auxiliares 2 aumentada; y actividad CTL baja o ausente.

La presente divulgación proporciona adicionalmente, un método para desarrollar vacunas y protocolos de vacunación eficaces para dirigir de manera específica al portal de entrada más común para microorganismos, las superficies de las mucosas del cuerpo. La divulgación establece que las vacunas podrían hacerse más eficaces encapsulándolas en liposomas con una composición/tamaño definido y suministrándolas directamente a las superficies de las mucosas. Combinando vacunas encapsuladas en liposomas con regímenes de inmunización apropiados, las respuestas inmunitarias se pueden adaptar para proporcionar vacunas más eficaces y específicas. En determinados enfoques, la vacuna ideal genera una respuesta inmunitaria equilibrada o sesgada a T auxiliares 1 (Th1) que también incluye respuestas fuertes de anticuerpos, generación de cTl y producción de citocinas de tipo Th1 e inmunidad local en los sitios de las mucosas. En otros enfoques, puede ser posible adaptar la respuesta inmunitaria para generar una respuesta inmunitaria sesgada a T auxiliares 2 (Th2), lo que puede ser beneficioso para prevenir el rechazo en hospedadores injertados y para proteger contra determinadas infecciones parasitarias.

La presente divulgación proporciona métodos, reactivos y kits para provocar respuestas inmunitarias de forma eficaz, tal como respuestas inmunitarias protectoras y terapéuticas en animales, especialmente mamíferos (p. ej., seres humanos), contra determinados antígenos, tales como antígenos víricos (p. ej., antígenos de VHS-2). Una característica destacada de la divulgación se refiere al uso de antígenos proteicos encapsulados en liposomas suministrados por vía mucosa (p. ej., por vía intranasal (IN)) o por vía intramuscular (IM) al animal hospedador.

Un componente de la presente invención es el uso de una inmunización "de sensibilización", que comprende la administración inicial de uno o más antígenos a un animal, especialmente un paciente humano, en preparación para administraciones posteriores del mismo antígeno. Específicamente, el término "sensibilización", como se usa en el presente documento, se refiere a una primera inmunización que usa un antígeno que induce una respuesta inmunitaria al antígeno deseado y recuerda un nivel más alto de respuesta inmunitaria al antígeno deseado tras la reinmunización posterior con el mismo antígeno cuando se administra en el contexto del mismo o diferente sistema de suministro de vacunas.

Otro componente de la presente invención es el uso de una "inmunización de refuerzo", o un "refuerzo" lo que significa la administración de una composición que suministra el mismo antígeno codificado en la inmunización de sensibilización. Un refuerzo a veces se denomina respuesta anamnésica, es decir, una respuesta inmunitaria en un animal previamente sensibilizado. Se pueden administrar múltiples refuerzos, utilizando cantidades iguales o diferentes para cada refuerzo. Un refuerzo que utiliza un sistema de suministro de antígeno diferente al de sensibilización se puede denominar "refuerzo heterólogo", mientras que un refuerzo que utiliza el mismo sistema de suministro de antígeno que el de sensibilización puede denominarse "refuerzo homólogo".

Los métodos de la divulgación conducen a potentes efectos sinérgicos entre la inmunización de sensibilización y la o las inmunizaciones de refuerzo en términos de respuestas inmunitarias que los métodos son capaces de provocar en un animal. Como resultado, los métodos de la divulgación permiten provocar un nivel deseado de respuesta inmunitaria, donde cada una de la preparación de sensibilización y la o las preparaciones de refuerzo, cuando se administran solas al animal, es insuficiente para lograr el nivel deseado de respuesta inmunitaria. En algunos enfoques, los métodos de inmunización heteróloga generan una respuesta inmunitaria terapéutica caracterizada por un aumento de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) y un aumento de IgG e IgA específicas de antígeno en las secreciones vaginales en comparación con un animal no tratado/no inmunizado o un animal vacunado con una vacuna no por vía mucosa. En otros enfoques, los métodos de inmunización heteróloga como se describen en el presente documento reducen o previenen completamente la recidiva de lesiones herpéticas y/o reducen la diseminación vírica del tracto genital en comparación con los observados en animales no tratados/no inmunizados o en animales vacunados con una vacuna no por vía mucosa.

Los efectos de la respuesta inmunitaria en el animal hospedador, incluyendo respuestas inmunitarias humorales y celulares, pueden evaluarse mediante varios ensayos conocidos en la técnica. La respuesta inmunitaria humoral incluye títulos de anticuerpos específicos de antígeno totales (inmunoglobulinas, es decir, Ig) en suero o en las superficies de las mucosas; títulos de anticuerpos específicos del antígeno de VHS-2 en suero o en las superficies de las mucosas; títulos de isotipos y/o subtipos de anticuerpos específicos, incluyendo IgG, IgA, IgG1 e IgG2a; relación de IgG1 e IgG2a. Los títulos de anticuerpos específicos de antígeno se pueden medir mediante métodos habituales conocidos en la técnica, tal como en ensayos ELISA. La respuesta inmunitaria celular incluye el fenotipo y la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL). La respuesta inmunitaria celular también incluye la secreción de citocinas características de las respuestas Th1, incluida IFN-y, y la secreción de citocinas características de la respuesta Th2, incluidas IL-10 e IL-4. Las citocinas se detectan directamente mediante ensayos ELISPOT y/o ELISA de citocinas (es decir, IFN-y, IL-10 y/o IL-4) y se infiere a partir de las relaciones IgG1:IgG2a (p. ej., respuesta Th1 frente a Th2). La actividad de neutralización de los anticuerpos en suero y mucosas se puede medir mediante diversos métodos que incluyen ensayos de neutralización dependientes del complemento como se describe en los ejemplos. El grado de latencia vírica de VHS-2 en el sistema nervioso se puede evaluar mediante, por ejemplo, análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qPCR) de células de los ganglios de la raíz dorsal. El número de copias víricas detectadas se correlaciona con la integración vírica del VHS-2 en el hospedador, la célula neuronal.

El vector de ácido nucleico que codifica el antígeno de VHS-2 se administra por vía intramuscular y el antígeno proteico encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal, lo que da como resultado no solamente una inducción de una respuesta de CTL, sino también en una fuerte respuesta inmunitaria de la mucosa.

La presente divulgación también contempla dispositivos para dispensar las preparaciones de sensibilización y refuerzo descritas en el presente documento. Por ejemplo, para enfoques en los que la preparación de refuerzo o el componente proteico de la preparación de refuerzo se suministra por vía intranasal, los dispositivos dispensadores para formulaciones intranasales pueden, por ejemplo, tomar la forma de un sistema de suministro en aerosol, y pueden disponerse para dispensar una única dosis o una multiplicidad de dosis. Un dispositivo de este tipo suministraría una dosis medida de la preparación de refuerzo al conducto nasal. Otros ejemplos de dispositivos apropiados incluyen, pero sin limitación, goteros, hisopos, aerosolizadores (p. ej., VaxINator™), insufladores (p. ej., dispositivo de administración nasal Valois Monopowder, dispositivo de suministro intranasal de polvo seco Bespak UniDose DP de dosis única), nebulizadores e inhaladores. Los dispositivos pueden suministrar la preparación de refuerzo o el componente proteico de la preparación de refuerzo por medios pasivos que necesitan que el sujeto inhale la formulación en la cavidad nasal. Como alternativa, el dispositivo puede suministrar activamente la preparación de refuerzo o el componente proteico de la preparación de refuerzo bombeando o rociando una dosis en la cavidad nasal. La preparación de refuerzo o el componente proteico de la preparación de refuerzo puede suministrarse en una o ambas fosas nasales mediante uno o más de dichos dispositivos. La administración podría incluir dos dispositivos por sujeto (un dispositivo por fosa nasal). En enfoques en los que la preparación de sensibilización o el componente del ácido nucleico de una preparación de refuerzo se suministra por vía intramuscular, pueden usarse dispositivos, tales como autoinyectores o inyectores de pluma, para suministrar la inyección.

Pueden usarse diferentes intervalos entre la preparación de sensibilización y la primera preparación de refuerzo. La primera preparación de refuerzo se puede administrar de 2-8 semanas, preferentemente de 4-6 semanas, o más preferentemente de aproximadamente 2-4 semanas después de la administración de la preparación primaria. En una realización, la primera preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 7 a aproximadamente 18 días después de la preparación de sensibilización. En otra realización, la primera preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 días después de la preparación de sensibilización.

También se pueden usar diferentes intervalos entre las preparaciones de refuerzo (p. ej., la primera preparación de refuerzo y la segunda preparación de refuerzo) y pueden ser iguales o diferentes del intervalo entre la administración de la preparación de sensibilización y la primera preparación de refuerzo. Por ejemplo, la segunda preparación de refuerzo (o la preparación de refuerzo posterior) se puede administrar de 2-8 semanas, preferentemente de 4-6 semanas, o más preferentemente alrededor de 2-4 semanas después de la administración de la primera preparación de refuerzo o de la preparación de refuerzo anterior. En una realización, la segunda preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 7 a aproximadamente 18 días después de la primera preparación de refuerzo (o de la preparación de refuerzo anterior). En otra realización, la segunda preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 días después de la primera preparación de refuerzo (o de la preparación de refuerzo anterior). Se pueden administrar múltiples preparaciones de refuerzo al animal (p. ej., mamífero, ser humano) después de la administración de la preparación de sensibilización y la primera preparación de refuerzo. En realizaciones preferidas, las preparaciones de refuerzo posteriores comprenden un componente de antígeno de un ácido nucleico (es decir, el ácido nucleico que codifica el antígeno) y un componente de antígeno proteico (p. ej., un antígeno proteico encapsulado en liposomas). En algunas realizaciones, una preparación de refuerzo posterior que comprende estos dos componentes se administra al animal ante el signo de uno o más síntomas de infección vírica. Por ejemplo, en realizaciones en las que la infección vírica es por VHS-2, se administra al animal una preparación de refuerzo posterior que comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno de VHS-2 y un antígeno proteico de VHS-2 encapsulado en liposomas ante el signo de recidiva de lesiones genitales (es decir, lesiones herpéticas).

La divulgación contempla que la dosis total de antígeno en la preparación de sensibilización o las preparaciones de refuerzo, o ambas, se puede administrar al animal en una o más administraciones. Por ejemplo, la preparación de sensibilización se puede administrar en el transcurso de dos o tres días. En un enfoque, la primera preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 3 a 10 semanas después de la última administración de sensibilización y la segunda preparación de refuerzo se administra de aproximadamente 3 a 10 semanas después del primer refuerzo. En otro enfoque, la sensibilización comprende una o dos administraciones separadas por 3 días, la primera preparación de refuerzo se administra aproximadamente 3 semanas después de la última administración de sensibilización y la segunda preparación de refuerzo se administra aproximadamente 3 semanas después del primer refuerzo. En un determinado enfoque, la sensibilización comprende dos administraciones separadas por un día (p. ej., preparación de sensibilización administrada el día 1 y el día 3), la primera preparación de refuerzo se administra 2-3 semanas después de la última administración de sensibilización, y la segunda preparación de refuerzo se administra 2-3 semanas después el primer refuerzo.

La administración de refuerzo inicial y las administraciones de refuerzo posteriores pueden usar la misma o diferentes cantidades de antígeno proteico (p. ej. antígeno proteico encapsulado en liposomas), y las administraciones de refuerzo posteriores y de refuerzo iniciales pueden administrarse mediante la misma o diferentes vías. La administración de sensibilización inicial, y la o las administraciones de refuerzo pueden usar la misma o diferentes cantidades de antígeno de ácido nucleico (p.ej., antígeno codificado por vector) suministrado de acuerdo con el mismo programa o programas diferentes. En algunos enfoques, la dosis de antígeno de ácido nucleico en la preparación de sensibilización se suministra en una o más administraciones (p. ej., dos administraciones, en el transcurso de tres días) y la dosis de antígeno de ácido nucleico en una preparación de refuerzo se suministra en una administración (p. ej., todo en uno día). La cantidad de antígeno de ácido nucleico puede ser igual o diferente a la cantidad de antígeno proteico suministrado en las preparaciones de refuerzo.

Como se usa en el presente documento, los términos "antígeno" o "inmunógeno", usados indistintamente, pretenden abarcar todas las secuencias de péptidos o proteínas que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en el animal en cuestión. Los términos "antígeno" o "inmunógeno" abarcan análogos de péptidos o de proteínas de antígenos conocidos o de tipo silvestre, cuyos análogos pueden ser más solubles o más estables que el antígeno de tipo silvestre, y los que también pueden contener mutaciones o modificaciones que hacen que el antígeno sea más activo inmunitariamente o esté optimizado para la expresión en determinados tipos celulares (es decir, uso de codones humanizados). Un antígeno también puede ser un péptido en el que se han realizado sustituciones de aminoácidos particulares en un antígeno de origen natural que alteran la estructura de la proteína, una porción del antígeno de origen natural que incluye epítopos protectores conocidos (es decir, epítopos de CTL), o una cadena de epítopos conocidos derivados sintéticamente que pueden estar limitados o no a un patógeno (vacuna multivalente).

También son útiles otros péptidos o proteínas que tienen secuencias homólogas con la secuencia de aminoácidos del antígeno deseado, donde el antígeno homólogo induce una respuesta inmunitaria al patógeno correspondiente. Los genes que son homólogos a la secuencia codificante del antígeno deseado deben interpretarse como incluidos en la presente invención siempre que codifiquen una proteína o polipéptido que tenga una actividad biológica sustancialmente similar a la del antígeno deseado.

Los análogos de los antígenos descritos en el presente documento pueden diferir de las proteínas o péptidos de origen natural por diferencias de secuencias de aminoácidos conservativas o por modificaciones que no afecten a la secuencia, o por ambas. Por ejemplo, se pueden realizar cambios conservativos de aminoácidos, que aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o péptido, normalmente no alteran su función. Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen derivatización química de polipéptidos in vivo, o in vitro, p. ej., acetilación o carboxilación. También se incluyen como antígenos las proteínas modificadas por glicosilación, p. ej., las realizadas mediante la modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; p. ej., al exponer el polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, p. ej., enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos. También se incluyen como antígenos, de acuerdo con la presente invención, secuencias que tienen restos de aminoácidos fosforilados, p. ej., fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. También se incluyen como antígenos los polipéptidos que se han modificado usando técnicas de biología molecular habituales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad. Los análogos de tales polipéptidos incluyen aquellos que contienen restos distintos de los L-aminoácidos de origen natural, p. ej., D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos no de origen natural. Los antígenos de la invención no se limitan a productos de ninguno de los procesos ilustrativos específicos enumerados en el presente documento.

Un antígeno puede ser un antígeno de longitud completa o truncado, un fragmento inmunogénico del mismo, o un epítopo derivado del antígeno. En determinados enfoques, el antígeno específico de patógeno en las preparaciones de refuerzo puede estar en forma de un patógeno atenuado o muerto. Los antígenos eficaces también incluyen antígenos de superficie de estos patógenos.

El término "epítopo" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente 3 a 5, preferentemente de aproximadamente 5 a 10 o 15, y no más de aproximadamente 1000 aminoácidos (o cualquier número entero entre ellos), que definen una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia mayor, se une a un anticuerpo generado en respuesta a dicha secuencia o estimula una respuesta inmunitaria celular. El término "epítopo" abarca secuencias idénticas a la secuencia natural, así como modificaciones a la secuencia natural, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa). Los antígenos usados en la invención pueden comprender un solo epítopo, tal como, por ejemplo, un solo epítopo de CTL.

Los antígenos codificados por los ácidos nucleicos en la preparación de sensibilización o preparaciones de refuerzo y los antígenos proteicos en las preparaciones de refuerzo tienen preferentemente epítopos solapantes. En determinadas realizaciones, los dos antígenos pueden ser idénticos entre sí. Como alternativa, en determinadas realizaciones de la divulgación, los dos antígenos pueden tener un conjunto de epítopos solapantes pero diferentes. A modo de ejemplo ilustrativo, en un protocolo de vacunación para VHS-2, se puede usar un ADN que codifica una glucoproteína de VHS-2 en la preparación de sensibilización, y la preparación de refuerzo puede ser VHS-2 inactivado. A modo de otro ejemplo ilustrativo, la preparación de sensibilización puede ser un vector que codifica un antígeno de VHS-2, y la preparación de refuerzo puede comprender una forma proteica del antígeno, o viceversa.

En la invención según se reivindica, el antígeno es un antígeno de VHS-2. Los antígenos de VHS-2 adecuados incluyen, pero sin limitación, glucoproteínas gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE o gD o derivados de las mismas o proteínas tempranas inmediatas tales como ICP27, ICP 47, ICP4 o ICP36. En una realización, el antígeno de VHS-2 es una glucoproteína gD. La glucoproteína gD puede ser la forma de longitud completa de la proteína (p. ej., SEQ ID NO: 3) o una forma truncada, tal como el dominio extracelular de gD, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Las formas truncadas de las glucoproteínas de VHS-2 (pe/, glucoproteína gD) pueden incluir formas truncadas que se secretan por células que expresan la glucoproteína. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el antígeno es el dominio extracelular de gD que consiste en los aminoácidos 1-314 de la proteína gD. En otras realizaciones, el antígeno es el dominio extracelular de gD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. También se pueden usar variantes de las formas de longitud completa o truncadas de gD. Por ejemplo, en una realización, la glucoproteína gD comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, S^eQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. Las formas de longitud completa o truncadas de glucoproteínas de VHS-2 (p. ej., glucoproteína gD) pueden comprender péptidos señal y/o etiquetas de purificación (p. ej., etiquetas de histidina o c-myc). En determinadas realizaciones, la secuencia que codifica el antígeno está optimizada para la expresión en células de mamífero, tales como células humanas. Por ejemplo, para la optimización en células humanas, los motivos que actúan en cis, tal como cajas TATA internas, sitios chi, sitios de entrada a ribosomas, tramos de secuencias ricas en AT o ricas en GC, elementos de secuencia ARE, INS, CRS, sitios donantes y aceptores de corte y empalme crípticos, y puntos de ramificación, se eliminan o se reducen en número de la secuencia que codifica el antígeno. En una realización, una secuencia de gD con codones optimizados humana adecuada comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

Los siguientes son ejemplos ilustrativos de antígenos adicionales que pueden usarse para inducir inmunidad protectora o terapéutica contra otros patógenos usando los métodos de la invención.

Los antígenos pueden derivar de VIH-1, (tales como tat, nef, gp120 o gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), del virus del herpes simple de tipo 1 humano (VHS-1) (tales como gH, gL gM gB gC gK gE o gD o derivados de los mismos o proteína temprana inmediata tales como ICP27, ICP 47, ICP 4, ICP36), de citomegalovirus, especialmente humano, (tal como gB o derivados de la misma), del virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados de la misma), del virus de la varicela zóster (tales como gpI, II, III e IE63), o de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, el antígeno de superficie de la hepatitis B o el antígeno central de la hepatitis o pol), del antígeno del virus de la hepatitis C y del antígeno del virus de la hepatitis E, o de otros patógenos víricos, tal como los paramixovirus: virus sincitial respiratorio (tal como las proteínas F y G o derivados de las mismas), o antígenos del virus paragripales, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18; p. ej., proteínas L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, ^e6, E7), flavivirus (p. ej., virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o células del virus de la gripe tal como proteínas HA, NP, NA o M, o combinaciones de las mismas), o antígenos derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo N. gonorrea y N. meningitidis (p. ej., proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo, proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M. catarrhalis, también conocido como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, incluyendoB. pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina pertussis o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo, ESAT6, Antígeno 85A, B o C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD de 19 kDa [Rv3763], PPD de 38 kDa [Rv0934]), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de colonización, toxina termolábil o derivados de los mismos, toxina termoestable o derivados de la misma), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por ejemplo., toxina similar a la toxina shiga o derivados de la misma); Vibrio spp, incluyendo V. colera (por ejemplo, toxina del cólera o derivados de la misma); Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo, una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo, ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani(por ejemplo, la toxina del tétanos y derivados de la misma), C. botulinum (por ejemplo, toxina botulínica y derivados de la misma), C. difficile (por ejemplo, toxinas A o B de clostridium y derivados de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis; Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo, toxina de la difteria y derivados de la misma); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la erliquiosis granulocítica humana; Ricketsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo, MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo, MOMP, proteínas de unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo, las raras proteínas de la membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivan de parásitos tal como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivan de levaduras como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans.

En algunos enfoques, se pueden usar dos o más antígenos. En las preparaciones de sensibilización y las preparaciones de refuerzo que tienen un componente de ácido nucleico, los dos o más antígenos pueden ser proteínas de fusión, en las que bien las proteínas antigénicas de longitud completa o los fragmentos inmunogénicos de las mismas se expresan a partir de un único marco abierto de lectura (p. ej., expresado como un único transcrito). En otras realizaciones, los dos o más antígenos pueden expresarse a partir de diferentes marcos abiertos de lectura (p. ej., expresados como transcritos separadas) bajo el control de un solo promotor o de diferentes promotores. En las preparaciones de refuerzo, los dos o más antígenos pueden estar presentes como una mezcla de antígenos o como una o más proteínas de fusión. Los dos o más antígenos pueden ser de un solo patógeno o de múltiples patógenos.

Otros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis son, por ejemplo, Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA (Rv0467), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c de 16 kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento WO 99/51748). Las proteínas para M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas donde al menos dos, preferentemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se fusionan en una proteína más grande. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748). Los antígenos más preferidos para Chlamydia incluyen, por ejemplo, la proteína de alto peso molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), ORF3 (documento EP 366 412) y supuestas proteínas de membrana (Pmps). Pueden seleccionarse otros antígenos de Chlamydia de la formulación de vacuna del grupo descrito en el documento WO 99/28475.

Las vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina) y el antígeno proteico Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), y derivados destoxificados mutantes del mismo (documento WO 90/06951; documento WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae de tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenzae no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (Patente de EE.UU. N.° 5.843.464) o variantes de copia múltiple o proteínas de fusión de los mismos.

Los antígenos que se pueden usar pueden comprender además antígenos derivados de parásitos que causan malaria. Por ejemplo, antígenos preferidos de Plasmodia falciparum incluyen RTS, S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción carboxiterminal de la proteína del circumsporozoíto (CS) de P. falciparum enlazada a través de cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de la hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se divulga en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/EP92/02591, publicada con el número WO 93/10152 reivindicando la prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido N.° 9124390.7. Cuando se expresa en levadura, RTS se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se expresa conjuntamente con el antígeno S del VHB, produce una partícula mixta conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/GB89/00895, publicada bajo el documento WO 90/01496. Una realización preferida de la presente invención es una vacuna contra la malaria en donde la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodios que probablemente sean candidatos a ser componentes de una vacuna contra la malaria de múltiples etapas son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, ^rA^p2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum y sus análogos en Plasmodium spp.

Las vacunas también pueden usarse para la profilaxis o terapia de trastornos crónicos además de alergias o enfermedades infecciosas. Estos trastornos crónicos son enfermedades tales como el asma, aterosclerosis y Alzheimer y otros trastornos autoinmunitarios. También se contemplan vacunas para su uso como anticonceptivo. Los antígenos relevantes para la profilaxis y la terapia de pacientes susceptibles a o que padecen la enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer son, en particular, el fragmento aminoterminal de 39-43 aminoácidos (Ap, la proteína precursora amiloide y fragmentos más pequeños. Este antígeno se divulga en la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 99/27944 -(Athena Neurosciences).

Los posibles autoantígenos que podrían incluirse como vacunas para trastornos autoinmunitarios o como vacuna anticonceptiva incluyen: citocinas, hormonas, factores de crecimiento o proteínas extracelulares, más preferentemente una citocina de 4 hélices, más preferentemente, IL13. Las citocinas incluyen, por ejemplo, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF y OSM. Las citocinas de 4 hélices incluyen IL2, IL3, IL4, IL5, IL13, GMCSF y MCSF. Las hormonas incluyen, por ejemplo, hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH), gonadotropina coriónica (CG), VGF, grelina, agutí, proteína relacionada con agutí y neuropéptido Y. Los factores de crecimiento incluyen, por ejemplo, VEGF.

En la divulgación, los ácidos nucleicos usados en la preparación de sensibilización o en las preparaciones de refuerzo pueden ser ARN o ADN, incluido el ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN y lo más preferentemente, una secuencia de ADNc. Para obtener la expresión del péptido antigénico dentro de las células de mamíferos, es necesario que la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antigénico se presente en un sistema de vector apropiado. Por "vector apropiado" como se usa en el presente documento se entiende cualquier vector que permita que el péptido antigénico se exprese dentro de un mamífero en cantidades suficientes para provocar una respuesta inmunitaria.

En la invención, el vector es un plásmido (p. ej., pDNAVACC). El vector puede comprender secuencias promotoras y de poliadenilación/terminación transcripcional dispuestas en el orden correcto para obtener la expresión de los péptidos antigénicos. La construcción de vectores que incluyen estos componentes y opcionalmente otros componentes tales como potenciadores, sitios de enzimas de restricción y genes de selección, tal como un gen de resistencia a antibióticos, es bien conocida por los expertos en la materia y se explica en detalle en Maniatis et al "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, Vol. 1-3, 2a edición, 1989.

El ácido nucleico de la preparación de sensibilización o de las preparaciones de refuerzo con un componente de ácido nucleico es un vector que codifica un antígeno de VHS-2 bajo el control de un promotor. Como se usa en el presente documento, "bajo el control de" o "unido operativamente" significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido que codifica el antígeno para controlar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido. Los promotores adecuados para su uso en el vector incluyen, pero sin limitación, promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, promotores de ARN pol I, pol II y pol III. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor de CMV, preferentemente un promotor génico temprano inmediato de CMV. La secuencia que codifica el antígeno de VHS-2 puede tener codones optimizados para su expresión en células de mamíferos, tales como células humanas. En determinadas realizaciones, el vector codifica una glucoproteína gD de longitud completa, con codones optimizados humanos. En una realización, la secuencia de glucoproteína gD de longitud completa con codones optimizados humanos comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1.

Un vector que porta ácidos nucleicos que codifican un péptido antigénico puede administrarse de diversas formas. Es posible que el vector se administre en forma desnuda (es decir, como secuencia de nucleótidos desnuda no asociada con formulaciones liposómicas, con vectores víricos o proteínas facilitadoras de la transfección) suspendido en un medio apropiado, por ejemplo, una solución salina tamponada tal como PBS y después se inyecte por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intradérmica o mucosa o se administre con pistola génica u otros dispositivos electrónicos (es decir, electroporación). Además, es posible que los vectores estén encapsulados mediante, por ejemplo, liposomas o dentro de partículas de polilactida coglicólido (PLG) para administración por vías nasal o pulmonar. En realizaciones preferidas, el vector que porta ácidos nucleicos que codifican un antígeno de VHS-2 se administra en forma desnuda por vía intramuscular.

También es posible, de acuerdo con una realización de la invención, la administración intradérmica del vector, preferentemente mediante el uso de técnicas de administración de pistola génica (en particular bombardeo de partículas). Dichas técnicas pueden implicar el recubrimiento del vector sobre perlas de oro que después se administran a alta presión en la epidermis, tal como se describe, por ejemplo, en Haynes et al. J. Biotechnology 44: 37-42 (1996).

También se pueden usar vectores víricos recombinantes para suministrar antígenos de ADN. Las ventajas de este enfoque incluyen la expresión abundante de proteínas codificadas por ADN en múltiples tipos celulares, fuerte potenciación de las respuestas de los CTL y la capacidad del virus para codificar múltiples genes. El virus vaccinia (incluido el virus modificado de Ankara) y los adenovirus (no replicativos) son dos virus populares que se utilizan para el desarrollo de vacunas (Im y Hanke, Expert, Rev. Vaccines 3:S89-S97 (2004); Basak et al., Viral Immunol.

17:182-196 (2004)).

Las modificaciones recientes de las vacunas de ADN incluyen el desarrollo de minigenes que codifican epítopos de CTL individuales, el uso de señales de direccionamiento codificadas por genes para permitir una presentación más eficaz de epítopos por la vía del MHC y la generación de proteínas secretadas para dirigirse a la vía del MHC de clase II (Doria-Rose y Haigwood, Methods 31:207-216 (2003); Leifert et al., Immunol. Rev. 199:40-53 (2004)).

Las preparaciones de refuerzo comprenden el antígeno proteico encapsulado en liposomas. El antígeno en las preparaciones de refuerzo es, en algunas realizaciones, el mismo antígeno codificado por el ácido nucleico en la preparación de sensibilización y las preparaciones de refuerzo que tienen un componente de ácido nucleico. En una realización, las preparaciones de refuerzo comprenden un antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas. En otra realización, el antígeno de VHS-2 es una glucoproteína gD. La glucoproteína gD puede ser la glucoproteína de longitud completa o un fragmento inmunogénico de la misma. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el antígeno encapsulado en liposomas en las preparaciones de refuerzo (p.ej., primera y segunda preparaciones de refuerzo) es el dominio extracelular de gD que comprende los aminoácidos 1-314 de la proteína gD. En otras realizaciones, el antígeno es el dominio extracelular de gD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Los liposomas tienen varias ventajas posibles como plataformas de suministro de vacunas. La encapsulación de antígenos dentro de los liposomas secuestra estos antígenos, por tanto, los liposomas sirven como un depósito de antígenos capaz de una liberación sostenida de antígenos. Además, los liposomas son biocompatibles y biodegradables, y de baja toxicidad e inmunogenicidad. Cuando tienen el tamaño apropiado (p. ej.,> 0,2 jm hasta 5 |jm), los liposomas son captados selectivamente por las células presentadoras de antígenos en el cuerpo y tienen el potencial de inducir respuestas tanto de anticuerpos humorales como de CTL. Los liposomas sirven como transportador/vehículo de antígenos, además de ser un adyuvante que puede administrarse de forma repetida sin toxicidad o inmunogenicidad.

Los liposomas son estructuras que consisten en una bicapa de membrana compuesta por fosfolípidos de origen biológico o sintético, generalmente de forma esférica. Los liposomas se forman de manera natural cuando los fosfolípidos o lípidos entran en contacto con el agua. La estructura de los liposomas se puede manipular mediante métodos para formarlos en el laboratorio, incluyendo el aporte de energía en forma de calor, energía sónica, ciclos de congelación-descongelación, o fuerzas de cizalla. La membrana de bicapa de fosfolípidos de los liposomas separa y protege los materiales atrapados en el núcleo acuoso interno del exterior. Tanto las sustancias solubles en agua como las insolubles pueden quedar atrapadas en diferentes compartimentos, el núcleo acuoso y la membrana de la bicapa, respectivamente, del mismo liposoma. La interacción química y física de estas sustancias se puede eliminar porque las sustancias se encuentran en estos compartimentos diferentes.

Los liposomas se pueden preparar usando cualquier método conocido en la técnica. Estos liposomas pueden tener un diámetro medio de aproximadamente 0,5 a 5 micras, de aproximadamente 2 a 4 micras, o de aproximadamente 1 a 4 micras. En algunos casos, también pueden ser útiles los liposomas de aproximadamente 0,2 a 8 micras. En determinadas realizaciones, los liposomas que se pueden usar en los métodos y kits de la invención son liposomas aniónicos (p. ej., cargados negativamente). La carga de los liposomas se puede manipular incorporando lípidos iónicos. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. N.° 5.290.563. Por ejemplo, la incorporación de dicetilfosfato confiere una carga negativa a los liposomas. En una realización, los liposomas utilizados en las preparaciones de refuerzo son liposomas aniónicos que comprenden fosfatidilcolina, colesterol y dicetil fosfato. En otra realización, los liposomas comprenden fosfatidilcolina, colesterol y dicetil fosfato en una relación de 7:3:0,5 % en moles. En algunas realizaciones, los liposomas utilizados en las preparaciones de refuerzo consisten en lípidos, es decir, los liposomas no contienen proteínas adicionales, ligandos o adyuvantes. Por ejemplo, en una realización, los liposomas son liposomas no fusogénicos (es decir, no contienen proteínas, tal como proteínas víricas incorporadas a la membrana liposómica).

A modo de ejemplo, un método para preparar los liposomas que se pueden usar se describe a continuación. Los liposomas de la invención objeto se preparan a las siguientes concentraciones de lípidos: fosfatidilcolina/colesterol/dicetil fosfato 7/3/0,5 % en moles. El dicetil fosfato se disuelve en cloroformo más un 5 % de etanol, después se sonicados y se añaden fosfatidilcolina y colesterol. Los lípidos se secan en un evaporador rotatorio Labconco durante una hora y las trazas de cloroformo se eliminan mediante liofilización con un sistema Freeze Dry System Freezone 4.5 durante la noche. La película lipídica se hidrata con antígeno, tal como glucoproteína gD de VHS-2 (gD), a una concentración de 125-300 pg/ml en tampón HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (HBS) y se filtra con un filtro de nailon de 0,2 pm. La mezcla se agita con formación de vórtice minuciosamente y se deja reposar durante 1 hora y después se agita con formación de vórtice nuevamente para asegurar la formación de vesículas multilaminares. Los liposomas resultantes se someten después a tres ciclos de congelación y descongelación (1 ciclo = congelación durante una hora y descongelación durante una hora a temperatura ambiente). El tamaño de los liposomas se mide con un analizador de tamaño de partículas submicrométricas N4 MD (Coulter Electronics). El potencial zeta se midió usando el analizador de potencial zeta Zeta-Puls (Brookhaven Instruments) en tampón HEPES 5 mM, NaCl 1,0 mM, pH 7,4. Para obtener liposomas con diámetros medios específicos inferiores a 2 micras, después del tercer ciclo de congelación-descongelación, Los liposomas se pueden calentar en un baño de agua a 50 °C y extruirlos a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 1,0 pm para obtener liposomas con diámetros medios de aproximadamente 1,0 pm. Los liposomas pueden extruirse adicionalmente para obtener liposomas de pequeño tamaño, por ejemplo, extruyendo adicionalmente los liposomas a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 0,4 pm y finalmente 0,2 pm utilizando una microextrusora Avanti de mano para obtener liposomas con diámetros medios de aproximadamente 0,2 pm.

En determinadas realizaciones, los liposomas son "liposomas de circulación prolongada" (también conocidos como "liposomas estabilizados estéricamente"), que son liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en los liposomas, dan como resultado una mayor vida útil en circulación en relación con los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas de circulación prolongada conocidos en la técnica incluyen aquellos en los que el liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos tales como monosialogangliósido GM1 o (B) comprende uno o más lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos, tal como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, al menos para liposomas de larga circulación que contienen gangliósidos, esfingomielina, o lípidos derivados de PEG, la vida media de circulación potenciada de estos liposomas procede de una captación reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES, por sus siglas en inglés) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Se conocen en la técnica diversos liposomas que comprenden uno o más glucolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) informaron sobre la capacidad del monosialogangliósido GM1, del sulfato de galactocerebrósido y del fosfatidilinositol para mejorar la semivida en sangre de los liposomas. Estos hallazgos se expusieron por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949). La patente de EE.UU. N.° 4.837.028 y la solicitud PCT publicada WO 88/04924, ambas en Allen et al., divulgan liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido GM1 o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La patente de EE.UU. N.° 5.543.152 (de Webb et al.) divulga liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sndimiristoilfosfatidilcolina se divulgan en la solicitud PCT publicada WO 97/13499 (de Lim et al.).

Se conocen en la técnica muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos y métodos de preparación de los mismos. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contienen un resto de PEG. Illum et al. (FEBS Letters, 1984, 167, 79) observaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado vidas medias en sangre significativamente potenciadas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (p. ej., PEG) y liposomas que comprenden tales fosfolípidos se describen por Sears (patentes de EE.UU. N.° 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Letts., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demostraban que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada con PEG o estearato de PEG tienen incrementos significativos en las semividas en circulación sanguínea. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron tales observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, p. ej., DSPE-PEG, formado por la unión química de PEG a DSPE (diestearoilfosfatidiletanolamina).

Los liposomas que tienen restos de PEG unidos covalentemente en su superficie externa se describen en la patente europea N.° 0445131 B1 y en la solicitud PCT publicada WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen 1-20 por ciento en moles (% en moles) de PE derivatizado con PEG y métodos de uso del mismo, se describen por Woodle et al. (patentes de EE.UU. N.° 5.013.556 y 5.356.633) y en Martin et al. (patente de EE.UU. N.° 5.213.804 y Patente europea N.° EP 0496 813 B1). Los liposomas que comprenden varios conjugados lípidopolímero diferentes se divulgan en la solicitud PCT publicada WO 91/05545 y la patente de EE.UU. N.° 5.225.212 (ambos de Martin et al.) y en la solicitud PCT publicada WO 94/20073 (Zalipsky et al.) Los liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG se describen en la solicitud PCT publicada WO 96/10391 (Choi et al.). Las patentes de EE.UU. N.° 5.540.935 (Miyazaki et al.) y 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que pueden derivatizarse adicionalmente en sus superficies con restos funcionales.

Se han descrito diversos liposomas que comprenden dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG). Generalmente, sin embargo, tales liposomas comprenden DMPG en un % molar de aproximadamente el 10 % o más (véanse, por ejemplo, Akhtar et al. (Nucl. Acids Res., 1991, 19, 5551; Yachi et al. (Biopharm. Drug Dispos., 1996, 17, 699; y Farmer et al. (Meth. Enz., 1987, 149, 184). Se han descrito liposomas que tienen 3 % en moles de DMPG, pero tales liposomas incluían un componente (en particular, un derivado de fosfatidilcolina) que no se encuentra en las composiciones liposómicas de la presente invención. Dichos componentes derivados de fosfatidilcolina incluyen, p. ej., 10 % en moles de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) (Brodt et al., Cancer Immunol. Immunother., 1989, 28, 54) o 7 % en moles de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) (Perez-Soler et al., J. Nuclear Med., 1985, 26, 743; Wasan et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1993, 37, 246; y Li et al., Oncology Res., 1995, 7, 611).

La preparación de liposomas puede estar recién preparada o liofilizada para almacenamiento a largo plazo. Ambas preparaciones se pueden utilizar con una eficacia comparable. Los liposomas pueden ser todos iguales (p. ej., las mismas composiciones o el mismo tamaño) o incluir más de un tipo de liposomas.

En determinadas realizaciones, pueden usarse liposomas disponibles comercialmente. Por ejemplo, los liposomas pueden prepararse en virtud de contrato con Northern Lipids Inc. (Vancouver, BC), una organización de investigación por contrato que se especializa en el desarrollo de formulaciones de liposomas basados en lípidos. En otras determinadas realizaciones, se pueden preparar liposomas de diversos tamaños usando la metodología que se describe a continuación. Los liposomas resultantes, dependiendo de los protocolos de preparación específicos, generalmente tienen un tamaño de entre aproximadamente 0,5 pm y 5 pm, por ejemplo, a 4 pM, 1 pm, o 0,2 pm pasando las preparaciones a través de un microfluidizador. Brevemente, los liposomas cargados negativamente se pueden preparar a las siguientes concentraciones de lípidos: fosfatidilcolina/colesterol/dicetil fosfato 7/3/0,5 % en moles. El antígeno tal como el antígeno de VHS-2 (p. ej., la glucoproteína gD de VHS-2) se incorpora en liposomas multilaminares en varias concentraciones para probar las respuestas inmunitarias. El tamaño de los liposomas se puede medir con un analizador de tamaño de partículas submicrométricas N4 MC (Coulter Electronics). En determinadas realizaciones, las preparaciones de antígenos pueden liofilizarse para su almacenamiento y después reconstituirse antes de su uso. Tanto el tamaño como el potencial Z (zeta, una medida de carga) se pueden medir antes de su uso. El potencial Z se puede determinar utilizando el analizador de potencial Z Zeta-Puls (Brookhaven Instruments). La relación lípido: proteína de antígeno se puede variar en algunas preparaciones para determinar la importancia de esta relación sobre las respuestas inmunitarias al antígeno específico (p.ej., gD de VHS-2).

Las preparaciones de sensibilización y refuerzo se administran en una cantidad tal que sea profiláctica o terapéuticamente eficaz. La cantidad exacta puede variar considerablemente según la especie y el peso del animal que se está inmunizando, la vía de administración, la potencia y la dosis de las preparaciones de sensibilización y refuerzo, la naturaleza de la patología que se está tratando o contra la que se protege, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para producir una respuesta inmunitaria y el grado de protección o eficacia terapéutica deseadas. Basándose en estas variables, un médico o veterinario será capaz de determinar fácilmente el nivel de dosificación apropiado. En el siguiente ejemplo, se determinó que las dosis adecuadas del vector de ADN que codifica la glucoproteína gD de VHS-2 usado en la preparación de sensibilización y en la preparación de refuerzo secundaria eran de aproximadamente 50 pg a 100 pg para cobayas. Estas dosis se pueden producir a escala a dosis apropiadas para su uso en seres humanos por un experto en la materia sin excesiva experimentación. Por ejemplo, las dosis adecuadas del vector de ADN que codifica la proteína gD de VHS-2 para su uso en seres humanos pueden ser de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg. La dosificación precisa dependerá del tipo de vector utilizado, el promotor, el nivel de expresión del antígeno, los métodos de administración y el tipo y nivel de optimización de codones de la secuencia de nucleótidos del antígeno. En el siguiente ejemplo, se determinó que una dosis adecuada de glucoproteína gD de VHS-2 encapsulada en liposomas usada en las preparaciones de refuerzo era de aproximadamente 30 pg/100 pl para cobayas. De manera similar a las dosis de vector de ADN, estas dosis para la preparación de refuerzo se pueden ajustar apropiadamente para su uso en seres humanos. Las dosis humanas adecuadas para el antígeno gD encapsulado en liposomas pueden ser de aproximadamente 3 a 6 pg/100 a 400 pl, por ejemplo, de aproximadamente 3 pg/100 pl a aproximadamente 6 pg/100 pl.

Los métodos y kits de acuerdo con la presente divulgación se pueden usar en relación con procedimientos profilácticos o de tratamiento de todos los animales, incluyendo, por ejemplo, animales domésticos, animales de laboratorio, animales de granja, animales salvajes cautivos y, lo más preferentemente, seres humanos.

Se contempla que los métodos y kits de la divulgación también se pueden practicar con la adición de uno o más adyuvantes conocidos en la técnica. Sin embargo, en algunas realizaciones, no se incluye ningún adyuvante adicional en las preparaciones de refuerzo. Los inventores han descubierto que los nuevos métodos proporcionados en el presente documento logran las respuestas inmunitarias deseadas sin la necesidad de ningún adyuvante que no sea liposoma, evitando así los riesgos y complicaciones asociados con muchos adyuvantes, especialmente las toxinas bacterianas como la toxina del cólera (CT) y la enterotoxina termolábil (LT) de E. coli.

Un adyuvante es una sustancia o procedimiento que aumenta las respuestas inmunitarias específicas a los antígenos modulando la actividad de las células inmunitarias. Los adyuvantes ilustrativos incluyen adyuvantes basados en sales tales como sales de alumbre, adyuvantes derivados de bacterias como lipopolisacáridos y toxinas bacterianas, emulsiones adyuvantes que permiten la liberación lenta de antígeno, anticuerpos agonistas contra moléculas coestimuladoras, adyuvante de Freund, dipéptidos de muramilo y adyuvantes recombinantes/sintéticos. En una realización particular, el adyuvante es un ligando de receptor de tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés), en particular un TLR-4, tales como monofosforil lípido A (MPL), o ligando de TLR-7, tal como R837. Recientemente, se ha informado que los ligandos de TLR-4 y TLR-7 en combinación con una formulación de nanopartículas potencian y prolongan las respuestas de anticuerpos cuando se administran con antígeno después de la inmunización (Kasturi et al. (2011) Nature, Vol. 470: 543-560). Por lo tanto, los ligandos de TLR-4 y/o TLR-7 pueden incluirse en las preparaciones de sensibilización y/o refuerzo. El alumbre es el adyuvante basado en sales más común utilizado para estimular las respuestas inmunitarias a las vacunas de proteínas y es el único adyuvante aprobado para uso humano en los Estados Unidos (Alving, Vaccine 20(3):S56-S64 (2002); Hunter, Vaccine 20(3):S7-12 (2002)). Sin embargo, el alumbre favorece las respuestas sesgadas aTh2 y no estimula la inmunidad mediada por células. La inmunidad de las mucosas se puede inducir mediante el uso de toxinas bacterianas tal como la toxina del cólera (CT) y la enterotoxina termolábil (LT) de E. coli, sin embargo, la seguridad de estos adyuvantes es cuestionable (Alving, Vaccine 20(3):S56-S64 (2002); Hunter, Vaccine 20(3): S7-12 (2002)). El desarrollo de nuevos, adyuvantes más seguros se ha centrado recientemente en estimular vías de respuesta inmunitaria particulares. La administración conjunta de citocinas, tales como interferón-y y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), se ha mostrado prometedora en la estimulación de las respuestas inmunitarias celulares (revisado en (Petrovsky y Aguilar, Immunol. Cell Biol. 82:488-496 (2004)). Sin embargo, los niveles altos de citocinas pueden causar toxicidad y los regímenes de dosificación deben modularse cuidadosamente. La administración de citocinas es en particular prometedora para la vacunación con ADN, donde los genes que codifican tanto la citocina como el antígeno podrían expresarse simultáneamente por el mismo vector. Los adyuvantes adicionales que se están explorando incluyen aquellos que se dirigen a la vía de señalización de toll. Los motivos CpG de ADN que se encuentran comúnmente en el ADN bacteriano son potentes activadores de las respuestas inmunitarias celulares, y las vacunas basadas en ADN de nueva generación con frecuencia codifican múltiples motivos CpG (revisado en (Petrovsky y Aguilar, Immunol. Cell Biol. 82:488-496 (2004)).

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1. Eficacia de una vacuna de mucosas contra el virus del herpes simple de tipo 2 en cobayas infectadas por virus

Anteriormente, los presentes inventores demostraron que una vacuna de mucosas contra VHS-2 redujo significativamente la recidiva del herpes genital en cobayas infectadas por el virus VHS-2, demostrando así la eficacia terapéutica de la vacuna. Véase la publicación de patente de EE. UU. N.° 2012/0027841A1. En este ejemplo, los presentes inventores compararon la eficacia terapéutica de la vacuna de mucosas contra el VHS-2 (es decir, la vacuna BRM), que comprende un vector de ADN administrado por vía intramuscular que codifica el antígeno gD de VHS-2 y un antígeno proteico gD encapsulado en liposomas administrado por vía intranasal, con una vacuna de subunidades de gD de VHS-2 que comprende alumbre y MPL en cobayas cuatro semanas después de una infección establecida por VHS-2. El modelo de cobayas es uno de los modelos animales más ampliamente utilizados para estudiar el herpes genital (Stanberry et al. (1985) Intervirology, Vol. 24(4): 226-231; Stanberry et al. (1982) J Infect Dis, Vol. 146(3): 397-404). De manera similar a los seres humanos, el modelo de cobaya presenta una infección aguda inicial con lesiones genitales graves seguida de episodios recurrentes espontáneos y se ha utilizado ampliamente para la evaluación de vacunas tanto profilácticas como terapéuticas.

Anteriormente, los presentes inventores establecieron con éxito la latencia de la infección por VHS-2 en cobayas Dunkin-Hartley sin tratamiento previo mediante la dosificación de la cepa MS en tres dosis de infección diferentes (1x 106, 2 x 105 y 2 x 104 ufp/animal). Una dosis de 2 x 105 ufp de VHS-2/animal condujo a una menor muerte animal y, por lo tanto, esta dosis de infección se seleccionó para establecer la infección por VHS-2 en los animales para este estudio. Se inocularon cobayas con una dosis de 2 x 105 ufp de VHS-2/animal (cepa MS) por vía intravaginal. Los signos clínicos de enfermedad y morbilidad se monitorizaron diariamente después de la infección. Los signos clínicos se puntuaron de acuerdo con la siguiente escala: 0 = sin signos clínicos de enfermedad (sin enrojecimiento ni lesiones visibles), 1 = eritema vaginal (enrojecimiento o hinchazón leve), 2 = lesiones herpéticas únicas o poco modestas (erosiones, vesículas o hinchazón moderada), 3 = varias vesículas grandes o fusionadas, 4 = úlceras grandes con maceración grave y/o retención urinaria y/o parálisis de las extremidades traseras, 5 = encontrado muerto. Los animales que alcanzaron una puntuación clínica de 4 se sacrificaron inmediatamente. Los hisopos vaginales recogidos el día 2, el día 4 y el día 21 después de la infección se analizaron mediante un ensayo de placas para confirmar si la infección vírica y la replicación se produjeron con éxito en la cavidad vaginal. Las cobayas infectadas con éxito mostraron signos clínicos de enfermedad que oscilaban entre una puntuación clínica de 2-3 durante la fase aguda y se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento (n = 10-12/grupo) el día 28 después de la infección. No hubo diferencia significativa entre los tres grupos en la tasa de recidivas (aparición de lesiones) antes del tratamiento (Figura 1).

Cada uno de los tres grupos de tratamiento se inmunizó con uno de los siguientes: la vacuna de mucosas (vacuna BRM), la vacuna de subunidades de gD de VHS-2 (vacuna de referencia), o el control del vehículo como se indica en la siguiente tabla y el esquema en la Figura 2.

La sensibilización (ADN de gD) en la vacuna de mucosas era un vector de plásmido de ADN que codificaba un gen de glucoproteína gD de longitud completa con codones optimizados, bajo el control de un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y se administró por vía intramuscular los días 28 y 30 después de la infección (total 100 |jg de ADN por cobaya; 5o |jg por animal por día) en el grupo de vacuna BRM. El vector de ADN de gD se administró de nuevo por vía intramuscular el día 58 después de la infección (2x50 jg/200 ul/pata; total 100 jg de ADN por cobaya) como parte de una segunda preparación de refuerzo. El plásmido sin el gen de gD (vector de ADN) se administró a los animales en el grupo de control del vehículo a la misma dosis, frecuencia y vía como el vector de ADN de gD.

La preparación de refuerzo (lip. de gD) en la vacuna de mucosas fue una preparación de liposomas cargados negativamente que encapsulaban el dominio extracelular (aminoácidos 1-314) de la glucoproteína gD y se administró por vía intranasal los días 44 y 58 posteriores a la infección (30 jg/100 jl/animal, 50 jl/fosa nasal) en el grupo de vacuna BRM. Se administró una preparación de liposomas vacíos cargados negativamente (vehículo de lip.) a los animales en el grupo de control del vehículo a la misma dosis, frecuencia y vía como la preparación de lip. de gD.

Cada dosis de la vacuna de referencia (vacuna de subunidades de gD de VHS-2) comprendía 5 jg del dominio extracelular (aminoácidos 1-306) de la glucoproteína gD, 125 jg de alumbre (Alhydrogel) y 12,5 jg de monofosforil lípido A (MPL). La vacuna de subunidades de gD de VHS-2 se administró por vía subcutánea los días 29, 44 y 58 después de la infección a los animales del grupo de vacuna de referencia.

Se recogieron muestras de suero y hisopos vaginales de los grupos de cobayas vacunadas y no vacunadas el día 21, tres semanas después de la infección (7 días antes de la sensibilización), el día 42 (inmediatamente antes del primer refuerzo), el día 56 (inmediatamente antes del segundo refuerzo) y el día 83 (final del estudio). Las muestras se analizaron mediante ELISA para evaluar las respuestas de anticuerpos vaginales y en suero. Las respuestas en suero de anticuerpos IgG específicos de antígeno (gD de VHS-2) para cada uno de los tres grupos de tratamiento se muestran en la Figura 3A. Los resultados muestran que la vacuna de referencia de subunidades de VHS-2 indujo un rápido aumento en la IgG específica de antígeno en suero, mientras que la vacuna de mucosas (vacuna BRM) produjo un aumento más gradual en los niveles de IgG específica de antígeno en suero. Sin embargo, la vacuna de mucosas indujo un aumento aproximado de 10 veces en los anticuerpos IgG vaginales anti-gD de VHS-2 en comparación con el grupo de control del vehículo en el día 83 después de la infección, mientras que la vacuna de ^{subunidades de VHS-2 indujo un aumento más moderado (} Figura 3b). De forma importante, únicamente la vacuna de mucosas indujo un aumento significativo en los anticuerpos IgA vaginales específicos de antígeno (Figura 4). No se observó un aumento de IgA vaginal en animales no vacunados o en animales vacunados con la vacuna de subunidades.

La diseminación vírica se evaluó mediante RT-PCR para las copias de ADN de VHS-2 de muestras de hisopos vaginales. La Figura 5 muestra el porcentaje de muestras de cada grupo de tratamiento que dieron positivo (más de 5 copias de ADN de VHS-2) para ADN de VHS-2 el día 83 después de la infección. Los animales que recibieron la vacuna de mucosas (vacuna BRM) tuvieron un porcentaje significativamente menor de muestras vaginales que fueron positivas para el virus en comparación con los animales no vacunados o con los animales que recibieron la vacuna de subunidades de referencia, lo que indica que la vacuna de mucosas redujo sustancialmente la cantidad de diseminación vírica vaginal. Las fuertes respuestas de anticuerpos de la mucosa inducidas por la vacuna BRM pueden contribuir a la reducción observada en la diseminación vírica con esta vacuna.

Después de la infección primaria, el VHS-2 provoca una infección latente en los ganglios del nervio sacro y la reactivación del virus se produce periódicamente durante la vida de un individuo y puede dar como resultado una enfermedad recurrente o una diseminación no aparente del virus que se produce incluso en presencia de respuestas inmunitarias a la infección inicial del virus (Whitley y Roizman (2001) Lancet, Vol. 357(9267): 1513-1518). Una vacuna terapéutica exitosa tendría que prevenir o reducir notablemente las recidivas periódicas. Después de la inmunización de cobayas infectadas, los animales se observaron durante 25 días en busca de evidencia de lesiones herpéticas recurrentes espontáneas. Los episodios recurrentes se enumeraron como recidivas acumuladas (aparición de lesiones) por cobaya para cada grupo, ajustados por el número de días en que se observaron las recidivas. La Figura 6 muestra el número de recidivas en cada grupo de tratamiento durante el período de tiempo posterior a la administración de la dosis de sensibilización e inmediatamente antes del primer refuerzo (del día 15 al día 42 después de la infección). Los datos muestran que la administración de la dosis de sensibilización de vector de ADN de gD en el grupo de vacuna de mucosas tuvo un efecto terapéutico rápido en la reducción del número de recidivas de lesiones herpéticas. Las respuestas de los linfocitos T inducidas por la administración de la dosis de sensibilización del vector de ADN de gD (datos no mostrados) parecen correlacionarse con esta rápida y significativa eficacia terapéutica observada desde el día 28 al día 42. Por el contrario, no se observó ningún efecto sobre el número de recidivas para los animales que recibieron la vacuna de subunidades de gD de VHS-2 a pesar de que esta vacuna de referencia indujo un aumento significativo en la IgG anti-gD de VHS-2 en suero durante este período de tiempo (compárense la Figura 3A y la Figura 6).

La Figura 7 representa el número de recidivas en cada grupo de tratamiento durante el período de tiempo posterior a la administración hasta el final del estudio (del día 28 al día 83 después de la infección). Los datos indican que la administración de la vacuna de mucosas a cobayas infectadas previamente redujo notablemente el número de recidivas de la enfermedad clínica por VHS-2 en comparación con los animales no vacunados y los animales que recibieron la vacuna de subunidades de gD de VHS-2. La Tabla de la Figura 7 muestra que después de la vacunación, la diferencia entre el grupo de vacuna de mucosas y los otros dos grupos de tratamiento es muy significativa (P < 0,0001).

Resumiendo, los resultados de la serie de experimentos descritos en este ejemplo muestran que una vacuna de mucosas, que comprende componentes tanto de ADN como de antígenos proteicos, induce fuertes respuestas vaginales de anticuerpos IgG e IgA, reduce la diseminación vírica vaginal y reduce de manera significativa y rápida el número de recidivas de lesiones herpéticas en animales infectados. Por el contrario, una vacuna de subunidades gD de VHS-2 administrada por vía subcutánea que comprende los adyuvantes alumbre y MPL induce respuestas fuertes, rápidas de anticuerpos IgG en suero, pero no logra inducir respuestas significativas de anticuerpos en mucosas. La vacuna de subunidades tampoco reduce la diseminación vírica y es menos eficaz para reducir el número de recidivas de lesiones herpéticas que la vacuna de mucosas.

Se entiende que la presente invención divulgada no se limita a la metodología, protocolos y materiales en particular descritos, ya que estos pueden variar. También se entiende que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de discernir, utilizando solamente experimentación habitual, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

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SECUENCIAS

Secuencia de nucleótidos de gD de VHS-2 con codones optimizados humanos (SEQ ID NO: 1)

ATGGGACGGCTGACCAGCGGAGTGGGCACAGCCGCCCTGCTGGTCGTGGCTGTGGGCCTGCGCG TGGTGTGCGCCAAGTACGCCCTGGCCGACCCCAGCCTGAAGATGGCCGACCCCAACCGGTTCCG CGGCAAGAACCTGCCCGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCCGGCGTGAAGCGCGTGTACCAC ATCCAGCCCAGCCTGGAGGACCCCTTCCAGCCCCCCAGCATCCCCATCACCGTGTACTACGCCG TGCTGGAGCGCGCCTGCCGGAGCGTGCTGCTGCACGCCCCCAGCGAGGCCCCCCAGATTGTGCG CGGAGCCAGCGACGAGGCCCGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTATCGGATGGGC GACAACTGCGCCATCCCTATTACCGTGATGGAGTACACCGAGTGCCCCTACAACAAGAGCCTGG GAGTGTGCCCCATCCGGACCCAGCCCCGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGA GGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCCCCTGCCTTCGAGACCGCCGGCACCTACCTGCGGCTG GTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACCGCGCCAGAGCCAGCT GCAAATACGCCCTGCCCCTGCGGATCCCCCCTGCCGCCTGCCTGACCAGCAAGGCCTATCAGCA GGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGCATGCTGCCCCGGTTCATCCCCGAGAACCAGCGGACCGTG GCCCTGTACTCTCTGAAGATCGCCGGCTGGCACGGCCCCAAGCCCCCCTACACCAGCACCCTGC TGCCCCCCGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACCCAGCCCGAGCTGGTGCCCGAGGACCCCGA GGATAGCGCCCTGCTGGAGGATCCCGCCGGAACAGTGAGCAGCCAGATCCCCCCCAACTGGCAC ATCCCTAGCATCCAGGACGTGGCCCCCCACCACGCCCCAGCCGCCCCTAGCAACCCCGGCCTGA TCATCGGCGCCCTGGCCGGCAGCACCCTGGCCGCCCTGGTGATCGGCGGCATCGCCTTTTGGGT GCGCAGACGCGCCCAGATGGCCCCCAAGCGGCTGCGGCTGCCCCACATCCGCGACGACGACGCC CCTCCATCTCACCAGCCCCTGTTCTAG

Secuencia de aminoácidos de gD truncada - aminoácidos 1-314 (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos de gD de longitud completa (SEQ ID NO: 3)

Variante n.° 1 de la secuencia de aminoácidos de gD de longitud completa (SEQ ID NO: 4)

MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYH IQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMG DNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRL VKINDWTEITQFILEHRARASCKYALPLRIPPAACLTSKAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTV ALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWH IP SIQDVAP HHAPAAP SNP GL11GALAG STLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAP KRLRLPHIRDDDA PPSHQPLFY

Variante n.° 2 de la secuencia de aminoácidos de gD de longitud completa (SEQ ID NO: 5)

MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDRLTDPPGVKRVYH IQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMG DNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRL VKINDWTEITQFILEHRARASCKYALPLRIPPAACLTSKAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTV ALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVS SQIPPNWH IPSIQDVAPHHAPAAPSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDA PPSHQPLFY

Variante n.° 3 de la secuencia de aminoácidos de gD de longitud completa (SEQ ID NO: 6)

MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADP SLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYH IQPSLEDPFQPP SIPITVYYAVLERACRSVLLHAP SEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMG DNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLIHAPAFETAGTYLRL VKINDWTEITQFILEHRARASCKYALPLRIPPAACLTSKAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTV ALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWH IP SIQDVAPHHAPAAPSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDA PPSHQPLFY

Variante n.° 4 de la secuencia de aminoácidos de gD de longitud completa (SEQ ID NO: 7)

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2 bajo el control de un promotor y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas para su uso en un método para tratar una infección por VHS-2 o para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VHS-2 en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero:

(a) una preparación de sensibilización que comprende el vector plasmídico que codifica un antígeno de VHS-2; (b) después de la etapa (a), administrar al mamífero una primera preparación de refuerzo que comprende el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas; y

(c) después de la etapa (b), administrar al mamífero una segunda preparación de refuerzo que comprende el vector plásmido que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas, en donde en el método, el vector plasmídico se administra por vía intramuscular y el antígeno encapsulado en liposomas se administra por vía intranasal.

2. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el método, la preparación de sensibilización se administra en una o dos administraciones, en el transcurso de tres días.

3. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el método, la primera preparación de refuerzo se administra al mamífero aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la preparación de sensibilización, aproximadamente de 7 a 18 días después de la preparación de sensibilización, o aproximadamente de 10 a 16 días después de la preparación de sensibilización.

4. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el método, la segunda preparación de refuerzo se administra al mamífero aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la primera preparación de refuerzo, aproximadamente de 7 a 18 días después de la primera preparación de refuerzo o aproximadamente de 10 a 16 días después de la primera preparación de refuerzo.

5. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además el método administrar al mamífero una combinación del vector que codifica el antígeno de VHS-2 y el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas ante el signo de recidiva de lesiones herpéticas.

6. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más síntomas de infección por VHS-2 mejoran en el mamífero después de la administración de la segunda preparación de refuerzo.

7. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la recidiva de lesiones herpéticas se reduce y/o se evita por completo en el mamífero en comparación con un mamífero no tratado o con un mamífero vacunado con una vacuna no por vía mucosa, y/o en donde se reduce la diseminación vírica en el mamífero en comparación con un mamífero no tratado o un mamífero vacunado con una vacuna no por vía mucosa.

8. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la IgA e IgG específicas de antígeno aumentan en las secreciones vaginales del mamífero en comparación con un mamífero no tratado o con un mamífero vacunado con una vacuna no por vía mucosa.

9. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 o con la reivindicación 8, en donde la vacuna no por vía mucosa comprende una proteína gD de VHS-2 truncada formulada para administración subcutánea.

10. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus y, opcionalmente, en donde el promotor de citomegalovirus es un promotor temprano inmediato.

11. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno de VHS-2 codificado por el vector tiene codones optimizados para la expresión en células de mamífero y, opcionalmente, en donde el antígeno de VHS-2 codificado por el vector tiene codones optimizados para la expresión en células humanas.

12. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno de VHS-2 es una glucoproteína gD.

13. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector codifica una secuencia de glucoproteína gD de longitud completa y, opcionalmente, en donde la secuencia de glucoproteína gD de longitud completa comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1.

14. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno encapsulado en liposomas es un dominio extracelular de una glucoproteína gD y, opcionalmente, en donde el antígeno de VHS-2 encapsulado en liposomas comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2.

15. El vector y el antígeno encapsulado en liposomas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los liposomas son liposomas aniónicos y, opcionalmente, en donde los liposomas tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,5-5 pm.