DE60108111T2

DE60108111T2 - Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate

Info

Publication number: DE60108111T2
Application number: DE60108111T
Authority: DE
Inventors: Blas Frangione; Thomas Wisniewski; M. Einar SIGURDSSON
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: WO2001090182A3; DE60108111D1; US20040043935A1; AU2001274873B2; CA2408925A1; US20090081204A1; ZA200207992B; ATE286072T1; US20020077288A1; CN1444598A; IL152625A; CN1249085C; IL152625A0; JP2003534351A; PT1284998E; EP1284998A2; EP1284998B1; WO2001090182A2; US7427655B2; AU7487301A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Amyloid β-Peptide und ein Verfahren zur Induzierung einer Immunreaktion gegen Amyloid β-Peptide und Amyloidablagerungen.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Alzheimersche Erkrankung (AE) ist die häufigste Form der Demenz im späteren Leben von Erwachsenen (Soto et al., 1994), die die vierthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten ausmacht. Ungefähr 10 % der Bevölkerung über 65 Jahre ist von dieser progressiv degenerativen Erkrankung betroffen, die durch Gedächtnisverlust, Verwirrung und einer Reihe von kognitiven Einschränkungen gekennzeichnet ist. Neuropathologisch ist AE durch große Läsionen gekennzeichnet: a) intraneuronale zytoplasmatische Ablagerungen von neurofibrillären Verwicklungen (NFV), b) parenchymale Amyloidablagerungen, die neuritische Plaques genannt werden, c) cerebrovaskuläre Amyloidose und d) synaptischer und neuronaler Verlust. Einer der Hauptvorgänge in AE ist die Ablagerung von Amyloid als unlösliche, faserartige Massen (Amyloidogenese), die in extrazellulären, neuritischen Plaques und Ablagerungen um die Wände von cerebralen Blutgefäßen herum resultieren. Der Hauptbestandteil der neuritischen Plaques und kongophilen Angiopathie ist Amyloid β (Aβ), obwohl diese Ablagerungen auch andere Proteine wie Glycosaminoglycane und Apolipoproteine enthalten.
Aβ ist ein hydrophobes 4,1 – 4,3 kDa Peptid, das in Chromosom 21 als Teil eines wesentlich größeren Amyloidvorläuferproteins APP kodiert wird (Muller-Hill et al., 1989). Das APP beginnt mit einer Leadersequenz (Signalpeptid) gefolgt durch eine Cysteinreiche Region, eine Domäne, die reich an Säuren ist, ein Proteasehemmermotif, eine mutmaßliche N-glycosylierte Region, eine Transmembrandomäne und schließlich eine kleine zytoplasmatische Region. Die Aβ-Sequenz beginnt nahe der Membran auf der extrazellulären Seite und endet innerhalb der Membran. Zwei Drittel von Aβ zeigen in den extrazellulären Raum und das andere Drittel ist in die Membran eingebettet (Kang et al., 1987 und Dyrks et al., 1988). Verschiedene Beweißlinien schlagen vor, dass Amyloid eine zentrale Rolle in der frühen Pathogenese von AE spielen kann.
Beweise, dass Amyloid eine wichtige Rolle in der frühen Pathogenese von AE spielt, kommen hauptsächlich von Studien mit Individuen, die von der familiären Form von AE (FAE) oder vom Down's Syndrom betroffen sind. Down's Syndrom Patienten haben drei Kopien des APP Gens und entwickeln eine AE Neuropathologie in einem frühen Alter (Wisniewski et al., 1985). Die genetische Analyse von Familien mit vererbbarer AE zeigte Mutationen in Chromosom 21 nahe oder innerhalb der Aβ Sequenz (Forsell et al., 1995) zusätzlich zu Mutationen innerhalb der Presenilin 1 und 2 Gene. Zudem wurde berichtet, dass transgene Mäuse, die große Mengen an menschlichem mutierten APP exprimieren, progressiv Amyloidose im Gehirn entwickeln (Garnes et al., 1995). Diese Ergebnisse scheinen eine Amyloidgenese in der Pathophysiologie von AE zu implizieren. Zusätzlich sind Aβ-Fibrillen in neuronaler Kultur toxisch (Yankner et al., 1989) und in geringem Ausmaß toxisch, wenn sie in die Gehirne von Tieren injiziert werden (Sigurdsson et al., 1996 und 1997).
Des Weiteren schlagen einige Beweisansätze vor, dass die Ablagerung von Aβ ein zentrales auslösendes Ereignis in der Pathogenese von AE ist, die zur anschließenden Bildung von NFV und neuralem Verlust führt. Die Amyloidablagerungen in AE haben eine Anzahl von Eigenschaften mit allen anderen cerebralen Amyloidosen wie den Prionenverwandten Amyloidosen sowie den systemischen Amyloidosen gemeinsam. Diese Eigenschaften sind: 1) dass sie relativ unlöslich sind; 2) dass sie eine hohe β-Faltblattsekundärstruktur aufweisen, die mit einer Tendenz zur Aggregation oder Polymerisierung assoziiert ist; 3) dass die Ablagerungen ultrastrukturell hauptsächlich fibrilliär sind; 4) das bestimmte amyloid-assoziierte Proteine wie die Amyloid P Komponente, Proteoglycane und Apolipoproteine vorhanden sind; 5) dass die Ablagerungen eine charakteristische apfelgrüne Doppelbrechung zeigen, wenn sie unter polarisiertem Licht nach Kongorotfärbung beobachtet werden.
Das gleiche Peptid, das Amyloidablagerungen in AE Gehirn ausbildet, wurde auch in einer löslichen Form (sAβ) gefunden, die normalerweise in menschlichen Körperflüssigkeiten zirkuliert (Seubert et al., 1992 und Shoji et al., 1992). Zlokovic et al. (1994) berichteten, dass die Blutgehirnschranke (BGS) die Fähigkeit hat, die cerebrovaskuläre Sequestrierung und den Transport von zirkulierendem sAβ zu steuern, und dass der Transport von sAβ über die BGS signifikant erhöht war, wenn sAβ in Meerschweinchen als ein Komplex mit Apolipoprotein J (apoJ) perfundiert wurde. Der sAβ-apoJ-Komplex wurde in nominaler cerebrospinaler Flüssigkeit gefunden (CSF; Ghiso et al., 1994) und in vivo-Studien zeigten, das sAβ mit apoJ als eine Komponente der Lipoproteine hoher Dichte (HDL) in normalem menschlichen Plasma transportiert wird (Koudinov et al., 1994). Es wurde auch von Zlokovic et al. (1996) berichtet, dass der Transport von sAβ über die BGS fast vollständig unterbrochen war, wenn der apoJ Rezeptor gp330 blockiert war. Es wird angenommen, dass die Umwandlung von sAβ in unlösliche Fibrillen durch eine konformelle Modifikation der 2 – 3 Aminosäuren längeren löslichen Form ausgelöst wird. Es wurde vorgeschlagen, dass die Amyloidbildung ein nukleationsabhängiges Phänomen ist, bei dem der anfänglich unlösliche "Keim" die selektive Ablagerung von Amyloid (Jarrett et al., 1993) erlaubt.
Peptide, die die Sequenz 1 – 40 oder 1 – 42 von Aβ enthalten, oder kürzere Derivate können amyloidartige Fibrillen in der Abwesenheit von anderem Protein ausbilden (Soto et al., 1994), was nahe legt, dass das Potential zur Ausbildung von Amyloidresten hauptsächlich in der Struktur von Aβ liegt. Das Verhältnis zwischen der primären Struktur vor Aβ und seiner Fähigkeit zur Ausbildung amyloidartiger Fibrillen wurde durch Änderung der Sequenz des Peptids analysiert. Die Substitution von hydrophilen Resten gegen hydrophobe in den inneren hydrophobe Aβ Regionen (Aminosäuren 17 – 21) beeinträchtigte die Fibrillenbildung (Hilbich et al., 1992), was vorschlägt, dass der Aβ-Zusammenbau teilweise durch hydrophobe Wechselwirkungen vorangetrieben wird. Tatsächlich sind größere Aβ-Peptide (Aβ1 – 42/43), die zwei oder drei zusätzliche hydrophobe C-terminale Reste umfassen, amyloidogener (Jarrett et al., 1993). Zweitens ist die Konformation, die durch die Aβ-Peptide angenommen wird, entscheidend bei der Amyloidbildung. Aβ-Peptide, die bei unterschiedlichen pH-Werten, Konzentrationen und Lösungsmitteln inkubiert werden, können entweder eine hauptsächlich α-helikale, zufallsorientierte oder eine β-Faltblatt- Sekundärstruktur aufweisen (Barrow et al., 1992); Burdick et al., 1992 und Zagorski et al., 1992). Das Aβ-Peptid mit einer α-helikalen oder zufallorientierten Struktur aggregiert langsam; Aβ mit β-Faltblatt- Konformation aggregiert schnell (Zagorski et al., 1992; Soto et al., 1995 und Soto et al., 1996). Die Bedeutung der Hydrophobizität und sekundären β-Faltblattstruktur für die Amyloidbildung wird auch durch den Vergleich der Sequenz von anderen amyloidogenen Proteinen vorgeschlagen.
Die Analyse der Aβ-Aggregation durch Trübungsmessungen zeigt an, dass die Länge der C-terminalen Domäne von Aβ die Geschwindigkeit des Aβ-Zusammenbaus durch das Beschleunigen der Nukleusausbildung beeinflusst (Jarrett et al., 1993). Somit kann die C-terminale Domäne von Aβ die Fibrillogenese regulieren. Jedoch wechselwirken in vitro Modulatoren der Aβ-Amyloidbildung wie Metallkationen (Zn, Al) (Bush et al., 1994 und Exley et al., 1993), Heparinsulfat, Proteoglycane und Apoliprotein E (Strittmatter et al., 1993) mit der 12 – 28 Region von Aβ. Zudem ergeben Mutationen in dem APP Gen innerhalb der N-terminalen Aβ-Domäne Analoga, die stärker fibrillogen sind (Soto et al., 1995 und Wisniewski et al., 1991). Letztendlich bestimmen Umgebungsparameter die Existenz der alternativen Konformation in der Aβ N-terminalen Domäne (Barrow et al., 1992; Soto et al., 1995 und Burdick et al., 1992), während die C-terminale Domäne von Aβ in wässrigen Lösungen beständig eine β-Strangstruktur einnimmt. Daher kann der N-Terminus eine potentielle Zielposition zur Hemmung der konformellen Änderung der anfänglichen zufallsorientierten Struktur in β-Faltblatt sein.
Das sich aus Studien mit synthetischen Peptiden entwickelnde Bild ist, dass die Aβ-Amyloidbildung von hydrophoben Wechselwirkungen der Aβ-Peptide abhängig ist, die eine antiparallele β-Faltblattkonformation annehmen, und dass beide, die N- und C-terminalen Domänen für die Amyloidbildung wichtig sind. Die Grundeinheit der Fibrillenbildung scheint das Konformer zu sein, das eine antiparallele β-Faltblattform annimmt, die aus Strängen zusammengesetzt ist, die die Regionen 10 – 24 und 29 – 40/42 des Peptids involvieren (Soto et al., 1994). Die Amyloidbildung schreitet durch intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den β-Strängen der verschiedenen Monomere voran, um eine oligomere β-Faltblattvorläuferstruktur der fibrillären β-Kreuzkonformation auszubilden. Wood et al., (1995) berichten von der Einfügung von aggregationsblockierenden Prolinen in Amyloidproteine und Peptide zur Verhinderung der Aggregation solcher Proteine und Peptide. Die Autoren schlagen vor, dass auf diese Weise neue Proteine entwickelt werden können, um das Problem einer Aggregation als Widrigkeit bei der Herstellung ohne Beeinträchtigung der Struktur oder Funktion des nativen Proteins zu vermeiden. Somit wollen Wood et al. neue Proteine herstellen, die durch das Einfügen von Aggregations-blockierenden Prolinen in diese neuen Peptide während der rekombinanten Proteinherstellung und Aufreinigung nicht aggregieren würden.
Derzeit gibt es keine Heilung oder wirksame Therapie zur Verringerung der Amyloidlast eines Patienten oder zur Vehinderung der Amyloidablagerung in AE und sogar die eindeutige Diagnose von AE kann nur nach post mortem Untersuchung von Gehirngeweben auf die kennzeichnenden neurofibrillären Verwirbelungen (NFV) und neuritischen Plaques gestellt werden. Jedoch gibt es eine wachsende Anzahl von Publikationen, die Strategien zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit aufzeigen. Amyloid-verwandte therapeutische Strategien umfassen die Verwendung von Verbindungen, die die Prozessierung des Amyloid β-Vorläuferproteins (APP; Dovey et al., 2001) beeinträchtigen, die die Fibrillenbildung stören oder den Abbau von Fibrillen unterstützen (Soto et al., 1998; Sigurdsson et al., 200; und Findeis, 2000).
Heparinsulfat (Glycosoaminoglycan) oder das Heparinsulfatproteoglycan Perlecan wurden als eine Komponente von allen Amyloiden identifiziert und wurden auch in den frühen Stadien der Entzündungs- assoziierten Amyloidinduktion impliziert. Kisilevsky et al. (1995) beschreibt die Verwendung von anionischen Sulfonat- oder Sulfatverbindungen mit geringem Molekulargewicht (135 – 1000 Da), die die Wechselwirkung von Heparinsulfat mit dem Entzündungs- assoziierten Amyloidvorläufer und dem β-Peptid von AE stören. Heparinsulfat beeinflusst spezifisch den löslichen Amyloidvorläufer (SAA2) zur Annahme einer erhöhten β-Faltblattstruktureigenschaft des proteinfaltenden Musters der Amyloide. Von diesen anionischen Sulfonat- oder Sulfatverbindungen wurde gezeigt, dass sie die Heparin-beschleunigte Alzheimersche Aβ-Fibrillenausbildung hemmen und in der Lage waren, vorgeformte Fibrillen in vitro zu zerlegen, wie durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurde. Zudem blockieren diese Verbindungen, wenn sie oral in relativ hohen Konzentrationen (20 oder 50 mM) verabreicht werden, wesentlich die murine entzündungsassoziierte Milzamyloidprogression in vivo in akuten und chronischen Modellen. Jedoch war die wirksamste Verbindung, Poly-(vinylsulfonat), akut toxisch.
Anthracyclin 4'-iod-4'-deoxy-doxorubicin (IDOX) wurde klinisch dahingehend beobachtet, dass es die Amyloidresorption in Patienten mit leichter Immunoglobinketten- Amyloidose (AL) induziert. Merlini et al. (1995) klärten diesen Wirkungsmechanismus auf. Es wurde herausgefunden, dass IDOX stark über hydrophobe Wechselwirkungen an zwei unterschiedliche Bindungsstellen (Scatchard Analyse) in fünf unterschiedlichen untersuchten Amyloidfibrillen bindet, was die Fibrillogenese und die anschließende Ausbildung von Amyloidablagerungen in vitro hemmt. Die Vorinkubation von IDOX mit dem Amyloidverstärkenden Faktor (AVF) verringerte auch die Ausbildung der Amyloidablagerungen. Das spezifische Zielen von IDOX auf Amyloidablagerungen in vivo wurde in einem akuten murinen Modell bestätigt. Diese Bindung unterscheidet sich von der Heparinsulfatbindung, weil das Entfernen der Glycosaminoglycane aus extrahierten Amyloidfibrillen mit Heparinasen die IDOX-Bindung nicht veränderte. Das gemeinsame Strukturmerkmal aller Amyloiden ist die β-gefaltete Faltblattkonformation. Jedoch bindet IDOX die nativen leichten Amyloidvorläufer Ketten nicht, was vorschlägt, dass das β-Faltblattgerüst allein nicht ausreichend ist, um die optimale Struktur für die IDOX-Bindung zu bilden, und dass es die quaternäre Fibrillen-Kreuz-β-Faltblatt Struktur ist, die für die maximale IDOX-Bindung notwendig ist. Es wurde herausgefunden, dass die Menge an IDOX, das aus Milzorganen extrahiert wird, mit der Amyloidbeladung korreliert und nicht mit den zirkulierenden Serumvorläuferamyloidmengen. Jedoch ist IDOX auch extrem toxisch.
Die Steuerung und Prozessierung von Amyloidvorläuferprotein (APP) über die Hemmung oder Modulierung der Phosphorylierung von APP Steuerungsproteinen wurde auch in dem U.S. Patent 5,385,915 und WO 9427603 untersucht. Die Modulierung der protoeolytischen Prozessierung von APP in nukleisierende Formen von AE wurde auch in AU 9338358 und EP56977 untersucht. WO 95046477 offenbart synthetische Peptide der Zusammensetzung X-X-N-X (SEQ ID NO: 69), die an ein Trägermittel gekoppelt sind, worin X eine kationische Aminosäure ist und N ist eine neutrale Aminosäure, die die Aβ-Bindung an Glycosoaminoglycan hemmt. Peptide, die Alzheimersche Aβ-Sequenzen enthalten, die die Bindung von α-1-Antichymotrypsin mit Aβ hemmen, werden in WO 9203474 offenbart.
Aus Experimenten, die in dem Labor der vorliegenden Erfinder durchgeführt wurden, offenbart WO 96/39834, dass Peptide, die in der Lage sind, mit einem hydrophoben Teil eines Proteins oder Peptids wie Aβ zu wechselwirken, das in die amyloidartige Ablagerungsbildung involviert ist, verwendet werden können, um die abnormale Faltung von solchen Proteinen und Peptiden in Amyloid- oder amyloidartige Ablagerungen zu hem men oder strukturell zu blockieren. Die Peptide, die die abnormale Faltung von Aβ in Amyloidablagerungen blockieren, haben einen hydrophoben Anteil, der β-Faltblattbrechende Aminosäurereste wie Prolin aufweist, die die Neigung des Peptids zur Annahme einer β-Faltkonformation verringern. Das Labor der vorliegenden Erfinder hat in späteren Berichten gezeigt, dass LeuProPhePheAsp (SEQ ID NO: 14), ein nicht-amyloidogenes Peptid mit Sequenzhomologie zu Aβ, die Fibrillenbildung blockiert (Soto et al., 1998) und in vivo den Abbau von fibillären Aβ-Ablagerungen induziert (Sigurdsson et al. 2000).
Kürzlich wurde die Verbindung von Lysinresten an Peptide von Pallitto et al. (1999) bei der Entwicklung von anti-β-Faltblattpeptiden oder Aβ-Fibrillogenesehemmern vorgeschlagen, die eine Aβ-Bindungserkennungssequenz und ein hexameres Lysinaggregations-störendes Element aufweisen.
In vitro-Studien zeigten, das monoklonale Antikörper, die gegen die N-terminale Region von Aß hergestellt wurden, Aβ-Fibrillen disaggregieren können, Aβ-Löslichkeit aufrechterhalten können und Aβ-Toxizität in Zellkultur verhindern können (Solomon et al., 1996 und 1997).
WO 96/25435 offenbart das Potential der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der für den freien C-Terminus des Aβ1 – 42 Peptids endspezifisch ist, nicht aber für das Aβ1 – 43 Peptid, zur Verhinderung der Aggregation von Aβ1 – 42. Die Verabreichung solch eines Aβ-endspezifischen monoklonalen Antikörpers wird weiterhin dahingehend offenbart, dass sie mit dem freien C-terminalen Rest von Aβ1 – 42 wechselwirkt, wodurch er die Aggregation stört oder abbricht, die in AE pathogen sein kann.
WO 98/44955 nimmt einen unterschiedlichen Ansatz zur Vermeidung der Probleme, die mit der wiederholten Verabreichung eines pharmakologisches Mittels assoziiert sind und offenbart ein Verfahren zur Verhinderung des Beginns der Alzheimerschen Krankheit oder zur Hemmung der Progression der Alzheimerschen Krankheit durch die stabile ectopische Expression von rekombinanten Antikörpern im Gehirn, die für Amyloid-β-Peptide endspezifisch sind.
Kürzlich haben Schenk et al., (1999) die Immunisierung mit Amyloid β-attenuierter Alzheimer Krankheit-artiger Pathologie in PDAPP transgenen Mäusen, die als Tiermodell für die Amyloid-β-Ablagerung und Alzheimer Krankeit-artigen Neuropathologien dienen, gezeigt. Sie berichteten, dass die Immunisierung von jungen Tieren vor dem Beginn der alzheimerartigen Neuropathologien im Wesentlichen die Entwicklung der β-Amyloidplaquebildung, der neuritischen Dystrophy und der Astrogliose hemmt, wohingegen bei der Behandlung von älteren Tieren nach dem Beginn der Alzheimer Erkrankungs-artigen Neuropathologien beobachtet wurde, dass das Ausmaß und die Progression dieser Neuropathologien verringert war. Von dieser Wirkung wird angenommen, dass sie durch Antikörper vermittelt wird, da für peripher verabreichte Antikörper gegen Aß gezeigt wurde, dass sie die parenchymale Amylolidgehirnlast verringern (Band et al., 2000). Zusätzlich verringert die intranasale Immunisierung mit frisch solubisiertem Aβ1 – 40 die cerebrale Amyloidlast (Weinen et al., 2000). Zwei kürzliche durchgeführte Studien zeigten, dass eine Impfstoff-induzierte Verringerung an Gehirnamyloidablagerungen in kognitiven Verbesserungen resultierte (Morgan et al., 2000; Janus et al., 2000).
Obwohl die von Schenk et al. berichteten Ergebnisse der Verwendung einer Immunmodulierung als allgemeiner Ansatz zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit viel versprechend sind, bereitet die Immunisierung mit intaktem Amyloid-β gemäß Schenk et al. Probleme, die sie zur Verwendung am Menschen ungeeignet machen. Erstens, Schenk et al's Experimente verwendeten transgene Mäuse, die ein mutiertes, menschliches Protein exprimieren, das diesen fremd ist und das keinerlei physiologische Funktion in Mäusen hat (die Maus- und menschlichen Aβ-Peptidsequenzen sind signifikant verschieden). Jedoch ist das Vorläuferprotein (βAPP) ein endogenes Protein, das eine normale Funktion aufweist. Somit kann die Verwendung dieses Ansatzes in Menschen mit einem menschlichen Aβ-Peptid wahrscheinlich zur Entwicklung einer Autoimmunerkrankung oder Störung führen, die die Dinge schlechter anstatt besser machen könnte. Zweitens haben B. Zlokovic (1997) und die vorliegenden Erfinder Ergebnisse, die zeigen, dass die Aβ-Peptide Aβ1 – 42 und Aβ1 – 40 die Blutgehirnschranke in experimentellen Tieren überschreiten können. Daher wird für Menschen angenommen, dass Aβ1 – 42, das zur Immunisierung in Schenk et al. verwendet wurde, die Blutgehirnschranke überwinden kann und sich auf jeglichen bereits existierenden Amyloidplaques mit ablagern kann, was zu einer erhöhten Toxizität führt und tatsächlich die Plaquebildung unterstützen könnte. Dieses war in dem PDAPP transgenen Mausmodell für AE kein Prob lem, da menschliches Aβ1 – 42 weniger toxisch für die Maus ist; sogar bei massiver Ablagerung von menschlichem Aβ1 – 42, zeigt keine der transgenen Mäuse einen signifikanten neuronalen Verlust. Drittens verwendet Schenk et al. ein toxisches Adjuvanz zur Induzierung einer Immunreaktion.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein synthetisches, immunogenes, nicht aber amyloidogenes Peptid, das zu Amyloid β homolog ist, zur Verfügung, das zur Induktion einer Immunreaktion gegen Amyloid β-Peptide unter Amyloidablagerungen verwendet werden kann und die Komplikationen und Probleme, die in dem Stand der Technik beobachtet wurden, bewältigt oder vermeidet.
Das synthetische, immunogene, nicht aber amyloidogene Peptid, das zu Amyloid-β homolog ist, umfasst die ersten dreißig Aminosäurereste von Aβ1-42 (SEQ NO: 1), worin null, einer oder zwei der Reste 17 – 21 mit Lys, Asp oder Glu substituiert sind und umfasst vorzugsweise ein N-terminales und/oder C-terminales Segment aus 4 – 10 Lys- oder Asp-Resten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Konjugat zur Verfügung, bei dem das Peptid mit einem immunstimulatorischen Polymermolekül vernetzt ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf eine immunisierende Zusammensetzung/Impfstoff gerichtet, der eine zur Immunisierung wirksame Menge des synthetischen, nicht-amyloidogenen aber immunogenen Peptids, das zu Amyloid β homolog ist, oder ein Konjugat davon enthält.
Eis weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Immuntherapie gerichtet, zur Induzierung einer Immunreaktion gegen Amyloid β-Peptide und Amyloidablagerungen.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung ist auf Moleküle gerichtet, die den antigenbindenden Teil eines Antikörpers umfassen, der gegen das synthetische, nicht-amyloidogene aber immunogene Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde.
Es werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die dieses peptidbindende Molekül enthaften und ein Verfahren zur Verringerung der Bildung von Amyloidfibrillen und Ablagerungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Ergebnisse eines Thioflavin T-fluorimetrischen Tests. Fibrillenbildung von Aβ1-42, Aβ1-30-NH₂ und K6Aβ1-30-NH₂ (SEQ ID NO: 6) wurde in vitro nach Inkubation bei 37 °C gemessen. K6Aβ1-30-NH₂ war das einzige Peptid, das zu keinem der Zeitpunkte Fibillen ausbildete.
Die 2A und 2B zeigen, dass Aβ40 und Aβ42 für menschliche Neuroblastomzellen (SK-N-SH) in Kultur toxisch sind, wie durch den MTT Assay bestimmt wurde, wohingegen KI6Aβ30-NH₂ keinerlei Wirkung bei 2 Tagen aufwies (2A) und bei 6 Tagen leicht trophisch ist (2B). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 im Vergleich zu VEH-Gruppe (Einweg ANOVA).
Die 3A – 3D zeigen koronale Schnitte (x 50; ursprüngliche Vergrößerung) durch den Hippokampus und den Kortex in einer Tg Kontroll- (3A) und einer K6Aβ1-30-behandelten (3B) Tg Maus, die mit 6E10 gegen Aβ gefärbt wurden. Die 3C und 3D sind benachbarte Schnitte (x 100), die auf Interleukin-1 doppelt gefärbt wurden, das Mikroglia und Aβ erkennt. Es wird auf die Verringerung der Amyloidlast in der immunisierten Maus (3B) und den Mangel an verzweigten Mikroglia (3D), die das Aβ-Plaque in der gleichen Maus umgeben, im Vergleich zu einer Kontrollmaus (3A, 3C) hingewiesen. Die Balken in den 3A und 3C sind 100 μm. Abkürzungen: hip = Hippokampus; cx =Kortex; cc = Korpus Kallosum.
Die 4A – 4C zeigen die Verringerung an kortikaler (4A) und Hippokampus (4B) Amyloidlast (6E10) nach 7-monatiger Behandlung mit K6Aβ1-30-NH₂. Es gibt eine 89 %ige Verringerung in der kortikalen Amyloidlast (*p = 0,002; t-Test; n = 4 pro Gruppe) und eine 81 %ige Verringerung in der Hippokampus-Amyloidlast (*p = 0,0001). Lösliche Aβ1-42 Mengen (4C) sind innerhalb der Gehirne der geimpften Mäuse (*p = 0,0019) um 57 % verringert.
5 zeigt die Ergebnisse eines Thioflavin T-fluorimetrischen Tests. Die Fibrillenbildung von Aβ1-42, Aβ1-40, Aβ1-30-NH₂; Aβ1-30K6, Aβ1-30-NH₂ (EE_18,19) und Aβ1-30-NH₂ (DD_18,19) in vitro wurde nach Inkubation bei 37 °C gemessen.
Die 6A und 6B zeigen die Ergebnisse des MTT Zelltoxizitätstests. Die Neurotoxizität von β1-42, Aβ1-40, Aβ1-30-NH₂; K6Aβ1-30-NH₂, Aβ1-30K6, Aβ1-30-NH₂ (EE_18,19) und Aβ1-30-NH₂ (DD_18,19) wurde nach Behandlung von menschlichen Neuroblastomzellen (SK-N-SH) für 2 (6A) und 6 (6B) Tage bestimmt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 im Vergleich zu VEH Gruppe (Einweg ANOVA)
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben synthetische, nicht-amyloidogene Peptide entwickelt, die zu Amyloid β (Aβ) homolog sind, die nicht nur eine verringerte Fähigkeit zur Annahme einer β-Faltblattkonformation als eine antigene Quelle aufweisen, die aber auch ein deutlich geringeres Risiko irgendwelcher toxischen Wirkungen in Menschen haben würden. Durch Verwendung dieser synthetischen, nicht-amyloidogenen Peptide oder Konjugate davon in einer immunisierenden Zusammensetzung stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Darstellung von Aβ-Peptiden und Amyloidablagerungen als Ziele des Immunsystems zur Verfügung. Eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Immunisierung zur Verfügung zu stellen, das die Toxizität minimiert, die mit injizierten Aβ-Peptiden assoziiert ist, während die Immunreaktion auf Aβ-Peptide und Amyloidablagerungen maximiert wird.
Die synthetischen, nicht-amyloidogenen, wohl aber immunogenen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, die zu Aβ homolog sind, sind entwickelt worden, um ein verringertes fibrillogenes Potential aufzuweisen, während sie die zwei hauptsächlichen immunogenen Stellen der Aβ-Peptide beibehalten, die die Reste 1 – 11 und 22 – 28 von Aβ1 – 42 basierend auf dem Antigenindex von Jameson et al. (1988) und den Ergebnissen/Beobachtungen, die in dem Labor der vorliegenden Erfinder erhalten wurden, sind. Dementsprechend basierten die vorliegenden Erfinder die Entwicklung des synthetischen, nicht-amyloidogenen Peptids auf den ersten dreißig Aminosäureresten (SEQ ID NO: 1) von Aβ1 – 42, worin einer oder zwei der hydrophoben Reste in den Positionen 17 – 21 von SEQ ID NO: 1 mit den geladenen Resten Lys, Asp oder Glu substituiert sind.
Die ersten dreißig Reste von Aβ weisen den hydrophoben C-Terminus vor Aβ1 – 42 nicht auf, behalten aber die zwei immunogenen Stellen, die mit den Resten 1 – 11 und 22 – 28 von SEQ ID NO: 1 korrespondieren.
Durch Veränderung von ein oder zwei Resten in des Positionen 17 – 21 von Aβ1 – 30 (SEQ ID NO: 1) mit Lys, Asp oder Glu, die hydrophile Reste sind, die eine geringe Wahrscheinlichkeit aufweisen, eine β-Faltblattkonformation anzunehmen, wird das fibrillogene Potential des Peptids stark verringert. Die SEQ ID NO: 12 und 13 sind Beispiele eines solchen modifizierten Aβ1 – 30. Zudem würde das Vorhandensein einer Serie von Lys- und Asp-Resten an dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus des synthetischen Peptids der vorliegenden Erfindung die Immunogenität weiterhin verstärken (Werdelin, 1981) und die Neigung des synthetischen Peptids zur Annahme einer β-Faltblattkonformation und Ausbildung von Amyloidfibrillen/Ablagerungen verringern. Die Bindung von Lysinresten an Aβ-Peptide von 4 bis 8 Resten in Länge wurde kürzlich von Pallitto et al. (1999) in der Entwicklung von anti-β-Faltblattpeptiden oder Aβ Fibrillogenesehemmern vorgeschlagen, aber die Verwendung von Pallitto's Peptiden als Immunogene wurde nie vorgeschlagen. Polykationische Aminosäuren wurden vor kurzem zur Verbesserung des Proteintransports in Zellen durch Endozytose-/Phagozytose-Prozesse verwendet (Martinez-Fong et al., 1994, Wang et al., 1989; Shen et al., 1985; Peterson et al., 1984; Deierkauf et al., 1977; DiNicola et al., 2000). Buschle et al., (1997) berichtete, dass polykationische Aminosäuren die Aufnahme von Peptiden durch Antigenpräsentierende Zellen verstärken, wodurch eine Immunreaktion ausgelöst wird. Sie berichteten auch, dass die Peptidanlieferung in der Gegenwart von Polyarginin auf endozytotischen Prozessen basieren kann, wohingegen die Peptidaufnahme, die durch Polylysin vermittelt wird, scheinbar durch eine zu mindestens transiente Permeabilisierung der Zellmembranen zustande kommt.
Das synthetische, immunogene, nicht aber amyloidogene Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, das zu Aβ homolog ist, von dem nicht angenommen wird, dass es ein Peptidinhibitor der Aβ-Fibrillogenese ist, wird durch die folgende Formel dargestellt: (A)_m-(N-Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅-C)_n-(B)_p worin: m 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 ist;
p 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 ist;
A Lys oder Asp ist;
B Lys oder Asp ist;
n 1 oder 2 ist;
N die Reste 1 – 16 von SEQ ID NO: 1 ist;
C die Reste 22–30 von SEQ ID NO: 1 ist;
Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ jeweils Leu, Val, Phe, Phe und Ala sind, in denen null, ein oder zwei der Reste Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ mit Lys, Asp oder Glu substituiert ist; und
wenn null Reste substituiert sind, dann ist entweder einer oder beide von m oder p nicht null.
Die Aminosäuresequenzen des Peptids, das durch die oben genannte Formel dargestellt wird, werden als SEQ ID NO: 2 – 5 präsentiert und identifiziert.
Die dreißig Aminosäuren lange Basissequenz (Aβ1 – 30) in der null, einer oder zwei der Reste 17 – 21 substituiert sind, wird in der oben genannten Formel durch N-Xaa₁Xaa₂-Xaa₃Xaa₄Xaa₅-C dargestellt. Dieses dreißig Aminosäurereste lange Segment kann sich in dem synthetischen Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung wiederholen (n ist 2). Vorzugsweise ist ein Polylysin- oder ein Polyaspartatsegment von 4 bis 10 Resten an dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus des Peptids vorhanden. Wenn keinerlei Reste in den Resten 17 – 21 von Aβ1 – 30 substituiert sind, hat das Peptid ein Polylysin- oder Polyaspartatsegment von 4 – 10 Resten an dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus. Wenn ein Polylysin- oder Polyaspartatsegment nicht an dem C-Terminus vorhanden ist, dann ist der C-Terminus vorzugsweise amidiert wie in SEQ ID NO: 6 als eine bevorzugte Ausführungsform beispielhaft dargestellt wird. SEQ ID NO: 11 ist eine Ausführungsform eines nicht-substituierten Aβ1 – 30-Peptids mit einem Polylysin- oder Polyaspartatsegment von 4 – 10 Resten an dem C-Terminus.
Des Weiteren, wenn m 0 ist, dann ist das N-terminale Polylysin- oder Polyaspartatsegment von 4 – 10 Resten nicht vorhanden, und es ist dann bevorzugt, dass entweder der C-Terminus des Peptids amidiert ist, um die Möglichkeit zu verringern, dass die C-terminale Ladung des Peptids die Immunogenizität der Reste 22 – 28 Region von Aβ verringern würde, oder dass ein Polylysin- oder Polyaspartatsegment von 4 – 10 Resten an dem C-Terminus vorhanden ist. Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:
wenn m nicht 0 ist, ist p 0;
wenn p nicht 0 ist, ist m 0; und
Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ sind jeweils Leu, Val, Phe, Phe und Ala, in denen null, einer oder zwei der Reste Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ mit Lys, Asp oder Glu (SEQ ID NO: 2–5) substituiert ist.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden auch zu schätzen wissen, dass Peptidomimetika des synthetischen Peptids der vorliegenden Erfindung, bei denen Peptidbindungen durch Nicht-Peptidbindungen ersetzt werden, auch verwendet werden können.
Wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist, kann das verringerte fibrillogene Potential für die synthetischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung leicht durch Messung der β-Faltblattkonformation der Peptide unter Verwendung konventioneller Techniken wie Zirkulardichroismusspektren, FT-IR und Elektronenmikroskopie der Peptidsuspensionen bestimmt werden.
Es ist auch wohl bekannt, dass Immunogene in Verbindung mit Histokompatibilitäts Klasse II Antigenen (MHC), (major histocompatibility class II antigens) präsentiert werden müssen, um eine effiziente Antikörperreaktion auszulösen. Die MHC Klasse II Antigene, die durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) hergestellt werden, binden an T-Zellepitope, die in dem Immunogen in einer sequenzspezifischen Weise vorhanden sind. Dieser MHC Klasse II Immunogenkomplex wird durch CD4⁺ Lymphozyten (T_h Zellen) erkannt, die die Proliferation von spezifischen B-Zellen bewirken, die in der Lage sind, ein B-Zellepitop aus dem präsentierten Immunogen zu erkennen und die Herstellung von B-Zell-Epitop-spezifischen Antikörpern durch solche B-Zellen zu stimulieren. Ein zusätzlicher Ansatz zur weiteren Erhöhung der Immunogenität der synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung ist es, ein Konjugat mit einem immunstimulierenden Polymermolekül wie Mannan (Polymer aus Mannose), Glucan (Polymer aus β1-2-Glucose), Tripalmitoyl-S-glycerincystein und Peptiden, die derzeitig zur Verwendung in Impfstoffen in Menschen zugelassen werden, herzustellen. Solche zur Verwendung in Impfstoffen zugelassenen Peptide stellen starke T-Helferzell (T_h) Epitope aus potenten Immunogenen wie Tetanustoxin, Pertussistoxin, dem Masernvirus F-Protein und dem Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (HBsAg) zur Verfügung. Die T_h Epitope, die zur Konjugation mit dem synthetischen Peptid ausgewählt werden, sind vorzugsweise in der Lage, T-Helferzellreaktionen in einer großen Anzahl von Individuen auszulösen, die diverse MHC-Haplotypen exprimieren. Diese Epitope funktionieren in vielen unterschiedlichen Individuen einer heterogenen Population und werden als promiskuitive T_h-Epitope angesehen. Promiskuitive T_h-Epitope stellen den Vorteil des Auslösens potenter Antikörperreaktionen in den meisten Mitgliedern von genetisch diversen Populationsgruppen zur Verfügung.
Zudem werden die T-Helferzellepitope, die an das synthetische Peptid der vorliegenden Erfindung konjugiert/vernetzt sind, auch nicht nur auf eine Kapazität zur Bewirkung von Immunreaktionen in den meisten Mitgliedern einer gegebenen Population, sondern auch auf eine Kapazität zur Bewirkung von Gedächtnis/Wiederholungsreaktionen vorteilhaft ausgewählt. Wenn das Säugetier ein Mensch ist, werden die große Mehrheit der menschlichen Probanden/Patienten, die eine Immuntherapie mit dem synthetischen Peptid der vorliegenden Erfindung erhalten, am wahrscheinlichsten bereits mit den pädiatrischen Impfstoffen (d. h., Masern + Mumps + Röteln und Diphtherie + Keuchhusten + Tetanus- Impfstoffen) und möglicherweise mit dem Hepatitis B-Virusimpfstoff immunisiert worden sein. Diese Patienten waren daher zuvor mindestens einem der Th-Epitope, die in pädiatrischen Impfstoffen vorhanden sind, ausgesetzt. Das vorherige Aussetzen an ein T_h-Epitop durch Immunisierung mit den Standardwachsinen sollte T_h-Zellklone etablieren, die sofort nach Verabreichung des synthetischen Peptids proliferieren (d. h., eine Gedächtnisreaktion) wodurch schnelle B-Zellreaktionen gegen Aβ-Peptide und Amyloidablagerungen stimuliert werden.
Während die Th-Epitope, die in dem Konjugat mit dem synthetischen Peptid der Erfindung verwendet werden können, promiskuitiv sind, sind sie aber nicht universell. Diese Eigenschaft bedeutet, dass die T_h-Epitope in einem großen Segment einer verzweigten Population, die unterschiedliche MHC Antigene exprimieren (in 50 bis 90 % der Population reaktiv), reaktiv sind, aber nicht in allen Mitgliedern dieser Population. Um eine umfassende, fast universale Immunreaktivität für die synthetischen, nicht-amyloidogenen Peptide der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen, kann eine Mischung von Konjugaten mit unterschiedlichen T_h-Epitopen hergestellt werden, die mit einem synthetischen Peptid vernetzt sind. Zum Beispiel kann eine Kombination von vier Konjugaten mit promiskuitiven T_h-Epitopen aus Tetanus- und Keuchhustentoxinen, Masernvirus F-Protein und HBsAg effektiver sein.
Die T_h-Epitope in dem immunstimulierenden Peptid, das mit dem synthetischen, nicht-amyloidogenen Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung vernetzt ist, umfassen Hepatitis B-Oberflächenantigen T-Helferzellepitope, Keuchhustentoxin T-Helferzellepitope, Tetanustoxin T-Helferzellepitope, Masernvirus F-Protein T-Helferzellepitope, Chlamydia trachomitis hauptsächliches äußeres Membranprotein T-Helferzellepitope; Diphtherietoxin T-Helferzellepitope, Plasmodium falciparum Circumsporozoit T-Helferzellepitope, Schistosoma mansoni Triosephosphatisomerase T-Helferzellepitope, Escherichia coli TraT T-Helferzellepitope und diese werden in dem U.S. Patent 5,843,446 offenbart.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden zu schätzen wissen, dass der Begriff "synthetisch", wie er für das Peptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet, dass es entweder chemisch synthetisiert oder nur in einem Organismus hergestellt wird, wenn der Wirtsorganismus genetisch aus seinem nativen Zustand transformiert wurde, um das Peptid herzustellen. Die synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung können durch synthetische Verfahren hergestellt, die dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind. Dementsprechend können die synthetischen Peptide unter Verwendung der automatisierten Merrifield Techniken der Festphasensynthese entweder mit t-Boc- oder F-moc-Chemie auf Peptidsynthesevorrichtungen wie einem Applied Biosystem Synthesizer hergestellt werden.
Alternativ dazu können längere Peptide durch wohl bekannte rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Jegliches Standardhandbuch der DNA-Technologie stellt detaillierte Protokolle zur Herstellung der synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Zur Herstellung einer Nukleotidsequenz, die ein synthetisches Peptid der vorliegenden Erfindung kodiert, wird die Aminosäuresequenz revers in eine Nukleinsäuresequenz transkribiert und vorzugsweise unter Verwendung einer optimierten Kodonverwendung für den Organismus, indem das Peptid exprimiert werden wird. Als nächstes wird ein synthetisches Gen typischerweise durch Synthese überlappender Oligonukleotide, die das Peptid und jegliche regulatorischen Elemente, falls notwendig, ko dieren, hergestellt. Das synthetische Gen wird in einen geeigneten Klonierungsvektor eingeführt und rekombinante Klone werden erhalten und charakterisiert. Das synthetische Peptid der vorliegenden Erfindung wird dann unter geeigneten Bedingungen exprimiert, die für das ausgewählte Expressionssystem und den Wirt geeignet sind und das gewünschte Peptid wird durch Standardverfahren aufgereinigt und charakterisiert.
Ein immunstimulierendes Peptid, das an das synthetische, nicht-amyloidogene Peptid der Erfindung vernetzt werden kann, ist auch aus dem Invasinprotein einer Yersinia-Spezies verfügbar Die Invasine der pathogenen Bakterien Yersinia spp. sind äußere Membranproteine, die das Eindringen der Bakterien in Säugetierzellen vermitteln (Isberg et al, 1990). Für die Invasion von kultivierten Säugetierzellen durch das Bakterium wurde gezeigt, dass sie die Wechselwirkung zwischen dem Yersinia Invasin-Molekül und verschiedenen Spezies der β1-Familie von Integrinen voraussetzt, die auf den kultivierten Zellen vorhanden sind (Tran Van Nhieu et al., 1991). Da T-Lymphozyten reich an β1-Integrinen sind (insbesondere aktivierte Immun- oder Gedächtnis-T-Zellen), wurden die Wirkungen von Invasin auf die menschliche T-Zelle untersucht (Brett et al. 1993). Es wird angenommen, dass Integrine die Migration von Immun T-Zellen aus den Blutgefäßen und durch das Bindegewebe zu den Positionen einer antigenen Herausforderung durch deren Wechselwirkung mit extrazellulären Matrixproteinen einschließlich Fibronektin, Laminin und Collagen erleichtern. Der Carboxyterminus des Invasinmoleküls stellte sich als co-stimulatorisch für naives menschliches CD4⁺ T in der Gegenwart des nicht-spezifischen Mitogens, des anti-CD3 Antikörpers, heraus, was eine erhöhte Proliferation und Expression von Zytokinen bewirkt. Die spezifische Invasindomäne, die mit den β1-Integrinen wechselwirkt, um diese Stimulation zu bewirken, wurde auch identifiziert (Brett et al., 1993). Wegen der gezeigten T-Zell co-stimulatorischen Eigenschaften, die mit dieser Domäne assoziiert sind, kann sie mit dem synthetischen Peptid der vorliegenden Erfindung verbunden werden, um die Immunogenität zu verstärken.
Viele der äußeren Membranproteine von Gram-negativen Bakterien sind sowohl Lipidmodfiziert wie auch sehr immunogen. Wegen der augenscheinlichen Korrelation zwischen der kovalenten Lipidbindung und der Immunogenität, kann Tripalmitoyl-S-glycerincystein (Pam₃Cys), ein Lipid, das in bakteriellen Membranproteinen üblich ist, an die synthetischen Peptide in einem Konjugat gekoppelt werden, um auch die Immunogenität zu erhöhen.
Die Immunogenität kann des Weiteren signifikant verbessert werden, wenn die synthetischen Peptide zusammen mit Adjuvanzien verabreicht werden. Adjuvanzien verbessern die Immunität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen. Adjuvanzien können durch das lokale Zurückhalten des Antigens in der Nähe der Stelle der Verabreichung wirken, um eine Depotwirkung herzustellen, die eine langsame, dauerhafte Freisetzung des Antigens für die Zellen des Immunsystems erleichtert. Adjuvanzien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot locken und solche Zellen dahingehend stimulieren, Immunreaktionen auszuüben.
Immunstimulatorische Mittel oder Adjuvanzien werden seit vielen Jahren verwendet, um die Wirtzimmunreaktionen zu verbessern, z. B. für Impfstoffe. Intrinsische Adjuvanzien wie Lipopolysaccharide sind normalerweise die Komponenten der getöteten oder attenuierten Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Adjuvanzien sind Immunmodulatoren, die typischerweise nicht kovalent an Antigene gebunden werden, und so formuliert werden, um die Immunreaktionen des Wirtes zu verstärken. Somit wurden Adjuvanzien identifiziert, die die Immunreaktion gegen Antigene verstärken, die parenteral verabreicht werden. Einige dieser Adjuvanzien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen auslösen, was sie zur Verwendung in Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. Tatsächlich werden nur Aluminumhydroxid und Aluminiumphosphat (kollektiv üblicherweise als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvanzien in menschlichen- und Veterinärimpfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun bei der Erhöhung der Antikörperreaktion auf Diphtherie- und Tetanustoxoide ist gut etabliert und ein HBsAg-Impfstoff wurde auch mit Alaun unterstützt.
Ein breiter Bereich extrinsischer Adjuvanzien kann potente Immunreaktionen gegen Antigene auslösen. Diese umfassen Saponine, die mit Membranproteinantigenen (immunstimulierende Komplexe) komplexiert sind, pluronische Polymere mit Mineralöl, getötete Mycobakterien in Mineralöl, Freund's vollständiges Adjuvanz, bakterielle Produkte wie Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS) sowie Lipid A und Liposome. Zur effizienten Induzierung humoraler Immunreaktionen (HIR) und zell-vermittelter Immunität (ZVI) werden Immunogene in Adjuvanzien emulgiert. Viele Adjuvanzien sind toxisch, induzieren Granulomas, akute und chronische Entzündungen (Freund's vollständiges Adjuvanz, FVA), Zytolyse (Saponine und pluronische Polymere) und pyrogene Wirkungen, Arthritis und vordere Uveitis (LPS und MDP). Obwohl FVA ein exzellentes Adjuvanz ist und in der Forschung breit verwendet wird, ist es zur Verwendung in menschlichen oder veterinären Impfstoffen bedingt durch seine Toxizität nicht zugelassen.
U.S. Patent Nr. 4,855,283 lehrt Glycolipidanaloga einschließlich N-Glycosylamide, N-Glycosylharnstoffe und N-Glycosylcarbamate, von denen jedes an dem Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren oder Adjuvanzien. U.S. Patent Nr. 4,258,029 lehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Adjuvanz funktioniert, wenn es mit Tetanustoxoid und Formalin- inaktiviertem Typ I, II und III Poliomyelitisvirusimpfstoff aktiviert ist. Auch Nixon-George et al., 1990, berichteten, dass Octadecylester der aromatischen Aminosäuren, die mit einem rekombinanten Hepatitis B-Oberflächenantigen komplexiert sind, die Wirtsimmunreaktionen gegen Hepatitis B Virus verstärkten.
Die Gabe von exogenen Adjuvanz-/Emulsionsformulierungen, die Immunreaktionen gegen Aβ-Peptide und Amyloidablagerungen maximieren, sind bevorzugt. Die Adjuvanzien und Träger, die geeignet sind, sind die folgenden: (1) solche, die zuvor erfolgreich in Phase I menschlichen klinischen Studien verwendet wurden; (2) solche, die basierend auf ihrem Mangel an Reaktivität in präklinischen Sicherheitsstudien ein Potential zur Zulassung zur Verwendung am Menschen aufweisen; oder (3) solche, die zur Verwendung in Nahrungs- und Haustieren zugelassen sind. Einige der Adjuvanzien, die derzeit klinische Studien durchlaufen, werden in Aguado et al., (1999) genannt.
Immuntherapieverfahren, die maximale Immunreaktionen nach der Verabreichung der geringsten Anzahl von Dosierungen, idealerweise nur einer Dosierung, herstellen, sind sehr wünschenswert. Dieses Ergebnis kann man durch Einbau des Immunogens in Mikropartikel angehen. Zum Beispiel kann absorbierbares Nahtmaterial Poly(lactid-co-glycolid) Copolymer in Mikropartikel geformt werden, die Immunogen enthalten. Nach oraler oder parenteraler Verabreichung ergibt die Hydrolyse der Mikropartikel in vivo die nicht-toxischen Nebenprodukte Milch- und Glycolsäuren, und setzt das Immunogen, das durch den Einbau größtenteils unverändert bleibt, frei. Die Geschwindigkeit des Mikropartikelabbaus und der Freisetzung des eingebauten Immunogens kann durch verschiedene Parameter gesteuert werden, die die folgenden umfassen: (1) das Verhältnis der zur Partikelherstellung verwendeten Polymere (Partikel mit höheren Co-Glycolid konzentrationen bauen sich schneller ab); (2) die Partikelgröße (kleinere Partikel bauen sich schneller ab als größere); und (3) die Einbaueffizienz (Partikel mit höheren Konzentrationen des eingebauten Antigens zersetzen sich schneller als Partikel mit geringeren Beladungen). Mikropartikelformulierungen können auch primäre und anschließende Boosterimpfungen in einer einzelnen Verabreichung durch Vermischen der Mikropartikel mit eingebautem Immunogen mit verschiedenen Freisetzungsgeschwindigkeiten zur Verfügung stellen. Einzeldosierungsformulierungen, die in der Lage sind, Antigen im Bereich von weniger als einer Woche bis zu mehr als sechs Monate freizusetzen, können leicht erreicht werden. Zudem kann die Verabreichung des synthetischen Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, das in Mikropartikel eingebaut ist, auch eine verbesserte Wirksamkeit zur Verfügung stellen, wenn das mikropartikulierte Immunogen mit einer exogenen Adjuvanz-/Emulgierungsformulierung vermischt ist.
Die Wirksamkeit der synthetischen Peptide kann etabliert und durch Injizieren in ein Tier analysiert werden, z. B. in Mäuse oder Ratten mit dem synthetischen Peptid, das in Alaun formuliert ist, und dem anschließenden Verfolgen der Immunreaktion gegen Amyloid β-Peptide.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Immunisierungszusammensetzung zur Verfügung, die eine zur Immunisierung wirksame Menge von einem oder mehreren der synthetischen Peptide der Erfindung oder Konjugate davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel einschließlich Adjuvanzien umfasst. Dementsprechend können die synthetischen Peptide oder Konjugate davon als eine Immunisierungszusammensetzung unter Verwendung von Adjuvanzien, pharmazeutisch verträglichen Trägermitteln, Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln, Hilfsmitteln oder anderen Inhaltsstoffen, die routinemäßig in immunisierenden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, formuliert werden. Solche Formulierungen werden leicht durch einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bestimmt und umfassen Formulierungen zur sofortigen Freisetzung und zur verzögerten Freisetzung, z. B. Mikroverkapselung. Die vorliegenden immunisierenden Zusammensetzungen können auf jedem handhabbaren Weg einschließlich subkutaner, oraler, intramuskulärer oder anderer parenteraler oder internen Wege verabreicht werden. In ähnlicher Weise können die Impfstoffe als eine Einzeldosierung oder in mehrere Dosierungen aufgeteilt zur Verabreichung verwendet werden. Immunisierungsprotokolle wer den leicht durch den Durchschnittsfachmann bestimmt. Zum Beispiel können die Adjuvanzien oder Emulgatoren, die in dieser Erfindung verwendet werden, Alaun, unvollständiges Freund's Adjuvanz, Liposyn, Saponin, Squalen, L121, Emulsigen und ISA720 umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Adjuvanzien/Emulgatoren Alaun, unvollständiges Freund's Adjuvanz, eine Kombination aus Liposyn und Saponin, eine Kombination aus Squalen und L121 oder eine Kombination aus Emulsigen und Saponin.
Die immunisierenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine immunwirksame Menge von einem oder mehreren der synthetischen Peptide oder Konjugate davon und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel. Solche Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform können ungefähr 0,5 μg bis ungefähr 1 mg von jedem Peptid oder Konjugat pro kg Körpergewicht enthalten. Wenn es in mehrfachen Dosierungen verabreicht wird, wird die Dosiseinheitsform handlicher Weise in geeignete Mengen pro Dosierung aufgeteilt.
Immunisierende Zusammensetzungen, die Cocktails aus zwei oder mehreren der synthetischen Peptide oder Konjugate davon der vorliegenden Erfindung enthalten, verbessern die Immunwirksamkeit in einer größeren Population und stellen somit eine bessere Immunreaktion gegen Amyloid β-Peptide und Amyloidablagerungen zur Verfügung. Andere immunstimulierende, synthetische Peptidimmunogene werden durch Modifikation in Lipopeptide erhalten, um eine eingebaute Adjuvanzwirkung für potente Impfstoffe zur Verfügung zu stellen.
Die Immunreaktionen gegen die synthetischen Peptidimmunogene der vorliegenden Erfindung können durch Verabreichung durch Einbau in oder auf biologisch abbaubare Mikropartikel der Art, die durch O'Hagen et al (1991) beschrieben wird, verbessert werden. Die Immunogene können mit oder ohne Adjuvanz verkapselt werden, einschließlich kovalent verbundener Lipidbereiche wie Pam₃Cys, und solche Mikropartikel können mit einem immunstimulierenden Adjuvanz wie Freund's unvollständigem Adjuvanz oder Alaun verabreicht werden. Die Mikropartikel fungieren zur Verstärkung der Immunreaktionen gegen ein Immunogen und stellen eine zeitgesteuerte Freisetzung von dauerhaften oder periodischen Reaktionen zur Verfügung zur oralen Verabreichung und zur topischen Verabreichung (O'Hagen et al., 1991).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Immunisierung mit dem synthetischen Peptid oder Konjugat davon der vorliegenden Erfindung. Dieses Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung involviert die Verabreichung einer immunisierenden Zusammensetzung, die das synthetische Peptid(e) oder Konjugate davon enthält, an ein Tier, das dessen Bedarf, vorzugsweise an einen Menschen. Die Wirksamkeit wird zuerst in transgenen Hausmodellen von AE, wie dem Hausmodell, das in Schenk et al. (1999) oder in anderen öffentlich oder kommerziell verfügbaren AE transgenen Hausmodellen verwendet wird, getestet.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Antikörper zur Verfügung, die gegen die immunogenen Peptide der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden und Moleküle, die den antigenbindenden Teil solcher Antikörper umfassen.
Es sollte verstanden werden, dass, wenn der Begriff "Antikörper" in Bezug auf die Antikörperausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, dass dies dahingehend vorgesehen ist, intakte Antikörper wie polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper (mAbs) sowie proteolytische Fragmente davon wie die Fab- oder F(ab')₂-Fragmente, mit zu umfassen. Des Weiteren kann die DNA, die die variable Region des Antikörpers kodiert, in andere Antikörper eingefügt werden, um chimäre Antikörper herzustellen (siehe zum Beispiel U.S. Patent 4,816,567) oder in T-Zell-Rezeptoren eingefügt werden, um T-Zellen mit der gleichen breiten Spezifität herzustellen (siehe Eshhar et al., (1990) und Gross et al., (1989)). Einzelkettige Antikörper können auch hergestellt und verwendet werden. Einzelkettige Antikörper können zusammengesetzte Einzelketten- Polypeptide mit Antigenbindungsfähigkeiten sein und ein paar Aminosäuresequenzen umfassen, die zu den variablen Regionen einer leichten und schweren Immunoglobulinkette homolog oder analog sind (verbundene V_H-V_L oder Einzelkette F_V). Sowohl V_H wie auch V_L können natürliche monoklonale Antikörpersequenzen kopieren oder eine oder beide dieser Ketten können ein CDR-FR Konstrukt des Typs umfassen, der in dem U.S. Patent 5,091,513 beschrieben wird. Die separaten Polypeptide, die zu den variablen Regionen der leichten und schweren Ketten analog sind, werden durch einen Polypeptidlinker zusammengehalten. Verfahren zur Herstellung solcher einzelkettiger Antikörper, insbesondere solche, bei denen die DNAs, die die Polypeptidstrukturen der V_H und V_L Ketten kodieren, bekannt sind, können gemäß den Verfahren erreicht werden, die zum Beispiel in den U. S. Patenten 4,946,778, 5,091,513 und 5,096,815, beschrieben werden.
Von einem Antikörper wird gesagt, dass er „in der Lage ist", ein Molekül zu binden, wenn er in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren und dadurch das Molekül an den Antikörper bindet. Der Begriff "Epitop" ist dahingehend gemeint, dass er sich auf den Teil eines Moleküls bezieht, der in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der auch durch diesen Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder "antigene Determinanten" bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und haben spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften sowie spezifische Ladungseigenschaften.
Polyklonale Antikörpe sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren abgeleitet werden, die mit einem Antigen immunisiert wurden.
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern gegen spezifische Antigene. mAbs können durch Verfahren erhalten werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Siehe zum Beispiel Köhler et al., (1975); U. S. Patent Nr. 4,376,110; Harlow et al., (1988); und Colligan et al., (1993)). Solche Antikörper können von jeglicher Immunoglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA und jeglicher Unterklasse davon. Die Hybridomzellen, die die mAbs dieser Erfindung herstellen, können in vitro oder in vivo kultiviert werden. Hohe Titer an mAbs können durch in vivo Produktion erhalten werden, bei der Zellen aus den einzelnen Hybridomzellen intraperitoneal in Pristan-vorbehandelte Balb/c-Mäuse zur Herstellung von Aszitesflüssigkeit injiziert werden, die hohe Konzentrationen der gewünschten mAbs enthält. mAbs des Isotyps IgM oder IgG können aus solchen Aszitesflüssigkeiten oder aus Kulturüberständen unter Verwendung von säulenchromatographischen Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt sind, aufgereinigt werden.
Chimäre Antikörper sind Moleküle, deren unterschiedliche Anteile aus unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet sind, wie solche mit einer variablen Region, die aus einem murinen mAb abgeleitet ist, und einer menschlichen konstanten Immunoglobulinregion. Chimäre Antikörper werden hauptsächlich verwendet, um die Immunogenität während der Applikation zu verringern und die Ausbeute bei der Herstellung zu erhöhen. Zum Beispiel, wenn murine mAbs höhere Ausbeuten in Hybridomzellen ergeben, aber eine höhere Immunogenität in Menschen aufzeigen, so dass menschliche/murine chimäre oder humanisierte mAbs verwendet werden. Chimäre und humanisierte Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung sind auf dem Gebiet wohl bekannt, z. B. Cabilly et al., 1984; Morrison et al., 1984; Boulianne et al., 1984; Cabilly et al., 1984,; Neuberger et al., 1985; Taniguchi et al., 1985; Morrison et al., 1986; Neuberger et al., 1986; Kudo et al., 1986; Morrison et al., 1986; Sahagan et al., 1986; Robinson et al., 1987; Liu et al., 1987; Sun et al., 1987; Better et al., 1988; und Harlow et al., 1988.
Ein "Molekül, das den antigenbindenden Anteil eines Antikörpers umfasst" ist dahingehend vorgesehen, nicht nur intakte Immunoglobulinmoleküle von jeglichem Isotyp und hergestellt durch jegliche tierische Zelllinie oder Mikroorganismen zu umfassen, sondern auch den antigenbindenden reaktiven Teil davon, einschließlich, nicht aber eingeschränkt auf, das Fab-Fragment, das Fab'-Fragment, das F(ab')₂-Fragment, den variablen Teil der schweren und/oder leichten Ketten davon und chimäre oder einzelkettige Antikörper, die solch einen reaktiven Teil eingebaut haben, sowie jegliche andere Art von Molekül oder Zelle, in der eine solche antikörperreaktive Fraktion physikalisch eingefügt wurde, wie ein chimärer T-Zellrezeptor oder eine T-Zelle mit solch einem Rezeptor oder Moleküle, die entwickelt wurden, um therapeutische Gruppen mittels eines Teils des Moleküls abzuliefern, der solch einen reaktiven Teil enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Molekül enthält, das den antigenbindenden Teil eines Antikörpers umfasst, der gegen ein Peptid der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Hilfsmittel. Die Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, deren Formulierung konventionellerweise auf dem hoch entwickelten Gebiet verwendet wird, und deren Zusammensetzungen zur vorgesehenen Verwendung als ein Therapeutikum zur Verringerung der Ausbildung von Amyloidfibrillen und Ablagerungen geeignet ist, kann nur mit Routineexperimenten durch die Fachleute auf dem Gebiet entwickelt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Molekül, das den antigenbindenden Teil eines Antikörpers umfasst, der gegen die immunogenen Peptide der vorliegenden Erfin dung hergestellt wurde, an ein Subjekt, das dessen Bedarf, verabreicht werden, um die Ausbildung von Amyloidfibrillen und Verablagerungen zu verringern. Die Stelle der Verabreichung, die Dosierung und der Zeitplan der Verabreichung werden gemäß den gut etablierten Verfahren bestimmt, die von den Fachleuten auf dem Gebiet verwendet werden.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird die gleiche leichter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden werden, die nur im Wege einer Veranschaulichung zur Verfügung gestellt werden und nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung zu verstehen sind.
BEISPIEL 1
Die Experimente in diesem Beispiel zeigen, dass die Immunisierung in transgenen APP-Mäusen (Tg2576) für 7 Monate mit einem nicht-amyloidogenen, nicht-toxischem Aβ homologen Peptid die kortikale und Hippkampusgehirnamyloidlast jeweils um 89 % (p = 0,0002) und um 81 % (p = 0,0001) verringert. Gleichzeitig verringerten sich die Mengen an löslichem Aβ1 – 42 um 57 % ((p = 0,0019). Verzweigte Mikroglia, die Interleukin-1β exprimieren, das mit den Aβ-Plaques assoziiert ist, waren in den immunisierten Mäusen abwesend, was die verringerte Entzündung in diesen Tieren anzeigt. Die in den Experimenten in diesem Beispiel verwendeten Materialien und Verfahren und die experimentellen Ergebnisse werden unten gezeigt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Peptide
Die verwendeten Peptide (Aβ1 – 40, Aβ1 – 42, Aβ1-30-NH₂ (SEQ ID NO: 1) und K6Aβ1-30-NH₂ (SEQ ID NO: 6)) wurden bei der Keck Foundation (Yale University, New Haven, CT) wie zuvor beschrieben (Sigurdsson et al., 2000) synthetisiert. Nicht-amyloidogene Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung von Festphasen-tBOC (N-tert-butyloxycarbonyl) Chemie synthetisiert, durch HPLC aufgereinigt und durch HPLC und Laserdesorptionsspektroskopie charakterisiert.
Das für die Immunisierungen verwendete Peptid K6Aβ1-30-NH₂ behält die zwei hauptsächlichen immunogenen Positionen der Aβ-Peptide, die die Reste 1 – 11 und 22 – 28 von Aβ1-42 basierend auf dem Antigenindex von Jameson et al. (1998) und auf vorläufigen Ergebnissen, die in dem Labor der vorliegenden Erfinder erhalten wurden, sind. Die Aβ1-30-NH₂ und K6Aβ1-30-NH₂-Peptide wurden an dem C-Terminus amidiert, um deren Antigenizität zu konservieren.
Sekundäre Strukturstudien
Die sekundäre Struktur (α-Helix, β-Faltblatt und Zufallswicklung) der Peptide wurde durch Circulardichroismus (CD) wie zuvor beschrieben untersucht (Soto et al., 1998 und Soto et al., 1996). Die Ergebnisse werden als molare Elliptizität in Einheiten Grad cm² dmol^–1 ausgedrückt und die Daten wurden durch die Lincomb und CCA-Algorithmen (Perczel et al., 1992) analysiert, um die Prozentanteile der unterschiedlichen Arten der sekundären Struktur zu erhalten.
Während die sekundäre Struktur der synthetisierten Peptide durch Circulardichroismus (CD) untersucht wurde, kann sie auch durch Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) unter Verwendung der publizierten Protokolle von Aucouturier et al., (1999) untersucht werden. Obwohl CD sensibel für die Gerüstkonformation ist und FTIR sensibel für den Grad und die Stärke der Wasserstoffbindung der Amidgruppen (die von der Struktur abhängt) ist, ergeben die zwei Techniken letztendlich ähnliche Information: die Prozentanteile der unterschiedlichen sekundären Strukturmotive d. h. α-Helix, β-Faltblatt, β-Wende und Zufallsausrichtung (Surewicz et al., 1993). Die CD ist eine sehr gut etablierte Technik zur Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen und Peptiden, die relativ genaue Abschätzungen des Anteils der unterschiedlichen Strukturmotive ergibt. Ein Hauptvorteil der FTIR Spektroskopie zur strukturellen Charakterisierung ist der Mangel an Abhängigkeit von dem physischen Zustand der Probe. Proben können als wässrige oder organische Lösungen, hydrierte Filme, inhomogene Dispersionen, aggregierte Materialien oder sogar als Proteine im festen Zustand untersucht werden. Daher sind die CD und FTIR komplementär zur Untersuchung der sekundären Struktur der Peptide.
Das experimentelle Prozedere für den Circulardichroismus wird gemäß Golabek et al., (1996) und Soto et al., (1996 und 1998) wie folgt durchgeführt: CD-Spektren von Lösungen, die synthetische Peptide (1 – 5 μM in 300 μl 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2) enthalten, werden in einem Jasco J-720 Spektropolarimeter bei 25 °C unter Verwendung einer Zelle mit 0,1 cm Weglänge mit doppelt destilliertem, deionisierten Wasser und TFE (Spektroskopiequalität) als Lösungsmittel aufgenommen. Die Kalibrierung des Instruments wird mit einer wässrigen Lösung d-(+)10-Kampfersulfonsäure durchgeführt. Die Spektren werden in 1 nm Intervallen über den Wellenlängenbereich von 180 bis 260 nm aufgenommen und Pufferspektren, die unter identischen Bedingungen erhalten werden, werden abgezogen.
Das experimentelle Prozedere für die Fourier-Transformationsinfrarotspektroskopie gemäß Aucouturier et al., (1999) ist wie folgt: Lösungen oder Suspensionen, die lösliche oder aggregierte synthetische Peptide (5 – 10 mg/ml) enthalten, werden in H₂O- und D₂-Puffern bei neutralem pH hergestellt und 10 μl werden in eine Infrarotzelle mit CaF₂-Platten und einem 6 μm Weglängenabstandshalter geladen. Die Spektren werden mit einem Perkin Elmer Modell 2000 FTIR Spektrophotometer bei 25 °C wie beschrieben aufgenommen (Aucouturier et al., 1999; Soto et al., 1995). Für jedes Spektrum wurden 1000 Scans in dem Einzelstrahlenmodus mit 2 cm^–1 Auflösung und einem 1 cm^–1 Intervall von 4000 bis 1000 cm^–1 gesammelt. Glätten und Fourier- Selbstdekonvolution wird angewendet, um die Spektralauflösung in der Amid I Region (1700 – 1600 cm^–1) zu erhöhen und die iterative Anpassung an Lorentz-Linienformen wird ausgeführt, um den Anteil von jedem sekundären Strukturelement abzuschätzen.
Studien der Amyloidfibrillenbildung in vitro
Studien der Amyloidfibrillenbildung in vitro können unter Verwendung publizierter Protokolle aus dem Labor der vorliegenden Erfinder (Castaño et al., 1995; Wisniewski et al., 1991; Wisniewski et al., 1993 und Wisniewski et al., 1994) durchgeführt werden. Proben der synthetischen Peptide bei einer Konzentration im Bereich zwischen 25 – 250 μM, hergestellt in 0,1 M Tris, pH 7,4, können für verschiedene Zeiten inkubiert werden, und deren Fibrillenbildung wird mit der von Aβ1 – 28, Aβ1 – 40 und Aβ1 – 42 verglichen. In diesem Beispiel wurden Proben der Peptide, die in 0,1 M Tris, pH 7,4 hergestellt wurden, für verschiedene Zeiten inkubiert und deren Fibrillenbildung wurde mit der von Aβ1- 30-NH₂ und Aβ1 – 42 verglichen. Die in vitro Genese von Fibrillen wurde durch einen fluorimetrischen Assay basierend auf der Fluoreszenzemission durch Thioflavin T untersucht, wie er zuvor durch das Labor der vorliegenden Erfinder beschrieben wurde (Soto et al., 1998 und Jameson et al., 1998). Thioflavin T bindet spezifisch an Amyloid und diese Bindung ergibt eine Verschiebung in seinem Emissionsspektrum und eine Fluoreszenzverstärkung proportional zu der Menge des gebildeten Amyloids (LeVine et al., 1993).
Obwohl es in diesem Beispiel nicht durchgeführt wurde, kann die in vitro Genese von Fibrillen auch durch drei andere unterschiedliche Verfahren beurteilt werden:

(A) Ein spektrophotometrischer Assay basierend auf der spezifischen Wechselwirkung von Kongorot mit Amyloidfibrillen. Nach dem Inkubationszeitraum werden 2 μl Kongorot (1, 5 mg/ml) zu jeder Probe hinzugefügt und im Dunkeln für eine Stunde inkubiert. Die Proben werden dann bei 15000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert und die Absorption des Überstandes wird bei 490 nm gemessen. Die Menge an Amyloid, die gebildet wurde, ist direkt proportional zu der Verringerung in der Absorption des Überstandes (Castaño et al., 1986).
(B) Es wird ein Sedimentationsassay, wie er beschrieben wurde, verwendet (Soto et al., 1995). In Kürze, die Proben werden bei 15000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um das lösliche und aggregierte Peptid abzutrennen. Die Menge des Materials in Lösung wird durch Mikrobore HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen Vydac C4 Säule und einem linearen Gradienten von 3 – 70 % Acetonitril analysiert. Der Prozentanteil des aggregierten Peptids wird durch Vergleich der Fläche der Spitze, die mit dem löslichen Peptid in jeder inkubierten Probe korrespondiert, mit einer identischen Kontrolle einer nicht-inkubierten Probe abgeschätzt.
(C) Eine zusätzliche Charakterisierung der Genese der Fibrillen wird durch Kongorotfärbung und elektronenmikroskopische Untersuchung nach negativer Färbung (Castaño et al., 1995; Wisniewski et al., 1991; Wisniewski et al., 1993 und Wisniewski et al., 1994) durchgeführt werden. In die Elektronenmikroskopie werden die inkubierten Proben der Peptide auf Kohlenstoffformar-beschichteten 300-Mesh Nickelgittern platziert und für 60 Sekunden mit 2 % Uranylacetat unter einem Dampf von 2 % Glutaraldehyd gefärbt. Die Gitter werden auf einem Zeiss EM 10 Elektronenmikroskop bei 80 kV sichtbar gemacht. Für die Kongorotfärbung werden die inkubierten Peptide auf Gelatine-beschichtete Glasmikroskopplatten platziert und bei 37 °C luftgetrocknet. Die Scheiben werden dann in 0,2 % Kongorot, das in 80 % wässrigem Ethanol aufgelöst ist, der mit NaCl gesättigt ist, für 60 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht, dreimal mit Wasser gewaschen und durch polarisierte Lichtmikroskopie visualisiert.

Neurotoxizität
Die potentielle Neurotoxizität von K6Aβ1-30-NH₂ (1 – 100 μM) wurde bei 2 und 6 Tagen in einer menschlichen Neuroblastomzelllinie (SK-N-SH) unter Verwendung eines Standard MTT Assays untersucht, wie er durch den Hersteller beschrieben wird (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Aβ1-30-NH₂, Aβ1 – 40 und Aβ1 – 42 wurden als Kontrollpeptide verwendet. In Kürze, die Zellen wurden bei 10000 Zellen / 100 μl Kulturmedium pro Vertiefung in Flachboden 96er Mikrotiterplatten ausplattiert. Die Zellen wurden an die Platte über Nacht in einem Inkubator (37 °C, 5,0 % CO₂) befestigen gelassen und dann wurde 10 μl frisch zubereitete Peptidlösung (in Nanopure H₂O) hinzugefügt. Aβ1 – 42 war nur teilweise bei 100 μM löslich und wurde daher als eine Suspension bei dieser Konzentration hinzugefügt. Die anschließenden Schritte waren wie in dem Assayprotokoll beschrieben wird.
Tiere
Die Impfung wurde in dem Tg2576 APP-Mausmodell durchgeführt, das durch Karen Hsiao et al. (1996) entwickelt wurde. Diese Mäuse entwickeln Aβ-Plaques sehr früh im Alter von 11 – 13 Monaten. Dieses Modell wurde vor dem Doppel Tg APP/PS1 Modell (Holcomb et al., 1998) gewählt, da das Alter des Beginns und der Progression der Aβ-Ablagerung in den einzelnen Tg APP-Mäusen, dem von AE stärker ähnelt. Altersübereinstimmende Träger-behandelte Tg-Mäuse und nicht-Tg Wurfgenossen, die K6Aβ1-30-NH₂ erhielten, wurden als Kontrollen verwendet, und die Tiere erhielten ihre erste Injektion bei 11 – 13 Monaten, zu welcher Zeit wenige Plaques bereits vorhanden sein sollten. Es waren vier Mäuse in jeder Gruppe. Die Tiere wurden in einem 12 Stunden Licht-Dunkel Zyklus gehalten und hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Die Tierpflege entsprach den Institutsvorschriften.
Impfstoffverabreichungen: K6Aβ1-30-NH₂ wurde als Trifluoressigsäure- (TFS) salz zur Verfügung gestellt. Die Immunisierungsprozedur wurde wie zuvor durch Schenk et al. (1999) beschrieben durchgeführt, außer, dass das Peptid nicht über Nacht bei 37 °C vor der Injektion inkubiert wurde. In Kürze, das Peptid wurde in PBS bei einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst und dann 1 : 1 (v/v) mit dem Adjuvanz oder PBS vermischt. Vollständiges Freund's Adjuvanz wurde für die erste Injektion verwendet, unvollständiges Freund's Adjuvanz für die nächsten 3 Injektionen und PBS ab der 5 Injektion. Die Mäuse erhielten eine subkutane Injektion von 100 μl der Mischung (d. h. 100 μg/100 μl) gefolgt von einer zweiten Injektion zwei Wochen später und dann monatlich danach.
Antikörpertiter: Antikörpertiter wurden durch serielle Verdünnungen der Seren unter Verwendung eines ELISA-Assays bestimmt, wie er zuvor beschrieben wurde (Jimenez-Huete et al., 1998), bei dem Aβ oder sein Derivat auf Mikrotiterplatten beschichtet ist. Der Titer, definiert als die Verdünnung, die 50 % das maximalen Signals ergibt, wurde durch einen Ziege Anti-Maus IgG nachgewiesen, das an eine Meerrettichperoxidase gebunden war (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) und Tetramethylbenzidin (Pierce, Rockford, IL) war das Substrat.
Histologie: Die Mäuse wurden mit Natriumpentobarital (150 mg/kg, i. p.) anästhetisiert, transaortisch mit Phosphatpuffer perfundiert und die Gehirne wurden wie zuvor beschrieben (Sigurdsson et al., 1996) verarbeitet. Die richtige Hemisphäre wurde durch Eintauchen in Periodat-Lysin-Paraformaldehyd fixiert, wohingegen die linke Hemisphäre für Messungen der Aβ-Mengen unter Verwendung etablierter ELISA- Verfahren schockgefroren wurde (Mehta et al., 1998 und Mehta et al., 2000). Serielle koronale Schnitte (40 μm) wurden geschnitten und fünf Serien der Schnitte mit 0,2 mm Intervallen wurden für die histologische Analyse aufbewahrt für 1) 6E10-, 2) Kongorot-, 3) Interleukin-1β/OX42-/Tomatenlektin-, 4) GFAP- und 5) Kresylviolett- gefärbte Schnitte. 6E10 erkennt Aβ und färbt sowohl pre-amyloide wie auch Aβ-Plaques (Kim et al., 1990). Kongorot Färbung wurde durchgeführt, um Amyloidläsionen in diesen Tieren zu identifizieren. GFAP ist eine Komponente der intermediären Gliafilamente, die Teil des Zytosskeletts bilden und hauptsächlich in Astrozyten zu finden sind. Mikroglia scheinen die hauptsächliche Quelle von Interleukin-1 (IL-1) innerhalb des ZNS (Schobitz et al., 1994) zu sein, und OX-42 erkennt CD11b auf Mikroglia, ein Rattenäquivalent zu dem menschlichen C3bi-Rezeptor (Robinson et al., 1986). Tomatenlektin bindet an Poly-N-acetyllactosaminreste und hat in neuralem Gewebe eine spezifische Affinität für Mikrogliazellen (Acarin et al., 1994). Sowohl Astrozyten wie auch Mikroglia sind mit Aβ-Ablagerungen assoziiert. Die Färbung mit Kresyiviolett wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Immunisierung eine neuronale Schrumpfung und/oder Zellverlust in diesen Zellen bewirkt. Nach dem Schneiden wurden die Serien in Ethylenglycol Gefrierschutzmittel platziert und bei – 20 °C bis zur Verwendung gelagert.
Kresylviolett und Kongorot: Befestigte Schnitte wurden in Xylol entfettet und in einem Gradienten aus Ethylalkohol- und Wasser-serien hydriert. Die Färbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Sigurdsson et al., 1996 und 1997 und Soto et al., 1998).
6E10. GFAP. IL-1β und OX-42: Die Färbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Sigurdsson et al., 1996 und Soto et al., 1998). In Kürze, die Schnitte wurden in 6E10 (freundlicherweise durch Richard Kascsak, Institute for Basic Research, zur Verfügung gestellt), einem primären Antikörper, der selektiv an menschliches Aβ bei einer 1:1000 Verdünnung bindet, inkubiert. Ein Maus auf Maus Immun-Nachweiskit (Vektor Laboratories, Burlingame, CA) wurde verwendet, bei dem der Anti-Maus IgG sekundäre Antikörper in einer 1:2000 Verdünnung verwendet wurde. Die GFAP- (1:500; Dako, Dänemark), IL-1β- (1:250; Endogen, Rockford IL) und OX-42- (1:250; Biosource Int., Camerillo, CA) Färbung wurde in der gleichen Art wie die 6E10-Färbung durchgeführt, außer dass der sekundäre Antikörper 1:1300 verdünnt wurde. Die Schnitte wurden in 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) mit oder ohne Nickelammoniumsulfat (Ni)-Intensivierung reagieren gelassen. Zur Doppelmarkierung der IL-1β- und Aβ-Plaques wurden die Schnitte zuerst auf IL-1β (DAP/Ni; schwarz) gefärbt, wobei Peroxidase das Enzym war. Die Plaques (6E10) wurden dann unter Verwendung des Vektor Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vektor) gefärbt.
Tomatenlektin: Die Schnitte wurden aus dem Gefrierschutzmittel entfernt und in PBS, 0,3 % Triton X-100 in PBS (PBX-Tx) gewaschen und dann für 30 Minuten in 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS inkubiert, um eine endogene Peroxidaseaktivität abzuschrecken. Nach 2 Stunden Inkubation mit Tomatenlektin (10 μg/ml PBS; Vektor) wurden die Schnitte in PBS-Tx gewaschen und dann mit Avidin-Meerrettichperoxidase (Vektor für eine Stunde reagieren gelassen. Anschließende Schritte waren diejenigen, die zur Antikörperfärbung verwendet wurden.
Bildanalyse: Die Immunhistochemie der Gewebeschnitte wurde mit einem Bioquant Image Analysis System quantifiziert und es wurde eine vorteilslose Probennahme verwendet (West et al., 1999). Alle Prozeduren wurden durch ein Individuum ausgeführt, das die experimentellen Bedingungen der Studien nicht kannte. Die analysierte kortikale Fläche war dorsomedial zu dem Cingulat-Kortex und verlängerte sich ventrolateral zu der rhinalen Spalte innerhalb der rechten Hemisphäre. Die Fläche des Gitters betrug 800 × 800 μm² und die Amyloidlast wurde in 10 Rahmen pro Maus gemessen (jeweils: 640 × 450 μm²), die zufällig ausgewählt wurden. Hippokampus-Messungen wurden auf dem gesamten Hippokampus in einer ähnlichen Weise wie die kortikale Analyse durchgeführt. Die Aβ-Last wird als der Prozentanteil der Fläche in dem Messfeld definiert, der durch das Reaktionsprodukt belegt ist.
Sandwich ELISA-Assay für lösliche Aβ-Mengen: Vor der Extraktion von Aβ aus Gehirngewebe wurden 10 % (Gew./Vol.) Homogenate in Gewebehomogenisationspuffer (20 mM Tris pH 7,4 250 mM Sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) hergestellt. Direkt vor der Verwendung wurde 1/100 Volumen 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid Stammlösung (in Ethanol) und 1/1000 Volumen LAP (jeweils 5 mg Leupeptin, Antipain und Pepstatin Aβ pro ml N-N-Dimethylformamid) zu dem Homogenisationspuffer hinzugefügt. Das Homogenat wurde dann ausgiebig mit einem gleichen Volumen 0,4 % Diethylamin / 100 mM NaCl inkubiert, dann bei 135000 × g für eine Stunde bei 4 °C geschleudert und anschließend mit 1/10 Volumen 0,5 M Tris, pH 6,8 neutralisiert. Die Proben wurden dann aufgeteilt, auf Trockeneis blitzgefroren und bei – 80 °C gelagert, bis sie auf Platten geladen wurden. Lösliche Aβ-Mengen wurden in der linken Hemisphäre unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 6E10 (spezifisch für ein Epitop, das auf den Aminosäureresten 1 – 16 von Aβ vorhanden ist), Kaninchenantiserum R162 (spezifisch für Aβ40) und Kaninchenserum 165 (spezifisch für Aβ42) in einem Doppelantikörpersandwich ELISA, wie er zuvor beschrieben wurde (Mehta et al., 1998 und 2000), gemessen. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm in einem Mikro-ELISA-Lesegerät gemessen. Das Verhältnis zwischen OD und Aβ40- oder Aβ42-Konzentrationen wurde durch eine vier Parameter logistische Logarithmusfunktion bestimmt. Eine nicht-lineare Kurvenanpassung wurde mit dem KlinetiCalc Programm (Biotek Instruments, Inc. Winooski, VT) durchgeführt, um die OD des Plasmas in geschätzte Konzentrationen umzuwandeln. Alle Proben waren kodiert und die Forscher waren blind bezüglich der Gruppenzuordnung bis die Mengen gemessen und aufgenommen waren. Die Nachweisgrenze des Assays beträgt 10 pg/ml für Aβ40 und Aβ42. Der prozentuale Koeffizient der Variation liegt normalerweise im Bereich von 8 bis 14 % (Inter-Assay) und 10 bis 18 % (Intra-Assay).
Datenanalyse: Die Zellkulturdaten wurden durch den Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt durch einen Dunnett's Test für eine post hoc Analyse (GraphPad Prism 3,0). Ein unvoreingenommenes stereologisches Bildanalysensystem (Bioquant, R&M Biometrics Inc., Nashville, TN) wurde verwendet, um die Amyloidlast in 6E10-gefärbten Gehirnabschnitten zu bestimmen. Die Daten für die Amyloidbelastung und die Mengen an löslichem Aβ innerhalb des Gehirns wurde durch einen Studenten t-Test analysiert.
ERGEBNISSE
Bevor die Impfstudie durchgeführt wurde, war es notwendig, zu bestätigen, dass das Prototyppeptid, KKKKKK-Aβ1-30-NH₂ tatsächlich weniger β-Faltblattstruktur und verringerte Fibrillogenese im Vergleich zu Aβ1 – 42 aufwies, und dass es in neuronaler Kultur nicht toxisch war. Die sekundäre Struktur dieser Peptide wurde durch Circulardichroismus (CD) und deren Fähigkeit zur Bildung von Amyloidfibrillen durch eine Thioflavin T-fluorimetrischen Assay bestimmt. Ein zusätzliches Kontrollpeptid war Aβ1-30-NH₂.
CD-Test: Verbindungen mit hohem β-Faltblattgehalt sind toxischer und wahrscheinlicher dahingehend Fibrillen auszubilden als Verbindungen mit geringem β-Faltblattgehalt (Pike et al., 1991). Die Peptide mit dem Polylysin an dem N-Terminus hatten wesentlich weniger β-Faltblattgehalt als das amidierte Aβ1 – 30 oder Aβ1 – 42 (Tabelle 1).
Das (K)₆Aβ1-30-NH₂-Peptid bildet auch keine Fibrillen nach Inkubation bei 37 °C für mindestens 15 Tage aus. Diese Daten zeigen eindeutig, dass die Zugabe von Polylysin an den N-Terminus das Peptid derart verändert, dass der β-Faltblatt-Gehalt wesentlich geringer als bei entweder Aβ1 – 42 oder Aβ1 – 30 ist. Zusätzlich erhöht sich der β-Faltblattgehalt des (K)₆Aβ1-30-NH₂-Peptids mit der Zeit nicht. Der β-Faltblattgehalt von Aβ1 – 42 erhöhte sich auf 55 % nach 96 Stunden, während der von (K)₆Aβ1-30-NH₂ bei 16 – 18 % blieb.
Tabelle 1
Thioflavin T-Assay: Aβ1 – 42 war bereits bei t = 0 fibrillär, wohin Aβ1-30-NH₂ langsam Fibrillen mit der Zeit ausbildete (1). Der relativ hohe Grad an Thioflavin T-Färbung des Aβ1-30-NH₂ gegenüber Aβ1 – 42 nach 6 Tagen reflektiert die bekannte Chargenvariabilität der Aβ-Peptidfibrillenbildung (Soto et al., 1995) sowie den Grad der Pelletbildung durch das Aβ1 – 42 bei verlängerter Inkubation. K₆Aβ1-30-NH₂ bildete keine Fibrillen nach Inkubation bei 37 °C für mindestens 15 Tage.
Neurotoxizität: Um weiterhin die Sicherheit dieses Impfstoffansatzes zu untersuchen, wurde die Neurotoxizität von K₆Aβ1-30-NH₂ bestimmt. K₆Aβ1-30-NH₂ hatte keinerlei Auswirkung auf die Zellüberlebensfähigkeit bei 2 Tagen und war bei Tag 6 leicht trophisch (p < 0,05), wohingegen Aßt – 40 und Aßt – 42 toxisch (p < 0,05 – 0,001) für die menschlichen Neuroplastomzellen (SK-N-SH) im Vergleich zu der Trägermittelgruppe waren, wie durch den MTT Assay bestimmt wurde (2A und B). Während des Inkubationszeitraumes waren Aggregate unter dem Mikroskop nur in Kulturvertiefungen sichtbar, die Aβ1 – 42 (10 – 100 μM) enthalten.
Antikörpertiter: Tg2576 und deren nicht-Tg Wurfgefährten wurden mit K₆Aβ1-30-NH₂ oder Trägermittel geimpft. Fast alle der Mäuse entwickelten Antikörper gegen das Immunogen (K₆Aβ1-30-NH₂), die mit Aβ1 – 40 und Aβ1 – 42 kreuzreagieren. Der Titer, der als die Verdünnung definiert ist, die 50 % des maximalen Signals ergibt, lag im Bereich von einigen hundert bis zu mehreren tausend (Daten werden nicht gezeigt). Die Trägerrmttel-behandelten Tiere, die mit dem Adjuvanz und PPS injiziert worden waren, entwickelten keine Antikörper gegen diese drei Peptide (die Daten werden nicht gezeigt). Nicht-transgene Mäuse hatten im Allgemeinen höhere Titer gegen alle 3 Peptide und die polyklonalen Antikörper hatten eine höhere Avidität für das Immunogen im Vergleich zu Aβ1 – 40 und Aβ1 – 42. Diese Ergebnisse werden erwartet, weil das Immunogen auf der menschlichen Sequenz von Aβ basiert, die sich in 3 Aminosäuren von dem Maus Aβ unterscheidet (Johnstone et al., 1991), und K₆Aβ1-30-NH₂, das die Immunreaktion auslöste, sollte mehr Bindungsmotive für Antikörper als die intakten Aβ-Peptide aufweisen.
Amyloidbelastung und assoziierte Histopathologie: Die Mäuse wurden bei 18 – 20 Monaten Alter nach 7 Monaten Behandlung getötet und deren rechte Hemisphäre wurde für die Histologie wie beschrieben (Sigurdsson et al., 1996) verarbeitet. Die Gehirnschnitte wurden mit Kresylviolett, Kongorot, Tomatenlektin und mit Antikörpern gegen: 1) menschliches Aβ (6E10); Mikroglia (OX-42; IL-1β) und GFAP (anti-GFAP) gefärbt. Nach K₆Aβ1-30-NH₂-Impfung war die kortikale und Hippokampus- Amyloidlast in den Tg-Mäusen um jeweils 89 % und 81 % verringert (3A, 3B; 4A, 4B), wie durch stereologische Techniken bestimmt wurde. Die Gesamtzahl an Kongorot- positiven Amyloidablagerungen war in den immunisierten Tieren verringert; jedoch der Prozentanteil an Aβ-immunreaktiven Läsionen, die Kongorot- positiv waren, schien der gleiche wie in den nicht-immunisierten Tg-Mäuse zu bleiben. Der Abbau der Amyloidablagerungen schien in anderen Gehirnregionen ähnlich zu sein. Ausgewählte Gehirnschnitte aus einer Kontrollmausmit hoher Amyloidlast und einer immunisierten Maus mit verringerter Amyloidlast wurden mit Seren von verschiedenen immunisierten und Kontrollmäusen gefärbt, deren Antikörpertiter zwischen null und dreitausend lag. Wie erwartet wurden mit erhöhtem Titer mehr Plaques gefärbt und das Muster war in beiden Mäusen (Daten nicht gezeigt) ähnlich. Es gab keinen offensichtlichen Unterschied zwischen den Tg-Behandlungsgruppen in der Kresylvioletffärbung. Reaktive Astrozyten wurden mit allen Amyloidplaques assoziiert beobachtet. Da die Trägermittel-behandelten Tg-Mäuse eine höhere Plaqueslast aufwiesen, hatten sie mehr Cluster von Astrozyten als immunisierte Tg-Mäuse. Die OX-42 Färbung von verzweigten anstatt phagozytischen (ameboiden) Mikroglia wurde hauptsächlich mit Plaques assoziiert beobachtet. Um zu verifizieren, dass dieser Mangel an Mikrogliaphagozyten nicht durch die Runterregulierung des CD11b-Rezeptors bedingt war, dem Bindungsmotiv von OX-42 (Robinson et al., 1986), wurden Schnitte aus allen Behandlungsgruppen mit Tomatenlektin gefärbt. Dieses bestimmte Lektin bindet die Poly-N-acetyllactosaminreste, die vorwiegend in verzweigten und phagozytischen Mikrogliazellen zusätzlich zu endothelialen und ependymalen Zellen zu finden sind (Acarin et al., 1994). Diese zwei letzteren Zelltypen wurden in allen Mäusen gefärbt. Die Mikroglia-Lektinfärbung spiegelte die OX-42 Färbung. Mit anderen Worten, in beiden, den immunisierten und den Kontroll Tg-Gruppen hatten die Mikroglia keine phagozytische Morphologie und die Anzahl der verzweigten Mikrogliaverlängerungen pro Plaques schienen ähnlich zwischen immunisierten und nicht-immunisierten Mäusen zu sein (Daten werden nicht gezeigt). Auf der anderen Seite war die IL-1β-Färbung verzweigter Mikrogliazellen hauptsächlich in der Umgebung der Aβ-Plaques in den Kontroll Tg-Mäusen (3C), wohingegen so gut wie keine IL-1β-Färbung in den immunisierten Mäusen (3D) beobachtet wurde. Signifikant ist, dass es keinerlei Anzeichen einer Glomerulonephritis in Hemotoxylin-/Eosin-gefärbten Nierenschnitten in K₆Aβ1-30-NH₂-behandelten Mäusen gab, was anzeigt, dass die Mäuse kein Autoimmunerkrankung entwickelt hatten.
Lösliches Aβ durch ELISA: Messungen von löslichen Aβ-Mengen wurden auf der linken Hemisphäre der Mäuse durchgeführt, deren rechte Hemisphäre zur Histologie verwendet wurde. Lösliches Aβ1 – 42 warum 57 % nach Impfung mit K₆Aβ1-30-NH₂ für 7 Monate (p = 0,0019) im Vergleich zur Kontrollgruppe (4C) verringert. Obwohl es einen Trend zu verringerten Mengen an löslichem Gesamt-Aβ und Aβ1 – 40 in der K₆Aβ1-30-behandelten Gruppe gab, unterschieden sich die Werte nicht signifikant von denen der mit Trägermitteln behandelten Gruppe.
Insgesamt resultiert die Immunisierung TG-APP-Mäusen mit nicht-amyloidogenem/nicht-toxischem (geringerer β-Faltblattgehalt) Aβ- homologen Peptid in einer ähnlichen Verringerung der Amyloidlast wie sie durch Schenk et al., (1999) beobachtet wurde, die ein fibrilläres/toxisches (hoher β-Faltblattgehalt) Aβ1 – 42 verwendeten.
DISKUSSION
Diese Ergebnisse zeigen, dass Aβ-Aggregate/Fibrillen nicht notwendig sind, um eine ausreichende Immunreaktion auszulösen, die in dem Abbau von Aβ-Plaques resultiert. Die Verwendung nicht-fibrillärer/nicht-toxischer Aβ- homologer Peptide wie K₆Aβ1-30-NH₂ ist ein sicherer Impfstoffansatz für Menschen.
Der Mechanismus der Impfstoff-induzierten Verringerung der zerebralen Amyloidlast wird nicht vollständig verstanden. Jedoch ist es basierend auf der passiven Impfstoffstudie von Bard et al. (1000) wahrscheinlich, dass Antikörper eine entscheidende Rolle spielen. Interessanterweise zeigten sie, dass es keine Korrelation zwischen der Antikörperwirksamkeit und der Affinität für lösliches Aβ oder die Bindung an aggregiertes synthetisches Aβ-Peptid gibt. Wirksame Antikörper waren jedoch in der Lage, Plaques in nicht-fixierten Gehirnschnitten zu binden. Janus et al., (2000) beobachten unter Verwendung des gleichen Protokolls wie Schenk et al., (1999), dass die Seren von Aβ-immunisierten Mäusen vorzugsweise dichte Kernplaques anstatt diffuse Aβ-Ablagerungen färbten, was vorschlägt, dass die Antikörper vielleicht eine höhere Affinität für β-Faltblatt Aβ aufweisen. Basierend auf diesen sich etwas wiedersprechenden Ergebnissen sind mehr Studien der Aβ-Antikörperwechselwirkungen notwendig, die vielleicht einen Einblick in den Mechanismus des Antikörper-vermittelten Aβ-Abbaus geben können. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Antikörper die Produktion von Aβ betreffen, da sie APP nicht erkennen (Weinen et al., 2000). Es ist wahrscheinlicher, dass die Antikörperden Abbau von Aβ durch Mikrogliaaktivierung nach Antikörperbindung an Aβ-Plaques (Schenk et al., 1999 und Bard et al., 2000) verstärken. Diese Wirkung kann auch teilweise durch die Bindung an lösliches Aβ innerhalb des Gehirns zustande kommen, die das Gleichgewicht zwischen abgelagertem Aβ und löslichem Aβ verändert. Da viele Berichte zeigen, dass Aβ bidirektional die Blutgehirnschranke überqueren kann (Zlokovic et al., 1993; Maness et al., 1994; Martel et al., 1996; Poduslo et al., 1997 und 1999; Mackic et al., 1998; Shibata et al., 2000 und Ji et al., 2001), könnte die Impfstoffwirkung teilweise durch die Bindung der Antikörper an lösliches Aβ in peripheren Flüssigkeiten vermittelt sein. Die anschließende Verringerung der peripheren Aβ-Mengen könnte das Gleichgewicht zwischen Aβ ändern, das innerhalb und außerhalb des ZNS zu finden ist, was in einem Ausfluss von Aβ aus dem ZNS resultieren könnte. Ein kürzlich erschienener Bericht zeigt, dass sich in den Tg2576 Mäusen Plasmamengen an Aβ verringern, während sich die zerebrale Plaquesbelastung erhöht (Kawarabayashi et al., 2001). Diese schlägt eine Wechselwirkung zwischen diesen beiden Kompartimenten vor, die manipuliert werden kann.
Interessanterweise beobachteten Morgan et al. in einer Verhaltensimpfstudie (2000) eine teilweise Umkehrung der kognitiven Defizite in APP/PS1-Mäusen, obwohl die zerebrale Amyloidlast, die durch Immunhistochemie gemessen wurde, nicht signifikant verringert war. Wie von Morgan et al. (2000) hingewiesen, wurde lösliches Aβ dahingehend vorgeschlagen, einen Synapsenverlust in APP Tg-Mäusen auszulösen, da einige Tg-Linien eine verringerte Synaptophysinfärbung in der Dentatgehirnwindung ohne Aβ- Ablagerungen aufzeigen (Mucke et al., 2000). Daher ist eine mögliche Erklärung für die kognitive Verbesserung der immunisierten Mäusen in der Abwesenheit einer verringerten Plaquesbelastung eine Verringerung in löslichem Aβ, obwohl diese potentielle Verbindung in deren Studie nicht gemessen wurde (Morgan et al., 2000). Die in dem Labor der vorliegenden Erfinder erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass nach 7 Monaten Behandlung die 81 – 89 %ige Verringerung in Amyloidplaquebelastung mit einer 57 %ige Verringerung an löslichem Aβ1 – 42 innerhalb des Gehirns assoziiert ist, wohingegen die Verringerung an löslichem Gesamt Aβ und Aβ1 – 40 sich nicht signfikant von der Kontrollgruppe unterschied. Mit anderen Worten, lösliches Aß ist weniger als Plaque Aβ verringert. Jedoch müssen detaillierte zeitabhängige Studien durchgeführt werden, um jegliche Änderungen in dem Gleichgewicht zwischen löslichem- und Plaque-Aβ genauer zu bestimmen. Diese Ergebnisse zeigen indirekt die Bedeutung von Aßt – 42 für die Aufrechterhaltung von Plaques. Insgesamt ist es wahrscheinlich, dass verschiedene unterschiedliche Mechanismen in einer Verringerung der zerebralen Amyloidlast, abhängig von dem Tiermodell und den Eigenschaften des für die Immunisierung verwendeten Peptids, resultieren können.
Viele Studien haben vorgeschlagen, dass Amyloidablagerungen entzündliche Kaskaden im Gehirn wie eine erhöhte IL-1 Produktion, die mit neuronaler Verletzung und Tod assoziiert ist, aktivieren können (Sigurdsson et al., 1996 und Akiyama et al., 2000). Es ist möglich, dass unsere Immunisierung mit Aβ- homologen Peptiden auch solche negativen entzündlichen Stoffwechselwege zusammen mit einer Amyloidverringerung stimulieren könnten. Jedoch wurden wenige phagozytische Mikroglia in unseren immunisierten Tieren beobachtet, wie durch OX-42 Immunreaktivität oder Tomatenlektinbindung identifiziert wurde. Dieses ist nicht überraschend, da nach 7 Monaten Behandlung die meisten der Plaques abgebaut waren. Zudem war in der immunisierten Gruppe der Mäuse eine Mikroglia- IL-1β-Färbung zu gut wie abwesend, wohingegen viele verzweigte IL-1β-positive Mikroglia mit den Plaques in der Kontroll Tg-Gruppe assoziiert waren. Das Labor der vorliegenden Erfinder hatte zuvor einen ähnlichen Mangel an IL-1β-Färbung in einem Rattenmodell der zerebralen Amyloidose gefolgt von der Behandlung mit einem β-Faltblatt- brechenden Peptid (Sigurdsson et al., 2000) berichtet. Jedoch war diese Wirkung in dieser akuten Studie (16 Tage) mit einer deutlichen Erhöhung in phagozytischer OX-42-Färbung assoziiert, was anzeigt, das Phagozyten IL-1β nicht exprimieren. Die derzeitigen Beobachtungen aus den Experimenten dieses Beispiels können vorschla gen, dass eine wichtige Wirkung der Immunisierung die verringerte Entzündung innerhalb des Gehirns ist.
BEISPIEL 2
MATERIALIEN UND METHODEN
Peptide
Die verwendeten Peptide (Aβ1 – 40, Aβ1 – 42, Aβ1-30-NH₂, K₆Aβ1-30-NH₂, Aβ1-30-K6 (SEQ ID NO: 11), Aβ1-30-NH₂ (EE_18,19) (SEQ ID NO: 12), Aβ1-30-NH₂ (DD_18,19) (SEQ ID NO: 13) wurden bei der Keck Foundation (Yale University, New Haven, CT) wie zuvor beschrieben (Sigurdsson et al., 2000) synthetisiert. Die Aβ- homologen Peptide behalten die zwei hauptsächlichen immunogen Stellen der Aβ-Peptide (Reste 1 – 11 und 22 – 28 von Aβ1 – 42 basierend auf dem Antigenindex von Jameson et al. (1998) und auf vorläufigen Ergebnissen, die in dem Labor der vorliegenden Erfinder erhalten wurden), wobei sie weder fibrillär und noch toxisch sind).
Studie der Amyloidfibrillenausbildung in vitro und Neurotoxizität
Die Experimente wurden wie in Beispiel beschrieben durchgeführt.
Datenanalyse
Datenanalyse: Die Zellkulturdaten wurden durch einen Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt durch einen Newman Keuls Test für eine post hoc-Analyse (GraphPad Prism 3,0).
ERGEBNISSE
Thioflavin T-Assay: Aβ1 – 42 war bereits bei t = 0 fibrillär, wohingegen Aβ1-30-NH₂ und Aβ1 – 40 im Laufe der Zeit allmählich Fibrillen ausbildeten (5). Aβ1-30-K6 war leicht fibrillogen, aber Aβ1-30-NH₂ (EE_18,19) und Aβ1-30-NH₂ (DD_18,19) bildeten keine Fibrillen nach Inkubation bei 37 °C für mindestens 15 Tage.
Neurotoxizität: Um die Sicherheit dieses Impfstoffansatzes weiterhin zu untersuchen, wurde die Neurotoxizität der Peptide bestimmt (6A und 6B). Die Behandlungswirkung wurde sowohl bei 2 wie auch 6 Tagen (p < 0,0001) beobachtet. Die Kontrollpeptide Aβ1 – 40 und Aβ1 – 42 waren toxisch (p < 0,01 – 0,001) für menschliche Neuroblastomzellen (SK-N-SH) im Vergleich zur Trägermittelgruppe, wie durch den MTT-Assay bestimmt wurde. K₆Aβ1-30-NH₂ hatte keine Wirkung auf die Überlebensfähigkeit der Zelle bei 2 Tagen und war bei 6 Tagen leicht trophisch (p < 0,001) und die höchste Dosierung (100 μM) von Aβ1-30-K6 war leicht toxisch nach 2 Tagen Behandlung, nicht aber nach 6 Tagen. Während der Inkubationszeit waren Aggregate unter dem Mikroskop nur in Kulturwells sichtbar, die Aβ1 – 42 (10 – 100 μM) enthalten. Diese Aβ- homologen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung bilden keine Fibrillen und sind nicht toxisch in menschlicher neuronaler Kultur. Insgesamt hat dieser Ansatz ein viel geringeres Risiko bezüglich der toxischen Wirkungen in Menschen als die Verwendung von Aβ1 – 40/42.
LITERATURSTELLEN

Aguado et al., Vaccine 17:2321–2328 (1999)
Aucouturier et al., Biochemical and conformational variability of human prion strains in sporadic Creutzfedt-Jakob disease, Neurosci. Lett. 274:33–36 (1999)
Barrow et al., J. Md. Biol. 225:1075–1093 (1992) Barrow et al., J. Mol. Biol. 225:1075–1093 (1992) Better et al., Science 240 :.1041–1043, (1988)
Boulianne et al., "Production of functional chimaeric mouse/human antibody", Nature 312:643–646, (1984)
Brett et al., Eur. J. Immunol. 23:1608 (1993) Burdidc et al., J. Biol. Chem. 267:546–564 (1992) Burdick et al., 'J-Biol. Chem. 267:546–554 (1992)
Bushchle et al., "Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells", Proc Natl Acad Sci USA, 94: (7)3256–61 (1997)
Bush et al., Science 265:1464–1467 (1994)
Cabilly et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:3273–3277, (1984)
Cabilly et al., European Patent Application 125.023 (published November 14, 1984)
Castafio et al., Fibrillogenesis in Alzheimer's disease of amyloid beta peptides and apolipoprotein E, Biochem. J. 306:599–604 (1995)
Castano et al., In vitro formation of amyloid fibrils from two synthetic peptides of different lengths homologous to Alzheimer's disease beta-protein, Biochem. Biophys. Res. Commun 141:782–789 (1986)
Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc, and Wiley Interscience, New York, (1993)
Deierkauf et al., "Phygocytosis by rabbit polymorphonuclear leukocytes: the effect of albumin and plyamine acids on latex uptake", J Cell Physiol, 92(2):169–75 (1977)
DiNicola et al., "Large-scale feasibility of gene transduction into human od34+ cell-derived dendritic cells by adenoviral/polycation complex", Br J Haematol, 111(1):34450 (2000)
Eshhar et al., Br J. Cancer Suppl., 10:27–9(1990) Exley et al., FEBS Lett. 324:293–295 (1993) Forsell et al., Neurosci. Lett. 184:90–93 (1995) Games et al., Nature 373:523–527 (1995) Ghiso et al. Biochem. J. 293:27–30 (1994)
Ghiso et al., Epitope map of two polyclonal antibodies that recognize amyloid lesions in patients with Alzheimer's disease, Biochem. J. 282:517–522 (1992)
Golabek et al., "The interaction between apolipoprotein E and Alzheimer's amyloid p-peptide is dependent on p-peptide conformation", J. Biol. Chem. 271:10602–10606 (1996)
Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024–8 (1989)
Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)
Hilbich et al., J. Mol. Biol. 228:460–473 (1992)
Holcomb et at., Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes, Nat. Genet. 4:97–100 (1998).
Hsiao et al., Correlative memory deficits, Aβ elevation and amyloid plagues in transgenic mice, Science 274:99–102 (1996)
Isberg et al., Cell 60:861 (1990)
Jameson et al., The Antigenic Index: A Novel Algorithm for
Predicating Antigenic Determinants, Comput. Appl. Biosci. 4:181–186 (1988)
Jarrett et al., Biochem. 32 :4693–4697 (1993) Jarrett et al., Cell 73:1055–1058 (1993)
Jarrett et al., Biochem 32:4693–4697 (1993)
Kang et al. Nature 325:503–507, 1987; Dyrks et al. EMBO J. 7:949–957, (1988) Risilevsky et al., Nature Medicine 1(2):143–148 (1995) Kohler et al., Nature 25j>:495–497 (1975)
Koudinov et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 205:1164–1171,. (1934)
Kudo et al., European Patent Application 184187 (published June 11,1986) LeVine, Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease β-amyloid proteins: detection of amyloid aggnregation in solution, Protein Sci. 2:404–410 (1993)
Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439–3443, (1987)
Martinez-Fong et al., "Nonenzymatic glycosylation of poly-L-lysine: a new tool for targeted gene delivery", Hepatology, 20(6):1602–8 (1994)
Merlini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2959–2963 (1995) Morrison et al., European Patent Application 173494 (published March 5, 1986)
Morrison et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:6851–6855, (1984) Muller-Hill and Beyreuther, Ann. Rev. Biochem. 38:287–307 (1989)
Neuberger et al., PCT Application WO 8601533, (published March 13, 1986)
Neuberger et al., Nature 314:268–270, (1985) O'Hagan et al., Vaccine 9:768–771 (1991) O'Hagan et al., Molec. Immunol. 28:287–294 (1991) Pallitto et al., Biochemistry 38:3570–3578 (1999)
Peterson et al., "Polyamino acid enhancement of bacterial phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes and peritoneal macrophages", Infect Immun 43(2):561–6 (1984).
Robinson et al., International Patent Publication WO 9702671 (published May 7, 1987) Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066–1074, (1986)
Schenk et al., Immunization with Amyloid-^ Attenuates Alzheimer Disease-like Pathology in the PDAPP Mouse, Nature 400:173–177 (1999)
Seubert et al., Nature 359:355–327 (1992)
Shen et al., "Disulfide spacer between methotrexate and poly(D-lysine). A probe for exploring the reductive process in endocytosis", J. Biol. Chem, 260(20):10905–8 (1985)
Shoji et al., Science 258:126–129 (1992)
Sigurdsson et al., In Vivo reversal of amyloid-3 lesions in rat brain, J. Neuropath. Exp. Neurol. 59:11–17 (2000)
Sigurdsson et al., Local and distant histopathological effects of unilateral amyloid-beta 25–35 injections into the amygdala of young F344 rat!s, Neurobiol. Aging 17:893–901 (1996)
Soto et al., "β-sheet breaker peptides inhibit fibrillogenesis in a rat brain model of amyloidosis: potential Alzheimer's therapy" Nat Med. 4:822–826 (1998)
Soto et al., Alzheimer's soluble p-amyloid is conformationally modified by apolipoproteins in vitro, Neuroreport 7:721725 (1996)
Soto et al., Biochem. J. 314:701–707 (1996)
Soto et al., The alpha-helical to beta-strand transition in the amino-terminal fragment of the amyloid beta-peptide modulates amyloid formation, J. Biol. Chem. 270:3063–3067 (1995)
Soto et al., Apolipoprotein E increases the fibrillogenic potential of synthetic peptides derived from Alzheimer's, gelsolin and AA amyloids, FEBS Lett. 371:110–114 (1995)
Soto et al. J. Neurochem. 63:1191–1198 (1994)
Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1977–1981, (1993)
Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218, (1987)
Surewicz et al., Determination of protein secondary structure by Fourier transform infrared spectroscopy: a critical assessment, Biochem. 32:389–394 (1993)
Taniguchi et al., European Patent Application 1714 96 (published February 19, 1985)
Tran Van Nhieu et al., J. Biol. Chem. 266:24367 (1991)
Wang et al., "Endocytosis of horseradish peroxidase-poly-lysine conjugate by glomerular epithelial cells: an in vivo study", J. Pathol., 159(2):159–67 (1989)
Wisniewski et al., Acceleration of Alzheimer's fibril formation by apolipoprotein E in vitro, Am. J. Pathol. 145:1030–1035 (1994)
Wisniewski et al., Cerebrospinal fluid inhibits Alzheimer beta-amyloid fibril formation in vitro, Ann. Neurol. } 34:631–633 (1993)
Wisniewski et al., Peptides homologous to the amyloid protein of Alzheimer's disease containing a glutamine for glutamic acid substitution have accelerated amyloid fibril formiation, Biochem. Biophys Res. Commun. 179:1247–1254 (1991)
Wisniewski et al., Ann. Neurol. 17:278–282 (1985)
Wood et al., Biochemistry 34:724–730 (1995)
Zagorski et al., Biochem. 31:5621–5631 (1992)
Zlokovic et al., Proc Natl. Acad. Sei. USA 93:4229–04233 (1996)
Zlokovic et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 205:1431–1437 (1994)

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein isoliertes Peptid, das durch die Formel: (A)_m-(N-Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Xaa₅-C)_n-(B)_p dargestellt wird, worin: m 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 ist; p 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ist; A Lys oder Asp ist; B Lys oder Asp ist; n 1 oder 2 ist; N die Reste 1 – 16 von SEQ ID NO:1 ist; C die Reste 22 – 30 von SEQ ID NO: 1 ist; Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ jeweils Leu, Val, Phe, Phe und Ala sind, in denen null, ein oder zwei der Reste Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ mit Lys, Asp oder Glu substituiert ist; und wenn null Reste substituiert sind, dann ist entweder einer oder beide von m oder p nicht Null.
Das Peptid von Anspruch 1, worin: wenn m nicht 0 ist, p 0 ist; wenn p nicht 0 ist, m 0 ist; und Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ sind jeweils Leu, Val, Phe, Phe und Ala, in denen null, einer oder zwei der Reste Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ mit Lys, Asp oder Glu substituiert ist.
Das Peptid von Anspruch 2, worin p 0 ist.
Das Peptid von Anspruch 3, worin der C-Terminus von besagtem Peptid amidiert ist.
Das Peptid von Anspruch 3, worin A Lys ist.
Das Peptid von Anspruch 3, worin A Asp ist.
Das Peptid von Anspruch 3, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 2 ist.
Das Peptid von Anspruch 3, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 3 ist.
Das Peptid von Anspruch 2, worin m 0 ist.
Das Peptid von Anspruch 9, worin B Lys ist.
Das Peptid von Anspruch 9, worin B Asp ist.
Das Peptid von Anspruch 9, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 4 ist.
Das Peptid von Anspruch 9, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 5 ist.
Das Peptid von Anspruch 1, worin m nicht null ist und p nicht Null ist.
Das Peptid von Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 7 ist und der C-terminale Rest amidiert sein kann.
Das Peptid von Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 6 ist und der C-terminale Rest amidiert sei kann.
Das Peptid von Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids SEQ ID NO: 8 ist.
Das Peptid von Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 besteht.
Das Peptid von Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des besagten Peptids aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 besteht.
Ein Konjugat des Peptids von Anspruch 1 oder 2, das mit einem Polymermolekül vernetzt ist.
Das Konjugat gemäß Anspruch 20, worin besagtes Polymermolekül ein Peptid ist, das ein promiskuitives T-Helferzellepitop umfasst.
Das Konjugat gemäß Anspruch 21, worin besagtes Peptid ein Peptid ist, das ein promiskuitives T-Helferzellepitop von Tetanustoxin, Pertussistoxin, Diphterietoxin, Masernvirus, Hepatitis B Virus – Oberfächenantigen, Chlamydia trachomitis äußeres Membranhauptprotein, Plasmodium falciparum circumsporozoit, Schistosoma masoni Triosephosphatisomerase oder Escherichia coli TraT umfasst.
Das Konjugat gemäß Anspruch 20, worin besagtes Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mannan, Glucan, Tripalmitoyl-5-glycerincystein und Poly(lactid-co-glycolid) besteht.
Eine immunisierende Zusammensetzung, die eine zur Immunisierung wirksame Menge des isolierten Peptids gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines Konjugates davon und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel, einen Hilfsstoff, ein Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel umfasst.
Die immunisierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, worin besagtes pharmazeutisch verträgliches Hilfsmittel ein Adjuvanz ist.
Die immunisierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 25, worin besagtes Adjuvanz Alaun ist.
Verwendung des isolierten Peptids gemäß dem Anspruch 1 oder 2 oder eines Konjugats davon zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung einer Immunreaktion auf Amyloid B Peptide und Amyloid - Ablagerungen.
Verwendung von Anspruch 27, worin besagtes Peptid an einen Menschen verabreicht werden soll.
Ein Molekül, das den Antigenbindungsanteil eines Antikörpers umfasst, der gegen das Peptid von Anspruch 1 oder 2 gerichtet ist, worin besagter Antikörper spezifisch für besagtes Peptid ist.
Ein Molekül gemäß Anspruch 29, worin besagtes Molekül ein monoklonaler Antikörper ist.
Ein Molekül gemäß Anspruch 29, worin besagtes Molekül ein chimärer oder humanisierter Antikörper ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Molekül gemäß Anspruch 29 und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel, ein Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff oder ein Hilfsmittel umfasst.