KR20080095836A - Ａ―베타 펩티드 단편에 의한 혈관형성의 조정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관형성 억제에 유용한 Aβ 펩티드 단편을 제공한다. 또한, 유효량의 Aβ 단편을 투여하여 병리적 또는 원치않는 혈관형성 및 그와 관련이 있는 상태 및 질환을 치료하는 방법도 제공한다. 특별한 실시양태에서, 상기 펩티드 단편은 서열 HHQKLVFF를 포함한다.

혈관형성, Aβ 펩티드 단편, 암, 종양, 변이체, 상동체, 화학요법제

Description

Ａ―베타 펩티드 단편에 의한 혈관형성의 조정 {MODULATION OF ANGIOGENESIS BY A-BETA PEPTIDE FRAGMENTS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2005년 11월 10일자로 출원한 미국 가출원 제60/735,472호의 이점을 우선권 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 병리적 혈관형성(angiogenesis)으로 매개되는 질환 및 병리 상태 또는 과정의 치료용 조성물, 및 전장 Aβ 펩티드의 생물학적 활성 단편을 병리적 혈관형성으로 매개되는 질환, 병리 상태 또는 과정을 앓고 있는 환자에게 투여하여 이러한 질환, 병리상태 또는 과정을 치료하는 방법에 관한 것이다.

알쯔하이머병 (AD)은 서양 국가들에서 노인들 치매의 주된 원인이며, 세포내 신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle), 세포외 실질 노년반(senile plaque) 및 뇌혈관 침착물의 진행적 축적을 특징으로 한다 [Sissodia, et al. F.A.S.E.B. J. 9:366-370 (1995)]. 노년반 및 뇌혈관 침착물의 주요 성분은 β-아밀로이드 펩티드로서, 이것의 응집된 형태는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로부터 단백질분해로 유래된 39-43 아미노산 잔기 Aβ 펩티드로 이루어진다 ([Naidu, et al. 1995 J. Biol. Chem. 270:1369-1374], [Gorevic, et al. 1986 J. Neuropathol. Exp. Neurol. 45, 647-64], [Selkoe, et al. 1986 J. Neurochem. 46, 1820-34]). 노년반의 주요 단백질 성분은 베타/A4 아밀로이드, 42-43 아미노산 펩티드이다.

혈관 병리는 AD의 진행성 사례에서의 기준으로서, 부검시에 검출되는 가장 흔한 비정상 중 하나인 뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)을 수반한다 [Ellis, et al. Neurology 46:1592-1596 (1996)]. 대부분의 AD 사례에서는 특정 혈관 병변, 예컨대 뇌 내피 및 뇌실주위의 백질 병변에 영향을 주는 미세혈관(microvessel) 변성이 뚜렷하다 ([Ellis, et al. Neurology 46:1592-1596 (1996)], [Kalaria, Ann. N.Y. Acad. Sci. 893:113-125 (1999)]). 추가로, 형태적 변경이 AD 뇌 미세혈관 및 모세혈관에서 관찰된 바 있으며, 특히 말단 세동맥에서는 종종 국소 수축이 일어나고 불규칙한 형상 및 배열의 평활근 세포를 갖는다 [Hashimura et al. Jpn. J. Psychiatry Neurol. 45:661-665 (1991)]. AD 뇌에서의 모세혈관은 전형적으로 그 경로를 따라 불규칙한 수축 및 확장이 있는, 비정상적으로 관강에서 떨어진(abluminal) 표면을 나타낸다 [Kimura et al. Jpn. J. Psychiatry Neurol. 45:671-676 (1991)]. 양전자 방출 단층촬영술 (PET) 및 단일 광자 방출 전산화 단층촬영술 (SPECT)을 비롯한 기능적 화상형성 기술은 AD에 대한 임상적 기준을 충족시키는 시기 이전의 개체에서 저관류의 존재를 밝혀낸 바 있으며, 이는 혈관 비정상이 질환 과정 동안의 초기에 발생함을 시사한다 ([Nagata et al. Neurobiology of Aging 21:301-307 (2000)], [Johnson et al. Neurobiology of Aging 21:289-292 (2000)]). 뇌혈관 손상 (예를 들어 외상성 뇌 상해, 졸중 및 뇌 동정맥 기형)을 수반하는 다른 장애에서, 혈관형성은 현저한 반응이다 ([Mendis et al. Neurochem. Res. 23:1117-23 (1998)], [Slevin et al. Stroke 31:1863-70 (2000)], [Hashimoto et al. Circ. Res. 89:111-3 (2001)]). AD 뇌에서 뇌혈관 손상에 대하여 다혈증이 보고된다면, 이 영역에서는 거의 일어나지 않았지만 혈관형성 회복 반응의 유도가 예상된다.

혈관형성 과정에 수반되는 구체적인 단계들 (접착, 이동, 성장, 침윤 및 분화)을 연구하기 위한 여러가지 검정법이 개발되었다. Aβ가 혈관형성에 미치는 영향에 대한 지식은, AD에서 관찰되는 미세-뇌혈관 비정상에 있어서의 역할을 이해하는데 매우 유용하다. AD 뇌에서, Aβ 펩티드는 혈관 주위에 원섬유 침착물을 형성하여, 뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)을 야기한다고 공지되어 있다 ([Pardridge, et al. 1987 J. Neurochem. 49, 1394-401], [Jellinger K.A., Attems J. 2005 J. Neurol. Sci. 229-230, 37-41]). AD 뇌에서 가용성 및 침착된 Aβ의 증가된 수준은 혈관 손상, 염증/신경교증, 및 뇌 혈류 감소를 유도할 수 있다 ([Paris, et al. 2000 Ann. N.Y. Acad. Sci. 903, 97-109], [Johnson, et al. 2005 Radiology. 234, 851-9]). 수많은 연구는 혈관의 기능적 장애 및 혈류 감소가 AD 뇌에서의 특징임을 보여주었다 ([Nicoll, et al. 2004 Neurobiol. Aging. 25, 589-97 and 603-4], [Paris, et al. 2004 Brain Res. 999, 53-61], [Beckmann, et al. 2003 J. Neurosci. 23, 8453-9], [Farkasm, et al. 2001 "Cerebral microvascular pathology in aging and Alzheimer's disease" Prog. Neurobiol. 64, 575-611]). 최근, AD에서는 혈관형성이 줄어들고 이것은 혈관 분화에 관여하는 유전자에서의 변경과 관련이 있음이 밝혀졌다 [Wu, et al. 2005 Nat. Med. 11, 959-65]. 뇌 모세혈관 밀도의 감소는 AD의 트랜스제닉 마우스 모델에서 알려져 있다 ([Paris, et al. 2004 Neurosci. Lett. 360, 80-5], [Lee, et al. 2005 Brain Res. Bull. 65, 317-22]). TgAPPsw 마우스의 뇌에서 수거된 내피 세포 및 동맥 외식편에 의한 재구성된 기저막 상에서의 모세혈관-유사 구조의 형성의 감소는, TgAPPsw 마우스의 혈관형성 반응에 있어서의 비정상적인 변경이 최근에 입증되었음을 시사한다 [Paris, et al. 2004 Neurosci. Lett. 360, 80-5].

미국 특허 공개 제2003/0077261호 (Paris et al.)는 Aβ 펩티드가 항-혈관형성 작용제로서 사용될 수 있음을 개시하고 있고, A-베타 펩티드 및 APP의 서열 뿐만이 아니라 이들을 코딩하는 핵산의 서열까지도 개시하며, 이것은 도 10에 나타낸 첨부된 서열목록에 나타나 있다.

혈관형성은 여러 상이한 시험관내 및 생체내 검정에서 Aβ 펩티드에 의해 억제되었다 [Paris, et al. 2004 Angiogenesis. 7, 75-85]. 시험관내에서, Aβ_1-40 및 Aβ_1-42는 매트리겔(Matrigel)상에 플레이팅된 경우에 인간 뇌 미세혈관 내피 세포에 의한 모세혈관 형성을 용량-의존적으로 억제할 수 있고, 높은 용량에서는 모세혈관 변성을 촉진할 수 있다. 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 전장 Aβ 펩티드의 돌연변이체 역시 생물학적 활성 항-혈관형성 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 낮은 용량의 Aβ는 전-혈관형성(pro-angiogenic) 성질을 갖는다고 여겨진다 ([Paris, et al. 2004 Angiogenesis. 7, 75-85], [Cantara, et al. 2004 F.A.S.E.B. J. 18, 1943-5]).

발명의 요약

놀랍게도, 전장 Aβ 펩티드의 생물학적 활성 단편이 항-혈관형성 작용제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 이들 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 원치않고/않거나 제어되지 않는 혈관형성 ("혈관형성 질환"으로 특징규명됨)에 의해 매개되는 병리 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 각종 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편 뿐만이 아니라 1종 이상의 이러한 단편을 포함하는 조성물도 제공한다. 한 실시양태에서, 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편은 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 39개 아미노산 길이일 수 있다.

특별한 실시양태에서, 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 Aβ_1-28 펩티드 단편, Aβ_10-35 펩티드 단편, Aβ_12-28 펩티드 단편, Aβ_13-20 펩티드 단편, 또는 그의 다른 생물학적 활성 단편 또는 그의 변이체 또는 상동체이다.

구체적인 실시양태에서, 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 Aβ_12-28이고, 아미노산 서열 HHQKLVFF, 또는 그의 생물학적 활성 단편, 그의 변이체 또는 상동체를 함유한다.

또다른 구체적인 실시양태에서, 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 Aβ_13-20이거 나, 또는 아미노산 서열 HHGKLVFF, 또는 그의 생물학적 활성 변이체 또는 상동체이다. 변이체는 예를 들어 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

제2 측면에서, 본 발명은 병리적 혈관형성으로 매개되는 질환 또는 장애를 치료할 필요가 있는 대상체에게 8개 내지 39개 아미노산 길이를 갖는 유효량의 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편을 투여하여 병리적 혈관형성으로 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 임의로, 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 1종 이상의 치료제와 함께 또는 별도로 투여된다. 대상체는 예를 들어 인간과 같은 포유동물일 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암을 치료할 필요가 있는 대상체에게 유효량의 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편을 임의로는 1종 이상의 화학요법제와 함께 또는 별도로 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

특별한 실시양태에서, 본 발명은 암을 치료할 필요가 있는 대상체에게 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 생물학적 활성 단편, 그의 변이체 또는 상동체를 함유하는 유효량의 Aβ_12-38 펩티드 단편을 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

또다른 특별한 실시양태에서, 상기한 암 치료 방법은 암을 치료할 필요가 있는 대상체에게 유효량의 Aβ_13-20 펩티드 단편 또는 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그 의 생물학적 활성 변이체 또는 상동체를 투여하는 것을 포함한다.

생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편은 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 폐, 점막, 국소, 경피, 피하, 근육내, 경막내(intrathecal) 또는 복강내 투여 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 수단으로 투여될 수 있다.

본 발명의 제3 측면은 생물학적 유체 및 조직 중에서 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편 활성을 검출하고 측정하기 위한 진단 방법 및 키트를 제공한다.

본 발명의 제4 측면은 Aβ 펩티드 단편의 항-혈관형성 효과를 저해하여 알쯔하이머병의 치료에 잠재적으로 치료 효능이 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 진단 방법 및 키트를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 병리적 혈관형성과 관련이 있는 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서 상기 펩티드 단편의 용도를 제공한다.

도 1은 실시예 8에 기재한 바와 같이 각종 Aβ 펩티드 단편의 0, 1, 5 및 10 μM 용량에 대한 모세혈관의 총 길이를 대조군 처치의 백분율(％)로서 표현한 그래프이다.

도 2A 및 도 2B는 실시예 9에 기재한 바와 같이 각종 Aβ 펩티드 단편과 함께 인큐베이션한 후의, HUVEC 샘플의 세포 증식 및 세포 접착을 대조군에 대한 백분율(％)로서 표현한 차트이다.

도 3은 실시예 10에 기재한 바와 같이 헤파린 (0.5 또는 1 mg/mL), Aβ_1-42 펩티드, Aβ + 헤파린 (500 ㎍/mL) 및 Aβ + 헤파린 (1 mg/mL) 처치시의 모세혈관 총 길이를 대조군 처치의 백분율(％)로서 표현한 차트이다.

도 4는 실시예 11에 기재한 바와 같이 Aβ_1-28, Aβ_1-28 GGQGL 및 Aβ_1-28 AAQAL의 0, 1, 5 및 10 μM 용량에 대한 모세혈관의 총 길이를 대조군 처치의 백분율(％)로서 표현한 그래프이다.

도 5는 실시예 11에 기재한 바와 같이 Aβ 펩티드 단편과 함께 인큐베이션한 후에 형성된 모세혈관의 사진 (4× 배율)을 제공한다.

도 6은 실시예 12에 기재한 바와 같이 펩티드 HHHQKLVFF, VHHQKLVII 및 VHHQKLVKK의 0, 1, 5 및 10 μM 용량에 대한 모세혈관의 총 길이를 대조군 처치의 백분율(％)로서 표현한 그래프이다.

도 7은 실시예 13에 기재한 바와 같이 200 ng의 VEGF, VEGF + 0.5 ㎍ Aβ_12-28, VEGF + 2.5 ㎍ Aβ_12-28 및 VEGF + 5.0 ㎍ Aβ_12-28에 대한 반응에 있어서 래트 각막 미세낭 검정의 혈관형성 지수 (Angiogenic Index, AI)에 대한 차트이다.

도 8은 실시예 14에 기재한 바와 같이 VEGF, 5 ㎍의 Aβ_1-28 GGQGL, 및 0.5 ㎍, 2.5 ㎍ 및 5 ㎍의 Aβ_12-28 및 HHH-펩티드 (HHHQKLVFF)에 대한 반응에 있어서 래트 각막 미세낭 검정의 혈관형성 지수 (AI)에 대한 차트이다.

도 9는 실시예 14에 기재한 바와 같이 VEGF 대조군 및 0.5 ㎍, 2.5 ㎍ 및 5.0 ㎍의 Aβ_{12- 28}를 포함하여 7일 동안 인큐베이션한 후의 래트 각막 미세낭에 대한 대표적인 사진을 제공한다.

도 10은 미국 특허 공개 제2003/0077261호 (Paris et al.)에 기재된 바와 같은 A-베타 펩티드 및 APP 뿐만이 아니라 이들을 코딩하는 핵산의 서열 목록이다.

종양 성장은 충분한 혈액 공급에 의존하기 때문에, 항-혈관형성 요법은 종양 진행을 억제하는 흥미로운 접근법이다. 본원에서는, Aβ 서열에서 유래된 짧은 펩티드가 혈관형성을 억제하고 항암 요법에 사용될 수 있음이 개시되어 있다.

본 발명은 원치않고/않거나 제어되지 않거나 또는 병리적인 혈관형성에 의해 매개되는 병리 상태를 치료하는데 사용될 수 있는 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편을 제공한다. 본원은 항-종양 또는 항-혈관형성 요법에 사용될 수 있는 특별한 항-혈관형성 모티프 (HHQKLVFF)를 제공한다.

항-혈관형성 펩티드 단편

본 발명은 병리적 또는 원치않는 혈관형성과 관련이 있는 장애 또는 질환의 치료에 유용한 Aβ 펩티드의 항-혈관형성 단편을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Aβ 펩티드 단편"은 전장 Aβ 펩티드의 항-혈관형성 단편 (예컨대, Aβ_1-40, Aβ_1-42, Aβ_1-43)을 지칭하고, 달리 언급되지 않는다면 Aβ 펩티드 단편 변이체, 상동체 (예컨대 포유동물 오르토로그(ortholog)) 및 이소형(isoform)을 포함한다. 상기 용어는 또한 1개 이상의 동등한 아미노산, 또는 비-천연 아미노산의 치환을 갖는 단편도 포함한다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 전장 Aβ 펩티드에 존재하는 아미노산 총수보다 1개 이상의 아미노산이 더 적다. 전장 Aβ 펩티드는 막횡단 당단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 1종 이상의 이소형의 단백질분해 프로세싱(processing)으로부터 유래된다 [Kang, J. et al. Nature (Lond.). (1987) 325:733-736]. 39-43-아미노산-길이의 Aβ 펩티드 아미노산 서열은 APP의 엑토도메인(ectodomain)에서 시작하여 막횡단 영역으로 연장된다. Aβ는 β-세크라타제 및 γ-세크라타제에 의한 APP의 순차적 절단으로 형성된다. Aβ_1-42 및 Aβ_1-43 형태는 모든 종류의 AD 플라크에서 특이적으로 발견되는데, 이는 상기한 형태가 AD 병리에 매우 중요함을 나타낸다.

특별한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 전장 Aβ_1-40 펩티드에 존재하는 아미노산 총수보다 1개 이상의 아미노산이 더 적다. Aβ_1-40 펩티드 단편은 예를 들어 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 39개 아미노산으로 이루어진다.

또다른 특별한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 전장 Aβ_1-42 펩티드에 존재하는 아미노산 총수보다 1개 이상의 아미노산이 더 적다. Aβ_1-42 단편은 예를 들어 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 41개 아미노산으로 이루어진다.

또다른 특별한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 전장 Aβ_1-43 펩티드에 존재하는 아미노산 총수보다 1개 이상의 아미노산이 더 적다. Aβ_1-43 단편은 예를 들어 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 41개 또는 42개 아미노산으로 이루어진다.

한 실시양태에서, 상기 단편은 예를 들어 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 이루어지며, 서열 HHQKLVFF를 포함한다.

한 실시양태에서, 하기하는 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편 중 1종 이상을 사용하여 원치않거나 병리적인 혈관형성과 관련이 있는 질환 또는 장애를 치료할 수 있다: Aβ_1-28 펩티드, Aβ_10-35 펩티드, Aβ_12-28 펩티드, Aβ_13-20 펩티드, 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 변이체.

항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편은 HHQK 프로테오글리칸 결합 영역을 함유하는 것이 바람직한데, 이것은 상기한 서열이 없는 단편 (Aβ_25-35, Aβ_17-28 및 Aβ_34-42)은 활성이 없기 때문이고, 이는 Aβ의 항-혈관형성 활성을 매개하는데에는 헤파린 결합 모티프 HHQK가 필요함을 시사한다. Aβ_10-16 단편은 HHQK 서열을 함유한다고 하더라도 불활성이며, 이것은 혈관형성을 억제하는데에는 HHQK 프로테오글리칸 결합 모티프로 충분하지 않으며 다른 이웃 잔기들이 필요하다는 것을 시사한다. 특히, HHQK 도메인 바로 뒤의 LVFF 서열도 혈관형성의 억제에 필요하다. 따라서, 바람직한 Aβ 펩티드 단편은 아미노산 서열 HHQKLVFF를 함유한다.

한 실시양태에서, 상기 단편은 예를 들어 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 이루어지며, 서열 HHQKLVFF를 포함한다. 이러한 단편은 예를 들어 비-천연 아미노산을 비롯한 동등한 아미노산의 1개 이상 (예컨대 2개, 3개 또는 4개)의 치환을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 아미노산 서열 HHQKLVFF, 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 함유하는 Aβ_12-28 펩티드이다.

또다른 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 Aβ_13-2O 펩티드 단편 또는 아미노산 서열 HHQKLVFF, 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 변이체이다.

또다른 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 예를 들어 Aβ 펩티드의 10개, 20개, 30개 또는 40개 아미노산 단편이다.

펩티드 단편은 예를 들어 화학적 합성으로 수득되거나 숙주 세포에 의해 재조합 방식으로 생성된다.

유사하게, 용어 변이체 및 상동체 역시 구별없이 사용된다. "변이체" 또는 "상동체" 펩티드 단편은 천연 폴리펩티드 서열에 대하여 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환과 같은 변형, 말단절단(truncation), 연장, 또는 키메라 이종 폴리펩티드의 부가를 함유하는 것을 지칭한다는 것이 이해될 것이다. 임의로, "변이체" 또는 "상동체" 펩티드 단편은 돌연변이 또는 번역후 변형을 함유할 수 있다.

"변이체" 또는 "상동체" 폴리펩티드 또는 펩티드 단편 중에서, 천연 폴리펩티드 서열과 80.0％ 내지 99.9％ (포괄적)의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 백분율(％)은 순전히 통계적이며, 2종의 펩티드 서열 사이의 차이는 전체 서열 길이에 걸쳐서 무작위로 분포할 수 있다.

별법으로, 본 발명의 폴리펩티드와 동일성(％)을 나타내는 "변이체" 또는 "상동체" 폴리펩티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드 서열과 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성을 가질 수 있다. 여기서, 동등한 아미노산이라는 표현은 기본 구조 내의 아미노산 중 하나를 치환할 수 있지만 상응하는 펩티드의 생물학적 활성은 본질적으로 변형시키지 않는 임의의 아미노산을 지칭하는 것이며, 하기에서 제공된다.

Aβ의 HHQKLVFF (모티프) 영역에 상기 펩티드의 항-혈관형성 성질을 잠재적으로 보유하는 여러가지 치환이 가해질 수 있다. 구체적으로, 하기하는 표현은 HHQKLVFF에 대한 이러한 동등한 치환을 나타낸다:

이러한 모티프를 갖는 예시적 서열이 표 1에 기재되어 있다. 특정 펩티드 서열이 천연 단백질의 일부인 경우에는 공급원을 언급하였다.

<표 1>

http://motif.genome.jp/MOTIF2.html에서의 모티프 검색을 이용하여, NR-AA Trembl/Swissprot 데이타베이스에서의 펩티드 조합물을 검색하였다. 펩티드 서열 중 물리-화학적으로 동등한 아미노산의 치환은 당업계에 공지되어 있다 ([Eisenberg, et al. 1984 "Amino acid scale: Normalized consensus hydrophobicity scale." J. Mol. Biol. 179:125-142] 및 [Mathura, et al. 2001, "New quantitative descriptors for amino acids based on multidimensional scaling of a large number of physical-chemical properties", J. Mol. Modeling 7:445-453]).

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 표 1에 나열한 펩티드 서열 중 하나로 이루어지거나, 또는 표 1에 나열한 펩티드 서열 중 하나를 포함하며, 임의의 동등한 아미노산 치환을 갖는다.

본 발명은 또한 면역 반응을 유발할 수 있는 생물학적 활성의 펩티드 단편을 제공한다. 면역 반응은 펩티드 단편과 반응성인 성분 (항체 또는 세포 면역 반응 성분 (예컨대 B-세포, 헬퍼, 세포독성, 및/또는 저해자 T-세포))을 제공할 수 있다.

본원에 기재한 바와 같이, 단편은 폴리펩티드를 단백질분해 효소 (예컨대 트립신, 키모트립신 또는 콜라게나제) 또는 화학적 시약, 예컨대 브롬화시아노겐 (CNBr)으로 절단하여 수득할 수 있다. 별법으로, 폴리펩티드 단편은 고도로 산성인 환경, 예를 들어 pH 2.5에서 생성될 수 있다. 이러한 폴리펩티드 단편은 또한 화학적 합성으로 제조할 수도 있고, 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 이용하여 제조할 수도 있다. 형질전환된 숙주 세포는 핵산을 함유하며, 공지된 방법에 따라 배양된다. 따라서, 적절한 조절 및/또는 발현 요소의 제어하에서는 이들 단편의 발현이 가능하다.

펩티드는 Aβ 유전자 전사 생성물의 스플라이싱에서의 변경, 유전자 재조합 또는 화학적 합성을 통해 변형될 수 있다. 이러한 펩티드는 변형되는 폴리펩티드 서열에 대하여 1개 이상의 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형으로는 폴리펩티드 내의 아미노산의 부가, 치환, 결실 등을 들 수 있다.

한 부류의 아미노산이 동일 유형의 또다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은, 그러한 치환이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한은 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 비-극성 아미노산의 부류는 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Gly 및 Trp을 포함하고, 대전되지 않은 극성 아미노산의 부류는 Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 및 Gln을 포함하고, 산성 아미노산의 부류는 Asp 및 Glu을 포함하며, 염기성 아미노산의 부류는 Lys, Arg 및 His을 포함한다. 일부 예에서, 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의하게 손상시키지 않는 경우에는 비-보존적 치환이 가해질 수도 있다.

본원에서 제공되는 폴리펩티드의 수명을 연장하기 위해서, 비-천연 아미노산, 예를 들어 D 형태의 아미노산을 사용하거나, 또는 별법으로는 아미노산 유사체, 예컨대 아미노산의 황-함유 형태를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 폴리펩티드의 수명을 연장시키는 별법의 수단이 이용될 수도 있다. 예를 들어, 펩티드 단편은 혈장 또는 혈청 반감기를 증가시키는 요소를 포함하도록 재조합 방식으로 변형될 수 있다. 이들 요소로는 항체 불변 영역 (예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,565,335호 및 상기 문헌에서 언급된 모든 참조문헌 참조), 또는 미국 특허 제6,319,691호, 동 제6,277,375호 또는 동 제5,643,570호 (상기 문헌은 각 특허에서 언급된 모든 참조문헌을 포함하여 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 다른 요소 등이 있지만 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드 및 유전자는 백신 제제화의 목적을 위한 면역원성 구축물의 제조에 유용한 요소 또는 본원에서 제공되는 폴리펩티드를 단리하는데 유용한 요소에 재조합 방식으로 융합될 수 있다.

본원에 개시된 펩티드 단편은 전달 또는 진단 목적을 위해서 단편이 담체 분자에 부착되는 것을 용이하게 하는 링커를 추가로 함유할 수 있다. 링커는, 친화도 정제 프로토콜에서 사용하기 위해서 단편을 고체 지지체 매트릭스에 부착시키는데 사용될 수도 있다. 한 실시양태에서, 링커는 상기 단편이 단백질 서열 데이타베이스를 검색할 때 확인된 것과 같은 또다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 하위서열인 경우는 특별히 제외시킨다. 즉, 이러한 측면에서, 다른 펩티드, 폴리펩티드, 단백질의 동일하지 않은 부분은 "링커"로 여기지 않는다. 본 발명의 실시에 적합한 "링커"의 비-제한적인 예는 면역원성 단편이 담체 분자에 연결되도록 하는 펩티드인 화학적 링커 (예컨대 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce)가 시판하는 것) (예를 들어, 미국 특허 제6,121,424호, 동 제5,843,464호, 동 제5,750,352호 및 동 제5,990,275호에 개시된 링커 참조. 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 최대 50개까지의 아미노산, 최대 40개까지의 아미노산, 최대 30개까지의 아미노산, 최대 20개까지의 아미노산, 최대 10개까지의 아미노산, 또는 최대 5개까지의 아미노산 길이일 수 있다.

다른 구체적인 실시양태에서, 펩티드는 융합체 또는 키메라 단백질 생성물 (이종 단백질 서열 (예컨대, 상이한 단백질)에 펩티드 결합을 통해 연결됨)로 발현될 수 있다. 이러한 키메라 생성물은 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 적절한 핵산 서열을 당업계에 공지된 방법으로 서로에게 적당한 코딩 프레임으로 라이게이션하고, 당업계에 통상적으로 공지된 방법으로 키메라 생성물을 발현시켜서 생성될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,342,362호, [Altendorf, et al. 1999-WWW, 2000 "Structure and Function of the F₀ Complex of the ATP Synthase from Escherichia Coli," J. of Experimental Biology 203:19-28, G. B.], [Baneyx 1999 Biotechnology 10:411-21], [Eihauer, et al. 2001 J. Biochem. Biophys. Methods 49:455-65], [Jones, et al. 1995 J. Chromatography 707:3-22], [Jones, et al. 1995 J. of Chromatography A. 707:3-22], [Margolin, et al. 2000 Methods 20:62-72], [Puig, et al. 2001 Methods 24:218-29], [Sassenfeld, et al. 1990 Tib. Tech. 8:88-93], [Sheibani, et al. 1999 Prep. Biochem. ＆ Biotechnol. 29(1):77-90], [Skerra, et al. 1999 Biomolecular Engineering 16:79-86], [Smith, et al. 1998 The Scientist 12(22):20], [Smyth, et al. 2000 Methods in Molecular Biology, 139:49-57], [Unger, et al. 1997 The Scientist 11(17):20]를 참조하며, 이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 별법으로, 이러한 키메라 생성물은 단백질 합성 기술, 예를 들어 펩티드 합성기를 사용하여 제조될 수 있다. 상기한 바와 같이, 융합 펩티드는 폴리펩티드 및 1종 이상의 단백질 형질도입 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 융합 펩티드는 수송물(cargo) 폴리펩티드를 세포막을 통해 전달하는데 특히 유용하다.

조직 내에서 Aβ 펩티드 단편 활성의 양을 증가시키는 것은 각종 혈관형성 질환, 예컨대 암, 종양 및/또는 악성종양의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라, 혈관형성 질환을 앓고 있는 환자에게 Aβ 펩티드 단편을 직접 투여 (예를 들어, Aβ 펩티드 단편의 외인성 전달)하거나 또는 간접적이거나 유전적인 수단 (예를 들어, Aβ 펩티드 단편을 코딩하거나 내인성 Aβ 펩티드 단편 활성을 상향조절하는 폴리뉴클레오티드의 전달)을 이용함으로써, 조직 내에서 Aβ 펩티드 단편 활성의 양을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 이러한 암, 종양 및/또는 악성종양의 비-제한적인 예로는 전립선암, 유방암, 흑색종, 만성 골수성 백혈병, 자궁경부암, 선암, 림프아구 백혈병, 결장직장암 및 폐 암종 등이 있다.

펩티드 단편 또는 이를 코딩하는 핵산은 혈관형성 또는 혈관형성-매개 질환이 있을 것이라고 추측되는 개체를 스크리닝하거나 그러한 진단을 돕는데 사용될 수 있다. 본원에 개시한 펩티드 단편 및 이를 코딩하는 핵산은 혼성화 검정에서 상보적 서열을 사용하여 Aβ 펩티드를 검출하는데 사용될 수 있다. Aβ 펩티드 단편의 양이 유의하게 증가된 것은 알쯔하이머병의 징후와 관련이 있다. Aβ 펩티드의 양이 유의하게 감소된 것은 혈관형성 질환, 예컨대 악성종양 또는 암의 징후와 관련이 있다. Aβ 유전자 생성물은 웨스턴 블럿, 효소-결합 면역검정 (ELISA), 방사선면역측정 (RIA), 노던 블럿, 써던 블럿, PCR-기재의 검정, 또는 유전자 생성물의 정량을 위한 당업자 공지의 다른 검정 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 정보, 및 숙련된 전문인에게 통상적인 다른 정보는 진단하는데 도움을 준다.

한 측면에서, 본 발명은 항-혈관형성 요법이 필요한 환자에게 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편을 투여하여 항-혈관형성 요법이 필요한 환자에서 혈관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 환자에게 치료 유효량의 Aβ 펩티드 단편을 투여하여 암, 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 건선, 황반 변성 및 당뇨병성 망막증으로 구성된 군에서 선택된 병리 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 21 아미노산 위치, 또는 22 아미노산 위치, 또는 23 아미노산 위치, 또는 이들의 조합에서 치환을 갖는 Aβ 펩티드 단편의 생물학적 활성 변이체가 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 치환(들)은 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 치환이다.

본원에 제공된 방법을 수행하기 위해서 폴리펩티드를 세포에 전달하는 각종 수단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 단백질 형질도입 도메인 (PTD)이 상기 폴리펩티드에 융합되어 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있는데, 이 경우에 PTD는 세포질막을 통과하여 폴리펩티드 수송물을 도입할 수 있다 [Wadia, J. S. and Dowdy, S. F., Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13(1), 52-56]. PTD의 예로는 초파리(Drosophila) 호메오(homeotic) 전사 단백질 안텐나페디아 (Antp), 단순 허피스 바이러스 구조 단백질 VP22, 및 인간 면역-결핍 바이러스 1 (HIV-I) 전사 활성자 Tat 단백질 등이 있다.

본원에서 제공되는 혈관형성 억제 방법에 따라, 본원에 개시한 Aβ 펩티드 단편을 발현하도록 유전자 변형된 재조합 세포를 환자에게 투여할 수 있다.

본원에서 제공되는 혈관형성 억제 방법은 암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용되거나 암 예방책으로서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 종양 억제 방법은 유방암, 전립선암, 흑색종, 만성 골수성 백혈병, 자궁경부암, 선암, 림프아구 백혈병, 결장직장암 및 폐 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에 따라, 각종 다른 항암 또는 항-종양 화합물, 예컨대 세포독성제가 Aβ 펩티드 단편과 함께 투여될 수 있다.

Aβ 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시한 펩티드 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되고/되거나 정제된 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

또한, Aβ 펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자도 제공한다. 본 발명의 한 측면은 (a) 표 1의 것을 포함하여 본원에 기재한 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 임의의 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것과 90％ 이상 동일한, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열(들)은 본 발명에 따라서 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 상기 DNA의 전사 생성물 (예컨대 RNA 분자)을 의미한다고 이해된다. 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 이온-교환 크로마토그래피, 분자 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분리 방법 또는 증폭, 클로닝 또는 서브클로닝과 같은 유전자 조작 방법으로 단리 또는 정제 (또는 부분적 정제)될 수 있다.

임의로, 폴리뉴클레오티드 서열은 이종 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 정제를 용이하게 하는 태그 (예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,342,362호, [Altendorf, et al. 1999-WWW, 2000 "Structure and Function of the F₀ Complex of the ATP Synthase from Escherichia Coli," J. of Experimental Biology 203:19-28, G. B.], [Baneyx 1999 Biotechnology 10:411-21], [Eihauer, et al. 2001 J. Biochem. Biophys. Methods 49:455-65], [Jones, et al. 1995 J. Chromatography 707:3-22], [Jones, et al. 1995 J. of Chromatography A. 707:3-22], [Margolin, et al. 2000 Methods 20:62-72], [Puig, et al. 2001 Methods 24:218-29], [Sassenfeld, et al. 1990 Tib. Tech. 8:88-93], [Sheibani, et al. 1999 Prep. Biochem. ＆ Biotechnol. 29(1):77-90], [Skerra, et al. 1999 Biomolecular Engineering 16:79-86], [Smith, et al. 1998 The Scientist 12(22):20], [Smyth, et al. 2000 Methods in Molecular Biology, 139:49-57], [Unger, et al. 1997 The Scientist 11(17):20] (이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨) 참조) 또는 스트라타진(STRATAGENE) (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재), 노바젠(NOVAGEN) (미국 위스콘신주 매디슨 소재), 퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.) (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 또는 인비트로젠(INVITROGEN) (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)과 같은 시판업체에서 구입할 수 있는 태그)을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수도 있다.

벡터

다른 측면은 본원에서 제공되는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 예를 들어 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공한다. 벡터는 백신, 복제 또는 증폭 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 조절 요소와 작동가능하게 연결된다. 특히, 이러한 벡터는 염색체, 에피솜 및 바이러스-유래의 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파지로부터 유래된 벡터, 트랜스포손(transposon)으로부터 유래된 벡터, 효모 에피솜으로부터 유래된 벡터, 삽입 요소로부터 유래된 벡터, 효모 염색체 요소로부터 유래된 벡터, 바쿨로바이러스, 파보바 바이러스, 예컨대 SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병(pseudorabies) 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 전술한 벡터 공급원, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소에서 유래한 것들의 조합물로부터 유래된 벡터 (예컨대, 코스미드 및 파지미드)를 포함한다.

상기한 바와 같이, 벡터는 주어진 숙주 세포에서 제공되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, Aβ 펩티드의 단편과 같은 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비를 제공하는데 필요한 요소를 포함할 수도 있다. 상기 벡터는 프로모터, 번역 개시 신호, 번역 종결 신호 및 전사 조절에 적절한 영역으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 요소를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포에서 안정적으로 유지될 수 있고, 임의로는 번역된 단백질의 분비를 지시하는 신호 서열을 함유할 수 있다. 다른 실시양태는 형질전환된 숙주 세포에서 안정적이지 않은 벡터를 제공한다. 벡터는 숙주 게놈에 통합될 수도 있고, 또는 자율 복제 벡터일 수도 있다.

구체적인 실시양태에서, 벡터는 단백질 또는 펩티드-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 1개 이상의 복제 기점, 및 임의로는 1종 이상의 선별가능한 마커 (예컨대, 항생제 내성 유전자)를 포함한다. 폴리펩티드 발현을 위한 비-제한적인 예시적 벡터로는 pBr형 벡터, pET형 플라스미드 벡터 (프로메가(PROMEGA)), pBAD 플라스미드 벡터 (인비트로젠) 또는 하기 실시예에서 제공되는 것 등이 있다. 추가로, 벡터는 본원에서 제공된 뉴클레오티드 서열의 클로닝 또는 발현을 위해 숙주 세포를 형절전환시키는 데에도 유용하다.

발현 제어에 사용될 수 있는 프로모터로는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터 영역 [Bernoist and Chambon 1981 Nature 290:304-310], 라우스 육종 바이러스의 3' 장쇄 말단 반복부에 함유된 프로모터 [Yamamoto, et al. 1980 Cell 22:787-797], 허피스 티미딘 키나제 프로모터 [Wagner et al. 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 [Brinster et al. 1982 Nature 296:39-42], β-락타마제 프로모터와 같은 프로모터를 함유하는 원핵 벡터 [Villa-Kamaroff, et al. 1978 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731] 또는 tac 프로모터 ([DeBoer, et al. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25] 및 ["Useful Proteins from Recombinant Bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94] 참조), 노팔린 신테타제 프로모터 영역을 포함하는 식물 발현 벡터 [Herrera-Estrella et al. 1983 Nature 303:209-213] 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 [Gardner, et al. 1981 Nucl. Acids Res. 9:2871], 및 광합성 효소 리불로스 비포스페이트 카르복실라제의 프로모터 [Herrera-Estrella et al. 1984 Nature 310:115-120], 효모 또는 진균으로부터의 프로모터 요소, 예컨대 Gal 4 프로모터, ADC (알콜 데히드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나제) 프로모터 및/또는 알칼리성 포스파타제 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상동성 뉴클레오티드 서열

본원에서는, "상동성" 또는 "변형된" 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 변형된 핵산 서열은 당업자에게 공지된 기술에 따른 돌연변이유발로 수득되고 정상적인 서열에 대한 변형을 나타내는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미한다고 이해된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 발현 수준을 변형시키는, 폴리펩티드의 발현을 위한 조절 및/또는 프로모터 서열에서의 돌연변이는 "변형된 뉴클레오티드 서열"을 제공한다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드에 대한 핵산의 치환, 결실 또는 부가는 "상동성" 또는 "변형된" 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 다양한 실시양태에서, "상동성" 또는 "변형된" 핵산 서열은 천연 (천연 발생) Aβ 펩티드 단편과 실질적으로 동일한 생물학적 또는 혈청학적 활성을 갖는다. "상동성" 또는 "변형된" 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 스플라이싱 변이체 또는 이하에서 정의되는 바와 같은 "변형된 폴리펩티드"의 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미한다는 것도 이해될 것이다.

본원에 기재한 바와 같이, 상동성 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 염기와의 동일성(％)이 적어도 (또는 적어도 약) 80.0％ 내지 99.9％ (포괄적), 또는 85％ 내지 99％, 또는 90％ 내지 99％, 또는 95％ 내지 99％ 사이인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본원에 기재한 뉴클레오티드 서열의 염기와 동일성(％)을 나타내는 상동성 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일성을 가질 수 있다.

단백질 및 핵산 서열 상동체 둘다 당업계에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램 중 임의의 것을 이용하여 평가될 수 있다. 이러한 알고리즘 및 프로그램으로는 TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, 및 CLUSTALW ([Pearson and Lipman 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(8):2444-2448], [Altschul, et al. 1990 J. Mol. Biol. 215(3):403-410], [Thompson, et al. 1994 Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680], [Higgins, et al. 1996 Methods Enzymol. 266:383-402], [Altschul, et al. 1990 J. Mol. Biol. 215(3):403-410], [Altschul, et al. 1993 Nature Genetics 3:266-272]) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본원에 개시한 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열도 제공된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 서열의 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드를 가지며 배향은 역위된 (예컨대, 안티센스 서열) 임의의 DNA를 포함하는 것으로 이해된다.

추가로, 본원에 개시한 폴리뉴클레오티드 서열의 단편도 제공된다. 폴리뉴클레오티드 서열의 대표적인 단편은, 그것이 유래된 서열의 8개 또는 9개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 15개 이상 또는 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 임의의 뉴클레오티드 단편을 의미한다고 이해된다. 이러한 단편에 대한 상한은 Aβ_1-42 펩티드를 코딩하는 서열에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 (또는, 특정 실시양태에서는 본원에서 동정된 오픈 리딩 프레임 (ORF))의 총수이다. 특정 펩티드를 코딩하는 이의 적절한 단편도 유용하다. 예를 들어, Aβ 펩티드 단편 상동체인 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편은 이미 동정된 바 있으며, 이것을 이용하여 본 발명의 혈관형성 억제 방법을 수행할 수 있다.

혼성화 및 검출 프로브

이들 대표적인 단편 중에서도 엄격 조건하에서 뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있는 것이 바람직하다. 엄격도가 높거나 중간 정도인 조건은 하기에 제공되며, 2개의 상보적 DNA 단편들 사이에 혼성화가 일어나도록 선택된다. 약 300개 염기 크기의 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화 조건은, 당업자가 당업계에 공지된 방법에 따라 더 크거나 더 작은 크기의 올리고뉴클레오티드에 맞게 변형시킬 것이다 (예를 들어 [Sambrook, et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y., pp. 9.47-9.57] 참조).

또한, 표적 서열 또는 표적 서열로부터 생성된 앰플리콘(amplicon)과의 혼성화를 위한 검출 프로브 (예컨대, 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 단편)도 제공된다. 이러한 검출 프로브는 서열로서 적어도 9개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 또는 100개 뉴클레오티드의 서열을 갖는 것이 유리할 것이다. 별법으로, 검출 프로브는 개시된 핵산의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개 및 예를 들어 최대 128개까지의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 검출 프로브는 본 발명에서 표지된 프로브 또는 프라이머로 사용될 수도 있다. 표지된 프로브 또는 프라이머는 방사성 화합물 또는 또다른 유형의 표지로 표지된다. 별법으로, 비-표지된 뉴클레오티드 서열이 프로브 또는 프라이머로서 직접 이용될 수 있다. 그러나, 상기 서열은 일반적으로 방사성 요소 (³²P, ³⁵S, ³H, ¹²⁵I) 또는 바이오틴, 아세틸아미노플루오렌, 디곡시게닌, 5-브로모-데옥시유리딘 또는 플루오레세인과 같은 분자로 표지되어, 수많은 용도에 사용될 수 있는 프로브를 제공한다.

본원에 개시된 뉴클레오티드 서열은 분석 시스템, 예컨대 DNA 칩에 사용될 수도 있다. DNA 칩 및 이것의 용도는 당업계에 공지 (예를 들어, 미국 특허 제5,561,071호, 동 제5,753,439호, 동 제6,214,545호, [Schena, et al. 1996 BioEssays 18:427-431], [Bianchi, et al. 1997 Clin. Diagn. Virol. 8:199-208]를 참조하며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)되어 있고/있거나 아피메트릭스, 인크.(AFFYMETRIX, Inc.) (미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)와 같은 시판업체가 제공한다.

혼성화의 엄격도는 다양한 정도로 이용될 수 있다. 보다 엄한 조건일 수록, 이중나선 형성에 요구되는 상보성이 더 높다. 조건의 엄격성은 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 강도, 시간 등에 의해 제어될 수 있다. 혼성화는 예를 들어 문헌 [Keller, G. H., M. M. Manak 1987 DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y., pp. 169-170]에 기재된 바와 같은 당업계 공지의 기술로 중간 정도 내지는 높은 엄격도 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.

예를 들어, 써던 블럿상의 고정된 DNA와 ³²P-표지된 유전자-특이적 프로브의 혼성화는 표준 방법으로 수행될 수 있다 [Maniatis, et al. 1982 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. 일반적으로, 혼성화 및 이후의 세척은 예시된 폴리뉴클레오티드 서열에 상동성을 갖는 표적 서열을 검출할 수 있게 하는 중간 정도 내지는 높은 엄격도 조건하에서 수행될 수 있다. 이중-가닥 DNA 유전자 프로브의 경우, 혼성화는 6×SSPE, 5× 덴하르트(Denhardt's) 용액, 0.1％ SDS, 0.1 mg/mL 변성 DNA 중에서 DNA 하이브리드의 용융 온도 (T_m)보다 20℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 밤새 수행될 수 있다. 용융 온도는 하기 식으로 기재된다 [Beltz et al. 1983 Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285]:

T_m = 81.5℃ + 16.6 Log[Na⁺] + 0.41(％G+C) - 0.61(％포름아미드)-600/염기쌍 중 이중나선의 길이.

세척은 전형적으로 다음과 같이 수행된다:

(1) 1× SSPE, 0.1％ SDS 중에서 실온에서 15분 동안 2회 (낮은 엄격도의 세척),

(2) 0.2× SSPE, 0.1％ SDS 중에서 T_m - 20℃에서 15분 동안 1회 (중간 정도의 엄격도 세척).

올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 혼성화는 6×SSPE, 5× 덴하르트 용액, 0.1％ SDS, 0.1 mg/mL 변성 DNA 중에서 하이브리드의 용융 온도 (T_m)보다 10℃ 내지 20℃ 낮은 온도에서 밤새 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 T_m은 하기 식으로 결정할 수 있다:

T_m (℃) = 2(T/A 염기쌍의 수) + 4(G/C 염기쌍의 수)

[Suggs et al. 1981 ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D. D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693].

세척은 다음과 같이 수행될 수 있다:

(1) 1× SSPE, 0.1％ SDS 중에서 실온에서 15분 동안 2회 (낮은 엄격도의 세척),

(2) 1× SSPE, 0.1％ SDS 중에서 혼성화 온도에서 15분 동안 1회 (중간 정도의 엄격도 세척).

일반적으로, 염 및/또는 온도를 변경시켜 엄격도를 변화시킬 수 있다. 70개 초과 정도의 염기 길이를 갖는 표지된 DNA 단편의 경우에는 하기하는 조건이 이용될 수 있다:

낮은 엄격도: 1× 또는 2× SSPE, 실온.

낮은 엄격도: 1× 또는 2× SSPE, 42℃.

중간 정도의 엄격도: 0.2× 또는 1× SSPE, 65℃.

높은 엄격도: 0.1× SSPE, 65℃.

또다른 비-제한적인 예로서, 높은 엄격도 조건을 이용하는 절차는 다음과 같이 수행될 수 있다: DNA를 함유하는 필터의 예비-혼성화를 8시간 동안 밤새 65℃에서 6× SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02％ PVP, 0.02％ 피콜(Ficoll), 0.02％ BSA 및 500 ㎍/mL 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 완충제 중에서 수행한다. 필터를 48시간 동안 바람직한 혼성화 온도인 65℃에서 100 ㎍/mL 변성 연어 정자 DNA 및 5 내지 20×10⁶ cpm의 ³²P-표지된 프로브를 함유하는 예비-혼성화 혼합물 중에서 혼성화시킨다. 별법으로, 혼성화 단계는 65℃에서 SSC 완충제, 1× SSC (0.15 M NaCl 및 0.05 M Na 시트레이트에 상응함)의 존재하에 수행할 수도 있다. 이후, 37℃에서 1시간 동안 2× SSC, 0.01％ PVP, 0.01％ 피콜 및 0.01％ BSA를 함유하는 용액 중에서 필터 세척을 행한 후에 O.1× SSC 중에서 50℃에서 45분 동안 세척할 수 있다. 별법으로, 필터 세척은 2× SSC 및 0.1％ SDS, 또는 0.5× SSC 및 0.1％ SDS, 또는 O.1× SSC 및 0.1％ SDS를 함유하는 용액 중에서 68℃에서 15분 간격 동안 수행할 수도 있다. 세척 단계 후, 혼성화된 프로브는 자가방사기록법으로 검출가능하다. 이용될 수 있는 높은 엄격도의 다른 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Sambrook, et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57] 및 [Ausubel, et al. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.]를 참고하며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 포함됨).

중간 정도의 엄격도 조건을 이용한 절차의 추가의 비-제한적인 예는 다음과 같다: DNA를 함유하는 필터를 예비-혼성화시킨 후에 60℃의 온도에서 5× SSC 완충제 및 표지된 프로브의 존재하에 혼성화시킨다. 이어서, 2× SSC를 함유하는 용액 중에서 50℃에서 필터 세척을 수행하며, 혼성화된 프로브는 자가방사기록법으로 검출가능하다. 이용될 수 있는 중간 정도 엄격도의 다른 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57] 및 [Ausubel et al 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.]을 참조하며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 포함됨).

이중나선 형성 및 안정성은 하이브리드의 2개 가닥 사이의 실질적 상보성에 따라 달라지고, 상기한 바와 같이 어느 정도의 미스매치(mismatch)는 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 프로브 서열은 기재된 서열의 돌연변이 (단일 돌연변이와 다중 돌연변이 둘다), 결실, 삽입 및 이들의 조합을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이, 삽입 및 결실은 관심 표적 폴리뉴클레오티드와의 안정적인 하이브리드 형성을 허용한다. 돌연변이, 삽입 및 결실은 주어진 폴리뉴클레오티드 서열에서 여러가지 방식으로 생성될 수 있으며, 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 추후에는 다른 방법이 공지될 수도 있다.

해당 DNA 서열의 기능적 단편을 수득하는데 제한 효소가 사용될 수도 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Bal31 엑소뉴클레아제는 DNA의 시간-조절되는 제한적 소화 (통상적으로, "염기 1개씩의 소화(erase-a-base)" 절차라고 지칭됨)에 편리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Maniatis, et al. 1982 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York], [Wei, et al. 1983 J. Biol. Chem. 258:13006-13512])을 참조한다. 본원에 개시된 핵산 서열은 핵산 분석 절차에서의 분자량 마커로서 사용될 수도 있다.

숙주 세포

본원에서는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 형질전환된 숙주 세포에 의한 Aβ 펩티드 단편의 생성이 제공된다. 일부 실시양태에서, 형질전환된 세포는 Aβ 펩티드 단편에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시양태는 Aβ 폴리뉴클레오티드 서열의 단편을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 형질전환된 숙주 세포는 본원에서 제공된 뉴클레오티드 서열의 복제 및/또는 발현을 허용하는 조건하에 배양될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 배양 배지에서 회수되어, 당업계에 공지된 방법에 따라 추가의 사용을 위해 정제된다.

숙주 세포는 진핵 또는 원핵 시스템, 예를 들어 박테리아 세포 (그람(Gram)-음성 또는 그람-양성), 효모 세포, 동물 세포, 식물 세포, 및/또는 바쿨로바이러스 벡터를 사용한 곤충 세포로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 발현용 숙주 세포는 미국 특허 제6,319,691호, 동 제6,277,375호, 동 제5,643,570호, 동 제5,565,335호, [Unger, et al. 1997 The Scientist 11(17):20] 또는 [Smith, et al. 1998 The Scientist 12(22):20] (상기 문헌은 각 특허 또는 문헌에서 언급된 모든 참조문헌을 비롯하여 그 전문이 참고로 포함됨)에서 교시된 것 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적이고 비-제한적인 숙주 세포로는 스타필로콕쿠스(Staphylococcus) 종, 엔테로콕쿠스(Enterococcus) 종, 이. 콜라이(E. coli) 및 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis); 진균 세포, 예컨대 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한셀라 폴리모르파(Hansela polymorpha), 클루베로마이세스 락티스(Kluveromyces lactis) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica); 곤충 세포, 예컨대 초파리 S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포 등이 있다. 매우 다양한 발현 시스템이 본원에서 제공되는 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드는 특정 발현 시스템에서의 발현에 최적인 코돈 사용을 제공하도록 당업계에 공지된 방법에 따라 변형될 수 있다.

추가로, 삽입된 서열의 발현을 조정하고, 유전자 생성물을 변형하고/하거나, 상기 유전자 생성물을 특별한 방식으로 프로세싱하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도물질(inducer)의 존재하에 상승될 수 있어서, 유전자 조작된 폴리펩티드의 발현이 제어될 수 있다. 추가로, 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역후 프로세싱 및 변형 (예컨대, 글리코실화, 인산화)를 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 원하는 변형 및 프로세싱이 일어나도록 하는 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템에서의 발현을 이용하여 글리코실화되지 않은 코어 단백질 생성물을 생성할 수 있지만, 효모에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 생성한다. 포유동물 세포에서의 발현은 이종 단백질의 "천연" 글리코실화를 제공하는데 이용될 수 있다. 추가로, 여러가지 벡터/숙주 발현 시스템은 프로세싱 반응을 상이한 정도로 일으킬 수 있다.

핵산 및/또는 벡터는 공지된 방법, 예를 들어 인산칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란 매개 형질감염법, 형질감염법, 미세주입법, 양이온성 지질-매개 형질감염법, 전기천공법, 형질도입법, 스크래프 로딩법(scrape loading), 발리스트 도입법(ballistic introduction) 및 감염법 등을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다 (예를 들어 [Sambrook, et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.] 참조).

본 발명은 또한 본원에 개시한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 유도체 또는 변이체 (예컨대, 스플라이싱 변이체)의 발현을 제공한다. 별법으로, 본 발명은 본원에 개시한 폴리뉴클레오티드 서열에서 유래한 폴리뉴클레오티드 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 유도체 또는 변이체로부터 수득된 폴리펩티드 단편의 발현을 제공한다. 어느 실시양태에서건, 본원에 개시된 서열은 폴리펩티드 또는 단편이 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 발현되도록 제2의 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 요소에 의해 제어될 수 있다.

본 발명은 또한 샘플 중 Aβ 유전자, 또는 그의 단편 또는 변이체의 존재를 확인하는 핵산-기재의 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 제공된 핵산을 이용할 수 있고, 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook, et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57] 또는 [Abbaszadega, et al. 2001 Reviews in Biology and Biotechnology, 1(2):21-26] 참조). 이러한 방법에 유용한 기술 중에는 효소적 유전자 증폭 (또는 PCR), 써던 블럿, 노던 블럿, 또는 샘플 중 폴리뉴클레오티드 서열의 확인을 위해 핵산 혼성화를 이용하는 다른 기술이 속한다. 핵산은 Aβ 유전자 또는 그의 전사 생성물의 조절곤란과 관련이 있는 장애에 대하여 개체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 중 5개 이상의 아미노산의 단편을 제공한다.

제약 제제 및 투여

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 작용제를 환자에게 전달하는 과정을 지칭한다. 투여 방법은 작용제(들) 및 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 투여는 치료제에 적절한 임의의 수단, 예를 들어 경구, 비경구, 점막, 폐, 국소, 카테터-기재, 직장, 두개내, 뇌실내, 대뇌내, 질내 또는 자궁내 전달로 수행될 수 있다. 비경구 전달은 예를 들어 피하 정맥내, 근육내, 동맥내, 및 장기의 조직 내, 특히 종양 조직 내로의 주사를 포함할 수 있다. 점막 전달은 예를 들어 비내 전달을 포함할 수 있다. 경구 또는 비내 전달은 추진제의 투여를 포함할 수 있다. 폐 전달은 작용제의 흡입을 포함할 수 있다. 카테터-기재의 전달은 이온트로페레트(iontropheretic) 카테터-기재의 전달에 의한 전달을 포함할 수 있다. 경구 전달은 코팅 환제의 전달, 또는 입을 통한 액제의 투여를 포할 수 있다. 투여는 일반적으로 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 완충제, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류 접합체, 리포좀 및/또는 지질과 함께 전달되는 것을 포함할 수도 있다. 유전자 요법 프로토콜은 또한 치료제가 전사체 또는 폴리펩티드로서 발현되어 환자에서 치료 목적을 달성할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 경우의 투여도 고려한다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 병리적 혈관형성 억제 유효량으로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관형성"은 새로운 혈관이 형성되고 다양한 정상적인 신체 활동 (예를 들어, 생식, 발생 및 상처 치유)에 필수적인 과정을 지칭하기 위한 것이다. 상기 과정은 모세혈관의 주 세포인 내피 세포의 성장을 자극하기도 하고 억제하기도 하는 분자들의 복잡한 상호작용을 수반한다고 여겨진다. 정상적인 상태에서는 이들 분자들이 연장된 기간 동안 휴면 상태 (즉, 모세혈관 성장이 없는 시기 중 하나)에서 미소혈관계를 유지한다고 여겨진다. 그러나, 필요한 경우 (예컨대 상처 치유 동안)에는 이들 세포에서 짧은 시간 내에 신속한 증식 및 턴오버(turnover)가 일어날 수 있다. 혈관형성이 정상적인 상태에서는 고도로 조절되는 과정이긴 하지만, 많은 상태 ("혈관형성 질환"으로 특징지어짐)가 지속적으로 조절되지 않는 혈관형성에 의해 발생된다. 즉, 조절되지 않는 혈관형성은 특정 병리 상태를 직접 초래할 수도 있고, 또는 기존의 병리 상태를 악화시킬 수도 있다. 예를 들어, 안구 혈관신생은 실명의 가장 흔한 원인임이 밝혀져 있고, 대략 20가지 눈 질환에서 우세하게 발생한다. 특정한 기존의 상태, 예컨대 관절염에서는 새로 형성된 모세혈관이 관절을 침윤하여 연골을 파괴한다. 당뇨병에서, 망막에서 형성된 새로운 모세혈관은 유리체로 침윤하여 출혈이 일어나고 실명을 일으킨다. 종양의 성장 및 전이 역시 혈관형성 의존적이다 ([Folkman, J., Cancer Research, 46:467-473, 1986], [Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82:4-6, 1989]). 예를 들어, 2 mm 초과로 비대해진 종양은 자신의 혈액 공급원을 구해야 하는데, 새로운 모세혈관의 성장을 유도함으로써 해결한다는 것이 밝혀졌다. 일단 이러한 새로운 혈관이 종양 내에 매립되면, 이것은 종양 세포에게 순환계로 들어가고 먼 부위, 예를 들어 간, 폐 또는 뼈로 전이할 수단을 제공한다 [Weidner, N. et al., The New England Journal of Medicine, 324(1):1-8, 1991].

본 발명의 제약 조성물은 제약상 유용한 조성물 제조를 위해서 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 이러한 제제는, 당업자에게 공지되고 쉽게 이용가능한 수많은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin E W 1995 Easton Pennsylvania Mack Publishing Company, 19.sup.th ed.)]은 본 발명에 사용될 수 있는 제제를 기재한다. 비경구 투여에 적합한 제제의 예로는 항산화제, 완충제, 정균제 및 제제를 의도된 수용체의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 멸균 주사 용액제, 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액제 등이 있다. 제제는 단위-투여 및 다중-투여 용기, 예를 들어 밀폐된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 전에 오직 멸균 액체 담체, 예컨대 주사용수의 조건만이 요구되는 냉동 건조 (동결건조)된 상태로 저장될 수 있다. 즉각 투여용(extemporaneous) 주사 용액제 및 현탁액제는 멸균 산제, 과립제, 정제 등으로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 제제는 특히 상기 언급한 성분에 추가하여 해당 제제 유형과 관련하여 당업계에 통상적인 다른 작용제도 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 지속 방출형 제제로 전달된다. 상기 제제는 연장 방출 및 연장된 반감기를 제공한다. 사용하기에 적합한 제어 방출 시스템으로는 확산-제어, 용매-제어 및 화학적-제어 시스템 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 확산-제어 시스템의 예로는 저장고 장치가 있고, 여기서는 Aβ 펩티드 단편(들)이 상기 펩티드 단편의 방출이 확산 장벽을 통한 투과로 제어되도록 장치 내에 밀폐된다. 통상적인 저장고 장치의 예로는 막, 캡슐, 마이크로캡슐, 리포좀 및 중공사 등이 있다. 단일체식(monolithic) (매트릭스) 장치가 제2 유형의 확산 제어 시스템이며, 여기서는 Aβ 펩티드 단편(들)이 속도-제어 매트릭스 (예컨대 중합체 매트릭스) 중에 분산되거나 용해된다. 펩티드 단편은 속도-제어 매트릭스 전체에 균질하게 분산되며, 약물 방출 속도는 매트릭스를 통한 확산에 의해 제어된다. 단일체식 매트릭스 장치에 사용하기에 적합한 중합체는 천연 중합체, 합성 중합체 및 합성 방식으로 변형된 천연 중합체 뿐만이 아니라 중합체 유도체까지도 포함한다.

Aβ 펩티드 단편에 대한 치료 유효하고 최적인 투여량 범위는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항-혈관형성 및/또는 항-종양 효과 달성에 적절한 투여량에 관한 지침은 본원에 개시한 예시된 검정에서 제공된다. 치료 효과 달성을 위한 Aβ 펩티드 단편의 최소량은 유사하게 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 μM 단위의 투여량 범위 내에 속하는 동등한 양으로 투여된다. 또다른 실시양태에서, 약 1 μM 내지 약 100 μM Aβ 펩티드 단편과 동등한 양이 투여된다. 또다른 실시양태에서, 약 2 μM 내지 약 10 μM Aβ 펩티드 단편과 동등한 양이 투여된다. 투여될 수 있는 제약 제제는 예를 들어 1 내지 10,000 mg, 10 내지 1000 mg, 50 내지 900 mg, 100 내지 800 mg, 또는 200 내지 500 mg을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 Aβ 펩티드 단편의 항-혈관형성 효과를 저해하여 알쯔하이머병을 치료하는데 잠재적으로 치료 효능이 있는 화합물을 진단 및/또는 스크리닝하는 방법 및 이러한 화합물을 스크리닝하기 위한 키트에 관한 것이기도 하다.

한 측면에서, Aβ-유도된 혈관형성 억제를 저해하는 화합물의 동정 방법이 포함되며, 상기 방법은 (a) 혈관형성이 일어날 수 있는 제1의 생물학적 샘플을 시험 화합물, 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편, 및 혈관형성 작용제와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 제1의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 결정하는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 (c) 혈관형성이 일어날 수 있는 제2의 생물학적 샘플을 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편 및 혈관형성 작용제와 별도로 접촉시키는 단계, (d) 상기 제2의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 결정하는 단계, 및 (e) 상기 제1의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 상기 제2의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 단계 (c) 및 (d)는 대조군으로서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1의 생물학적 샘플 및 제2의 생물학적 샘플에 동일한 Aβ 펩티드 단편을 사용한다.

혈관형성의 정도의 결정은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 본원에 기재한 방법을 이용하여 수행될 수 있고, 정성적으로 또는 정량적으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 암 또는 종양 성장의 분자 마커 또는 세포내 마커를 사용할 수 있다. 혈관형성의 정도는 생물학적 샘플 내에서 내피 세포의 증식량 또는 혈관 성장의 정도를 측정하여 결정할 수도 있다.

상기 방법 및 키트에 사용되는 생물학적 샘플은 혈관형성 및/또는 종양 발생을 나타낼 수 있는 각종 생물학적 유체 및 조직을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 동맥 조직, 각막 조직, 내피 세포, 제대 조직, 요낭융모막(chorionic allantoid membrane) 등일 수 있다.

혈관형성 작용제는 생물학적 샘플 중에서 혈관형성을 유도할 수 있는 임의의 분자, 화합물 또는 세포일 수 있다. 예를 들어, 혈관형성 작용제는 신경영양성 인자와 같은 영양성 인자일 수 있다. 혈관형성 인자는 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자, 혈소판-유래의 성장 인자 및 염기성 섬유아세포 성장 인자일 수 있다. 본 발명의 진단 및/또는 스크리닝 방법은 동물 모델과 같은 생체내에서 수행될 수도 있고 시험관내에서 수행될 수도 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 Aβ-유도된 혈관형성 억제를 저해하는 화합물을 동정하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 1종 이상의 Aβ 펩티드 단편을 함유하는 구획, 및 임의로는 혈관형성 작용제를 함유하는 구획을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 키트는 1종 이상의 생물학적 샘플을 함유하는 구획을 임의로 포함할 수 있다.

또다른 측면에서, (a) 제1 종양 조직을 시험 화합물 및 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편과 접촉시키는 단계, 및 (b) 종양 조직에서 일어난 종양 성장의 정도를 결정하는 단계를 포함하는, Aβ-유도된 항-종양 활성을 저해하는 화합물의 동정 방법이 제공된다. 임의로, 상기 방법은 (c) 제2의 종양 조직을 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편과 별도로 접촉시키는 단계, (d) 상기 제2의 종양 조직에서 일어난 종양 성장의 정도를 결정하는 단계, 및 (e) 상기 제1 종양 조직에서 일어난 종양 성장의 정도를 상기 제2의 종양 조직에서 일어난 종양 성장의 정도와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 단계 (c) 및 (d)는 대조군으로서 이용될 수 있다. 종양 성장의 정도는 본원에 기재한 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 방법을 이용하여 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 암 또는 종양 성장의 분자 마커 또는 세포내 마커를 사용할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 Aβ-유도된 항-종양 활성을 저해하는 화합물을 동정하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 1종 이상의 Aβ 펩티드 단편을 함유하는 구획, 및 임의로는 1종 이상의 종양 조직을 함유하는 구획을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 키트는 1종 이상의 생물학적 샘플을 함유하는 구획을 임의로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법 및 키트를 이용하여 스크리닝될 수 있는 시험 화합물로는 예를 들어 소분자(small molecule) 및 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 비롯한 임의의 물질, 작용제 또는 분자 등을 들 수 있다.

임의의 척추동물 종을 비롯한 다양한 환자를 치료할 수 있다. 바람직하게는, 상기 환자는 포유동물 종의 환자이다. 본원에 개시된 치료 방법이 유익한 포유동물 종으로는 유인원, 침팬지, 오랑우탄, 인간, 원숭이; 사육 동물 (예컨대 애완동물), 예를 들어 개, 고양이, 기니아피그, 햄스터, 베트남 배불뚝이 돼지, 토끼 및 흰족제비; 사육 가축, 예를 들어 소, 버팔로, 들소, 말, 당나귀, 돼지, 양 및 염소; 전형적으로는 동물원에 있는 외국 동물, 예를 들어 곰, 사자, 호랑이, 표범, 코끼리, 하마, 코뿔소, 기린, 영양, 나무늘보, 가젤, 얼룩말, 누, 프레리도그, 코알라, 캥거루, 주머니쥐, 너구리, 팬더, 하이에나, 물개, 강치, 해마, 수달, 돌고래 (porpoise, dolphin) 및 고래 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

종양 및 암의 치료

한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본원에 개시한 Aβ 펩티드 단편을 임의로는 단위 투여량 형태로 투여하는 것을 포함하는, 종양, 암 또는 다른 증식성 장애를 치료할 필요가 있는 동물 또는 인간에서 종양, 암 또는 다른 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 치료 유효량의 본원에 개시한 Aβ 펩티드 단편을 임의로는 단위 투여량 형태로 투여하는 것을 포함하는, 혈관형성을 억제할 필요가 있는 동물 또는 인간에서 혈관형성을 억제하는 방법도 제공한다.

본 발명은, 하기하는 조직 또는 장기에서의 암 또는 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 및 암을 치료하기 위한 한 실시양태에서 사용할 수 있는 Aβ 펩티드 단편 및 상기 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다: 유방, 전립선, 폐, 기관지, 결장, 요로, 방광, 신장, 췌장, 갑상선, 위, 뇌, 식도, 간, 간내 담관, 자궁경부, 피부, 후두, 심장, 고환, 소장, 갑상선, 음문, 담낭, 흉막, 눈, 코, 귀, 비인강, 요관, 위장 시스템, 직장 조직, 췌장, 두부 및 경부. 치료될 수 있는 암으로는 비-호지킨 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 암종, 선암, 육종, 림프종 및 백혈병 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

한 하위 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 예를 들어 전립선암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 피부 흑색종, 췌장암, 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 비-호지킨 림프종 및 난소암을 치료하는데 사용될 수 있다.

또다른 하위 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 피부암, 자궁경부암, 항문 암종, 식도암, 간세포 암종 (간), 후두암, 신세포 암종 (신장), 위암, 고환암 및 갑상선암을 비롯한 상피 세포의 암 및 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.

또다른 하위 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 비롯한 혈액계 악성종양 (혈액 및 골수)을 치료하는데 사용된다.

추가의 하위 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 골육종 (뼈), 연골육종 (연골에서 생김) 및 횡문근육종 (근육)을 비롯한 육종을 치료하는데 사용된다.

또다른 하위 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 뇌종양, 위장관 간질 종양 (GIST), 중피종 (흉막 또는 심막), 흉선종 및 기형종 및 흑색종을 비롯한 각종 기원의 암 및 종양을 치료하는데 사용된다.

치료될 수 있는 종양의 예로는 악성 뇌종양, 예컨대 교아세포종; 악성 폐 종양, 예컨대 선암; 또는 유방, 결장, 신장, 방광, 두부 또는 경부의 악성 종양 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

치료될 수 있는 증식성 장애로는 조혈 장애, 예를 들어 백혈병, 림프종 또는 적혈구증가증 및 안구 장애, 예를 들어 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 녹내장 또는 색소성 망막염 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 치료될 수 있는 염증성 장애로는 류마티스성 관절염, 골관절염, 폐 섬유증, 사르코이드 육아종(sarcoid granuloma), 건선 또는 천식 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 암종, 육종, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시한 Aβ 펩티드 단편은 충실성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 기재한 Aβ 펩티드 단편은 하기 표 2a에 기재한 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

<표 2a>

암의 유형

급성 림프아구성 백혈병, 성인 모발 세포성 백혈병

급성 림프아구성 백혈병, 두부경부암

소아 간세포 (간) 암, 성인

급성 골수양 백혈병, 성인 (원발성)

급성 골수양 백혈병, 소아 간세포 (간) 암,

부신피질 암종 소아 (원발성)

부신피질 암종, 소아 호지킨 림프종, 성인

AIDS-관련 암 호지킨 림프종, 소아

AIDS-관련 림프종 임신 동안의 호지킨 림프종

항문암 하인두암

성상세포종, 소아 소뇌 시상하부 및 시각 경로

성상세포종, 소아 대뇌 신경교종, 소아

기저세포암 안내 흑색종

담관암, 간외 섬세포 암종 (내분비

방광암 췌장)

방광암, 소아 카포시 육종

골암, 골육종/악성 신장 (신세포) 암

섬유성 조직구종 신장암, 소아

뇌간 신경교종, 소아 후두암

뇌종양, 성인 후두암, 소아

뇌종양, 뇌간 신경교종, 백혈병, 급성 림프아구성, 성인

소아 백혈병, 급성 림프아구성,

뇌종양, 소뇌 성상세포종, 소아

소아 백혈병, 급성 골수양, 성인

뇌종양, 대뇌 백혈병, 급성 골수양, 소아

성상세포종/악성 신경교종, 백혈병, 만성 림프구성

소아 백혈병, 만성 골수성

뇌종양, 상의세포종, 소아 백혈병, 모발 세포성

뇌종양, 수아세포종, 입술 및 구강의 암

소아 간암, 성인 (원발성)

뇌종양, 천막상 원시 간암, 소아 (원발성)

신경외배엽 종양, 소아 폐암, 비-소세포(non-small cell)

뇌종양, 시각 경로 및 폐암, 소세포

시상하부 신경교종, 소아 림프종, AIDS-관련

뇌종양, 소아 림프종, 버키트

유방암 림프종, 피부 T-세포,

유방암, 소아 균상식육종 및 세자리

유방암, 남성 증후군 참조

기관지 선종/유암, 림프종, 호지킨, 성인

소아 림프종, 호지킨, 소아

버키트 림프종 림프종,

유암종, 소아 임신 동안의 호지킨

유암종, 위장 림프종, 비-호지킨, 성인

미지의 원발성 암종 림프종, 비-호지킨, 소아

중추 신경계 림프종, 림프종, 임신 동안의

원발성 비-호지킨

소뇌 성상세포종, 소아 림프종, 원발성 중추

대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 신경계

소아 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬

자궁경부암 뼈의

소아암 악성 섬유성 조직구종/골육종

만성 림프구성 백혈병 수아세포종, 소아

만성 골수성 백혈병 흑색종

만성 골수증식성 장애 흑색종, 안내 (눈)

결장암 메르켈 세포 암종

결장직장암, 소아 중피종, 성인 악성

피부 T-세포 림프종, 중피종, 소아

균상식육종 및 세자리 증후군 참조 잠재적 원발성 다중 내분비

자궁내막암 신생물을 수반하는 전이성

상의세포종, 소아 편평 경부암(Squamous Neck Cancer)

식도암 증후군, 소아

식도암, 소아 다발성 골수종/형질 세포

유잉계 종양 신생물

두개외 생식 세포 종양, 소아 균상식육종

고환외 생식 세포 종양 골수이형성 증후군

간외 담관암 골수이형성/골수증식성

눈의 암, 안내 흑색종 질환

눈의 암, 망막아세포종 골수성 백혈병, 만성

담낭암 골수양 백혈병, 성인 급성

위(gastric, stomach)암 골수양 백혈병, 소아 급성

위암, 소아 골수종, 다발성

위장 유암종 골수증식성 장애, 만성

생식 세포 종양, 두개외, 비강 및 부비동의 암

소아 비인두암

생식 세포 종양, 고환외 비인두암, 소아

생식 세포 종양, 난소 신경아세포종

임신성 융모성 종양 비-호지킨 림프종, 성인

신경교종, 성인 비-호지킨 림프종, 소아

신경교종, 소아 뇌간 임신 동안의

신경교종, 소아 대뇌 성상세포종 비-호지킨 림프종

신경교종, 소아 시각 경로 및 비-소세포 폐암

시상하부 구강암, 소아

구강암,

피부암 (흑색종) 입술 및 구인두의 암

피부 암종, 메르켈 세포 골육종/뼈의

소세포 폐암 악성 섬유성 조직구종

소장암 난소암, 소아

연부 조직 육종, 성인 난소 상피암

연부 조직 육종, 소아 난소 생식 세포 종양

편평 상피암, 악성 가능성이 낮은 난소 종양

피부암 (비-흑색종) 참조 췌장암

잠재적 원발성의 편평 경부암, 췌장암, 소아

전이성 췌장암, 섬세포

위암 부비동 및 비강의 암

위암, 소아 부갑상선암

천막상 원시 신경외배엽 음경암

종양, 소아 크롬친화성세포종

T-세포 림프종, 피부, 송과체아세포종 및 천막상

균상식육종 및 세자리 증후군 참조 원시 신경외배엽 종양,

고환암 소아

흉선종, 소아 하수체 종양

흉선종 및 흉선 암종 형질 세포 신생물/다발성

갑상선암 골수종

갑상선암, 소아 흉막과 폐의 아세포종

신우 및 요관의 임신 및 유방암

이행세포암 임신 및 호지킨 림프종

융모성 종양, 임신성 임신 및 비-호지킨

미지의 주요 부위의 암종, 림프종

성인 주요 중추 신경계

미지의 주요 부위의 암, 림프종

소아 전립선암

소아의 희귀 암 직장암

요관 및 신우, 이행 세포 신세포 (신장) 암

암 신세포 (신장) 암, 소아

요도암 신우 및 요관,

자궁암, 자궁내막 이행 세포 암

자궁 육종 망막아세포종

질암 횡문근육종, 소아

시각 경로 및 시상하부 타액선암

신경교종, 소아 타액선암, 소아

음문암 육종, 유잉계 종양

발덴스트롬 마크로글로불린혈증 육종, 카포시

빌름스 종양 육종, 연부 조직, 성인

육종, 연부 조직, 소아

육종, 자궁

세자리 증후군

피부암 (비-흑색종)

피부암, 소아

Aβ 펩티드 단편의 항-혈관형성 활성

어떠한 이론에도 제한되지 않고, 서열 HHQKLVFF가 항-혈관형성 활성을 부여하는 Aβ의 서열인 것이 가능하다.

수많은 연구에서 세포 표면상의 헤파린 및 각종 프로테오글리칸이 Aβ 펩티드에 결합할 수 있는 것으로 나타났고 ([Snow, et al. 1995 Arch. Biochem. Biophys. 320, 84-95], [McLaurin, et al. 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6353-61], [McKeon J, Holland LA. 2004 Electrophoresis 25, 1243-8]), 헤파란 술페이트 프로테오글리칸이 AD 뇌에서의 아밀로이드 침착물과 관련이 있는 것으로 밝혀진 바 있다 [van Horssen, et al. 2001 Acta Neuropathol. (Berl). 102, 604-14]. 또한, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸은 혈관형성 동안에 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 같은 특정 성장 인자가 세포 표면과 상호작용하도록 하여 뚜렷한 역할을 수행한다. 이러한 방식으로, 프로테오글리칸은 성장 인자와 수용체의 상호작용을 조정한다고 여겨진다 ([Rusnati M, Presta M. 1996 Int. J. Clin. Lab. Res. 26, 15-23], [Dougher, et al. 1997 Growth Factors. 14, 257-68]). 본원에서는, 외인성 헤파린의 첨가가 Aβ_1-42의 항-혈관형성 활성을 효과적으로 방해할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 헤파린을 단독으로 첨가하면 혈관형성이 약간 억제되었고, 이것은 혈관형성에 대한 과량의 헤파린의 억제 효과를 나타내는 연구와 일치한다. 이러한 효과의 메카니즘이 조직 인자 경로 억제제의 방출 증가를 통해 작용한다는 것이 시사된 바 있다 [Mousa SA, Mohamed S. 2004 Thromb. Haemost. 92, 627-33].

헤파란 술페이트 프로테오글리칸과 같은 세포 표면 프로테오글리칸은 VEGF 및 bFGF를 비롯한 각종 성장 인자에 결합하여 이것이 활성이 되도록 할 수 있다 ([Iozzo RV, San Antonio JD. 2001 J. Clin. Invest. 108, 349-55], [Presta, et al. 2005 Cytokine Growth Factor Rev. 16, 159-78], [Sanderson, et al. 2005 J. Cell Biochem. Sep 7, (advance electronic publication)]). Aβ가 이들 프로테오글리칸에 결합하여 성장 인자와 세포의 결합 및 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 혈관형성 검정에는 헤파린 결합 성장 인자가 포함되기 때문에, 과량의 헤파린 첨가는 Aβ 펩티드와 결합하고 이것이 세포 표면에 결합하는 것을 방지하여, Aβ의 항-혈관형성 활성과 반대되는 작용을 할 수 있다. 별법으로, Aβ는 또한 VEGF상의 헤파린 결합 모티프와 직접 상호작용하는 것으로 밝혀진 바 있다 [Yang, et al. 2005 J. Neurochem. 93, 118-27]. 따라서, Aβ가 헤파린에 결합하면 이것이 VEGF에 결합하는 것을 저해할 수 있어서 Aβ의 항-혈관형성 활성을 방해하는 것이 가능하다. 또한, 헤파린 (및 다른 글리코스아미노글리칸)이 Aβ 펩티드의 형태적 특성에 영향을 미쳐서 원섬유 형성 속도를 변화시킴으로써 ([Castillo, et al. 1999 J. Neurochem. 72, 1681-7], [Cohlberg, et al. 2002 Biochemistry. 41, 1502-11]) 상기 펩티드가 혈관형성을 차단하지 못하도록 하는 것도 가능하다. β-시트(sheet) 함량이 더 높은 Aβ의 제제가 보다 강력한 항-혈관형성 효능을 갖기 때문에 [Gebbink, et al. 2000 Biochim. Biophys. Acta. 1502, 16-30], Aβ 펩티드의 시험관내 항-혈관형성 활성은 그의 형태적 특성과 관련이 있다고 여겨진다. 추가로, 상기 펩티드의 가용성 올리고머는 원섬유가 불활성인데 비하여 특별한 항-혈관형성 활성을 갖는데 ([Paris, et al. 2005 Brain Res. Mol. Brain Res. 136, 212-30], [Skovseth, et al. 2005 Blood 105, 1044-51]), 이는 혈관형성을 억제하기 위해서는 Aβ 펩티드 내의 특정 잔기가 노출될 필요가 있음을 시사한다.

항-혈관형성 활성을 부여하는데 중요할 수 있는 Aβ 펩티드 서열 내의 한 모티프는 추정적인 프로테오글리칸 결합 영역인 HHQK이다 ([Cardin, A.D.; Weintaub, H.J.R. 1989 Arteriosclerosis. 9, 21-32], [Snow, et al. 1995 Arch. Biochem. Biophys. 320, 84-95], [McLaurin, et al. 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6353-61], [McKeon, et al. 2004 Electrophoresis. 25, 1243-8]). 프로테오글리칸은 혈관형성 동안에 조절 역할을 수행한다고 공지되어 있다 ([Moon, et al. 2005 J. Cell Physiol. 203, 166-76], [Tkachenko, et al. 2005 Circ. Res. 96, 488-500], [Presta, et al. 2005, Cytokine Growth Factor Rev. 16, 159-78]). 또한, 수많은 연구에서는 AD 발병에 있어서 헤파란 술페이트 프로테오글리칸의 중요한 역할이 나타났고, 이들 분자와 Aβ의 결합 저해는 치료적으로 유익할 수 있음이 시사된 바 있다 ([Leveugle, et al. 1994) Neuroreport. 5, 1389-92], [Kisilevsky, et al. 2002 J. Mol. Neurosci. 19, 45-50]).

항-혈관형성 활성에 잠재적으로 유의한 또다른 서열은 HHQK 모티프에 인접한 C-말단부 방향의 4개 아미노산 (LVFF)이다. 이 영역은 β 가닥의 일부를 구성하는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 상기 펩티드의 올리고머화에 중요하다 ([Morimoto, et al. 2004 J. Biol. Chem. 279, 52781-8], [Irie, et al. 2005 J. Biosci. Bioeng. 99, 437-47]). 최근, Aβ_10-42의 형태 모델에서는 고도로 소수성인 잔기 17 내지 20이 이량체 형태로 노출되어 있다는 것이 밝혀졌는데, 또다른 집단에 의한 연구에서는 이 영역이 원섬유 형태로 매립되어 있는 것으로 밝혀졌다 ([Mathura, et al. 2005 Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 585-92], [Olofsson, et al. 2005 J. Biol. Chem. Oct 7, (advance electronic publication)]).

Aβ가 성장 인자와 세포 표면상의 프로테오글리칸의 결합을 억제하여 작용할 수 있다는 가능성을 추가로 조사하기 위해서, Aβ_12-28의 추정적인 프로테오글리칸 결합 서열인 HHQK에서 3개의 잔기를 치환하였다. 여기서는, 야생형인 HHQK를 대신하여 중성 아미노산 치환 GGQG 또는 AAQA를 행하면 야생형 Aβ_12-28 펩티드의 항-혈관형성 효과가 완벽하게 사라지는 것으로 나타났다. 추가로, VEGF-유도된 혈관형성의 래트 각막 미세낭 모델을 이용하여 Aβ_12-28의 생체내 항-혈관형성 효능을 확인하였다. AD 환자의 뇌에서는 VEGF의 수준이 증가되지만 ([Kalaria, et al. 1998 Brain Res. Mol. Brain Res. 62, 101-5], [Tarkowski, et al. 2002 Neurobiol Aging. 23, 237-43]), 이것은 뇌 혈관신생의 증가와는 관련이 없다 [Buee, et al. 1997 Ann. N. Y. Acad. Sci. 826, 7-24]. 따라서, AD 뇌에서의 Aβ 축적은 VEGF 활성의 억제를 초래할 수 있다. VEGF는 신경영양성이고, 이것은 혈관 통합성(integrity)의 유지에 중요하며, 또한 졸중 또는 두부 상해 후의 혈관 리모델링에 있어서 핵심 인자이다 ([Slevin, et al. 2000 Neuroreport 11, 2759-64], [Shore, et al. 2004 Neurosurgery. 54, 605-12]). AD 뇌에서 VEGF에 대한 Aβ의 길항 작용은, AD 환자 및 AD의 트랜스제닉 마우스 모델이 졸중 후에 건강이 좋지 못한 이유를 설명할 수 있다 ([Koistinaho, et al. 2002 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 1610-5], [Wen, et al. 2004 J. Biol. Chem. 279, 22684-92], [Koistinaho M, Koistinaho J. 2005 Brain Res. Brain Res. Rev. 48, 240-50]).

본원에서 제공되는 실시예는 프로테오글리칸 결합 모티프 단독으로는 항-혈관형성 효과를 유발하기에 충분치 않을 수 있으며, Aβ의 항-혈관형성 활성을 매개하기 위해서는 상기 서열에 바로 인접한 아미노산 (LVFF)이 필요하다는 것을 뒷받침한다. Aβ 올리고머의 형태 모델에서, LVFF 서열 (아미노산 17 내지 20)이 상기 펩티드의 노출 영역이라는 것이 밝혀진 바 있다 [Mathura, et al. 2005 Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 585-92].

Aβ_34-42의 전-혈관형성 효과 역시 밝혀졌다. 본원에 기재한 네트워크 검정에서 관찰된 Aβ_34-42 단편의 전-혈관형성 활성은 예전에 관찰된 바 있는 저농도 Aβ_1-40/42 펩티드의 전-혈관형성 활성과 일치한다 ([Paris, et al. 2004 Angiogenesis. 7, 75-85], [Cantara, et al. 2004 F.A.S.E.B. J. 18, 1943-5]). Aβ의 폴딩은 단량체 및 이량체가 형성되는 경우에 C-말단의 34 내지 42 서열이 노출된 채로 있도록 할 수 있다. 이후, 상기 영역은 보다 고차수의 올리고머 또는 원섬유 형성시에 매립될 수 있다. Aβ_1-42 원섬유에 대한 최근의 NMR 연구는, 잔기 28 내지 42에는 용매가 접근할 수 없으며 주쇄 아미드는 오랜 기간이 지난 후일지라도 중수소 교환될 수 없음을 확인하였다 [Olofsson, et al. 2005 J. Biol. Chem. Oct 7, (advance electronic publication)]. 따라서, 저농도 Aβ_1-4O/42 펩티드의 전-혈관형성 효과는 C-말단 영역에서 전-혈관형성 모티프를 노출시키는, 주로 단량체 또는 이량체인 상태로 인한 것일 수 있다 ([Olofsson, et al. 2005 J. Biol. Chem. Oct 7, (advance electronic publication)], [Fraser, et al. 1994 J. Mol. Biol. 244, 64-73], [van Horssen, et al. 2001 Acta Neuropathol. (Berl). 102, 604-14], [Rusnati, M; Presta, M. 1996 Int. J. Clin. Lab. Res. 26, 15-23], [Dougher, et al. 1997 Growth Factors. 14, 257-68], [Mousa, et al. 2004 Thromb. Haemost. 92, 627-33], [Iozzo, et al. 2001 J. Clin. Invest. 108, 349-55], [Presta, et al. 2005 Cytokine Growth Factor Rev. 16, 159-78], [Sanderson, et al. 2005 J. Cell Biochem. Sep 7, (advance electronic publication)]).

조합 요법

한 측면에서, 본원에 개시한 펩티드 단편은 암, 종양 또는 다른 증식성 장애의 치료를 위해서 1종 이상의 추가의 화학요법제와 병용될 수 있다. 상기 추가의 작용제는 본원에 개시한 화합물과 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. 상기 약물은 동일 조성물의 일부를 형성할 수도 있고, 또는 동일 시간 또는 다른 시간에 투여하기 위한 별개의 조성물로서 제공될 수도 있다.

제2 치료제의 예로는 IL-12, 레티노이드, 인터페론, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 탈리도미드, 트롬보스폰딘-1, 트롬보스폰딘-2, 카프토프릴, 항-신생물제, 예컨대 알파 인터페론, COMP (시클로포스프아미드, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 프레드니손), 에토포시드, mBACOD (메토르트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스프아미드, 빈크리스틴 및 덱사메타손), PRO-MACE/MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트 (류코빈 구제 수반), 독소루비신, 시클로포스프아미드, 탁솔, 에토포시드/메클로르에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 안지오인히빈, TNP-470, 펜토산 폴리술페이트, 혈소판 인자 4, 안지오스타틴, LM-609, SU-101, CM-101, 테크갈란, 탈리도미드, SP-PG 및 방사선 조사(radiation) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

다른 예로는 항-유사분열 효과를 갖는 작용제 (항-유사분열 억제제), 예를 들어 세포골격 요소를 표적으로 하는 작용제, 예컨대 탁산 약물 (예컨대 탁솔, 파클리탁셀, 탁소테레, 도세탁셀), 포도필로톡신 또는 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴)와 같은 미세소관 조정자; 항-대사물질 약물 (예컨대 5-플루오로우라실, 시타라빈, 겜시타빈, 퓨린 유사체, 예컨대 페토스타틴, 메토트렉세이트); 알킬화제 또는 질소 머스타드 (예컨대 니트로소우레아, 시클로포스프아미드 또는 이포스프아미드); DNA를 표적으로 하는 약물, 예컨대 안트라사이클린 약물, 아드리아마이신, 독소루비신, 파르모루비신 또는 에피루비신; 토포이소머라제를 표적으로 하는 약물 (토포이소머라제 억제제), 예컨대 에토포시드; 호르몬 및 호르몬 효능제 또는 길항제, 예컨대 에스트로겐, 항-에스트로겐 (타목시펜 및 관련 화합물) 및 안드로겐, 플루트아미드, 류프로렐린, 고세렐린, 시프로트론 또는 옥트레오티드; 종양 세포에서의 신호 도입을 표적으로 하는 약물, 예컨대 항체 유도체, 예컨대 헤르셉틴; 알킬화 약물, 예컨대 백금 약물 (시스-플라틴, 카르본플라틴, 옥살리플라틴, 파라플라틴) 또는 니트로소우레아; 종양의 전이에 잠재적으로 영향을 주는 약물, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 유전자 요법 및 안티센스 작용제; 항체 치료제; 해양 기원의 다른 생물활성 화합물, 예컨대 디뎀닌, 예컨대 아플리딘; 코르티코스테로이드; 스테로이드 유사체, 예컨대 덱사메타손; 소염 약물, 예컨대 비-스테로이드성 작용제 (예컨대 아세트아미노펜 또는 이부프로펜) 또는 스테로이드 및 이들의 유도체, 특히 덱사메타손; 및 진토 약물, 예컨대 5HT-3 억제제 (예컨대 그라미세트론 또는 온다세트론) 등이 있다.

제2 치료제의 다른 예는 하기 표 1a에 개시한 것들을 포함한다:

<표 1a>

화학요법제

- 13-시스-레티노산 - 네오사르

- 2-아미노-6-메르캅토퓨린 - 뉼라스타

- 2-CdA - 뉴메가

- 2-클로로데옥시아데노신 - 뉴포겐

- 5-플루오로우라실 - 닐란드론

- 5-FU - 닐루트아미드

- 6-TG - 질소 머스타드

- 6-티오구아닌 - 노발덱스

- 6-메르캅토퓨린 - 노반트론

- 6-MP - 옥트레오티드

- 악큐탄 - 옥트레오티드 아세테이트

- 악티노마이신-D - 온코스파르

- 아드리아마이신 - 온코빈

- 아드루실 - 온타크

- 아그릴린 - 온크살

- Ala-Cort - 오프레벨킨

- 알데스류킨 - 오라프레드

- 알렘투주맙 - 오라손

- 알리트레티노인 - 옥살리플라틴

- 알카반-AQ - 파클리탁셀

- 알케란 - 파미드로네이트

- All-트란스레티노산 - 판레틴

- 알파 인터페론 - 파라플라틴

- 알트르에타민 - 페디아프레드

- 아메토프테린 - PEG 인터페론

- 아미포스틴 - PEG 아스파르가제

- 아미노글루테티미드 - PEG 필그라스팀

- 아나그렐리드 - PEG-인트론

- 아난드론 - PEG-L-아스파라기나제

- 아나스트로졸 - 페닐알라닌 머스타드

- 아라비노실시토신 - 플라티놀

- Ara-C - 플라티놀-AQ

- 아라네스프 - 프레드니솔론

- 아레디아 - 프레드니손

- 아리미덱스 - 프렐론

- 아로마신 - 프로카르바진

- 아르센산삼산화물 - 프로크리트

- 아스파라기나제 - 프로류킨

- ATRA - 카르무스틴 이식물을 함유하는

프롤리페프로스판 20

- 아바스틴 - 퓨린톨

- BCG - 랄록시펜

- BCNU - 류마트렉스

- 베바시주맙 - 리툭산

- 벡사로텐 - 리툭시맙

- 비칼루트아미드 - 로베론-A (인터페론 알파-2a)

- BiCNU - 루벡스

- 블레녹산 - 루비도마이신 히드로클로라이드

- 블레오마이신 - 산도스타틴

- 보르테조밉 - 산도스타틴 LAR

- 부술판 - 사르그라이노스팀

- 부술펙스 - 솔루-코르테프

- C225 - 솔루-메드롤

- 칼슘 류코보린 - STI-571

- 캄파쓰 - 스트레오토조신

- 캄프토사르 - 타목시펜

- 캄프토테신-11 - 타르그레틴

- 카페시타빈 - 탁솔

- 카라크 - 탁소테레

- 카르보플라틴 - 테모다르

- 카르무스틴 - 테모졸로미드

- 카르무스틴 웨이퍼 - 테니포시드

- 카소덱스 - TESPA

- CCNU - 탈리도미드

- CDDP - 탈로미드

- CeeNU - 테라Cys

- 세루비딘 - 티오구아닌

- 세툭시맙 - 티오구아닌 타블로이드

- 클로르암부실 - 티오포스포아미드

- 시스플라틴 - 티오플렉스

- 시트로보룸 인자 - 티오테파

- 클라드리빈 - TICE

- 코르티손 - 토포사르

- 코스메겐 - 토포테칸

- CPT-11 - 토레미펜

- 시클로포스프아미드 - 트라츠주맙

- 시타드렌 - 트레티노인

- 시타라빈 - 트렉살

- 시타라빈 리포좀 - 트리세녹스

- 시토사르-U - TSPA

- 시톡산 - VCR

- 다카르바진 - 벨반

- 닥티노마이신 - 벨카데

- 다르베포에틴 알파 - 베페시드

- 다우노마이신 - 베사노이드

- 다우노루비신 - 비아두르

- 다우노루비신 히드로클로라이드 - 빈블라스틴

- 다우노루비신 리포좀 - 빈블라스틴 술페이트

- 다우노크솜 - 빈카사르 Pfs

- 데카드론 - 빈크리스틴

- 델타-코르테프 - 비노렐빈

- 델타손 - 비노렐빈 타르트레이트

- 데니류킨 디프티톡스 - VLB

- 데포Cyt - VP-16

- 덱사메타손 - 부몬

- 덱사메타손 아세테이트 - 크세로다

- 덱사메타손 나트륨 포스페이트 - 자노사르

- 덱사손 - 제발린

- 덱스라족산 - 지네카르드

- DHAD - 졸라덱스

- DIC - 졸렌드론산

- 디오덱스 - 조메타

- 도세탁셀 - 글리아델 웨이퍼

- 독실 - 글리벡

- 독소루비신 - GM-CSF

- 독소루비신 리포좀 - 고세렐린

- 드록시아 - 과립구-콜로니 자극 인자

- DTIC - 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자

- DTIC-Dome - 할로테스틴

- 두랄론 - 헤르셉틴

- 에푸덱스 - 헥사드롤

- 엘리가르드 - 헥살렌

- 엘렌스 - 헥사메틸멜라민

- 엘록사틴 - HMM

- 엘스파르 - 하이캄틴

- 엠시트 - 하이드레아

- 에피루비신 - 하이드로코르트 아세테이트

- 에포에틴 알파 - 하이드로코르티손

- 에르비툭스 - 하이드로코르티손

나트륨 포스페이트

- 에르위니아 L-아스파라기나제 - 하이드로코르티손

나트륨 숙시네이트

- 에스트라무스틴 - 하이드로코르톤 포스페이트

- 에티올 - 히드록시우레아

- 에토포포스 - 이브리투모맙

- 에토포시드 - 이브리투모맙 티욱세탄

- 에토포시드 포스페이트 - 이다마이신

- 유렉신 - 이다루비신

- 에비스타 - 이펙스

- 엑세메스탄 - IFN-알파

- 파레스톤 - 이포스프아미드

- 파슬로덱스 - IL-2

- 페마라 - IL-11

- 필그라스팀 - 이마티닙 메실레이트

- 플록스유리딘 - 이미다졸 카르복스아미드

- 플루다라 - 인터페론 알파

- 플루다라빈 - 인터페론 알파-2b (PEG 접합체)

- 플루오로플렉스 - 인터류킨-2

- 플루오로우라실 - 인터류킨-11

- 플루오로우라실 (크림) - 인트론 A (인터페론 알파-2b)

- 플루옥시메스테론 - 류코보린

- 플루트아미드 - 류케란

- 폴린산 - 류킨

- FUDR - 류프롤리드

- 풀베스트란트 - 류로크리스틴

- G-CSF - 류스타틴

- 게피티닙 - 리포좀 Ara-C

- 겜시타빈 - 액체 프레드

- 겜투주맙 오조가마이신 - 로무스틴

- 겜자르 - L-PAM

- 글리벡 - L-사르코리신

- 루프론 - 메티코르텐

- 루프론 데포트 - 미토마이신

- 마툴란 - 미토마이신-C

- 막시덱스 - 미톡산트론

- 메클로르에타민 - M-프레드니솔

- 메클로르에타민 히드로클로린 - MTC

- 메드랄론 - MTX

- 메드롤 - 무스타르겐

- 메게이스 - 무스틴

- 메게스트롤 - 무타마이신

- 메게스트롤 아세테이트 - 마일레란

- 멜팔란 - 이레싸

- 메르캅토퓨린 - 이리노테칸

- 메스나 - 이소트레티노인

- 메스넥스 - 키드롤라제

- 메토트렉세이트 - 라나코르트

- 메토트렉세이트 나트륨 - L-아스파라기나제

- 메틸프레드니솔론 - LCR

- 마이로셀

- 레트로졸

본원에 개시한 펩티드에 유용한 검정법

당업계에 공지된 혈관형성 검정법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 래트 대동맥륜, 소, 마우스 및 인간 혈관형성 검정법이 기재되어 있는 미국 특허 출원 2003/0077261 A1 (Paris, et al.)을 참조한다.

예를 들어, 미국 특허 출원 2003/0077261 A1 (Paris, et al.)에 기재된 바와 같은 미세혈관륜 과성장의 정량화를 이용할 수 있으며, 여기서는 륜 배양물을 올림푸스(OLYMPUS) BX60 현미경에 연결시킨 디지탈 비디오 카메라로 촬영하고, 이미지 프로 플러스(Image Pro Plus) 소프트웨어를 사용하여 과성장 영역을 선택적으로 측정하고 검출한다.

미국 특허 출원 2003/0077261 A1 (Paris, et al.)에 기재된 내피 세포 이동 검정법을 이용할 수 있으며, 여기서는 인간 뇌 성인 내피 세포의 이동을 문헌 ([Soker et al. 1998], [Nakamura et al. 1997])에 기재된 바와 같이 변형된 보이덴(Boyden) 챔버 검정법 (비디 바이오코트 매트리겔(BD BioCoat MATRIGEL) 침윤 챔버)을 이용하여 평가한다.

예를 들어 미국 특허 출원 2003/0077261 A1 (Paris, et al.)에 기재된 바와 같은 누드 마우스 종양 이종이식 모델을 이용할 수 있으며, 여기서는 A-549 (인간 폐 선암) 및 U87-MG (인간 교아세포종) 세포를 8주령의 암컷 누드 마우스에게 이식한다. 상기 동물에서 성장한 종양을 Aβ 펩티드 처치 이전, 처치 이후 및 처치 동안에 측정한다. 각 생체내 항-종양 연구의 종료일에는 종양을 적출하여 미세혈관을 정량한다.

본 발명은 하기하는 비-제한적인 실시예에서 보다 상세하게 이해될 것이다.

(재료 및 방법은 실시예 1 내지 실시예 7에 기재되어 있음).

실시예 1: 세포 배양 및 시약

모든 시험관내 실험은 아메리칸 티슈 타입 컬쳐 콜렉션(American Tissue Type Culture Collection, ATCC) (미국 버지니아주 소재)에서 구입한 3 내지 4 계대의 초대 인간 제정맥 내피 세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)을 사용하여 수행하였다. 세포를 10％ 소 태아 혈청 (미국 캘리포니아 소재 의 인비트로젠), 0.1 mg/mL 헤파린 및 0.03 mg/mL 내피 세포 성장 보충물 (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))이 보충된 F12K 배지 (미국 버지니아주 소재의 ATCC)에서 배양하였다. 이 동안에, 세포는 계속 37℃ 및 5％ CO₂의 멸균 세포 배양 인큐베이터에서 유지시켰다.

실시예 2: Aβ 펩티드의 제조

모든 펩티드는 미국 캘리포니아주 소재의 바이오소스(Biosource)에게 주문하여 제조한 것을 구입하였다. 동결건조된 펩티드 1 mg을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP) 1 mL 중에 용해시켜 β-시트 구조의 형성을 최소화하고 α-나선 2차 구조를 촉진시켰다. 펩티드를 화학적 연기 후드(fume hood)에서 1시간 동안 공기 건조시킨 후에 스피드-백(speed-vac) (미국 뉴욕주 소재의 써모-사반트(Thermo-Savant))에서 30분 동안 추가로 건조시켰다. 생성된 투명한 필름을 100％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 1 mM의 농도로 재현탁하였다. 이후, 펩티드를 분취하여 -80℃에 저장하였다.

실시예 3: 모세혈관 형성 검정

24웰 플레이트에서 4％ 혈청 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로젠), 0.1 mg/mL 헤파린 및 0.03 mg/mL 내피 세포 성장 보충물 (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치)을 함유하는 F12K 배지 (미국 버지니아주 소재의 ATCC) 중 매트리겔 기저막 매트릭스 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로젠)의 층 상부에 배지 500 ㎕ 중 HUVEC (7.5×10⁴개 세포/mL)을 접종하였다. 세포를 펩티드 (또는 대조군 조건) 와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 웰에는 펩티드 희석에 사용한 비히클 (DMSO)을 동일 부피로 처리하였다. 네트워크 형성 실험은 3벌로 수행하였고, 각 웰마다 4× 대물렌즈를 사용하여 무작위로 선택한 영역 2개 이상의 사진을 찍었다. 모세혈관 길이는 이미지 프로 플러스 소프트웨어 (미국 메릴랜드주 메디아 사이버네틱, 인크.(Media Cybernetic, Inc.))를 사용하여 측정하였다.

실시예 4: 세포 증식 검정

HUVEC (5×10³개 세포/웰)을 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 펩티드 (또는 대조군 조건)와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 프로토콜 (미국 캘리포니아주 소재의 바이오비젼 인크.(Biovision Inc.))에 따라, 신속한 세포 증식 검정을 수행하였다.

실시예 5: 세포 접착 검정

HUVEC (1×10⁴개 세포/웰)을 기저막 단백질 복합체로 미리 코팅해 둔 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 펩티드 (또는 대조군 조건)와 함께 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 접착의 측정을 위해서, 인노사이트(Innocyte) 세포 접착 검정법 (미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐(Calbiochem))을 이용하였고, 제조업체가 권고하는 프로토콜을 수행하였다.

실시예 6: 래트 각막 미세낭 검정

본 검정은 VEGF (200 ng)를 단독으로 함유하거나 여러가지 양의 Aβ 펩티드 단편과 함께 함유하는 하이드론 펠렛을 사용하여 기존에 기재된 바와 같이 수행하 였다 [Paris D, Townsend K, Quadros A, Humphrey J, Sun J, Brem S, Wotoczek-Obadia M, DelleDonne A, Patel N, Obregon DF, Crescentini R, Abdullah L, Coppola D, Rojiani AM, Crawford F, Sebti SM, Mullan M. (2004) Angiogenesis. 7, 75-85]. 이식후 제7일에 혈관 성장 반응을 측정하였다. 혈관 과성장의 길이 및 너비를 측정하고, 식 L×W = AI에 따라 혈관형성 지수 (AI)를 산출하였다. 래트를 콜로이드상 탄소로 관류시키고, 눈을 적출하여 10％ 완충 포르말린 중에 고정시켰다. 올림푸스 절개 현미경을 사용하여 각막을 제거하고 크리스탈 마운트(Crystal Mount) 매질을 사용하여 유리 슬라이드 위에 놓았다.

실시예 7: 통계적 분석

통계적 분석은 윈도우즈 릴리즈(Windows release) 10.1의 SPSS를 이용한 쉐페(Scheffe's) 또는 본페로니(Bonferroni's)를 사용한 사후 비교로 ANOVA를 사용하여 수행하였다.

실시예 8: Aβ 펩티드 단편이 모세혈관 형성에 미치는 효과

Aβ_1-42, Aβ_1-40, Aβ_1-28, Aβ_12-28, Aβ_17-28, Aβ_25-35, Aβ_10-35, Aβ_10-16 및 Aβ_34-42를 비롯한 각종 Aβ 펩티드 및 펩티드 단편을, 1 μM, 5 μM 및 10 μM에서 실시예 3에 기재한 검정에서의 모세혈관 네트워크 형성 억제 능력에 대하여 시험하였다. 각 처치군 (n ≥ 8)마다 모세혈관의 총 길이를 정량하고, 대조군 처치의 백분율(％)로 표현하였다 (도 1).

사후 분석은 5 μM 및 10 μM 용량의 대조군 및 Aβ_1-40, Aβ_1-42, Aβ_1-28, Aβ _10-35 및 Aβ_12-28 사이의 유의한 차이를 밝혀냈다 (P < 0.005). 시험한 펩티드 중에서, Aβ_1-28, Aβ_12-28, Aβ_10-35, Aβ_1-40 및 Aβ_1-42가 가장 활성이었다. Aβ_25-35는 5 μM에서는 약간 활성이었지만 10 μM에서는 활성이 아니었고, 다른 펩티드들 (Aβ_10-16, Aβ_17-28 및 Aβ_34-42)은 어떠한 항-혈관형성 활성도 나타내지 않았다 (도 1). 반대로, Aβ_34-42는 용량-의존적 방식으로 혈관형성을 촉진하였다. 이러한 데이타는 Aβ 펩티드의 항-혈관형성 활성을 보존하는데 필요한 최소 서열이 잔기 12 내지 28에 포함된다는 것을 시사한다. 추가로, Aβ_12-28 단편은 항-혈관형성 활성을 갖지만 Aβ_17-28 단편 (HHQK 모티프가 없음)은 불활성이라는 관찰 결과는, 잔기 13과 잔기 16 사이에 존재하는 프로테오글리칸 결합 영역 (HHQK)이 항-혈관형성 활성에 필요함을 시사한다.

실시예 9: Aβ 펩티드 단편이 세포 증식 및 세포 접착에 미치는 효과

실시예 4 및 실시예 5 각각에 기재한 검정법을 이용하여, 각종 Aβ 펩티드 단편이 세포 증식 및 기저막 복합체로의 세포 접착을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다.

모든 펩티드 처치는 세포 증식을 유의하게 억제하였다 (P < 0.005). ANOVA는 시험한 임의의 펩티드들 사이에는 유의한 주된 효과가 없음을 밝혀냈다. 사후 시험은 여러가지 펩티드 사이에 유의한 차이가 없음을 밝혀냈다 (P > 0.005). 시험한 모든 단편이 HUVEC의 세포 증식을 억제할 수 있었지만, 여러가지 펩티드들의 효능상에는 인식가능한 차이가 없었다 (도 2A). 그러나, ANOVA와 사후 시험 모두가 시험한 단편 중 어느 것도 라미닌, 콜라겐 IV, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴을 포함하는 기저막 복합체로의 세포 접착에 유의한 영향을 미칠 수 없다는 것을 밝혀냈다 (P > 0.005) (도 2B). 따라서, Aβ 펩티드 단편의 항-혈관형성 활성에 있어서의 차이는 세포 증식 또는 접착에 대한 효과와는 관련이 없다.

실시예 10: 헤파린이 모세혈관 형성에 미치는 효과

Aβ 펩티드 내 추정적인 헤파린 결합 서열의 중요성을 입증하기 위해서, 샘플에 헤파린을 첨가하고, Aβ 펩티드의 항-혈관형성 활성을 실시예 3에 기재한 모세혈관 형성 검정법을 이용하여 정량하였다.

각 처치군 (n ≥ 8)마다 모세혈관의 총 길이를 정량하고, 대조군 처치의 백분율(％)로 표현하였다. 사후 분석은, 대조군과 모든 처치군 사이 (P < 0.001), Aβ와 Aβ + 헤파린 500 ㎍/mL (P < 0.001) 사이, Aβ와 Aβ + 헤파린 1 mg/mL 사이 (P < 0.001)의 유의한 차이를 밝혀냈다. 500 ㎍/mL 헤파린 및 1 mg/mL 헤파린의 첨가는 Aβ_1-42에 의해 유도되는 모세혈관 형성의 억제를 효과적으로 방해하였다 (도 3). 헤파린을 단독으로 첨가한 것도 역시 혈관형성을 약간 억제하였다.

실시예 11: 프로테오글리칸 결합 영역 돌연변이체 Aβ 펩티드 단편이 모세혈관 형성에 미치는 효과

헤파린 첨가가 Aβ_1-42의 항-혈관형성 활성을 방해하였기 때문에, 상기 펩티드 내의 프로테오글리칸 결합 영역이 항-혈관형성 활성 부여에 중요할 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 항-혈관형성 활성의 펩티드 단편 중 하나 (Aβ_1-28)에 Aβ가 헤파란 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 것을 효과적으로 저해하는 것으로 알려진 아미노산 치환 (GGQG 또는 AAQA가 되도록, HHQK 프로테오글리칸 결합 모티프에 존재하는 3개의 아미노산을 치환함) ([McLaurin et al. Eur. J. Biochem. 2000, 267, 6353-61], [Olofssen, et al. J. Biol. Chem 2005, Oct 7, advance electronic publication])을 가하였다. 이어서, 돌연변이체 Aβ 펩티드 단편의 효과를 실시예 3에 기재한 모세혈관 형성 검정법으로 시험하였다.

각 처치군 (n ≥ 8)마다 모세혈관의 총 길이를 정량하고, 대조군 처치의 백분율(％)로 표현하였다. ANOVA는 야생형 Aβ_1-28의 유의한 용량-의존적 주된 효과를 밝혀냈지만 (P < 0.001), Aβ_1-28 GGQGL (P = 0.566) 또는 Aβ_1-28 AAQAL (P = 0.380)의 주된 효과는 밝혀내지 못했다. 사후 분석은 1 μM, 5 μM 및 10 μM의 야생형 Aβ_1-28의 유의한 효과를 밝혀냈지만 (P < 0.005), 돌연변이체 Aβ_1-28 펩티드는 시험한 어떤 용량에서도 유의한 효과를 나타내지 않았다.

Aβ의 프로테오글리칸 결합 영역에서의 아미노산 치환은 Aβ_1-28 펩티드의 항-혈관형성 활성을 완벽하게 없앴다 (도 4) (펩티드 서열 리스트에 관한 표 2 참조).

<표 2>

실시예 12: LVFF 돌연변이체 Aβ 펩티드 단편이 모세혈관 형성에 미치는 효과

HHQK 서열의 C-말단측에 인접한 VFF 아미노산 서열의 역할은, HHQK 서열에서 출발하는 9개 아미노산으로 구성된 펩티드 단편들 (표 2, 단편 1 내지 단편 3)을 실시예 3에 기재한 모세혈관 형성 검정법으로 시험하여 수립되었다.

각 처치군 (n ≥ 6)마다 모세혈관의 총 길이를 정량하고, 대조군 처치의 백분율(％)로 표현하였다. ANOVA는 야생형 (HHHQKLVFF)의 유의한 주된 효과를 밝혀냈지만, 돌연변이체 펩티드의 효과는 밝혀내지 못했다. 사후 분석은 1 μM, 5 μM 및 10 μM 야생형 펩티드의 유의한 효과를 밝혀냈지만 (P < 0.005), LVFF 돌연변이체 펩티드는 시험한 어떠한 용량에서도 유의한 효과를 나타내지 않았다.

이러한 결과는 HHQK와 VFF 모티프를 둘다 함유하는 펩티드 서열만이 모세혈 관 형성 검정에서 혈관형성을 효과적으로 억제한다는 것을 뒷받침한다 (도 6). 그러나, YEVHHQK 서열만을 함유하는 Aβ_10-16 단편은 불활성이었고, 이는 상기 영역 단독으로는 항-혈관형성 활성에 충분치 못함을 보여준다.

실시예 13: 래트 각막 미세낭 검정에서 Aβ _12-28 펩티드 단편의 효과

시험관내 항-혈관형성이라고 여겨지는 Aβ_12-28 펩티드 단편이 생체내에서도 항-혈관형성인지를 결정하기 위해서, Aβ_12-28을 실시예 6에 기재한 래트 각막 미세낭 검정법으로 시험하였다. 각막 미세낭을 7일 동안 인큐베이션하였다. 200 ng의 VEGF, VEGF + Aβ_12-28 0.5 ㎍, VEGF + Aβ_12-28 2.5 ㎍ 및 VEGF + Aβ_12-28 5.0 ㎍에 대한 반응에서 래트 각막 미세낭 검정으로부터의 데이타를 정량하였다. ANOVA는 Aβ 용량의 유의한 주된 효과를 밝혀내었고, 사후 분석은 5 ㎍ 용량에서의 유의한 효과를 밝혀내었다 (P < 0.001). 혈관형성 지수는 평균 +/- SEM으로 표시된다.

이러한 결과는 Aβ_12-28이 본 생체내 검정에서 VEGF-유도된 혈관형성을 용량-의존적으로 억제할 수 있음을 뒷받침하며 (도 7), 시험관내 실험으로부터의 데이타를 확인시켜 준다.

실시예 14: 래트 각막 미세낭 검정에서 Aβ _12-28 , Aβ _12-28 돌연변이체 및 Aβ _13-20 의 효과

실시예 6에 기재한 래트 각막 미세낭 검정 방법에 따라, 각종 Aβ 펩티드 단편 및 돌연변이체의 효과를 시험하였다. 200 ng의 VEGF, Aβ_12-28 GGQGL 돌연변이체 펩티드 5.0 ㎍ 및 0.5 ㎍, 2.5 ㎍ 및 5.0 ㎍의 Aβ_12-28 및 Aβ_13-20 (HHH-펩티드 또는 HHQKLVFF)에 대한 반응에서 상기 검정으로부터의 데이타를 정량하였다. Aβ_12-28 GGQGL 돌연변이체는 혈관형성을 생체내 억제하는 것에 불활성이었다. 더 짧은 HHH-펩티드는 생체내 항-혈관형성 활성을 나타내었다 (용량 의존적 방식, P < O.05). 결과는 도 8에 나타내었다. 모세혈관의 4× 배율 사진을 도 9에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> Paris, Daniel Mullan, Michael <120> Modulation of Angiogenesis by A-Beta Peptide Fragments <130> 12062-105008 <140> US 11/598,299 <141> 2006-11-13 <150> US 60/735,472 <151> 2005-11-10 <160> 90 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Gly Gly Gln Gly 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Ala Ala Gln Ala 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 5 His His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 6 Val His His Gln Lys Leu Val Ile Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 7 Val His His Gln Lys Leu Val Lys Lys 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn 1 5 10 15 Lys <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 His His Gln Lys 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Val Phe Phe 1 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 = Arg or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 = Asn or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 = Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 = Ile, Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 = Ile, Leu or Val <400> 11 Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Phe 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 12 Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 13 His His Asn Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 14 Arg His Asn Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 15 His His Gln Arg Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 16 Arg His Gln Arg Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 17 His His Asn Arg Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 18 Arg His Asn Arg Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 19 His His Gln Lys Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 20 Arg His Gln Lys Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 21 His His Asn Lys Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 22 Arg His Asn Lys Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 23 His His Gln Arg Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 24 Arg His Gln Arg Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 25 His His Asn Arg Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 26 Arg His Asn Arg Ile Val Phe Phe 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 27 His His Gln Lys Val Val Phe Phe 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 28 Arg His Gln Lys Val Val Phe Phe 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 29 His His Asn Lys Val Val Phe Phe 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 30 Arg His Asn Lys Val Val Phe Phe 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 31 His His Gln Arg Val Val Phe Phe 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 32 Arg His Gln Arg Val Val Phe Phe 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 33 His His Asn Arg Val Val Phe Phe 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 34 Arg His Asn Arg Val Val Phe Phe 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 35 His His Gln Lys Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 36 Arg His Gln Lys Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 37 His His Asn Lys Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 38 Arg His Asn Lys Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 39 His His Gln Arg Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 40 Arg His Gln Arg Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 41 His His Asn Arg Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 42 Arg His Asn Arg Leu Ile Phe Phe 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 43 His His Gln Lys Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 44 Arg His Gln Lys Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 45 His His Asn Lys Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 46 Arg His Asn Lys Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 47 His His Gln Arg Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 48 Arg His Gln Arg Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 49 His His Asn Arg Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 50 Arg His Asn Arg Ile Ile Phe Phe 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 51 His His Gln Lys Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 52 Arg His Gln Lys Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 53 His His Asn Lys Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 54 Arg His Asn Lys Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 55 His His Gln Arg Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 56 Arg His Gln Arg Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 57 His His Gln Lys Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 58 Arg His Gln Lys Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 59 His His Asn Lys Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 60 Arg His Asn Lys Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 61 His His Gln Arg Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 62 Arg His Gln Arg Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 63 His His Asn Arg Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 64 Arg His Asn Arg Leu Leu Phe Phe 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 65 His His Gln Lys Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 66 Arg His Gln Lys Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 67 His His Asn Lys Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 68 Arg His Asn Lys Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 69 His His Gln Arg Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 70 Arg His Gln Arg Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 71 His His Asn Arg Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 72 Arg His Asn Arg Ile Leu Phe Phe 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 73 His His Gln Lys Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 74 Arg His Gln Lys Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 75 His His Asn Lys Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 76 Arg His Asn Lys Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 77 His His Gln Arg Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 78 Arg His Gln Arg Val Leu Phe Phe 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 79 His His Asn Arg Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 80 Arg His Asn Arg Val Ile Phe Phe 1 5 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 Gly Gly Gln Gly 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Ala Ala Gln Ala 1 <210> 83 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 84 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 1 5 10 <210> 86 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly 1 5 10 15 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met 20 25 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met 1 5 10 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5

Claims (54)

1. 8개 내지 39개 아미노산 길이의 항-혈관형성(anti-angiogenic) Aβ 펩티드 단편 또는 그의 변이체 또는 상동체.
2. 제1항에 있어서, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 39개 아미노산 길이인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
3. 제1항에 있어서, Aβ_1-28, Aβ_10-35, Aβ_12-28 또는 Aβ_13-20인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
4. 제3항에 있어서, Aβ_12-28인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
5. 제1항에 있어서, Aβ_13-20인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
6. 제5항에 있어서, Aβ_12-28 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상동체를 포함하는 것인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
7. 제5항에 있어서, Aβ_13-20 펩티드 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상동체인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
8. 제1항에 있어서, 변이체 또는 상동체가 천연 Aβ 펩티드 단편에 대하여 약 80.0％ 내지 약 99.9％의 아미노산 동일성을 나타내는 것인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
9. 제1항에 있어서, 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
10. 제9항에 있어서, 아미노산 치환이 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
11. 제1항에 있어서, 링커를 추가로 포함하는 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
12. 제1항에 있어서, 제2의 펩티드 또는 단백질에 연결된 것인 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편.
13. 제1항의 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
14. 제13항에 있어서, 제어 방출 제제인 제약 조성물.
15. 제14항에 있어서, 제어 방출 제제가 중합체 매트릭스인 제약 조성물.
16. 병리적 혈관형성으로 매개되는 질환 또는 장애를 치료할 필요가 있는 대상체에게 8개 내지 39개 아미노산 길이를 갖는 유효량의 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편 또는 그의 변이체 또는 상동체를 투여하는 것을 포함하는, 병리적 혈관형성으로 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법.
17. 제16항에 있어서, 단편이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 39개 아미노산 길이인 방법.
18. 제16항에 있어서, 단편이 Aβ_1-28인 방법.
19. 제16항에 있어서, 단편이 Aβ_10-35인 방법.
20. 제16항에 있어서, 단편이 Aβ_12-28인 방법.
21. 제16항에 있어서, 단편이 Aβ_13-20인 방법.
22. 제16항에 있어서, 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상동체인 방법.
23. 제16항에 있어서, 질환 또는 장애가 암인 방법.
24. 제16항에 있어서, 질환 또는 장애가 증식성 장애인 방법.
25. 제16항에 있어서, 질환 또는 장애가 염증성 장애인 방법.
26. 제16항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
27. 제16항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
28. 제16항에 있어서, 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편이 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 폐, 점막, 국소, 경피, 피하, 근육내, 직장, 두개내, 뇌실내, 대뇌내, 질내, 자궁내, 경막내(intrathecal) 또는 복강내 투여로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여되는 것인 방법.
29. 제16항에 있어서, 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편이 대상체에게 제약상 허용가능한 담체와 함께 투여되는 것인 방법.
30. 제16항에 있어서, Aβ 펩티드 단편이 대상체에게 제어 방출 제제로 투여되는 것인 방법.
31. 제16항에 있어서, 제어 방출 제제가 중합체 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
32. 제16항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편과 함께 또는 별도로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제인 방법.
34. 제16항에 있어서, Aβ 펩티드 단편을 환자에게 융합 펩티드로서 투여하는 것인 방법.
35. 암을 치료할 필요가 있는 대상체에게 8개 내지 39개 아미노산 길이를 갖는 유효량의 생물학적 활성의 Aβ 펩티드 단편 또는 그의 변이체 또는 상동체를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
36. 제35항에 있어서, 단편이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 39개 아미노산 길이인 방법.
37. 제35항에 있어서, 단편이 Aβ_1-28, Aβ_10-35, Aβ_12-28 및 Aβ_13-20으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, 단편이 Aβ_13-20인 방법.
39. 제38항에 있어서, Aβ_13-20 펩티드 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상동체인 방법.
40. 제35항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 결장암 및 비-호지 킨 림프종으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
41. 제35항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
42. 제35항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
43. 제35항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
44. 제43항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제인 방법.
45. 제44항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제, 니트로소우레아, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 코르티코스테로이드 억제제로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
46. (없음)
47. (없음)
48. (없음)
49. (a) 혈관형성이 일어날 수 있는 제1의 생물학적 샘플을 시험 화합물, 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편, 및 혈관형성 작용제와 접촉시키는 단계, 및

    (b) 상기 제1의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 결정하는 단계

    를 포함하는, Aβ-유도된 혈관형성 억제를 저해하는 화합물의 동정 방법.
50. 제49항에 있어서,

    (c) 혈관형성이 일어날 수 있는 제2의 생물학적 샘플을 생물학적 활성량의 Aβ 펩티드 단편 및 혈관형성 작용제와 별도로 접촉시키는 단계,

    (d) 상기 제2의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 결정하는 단계, 및

    (e) 상기 제1의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도를 상기 제2의 생물학적 샘플에서 일어난 혈관형성의 정도와 비교하는 단계

    를 추가로 포함하는 것인 방법.
51. 병리적 혈관형성과 관련이 있는 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서, 임의로는 제약상 허용가능한 담체 중 8개 내지 39개 아미노산 길이의 항-혈관형성 Aβ 펩티드 단편 또는 그의 변이체 또는 상동체의 용도.
52. 제51항에 있어서, 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상 동체를 포함하는 Aβ_12-28 단편인 용도.
53. 제51항에 있어서, 펩티드 단편이 아미노산 서열 HHQKLVFF 또는 그의 변이체 또는 상동체를 갖는 것인 용도.
54. 제51항에 있어서, 제약상 허용가능한 담체가 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 폐, 점막, 국소, 경피, 피하, 근육내, 직장, 두개내, 뇌실내, 대뇌내, 질내, 자궁내, 경막내 또는 복강내 투여에 적합한 것인 용도.

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