CN101558080A - Aβ肽片段对血管生成的调节 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于抑制血管生成的Aβ肽片段。本发明还提供通过给予有效量的Aβ片段，用于治疗病理性或不需要的血管生成及其相关病症和疾病的方法。在一个具体的实施方案中，肽片段包括序列HHQKLVFF。

Description

Aβ肽片段对血管生成的调节

相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求2005年11月10目申请的美国临时申请号60/735,472的权益，其内容通过引用结合到本文中。

发明领域

[0002]本发明涉及用于治疗由病理性血管生成介导的疾病和病理病症或过程的组合物和方法，该方法包括给予受累于这些疾病、病症或过程的患者全长Aβ肽的生物活性片段。

相关领域描述

[0003]阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是西方国家老年性痴呆的主要原因，以胞内神经原纤维缠结的进行性累积、胞外实质老年斑和脑血管沉积物为特征(Sissodia等，F.A.S.E.B.J.9：366-370(1995))。老年斑和脑血管沉积物的主要成分是β-淀粉样肽，是由39-43个氨基酸残基Aβ肽组成的聚合形式，由淀粉样前体蛋白(APP)蛋白水解后产生(Naidu等，1995J.Biol.Chem.270：1369-1374；Gorevic等，1986J.Neuropathol.Exp.Neurol.45，647-64；Selkoe等，1986J.Neurochem.46，1820-34)。老年斑的主要蛋白质成分是β/A4淀粉样蛋白，是一种42-43个氨基酸的肽。

[0004]伴有脑淀粉样蛋白血管病(CAA)的血管病理是晚期AD病例的标准，脑淀粉样蛋白血管病是在尸体解剖时观察到的一种最普遍的异常情况(Ellis等，Neurology 46：1592-1596(1996))。某些血管病变，例如影响脑内皮和室周白质病变的微血管变性，在大多数AD病例中清晰可见(Ellis等，Neurology 46：1592-1596(1996)；Kalaria，Ann.N.Y.Acad.Sci.893：113-125(1999))。此外，在AD脑微血管和毛细血管中观察到形态变化；具体地说，末端小血管通常具有局灶性收缩及具有不规则形状和排列的平滑肌细胞(Hashimura等，Jpn.J.PsychiatryNeurol.45：661-665(1991))。AD脑的毛细血管通常显示出具有不规则收缩的异常的管腔表面(abluminal surface)，并沿其管道扩张(Kimura等，Jpn.J.Psychiatry Neurol.45：671-676(1991))。包括正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的功能成像技术揭示，在符合AD临床标准之前个体存在血液灌注不足，表明血管畸形发生在疾病过程的早期(Nagata等，Neurobiology of Aging 21：301-307(2000)；Johnson等，Neurobiology of Aging 21：289-292(2000))。在包括脑血管损伤(例如创伤性脑损伤、脑卒中和脑动静脉畸形)的其它疾病中，血管生成是主要的反应(Mendis等，Neurochem.Res.23：1117-23(1998)；Slevin等，Stroke 31：1863-70(2000)；Hashimoto等，Circ.Res.89：111-3(2001))。已知有关AD脑内脑血管损伤多血症的报道，预期会引起血管生成修复反应，尽管在这一领域中的研究甚少。

[0005]已经开发出几种测定法以研究参与血管生成过程(粘附、迁移、生长、侵袭和分化)的具体步骤。了解Aβ对血管生成的作用，可能对了解其在AD中所观察到的微脑血管畸形中的作用具有价值。在AD脑内，已知Aβ肽在血管周围形成原纤维沉积物，引起脑淀粉样蛋白血管病(CAA)(Pardridge等，1987J.Neurochem.49，1394-401；Jellinger K.A.，Attems J.2005J.Neurol.Sci.229-230，37-41)。在AD脑内可溶性和沉积性Aβ水平的增加可能引起血管损伤、炎症/神经胶质增生，减少脑血流量(Paris等，2000Ann.N.Y.Acad.Sci.903，97-109；Johnson等，2005Radiology.234，851-9)。多项研究表明，血管功能削弱和血流量减少是AD脑特有的特征(Nicoll等，2004Neurobiol.Aging.25，589-97和603-4；Paris等，2004Brain Res.999，53-61；Beckmann等，2003J.Neurosci.23，8453-9；Farkasm等，2001“Cerebralmicrovascular pathology in aging and Alzheimer′s disease(衰老和阿尔茨海默病的脑微血管病理)”，Prog.Neurobiol.64，575-611)。最近，有研究表明AD中血管生成削弱，这与参与血管分化的基因改变有关(Wu等，2005Nat.Med.11，959-65)。已知在AD转基因小鼠模型中，脑毛细血管密度降低(Paris等，2004Neurosci.Lett.360，80-5；Lee等，2005Brain Res.Bull.65，317-22)。从TgAPPsw小鼠脑获取的内皮细胞和动脉外植体中，在重建的基底膜上，毛细血管样结构形成削弱，表明在TgAPPsw小鼠中血管生成反应的异常变化得到最新的证实(Paris等，2004Neurosci.Lett.360，80-5)。

[0006]Paris等人的美国专利公布号2003/0077261公开了Aβ肽可以用作抗血管生成药，而且公开了Aβ肽和APP的序列以及编码它们的核酸序列，这些序列见图10所附序列表。

[0007]在多项不同的体外和体内测定中，血管生成均被Aβ肽抑制(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85)。在体外，人脑微血管内皮细胞接种至基质胶(Matrigel)时，Aβ_1-40和Aβ_1-42可以剂量依赖性地抑制毛细血管形成，在高剂量时可促使毛细血管变性。还发现全长Aβ肽的突变型(包括1或2个氨基酸置换)，是有生物活性的抗血管生成药。然而，低剂量时，Aβ似乎是促血管生成的(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85；Cantara等，2004F.A.S.E.B.J.18，1943-5)。

发明概述

[0008]我们预料不到地发现，全长Aβ肽的生物活性片段可用作抗血管生成药。这些抗血管生成Aβ肽片段可用来治疗由不需要和/或不受控制的血管生成介导的病理病症(称为“血管生成性疾病”)，如本文将进一步描述一样。

[0009]因此，第一方面，本发明提供多种抗血管生成Aβ肽片段以及包含一种或多种该类片段的组合物。在一个实施方案中，生物活性Aβ肽片段的长度可为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸。

[0010]在一个具体的实施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ_1-28肽片段、Aβ_10-35肽片段、Aβ_12-28肽片段、Aβ_13-20肽片段或其其它的生物活性片段或变异体或同源物。

[0011]在一个具体的实施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ_12-28，含有氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段、变异体或同源物。

[0012]在另一个具体的实施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ_13-20或氨基酸序列HHGKLVFF或其生物活性变异体或同源物。变异体可以包括例如氨基酸置换。

[0013]在另一个实施方案中，本发明是包含抗血管生成Aβ肽片段和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

[0014]第二方面，本发明提供通过给予有需要的受治疗者有效量的生物活性Aβ肽片段，用于治疗由病理性血管生成介导的疾病或病症的方法，其中所述片段的长度介于8和39个氨基酸之间。抗血管生成Aβ肽片段任选与一种或多种治疗药物联合或交替给药。受治疗者可以是例如哺乳动物(例如人)。

[0015]在一个实施方案中，本发明是通过给予有需要的受治疗者有效量的生物活性Aβ肽片段用于治疗癌症的方法，任选与一种或多种化疗药物联合或交替给药。

[0016]在一个具体的实施方案中，本发明是通过给予有需要的受治疗者有效量的Aβ_12-38肽片段治疗癌症的方法，所述肽片段含有氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段、变异体或同源物。

[0017]在另一个具体的实施方案中，治疗癌症的方法包括给予有需要的受治疗者有效量的Aβ_13-20肽片段或氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性变异体或同源物。

[0018]可以通过任何合适的方式给予生物活性Aβ肽片段，该方式包括但不限于口服、胃肠外、静脉内、动脉内、肺部、黏膜、局部、经皮、皮下、肌内、鞘内或腹膜内给药。

[0019]本发明第三方面提供诊断方法和用于检测和测定生物体液和组织中抗血管生成Aβ肽片段活性的试剂盒。

[0020]本发明第四方面提供诊断方法和筛选化合物的试剂盒，所述化合物通过干预Aβ肽片段的抗血管生成作用，在治疗阿尔茨海默病中是有效的治疗药。

[0021]本发明另一方面是肽片段在......中的用途

附图简述

[0022]图1是毛细血管总长度的曲线图，用剂量为0μM、1μM、5μM和10μM的实施例8所述的各种Aβ肽片段占对照治疗的百分比表示。

[0023]图2A和图2B是HUVEC样品细胞增殖和细胞粘附的直方图，用与实施例9所述的各种Aβ肽片段孵育后占对照的百分比表示。

[0024]图3是毛细血管总长度的直方图，用实施例10所述的肝素(0.5mg/ml或1mg/ml)、Aβ_1-42肽、Aβ+肝素(500μg/ml)和Aβ+肝素(1mg/ml)治疗占对照治疗的百分比表示。

[0025]图4是毛细血管总长度的曲线图，用剂量为0μM、1μM、5μM和10μM的实施例11所述的Aβ_1-28、Aβ_1-28GGQGL和Aβ_1-28AAQAL占对照治疗的百分比表示。

[0026]图5是与实施例11所述的Aβ肽片段孵育后形成的毛细血管照片(放大4倍)。

[0027]图6是毛细血管总长度的曲线图，用剂量为0μM、1μM、5μM和10μM的实施例12所述肽HHHQKLVFF、VHHQKLVII和VHHQKLVKK占对照治疗的百分比表示。

[0028]图7是响应实施例13所述的200ng VEGF、VEGF+0.5μg Aβ_12-28、VEGF+2.5μg Aβ_12-28和VEGF+5.0μg Aβ_12-28的大鼠角膜微囊袋试验(corneal micropocket assay)中血管生成指数(AI)的直方图。

[0029]图8是响应实施例14所述的VEGF、5μg Aβ_1-28GGQGL及0.5μg、2.5μg和5μg Aβ_12-28和HHH-肽(HHHQKLVFF)的大鼠角膜微囊袋试验中血管生成指数(AI)的直方图。

[0030]图9是按实施例14所述经7天孵育后大鼠角膜微囊袋的代表型照片，包括VEGF对照和0.5μg、2.5μg和5.0μg Aβ_12-28。

[0031]图10是Aβ肽和APP以及编码它们的核酸的序列表，参见Paris等人的美国专利公布号2003/0077261。

发明详述

[0032]抗血管生成疗法是用于抑制肿瘤进程的颇有吸引力的方法，因为肿瘤生长取决于足够的血液供给。本文公开了抑制血管生成的衍生自Aβ序列的短肽，可用于抗癌疗法。

[0033]本发明提供抗血管生成Aβ肽片段，可用于治疗不需要和/或不受控制的血管生成或病理性血管生成介导的病理病症。本文提供具体的抗血管生成基序(HHQKLVFF)，可用于抗肿瘤疗法或抗血管生成疗法。

抗血管生成肽片段

[0034]本发明提供抗血管生成Aβ肽片段，用于治疗与病理或不需要的血管生成相关的病症或疾病。

[0035]本文所用术语“Aβ肽片段”是指全长Aβ肽的抗血管生成片段(例如Aβ_1-40、Aβ_1-42、Aβ_1-43)，包括Aβ肽片段变异体、同源物(例如哺乳动物的直向同源物)和同等型(isoform)，除非另有说明。该术语还包括被一个或多个等同氨基酸或非天然氨基酸置换的片段。

[0036]在一个实施方案中，Aβ肽片段的氨基酸数比全长Aβ肽所得到的氨基酸总数少至少一个氨基酸。全长Aβ肽衍生自一种或多种淀粉样前体蛋白(APP)同等型，即跨膜糖蛋白的蛋白酶解加工产物(Kang，J.等，Nature(Lond.).(1987)325：733-736)。39-43个氨基酸长的Aβ肽氨基酸序列始于APP的胞外域，并延伸至跨膜区。APP被β-分泌酶和γ-分泌酶连续切割后形成Aβ。在所有类型的AD斑块中都分别发现了Aβ_1-42和Aβ_1-43的形式，表明这些形式在AD病理中十分重要。

[0037]在一个具体的实施方案中，Aβ肽片段的氨基酸数比全长Aβ_1-40肽中存在的氨基酸总数少至少一个氨基酸。Aβ_1-40肽片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸组成。

[0038]在另一个具体的实施方案中，Aβ肽片段的氨基酸数比全长Aβ_1-42肽存在的氨基酸总数少至少一个氨基酸。Aβ_1-42片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个氨基酸组成。

[0039]在另一个具体的实施方案中，Aβ肽片段的氨基酸数比全长Aβ_1-43肽存在的氨基酸总数少至少一个氨基酸。Aβ_1-43片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41或42个氨基酸组成。

[0040]在一个实施方案中，片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个或更多个氨基酸残基组成，包括序列HHQKLVFF。

[0041]在一个实施方案中，一种或多种以下的生物活性Aβ肽片段可以用来治疗与不需要或病理性血管生成相关的疾病或病症：Aβ_1-28肽、Aβ_10-35肽、Aβ_12-28肽、Aβ_13-20肽或其生物活性片段或变异体。

[0042]抗血管生成Aβ肽片段优选含有HHQK蛋白聚糖结合区，因为无该序列的片段(Aβ_25-35、Aβ_17-28和Aβ_34-42)没有活性，这表明需要肝素结合基序HHQK来介导Aβ的抗血管生成活性。Aβ_10-16片段是无活性的，即使含有HHQK序列，这表明HHQK蛋白聚糖结合基序不足以抑制血管生成，需要其它相邻的残基。具体地说，抑制血管生成还需要紧接HHQK域后的LVFF序列。因此，优选的Aβ肽片段含有氨基酸序列HHQKLVFF。

[0043]在一个实施方案中，片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、25、36、37、38个或更多个氨基酸残基组成并且包括序列HHQKLVFF。该片段可能包括一个或多个(例如2、3或4个)等同氨基酸(例如包括非天然氨基酸)置换。

[0044]在一个实施方案中，Aβ肽片段是含有氨基酸序列HHQKLVFF的Aβ_12-28肽或其生物活性片段或变异体。

[0045]在另一个实施方案中，Aβ肽片段是Aβ_13-20肽片段或氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段或变异体。

[0046]在另一个实施方案中，Aβ肽片段是例如10、20、30或40个氨基酸的Aβ肽片段。

[0047]肽片段可以通过例如化学合成法得到，或者由宿主细胞重组产生。

[0048]同样地，术语变异体和同源物也可互换使用。“变异”或“同源”肽片段应理解为是指相对于天然多肽序列，含有修饰的多肽序列，修饰例如至少一个氨基酸的缺失、添加或置换，嵌合异源多肽的截短、延伸或添加。任选“变异”或“同源”肽片段可含有突变或翻译后修饰。

[0049]在“变异”或“同源”多肽或肽片段中，优选为其氨基酸序列与天然多肽序列具有80.0％-99.9％(含80.0％和99.9％)同一性的多肽或肽片段。这些百分数是纯粹统计性质的，两个肽序列之间的差异可能随机分布并遍及整个序列长度中。

[0050]与本发明多肽具有百分比同一性的“变异”或“同源”多肽序列可任选与本发明多肽序列具有以下的百分比同一性：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。术语等同氨基酸在本文是指能够在基础结构中有一个氨基酸被置换，而基本上不改变相应肽的生物活性的任何氨基酸，见下文。

[0051]可对Aβ的HHQKLVFF(基序)区进行数个置换而又能保持置换肽的抗血管生成性质。准确地讲，下式表示对于HHQKLVFF的这种等同置换：

[RH]-H-[NQ]-[RK]-[ILV]-[ILV]-F-F

[0052]该基序的示例性序列见表1。如果具体的肽序列是天然存在蛋白质的一部分，则注明了来源。

表1

氨基酸序列	来源(如果天然存在的话)
		HHQKLVFF	人APP/Aβ
RHQKLVFF	大鼠/小鼠APP/Aβ
		HHNKLVFF
RHNKLVFF
		HHQRLVFF
RHQRLVFF
		HHNRLVFF
RHNRLVFF
		HHQKIVFF
RHQKIVFF
		HHNKIVFF
RHNKIVFF
		HHQRIVFF
RHQRIVFF	tr：Q3YB12_BACST推定调节子[嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermnophilus)]
		HHNRIVFF
RHNRIVFF
		HHQKVVFF
RHQKVVFF

HHNKVVFF
		RHNKVVFF
HHQRVVFF	[Q6CET0]耶罗威亚解脂酵母(Yarrowia lipolytica)耶罗威亚解脂酵母菌株CLIB99染色体B(trembl)。
		RHQRVVFF
HHNRVVFF
		RHNRVVFF
HHQKLIFF
		RHQKLIFF
HHNKLIFF
		RHNKLIFF
HHQRLIFF
		RHQRLIFF
HHNRLIFF
		RHNRLIFF
HHQKIIFF
		RHQKIIFF
HHNKIIFF
		RHNKIIFF
HHQRIIFF
		RHQRIIFF
HHNRIIFF
		RHNRIIFF
HHQKVIFF
		RHQKVIFF
HHNKVIFF
		RHNKVIFF
HHQRVIFF
		RHQRVIFF
HHQKLLFF
		RHQKLLFF
HHNKLLFF
		RHNKLLFF
HHQRLLFF
		RHQRLLFF

HHNRLLFF
		RHNRLLFF	Trembl序列登录号tr：Q7QS20_GIALA
HHQKILFF
		RHQKILFF
HHNKILFF
		RHNKILFF
HHQRILFF
		RHQRILFF
HHNRILFF
		RHNRILFF
HHQKVLFF
		RHQKVLFF
HHNKVLFF
		RHNKVLFF
HHQRVLFF
		RHQRVLFF
HHNRVIFF
		RHNRVIFF

[0053]使用检索自http://motif.genome.jp/MOTIF2.html的基序以在NR-AA Trembl/Swissprot数据库中检索肽组合。本领域已知肽序列中物理化学等同氨基酸的置换(Eisenberg等，1984“Amino acidscale：Normalized consensus hydrophobicity scale(氨基酸标度：归一化共有疏水性标度)”，J.Mol.Biol.179：125-142；Mathura等，2001，“New quantitative descriptors for amino acids based on multidimensionalscaling of a large number of physical-chemical properties(用于氨基酸的基于大量理化性质多维定标的新的定量描述符)”，J.Mol.Modeling7：445-453)。

[0054]在一个实施方案中，Aβ肽片段由表1所列的一个肽序列组成，或者包括表1所列的一个肽序列，任选具有等同氨基酸置换。

[0055]本发明还提供能够诱发免疫反应的生物活性肽片段。免疫反应可提供与肽片段反应的组分(抗体或细胞免疫反应组分(例如B-细胞，辅助、细胞毒和/或抑制性T-细胞))。

[0056]可以用蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原酶)或用化学试剂(例如溴化氰(CNBr))切割多肽来获得本文所述片段。或者，可以在高的酸性环境(例如pH 2.5)产生多肽片段。还可以通过化学合成，或者使用用含有多肽片段编码核酸的表达载体转化的宿主制备这些多肽片段。转化宿主细胞含有核酸，按照众所周知的方法进行培养；因此，在合适的调节和/或表达元件控制下，可表达这些片段。

[0057]可以通过Aβ基因转录产物拼接中的变化、基因重组或者通过化学合成对肽进行修饰。这些肽与待修饰多肽序列相比可含有至少一个修饰。这些修饰可包括包含在多肽内氨基酸的添加、置换、缺失。

[0058]保守置换即一种类型的一个氨基酸被同一类型的另一个氨基酸置换落入本发明的范围内，只要置换不实质性改变多肽的生物活性。例如，非极性氨基酸的类型包括Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Gly和Trp；不带电荷的极性氨基酸类型包括Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln；酸性氨基酸的类型包括Asp和Glu；碱性氨基酸的类型包括Lys、Arg和His。在一些情况下，可以进行非保守置换，只是这些置换不显著降低多肽的生物活性。

[0059]为了延长所提供的多肽的寿命，采用非天然氨基酸，例如D型氨基酸或者氨基酸类似物(例如含硫的氨基酸形式)，可能是有利的。还可以采用延长多肽寿命的备选方法。例如，肽片段可通过重组修饰以包括延长血浆或血清半寿期的元件。这些元件包括但不限于抗体恒定区(参见例如美国专利第5,565,335号，特此通过引用全部结合到本文中，包括其中引用的所有参考文献)，或者其它元件，例如参见美国专利号6,319,691、6,277,375或5,643,570，这些专利中的每一个都通过引用全部结合到本文中，包括各相应专利中所引用的所有参考文献。或者，多核苷酸和基因可重组性融合到用于制备免疫原性构建体的元件中，该构建体是为了疫苗制剂目的，或者用于分离所提供的多肽。

[0060]所公开的肽片段可进一步含有促进片段与用于递送或诊断目的的载体分子连接的接头。接头还可用来使片段与固相支持基质连接，用于亲和纯化法。在一个实施方案中，接头尤其不包括其中片段是蛋白质序列数据库检索中已鉴定的其它肽、多肽或蛋白质的亚序列。换句话说，其它肽、多肽或蛋白质的非相同部分，不被认为是这一方面的“接头”。适于实施本发明“接头”的非限制性实例包括化学接头(例如Pierce公司，Rockford，Ill.出售的化学接头)、允许免疫原性片段与载体分子连接的肽(参见例如美国专利号6,121,424、5,843,464、5,750,352和5,990,275所公开的接头，特此通过引用全部结合到本文中)。在不同实施方案中，接头的长度可多达50个氨基酸，多达40个氨基酸，多达30个氨基酸，多达20个氨基酸，多达10个氨基酸或多达5氨基酸。

[0061]在其它具体的实施方案中，肽可表示为融合或嵌合蛋白产物(通过肽键与异源蛋白质序列(例如不同的蛋白质)连接)。可以通过本领域已知方法将合适的编码所需氨基酸序列的核酸序列在合适的编码框内与其它序列连接，通过本领域公知的方法表达嵌合产物，来制备这样的嵌合产物(参见例如美国专利第6,342,362号，特此通过引用全部结合到本文中；Altendorf等，1999-WWW，2000“Structure andFunction of the F_o Complex of the ATP Synthase from Escherichia Coli(来自大肠杆菌的ATP合酶F_o复合体的结构与功能)”，J.ofExperimental Biology 203：19-28，G.B.；Baneyx 1999Biotechnology10：411-21；Eihauer等，2001J.Biochem.Biophys.Methods 49：455-65；Jones等，1995J.Chromatography 707：3-22；Jones等，1995J.ofChromatography A.707：3-22；Margolin等，2000Methods 20：62-72；Puig等，2001Methods 24：218-29；Sassenfeld等，1990Tib.Tech.8：88-93；Sheibani等，1999Prep.Biochem.& Biotechnol.29(1)：77-90；Skerra等，1999Biomolecular Engineering 16：79-86；Smith等，1998The Scientist 12(22)：20；Smyth等，2000Methods inMolecular Biology，139：49-57；Unger等，1997The Scientist11(17)：20；这些文献的每一篇都通过引用全部结合到本文中)。或者，可以通过蛋白质合成技术(例如使用肽合成仪)来制备这样的嵌合产物。融合肽可包含如上所述的多肽和一个或多个蛋白转导域(proteintransduction domain)。这些融合肽特别用于递送货物多肽(cargopolypeptide)穿过细胞膜。

[0062]增加组织内Aβ肽片段的活性量用于治疗多种血管生成性疾病，例如癌症、肿瘤和/或恶性肿瘤。因此，按照所提供的方法，可以通过直接给予罹患血管生成性疾病的患者Aβ肽片段(例如外部递送Aβ肽片段)，或者通过间接方法或基因方法(例如给予编码Aβ肽片段的多核苷酸或者上调内源Aβ肽片段活性)，来增加组织内Aβ肽片段的活性量。可以用本发明方法治疗的这些癌症、肿瘤和/或恶性肿瘤的非限制性实例包括前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、慢性髓细胞白血病、子宫颈癌、腺癌、成淋巴细胞白血病、结肠直肠癌和肺癌。

[0063]肽片段或其编码核酸可用于筛选或辅助诊断疑患血管源性或血管生成介导的疾病的个体。本文所公开的肽片段及其编码核酸可以通过使用互补序列，用来检测杂交测定中的Aβ肽。Aβ肽片段含量显著增加的存在与阿尔茨海默病适应症有关。Aβ肽含量显著减少的存在与血管生成性疾病适应症(例如恶性肿瘤或癌症)有关。可以通过众所周知的方法检测Aβ基因产物，包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、RNA印迹、DNA印迹、基于PCR的测定或本领域技术人员已知的用于基因产物定量测定的其它测定法。这些资料结合专业人员可获得的其它资料，有助于作出诊断。

[0064]一方面，本发明涉及通过给予患者生物活性Aβ肽片段，抑制需要抗血管生成疗法的患者的血管生成的方法。

[0065]在一个实施方案中，通过给予患者治疗有效量的Aβ肽片段治疗的病理病症选自癌症、关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、黄斑变性和糖尿病性视网膜病。

[0066]在一个实施方案中，使用生物活性Aβ肽片段的变异体，其中变异体在21位氨基酸、或22位氨基酸、或23位氨基酸上或其组合位上有置换。在一个具体的实施方案中，置换是保守置换，它并不实质性地改变多肽的生物活性。

[0067]可以利用将多肽递送至细胞的各种方法以实施本发明所提供的方法。例如，蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)可与多肽融合，产生融合多肽，其中PTD能够将多肽货物跨血浆膜转导(Wadia，J.S.和Dowdy，S.F.，Curr.Opin.Biotechnol.2002，13(1)，52-56)。PTD的实例包括果蝇(Drosophila)同源异型转录蛋白触角足(Antp)、单纯疱疹病毒结构蛋白VP22和人免疫缺陷疾病1(HIV-1)转录激活因子Tat蛋白。

[0068]按照本发明所提供的血管生成抑制方法，可以给予患者重组细胞，其中重组细胞经基因修饰以表达本文所公开的Aβ肽片段。

[0069]可以采用本发明所提供的血管生成抑制方法治疗患有癌症的患者或者作为癌症预防方法。可以采用本发明所提供的肿瘤抑制方法治疗患有多种癌症的患者，癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、慢性髓细胞白血病、子宫颈癌、腺癌、成淋巴细胞白血病、结肠直肠癌和肺癌。按照本发明所提供的方法，可与Aβ肽片段联合给予其它不同的抗癌或抗肿瘤化合物，例如细胞毒药物。

编码Aβ片段的核苷酸序列

[0070]另一方面，本发明提供分离和/或纯的核苷酸序列，该核苷酸序列包含编码本文所公开的肽片段氨基酸序列的多核苷酸序列。

[0071]本发明还提供分离的核酸分子，该核酸分子包含编码Aβ肽片段的多核苷酸。本发明一方面提供分离的核酸分子，该核酸分子包含具有选自以下核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码本文所述(包括表1所列)多肽的任何氨基酸序列的核苷酸序列；和(b)与(a)中任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。

[0072]本发明另外的实施方案包括分离的核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸，具有与上述(a)或(b)中任何核苷酸序列有至少90％同一性的核苷酸序列，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。

[0073]根据本发明，核苷酸、多核苷酸或核酸序列应当理解为是指双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物(例如RNA分子)。核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以是通过分离方法分离的、纯化的(或部分纯化的)，分离方法包括但不限于离子交换层析、分子大小排阻层析(molecular size exclusion chromatography)、亲和层析或基因工程方法例如扩增、克隆或亚克隆。

[0074]任选多核苷酸序列还可含有一个或多个编码异源多肽序列的多核苷酸(例如促进本发明多肽纯化的标记(参见例如美国专利第6,342,362号，特此通过引用全部结合到本文中；Altendorf等，1999-WWW，2000“Structure and Function of the F_o Complex of the ATPSynthase from Escherichia Coli(来自大肠杆菌的ATP合酶F_o复合体的结构与功能)”，J.of Experimental Biology 203：19-28，G.B.；Baneyx1999Biotechnology 10：411-21；Eihauer等，2001J.Biochem.Biophys.Methods 49：455-65；Jones等，1995J.Chromatography 707：3-22；Jones等，1995J.of Chromatography A.707：3-22；Margolin等，2000Methods 20：62-72；Puig等，2001Methods 24：218-29；Sassenfeld等，1990Tib.Tech.8：88-93；Sheibani等，1999Prep.Biochem.&Biotechnol.29(1)：77-90；Skerra等，1999Biomolecular Engineering16：79-86；Smith等，1998The Scientist 12(22)：20；Smyth等，2000Methods in Molecular Biology，139：49-57；Unger等，1997TheScientist 11(17)：20；这些文献的每一篇都通过引用全部结合到本文中)，或者可从商家购买的标记例如STRATAGENE(La Jolla，Calif.)、NOVAGEN(Madison，Wis.)、QIAGEN，Inc.，(Valencia，Calif.)或者INVITROGEN(San Diego，Calif.)。

载体

[0075]其它方面提供含有一种或多种本发明所提供的多核苷酸的载体，例如含有编码生物活性Aβ肽片段的核苷酸的载体。载体可以是疫苗载体、复制载体或扩增载体。在一些实施方案中，多核苷酸与能够引起多核苷酸序列表达的调节元件操作性连接。这种载体还包括染色体载体、附加型载体和病毒衍生载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(例如杆状病毒)、乳多空病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽豆病毒、假性狂犬病病毒和反转录病毒的载体，以及衍生自上述载体来源组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体基因元件(例如黏粒和噬菌粒)的载体。

[0076]如上所述，载体还包含提供在给定宿主细胞中，表达和/或分泌由所提供的核苷酸序列编码的多肽(例如Aβ肽片段)所必需的元件。载体可含有一种或多种选自以下的元件：启动子、翻译起始信号、翻译终止信号和合适的转录调节区。在某些实施方案中，载体可以稳定地保存在宿主细胞内，任选含有指导翻译蛋白质分泌的信号序列。其它实施方案提供在转化宿主细胞内不稳定的载体。载体可以整合到宿主基因组中，或者可以是自主复制载体。

[0077]在一个具体的实施方案中，载体包含启动子与以下成分操作性连接：编码蛋白质或肽的核酸序列、一个或多个复制起点和任选一个或多个选择标记(例如抗生物素抗性基因)。用于多肽表达的非限制示例性的载体包括pBr型载体、pET型质粒载体(PROMEGA)、pBAD质粒载体(INVITROGEN)或下面实施例中所提供的载体。此外，载体用于转化宿主细胞以克隆或表达所提供的核苷酸序列。

[0078]可以用来控制表达的启动子包括但不限于CMV启动子、SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon 1981 Nature290：304-310)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)中3′长末端重复序列内所包含的启动子(Yamamoto等，1980Cell 22：787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982Nature296：39-42)；含有启动子的原核载体，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；还可参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria(得自重组细菌的有益蛋白质)”，Scientific American，1980，242：74-94；包含胭脂氨酸合成酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella等，1983Nature303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RN启动子(Gardner等，1981Nucl.Acids Res.9：2871)和光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶启动子(Herrera-Estrella等，1984Nature 310：115-120)；得自酵母或真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。

同源核苷酸序列

[0079]本文所提供的有“同源的”或“修饰的”核苷酸序列。修饰的核酸序列应当理解为是指按照本领域技术人员熟知的技术经诱变获得，并且与正常序列相比是被修饰的任何核苷酸序列。例如，表达多肽的调节序列和/或启动子序列的突变，导致多肽表达水平改进，提供了“修饰的核苷酸序列”。同样地，置换、缺失或添加核酸至多核苷酸提供“同源的”或“修饰的”核苷酸序列。在不同实施方案中，“同源的”或“修饰的”核酸序列具有与天然(天然存在的)Aβ肽片段基本相同的生物活性或血清活性。“同源的”或“修饰的”核苷酸序列还应理解为是指本发明多核苷酸或编码如下所述“修饰多肽”的任何核苷酸序列的剪接变异体。

[0080]本文所述同源核苷酸序列包括与所述核苷酸序列碱基的百分比同一性介于至少(或者至少约)80.0％-99.9％(含80.0％和99.9％)之间、或85％-99％之间、或90％-99％之间、或95％-99％之间的核苷酸序列。

[0081]在不同实施方案中，与所述核苷酸序列碱基具有百分比同一性的同源序列，可与本发明多核苷酸序列具有以下的百分比同一性：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

[0082]可以运用本领域已知的各种序列比较算法和程序，评价蛋白质和核酸序列同源性。这些算法和程序包括但绝不仅限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(8)：2444-2448；Altschul等，1990J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Thompson等，1994Nucleic AcidsRes.22(2)：4673-4680；Higgins等，1996Methods Enzymol.266：383-402；Altschul等，1990J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Altschul等，1993NatureGenetics 3：266-27)。

[0083]本发明还提供与本文所公开的任何多核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，本发明应理解为包括其核苷酸与本发明序列核苷酸互补的任何DNA，以及方向是逆转的DNA(例如反义序列)。

[0084]本发明还进一步提供本文所公开的多核苷酸序列的片段。多核苷酸序列的代表性片段应当理解为是指具有从其所衍生序列的至少8或9个连续核苷酸、优选至少12个连续核苷酸、更优选至少15个连续核苷酸或至少20个连续核苷酸的任何核苷酸片段。这些片段的上限是Aβ_1-42肽编码序列中存在的多核苷酸的总数(或者在某些实施方案中，是本文所规定的可读框(ORF))。还使用编码具体肽的合适片段。例如，可以用之前规定的是Aβ肽片段同源物或其片段的核苷酸序列，来实施本发明抑制血管生成的方法。

杂交和检测探针

[0085]在这些代表性片段中，优选能够在严格条件与核苷酸序列杂交的片段。下文将提供高度严格或中等严格的条件，选择以使两个互补的DNA片段杂交。按照本领域众所周知的方法(参见例如Sambrook等，1989Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页)，对于较长或较短的寡核苷酸，本领域技术人员将采用用于大小约300个碱基的多核苷酸的杂交条件。

[0086]本发明还提供检测探针(例如所公开的多核苷酸序列的片段)用于与目标序列或者与由目标序列产生的扩增子杂交。这种检测探针最好具有至少以下数目核苷酸的序列：9、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。或者，检测探针可包含所公开核酸的连续核苷酸的以下个数：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127个和多至例如128个。本发明中，检测探针还可用作标记探针或引物。标记探针或引物用放射性化合物或者用另一类型的标记进行标记。或者，非标记核苷酸序列可以直接用作探针或引物；然而，序列一般用放射性元素(³²P、³⁵S、³H、¹²⁵I)标记，或者用例如生物素、乙酰氨基芴、洋地黄毒苷、5-溴-脱氧尿苷或荧光素等分子标记，以提供可用于多项应用中的探针。

[0087]本发明所公开的核苷酸序列还可用于分析系统，例如DNA芯片。DNA芯片及其用途是本领域众所周知的(参见例如美国专利号5,561,071、5,753,439、6,214,545、Schena等，1996BioEssays18：427-431；Bianchi等，1997Clin.Diagn.Virol.8：199-208；这些文献的每一篇都通过引用全部结合到本文中)和/或由供应商提供，例如AFFYMETRIX，Inc.(Santa Clara，Calif.)。

[0088]可以采用不同严格性程度的杂交。条件越严格，双链体形成需要的互补性越高。条件的严格程度可通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等予以控制。优选用本领域众所周知的技术在中等至高度严格性条件下进行杂交，参见例如Keller，G.H.，M.M.Manak 1987DNA Probes(DNA探针)，Stockton Press，New York，N.Y.，第169-170页。

[0089]举例来说，在DNA印迹上用³²P标记的基因特异性探针与固定化DNA的杂交可通过标准方法进行(Maniatis等，1982Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)。一般而言，在允许检测与示例性多核苷酸序列同源的目标序列的中等至高度严格性条件下，进行杂交和随后的洗涤。对于双链DNA基因探针，可在6x SSPE、5x Denhardt杂交溶液(Denhardt′s solution)、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中，在低于DNA杂合解链温度(Tm)20-25℃下过夜进行杂交。解链温度用以下公式表示(Beltz等，1983Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[主编]Academic Press，New York100：266-285)。

[0090]T_m＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/碱基对双链体长度。

[0091]通常如下进行洗涤：

[0092](1)在1x SSPE、0.1％SDS中于室温下两次15分钟(低严格性洗涤)；

[0093](2)在0.2x SSPE、0.1％SDS中于T_m-20℃下一次15分钟(中等严格性洗涤)。

[0094]对于寡核苷酸探针，可以在6x SSPE、5x Denhardt杂交溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中，在低于杂合解链温度(T_m)10-20℃下过夜进行杂交。可以用下列公式求出寡核苷酸探针的T_m：

[0095]T_m(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)(Suggs等，1981ICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using Purified Genes(使用纯化基因)，D.D.Brown[主编]，Academic Press，New York，23：683-693)。

[0096]洗涤可如下进行：

[0097](1)在1x SSPE、0.1％SDS中于室温下两次15分钟(低严格性洗涤)；

[0098](2)在1x SSPE、0.1％SDS中于杂交温度下一次15分钟(中等严格性洗涤)。

[0099]一般而言，可以改变盐和/或温度以改变严格性。标记DNA片段长度＞70个左右的碱基时，可以采用下列条件：

[00100]1低：1或2X SSPE，室温，低：1或2X SSPE，42℃。中等：0.2X或1X SSPE，65℃。高：0.1X SSPE，65℃。

[00101]再以另一个非限制性实例来说，步骤还可用高严格性条件如下进行：在65℃下，在由6x SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可(Ficoll)、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的缓冲液中，使含有DNA的滤膜进行预杂交8小时至过夜。在含有100μg/ml变性鲑鱼精DNA和5-20x10⁶cpm ³²P标记探针的预杂交混合物中，使滤膜在65℃(优选的杂交温度)下进行杂交48小时。或者，在SSC缓冲液、对应于0.15M NaCl和0.05M柠檬酸钠的1x SSC存在下，在65℃下进行杂交步骤。随后，可在含有2x SSC、0.01％PVP、0.01％菲可和0.01％BSA的溶液中，在37℃下将滤膜洗涤1小时后，在0.1x SSC中于50℃洗涤45分钟。或者，可以在含有2x SSC和0.1％SDS或者0.5x SSC和0.1％SDS或者0.1xSSC和0.1％SDS的溶液中，在68℃下将滤膜洗涤15分钟时间。洗涤步骤后，可用放射自显影检测杂交探针。可以采用的其它高严格性条件是本领域众所周知的(参见例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，第二版，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页；Ausubel等，1989CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验技术)，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.，每个文献都通过引用全部结合到本文中)。

[00102]使用中等严格性条件步骤的另一非限制性实例如下：使含有DNA的滤膜预杂交，然后在5x SSC缓冲液和标记探针存在下，在60℃温度下杂交。随后，在50℃下。在含有2x SSC的溶液中进行滤膜洗涤，可通过放射自显影检测杂交探针。可以采用的其它中等严格性条件是本领域众所周知的(参见例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，第二版，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页；Ausubel等，1989CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验技术)，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y，每个文献都通过引用全部结合到本文中)。

[00103]双链体形成和稳定性取决于两条杂合链之间的实际的互补性，以及如上观察到的可以耐受的某种程度的错配。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单突变和多突变)、缺失、插入及其组合，其中所述突变、插入和缺失使得与目标靶多核苷酸形成稳定的杂合。可按许多方法在给定的多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，这些方法为普通技术人员所知。其它方法可能在不久的将来为大众所知。

[00104]本领域还众所周知的是，可以使用限制性内切酶获得本发明DNA序列的功能片段。例如，Bal31外切核酸酶可以方便地用于DNA的定时有限消化(一般称作“碱基除去(erase-a-base)法”)。参见例如Maniatis等，1982Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Wei等，1983J.Biol.Chem.258：13006-13512。本发明所公开的核酸序列还可用作核酸分析方法中的分子量标记。

宿主细胞

[00105]本发明提供用本发明的多核苷酸转化的宿主细胞和由转化宿主细胞产生的Aβ肽片段。在一些实施方案中，转化细胞包含表达载体，该表达载体含有Aβ肽片段的多核苷酸序列。其它实施方案提供用核酸转化的宿主细胞。还有其它实施方案提供包含表达载体的转化细胞，该载体中含有Aβ片段多核苷酸序列。可以在允许所提供的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养转化宿主细胞。按照本领域已知方法，从培养基中回收表达多肽，纯化待进一步使用。

[00106]可以用杆状病毒载体，从真核系统或原核系统选择宿主细胞，例如细菌细胞(革兰氏阴性或革兰氏阳性)、酵母细胞、动物细胞、植物细胞和/或昆虫细胞。在一些实施方案中，用于多肽表达的宿主细胞包括但不限于以下文献所给出的宿主细胞：美国专利号6,319,691、6,277,375、5,643,570、5,565,335；Unger等，1997The Scientist11(17)：20；或者Smith等，1998The Scientist 12(22)：20，这些文献中的每一篇都通过引用全部结合到本文中，包括各相应专利或文献中所引用的所有参考文献。其它示例性和非限制性宿主细胞包括葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)、大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；真菌细胞，例如链霉菌(Streptomycesspp.)、曲霉菌(Aspergillus spp.)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；昆虫细胞例如果蝇S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes黑素瘤细胞和植物细胞。可以使用各种各样的表达系统以产生本文所提供的多肽，可以按照本领域已知方法对多核苷酸进行修饰以提供用于在具体表达系统中表达的最佳密码子使用。

[00107]此外，可以选择调节插入序列表达，修饰基因产物，和/或以特殊方式加工基因产物的宿主细胞菌株。在某些诱导物存在下，可提高某些启动子的表达；因此，可以控制基因工程多肽的表达。此外，不同的宿主细胞对于蛋白质翻译和翻译后的加工和修饰(例如糖基化、磷酸化)具有特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白质所需要的修饰和加工。例如，在细菌系统中表达可以用来产生未糖基化的核心蛋白产物，而在酵母中表达将产生糖基化产物。在哺乳动物细胞内表达可以用来提供异源蛋白质的“天然”糖基化。此外，不同的载体/宿主表达系统可能不同程度地影响加工反应。

[00108]可以通过众所周知的方法将核酸和/或载体导入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕标记(scrapeloading)、基因枪(ballistic introduction)和感染(参见例如Sambrook等，1989Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，2.sup.nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)。

[00109]本发明还提供由本文所公开的多核苷酸序列编码的多肽、衍生物或变异体(例如剪接变异体)的表达。或者，本发明提供表达的多肽片段，该多肽片段得自多肽、衍生物或变异体，而多肽、衍生物或变异体由衍生自本文所公开的多核苷酸序列的多核苷酸片段编码。在任一个实施方案中，所公开的序列可被第二核酸序列调节，使得在用本发明的重组DNA分子转化的宿主内表达多肽或片段。例如本领域已知的任何启动子/增强子元件可控制蛋白质或肽的表达。

[00110]本发明还提供用于鉴定样品中Aβ基因或其片段或变异体存在的基于核酸的方法。这些方法可利用本发明提供的核酸，并且是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页或Abbaszadega等，2001Reviews in Biology andBiotechnology(生物学与生物工程学综述)，1(2)：21-26)。用于这些方法的技术中有酶促基因扩增(或者PCR)、DNA印迹、RNA印迹或利用核酸杂交，用于鉴定样品中多核苷酸序列的其它技术。可以利用核酸来筛选个体与Aβ基因或其转录产物失调相关的疾病。

[00111]本发明还提供由本发明核苷酸序列编码的多肽。本发明还提供至少5个氨基酸的多肽片段，该多肽由本发明的多核苷酸编码。

药物剂型和给药

[00112]本文所用术语“给药”或“给予”是指将药物递送给患者的方法。可以改变给药方法，这取决于一种或多种药物和所需的效果。可以适于治疗药的任何方法实施给药，例如通过口服、胃肠外、黏膜、肺部、局部、基于导管、直肠、颅内、脑室内、大脑内、阴道内或子宫内递药。胃肠外递药可包括例如皮下、静脉内、肌内、动脉内注射和注射到器官组织内，特别是注射到肿瘤组织内。黏膜递药可包括例如鼻内递药。口服或鼻内递药可包括抛射剂给药。肺部递药可包括药物吸入。基于导管的递药可包括通过离子电渗导管型递药(iontopheretic catheter-based delivery)。口服递药可包括口服包衣丸剂递药或者口服液体制剂给药。给药一般还可包括与药学上可接受的载体一起递药，载体例如缓冲剂、多肽、肽、多糖缀合物、脂质体和/或脂质。也可考虑给予基因疗法，其中治疗药是当作为转录物或多肽进入患者体内表达时，能够实现治疗目的多核苷酸。

[00113]在一个实施方案中，以有效量给予Aβ肽片段以抑制病理性血管生成。本文所用术语“血管生成”是指新血管形成的过程，其对各种正常身体活动(例如生殖、发育和伤口修复)是必不可少的。据信该过程包括复杂的分子相互影响，既刺激又抑制内皮细胞(毛细血管的主要细胞)的生长。在正常条件下，这些分子似乎较长期地维持微脉管系统在静止状态下(即无毛细血管生长的状态)。然而，必要时(例如伤口修复期间)，这些细胞可进行快速的增殖，并在短时间内更新。尽管在正常条件下，血管生成是受高度调节的过程，但许多病症(以“血管生成性疾病”为特征)是由血管生成持续性失调引起的。换句话说，血管生成失调既可直接引起具体的病理病症，又可使现有病理病症恶化。例如眼部新血管形成被认为是最普遍的致盲原因，引起大约20种眼病。在某些现有疾病中(例如关节炎)，新形成的毛细血管侵袭关节，破坏软骨。糖尿病中，在视网膜中新形成的毛细血管侵袭玻璃体，出血，致盲。肿瘤的生长和转移也依赖于血管生成(Folkman，J.，CancerResearch，46：467-473，1986；Folkman，J.，Journal of the National CancerInstitute，82：4-6，1989)。例如，有研究表明，增大超过2mm的肿瘤，必需获得自身血供给，并且是通过诱导新毛细血管的生长来实现的。一旦这些新血管深入到肿瘤内，便为肿瘤细胞进入循环，转移至远距离位置(例如肝、肺或骨)提供了途径(Weidner，N.等，The New EnglandJournal of Medicine，324(1)：1-8，1991)。

[00114]可以按照制备药用组合物的已知方法，制备本发明的药物组合物。各种剂型记载于多种已知的并且易为本领域技术人员获得的资料中。例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷氏药学大全)(Martin E W 1995Easton Pennsylvania Mack Publishing Company，19.sup.th ed.)记载了可与本发明联用的剂型。适于胃肠外给药的剂型包括例如无菌注射水溶液，它含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和为待接受者提供血液等渗剂型的溶质；水性和非水性无菌混悬剂，它可包括悬浮剂和增稠剂。剂型可装入单位剂量容器或多剂量容器内，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以保存在冻干条件下，临用前仅需要无菌液体载体(例如水)条件以注射。可以由无菌粉针剂、颗粒剂、片剂等制备临用时配制的注射溶液剂和混悬剂。应当理解的是，除上述具体提及的成分以外，本发明的剂型可包括本领域常用的考虑所述剂型类型的其它药物。

[00115]在一个实施方案中，以缓释剂型递送Aβ肽片段。该剂型释出延长，半寿期延长。适于使用的控释系统包括但不限于扩散控制系统、溶剂控制系统和化学控制系统。扩散控制系统包括例如贮库装置(reservoir device)，其中一种或多种Aβ肽片段被包封在一个装置内，因此肽片段的释放受到穿过扩散屏障渗透的控制。常见的贮库装置包括例如膜、胶囊、微胶囊、脂质体和中空纤维。单片(基质)装置(Monolithic(matrix)device)是第二种类型的扩散控制系统，其中Aβ肽片段分散或者溶于控速骨架片(例如聚合物骨架片)。肽片段均匀分散在整个控速基质中，通过基质扩散来控制释药速度。适用于单片基质装置的聚合物包括天然存在的聚合物、合成聚合物、合成性修饰的天然聚合物以及聚合物衍生物。

[00116]可以采用本领域已知方法，确定Aβ肽片段的治疗有效剂量和最佳剂量范围。本文所公开的示例性测定法提供了对于获得抗血管生成和/或抗肿瘤效果的合适剂量的指导。同样地，可以确定获得治疗效果的Aβ肽片段的最低剂量。在一个实施方案中，以μM剂量范围的等同剂量给予Aβ肽片段。在另一个实施方案中，以等同于约1μM至约100μM的量给予Aβ肽片段。在另一个实施方案中，以等同于约2μM至约10μM的量给予Aβ肽片段。可以给予的药物剂型可包括例如1-10,000mg、10-1000mg、50-900mg、100-800mg或200-500mg。

[00117]本发明还涉及诊断和/或筛选方法以及筛选化合物的试剂盒，该化合物通过干预Aβ肽片段的抗血管生成作用，在阿尔茨海默病治疗中是有效的治疗药。

[00118]一方面，本发明包括鉴定干预Aβ诱导的血管生成抑制的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)使能够进行血管生成的第一生物样品与试验化合物、生物活性量的Aβ肽片段和血管生成药接触；和(b)测定发生在第一生物样品中血管生成的程度。任选该方法可包括以下步骤：(c)单独使能够进行血管生成的第二生物样品与生物活性量的Aβ肽片段和血管生成药接触；(d)测定发生在第二生物样品中血管生成的程度；和(e)将发生在第一生物样品中血管生成的程度与发生在第二生物样品中的血管生成程度进行比较。这样，步骤(c)-(d)可用作对照。优选在第一和第二生物样品中使用相同的Aβ肽片段。

[00119]可用本领域已知方法(例如本文所述方法)进行血管生成程度的测定，并且可以定性或定量测定。例如，可以利用癌症或肿瘤生长的分子标记或细胞标记。还可通过测定生物样品中内皮细胞增殖量或血管生长程度，来测定血管生成的程度。

[00120]方法和试剂盒中使用的生物样品可包括具有血管生成和/或肿瘤发育的各种生物液体和组织。例如，生物样品可以是动脉组织、角膜组织、内皮细胞、脐带组织、绒毛尿囊膜等等。

[00121]血管生成药可以是在生物样品中能够诱导血管生成的任何分子、化合物或细胞。例如，血管生成药可以是营养因子，例如神经营养因子。血管生成因子可以是细胞因子或生长因子例如血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。可在体内(例如在动物模型内)或体外进行本发明的诊断和/或筛选方法。

[00122]另一方面，本发明包括试剂盒，用于鉴定干预Aβ诱导的血管生成抑制的化合物。试剂盒可包括含有至少一种Aβ肽片段的隔室和任选含有血管生成药的隔室。此外，试剂盒可任选包括含有一种或多种生物样品的隔室。

[00123]另一方面，本发明提供用于鉴定干预Aβ诱导的抗肿瘤活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使第一肿瘤组织与试验化合物和生物活性量的Aβ肽片段接触；和(b)测定发生在肿瘤组织中的肿瘤生长程度。任选该方法还可包括以下步骤：(c)单独使第二肿瘤组织与生物活性量的Aβ肽片段接触；(d)测定发生在第二肿瘤组织中的肿瘤生长程度；和(e)将发生在第一肿瘤组织中的肿瘤生长程度与发生在第二肿瘤组织中的肿瘤生长程度进行比较。这样，可利用步骤(c)-(d)作为对照。可用本领域已知方法(包括本文所述方法)定量或定性测定肿瘤生长的程度。例如，可以利用癌症或肿瘤生长的分子标记或细胞标记。

[00124]另一方面，本发明包括用于鉴定干预Aβ诱导的抗肿瘤活性的化合物的试剂盒。试剂盒可包括含有至少一种Aβ肽片段的隔室和任选含有至少一种肿瘤组织的隔室。此外，试剂盒可任选包括含有一种或多种生物样品的隔室。

[00125]可以用本发明的方法和试剂盒筛选的试验化合物可包括任何物质、药物或分子，包括例如小分子和活细胞或死细胞。

[00126]本方法可以治疗许多患者，包括任何脊椎动物种类。优选患者是哺乳动物种类。从所公开的治疗方法中获益的哺乳动物种类包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养动物(例如宠物)，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南大肚猪(Vietnamese pot-bellied pig)、兔和白鼬；驯养农用动物，例如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；一般是见于动物园的外来动物，例如熊、狮子、老虎、豹、大象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树懒、瞪羚、斑马、角马、草原土拨鼠、树袋熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、土狼、海豹、海狮、海象、水獭、鼠海豚、海豚和鲸。

肿瘤和癌症的治疗

[00127]在一个实施方案中，本发明提供用于治疗需要这种治疗的动物或人的肿瘤、癌症或其它增殖性疾病的方法，该方法包括给予治疗有效量的(任选以单位剂型)本文所述的Aβ肽片段。本发明还提供抑制有需要的动物或人的血管生成的方法，该方法包括给予治疗有效量的(任选以单位剂型)本文所公开的Aβ肽片段。

[00128]本发明提供在一个实施方案中用来治疗肿瘤和癌症的Aβ肽片段和包含该片段的药物组合物，所述肿瘤和癌症包括但不限于以下组织或器官的癌症或肿瘤：乳腺、前列腺、肺、支气管、结肠、尿道、膀胱、肾、胰腺、甲状腺、胃、脑、食道、肝、肝内胆管、子宫颈、皮肤、喉、心脏、睾丸、小肠、甲状腺、外阴、胆囊、胸膜、眼、鼻、耳、鼻咽、输尿管、胃肠系统、直肠组织、胰腺、头颈部。可以治疗的癌症包括但不限于非霍金奇淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、黑素瘤、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍金奇淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、癌、腺癌；肉瘤；淋巴瘤和白血病。

[00129]在一个细分实施方案中，可以使用Aβ肽片段治疗例如前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、皮肤黑素瘤、胰腺癌、白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、非霍金奇淋巴瘤和卵巢癌。

[00130]在另一个细分实施方案中，可以使用Aβ肽片段治疗上皮细胞癌和肿瘤，包括皮肤癌、子宫颈癌、肛门癌、食道癌、肝细胞癌(肝内)、喉癌、肾细胞癌(肾内)、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。

[00131]在另一个细分实施方案中，Aβ肽片段用来治疗血液恶性肿瘤(血液和骨髓)，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

[00132]在又一个细分实施方案中，Aβ肽片段用来治疗肉瘤，包括骨肉瘤(骨内)、软骨肉瘤(起于软骨)和横纹肌肉瘤(肌内)。

[00133]在另一个细分实施方案中，Aβ肽片段用来治疗各种各样起源的癌症和肿瘤，包括脑肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、间皮瘤(胸膜或心包膜内)、胸腺瘤、畸胎瘤和黑素瘤。

[00134]可以治疗的肿瘤的实例包括但不限于恶性脑肿瘤，例如成胶质细胞瘤；恶性肺肿瘤，例如腺癌；或者乳腺恶性肿瘤、结肠恶性肿瘤、肾恶性肿瘤、膀胱恶性肿瘤、头颈部恶性肿瘤。

[00135]可以治疗的增殖性疾病包括但不限于造血异常，例如白血病、淋巴瘤或红细胞增多症；眼病，例如糖尿病性视网膜病、黄斑变性、青光眼或色素性视网膜炎。可以治疗的炎性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、肺纤维变性、结节病样肉芽肿(sarcoidgranulomas)、牛皮癣或哮喘。

[00136]在一个实施方案中，可以使用Aβ肽片段治疗癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤。在其它实施方案中，可以使用本文所公开的Aβ肽片段治疗实体瘤。

[00137]在其它实施方案中，本文所述的Aβ肽片段可用于治疗癌症，包括但不限于下表2a中所列癌症。

Aβ肽片段的抗血管生成活性

[00138]虽然不受限于任何理论，但是有可能序列HHQKLVFF正是赋予抗血管生成活性的Aβ序列。

[00139]多项研究表明，细胞表面上的肝素和各种蛋白聚糖可与Aβ肽结合(Snow等，1995Arch.Biochem.Biophys.320，84-95；McLaurin等，2000Eur.J.Biochem.267，6353-61；McKeon J，HollandLA.2004Electrophoresis 25，1243-8)，并且有研究表明，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与AD脑内的淀粉样蛋白沉积物缔合(van Horssen等，2001Acta Neuropathol.(Berl).102，604-14)。硫酸肝素蛋白聚糖还通过允许特定的生长因子(例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF))与细胞表面相互作用，而在血管生成中发挥重要作用。因此，蛋白聚糖被认为可调节生长因子与受体的相互作用(Rusnati M，Presta M.1996Int.J.Clin.Lab.Res.26，15-23；Dougher等，1997GrowthFactors.14，257-68)。本文显示，加入外源肝素能够有效地使Aβ_1-42抗血管生成活性逆转。仅加入肝素引起轻微地血管生成抑制，这与表明过量肝素对血管生成抑制作用的研究是一致的。有研究指出，这种作用的机制是通过增加组织因子途径抑制剂的释放(Mousa SA，Mohamed S.2004 Thromb.Haemost.92，627-33)。

[00140]细胞表面蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)可与各种生长因子(包括VEGF和bFGF)结合并表现出活性(Iozzo RV，SanAntonio JD.2001J.Clin.Invest.108，349-55；Presta等，2005CytokineGrowth Factor Rev.16，159-78；Sanderson等，2005J.Cell Biochem.9月7日，(先期电子出版物))。Aβ有可能与这些蛋白聚糖结合，对生长因子与细胞的结合和相互作用产生影响。因此，当血管生成测定含有肝素结合性生长因子时，加入过量肝素可能起着结合到Aβ肽外部的作用，防止了它们与细胞表面结合，从而对抗Aβ的抗血管生成活性。或者，有研究表明，Aβ与VEGF上的肝素结合基序发生直接的相互作用(Yang等，2005J.Neurochem.93，118-27)；因此，Aβ与肝素的结合有可能阻止其与VEGF结合，逆转了Aβ的抗血管生成活性。肝素(和其它糖胺聚糖)还可能影响Aβ肽的构象性质，改变原纤维形成速率(Castillo等，1999J.Neurochem.72，1681-7；Cohlberg等，2002Biochemistry.41，1502-11)，从而提供不能阻止血管生成的肽。Aβ肽体外的抗血管生成活性似乎与其构象性质有关，因为含有较高β-折叠含量的Aβ制品是较有效的抗血管生成剂(Gebbink等，2000Biochim.Biophys.Acta.1502，16-30)。另外，肽的可溶性低聚体是特别抗血管生成的，然而原纤维形式则是无活性的(Paris等，2005Brain Res.Mol.Brain Res.136，212-30；Skovseth等，2005Blood 105，1044-51)，这表明为了抑制血管生成，Aβ肽中的特定残基需要暴露出来。

[00141]Aβ肽序列内对于赋予抗血管生成活性很重要的一个基序是推定蛋白聚糖结合区(HHQK)(Cardin，A.D.；Weintaub，H.J.R.1989Arteriosclerosis.9，21-32；Snow等，1995Arch.Biochem.Biophys.320，84-95；McLaurin等，2000Eur.J.Biochem.267，6353-61；McKeon等，2004Electrophoresis.25，1243-8)。已知蛋白聚糖在血管生成期间起着调节作用(Moon等，2005J.Cell Physiol.203，166-76；Tkachenko等，2005Circ.Res.96，488-500；Presta等，2005Cytokine Growth FactorRev.16，159-78)。同样地，多项研究表明硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在AD发病机制中的重要作用，这就表明干预这些分子与Aβ结合可以是治疗上有益的(Leveugle等，1994，Neuroreport.5，1389-92；Kisilevsky等，2002J.Mol.Neurosci.19，45-50)。

[00142]对于抗血管生成活性的另一个可能的重要序列是与HHQK基序相邻，向着C端部分的4个氨基酸(LVFF)。已知该区是组成β链的部分，因此对于肽的低聚反应很重要(Morimoto等，2004J.Biol.Chem.279，52781-8；Irie等，2005J.Biosci.Bioeng.99，437-47)。最近有研究表明，在Aβ_10-42的构象模型中，其高度疏水残基17-20暴露于二聚体中，而在另一项研究中则显示该区埋入原纤维体(fibrillarform)中(Mathura等，2005Biochem.Biophys.Res.Commun.332，585-92；Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期电子出版物))。

[00143]为了进一步研究Aβ可通过在细胞表面上阻止生长因子与蛋白聚糖结合而起作用的可能性，置换Aβ_12-28的推定蛋白聚糖结合序列HHQK上的三个残基。本文显示用天然氨基酸置换型GGQG或AAQA替换野生型HHQK，完全破坏野生型Aβ_12-28肽的抗血管生成作用。此外，通过用VEGF诱导血管生成的大鼠角膜微囊袋模型，证实了Aβ_12-28体内的抗血管生成功效。AD患者脑内的VEGF水平增加(Kalaria等，1998Brain Res.Mol.Brain Res.62，101-5；Tarkowski等，2002Neurobiol Aging.23，237-43)，但是这与脑血管形成增加无关(Buee等，1997Ann.N.Y.Acad.Sci.826，7-24)。因此，AD脑内Aβ的累积可导致VEGF活性的抑制。VEGF是神经营养性的，对于维持血管完整性很重要，还是脑卒中或头损伤后血管重塑的关键因子(Slevin等，2000Neuroreport 11，2759-64；Shore等，2004Neurosurgery.54，605-12)。Aβ在AD脑内对VEGF的拮抗作用可以解释为什么AD患者和AD转基因小鼠模型在脑卒中后恢复不良(Koistinaho等，2002Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，1610-5；Wen等，2004J.Biol.Chem.279，22684-92；Koistinaho M，Koistinaho J.2005Brain Res.Brain Res.Rev.48，240-50)。

[00144]本文所提供的实施例支持仅蛋白聚糖结合基序可能不足以诱发抗血管生成作用，需要紧接该序列的氨基酸(LVFF)以介导Aβ的抗血管生成活性的结论。有研究表明在Aβ低聚体的构象模型中，LVFF序列(氨基酸17-20)是肽的暴露区(Mathura等，2005Biochem.Biophys.Res.Commun.332，585-92)。

[00145]还观察到Aβ_34-42的促血管生成作用。在本文所述的网络实验(network assay)中观察到Aβ_34-42片段的促血管生成活性与之前曾观察到的低浓度下Aβ_1-40/42肽的促血管生成活性是一致的(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85；Cantara等，2004F.A.S.E.B.J.18，1943-5)。当形成单体和二聚体时，Aβ的折叠可使C端34-42序列暴露出来。随后该区可以埋入更高层次的低聚体或原纤维体中。Aβ_1-42原纤维最新的NMR研究证实，残基28-42是溶剂达不到的，而且即使在长时间后，主干酰胺也不会发生氘交换(Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期电子出版物))。因此，低浓度下Aβ_1-40/42肽的促血管生成作用可能是由其主要的单体或二聚体状态暴露出C端区的促血管生成基序所致(Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期电子出版物)；Fraser等，1994J.Mol.Biol.244，64-73；van Horssen等，2001Acta Neuropathol.(Berl).102，604-14；Rusnati，M；Presta，M.1996Int.J.Clin.Lab.Res.26，15-23；Dougher等，1997Growth Factors.14，257-68；Mousa等，2004Thromb.Haemost.92，627-33；Iozzo等，2001J.Clin.Invest.108，349-55；Presta等，2005Cytokine Growth Factor Rev.16，159-78；Sanderson等，2005J.Cell Biochem.9月7日，(先期电子出版物))。

联合疗法

[0001]一方面，为了治疗癌症、肿瘤或其它增殖性疾病，本文所公开的肽片段可与至少一种另外的化疗药物联用。另外的药物可与本文所公开的化合物联合或交替给药。药物可以形成同一组合物的部分，或者以单独的组合物在同一时间或不同时间给药。

[0002]第二治疗药的实例包括但不限于IL-12、类视色素、干扰素、血管生长抑素、内皮生长抑素、沙利度胺、凝血酶致敏蛋白-1、凝血酶致敏蛋白-2、卡托普利(captopryl)、抗肿瘤药物例如α干扰素、COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨蝶呤和泼尼松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和地塞米松)、PRO-MACE/MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤(w/leucovin rescue)、多柔比星、环磷酰胺、泰素、依托泊苷/氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)、长春新碱、长春碱、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、聚硫酸戊聚糖、血小板因子4、血管生长抑素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙利度胺、SP-PG和放射性药物。

[0003]其它实例包括具有抗有丝分裂作用的药物(抗有丝分裂抑制剂)，例如靶向细胞骨架组分的抗有丝分裂抑制剂，包括微管调节剂例如紫杉烷类(taxane)药物(例如泰素、紫杉醇、泰素帝、多西他赛)、鬼臼毒素或长春花属生物碱(长春新碱、长春碱)；抗代谢药(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、嘌呤类似物例如喷司他丁、甲氨蝶呤)；烷化剂或氮芥类(例如亚硝基脲、环磷酰胺或异环磷酰胺)；靶向DNA的药物例如蒽环霉素药类、阿霉素、多柔比星、盐酸表柔比星制剂或表柔比星；靶向拓扑异构酶的药物(拓扑异构酶抑制剂)例如依托泊苷；激素类和激素激动剂或拮抗剂例如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬及相关化合物)和雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、环丙孕酮或奥曲肽；靶向肿瘤细胞信号转导的包括抗体衍生物在内的药物例如曲妥单抗；烷化药物例如铂类药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂、伯尔定)或亚硝基脲；可能影响肿瘤转移的药物例如基质金属蛋白酶抑制剂；基因疗法和反义药物；抗体治疗药；海洋源的其它生物活性化合物例如膜海鞘素类(didemnin)例如aplidine；皮质类固醇；类固醇类似物，例如地塞米松；抗炎药物，包括非甾类药物(例如对乙酰氨基酚或布洛芬)或类固醇类及其衍生物，特别是地塞米松和镇吐药，包括5HT-3抑制剂(例如格拉司琼或昂丹司琼)。

[0004]第二治疗药的其它实例包括下表1a所公开的药物。

表1a：

化疗药物

                                           

-13-顺-维A酸	-环磷酰胺注射剂
		-2-氨基-6-巯基嘌呤	-Neulasta
-2-CdA	-纽密伽(Neumega)
		-2-氯脱氧腺苷	-Neupogen
-5-氟尿嘧啶	-Nilandron
		-5-FU	-尼鲁米特
-6-TG	-氮芥
		-6-硫鸟嘌呤	-Novaldex
-6-巯基嘌呤	-诺消灵(Novantrone)
		-6-MP	-奥曲肽
-Accutane	-醋酸奥曲肽
		-放射菌素-D	-Oncospar
-阿霉素	-硫酸长春新碱(Oncovin)
		-Adrucil	-地尼白介素2
-阿那格雷(Agrylin)	-Onxal
		-氢化可的松(Ala-Cort)	-奥普瑞白介素
-阿地白介素	-Orapred
		-阿仑单抗	-泼尼松制剂
-阿利维A酸	-奥沙利铂
		-Alkaban-AQ	-紫杉醇
-爱克兰	-帕米膦酸(Pamidronate)

-全反式维A酸	-0.1％阿利维A酸凝胶剂
		-α干扰素	-伯尔定
-六甲蜜胺	-泼尼松磷酸钠制剂
		-甲氨蝶呤	-PEG干扰素(PEG Interferon)
-氨磷汀	-培门冬酶
		-氨鲁米特	-Pegfilgrastim
-阿那格雷	-PEG-干扰素
		-安得乐(Anandron)	-PEG-L-天冬酰胺酶
-阿那曲唑	-苯丙氨酸氮芥(PhenylalanineMustard)
		-阿拉伯糖胞嘧啶	-川铂注射剂
-阿糖胞苷(Ara-C)	-川铂注射剂-AQ
		-Aranesp	-泼尼松龙
-阿可达	-泼尼松
		-瑞宁得	-Prelone
-阿诺新(Aromasin)	-丙卡巴肼
		-三氧化二砷	-重组人类红细胞生成素α
-天冬酰胺酶	-Proleukin
		-ATRA	-Prolifeprospan 20与卡莫司汀植入剂
-Avastin	-巯嘌呤
		-BCG	-雷洛昔芬
-BCNU	-Rheumatrex
		-贝伐单抗	-Rituxan
-贝沙罗汀	-利妥昔单抗
		-比卡鲁胺	-Roveron-A(干扰素α-2a)
-BiCNU	-Rubex
		-硫酸博来霉素	-盐酸红比霉素
-博来霉素	-善宁

-硼替佐米	-善宁LAR
		-白消安	-沙格司亭
-马利兰针(Busulfex)	-氢可琥钠制剂
		-C225	-甲强龙制剂
-亚叶酸钙	-STI-571
		-Campath	-链佐星
-Camptosar	-他莫昔芬
		-喜树碱-11	-Targretin
-卡培他滨	-泰素
		-Carac	-泰素帝
-卡铂	-Temodar
		-卡莫司汀	-替莫唑胺
-卡莫司汀糯米纸囊剂	-替尼泊苷
		-康士德	-TESPA
-CCNU	-沙利度胺
		-CDDP	-Thalomid
-CeeNU	-TheraCys
		-盐酸柔红霉素(Cerubidine)	-硫鸟嘌呤
-西妥昔单抗	-硫鸟嘌呤片剂
		-苯丁酸氮芥	-塞替派(Thiophosphoamide)
-顺铂	-塞替派粉针剂
		-亚叶酸(Citrovorum Factor)	-塞替派
-克拉屈滨	-TICE
		-可的松	-拓扑杀
-放线菌素粉针剂	-托泊替康
		-CPT-11	-托瑞米芬
-环磷酰胺	-曲妥单抗
		-氨鲁米特片剂	-维A酸

-阿糖胞苷	-Trexall
		-阿糖胞苷脂质体	-Trisenox
-阿糖胞苷粉针剂	-TSPA
		-环磷酰胺制剂	-VCR
-达卡巴嗪	-硫酸长春碱制剂
		-放射菌素D	-万珂(Velcade)
-Darbepoetin alfa	-凡必士
		-道诺霉素	-维A酸胶囊剂
-柔红霉素	-醋酸亮丙瑞林植入剂
		-盐酸柔红霉素	-长春碱
-柔红霉素脂质体	-硫酸长春碱
		-枸橼酸柔红霉素脂质体	-硫酸长春碱注射剂
-地塞米松	-长春新碱
		-泼尼松龙(Delta-Cortef)	-长春瑞滨
-泼尼松	-酒石酸长春瑞滨
		-地尼白介素2	-VLB
-脂质体阿糖胞苷注射剂	-VP-16
		-地塞米松	-卫萌
-醋酸地基米松	-适罗达
		-地塞米松磷酸钠	-链佐星粉针剂
-地塞米松磷酸钠(Dexasone)	-泽娃灵(Zevalin)
		-右雷佐生	-右雷佐生粉针剂
-DHAD	-诺雷德
		-DIC	-唑来膦酸
-Diodex	-Zometa
		-多西他赛	-卡氮芥糯米纸囊剂
-盐酸多柔比星脂质体	-甲磺酸依马替尼

-多柔比星	-GM-CSF
		-多柔比星脂质体	-戈舍瑞林
-羟基脲(Droxia)	-粒细胞集落刺激因子
		-DTIC	-粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
-氮烯咪胺(DTIC-Dome)	-氟甲睾酮制剂
		-醋酸甲泼尼龙(Duralone)	-曲妥单抗
-氟尿嘧啶(Efudex)	-地塞米松(Hexadrol)
		-Eligard	-克瘤灵
-Ellence	-六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)
		-奥沙利铂	-HMM
-爱施巴	-和美新粉针剂
		-Emcyt	-羟基脲(Hydrea)
-表柔比星	-Hydrocort Acetate
		-阿法依泊汀	-氢化可的松
-爱必妥(Erbitux)	-氢化可的松磷酸钠
		-欧文氏菌属L-天冬酰胺酶	-氢化可的松琥珀酸钠
-雌莫司汀	-Hydrocortone phosphate
		-氨磷汀(Ethyol)	-羟基脲
-凡毕复	-Ibritumomab
		-依托泊苷	-替伊莫单抗
-磷酸依托泊苷	-盐酸伊达比星(Idamycin)
		-Eulexin	-伊达比星
-雷洛昔芬(Evista)	-异环磷酰胺粉针剂
		-依西美坦	-IFN-α
-枸橼酸托瑞米芬(Fareston)	-异环磷酰胺
		-氟维司群(Faslodex)	-IL-2
-富马乐(Femara)	-IL-11

-非格司亭	-甲磺酸伊马替尼
		-氟尿苷	-达卡巴嗪(Imidazole Carboxamide)
-氟达拉滨(Fludara)	-干扰素α
		-氟达拉滨(Fludarabine)	-干扰素α-2b(PEG缀合物)
-Fluoroplex	-白介素-2
		-氟尿嘧啶	-白介素-11
-氟尿嘧啶(乳膏剂)	-甘乐能A(干扰素α-2b)
		-氟甲睾酮	-亚叶酸
-氟他胺	-留可然
		-亚叶酸	-白细胞素
-FUDR	-亮丙立德
		-氟维司群	-长春新碱(Leurocristine)
-G-CSF	-克拉屈滨
		-吉非替尼(Gefitinib)	-Liposomal Ara-C
-吉西他滨	-Liquid Pred
		-吉姆单抗奥佐米星	-洛莫司汀
-健择	-L-PAM
		-格列卫(Gleevec)	-L-沙可来新
-醋酸亮丙瑞林	-泼尼松(Meticorten)
		-醋酸亮丙瑞林贮库制剂	-丝裂霉素
-丙卡巴肼制剂	-丝裂霉素-C
		-Maxidex	-米托蒽醌
-氮芥	-M-Prednisol
		-盐酸氮芥	-MTC
-甲泼尼龙(Medralone)	-MTX
		-美卓乐	-氮芥(Mustargen)
-美格施	-氮芥(Mustine)

-甲地孕酮	-丝裂菌素制剂
		-甲醋酸地孕酮	-马利兰
-美法仑	-易瑞沙(Iressa)
		-巯嘌呤	-伊立替康
-美钠	-异维A酸
		-美钠针剂	-天冬酰胺酶
-甲氨蝶呤	-醋酸氢可的松
		-甲氨蝶呤钠	-L-天冬酰胺酶
-甲泼尼龙	-LCR
		-Mylocel
-来曲唑

[00146]用于本文所公开肽的测定法

[00147]可以采用本领域已知的血管生成测定法。参见例如美国专利申请2003/0077261A1(Paris等)，其中记载了大鼠主动脉环、牛、小鼠和人的血管生成测定法。

[00148]可以采用环微血管增生定量测定法，参见例如美国专利申请2003/0077261A1(Paris等)，其中用与奥林巴斯(OLYMPUS)BX60显微镜连接的数码摄像机，拍摄环微血管培养物，用Image ProPlus软件有选择性地检测增生区域。

[00149]可以采用内皮细胞迁移测定法，参见美国专利申请2003/0077261A1(Paris等)，其中采用改进的Boyden小室测定法(BDBioCoat MATRIGEL侵袭小室)，评价成人脑内皮细胞的迁移，参见Soker等1998、Nakamura等1997。

[00150]可以采用裸小鼠肿瘤异种移植物模型，参见例如美国专利申请2003/0077261A1(Paris等)，其中将A-549(人肺腺癌)和U87-MG(人成胶质细胞瘤)细胞植入8周龄的雌性裸小鼠体内。在用Aβ肽治疗前、治疗后和治疗期间，测量生长在动物内的肿瘤。在每项体内抗肿瘤研究结束之日，摘取肿瘤，定量测定微血管。

[00151]根据以下非限制性实施例，将更详尽地理解本发明。

实施例

(材料与方法在实施例1-7提供)

实施例1：细胞培养和试剂

[00152]所有体外实验都使用传代3-4次的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，VA)。将细胞培养在F12K培养基(ATCC，VA)中，培养基补充了10％胎牛血清(Invitrogen，CA)、0.1mg/ml肝素和0.03mg/ml内皮细胞生长补充剂(Sigma-Aldrich，MO)。在所有时间内，细胞都保存在37℃和5％CO₂的无菌细胞培养箱内。

实施例2：Aβ肽的制备

[00153]所有肽都购自Biosource，CA，需要时配制。为了使β-折叠结构的形成减到最少并促进α-螺旋二级结构，将1mg冻干肽溶于1ml 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)。使肽在化学通风橱中风干1小时后，在真空离心蒸发浓缩器(Thermo-Savant，NY)中再干燥30分钟。将所得透明薄膜重新悬浮于100％二甲亚砜(DMSO)至1mM浓度。随后将肽等分并保存在-80℃下。

实施例3：毛细血管形成测定法

[00154]将500μl培养基中的HUVEC(7.5x10⁴细胞/ml)接种至24孔板内的F12K培养基(ATCC，VA)的基质胶基底膜基质(Invitrogen，CA)的顶层，培养基含有4％血清(Invitrogen，CA)、0.1mg/ml肝素和0.03mg/ml内皮细胞生长补充剂(Sigma-Aldrich，MO)。使细胞与肽(或对照条件)孵育24小时。对照孔接收相同体积的用于稀释肽的溶媒(DMSO)。按一式三份进行网络形成实验，每孔随机选择至少2个视野，用四倍物镜拍照。用Image Pro Plus软件(MediaCybernetic，Inc.，MD)测量毛细血管长度。

实施例4：细胞增殖测定法

[00155]将HUVEC(5x10³细胞/孔)接种至96孔板。使细胞与肽(或对照条件)孵育24小时。按照生产商的方法(Biovision Inc.，CA)进行快速细胞增殖测定。

实施例5：细胞粘附测定法

将HUVEC(1x10⁴细胞/孔)接种至预包被有基底膜蛋白复合物的96孔板上。使细胞与肽(或对照条件)孵育2.5小时。对于细胞粘附测定，采用Innocyte细胞粘附测定法(Calbiochem，CA)和按照生产商说明书的方法。

实施例6：大鼠角膜微囊袋试验

[00156]按前述方法(Paris D，Townsend K，Quadros A，Humphrey J，Sun J，Brem S，Wotoczek-Obadia M，DelleDonne A，Patel N，Obregon DF，Crescentini R，Abdullah L，Coppola D，Rojiani AM，Crawford F，Sebti SM，Mullan M.(2004)Angiogenesis.7，75-85)，用仅含VEGF(200ng)，或者含有VEGF(200ng)与不同含量Aβ肽片段组合的hydron小珠，进行该项测定。植入后7天测定血管生长反应。测量血管增生的长度和宽度，运用公式LxW＝AI计算血管生成指数(AI)。大鼠用胶态炭灌注，摘出眼球，在10％缓冲福尔马林中固定。在奥林巴斯(Olympus)解剖显微镜下取出角膜，放在有晶体封固剂的载玻片上。

实施例7：统计分析

[00157]用ANOVA与用Scheffe或Bonferroni事后比较，对于Windows版本10.1用SPSS，进行统计分析。

实施例8：Aβ肽片段对毛细血管形成的作用

[00158]在实施例3所述测定中，检测不同的Aβ肽和肽片段抑制毛细血管网络形成的能力，包括1μM、5μM和10μM的Aβ_1-42、Aβ_1-40、Aβ_1-28、Aβ_12-28、Aβ_17-28、Aβ_25-35、Aβ_10-35、Aβ_10-16和Aβ_34-42。对于每个治疗组(n≥8)定量测定毛细血管总长度，用占对照治疗的百分比表示(图1)。

[00159]事后分析显示在5μM和10μM剂量下，对照与Aβ_1-40、Aβ_1-42、Aβ_1-28、Aβ_10-35和Aβ_12-28之间的显著性差异(P＜0.005)。所测肽中，Aβ_1-28、Aβ_12-28、Aβ_10-35、Aβ_1-40和Aβ_1-42活性最强。Aβ_25-35在5μM下略有活性，但在10μM没有活性，其它肽(Aβ_10-16、Aβ_17-28和Aβ_34-42)不显示任何抗血管生成活性(图1)。与之相反，Aβ_34-42以剂量依赖性方式促进血管生成。这些数据表示保持Aβ肽抗血管生成活性所需要的最小序列包括在残基12-28内。此外，Aβ_12-28片段抗血管生成，而17-28片段(缺失HHQK基序)无活性的观察结果表明，存在于残基13-16之间的蛋白聚糖结合区(HHQK)是抗血管生成活性所必需的。

实施例9：Aβ肽片段对细胞增殖和细胞粘附的作用

[00160]分别用实施例4和实施例5所述测定法，检测不同的Aβ肽片段对细胞增殖和细胞粘附到基底膜复合物上的抑制能力。

[00161]所有的肽治疗显著地抑制细胞增殖(P＜0.005)。ANOVA显示任何所测肽之间没有显著性的重要作用。事后检验法显示不同肽之间无显著性差异(P＞0.005)。虽然所有所测片段都能够抑制HUVEC的细胞增殖，但是不同肽之间在功效上没有明显差异(图2a)。然而，ANOVA和事后检验法显示，所测片段中都不能显著影响细胞粘附到包含层粘连蛋白、胶原IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白的基底膜复合物上(P＞0.005)(图2b)。因此，Aβ肽片段抗血管生成活性的差异可能与对细胞增殖或粘附的作用无关。

实施例10：肝素对毛细血管形成的作用

[00162]为了证实Aβ肽内的推定肝素结合序列的重要性，将肝素加到样品中，用实施例3所述毛细血管形成测定法，定量测定Aβ肽的抗血管生成活性。

[00163]定量测定每个治疗组(n≥8)的毛细血管总长度，用占对照治疗的百分比表示。事后分析显示以下情况的显著性差异：对照和所有治疗组之间(P＜0.001)、Aβ和Aβ+肝素500μg/ml之间(P＜0.001)、Aβ和Aβ+肝素1mg/ml之间(P＜0.001)。加入500μg/ml和1mg/ml的肝素有效地逆转由Aβ_1-42诱导的毛细血管形成抑制(图3)。仅加入肝素还引起轻微的血管生成抑制。

实施例11：蛋白聚糖结合区突变型Aβ肽片段对毛细血管形成的作用

[00164]因为加入肝素逆转Aβ_1-42的抗血管生成活性，所以推测肽内的蛋白聚糖结合区对赋予抗血管生成活性十分重要。为了验证这个假设，用氨基酸置换(存在于HHQK蛋白聚糖结合基序的3个氨基酸置换为GGQG或AAQA)制备成一种抗血管生成的肽片段(Aβ_1-28)，已知该氨基酸置换有效抑制Aβ与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合(McLaurin等，Eur.J.Biochem.2000，267，6353-61；Olofssen等，J.Biol.Chem 2005，10月7日，先期电子出版物)。然后，用实施例3所述毛细血管形成测定法，测定突变型Aβ肽片段的作用。

[00165]定量测定每个治疗组(n≥8)的毛细血管总长度，用占对照的百分比表示。ANOVA显示野生型Aβ_1-28显著的剂量依赖的重要作用(P＜0.001)，Aβ_1-28GGQGL(P＝0.566)或Aβ_1-28AAQAL(P＝0.380)则没有重要作用。事后分析显示野生型Aβ_1-28在1μM、5μM和10μM下有显著作用(P＜0.005)，但是突变型Aβ_1-28肽在任何测试剂量下都没有显著作用。

[00166]Aβ蛋白聚糖结合区的氨基酸置换完全破坏了Aβ_1-28肽的抗血管生成活性(图4)(见表2肽序列一览表)。

表2：10μM Aβ肽序列抗血管生成活性一览表

肽	氨基酸序列	抗血管生成？
			Aβ1-42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	是
Aβ1-40	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV	是
			Aβ12-28	VHHQKLVFFAEDVGSNK	是
Aβ17-28	LVFFAEDVGSNK	否
			Aβ10-35	YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM	是
Aβ25-35	GSNKGAIIGLM	否
			Aβ10-16	YEVHHQK	否
Aβ34-42	LMVGGVVIA	否
			Aβ1-28野生型	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK	是
Aβ1-28突变型1	DAEFRHDSGYEVGGQGLVFFAEDVGSNK	否
			Aβ1-28突变型2	DAEFRHDSGYEVAAQALVFFAEDVGSNK	否
片段1	HHHQKLVFF	是
			片段2	VHHQKLVII	否
片段3	VHHQKLVKK	否

实施例12：LVFF突变型Aβ肽片段对毛细血管形成的作用

[00167]用实施例3所述毛细血管形成测定法，通过测定始于HHQK序列由9个氨基酸组成的肽片段(表2，片段1-3)，来确定接近HHQK序列C端一侧VFF氨基酸序列的作用。

[00168]定量测定每个治疗组(n≥6)的毛细血管总长度，用占对照的百分比表示。ANOVA显示对于野生型(HHHQKLVFF)的显著性重要作用，但是对于突变型肽则无。事后分析显示野生型肽在1μM、5μM和10μM下有显著作用(P＜0.005)，但是LVFF突变型肽在任何测试剂量下都无显著作用。

[00169]这些结果都支持仅含有HHQK和VFF基序的肽序列才有效抑制毛细血管形成测定中血管生成的结论(图6)。然而，仅含有YEVHHQK序列的Aβ_10-16片段无活性，表明仅该区不足以具备抗血管生成活性。

实施例13：大鼠角膜微囊袋试验中Aβ_12-28肽片段的作用

[00170]为了确定体外表现出抗血管生成的Aβ_12-28肽片段是否体内也抗血管生成，用实施例6所述大鼠角膜微囊袋试验测定Aβ_12-28。使角膜微囊袋孵育7天。在对200ng VEGF、VEGF+0.5μg Aβ_12-28、VEGF+2.5μg Aβ_12-28和VEGF+5.0μg Aβ_12-28的反应中，对从大鼠角膜微囊袋试验得到的数据进行定量。ANOVA显示Aβ剂量显著性的重要作用，事后分析显示在5μg剂量下的显著性作用(P＜0.001)。血管生成指数用平均值+/-SEM表示。

[00171]这些结果支持在该体内测定法中Aβ_12-28能够剂量依赖性地抑制VEGF诱导的血管生成的结论(图7)，证实了得自体外实验的数据。

实施例14：Aβ_12-28、Aβ_12-28突变型和Aβ_13-20在大鼠角膜微囊袋试验中的作用

[00172]按照实施例6所述大鼠角膜微囊袋试验方法，测试不同Aβ肽片段和突变型的作用。对得自响应200ng VEGF、5.0μg Aβ_12-28GGQGL突变型肽和0.5μg、2.5μg和5.0μg Aβ_12-28和Aβ_13-20(HHH-肽或HHQKLVFF)反应的测定数据进行定量。Aβ_12-28GGQGL突变型在体内对抑制血管生成无活性。较短的HHH-肽在体内表现出抗血管生成(P＜0.05，以剂量依赖性方式)。结果见图8。图9是毛细血管的四倍放大照片。

Claims (51)

1.一种抗血管生成Aβ肽片段或其变异体或同源物，其中所述片段的长度介于8和39个氨基酸之间。

2.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸。

3.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ_1-28、Aβ_10-35、Aβ_12-28或Aβ_13-20。

4.权利要求3的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ_12-28。

5.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ_13-20。

6.权利要求5的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述Aβ_12-28片段包含氨基酸序列HHQKLVFF或其变异体或同源物。

7.权利要求5的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述Aβ_13-20肽片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其变异体或同源物。

8.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述变异体或同源物具有与天然Aβ肽片段约80.0％至约99.9％的氨基酸同一性。

9.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是含有至少一个氨基酸置换的变异体。

10.权利要求9的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述氨基酸置换是非天然氨基酸或氨基酸类似物。

11.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，还另包含接头。

12.权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段与第二肽或蛋白质连接。

13.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1的抗血管生成Aβ肽片段和药学上可接受的载体。

14.权利要求13的药物组合物，其中所述药物组合物是控释剂型。

15.权利要求14的药物组合物，其中所述控释剂型是聚合物骨架片。

16.一种治疗由病理性血管生成介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予有需要的受治疗者有效量的生物活性Aβ肽片段或其变异体或同源物，其中所述片段的长度介于8和39个氨基酸之间。

17.权利要求16的方法，其中所述片段的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸。

18.权利要求16的方法，其中所述片段是Aβ_1-28。

19.权利要求16的方法，其中所述片段是Aβ_10-35。

20.权利要求16的方法，其中所述片段是Aβ_12-28。

21.权利要求16的方法，其中所述片段是Aβ_13-20。

22.权利要求16的方法，其中所述片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其变异体或同源物。

23.权利要求16的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

24.权利要求16的方法，其中所述疾病或病症是增殖性疾病。

25.权利要求16的方法，其中所述疾病或病症是炎性疾病。

26.权利要求16的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。

27.权利要求16的方法，其中所述受治疗者是人。

28.权利要求16的方法，其中所述生物活性Aβ肽片段通过选自以下的途径给予：口服、胃肠外、静脉内、动脉内、肺部、黏膜、局部、经皮、皮下、肌内、直肠、颅内、脑室内、大脑内、阴道内、子宫内、鞘内或腹膜内给药。

29.权利要求16的方法，其中所述生物活性Aβ肽片段与药学上可接受的载体联合给予受治疗者。

30.权利要求16的方法，其中所述Aβ肽片段是以控释剂型给予受治疗者。

31.权利要求16的方法，其中所述控释剂型包括聚合物骨架片。

32.权利要求16的方法，该方法还包括一种或多种另外的治疗药与生物活性Aβ肽片段联合或交替给药。

33.权利要求32的方法，其中所述另外的治疗药是化疗药物。

34.权利要求16的方法，其中所述Aβ肽片段作为融合肽给予患者。

35.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予有需要的受治疗者有效量的生物活性Aβ肽片段或其变异体或同源物，其中所述片段的长度介于8和39个氨基酸之间。

36.权利要求35的方法，其中所述片段的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸。

37.权利要求的35方法，其中所述片段选自Aβ_1-28、Aβ_10-35、Aβ_12-28和Aβ_13-20。

38.权利要求37的方法，其中所述片段是Aβ_13-20。

39.权利要求38的方法，其中所述Aβ_13-20肽片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其变异体或同源物。

40.权利要求35的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、结肠癌和非霍金奇淋巴瘤。

41.权利要求35的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。

42.权利要求35的方法，其中所述受治疗者是人。

43.权利要求35的方法，该方法还包括给予一种或多种另外的治疗药。

44.权利要求43的方法，其中所述另外的治疗药是化疗药物。

45.权利要求44的方法，其中所述化疗药物选自烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇抑制剂。

49.一种鉴定干预Aβ诱导的血管生成抑制的化合物的方法，该方法包括(a)使能够进行血管生成的第一生物样品与试验化合物、生物活性量的Aβ肽片段和血管生成药接触；和(b)测定发生在第一生物样品中血管生成的程度。

50.权利要求49的方法，该方法还包括(c)单独使能够进行血管生成的第二生物样品与生物活性量的Aβ肽片段和血管生成药接触；(d)测定发生在第二生物样品中血管生成的程度和(e)将发生在第一生物样品中血管生成的程度与发生在第二生物样品中的血管生成的程度进行比较。

51.抗血管生成Aβ肽片段或其变异体或同源物，任选与药学上可接受的载体一起在制备用于治疗病理性血管生成相关疾病或病症的药物中的用途，其中所述片段的长度介于8和39个氨基酸之间。

52.权利要求51的用途，其中所述片段是包含氨基酸序列HHQKLVFF的Aβ_1-28片段或其变异体或同源物。

53.权利要求51的用途，其中所述肽片段具有氨基酸序列HHQKLVFF或其变异体或同源物。

54.权利要求51的用途，其中所述药学上可接受的载体适于：口服、胃肠外、静脉内、动脉内、肺部、黏膜、局部、经皮、皮下、肌内、直肠、颅内、脑室内、大脑内、阴道内、子宫内、鞘内或腹膜内给药。

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