ES2235926T3 - Ensamblaje globular de proteina beta amiloide y sus usos. - Google Patents
Ensamblaje globular de proteina beta amiloide y sus usos.Info
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Abstract
Una estructura oligomérica â-amiloide no fibrilar soluble aislada que comprende de 13 a aproximadamente 24 proteínas â-amiloides, que no contiene un agente de reticulación exógeno añadido y que exhibe actividad neurotóxica.
Description
Ensamblaje globular de proteína \beta amiloide
y sus usos.
La presente invención se refiere a una nueva
composición de material, ligandos de demencia derivados de
beta-amiloide (LDDA). Los LDDA comprenden un péptido
\beta-amiloide ensamblado en estructuras
oligoméricas globulares no fibrilares solubles que son capaces de
activar procesos celulares específicos. La invención proporciona
también métodos para ensayar la formación, presencia, unión a
proteína receptor y actividades celulares de los LDDA. Se describen
también compuestos que bloquean la formación o actividad de los
LDDA, y métodos de identificación de dichos compuestos. La formación
y actividad de LDDA son relevantes entre otras cosas para el
aprendizaje y la memoria. La modulación de la formación o actividad
de LDDA puede emplearse por tanto según la invención en el
tratamiento de trastornos del aprendizaje y la memoria, así como
otras enfermedades, trastornos o afecciones que son debidos a los
efectos de los LDDA.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad
neurodegenerativa progresiva caracterizada por distintas patologías,
incluyendo haces neurofibrilares, placas neuríticas, atrofia
neuronal, reducción dendrítica y muerte neuronal. Desde una
perspectiva histórica, el diagnóstico definitivo de la enfermedad de
Alzheimer se ha basado siempre en la identificación de marcas
patológicas específicas, es decir los haces neurofibrilares que
representan el citoesqueleto colapsado de neuronas muertas y
moribundas, y las placas neuríticas que son depósitos extracelulares
de diversos compuestos de proteína, lípido, carbohidrato y sal, cuyo
componente proteico primario es un péptido de 39-43
residuos conocido como \beta-amiloide.
Desde el punto de vista del impacto de la
enfermedad, sin embargo, son más significativos los síntomas
manifestados en la enfermedad de Alzheimer, es decir, pérdida de
memoria, erosión de las funciones cognitivas y cambios
significativos de personalidad y comportamiento. Subyacentes a estos
cambios sintomáticos se encuentran mecanismos celulares específicos
que causan el malfuncionamiento de células nerviosas, y
eventualmente su degeneración y muerte. Estos mecanismos celulares
operan indudablemente en un entorno de fondo que proporciona
variablemente cierto nivel de protección, o que ejerce efectos de
contribución y exacerbación. El resultado es una curva de
distribución de incidencia/edad muy amplia, con pocos indicios de
los estudios de población que apunten a causas específicas.
La genética molecular representa una esfera de
estudios de la que emerge una clara descripción de la enfermedad de
Alzheimer familiar. Como se describe con más detalle a continuación,
resulta ahora evidente por estudios que identifican mutaciones en 3
proteínas diferentes, PPA y las presenilinas 1 y 2, que la ruta
final común que conduce a la enfermedad de Alzheimer es la
producción aumentada de \beta-amiloide
1-42 (así como \beta-amiloide
1-43), que ocurre en todas estas mutaciones de EA
familiar. Esto es particularmente notable, porque los LDDA, el foco
central de la invención descrita en la presente memoria, se forman
sólo como entidades estables a partir de esta forma más larga de
amiloide, y no a partir de la forma más corta más prevalente
A\beta 1-40.
En 1984, Glenner y Wong tuvieron éxito en el
aislamiento e identificación del amiloide cerebrovascular asociado a
la enfermedad de Alzheimer (Glenner et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 120, 885-890,
1984a). Posteriormente, los mismos péptidos de 39-43
residuos ahora conocidos como \beta-amiloide se
identificaron como el componente proteico mayoritario de las placas
neuríticas de la enfermedad de Alzheimer (Glenner et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 122,
1131-1135, 1984b; Masters et al., EMBO
J., 4, 2757-2764, 1985a; Masters et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,
4245-4249, 1985b). Esta fue la primera vez que se
ligó una molécula discreta a la enfermedad de Alzheimer, una
enfermedad que hasta ese momento se había caracterizado sólo por
descripciones de neuroanatomía y neuropatología. El
\beta-amiloide se identificó también como el
componente de placa en cerebros de individuos con síndrome de Down
(Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun,
122, 1131-1135, 1984b; Masters et al.,
EMBO J., 4, 2757-2764, 1985a; Masters
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,
4245-4249, 1985b), conduciendo a la sugerencia de
que el gen que lo codifica podría existir en el cromosoma 21. Para
1987, una serie de grupos habían utilizado la información de
secuencia del \beta-amiloide y técnicas de
genética molecular para validar esa sugerencia, identificando el gen
de la proteína precursora de amiloide (PPA) (Kang et al.,
Nature, 325, 733, 1987; Tanzi et al.,
Science, 235, 880-884,
1987).
1987).
El gen de la PPA es un gen multiexónico grande
que se ayusta diferencialmente en una serie de PPA (revisado por
Selkoe en Annual Review of Neuroscience, Cowan (Ed.),
17, ix + 623 p, 489-517, 1994). Las proteínas
son proteínas transmembrana grandes ahora conocidas por ser
procesadas mediante varias rutas, una o más de las cuales pueden
generar \beta-amiloide. Los estudios iniciales del
procesamiento de PPA habían sugerido que la formación de
\beta-amiloide no era un proceso normal (Esch
et al., Science, 248,
1122-1124, 1990; Sisodia et al.,
Science, 248, 492-495, 1990), aunque
estudios posteriores en células cultivadas y el análisis de suero y
fluido cerebroespinal han mostrado que la formación de
\beta-amiloide ocurre como un proceso normal en
muchos tipos celulares, aunque su formación puede no representar una
ruta global predominante.
Los estudios genéticos clave de ADN de individuos
aquejados de inicio temprano de la enfermedad de Alzheimer familiar
revelaron que las mutaciones en un solo gen, este mismo gen de la
PPA, eran las causantes de esta forma muy grave de la enfermedad. De
forma interesante, se encontró que varias mutaciones diferentes en
el gen de la PPA incluían tres sustituciones de residuo individual
diferentes en Val 717, cuatro residuos cadena abajo de la
terminación C del \beta-amiloide
1-42 (Goate et al., Nature,
349, 704-706, 1991;
Chartier-Harlan et al., Nature,
353, 844-846, 1991; Murrell et al.,
Science, 254, 97-99, 1991), y una
mutación de dos residuos (670-671) inmediatamente
cadena arriba de la terminación N del
\beta-amiloide, asociadas al inicio temprano de
enfermedad de Alzheimer familiar en una familia sueca (Mullan et
al., Nature Genetics 1, 345-347,
1992). Cuando un vector que codifica el ADNc del gen de la PPA
mutante sueco se transfectó a estirpes celulares para evaluar el
procesamiento de la PPA, se encontró que se formaba
seis-ocho veces más
\beta-amiloide, en comparación con los niveles de
PPA tipo silvestre (Citron et al., Nature, 360,
672-674, 1992; Cai et al., Science,
259, 514-516, 1993). Se demostró también que
los extractos de tejido cerebral que contenían actividades proteasa
cerebral humana nativa fueron capaces de procesar un sustrato
octapeptídico fluorogénico que comprendía la mutación sueca más de
100 veces más rápido que el correspondiente sustrato basado en la
secuencia de tipo silvestre (Ladror et al., J. Biol.
Chem., 269, 18422-18428, 1994). Estos
resultados sugieren que el mecanismo mediante el que la mutación
sueca causa el inicio temprano de la enfermedad de Alzheimer
familiar implica una sobreproducción sustancial de
\beta-amiloide. Se habían realizado también
estudios similares de formación de amiloide en células transfectadas
con el mutante 717 de PPA, pero los niveles de
\beta-amiloide producidos no fueron diferentes de
los niveles producidos por PPA de tipo silvestre. Esto condujo a
especulaciones mecanísticas de que algo distinto de la producción de
\beta-amiloide fuera patogénico para estas
mutaciones. Una evaluación más detallada del procesamiento del
mutante 717 de PPA y del mutante sueco de PPA por Younkin y
colaboradores (Suzuki et al., Science, 264,
1336-1340, 1994) proporcionó una visión unificada de
estos casos de enfermedad de Alzheimer genética. En este estudio, no
sólo se evaluaron los niveles totales de producción de
\beta-amiloide, sino que se analizaron también las
longitudes específicas de los péptidos
\beta-amiloides producidos. Los resultados
confirmaron que la mutación 717 conducía a más que duplicar la
relación de \beta-amiloide 1-42 a
\beta-amiloide 1-40 (un péptido
altamente soluble en condiciones fisiológicas) aunque los niveles de
\beta-amiloide totales no cambiaran. Las
recientemente descubiertas mutaciones en presenilina 1 y 2 de la
enfermedad de Alzheimer familiar en genes que residen en el
cromosoma 14 (Sherrington et al., Nature, 375,
754-758, 1995) y el cromosoma 1
(Levy-Lahad et al., Science,
269, 970-973, 1995), respectivamente, se han
ligado también a una sobreproducción significativa de
\beta-amiloide 1-42. (Mann et
al., Annals of Neurology, 40,
149-156, 1996; Schuener et al., Nature
Medicine, 2, 864-870, 1996). Basándose en
estos descubrimientos, parece que el proceso patogénico mediado por
estas distintas mutaciones de la enfermedad de Alzheimer familiar es
la producción de mayores niveles de \beta-amiloide
1-42. Esta es la forma de amiloide que agrega más
fácilmente (Snyder et al., Biophys. J., 67,
1216-1228, 1994), que siembra la agregación del
\beta-amiloide para formar placas neuríticas
(Roher et al., Neurochem., 61,
1916-1926, 1993; Tamaoka et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 205, 834-842,
1994) y, como se describe en la presente memoria, la forma que
inesperadamente forma ensamblajes estables de orden superior
denominados "LDDA". El documento WO 98/33815 da a conocer LDDA
que comprenden de 3 a aproximadamente 12 monómeros
\beta-amiloide 1-42
(A\beta1-42).
(A\beta1-42).
El \beta-amiloide es el
componente proteico mayoritario de las placas, comprende más de un
70% de la proteína total. Sin embargo, están también presentes otros
componentes proteicos, incluyendo
\alpha1-antiquimotripsina (ACT), proteoglicanos de
sulfato de heparina (HSPG), apolipoproteínas E y J,
butirilcolinesterasa (BChE), S-100B, y varios
componentes complementarios. Aunque la importancia de estos
componentes en el inicio y la progresión de la enfermedad de
Alzheimer no se ha establecido, la implicación de las isoformas de
apo E en la enfermedad se ha establecido mediante los estudios
genéticos de Roses y colaboradores (Strittmatter et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
1977-1981, 1993), que descubrieron que un
polimorfismo en el gen de apolipoproteína E, es decir apo E4, se
correlacionaba con un inicio más temprano de la enfermedad de
Alzheimer en un gran conjunto de casos de enfermedad de Alzheimer
familiar de inicio tardío. Estudios posteriores han confirmado que
grupos de individuos con apo E4 tienen un riesgo significativamente
mayor de enfermedad de Alzheimer, y que el inicio de la enfermedad
de Alzheimer es aproximadamente paralelo a la dosificación génica de
apo E4. A nivel mecanístico, los estudios han revelado que la apo E4
se une con menor afinidad al \beta-amiloide que la
apo E3 o la apo E2, isoformas que están asociadas a un inicio
posterior de la enfermedad de Alzheimer. Se ha sugerido que estas
isoformas pueden ejercer un efecto protector mediante una
eliminación más eficaz de depósitos de
\beta-amiloide 1-42 (Ladu et
al., J. Biol. Chem., 269,
23403-23406, 1994; Ladu et al., J. Biol.
Chem., 270, 9039-9042, 1995).
El papel de los demás componentes de la placa no
está tan claro, aunque estudios recientes (Oda et al.,
Exptl. Neurology, 136, 22-31, 1995)
han mostrado que la apo J (clusterina) puede potenciar
significativamente la toxicidad del \beta-amiloide
1-42 agregado in vitro. Se ha reseñado
también que el HSPG potencia la toxicidad del
\beta-amiloide 1-40 cuando se
inyecta en cerebro de rata (Snow et al., Soc. Neurosci.
Abstr., 18, 1465, 1992). Wright et al. (Ann.
Neurol. 34, 373-384, 1993) demostraron
que las placas amiloides de cerebro con enfermedad de Alzheimer
contienen niveles significativos de BChE, mientras que las placas
amiloides de individuos ancianos no demenciados no. La proteína
inflamatoria en fase aguda ACT está también potenciada en cerebro
con enfermedad de Alzheimer, y es conocida por asociarse con los 16
residuos N-terminales del \beta-amiloide.
Ma et al. (Ma et al., Nature, 372,
92-94, 1994) han reseñado que la ACT puede potenciar
la agregación de \beta-amiloide
1-42, y estos autores especulan que la agregación
potenciada contribuye a su neurotoxicidad.
Más allá de las placas y haces que son las marcas
de la enfermedad de Alzheimer, resulta evidente que se han inducido
una serie de respuestas celulares, tanto en neuronas como en células
gliales acompañantes. A nivel bioquímico, resulta evidente la
hiperfosforilación de la proteína tau, que resulta de la
perturbación del balance de quinasa/fosfatasa. A nivel
transcripcional, se activan una variedad de genes para producir un
espectro de proteínas normalmente no presentes o presentes sólo a
niveles inferiores en el cerebro. Existen también evidencias
significativas de que se han activado procesos inflamatorios. En
particular, se ha documentado que se induce la fosforilación tau por
el \beta-amiloide 1-42 agregado en
células SH-SY5Y diferenciadas (Lambert et
al., J. Neurosci. Res., 39,
377-384, 1994), y este resultado se ha confirmado en
un informe más reciente por Busciglio et al. (Neuron,
14, 879-888, 1995), en el que el
\beta-amiloide activaba la fosforilación tau en
neuronas primarias incubadas de hipocampo de
rata.
rata.
El mecanismo mediante el que el
\beta-amiloide 1-42 causa la
enfermedad de Alzheimer no se ha elucidado, pero la bibliografía
contiene más de 200 estudios de la neurotoxicidad del
\beta-amiloide, muchos de los cuales se han
revisado recientemente (por ejemplo, Yankner et al.,
Neuron, 16, 921-932, 1996; Iversen,
et al., Biochemical Journal, 311,
1-16, 1995). El panorama de consenso es que para que
el \beta-amiloide sea tóxico debe ensamblarse en
estructuras fibrilares (Pike et al., J. Neurosci.,
13, 1676-1687, 1993). Las soluciones que
contienen sólo \beta-amiloide monomérico se ha
demostrado repetidamente que no tienen un efecto dañino sobre
neuronas en cultivo. Además, algunos estudios han correlacionado la
formación de fibrillas que contienen hoja \beta de amiloide con el
momento y el grado de toxicidad utilizando técnicas tales como
dicroísmo circular y microscopía electrónica (Simmons et al.,
Molecular Pharmacology, 45, 373-379,
1994). Un estudio concluyó explícitamente que el
\beta-amiloide debe existir en forma fibrilar para
que sea tóxico (Lorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, 12243-12247, 1994). A pesar de
este consenso respecto a la estructura y actividad del
\beta-amiloide, continúa habiendo un problema de
reproducibilidad del trabajo experimental publicado que implica la
toxicidad del amiloide (Brining, Neurobiology of Aging,
18, 581-589, 1997) y la amplia variabilidad
de la actividad obtenida con diferentes lotes de amiloide, o incluso
el mismo lote de amiloide manejado de modos ligeramente diferentes,
a pesar de la composición química idéntica (May et al.,
Neurobiology of Aging, 13, 1676-1687,
1993). Esto ha planteado preguntas respecto a las estructuras
precisas del \beta-amiloide que son responsables
de su actividad.
La presente invención busca superar los problemas
de la técnica anterior. En consecuencia, es un objeto de la presente
invención proporcionar una nueva composición de material, péptido
\beta-amiloide ensamblado en estructuras
oligoméricas globulares no fibrilares solubles (LDDA), que
inesperadamente son neurotóxicas. Estos y otros objetos y ventajas
de la presente invención, así como rasgos inventivos adicionales,
resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción.
La Figura 1 es una imagen generada por ordenador
de un gel de poliacrilamida teñido con plata barrido por
densitómetro que muestra la electroforesis de LDDA, con una banda
primaria correspondiente a aproximadamente 30 kDa, una banda menos
abundante correspondiente a aproximadamente 17 kDa y ninguna
evidencia de fibrillas ni agregados.
La Figura 2 es una imagen generada por ordenador
de un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie
barrido por densitómetro que muestra la electroforesis de LDDA, con
una banda primaria (doblete superior) correspondiente a un tamaño de
aproximadamente 17 a aproximadamente 22 kDa, y con otra banda (banda
oscura inferior) que indica abundante monómero de 4 kDa presente,
presuntamente un producto de degradación. Carriles: primero,
marcadores de peso molecular; segundo, preparación de LDDA; tercero,
carga mayor de preparación de LDDA.
La Figura 3 es una imagen generada por ordenador
representativa de análisis por MFA de la "fracción 3" que
contiene LDDA (fraccionado en una columna de filtración de gel
Superdex 75).
La Figura 4 es una imagen generada por ordenador
de un gel en gradiente de SDS-poliacrilamida teñido
con Coomasie barrido por densitómetro de LDDA preparados mediante
coincubación con clusterina (carril A) o medio F12 frío (carril B),
y de LDDA preparados mediante coincubación con clusterina y que
pasaron a través de una membrana Centricon de 10 kDa de corte
(carril C) o que se retuvieron por una membrana Centricon de 10 kDa
de corte (carril D); PM, marcadores de peso molecular.
La Figura 5 es una gráfica de la concentración de
LDDA medida como concentración de \beta-amiloide
1-42 (nM) frente al % de células muertas para
secciones de cerebro de ratón tratadas con las preparaciones de
LDDA.
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
la reducción del % de MTT para células PC12 control no expuestas a
LDDA ("cont"), células PC12 expuestas a clusterina sola ("apo
J"), células PC12 expuestas a A\beta monomérica
("A\beta") y células PC12 expuestas a
\beta-amiloide coagregado con clusterina y
envejecidas un día ("A\beta:apo J").
La Figura 7 es un FACScan que muestra la
intensidad de fluorescencia (0-170) frente a los
eventos (0-300) para células B103 no expuestas a
LDDA (pico sin sombrear) y células B103 unidas a LDDA marcados
fluorescentemente (pico sombreado).
La Figura 8 es un FACScan que muestra la
intensidad de fluorescencia (0-200) frente a los
eventos (0-300) para células de hipocampo no
expuestas a LDDA (pico sin sombrear, "LDDA-") y células de
hipocampo unidas a LDDA marcados fluorescentemente (pico sombreado,
"LDDA+").
La Figura 9 es un gráfico de barras del
porcentaje máximo de unión de LDDA o de muerte provocada por LDDA
para células B103 que no se han expuesto ("-") o se han
coexpuesto ("+") a los péptidos liberados por la tripsinación
de células B103.
La Figura 10 es una gráfica de la concentración
relativa de LDDA frente al % de células muertas para secciones de
cerebro de ratones tratadas con las preparaciones de LDDA. Para
determinar la concentración relativa, se empleó una concentración
inicial de proteína A\beta 10 \muM para formar LDDA en el punto
de datos más alto (punto "16"), ésta se diluyó posteriormente a
½ (punto "8") y ¼ (punto "4"), y similares.
La Figura 11 es un gráfico de barras que muestra
la densidad óptica obtenida en el ensayo ELISA de unión de LDDA, en
el que se coincubaron células B103 con LDDA y anticuerpo 6E10 (barra
"células, LDDA, 6E10"), se coincubaron células B103 con LDDA y
células (barra "células, LDDA"), y se coincubaron células B103
con anticuerpo 6E10 (barra "células, 6E10"), se incubaron
células B103 solas (barra "células"), se incubó anticuerpo 6E10
solo (barra "6E10") o se leyó la densidad óptica del diluyente
(barra "blanco").
La Figura 12 es un gráfico de barras del % de
células muertas en ratones fyn +/+ (tipo silvestre,
"Fyn+"; barras rayadas) o fyn -/- (con eliminación
genética, "Fyn-"; barras sólidas) no tratados ("medio") o
puestos en contacto con LDDA ("LDDA").
La Figura 13 es una gráfica de la concentración
de A\beta (\muM) frente a glía activada (número) obtenida tras
la incubación de astrocitos con LDDA (rombos blancostriángulos
negros) o A\beta 17-42 (círculos negros).
La Figura 14 es una gráfica del tiempo (minutos)
frente al % de amplitud de espiga del cuerpo celular de línea base
para ratones control no tratados con LDDA (triángulos negros) o
ratones tratados con LDDA (cuadrados negros).
La Figura 15 es una gráfica del tiempo (minutos)
frente a la amplitud media de espiga para secciones de hipocampo de
rata control no expuestas a LDDA (rombos negros) frente a secciones
de hipocampo de rata expuestas a LDDA (cuadrados negros).
La Figura 16 es una imagen generada por ordenador
de un gel de SDS-poliacrilamida con
tris-tricina al 16,5% barrido por densitómetro
(Biorad) que muestra un intervalo de LDDA solubles oligoméricos
(marcados "LDDA") y \beta-amiloide dimérico
(marcado "dímero"), y monomérico (marcado "monómero").
Carriles: primero, patrones de peso molecular Mark XII
teñidos con plata (Novex, San Diego, California); segundo, LDDA
teñidos con plata; tercero, transferencia Western del segundo carril
utilizando el anticuerpo monoclonal 26D6 (Sibia Neurosciences, San
Diego, California).
La Figura 17 es una imagen generada por ordenador
de un análisis por MFA de LDDA. La imagen sustractiva de vista en
planta muestra una vista de gran aumento (2,0 \mum x 2,0 \mum)
de moléculas de \beta-amiloide agregadas que se
han depositado sobre mica recién cortada.
La invención comprende una nueva composición de
material, denominado ligandos de demencia derivados de
\beta-amiloide o ligandos difusibles derivados de
\beta-amiloide (LDDA). Los LDDA consisten en
péptido \beta-amiloide ensamblado en estructuras
oligoméricas no fibrilares solubles que son capaces de activar
procesos celulares específicos. Otro aspecto de la invención
consiste en métodos de ensayo de la formación, presencia, unión a
proteína receptor y actividades celulares de los LDDA. La invención
comprende además métodos de ensayo y métodos de identificación de
compuestos que modulan (por ejemplo aumentan o reducen) la formación
y/o actividad de los LDDA. Dichos compuestos pueden emplearse en el
tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones debidos a los
efectos de los LDDA.
Se ha descubierto que en muestras neurotóxicas de
\beta-amiloide no sólo existen estructuras
fibrilares, sino que inesperadamente existen también algunas
estructuras de proteína globular que parecen ser responsables de la
neurotoxicidad. Utilizando nuevos métodos, se han generado como se
describe en la presente memoria muestras que contienen
predominantemente estos ensamblajes de proteína globular solubles y
sin estructuras fibrilares. En muestras heterogéneas preparadas
mediante varios métodos, la retirada de las formas fibrilares
mayores de \beta-amiloide mediante centrifugación
no elimina estos ensamblajes globulares solubles de
\beta-amiloide en las fracciones sobrenadantes.
Estas fracciones sobrenadantes exhiben una neurotoxicidad
significativamente mayor que las muestras de
\beta-amiloide no fraccionadas agregadas en
condiciones de la bibliografía. Estas nuevas e inesperadas formas
globulares neurotóxicas solubles se designan en la presente memoria
como ligandos de demencia derivados de
\beta-amiloide, ligandos difusibles derivados de
\beta-amiloide (LDDA), estructuras oligoméricas
\beta-amiloides no fibrilares solubles o
simplemente estructuras oligoméricas. Las muestras de
\beta-amiloide que se habían "envejecido" en
condiciones estándar de la bibliografía (por ejemplo, Pike et
al., J. Neurosci., 13, 1676-1687,
1993) durante más de tres semanas perdieron su neurotoxicidad,
aunque estas muestras contienen predominantemente estructuras
fibrilares con pocos o ningún LDDA. El descubrimiento de que los
LDDA globulares son neurotóxicos es particularmente sorprendente,
puesto que el pensamiento actual mantiene que son las estructuras
fibrilares las que constituyen la forma tóxica del
\beta-amiloide (Lorenzo et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12243-12247,
1994; Howlett et al., Neurodegen., 4,
23-32, 1995).
Los LDDA pueden formarse in vitro. Cuando
se diluye una solución (por ejemplo una solución en DMSO) que
contiene \beta-amiloide 1-42
monomérico (u otro \beta-amiloide apropiado, como
se describe adicionalmente en la presente memoria), en un medio de
cultivo de tejido frío (por ejemplo medio de cultivo de células
F12), después se deja incubar aproximadamente a 4ºC durante
aproximadamente 2 a aproximadamente 48 horas, y se centrifuga
durante aproximadamente 10 minutos aproximadamente a 14.000 g a una
temperatura de 4ºC, la fracción sobrenadante contiene glóbulos
oligoméricos solubles pequeños que son altamente neurotóxicos, por
ejemplo en cultivos de células neuronales y secciones de cerebro.
Los LDDA pueden formarse también mediante coincubación de
\beta-amiloide con ciertos agentes apropiados, por
ejemplo clusterina (una proteína de placa senil que es también
conocida como ApoJ), así como mediante otros métodos como se
describen en la presente memoria.
Por tanto, en particular, la presente invención
proporciona una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada. La
estructura oligomérica así aislada no contiene un agente de
reticulación añadido exógeno. La estructura oligomérica es
deseablemente estable en ausencia de cualquier reticulante.
Puede llevarse a cabo un análisis por microscopía
de fuerzas atómicas (MFA) como es conocido en la técnica y se
describe en la presente memoria, por ejemplo utilizando un
microscopio de fuerzas atómicas Digital Instruments como se describe
en el ejemplo 3. La MFA de dicha fracción sobrenadante
(concretamente una fracción sobrenadante de la que se han retirado
las estructuras fibrilares) revela una serie de glóbulos de
diferente tamaño (concretamente o estructuras oligoméricas de
diferente tamaño) presentes en la fracción. Estos glóbulos entran
dentro del intervalo de tamaño de aproximadamente 4,7 a
aproximadamente 11,0 nm, entrando la fracción mayoritaria en un
intervalo de tamaño de aproximadamente 4,7 mm a aproximadamente 6,2
mm. Parece haber distintas especies de glóbulos que entran dentro de
este intervalo de tamaño y que corresponden a especies oligoméricas
de tamaño específico tales como las indicadas mediante el análisis
en ciertos sistemas de electroforesis en gel, como se muestra en las
Figuras 2 y 16. Resulta una ligera variación en la altura de la
superficie de cómo las especies particulares se asientan sobre la
superficie de mica en el momento del análisis por MFA. A pesar de
esta ligera variación, sin embargo, parece haber varios tamaños
predominantes de glóbulos en el intervalo de tamaño de
4,7-6,2, concretamente de aproximadamente 4,9 nm a
aproximadamente 5,4 nm, y de aproximadamente 5,7 nm a
aproximadamente 6,2 nm, que constituyen aproximadamente un 50% de
las estructuras oligoméricas en una muestra típica. Parece haber
también una especie de tamaño distinto de glóbulo que tiene
dimensiones de aproximadamente 5,3 nm a aproximadamente 5,7 nm.
Glóbulos mayores de aproximadamente 6,5 nm a aproximadamente 11,0 nm
aparecen menos frecuentemente, pero pueden poseer actividades
neurotóxicas similares a las especies más pequeñas más prevalentes.
Parece que los glóbulos de dimensiones de aproximadamente 4,7 nm a
aproximadamente 6,2 nm en MFA comprenden la forma pentamérica y
hexamérica de proteína \beta-amiloide oligomérica
(A\beta). Los glóbulos de tamaño MFA de aproximadamente 4,2 nm a
aproximadamente 4,7 nm parecen corresponder al tetrámero de
A\beta. Los glóbulos de tamaño de aproximadamente 3,4 nm a
aproximadamente 4,0 nm parecen corresponder al trímero. Los glóbulos
grandes parecen corresponder a especies oligoméricas en el intervalo
de tamaño de aproximadamente 13 momómeros amiloides a
aproximadamente 24 monómeros amiloides. Los glóbulos de tamaño de
aproximadamente 2,8 nm a aproximadamente 3,4 nm corresponden al
dímero (Roher et al., J. Biol. Chem., 271,
20631-20635, 1996). El tamaño de MFA del monómero de
A\beta está en el intervalo de aproximadamente 0,8 nm a
aproximadamente 1,8-2,0 nm. Los
\beta-amiloides monomérico y dimérico no son
neurotóxicos en cultivos de células neuronales o en cultivos de
secciones de cerebro organotípicos.
Por tanto, la presente invención proporciona una
estructura oligomérica \beta-amiloide no fibrilar
soluble aislada (concretamente un LDDA) que comprende
preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 24 monómeros
de proteína \beta-amiloide, especialmente de
aproximadamente 3 a aproximadamente 20 monómeros de proteína
\beta-amiloide, particularmente de aproximadamente
3 a aproximadamente 16 monómeros de proteína
\beta-amiloide, lo más preferiblemente de
aproximadamente 3 a aproximadamente 12 monómeros de proteína
\beta-amiloide, y que comprende deseablemente de
aproximadamente 3 a aproximadamente 6 monómeros de proteína
\beta-amiloide. Como se describe anteriormente,
los glóbulos grandes (especies menos predominantes) parecen
corresponder a especies oligoméricas en el intervalo de tamaño de
aproximadamente 13 monómeros \beta-amiloides a
aproximadamente 24 monómeros \beta-amiloides. En
consecuencia, la invención proporciona una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada,
comprendiendo preferiblemente la estructura oligomérica agregados de
trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, octámero, de 12,
16, 20 ó 24 unidades de proteínas \beta-amiloides.
En particular, la invención proporciona una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada,
comprendiendo preferiblemente la estructura oligomérica agregados de
trímero, tetrámero, pentámero o hexámero de proteína
\beta-amiloide. La estructura oligomérica de la
invención exhibe óptimamente actividad neurotóxica.
El orden estructural superior de la estructura
oligomérica de proteína \beta-amiloide no fibrilar
soluble (concretamente la agregación de monómeros para formar la
estructura oligomérica) puede obtenerse deseablemente no sólo a
partir del \beta-amiloide 1-42,
sino también a partir de cualquier proteína
\beta-amiloide capaz de formar establemente la
estructura oligomérica \beta-amiloide no fibrilar
soluble. En particular, puede emplearse también el
\beta-amiloide 1-43. Puede
emplearse también el \beta-amiloide
1-42 con biocitina en la posición 1. Puede emplearse
también el \beta-amiloide (por ejemplo \beta
1-42 o \beta 1-43) con una
cisteína en la terminación N. De forma similar, puede
emplearse el A\beta truncado en la terminación amino (por ejemplo,
particularmente, en el que faltan uno o más hasta la totalidad de la
secuencia de residuos aminoacídicos 1 a 8 de A\beta
1-42 o A\beta 1-43), o A\beta
(por ejemplo, A\beta 1-42 o 1-43)
que tienen uno o dos residuos aminoacídicos extra en la terminación
carboxilo. En contraposición, el \beta-amiloide
1-40 puede formar transitoriamente estructuras de
tipo LDDA que pueden ser tóxicas, pero estas estructuras no son
estables y no pueden aislarse en forma de soluciones acuosas,
probablemente debido a la naturaleza acortada de la proteína, que
limita su capacidad de formar dichos ensamblajes de orden superior
de modo estable.
Deseablemente, la estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada según
la invención comprende glóbulos de dimensiones de aproximadamente
4,7 nm a aproximadamente 11,0 nm, particularmente de aproximadamente
4,7 nm a aproximadamente 6,2 nm medidas mediante microscopía de
fuerzas atómicas. Además, preferiblemente la estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada
comprende glóbulos de dimensiones de aproximadamente 4,9 nm a
aproximadamente 5,4 nm, o de aproximadamente 5,7 nm a
aproximadamente 6,2 nm, o de aproximadamente 6,5 nm a
aproximadamente 11,0 nm, medidas mediante microscopía de fuerzas
atómicas. En particular, la estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada según
la invención es preferiblemente tal que de aproximadamente un 30% a
aproximadamente un 85%, aún más preferiblemente de aproximadamente
un 40% a aproximadamente un 75% del ensamblaje comprenda dos tamaños
predominantes de glóbulos, es decir, de dimensiones de
aproximadamente 4,9 nm a aproximadamente 5,4 nm, y de
aproximadamente 5,7 nm a aproximadamente 6,2 nm, medidas mediante
microscopía de fuerzas atómicas. Sin embargo, también es deseable
que la estructura oligomérica comprenda glóbulos de tamaño MFA de
aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,7 nm. Es también deseable
que la estructura oligomérica pueda comprender glóbulos de tamaño
MFA de aproximadamente 6,5 nm a aproximadamente 11,0 nm.
Para electroforeis en gel no desnaturalizante,
las bandas correspondientes a LDDA se desarrollan de aproximadamente
26 kDa a aproximadamente 28 kDa, y con una banda ancha separada que
representa tamaños de aproximadamente 36 kDa a aproximadamente 108
kDa. En condiciones desnaturalizantes (por ejemplo en un gel de
SDS-poliacrilamida al 15%), los LDDA comprenden una
banda que se desarrolla de aproximadamente 22 kDa a aproximadamente
24 kDa, y puede comprender adicionalmente una banda que se
desarrolla de aproximadamente 18 a aproximadamente 19 kDa. En
consecuencia, la invención proporciona preferiblemente una
estructura oligomérica \beta-amiloide no fibrilar
soluble aislada (concretamente LDDA) que tiene un peso molecular de
aproximadamente 26 kDa a aproximadamente 28 kDa, determinado
mediante electroforesis en gel no desnaturalizante. La invención
proporciona también preferiblemente una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada
(concretamente LDDA) que se desarrolla en forma de una banda
correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 22 kDa a
aproximadamente 24 kDa, determinado mediante electroforesis en gel
de SDS-poliacrilamida al 15%. La invención
proporciona preferiblemente además una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada
(concretamente LDDA) que se desarrolla en forma de una banda
correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 18 kDa a
aproximadamente 19 kDa, determinado mediante electroforesis en un
gel de SDS-poliacrilamida al 15%.
Además, utilizando un sistema de gel de
SDS-poliacrilamida con tris-tricina
al 16,5%, pueden visualizarse bandas de LDDA adicionales. La
resolución aumentada obtenida con este sistema de gel confirma la
capacidad de obtener según la invención una estructura oligomérica
aislada que tenga un peso molecular en el intervalo de
aproximadamente 13 kDa a aproximadamente 116 kDa, determinado
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
con tris-tricina al 16,5%. Las bandas de LDDA
parecen corresponder a especies de distinto tamaño. En particular,
el uso de este sistema de gel permite la visualización de bandas
correspondientes a un trímero con un tamaño de aproximadamente 13 a
aproximadamente 14 kDa, a un tetrámero con un tamaño de
aproximadamente 17 a aproximadamente 19 kDa, a un pentámero con un
tamaño de aproximadamente 22 kDa a aproximadamente 23 kDa, a un
hexámero con un tamaño de aproximadamente 26 a aproximadamente 28
kDa, a un heptámero con un tamaño de aproximadamente 32 kDa a 33
kDa, y a un octámero con un tamaño de aproximadamente 36 kDa a
aproximadamente 38 kDa, así como a oligómeros solubles mayores que
están en el intervalo de tamaño de aproximadamente 12 monómeros a
aproximadamente 24 monómeros. Por tanto, la invención proporciona
deseablemente una estructura oligomérica aislada, teniendo la
estructura oligomérica, como se determina mediante electroforesis en
gel de SDS-poliacrilamida con
tris-tricina al 16,5%, un peso molecular
seleccionado del grupo constituido por aproximadamente 13 kDa a
aproximadamente 14 kDa, de aproximadamente 17 kDa a aproximadamente
19 kDa, de aproximadamente 22 kDa a aproximadamente 23 kDa, de
aproximadamente 26 kDa a aproximadamente 28 kDa, de aproximadamente
32 kDa a aproximadamente 33 kDa y de aproximadamente 36 kDa a
aproximadamente 38 kDa.
La invención proporciona adicionalmente un método
para preparar la estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada. Este
método comprende opcionalmente las etapas de:
(a) obtener una solución de proteína
\beta-amiloide monomérica;
(b) diluir la solución de proteína en un medio
apropiado;
(c) incubar el medio resultante de la etapa (b)
aproximadamente a 4ºC;
(d) centrifugar el medio aproximadamente a 14.000
g aproximadamente a 4ºC; y
(e) recuperar el sobrenadante resultante de la
centrifugación que contiene la estructura oligomérica
\beta-amiloide. En la etapa (c) de este método, la
solución se incuba deseablemente durante aproximadamente 2 horas a
aproximadamente 48 horas, especialmente de aproximadamente 12 horas
a aproximadamente 48 horas, y lo más preferiblemente de
aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas. En la etapa (d)
de este método, la centrifugación se lleva a cabo preferiblemente
durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora,
especialmente durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30
minutos, y óptimamente durante aproximadamente 10 minutos.
Generalmente, sin embargo, ésta es sólo una medida de precaución
para eliminar cualquier estructura fibrilar o protofibrilar naciente
y puede no ser necesaria, particularmente cuando la estabilidad a
largo plazo de la preparación de LDDA no es un problema.
La proteína A\beta se diluye deseablemente en
la etapa (b) a una concentración final en el intervalo de
aproximadamente 5 nM a aproximadamente 500 \muM, particularmente
de aproximadamente 5 \muM a aproximadamente 300 \muM,
especialmente aproximadamente a 100 \muM. El "medio
apropiado" en el que se diluye la solución de proteína A\beta
en la etapa (b) es preferiblemente cualquier medio que soporte, si
no facilite, la formación de LDDA. En particular, se prefiere el
medio F12 (que está comercialmente disponible así como fácilmente
formulado en laboratorio) para uso en este método de la invención.
De forma similar, puede emplearse también deseablemente "medio
sustitutivo de F12". El medio sustitutivo de F12 difiere del
medio F12 que está comercialmente disponible o se formula en
laboratorio. Según la invención, el medio sustitutivo de F12
comprende preferiblemente los siguientes componentes:
N,N-dimetilglicina, D-glucosa, cloruro de
calcio, sulfato de cobre pentahidratado, sulfato de hierro (II)
heptahidratado, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de
sodio, bicarbonato de sodio, hidrogenofosfato de disodio y sulfato
de cinc heptahidratado.
En particular, el medio F12 sintético según la
invención comprende opcionalmente: N,N-dimetilglicina (de
aproximadamente 600 a aproximadamente 850 mg/l),
D-glucosa (de aproximadamente 1,0 a aproximadamente
3,0 g/l), cloruro de calcio (de aproximadamente 20 a aproximadamente
40 mg/l), sulfato de cobre pentahidratado (de aproximadamente 15 a
aproximadamente 40 mg/l), sulfato de hierro (II) heptahidratado (de
aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,2 mg/l), cloruro de potasio
(de aproximadamente 160 a aproximadamente 280 mg/l), cloruro de
magnesio (de aproximadamente 40 a aproximadamente 75 mg/l), cloruro
de sodio (de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0 g/l),
bicarbonato de sodio (de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 1,4
g/l), hidrogenofosfato de disodio (de aproximadamente 120 a
aproximadamente 160 mg/l) y sulfato de cinc heptahidratado (de
aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,1 mg/l). Óptimamente, el
medio F12 sintético según la invención comprende:
N,N-dimetilglicina (aproximadamente 766 mg/l),
D-glucosa (aproximadamente 1,802 g/l), cloruro de
calcio (aproximadamente 33 mg/l), sulfato de cobre pentahidratado
(aproximadamente 25 mg/l), sulfato de hierro (II) heptahidratado
(aproximadamente 0,8 mg/l), cloruro de potasio (aproximadamente 223
mg/l), cloruro de magnesio (aproximadamente 57 mg/l), cloruro de
sodio (aproximadamente 7,6 g/l), bicarbonato de sodio
(aproximadamente 1,18 g/l), hidrogenofosfato de disodio
(aproximadamente 142 mg/l), y sulfato de cinc heptahidratado
(aproximadamente 0,9 mg/l). Además, el pH del medio sustitutivo de
F12 se ajusta preferiblemente, por ejemplo utilizando hidróxido de
sodio 0,1 M, deseablemente a un pH de aproximadamente 7,0 a
aproximadamente 8,5, y preferiblemente a un pH de aproximadamente
8,0.
El método anterior puede llevarse a cabo
deseablemente además formando la estructura oligomérica de
sedimentación lenta en presencia de un agente apropiado, tal como
clusterina. Esto se hace, por ejemplo, añadiendo clusterina en la
etapa (c) y como se indica en los ejemplos siguientes.
Además, la invención proporciona también, como se
describe en los ejemplos, un método para preparar una estructura
oligomérica \beta-amiloide no fibrilar soluble
según la invención, comprendiendo el método:
(a) obtener una solución de proteína
\beta-amiloide monomérica, siendo la proteína
\beta-amiloide capaz de formar la estructura
oligomérica;
(b) disolver el monómero
\beta-amiloide en hexafluoroisopropanol;
(c) retirar el hexafluoroisopropanol mediante
evaporación rápida a vacío para obtener el péptido sólido;
(d) disolver el péptido sólido en DMSO para
formar una solución madre en DMSO;
(e) diluir la solución madre en un medio
apropiado;
(f) agitar con vórtex; y
(g) incubar aproximadamente a 4ºC durante
aproximadamente 24 horas.
Si los LDDA se preparan mediante la incorporación
de \beta-amiloide 1-42 biotinilado
al 10% (u otra proteína \beta-amiloide biotinilada
apropiada), pueden utilizarse en un ensayo de unión a receptor
utilizando células neuronales y llevado a cabo, por ejemplo, en un
instrumento de separación celular activada por fluorescencia (FACS),
con marcaje mediante un conjugado de avidina fluorescente. Como
alternativa, en lugar de incorporar biotina a la proteína
\beta-amiloide, puede emplearse otro reactivo
capaz de unirse al LDDA para formar una molécula marcada
fluorescentemente, y que puede ser ya parte de un conjugado marcado
fluorescentemente. Por ejemplo, la estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble puede formarse
de tal modo que la proteína amiloide incluya otro resto de unión,
comprendiendo "resto de unión" como se utiliza en la presente
memoria una molécula (tal como avidina, estreptavidina, polilisina y
similares) que puede emplearse para unirse a un reactivo para formar
un compuesto o conjugado marcado fluorescentemente. El "reactivo
fluorescente" al que se une la estructura oligomérica no necesita
ser fluorescente directamente por sí mismo, sino que en lugar de
ello puede ser simplemente capaz de fluorescencia mediante la unión
a otro agente. Por ejemplo, el reactivo fluorescente que se une a la
estructura oligomérica puede comprender un anticuerpo específico de
\beta-amiloide (por ejemplo 6E10), con la
fluorescencia generada mediante el uso de un anticuerpo
secundario
fluorescente.
fluorescente.
Junto con otros experimentos, el análisis FACScan
de células B103 de SNC de rata se realizó con y sin incubación con
LDDA. Los resultados de estos y otros estudios confirman que la
unión a la superficie celular es saturable, y un breve tratamiento
con tripsina retira selectivamente un subconjunto de proteínas de
superficie celular y elimina la unión de LDDA. Las proteínas que son
escindibles mediante un breve tratamiento con tripsina de la
superficie de células B103 evitan también la unión de LDDA a células
B103 o neuronas primarias cultivadas de hipocampo de rata. Estos
resultados apoyan todos que los LDDA actúan mediante un receptor de
superficie celular particular, y que los eventos tempranos mediados
por los LDDA (concretamente eventos anteriores a la muerte celular)
pueden controlase ventajosamente (por ejemplo para tratamiento o
investigación) mediante compuestos que bloquean la formación y
actividad (por ejemplo incluyendo unión a receptor) de los LDDA.
Por tanto, la invención proporciona un método
para identificar compuestos que modulan (concretamente facilitan o
bloquean) la actividad (por ejemplo la actividad tal como unión a
receptor) del LDDA. Este método comprende preferiblemente:
(a) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con la estructura oligomérica de la invención en
presencia o ausencia de puesta en contacto con el compuesto de
ensayo;
(b) añadir un reactivo que se une a la estructura
oligomérica, siendo fluorescente el reactivo;
(c) analizar los cultivos celulares separados
mediante separación celular activada por fluorescencia; y
(d) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la actividad (concretamente la unión a una
proteína de superficie celular) de la estructura oligomérica que se
está identificando, que dan como resultado una fluorescencia
reducida del cultivo, y compuestos que facilitan la unión a una
proteína de superficie celular (concretamente un receptor) que se
está identificando, que dan como resultado una fluorescencia
aumentada del cultivo, comparada con el correspondiente cultivo
puesto en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del
compuesto de ensayo. Como alternativa, en lugar de añadir un
reactivo fluorescente que es capaz de unirse por sí mismo al
complejo proteico, se lleva a cabo deseablemente un método en el que
la estructura oligomérica se forma a partir de proteína
\beta-amiloide 1-42 (u otro
\beta-amiloide) preparada de tal modo que
comprenda un resto de unión capaz de unirse al reactivo
fluorescente.
De forma similar, puede emplearse un método para
identificar compuestos que modulan (concretamente facilitan o
bloquean) la formación o actividad (por ejemplo la unión a una
proteína de superficie celular tal como un receptor) de la
estructura oligomérica, que comprende:
(a) preparar muestras separadas de
\beta-amiloide que se han mezclado o no con el
compuesto de ensayo;
(b) formar la estructura oligomérica en las
muestras separadas;
(c) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con las muestras separadas;
(d) añadir un reactivo que se une a la estructura
oligomérica, siendo fluorescente el reactivo;
(e) analizar los cultivos celulares separados
mediante separación celular activada por fluorescencia; y
(f) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la formación o unión a una proteína de
superficie celular de la estructura oligomérica que se está
identificando, que dan como resultado una fluorescencia reducida del
cultivo, y compuestos que facilitan la formación o unión a una
proteína de superficie celular de la estructura oligomérica que se
está identificando, que dan como resultado una fluorescencia
aumentada del cultivo, comparada con el correspondiente cultivo
puesto en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del
compuesto de ensayo. Además, en lugar de añadir un reactivo
fluorescente que es capaz por sí mismo de unirse al complejo
proteico, puede llevarse a cabo un método en el que la estructura
oligomérica se forma a partir de proteína
\beta-amiloide preparada de tal modo que comprenda
un resto de unión capaz de unirse al reactivo fluorescente.
La fluorescencia de los cultivos se compara
opcionalmente además con la fluorescencia de cultivos que se han
tratado del mismo modo, excepto porque en lugar de añadir o no
añadir compuesto de ensayo antes de la formación de la estructura
oligomérica, se añade o no el compuesto de ensayo después de la
formación de la estructura oligomérica. En esta situación, los
compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica se
identifican por dar como resultado una fluorescencia reducida del
cultivo, y los compuestos que facilitan la formación de la
estructura oligomérica se identifican por dar como resultado una
fluorescencia aumentada del cultivo, comparada con el
correspondiente cultivo puesto en contacto con la estructura
oligomérica en ausencia del compuesto de ensayo, sólo cuando
el compuesto se añade antes que la estructura oligomérica.
En contraposición, los compuestos que bloquean la
unión a una proteína de superficie celular (por ejemplo un receptor)
de la estructura oligomérica se identifican por dar como resultado
una fluorescencia reducida del cultivo, y los compuestos que
facilitan la unión a una proteína de superficie celular de la
estructura oligomérica se identifican por dar como resultado una
fluorescencia aumentada del cultivo, comparada con el
correspondiente cultivo puesto en contacto con la estructura
oligomérica en ausencia del compuesto de ensayo, cuando el compuesto
se añade antes o después que la estructura oligomérica.
De modo similar, puede emplearse un ensayo basado
en células, particularmente un ensayo de inmunosorción ligado a
enzima basado en células (ELISA) según la invención para evaluar la
actividad de unión de LDDA. En particular, el método puede emplearse
para detectar la unión de la estructura oligomérica a una proteína
de superficie celular. Este método comprende preferiblemente:
(a) formar una estructura oligomérica a partir de
la proteína \beta-amiloide;
(b) poner en contacto un cultivo de células
neuronales con la estructura oligomérica;
(c) añadir un anticuerpo (por ejemplo 6E10) que
se une a dicha estructura oligomérica, incluyendo dicho anticuerpo
un resto de conjugación (por ejemplo biotina u otro agente
apropiado);
(d) separar por lavado el anticuerpo no
unido;
(e) ligar una enzima (por ejemplo peroxidasa de
rábano picante) a dicho anticuerpo unido a dicha estructura
oligomérica mediante dicho resto de conjugación;
(f) añadir un sustrato incoloro (por ejemplo
ABTS) que se escinde mediante dicha enzima proporcionando un cambio
de color; y
(g) determinar dicho cambio de color (por ejemplo
espectrofotométricamente) o la velocidad del cambio de color como
medida de la unión a una proteína de superficie celular (por ejemplo
un receptor) de dicha estructura oligomérica. Como se ha descrito
anteriormente, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo capaz de
detectar LDDA (por ejemplo un anticuerpo dirigido contra un sitio
expuesto en el \beta-amiloide), y el resto de
conjugación de anticuerpo puede ser cualquier agente capaz de
ligamiento con un medio de detección (por ejemplo una enzima). La
enzima puede ser cualquier resto (por ejemplo quizás incluso otra
proteína) que proporcione un medio para detectar (por ejemplo cambio
de color debido a la escisión de un sustrato), y además pueda unirse
(por ejemplo covalente o no covalentemente) al anticuerpo unido a la
estructura oligomérica mediante otro resto (por ejemplo un
anticuerpo secundario). Además, preferiblemente según la invención,
las células se adhieren a un sustrato sólido (por ejemplo plástico
de cultivo de tejido) antes de realizar el ensayo. No es necesario
aclarar que la etapa (b) deberá llevarse a cabo deseablemente como
se describe en la presente memoria, de tal modo que los LDDA sean
capaces de unirse a células. De forma similar, la etapa (c)
preferiblemente deberá llevarse a cabo durante un periodo de tiempo
suficientemente largo (por ejemplo de aproximadamente 10 minutos a
aproximadamente 2 horas, deseablemente durante aproximadamente 30
minutos) y en condiciones apropiadas (por ejemplo aproximadamente a
temperatura ambiente, preferiblemente con agitación suave) para
dejar unir el anticuerpo a los LDDA. Además, pueden llevarse a cabo
etapas de bloqueo apropiadas tal como son conocidas por los expertos
en la técnica, utilizando reactivos de bloqueo apropiados para
reducir cualquier unión no específica del anticuerpo. El experto
está familiarizado con los ELISA y puede emplear modificaciones del
ensayo tal como son conocidas en la técnica.
El ensayo puede llevarse a cabo deseablemente
también para identificar compuestos que modulan (concretamente
facilitan o bloquean) la formación o unión a una proteína de
superficie celular de la estructura oligomérica. En este método,
como en los ensayos descritos anteriormente para compuestos de
ensayo, el compuesto de ensayo se añade a la preparación de LDDA
antes de poner en contacto las células con los LDDA. Este ensayo
puede emplearse por tanto para detectar compuestos que modulan la
formación de la estructura oligomérica (por ejemplo como se describe
anteriormente). Además, el compuesto de ensayo puede añadirse a la
preparación de LDDA antes de poner en contacto las células (pero
después de la formación de LDDA) o a las células antes de poner en
contacto con los LDDA). Este método (por ejemplo como se describe
anteriormente) puede emplearse para detectar compuestos que modulan
la unión de LDDA a la superficie celular. Además, puede añadirse un
compuesto de ensayo a la mezcla de células más LDDA. Este método
(por ejemplo como se describe anteriormente) puede emplearse para
detectar compuestos que afectan a eventos mediados por LDDA que
ocurren cadena abajo del sitio de unión de LDDA a una proteína de
superficie celular (por ejemplo a un receptor de LDDA). La
especificidad de los compuestos para actuar sobre un efecto cadena
abajo mediado por LDDA puede confirmarse, por ejemplo, añadiendo
simplemente el compuesto de ensayo en ausencia de cualquier
coincubación con LDDA. Por supuesto, deben incluirse con todos los
ensayos controles apropiados adicionales (por ejemplo como se da a
conocer en los siguientes ejemplos y como es conocido por los
expertos en la técnica).
De forma similar, utilizando los métodos
descritos en la presente memoria (por ejemplo en los ejemplos), la
presente invención proporciona un método para identificar compuestos
que bloquean la formación de la estructura oligomérica de la
invención, comprendiendo deseablemente el método:
(a) preparar muestras separadas de proteína
\beta-amiloide que se han mezclado o no con el
compuesto de ensayo;
(b) formar la estructura oligomérica en las
muestras separadas;
(c) evaluar si se ha formado algún ensamblaje de
proteína en las muestras separadas utilizando un método seleccionado
del grupo constituido por electroforesis, inmunoreconocimiento y
microscopía de fuerzas atómicas; y
(d) comparar la formación de los ensamblajes de
proteína en las muestras separadas, identificándose aquellos
compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica
por dar como resultado la formación reducida de estructura
oligomérica en la muestra comparada con una muestra en la que se
forma la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de
ensayo.
Esta información sobre los compuestos que modulan
(concretamente facilitan o bloquean) la formación y/o actividad,
incluyendo la unión a una proteína de superficie celular, de la
estructura oligomérica puede emplearse en la investigación y el
tratamiento de enfermedades, afecciones o trastornos mediados por
LDDA. Los métodos de la invención pueden emplearse para investigar
la actividad y neurotoxicidad de los LDDA mismos. Por ejemplo,
cuando se inyectaron 20 nl de la preparación de LDDA a la región del
hipocampo de un ratón adulto 60-70 minutos antes de
realizar un experimento de potenciación a largo plazo (PLP) (por
ejemplo Namgung et al., Brain Research, 689,
85-92, 1995), la fase de estimulación del
experimento ocurrió de manera idéntica con inyecciones de control
salino, pero la fase de consolidación mostró una reducción continua
significativa de la actividad sináptica, medida mediante la amplitud
de espiga del cuerpo celular, durante las 2 horas posteriores,
comparada con animales control en los que la actividad sináptica
permaneció a un nivel comparable al exhibido durante la fase de
estimulación. El análisis de secciones de cerebro después del
experimento indicó que no había ocurrido muerte celular. Estos
resultados, así como otros descritos en los siguientes ejemplos,
confirman que el tratamiento con LDDA comprometía la respuesta de
PLP. Esto indica que los LDDA contribuyen al aprendizaje y memoria
comprometidos observados en la enfermedad de Alzheimer mediante
interferencia con procesos de señalización neuronal, en lugar de
mediante la inducción de la muerte de células nerviosas.
Puede obtenerse información adicional sobre los
efectos de los LDDA (en presencia o ausencia de compuestos de ensayo
que modulan potencialmente la formación y/o actividad de LDDA)
utilizando los ensayos adicionales según la invención. Por ejemplo,
la invención proporciona un método para ensayar los efectos de los
LDDA que comprende preferiblemente:
(a) administrar la estructura oligomérica al
hipocampo de un animal;
(b) aplicar un estímulo eléctrico; y
(c) medir la amplitud de la espiga del cuerpo
celular frente al tiempo para determinar la respuesta de
potenciación a largo plazo. Se lleva a cabo opcionalmente un método
en el que la respuesta de potenciación a largo plazo del animal se
compara con la respuesta de potenciación a largo plazo de otro
animal tratado del mismo modo excepto porque se ha administrado
solución salina en lugar de estructura oligomérica antes de la
aplicación del estímulo eléctrico. Este método puede emplearse
además para identificar compuestos que modulan (concretamente
aumentan o reducen) los efectos de los LDDA, por ejemplo comparando
la respuesta de PLP en animales administrados con LDDA solos o junto
con compuestos de ensayo.
Siguiendo esta línea, la invención proporciona un
método para identificar compuestos que modulan los efectos de la
estructura oligomérica de LDDA. El método comprende
preferiblemente:
(a) administrar solución salina o un compuesto de
ensayo al hipocampo de un animal;
(b) aplicar un estímulo eléctrico;
(c) medir la amplitud de la espiga del cuerpo
celular frente al tiempo para determinar la respuesta de
potenciación a largo plazo; y
(d) comparar la respuesta de potenciación a largo
plazo de animales a los que se ha administrado solución salina con
la respuesta de potenciación a largo plazo de animales a los que se
ha administrado compuesto de ensayo. El método comprende además
opcionalmente administrar la estructura oligomérica al hipocampo
antes, a la vez o después de administrar la solución salina o el
compuesto de ensayo.
De forma similar, la presente invención
proporciona un método para identificar compuestos que modulan
(concretamente aumentan o reducen) la neurotoxicidad del ensamblaje
de proteína LDDA, comprendiendo dicho método:
(a) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con la estructura oligomérica en presencia o
ausencia de puesta en contacto con el compuesto de ensayo;
(b) medir la proporción de células viables en
cada cultivo; y
(c) comparar la proporción de células viables en
cada cultivo. Los compuestos que bloquean la neurotoxicidad de la
estructura oligomérica se identifican, por ejemplo, por dar como
resultado una proporción aumentada de células viables en el cultivo
comparada con el correspondiente cultivo puesto en contacto con la
estructura oligomérica en ausencia del compuesto de ensayo. Los
compuestos que aumentan la neurotoxicidad de la estructura
oligomérica se identifican, por ejemplo, por dar como resultado una
porción reducida de células viables en el cultivo comparada con el
correspondiente cultivo puesto en contacto con la estructura
oligomérica en presencia del compuesto de ensayo.
Los métodos de la invención pueden emplearse
también para detectar en materiales de ensayo LDDA (por ejemplo como
parte de investigación, diagnóstico y/o terapia). Por ejemplo, los
LDDA causan un rápido cambio morfológico en células B103 sin suero,
y activan también la actividad quinasa Fyn en estas células a los 30
minutos de tratamiento con LDDA (datos no mostrados). Los LDDA
inducen también una rápida formación de complejo entre Fyn y la
quinasa de adhesión focal (FAK; Zhang et al., Neurosci.
Letters, 211, 1-4, 1996), y la
translocación de varias proteínas fosforiladas y el complejo
Fyn-Fak a una fracción insoluble en Triton (Berg,
et al., J. Neurosci. Res., 50,
979-989, 1997). Esto sugiere que Fyn y otras rutas
de señalización activadas están implicadas en el proceso
neurodegenerativo inducido por los LDDA. Esto se ha confirmado
mediante experimentos en cultivos de sección de cerebro de ratones
genéticamente alterados que carecen de un gen fyn funcional,
en los que la adición de LDDA no dio como resultado un aumento de la
neurotoxicidad comparado con controles vehículo.
Por lo tanto, los compuestos que bloquean una o
más de la función de Fyn o la relocalización de Fyn, es decir, que
afectan a los LDDA, pueden ser fármacos neuroprotectores importantes
para la enfermedad de Alzheimer. De forma similar, cuando se añaden
LDDA a cultivos de astrocitos primarios, los astrocitos se activan y
el ARNm de varias proteínas, incluyendo IL-1, óxido
nítrico sintasa inducible, Apo E, Apo J y
\alpha1-antiquimotripsina, se eleva. Estos
fenómenos se emplean deseablemente según la invención en un método
para detectar en un material de ensayo el ensamblaje de proteína
LDDA. Dichos métodos comprenden opcionalmente:
(a) poner en contacto el material de ensayo con
un anticuerpo (por ejemplo el anticuerpo 6E10 u otro anticuerpo);
y
(b) detectar la unión a la estructura oligomérica
del anticuerpo;
De forma similar, puede emplearse deseablemente
un método en el que
(a) se pone en contacto el material con células
de neuroblastoma sin suero (por ejemplo células de neuroblastoma
B103); y
(b) se miden los cambios morfológicos en las
células comparando la morfología de las células frente a células de
neuroblastoma que no se han puesto en contacto con el material de
ensayo.
Puede emplearse preferiblemente también un método
en el que:
(a) el material de ensayo se pone en contacto con
cultivos de sección de cerebro; y
(b) se mide la muerte cerebral comparada con
cultivos de secciones de cerebro que no se han puesto en contacto
con el material de ensayo. Puede realizarse deseablemente además un
método en el que:
- (a)
- se pone en contacto el material de ensayo con células de neuroblastoma (por ejemplo células de neuroblastoma B103); y
- (b)
- se miden los aumentos de actividad quinasa fyn comparando la actividad quinasa fyn en las células frente a la actividad quinasa fyn en células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con dicho material de ensayo. En particular, la actividad quinasa Fyn puede compararse haciendo uso de un kit comercialmente disponible (por ejemplo el kit nº QIA-28 de Oncogene Research Products, Cambridge, MA) o utilizando un ensayo análogo al descrito en Borowski et al., J. Biochem., (Tokio), 115, 825-829, 1994.
En aún otra realización preferida del método de
detección de LDDA en material de ensayo, el método comprende
deseablemente:
(a) poner en contacto el material de ensayo con
cultivos de astrocitos primarios; y
(b) determinar la activación de los astrocitos en
comparación con cultivos de astrocitos primarios que no se han
puesto en contacto con el material de ensayo. En una variación de
este método, el método comprende opcionalmente:
- (a)
- poner en contacto el material de ensayo con cultivos de astrocitos primarios; y
- (b)
- medir en los astrocitos los aumentos de ARNm de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en interleucina-1, óxido nítrico sintasa inducible, Apo E, Apo J y \alpha1-antiquimotripsina comparando los niveles de ARNm en los astrocitos frente a los correspondientes niveles de ARNm en cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de ensayo. Existen, por supuesto, otros métodos de ensayo, y resultarían evidentes variaciones adicionales de los descritos anteriormente para un experto en la técnica, particularmente a la vista de la presente memoria descriptiva.
Por tanto, claramente, los LDDA según la presente
invención tienen utilidad in vitro. Dichos LDDA pueden
utilizarse entre otras cosas como herramienta de investigación en el
estudio de la unión e interacción de LDDA en células y en un método
de ensayo de la actividad de LDDA. De forma similar, pueden
emplearse in vivo LDDA y estudios de la formación, actividad
y modulación de LDDA.
En particular, los compuestos identificados
utilizando los métodos de la presente invención pueden utilizarse
para tratar cualquiera de una serie de enfermedades, trastornos o
afecciones que dan como resultado déficit de cognición o aprendizaje
(concretamente debido a una falta de memoria), y/o déficit de
memoria mismos. Dicho tratamiento o prevención puede efectuarse
mediante la administración de compuestos que previenen la formación
y/o actividad de los LDDA, o que modulan (concretamente aumentan o
reducen la actividad, deseablemente como consecuencia de afectar a
los LDDA) los agentes celulares con los que interactúan los LDDA
(por ejemplo los denominados eventos "cadena abajo"). Dichos
compuestos que tienen capacidad de afectar a los LDDA se designan en
la presente memoria como "compuestos moduladores de LDDA". Los
compuestos moduladores de LDDA no sólo pueden actuar de modo
negativo, sino que también en algunos casos se emplean
preferiblemente para aumentar la formación y/o actividad de los
LDDA.
Deseablemente, cuando se emplea in vivo,
el método puede emplearse para proteger a un animal frente a
disminuciones de cognición, aprendizaje o memoria debidas a los
efectos del ensamblaje de proteína LDDA. Este método comprende
administrar un compuesto que bloquea la formación o actividad de los
LDDA. De forma similar, en la medida en que los déficit de
cognición, aprendizaje y/o memoria aumentan debido a la formación
y/o actividad de los LDDA, dichos déficit pueden revertirse o
restaurarse una vez se bloquea la actividad (y/o formación) de los
LDDA. La invención proporciona por tanto preferiblemente un método
para revertir (o restaurar) en un animal disminuciones de cognición,
aprendizaje o memoria debidas a los efectos de una estructura
oligomérica según la invención. Este método comprende
preferiblemente bloquear la formación o actividad de los LDDA. La
invención proporciona por tanto también deseablemente un método para
revertir en una célula nerviosa las disminuciones de potenciación a
largo plazo debidas a los efectos de una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble según la
invención (así como para proteger a una célula nerviosa frente a la
disminución de la potenciación a largo plazo debida a los efectos de
una estructura oligomérica \beta-amiloide no
fibrilar soluble), comprendiendo el método poner en contacto la
célula con un compuesto que bloquea la formación o actividad de la
estructura oligomérica.
En particular, este método puede aplicarse
deseablemente al tratamiento o la prevención de una enfermedad,
trastorno o afección que se manifieste como un déficit de cognición,
aprendizaje y/o memoria, y que sea debido a la formación o actividad
de LDDA, especialmente una enfermedad, trastorno o afección
seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer,
síndrome de Down en adultos (concretamente de más de 40 años de
edad) y demencia senil.
Además, este método puede aplicarse deseablemente
en el tratamiento o la prevención de los efectos perjudiciales
tempranos sobre la actividad celular, la cognición, el aprendizaje y
la memoria que pueden ser evidentes antes del desarrollo de la
enfermedad, trastorno o afección mismo, y pudiendo contribuir dichos
efectos perjudiciales al desarrollo de, o constituyendo en último
caso, la enfermedad, trastorno o afección mismo. En particular, el
método puede aplicarse preferiblemente en el tratamiento o la
prevención del malfuncionamiento temprano de células nerviosas u
otras células cerebrales que puede resultar como consecuencia de la
formación o actividad de LDDA. De forma similar, el método puede
aplicarse preferiblemente en el tratamiento o la prevención de
déficit de memoria focal (DMF) tales como se han descrito en la
bibliografía (por ejemplo, Linn et al., Arch. Neurol.,
52, 485-490, 1995), en el caso de que dicho
DMF sea debido a la formación o actividad de LDDA. El método puede
emplearse además deseablemente en el tratamiento o la prevención de
señalización neuronal aberrante inducida por LDDA, deterioro de las
habilidades de escritura de orden superior (por ejemplo Snowdon
et al., JAMA, 275, 528-532,
1996) u otra función cognitiva de orden superior, disminuciones (o
ausencia) de la potenciación a largo plazo, que siguen como
consecuencia de la formación o actividad de LDDA.
Según esta invención, la "señalización neuronal
aberrante inducida por LDDA" puede medirse mediante una serie de
medios. Por ejemplo, para señalización neuronal normal (así como
observación de una respuesta de potenciación a largo plazo), parece
que entre otras cosas debe activarse la quinasa Fyn, la quinasa Fyn
debe fosforilar el canal de NMDA (Miyakawa et al.,
Science, 278, 698-701, 1997; Grant,
J. Physiol. Paris, 90, 337-338, 1996)
y debe estar presente Fyn en la localización celular apropiada (que
puede impedirse por la formación del complejo
Fyn-FAK, por ejemplo, como ocurre en ciertas
reorganizaciones citoesqueléticas inducidas por LDDA). Basándose en
esto, la señalización neuronal aberrante inducida por LDDA (que es
un malfuncionamiento de señalización que está inducido por la
activación aberrante de las rutas celulares por los LDDA) y el
conocimiento de la misma pueden emplearse en los métodos de la
invención, tal como sería obvio para un experto en la técnica. Por
ejemplo, la señalización celular aberrante inducida por LDDA puede
evaluarse (por ejemplo como consecuencia de poner en contacto
células nerviosas con LDDA, que puede realizarse además en presencia
o ausencia de compuestos en los que se están ensayando la actividad
moduladora de LDDA) utilizando cualquiera de estas medidas, o tal
como sería evidente para un experto en la técnica, por ejemplo,
activación de quinasa Fyn (o alteración de la misma), formación del
complejo Fyn-FAK (o alteración del mismo),
reorganización citoesquelética (o alteración de la misma),
localización subcelular de quinasa Fyn (o alteración de la misma),
fosforilación por quinasa Fyn del canal de NMDA (o alteración de la
misma).
Además, en lugar de utilizar compuestos que se
identifican utilizando los métodos de la invención, pueden emplearse
compuestos conocidos por tener efectos particulares in vitro
e in vivo para afectar a los LDDA en los métodos de
tratamiento anteriormente descritos. Es decir, la formación de
amiloide puede modelizarse (pero no necesariamente) en forma de un
proceso de dos fases. En la primera fase, se inicia la producción de
precursor de proteína amiloide (por ejemplo el precursor de proteína
amiloide de 695 aminoácidos (Kang et al., Nature, 325,
733-736 (1987)) o la proteína de 751 aminoácidos
(Ponte et al., Nature, 331, 525-527
(1988), que tienen cada una en su secuencia la secuencia de proteína
núcleo \beta-amiloide de aproximadamente 4 kDa
identificada por Glenner et al. (patente de EE.UU.
4.666.829)). En la segunda fase, ocurre el procesamiento y/o
deposición de amiloide en estructuras de mayor peso molecular (por
ejemplo fibrillas o cualquier otra estructura de
\beta-amiloide que tenga un peso molecular mayor
que el monómero \beta-amiloide, e incluyendo
estructuras que son considerablemente menores que las placas y
preplacas). Es concebible que algunos compuestos puedan afectar a
una o ambas de estas fases. Para algunos compuestos, se obtiene un
efecto perjudicial, pero no está claro si el lugar de inhibición
está en la producción de proteína o en el procesamiento y/o
deposición de amiloide.
Por tanto, son relevantes para esta invención
compuestos que actúan en la primera o segunda fase, o ambas fases.
En particular, los compuestos que modulan la segunda fase tienen
especial utilidad para afectar a los LDDA y encuentran uso en
métodos de tratamiento que se basan en la modulación de LDDA. Dichos
compuestos que modulan (por ejemplo bloquean) la deposición de
amiloide en estructuras de mayor peso molecular incluyen, pero sin
limitación, compuestos que modulan (particularmente compuestos que
impiden) la incorporación de monómeros
\beta-amiloides a estructuras de mayor peso
molecular, especialmente fibrillas. En consecuencia, deseablemente
según la invención, dichos compuestos que perjudican la
incorporación de monómeros \beta-amiloides a
estructuras de mayor peso molecular, particularmente compuestos que
son conocidos por inhibir la formación de fibrillas (y por tanto se
ha confirmado que inhiben la incorporación de
\beta-amiloide a estructuras de mayor peso
molecular), pueden emplearse para ejercer un efecto inhibidor sobre
la formación y/o actividad de LDDA (concretamente reduciendo la
formación de LDDA), según los métodos de la invención. Por supuesto,
es preferible que antes de dicho uso se confirme la capacidad de los
moduladores de afectar a los LDDA, por ejemplo utilizando los
métodos de la invención. Dichos moduladores conocidos que pueden
emplearse deseablemente en la presente invención se describen a
continuación, sin embargo pueden emplearse también otros moduladores
similares.
En términos de compuestos que actúan en la
segunda fase, la solicitud internacional PCT WO 96/39834 y la
solicitud canadiense 2222690 se refieren a nuevos péptidos capaces
de interaccionar con un determinante estructural hidrófobo en una
proteína o péptido para la formación de depósitos de amiloide o de
tipo amiloide, inhibiendo y bloqueando estructuralmente así el
plegamiento anormal de proteínas y péptidos en depósitos de amiloide
y de tipo amiloide. En particular, la solicitud WO 96/39834 se
refiere a péptidos inhibidores que comprenden una secuencia de
aproximadamente 3 a aproximadamente 15 residuos aminoacídicos y que
tienen una agrupación hidrófoba de al menos tres aminoácidos, en la
que al menos uno de los residuos es un residuo aminoacídico
bloqueante de hoja \beta seleccionado de Pro, Gly, Asn y His, y el
péptido inhibidor es capaz de asociarse con un determinante
estructural en la proteína o péptido para bloquear e inhibir
estructuralmente la disposición anormal en depósitos amiloides o de
tipo amiloide.
La solicitud internacional PCT WO 95/09838 se
refiere a una serie de compuestos peptidérgicos y a su
administración a pacientes para prevenir una deposición anormal de
péptido \beta-amiloide.
La solicitud internacional PCT WO 98/08868 se
refiere a péptidos que modulan la agregación de péptido
\beta-amiloide natural. Estos moduladores de
péptidos comprenden de tres a cinco residuos
D-aminoacídicos e incluyen al menos dos residuos
D-aminoacídicos seleccionados del grupo constituido
por D-leucina, D-fenilalanina y
D-valina.
De forma similar, la solicitud internacional PCT
WO 96/28471 se refiere a un compuesto modulador amiloide que
comprende una proteína amiloidogénica o un fragmento peptídico de la
misma (por ejemplo, transtiretina, proteína priónica, polipéptido
amiloide de isleta, factor natriurético auricular, cadena ligera
kappa, cadena ligera lambda, amiloide A, procalcitonina, cistatina
C, microglobulina \beta2, ApoA-1, gelsolina,
procalcitonina, calcitonina, fibrinógeno y lisozima) acoplado
directa o indirectamente al menos a un grupo modificante (por
ejemplo, comprende un grupo cíclico, heterocíclico o policíclico,
contiene un grupo cis-decalina, contiene una
estructura de colanilo, es un grupo colilo, comprende un grupo que
contiene biotina, un grupo que contiene fluoresceína, etc.) de tal
modo que el compuesto modula la agregación de proteínas o péptidos
amiloides naturales cuando se pone en contacto con estas proteínas o
péptidos amiloidogénicos naturales.
Además, la solicitud internacional PCT WO
97/21728 se refiere a péptidos que incorporan la secuencia
Lys-Leu-Val-Phe-Phe
(KVLFF) del \beta-amiloide que es necesaria para
que ocurra la polimerización. Los péptidos que incorporan esta
secuencia se unen al \beta-amiloide y son capaces
de bloquear la formación de fibrillas.
En términos de agentes no peptídicos, la
solicitud internacional PCT WO 97/16191 se refiere a un agente para
inhibir la agregación de proteína amiloide en animales mediante la
administración de un compuesto de 9-acridinona que
tiene la fórmula
en la que R^{1} y R^{2} son
hidrógeno, halo, nitro, amino, hidroxi, trifluorometilo, alquilo,
alcoxi y alquiltio; R^{3} es hidrógeno o alquilo y R^{4} es
alquilen-N-R^{5}R^{6}, en la que R^{5} y R^{6} son
independientemente hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{4}, o tomados conjuntamente con el
nitrógeno al que están unidos son piperidilo o pirrolidinilo, y las
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos
dados a conocer anteriormente se identificaron como agentes
antibacterianos y antitumorales (patente de EE.UU. 4.626.540) y como
agentes antitumorales (Cholody et al., J. Med. Chem.
33, 49-52 (1990); Cholody et al., J. Med.
Chem., 35, 378-382
(1992)).
La solicitud internacional PCT WO 97/16194 se
refiere a un agente para inhibir la agregación de proteína amiloide
en animales mediante la administración de un compuesto naftilazo que
tiene la fórmula
en la que R^{1} y R^{2} son
independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido o un
anillo heterocíclico completo, R^{3} es hidrógeno o alquilo,
R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} son grupos sustituyentes
incluyendo, pero sin limitación, hidrógeno, halo, alquilo y
alcoxi.
La patente japonesa 9095444 se refiere a un
agente para inhibir la aglomeración y/o deposición de proteína
amiloide, en la que este agente comprende un derivado de
tionaftaleno de fórmula
en la que R es un alquilo de
1-5 carbonos sustituido con OH o COOR^{4}
(opcionalmente sustituido con arilo, heterociclilo, COR^{5},
CONHR^{6} o ciano; R^{4} es H o alquilo de 1-10
carbonos, alquenilo de 3-10 carbonos, alquilo
cíclico de 3-10 carbonos (todos opcionalmente
sustituidos); R^{5} y R^{6} son arilo o heterociclilo
opcionalmente sustituidos; R^{1} y R^{2} son H, alquilo de
1-5 carbonos o fenilo; R^{3} es hidrógeno, alquilo
de 1-5 carbonos o COR^{7}; R^{7} es OR', -R'' o
-N(R''')_{2}; R', R'', R''' son alquilo de
1-4
carbonos.
La patente japonesa 7309760 y la solicitud
internacional PCT WO 95/11248 se refieren a inhibidores de la
coagulación y/o deposición de proteína
\beta-amiloide que son derivados particulares de
rifamicina. La patente japonesa 7309759 se refiere a inhibidores de
la coagulación y/o deposición de proteína
\beta-amiloide que son derivados particulares de
rifamicina SV. La patente japonesa 7304675 se refiere a inhibidores
de la aglutinación y/o precipitación de proteína
\beta-amiloide que son derivados particulares de
3-homopiperazinilrifamicina.
La patente japonesa 7247214 se refiere a
derivados de piridina y sus sales o profármacos que pueden emplearse
como inhibidores de la formación o deposición de
\beta-amiloide.
La patente de EE.UU. 5.427.931 se refiere a un
método para inhibir la deposición de placas amiloides en un
mamífero, que comprende la administración al mamífero de una
cantidad inhibidora eficaz de la deposición de placa de proteasa
nexina-2, o un fragmento o análogo de la misma.
En términos de compuestos que pueden actuar en la
primera o segunda fase (concretamente el sitio de acción está
indefinido), la solicitud internacional PCT WO 96/25161 se refiere a
una composición farmacéutica para inhibir la producción o secreción
de proteína \beta-amiloide, que comprende un
compuesto que tiene la fórmula
en la que el anillo A es un anillo
de benceno opcionalmente sustituido, R representa
OR^{1},
\vskip1.000000\baselineskip
o SR^{1}, en las que R^{1},
R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes y se selecciona cada uno
de un átomo de hidrógeno, un grupo hidrocarburo opcionalmente
sustituido o R^{2} y R^{3}, tomados conjuntamente con el átomo
de nitrógeno adyacente, forman un grupo heterocíclico que contiene
nitrógeno opcionalmente sustituido, e Y es un grupo alquilo
opcionalmente sustituido o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, si es necesario, con un excipiente, vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable. Por supuesto, se prefiere emplear estos
y otros moduladores conocidos (por ejemplo de la primera fase o la
segunda fase) según la invención. Se prefiere también emplear
gosipol y derivados de gosipol. Además, se contempla que se empleen
moduladores que tienen la capacidad de afectar a la actividad de
LDDA (por ejemplo, solicitudes internacionales PCT WO 93/15112 y
97/26913).
Además, los LDDA mismos pueden aplicarse en
tratamiento. Se ha descubierto que estos nuevos ensamblajes
descritos en la presente memoria tienen numerosos efectos
inesperados sobre células, que concebiblemente pueden aplicarse para
terapia. Por ejemplo, los LDDA activan células endoteliales, y
dichas células endoteliales son conocidas, entre otras cosas, por
interactuar con células vasculares. Siguiendo esta línea, podrían
emplearse los LDDA, por ejemplo, en la curación de heridas. Además,
a modo de ejemplo, la toxina botulínica de tipo A (BoTox) es un
agente bloqueante de la unión neuromuscular producido por la
bacteria Clostridium botulinum que actúa bloqueando la
liberación del neurotransmisor acetilcolina. El Botox se ha probado
beneficioso en el tratamiento de espasmos musculares
discapacitantes, incluyendo distonía. Los LDDA mismos podrían
aplicarse teóricamente para controlar la función celular neuronal o
para destruir selectivamente células neuronales blanco (por ejemplo
en casos de cáncer, por ejemplo del sistema nervioso central,
particularmente el cerebro). Los LDDA parecen además ventajosos a
este respecto, dado que tienen efectos muy tempranos sobre las
células, y dado que su efecto sobre las células (aparte de su efecto
destructor de células) parece ser reversible.
Como se discute anteriormente, los compuestos
moduladores de LDDA de la presente invención, compuestos conocidos
por afectar a la incorporación de \beta-amiloide a
estructura de mayor peso molecular, así como los LDDA mismos, pueden
emplearse para poner en contacto células in vitro o in
vivo. Según la invención, una célula puede ser cualquier célula,
y preferiblemente es una célula eucariótica. Una célula eucariótica
es una célula que posee típicamente en alguna etapa de su vida un
núcleo rodeado por una membrana nuclear. Preferiblemente, la célula
eucariótica es de una especie multicelular (por ejemplo en
contraposición con una célula de levadura unicelular) y, aún más
preferiblemente, es una célula de mamífero (opcionalmente humana).
Sin embargo, el método puede llevarse a cabo eficazmente también
utilizando una amplia variedad de diferentes tipos celulares tales
como células de ave y células de mamífero, incluyendo pero sin
limitación, roedores, primates (tales como chimpancés, monos,
simios, gorilas, orangutanes o gibones), felinos, caninos, ungulados
(tales como rumiantes o cerdos), así como, en particular, células
humanas. Los tipos celulares preferidos son células formadas en el
cerebro, incluyendo células neuronales y células gliales. Un tipo
celular especialmente preferido según la invención es una célula
neuronal (normal o aberrante, por ejemplo transformada o cancerosa).
Cuando se emplea en cultivo de tejido, la célula neuronal es
deseablemente una célula de neuroblastoma.
Una célula puede estar presente en forma de una
sola entidad, o puede ser parte de una colección mayor de células.
Dicha "colección mayor de células" puede comprender, por
ejemplo, un cultivo celular (mixto o puro), un tejido (por ejemplo
tejido neuronal u otro), un órgano (por ejemplo cerebro u otros
órganos), un sistema de órganos (por ejemplo sistema nervioso u otro
sistema de órganos), o un organismo (por ejemplo mamífero o
similar). Preferiblemente, los órganos/tejidos/células de interés en
el contexto de la invención son del sistema nervioso central (por
ejemplo son células neuronales).
Además, según la invención, "poner en
contacto" comprende cualquier medio mediante el que estos agentes
tocan físicamente una célula. El método no depende de ningún medio
particular de introducción, y no ha de considerarse así. Los medios
de introducción son bien conocidos por los expertos en la técnica, y
se ejemplifican también en la presente memoria. En consecuencia, la
introducción puede efectuarse, por ejemplo, in vitro (por
ejemplo en un método de terapia de tipo ex vivo o en estudios
de cultivo de tejido) o in vivo. Están también disponibles
otros métodos y son conocidos por los expertos en la técnica.
Dicha "puesta en contacto" puede realizarse
mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, y
descrito en la presente memoria, mediante el que pueda efectuarse el
contacto aparente o la tangencia mutua de los LDDA y los compuestos
moduladores de LDDA y la célula. Por ejemplo, la puesta en contacto
puede realizarse mezclando estos elementos en un pequeño volumen de
la misma solución. Opcionalmente, los elementos pueden unirse además
covalentemente, por ejemplo mediante medios químicos conocidos por
los expertos en la técnica u otros medios, o preferiblemente pueden
ligarse mediante interacciones no covalentes (por ejemplo enlaces
iónicos, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals y/o
interacciones no polares). En comparación, la célula a afectar y el
LDDA o compuesto modulador de LDDA no necesitan ponerse en contacto
necesariamente en un volumen pequeño, como por ejemplo en casos en
que el LDDA o compuesto modulador de LDDA se administra a un
hospedador y el complejo viaja por la corriente sanguínea u otro
fluido corporal tal como fluido cerebroespinal hasta la célula con
la que se une. La puesta en contacto de la célula con un LDDA o
compuesto modulador de LDDA se realiza a veces antes de, junto a o
después de administrar otro compuesto de interés. Deseablemente,
esta puesta en contacto se realiza de tal modo que existe al menos
cierto periodo de tiempo en el que los agentes coadministrados
ejercen simultáneamente sus efectos sobre una célula o sobre el
LDDA.
Un experto en la técnica apreciará que están
disponibles los métodos adecuados de administración de un agente
(por ejemplo un LDDA o un compuesto modulador de LDDA) de la
presente invención a un animal con fines de terapia y/o diagnóstico,
investigación o estudio y, aunque puede utilizarse más de una vía
para administración, una vía particular puede proporcionar una
reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Los excipientes
farmacéuticamente aceptables son también bien conocidos por los
expertos en la técnica, y están fácilmente disponibles. La elección
del excipiente estará determinada en parte por el método particular
utilizado para administrar el agente. En consecuencia, existe una
amplia variedad de formulaciones adecuadas para uso en el contexto
de la presente invención. Los siguientes métodos y excipientes son
simplemente ejemplares y en modo alguno limitantes.
Las formulaciones adecuadas para administración
oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una
cantidad eficaz del compuesto disuelto en diluyentes, tales como
agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, saquitos o
comprimidos, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del
ingrediente activo, en forma de sólidos o gránulos; (c) suspensiones
en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de
comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, manitol, almidón de
maíz, almidón de patata, celulosa microcristalina, goma arábiga,
gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio,
talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes,
colorantes, diluyentes, agentes de tamponación, agentes humectantes,
conservantes, agentes aromatizantes y excipientes farmacológicamente
compatibles. Las formas de pastilla masticable pueden comprender el
ingrediente activo en un aroma, habitualmente sacarosa y goma
arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el
ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y
glicerina, emulsiones, geles y similares que contienen, además del
ingrediente activo, dichos excipientes conocidos en la técnica.
Un agente de la presente invención, solo o en
combinación con otros ingredientes adecuados, puede prepararse en
formulaciones de aerosol para administrar mediante inhalación. Estas
formulaciones de aerosol pueden disponerse en propelentes a presión
aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y
similares. Pueden formularse también en forma de productos
farmacéuticos para preparaciones no a presión tales como en un
nebulizador o atomizador.
Se prefieren las formulaciones adecuadas para
administración parenteral según la invención, e incluyen soluciones
de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden
contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen
la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes,
estabilizantes y conservantes. Las formulaciones pueden presentarse
en envases sellados monodosis o multidosis, tales como ampollas o
viales, y pueden almacenarse en estado liofilizado que requiere sólo
la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo agua para
inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y
suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de
polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito
anteriormente.
La dosis administrada a un animal,
particularmente un ser humano, en el contexto de la presente
invención variará con el agente de interés, la composición empleada,
el método de administración y el sitio y organismo particular que se
esté tratando. Sin embargo, se emplea preferiblemente una dosis
correspondiente a una cantidad eficaz de un agente (por ejemplo un
LDDA o compuesto modulador de LDDA según la invención). Una
"cantidad eficaz" es aquella que es suficiente para producir el
efecto deseado en un hospedador, que puede controlarse utilizando
varios puntos finales conocidos por los expertos en la técnica.
Algunos ejemplos de efectos deseados incluyen, pero sin limitación,
un efecto sobre el aprendizaje, la memoria, la respuesta de PLP, la
neurotoxicidad, la formación de LDDA, la unión de LDDA a proteína de
superficie celular (por ejemplo receptor), la unión de anticuerpo,
cambios morfológicos celulares, la actividad quinasa Fyn, la
activación de astrocitos y cambios en los niveles de ARNm de
proteínas tales como interleucina-1, óxido nítrico
sintasa inducible, ApoE, ApoJ y
\alpha1-antiquimotripsina. Estos métodos descritos
no son exclusivos en modo alguno, y resultarán evidentes métodos
adicionales que se ajusten a la aplicación específica para el
experto en la técnica.
Además, con aplicaciones particulares (por
ejemplo in vitro o in vivo), la dosis y esquema de
administración reales de LDDA o compuestos moduladores de LDDA
pueden variar dependiendo de si la composición se administra en
combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de
las diferencias entre individuos en la farmacocinética, disposición
de fármaco y metabolismo. De forma similar, las cantidades pueden
variar en las aplicaciones in vitro dependiendo del tipo
celular particular utilizado o del medio o solución mediante el que
se transfiere el LDDA o compuesto modulador de LDDA al cultivo. Un
experto en la técnica puede hacer fácilmente cualquier ajuste
necesario según los requisitos de la situación particular.
Con el uso de ciertos compuestos, puede ser
deseable o incluso necesario introducir los compuestos
(concretamente agentes) en forma de composiciones farmacéuticas
directa o indirectamente en el cerebro. Las técnicas directas
incluyen, pero sin limitación, la disposición de un catéter de
suministro de fármaco en el sistema ventricular del hospedador,
superando así la barrera hematoencefálica. Las técnicas indirectas
incluyen, pero sin limitación, la formulación de las composiciones
para convertir fármacos hidrófilos en fármacos liposolubles
utilizando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo bloqueando
los grupos hidroxilo, carboxilo y amina primaria presentes en el
fármaco) que hacen al fármaco capaz de cruzar la barrera
hematoencefálica. Además, el suministro de fármacos hidrófilos puede
mejorarse, por ejemplo, mediante infusión intraarterial de
soluciones hipertónicas (u otras soluciones) que abren
transitoriamente la barrera hematoencefálica.
Las descripciones anteriores (así como las
siguientes) son sólo ejemplares. Otras aplicaciones y el método y
constituyentes de la presente invención resultarán evidentes para un
experto en la técnica. Por tanto, los siguientes ejemplos ilustrarán
adicionalmente la presente invención pero, por supuesto, no deberán
ser considerados en modo alguno como limitantes de su alcance.
Según la invención, se prepararon LDDA
disolviendo 1 mg de \beta-amiloide
1-42 sólido (por ejemplo, sintetizado como se
describe en Lambert et al., J. Neurosci. Res.,
39, 377-395, 1994) en 44 \mul de DMSO
anhidro. Se diluyó después esta solución 5 mM en medio F12 frío
(4ºC) (Gibco BRL, Life Technologies) hasta un volumen total de 2,20
ml (dilución de 50 veces), y se agitó con vórtex durante
aproximadamente 30 segundos. Se dejó incubar la mezcla
aproximadamente a 0ºC a aproximadamente 8ºC durante aproximadamente
24 horas, seguido de centrifugación a 14.000 g durante
aproximadamente 10 minutos aproximadamente a 4ºC. Se diluyó el
sobrenadante por factores de 1:10 a 1:10.000 en el medio definido
particular, antes de la incubación con cultivos de sección de
cerebro, cultivos celulares o preparaciones de proteína de unión. En
general, sin embargo, se formaron LDDA a una concentración de
proteína A\beta 100 \muM. Típicamente, la concentración más alta
utilizada para los experimentos es 10 \muM y, en algunos casos, se
diluyeron los LDDA (medidos como concentración inicial de A\beta)
(por ejemplo en medio de cultivo celular) a 1 nM. Para análisis
mediante microscopía de fuerzas atómicas (MFA), se aplicó una
alícuota de 20 \mul de la dilución 1:100 a la superficie de un
disco de mica recién cortado y se analizó. Otras manipulaciones
fueron como se describe a continuación, o como resulta evidente.
Como alternativa, la formación de LDDA se llevó a
cabo como se describe anteriormente, con la excepción de que el
medio F12 se reemplazó por un tampón (concretamente, "medio
sustitutivo de F12") que contenía los siguientes componentes:
N,N-dimetilglicina (766 mg/l), D-glucosa
(1,802 g/l), cloruro de calcio (33 mg/l), sulfato de cobre
pentahidratado (25 mg/l), sulfato de hierro (II) heptahidratado (0,8
mg/l), cloruro de potasio (223 mg/l), cloruro de magnesio (57 mg/l),
cloruro de sodio (7,6 g/l), bicarbonato de sodio (1,18 g/l),
hidrogenofosfato de disodio (142 mg/l) y sulfato de cinc
heptahidratado (0,9 mg/l). Se ajustó el pH del tampón a 8,0
utilizando hidróxido de sodio
0,1 M.
0,1 M.
Se ha utilizado exitosamente glutaraldehído en
una serie de sistemas bioquímicos. El glutaraldehído tiende a
reticular proteínas que están directamente en contacto, en
contraposición con una reacción no específica con altas
concentraciones de proteína monomérica. En este ejemplo, se
investigó la reticulación controlada por glutaraldehído del
\beta-amiloide.
Se llevó a cabo la preparación de oligómero como
se describe en el ejemplo 1, con el uso de medio sustitutivo de F12.
Se trató el sobrenadante que se obtuvo después de centrifugación (y
en algunos casos fraccionamiento) con 0,22 ml de una solución acuosa
de glutaraldehído al 25% (Aldrich), seguido de 0,67 ml de
borohidruro de sodio 0,175 M en NaOH 0,1 M (según el método de
Levine, Neurobiology of Aging, 1995). Se agitó la mezcla a
4ºC durante 15 minutos y se inactivó mediante la adición de 1,67 ml
de sacarosa acuosa al 20%. Se concentró la mezcla 5 veces en un
SpeedVac y se dializó para retirar los componentes menores de 1 kDa.
Se analizó el material mediante SDS-PAGE. Se llevó a
cabo la cromatografía con filtración en gel según los siguientes
parámetros: se equilibró una columna Superose 75PC 3,2/3,0
(Pharmacia) con tampón hidrogenocarbonato de amonio al 0,15%
filtrado y desgasificado (pH= 7,8) a un caudal de 0,02 ml/min
durante el transcurso de 18 h a temperatura ambiente. Se cambió el
caudal a 0,04 ml/min y se eluyeron 20 ml de disolvente. Se cargaron
50 \mul de solución de reacción en la columna y se retomó el
caudal a 0,04 ml/min. Se monitorizó la elución del compuesto
mediante detección UV a 220 nm, y se recogieron fracciones de
0,5-1,0 ml durante el transcurso de la
cromatografía. Se aisló la fracción nº3, correspondiente al tercer
pico de absorbancia UV, y se demostró mediante MFA que contenía
glóbulos de 4,9 \pm 0,8 nm (mediante análisis de anchura). Esta
fracción era altamente neurotóxica cuando se ponía en contacto con
secciones de neuronas cerebrales, como se describe en los ejemplos
siguientes.
Este ejemplo da a conocer la caracterización del
tamaño de los LDDA formados en el ejemplo 1, utilizando una variedad
de métodos (por ejemplo electroforesis en gel nativo, electroforesis
en gel SDS-poliacrilamida, MFA, fraccionamiento de
flujo de campo e inmunoreconocimiento).
La MFA se llevó a cabo esencialmente como se
describe anteriormente (por ejemplo Stine et al., J.
Protein Chem., 15, 193-203, 1996). Es
decir, se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fuerzas
atómicas Nanoscope IIIa Multimode de Digital Instruments (Santa
Barbara, CA) utilizando un escáner J con un intervalo xy de 150
\mum. Se empleó el Tapping Mode para todas las imágenes utilizando
Nanoprobes TESP de silicio grabado (Digital Instruments). Los datos
de MFA se analizan utilizando el software Nanoscope IIIa y el
software de análisis de la forma de onda IGOR Pro™. Para análisis de
MFA, se realizaron barridos de 4 \mum (concretamente, evaluación
de un cuadrado de 4 \mum x 4 \mum). Las dimensiones reseñadas en
la presente memoria se obtuvieron mediante análisis de sección, y
cuando se empleó análisis de anchura, se especifica que es un valor
obtenido mediante análisis de anchura. Los análisis de sección y
anchura están en módulos de análisis separados en el software
Nanoscope IIIa. Generalmente, para análisis de LDDA, existe una
desviación sistemática entre los tamaños obtenidos mediante análisis
de sección y aquellos obtenidos mediante análisis de anchura. Es
decir, para un barrido de 4 \mum, el análisis de sección
proporciona alturas que son habitualmente aproximadamente 0,5 nm
mayores, dando así como resultado una desviación de aproximadamente
0,5 nm en los valores obtenidos para los tamaños de los
glóbulos.
El análisis mediante electroforesis en gel se
llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 15% y se visualizó
mediante tinción con azul de Coomasie. Se resolvieron los LDDA en
geles con tris-glicina al 4-20% en
condiciones no desnaturalizantes (Novex). Se realizó la
electroforesis a 20 mA durante aproximadamente 1,5 horas. Se
resolvieron las proteínas con SDS-PAGE como se
describe en Zhang et al., J. Biol. Chem., 269,
25247-25250, 1994. Se visualizó después la proteína
utilizando tinción con plata (por ejemplo como se describe por
Sherchenko et al., Anal. Chem., 68,
850-858, 1996). Las proteínas en gel de geles
nativos y con SDS se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
según Zhang et al. (J. Biol. Chem., 269,
25247-25250, 1994). Se realizaron
inmunotransferencias con anticuerpo 6E10 biotinilado (Senetak, Inc.,
St. Louis, Missouri) a 1:5000 y se visualizaron utilizando ECL
(Amersham). Típicamente, se barrieron los geles utilizando un
densitómetro. Esto permitió la provisión de imágenes generadas por
ordenador de los geles (por ejemplo frente a fotografías de los
geles mismos).
La caracterización del tamaño de los LDDA
mediante análisis de sección por MFA (por ejemplo como se describe
en Stine et al., J. Protein. Chem., 15,
193-203, 1996) o análisis de anchura (software
Nanoscope III) indicó que la especie predominante eran glóbulos de
aproximadamente 4,7 nm a aproximadamente 6,2 nm a lo largo del eje
z. La comparación con proteínas globulares pequeñas (A\beta
1-40 monomérica, aprotinina, bFGF, anhidrasa
carbónica) sugirió que los LDDA tenían una masa entre
17-42 kDa. Pueden reconocerse lo que parecen ser
especies distintas. Éstas parecen corresponder a glóbulos de
dimensiones de aproximadamente 4,9 nm a aproximadamente 5,4 nm, de
aproximadamente 5,4 nm a aproximadamente 5,7 nm y de aproximadamente
5,7 nm a aproximadamente 6,2 nm. Los glóbulos de dimensiones de
aproximadamente 4,9-5,4 nm y 5,7-6,2
nm parecen comprender aproximadamente un 50% de los glóbulos.
En consonancia con el análisis de MFA, las
inmunotransferencias de SDS-PAGE de LDDA
identificaron oligómeros de A\beta de aproximadamente 17 kDa a
aproximadamente 22 kDa, con abundante monómero de 4 kDa presente,
presumiblemente un producto de degradación. Consistentemente con
esta interpretación, los geles de poliacrilamida no
desnaturalizantes de LDDA muestran escaso monómero, con una banda
primaria cerca de 30 kDa, una banda menos abundante a \sim17 kDa,
y ninguna evidencia de fibrillas ni agregados. Las imágenes
generadas por ordenador de un gel nativo teñido con plata y un gel
de SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie se indican
en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. La correspondencia
entre los geles con SDS y no desnaturalizantes confirma que el
pequeño tamaño oligomérico de los LDDA no fue debido a la acción
detergente. Los oligómeros observados en preparaciones de LDDA
fueron más pequeños que la clusterina (Mr 80 kDa, 40 kDa en geles
desnaturalizados), como se esperaba por el uso de bajas
concentraciones de clusterina (1/40 respecto a A\beta, con la
asociación impedida de A\beta en forma de complejos de
A\beta-clusterina 1:1).
Se fraccionó una preparación de LDDA según la
invención en una columna Superdex 75 (Pharmacia, columna Superose
75PC 3,2/3,0). La fracción que comprende los LDDA fue la tercera
fracción de absorbancia UV que eluía de la columna, y se analizó por
MFA y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Se describe un análisis de MFA representativo de la fracción 3 en la
Figura 3. El fraccionamiento dio como resultado una mayor
homogeneidad para los LDDA, teniendo la mayoría de los glóbulos
dimensiones de aproximadamente 4,9 nm a aproximadamente 5,4 nm. La
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de la
fracción demostró una banda pesada inferior correspondiente a la
forma monomérica/dimérica de A\beta. Como se observa también para
la preparación no fraccionada de LDDA, éste parece ser un producto
de degradación de los LDDA. La carga mayor de la fracción reveló una
banda ancha de mayor tamaño (quizás un doblete). Esto confirma
adicionalmente la estabilidad de las estructuras A\beta
oligoméricas no fibrilares ante el SDS.
Aunque se ha propuesto que las estructuras
fibrilares representan la forma tóxica de A\beta (Lorenzo et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91,
12243-12247, 1994; Howlett et al.,
Neurodegen. 4, 23-32, 1995), se
formarán nuevas neurotoxinas que no se comportan como fibrillas
sedimentables cuando se incube A\beta 1-42 con
dosis bajas de clusterina, que se conoce también como "Apo J"
(Oda et al., Exper. Neurol. 136,
22-31, 1995; Oda et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 204, 1131-1136, 1994). Para
ensayar si estas toxinas de sedimentación lenta podrían seguir
conteniendo fibrillas pequeñas o nacientes, se examinaron las
preparaciones de A\beta tratadas con clusterina mediante
microscopía de fuerzas atómicas.
El tratamiento con clusterina se llevó a cabo
como se describe en Oda et al. (Exper. Neurol.
136, 22-31, 1995), básicamente añadiendo
clusterina a la incubación descrita en el ejemplo 1. Como
alternativa, el A\beta 1-42 de partida podría
disolverse en HCl 0,1 N en lugar de DMSO, y este A\beta
1-42 de partida podría tener incluso estructuras
fibrilares al inicio. Sin embargo, la incubación con clusterina
durante 24 horas a temperatura ambiente de 37ºC dio como resultado
preparaciones que estaban predominantemente libres de fibrillas,
consistentemente con su lenta sedimentación. Se confirmó esto
mediante experimentos que muestran que la formación de fibrillas se
reduce a medida que aumenta la cantidad de clusterina añadida.
Las preparaciones que resultan del tratamiento
con clusterina comprendían exclusivamente estructuras globulares
pequeñas de aproximadamente 5-6 nm de tamaño,
determinado mediante análisis por MFA de los LDDA fraccionados en
una columna de gel Superdex 75. Se obtuvieron resultados
equivalentes mediante microscopía electrónica convencional. En
contraposición, el A\beta 1-42 que se había
autoasociado en condiciones estándar (Snyder et al.,
Biophys. J., 67, 1216-1228, 1994) en
ausencia de clusterina mostró principalmente una especie grande
fibrilar no difusible. Además, las preparaciones de LDDA resultantes
se pasaron a través de una membrana Centricon de 10 kDa de corte y
se analizaron en un gel en gradiente de
SDS-poliacrilamida. Como puede observarse en la
Figura 4, sólo el monómero pasa a través del filtro Centricon 10,
mientras que los LDDA se retienen por el filtro. El monómero
encontrado después de la separación podría formarse sólo a partir de
las especies de mayor peso molecular retenidas por el
filtro.
filtro.
Estos resultados confirman que las preparaciones
de LDDA tóxicos comprenden oligómeros pequeños libres de fibrillas
de A\beta 1-42, y que los LDDA pueden obtenerse
mediante un tratamiento con clusterina apropiado de
\beta-amiloide.
Los restos tóxicos del ejemplo 4 podrían
comprender estructuras raras que contienen A\beta oligomérica y
clusterina. Aunque Oda et al. (Exper. Neurol.
136, 22-31, 1995) reseñaron que se encontró
que la clusterina aumenta la toxicidad de soluciones de A\beta
1-42, otros han encontrado que la clusterina a
niveles estequiométricos protege frente a la toxicidad de A\beta
1-40 (Boggs, et al., J. Neurochem.,
67, 1324-1327, 1997). En consecuencia, la formación
de LDDA en ausencia de clusterina se caracterizó adicionalmente en
este ejemplo.
Cuando se mantuvieron soluciones de A\beta
1-42 monomérico a baja temperatura en un medio
apropiado, la formación de fibrillas de A\beta sedimentables se
bloqueó casi completamente. El A\beta, sin embargo, se autoasoció
en estas soluciones a baja temperatura, formando LDDA esencialmente
indistinguibles de los rematados por clusterina. Finalmente, se
formaron también LDDA cuando se incubaron soluciones de A\beta
monomérico a 37ºC en medio de cultivo de sección de cerebro pero a
una concentración muy baja (50 nM), indicando un potencial de
formación fisiológica. Todas las preparaciones de LDDA fueron
relativamente estables y no mostraron conversión en fibrillas
durante los experimentos de cultivo en tejido de 24 horas.
Estos resultados confirman que los LDDA se forman
y son estables en condiciones fisiológicas, y sugieren que pueden
formarse de forma similar y ser estables in vivo.
Si los LDDA se inducían mediante clusterina, baja
temperatura o baja concentración de A\beta, los oligómeros
estables que se formaban eran neurotoxinas potentes. Se examinó la
toxicidad en cultivos de sección de cerebro de ratón organotípicos,
que proporcionaron un modelo fisiológicamente relevante para SNC
maduro. El tejido de cerebro se soportó en una interfase de
atmósfera-medio mediante un filtro para mantener una
alta viabilidad en los controles.
Para estos experimentos, se obtuvieron secciones
de cerebro de las cepas B6 129 F2 y JR 2385 (Jackson Laboratories) y
se cultivaron como se describe anteriormente (Stoppini et
al., J. Neurosci. Meth., 37,
173-182, 1991), con modificaciones. Es decir, se
sacrificó un ratón adulto mediante inhalación de dióxido de carbono,
seguido de decapitación rápida. Se sumergió la cabeza en tampón de
disección estéril frío (94 ml de solución salina equilibrada de Gey,
pH 7,2, suplementada con 2 ml de MgCl_{2} 0,5 M, 2 ml de glucosa
al 25% y 2 ml de Hepes 1,0 M), después de lo cual se extrajo el
cerebro y se dispuso en una placa estéril recubierta con Sylgard. Se
extrajo el cerebelo y se realizó un corte de línea media para
separar los hemisferios cerebrales. Se laminó separadamente cada
hemisferio. Se dispuso el hemisferio con el corte de línea media
abajo y se realizó un corte de 30º desde el lado dorsal para
orientar el hemisferio. Se pegó el hemisferio con el corte hacia
abajo sobre una plataforma de plástico de un cortador de tejido
Campden (previamente lavado con etanol) y se sumergió en tampón
estéril enfriado con hielo. Se realizaron secciones de 200 \mum de
grosor de dirección lateral a media, recogiendo aquellas en las que
era visible el hipocampo.
Se transfirió cada sección con el extremo
superior de una pipeta estéril a una pequeña placa Petri que
contenía medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10%
de suero fetal de ternero, 2% de S/P/F (estreptomicina, penicilina y
fungizona; Life Technologies (Gibco, BRL), Gaithersburg, MD), se
observó con un microscopio para verificar la presencia del
hipocampo, y se dispuso sobre un inserto
Millicell-CM (Millipore) en un disco de cultivo de
tejido de pocillo profundo (Falcon, disco de 6 pocillos). Cada
pocillo contenía 1,0 ml de medio de crecimiento, y había
habitualmente dos secciones en cada inserto. Se dispusieron las
secciones en un incubador (6% de CO_{2}, 100% de humedad) durante
una noche. Se retiró el medio de crecimiento y se lavaron los
pocillos con 1,0 ml de Hanks BSS caliente (Gibco, BRL, Life
Technologies). Se añadió a cada pocillo medio definido (DMEM,
suplementos de N2, SPF, por ejemplo como se describe en Bottenstein
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76,
514-517, 1979) que contenía oligómeros
\beta-amiloides, con o sin compuestos inhibidores,
y se continuó la incubación durante 24 horas.
Se midió la muerte celular utilizando el kit de
ensayo LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR). Este es un ensayo
de fluorescencia de doble marcaje en el que se detectan células
vivas mediante la presencia de una esterasa que escinde
calceína-AM a calceína, dando como resultado una
fluorescencia verde. Las células muertas captan etidio homodimérico,
que se intercala con el ADN y tiene una fluorescencia roja. Se llevó
a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante a etidio
homodimérico 2 \muM y calceína 4 \muM. Se obtuvieron imágenes a
los 30 minutos utilizando un microscopio Nikon Diaphot equipado con
epifluorescencia. Se utilizó el sistema de análisis de imágenes
MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Filadelfa, PA) para
cuantificar el número y/o área de las células que muestran
fluorescencia verde o roja.
Para estos experimentos, estuvieron presentes
LDDA durante 24 horas a una dosis máxima de 5 \muM de A\beta
total (concretamente, el A\beta total no fue nunca mayor de 5
\muM en ningún experimento de LDDA). La muerte celular, mostrada
por "tinción falsa de amarillo", estaba casi completamente
limitada al estrato piramidal (CA 3-4) y a la
circunvolución dentada (DG), sugiriendo fuertemente que las neuronas
principales del hipocampo (células piramidales y granulares,
respectivamente) son las dianas de la toxicidad inducida por LDDA.
Además, la viabilidad glial no está afectada por un tratamiento de
24 horas con LDDA de glía primaria de cerebro de rata, determinado
mediante exclusión con azul de tripano y ensayo de MTT (Finch et
al., no publicado). Las regiones de circunvolución dentada (DG)
y CA3 fueron particularmente sensibles y mostraron muerte celular
provocada por LDDA en todos los cultivos obtenidos a partir de
animales de edad P20 (recién destetados) a P84 (adultos jóvenes).
Hasta un 40% de las células de esta región mueren después de
exposición crónica a LDDA. El patrón de muerte neuronal no fue
idéntico al observado para NMDA, que destruía neuronas en DG y CA1
pero no en CA3.
Se trataron algunos cultivos de las regiones DG y
CA3 de hipocampo de animales de más de 20 días de edad con
preparaciones convencionales de A\beta fibrilar. Consistentemente
con la naturaleza no difusible de las fibrillas, no resultó evidente
muerte celular (tinción amarilla) incluso a 20 \muM. El patrón de
tinción para células vivas en este cultivo verificó que se estaba
examinando la región CA3/circunvolución dentada del hipocampo. La
extensión de la muerte celular observada después del tratamiento
convencional con A\beta (concretamente preparaciones de A\beta
fibrilar) fue indistinguible de controles negativos a cuyos cultivos
se añadieron medio o medio con suplemento de clusterina. En
controles típicos, la muerte celular fue menor de un 5%. De hecho,
pudo encontrarse una alta viabilidad en los controles incluso en
cultivos mantenidos varios días después de un experimento típico, lo
que confirma que la supervivencia celular no estaba comprometida por
las condiciones de cultivo estándar.
Se llevó a cabo un experimento de respuesta a la
dosis para determinar la potencia de los LDDA para provocar la
muerte celular. Se utilizó el análisis de imágenes para cuantificar
las células muertas y la tinción de células vivas en campos que
contienen las áreas DG/CA3. La Figura 5 ilustra el % de células
muertas frente a la concentración de LDDA medida como concentración
inicial de \beta-amiloide 1-42
(nM). Debido a las dificultades de cuantificar las secciones de
cerebro, los resultados no son suficientemente detallados para
determinar la CE50 con precisión. Sin embargo, como puede observarse
en la Figura 5, incluso después de una dilución de 1000 veces
(A\beta \sim5 nM), la muerte celular provocada por LDDA fue
mayor de un 20%. Se observó toxicidad incluso con LDDA 0,3 nM. Esto
contrasta con los resultados obtenidos con A\beta envejecido
convencionalmente, que es tóxico para las neuronas en cultivo de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 \muM. Estos datos muestran
que los LDDA son eficaces a dosis aproximadamente
1.000-10.000 veces menores que las utilizadas en
experimentos de A\beta fibrilar.
Estos datos de secciones de hipocampo confirman
así la naturaleza ultratóxica de los LDDA. Además, debido a que los
LDDA tuvieron que pasar a través de un filtro de soporte del cultivo
para causar la muerte celular, los resultados validan que los LDDA
son difusibles, consistentemente con su pequeño tamaño oligomérico.
Además, los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden
emplearse como un ensayo de los cambios mediados por LDDA en la
viabilidad celular. En particular, el ensayo puede llevarse a cabo
coincubando o coadministrando junto con los LDDA agentes que pueden
aumentar o reducir potencialmente la formación y/o actividad de
LDDA. Los resultados obtenidos con dicha coincubación o
coadministración pueden compararse con los resultados obtenidos con
la inclusión de LDDA solos.
Este ejemplo da a conocer un ensayo que puede
emplearse para detectar un cambio de toxicidad temprana en respuesta
a oligómeros \beta-amiloides.
Para estos experimentos, se pasaron células PC12
a 4 x 10^{4} células/pocillo a una placa de cultivo de 96 pocillos
y se dejaron crecer durante 24 horas en DMEM + 10% de suero fetal de
ternero + 1% de S/P/F (estreptomicina, penicilina y fungizona). Se
trataron las placas con
poli-L-lisina 200 \mug/ml durante
2 horas antes del sembrado de placas para potenciar la adhesión
celular. Se dejó un conjunto de seis pocillos sin tratar y se
alimentó con medio fresco, mientras que otro conjunto de pocillos se
trató con control vehículo (PBS que contiene 10% de HCl 0,01 N
envejecido una noche a TA). Se trataron los controles positivos con
Triton (al 1%) y azida de sodio (al 0,1%) en medio de crecimiento
normal. Se añadieron a las células durante 24 horas los oligómeros
\beta-amiloides preparados como se describe en el
ejemplo 1, u obtenidos tras coincubación con clusterina, con y sin
compuestos inhibidores presentes. Después de la incubación de 24
horas, se añadió MTT (0,5 mg/ml) a las células durante 2,5 horas (11
\mul de solución madre 5 mg/ml solubilizada en PBS en 100 \mul
de medio). Las células sanas reducen el MTT a un producto coloreado
de azul de formazano. Después de la incubación con MTT, se aspiró el
medio y se añadieron 100 \mul de 100% de DMSO para lisar las
células y disolver los cristales azules. Se incubó la placa durante
15 min a TA y se leyó en un lector de placas (ELISA) a 550 nm.
Se describen los resultados de uno de dichos
experimentos en la Figura 6. Como puede observarse en esta figura,
las células control no expuestas a LDDA ("cont."), las células
expuestas a clusterina sola ("Apo J") y las células expuestas a
A\beta monomérico ("A\beta") no muestran toxicidad celular.
En contraposición, las células expuestas a
\beta-amiloide coagregadas con clusterina y
envejecidas un día ("A\beta:Apo J") muestran una disminución
de la reducción de MTT, evidenciando un cambio de la toxicidad
temprana. Se confirmó por MFA que estas últimas preparaciones de
amiloide carecían de fibrillas amiloides.
Los resultados de este experimento confirman por
tanto que las preparaciones de LDDA obtenidas por coagregación de
A\beta mediada por clusterina han potenciado la toxicidad. Además,
los resultados confirman que la respuesta de estrés oxidativo de P12
puede emplearse como ensayo para detectar cambios celulares
tempranos debidos a LDDA. El ensayo puede llevarse a cabo
coincubando o coadministrando junto con los LDDA agentes que pueden
aumentar o reducir potencialmente la formación y/o actividad de
LDDA. Los resultados obtenidos con dicha coincubación o
coadministración pueden compararse con los resultados obtenidos con
la inclusión de LDDA solos.
Este ejemplo da a conocer un ensayo adicional de
cambios celulares mediados por LDDA. Es decir, el ensayo de
toxicidad por estrés oxidativo con MTT presentado en el ejemplo
precedente puede llevarse a cabo con células HN2 en lugar de células
PC12. Pueden emplearse de forma similar otras células
apropiadas.
Para este ensayo, se pasaron células HN2 a 4 x
10^{4} células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos y se
dejaron crecer durante 24 horas en DMEM + 10% de suero fetal de
ternero + 1% de S/P/F (estreptomicina, penicilina y fungizona). Se
trataron las placas con
poli-L-lisina 200 \mug/ml durante
2 horas antes del sembrado celular para potenciar la adhesión
celular. Se diferenciaron las células durante 24-48
horas con ácido retinoico 5 \muM y se inhibió adicionalmente el
crecimiento con suero al 1%. Se dejó sin tratar un conjunto de
pocillos y se administró medio fresco. Se trató otro conjunto de
pocillos con el control vehículo (DMSO al 0,2%). Se trataron los
controles positivos con Triton (al 1%) y azida de sodio (al 0,1%).
Se añadieron a las células durante 24 horas los oligómeros
\beta-amiloides preparados como se describe en el
ejemplo 1, con y sin compuestos inhibidores presentes. Después de la
incubación de 24 horas, se añadió MTT (0,5 mg/ml) a las células
durante 2,5 horas (11 \mul de solución madre 5 mg/ml en 100 \mul
de medio). Después de la incubación con MTT, se aspiró el medio y se
añaden 100 \mul de 100% de DMSO para lisar las células y disolver
los cristales azules. Se incubó la placa durante 15 minutos a TA y
se leyó en un lector de placas (ELISA) a 550 nm.
Este ensayo puede llevarse a cabo de forma
similar coincubando o coadministrando junto con los LDDA agentes que
pueden aumentar o reducir potencialmente la formación y/o actividad
de LDDA. Los resultados obtenidos con dicha coincubación o
coadministración pueden compararse con los resultados obtenidos con
la inclusión de LDDA solos.
Este ejemplo da a conocer aún otro ensayo de
cambios celulares mediados por LDDA, el ensayo de morfología celular
mediante microscopía de fase.
Para este ensayo, se hicieron crecer cultivos a
baja densidad (50-60% de confluencia). Para iniciar
el experimento, se dispusieron las células en medio F12 sin suero
durante 1 hora. Se incubaron después las células durante 3 horas con
oligómeros \beta-amiloides preparados como se
describe en el ejemplo 1, con y sin compuestos inhibidores añadidos
a las células durante 24 horas. Después de 3 horas, se examinaron en
las células las diferencias morfológicas o se fijaron para marcaje
de inmunofluorescencia. Se examinaron las muestras utilizando el
sistema MetaMorph Image Analysis y una cámara de vídeo MRI
(Universal Imaging, Inc.).
Los resultados de dichos ensayos se presentan en
los ejemplos siguientes. En particular, el ensayo puede llevarse a
cabo coincubando o coadministrando junto con los LDDA agentes que
pueden aumentar o reducir potencialmente la formación y/o actividad
de LDDA. Los resultados obtenidos con dicha coincubación o
coadministración pueden compararse con los resultados obtenidos con
la inclusión de LDDA solos.
Debido a que se han identificado recientemente
receptores de superficie celular en células gliales para A\beta
preparado convencionalmente (Yan et al., Nature,
382, 685-691, 1996; El Khoury et al.,
Nature, 382, 716-719, 1996), y debido
a que la muerte neuronal a bajas dosis de LDDA sugirió la posible
implicación de mecanismos de señalización, se emprendieron
experimentos para determinar si existen sitios de unión a superficie
celular específicos en neuronas para los LDDA.
Para citometría de flujo, se disociaron células
con tripsina al 0,1% y se sembraron al menos durante una noche sobre
un plástico de cultivo de tejido a baja densidad. Se retiraron las
células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría/EDTA
0,5 mM, se lavaron tres veces y se resuspendieron en PBS enfriado
con hielo hasta una concentración final de 500.000 células/ml. Se
incubaron las células en PBS frío con oligómeros
\beta-amiloides preparados como se describe en el
ejemplo 1, excepto porque un 10% del
\beta-amiloide es un análogo
\beta-amiloide 1-42 que contiene
biocitina en la posición 1 sustituyendo al aspartato. Se añadieron a
las células durante 24 horas oligómeros con y sin compuestos
inhibidores presentes. Se lavaron las células dos veces con PBS frío
para retirar los oligómeros \beta-amiloides no
unidos libres, se resuspendieron en una dilución 1:1.000 de avidina
conjugada con fluoresceína y se incubaron durante 1 hora a 4ºC con
agitación suave. Como alternativa, se emplearon anticuerpos
específicos de \beta-amiloide y anticuerpo
secundario fluorescente en lugar de avidina, eliminando la necesidad
de incorporar un 10% del análogo \beta-amiloide
biotinilado. Es decir, se añadió anticuerpo monoclonal 6E10
biotinilado (1 \mul de Senetec Inc., St. Louis, Missouri) a la
suspensión celular y se incubó durante 30 minutos. Se detectó el
anticuerpo unido después de sedimentar las células y resuspender en
500 \mul de PBS, utilizando estreptavidina conjugada con FITC
(1:500, Jackson Laboratories) durante 30 minutos.
Se analizaron las células mediante un escáner de
células activadas por fluorescencia Becton-Dickinson
(FACScan). Se recogieron típicamente 10.000 ó 20.000 eventos tanto
de dispersión frontal (tamaño) como de intensidad de fluorescencia,
y se analizaron los datos mediante software Consort 30
(Becton-Dickinson). Se cuantificó la unión
multiplicando la fluorescencia media por el número total de eventos,
y restando el valor de la fluorescencia celular de fondo en
presencia de 6E10 y FITC.
Para estos experimentos, se realizó el análisis
FACScan para comparar la inmunoreactividad de LDDA en suspensiones
de células de levadura en fase logarítmica (una superficie
mayoritariamente de carbohidrato) y de la estirpe celular neuronal
del SNC B103 (Schubert et al., Nature, 249,
224-227, 1974). Para las células B103, la adición de
LDDA causó un gran aumento de la fluorescencia asociada a las
células, como se muestra en la Figura 7. El tratamiento con tripsina
de las células B103 durante 1 minuto eliminó la unión de LDDA. En
contraposición, las células de levadura control (datos no mostrados)
no demostraron unión de LDDA, verificando la selectividad de los
LDDA por proteínas presentes en la superficie celular. Las
suspensiones de células de hipocampo (tejido tripsinizado seguido
por una recuperación metabólica de 2 horas) unieron también LDDA,
pero con un número reducido de eventos de unión comparado con las
células B103, como evidencia la reducida intensidad de fluorescencia
del pico marcado. Esto aparece en la Figura 8 en forma de un
desplazamiento hacia la izquierda del pico marcado.
Estos resultados sugieren por tanto que los LDDA
ejercen sus efectos mediante la unión a un receptor de superficie
celular específico. En particular, la sensibilidad a la tripsina de
las células B103 mostró que sus sitios de unión a LDDA eran
proteínas de superficie celular, y que la unión era selectiva de un
subconjunto de dominios particulares en estas proteínas.
Además, el presente ensayo puede emplearse
también como un ensayo de unión celular mediada por LDDA. En
particular, el ensayo puede llevarse a cabo coincubando o
coadministrando junto con los LDDA agentes que pueden aumentar o
reducir potencialmente la formación y/o actividad de LDDA. Los
resultados obtenidos con dicha coincubación o coadministración
pueden compararse con los resultados obtenidos con la inclusión de
LDDA solos.
Este ejemplo da a conocer la manera en que puede
inhibirse la formación de LDDA utilizando, por ejemplo, gosipol.
Para estos experimentos, se prepararon LDDA como
se describe en el ejemplo 1. Se añadió gosipol (Aldrich) a una
concentración de 100 \muM durante la incubación de la proteína
A\beta para formar LDDA. Se evaluó la neurotoxicidad de la
preparación resultante utilizando el kit de ensayo LIVE/DEAD® como
se describe anteriormente. La cantidad de muerte celular que ocurrió
después de 24 horas de exposición a la preparación de gosipol/LDDA
fue menor de un 5%. Esto es comparable al nivel de toxicidad
obtenido para una preparación control en DMSO correspondiente
(concretamente al 6%) o una preparación control de gosipol que no
contenía ningún LDDA (concretamente al 4%).
Estos resultados confirman por tanto que
compuestos tales como gosipol pueden emplearse para inhibir la
formación de LDDA.
Debido a que se encontró que la tripsinación de
células B103 bloqueaba la posterior unión de LDDA, se realizaron
experimentos como se da a conocer en este ejemplo para ensayar si
los fragmentos trípticos liberados de la superficie celular retardan
la actividad de unión de LDDA.
Se prepararon los péptidos trípticos utilizando
células B103 confluyentes a partir de cuatro discos de 100 mm que se
retiraron mediante tripsinación (al 0,025%, Life Technologies)
durante aproximadamente 3 minutos. Se añadió inhibidor de
tripsina-quimotripsina (Sigma, 0,5 mg/ml en solución
salina tamponada de Hank), y se retiraron las células mediante
centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Se concentró el
sobrenadante (\sim12 ml) aproximadamente a 1,0 ml utilizando un
filtro Centricon 3 (Amicon), y se congeló después de determinar la
concentración de proteína. Para experimentos de bloqueo, se
añadieron péptidos trípticos concentrados estériles (0,25 mg/ml) a
la sección de cerebro organotípica o a las células B103 suspendidas
en el ensayo FACS al mismo tiempo que se añadían los LDDA.
En ensayos FACScan, los péptidos trípticos
liberados al medio de cultivo (0,25 mg/ml) inhibieron la unión de
LDDA en >90% como se muestra en la Figura 9. En comparación, las
células control expuestas a BSA, incluso a 100 mg/ml, no tuvieron
pérdida de unión. Los péptidos trípticos, si se añadían después de
que los LDDA estuvieran ya unidos a las células, no redujeron
significativamente las intensidades de fluorescencia. Esto indica
que los péptidos no comprometieron la capacidad del ensayo de
cuantificar los LDDA unidos. Además de bloquear la unión de LDDA,
los péptidos trípticos eran también antagonistas de la muerte
celular provocada por LDDA. Es decir, como se muestra en la Figura
9, la adición de péptidos trípticos dio como resultado un 75% de
reducción de la muerte celular, p < 0,002.
Estos datos confirman que proteínas de superficie
celular particulares median la unión de LDDA, y que los péptidos
trípticos solubilizados de la superficie celular proporcionan
actividad neutralizante de LDDA neuroprotectora. Además, el presente
ensayo puede emplearse también como ensayo para agentes que median
la unión celular de LDDA o efectos de LDDA sobre la actividad
celular. En particular, el ensayo puede llevarse a cabo coincubando
o coadministrando junto con los LDDA agentes que pueden aumentar o
reducir potencialmente la formación y/o actividad de LDDA. Los
resultados obtenidos con dicha coincubación o coadministración
pueden compararse con los resultados obtenidos con la inclusión de
LDDA solos. Además, puede compararse la adición de los agentes antes
o después de la unión de los LDDA a la superficie celular para
identificar agentes que afectan a dicha unión, o que actúan después
de que haya ocurrido la unión.
Este ejemplo da a conocer experimentos de
respuesta a la dosis realizados para determinar si la unión de LDDA
a la superficie celular es saturable. Se esperaría dicha
saturabilidad si los LDDA interaccionaran de hecho con un receptor
de superficie celular particular.
Para estos estudios, se incubaron células B103
con cantidades crecientes de LDDA y se cuantificó la unión de LDDA
mediante análisis FACScan. Se presentan los resultados en la Figura
10. Estos resultados confirman que se alcanza una clara meseta para
la unión de LDDA. La saturabilidad de la unión de LDDA ocurre a una
concentración relativa de A\beta 1-42
(concretamente una concentración de LDDA respecto a A\beta) de
aproximadamente 250 nM.
Estos resultados confirman por tanto que la unión
de LDDA es saturable. Dicha saturabilidad de la unión de LDDA,
especialmente cuando se consideran los resultados de los estudios de
tripsina, valida que los LDDA estén actuando mediante un receptor de
superficie celular particular.
Este ejemplo da a conocer un ensayo basado en
célula, particularmente un ensayo de inmunosorción ligado a enzima
basado en célula (ELISA) que puede emplearse para evaluar la
actividad de unión de LDDA.
Para estos estudios, se dispusieron 48 horas
antes de realizar el experimento 2,5 x 10^{4} células B103
presentes en forma de una suspensión en 100 \mul de DMEM en cada
pocillo de ensayo de una placa de microvaloración de 96 pocillos, y
se mantuvieron en un incubador a 37ºC. 24 horas antes de realizar el
experimento, se prepararon LDDA según el método descrito en el
ejemplo 1. Para empezar el ensayo, se trató cada pocillo de la placa
de microvaloración que contiene células con 50 \mul de fijante
(3,7% de formalina en DMEM) durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Se retiró esta solución fijante/DMEM y se llevó a cabo un
segundo tratamiento con 50 \mul de formalina (sin DMEM) durante 15
minutos a temperatura ambiente. Se retiró el fijante y se lavó cada
pocillo dos veces con 100 \mul de tampón salino tamponado con
fosfato (PBS). Se añadieron 200 \mul de un agente de bloqueo (BSA
al 1% en PBS) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente
durante 1 hora. Después de 2 lavados con 100 \mul de PBS, se
añadieron 50 \mul de LDDA (previamente diluidos 1:10 en PBS) a los
pocillos apropiados, o PBS solo como control, y se incubaron los
pocillos resultantes a 37ºC durante 1 hora. Se llevaron a cabo 3
lavados con 100 \mul de PBS, y se añadieron 50 \mul de 6E10
biotinilado (Senetek) diluido 1:1000 en BSA al 1%/PBS a los pocillos
apropiados. En otros pocillos, se añadió PBS como control. Después
de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en un
agitador rotatorio, se lavaron los pocillos 3 veces con 50 \mul de
PBS, se añadieron 50 \mul del reactivo ABC (kit Elite ABC, Vector
Labs) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en el
agitador rotatorio. Después de lavar 4 veces con 50 \mul de PBS,
se añadieron 50 \mul de solución de sustrato ABTS a cada pocillo y
se incubó la placa en la oscuridad a temperatura ambiente. Se
analizó en la placa el aumento de absorción a 405 nm. Sólo cuando
estaban presentes LDDA, células y 6E10, hubo una señal
significativa, como se ilustra en la Figura 11.
Estos resultados confirman adicionalmente que
puede emplearse un ensayo ELISA basado en célula como ensayo de la
unión celular mediada por LDDA. En particular, el ensayo puede
llevarse a cabo coincubando o coadministrando junto con los LDDA
agentes que pueden aumentar o reducir potencialmente la formación
y/o actividad de LDDA. Los resultados obtenidos con dicha
coincubación o coadministración pueden compararse con los resultados
obtenidos con la inclusión de LDDA solos.
Para investigar adicionalmente la potencial
implicación de la transducción de señal en la toxicidad de LDDA, los
experimentos en este ejemplo compararon el impacto de los LDDA sobre
secciones de cerebro de animales isogénicos fyn -/- y fyn
+/+. Fyn pertenece a la familia Src de proteína tirosina quinasas,
que son básicas para múltiples señales y respuestas celulares
(Clarke et al., Science, 268,
233-238). Fyn es particularmente interesante porque
está potenciada en neuronas aquejadas por EA (Shirazi et al.,
Neuroreport., 4, 435-437, 1993).
Parece que está también activada por preparaciones de A\beta
convencionales (Zhang et al., Neurosci. Letts.,
211, 187-190, 1996), que se ha mostrado
posteriormente que contienen LDDA por MFA. Los ratones con
eliminación genética de Fyn, además, tienen una apoptosis reducida
en el hipocampo en desarrollo (Grant et al., Science,
258, 1903-1910, 1992).
Para estos estudios, se trataron ratones con
eliminación genética de Fyn (Grant et al., Science,
258, 1903-1910, 1992) como se describe en los
ejemplos precedentes, comparando las imágenes de secciones de
cerebro de ratones tratados o no tratados con LDDA durante 24 horas
para determinar las células muertas en el área DG y CA3. La
comparación cuantitativa (presentada en la Figura 12) se obtuvo con
barras de error que representan medias \pm ETM para
4-7 secciones.
En contraposición con cultivos de animales de
tipo silvestre, los cultivos de animales fyn -/- mostraron
una muerte celular provocada por LDDA insignificante, como se
muestra en la Figura 12. Para los LDDA, el nivel de muerte celular
en secciones fyn +/+ fue más de cinco veces la de cultivos
fyn -/-. En cultivos fyn -/-, la muerte celular en
presencia de LDDA estaba al nivel del fondo. La respuesta
neuroprotectora era selectiva; la muerte celular en hipocampo
provocada por antagonistas de receptor de NMDA (Bruce et al.,
Exper. Neurol., 132, 209-219, 1995;
Vornov et al., Neurochem., 56,
996-1006, 1991) no se vio afectada (no mostrado). El
análisis (ANOVA) utilizando la comparación múltiple de Tukey
proporcionó un valor de P < 0,001 para los datos de LDDA
fyn +/+, comparado con todas las demás condiciones.
Estos resultados confirman que la pérdida de
quinasa Fyn protegía a las regiones DG y CA3 de hipocampo de la
muerte celular inducida por LDDA. Los resultados validan que la
toxicidad de LDDA está mediada por un mecanismo bloqueado por la
eliminación genética de proteína tirosina quinasa. Estos resultados
sugieren adicionalmente que pueden obtenerse beneficios
neuroprotectores mediante tratamientos que anulen la actividad de la
proteína tirosina quinasa Fyn o la expresión del gen que codifica la
proteína quinasa Fyn.
Para investigar adicionalmente la implicación
potencial de la transducción de señal en la toxicidad de LDDA, los
experimentos en este ejemplo compararon el impacto de los LDDA sobre
la activación de astrocitos.
Para estos experimentos, se prepararon cultivos
de astrocitos corticales a partir de cachorros de rata
Sprague-Dawley neonatos (de 1-2
días) mediante el método de Levison y McCarthy (Levison et
al., en: Banker et al. (ed.) "Culturing Nerve
Cells", MIT Press, Cambridge, MA, 309-336, 1991)
como se describe anteriormente (Hu et al., J. Biol.
Chem., 271, 2543-2547, 1996). Brevemente,
se cortó corteza cerebral, se tripsinizó y se cultivaron las células
en \alpha-MEM (Gibco, BRL) que contenía 10% de
suero fetal bovino (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) y
antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina).
Después de 11 días en cultivo, se tripsinizaron las células, se
resembraron en placas de 100 mm a una densidad de \sim6 x 10^{5}
células/placa y se dejaron crecer hasta confluencia (Hu et
al., J. Biol. Chem., 271,
2543-2547, 1996).
Se trataron los astrocitos con LDDA preparados
según el ejemplo 1, o con A\beta 17-42
(sintetizado según Lambert et al., J. Neurosci. Res.,
39, 377-384, 1994; también comercialmente
disponible). Se realizó el tratamiento tripsinizando cultivos
confluyentes de astrocitos y sembrando en discos de cultivo de
tejido de 60 mm a una densidad de 1 x 10^{6} células/disco (por
ejemplo para análisis de ARN y ELISA), en portaobjetos con cámara de
4 pocillos a 5 x 10^{4} células/pocillo (por ejemplo para
inmunohistoquímica), o en placas de 96 pocillos a una densidad de 5
x 10^{4} células/pocillo (por ejemplo para ensayos de NO). Después
de 24 horas de incubación, se lavaron dos veces las células con PBS
para retirar el suero, y se incubaron los cultivos en
\alpha-MEM que contenía suplementos de N2 durante
24 horas adicionales antes de la adición de péptidos A\beta o
tampón control (concretamente diluyente que contiene tampón).
Se realizó el examen de morfología de los
astrocitos examinando las células con un microscopio invertido Nikon
TMS equipado con una cámara Javelin SmartCam, un monitor de vídeo
Sony y una videoimpresora a color. Típicamente, se fotografiaron
cuatro campos microscópicos seleccionados arbitrariamente (20x
aumentos) para cada condición experimental. Se cuantificó la
activación morfológica a partir de las fotografías con NIH Image
contando el número de células activadas (definido como una célula
con uno o más procesos de al menos un cuerpo celular de longitud) en
los cuatro campos.
Los niveles de ARNm en los cultivos se determinó
con el uso de transferencias Northern y transferencias en ranura.
Esto se realizó exponiendo células a LDDA o tampón control durante
24 horas. Después de este tiempo, se lavaron las células dos veces
con PBS tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) y se aisló el
ARN total mediante minicolumnas de purificación RNeasy (Qiagen,
Inc., Chatsworth, CA) como se recomienda por el fabricante. Los
rendimientos típicos de ARN fueron de 8 a 30 mg de ARN total por
disco. Para análisis de transferencia Northern, se separaron 5 mg de
ARN total por muestra en un gel de
agarosa-formaldehído, se transfirieron mediante
acción capilar a una membrana Hybond-N (Amersham,
Arlington Heights, IL) y se reticularon con UV. Para análisis de
transferencia en ranura, se transfirieron 200 ng de ARN total por
muestra a una membrana Duralon-UV (Stratagene, La
Jolla, CA) a vacío, y se reticularon con UV. Se realizó la
confirmación de las cargas de ARN equivalente mediante tinción con
bromuro de etidio o mediante hibridación y normalización con una
sonda GAPDH.
Se generaron sondas mediante digestiones con
enzimas de restricción de plásmidos y la posterior purificación en
gel del fragmento apropiado. Es decir, se prepararon fragmentos de
ADNc mediante RT-PCR utilizando el ARN total de
astrocitos corticales de rata. Se transcribió inversamente el ARN
con un sistema Superscript II (GIBCO/BRL) y se realizó una PCR en un
controlador térmico PTC-100 (MJ Research Inc.,
Watertown, MA) utilizando 35 ciclos con la siguiente configuración:
52ºC durante 40 segundos; 72ºC durante 40 segundos; 96ºC durante 40
segundos. Los pares cebadores utilizados para amplificar un
fragmento de 447 pb de IL-1\beta de rata fueron:
de codificación:
5'-GCACCTTCTTTCCCTTCATC-3' [SEC ID
Nº 1]. Inverso:
5'-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3' [SEC ID
Nº 2]. Los pares cebadores utilizados para amplificar un fragmento
de 435 pb de GFAP de rata fueron: de codificación:
5'-CAGTCCTTGACCTGCGACC-3' [SEC ID Nº
3]. Inverso:
5'-GCCTCACATCACATCCTTG-3' [SEC ID Nº
4]. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCR2.1 con el kit
de clonación Invitrogen TA, y los constructos se verificaron
mediante secuenciación de ADN. Se prepararon las sondas mediante
digestión con EcoRI del vector, seguido de purificación en
gel de los fragmentos apropiados. Los plásmidos fueron el plásmido
de ADNc de iNOS de rata pAstNOS-4, correspondiente a
las bases de ADNc de iNOS 3007-3943 (Galea et
al., J. Neurosci. Res., 37,
406-414, 1994), y el plásmido de ADNc de GAPDH de
rata pTRI-GAPDH (Ambion, Inc., Austin, TX).
Se marcaron las sondas (25 ng) con
^{32}P-dCTP utilizando un kit de marcaje por
cebado aleatorio Prime-a-Gene
(Promega, Madison, WI), y se separaron de los nucleótidos no
incorporados mediante el uso de columnas de impulsión (Stratagene).
Se realizó la hibridación en condiciones rigurosas con una solución
QuikHyb (Stratagene), utilizando el protocolo recomendado para
hibridación rigurosa. Brevemente, se realizó la prehibridación a
68ºC durante aproximadamente 30 a 60 minutos, y la hibridación fue a
68ºC durante aproximadamente 60 minutos. Se lavaron después las
transferencias en condiciones rigurosas y se expusieron a
autorradiografía o placa Phosphoimaging. Se barrieron los
autorradiogramas con un escáner láser BioRad GS-670,
y se cuantificó la densidad de banda con software de análisis de
imagen Molecular Analyst v2.1 (BioRad, Hercules, CA). Se capturaron
las imágenes PhosphoImage en un sistema Storm 840 (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA) y se cuantificó la densidad de banda con
software de análisis de imagen Image Quant v.1.1 (Molecular
Dynamics).
Para la medida del NO mediante ensayo de nitrito,
se incubaron las células con péptidos A\beta o tampón control
durante 48 horas, y después se midieron los niveles de nitrilo en el
medio acondicionado mediante la reacción de Griess como se describe
anteriormente (Hu et al., J. Biol. Chem., 271,
2543-2547, 1996). Cuando se utilizó el inhibidor de
NOS éster metílico de
N-nitro-L-arginina (L) o el
isómero D inactivo, estos agentes se añadieron a los cultivos al
mismo tiempo que el A\beta.
Los resultados de estos experimentos se presentan
en la Figura 13. Como puede observarse en esta figura, la activación
de la glía aumenta cuando se incuban los astrocitos con LDDA, pero
no con cuando se incuban los astrocitos con A\beta
17-42.
Estos resultados confirman que los LDDA activan
las células gliales. Es posible que las proteínas gliales puedan
contribuir a los déficit neuronales, por ejemplo, como ocurre en la
enfermedad de Alzheimer, y que algunos efectos de los LDDA puedan
estar realmente mediados indirectamente por la activación de células
gliales. En particular, las proteínas gliales pueden facilitar la
formación de LDDA o los efectos mediados por LDDA que ocurren cadena
abajo de la unión a receptor. Además, es conocido que la clusterina
está potenciada en el cerebro de sujetos aquejados de Alzheimer, y
la clusterina está a niveles elevados sólo en células gliales que
están activadas. Basándose en esto, la activación de células gliales
mediante un estímulo no amiloide no LDDA podría producir clusterina,
que a su vez podría conducir a LDDA, que a su vez dañarían las
neuronas y causarían una activación adicional de las células
gliales.
Independientemente del mecanismo, estos
resultados sugieren adicionalmente que pueden obtenerse efectos
neuroprotectores mediante tratamientos que modulan (concretamente
aumentan o reducen) la activación de células gliales mediada por
LDDA. Además, los resultados sugieren que el bloqueo de estos
efectos sobre células gliales, aparte de bloquear los efectos
neuronales, puede ser beneficioso.
La potenciación a largo plazo (PLP) es un
paradigma clásico para plasticidad sináptica y un modelo para la
memoria y el aprendizaje, facultades que se pierden selectivamente
en la etapa temprana de la EA. Este ejemplo da a conocer
experimentos realizados para examinar los efectos de los LDDA sobre
la PLP, particularmente la PLP de células granulares de senda
perforante media.
Inyecciones de animales intactos: Se
anestesiaron ratones con uretano y se dispusieron en un aparato
estereotáxico. Se mantuvo la temperatura corporal utilizando una
almohadilla con camisa llena de agua caliente. Se expuso la
superficie cerebral mediante orificios en el cráneo. Las posiciones
de bregma y lambda para inyección en la capa molecular media del
hipocampo están 2 mm posterior al bregma, 1 mm lateral a la línea
media y 1,2-1,5 mm ventral a la superficie celular.
Las inyecciones de oligómero \beta-amiloide fueron
por descarga de nitrógeno mediante pipetas de vidrio de \sim10 nm
de diámetro. Se administraron volúmenes de 20-50 nl
de solución de oligómero \beta-amiloide (180 nM de
\beta-amiloide en solución salina tamponada con
fosfato, PBS) durante el transcurso de una hora. Los ratones control
recibieron un volumen equivalente de PBS solo. Se dejó descansar al
animal durante periodos de tiempo variables antes de administrar el
estímulo de PLP (típicamente 60 minutos).
PLP en animales inyectados: Los
experimentos siguen el paradigma establecido por Routtenberg y
colaboradores para PLP en ratones (Namgung et al., Brain
Research, 689, 85-92, 1995). Se utilizó
la estimulación de la ruta perforante desde la corteza entorrinal,
con registro de la capa molecular media y del cuerpo celular de la
circunvolución dentada. Se observaron una población de potencial
postsináptico excitatorio (pob-EPSP) y una población
de potencial espiga (pob-espiga) tras la
estimulación eléctrica. La PLP pudo inducirse en estas respuestas
mediante un estímulo de 3 trenes de 400 Hz, 8 pulsos x 0,4 ms/tren
(Namgung et al., Brain Research, 689,
85-92, 1995). Se tomaron registros durante
2-3 horas después del estímulo (concretamente
aplicado a tiempo 0) para determinar si se retiene la PLP. Se
sacrificó después el animal inmediatamente, o se dejó recuperar
durante 1, 3 ó 7 días y después se sacrificó como anteriormente. Se
crioprotegió el cerebro con sacarosa al 30% y se seccionó después
(30 \mum) con un microtomo. Se dispusieron algunas secciones en
portaobjetos impregnados con gelatina y otras se analizaron
utilizando un protocolo de flotación libre. Se utilizó la
inmunohistoquímica para monitorizar los cambios de
GAP-43, subtipos de PKC y fosforilación de proteína
de tau (PHF-1), paxilina y quinasa de adhesión
focal. Se analizaron las formas de onda informáticamente como se
describe anteriormente (Colley et al., J. Neurosci.,
10, 3353-3360, 1990). Un ANOVA de 2 factores
compara los cambios en la amplitud de espiga entre los grupos
tratados y no tratados.
La Figura 14 ilustra el efecto de amplitud de
espiga de los LDDA en animales completos. Como puede observarse
claramente en esta figura, los LDDA bloquean la fase de persistencia
de la PLP inducida por estímulos eléctricos de alta frecuencia
aplicados a la corteza entorrinal y medida como amplitud de espiga
del cuerpo celular en la capa molecular media de la circunvolución
dentada.
Después de realizar el experimento de PLP, se
dejaron recuperar los animales durante diversos periodos y se
sacrificaron después utilizando anestésico pentobarbitol de sodio y
perfusión con 4% de paraformaldehído. Para estudios de viabilidad,
se utilizaron periodos de 3 horas, 24 horas, 3 días y 7 días. Se
crioprotegió el cerebro con sacarosa al 30% y después se seccionó
(30 \mum) con un microtomo. Se dispusieron las secciones en
portaobjetos impregnados con gelatina y se tiñeron inicialmente con
violeta de cresilo. Se midió la pérdida celular contando los cuerpos
celulares en la circunvolución dentada, CA3, CA1 y corteza
entorrinal, y se correlacionó con la dosis y el tiempo de exposición
a LDDA. Los resultados de estos experimentos confirmaron que no
ocurría muerte celular 24 horas después de los experimentos de
PLP.
De forma similar, se examinó la respuesta de PLP
en secciones de hipocampo de ratas adultas jóvenes. Como puede
observarse en la Figura 15, la incubación de secciones de hipocampo
de rata con LDDA evita la PLP mucho antes de cualquier signo abierto
de degeneración celular. Las secciones de hipocampo (n= 6) expuestas
a LDDA 500 nM durante 45 minutos antes no mostraron potenciación de
la población de espiga 30 minutos después de la estimulación
tetánica (amplitud media 99\pm7,6%) a pesar de continuar la
capacidad de potenciales de acción. En contraposición, la PLP se
indujo fácilmente en secciones incubadas con vehículo (n= 6), con
una amplitud de 138\pm8,1% durante los últimos 10 minutos; este
valor es comparable al demostrado anteriormente en este grupo de
edad (Trommer et al., Exper. Neurol., 131,
83-92, 1995). Aunque la PLP estuvo ausente en
secciones tratadas con LDDA, sus células fueron competentes para
generar potenciales de acción y no mostraron signos de
degeneración.
Estos resultados validan que tanto en animales
completos como en secciones de tejido, la adición de LDDA da como
resultado una desestabilización significativa de la PLP en menos de
una hora, antes que cualquier degeneración o muerte celular. Estos
experimentos apoyan por tanto que los LDDA ejercen efectos muy
tempranos sobre, e interferencia con, la formación y/o actividad de
LDDA, y pueden emplearse por tanto para obtener un efecto
terapéutico antes de la progresión de una enfermedad, trastorno o
afección (por ejemplo enfermedad de Alzheimer) a una etapa en la que
resulte muerte celular. En otras palabras, estos resultados
confirman que las disminuciones de memoria ocurren antes de que
mueran las neuronas. Las interferencias antes de dicha muerte
celular pueden emplearse por tanto para invertir la progresión y
potencialmente restaurar las disminuciones de memoria.
Este ejemplo da a conocer los efectos tempranos
de los LDDA in vivo y la manera en que el conocimiento de
dichos efectos tempranos puede manipularse.
Los síntomas primarios de la enfermedad de
Alzheimer implican déficit de aprendizaje y memoria. Sin embargo, la
conexión entre déficit de comportamiento y depósitos amiloides
agregados ha sido difícil de establecer. En ratones transgénicos, el
mutante que sobreexpresa PPA bajo el control del promotor del factor
de crecimiento derivado de plaquetas da como resultado la deposición
de grandes cantidades de amiloide (Games et al.,
Nature, 373, 523-527, 1995). En
contraposición, no se han reseñado déficit de comportamiento
utilizando este sistema. Otros investigadores (concretamente
Nalbantoglu et al., Nature, 387,
500-505, 1997 y Holcomb et al., Nat.
Med., 4, 97-100, 1998) que trabajan con
ratones transgénicos reseñan la observación de déficit de
comportamiento y cognitivos significativos que ocurren mucho antes
de que se observe ningún depósito significativo de amiloide
agregado. Estos defectos de comportamiento y cognitivos incluyen
incapacidad de potenciar a largo plazo (Nalbantoglu et al.,
supra). Estos modelos sugieren colectivamente que las formas no
depositadas de amiloide son responsables de los déficit cognitivos y
de comportamiento tempranos que ocurren como resultado del
malfuncionamiento neuronal inducido. Es consistente con estos
modelos que los nuevos LDDA descritos en la presente memoria sean
esta forma no depositada de amiloide que causa los defectos
cognitivos y de comportamiento. A la vista de esto, los compuestos
moduladores de LDDA según la invención pueden emplearse en el
tratamiento y/o la prevención de estos déficit cognitivos y de
comportamiento que resultan del malfuncionamiento neuronal inducido
por LDDA, o pueden aplicarse los LDDA mismos, por ejemplo en modelos
animales, para estudiar dicho malfuncionamiento neuronal
inducido.
De forma similar, en ancianos humanos, el declive
cognitivo y los déficit de memoria focal pueden ocurrir mucho antes
de realizar un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en probable
etapa I (Linn et al., Arch. Neurol., 52,
485-490, 1995). Estos déficit de memoria focal
pueden resultar de señalización aberrante inducida en neuronas, en
lugar de muerte celular. Otras funciones, tales como habilidades de
escritura de orden superior (Snowdon et al., JAMA,
275, 528-532, 1996) pueden estar afectadas
también por una función neuronal aberrante que ocurre mucho antes
que la muerte celular. Es consistente con lo que se conoce respecto
a estos defectos, y la información respecto a los LDDA proporcionada
en la presente memoria, que los LDDA inducen estos defectos de
manera similar a la función PLP comprometida tal como se induce por
los LDDA. Siguiendo esta línea, los compuestos moduladores de LDDA
según la invención pueden emplearse en el tratamiento y/o la
prevención de estos declive cognitivo y déficit de memoria focal
tempranos, y deterioro de las habilidades de escritura de orden
superior, que resultan de la formación o actividad de LDDA, o los
LDDA mismos pueden aplicarse, por ejemplo en modelos animales, para
estudiar dichos defectos inducidos. En particular, dichos estudios
pueden realizarse tal como es conocido por los expertos en la
técnica, por ejemplo comparando sujetos tratados o tratados con
placebo de edad coincidente.
Este ejemplo describe un método alternativo para
preparar LDDA que puede emplearse en lugar, por ejemplo, de los
métodos descritos en los ejemplos 1 y 4.
La solución madre de monómero
\beta-amiloide se prepara disolviendo el monómero
en hexafluoroisopropanol (HFIP), que se retira posteriormente
mediante evaporación rápida a vacío. Se redisuelve el péptido sólido
en DMSO seco 5 mM para formar una solución madre en DMSO, y se
preparan los LDDA diluyendo 1 \mul de la solución madre en DMSO en
49 \mul de medio F12 (libre de suero, libre de rojo fenol). La
mezcla se agita con vórtex y después se incuba a 4ºC durante 24
horas.
Este ejemplo describe estudios en gel adicionales
realizados en oligómeros \beta-amiloides.
Para el análisis en gel después de la preparación
de oligómeros \beta-amiloides (concretamente
oligómeros preparados como se describe en el ejemplo anterior), se
añade 1 \mul de la solución de oligómero a 4 \mul de F12 y 5
\mul de tampón de carga de tris-tricina, y después
se carga en un gel de tris-tricina al 16,5%
prefabricado (BioRad). Se lleva a cabo la electroforesis durante
2,25 horas a 100 V. Después de la electroforesis, se tiñe el gel
utilizando el kit Silver Xpress (Novex). Como alternativa, en lugar
de teñir el gel, se transfieren las especies
\beta-amiloides del gel a
Hybond-ECL (Amersham) en tampón de transferencia que
contiene SDS durante 1 hora a 100V a 4ºC. Se bloquea la
transferencia en TBS-T1 que contiene 5% de leche
durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con
TBS-T1, se incuba la transferencia con anticuerpo
primario (26D6, 1:2000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El
anticuerpo 26D6 reconoce la región amino-terminal
del \beta-amiloide. Después de un lavado
adicional, se incuba la transferencia con anticuerpo secundario (HRP
anti-ratón, 1:3500) durante 1,5 horas a temperatura
ambiente. Después de más lavado, se incuba la transferencia en
reactivos West Pico Supersignal (500 \mul de cada uno,
suministrados por Pierce) y 3 ml de H_{2}O bd durante 5 minutos.
Finalmente, se expone la transferencia a una película y se
revela.
Se describen los resultados de dichos estudios en
gel adicionales en la Figura 16, que muestra una imagen generada por
ordenador de un gel de SDS-poliacrilamida con
tris-tricina al 16,5% barrido por densitómetro
(Biorad). La figura confirma un intervalo de LDDA oligoméricos
solubles (marcado "LDDA"), dimérico (marcado "dímero") y
monomérico (marcado "monómero"). Este sistema de gel posibilita
por tanto la visualización de distintos LDDA que comprenden desde al
menos 3 monómeros (trímero) hasta aproximadamente 24 monómeros.
Lo que no se describe en la Figura 16, pero
resulta evidente tras comparar geles/transferencias Western
obtenidos antes y después de la agregación, es el hecho de que la
banda de tetrámero aumenta tras la agregación, mientras que las
especies oligoméricas de pentámero hasta de 24 unidades aparecen
sólo después de la agregación. Las diferencias entre las cantidades
teñidas con plata e inmunodetectadas de los oligómeros
(especialmente dímero y tetrámero) sugieren que los oligómeros
pueden representar diferentes conformaciones obtenidas tras la
agregación.
Este ejemplo describe estudios de MFA adicionales
realizados en oligómeros \beta-amiloides.
Se realizó la MFA como se describe en el ejemplo
3, excepto porque no se realizó el fraccionamiento en una columna
Superdex 75, y el campo se seleccionó específicamente de tal modo
que se midieran los glóbulos de tamaño mayor en el campo. El
análisis es el mismo desde un punto de vista técnico que el
realizado en el ejemplo 3, pero en este caso el campo que se
seleccionó específicamente y se examinó permite la visualización de
oligómeros que tienen tamaños mayores que los medidos mediante el
análisis de sección. La MFA se llevó a cabo utilizando una estación
de trabajo de MFA Nanoscope® III MultiMode (MMAFM) utilizando
TappingMode® (Digital Instruments, Santa Bárbara, CA).
Los resultados de estos estudios se muestran en
la Figura 17, que es una imagen generada por ordenador de un
análisis por MFA de LDDA que muestra estructuras de diversos tamaños
de diferentes oligómeros \beta-amiloides. Las
estructuras adheridas están en un intervalo de tamaño de 1 a 10,5 nm
en la altura z. Basándose en esta caracterización, las estructuras
comprenden de 3 a 24 subunidades monoméricas, consistente con las
bandas mostradas en SDS-PAGE con
Tris-tricina. En experimentos separados (no
mostrados), se han observado especies del orden de aproximadamente
11 nm.
Todas las referencias citadas en la presente
memoria, incluyendo patentes, solicitudes de patente, publicaciones
y similares se incorporan a la presente memoria en su totalidad como
referencia.
Esta invención se ha descrito destacando las
realizaciones preferidas. En consecuencia, esta invención está
definida por las siguientes reivindicaciones.
Claims (26)
1. Una estructura oligomérica
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada que
comprende de 13 a aproximadamente 24 proteínas
\beta-amiloides, que no contiene un agente de
reticulación exógeno añadido y que exhibe actividad neurotóxica.
2. Una estructura oligomérica aislada según la
reivindicación 1, en la que dicha estructura oligomérica aislada
comprende agregados de 16, 20 ó 24 unidades de proteínas
\beta-amiloides.
3. Una estructura oligomérica aislada según la
reivindicación 1, en la que dicha estructura oligomérica tiene un
peso molecular de aproximadamente 36 kDa a aproximadamente 108 kDa
determinado mediante electroforesis en gel no desnaturalizante.
4. Una estructura oligomérica aislada según la
reivindicación 1, en la que dicha estructura oligomérica comprende
glóbulos de dimensiones de aproximadamente 6,5 nm a aproximadamente
11,0 nm medidas mediante microscopía de fuerzas atómicas.
5. Una estructura oligomérica aislada según la
reivindicación 1, en la que dicha estructura oligomérica tiene un
peso molecular de aproximadamente 38 kDa a aproximadamente 116 kDa
determinado mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida con Tris-tricina
al 16,5%.
6. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con anticuerpo 6E10; y
(b) detectar la unión a dicha estructura
oligomérica de dicho anticuerpo.
7. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con células de neuroblastoma sin suero; y
(b) medir los cambios morfológicos en dichas
células comparando la morfología de dichas células frente a células
de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con dicho material
de ensayo.
8. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con cultivos de sección de cerebro; y
(b) medir la muerte celular cerebral comparada
frente a cultivos de sección de cerebro que no se han puesto en
contacto con dicho material de ensayo.
9. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con células de neuroblastoma; y
(b) medir los aumentos de actividad quinasa Fyn
comparando la actividad quinasa Fyn en dichas células frente a la
actividad quinasa Fyn en células de neuroblastoma que no se han
puesto en contacto con dicho material de ensayo.
10. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con cultivos de astrocitos primarios; y
(b) determinar la activación de dichos astrocitos
comparada con cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto
en contacto con dicho material de ensayo.
11. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con cultivos de astrocitos primarios; y
(b) medir en dichos astrocitos los aumentos de
ARNm de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en
interleucina-1, óxido nítrico sintasa inducible, Apo
E, Apo J y \alpha1-antiquimotripsina, comparando
dichos niveles de ARNm en dichos astrocitos frente a los
correspondientes niveles de ARNm en cultivos de astrocitos primarios
que no se han puesto en contacto con dicho material de ensayo.
12. Un método para identificar compuestos que
bloquean la neurotoxicidad de la estructura oligomérica según la
reivindicación 1, que comprende:
(a) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con dicha estructura oligomérica en presencia o
ausencia de puesta en contacto con dicho compuesto de ensayo;
(b) medir la proporción de células viables en
cada cultivo; y
(c) comparar la proporción de células viables en
cada cultivo con compuestos que bloquean la neurotoxicidad de dicha
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado una proporción aumentada de células viables en dicho
cultivo comparada con el correspondiente cultivo puesto en contacto
con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho compuesto de
ensayo.
13. Un método para identificar compuestos que
bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la
estructura oligomérica según la reivindicación 1, que comprende:
(a) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con dicha estructura oligomérica en presencia o
ausencia de puesta en contacto con dicho compuesto de ensayo;
(b) añadir un reactivo que se une a dicha
estructura oligomérica, siendo fluorescente dicho reactivo;
(c) analizar dichos cultivos separados mediante
separación celular activada por fluorescencia; y
(d) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie
celular de la estructura oligomérica que se está identificando, que
dan como resultado una fluorescencia reducida de dicho cultivo
comparada con el correspondiente cultivo puesto en contacto con
dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho compuesto de
ensayo.
14. Un método para identificar compuestos que
bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la
estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) formar dicha estructura oligomérica a partir
de proteína \beta-amiloide de tal modo que se
convierta en una estructura oligomérica marcada que comprenda un
resto de unión capaz de unir un reactivo fluorescente;
(b) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con dicha estructura oligomérica marcada en
presencia o ausencia de puesta en contacto con dicho compuesto de
ensayo;
(c) añadir un reactivo fluorescente que se une a
dicha estructura oligomérica;
(d) analizar dichos cultivos celulares separados
mediante separación celular activada por fluorescencia; y
(e) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la unión a una proteína de superficie
celular de la estructura oligomérica que se está identificando, que
dan como resultado una fluorescencia reducida de dicho cultivo
comparada con el correspondiente cultivo puesto en contacto con
dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho compuesto de
ensayo.
15. Un método para identificar compuestos que
bloquean la formación o unión a una proteína de superficie celular
de la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) preparar muestras separadas de proteína
\beta-amiloide que se han mezclado o no con dicho
compuesto de ensayo;
(b) formar dicha estructura oligomérica en dichas
muestras separadas;
(c) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con dichas muestras separadas;
(d) añadir un reactivo que se une a dicha
estructura oligomérica, siendo fluorescente dicho reactivo;
(e) analizar dichos cultivos celulares separados
mediante separación celular activada por fluorescencia; y
(f) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la formación o unión a una proteína de
superficie celular de la estructura oligomérica que se está
identificando, que dan como resultado una fluorescencia reducida de
dicho cultivo comparada con el correspondiente cultivo puesto en
contacto con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho
compuesto de ensayo.
\newpage
16. Un método para identificar compuestos que
bloquean la formación o unión a una proteína de superficie celular
de la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) preparar muestras separadas de proteína
\beta-amiloide que se han mezclado o no con dicho
compuesto de ensayo;
(b) formar dicha estructura oligomérica en dichas
muestras separadas de tal modo que se convierta en una estructura
oligomérica marcada que comprenda un resto de unión capaz de unirse
a un reactivo fluorescente en cada una de dichas muestras
separadas;
(c) poner en contacto los cultivos separados de
células neuronales con dichas muestras separadas;
(d) añadir un reactivo fluorescente que se une a
dicha estructura oligomérica;
(e) analizar dichos cultivos celulares separados
mediante separación celular activada por fluorescencia; y
(f) comparar la fluorescencia de los cultivos con
compuestos que bloquean la formación o la unión a una proteína de
superficie celular de la estructura oligomérica que se está
identificando, que dan como resultado una fluorescencia reducida de
dicho cultivo comparada con el correspondiente cultivo puesto en
contacto con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho
compuesto de ensayo.
17. El método de la reivindicación 15, en el que
la fluorescencia de dichos cultivos se compara adicionalmente con la
fluorescencia de cultivos que se han tratado del mismo modo excepto
porque en lugar de añadir o no añadir compuesto de ensayo antes de
la formación de la estructura oligomérica, dicho compuesto de ensayo
se añade o no después de la formación de la estructura
oligomérica,
con compuestos que bloquean la formación de la
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado una fluorescencia reducida de dicho cultivo comparada con
el correspondiente cultivo puesto en contacto con dicha estructura
oligomérica en ausencia de dicho compuesto de ensayo, sólo cuando
dicho compuesto se añade antes a la estructura oligomérica, y
compuestos que bloquean la unión a una proteína
de superficie celular de la estructura oligomérica que se está
identificando, que dan como resultado una fluorescencia reducida de
dicho cultivo comparada con el correspondiente cultivo puesto en
contacto con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho
compuesto de ensayo, cuando dicho compuesto se añade antes o después
que la estructura oligomérica.
18. El método de la reivindicación 15, en el que
la fluorescencia de dichos cultivos se compara adicionalmente con la
fluorescencia de cultivos que se han tratado del mismo modo excepto
porque en lugar de añadir o no compuesto de ensayo antes de la
formación de la estructura oligomérica, dicho compuesto de ensayo se
añade o no después de la formación de la estructura oligomérica;
con compuestos que bloquean la formación de la
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado una fluorescencia reducida de dicho cultivo comparada con
el correspondiente cultivo puesto en contacto con dicha estructura
oligomérica en ausencia de dicho compuesto de ensayo, sólo cuando
dicho compuesto se añade antes a la estructura oligomérica, y
compuestos que bloquean la unión a una proteína
de superficie celular de la estructura oligomérica que se está
identificando, que dan como resultado una fluorescencia reducida de
dicho cultivo comparada con el correspondiente cultivo puesto en
contacto con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho
compuesto de ensayo, cuando dicho compuesto se añade antes o después
que la estructura oligomérica.
19. Un método de detección de la unión a una
proteína de superficie celular de la estructura oligomérica según la
reivindicación 1, que comprende:
(a) formar dicha estructura oligomérica a partir
de la proteína \beta-amiloide;
(b) poner en contacto un cultivo de células
neuronales con dicha estructura oligomérica;
(c) añadir un anticuerpo que se une a dicha
estructura oligomérica, incluyendo dicho anticuerpo un resto de
conjugación;
(d) separar por lavado el anticuerpo no
unido;
(e) ligar una enzima a dicho anticuerpo unido a
dicha estructura oligomérica mediante dicho resto de
conjugación;
(f) añadir un sustrato incoloro que se escinde
mediante dicha enzima proporcionando un cambio de color; y
(g) determinar dicho cambio de color como una
medida de la unión a una proteína de superficie celular de dicha
estructura oligomérica.
20. Un método para identificar compuestos que
bloquean la unión a una proteína de superficie celular de la
estructura oligomérica según la reivindicación 1, que comprende:
(a) preparar muestras separadas de proteína
\beta-amiloide que se han mezclado o no con dicho
compuesto de ensayo;
(b) formar dicha estructura oligomérica en dichas
muestras separadas;
(c) poner en contacto cultivos separados de
células neuronales con dichas muestras separadas;
(d) añadir un anticuerpo que se une a dicha
estructura oligomérica, incluyendo dicho anticuerpo un resto de
conjugación;
(e) separar por lavado el anticuerpo no
unido;
(f) ligar una enzima a dicho anticuerpo unido a
dicha estructura oligomérica mediante dicho resto de
conjugación;
(g) añadir un sustrato incoloro que se escinde
mediante dicha enzima proporcionando un cambio de color; y
(h) comparar el cambio de color producido por
cada una de dichas muestras separadas con compuestos que bloquean la
formación o unión a una proteína de superficie celular de la
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado un cambio de color reducido producido mediante dicho
cultivo comparado con el correspondiente cultivo puesto en contacto
con dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho compuesto de
ensayo.
21. El método de la reivindicación 20, en el que
el cambio de color producido por dichos cultivos se compara
adicionalmente con el cambio de color producido mediante cultivos
que se han tratado del mismo modo excepto porque en lugar de añadir
o no compuesto de ensayo antes de la formación de la estructura
oligomérica, dicho compuesto de ensayo se añade o no después de la
formación de la estructura oligomérica,
con compuestos que bloquean la formación de la
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado un cambio de color reducido producido por dicho cultivo
comparado con el correspondiente cultivo puesto en contacto con
dicha estructura oligomérica en ausencia de dicho compuesto de
ensayo, sólo cuando dicho compuesto se añade antes que la estructura
oligomérica, y
compuestos que bloquean la unión a receptor de la
estructura oligomérica que se está identificando, que dan como
resultado un cambio de color reducido comparado con el
correspondiente cultivo puesto en contacto con dicha estructura
oligomérica en ausencia de dicho compuesto de ensayo, cuando dicho
compuesto se añade antes o después que la estructura
oligomérica.
22. Un método para identificar compuestos que
bloquean la formación de la estructura oligomérica según la
reivindicación 1, que comprende:
(a) preparar muestras separadas de proteína
\beta-amiloide que se han mezclado o no con dicho
compuesto de ensayo;
(b) formar dicha estructura oligomérica en dichas
muestras separadas;
(c) evaluar si se ha formado algún ensamblaje de
proteína en las muestras separadas utilizando un método seleccionado
del grupo que consiste en electroforesis, inmunoreconocimiento y
microscopía de fuerzas atómicas; y
(d) comparar la formación de dichos ensamblajes
de proteína en dichas muestras separadas, estando identificados
dichos compuestos que bloquean la formación de dicha estructura
oligomérica por dar como resultado una formación reducida de dicha
estructura oligomérica en dicha muestra comparada con una muestra en
la que dicha estructura oligomérica se forma en ausencia de dicho
compuesto de ensayo.
23. Un método de preparación de una estructura
oligomérica \beta-amiloide globular no fibrilar
soluble aislada según la reivindicación 1, en el que dicho método
comprende:
(a) obtener una solución de proteína
\beta-amiloide monomérica, siendo capaz dicha
proteína \beta-amiloide de formar dicha estructura
oligomérica;
(b) diluir dicha solución de proteína en un medio
apropiado hasta una concentración final de aproximadamente 5 nM a
aproximadamente 500 \muM;
(c) incubar el medio que resulta de la etapa (b)
aproximadamente a 4ºC durante aproximadamente 2 horas a
aproximadamente 48 horas;
(d) centrifugar dicha solución aproximadamente a
14.000 g aproximadamente a 4ºC; y
\newpage
(e) recuperar el sobrenadante que resulta de
dicha centrifugación que contiene dicha estructura oligomérica
\beta-amiloide.
24. El método de la reivindicación 23, en el que
dicho método comprende incubar el medio que resulta de la etapa (b)
aproximadamente a 4ºC en presencia de clusterina.
25. Un método para preparar una estructura
oligomérica \beta-amiloide no fibrilar soluble
según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende:
(a) obtener una solución de proteína
\beta-amiloide monomérica, siendo capaz dicha
proteína \beta-amiloide de formar dicha estructura
oligomérica;
(b) disolver dicho monómero
\beta-amiloide en hexafluoroisopropanol;
(c) retirar el hexafluoroisopropanol mediante
evaporación rápida a vacío para obtener péptido sólido;
(d) disolver dicho péptido sólido en DMSO para
formar una solución madre en DMSO;
(e) diluir dicha solución madre en un medio
apropiado;
(f) agitar con vórtex; y
(g) incubar aproximadamente a 4ºC durante
aproximadamente 24 horas.
26. Un método para detectar en un material de
ensayo la estructura oligomérica según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto dicho material de ensayo
con una célula nerviosa; y
determinar si dicha célula exhibe señalización
neuronal aberrante inducida por LDDA.
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