ES2280090T3 - Proteina beta amiloide (ensamblaje globular y sus utilizaciones). - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a ligandos neurodegenerativos del amiloide {be} (ADDL) que contiene una proteína amiloide {be}, unidad en estructuras oligómeras globulares no fibrilares capaces de activar procesos celulares específicos. La invención se refiere también a procedimientos de determinación de la formación, de la presencia, del enlace del receptor proteico y de la actividad celular de los ADDL, así como a compuestos que bloquean la formación o la actividad de los ADDL y a procedimientos de identificación de tales compuestos. Además, la invención se refiere a procedimientos de utilización de los ADLL y de modulación de la formación y/o de la actividad de los ADDL, en particular en el tratamiento de los trastornos del aprendizaje y/o de la memoria.
Description
Proteína \beta-amiloide
(ensamblaje globular y sus utilizaciones).
La presente invención se refiere a una nueva
composición de materia, los ligandos para tratar la demencia
derivados de la \beta-amiloide (ADDLs). Los ADDLs
comprenden el péptido \beta-amiloide ensamblado en
estructuras oligoméricas no fibrilares globulares solubles que son
capaces de activar procesos celulares específicos. La invención
también proporciona procedimientos para ensayar la formación, la
presencia, la fijación a la proteína receptora y las actividades
celulares de los ADDLs. También se describen compuestos que bloquean
la formación o la actividad de los ADDLs, y los procedimientos de
identificación de dichos compuestos de formación y de actividad de
los ADDLs relevantes entre otras cosas para el aprendizaje y la
memoria. Se puede emplear de este modo la modulación de la
formación o la actividad de los ADDLs según la presente invención en
el tratamiento de los trastornos de aprendizaje y de memoria, así
como otras enfermedades, trastornos o estados que son debidos a los
efectos de los
ADDLs.
ADDLs.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad
neurodegenerativa progresiva, que se caracteriza por patologías
definidas, que incluyen los ovillos neurofibrilares, las placas
neuríticas, la atrofia neuronal, la poda dentrítica y la muerte
neuronal. Desde una perspectiva histórica, el diagnóstico definitivo
de la enfermedad de Alzheimer se ha basado siempre en la
identificación de distintivos patológicos específicos,
concretamente los ovillos neurofibrilares que representan el
citoesqueleto colapsado de neuronas muertas y agonizantes, y las
placas neuríticas, que son depósitos extracelulares de varias
proteínas, lípidos, hidratos de carbono y compuestos de sales, el
componente de proteína primaria del cual es un péptido de los
residuos 39-43 conocido como
\beta-amiloide.
Desde el punto de vista del impacto de la
enfermedad, sin embargo, es el manifiesto de los síntomas en la
enfermedad de Alzheimer, concretamente la pérdida de la memoria, el
deterioro de las funciones cognitivas, y los cambios significativos
en la personalidad y en el comportamiento, las que son más
significativas. Subyacentes a estos cambios sintomáticos son los
mecanismos celulares específicos que causan el mal funcionamiento de
las células nerviosas y, finalmente, su degeneración y su muerte.
Estos mecanismos celulares operan sin duda dentro de un medio
introductor que permite de forma muy diversa algún nivel de
protección, o ejerce efectos contribuyentes y exacerbantes. El
resultado es una curva de distribución edad/incidencia muy amplia,
con pocas pistas a partir de los estudios de población que señalen
a causas específicas.
La genética molecular representa un terreno de
estudio en el que está surgiendo un cuadro claro de la enfermedad
de Alzheimer familiar. Tal y como se describe en más detalle a
continuación, actualmente está claro a partir de los estudios que
identifican mutaciones en 3 proteínas diferentes, APP y las
presenilinas 1 y 2, que el mecanismo final común que conduce a la
enfermedad de Alzheimer es la mayor producción de
\beta-amiloide 1-42 (así como de
la \beta-amiloide 1-43), que tiene
lugar en todas estas mutaciones diferentes de AD familiar. Esto es
particularmente de interés, porque los ADDLs, el foco central de la
invención que se describe, se forman solamente como entidades
estables a partir de esta forma más larga de amiloide, y no a partir
de la más frecuente, la forma más corta A\beta
1-40.
La \beta-Amiloide en la
Enfermedad de Alzheimer. En 1984, Glenner y Wong consiguieron
aislar e identificar la amiloide cerebro-vascular
asociada con la enfermedad de Alzheimer (Glenner et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 120,
885-890, 1984a). Posteriormente, los mismos péptidos
de residuos 39-43 conocidos en la actualidad como
\beta-amiloide se identificaron como el componente
proteínico principal de las placas neuríticas de la enfermedad de
Alzheimer (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 122, 1131-1135 1984b; Masters
et al., EMBO J., 4, 2757-2764,
1985a; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
82, 4245-4249, 1985b). Esta fue la primera
vez que una molécula discreta se había relacionado con la enfermedad
de Alzheimer, una enfermedad que hasta este punto se había
caracterizado solamente por descripciones neuroanatómicas y
neuropatológicas. La \beta-amiloide también se
identificó como el componente de placa en los cerebros de los
individuos con el Síndrome de Down (Glenner et al,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 122,
1131-1135, 1984b; Masters et al., EMBO
J., 4, 2757-2764, 1985a; Masters et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,
4245-4249, 1985b), conduciendo a la teoría de que
el gen que la codifica podría existir en el cromosoma 21. Por el año
1987, para dar validez esta teoría, una serie de grupos utilizaron
la información de la secuencia de la
\beta-amiloide y las técnicas de genética
molecular, identificando el gen para la proteína precursora de la
amiloide (APP) (Kang et al., Nature, 325, 733,
1987; Tanzi et al., Science, 235,
880-884, 1987).
El gen de la APP es un gran gen multiexónico que
está ensamblado de forma diferencial con una serie de APPs
(revisado en Selkoe, In, Annual Review of Neuroscience, Cowan
(Ed.), 17, ix + 623 p, 489-517, 1994). Las
proteínas son proteínas de transmembrana grandes, en la actualidad
conocidas para ser procesadas por diversos mecanismos, de las que
una o varias pueden generar la \beta-amiloide. Los
estudios iniciales del procesado de la APP sugirieron que la
formación de la \beta-amiloide no era un proceso
normal (Esch et al., Science, 248,
1122-1124, 1990; Sisodia et al.,
Science, 248, 492-495, 1990), aunque
estudios posteriores en células de cultivo y en análisis de suero y
de fluido cerebro-espinal han mostrado que la
formación de \beta-amiloide tiene lugar como un
proceso normal en muchos tipos de células, aunque su formación no
puede representar un mecanismo global predominante.
Los estudios genéticos fundamentales de ADN en
individuos aquejados de la aparición temprana de la enfermedad de
Alzheimer familiar revelaron que las mutaciones en un gen
individual, este mismo gen de la APP, fueron las causantes de esta
forma muy severa de la enfermedad. De manera interesante, se
encontraron varias mutaciones diferentes en el gen de la APP
incluyendo tres substituciones de residuos individuales diferentes
en la Val 717, cuatro residuos en dirección 3' del extremo C de la
\beta-amiloide 1-42 (Goate et
al., Nature, 349, 704-6, 1991;
Chartier-Harlan et al., Nature,
353, 844-6, 1991; Murrell et al.,
Science, 254, 97-9, 1991), y una
mutación de dos residuos (670-671) inmediatamente en
la dirección 5' del extremo N de la
\beta-amiloide, asociada con la aparición
temprana de la enfermedad de Alzheimer familiar en una familia sueca
(Mullan et al., Nature Genetics, 1,
345-347, 1992). Cuando un vector que codifica el
ADNc del gen de la APP mutante sueco se transfectó en líneas de
células para evaluar el procesado de la APP, se observó que se formó
de seis a ocho veces más \beta-amiloide, en
comparación con los niveles de la APP natural (Citron et al.,
Nature, 360, 672-674, 1992; Cai et
al., Science, 259, 514-516, 1993).
Se demostró también que fragmentos de tejido cerebral que
contenían actividades de proteasa nativas del cerebro humano eran
capaces de procesar un sustrato octapéptido fluorogénico que
comprendía la mutación sueca más de 100 veces más deprisa que el
correspondiente sustrato basado en la secuencia natural (Ladror
et al., J. Biol. Chem., 269,
18422-8, 1994). Estos resultados sugieren que el
mecanismo por el cual la mutación sueca causa la aparición temprana
de la enfermedad de Alzheimer familiar implica la sobreproducción
considerable de la \beta-amiloide. También se han
llevado a cabo estudios similares sobre la formación de amiloide en
células transfectadas con la APP mutante 717, pero los niveles
producidos de la \beta-amiloide no fueron
diferentes de los niveles producidos por la APP natural. Esto
condujo a especulaciones mecanísticas sobre que alguna otra cosa
diferente de la producción de la \beta-amiloide
era patógena para estas mutaciones. Una evaluación más próxima del
procesado del mutante 717 de la APP, y la APP mutante sueca de
Younkin y sus colaboradores (Suzuki et al., Science,
264, 1336-1340, 1994) proporcionó un cuadro
unificado de estos casos genéticos de la enfermedad de Alzheimer. En
este estudio, no solamente fueron evaluados los niveles totales de
la producción de la \beta-amiloide, sino que
también fueron analizadas las longitudes específicas de los
péptidos producidos de la \beta-amiloide. Los
resultados confirmaron que la mutación 717 condujo a más de un
duplicado de la proporción de la \beta-amiloide
1-42 con respecto a la
\beta-amiloide 1-40 (un péptido
muy soluble en condiciones fisiológicas) a pesar de que no cambiaran
los niveles totales de la \beta-amiloide. Las
mutaciones recientemente descubiertas de la enfermedad de Alzheimer
familiar de presenilina 1 y 2 en genes que residen en el cromosoma
14 (Sherrington et al., Nature, 375,
754-758, 1995) y en el cromosoma 1
(Levy-Lahad et al., Science,
269, 970-973, 1995), respectivamente,
también se han relacionado con una importante sobreproducción de la
\beta-amiloide 1-42 (Mann et
al., Annals of Neurology, 40,
149-56, 1996; Schuener et al., Nature
Medicine, 2, 864-70, 1996). Basándose en
estos hallazgos, parece que el proceso patogénico mediado por estas
claramente diferentes mutaciones de la enfermedad de Alzheimer
familiar es la producción de mayores niveles de la
\beta-amiloide 1-42. Ésta es la
forma de la amiloide que se agrega más fácilmente (Snyder et
al., Biophys. J., 67, 1216-28,
1994), que siembra la agregación de la
\beta-amiloide para formar placas neuríticas
(Roher et al., Neurochem., 61,
1916-1926, 1993; Tamaoka et al., Biochem.
Biophs. Res. Commun., 205, 834-842,
1994), y, tal y como se describe en la presente, la forma en la que
inesperadamente se forman ensamblajes estables de orden superior
denominados como "ADDLs".
Los Componentes de la Placa no Amiloide en la
Enfermedad de Alzheimer. La \beta-amiloide es
el componente proteínico principal de las placas, comprendiendo más
del 70% de la proteína total. Sin embargo, también están presentes
una variedad de otros componentes de la proteína incluyendo la
\alpha1-antiquimotripsina (ACT), los
proteoglicanos heparán sulfato (HSPG), las apolipoproteínas E y J,
la butirilcolinesterasa (BChE), S-100B, y diversos
componentes complementarios. Aunque no se ha establecido la
importancia de estos componentes en la aparición y la progresión de
la enfermedad de Alzheimer, se ha establecido la participación de
isoformas de la apo E en la enfermedad mediante estudios genéticos
de Roses y colaboradores (Strittmatter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1977-81, 1993),
que descubrieron que un polimorfismo en el gen de la apoliproteína
E, concretamente apo E4, está relacionado con la aparición temprana
de la enfermedad de Alzheimer en una gran serie de casos de
aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer familiar. Posteriores
estudios han confirmado que grupos de individuos con apo E4 tienen
un riesgo considerablemente más grande de la enfermedad de
Alzheimer y que la aparición de la enfermedad de Alzheimer es
análoga en líneas generales a la dosis de gen para la apo E4. A
nivel mecanístico, los estudios han revelado que el apo E4 se fija
con inferior afinidad a la \beta-amiloide que con
la apo E3 o que con la apo E2, isoformas que están asociadas con la
aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer. Se ha sugerido que
estas isoformas puedan ejercer un efecto protector mediante una
aclaración más eficaz de los depósitos de la
\beta-amiloide 1-42 (Ladu et
al., J. Biol. Chem., 269,
23403-23406, 1994; Ladu et al., J. Biol.
Chem., 270, 9039-42, 1995).
No está tan claro el papel de los otros
componentes de la placa, aunque estudios recientes (Oda et
al., Exptl. Neurology, 136, 22-31,
1995) han mostrado que la apo J (clusterina) puede aumentar
considerablemente la toxicidad de la
\beta-amiloide 1-42 agregada in
vitro. También se ha descrito que los HSPG aumentan la toxicidad
de la \beta-amiloide 1-40 cuando
se inyecta en un cerebro de rata (Snow et al., Soc.
Neurosci. Abstr., 18, 1465, 1992). Wright et al.
(Ann. Neurol., 34, 373-384, 1993)
demostraron que las placas de amiloide de un cerebro con la
enfermedad de Alzheimer contienen niveles importantes de BChE,
mientras que las placas de amiloide de individuos ancianos no
dementes no los contienen. La proteína ACT inflamatoria de fase
aguda también se regula por incremento en el cerebro con la
enfermedad de Alzheimer, y se conoce que se asocia con los 16
residuos del extremo N de la \beta-amiloide. Ma
et al. (Ma et al., Nature, 372,
92-94, 1994) han descrito que la ACT puede aumentar
la agregación de la \beta-amiloide
1-42, y estos autores especulan que la mayor
agregación contribuye a su neurotoxicidad.
La Respuesta Celular de la
\beta-amiloide y la Patología In Vivo .
Más allá de las placas y de los ovillos que son el distintivo de la
enfermedad de Alzheimer, está claro que se ha inducido un campo de
respuestas celulares, tanto en las neuronas como en las células
gliales que las acompañan. A nivel bioquímico, es evidente la
hiperfosforilación de la proteína tau, que resulta de la
perturbación del equilibrio quinasa/fosfatasa. A nivel de
transcripción, se activan una variedad de genes para producir un
espectro de proteínas que no se presentan normalmente o que sólo se
presentan en el cerebro a niveles inferiores. También existe una
importante evidencia de que se han activado los procesos
inflamatorios. En particular, la fosforilación de la tau se ha
descrito que es inducida por la \beta-amiloide
1-42 agregada en células SH-SY5Y
diferenciadas (Lambert et al., J. Neurosci. Res.,
39, 377-384, 1994), y este resultado se ha
confirmado en una publicación más reciente de Busciglio et
al. (Neuron, 14, 879-88, 1995), en
la que la \beta-amiloide activó la fosforilación
de la tau en las neuronas del hipocampo de rata primarias de
cultivo.
La \beta-amiloide Fibrilar
y la Neurodegeneración en la Enfermedad de Alzheimer. No se ha
elucidado el mecanismo por el cual la
\beta-amiloide 1-42 causa la
enfermedad de Alzheimer, pero la literatura contiene más de 200
estudios sobre la neurotoxicidad de la
\beta-amiloide, muchos de los cuales se han
revisado recientemente (por ejemplo, Yankner et al.,
Neuron, 16, 921-32, 1996; Iversen
et al., Biochemical Journal, 311,
1-16, 1995). La opinión consensuada es que para que
la \beta-amiloide sea tóxica, se debe ensamblar en
estructuras fibrilares (Pike et al., J. Neurosci.,
13, 1676-87, 1993). Las soluciones que
contienen sólo la \beta-amiloide monómera han
demostrado repetidamente que no tienen un efecto perjudicial en las
neuronas de cultivo. Además, los estudios han establecido una
correlación entre la formación de láminas de
\beta-amiloide que contienen fibrillas y la
sincronización y la extensión de la toxicidad utilizando técnicas
tales como el dicroismo circular y la microscopía de electrones
(Simmons et al., Molecular Pharmacology, 45,
373-9, 1994). Un estudio concluyó explícitamente
que la \beta-amiloide debe existir en forma
fibrilar para ser tóxica (Lorenzo et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 12243-12247, 1994).
A pesar de este consenso en lo que respecta a la estructura y a la
actividad de la \beta-amiloide, continúa siendo
un problema de reproducibilidad del trabajo experimental publicado
que implica la toxicidad de amiloide (Brining, Neurobiology of
Aging, 18, 581-589, 1997), y la
variabilidad generalizada de la actividad obtenida con series
diferentes de la amiloide, o incluso la misma serie de amiloide
tratada de formas ligeramente diferentes, a pesar de la composición
química idéntica (May et al., Neurobiology of Aging,
13, 1676-87, 1993). Esto ha dado lugar a
cuestiones con respecto a las estructuras precisas de la
\beta-amiloide que son responsables de su
actividad.
La presente invención busca superar los
problemas de la técnica anterior. Por consiguiente, es un objeto de
la presente invención proporcionar una nueva composición de materia,
el péptido \beta-amiloide ensamblado en
estructuras oligoméricas no fibrilares globulares solubles (ADDLs),
que de forma inesperada son neurotóxicas. Estos y otros objetos y
ventajas de la presente invención, así como las características
inventivas adicionales, serán obvias a partir de la siguiente
descripción.
La Figura 1 es una imagen generada por ordenador
de un gel de poliacrilamida teñido de plata escaneado por
densitómetro que muestra la electroforesis de los ADDLs con una
banda primaria que se corresponde con aproximadamente 30 kD, una
banda menos abundante que se corresponde con aproximadamente 17 kD,
y sin evidencia de fibrillas ni agregados.
La Figura 2 es una imagen generada por ordenador
de un gel de SDS-poliacrilamida teñido de Coomassie
escaneado por densitómetro que muestra la electroforesis de los
ADDLs con una banda primaria (doblete superior) que se corresponde
con un tamaño de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 22 kD, y
con otra banda (banda oscura inferior) que indica abundante
monómero 4 kD presente, presumiblemente un producto descompuesto.
Carriles: primero, marcadores de tamaño molecular; segundo,
preparación de la ADDL; tercero, carga más pesada de la preparación
de la ADDL.
La Figura 3 es una imagen generada por ordenador
representativa del análisis AFM de la "fracción 3" que contiene
ADDL (fraccionada en una columna de filtración de gel Superdex
75).
La Figura 4 es una imagen generada por ordenador
de un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida teñido
de Coomassie escaneado por densitómetro de los ADDLs preparados
mediante coincubación con clusterina (carril A) o medios F12 fríos
(carril B), y de los ADDLs preparados mediante coincubación con
clusterina y que pasados a través de una membrana aislada de 10 kD
Centricon (carril C) o fueron retenidos mediante una membrana
aislada de 10 kD Centricon (carril D): MW, marcadores de
tamaño molecular.
La Figura 5 es un gráfico de la concentración
del ADDL medida como concentración de la
\beta-amiloide 1-42 (nM) con
respecto el porcentaje de células muertas para cortes de cerebro de
ratones tratados con las preparaciones del ADDL.
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
el porcentaje de reducción de MTT para el control de las células PC
12 no expuestas a los ADDLs ("Cont."), de las células PC 12
expuestas únicamente a la clusterina ("Apo J"), a las células
PC 12 expuestas a la A\beta monómera ("A\beta"), a las
células PC 12 expuestas a la \beta-amiloide
congregadas con clusterina y maduradas durante un día ("A\beta:
Apo J").
La Figura 7 es un escáner FAC que muestra la
intensidad de fluorescencia (0-170) con respecto a
las pruebas (0-300) para las células B103 no
expuestas a los ADDLs (pico no sombreado) y para las células B103
enlazadas con los ADDLs marcados fluorescentes (pico
sombreado).
La Figura 8 es un escáner FAC que muestra la
intensidad de fluorescencia (0-200) con respecto a
las pruebas (0-300) para células del hipocampo no
expuestas a los ADDLs (picos no sombreados, "- ADDLs") y para
células del hipocampo delimitadas por los ADDLs marcados
fluorescentes (pico sombreado, "+ ADDLs").
La Figura 9 es un gráfico de barras del
porcentaje máximo del ADDL fijado o de la muerte provocada por el
ADDL para las células B103 que no se han expuesto ("-") o que
se han coexpuesto ("+") a los péptidos liberados mediante
trisinización de las células B103.
La Figura 10 es una gráfica de la concentración
relativa del ADDL con respecto el porcentaje de las células muertas
para los cortes de cerebro de ratones tratados con las preparaciones
del ADDL. Para determinar la concentración relativa, se empleó una
concentración inicial de 10 \muM de proteína A\beta para formar
los ADDLs en el punto de datos más alto (punto "16"), éste se
diluyó posteriormente hasta ½ (punto "8"), ¼ (punto "4"),
y por el estilo.
La Figura 11 es un gráfico de barras que muestra
la densidad óptica obtenida en el ensayo ELISA de unión del ADDL en
el que las células B103 se coincubaron con los ADDLs y con el
anticuerpo 6E10 (barra "células, ADDL, 6E10"), en que las
células B103 se coincubaron con los ADDLs (barra "células,
ADDL"), en que las células B103 se coincubaron con el anticuerpo
6E10 (barra "células, 6E10"), en que las células B103 se
coincubaron solas (barra "células"), en el que el anticuerpo
6E10 se coincubó solo (barra "6E10"), o en el que se leyó la
densidad óptica del diluyente (barra "blanca").
La Figura 12 es un gráfico de barras del
porcentaje de células muertas en la fyn +/+ (natural, "Fyn
+"; barras sombreadas), la fyn -/- (eliminatorio, "Fyn
-"; barras compactas) de ratones, las no tratadas ("Medio")
o las puestas en contacto con los ADDLs ("ADDLs").
La Figura 13 es una gráfica de la concentración
de la A\beta (\muM) con respecto a la glial activada (número)
obtenida por incubación de astrocitos con los ADDLs (triángulos
rellenos) o con la A\beta 17-42 (cuadrados
rellenos).
La Figura 14 es una gráfica del tiempo (en
minutos) con respecto al porcentaje de la amplitud de pico del
cuerpo de la célula de la línea de base para controlar los ratones
no tratados con los ADDLs (triángulos rellenos) o los ratones
tratados con los ADDLs (cuadrados rellenos).
La Figura 15 es una gráfica del tiempo (en
minutos) con respecto a la amplitud de pico promedio para controlar
el corte de hipocampo de rata no expuesto a los ADDLs (triángulos
rellenos) con respecto al corte del hipocampo de rata expuesto a
los ADDLs (cuadrados rellenos).
La invención engloba una nueva composición de
materia, calificada como ligandos para tratar la demencia derivados
de la beta-amiloide o como ligandos difusibles
derivados de la beta-amiloide (ADDLs). Los ADDLs
consisten en el péptido \beta-amiloide ensamblado
en estructuras oligoméricas no fibrilares solubles que son capaces
de activar procesos celulares específicos. Otro aspecto de la
invención consiste en los procedimientos para ensayar la formación,
la presencia, la fijación de la proteína receptora y las actividades
celulares de los ADDLs. La invención engloba además procedimientos
de ensayo y procedimientos de identificación de los compuestos para
modular (por ejemplo, incrementar o disminuir) la formación y/o la
actividad de los ADDLs. Dichos componentes se pueden emplear en el
tratamiento de las enfermedades, los trastornos, o los estados
debidos a los efectos de los ADDLs.
Se ha descubierto que muestras neurotóxicas de
la \beta-amiloide no sólo hacen existir a
estructuras fibrilares, sino también, de forma imprevista, hacen
existir a algunas pequeñas estructuras proteínicas globulares que
aparecen para ser responsables por la neurotoxicidad. Utilizando
procedimientos novedosos, se han generado tal y como se describe en
la presente, las muestras que contienen predominantemente estos
ensamblajes de proteína globular soluble y de estructuras no
fibrilares. En las muestras heterogéneas preparadas mediante
procedimientos diversos, la extracción de las más grandes formas
fibrilares de la \beta-amiloide mediante
centrifugación no elimina estos ensamblajes globulares solubles de
la \beta-amiloide en las fracciones de
sobrenadante. Estas fracciones de sobrenadante exponen una
neurotoxicidad considerablemente superior que las muestras no
fraccionadas de la \beta-amiloide agregadas bajo
condiciones publicadas. Estas formas globulares solubles
neurotóxicas novedosas e inesperadas se refieren aquí como los
ligandos para tratar la demencia derivados de la
\beta-amiloide o como ligandos difusibles
derivados de la beta-amiloide (ADDLs). Las muestras
de la \beta-amiloide que se han "envejecido"
bajo condiciones bibliográficas estándar (por ejemplo, Pike et
al., J. Neurosci., 13, 1676-1687,
1993) durante más de tres semanas perdieron su neurotoxicidad, aún
cuando estas muestras contengan predominantemente estructuras
fibrilares con pocos ADDLs o sin los ADDLs. Este descubrimiento de
que los ADDLs globulares son neurotóxicos es en especial
sorprendente ya que el pensamiento actual mantiene que son unas
estructuras fibrilares que constituyen la forma tóxica de la
\beta-amiloide (Lorenzo et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12243-12247,
1994; Howlett et al., Neurodegen, 4,
23-32, 1995).
Los ADDLs se pueden formar in vitro.
Cuando una solución (por ejemplo, una solución de DMSO) que contiene
la \beta-amiloide 1-42 (o
cualquier otra \beta-amiloide apropiada, tal y
como se describe en la presente más adelante) se diluye en los
medios de cultivo de tejido frío (por ejemplo, los medios de cultivo
de la célula F12), permite entonces incubar a aproximadamente 4ºC
durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 48 horas y
centrifugado durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente
14.000 x g a una temperatura de 4ºC, la fracción sobrenadante
contiene pequeños glóbulos oligómeros solubles que son altamente
neurotóxicos, como por ejemplo, en las células neuronales y en los
cultivos de cortes de cerebro. Se pueden formar también los ADDLs
mediante la coincubación de la \beta-amiloide con
ciertos agentes apropiados, como por ejemplo, la clusterina (una
proteína de placa senil que también se conoce como Apon).
El análisis de dicha fracción de sobrenadante
mediante el microscopio de fuerza atómica (AFM) revela una serie de
glóbulos de tamaños diferentes presente en la fracción. Estos
glóbulos caen dentro del rango entre aproximadamente 4,7 nm y
aproximadamente 6,2 nm. Se pueden distinguir especies diferentes de
glóbulos cayendo dentro de este rango. Concretamente, la leve
variación en la superficie de altura da lugar a como la especie
concreta se asienta en la superficie de mica en el tiempo del
análisis. A pesar de esta leve variación, sin embargo, parecen ser
dos los tamaños predominantes de glóbulos, como, por ejemplo, entre
aproximadamente 4,9 nm y aproximadamente 5,4 nm y entre
aproximadamente 5,7 nm y aproximadamente 6,2 nm, que constituyen
aproximadamente el 50% de las estructuras oligoméricas en una
muestra típica. También puede ser una especie de tamaño distinto de
glóbulo que tenga unas dimensiones desde aproximadamente 5,3 nm
hasta aproximadamente 5,7 nm. Parece que los glóbulos de
dimensiones entre aproximadamente 4,7 nm y aproximadamente 6,2 nm en
el AFM comprenden la forma pentámero y hexámero de la proteína
\beta-amiloide oligomérica. Los glóbulos de tamaño
del AFM entre aproximadamente 4,2 nm y aproximadamente 4,7 nm
aparecen para corresponderse con el tetrámero A\beta. Los glóbulos
de tamaño entre aproximadamente 3,4 nm y aproximadamente 4,0 nm
aparecen para corresponderse con el trímero. Los glóbulos de tamaño
entre aproximadamente 2,8 nm y aproximadamente 3,4 nm se
corresponden con el dímero (Roher et al., J. Biol.
Chem., 271, 20631-20635, 1996). El tamaño
del AFM de monómero A\beta se extienden entre aproximadamente 0,8
nm y aproximadamente 1,8 - 2,0 nm. La
\beta-amiloide monómera y dímera no son
neurotóxicas en los cultivos de células neuronales ni en los
cultivos organotípicos de los cortes de cerebro.
De este modo, la presente invención proporciona
una proteína \beta-amiloide aislada y homogénea,
soluble, globular y no fibrilar, ensamblada (esto es, el ADDL) que
comprende de 4 a 12 proteínas de la \beta-amiloide
1-42, en la que la estructura pone de manifiesto la
neurotoxicidad y que no contiene la proteína
\beta-amiloide 1-40. En especial,
la invención proporciona una proteína
\beta-amiloide aislada ensamblada en la que el
ensamblaje comprende preferentemente una forma oligomérica
seleccionada del grupo consistente en tetrámero, pentámero y
hexámero. La proteína óptimamente ensamblada pone de manifiesto la
actividad neurotóxica. Se puede emplear la
\beta-amiloide 1-42 con
biocintina en la posición 1. También se puede emplear la
\beta-amiloide 1-42 con una
cisteína en el extremo N.
Idealmente, el ensamblaje de la proteína
\beta-amiloide aislada según la invención
comprende los glóbulos de dimensiones entre 4,7 nm y 6,2 nm medidos
mediante el microscopio de fuerza atómica. También, preferentemente
el ensamblaje de la proteína \beta-amiloide
aislada comprende los glóbulos de dimensiones entre 4,9 nm y 5,4 nm,
o entre 5,7 nm y 6,2 nm, medidos mediante el microscopio de fuerza
atómica. En especial, preferentemente el ensamblaje de la proteína
\beta-amiloide aislada según la invención es tal
que en la que entre el 30% y el 85%, incluso más preferentemente
entre el 40% y el 75% del ensamblaje comprende dos tamaños
predominantes de glóbulos, a saber, de dimensiones ente 4,9 nm y
5,4 nm, y entre 5,7 nm y 6,2 nm, medidos mediante el microscopio de
fuerza atómica. Sin embargo, también es deseable que el ensamblaje
de proteína comprenda glóbulos de tamaño del AFM de 5,3 a 5,7
nm.
Mediante la electroforesis en gel no
desnaturalizante, las bandas correspondientes a los ADDLs saltan
entre los 26 kD y los 28 kD. Bajo las condiciones desnaturalizadas
(por ejemplo, en un gel con el 15% de
SDS-poliacrilamida), los ADDLs comprenden una banda
que salta entre los 22 kD y los 24 kD, y puede comprender además una
banda que salta de los 18 kD a los 19 kD. En consecuencia, la
invención proporciona preferentemente un ensamblaje de la proteína
\beta-amiloide aislada (esto es, el ADDL) que
tiene un peso molecular entre los 26 kD y los 28 kD determinados
mediante la electroforesis en gel no desnaturalizante. La invención
también proporciona preferentemente un ensamblaje de la proteína
\beta-amiloide aislada (esto es, el ADDL) que
funciona como una banda que se corresponde con un peso molecular
entre los 22 kD y los 24 kD, o entre los 18 kD y los 19 kD,
determinados mediante electroforesis en gel con el 15% de
SDS-poliacrilamida.
También se hace referencia a un procedimiento
para preparar el ensamblaje de la proteína
\beta-amiloide no fibrilar soluble aislada. El
procedimiento comprende opcionalmente las etapas de:
- (a)
- obtener una solución de la proteína \beta-amiloide monómera;
- (b)
- diluir la solución de proteína en un medio apropiado;
- (c)
- incubar el medio resultante de la etapa (b) hasta aproximadamente 4ºC;
- (d)
- centrifugar el medio hasta aproximadamente 14.000 x g hasta aproximadamente 4ºC; y
- (e)
- recuperar el sobrenadante resultante de la centrifugación que contiene el ensamblaje de la proteína \beta-amiloide. En la etapa (c) de este procedimiento, la solución ideal es la incubación durante entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 48 horas, especialmente entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 48 horas, y más preferentemente entre aproximadamente 24 horas y aproximadamente 48 horas. En la etapa (d) de este procedimiento, la centrifugación se lleva a cabo preferentemente durante entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 1 hora, especialmente durante entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 30 minutos, y óptimamente durante aproximadamente 10 minutos. Por lo general, sin embargo, esto es sólo una medida preventiva para eliminar algunas estructuras nacientes fibrilares o protofibrilares y puede no ser necesario, en particular cuando no es una cuestión la estabilidad a largo plazo de la preparación del ADDL.
La proteína A\beta se diluye en la etapa (b)
idealmente hasta una concentración final que se extiende entre
aproximadamente 5 \muM y aproximadamente 500 \muM, en particular
entre aproximadamente 5 \muM y aproximadamente 300 \muM,
especialmente hasta aproximadamente 100 \muM. El "medio
apropiado" en el que la solución de proteína A\beta se diluye
en la etapa (b) es preferentemente algún medio que mantendrá, si no
se facilita, la formación del ADDL. En particular, se prefiere el
medio F12 (que se dispone comercialmente además de formulado con
facilidad en el laboratorio) para utilizarse en este procedimiento
de la invención. De manera parecida, también idealmente se puede
emplear el "medio F12 substitutivo". El medio F12 substitutivo
difiere del medio F12 en que se dispone comercialmente o en que se
formula en el laboratorio. Según la invención, el medio F12
substitutivo comprende preferentemente los siguientes componentes:
N,N-dimetilglicina, D-glucosa,
cloruro de calcio, sulfato de cobre pentahidrato, sulfato de hierro
(II) heptahidrato, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro
de sodio, hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenofosfato de sodio, y
sulfato de cinc heptahidrato.
En particular, el medio F12 sintético según la
invención comprende opcionalmente:
N,N-dimetilglicina (entre aproximadamente 600 y
aproximadamente 850 mg/l), D-glucosa (entre
aproximadamente 1,0 y aproximadamente 3,0 g/l), cloruro de calcio
(entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 mg/l), sulfato de
cobre pentahidrato (entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40
mg/l), sulfato de hierro (II) heptahidrato (entre aproximadamente
0,4 y aproximadamente 1,2 mg/l), cloruro de potasio (entre
aproximadamente 160 y aproximadamente 280 mg/l), cloruro de
magnesio (entre aproximadamente 40 y aproximadamente 75 mg/l),
cloruro de sodio (entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 9,0
g/l), hidrogenocarbonato de sodio (entre aproximadamente 0,75 y
aproximadamente 1,4 g/l), hidrogenofosfato de sodio (entre
aproximadamente 120 y aproximadamente 160 mg/l), y sulfato de cinc
heptahidrato (entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 1,1 mg/l).
Óptimamente, el medio F12 sintético según la invención comprende:
N,N-dimetilglicina (aproximadamente 766 mg/l),
D-glucosa (aproximadamente 1,802 g/l), cloruro de
calcio (aproximadamente 33 mg/l), sulfato de cobre pentahidrato
(aproximadamente 25 mg/l), sulfato de hierro (II) heptahidrato
(aproximadamente 0,8 mg/l), cloruro de potasio (aproximadamente 223
mg/l), cloruro de magnesio (aproximadamente 57 mg/l), cloruro de
sodio (aproximadamente 7,6 g/l), hidrogenocarbonato de sodio
(aproximadamente 1,18 g/l), hidrogenofosfato de sodio
(aproximadamente 142 mg/l), y sulfato de cinc heptahidrato
(aproximadamente 0,9 mg/l). Además, el pH del medio F12 sintético se
ajusta preferentemente, por ejemplo, utilizando 0,1 M de hidróxido
de sodio, idealmente a un pH entre aproximadamente 7,0 y
aproximadamente 8,5, y preferentemente a un pH de aproximadamente
8,0.
El procedimiento precedente más ideal se puede
llevar a cabo mediante la formación del ensamblaje de proteína
sedimentada lentamente en presencia de un agente apropiado, tal como
la clusterina. Esto se hace, por ejemplo, añadiendo la clusterina
en la etapa (c) y tal y como se expone en los Ejemplos que
siguen.
Si los ADDLs se preparan mediante la
incorporación del 10% de la \beta-amiloide
1-42 biotinilada (o cualquier otra proteína
\beta-amiloide 1-42 biotinilada),
se pueden utilizar en un ensayo de fijación del receptor utilizando
células neurales y llevándolo a cabo, por ejemplo, en un instrumento
de separación de células activadas por fluorescencia (FACS), que
marca mediante un conjugado avidina fluorescente. Otra posibilidad
es que en lugar de incorporar biotina en la proteína
\beta-amiloide, se puede emplear cualquier otro
reactivo capaz de fijar el ADDL para formar una molécula marcada
fluorescentemente, y que puede ser parte ya de un conjugado marcado
fluorescente. Por ejemplo, se puede formar el ensamblaje de proteína
de manera que la proteína amiloide incluya otra fracción de la
fijación, con la "fracción de la fijación" como aquí se utiliza
englobando una molécula (tal como la avidina, la estreptavidina, la
polilisina, y cualquier otra por el estilo), que se puede emplear
para fijarse a un reactivo para formar un compuesto o un conjugado
marcados fluorescentemente. El "reactivo fluorescente", al que
se fija el ensamblaje de proteína, necesita no por sí mismo
directamente fluorescencia, pero en su lugar puede simplemente ser
capaz de dar fluorescencia por fijación a cualquier otro agente. Por
ejemplo, el reactivo fluorescente que se fija el ensamblaje de
proteína puede comprender un anticuerpo específico de la
\beta-amiloide (por ejemplo, el 6E10), con la
fluorescencia generada mediante la utilización de un anticuerpo
secundario fluorescente.
Junto con otros experimentos, los análisis
mediante un escáner FAC de las células CNS B103 de rata se dieron
sin y con incubación del ADDL. Los resultados de estos y de más
estudios confirman que la fijación a la superficie de la célula es
saturable, y el tratamiento breve con tripsina elimina con criterio
selectivo un subconjunto de proteínas de la superficie celular y
elimina la fijación de los ADDLs. Las proteínas que son divididas
mediante el tratamiento breve con la tripsina desde la superficie de
las células B103 previenen también la fijación del ADDL a las
células B103 o a las neuronas primarias cultivadas del hipocampo de
rata. Estos resultados sostienen todos que los ADDLs actúan a
través de un receptor de superficie celular especial, y que los
acontecimientos anticipados logrados mediante los ADDLs (esto es,
los acontecimientos previos a la muerte de la célula) se pueden
controlar de forma beneficiosa (por ejemplo, por tratamiento o
investigación) mediante compuestos que bloquean la formación y la
actividad (por ejemplo, incluyendo la fijación del receptor) de los
ADDLs.
De este modo, la invención proporciona un
procedimiento para identificar los compuestos que modulan (esto es,
que facilitan o que bloquean) la fijación del receptor del ADDL.
Este procedimiento comprende preferentemente:
- (a)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con el ensamblaje de proteínas en presencia o en ausencia de contacto con los compuestos de prueba;
- (b)
- añadir un reactivo que se fija al ensamblaje de proteína, siendo el reactivo fluorescente;
- (c)
- analizar los cultivos celulares separados mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (d)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con los compuestos que bloquean la fijación del receptor del ensamblaje de proteína que se identifican como que dan lugar a una fluorescencia reducida del cultivo, y los compuestos que facilitan la fijación del receptor que se identifican como que dan lugar a un incremento de la fluorescencia del cultivo, comparado con el correspondiente cultivo puesto en contacto con el ensamblaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Otra posibilidad es que en lugar de añadir un reactivo fluorescente que en y por sí mismo es capaz de fijar el complejo proteínico, el procedimiento se lleva a cabo idealmente en el que el ensamblaje de proteína se forma a partir de la proteína \beta-amiloide 1-42 (o cualquier otra \beta-amiloide) preparada de manera que comprenda una fracción de la fijación capaz de fijar al reactivo fluorescente.
De manera parecida, el procedimiento se puede
emplear para identificar compuestos que modulan (esto es, que
facilitan o que bloquean) la formación o la fijación del receptor
del ensamblaje de proteína que comprenden:
- (a)
- preparar las muestras separadas de la \beta-amiloide que se han o no se han mezclado con el compuesto de prueba;
- (b)
- formar el ensamblaje de proteína en la muestra separada;
- (c)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas;
- (d)
- añadir un reactivo que se fija al ensamblaje de proteína, siendo el reactivo fluorescente;
- (e)
- analizar los cultivos de células separadas mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (f)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con los compuestos que bloquean la formación o la fijación del receptor del ensamblaje de proteína que se identifican como que dan lugar a una fluorescencia reducida del cultivo, y compuestos que facilitan la formación o la fijación del receptor del ensamblaje de proteína que se identifican como que dan lugar a una fluorescencia aumentada del cultivo, comparado con el correspondiente cultivo puesto en contacto con el ensamblaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Otra posibilidad es que en lugar de añadir un reactivo fluorescente que en y por sí mismo es capaz de fijar el complejo proteínico, el procedimiento se lleva a cabo en el que el ensamblaje de proteína se forma a partir de la proteína \beta-amiloide preparada de manera que comprenda una fracción de la fijación capaz de fijar el reactivo fluorescente.
La fluorescencia de los cultivos es
opcionalmente comparada además con la fluorescencia de los cultivos
que se han tratado de la misma manera excepto que en vez de añadir o
de no añadir el compuesto de prueba previamente a la formación del
ensamblaje de proteína, el compuesto de prueba se añade o no se
añade después de la formación del ensamblaje de proteína. En esta
situación, los compuestos que bloquean la formación del ensamblaje
de proteína se identifican como que dan lugar a una fluorescencia
reducida del cultivo, y los compuestos que facilitan la formación
del ensamblaje de proteína se identifican como que dan lugar a una
fluorescencia aumentada del cultivo, comparado con el
correspondiente cultivo puesto en contacto con el ensamblaje de
proteína en ausencia del compuesto de prueba, solamente cuando se
añade el compuesto previamente al ensamblaje de proteína.
Mediante contraste, los compuestos que bloquean
la fijación del receptor del ensamblaje de proteína se identifican
como que dan lugar a una fluorescencia reducida del cultivo, y los
compuestos que facilitan la fijación del receptor del ensamblaje de
proteína se identifican como que dan lugar a una fluorescencia
aumentada del cultivo, comparado con el correspondiente cultivo
puesto en contacto con el ensamblaje de proteína en ausencia del
compuesto de prueba, cuando se añade el compuesto previamente
o después del ensamblaje de proteína.
En una manera similar, se puede emplear un
ensayo con base celular, en particular un ensayo inmunosorbente
relacionado con enzimas con base celular (ELISA) según la invención
para calcular la actividad fijadora del ADDL. En particular, se
puede emplear el procedimiento para detectar la fijación de los
ensamblajes de proteína de un receptor de superficie celular. Este
procedimiento comprende preferentemente:
- (a)
- formar un ensamblaje de proteína procedente de la proteína \beta-amiloide;
- (b)
- poner en contacto un cultivo de células neuronales con el ensamblaje de proteína;
- (c)
- añadir un anticuerpo (por ejemplo, el 6E10) que fija dicho ensamblaje de proteína, incluyendo dicho anticuerpo una fracción de conjugación (por ejemplo, la biotina, o cualquier otro agente apropiado);
- (d)
- eliminar por lavado del anticuerpo no unido;
- (e)
- unir un enzima (por ejemplo, la peroxidasa del rábano) a dicho enlace del anticuerpo hacia dicho ensamblaje de proteína por medio de dicha fracción de conjugación;
- (f)
- añadir un substrato incoloro (por ejemplo, ABTS) que se divide mediante dicho enzima para dar un cambio de color; y
- (g)
- determinar dicho cambio de color (por ejemplo, mediante la técnica espectrofotométrica) o el ritmo del cambio de color como una medida de la fijación del receptor de dicho ensamblaje de proteína. Tal y como se describió anteriormente, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo capaz de detectar los ADDLs (por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un emplazamiento expuesto a la \beta-amiloide), y la fracción de conjugación del anticuerpo puede ser cualquier agente capaz de unir un medio de detección (por ejemplo, incluso tal vez otra proteína) que proporciona un medio de detección (por ejemplo, el cambio de color debido a la división de un substrato), y además, se puede unir (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) al enlace del anticuerpo al ensamblaje de proteína por medio de otra fracción (por ejemplo, un anticuerpo secundario). Además, preferentemente según la invención, las células están adheridas a un substrato sólido (por ejemplo, un plástico de cultivo celular) previamente a la conducción del ensayo. Esto pasa sin decir que idealmente se debería llevar a cabo la etapa (d) como aquí se describe, de manera que los ADDLs sean capaces de fijarse a las células. De manera parecida, preferiblemente se debería llevar a cabo la etapa (c) durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 2 horas, idealmente durante aproximadamente 30 minutos) y bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, a aproximadamente la temperatura del recinto, preferentemente con agitación suave) para permitir al anticuerpo el fijarse a los ADDLs. Además, se pueden llevar a cabo las etapas de bloqueo apropiadas de manera que sean conocidos por aquellos expertos en la técnica utilizando los reactivos de bloqueo apropiados para reducir cualquier fijación no específica del anticuerpo. El artesano está familiarizado con los ELISAs y puede emplear modificaciones en el ensayo de forma que sean conocidas por la técnica.
El ensayo también se puede llevar a cabo
idealmente para identificar compuestos que modulen (esto es, que
faciliten o que bloqueen) la formación o la fijación del receptor
del ensamblaje de proteína. En este procedimiento, como en los
ensayos descritos previamente para los compuestos de prueba, el
compuesto de prueba se añade a la preparación del ADDL, previamente
al contacto de las células con los ADDLs. Se puede emplear de este
modo este ensayo para detectar los compuestos que modulan la
formación del ensamblaje de proteína (por ejemplo, tal y como se
describió anteriormente). Sin embargo, los compuestos de prueba se
pueden añadir a la preparación del ADDL previamente al contacto de
las células (pero después de la formación del ADDL), o a las
células previamente al contacto con los ADDLs. Este procedimiento
(por ejemplo, tal y como se describió anteriormente) se puede
emplear para detectar compuestos que modulan la fijación del ADDL a
la superficie de la célula. Además, un compuesto de prueba se puede
añadir a la mezcla de células más ADDLs. Este procedimiento (por
ejemplo, tal y como se describió anteriormente) se puede emplear
para detectar compuestos que impactan en los eventos mediadores del
ADDL y que ocurren en la posición 3' de la fijación del receptor del
ADDL. Se puede confirmar la especificidad de los compuestos para
actuar en efecto de mediador del ADDL en la posición 3', por
ejemplo, mediante el simple añadido del compuesto de prueba en
ausencia de cualquier coincubación con los ADDLs. Por supuesto, se
deberían incluir los controles más adecuados (por ejemplo, tal y
como se fija en adelante en los siguientes Ejemplos y como es
conocido por los expertos en la técnica) con todos los ensayos.
Esta información acerca de los compuestos, la
formación modulada (esto es, facilitar o bloquear) y/o la actividad
que incluye la fijación del receptor del ensamblaje de proteína se
puede emplear en la investigación y en el tratamiento de las
enfermedades, las afecciones y los trastornos transmitidos por el
ADDL. Se pueden emplear los procedimientos de la invención para
investigar la actividad y la neurotoxicidad propia de los ADDLs.
Por ejemplo, cuando se inyectaron 20 nl de la preparación de ADDL en
la región del hipocampo de un ratón adulto unos 60 a 70 minutos
antes del experimento de potenciación a largo plazo (LTP) de la
conducta (por ejemplo, Namgung et al., Brain
Research, 689, 85-92, 1995), la fase de
estimulación del experimento tuvo lugar de manera idéntica que con
las inyecciones de control salino, pero la fase de consolidación
mostró un significante disminución continua en la actividad
sináptica tal y como se midió mediante la amplitud de pico del
cuerpo de la célula, en el que la actividad sináptica continúa a un
nivel comparable al que se expone durante la fase de estimulación.
Los análisis de los cortes de cerebro después del experimento
indicaron que no había ocurrido la muerte celular. Estos
resultados, además de los otros resultados descritos en los
siguientes Ejemplos, confirman que el tratamiento del ADDL
comprometió la respuesta del LIP. Esto indica que los ADDLs
contribuyen al aprendizaje comprometido y a la memoria comprometida
que se observan en la enfermedad de Alzheimer por interferencia con
los procesos de señalización neuronal, más que por la inducción de
la muerte de células nerviosas.
Se puede obtener información adicional de los
efectos de los ADDLs (en presencia o en ausencia de los compuestos
de prueba que potencialmente modulan la formación y/o la actividad
del ADDL) utilizando más ensayos según la invención. Por ejemplo,
también se hace referencia a un procedimiento para ensayar los
efectos de los ADDLs que comprende preferentemente:
- (a)
- administrar el ensamblaje de proteína en el hipocampo de un animal;
- (b)
- aplicar un estímulo eléctrico; y
- (c)
- medir el tiempo extra de la amplitud de pico del cuerpo de la célula para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo. El procedimiento se lleva a cabo opcionalmente en el que la respuesta de potenciación a largo plazo del animal se compara con la respuesta de potenciación a largo plazo de cualquier otro animal tratado de la misma forma exceptuando en que se había administrado solución salina en vez del ensamblaje de proteína antes de la aplicación del estímulo eléctrico. Este procedimiento se puede emplear además para identificar compuestos que modulan (esto es, que aumentan o que disminuyen) los efectos de los ADDLs, por ejemplo, por comparación de la respuesta del LTP en animales a los que se les administró los ADDLs, en solitario o en conjunción con los compuestos de prueba.
Junto con estas líneas, también se hace
referencia a un procedimiento para identificar compuestos que
modulan los efectos de los ensamblajes de proteína del ADDL. El
procedimiento comprende preferentemente:
- (a)
- administrar la solución salina o un compuesto de prueba en el hipocampo de un animal;
- (b)
- aplicar un estímulo eléctrico;
- (c)
- medir el tiempo extra de la amplitud de pico del cuerpo de la célula para determinar la respuesta de potenciación a largo plazo; y
- (d)
- comparar la respuesta de potenciación a largo plazo de animales que tienen administrada la solución salina con la respuesta de potenciación a largo plazo de animales que tienen administrado componentes de prueba. El procedimiento opcionalmente comprende además el ensamblaje de proteína administrada en el hipocampo antes, con o después de administrar la solución salina o el compuesto de prueba.
De modo similar, también se hace referencia a un
procedimiento para identificar los compuestos que modulan (esto es,
que aumentan o que disminuyen) la neurotoxicidad de los ensamblajes
de proteína del ADDL, en el que el procedimiento comprende:
- (a)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con el ensamblaje de proteína en presencia o en ausencia de contacto con el compuesto de prueba;
- (b)
- medir la proporción de las células viables en cada cultivo; y
- (c)
- comparar la proporción de las células viables en cada cultivo. Se identifican los compuestos que bloquean la neurotoxicidad de los ensamblajes de proteína, por ejemplo, como que dan lugar a una proporción aumentada de las células viables en el cultivo comparando con los correspondientes cultivos en contacto con el ensamblaje de proteína en ausencia del compuesto de prueba. Se identifican los compuestos que incrementan la neurotoxicidad del ensamblaje de proteína, por ejemplo, como que dan lugar a una proporción reducida de las células viables en el cultivo comparando con los correspondientes cultivos en contacto con el ensamblaje de proteína en presencia del compuesto de prueba.
También se pueden emplear los procedimientos de
la invención en la detección de materiales de prueba de los ADDLs
(por ejemplo, como parte de la investigación, el diagnóstico y/o la
terapia). Por ejemplo, los ADDLs provocan un rápido cambio
morfológico en las células B103 privadas de suero, y también activan
la actividad de la quinasa Fyn en estas células dentro de los 30
minutos del tratamiento del ADDL (datos no mostrados). Los ADDLs
también inducen a la rápida formación de complejo entre la Fyn y la
quinasa de adhesión focal (FAK; Zhang et al, Neurosci.
Letters, 211, 1-4, 1996) y la
translocalización de diversas proteínas fosforilatadas y de
complejos Fyn-Fak en una fracción insoluble de
Tritón (Berg et al., J. Neurosci. Res., 50,
979-989, 1997). Esto sugiere que se implican en el
proceso neurodegenerativo inducido por los ADDLs, la Fyn y las otras
vías de señalización activadas. Esto se ha proseguido mediante
experimentos en los cultivos de los cortes de cerebro de ratones
alterados genéticamente que carecen de un gen fyn funcional, donde
añadir los ADDLs no da como resultado una neurotoxicidad aumentada
comparada con los controles de los excipientes.
Por lo tanto, los compuestos que bloquean una o
más funciones Fyn, o relocalizan la Fyn, concretamente mediante el
impactado con los ADDLs, pueden ser un medicamento neuroprotector
importante para la enfermedad de Alzheimer. De manera parecida,
cuando los ADDLs se añadirán a los cultivos de los astrocitos
primarios, se activan los astrocitos y se vuelve elevado el ARNm de
diversas proteínas, incluyendo la IL-1, la síntesis
de óxido nítrico inducible, la Apo E, la Apo J y la
\alpha1-antiquimotripsina. Estos fenómenos se
emplean idealmente en un procedimiento para detectar en un material
de ensayo el ensamblaje de proteína del ADDL. Dicho procedimiento
comprende opcionalmente:
- (a)
- poner en contacto el material de ensayo con un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo 6E10 o cualquier otro anticuerpo); y
- (b)
- detectar la fijación en el ensamblaje de proteína del anticuerpo.
De modo similar, el procedimiento se puede
emplear idealmente en que:
- (a)
- poner en contacto el material de prueba con las células de neuroblastoma privadas de suero (por ejemplo, las células de neuroblastoma B103); y
- (b)
- medir los cambios morfológicos en las células comparando la morfología de las células con las células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con el material de prueba.
El procedimiento también se puede emplear
preferentemente en que:
- (a)
- poner en contacto el material de prueba con los cultivos de cortes de cerebro; y
- (b)
- medir la muerte de células de cerebro comparándolo con los cultivos de cortes de cerebro que no se han puesto en contacto con el material de ensayo. El procedimiento se puede más idealmente llevar a cabo en que:
- (a)
- poner en contacto el material de prueba con las células de neuroblastoma (por ejemplo, las células de neuroblastoma B103); y
- (b)
- medir los aumentos en la actividad de la quinasa fyn por comparación de la actividad de la quinasa fyn en las células contra la actividad de la quinasa fyn en las células de neuroblastoma que no se han puesto en contacto con dicho material de prueba. En especial, la actividad de la quinasa fyn se puede comparar haciendo uso de un equipo disponible comercialmente (por ejemplo, el Equipo #QIA-28 de Oncogene Research Products, Cambridge, MA) o utilizando un ensayo análogo al descrito en Borowski et al., J. Biochem. (Tokio), 115, 825-829, 1994.
En aún otra realización preferida del
procedimiento de detección de los ADDLs en el material de prueba,
el procedimiento idealmente comprende:
- (a)
- poner en contacto el material de prueba con cultivos de astrocitos primarios; y
- (b)
- determinar la activación de los astrocitos comparados con los cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba. En una variación de este procedimiento, el procedimiento opcionalmente comprende:
- (a)
- poner en contacto del material de prueba con los cultivos de los astrocitos primarios; y
- (b)
- medir el aumento de astrocitos en el ARNm para proteínas seleccionadas de los grupos consistentes en la interleuquina-1, la síntesis de óxido nítrico inducible, la Apo E, la Apo J y la \alpha1-antiquimotripsina, por comparación de los niveles de ARNm en los cultivos de astrocitos primarios con los correspondientes niveles de ARNm en los cultivos de astrocitos primarios que no se han puesto en contacto con el material de prueba. Existen, por supuesto, otros procedimientos de ensayo, y más variaciones de los mismos descritas anteriormente que serían evidentes a un experto en la técnica, en particular en vista de las especificaciones que aquí hacen referencia.
De este modo, claramente, los ADDLs tiene
utilidad in vitro según la presente invención. Dichos ADDLs
se pueden utilizar entre otras cosas como una herramienta de
investigación en el estudio de la fijación del ADDL y la
interacción dentro de las células y un procedimiento de ensayo de la
actividad del ADDL. De modo similar, se pueden emplear in
vivo los ADDLs, y los estudios de la formación, la actividad y
la modulación del ADDL.
En especial, los compuestos identificados
utilizando los procedimientos de la presente invención se pueden
utilizar para tratar cualquier número de enfermedades, trastornos, o
estados que dan como resultado un déficit en la cognición o el
aprendizaje (esto es, debido a un fallo de la memoria), y/o los
propios déficit de memoria. Dichos tratamiento o prevención se
pueden efectuar por administración de compuestos que previenen la
formación y/o la actividad de los ADDLs, o que modulan (esto es, que
aumentan o que disminuyen la actividad, idealmente, como una
consecuencia del impacto de los ADDLs) a los agentes celulares con
los que interactúan los ADDLs (por ejemplo, los eventos "en
dirección 3'" así llamados). Se hace referencia aquí de dichos
compuestos, que tienen capacidad de impactar con los ADDLs, como
"compuestos moduladores del ADDL". Los compuestos moduladores
del ADDL no sólo pueden actuar de una manera negativa, sino también,
en algunos casos, se emplean preferentemente para aumentar la
formación y/o la actividad de los ADDLs.
Idealmente, cuando se emplea in vivo, el
procedimiento se puede emplear para proteger un animal de las
disminuciones en la cognición, el aprendizaje y la memoria debido a
los efectos de los ensamblajes de proteína del ADDL. Este
procedimiento comprende la administración de un compuesto que
bloquea la formación o la actividad de los ADDLs. De modo similar,
en la extensión que los déficits en la cognición, el aprendizaje y
la memoria se acumulan debido a la formación y/o la actividad de los
ADDLs, dichos déficit se pueden invertir o reestablecer una vez que
se bloquea la actividad (y/o la formación) de los ADDLs. La
invención preferentemente proporciona de este modo un procedimiento
para invertir (o para reestablecer) en un animal las disminuciones
en la cognición, el aprendizaje y la memoria debido a los efectos de
un ensamblaje de proteína según la invención. Este procedimiento
comprende preferentemente el bloqueo de la formación o de la
actividad de los ADDLs.
En especial, este procedimiento se puede aplicar
idealmente en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, un
trastorno o una afección que se manifieste como un déficit en la
cognición, el aprendizaje y la memoria y que se deba a la formación
o la actividad del ADDL, especialmente a una enfermedad, un
trastorno o una afección escogidas del grupo consistente en la
enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down de adultos (esto es,
por encima de la edad de 40 años), y la demencia senil.
También, este procedimiento idealmente se puede
aplicar en el tratamiento o la prevención de los efectos
perjudiciales tempranos en la actividad celular, la cognición, el
aprendizaje y la memoria que pueden advertir previamente al
desarrollo de la propia enfermedad, trastorno o afección, y cuyos
efectos perjudiciales pueden contribuir al desarrollo, o en última
instancia constituir la propia enfermedad, del trastorno o la
afección. En especial, el procedimiento se puede aplicar
preferentemente en el tratamiento o la prevención de la disfunción
temprana de las células nerviosas o cualquier otra célula del
cerebro que puede resultar como una consecuencia de la formación o
de la actividad del ADDL. De modo similar, el procedimiento se puede
aplicar preferentemente en el tratamiento o la prevención del
déficit de memoria focal (FMD) de la forma que se encuentra descrita
en el material publicado (por ejemplo, Linn et al., Arch.
Neurol., 52, 485-490, 1995), en el caso
de que el FMD se deba a la formación o a la actividad del ADDL. El
procedimiento puede ser empleado más idealmente en el tratamiento y
en la prevención de la señalización neuronal aberrante inducida por
el ADDL, discapacidad de orden superior por los escritos de los
expertos (por ejemplo, Snowdon et al., JAMA,
275, 528-532, 1996), o cualquier otra
función cognitiva de orden superior, que disminuye en (o a falta de)
la potenciación a largo plazo, que sigue como una consecuencia de
la formación o la actividad del
ADDL.
ADDL.
Según esta invención, se puede medir la
"señalización neuronal aberrante inducida por el ADDL" mediante
una variedad de recursos. Por ejemplo, para la señalización
neuronal normal (además de la observación de la respuesta de la
potenciación a largo plazo), parece que entre otras cosas, se puede
activar la quinasa Fyn, la quinasa Fyn puede fosforilatar el canal
de NMDA (Miyakawa et al., Science. 278,
698-701, 1997; Grant, J. Physiol. Paris,
90, 337-338, 1996), y se puede presentar la
Fyn en la posición celular apropiada (que se puede impedir mediante
la formación del complejo Fyn-FAK, por ejemplo, como
ocurre en ciertas reorganizaciones de citoesqueleto inducidas por
el ADDL). Basado en esto, se puede emplear en los procedimientos de
la invención la señalización neuronal aberrante inducida por el
ADDL (que es una disfunción de la señalización que se induce
mediante la activación aberrante de las vías celulares mediante los
ADDLs) y el aprendizaje del mismo, de manera que podría ser obvio
para un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede evaluar la
señalización celular aberrante inducida por el ADDL (por ejemplo,
como una consecuencia de las células nerviosas que contactan con
los ADDLs, que además se puede llevar a cabo en presencia o en
ausencia de los compuestos que fueron probados para la actividad
modulada por al ADDL) utilizando cualquiera de estas medidas, o de
manera que sería evidente para un experto en la técnica, por
ejemplo, la activación de la quinasa Fyn (o la alteración del
mismo), la formación del complejo Fyn-FAK (o la
alteración del mismo), la reorganización del citoesqueleto (o la
alteración del mismo), la ubicación subcelular de la quinasa Fyn (o
la alteración del mismo), y la fosforilación el canal de NMDA (o la
alteración del mismo).
También, se pueden aplicar en el tratamiento los
propios ADDLs. Se ha descubierto que estos novedosos ensamblajes
aquí descritos tienen numerosos efectos inesperados en las células y
cabe la posibilidad de que se pueda aplicar para la terapia. Por
ejemplo, las células endoteliales activadoras de los ADDLs, cuyas
células endoteliales son conocidas, entre otras cosas, para
interactuar con células vasculares. Junto con estas líneas, los
ADDLs se pueden emplear, por ejemplo, en la curación de heridas.
También, por medio de un ejemplo, la Toxina de la Botulina Tipo A
(BoTox) es un agente de bloqueo de las uniones neuromusculares
producida por la bacteria Clostridium botulinum que actúa
mediante el bloqueo de la liberación de la acetilcolina
neurotransmisora. El Bótox ha resultado beneficioso en el
tratamiento de los espasmos musculares descapacitadores, que
incluyen a la distonia. Se pueden teóricamente aplicar los propios
ADDLs para la función celular neural ordenada o para las células
neurales de destino destruidas selectivamente (por ejemplo, en los
casos de cáncer, por ejemplo, del sistema nervioso central, en
particular del cerebro). Los ADDLs parecen más ventajosos en esta
consideración debido a que tienen efectos muy tempranos en células,
y debido a que parece ser reversible su efecto en células (aparte
de su efecto de matar células).
Tal y como se discutió anteriormente, los
componentes moduladores del ADDL de la presente invención, además
de los propios ADDLs, se pueden emplear para poner en contacto
células in vitro o in vivo. Según la invención, una
célula puede ser cualquier célula, y, preferentemente, es una célula
eucariótica. Una célula eucariótica es una célula típica que posee
en la misma fase de su vida un núcleo rodeado por una membrana
nuclear. Preferentemente, la célula eucariótica es de una especie
multicelular (por ejemplo, lo opuesto a una célula de levadura
unicelular), e incluso más preferentemente, es una célula de
mamífero (opcionalmente humana). Sin embargo, el procedimiento se
puede llevar a cabo también con eficacia utilizando una amplia
variedad de diferentes tipos de células tales como las células
aviares y las células de mamíferos, que incluyen pero no limitan a
las células de los roedores, de los primates (tales como el
chimpancé, el mono, el simio, el gorila, el orangután o el gibón),
de los felinos, de los cánidos, de los ungulados (tales como los
rumiantes o el cerdo), además de, en especial, las células humanas.
Preferentemente los tipos de células son células formadas en el
cerebro, que incluyen las células neurales y las células gliales. Un
tipo de célula especialmente preferente según la invención es una
célula neural (normal o aberrante, por ejemplo, transformada o
cancerosa). La célula neural es idealmente una célula de
neuroblastoma cuando se emplea en el cultivo de tejidos.
Se puede presentar una célula como una entidad
individual, o puede ser parte de una gran colección de células.
Dicha "gran colección de células" puede comprender, por
ejemplo, un cultivo de células (mezcladas o puras), un tejido (por
ejemplo, neural o cualquier otro tejido), un órgano (por ejemplo, el
cerebro o cualquier otro órgano), un sistema de órganos (por
ejemplo, el sistema nervioso o cualquier otro sistema de órganos),
o un organismo (por ejemplo, el mamífero, o cualquier otro por el
estilo). Preferentemente, los órganos/tejidos/células de interés en
el contexto de la invención están en el sistema nervioso central
(por ejemplo, son las células neurales).
También, según la invención, "el contacto"
comprende cualquier medio por el que estos agentes tocan
físicamente a la célula. El procedimiento no es dependiente de
cualquier medio particular de introducción y no está para ser
interpretado. Los medios de introducción son bien conocidos por
aquellos expertos en la técnica, y también son aquí ejemplificados.
En consecuencia, la introducción se puede efectuar, por ejemplo,
in vitro (por ejemplo, en un tipo de procedimiento ex
vivo o en estudios de cultivos de tejidos) o in vivo.
Están disponibles también otros procedimientos y que son conocidos
por aquellos expertos en la técnica.
Dicho "contacto" se puede dar por cualquier
medio conocido por aquellos expertos en la técnica, y descrito en
la presente, por el que se puede llevar a cabo el toque aparente o
la tangencia común de los ADDLs y de los compuestos modulantes del
ADDL y de la célula. Por ejemplo, el contacto se puede dar por la
mezcla de estos elementos en un volumen pequeño de la misma
solución. Opcionalmente, los elementos además se pueden unir de
forma covalente, por ejemplo, mediante medios químicos conocidos por
aquellos expertos en la técnica, o mediante cualquier otro medio, o
preferentemente se pueden unir por medio de interacciones
monocovalentes (por ejemplo, los enlaces iónicos, los enlaces de
hidrógeno, las fuerzas de Van der Waals, y/o interacciones no
polares). En comparación, para ser afectada la célula y el ADDL o el
compuesto modulante del ADDL no necesariamente necesitan ser
llevados a contactar en un volumen pequeño, como, por ejemplo, por
si donde el ADDL o el compuesto modulante del ADDL se administra a
un receptor, y el complejo se desplaza por el torrente sanguíneo o
cualquier otro fluido del cuerpo, tal como el fluido
cerebroespinal, hasta la célula con la que se fijan. El contacto de
la célula con un ADDL o un compuesto modulante del ADDL se da a
veces antes de, junto con, o después de que se administre cualquier
otro compuesto de interés. Idealmente, este contacto se da de manera
que existe al menos algún periodo de tiempo en el que los agentes
coadministradores ejercen simultáneamente sus efectos en una célula
o en el ADDL.
Un experto en la técnica apreciará que están
disponibles los procedimientos adecuados para administrar un agente
(por ejemplo, un ADDL o un compuesto modulante del ADDL) de la
presente invención a un animal para los efectos de la terapia y/o
el diagnosis, la investigación o el estudio, y, aunque se puede
utilizar más que una vía para administrar, una vía especial puede
proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que
cualquier otra vía. También son bien conocidos los excipientes
aceptables farmacéuticamente por aquellos que son expertos en la
técnica, y que son fácilmente disponibles. La elección del
excipiente estará determinada en parte por el procedimiento
especial utilizado para administrar el agente. En consecuencia,
existe una amplia variedad de formulaciones apropiadas para
utilizar en el contexto de la presente invención. Los siguientes
procedimientos y excipientes son simplemente ejemplares y no están
de ninguna manera para restringir.
Las formulaciones apropiadas para la
administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas,
tal como una efectiva cantidad del compuesto disuelto en diluyentes,
tales como agua, solución salina, o jugo de naranja; (b) cápsulas,
sobrecitos o comprimidos, conteniendo cada uno de ellos una cantidad
predeterminada de los ingredientes activos, como sólidos o
gránulos; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones
apropiadas. Las formas en comprimidos pueden incluir uno o más
excipientes de lactosa, de mannitol, de almidón de maíz, de almidón
de patata, de celulosa microcristalina, de acacia, de gelatina, de
dióxido de silicio coloidal, de croscarmellosa de sodio, de talco,
de estearato de magnesio, de ácido esteárico, y de cualquier otro
excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponadores, agentes
humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, y excipiente
farmacológicamente compatible. Las formas en pastillas pueden
comprender el ingrediente activo en un compuesto donante de sabor,
normalmente sacarosa y acacia o tragacanto, además de pastillas que
comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como
gelatina y glicerina, emulsiones, geles, y los que contenga por el
estilo, además del ingrediente activo, y dichos excipientes son
conocidos en la técnica.
Un agente de la presente invención, sólo o en
combinación con otros ingredientes apropiados, se puede realizar en
formulaciones de aerosol para ser administradas por vía de
inhalación. Estas formulaciones de aerosoles se pueden poner en
propelentes aceptablemente presurizados, tales como el
diclorodifluorometano, el propano, el nitrógeno, y cualquier otro
por el estilo. También se pueden formular como producto farmacéutico
en preparaciones no presurizadas tales como en un nebulizador o un
atomizador.
Según la invención son preferentes las
formulaciones apropiadas para la administración parenteral e
incluyen acuosas y no acuosas, soluciones inyectables estériles
isotónicas, que pueden contener antioxidantes, soluciones tampón,
bacteriostatos, y solutos que se traducen en el isotónico de la
formulación con la sangre del recipiente buscado, y las
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir a
agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes,
estabilizantes, y conservantes. Las formulaciones se pueden
presentar en recipientes cerrados monodosis o multidosis, tales como
ampollas y viales, y se pueden almacenar en condiciones de
congelación en seco (liofilización) que requieren sólo añadir el
excipiente líquido estéril, por ejemplo, el agua, para inyecciones,
inmediatamente antes de su utilización. Se pueden preparar
improvisadas soluciones y suspensiones para inyectar a partir de
polvos estériles, gránulos y comprimidos de la clase descrita
anteriormente.
La dosis administrada a una animal, en
particular a un humano, en el contexto de la presente invención
variará con el agente de interés, la composición empleada, el
procedimiento de administración, y el emplazamiento especial y el
organismo que sea tratado. Sin embargo, preferentemente se emplea
una dosis correspondiente a una cantidad efectiva de un agente (por
ejemplo, un ADDL o un compuesto modulante del ADDL según la presente
invención). Una "cantidad efectiva" es aquella que sea
suficiente para producir los efectos deseados en un receptor, que
se puede monitorizar utilizando varios puntos finales conocidos por
aquellos expertos en la técnica. Algunos ejemplos de los efectos
deseados incluyen, pero no por eso limitan, un efecto en el
aprendizaje, la memoria, la respuesta de LTP, la neurotoxicidad, la
formación del ADDL, la fijación del receptor del ADDL, la fijación
del anticuerpo, los cambios morfológicos celulares, la actividad de
la quinasa Fyn, la activación de los astrocitos, y los cambios en
los niveles del ARNm para las proteína tales como la
interleuquina-1, la síntesis de óxido nítrico
inducible, la Apo E, la Apo J, y la
\alpha1-antiquimotripsina. Estos procedimientos
descritos no constan ni mucho menos con todo incluido, y serán
obvios otros procedimientos adicionales para el experto artesano
corriente para adaptar la aplicación específica.
Sin embargo, con las aplicaciones especiales
(por ejemplo, in vitro o in vivo) la dosis actual y el
programa de administración de los ADDLs o de los compuestos
modulantes del ADDL puede variar dependiendo de si la composición
se administra en combinación con otras composiciones farmacéuticas,
o dependiendo de las diferencias interindividuales en cinética
farmacológica, la disposición de drogas, y el metabolismo. De modo
similar, las cantidades pueden variar en las aplicaciones in
vitro que dependen del tipo de célula especial utilizado o del
medio o la solución mediante la que el ADDL o el compuesto modulante
del ADDL se transfiera al cultivo. Un experto en la técnica puede
hacer fácilmente cualquier tipo de adaptaciones según los
requerimientos de la situación particular.
Las descripciones precedentes (además de
aquellas que siguen) están solamente como simples ejemplos. Para un
experto en la técnica serán obvias otras aplicaciones del
procedimiento y constituyentes de la presente invención. De este
modo, los siguientes ejemplos ilustrarán además la presente
invención pero, claro está, no deberían ser interpretados de
cualquiera manera como limitadoras del alcance.
Según la invención, los ADDLs se prepararon
mediante la disolución de 1 mg de la
\beta-amiloide 1-42 sólida (por
ejemplo, sintetizada tal y como se describe en Lambert et
al., J. Neurosci. Res., 39,
377-395, 1994) en 44 \mul de DMSO anhidro. Esta
solución de 5 mM se diluyó entonces en el medio F12 frío (a 4ºC)
(Gibco BRL, Life Technologies) hasta un volumen total de 2,20 ml
(diluyendo por 50), y agitado durante aproximadamente 30 segundos.
Se permitió incubar la mezcla entre aproximadamente 0ºC y
aproximadamente 8ºC durante aproximadamente 24 horas, siguiendo una
centrifugación a 14.000 x g durante aproximadamente 10 minutos a
aproximadamente 4ºC. El sobrenadante se diluyó mediante factores de
1:10 a 1:10.000 en un medio definido especialmente, antes de
incubar con los cultivos de cortes de cerebro, los cultivos de
células o las preparaciones de proteínas fijadas. En general, sin
embargo, los ADDLs se formaron a una concentración de proteína
A\beta de 100 \muM. Normalmente, la concentración más alta
utilizada para los experimentos es de 10 \muM y, en algunos casos,
los ADDLs (medidos como concentración inicial de la A\beta) se
diluyeron (por ejemplo, en medios de cultivo de células) hasta 1 nM.
Para el análisis mediante microscopio de fuerza atómica (AFM), se
aplicó una alícuota de 20 \mul de la dilución de 1:100 a la
superficie de un disco de una mica recién cortada y se analizó.
Cualquier otra manipulación se describió como sigue, o como se
advierte.
Alternativamente, la formación del ADDL se llevó
a cabo tal y como se describió anteriormente, con la excepción de
que el medio F12 se reemplazó por una solución tampón (esto es, el
"medio F12 substituto") que contiene los siguientes
componentes: N,N-dimetilglicina (aproximadamente 766
mg/l), D-glucosa (aproximadamente 1,802 g/l),
cloruro de calcio (aproximadamente 33 mg/l), sulfato de cobre
pentahidrato (aproximadamente 25 mg/l), sulfato de hierro (II)
heptahidrato (aproximadamente 0,8 mg/l), cloruro de potasio
(aproximadamente 223 mg/l), cloruro de magnesio (aproximadamente 57
mg/l), cloruro de sodio (aproximadamente 7,6 g/l),
hidrogenocarbonato de sodio (aproximadamente 1,18 g/l),
hidrogenofosfato de sodio (aproximadamente 142 mg/l), y sulfato de
cinc heptahidrato (aproximadamente 0,9 mg/l). El pH de la solución
tampón se ajustó hasta 8,0 utilizando hidróxido de sodio 0,1 M.
El glutaraldehído se ha utilizado
satisfactoriamente en una variedad de sistemas bioquímicos. El
glutaraldehído tiende a reticular a las proteínas que están en
contacto directo, a diferencia de la reacción no específica con
altas concentraciones de proteína monómera. En este ejemplo, se
investigó el reticulado de la \beta-amiloide que
dispone de glutaraldehído.
La preparación de oligómero se llevó a cabo tal
y como se describió en el Ejemplo 1, con la utilización del medio
F12 substitutivo. El sobrenadante que se obtuvo por la
centrifugación siguiente (y en algunos casos, por el fraccionado)
se trató con 0,22 ml de una solución acuosa al 25% de glutaraldehído
(Aldrich), seguido de 0,67 ml de borohidro de sodio 0,175 M en NaOH
0,1 M (según el procedimiento de Levine, Neurobiología del
Envejecimiento, 1995). Se agitó la mezcla a 4ºC durante 15 minutos y
se enfrió añadiendo 1,67 ml de sacarosa acuosa al 20%. Se concentró
la mezcla hasta 5 veces en un SpeedVac y se dializó para eliminar
los componentes más pequeños de 1 kD. El material fue analizado
mediante SDS PAGE. Se llevó a cabo la cromatografía de filtración
de gel según lo siguiente: la columna Superose 75PC 3.2/3.0
(Farmacia) se equilibró con filtración y con desgasificación de una
solución tampón (pH = 8,0) de hidrógeno carbonato de amonio al
0,15% a una velocidad de flujo de 0,02 ml/min por encima de un
ciclo de 8 horas a la temperatura del recinto. Se cambió la
velocidad del flujo a 0,04 ml/min y 20 ml de disolvente se eluyen.
Se cargaron 50 microlitros de la solución de reacción en la columna
y la velocidad del flujo se reanudó a 0,04 ml/min. Se monitorizó la
elución del compuesto vía detección UV a 220 nm, y se recuperaron
fracciones de 0,5 - 1,0 ml durante el transcurso de la
cromatografía. Se aisló la fracción Número 3, que corresponde con
el tercer pico de la absorbancia UV, y se demostró mediante el AFM
que contenía glóbulos de 4.9 +/- 0,8 nm (mediante el análisis de
anchura). Esta fracción era muy neurotóxica cuando contactó con las
neuronas de los cortes de cerebro, tal y como se describe en los
ejemplos que siguen.
Este ejemplo parte de la caracterización por
tamaños de los ADDLs formados como en el Ejemplo 1, y utilizando
una variedad de procedimientos (por ejemplo, la electroforesis en
gel nativo, la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, el AFM, el fraccionamiento por
campo gravitatorio y flujo, y el inmunoreconocimiento).
El AFM se llevó a cabo esencialmente tal y como
se describió anteriormente (por ejemplo, Stine et al., J.
Protein Chem., 15, 193-203, 1996).
Concretamente, las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio
de fuerza atómica Multimodo modelo Nanoscopio IIIa de Digital
Instruments (Santa Bárbara, CA) utilizando un escáner J con rango
xy de 150 \mu. Se empleó el Contacto Intermitente para todas las
imágenes utilizando el TESP Nanoprobes (Digital Instruments) de
silicio grabado. Los datos del AFM se analizan utilizando el
software del Nanoscopio IIIa y el software del análisis de la onda
de pulso del IGOR Pro™. Para el análisis del AFM, se llevó a cabo
con el escáner de 4 \mu (esto es, que calcula un cuadrado de 4
\mum x 4 \mum). Normalmente, las dimensiones presentadas se
obtuvieron mediante el análisis de sección, y está especificado
donde se empleó el análisis de anchura. Los análisis de sección y
de anchura son módulos de análisis por separado con el software del
Nanoscopio IIIa. Generalmente, para el análisis ADDL, existe una
desviación sistemática entre los tamaños obtenidos mediante el
análisis de sección y los obtenidos mediante el análisis de anchura.
Concretamente, para un escáner de 4 \mu, el análisis de sección
da alturas que por lo general son aproximadamente un 0,5 nm más
altos, de este modo resulta una desviación de aproximadamente 0,5 nm
en los valores obtenidos para los tamaños de los glóbulos.
Se llevó a cabo el análisis mediante
electroforesis en gel en geles al 15% de poliacrilamida y se
visualizó mediante tinción de azul de Coomassie. Se resolvieron los
ADDLs en geles de trisglicina al 4 - 20% bajo condiciones no
desnaturalizadas (Novex). Se efectuó la electroforesis a 20 mA
durante aproximadamente 1,5 horas. Se resolvieron las proteínas con
el SDS-PAGE tal y como se describe en Zhang et
al., J. Biol. Chem., 269,
25247-25250, 1994. Se visualizó entonces la proteína
utilizando un teñido de plata (por ejemplo, tal y como se describe
en Sherchenko et al., Anal. Chem., 68,
850-858, 1996). Se transfirieron las proteínas del
gel a partir del gel nativo y del gel SDS, a membranas de
nitrocelulosa según Zhang et al. (J. Biol. Chem.,
269, 25247-50, 1994). Se efectuaron las
inmunotransferencias con el anticuerpo 6E10 biotinilatado (Senetak,
Inc., St. Louis, Missouri) a 1:5.000 y visualizados utilizando ECL
(Amersham). Normalmente, se escanearon los geles utilizando un
densitómetro. Esto permite abastecer a las imágenes de los geles
generadas por ordenador (por ejemplo, contra las fotografías
propias de los geles).
La caracterización por tamaños de los ADDLs
mediante el análisis de sección del AFM (por ejemplo, tal y como se
describe en Stine et al., J. Protein Chem., 15,
193-203, 1996) o el análisis de anchura (software
del Nanoscopio III) indicaron que las especies predominantes eran
los glóbulos de aproximadamente 4,7 nm a aproximadamente 6,2 nm por
el eje z. La comparación con proteínas globulares pequeñas (monómero
A\beta 1-40, aprotinina, bFGF, anhidrasa
carbónica) sugirió que los ADDLs tenían una masa entre 17 - 42 kD.
Se puede reconocer que parecen ser especies distintas. Estos
parecen que corresponden a glóbulos de dimensiones entre
aproximadamente 4,9 nm y aproximadamente 5,4 nm, entre
aproximadamente 5,4 nm y aproximadamente 5,7 nm, y entre
aproximadamente 5,7 nm y aproximadamente 6,2 nm. Los glóbulos de
dimensiones de aproximadamente 4,9 - 5,4 nm y 5,7 - 6,2 nm aparecen
para comprender aproximadamente el 50% de los glóbulos.
En armonía con el análisis del AFM, las
inmunotransferencias SDS-PAGE de los ADDLs
identificaron a los oligómeros A\beta de aproximadamente 17 kD
hasta aproximadamente 22 kD, con abundante monómero presente de 4
kD, presumiblemente un producto de descomposición. Consecuentes con
esta interpretación, los geles de poliacrilamida no desnaturalizada
de los ADDLs muestran escaso monómero, con una banda primaria
cercana a los 30 kD, una banda menos abundante a \sim17 kD, y sin
pruebas de fibrillas ni de agregados. En la Figura 1 y en la Figura
2 se exponen las imágenes generadas por ordenador de un gel nativo
teñido de plata y de un gel de SDS-poliacrilamida
de teñido de plata de Coomassie, respectivamente. La correspondencia
entre el gel SDS y el gel no desnaturalizante confirma que el
tamaño oligomérico pequeño de los ADDLs no se debía a la acción
detergente. Los oligómeros vistos en las preparaciones de ADDL eran
más pequeños que la clusterina (Mr 80 kD, 40 kD en los geles
desnaturalizantes), tal y como se supone al utilizar
concentraciones de clusterina bajas (1/40 relativo a A\beta, que
descarta la asociación de A\beta como complejos de 1:1 clusterina
A\beta).
Se fraccionó una preparación de ADDL según la
invención en una columna Superdex 75 (Farmacia, columna de Superose
75PC 3.2/3.0). La fracción que comprendía los ADDLs era la tercera
fracción del eluyente de la absorbancia UV de la columna y se
analizó mediante el AFM y la electroforesis en gel de
SDS-poliacrialamida. En la Figura 3 se representan
unos análisis representativos del AFM de la fracción 3. El
fraccionamiento resultó una homogeneidad más grande para los ADDLs,
con la mayoría de los glóbulos que tenían dimensiones entre
aproximadamente 4,9 nm y aproximadamente 5,4 nm. La electroforesis
en gel de SDS-poliacrialamida de la fracción
demostró una banda inferior densa que correspondía con la forma
monómera/dímera del A\beta. Como también se observó para la
preparación no fraccionada de los ADDLs, esto parece ser un producto
de descomposición de los ADDLs. La carga más pesada de la fracción
revelaba una banda ancha de gran tamaño (tal vez un doblete). Esto
confirma además la estabilidad de las estructuras oligoméricas
A\beta no fibrilares en el SDS.
Aunque se ha propuesto que las estructuras
fibrilares representan la forma tóxica de la A\beta (Lorenzo
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,
12243-12247, 1994; Howlett et al.,
Neurodegen, 4, 23-32, 1995), se
formarán las neurotoxinas novedosas, que no se comportan como
fibrillas sedimentables, cuando la A\beta 1-42 se
incube con una baja dosis de clusterina, que también se conoce como
"Apo J" (Oda et al., Exper. Neurol., 136,
22-31, 1995; Oda et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 204, 1131-1136, 1994). Para
probar si estas toxinas lentamente sedimentadas pudieran contener
aún pequeñas o incipientes fibrillas, las preparaciones de la
A\beta tratadas con clusterina se examinaron mediante el
microscopio de fuerza atómica.
El tratamiento de la clusterina se llevó a cabo
tal y como se describe en Oda et al. (Exper. Neurol.,
136, 22-31, 1995) básicamente añadiendo
clusterina en la incubación descrita en el Ejemplo 1. Otra
posibilidad es que la A\beta 1-42 de partida se
podría disolver en HCl 0,1 N, bastante más que el DMSO, y esta
A\beta 1-42 de partida podría incluso tener
estructuras fibrilares desde el principio. Sin embargo, la
incubación con clusterina durante 24 horas a una temperatura del
recinto de 37ºC, en preparaciones que estaban predominantemente
libres de fibrillas, resultó constante con su lenta sedimentación.
Esto se confirmó mediante experimentos que muestran que la
formación de fibrillas disminuye cuando aumenta la cantidad de la
clusterina añadida.
Las preparaciones resultantes desde el
tratamiento con clusterina comprendían exclusivamente las pequeñas
estructuras globulares de aproximadamente 5 - 6 nm de tamaño tal y
como se determinó mediante el análisis del AFM de los ADDLs
fraccionados en una columna de gel Superdex 75. Se obtuvieron
resultados equivalentes mediante la microscopía de electrones
convencional. En contraste, la A\beta 1-42 que
tenía propiamente asociada bajo condiciones estándar (Snyder et
al., Biophys. J., 67, 1216-28,
1994) en ausencia de clusterina mostró las especies fibrilares no
difusibles fundamentalmente grandes. Sin embargo, las preparaciones
del ADDL resultante se pasaron a través de una membrana aislada
Centricon de 10 kD y se analizó en gel de gradiente de
SDS-poliacrialamida. Tal y como se pudo ver en la
Figura 4, sólo el monómero pasa a través del filtro 10 del
Centricon, mientras que los ADDLs son retenidos por el filtro. El
monómero encontrado después de la separación se podría formar a
partir de las especies de peso molecular grande retenidas por el
filtro.
Estos resultados confirman que las preparaciones
de ADDL tóxicas comprenden pequeños oligómeros libres de fibrillas
de la A\beta 1-42, y que se pueden obtener los
ADDLs mediante el tratamiento de clusterina apropiado de la
\beta-amiloide.
Las fracciones tóxicas del ejemplo 4 podrían
comprender estructuras poco comunes que contienen el oligómero
A\beta y la clusterina. Mientras que Oda et al. (Exper.
Neurol., 136, 22-31, 1995) informaba que
se encontró la clusterina para aumentar la toxicidad de las
soluciones A\beta 1-42, otros han encontrado que
la clusterina a niveles estequiométricos protege contra la
toxicidad de la A\beta 1-40 (Boggs et al.,
J. Neurochem., 67, 1324-1327, 1997).
En consecuencia, se caracterizó además en este ejemplo la formación
de ADDL en ausencia de la clusterina.
Cuando las soluciones A\beta
1-42 monómeras se mantuvieron a bajas temperaturas
en un medio apropiado, se bloqueó casi por completo la formación de
fibrillas A\beta sedimentables. La A\beta, sin embargo, se
autoasoció a estas soluciones a bajas temperaturas, formando los
ADDLs esencialmente indistinguibles desde los acompañados por la
clusterina. Finalmente, también se formaron los ADDLs cuando las
soluciones A\beta monómeras se incubaron a 37 grados en el medio
de cultivo de cortes de cerebro pero a muy baja concentración (50
nM), indicando un potencial para formarlos fisiológicamente. Se
estabilizaron relativamente todas las preparaciones de los ADDLs y
mostraron la no conversión a fibrillas durante las 24 horas de
experimentos de cultivos de tejidos.
Estos resultados confirman que se forman los
ADDLs y que son estables bajo condiciones fisiológicas y sugiere
que de manera parecida se pueden formar y pueden estar estables
in vivo.
Los ADDLs se indujeron con la clusterina, a baja
temperatura, o con una concentración baja de la A\beta, y los
oligómeros estables que se formaron eran potentenciadores de las
neurotoxinas. La toxicidad se examinó en cultivos de cerebro de
ratón organotípico, que proporcionaron un modelo fisiológicamente
relevante para las CNS maduras. El tejido de cerebro se sustentó en
la interfase de un medio ambiente mediante un filtro para mantener
una alta viabilidad en los controles.
Para estos experimentos, los cortes de cerebro
se obtuvieron partir de las variedades B6 129 F2 y JR 2385 (Jackson
Laboratories) y cultivadas tal y como se describió anteriormente
(Stoppini et al., J. Neurosci. Meth., 37,
173-182, 1991), con modificaciones. Concretamente,
un ratón adulto se sacrificó mediante la inhalación de dióxido de
carbono, seguido de una rápida decapitación. La cabeza se emergió en
frío, en una solución tampón de disección estéril (94 ml de
solución salina equilibrada de Gey, a pH de 7,2, complementada con 2
ml de MgCl_{2} 0,5 M, 2 ml de glucosa al 25%, y 2 ml de Heder 1,0
M), después de que se sacara el cerebro y se colocara en una placa
de Petri recubierta de silicona estéril. Se sacó el cerebro y se le
hizo un corte a media altura para separar los hemisferios
cerebrales. Se cortó cada hemisferio por separado. Se colocó el
hemisferio con el corte a media altura hacia abajo y se hizo un
corte de 30 grados desde el lado dorsal para orientar el
hemisferio. Se pegó el hemisferio con el corte hacia abajo en la
platina de plástico de una cortadora de tejidos Campeen (limpiado
anteriormente con etanol) y emergida en una solución tampón estéril
fría. Se hicieron cortes de un grosor de 200 \mum desde un
lateral hasta media dirección, reuniendo aquellos en los que era
visible el hipocampo.
Cada corte se transfirió con una pipeta estéril
con la parte superior cerrada a una pequeña placa de Petri que
contenía el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que
contenía un suero de cría animal fetal al 10% (estreptomicina,
penicilina, y Fungizone; Life Technologies (Gibco, BRL),
Gaithersburg, MD), se observó con un microscopio para verificar la
presencia del hipocampo, y se colocó en un injerto de
Millicell-CM (Millipore) en una placa de cultivo de
tejido de cubeta profunda (Falcon, placa de 6 cubetas). Cada cubeta
contenía 1,0 ml del medio de crecimiento, y normalmente dos cortes
en cada injerto. Se colocaron los cortes en una incubadora (6% de
CO_{2}, 100% de humedad) durante toda una noche. Se sacó el medio
de crecimiento y se lavaron las cubetas con 1,0 ml de Hanks BSS
(Gibco, BRL, Life Technologies) templado. Se añadió a cada cubeta
el medio definido (DMEM, suplementos N2, SPF, por ejemplo, tal y
como se describe en Bottenstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 76, 514-517, 1979) que contiene los
oligómeros de la \beta-amiloide, con o sin los
compuestos inhibidores, y se continuó la incubación durante
24
horas.
horas.
Se midió la muerte de las células utilizando el
equipo de ensayo LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR).
Este ensayo de fluorescencia de marca dual detecta las células vivas
mediante la presencia de un esterasa que parte la
calceína-AM a calceína, resultando una fluorescencia
verde. Las células muertas toman al hemodímero de etidio, que se
intercala con el AND y que tiene una fluorescencia roja. El ensayo
se llevó a cabo según las indicaciones del fabricante con 2 \muM
de hemodímero de etidio y con 4 \muM de calceína. Se obtuvieron
las imágenes dentro de los 30 minutos utilizando un microscopio
Nikon Diaphot equipado con epifluorescencia. Se utilizó el sistema
de análisis de imágenes MetaMorfas (Universal Imaging Corporation,
Philadelphia, PA) para cuantificar el número y/o el área de células
mostradas por la fluorescencia verde o roja.
Para estos experimentos, los ADDLs estuvieron
presentes durante 24 horas a una dosis máxima de 5 \muM del total
de la A\beta (esto es, la A\beta total nunca fue superior a 5
\muM en cualquier experimento de la ADDL). La muerte de las
células, tal y como se muestra mediante el "teñido amarillo
falso", se limitó casi completamente a la stratum
pyramidale (CE 3-4) y a los giros dentados (DG)
que sugieren con fuerza que las neuronas principales del hipocampo
(células piramidales y granuladas, respectivamente) son los
objetivos de la toxicidad del ADDL inducido. Además, la viabilidad
de la glial no se vio afectada mediante un tratamiento de 24 horas
con el ADDL de la glial de cerebro de rata primaria, tal y como se
determinó mediante la exclusión del azul de tripan y el ensayo MTT
(Finch et al., no publicado). Los giros dentados (DG) y las
regiones CA3 eran particularmente sensibles y mostraban la muerte
de las células provocada por el ADDL en cada cultivo obtenido de los
animales que tenían una edad de P20 (destetados) a P84 (jóvenes
adultos). Hasta el 40% de las células en esta región murieron
siguiendo a una exposición crónica con los ADDLs. El modelo de
muerte neuronal no fue idéntico al que se observó para el NMDA,
que daba muerte a las neuronas en los DG y en el CA1 pero
separadamente del CA3.
Se trataron algunos cultivos del hipocampo de
las regiones DG y CA3 de animales de más de 20 días de edad con
preparaciones convencionales de la A\beta fibrilar. Coherentes con
la naturaleza no difusible de las fibrillas, se evidenció la muerte
de las no células (teñido amarillo) incluso a 20 \muM. El modelo
del teñido para las células vivas en este cultivo confirmó que se
estaba examinando la región CA3/giros dentados del hipocampo. La
extensión de la muerte de las células observado después del
tratamiento convencional de la A\beta (esto es, las preparaciones
fibrilares de la A\beta) era imposible de distinguir de los
controles negativos en que los cultivos fueron dando del medio, o
del medio con suplemento de la clusterina. En los típicos controles,
la muerte de las células era inferior al 5%. De hecho, la alta
viabilidad en los controles se podría encontrar incluso en cultivos
de un típico experimento que se mantuvieran más allá de varios días,
lo que confirma que la supervivencia de las células no se
compromete por las condiciones del cultivo estándar.
Se llevó a cabo un experimento de respuesta de
dosis para determinar la fuerza de los ADDLs en la provocación de
la muerte de las células. Se utilizó el análisis de imágenes para
cuantificar las células muertas y las células vivas teñidas en los
campos que contienen las áreas de DG/CA3. La Figura 5 ilustra el
porcentaje de células muertas respecto a la concentración el ADDL
medido como concentración inicial de
\beta-amiloide 1-42 (en nM). A
causa de las dificultades para cuantificar los cortes de cerebro,
los resultados no detallan lo suficiente como para determinar la
EC50 con precisión. Sin embargo, tal y como se puede ver en la
Figura 5, incluso después de diluir hasta 1.000 veces (\sim5 nM
de A\beta), la muerte de las células provocada por el ADDL fue
menor del 20%. Se observó la toxicidad incluso con 0,3 nM de los
ADDLs. Esto contrasta con los resultados obtenidos con la A\beta
madurada de manera convencional, que es tóxica para las neuronas en
cultivos a aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 \muM.
Estos datos muestran que los ADDLs son efectivos a dosis de
aproximadamente 1.000 a 10.000 veces más grandes que las utilizadas
en los experimentos de la A\beta fibrilar.
Estos datos de los cortes de hipocampo confirman
de este modo la naturaleza supertóxica de los ADDLs. Además, como
los ADDLs tenían que pasar a través de un filtro de soporte de
cultivos para provocar la muerte de las células, los resultados
dieron validez a que los ADDLs eran difusibles, consecuente con su
gran tamaño oligomérico. Además, los procedimientos que partían de
aquí se podían emplear como un ensayo para los cambios mediados por
el ADDL en la viabilidad de las células. En particular, se puede
llevar a cabo el ensayo mediante la coincubación o la
coadministración junto con los agentes de los ADDLs que
potencialmente pueden aumentar o disminuir la formación y/o la
actividad del ADDL. Los resultados obtenidos con dicha coincubación
o dicha coadministración se pueden comparar con los resultados
obtenidos con la inclusión en solitario de los ADDLs.
Este ejemplo parte de un ensayo que se puede
emplear para detectar un cambio temprano de la toxicidad en
respuestas a los oligómeros de la
\beta-amiloide.
Para estos experimentos, las células PC12 fueron
conducidas a 4 x 10^{4} células/cubeta en una placa de cultivo de
96 cubetas y se hicieron crecer durante 24 horas en DMEM + 10% de
suero de cría animal fetal + 1% de S/P/F (estreptomicina,
penicilina, y Fungizone). Se trataron las placas con 200 \mug/ml
de poli-1-lisina durante 2 horas
antes del emplacado de las células para aumentar la adhesión de las
células. Se dejó sin tratar un juego de seis cubetas y se alimentó
del nuevo medio, mientras que otro juego de cubetas se trató con el
control de excipiente (PBS que contiene un 10% 0,01 N de HCl,
madurada o no al RT). Se trataron los controles positivos con
Tritón (1%) y con Azida de sodio (0,1%) en el medio normal de
crecimiento. Los oligómeros de \beta-amiloide,
preparados tal y como se describió en el Ejemplo 1, o obtenidos
prácticamente por coincubación con clusterina, con o sin los
compuestos de inhibición presentes, se añadieron a las células
durante 24 horas. Después de las 24 horas de incubación, se añadió
MTT (0,5 mg/ml) a las células durante 2,5 horas (11 \mul de una
reserva de 5 mg/ml solubilizada en PBS en 100 \mul del medio). Las
células sanas reducen el MTT en un producto coloreado de azul de
formazan. Después de la incubación con el MTT, se aspiró el medio y
se añadieron 100 \mul de 100% de DMSO para lisar las células y
disolver los cristales azules. Se incubó la placa durante 15 minutos
a RT y se leyó en el lector de placas (ELISA) a 550
nm.
nm.
En la Figura 6 se representan los resultados de
uno de los experimentos. Tal y como se puede ver en esta figura,
las células de control no expuestas a los ADDLs ("Cont."), las
células expuestas sólo a clusterina ("Apo J") y las células
expuestas a la A\beta monomérica ("A\beta") no muestran
toxicidad en las células. En comparación, las células expuestas a
la \beta-amiloide congregadas con clusterina y
maduradas un día ("A\beta: Apo J") muestran una disminución
en la reducción de MTT, evidenciando un cambio temprano de la
toxicidad. Las preparaciones más últimas de la amiloide confirmaron
que carecían de fibrillas de la amiloide mediante el AFM.
Los resultados de este experimento confirman de
este modo que esas preparaciones del ADDL obtenidas a partir de
congregaciones de la A\beta logradas mediante la clusterina han
aumentado la toxicidad. Por otra parte, los resultados confirman
que la respuesta a la tensión oxidativa de las PC12 se puede emplear
como un ensayo para detectar los cambios tempranos de células
debido a los ADDLs. El ensayo también se puede llevar a cabo
mediante la coincubación o la coadministración junto con los agentes
de los ADDLs que potencialmente pueden aumentar o disminuir la
formación y/o la actividad del ADDL. Los resultados obtenidos con
dicha coincubación o dicha coadministración se pueden comparar con
los resultados obtenidos con la inclusión en solitario de los
ADDLs.
Este ejemplo parte de otro ensayo de los cambios
de las células mediados por el ADDL. Concretamente, el ensayo de
toxicidad a tensión oxidativa de MTT presentado en el ejemplo
precedente se puede llevar a cabo con las células HN2 en vez de con
las células PC12. Se pueden emplear similarmente otras células
apropiadas.
Para este ensayo, se condujeron las células HN2
a 4 x 10^{4} células/cubeta en una placa de cultivo de 96 cubetas
y se hicieron crecer durante 24 horas en DMEM + 10% de suero de cría
animal fetal + 1% de S/P/F (estreptomicina, penicilina, y
Fungizone). Se trataron las placas con 200 \mug/ml de
poli-1-lisina durante 2 horas antes
del emplacado de las células para aumentar la adhesión de las
células. Se diferenciaron las células durante 24 - 48 horas con 5
\muM de ácido retinoico y el crecimiento se inhibió además con un
1% de suero. Se dejó sin tratar un juego de seis cubetas y se le
dio el nuevo medio. Se trató otro juego de cubetas con el control
de excipiente (0,5% de DMSO). Se trataron los controles positivos
con Tritón (1%) y con Azida de sodio (0,1%). Los oligómeros de
\beta-amiloide, preparados tal y como se describió
en el Ejemplo 1, con o sin los compuestos de inhibición presentes,
se añadieron a las células durante 24 horas. Después de las 24 horas
de incubación, se añadió MTT (0,5 mg/ml) a las células durante 2,5
horas (11 \mul de una reserva de 5 mg/ml en 100 \mul del medio).
Después de la incubación con el MTT, se aspiró el medio y se
añadieron 100 \mul de 100% de DMSO para lisar las células y
disolver los cristales azules. Se incubó la placa durante 15 minutos
a RT y se leyó en el lector de placas (ELISA) a 550 nm.
Se puede llevar a cabo este ensayo similarmente
mediante la coincubación o la coadministración junto con los
agentes de los ADDLs que potencialmente pueden aumentar o disminuir
la formación y/o la actividad del ADDL. Los resultados obtenidos
con dicha coincubación o dicha coadministración se pueden comparar
con los resultados obtenidos con la inclusión en solitario de los
ADDLs.
Este ejemplo parte aún de otro ensayo de los
cambios de las células mediados por el ADDL de la morfología de las
células mediante microscopía de fase.
Para este ensayo, se hicieron crecer los
cultivos a baja densidad (50 - 60% de confluencia). Para iniciar el
experimento, se privaron de suero a las células en el medio F12
durante 1 hora. Se incubaron entonces las células durante 3 horas
con oligómeros de \beta-amiloide preparados tal y
como se describió en el Ejemplo 1, con o sin los compuestos
inhibidores añadidos a las células, durante 24 horas. Después de 3
horas, se examinaron las células para las diferencias morfológicas
o fijadas para el marcado inmunofluorescente. Se examinaron las
muestras utilizando el sistema de Análisis de Imágenes MetaMorfas y
una cámara de video MRI (Universal Imaging, Inc.).
En los ejemplos que siguen se presentan los
resultados de dichos ensayos. En particular, se puede llevar a cabo
el ensayo mediante la coincubación o la coadministración junto con
los agentes de los ADDLs que potencialmente pueden aumentar o
disminuir la formación y/o la actividad del ADDL. Se pueden comparar
los resultados obtenidos con dicha coincubación o dicha
coadministración con los resultados obtenidos con la inclusión en
solitario de los ADDLs.
Como los receptores de superficie de las células
se han identificado recientemente en células gliales para las
A\beta preparadas de manera convencional (Yan et al.,
Nature, 382, 685-691, 1996; El Khoury
et al., Nature, 382, 716-719,
1996), y como la muerte neuronal a dosis bajas del ADDL sugieren la
posible participación de mecanismos de señalización, se asumieron
los experimentos para determinar si existen para los ADDLs los
emplazamientos de fijación de las células específicas en
neuronas.
Mediante la citometría de flujo, se disociaron
las células con 0,1% de tripsina y se empacaron al menos toda la
noche sobre un plástico de cultivo de tejidos a baja densidad. Se
eliminaron las células con solución tampón de fosfato salino en
frío (PBS)/0,5 mM de EDTA, se lavaron tres veces y se revitalizaron
en PBS de hielo frío hasta una concentración final de 500.000
células/ml. Se incubaron las células en PBS frío con oligómeros de
la \beta-amiloide preparados tal y como se
describió en el Ejemplo 1, excepto que el 10% de la
\beta-amiloide es una
\beta-amiloide 1-42 conteniendo de
manera análoga biocitina en la posición 1 substituyendo al
aspartato. Se añadieron a las células durante 24 horas los
oligómeros con y sin presencia de los compuestos inhibidores. Se
lavaron las células dos veces en PBS frío para eliminar a los
oligómeros de \beta-amiloide no unidos, libres,
se revitalizaron en una dilución 1:1.000 de avidina conjugada con
fluoresceína, y se incubaron durante una hora a 4ºC con agitación
suave. Alternativamente, se emplearon los anticuerpos específicos de
la \beta-amiloide y los anticuerpos secundarios
fluorescentes en lugar de la avidina, eliminando la necesidad de
incorporar el 10% de la análoga \beta-amiloide
biotinilatada. Concretamente, se añadió el anticuerpo monoclónico
6E10 biotinilatado (1 \mul, Senetec, Inc., St. Louis, Missouri) a
la suspensión de las células y se incubó durante 30 minutos. Se
detectó el anticuerpo delimitado después del pelitizado de las
células y del revitalizado en 500 \mul de PBS, utilizando
estreptavidina conjugada con FITC (1:500, Jackson Laboratories)
durante 30 minutos.
Se analizaron las células mediante un Escáner de
Células Activado por Fluorescencia Becton-Dickenson
(escáner FAC). Se reunieron normalmente 10.000 ó 20.000 eventos
tanto por dispersión delantera (tamaño) como por intensidad de
fluorescencia, y se analizaron los datos mediante el software del
Consort 30 (Becton-Dickinson). Se cuantificó la
fijación multiplicando la fluorescencia promedio por el número total
de eventos, y restando el valor por la fluorescencia de las células
de fondo en presencia del 6E10 y del FITC.
Para estos experimentos, se dio el análisis de
escáner FAC para comparar la inmunoreactividad de ADDL en
suspensiones de las células de levadura de la fase logarítmica (en
buen parte una superficie de carbohidrato) y de la línea de células
neuronales B103 CNS (Schubert et al., Nature,
249, 224-227, 1974). Para las células B103,
añadir los ADDLs causa un mayor incremento en la fluorescencia
asociada de las células, tal y como se muestra en la Figura 7. El
tratamiento de la tripsina de las células B103 durante 1 minuto
eliminó las fijaciones del ADDL. En contraste, las células de
levadura controladas (datos no mostrados) demostraron la no fijación
del ASSL, verificando la selectividad de los ADDLs por las
proteínas presentes en la superficie de la célula. Las suspensiones
de las células del hipocampo (tejidos tripsinizados seguidos de una
recuperación metabólica de dos horas) también delimitaron a los
ADDLs, pero con un número reducido de eventos fijados comparado con
las células B103, como evidencia la reducida intensidad de
fluorescencia del pico marcado. Esto aparece en la Figura 8 como un
movimiento hacia la izquierda del pico marcado.
Estos resultados sugieren de este modo que los
ADDLs ejercen sus efectos mediante la fijación a un receptor de
superficie de la célula específico. En particular, la sensibilidad
de la tripsina de las células B103 mostró que sus emplazamientos de
fijación del ADDL eran proteínas de superficie de células y que las
fijaciones eran selectivas para un conjunto de dominio especial
dentro de estas proteínas.
Por otra parte, se puede también emplear el
presente ensayo como un ensayo para la fijación de las células por
mediación del ADDL. En particular, se puede llevar a cabo el ensayo
mediante la coincubación o la coadministración junto con los
agentes de los ADDLs que potencialmente pueden aumentar o disminuir
la formación y/o la actividad del ADDL. Los resultados obtenidos
con dicha coincubación o dicha coadministración se pueden comparar
con los resultados obtenidos con la inclusión en solitario de los
ADDLs.
Este ejemplo parte de la manera en que se puede
inhibir la formación del ADDL utilizando, por ejemplo, el
gosipol.
Para estos experimentos, se prepararon los ADDLs
tal y como se describió en el Ejemplo 1. Se añadió el gosipol
(Aldrich) a una concentración de 100 \muM durante la incubación de
la proteína A\beta para formar los ADDLs. Se evaluaron las
preparaciones resultantes mediante neurotoxicidad utilizando el
equipo de ensayo LIVE/DEAD® tal y como se describió
anteriormente. La cantidad de muerte de células que ocurre después
de 24 horas de exposición a la preparación gosipol/ADDL era
inferior al 5%. Esto es comparable con el nivel de toxicidad
obtenido para una correspondiente preparación de control del DMSO
(esto es, el 6%), o con una preparación de control del gosipol que
no contuviera ningún ADDL (esto es, el 4%).
Estos resultados confirman de este modo que los
compuestos tales como el gosipol se pueden emplear para inhibir la
formación del ADDL.
Tal y como se encontró en la tripsinización de
las células B103 para bloquear posteriormente la fijación del ADDL,
se dieron los experimentos partiendo de este ejemplo para probar si
los fragmentos trípticos liberados de las superficies de las
células retardan la actividad de fijación del ADDL.
Se prepararon los péptidos trípticos utilizando
las células B103 confluentes desde cuatro placas de 100 mm que se
sacaron mediante tripsinización (0,025%, Life Technologies) durante
aproximadamente 3 minutos. Se añadió el inhibidor de tripsina -
quimotripsina (Sigma, 0,5 mg/ml en Solución Tampón de la Solución
Salina de Hank), y las células se sacaron por vía centrifugación a
500 x g durante 5 minutos. Se concentro el sobrenadante (\sim12
ml) hasta aproximadamente 1,0 ml utilizando un filtro Centricon 3
(Amicon), y se congeló después de que se determinara la
concentración de proteína. Para los experimentos del bloqueo, se
añadieron los péptidos trípticos concentrados estériles (0,25
mg/ml) al corte de cerebro organotópico o a las células B103
suspendidas en el ensayo de FAC a la vez que se añadieron los
ADDLs.
Se muestra en la Figura 9 como en los ensayos
del escáner FAC, los péptidos trípticos liberados en el medio de
cultivo (0,25 mg/ml) inhibieron las fijaciones del ADDL por encima
del 90%. Por comparación, no había pérdida de fijación en las
células de control expuestas al BSA, incluso a 100 mg/ml. Los
péptidos trípticos, si se añadían después de que los ADDLs se
adjuntaran ya a las células, no produjeron considerablemente
inferiores intensidades de fluorescencia. Esto indica que los
péptidos no comprometían la capacidad del ensayo para cuantificar
los ADDLs enlazados. Además de la fijación bloqueada del ADDL, los
péptidos trípticos también antagonistas de la muerte de las células
provocada por el ADDL. En la Figura 9 se muestra como,
concretamente, añadir péptidos trípticos obtuvo como resultado una
reducción del 75% en la muerte de las células, p < 0,002.
Estos datos confirman que las proteínas
especiales de la superficie de las células actúan de mediadoras de
las fijaciones del ADDL, y que los péptidos trípticos solubilizados
de la superficie de las células proporcionan neuroprotección, la
actividad neutralizante del ADDL. Por otra parte, se puede también
emplear el presente ensayo como un ensayo para los agentes que
actúan de mediador de la fijación celular del ADDL o para los
efectos del ADDL en la actividad de las células. En particular, se
puede llevar a cabo el ensayo mediante la coincubación o la
coadministración junto con los agentes de los ADDLs que
potencialmente pueden aumentar o disminuir la formación y/o la
actividad del ADDL. Se pueden comparar los resultados obtenidos con
dicha coincubación o dicha coadministración con los resultados
obtenidos con la inclusión en solitario de los ADDLs. Por otra
parte, se puede comparar el añadido de los agentes antes o después
de la fijación de los ADDLs a la superficie de las células para
identificar los agentes que hacen impacto con dicha fijación, o el
que acto que tenga lugar después de la fijación.
Este ejemplo parte de los experimentos de
respuesta de dosis efectuados para determinar si es saturable la
fijación del ADDL a la superficie de las células. Se esperaría dicha
saturabilidad si los ADDLs interrelacionaran de hecho con un
receptor especial de la superficie de las células.
Para estos estudios, se incubaron las células
B103 con cantidades aumentadas de los ADDLs y se cuantificaron las
fijaciones del ADDL mediante el análisis del escáner FAC. Los
resultados se presentaron en la Figura 10. Estos resultados
confirmaron que se logró un periodo de estancamiento definido para
la fijación del ADDL. La saturabilidad de la fijación del ADDL
tiene lugar a una concentración relativa de la A\beta (esto es,
una concentración de ADDL relativa a la A\beta) de
aproximadamente 250 nm.
Estos resultados confirman de este modo que la
fijación del ADDL es saturable. Dicha saturabilidad de la fijación
del ADDL, especialmente cuando se consideró con los resultados de
los estudios de la tripsina, dieron validez a que los ADDLs actúan
a través de un receptor especial de la superficie de las
células.
Este ejemplo parte de un ensayo con base
celular, en particular un ensayo inmunosorbente relacionado con
enzimas con base celular (ELISA) que se puede emplear para evaluar
la actividad de fijación del ADDL.
Para estos estudios, 48 horas antes de llevar a
cabo los experimentos, se colocaron 2,5 x 10^{4} células B103
presentes como una suspensión en 100 \mul de DMEM en cada cubeta
de ensayo de una placa de microtitulación con 96 cubetas y se
guardó en una incubadora a 37ºC. 24 horas antes de llevar a cabo el
experimento, se prepararon los ADDLs según con el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1. Para empezar el ensayo, se trató cada
cubeta de la placa de microtitulación que contiene las células con
50 \mul de fijador (3,7% de formalina en el DMEM) durante 10
minutos a la temperatura del recinto. Se sacó esta solución
fijador/DMEM y un segundo tratamiento se llevó a cabo con 50 \mul
de formalina (sin DMEM) durante 15 minutos a la temperatura del
recinto. Se sacó el fijador y se lavó dos veces cada cubeta con 100
\mul de solución tampón de fosfato salino (PBS). Se añadieron 200
\mul de una agente de bloqueo (1% de BSA en PBS) a cada cubeta y
se incubaron a la temperatura del recinto durante 1 hora. Se
añadieron a las cubetas apropiadas después de 2 lavados con 100 ml
de PBS, 50 \mul de ADDLs (diluido previamente a 1:10 en PBS), o
el PBS en solitario como un control, y las cubetas resultantes se
incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se llevaron a cabo 3 lavados con
100 \mul de PBS, y se añadieron 50 \mul del 6E10 biotinilado
(Senetek) diluidos a 1:1.000 en 1% de BSA/PBS a las cubetas
apropiados. Se añadió en otras cubetas el PBS como un control.
Después de la incubación durante 1 hora a la temperatura del recinto
en un rotador, se lavaron tres veces las cubetas con 50 \mul de
PBS, y se añadieron 50 \mul del reactivo ABC (equipo Elite ABC,
Vector Labs) y se incubó en un rotador durante 30 minutos a la
temperatura del recinto. Después de lavar 4 veces con 50 \mul de
PBS, se añadieron 50 \mul de solución sustrato ABTS a cada cubeta
y se incubó la placa en la oscuridad a la temperatura del recinto.
Se analizó la placa mediante absorción aumentada a 405 nm. Se
ilustra en la Figura 11 como existía una importante señal sólo
cuando estaban presentes los ADDLs, las células y los 6E10.
Estos resultados confirman además que se puede
emplear el ensayo ELISA con base celular como un ensayo para las
fijaciones de las células por mediación del ADDL. En particular, se
puede llevar a cabo el ensayo mediante la coincubación o la
coadministración junto con los agentes de los ADDLs que
potencialmente pueden aumentar o disminuir la formación y/o la
actividad del ADDL. Se pueden comparar los resultados obtenidos con
dicha coincubación o dicha coadministración con los resultados
obtenidos con la inclusión en solitario de los ADDLs.
Para investigar además la relación potencial de
la transducción de señal en la toxicidad del ADDL, los
experimentos en este ejemplo compararon el impacto de los ADDLs en
los cortes de cerebro desde el isogénico fyn -/- y fyn +/+ de
animales. El fyn pertenece a la familia Src de las quinasas de
tirosina de proteína, que son el centro de las señales celulares
múltiples y de las respuestas (Clarke et al., Science,
268, 233-238). El fyn es de especial interés
porque se regula por incremento en las neuronas aquejadas de AD
(Shirazi et al., Neuroreport, 4,
435-437, 1993). También aparece para ser activado
mediante las preparaciones de la A\beta convencionales (Zhang
et al., Neurosci. Letts., 211,
187-190, 1996) que posteriormente se han mostrado
para contener los ADDLs mediante la AFM. Los ratones con exclusión
genética fyn, por otra parte, han reducido la apoptosis en el
desarrollado hipocampo (Grant et al., Science,
258, 1903-1910, 1992).
Para estos estudios, se trataron los ratones con
exclusión genética fyn (Grant et al., Science,
258, 1903-1910, 1992) tal y como se
describió en los ejemplos precedentes, mediante la comparación de
imágenes de trocos de cerebro de ratones tratados o no tratados con
los ADDLs durante 24 horas para determinar las células muertas en
el área DG y en el área CA3. Se obtuvo la comparación cuantitativa
(presentada en la Figura 12) con las barras de error que
representan los medios SEM +/- para 4 - 7 cortes.
En contraste con los cultivos naturales de
animales, los cultivos de fyn -/- de animales muestran la muerte
insignificante de las células provocada por el ADDL, tal y como se
muestra en la Figura 12. Para los ADDLs, el nivel de muerte de las
células en el fyn +/+ de los cortes era cinco veces mayor que en el
fyn -/- de los cultivos. En el fyn -/- de los cultivos, la muerte
de las células en presencia de los ADDLs era a nivel de fondo. La
respuesta neuroprotectora era selectiva; la muerte de las células
del hipocampo provocada por los agonistas receptores de NMDA (Bruce
et al., Exper. Neurol., 132,
209-219, 1995; Vornov et al.,
Neurochem., 56, 996-1006, 1991) no se
veía afectada (no mostrado). El análisis (ANOVA) utilizando la
comparación múltiple Tukey dio un valor de P < 0,001 para los
datos de fyn +/+ del ADDL comparado con todas las otras
condiciones.
Estos resultados confirman que la pérdida de
quinasa Fyn protegió a las regiones del hipocampo DG y CA3 de la
muerte de las células inducida por los ADDLs. Los resultados dan
validez a que se media la toxicidad del ADDL mediante un mecanismo
de bloqueo por la exclusión genética de la quinasa de tirosina de
proteína Fyn. Estos resultados sugieren además que se pueden
obtener los beneficios neuroprotectores mediante tratamientos que
derogan la actividad de la quinasa de tirosina proteína Fyn o la
expresión del gen que codifica la quinasa proteína
Fyn.
Fyn.
Para investigar además la relación potencial de
tansducción de señal en la toxicidad del ADDL, los experimentos en
este ejemplo compararon el impacto en los ADDLs en la activación de
los astrocitos.
Para estos experimentos, se prepararon los
cultivos de astrocitos corticales a partir de las crías neonatas
(de 1 - 2 días de edad) de rata Sprague-Dawley
mediante el procedimiento de Levison y McCarthy (Levison et
al., In: Banker et al. (Eds.), Culturing Nerve
Cells, MIT press, Cambridge, MA, 309-36, 1991),
tal y como se describió previamente (Hu et al., J. Biol.
Chem., 271, 2543-2547, 1996). En resumen,
se diseccionó el córtex cerebral, tripsinizado, y se cultivaron las
células en \alpha-MEM (Gibco, BRL) que contiene
un 10% de suero bovino fetal (Hyclone Laboratories Inc., Logan UT)
y antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de
estreptomicina). Después de 11 días en cultivo, se tripsinizaron
las células y se replacaron en placas de 100 mm a una densidad de
\sim6 x 10^{5} células/placa y se hicieron crecer hasta la
confluencia (Hu et al., J. Biol. Chem., 271,
2543-2547, 1996).
Se trataron los astrocitos con los ADDLs
preparados según el Ejemplo 1, o con la A\beta
17-42 (sintetizada por Lambert et al., J.
Neurosci. Res., 39, 377-384, 1994;
disponible también comercialmente). Se efectuó el tratamiento
mediante cultivos confluentes tripsinizados de astrocitos y poniendo
una placa sobre las placas de cultivo de tejido de 60 mm a una
densidad de 1 x 10^{6} células/placa (por ejemplo, para el
análisis de ARN y de los ELISAs), en portaobjetos de cámara de 4
cubetas a 5 x 10^{4} células/cubeta (por ejemplo, para
inmunohistoquímica), o sobre placas de 96 cubetas a una densidad de
5 x 104 células/cubeta (por ejemplo, para ensayos NO). Después de
24 horas de incubación, se lavaron dos veces las células con PBS
para sacar el suero, y los cultivos se incubaron en
\alpha-MEM que contenían suplementos de N2 durante
unas 24 horas adicionales antes de añadir los péptidos de la
A\beta o de la solución tampón de control (esto es, la solución
tampón que contiene el diluyente).
El examen de la morfología del astrocito se dio
mediante el examen de las células bajo un microscopio invertido
Nikon TMS equipado con una cámara Javelin SmartCam, un monitor de
video Sony y una impresora de video a color. Normalmente se
fotografiaron cuatro campos microscópicos elegidos arbitrariamente
(aumentos de 20X) para cada condición experimental. Se cuantificó
la activación morfológica desde las fotografías con el NIH Image
mediante el contaje del número de células activadas (definido como
una célula con uno o más procesan al menos un cuerpo de célula a lo
largo) en los cuatro campos.
Se determinaron los niveles de ARNm en los
cultivos con la utilización de los ensayos de
Northern-blot y de slot-blot. Esto
se efectuó por exposición de las células a los ADDLs o a la solución
tampón de control durante 24 horas. Después de este tiempo, se
lavaron dos veces las células con PBS tratado con
dietilpirocarbonato (DEPC), y se aisló el ARN total mediante las
minicolumnas de RNeasy (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), como
recomienda el fabricante. El rendimiento normal de ARN era de 8 a
30 mg de ARN total por placa. Para el análisis de
Northern-blot, se separaron 5 mg de ARN total por
muestra en un gel de agarosa-formaldehído,
transferido por la acción capilar de la membrana
Hybond-N (Amersham, Arlington Heights IL), y
reticulado UV. Para el análisis slot-blot, se
secaron 200 ng de ARN total por muestra en la membrana
Duralon-UV (Stratagene, La Jolla CA) en condiciones
de vacío, y reticulado UV. Se efectuó la confirmación de las cargas
de ARN equivalentes mediante teñido de bromuro de etidio o mediante
hibridación y normalización con una sonda GAPDH.
Se generaron las sondas mediante restricción de
digestos de enzimas de plásmidos, y la subsiguiente purificación
del gel del fragmento apropiado. Concretamente, se prepararon los
fragmentos de ADNc mediante RT-PCR utilizando ARN
total de los astrocitos corticales de ratas. Se transcribió el ARN
de forma inversa con un sistema Superscript II (GIBCO/BRL), y se
llevó a cabo el PCR en un controlador térmico
PTC-100 (MJ Research Inc, Watertown, MA) utilizando
35 ciclos con los siguientes posicionamientos: a 52ºC durante 40
segundos; a 72ºC durante 40 segundos; a 96ºC durante 40 segundos.
Las parejas utilizadas para amplificar a 447 bp el fragmento de
rata IL-1\beta eran: Delante: 5'
GCACCTTCTTTCCCTTCATC 3' [SEC ID Nº 1]. Reverso: 5'
TGCTGATGTACCAGTTGGGG 3' [SEC ID Nº 2]. Las parejas utilizadas para
amplificar a 435 bp el fragmento de rata GFAP eran: Delante: 5'
CAGTCCTTGACCTGC
GACC 3' [SEC ID Nº 3]. Reverso: 5' GCCTCACATCACATCCTTG 3' [SEC ID Nº 4]. Se clonaron los productos PCR en el vector pCR2.1 con el equipo de clonación Invitrogen TA, y se verificaron las construcciones mediante la secuencia de ADN. Se prepararon las sondas mediante la digestión EcoRI del vector, seguido de la purificación del gel de los fragmentos apropiados. Los plásmidos eran plásmidos de ADNc iNOS de rata pAstNOS-4, que se corresponden con las bases de ADNc iNOS de rata 3007-3943 (Galea et al., J. Neurosci. Res., 37, 406-414, 1994), y el plásmido de cDNA GAPDH de rata pTRI-GAPDH (Ambion, Inc., Austin TX).
GACC 3' [SEC ID Nº 3]. Reverso: 5' GCCTCACATCACATCCTTG 3' [SEC ID Nº 4]. Se clonaron los productos PCR en el vector pCR2.1 con el equipo de clonación Invitrogen TA, y se verificaron las construcciones mediante la secuencia de ADN. Se prepararon las sondas mediante la digestión EcoRI del vector, seguido de la purificación del gel de los fragmentos apropiados. Los plásmidos eran plásmidos de ADNc iNOS de rata pAstNOS-4, que se corresponden con las bases de ADNc iNOS de rata 3007-3943 (Galea et al., J. Neurosci. Res., 37, 406-414, 1994), y el plásmido de cDNA GAPDH de rata pTRI-GAPDH (Ambion, Inc., Austin TX).
Se marcaron las sondas (de 25 ng) con
^{32}P-dCTP mediante la utilización de un equipo
de marcado Prime-a-Gene
Random-Prime (Promega, Madison WI) y se separaron de
los nucleótidos no incorporados mediante la utilización de las
columnas de efecto Push (Stratagene). Se dio la hibridación bajo
rigurosas condiciones con la solución QuikHyb (Stratagene),
utilizando el protocolo recomendado para la hibridación rigurosa.
Brevemente, se llevaron a cabo la prehibridación a 68ºC durante
aproximadamente de 30 a 60 minutos, y la hibridación a 68ºC durante
aproximadamente 60 minutos. Se lavaron entonces los blots bajo
rigurosas condiciones y se expusieron a la placa de autoradiografía
o de fosfoimagen. Se escanearon los autoradiogramas con un escáner
láser BioRad GS-670, y se cuantificó la densidad de
banda con el software de análisis de imagen Molecular Analyst v2.1
(BioRad, Hercules CA). Se capturaron las Fosfoimágenes con un
sistema Store 840 (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA), y se
cuantificó la densidad de banda con el software de análisis de
imagen Image Quant v1.1 (Molecular Dynamics).
Para la medición de NO mediante el análisis de
nitrito, se incubaron las células con péptidos A\beta o con la
solución tampón de control durante 48 horas, y se midieron entonces
los niveles de nitrito en el medio condicionado mediante la
reacción de Griess, tal y como se describió anteriormente (Hu et
al., J. Biol. Chem., 271,
2543-2547, 1996). Cuando se utilizan el metiléster
N-nitro-L-arginina
(notación L) inhibidor del NOS o el isómero inactivo de notación D,
se añaden estos agentes a los cultivos a la vez que la A\beta.
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Figura 13. Tal y como se puede ver en esta figura,
la activación glial aumenta cuando se incuban los astrocitos con los
ADDLs, pero no cuando se incuban los astrocitos con la A\beta
17-42.
Estos resultados confirman que los ADDLs activan
las células gliales. Es posible que las proteínas gliales puedan
contribuir a los déficits neurales, por ejemplo, como ocurre en la
Enfermedad de Alzheimer, y que algunos efectos de los ADDLs pueden
actuar en realidad de mediadores indirectamente por activación de
las células gliales. En particular, las proteínas gliales pueden
facilitar la formación de los ADDLs, o los efectos mediadores del
ADDL que tienen lugar en la dirección 3' de la fijación del
receptor. También se sabe que la clusterina se regula por
incremento en el cerebro del sujeto con la enfermedad de Alzheimer,
y se produce la clusterina a niveles elevados sólo en las células
gliales que están activadas. Basado en esto, la activación de las
células gliales mediante un estímulo sin ADDL, no amiloide, podía
producir la clusterina que a su vez podía llevar al ADDL, que a su
vez podría dañar las neuronas y causa además la activación de las
células gliales.
A pesar del mecanismo, estos resultados sugieren
además que se pueden obtener los beneficios neuroprotectores
mediante los tratamientos que modulan (esto es, aumentan o
disminuyen) la activación de las células gliales que actúan de
mediador del ADDL. Además, los resultados sugieren que puede ser
beneficioso el bloqueo de estos efectos en las células gliales,
aparte de bloquear los efectos neurales.
La potenciación a largo plazo (LTP) es un
paradigma clásico para la plasticidad sináptica y un modelo para la
memoria y el aprendizaje, facultades que se pierden selectivamente a
temprana etapa AD. Este ejemplo parte de experimentos efectuados
para examinar los efectos de los ADDLs en el LTP, en particular el
LTP de las células de la línea media vía perforante granular.
Inyecciones de animales intactos: Se
anestesiaron los ratones con uretano y se colocaron en un aparato
esterotáxico. Se mantuvo la temperatura del cuerpo utilizando un
chaleco de agua caliente. La superficie del cerebro estuvo expuesta
a través de agujeros en el cráneo. Las posiciones bregma y lambda
para la inyección de la capa molecular media del hipocampo están 2
mm posteriores al bregma, 1 mm del lateral de la línea media, y 1,2
- 1,5 mm del ventral de la superficie del cerebro. Las inyecciones
del oligómero \beta-amiloide fueron mediante una
ráfaga de nitrógeno a través de pipetas de vidrio de \sim10 nm de
diámetro. Se agregaron volúmenes de 20 - 25 nl de solución del
oligómero \beta-amiloide (180 nM de la
\beta-amiloide en la solución tampón de fosfato
salino) en el transcurso de una hora. Los ratones de control
recibieron un volumen equivalente de PBS en solitario. Se permitió
dejar descansar al animal variando los períodos de tiempo antes de
que se den los estímulos de la LTP (normalmente 60 minutos).
La LTP en animales inyectados: Los
experimentos siguen el paradigma establecido por Routtenberg y
colaboradores para la LTP en ratones (Namgung et al.,
Brain Research, 689, 85-92, 1995). Se
utilizó la estimulación por vía perforante del córtex entorinal,
con el registro de la capa molecular media y el cuerpo de la célula
de los giros dentados. Con una estimulación eléctrica se observó un
potencial de excitación postsináptico de población
(pop-EPSP) y una potencial espiga de población
(pop-spike). Se podría inducir la LTP en estas
respuestas mediante un estímulo de 3 trenes de 400 Hz (8 x 0,4 ms
pulsos/tren (Namgung et al., Brain Research,
689, 85-92, 1995). Para determinar si la LTP
se retiene se tomaron los registros durante 2 - 3 horas después del
estímulo (esto es, aplicado a tiempo 0). Entonces se sacrificó
inmediatamente el animal, o se le permitió recuperar durante 1, 3 ó
7 días y se le sacrificó como anteriormente. Se crioprotegió el
cerebro con un 30% de sacarosa, y se seccionó entonces (30 \muM)
con un microtomo. Se colocaron algunas secciones en portaobjetos
recubiertos con gelatina y con otros donde se analizaron utilizando
un protocolo de flotación libre. Se utilizó la inmunohistoquímica
para monitorizar los cambios en el GAP-43, en los
subtipos PKC, y en la fosforilación de la proteína tau
(PHF-1), la paxilina, y la quinasa de adhesión
focal. Se analizaron las formas de las ondas mediante la máquina
que se describió anteriormente (Colley et al., J.
Neurosci., 10, 3353-3360, 1990). Una
ANOVA de dos vías compara los cambios en la amplitud de pico entre
los grupos tratos y los no tratados.
La Figura 14 ilustra el efecto de la amplitud de
pico de los ADDLs en todos los animales. Tal y como se puede ver
claramente en esta figura, los ADDLs bloquean la fase de
persistencia de la LTP inducida mediante estímulos eléctricos de
alta frecuencia aplicados en el córtex entorinal y medidos como la
amplitud de pico del cuerpo de la célula en la capa molecular media
de los giros dentados.
Después de que se llevara a cabo el experimento
de la LTP, se les permitieron a los animales recuperarse varias
veces y se sacrificaron entonces utilizando el anestésico
pentobarbitol sódico y la perfusión con un 4% de paraformaldehido.
Se utilizaron tiempos de 3 horas, 24 horas, 3 días y 7 días para la
vialidad de los estudios, Se crioprotegió el cerebro con un 30% de
sacarosa y se seccionó entonces (30 \muM) con un microtomo. Se
colocaron las secciones en portaobjetos recubiertos con gelatina y
se tiñeron inicialmente con violeta de cresilo. Se midió la pérdida
de células mediante el contaje de cuerpos de células en los giros
dentados, en la CA3, la CA1, y el córtex entorinal, y se estableció
una correlación entre la dosis y el tiempo de exposición de los
ADDLs. Los resultados de estos experimentos confirmaron que la
muerte no celular tuvo lugar a las 24 horas siguientes a los
experimentos de la LTP.
De modo similar, se examinó la respuesta de la
LTP en los cortes de hipocampo procedentes de jóvenes ratas
adultas. Tal y como se puede ver en la Figura 15, la incubación de
los cortes de hipocampo de ratas con los ADDLs impide bien la LTP
antes de cualquier signo manifiesto de degeneración de las células.
Los cortes de hipocampo (n=6) expuestos a 500 nM de ADDLs durante
45 minutos mostraron previamente la no potenciación en la espiga de
población 30 minutos después de la estimulación tetánica (amplitud
media del 99% +/- 7,6), a pesar de una capacidad continuada para
potenciales de acción. Como contraste, se indujo inmediatamente a
la LTP en cortes incubados con excipiente (n=6), con una amplitud
del 138% +/- 8,1 durante los últimos 10 minutos; este valor es
comparable al que se demostró previamente en este grupo de edades
(Trommer et al., Exper. Neurol., 131,
83-92, 1995). Aunque estaba ausente la LTP en los
cortes tratados con ADDL, sus células eran capaces de generar
potenciales de acción y no mostrar signos de degeneración.
Estos resultados dan validez a que tanto en
todos los animales como en los trozos de tejido, añadir los ADDLs
da como resultado la afectación de la LTP en menos de una hora,
antes de la degeneración o la muerte de cualquier célula. Estos
experimentos mantienen de este modo que los ADDLs ejercen efectos
muy tempranos, y la interferencia con la formación y/o la actividad
del ADDL se puede emplear de este modo para obtener un efecto
terapéutico antes del fomento de una enfermedad, un trastorno o una
afección (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer) hasta una fase
donde se obtiene como resultado la muerte de las células. En otras
palabras, estos resultados confirman que las disminuciones en la
memoria suceden antes de que se mueran las neuronas. Se puede
emplear la interferencia previa a dicha muerte de las células para
invertir la progresión, y las disminuciones potencialmente
restituidas en la memoria.
Este ejemplo parte de los tempranos efectos de
los ADDLs in vivo y la forma de conocer como se pueden
manipular dichos efectos tempranos.
Los síntomas principales de la enfermedad de
Alzheimer suponen los déficits en el aprendizaje y la memoria. Sin
embargo, ha sido difícil de establecer el eslabón entre el déficit
de conducta y los depósitos de la amiloide agrupados. En los
ratones transgénicos, la sobreexpresión de APP mutante bajo el
control del promotor del factor de crecimiento plaquetar da como
resultado la deposición de grandes cantidades de la amiloide (Games
et al., Nature, 373, 523-527,
1995). En contraste, utilizando este sistema se han presentado los
déficits de la no conducta. Otros investigadores (esto es,
Nalbantoglu et al., Nature, 387,
500-505, 1997, y Holcomb et al., Nat.
Med., 4, 97-100, 1998) que trabajaron con
informes de ratones transgénicos observaron unos importantes
déficit de conducta y cognitivos que tienen lugar bien antes de que
se observen algunos depósitos importantes de amiloide agrupada.
Estos defectos de conducta y cognitivos incluyen el incumplimiento
potenciativo a largo plazo (Nalbantoglu et al.,
supra). Estos modelos sugieren conjuntamente que las formas
no depositadas de la amiloide son responsables de los tempranos
déficit cognitivos y de conducta que tienen lugar como resultado de
una disfunción neuronal inducida. Concuerdan con estos modelos que
los ADDLs novedosos aquí descritos son estas formas no depositadas
de la amiloide causantes de los tempranos defectos cognitivos y de
conducta. En vista de esto, se pueden emplear los compuestos de
modulación del ADDL, según la invención, en el tratamiento y/o la
prevención de estos tempranos defectos cognitivos y de conducta que
resultan de la disfunción neuronal inducida por el ADDL, o los
ADDLs que se pueden aplicar, por ejemplo, en modelos de animales,
para estudiar dicha disfunción neuronal inducida.
De modo similar, en humanos mayores, la
disminución cognitiva y los déficits focales de memoria pueden
tener lugar bien antes de que se produzca un diagnóstico de la
probable etapa I de la enfermedad de Alzheimer (Linn et al.,
Arch. Neurol, 52, 485-490, 1995).
Estos déficits de memoria focal pueden ser resultado de la
señalización aberrante inducida en las neuronas, además de la muerte
de las células. Otras funciones, tal como la habilidad elevada de
la escritura ordenada (Snowdon et al., JAMA, 275,
528-532, 1996) también se pueden afectar por la
función neuronal aberrante que tiene lugar mucho antes la muerte de
las células. En lo que respecta a estos defectos, concuerda con que
se conoce, y la información en lo que respecta a los ADDLs aquí
proporcionados, los ADDLs inducen a estos defectos de manera similar
a la función de la LTP comprometida de manera que se induce por los
ADDLs. Con estas líneas, los compuestos de modulación del ADDL según
la invención se pueden emplear en el tratamiento y/o la prevención
de estos tempranos disminuciones cognitivas y déficits de memoria
focal, y la discapacidad de las habilidades elevadas de la escritura
ordenada, resultantes de la formación o la actividad del ADDL, y se
pueden aplicar los propios ADDLs, por ejemplo, en modelos de
animales, para estudiar dichos defectos inducidos. En especial, se
pueden llevar a cabo dichos estudios de la forma que sea conocida
por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante los sujetos de
edad parecida tratados o los sujetos de edad parecida tratados con
placebo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Acumen Pharmaceuticals, Inc. et al.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína \beta-Amiloide (Ensamblaje Globular y Sus Utilizaciones)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: McDonnell Boehnen Hulbert & Berghoff
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 300 South Wacker Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 60606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MSDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (US)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICUTD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de febrero de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DATOS DE CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/796.089
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de febrero de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACCTTCTT TCCCTTCATC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTGATGTA CCAGTTGGGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCTTGA CCTGCGACC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cualquier otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTCACATC ACATCCTTG
\hfill19
Claims (29)
1. Estructura oligomérica de amiloide aislada,
homogénea, soluble, globular, no fibrilar, que comprende de 4 a 12
proteínas \beta-amiloide 1-42, en
la que la estructura muestra neurotoxicidad y no contiene la
proteína \beta-amiloide 1-40.
2. Estructura oligomérica según la
Reivindicación 1, en la que la estructura oligomérica comprende una
forma oligomérica seleccionada del grupo consistente en agregados
de tetrámeros, pentámeros y hexámeros de la proteína
\beta-amiloide 1-42.
3. Estructura oligomérica según la
Reivindicación 1 ó 2, en la que la estructura oligomérica tiene un
peso molecular entre 26 kD y 28 kD tal y como se determina mediante
electroforesis en gel no desnaturalizante.
4. Estructura oligomérica según las
Reivindicaciones 1 a 3 en la que la estructura oligomérica tiene un
peso molecular entre 22 kD y 24 kD o entre 18 kD y 19 kD tal y como
se determina mediante electroforesis en gel al 15% de
SDS-poliacrilamida.
5. Estructura oligomérica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que la estructura oligomérica
comprende glóbulos de dimensiones entre 4,7 nm y 6,2 nm medidas
mediante el microscopio de fuerza atómica.
6. Estructura oligomérica según cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 5, en la que la estructura oligomérica
comprende glóbulos de dimensiones entre 4,9 nm y 5,4 nm medidas
mediante el microscopio de fuerza atómica.
7. Estructura oligomérica según cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 5, en la que la estructura oligomérica
comprende glóbulos de dimensiones entre 5,7 nm y 6,2 nm medidas
mediante el microscopio de fuerza atómica.
8. Estructura oligomérica según cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 5, en la que entre el 40% y el 75% de la
estructura oligomérica comprende glóbulos de dimensiones entre 4,9
nm y 5,4 nm, y dimensiones entre 5,7 nm y 6,2 nm, medidas mediante
el microscopio de fuerza atómica.
9. Procedimiento para identificar los compuestos
de prueba que bloquean la neurotoxicidad según la estructura
oligomérica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8,
comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica en presencia o en ausencia de contacto con el compuesto de prueba;
- (b)
- medir la proporción de células viables en cada cultivo; y
- (c)
- comparar la proporción de células viables en cada cultivo, con los compuestos que bloquean la neurotoxicidad de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a un aumento de la proporción de células viables en dicho cultivo, en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
10. Procedimiento para identificar los
compuestos de prueba que bloquean la fijación a una proteína de la
superficie de la célula de la estructura oligomérica según
cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el
procedimiento:
- (a)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica en presencia o en ausencia de contacto con el compuesto de prueba;
- (b)
- añadir un reactivo que se fija a la estructura oligomérica, siendo el reactivo fluorescente;
- (c)
- analizar dichos cultivos de células separados mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (d)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con los compuestos que bloquean la fijación a la proteína de una superficie de la célula de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una disminución de la fluorescencia del cultivo en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
11. Procedimiento para identificar compuestos
que bloquean la fijación a una proteína de la superficie de la
célula de la estructura oligomérica según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- formar la estructura oligomérica de la proteína \beta-amiloide 1-42, de manera que se convierte en una estructura oligomérica marcada que comprende una fracción de fijación capaz de fijar un reactivo fluorescente;
- (b)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con la estructura oligomérica marcada en presencia o en ausencia de contacto con el compuesto de prueba;
- (c)
- añadir el reactivo fluorescente que se fija a la estructura oligomérica;
- (d)
- analizar los cultivos de las células separados mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (e)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con los compuestos que bloquean la fijación a la proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una disminución de la fluorescencia del cultivo en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
12. Procedimiento para identificar los
compuestos que bloquean la formación o la fijación a la proteína de
la superficie de la célula de la estructura oligomérica según
cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el
procedimiento:
- (a)
- preparar las muestras separadas de la proteína \beta-amiloide 1-42 que han sido o no mezcladas con el compuesto de prueba;
- (b)
- formar la estructura oligomérica en las muestras separadas;
- (c)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas;
- (d)
- añadir un reactivo que se fija a la estructura oligomérica, siendo el reactivo fluorescente;
- (e)
- analizar los cultivos de las células separados mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (f)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con compuestos que bloquean la formación o la fijación a la proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una disminución de la fluorescencia del cultivo en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
13. Procedimiento para identificar los
compuestos que bloquean la formación o la fijación a la proteína de
la superficie de la célula de la estructura oligomérica según
cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el
procedimiento:
- (a)
- preparar muestras separadas de la proteína \beta-amiloide 1-42 que han sido o no mezcladas con el compuesto de prueba;
- (b)
- formar la estructura oligomérica en las muestras separadas, de manera que se convierte en una estructura oligomérica marcada que comprende una fracción de la fijación capaz de fijar un reactivo fluorescente en cada una de las muestras separadas;
- (c)
- poner en contacto los cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas;
- (d)
- añadir un reactivo fluorescente que se fija a la estructura oligomérica;
- (e)
- analizar los cultivos de las células separados mediante la separación de células activadas por fluorescencia; y
- (f)
- comparar la fluorescencia de los cultivos, con los compuestos que bloquean la formación o la fijación a una proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica identificándose que da lugar a una disminución de la fluorescencia del cultivo en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
14. Procedimiento según la Reivindicación 12 ó
13, en el que la fluorescencia de los cultivos se compara además
con la fluorescencia de cultivos que han sido tratados de la misma
manera excepto que en lugar de añadir o no añadir el compuesto de
prueba antes de la formación de la estructura oligomérica, el
compuesto de prueba es o no añadido después de la formación de la
estructura oligomérica,
con los compuestos que bloquean la formación de
la estructura oligomérica identificándose como que da lugar a una
disminución de la fluorescencia del cultivo en comparación con el
correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica
en ausencia del compuesto de prueba, solamente cuando el compuesto
es añadido antes a la estructura oligomérica, y
compuestos que bloquean la fijación a una
proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica
identificándose como que da lugar a una disminución de la
fluorescencia del cultivo en comparación con el correspondiente
cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del
compuesto de prueba, cuando el compuesto es añadido antes o después
a la estructura oligomérica.
15. Procedimiento para detectar la fijación a
una proteína de la superficie de la célula de la estructura
oligomérica según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8,
comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- formar la estructura oligomérica a partir de la proteína \beta-amiloide 1-42;
- (b)
- poner en contacto un cultivo de células neuronales con la estructura oligomérica;
- (c)
- añadir un anticuerpo que se fija a dicha estructura oligomérica, incluyendo el anticuerpo una fracción de conjugación;
- (d)
- eliminar por lavado el anticuerpo no unido;
- (f)
- unir un enzima al anticuerpo unido a la estructura oligomérica por medio de la fracción de conjugación;
- (g)
- añadir un substrato incoloro que se divide mediante el enzima para obtener un cambio de color; y
- (h)
- determinar el cambio de color como una medida de la fijación a la proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica.
16. Procedimiento para identificar los
compuestos que bloquean la fijación a una proteína de la superficie
de la célula de la estructura oligomérica según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el procedimien-
to:
to:
- (a)
- preparar muestras separadas de la proteína \beta-amiloide 1-42 que han sido o no mezcladas con el compuesto de prueba;
- (b)
- formar la estructura oligomérica en las muestras separadas;
- (c)
- poner en contacto cultivos separados de células neuronales con las muestras separadas;
- (d)
- añadir un anticuerpo que se fija a la estructura oligomérica, incluyendo el anticuerpo una fracción de conjugación;
- (e)
- eliminar por lavado el anticuerpo no unido;
- (f)
- unir un enzima al anticuerpo unido a la estructura oligomérica por medio de dicha fracción de conjugación;
- (g)
- añadir un substrato incoloro que se divide mediante el enzima para obtener un cambio de color; y
- (h)
- comparar el cambio de color producido por cada una de las muestras separadas, con los compuestos que bloquean la formación o la fijación a una proteína de la superficie de la célula de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una disminución del cambio de color producido por el cultivo en comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba.
17. Procedimiento según la Reivindicación 16, en
el que el cambio de color producido por los cultivos se compara
además con el cambio de color producido por cultivos que han sido
tratados de la misma manera excepto en que en lugar de añadir o no
el compuesto de prueba antes de la formación de la estructura
oligomérica, el [dicho] compuesto de prueba es o no añadido después
de la formación de la estructura oligomérica,
con compuestos que bloquean la formación de la
estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una
disminución del cambio de color producido por el cultivo en
comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la
estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba,
solamente cuando el compuesto es añadido antes de la estructura
oligomérica, y
con compuestos que bloquean la formación de la
estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una
disminución del cambio de color producido por el cultivo en
comparación con el correspondiente cultivo en contacto con la
estructura oligomérica en ausencia del compuesto de prueba, cuando
el compuesto es añadido antes o después de la estructura
oligomérica.
18. Procedimiento para identificar los
compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el
procedimiento:
- (a)
- preparar muestras separadas de la proteína \beta-amiloide 1-42 que han sido o no mezcladas con el compuesto de prueba;
- (b)
- formar la estructura oligomérica en las muestras separadas;
- (c)
- evaluar si cualquier ensamblaje de proteínas formado en las muestras separadas utilizando un procedimiento seleccionado del grupo consistente en la electroforesis, la inmunoreconocimiento, y el microscopio de fuerza atómica; y
- (d)
- comparar la formación de los ensamblajes de proteínas en las muestras separadas, con compuestos que bloquean la formación de la estructura oligomérica identificándose como que dan lugar a una disminución de la formación de la estructura oligomérica en la muestra en comparación con la muestra en la que la estructura oligomérica se forma en ausencia del compuesto de prueba.
19. Procedimiento para preparar la estructura
oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el
que el procedimiento comprende:
- (a)
- obtener una solución de proteína \beta-amiloide 1-42 monomérica, siendo dicha proteína \beta-amiloide 1-42 capaz de formar la estructura oligomérica;
- (b)
- diluir la solución de proteínas en un medio apropiado hasta una concentración final desde aproximadamente 5 nM hasta aproximadamente 500 \muM;
- (c)
- incubar el medio resultante de la etapa (b) a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas;
- (d)
- centrifugar la solución a aproximadamente 14.000 x g a aproximadamente 4ºC; y
- (e)
- recuperar el sobrenadante resultante de la centrifugación conteniendo la estructura oligomérica de \beta-amiloide 1-42.
20. Procedimiento según la Reivindicación 19, en
el que el procedimiento comprende incubar el medio resultante de la
etapa (b) a aproximadamente 4ºC en presencia de clusterina.
21. Estructura oligomérica de
\beta-amiloide soluble, globular, no fibrilar,
preparada según la Reivindicación 19 ó 20.
22. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 para modificar la
respuesta de potenciación a largo plazo de una célula nerviosa, que
comprende poner en contacto la célula in vitro con la
estructura oligomérica.
23. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para provocar el
cambio morfológico de una célula nerviosa que comprende poner en
contacto de la célula in vitro con la estructura
oligomérica.
24. Utilización según la Reivindicación 23, en
la que el cambio morfológico incluye un efecto seleccionado del
grupo consistente en la muerte de la célula, la alteración de la
actividad de la quinasa Fyn, la alteración de la localización
subcelular de la quinasa Fyn, y la alteración de los niveles de ARNm
para proteínas que incluyen la interleuquina-1,
óxido nítrico sintasa inducible, la Apo E, la Apo J y la
\alpha1-antiquimotripsina.
25. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para provocar la
activación de los astrocitos, que comprende poner en contacto un
astrocito in vitro con la estructura oligomérica.
26. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para identificar
los compuestos de prueba que bloquean la neurotoxicidad de la
estructura oligomérica, que comprende poner en contacto una célula
nerviosa in vitro con la estructura oligomérica y el
compuesto de prueba.
27. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para identificar
los compuestos de prueba que bloquean la fijación a una proteína de
la superficie de la célula de la estructura oligomérica, que
comprende poner en contacto una célula nerviosa in vitro con
la estructura oligomérica y el compuesto de prueba.
28. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para identificar
los compuestos de prueba que bloquean la formación de la estructura
oligomérica, que comprende poner en contacto la proteína
\beta-amiloide 1-42 con el
compuesto de prueba durante la incubación para formar la estructura
oligomérica.
29. Utilización de la estructura oligomérica
según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para provocar la
señalización neuronal aberrante inducida por el ADDL, que comprende
poner en contacto la célula con la estructura oligomérica.
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