CN102596997B - 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途 - Google Patents

特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明人成功地生成了只对可溶性Aβ寡聚体特异性的但不识别作为生理分子的可溶性Aβ单体的单克隆抗体。证明了该抗体可用作阿尔茨海默氏病的诊断用/治疗用单克隆抗体。

Description

特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
发明领域
优先权
本申请要求2009年8月6日提交的美国临时申请No.61/231,797和2010年2月26日提交的美国临时申请No.61/282,118的权益，通过述及将其完整内容收入本文。
技术领域
本发明涉及特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途。
发明背景
全世界阿尔茨海默氏病(AD)患者的数目在2006年超过约2600万，而且预测它在老龄化社会中继续上升(非专利文献(NPL)1)。然而，没有能阻止或逆转阿尔茨海默氏病进展的治愈性治疗剂，尽管能迟滞疾病进展的治疗剂有市售。
多项证据显示了记忆衰退源自由可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)寡聚体触发的突触功能障碍(参见非专利文献2和3)。过度Aβ寡聚体积累和沉积可能是导致阿尔茨海默氏病的一系列病理级联的触发者。因此，靶向Aβ寡聚体的治疗性干预可能有效阻断这些级联(参见非专利文献4和5)。
最近，正在开发靶向Aβ的抗体药物。然而，先前报告的抗Aβ寡聚体抗体并非特异性结合Aβ寡聚体，而是结合所有三种形式，即Aβ单体、寡聚体、和原纤维。如此，即使体内施用它们，结合Aβ寡聚体的抗体量会相对较低，而且可能需要提高剂量以获得效果。此外，由于健康个体的脑中存在Aβ单体，因此抗体结合Aβ单体可引起副作用。
另外，Aβ寡聚体的量可作为阿尔茨海默氏病的指标；然而，使用常规抗Aβ抗体难以单独测量Aβ寡聚体。
下文显示涉及本发明的现有技术信息。
引用表
非专利文献
[NPL 1]Brookmeyer R et al.，Alzheimers Dement.Jul；3(3)：186-91，2007
[NPL 2]Klein WL，Trends Neurosci.24：219-224，2001
[NPL 3]Selkoe DJ，Science 298：789-791，2002
[NPL 4]Haass C et al.，Nat Rev Mol Cell Biol.8：101-12，2007
[NPL 5]Lee EB et al.，J.Biol.Chem.281：4292-4299，2006
发明概述
技术问题
本发明是鉴于上述境况而实现的。本发明的一个目标是提供特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途。更具体地，本发明提供特异性结合Aβ寡聚体的抗体、使用该抗体来检测Aβ寡聚体的方法、使用该抗体来诊断阿尔茨海默氏病的方法、包含该抗体的药物组合物和药剂、用于检测Aβ寡聚体的药剂和试剂盒、及用于诊断阿尔茨海默氏病的药剂和试剂盒。
解决问题的方案
使用分离的Aβ四聚体作为抗原，本发明人成功地生成了只对可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)寡聚体特异性的且不识别作为生理分子的可溶性Aβ单体的多种单克隆抗体。
如此，本发明人公开，所述多种抗体是用于治疗/预防阿尔茨海默氏病的治疗用抗体或用于诊断阿尔茨海默氏病的诊断用抗体的有希望的候选者。
更具体地，本发明提供下述：
[1]一种识别分离的Aβ寡聚体作为抗原的抗体，其中该抗体不结合Aβ单体。
[2][1]的抗体，其是下文(1)至(12)中任一：
(1)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH中鉴定；
(2)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL中鉴定；
(3)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的VH中鉴定；
(4)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的VL中鉴定；
(5)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的VH中鉴定；
(6)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的VL中鉴定；
(7)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列的VH中鉴定；
(8)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列的VL中鉴定；
(9)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的VH中鉴定；
(10)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列的VL中鉴定；
(11)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的VH中鉴定；
(12)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的VL中鉴定。
[3][1]的抗体，其是下文(1)至(38)之任一：
(1)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(2)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(3)一种抗体，其包含(1)的H链和(2)的L链；
(4)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列作为VH的H链；
(5)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列作为VL的L链；
(6)一种抗体，其包含(4)的H链和(5)的L链；
(7)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：24的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：26的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(8)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：30的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：32的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(9)一种抗体，其包含(7)的H链和(8)的L链；
(10)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：102的氨基酸序列作为VH的H链；
(11)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列作为VL的L链；
(12)一种抗体，其包含(10)的H链和(11)的L链；
(13)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：40的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：42的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：46的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：48的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(15)一种抗体，其包含(13)的H链和(14)的L链；
(16)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：106的氨基酸序列作为VH的H链；
(17)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列作为VL的L链；
(18)一种抗体，其包含(16)的H链和(17)的L链；
(19)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：56的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：58的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(20)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：62的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：64的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(21)一种抗体，其包含(19)的H链和(20)的L链；
(22)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：110的氨基酸序列作为VH的H链；
(23)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：112的氨基酸序列作为VL的L链；
(24)一种抗体，其包含(22)的H链和(23)的L链；
(25)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：72的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：74的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(26)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：78的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：80的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(27)一种抗体，其包含(25)的H链和(26)的L链；
(28)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列作为VH的H链；
(29)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列作为VL的L链；
(30)一种抗体，其包含(28)的H链和(29)的L链；
(31)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：88的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：90的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(32)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：94的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：96的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(33)一种抗体，其包含(31)的H链和(32)的L链；
(34)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列作为VH的H链；
(35)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列作为VL的L链；
(36)一种抗体，其包含(34)的H链和(35)的L链；
(37)一种抗体，其在(1)至(36)任一的抗体中包含一处或多处氨基酸替代、删除、添加、和/或插入，其与(1)至(36)任一的抗体具有等同活性；和
(38)一种抗体，其结合(1)至(36)任一的抗体所结合的表位。
[4][1]至[3]任一项的抗体，其中该抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
[5][1]至[4]任一项的抗体的抗原结合片段。
[6]一种药物组合物，其包含[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，及药学可接受载体。
[7][6]的组合物，其是抗认知缺损的作用剂、用于阿尔茨海默氏病的治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于阻抑老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒性剂、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂、或抗突触毒性的作用剂。
[8]一种用于检测Aβ寡聚体的方法，其包括使用[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段来检测样品中含有的Aβ寡聚体的步骤。
[9]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括使用[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段来检测自受试者收集的样品中的Aβ寡聚体。
[10]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段接触；并
(b)测量该样品中Aβ寡聚体的量，
其中当步骤(b)中测量得到的量高于健康个体的量时，确定该受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
[11]一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段、以及结合Aβ单体的抗体接触；并
(b)测量该样品中Aβ寡聚体对Aβ单体的比，
其中当步骤(b)中测量得到的比高于健康个体的比时，确定该受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
[12][8]至[11]任一项的方法，其中所述样品是血液或脑脊液。
[13]一种作用剂，供[8]至[12]任一项的方法中使用。
[14]一种试剂盒，供[8]至[12]任一项的方法中使用。
另外，本发明提供下述：
[15][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于制造抗认知缺损的作用剂、用于阿尔茨海默氏病的治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于阻抑老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒性剂、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂、或抗突触毒性的作用剂的用途。
[16][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供预防和/或治疗认知缺损使用。
[17][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供预防和/或治疗阿尔茨海默氏病使用。
[18][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供阻抑阿尔茨海默氏病进展使用。
[19][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供阻抑老年斑形成使用。
[20][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供阻抑Aβ积累使用。
[21][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供中和(阻抑)神经毒性使用。
[22][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成使用。
[23][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段，供中和(阻抑)突触毒性使用。
[24]一种用于预防和/或治疗认知缺损的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[25]一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[26]一种用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[27]一种用于阻抑老年斑形成的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[28]一种用于阻抑Aβ积累的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[29]一种用于中和神经毒性的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[30]一种用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[31]一种用于中和突触毒性的方法，其包括施用治疗有效量的[1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段的步骤。
[32][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于预防和/或治疗认知缺损的用途。
[33][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的用途。
[34][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的用途。
[35][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于阻抑老年斑形成的用途。
[36][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于阻抑Aβ积累的用途。
[37][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于中和神经毒性的用途。
[38][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的用途。
[39][1]至[4]任一项的抗体或[5]的抗原结合片段用于中和(阻抑)突触毒性的用途。
本发明的有益效果
本发明提供的抗体有助于建立针对负责引发阿尔茨海默氏病的病理状况的分子具有选择性的预防/治疗方法，及建立阿尔茨海默氏病的早期诊断标志。
附图简述
[图1]图1呈现IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、和IR-148抗体中每一种的点印迹分析结果的照片。
[图2]图2呈现六种抗体的竞争性ELISA结果。垂直轴显示波长450nm处的吸光度，而水平轴显示用作抑制剂的Aβ寡聚体或单体的浓度(mg/ml)。每一张图的虚线显示当Aβ寡聚体用作抑制剂时的抗原结合活性。每一张图的实线显示当Aβ单体用作抑制剂时的抗原结合活性。
[图3]图3呈现六种抗体的竞争性ELISA结果，其中抑制剂浓度以摩尔浓度显示。垂直轴显示波长450nm处的吸光度，而水平轴显示用作抑制剂的Aβ寡聚体或单体的摩尔浓度(mol/L)。Aβ寡聚体的摩尔浓度(mol/L)通过将Aβ寡聚体的摩尔数换算成Aβ单体的摩尔数来计算。
[图4]图4显示六种抗体对Aβ寡聚体的亲和力分析的结果，由Biacore3000测得。
[图5]图5显示使用每一种抗体针对Aβ诱导的细胞毒性的中和测定法的结果。
[图6]图6显示使用每一种抗体针对Aβ原纤维形成的抑制测定法的结果。
[图7]图7显示评估每一种抗体是否结合人APP的免疫印迹测定法的结果。在使用对照抗体6E10的Tg2576的结果中检测到人APP，以箭号标示。
发明详述
下文会更具体地描述本发明。
如上所述，本发明人成功地获得了特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的抗体。就是说，本发明提供结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的抗体。另外，本发明提供结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的抗体。所述抗体优选是分离的或纯化的。
用于本发明物质(抗体等等)的术语“分离的”和“纯化的”指示所述物质基本上不包括至少一种天然来源中可能含有的其它物质。因此，“分离的抗体”和“纯化的抗体”指基本上不包括来自该抗体(蛋白质)所来源的细胞或组织源的细胞材料(如烃、脂、或其它污染性蛋白质)的抗体。当抗体是化学合成的时，该等术语指抗体基本上不包括化学前体物质或其它化学物质。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是分离的或纯化的。
“抗体”指具有相同结构特征的糖蛋白。抗体显示针对特定抗原的结合特异性。在本文中，“抗原”指有能力结合相应抗体且在体内诱导抗原-抗体反应的蛋白质。
在本文中，抗体重链可表示为“H链”，抗体轻链可表示为“L链”，重链可变区可表示为“VH”，轻链可变区可表示为“VL”，重链恒定区可表示为“CH”，轻链恒定区可表示为“CL”，框架区可表示为“FR”，而互补决定区可表示为“CDR”。
作为淀粉状蛋白的主要成分，Aβ蛋白是由40至42个氨基酸组成的肽，而且已知其通过蛋白酶的作用自称作淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的前体蛋白生成。除在超速离心沉降级分中收集的淀粉状蛋白原纤维之外，自APP生成的淀粉状蛋白分子还包括寡聚非纤维状装配体以及可溶性单体。本发明的“Aβ寡聚体”指非纤维状装配体。本发明的“Aβ寡聚体”的Aβ聚合程度不受特别限制，但是通常为2至150。本发明的“Aβ寡聚体”包括例如Aβ40(Aβ1-40)寡聚体、Aβ42(Aβ1-42)寡聚体、和Aβ40/Aβ42寡聚体(其中Aβ40和Aβ42聚合)。例如，本发明的“Aβ寡聚体”通常是在SDS-PAGE中显示分子量45至160kDa，及在Blue Native PAGE中显示分子量22.5至1,035kDa的分子。当使用分子筛时，该分子主要在＞100kDa的保留溶液中被收集。当在原子力显微镜下观察时，该分子显示具有高度为1.5至3.1nm的颗粒状、珠形、和环形分子的混合形态。
对本发明中使用的抗体的来源和形式没有限制，只要它们结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体或它们结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白即可。
本发明的抗体以其结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体或结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白为特征。优选地，这些抗体具有下述特征。
在点印迹分析中，它们与Aβ40寡聚体和Aβ42寡聚体起反应但不与Aβ40单体起反应。
在使用固定化Aβ寡聚体的竞争性ELISA测定中，Aβ单体对于抗体与固定化Aβ寡聚体的结合的50％抑制浓度(IC50)高于Aβ寡聚体的50％抑制浓度(IC50)。
在使用固定化Aβ寡聚体的竞争性ELISA测定法中，Aβ单体的IC50是500nmol/L或更多，优选1000nmol/L或更多，更优选1500nmol/L或更多，或更优选2000nmol/L或更多。
在使用固定化Aβ寡聚体的竞争性ELISA测定法中，Aβ寡聚体的IC50是100nmol/L或更少，优选50nmol/L或更少，更优选25nmol/L或更少，或更优选20nmol/L或更少。
在使用固定化Aβ寡聚体的竞争性ELISA测定法中，就抗体与固定化Aβ寡聚体的结合的抗原选择性而言，如Aβ单体与Aβ寡聚体的IC50之比即Aβ单体的IC50/Aβ寡聚体的IC50所示，为50或更多，优选100或更多，更优选150或更多，或更优选200或更多。
在使用Biacore(Biacore 3000)进行的Aβ寡聚体的亲和力分析中，结合速率常数(ka)是1.0E+04M-1S-1或更多，优选2.0E+04M-1S-1或更多，更优选5.0E+04M-1S-1或更多，或更优选1.0E+05M-1S-1或更多。
在使用Biacore(Biacore 3000)进行的Aβ寡聚体的亲和力分析中，解离速率常数(kd)是0.5S-1或更少，优选0.2S-1或更少，更优选0.1S-1或更少，更优选0.05S-1或更少，更优选0.01S-1或更少，或更优选6.0E-03-1或更少。
在使用Biacore(Biacore 3000)进行的Aβ寡聚体的亲和力分析中，解离常数(KD)是5.0E-06M或更少，优选1.0E-06M或更少，更优选7.0E-07M或更少，更优选1.0E-07M或更少，或更优选5.0E-08M或更少。
在免疫印迹分析中，它们不与人淀粉状蛋白前体蛋白反应。
本发明的抗体可以具有至少一项上述特征。另外，抗体特征可以具有两项或更多项上述特征。
本发明的“抗体”包括单克隆和多克隆抗体二者。本发明的抗体还包括任何类型的抗体，诸如非人动物抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、稍后描述的微型抗体(minibody)、氨基酸序列修饰抗体、缀合至其它分子(例如聚合物，诸如聚乙二醇)的修饰抗体、和糖链修饰抗体。
在本文中，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体。就是说，构成群体的各个抗体是相同的，除了可能存在的痕量的天然突变体之外。单克隆抗体是高度特异性的，并且识别单一抗原位点。每一种单克隆抗体识别抗原的单一决定簇，与通常含有针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同。
除上文所述特异性之外，单克隆抗体还具有这样的优点：它们能自杂交瘤培养物合成，而不受其它免疫球蛋白污染。因此，“单克隆”表示抗体的能自基本上同质的抗体群体获得的特征。此术语不表示抗体生成要求任何特定的方法。
基本上，单克隆抗体可通过使用已知技术来生成。例如，它们可通过首先由Kohler和Milstein(Nature 256：495-7，1975)记载的杂交瘤法或通过重组DNA法(Cabilly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-7，1984)来生成，但是该等方法不限于此。例如，当使用杂交瘤法时，使用Aβ寡聚体作为致敏性抗原，且依照常规免疫接种方法进行免疫接种。通过常规细胞融合方法将获得的免疫细胞与已知亲本细胞融合，并可使用常规筛选方法来筛选和分离单克隆抗体生成细胞。
本发明的单克隆抗体可例如如下生成。首先，在蒸馏去离子水或10mM磷酸盐缓冲溶液中溶解合成Aβ1-42(Peptide Institute，Inc.，Osaka)，并将此于37摄氏度温育18小时。然后，将肽通过4-12％SDS-PAGE分开并通过CBB染色来显现，并单独切出未受Aβ1-42单体污染的Aβ1-42四聚体部分。接着，给BALB/c小鼠在它们的足垫免疫接种2.5微克使用完全弗氏佐剂乳化的Aβ1-42四聚体。随后，进行强化免疫接种六次。通过使用聚乙二醇1500与Sp2/O-Ag14细胞融合，自腹股沟淋巴结生成杂交瘤。
在本发明中，免疫接种致敏性抗原的动物不受特别限制，但是优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性来选择。一般地，使用啮齿类动物、兔类动物、灵长类动物。啮齿类动物包括例如小鼠、大鼠、和仓鼠。兔类动物包括例如家兔。灵长类动物包括例如狭鼻猴(Catarrhini)(旧大陆)猴诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(Macaca mulatta)、狒狒、和黑猩猩。
依照已知方法给动物免疫接种致敏性抗原。例如，作为一种标准方法，通过腹膜内或皮下将致敏性抗原注射入哺乳动物来实施免疫接种。
与上述免疫细胞融合的亲本细胞的一个例子是Sp2/O-Ag14细胞，其会在下文实施例中描述。然而，可使用各种其它已知细胞系。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合可基本上依照已知方法来进行，包括由Kohler和Milstein(Kohler G.和Milstein C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)记载的方法。
以此方式获得的杂交瘤通过在常规选择培养基诸如含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷的HAT培养基中培养它们来选择。在上文所述HAT培养基中的培养一般持续几天至几周，足以杀死期望杂交瘤以外的细胞(未融合细胞)的时间。接着，实施常规有限稀释法来筛选和单克隆化生成期望抗体的杂交瘤。
此后，将获得的杂交瘤移植入小鼠的腹腔，并提取含有期望单克隆抗体的腹水。例如，可通过常规蛋白质分离和/或纯化方法自腹水纯化抗体，诸如柱层析的选定组合，包括但不限于亲和层析、过滤、超滤、盐沉淀、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、和等电聚焦(Antibodies：A Laboratory manual，Harlow和David，Lane(edit.)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
蛋白A柱和蛋白C柱可用于亲和柱。使用的蛋白A柱的例子包括Hyper D、POROS、和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
层析(排除亲和层析)包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、和吸附层析(″Strategies for Protein Purification and Characterization：ALaboratory Course Manual″，Daniel R Marshak et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1996)。当进行层析时，可使用液相层析法，诸如HPLC和FPLC。
以此方式制备的单克隆抗体生成杂交瘤可在常规培养基中传代培养，而且它们可在液氮中长时间保存。
可使用免疫原免疫接种任何哺乳动物以生成抗体。然而，当通过生成杂交瘤来制备单克隆抗体时，优选考虑与为生成杂交瘤而进行的细胞融合中使用的亲本细胞的相容性。
一般地，免疫接种使用啮齿类动物、兔类动物、或灵长类动物。啮齿类动物包括例如小鼠、大鼠、和仓鼠。兔类动物包括例如家兔。灵长类动物包括例如狭鼻猴(旧大陆)猴诸如食蟹猴、恒河猴、狒狒、和黑猩猩。
具有人抗体基因全集的转基因动物的使用是本领域已知的(Ishida I，etal.，Cloning and Stem Cells 4：91-102，2002)。与其它动物一样，为了获得人单克隆抗体，免疫接种转基因动物，然后自动物收集抗体生成细胞并与骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤，并可自这些杂交瘤制备抗蛋白人抗体(参见国际公开文本No.WO92/03918，WO94/02602，WO94/25585，WO96/33735，和WO96/34096)。
或者，可使用用癌基因永生化的淋巴细胞来生成单克隆抗体。例如，在体外给经EB病毒等等感染的人淋巴细胞免疫接种免疫原。接着，使经免疫接种的淋巴细胞与能够无限分裂的人衍生骨髓瘤细胞(U266等)融合，并如此获得生成期望人抗体的杂交瘤(日本专利申请特开昭63-17688(未审查、已公布的日本专利申请))。
一旦能通过任何上述方法获得单克隆抗体，还可使用遗传工程方法来制备抗体(参见例如，Borrebaeck CAK和Larrick JW，Therapeutic MonoclonalAntibodies，MacMillan Publishers，UK，1990)。例如，可如下制备重组抗体：自抗体生成细胞(诸如生成抗体的经免疫接种的淋巴细胞或杂交瘤)克隆编码期望抗体的DNA，然后将克隆的DNA插入适宜载体，并将载体转染入合适宿主细胞。本发明也包括这样的重组抗体。
本发明的单克隆抗体的例子包括下述：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。
对于本发明的IR-003抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：97；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：99；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：6和SEQID NO：5；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：8和SEQID NO：7；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：10和SEQID NO：9；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：12和SEQID NO：11；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：14和SEQID NO：13；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：16和SEQID NO：15。
对于本发明的IR-091抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：101；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：103；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：22和SEQID NO：21；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：24和SEQID NO：23；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：26和SEQID NO：25；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：28和SEQID NO：27；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：30和SEQID NO：29；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：32和SEQID NO：31。
对于本发明的IR-099抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：105；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：107；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：38和SEQID NO：37；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：40和SEQID NO：39；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：42和SEQID NO：41；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：44和SEQID NO：43；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：46和SEQID NO：45；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：48和SEQID NO：47。
对于本发明的IR-103抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：109；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：111；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：54和SEQID NO：53；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：56和SEQID NO：55；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：58和SEQID NO：57；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：60和SEQID NO：59；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：62和SEQID NO：61；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：64和SEQID NO：63。
对于本发明的IR-130抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：113；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：115；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：70和SEQID NO：69；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：72和SEQID NO：71；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：74和SEQID NO：73；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：76和SEQID NO：75；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：78和SEQID NO：77；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：80和SEQID NO：79。
对于本发明的IR-148抗体：
H链可变区(VH)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：117；
L链可变区(VL)的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：119；
H链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：86和SEQID NO：85；
H链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：88和SEQID NO：87；
H链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：90和SEQID NO：89；
L链CDR1的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：92和SEQID NO：91；
L链CDR2的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：94和SEQID NO：93；且
L链CDR3的氨基酸序列和核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：96和SEQID NO：95。
在一个实施方案中，本发明的抗体包括微型抗体。微型抗体含有缺少完整抗体一部分的抗体片段，而且不受特别限制，只要它有能力结合抗原。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv。微型抗体的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、和sc(Fv)2(单链(Fv)2)。
这些微型抗体可例如通过用酶处理抗体以生成抗体片段来获得。已知用于生成抗体片段的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、和纤溶酶。或者，可生成编码抗体片段的基因构建物，插入表达载体，并在合适宿主细胞中表达(参见例如Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.和Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Lamoyi，E.，Methodsin Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.et al.，Methods inEnzymology(1989)121，663-669，Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
在本文中，“抗原结合片段”表示具有抗原结合能力的上文所述抗体片段，或包括具有抗原结合能力的抗体片段的微型抗体。本发明也包括结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的抗体片段，或结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白的抗体片段。下文中，对“抗体”的提及包括对上述“抗原结合片段”的提及。
本发明的多克隆抗体可通过下述方法来获得。为了获得多克隆抗体，在使用常规方法给哺乳动物免疫接种作为致敏性抗原的Aβ寡聚体(例如Aβ四聚体)之后自经抗原致敏的哺乳动物取出血液，并确认期望抗体的血清水平升高。通过已知方法将血清与血液分开。当使用多克隆抗体时，可利用含有多克隆抗体的血清。或者，在必要时，可以自血清分离含有多克隆抗体的级分，然后使用。例如，可通过使用偶联有Aβ寡聚体的亲和柱分离特异性识别Aβ寡聚体的级分，然后使用蛋白A或蛋白G柱纯化此级分，来制备免疫球蛋白G或M。
本发明提供被本发明的抗体结合的Aβ寡聚体。优选地，所述抗体包括下述：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。Aβ寡聚体可用作用于制备抗体的抗原、或疫苗。
换言之，在本发明中，Aβ寡聚体是被下述抗体结合的抗原：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。
另外，本发明的抗体包括结合下述抗体所结合的抗原的抗体：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。
另外，本发明提供下文(1)至(12)任一的抗体：
(1)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH中鉴定；
(2)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL中鉴定；
(3)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的VH中鉴定；
(4)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的VL中鉴定；
(5)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的VH中鉴定；
(6)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的VL中鉴定；
(7)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列的VH中鉴定；
(8)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列的VL中鉴定；
(9)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的VH中鉴定；
(10)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列的VL中鉴定；
(11)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的VH中鉴定；
(12)一种抗体，其包含具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的VL中鉴定。
如上所述，“CDR1、CDR2、和CDR3”指通过本领域公知方法(例如参见Kabat，Elvin A.，Sequences of proteins of immunological interest 5th ed.，National Institutes of Health，1991；Chothia et al，J Mol Biol 196：901-917，1987)确定的CDR。CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列可以使用本领域公知方法在包括CDR1、CDR2和CDR3的区域的氨基酸序列中鉴定，这是本领域公知常识。在下面的实施方案中，对于每一种抗体，显示依照Kabat的定义确定的CDR氨基酸序列的一个例子。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是下文(1)至(38)之任一。
IR-003抗体：
(1)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(2)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(3)一种抗体，其包含(1)的H链和(2)的L链；
(4)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列作为VH的H链；
(5)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列作为VL的L链；
(6)一种抗体，其包含(4)的H链和(5)的L链；
IR-091抗体：
(7)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：24的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：26的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(8)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：30的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：32的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(9)一种抗体，其包含(7)的H链和(8)的L链；
(10)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：102的氨基酸序列作为VH的H链；
(11)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列作为VL的L链；
(12)一种抗体，其包含(10)的H链和(11)的L链；
IR-099抗体：
(13)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：40的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：42的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：46的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：48的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(15)一种抗体，其包含(13)的H链和(14)的L链；
(16)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：106的氨基酸序列作为VH的H链；
(17)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列作为VL的L链；
(18)一种抗体，其包含(16)的H链和(17)的L链；
IR-103抗体：
(19)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：56的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：58的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(20)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：62的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：64的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(21)一种抗体，其包含(19)的H链和(20)的L链；
(22)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：110的氨基酸序列作为VH的H链；
(23)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：112的氨基酸序列作为VL的L链；
(24)一种抗体，其包含(22)的H链和(23)的L链；
IR-130抗体：
(25)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：72的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：74的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(26)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：78的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：80的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(27)一种抗体，其包含(25)的H链和(26)的L链；
(28)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列作为VH的H链；
(29)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列作为VL的L链；
(30)一种抗体，其包含(28)的H链和(29)的L链；
IR-148抗体：
(31)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：88的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：90的氨基酸序列作为CDR3的H链；
(32)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：94的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：96的氨基酸序列作为CDR3的L链；
(33)一种抗体，其包含(31)的H链和(32)的L链；
(34)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列作为VH的H链；
(35)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列作为VL的L链；
(36)一种抗体，其包含(34)的H链和(35)的L链；
(37)一种抗体，其在(1)至(36)之任一的抗体中包含一处或多处氨基酸替代、删除、添加、和/或插入，并具有与(1)至(36)中任一的抗体等同的活性；和
(38)一种抗体，其结合(1)至(36)之任一的抗体所结合的表位。
IR-003抗体：
上文所述(1)″具有SEQ ID NO：6(IR-003抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：8(IR-003抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10(IR-003抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：98(IR-003抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(2)″具有SEQ ID NO：12(IR-003抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：14(IR-003抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16(IR-003抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：100(IR-003抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
IR-091抗体：
上文所述(7)″具有SEQ ID NO：22(IR-091抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：24(IR-091抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：26(IR-091抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：102(IR-091抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(8)″具有SEQ ID NO：28(IR-091抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：30(IR-091抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：32(IR-091抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：104(IR-091抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
IR-099抗体：
上文所述(13)″具有SEQ ID NO：38(IR-099抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：40(IR-099抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：42(IR-099抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：106(IR-099抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(14)″具有SEQ ID NO：44(IR-099抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：46(IR-099抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：48(IR-099抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：108(IR-099抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
IR-103抗体：
上文所述(19)″具有SEQ ID NO：54(IR-103抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：56(IR-103抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：58(IR-103抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：110(IR-103抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(20)″具有SEQ ID NO：60(IR-103抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：62(IR-103抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：64(IR-103抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：112(IR-103抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
IR-130抗体：
上文所述(25)″具有SEQ ID NO：70(IR-130抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：72(IR-130抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：74(IR-130抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：114(IR-130抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(26)″具有SEQ ID NO：76(IR-130抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：78(IR-130抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：80(IR-130抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：116(IR-130抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
IR-148抗体：
上文所述(31)″具有SEQ ID NO：86(IR-148抗体H链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：88(IR-148抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：90(IR-148抗体H链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的H链″中的VH的一个例子是包含SEQ ID NO：118(IR-148抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。
上文所述(32)″具有SEQ ID NO：92(IR-148抗体L链CDR1的序列)的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：94(IR-148抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：96(IR-148抗体L链CDR3的序列)的氨基酸序列作为CDR3的L链″中的VL的一个例子是包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VL，更优选包含SEQ ID NO：120(IR-148抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。
上文所述H链、L链、VH、和VL可用于制备本发明的抗体。本发明还涉及上文所述H链、L链、VH、和VL。
上文所述(1)至(38)的抗体不仅包括单价抗体，而且还包括具有两个或更多个效价的多价抗体。本发明的多价抗体包括抗原结合位点都相同的多价抗体和抗原结合位点部分或完全不同的多价抗体。
在一个优选的实施方案中，上文所述(37)的抗体是没有经修饰CDR的抗体。例如，上文所述(37)的抗体，“抗体，其在(1)的抗体中包含一处或多处氨基酸替代、删除、添加和/或插入，其与(1)的抗体具有等同活性”，优选是“一种抗体，其与(1)的抗体具有等同活性，且在(1)的抗体中包含一处或多处氨基酸替代、删除、添加、和/或插入，且包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3的H链”。上文所述(37)的抗体的另一种优选抗体可以以相似方式表述。
然而，上文所述(37)的抗体不排除一个或多个CDR经过修饰的抗体。本领域技术人员能修饰CDR氨基酸序列而不损失等同活性。可以例如使用分子建模技术预测不损失等同活性的氨基酸突变。
因此，对于上文所述(37)的抗体，与具有IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体的H链CDR和/或L链CDR的抗体具有等同活性的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：a的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：b的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3的H链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：a的氨基酸序列或在SEQ ID NO：a的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：b的氨基酸序列或在SEQ ID NO：b的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：c的氨基酸序列或在SEQ ID NO：c的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3；
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：e的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：d的氨基酸序列或在SEQ ID NO：d的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：e的氨基酸序列或在SEQ ID NO：e的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：f的氨基酸序列或在SEQ ID NO：f的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3；或
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：a的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：b的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3的H链和具有SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：e的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：a的氨基酸序列或在SEQ ID NO：a的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：b的氨基酸序列或在SEQ ID NO：b的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：c的氨基酸序列或在SEQ ID NO：c的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3，
和如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：d的氨基酸序列或在SEQ ID NO：d的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：e的氨基酸序列或在SEQ ID NO：e的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：f的氨基酸序列或在SEQ ID NO：f的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3。
对于每一种上述抗体，(37)的抗体可通过提述H链CDR1的氨基酸SEQ IDNO作为上文的″a″、H链CDR2的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″b″、H链CDR3的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″c″、L链CDR1的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″d″、L链CDR2的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″e″、L链CDR3的氨基酸SEQID NO作为上文的″f″来表述。例如，对于与具有IR-003抗体的H链CDR和/或L链CDR的抗体具有等同活性的抗体，(37)的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3的H链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：6的氨基酸序列或在SEQ ID NO：6的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：8的氨基酸序列或在SEQ ID NO：8的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：10的氨基酸序列或在SEQ ID NO：10的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3；
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：12的氨基酸序列或在SEQ ID NO：12的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：14的氨基酸序列或在SEQ ID NO：14的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：16的氨基酸序列或在SEQ ID NO：16的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3；或
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3的H链和具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：6的氨基酸序列或在SEQ ID NO：6的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：8的氨基酸序列或在SEQ ID NO：8的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：10的氨基酸序列或在SEQ ID NO：10的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3，
和
如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：12的氨基酸序列或在SEQ ID NO：12的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：14的氨基酸序列或在SEQ ID NO：14的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：16的氨基酸序列或在SEQ ID NO：16的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR3。
另外，如上所述，关于下文所述实施方案中的抗体，对于每一种抗体，(37)的抗体可通过提述IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体的VH、VL、CDR的氨基酸SEQ ID NO作为″a″至″h″来表述。
在上述的CDR经过修饰的抗体中，“几处/几个”表示优选5个氨基酸或更少、更优选4个氨基酸或更少、更优选3个氨基酸或更少、更优选2个氨基酸。两种氨基酸序列之间替代、删除、添加、和/或插入的氨基酸的数目可通过使用序列分析程序比对氨基酸序列来鉴定。用于比对的程序包括例如FASTA(Lipman DJ，Pearson WR(1985)Science 227(4693)：1435-1441；Pearson，WR.，Lipman，DJ(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448)、BLAST(Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Altschulet al(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。
本领域技术人员知道，在抗体对抗原的结合特异性或亲和力中，CDR3发挥特别重要的作用。因此，在(37)的抗体中，优选CDR3序列是保守的。因此，在一个优选的实施方案中，(37)的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：a的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：b的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3的H链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：a的氨基酸序列或在SEQ ID NO：a的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：b的氨基酸序列或在SEQ ID NO：b的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3；
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：e的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：d的氨基酸序列或在SEQ ID NO：d的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：e的氨基酸序列或在SEQ ID NO：e的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3；或
一种抗体，其与包含具有SEQ ID NO：a的氨基酸序列作为CDR1、SEQ IDNO：b的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3的H链和具有SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：e的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3的L链的抗体具有等同活性，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
如下的H链，其具有：
SEQ ID NO：a的氨基酸序列或在SEQ ID NO：a的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：b的氨基酸序列或在SEQ ID NO：b的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR3，
和
如下的L链，其具有：
SEQ ID NO：d的氨基酸序列或在SEQ ID NO：d的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR1；
SEQ ID NO：e的氨基酸序列或在SEQ ID NO：e的氨基酸序列中具有一处或几处氨基酸替代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列作为CDR2；
SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR3。
关于(37)的抗体，与具有IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体的VH和/或VL的抗体具有等同活性的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含如下H链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：g的氨基酸序列的VH，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VH的H链，所述VH包含在SEQ ID NO：g的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
一种抗体，其与包含如下L链的抗体具有等同活性，所述L链具有包含SEQ ID NO：h的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VL的L链，所述VH包含在SEQ ID NO：h的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
或
一种抗体，其与包含如下H链和如下L链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：g的氨基酸序列的VH，所述L链具有包含SEQ ID NO：h的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
具有如下VH的H链，所述VH包含SEQ ID NO：g的氨基酸序列或在SEQID NO：g的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列，和
具有如下VL的L链，所述VL包含SEQ ID NO：h的氨基酸序列或在SEQID NO：h的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列。
对于每一种上述抗体，(37)的抗体可通过提述VH的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″g″和VL的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″h″来表述。例如，对于与具有IR-003抗体的VH和/或VL链的抗体具有等同活性的抗体，(37)的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含如下H链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VH的H链，所述VH包含在SEQ ID NO：98的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
一种抗体，其与包含如下L链的抗体具有等同活性，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VL的L链，所述VH包含在SEQ ID NO：100的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
或
一种抗体，其与包含如下H链和如下L链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
具有如下VH的H链，所述VH包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列或在SEQID NO：98的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列，和
具有如下VL的L链，所述VH包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列或在SEQID NO：100的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列。
在上述VH和/或VL经过修饰的抗体中，“几处/几个”表示优选50个氨基酸或更少、30个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、或10个氨基酸或更少、更优选9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、或2个氨基酸。只要等同活性得到保留，修饰氨基酸的位置没有特别限制；然而，优选修饰FR中的氨基酸。
因此，在一个优选的实施方案中，在(37)的抗体中，与具有IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体的VH和/或VL的抗体具有等同活性的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含如下H链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VH的H链，所述VH包含在SEQ ID NO：a的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：b的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR3；
一种抗体，其与包含如下L链的抗体具有等同活性，所述L链具有包含SEQ ID NO：e的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VL的L链，所述VL包含在SEQ ID NO：e的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：g的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：h的氨基酸序列作为CDR3；
或
一种抗体，其与包含如下H链和如下L链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH，所述L链具有包含SEQ ID NO：e的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
具有如下VH的H链，所述VH包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列或在SEQID NO：a的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：b的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：c的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：d的氨基酸序列作为CDR3，
和
具有如下VL的L链，所述VL包含SEQ ID NO：e的氨基酸序列或在SEQID NO：e的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：f的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：g的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：h的氨基酸序列作为CDR3。
对于每一种上述抗体，(37)的抗体可通过提述VH的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″a″、H链CDR1的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″b″、H链CDR2的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″c″、H链CDR3的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″d″、VL的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″e″、L链CDR1的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″f″、L链CDR2的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″g″、L链CDR3的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″h″来表述。例如，对于与具有IR-003抗体的VH和/或VL的抗体具有等同活性的抗体，(37)的抗体可表述如下：
一种抗体，其与包含如下H链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VH的H链，所述VH包含在SEQ ID NO：98的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3；
一种抗体，其与包含如下L链的抗体具有等同活性，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含具有如下VL的L链，所述VL包含在SEQ ID NO：100的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3；
或
一种抗体，其与包含如下H链和如下L链的抗体具有等同活性，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL，其中所述“具有等同活性的抗体”包含
具有如下VH的H链，所述VH包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列或在SEQID NO：98的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：6的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CDR3，
和
具有如下VL的L链，所述VL包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列或在SEQID NO：100的氨基酸序列中替代、删除、添加、和/或插入一个或几个氨基酸的氨基酸序列及SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO：14的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为CDR3。
在具有IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体的H链CDR和/或L链CDR或者VH和/或VL的经修饰抗体中，氨基酸修饰优选是保守氨基酸替代，如下文详细描述的。因此，在一个更优选的实施方案中，在上文所述(37)的抗体中，可实施“保守氨基酸替代”，代替“替代、删除、添加、和/或插入”。
本领域技术人员公知的用于制备具有与某些多肽的活性等同的活性的多肽的方法包括用于将突变导入多肽的方法。例如，本领域技术人员能通过使用定点诱变(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W，and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等等将适宜突变导入抗体来制备具有与本发明抗体的活性的等同的活性的抗体。氨基酸突变也可天然发生。本发明的抗体还包括如下抗体，其包含在本发明抗体的氨基酸序列中具有一处或多处氨基酸突变的氨基酸序列，且具有与本发明抗体的活性等同的活性。
氨基酸残基优选突变成保持氨基酸侧链特性的其它氨基酸。例如，氨基酸根据侧链特性如下分类：疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，和V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，和T)，带有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I，和P)，带有含羟基侧链的氨基酸(S，T，和Y)，带有含硫原子侧链的氨基酸(C和M)，带有含羧酸和含酰胺侧链的氨基酸(D，N，E，和Q)，带有碱性侧链的氨基酸(R，K，和H)，及带有含芳香环侧链的氨基酸(H，F，Y，和W)(氨基酸以括号中的单字母代码表示)。“保守氨基酸替代”指氨基酸用具有保守氨基酸侧链特征的另一氨基酸替代。在(37)的抗体中，抗体中的氨基酸序列突变优选是“保守氨基酸替代”。
一般地，已知具有如下氨基酸序列的多肽保留它的初始生物学活性(功能)，其中在某种氨基酸序列中一个或多个氨基酸经过修饰(删除、添加、和/或替代成其它氨基酸)。
在上文所述修饰之外，本发明的抗体可缀合至其它物质，只要活性得到维持。该等物质的例子包括肽、脂、糖和糖链、乙酰基、及天然和合成聚合物。可实施这些修饰以赋予抗体以别的功能或使抗体稳定。
其中已经对本发明抗体的氨基酸序列添加了几个氨基酸残基的抗体包括含有抗体的融合蛋白。在融合蛋白中，抗体与另一肽或蛋白质融合。用于生成融合蛋白的方法可如下进行，即以符合读码框的方式连接编码本发明抗体的多核苷酸与编码另一肽或多肽的多核苷酸，并将此插入表达载体，并在宿主中表达融合构建物。本领域技术人员已知的技术可用于此目的。与本发明的抗体融合的肽或多肽包括例如已知肽，诸如FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、由六个组氨酸(His)残基组成的6xHis、10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、和蛋白C片段；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；免疫球蛋白恒定区；β-半乳糖苷酶；及麦芽糖结合蛋白(MBP)等。可将编码这些肽或多肽的商品化多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合，并可通过表达如此制备的融合多核苷酸来生成融合多肽。
本发明的抗体可以在氨基酸序列、分子量、糖链的存在或缺失、结构等等方面有不同，取决于生成抗体的细胞或宿主或纯化方法。然而，只要获得的抗体具有与本发明抗体等同的活性，它就包括在本发明中。
在本文中，“等同活性”表示感兴趣抗体具有与本发明抗体相同的生物学或生物化学活性。本发明的“活性”包括例如特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的活性、特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白的活性、抗神经毒性活性、Aβ淀粉状蛋白原纤维形成阻抑活性、抗突触毒性活性、抗记忆缺损活性、抗Aβ沉积活性、抗硫黄素S-阳性斑形成活性、和抗Aβ寡聚体积累活性。
在一个优选的实施方案中，本发明的“活性”是特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的活性。如实施例中显示的，“特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体的活性”优选通过点印迹或竞争性ELISA来评估。点印迹或竞争性ELISA的具体方法包括实施例中描述的方法。另外，针对Aβ寡聚体和单体的结合活性可通过其它免疫检测方法来评估，例如吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫荧光法、等。例如，在ELISA中，将抗体固定化到板上，对板添加抗体的抗原，并添加抗体生成细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后，添加识别一抗且带有酶标签诸如碱性磷酸酶的二抗，并将板温育。在清洗之后，对板添加酶底物诸如磷酸对硝基苯酯，并测量吸光度以评估感兴趣样品的抗原结合能力。Aβ寡聚体和单体的结合能力优选通过相同方法来测量；然而，它们可通过不同方法来测量。例如，对Aβ寡聚体的结合可使用Biacore(GE Healthcare Sciences)来分析。
当本发明的“活性”是特异性结合Aβ寡聚体但不结合Aβ单体和淀粉状蛋白前体蛋白的活性时，该活性可通过上文所述方法或实施例中描述的方法来评估。
当本发明的“活性”是抗神经毒性活性时，此活性可通过例如在有或无抗体存在下将神经原与Aβ一起培养，并测量被抗体抑制的Aβ诱导的细胞毒性水平来评估。Aβ诱导的细胞毒性可通过例如活的/死的双色荧光测定法，测量来源于死细胞的、释放入培养基的LDH量来测量。对于测量LDH量，可使用例如CytoTox96(Promega)等等。用于测量抗神经毒性活性的具体方法包括实施例中描述的方法。
当本发明的“活性”是Aβ淀粉状蛋白原纤维形成阻抑活性时，此活性可例如通过在有或无抗体下温育Aβ溶液，并检测被抗体阻抑的Aβ淀粉状蛋白原纤维形成水平来评估。Aβ淀粉状蛋白原纤维的量例如通过对培养物添加ThT(硫黄素T)溶液，并以ThT荧光检测结合至淀粉状蛋白原纤维的ThT的量来评估。用于测量Aβ淀粉状蛋白原纤维形成阻抑活性的具体方法包括实施例中描述的方法。
当本发明的“活性”是抗突触毒性活性时，此活性可例如通过检测抗体施用对突变型人APP基因表达小鼠(例如Tg2576小鼠，Taconics，USA)实现的突触毒性阻抑来评估。突触毒性的评估可通过小鼠记忆缺损测试、使用抗突触素抗体对肿胀的营养不良神经突数目的分析、使用抗突触素或抗脑发育调节蛋白抗体对小鼠脑切片的免疫荧光分析来实施。当本发明的“活性”是抗记忆缺损活性时，此活性可通过使用突变型APP基因表达小鼠的记忆缺损测试来评估。如果本发明的“活性”是抗Aβ沉积活性、抗硫黄素S阳性斑形成活性、或抗Aβ寡聚体积累活性，这些活性可通过使用突变型APP基因表达小鼠进行的抗体施用测试来评估。
用于测量抗记忆缺损活性、抗突触毒性活性、抗Aβ沉积活性、抗硫黄素S阳性斑形成活性、和抗Aβ寡聚体积累活性的具体方法包括下述方法。
给作为对照的雌性非转基因(非Tg)小鼠和具有且过表达自家族性AD衍生的具有双重突变(K670N和M671L)的瑞典型突变人APP基因的Tg2576小鼠胃静脉内施用本发明的抗体(剂量在0.4至5.0mg/kg/w的范围内)或PBS。关于施用开始时的小鼠年龄，对于监测治疗效果而言是6个月或更晚，此时表现出记忆和学习缺损；或者，对于监测预防效果而言为4个月。抗体施用期是2个月(用于监测治疗效果)和9个月(用于监测预防效果)。为了测量抗记忆缺损活性，在抗体施用期之后分析下述三项行为范式(Mouri A，FASEB J，21：2135-2148，2007)：(1)针对短期记忆的Y-迷宫测试；(2)新物体识别测试；(3)场景恐惧条件性测试(contextual fear conditioning test)。为了评估其它活性，在行为分析之后处死小鼠，并使用低温切片机(RM 2145；Leica，Wetzlar，Germany)将脑半球切成10至30微米厚的矢状切片。为了观察硫黄素S阳性斑形成，如Wyss-Coray et al.，2001所述实施硫黄素S染色。使用抗突触素抗体(Chemicon，Temecula，CA)来观察肿胀营养不良神经突的形成。对于每一只小鼠，以40倍放大倍数在来自一个脑半球的4张或5张切片中计算硫黄素S阳性斑和突触素阳性肿胀营养不良神经突的数目。为了观察Aβ沉积，使用Aβ免疫染色试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)或抗Aβ多克隆抗体(Biosource)对用甲酸或蛋白酶K简单预处理的连续切片染色，并使用ABC elite试剂盒(VectorLaboratories)显现免疫阳性信号。使用连接显微镜的数字照相机记录大脑皮层和海马的图像，并使用简单PCI软件(Compix Imaging System，LakeOswego，OR)分析。以双盲方式确定硫黄素S阳性斑和突触素阳性肿胀营养不良神经突的数目。使用抗突触素或抗脑发育调节蛋白抗体通过免疫染色来观察突触变性。为了评估抗Aβ寡聚体沉积活性，使用Kawarabayashi et al.，J.Neuroscience 2001)的方法自同一小鼠的另一脑半球制备脑匀浆物，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析来测量Aβ寡聚体的量。对于检测抗体，可使用商品化抗Aβ寡聚体单克隆抗体(例如6E10，Covance Immuno-Technologies，Dedham，MA)或多克隆抗体(例如A11，Biosource，Carmarillo，CA)。
“等同活性”中的术语“等同”表示作为生物学或生物化学活性获得的数值在所比较的两种抗体间相差在20％之内。活性值的差异优选在15％之内、在10％之内、在5％之内、或在2.5％之内。结合上文(1)至(36)之任一的抗体结合的表位的抗体可通过本领域技术人员已知的方法来获得。例如，该等抗体可如下获得：(i)使用常规方法确定(1)至(36)之任一的抗体结合的表位，并使用包含表位中包括的氨基酸序列的多肽作为免疫原来生成抗体；或(ii)确定通过常规方法生成的抗体的表位，并选择其表位与(1)至(36)之任一的抗体的表位相同的抗体。
上文所述(1)至(38)的抗体还包括任何类型的抗体，诸如上文所述微型抗体、具有经修饰氨基酸序列的抗体诸如人源化抗体和嵌合抗体、非人动物抗体、人抗体、缀合至其它分子(例如聚合物，诸如聚乙二醇)的经修饰抗体、和糖链修饰抗体。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包括：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。这些抗体可通过实施例中描述的方法来获得。或者，所述抗体可基于它们的序列信息来制备。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包括经修饰抗体，诸如嵌合抗体或人源化抗体。在一个更优选的实施方案中，嵌合抗体包括如下抗体，其包含自IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体衍生的可变区和自人免疫球蛋白衍生的恒定区。在一个更优选的实施方案中，人源化抗体包括如下抗体，其包含自IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、或IR-148抗体衍生的CDR和自人免疫球蛋白衍生的FR，及自人免疫球蛋白衍生的恒定区。
上述嵌合抗体可表述如下：
一种抗体，其包含如下H链，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH和人抗体的CH；
一种抗体，其包含如下L链，所述L链具有包含SEQ ID NO：b的氨基酸序列的VL和人抗体的CL；或
一种抗体，其包含如下H链和如下L链，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH和人抗体的CH，所述L链具有包含SEQ ID NO：b的氨基酸序列的VL和人抗体的CL。
来自每一种上述抗体的嵌合抗体的优选实施方案可通过提述VH的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″a″和VL的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″b″来表述。例如，对于IR-003抗体，嵌合抗体可表述如下：
一种抗体，其包含如下H链，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH和人抗体的CH；
一种抗体，其包含如下L链；所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL和人抗体的CL；或
一种抗体，其包含如下H链和如下L链，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH和人抗体的CH，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL和人抗体的CL。
上述人源化抗体可表述如下：
一种抗体，其包含如下H链，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH的CDR、人抗体的VH的FR、和人抗体的CH；
一种抗体，其包含如下L链，所述L链具有包含SEQ ID NO：b的氨基酸序列的VL的CDR、人抗体的VL的FR、和人抗体的CL；或
一种抗体，其包含如下H链和如下L链，所述H链具有包含SEQ ID NO：a的氨基酸序列的VH的CDR、人抗体的VH的FR、和人抗体的CH，所述L链具有包含SEQ ID NO：b的氨基酸序列的VL的CDR、人抗体的VL的FR、和人抗体的CL。
来自每一种上述抗体的人源化抗体的优选实施方案可通过提述VH的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″a″和VL的氨基酸SEQ ID NO作为上文的″b″来表述。例如，对于IR-003抗体，人源化抗体可表述如下：
一种抗体，其包含如下H链，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH的CDR、人抗体的VH的FR、和人抗体的CH；
一种抗体，其包含如下L链，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL的CDR、人抗体的VL的FR、和人抗体的CL；或
一种抗体，其包含如下H链和如下L链，所述H链具有包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的VH的CDR、人抗体的VH的FR、和人抗体的CH，所述L链具有包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的VL的CDR、人抗体的VL的FR、和人抗体的CL。
上文的经修饰抗体可使用已知方法来生成。
由于嵌合抗体或人源化抗体在人体中的抗原性降低，因此此类抗体可用于为治疗目的等等对人施用。
嵌合抗体通过组合自不同动物衍生的序列来生成。嵌合抗体的例子包括包含小鼠抗体重链和轻链可变区和人抗体重链和轻链恒定区的抗体。嵌合抗体的生成可使用已知方法来进行(参见例如Jones et al.，Nature 321：522-5，1986；Riechmann et al.，Nature 332：323-7，1988；及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2：593-6，1992)。例如，首先，通过聚合酶链式反应(PCR)等等自抗体生成细胞的RNA制备编码感兴趣抗体的可变区或CDR的基因(参见例如Larricket al.，″Methods：a Companion to Methods in Enzymology″，Vol.2：106，1991；Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies″inMonoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application；Ritteret al.(eds.)，page 166，Cambridge University Press，1995，及Ward et al.，″GeneticManipulation and Expression of Antibodies″in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications；及Birch et al。(eds.)，page 137，Wiley-Liss，Inc.，1995)。为了从IR-003至AL-333抗体中任一者制备嵌合抗体，可基于本文中公开的每一种抗体的序列信息来合成编码可变区或CDR的基因。将制备的编码可变区或CDR的基因与编码恒定区(例如人抗体恒定区)或框架区(例如人抗体框架区)的基因连接。编码恒定区或框架区的基因可以以与用于编码可变区或CDR的基因的方式相似的方式来确定，或者，它们可基于已知抗体的序列信息来制备。编码嵌合产物和CDR嫁接产物的DNA序列可使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。例如，可实施由Jones et al.(Nature 321：522-5，1986)记载的寡核苷酸合成。另外，在一些情况中，可适当使用定点诱变和聚合酶链式反应技术。可使用由Verhoeyen et al.(Science 239：1102-6，1988)和Riechmann et al.(Nature 332：323-7，1988)记载的用于已知可变区的寡核苷酸特异性诱变的技术来修饰可变区序列，以便例如增强嵌合抗体的结合能力。另外，在必要时，可使用T4 DNA聚合酶实施带缺口寡核苷酸的酶促填平，例如如由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-33，1989；及WO90/07861)记载的。
例如，CDR嫁接技术是本领域已知的(″Immunoglobulin genes″，AcademicPress(London)，pp 260-74，1989；及Michael A et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：969-73，1994)。使用该等技术，将某些抗体的CDR用另一抗体的CDR替换。经由此类替换，将前一种抗体的结合特异性变成后一种抗体的结合特异性。在此类嵌合抗体中，其框架氨基酸衍生自人抗体者被称作“人源化抗体(CDR嫁接抗体)”。当使用抗体来治疗人时，优选利用人抗体或人源化抗体。
一般地，嵌合抗体包含非人哺乳动物源抗体的可变区和源自人抗体的恒定区。另一方面，人源化抗体包含非人哺乳动物源抗体的互补决定区(CDR)和源自人抗体的框架区和恒定区。
在生成嵌合抗体或人源化抗体之后，可变区(例如FR)或恒定区中的氨基酸可用其它氨基酸替代。
嵌合抗体的可变区或人源化抗体的CDR的来源没有特别限制。
将源自人抗体的C区用于嵌合抗体和人源化抗体的C区。例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、和Cε可用于H链C区，而Cκ和Cλ可用于L链C区。它们的序列是已知的。另外，可修饰人抗体C区以改善抗体的稳定性或其生成。
本发明提供编码上述本发明抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
本发明的多核苷酸没有特别限制，只要它们编码本发明的抗体，而且可以是DNA或RNA。另外，它们可以包括非天然碱基。本发明的多核苷酸可用于通过遗传工程技术来生成本发明的抗体。
本发明的多核苷酸可如下获得：自生成本发明抗体的抗体生成细胞分离mRNA，通过逆转录反应来获得cDNA，并通过PCR等等来扩增获得的cDNA，如实施例中描述的。
在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包括编码如下抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述抗体包含下述每一种抗体的H链CDR和/或L链CDR：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，或IR-148抗体。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包括编码如下抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述抗体包含每一种下述抗体的VH和/或VL：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，或IR-148抗体。
在上述实施方案中，多核苷酸可通过基于本文所述每一种上述抗体的氨基酸序列信息合成多核苷酸来获得。
另外，本发明提供包含本发明的多核苷酸的载体。本发明的载体优选是用于在宿主细胞中表达本发明抗体的表达载体。本发明的载体可用于生成本发明的抗体。
除了本发明的多肽之外，本发明的载体优选包含使得在宿主细胞中能够进行表达的启动子序列。另外，它们可包含用于分泌本发明抗体的信号序列。另外，它们可包含用于选择其中已经导入本发明载体的宿主细胞的标志基因。载体中包含的构件不限于此，可以是本领域技术人员恰当选择的合适构件。
例如，用于在大肠杆菌中表达的表达载体包括如下载体，其具有用于在大肠杆菌中复制的“起点”，而且具有启动子，如lacZ启动子(Ward et al.，Nature(1989)341，112-114；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better et al.，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子，和标志基因诸如针对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等的药物抗性基因。载体包括M13载体、pUC载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，作为信号序列，可使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)等等。
大肠杆菌表达载体以外的本发明载体包括例如哺乳动物衍生表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p1002)、pEF、pCDM8)、昆虫细胞衍生表达载体(例如Bac-to-BAC杆状病毒表达系统(Gibco BRL)、pBacPAK8)、植物衍生表达载体(例如pMH1、pMH2)、动物病毒衍生表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆转录病毒衍生表达载体(例如pZIPneo)、酵母衍生表达载体(例如毕赤氏酵母(Pichia)表达试剂盒(Invitrogen))、pNV11、SP-Q01)、和芽孢杆菌衍生表达载体(例如pPL608、pKTH50)。
用于在动物细胞诸如CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞中表达的表达载体包括如下载体，其具有启动子，诸如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature(1979)277，108)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，NucleicAcids Res.(1990)18，1002)、CMV启动子、等等；和标志基因，诸如针对新霉素、G418等的药物抗性基因。这些载体包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。作为信号序列，可使用实施例中描述的信号序列中的任一种。
另外，本发明提供生成本发明抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。宿主细胞包括具有本发明多核苷酸或本发明载体的细胞。本发明的宿主细胞可用于生成本发明的抗体或抗原结合片段。
本发明的宿主细胞不限于生成本发明抗体的杂交瘤，而且可以是其中已经导入本发明载体的原核生物或真核生物。当使用真核生物作为宿主细胞时，可利用例如动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。动物细胞包括哺乳动物细胞(CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero细胞等)、两栖动物细胞(非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞(Valle，et al.，Nature(1981)291，358-340)等)、昆虫细胞(Sf9、Sf21、Tn5等)。作为植物细胞，例如，已知自烟草(Nicotiana tabacum)衍生的细胞是蛋白质表达系统，而且它们可以培养成愈伤组织(callus)并使用。真菌细胞包括例如酵母(例如酵母属(Saccharomyces)(啤酒酵母/酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)等)、丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus)(黑曲霉(Aspergillus niger)等)。原核细胞包括例如大肠杆菌和芽孢杆菌属(Bacillus)。可通过磷酸钙法、DEAE右旋糖苷法、使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Manheim)的方法、电穿孔法、脂转染法等将载体导入宿主细胞。
另外，本发明提供自上述宿主细胞生成的抗体。
另外，本发明提供包含上文所述本发明抗体和药学可接受载体的组合物。
如下所述，本发明强烈提示下述抗体均是用于预防阿尔茨海默样表型的治疗性抗体的有希望的候选者：IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148抗体。已显示记忆衰退与由可溶性Aβ寡聚体引起的突触功能障碍有关(Klein WL，2001，Trends Neurosci；及Selkoe DJ，2002，Science)。过度Aβ寡聚体积累和沉积可触发引起阿尔茨海默氏病的复杂下游级联。因此，使用包含本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物的治疗性干预能有效阻断病理级联，因此，这可能为治疗阿尔茨海默氏病提供可能(WO2009/051220，WO2009/099176，US 12/533,294，及US 12/533,348)。
本发明的“治疗”或“预防”不一定对展现病症或疾病症状的器官或组织具有完全的治疗或预防效果，但是可具有部分的效果或阻抑症状进展的效果。
在本发明中，“治疗阿尔茨海默氏病”表示改善至少一种可能由阿尔茨海默氏病引起的症状或阻抑其症状进展，其实例包括改善或阻抑认知缺损、改善或阻抑老年斑形成、改善或阻抑突触功能障碍、及减少或阻抑脑组织、血液等等中的Aβ积累。在本文中，“认知缺损”包括例如记忆缺损包括长期/短期记忆缺损、物体识别记忆缺损、空间记忆缺损、及联想和情绪记忆缺损。在本文中，“预防阿尔茨海默氏病”表示阻抑至少一种可能由阿尔茨海默氏病引起的症状，包括阻抑认知缺损发生、阻抑老年斑形成、阻抑突触功能障碍发生、阻抑脑组织、血液等等中的Aβ积累。
本发明提供含有包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物作为活性组分的药物组合物或药剂。上述药物组合物或药剂表述成“包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段作为活性组分和药学可接受载体的药物组合物或药剂”。
在本发明中，短语“含有包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物作为活性组分”和“包含上文所述抗体或抗原结合片段作为活性组分”表示含有包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物，或上文所述本发明抗体或抗原结合片段作为主要组分或显示生理活性或药理功能的成分，但是不限制它的含量比率。
上文所述药物组合物的例子包括抗认知缺损的作用剂、阿尔茨海默氏病治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于阻抑老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒性剂(用于中和神经毒性的药剂)、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂、和抗突触毒性剂(用于中和突触毒性的作用剂)。
上文所述本发明药物组合物可表示成例如“用于阻抑阿尔茨海默氏病的方法”，其包括对受试者(个体)施用包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物的步骤。或者，它可表述成例如“用于阻抑阿尔茨海默氏病的方法”，其包括对受试者施用治疗有效量的上文所述本发明抗体或抗原结合片段的步骤。在其它实施方案中，例子包括用于阻抑认知缺损的方法、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法、用于阻抑老年斑形成的方法、用于阻抑Aβ积累的方法、用于中和(阻抑)神经毒性活性的方法、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的方法、和用于中和(阻抑)突触毒性的方法。在别的实施方案中，例子包括用于预防和/或治疗认知缺损的方法和用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法。
本发明还提供包含上文所述本发明抗体或抗原结合片段和药学可接受载体的组合物用于制造上文所述的药物组合物的用途。本发明进一步提供上文所述的本发明抗体或抗原结合片段用于制造上文所述药物组合物的用途。
另外，本发明涉及下述抗体或抗原结合片段。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于预防和/或治疗认知缺损。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于阻抑阿尔茨海默氏病进展。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于阻抑老年斑形成。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于阻抑Aβ积累。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于中和(阻抑)神经毒性活性。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段，用于中和(阻抑)突触毒性。
本发明还涉及下述：
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于预防和/或治疗认知缺损的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于阻抑老年斑形成的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于阻抑Aβ积累的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于中和(阻抑)神经毒性的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的用途。
-上文所述本发明抗体或抗原结合片段用于中和(阻抑)突触毒性的用途。
上文所述本发明药物组合物或药剂可施用于人或其它动物。在本发明中，可对其施用药物组合物或药剂的非人动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、鸡、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、和黑猩猩。这些动物优选展现至少一种选自例如认知缺损、老年斑形成、突触功能障碍、脑组织或血液等中的Aβ积累的症状。
本发明的药物组合物中含有的抗体或抗原结合片段不受特别限制，只要它们包括在上文所述本发明抗体或抗原结合片段中即可，实例包括本文中所描述的抗体或抗原结合片段。
当使用上文提及的本发明抗体或抗原结合片段来制备药物组合物时，它们可通过本领域技术人员知道的方法来配制。例如，视需要，它们可以使用水或其它药学可接受液体制备成可注射无菌溶液或悬浮液的形式，而且可以胃肠外施用。例如，药物组合物中要包括的抗体或抗原结合片段可以与药学可接受载体或媒介组合，具体有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮液、表面活性剂、稳定剂、芳香剂、赋形剂、溶剂、防腐剂、粘合剂、等等，并混合成公认药学实践所要求的单位剂量形式。短语“药学可接受的”表示该物质是无活性的，而且包括用作药物的稀释剂或媒介的常规物质。合适的赋形剂及其配方记载于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th ed.(1980)Mack Publishing Co.，ed.Oslo et al。
生理盐水和其它含有葡萄糖或佐剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)的等张溶液可用作注射用水溶液。它们可以与适宜的增溶剂(诸如醇，更具体地是乙醇和多元醇(丙二醇、聚乙二醇、等等))和非离子型表面活性剂(聚山梨酯80TM、HCO-50、等等)一起使用。
芝麻油或大豆油可用作油质液体，而且苯甲酸苯甲酯或苯甲醇可以作为增溶剂组合使用。缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂和乙酸钠缓冲剂)、安抚剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇和苯酚)、和抗氧化剂可用于配制剂。可将制备的注射溶液装入适宜的安瓿。
施用优选是胃肠外施用，具体的例子包括注射施用、经鼻施用、经肺施用、和经皮施用。注射施用的例子包括通过静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射等等的系统和局部施用。
药物组合物含有药学有效量或治疗有效量的活性成分(上文所述的本发明抗体)。“(化合物的)药学有效量”或“治疗有效量”指足以治疗和/或预防上文所述本发明抗体的抗原在其中发挥重要作用的病症的量。例如，“药学有效量”或“治疗有效量”可以是当将上文所述本发明抗体或抗原结合片段施用于个体(患者)时，为降低Aβ积累、中和Aβ诱导的毒性、降低Aβ原纤维形成等等，由此治疗或预防由阿尔茨海默氏病引起的状况所需的量。降低或中和可以是例如至少大约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％、95％、99％、或100％的降低或中和。
用于确定上文所述本发明抗体或抗原结合片段的此类药学有效量的评估可使用标准临床方案(包括组织病理学诊断)来进行。
可根据患者的年龄和症状来选择合适施用方法。每次施用时含抗体药物组合物的剂量可选择成例如在0.0001mg至1000mg每千克体重的范围内。或者，例如，每位患者的剂量可选择成在0.001至100,000mg/身体的范围内；然而，剂量不必限于这些范围。虽然剂量和施用方法随患者的体重、年龄、症状、等等而变化，但本领域技术人员能适宜选择它们。可以基于人类健康保险覆盖的高剂量静脉内免疫球蛋白疗法(400mg/kg)来选择剂量。
在本发明中，包含本发明的抗体或抗原结合片段的药物组合物或药剂可包括在装有可用于治疗受试者的病理状况的材料的产品和试剂盒。产品可包含任何带标签的化合物容器。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以自各种材料制成，诸如玻璃和塑料。容器表面上的标签应当指明组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明施用说明等等。
除了上文所述的容器之外，装有包含抗体或抗原结合片段的药物组合物或药剂的试剂盒可任选包括保存药学可接受稀释剂的第二容器。试剂盒可进一步包括从商业和使用者立场上想要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页。
在必要时，药物组合物可以在包或分配器装置中提供，其可含有一个或多个包含活性组分单位剂量形式。包可包含金属或塑料箔，而且例如它是泡罩包。包或分配器装置可伴有施用说明。
在上文所述药剂和试剂盒中，在作为活性组分的本发明抗体或抗原结合片段之外，在必要时可混合无菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、增溶剂、缓冲剂、蛋白质稳定剂(BSA、明胶等)、防腐剂、封闭溶液、反应溶液、反应淬灭溶液、用于处理样品的试剂等等。
另外，本发明提供用于检测样品(标本)中Aβ寡聚体(例子包括Aβ40(Aβ1-40)、Aβ42(Aβ1-42)寡聚体、和Aβ40/Aβ42寡聚体)的方法。本发明的“样品”的例子包括自受试者收集的样品、细胞培养物上清液、细胞提取物、自受试动物收集的样品、等等；然而，它们不受特别限制，只要它们含有Aβ寡聚体。具体地，本方法包括使用本发明的抗体或抗原结合片段检测样品(例如自受试者收集的样品)中含有的Aβ寡聚体的步骤。样品中的Aβ寡聚体可通过常规免疫学检测方法来检测，例如使用ELISA(使用化学发光的夹心式固相酶免疫测定法方法(化学发光ELISA)等)、RIA、使用获得的抗体的免疫沉淀法、免疫印迹、流式细胞术、质谱术、和免疫组织化学分析。
当通过上文所述测量方法在自受试者收集的样品中检测到Aβ寡聚体时，受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者(WO2009/051220，WO2009/099176，US 12/533,294，及US 12/533,348)。因此，本发明还提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法。例如，当将自受试者收集的样品中Aβ寡聚体的量与来自健康个体的量比较时，且如果受试者中的Aβ寡聚体的量大于健康个体中的量的话，就确定受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者通常由内科医师(包括在来自内科医师的指示下的个体；下文相同)来诊断。通过本诊断方法获得的关于自受试者和健康个体收集的样品中Aβ寡聚体的量的数据对于内科医师的诊断会是有用的。因此，本诊断方法可表述成收集和呈现对内科医师诊断有用的数据的方法。另外，“诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法”另可表述为“诊断受试者是否患有阿尔茨海默氏病或处于发生阿尔茨海默氏病的风险中的方法”。
具体地，本发明提供用于诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其中该方法包括使用本发明的抗体或抗原结合片段检测自受试者收集的样品中的Aβ寡聚体。
更具体地，本发明提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与本发明的抗体或抗原结合片段接触；并
(b)测量样品中Aβ寡聚体的量，
其中当步骤(b)中测量得到的量高于健康个体的量时，确定受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。上文步骤(b)另可表述为“经结合至样品中Aβ寡聚体的本发明抗体或抗原结合片段检测样品中Aβ寡聚体的步骤”。
另外，本发明提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与本发明的抗体或抗原结合片段和结合Aβ单体的抗体或抗原结合片段接触；并
(b)测量样品中Aβ寡聚体对Aβ单体的比率，
其中如果步骤(b)中测量得到的比率高于健康个体的比率的话，确定受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
首先，在本方法中，使自受试者收集的样品与本发明的抗体或抗原结合片段和结合Aβ单体的抗体或抗原结合片段接触。在本文中，“接触”可例如通过将每一种上文所述抗体或抗原结合片段添加至放置在试管中的自受试者收集的样品来进行。在这种情况中，以溶液、通过冷冻干燥获得的固体等形式合适地添加抗体或抗原结合片段。当作为水溶液添加抗体时，溶液可以纯粹地单独含有抗体，或者可以含有例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、张度剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、促流剂、或矫味剂。添加抗体的浓度不受特别限制。例如，与人免疫球蛋白配制剂一样，可合适地使用500-mg、1000-mg、和2500-mg冷冻干燥配制剂等等。“接触”可例如通过将样品添加至上面固定化有上述抗体或抗原结合片段的载体来实施。上面固定化有上述抗体或抗原结合片段的载体的优选例子包括例如微量板、珠(磁珠、Sepharose珠、等。
接着，测量上述样品中Aβ寡聚体对Aβ单体的比率(在本文中，这也称作“O/M指数”)。为了测量此比率，可使用比较自同一样品获得的寡聚体和单体ELISA值的方法进行测量。
然后，将此比率与健康个体的比率比较。当受试者中的比率高于健康个体中的比率时，确定受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
本发明的诊断方法可在体外和在体内实施，但是它们优选在体内实施。
优选地，本发明“自受试者收集的样品”没有特别限制，只要它是源自受试者的组织。实例包括受试者的脑(脑实质等等)、器官、和体液(血液、脑脊液等等)。在本发明中，样品优选是血液(更优选血浆)或脑脊液。“自受试者收集的样品”包括在收集之后经酶处理、使用柱处理、通过离心处理、通过提取处理的样品。
当样品是脑组织时，可将来自脑组织的冷冻组织样品匀浆并进行超速离心等等，以将缓冲液可溶性级分和缓冲液可溶性级分分开并测量Aβ寡聚体。例如，将脑组织在9倍体积的含有蛋白酶抑制剂混合物的Tris缓冲盐水(TS)中匀浆，并将匀浆物以265,000xg超速离心20分钟。然后，作为脑组织的可溶性级分收集的上清液可作为样品用于免疫印迹、ELISA、RIA、免疫沉淀、等。缓冲液不可溶性级分可通过甲酸(例如70％)提取来溶解，并作为样品用于免疫印迹、ELISA、RIA、免疫沉淀等。甲酸提取物可以用缓冲液(例如1MTris-HCl(pH 8.0))适当中和或稀释。
当通过免疫组织化学方法来显现并测量脑组织中存在的Aβ寡聚体时，来自受试者的脑组织切片可用作样品。为了增强免疫反应性，可以用蛋白酶K预处理脑组织切片。在免疫组织化学方法中，定量脑组织中的Aβ寡聚体不是必需的。例如，如果观察到Aβ沉积的话，就确定受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
为了提高Aβ寡聚体测量的精确度，可以除去源自受试者的样品中的脂蛋白。脂蛋白消减可通过例如组合超速离心、超滤和亲和层析来实施。下文例示了自样品消减脂蛋白的一种具体方法，但不限于此。
用KBr将样品的密度调整至1.25g/ml。将样品以100,000rpm、16摄氏度超速离心8小时。使用3kDa截留膜(Microcon 3；Arnicon，Inc)对在1.25g/ml的密度漂浮的脂蛋白和消减了脂蛋白的澄清的液体进行超滤，然后冷冻和保存，或保存于4摄氏度，直至使用。也使用PHML-LIPOSORB(Calbiochem，La Jolla，CA)通过亲和层析来除去脂蛋白。将样品和PHML-LIPOSORB(Calbiochem，La Jolla，CA)以1.5∶1的比率组合，并混合60秒钟。然后，将混合物以3,000rpm离心10分钟。所得上清液可用作无脂蛋白样品。使用20mM脱氧胆酸钠洗脱结合至PHML-LIPOSORB的脂蛋白结合样品。特定脂蛋白的清除可通过1％琼脂糖凝胶电泳，继而用FAST-RED 7B(Wako，Osaka，Japan)染色来验证。
另外，通过使用大小排阻层析、超滤等等对样品中的Aβ寡聚体进行大小分级，随后使用本发明的抗体或抗原结合片段检测每个级分中的Aβ寡聚体，可测量样品中每一种大小的Aβ寡聚体的量。通过大小排阻层析进行的分级可如下实施：使用Microcon 3kDa分子量截留滤器(Millipore Corp.)将源自受试者的样品浓缩约10倍，然后将样品应用至用磷酸盐缓冲液平衡的Superose 12大小排阻柱(1cmx30cm；Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden；流速0.5ml/min)。或者，通过超滤进行的分级可如下进行：使用Microcon 3kDa、10kDa、30kDa和100kDa截留膜连续超滤。每一个级分中含有的Aβ寡聚体的量可通过ELISA、RIA、免疫印迹、免疫沉淀等来测量。
本发明测量Aβ寡聚体的方法不受特别限制，只要它们包括使用本发明的抗体或抗原结合片段来检测样品中Aβ寡聚体的步骤。优选方法包括夹心式ELISA。当实施夹心式ELISA时，可固定化或标记本发明的抗体或抗原结合片段。或者，本发明的抗体或抗原结合片段可用作一抗，而且经过标记的二抗可结合它。夹心式ELISA中使用的另一种抗体可以是本发明的抗体或抗原结合片段，或者可以是商品化抗Aβ抗体。下文例示了通过夹心式ELISA检测样品中Aβ寡聚体的一种具体方法，但不限于此。
将微量板用本发明的抗体或抗原结合片段包被，并添加100μl样品并于4摄氏度连续温育24小时。然后，添加辣根过氧化物酶缀合的BA27Fab′片段(对Aβ40特异性的抗Aβ1-40；Wako pure chemical，Osaka，Japan)或辣根过氧化物酶缀合的BCO5 Fab′片段(对Aβ42特异性的抗Aβ35-43；Wako purechemical，Osaka，Japan)并于4摄氏度温育24小时。用Veritas微量板照度计(Promega)定量使用SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Pierce，Rockford，IL，USA)生成的化学发光。
另外，如果使用本发明的抗体免疫沉淀样品，然后实施免疫印迹分析的话，可鉴定样品中含有的Aβ寡聚体的大小，无需通过大小排阻层析、超滤、等等进行大小分级。下文例示了一种具体方法，但不限于此。
通过将样品与本发明的抗体与蛋白G-Sepharose一起温育来进行免疫沉淀。使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris-甘氨酸凝胶将免疫沉淀的Aβ寡聚体分开，并使用含有10％甲醇的10mM 3-环己基氨基-1-丙磺酸(pH 11)以400mA1小时转移到硝酸纤维素膜或Immobilon P(Millipore)上。于室温用含有5％低脂乳、1％BSA、和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液封闭膜上的非特异性结合位点3小时。通过与本发明的抗体或商品化抗Aβ抗体诸如4G8或6E10(Covance Immuno-Technologies，Dedham，MA)的反应来检测Aβ寡聚体。
另外，为了定量样品中Aβ寡聚体的量，可使用含有已知浓度的Aβ寡聚体的标准样品来绘制校正曲线。用于制备标准样品的Aβ寡聚体可通过用PBS等将在HCl溶液中溶解的合成的Aβ(HCl形式)稀释至合适浓度(例如0.1mg/ml)，并于37摄氏度温育1小时来制备。可合适地选择用于合成的Aβ的温育温度和时间。在本发明的方法中，为了获得Aβ寡聚体对Aβ单体的比率，也可为Aβ单体绘制校正曲线。用于制备标准Aβ单体样品的Aβ单体可通过用PBS等等将在TFA(三氟乙酸)中溶解的合成的Aβ(TFA形式)稀释至合适浓度(例如0.1mg/ml)来制备。对于合成的Aβ，可使用Aβ1-40、Aβ1-42等等。
另外，本发明提供作用剂(试剂)或试剂盒，供上文所述的测量样品中Aβ寡聚体的方法或诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法中使用。
供上文所述测量Aβ寡聚体的方法或诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法中使用的作用剂包括包含本发明抗体或抗原结合片段的作用剂。在一个优选的实施方案中，作用剂包括抗体溶液和固定化抗体；但它们不限于此。当作用剂是抗体溶液的形式时，在合适溶剂中溶解本发明的抗体或抗原结合片段。本领域技术人员能选择合适的溶剂，诸如水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等，用于溶解本发明的抗体或抗原结合片段。除了本发明的抗体之外，上述本发明抗体溶液可视需要包含缓冲剂、蛋白质稳定剂、防腐剂、封闭剂、表面活性剂、增溶剂等。
当本发明的作用剂是固定化抗体时，本发明的抗体或抗原结合片段由合适的载体携带。载体的例子包括微量板、珠(磁珠、Sepharose珠、等)、硝酸纤维素膜等等；然而，它们不限于此。本领域技术人员能选择合适载体，用于固定化本发明的抗体。可使用已知方法将本发明的抗体或抗原结合片段结合至载体。
作用剂中包含的本发明抗体或抗原结合片段可合适地用酶标记物、放射性标记物、荧光标记物、染料标记物、活性发光标记物等标记。
供上文所述测量Aβ寡聚体的方法或诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法中使用的试剂盒包括包含作用剂的试剂盒，所述作用剂包含本发明的抗体或抗原结合片段。包含本发明抗体或抗原结合片段的作用剂的优选例子如上所述。试剂盒可包含冻干粉形式的本发明抗体或抗原结合片段。在这种情况中，试剂盒使用者用合适溶剂溶解抗体或抗原结合片段的冻干粉。试剂盒可包含此类溶剂，用于溶解抗体或抗原结合片段。试剂盒进一步包含稀释溶液，用于稀释上文所述抗体溶液。
除了包含本发明抗体或抗原结合片段的作用剂之外，试剂盒还可视需要包含下述试剂，诸如封闭剂、生色试剂、生色底物、反应终止溶液、清洗溶液、缓冲液、一抗、二抗等等。本领域技术人员能根据Aβ寡聚体测量方法来选择合适试剂。例如，包含上面固定化有抗体的微量板的夹心式ELISA试剂盒可进一步包含经过标记的抗Aβ抗体、生色底物、反应终止溶液、清洗溶液、板密封器等。另外，包含本发明抗体溶液的夹心式ELISA试剂盒可进一步包含上面固定化有抗Aβ抗体的微量板、生色底物、反应终止溶液、清洗溶液、板密封器、经过标记的二抗(如果本发明的抗体未经标记)等。
试剂盒可进一步包含用于绘制Aβ寡聚体校正曲线的标准样品。标准样品可以是含有已知浓度的Aβ寡聚体的溶液。试剂盒可包含稀释溶液，用于逐步稀释标准溶液。或者，可包括Aβ寡聚体的冻干粉，而且可包含用于溶解冻干粉的溶剂。另外，试剂盒可包含Aβ单体的溶液或冻干粉，而且试剂盒使用者可通过温育Aβ单体溶液以聚合Aβ单体来制备Aβ寡聚体标准溶液。
当试剂盒用于诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法时，它们可包含自健康个体收集的样品(脑组织、脑脊液、血液、血浆等)作为阴性对照及自AD脑患者收集的样品作为阳性对照。
试剂盒可进一步包括其它商业和使用者立场想要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和所附文件，包括使用说明(说明书、CD-ROM、等)。试剂盒中包含的作用剂等可装在带标签的容器中。此类容器包括瓶、管形瓶、试管、微型管等。
通过述及将本文中引用的所有现有技术参考文献收入本说明书。
实施例
下面，参照实施例具体描述本发明，但是不应解释为限于此。
方法：
抗原的制备
将荧光染料6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)(SIGMA)化学连接至合成的Aβ1-40肽(Peptide Institute，Inc.)的N端以生成修饰的Aβ。通过共聚合修饰Aβ和合成Aβ1-40肽来制备富含寡聚体的样品(Aβ1-40寡聚体)。优选调整条件使得通过下文所述ThT测定法(Yamamoto N，et al：J Biol Chem，282：2646-2655，2007)测定的荧光强度为修饰Aβ缺失下的荧光强度的四分之一或更低。更具体地，优选混合修饰Aβ和合成Aβ1-40肽各100μM，并聚合20小时。
抗体生成杂交瘤的制备
免疫接种BALB/c小鼠，方式是将通过上文所述方法制备的抗原注射入它们的足垫或腹腔。然后，进行强化免疫接种六次。通过使用聚乙二醇1500与Sp2/O-Ag14细胞融合，自腹股沟淋巴结细胞或脾细胞制备杂交瘤。
ELISA筛选(初筛选)
将杂交瘤培养物上清液添加至固定化有Aβ寡聚体的ELISA板并反应。使用与HRP缀合的抗小鼠IgG抗体反应和TMB溶液进行显色。此方法中使用的Aβ寡聚体是温育1小时后的Aβ1-40(HCl形式)或上文所述提取的Aβ1-42四聚体抗原。
点印迹分析(二次筛选)
对初筛选给出阳性结果的杂交瘤进行点印迹分析。在此分析中，将0.1微克/点的3种Aβ即合成的Aβ1-40(TFA形式)(Aβ单体)、温育1小时之后的合成的Aβ1-40(HCl形式)(Aβ寡聚体)、和合成的Aβ1-42固定化到硝酸纤维素膜上并使用。将膜用含有5％低脂乳和0.05％Tween-20的Tris缓冲液封闭，并与杂交瘤培养物上清液反应并使用与HRP缀合的抗小鼠IgG抗体和化学发光试剂盒(ECL)检测。
抗体同种型测定
使用Serotec(Oxford，UK)小鼠单克隆抗体同种型测试试剂盒进行纯化的免疫球蛋白的同种型测定。
抗体序列的鉴定
使用FastPure RNA试剂盒(TaKaRa，Japan)自通过上文所述方法生成的杂交瘤(1x106个细胞)纯化RNA。使用RNA作为模板，使用5′RACE系统(Invitrogen，USA)和对自每一种杂交瘤生成的抗体的H链或L链特异性的引物合成DNA。下文显示了用于cDNA合成的3′侧引物序列。
H链(G1)mIGC1Rv：AAGGCTTACAACCACAATCCCT(SEQ ID NO：131)
H链(G2a)mIGC2aRv：TGCTGGGCATTTGCATGGA(SEQ ID NO：132)
H链(G2b)mIGC2bRv：TGGGCATTTGTGACACTCC(SEQ ID NO：133)
H链(G3)mIGC3Rv：ACTGGGCTTGGGTATTCTAGG(SEQ ID NO：134)
L链(κ)mIKCNRv1：GTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCGTT(SEQID NO：135)
L链(λ)mILCNRv1：TCCACAGTGTGACCTTCATGAGTGACC(SEQ ID NO：136)
另外，使用所述cDNA，通过PCR法扩增VH和VL区。下文显示了用于PCR的对H链或L链特异性的3′侧引物序列。
H链mIGCNRv：ACAGGGATCCAGAGTTCCA(SEQ ID NO：137)
L链(κ)mIKCNRv2：TAACTGCTCACTGGATGG(SEQ ID NO：138)
L链(λ)mILCNRv2：AGTGTGGCCTTGTTAGTCTCGAGC(SEQ ID NO：139)
依照产品所附手册进行cDNA合成和PCR，并使用产品所附引物(AAP：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：140)，AUAP：GGCCACGCGTCGACTAGTAC(SEQ ID NO：141))作为5′侧引物。使用TaqDNA聚合酶高保真(Invitrogen，USA)进行PCR。
将通过PCR扩增的VH和VL区片段与线性载体(pGEMTM-T Easy载体(Promega，USA))连接1小时，然后转化入大肠杆菌DH5α菌株。将形成的菌落在液体选择培养基中培养过夜，并使用高纯度质粒微量制备系统(MARIGEN BIOSCIENCES，USA)纯化质粒。使用BigDye终止物V3.1循环序列试剂盒(Applied Biosystems)和3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems)通过基因序列分析来测定抗体序列。使用下文所述两种引物进行序列分析。
SP6：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO：142)
M13Rv：TCACACAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO：143)
对照抗体
使用抗Aβ抗体6E10作为对照抗体以与本发明的抗体比较。抗Aβ抗体6E10(Covance Immuno-Technologies，Dedham，MA)是一种小鼠单克隆抗体，其识别Aβ1-16中的一段序列作为表位，且对Aβ寡聚体没有选择性(结合Aβ单体)。
竞争性ELISA
通过用PBS稀释合成的Aβ1-40(HCl形式)于0.1mg/ml来制备Aβ寡聚体抗原，并于37摄氏度温育1小时。通过用PBS稀释的合成的Aβ1-40(TFA形式)于0.1mg/ml来制备Aβ单体。首先，将400ng/孔Aβ寡聚体固定化到96孔免疫板上，并将板用BSA封闭。接着，将本发明的抗体或对照抗Aβ抗体(6E10)各自与连续稀释的Aβ单体或Aβ寡聚体混合(范围为100pg/ml至100μg/ml)并温育2小时，然后将每一种混合物添加至96孔免疫板并于室温温育10分钟。通过与HRP缀合的抗小鼠IgG抗体反应并使用TMB溶液通过测量450nm吸光度来显现，检测每一种抗体对固定化Aβ寡聚体的结合能力。在本方法中，作为竞争性物质比较了2种Aβ1-40(Aβ1-40单体和Aβ1-40寡聚体)，它们具有相同的序列，但具有不同的结构及由其结构所致的聚合特征。因而，该方法能比较仅源于Aβ1-40多聚化的存在的抗体的结合差异，因此能获得极其可靠的结果。
对Aβ寡聚体的亲和力的分析
使用Biacore 3000(GE Healthcare Sciences)通过表面等离子共振(SPR)进行分析。将Aβ寡聚体固定化到传感器芯片(CM5)上作为配体，并使用本发明的抗体和对照6E10抗体作为分析物，进行动力学分析。于下述5个浓度对分析物抗体进行分析：1.25，2.50，5.00，10.00，和20.00μg/ml，并使用BiaEvaluation软件计算结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、和解离常数(KD)。通过用PBS稀释合成的Aβ1-40(HCl形式)于0.1mg/ml并于37摄氏度温育1小时来制备该分析中使用的Aβ寡聚体。
Aβ诱导的神经毒性测定法
以150,000个细胞/孔的密度将人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)分配入24孔板，并在含有10％FBS的DMEM中温育24小时。然后，将培养基更换成有或无抗体的含有12.5μM Aβ1-42的无血清培养基，并将细胞再培养24小时。为了测定由Aβ1-42诱导的细胞毒性，使用CytoTox96试剂盒(Promega)测定从死细胞释放入培养基的LDH含量。
阻抑Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的活性
在有或无本发明的抗体的条件下将用细胞培养基稀释至12.5μM的Aβ1-42溶液与37摄氏度温育24小时。然后，将溶液与硫黄素T(ThT)溶液(5μM ThT，50mM甘氨酸-NaOH，pH8.5)混合，使用荧光分光光度计(RF-980PC；Shimadzu Co.，Kyoto，Japan)测定与Aβ淀粉状蛋白原纤维含量相关的ThT荧光强度。激发和发射波长分别设置为446nm和490nm。在制备混合物之后立即测量荧光强度。
免疫印迹
使用Tg2576或野生型小鼠的脑匀浆物进行APP结合测定。将匀浆物在NuPAGE Tris-甘氨酸4-12％凝胶中电泳，并转移至PVDF膜。用PVDF封闭试剂(TOYOBO)封闭之后，将膜与每一种抗体反应。用HRP缀合的抗小鼠IgG抗体和化学发光试剂(Immobilon western，Millipore)来检测结合能力。
结果：
抗Aβ寡聚体抗体的选择
给46只小鼠免疫接种Aβ1-40寡聚体抗原，并自每一只小鼠分离腹股沟淋巴结或脾。将源自每种器官的细胞与骨髓瘤(Sp2/O-Ag14)融合，并分配入96孔板(每只小鼠7块板)并培养。通过将来自96孔板的培养物上清液添加到固定化有Aβ寡聚体的ELISA板上，并使它们反应以分析来选择生成感兴趣抗体的杂交瘤。结果，自30,912个孔((46只小鼠)x(7块板)x(96个孔))中选择出507个阳性细胞。
上文所述ELISA筛选也选择并非特异性结合Aβ寡聚体的抗体(结合ELISA板而非Aβ寡聚体的抗体)。通过实施点印迹分析，可排除这些非特异性抗体。因而，使用ELISA阳性细胞进行点印迹分析。为了点印迹分析，点样了两种类型的寡聚体和Aβ单体，并排除非特异性抗体(排除了不结合被点样的Aβ寡聚体的抗体)，而且验证针对Aβ寡聚体的特异性(没有对Aβ单体的结合)。作为结果，在507个ELISA阳性细胞中选择出6个阳性抗体(图1)。
抗体序列的鉴定
对通过上文点印迹分析选择出的6种抗体(即IR-003、IR-091、IR-099、IR-103、IR-130、和IR-148)，通过上文所述方法分析可变区序列。作为结果，获得了下述包含VH CDR1、CDR2、和CDR3的区域的核苷酸序列：SEQ ID NO：1(IR-003)，SEQ ID NO：17(IR-091)，SEQ ID NO：33(IR-099)，SEQ ID NO：49(IR-103)，SEQ ID NO：65(IR-130)，和SEQ ID NO：81(IR-148)。根据上述核苷酸序列，获得了下述氨基酸序列：SEQ ID NO：2(IR-003)，SEQ ID NO：18(IR-091)，SEQ ID NO：34(IR-099)，SEQ ID NO：50(IR-103)，SEQ ID NO：66(IR-130)，和SEQ ID NO：82(IR-148)。
另外，获得了下述包含VL CDR1、CDR2和CDR3的区的核苷酸序列：SEQID NO：3(IR-003)，SEQ ID NO：19(IR-091)，SEQ ID NO：35(IR-099)，SEQ IDNO：51(IR-103)，SEQ ID NO：67(IR-130)，和SEQ ID NO：83(IR-148)。根据上述核苷酸序列，获得了下述氨基酸序列：SEQ ID NO：4(IR-003)，SEQ IDNO：20(IR-091)，SEQ ID NO：36(IR-099)，SEQ ID NO：52(IR-103)，SEQ ID NO：68(IR-130)，和SEQ ID NO：84(IR-148)。
CDR序列是基于Kabat(Kabat，Elvin A.，Sequences of proteins ofimmunological interest 5th ed.，National Institutes of Health，1991)的定义自氨基酸序列确定的。抗体的CDR序列显示于表1。在表1中，“名称”显示每一种抗体的名称，“类”显示每一种抗体的IgG亚类，“链”显示该链是H或L链，而″(na)″表示“核酸”。
表1
所获得的VH和VL序列中的一些含有信号肽或缺少N端或C端序列。如果缺少序列的话，就补充它们。因此，没有信号序列的VH和VL序列是基于与先前报告的抗体序列的同源性而确定的。
每一种抗体的VH和VL氨基酸序列(不包括信号肽)显示于表2。
表2
每一种抗体的H链信号肽的氨基酸序列显示于下述序列ID编号中：
SEQ ID NO：122(IR-003)，SEQ ID NO：124(IR-091)，SEQ ID NO：126(IR-099，IR-103，和IR-148)，SEQ ID NO：128(IR-130)。编码每一种抗体的H链信号肽的核苷酸序列显示于下述序列ID编号中：SEQ ID NO：121(IR-003)，SEQ ID NO：123(IR-091)，SEQ ID NO：125(IR-099，IR-103，和IR-148)，SEQ ID NO：127(IR-130)。
每一种抗体的L链信号肽的氨基酸序列显示于下述序列ID编号中：SEQID NO：130(IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148)。编码每一种抗体的L链信号肽的核苷酸序列显示于下述序列ID编号中：SEQ ID NO：129(IR-003，IR-091，IR-099，IR-103，IR-130，和IR-148)。
竞争性ELISA分析
点印迹分析是一种用于分析针对硝酸纤维素膜上固定化的Aβ单体或寡聚体的反应性的方法。然而，Aβ可溶解到体液，诸如间质液、脑液、或血液中。故而，进行本分析以调查对溶液中的Aβ寡聚体的特异性结合和对Aβ单体的选择性的差异。竞争性ELISA是一种用于测定寡聚体特异性的方法，其方式是预先在溶液中使要测量的抗体和经连续稀释的Aβ单体或寡聚体反应，并将溶液添加至固定化有Aβ寡聚体的板来进行ELISA。当抗体是Aβ寡聚体特异性抗体时，在与Aβ寡聚体反应的溶液中的ELISA反应以Aβ寡聚体浓度依赖性方式降低，但是在与Aβ单体反应的溶液中的ELISA反应不降低或在Aβ浓度变得高于寡聚体浓度时降低。分析了上述六种抗体，并获得了图2所示结果。所有抗体甚至在溶液中亦显示高结合特异性。同时，用作对照的、与Aβ单体和寡聚体二者反应的抗体(6E10)显示针对单体和寡聚体的等同的ELISA反应性。另外，竞争性ELISA结果显示于图3，其中抑制剂浓度以摩尔浓度显示。通过图3中的竞争性ELISA计算的IC50和相比于Aβ单体的对Aβ寡聚体的选择性(Aβ单体IC50/Aβ寡聚体IC50)显示于表3。
表3
对Aβ寡聚体的亲和力的分析
为了调查本发明抗体对Aβ寡聚体的结合能力，分析了亲和力(参见“方法”)。分析了六种抗体，并获得了图4所示结果。计算结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、和解离常数(KD)显示于表4。
表4
抗Aβ寡聚体抗体针对Aβ诱导的细胞毒性的中和能力的测定
Aβ寡聚体对神经元细胞引起细胞毒性。为了评估抗Aβ寡聚体抗体是否中和Aβ诱导的细胞毒性，使用人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)实施体外测定法。大多数抗体显示出针对Aβ诱导的细胞毒性的中和能力。显示中和能力的抗体的例子显示于图5。在图中，Y轴的值指示相对于只有Aβ(无抗体)时的细胞毒性的比率。
抗Aβ寡聚体抗体针对Aβ-原纤维形成的抑制能力的测定
Aβ单体当在中性pH缓冲液中被温育时由于多聚化而形成原纤维。为了评估抗体是否抑制原纤维形成，混合抗体和Aβ并温育24小时，并通过反映原纤维量的硫黄素T荧光来测量混合物。大多数抗体显示出针对Aβ原纤维形成的抑制能力。显示抑制能力的抗体的例子显示于图6。在图中，Y轴的值指示相对于只有Aβ(无抗体)时的原纤维形成比率。
验证抗Aβ寡聚体抗体不结合APP (淀粉状蛋白前体蛋白)的免疫印迹
抗Aβ抗体不结合APP(其是在健康身体中表达的生理蛋白)对于规避副作用是重要的。预期抗Aβ寡聚体抗体不结合APP，因为它们识别APP中不存在的Aβ寡聚体构象域(conformational domain)。因此，实施了免疫印迹来评估本发明的抗Aβ寡聚体抗体是否不结合APP。确认了它们不结合人APP(与对照6E10抗体的结果相比)。免疫印迹分析的例子显示于图7。此数据还显示本发明的抗体对Aβ寡聚体以外的蛋白质具有低的结合亲和力，而且抗体的特异性高(与对照6E10抗体的结果相比)。
工业应用性
由本发明提供的抗体有助于建立对引发阿尔茨海默氏病的病理状况负有责任的分子选择性的预防/治疗方法，及建立阿尔茨海默氏病的早期诊断标志物。

Claims (12)

1.一种识别分离的Aβ寡聚体作为抗原的抗体，其中该抗体不结合Aβ单体，其中所述抗体包含：
(1)具有CDR1、CDR2、和CDR3的H链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在由SEQID NO:106的氨基酸序列组成的VH中鉴定；和
(2)具有CDR1、CDR2、和CDR3的L链，所述CDR1、CDR2、和CDR3在由SEQID NO:108的氨基酸序列组成的VL中鉴定。
2.一种识别分离的Aβ寡聚体作为抗原的抗体，其中该抗体不结合Aβ单体，其中所述抗体包含：
(1)其CDR1由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成、CDR2由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成、和CDR3由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的H链；
(2)其CDR1由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成、CDR2由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成、和CDR3由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的L链。
3.权利要求1或2的抗体，其中该抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
4.权利要求1至3中任一项的抗体的抗原结合片段，其中所述片段选自下组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、双抗体、和sc(Fv)2。
5.一种药物组合物，其包含权利要求1至3中任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段，及药学可接受载体。
6.权利要求5的组合物，其是抗认知缺损的作用剂、用于阿尔茨海默氏病的治疗剂、用于阻抑阿尔茨海默氏病进展的作用剂、用于阻抑老年斑形成的作用剂、用于阻抑Aβ积累的作用剂、抗神经毒性剂、用于抑制Aβ淀粉状蛋白原纤维形成的作用剂、或抗突触毒性的作用剂。
7.权利要求1至3中任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段在制备用于检测样品中含有的Aβ寡聚体的试剂盒中的用途。
8.权利要求1至3中任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段用于制备用于诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的试剂中的用途，所述诊断包括检测自受试者收集的样品中的Aβ寡聚体。
9.权利要求1至3中任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段用于制备用于诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的试剂的用途，所述诊断包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与所述抗体或抗原结合片段接触；并
(b)测量该样品中Aβ寡聚体的量，
其中当步骤(b)中测量得到的量高于健康个体的量时，确定该受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
10.权利要求1至3中任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段用于制备用于诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的试剂的用途，所述诊断包括下述步骤：
(a)使自受试者收集的样品与所述抗体或抗原结合片段、以及结合Aβ单体的抗体接触；并
(b)测量该样品中Aβ寡聚体对Aβ单体的比，
其中当步骤(b)中测量得到的比高于健康个体的比时，确定该受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。
11.权利要求7的用途，其中所述样品是血液或脑脊液。
12.权利要求8至10中任一项的用途，其中所述样品是血液或脑脊液。
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