PT1830881E

PT1830881E - Terapias de combinação visando múltiplos receptores do tipo toll e a sua utilização

Info

Publication number: PT1830881E
Application number: PT05856275T
Authority: PT
Inventors: Greg Elson; Olivier Leger
Original assignee: Novimmune Sa
Priority date: 2004-12-10
Filing date: 2005-12-12
Publication date: 2010-08-30
Also published as: JP5118491B2; JP2012197316A; CA2593561C; AU2005325482A1; CA2593561A1; DE602005021694D1; PL1830881T3; WO2006077471A3; ATE469658T1; ES2348792T3; US20060165686A1; WO2006077471A2; JP2008523048A; DK1830881T3; AU2005325482B2; EP1830881A2; EP1830881B1; US8029794B2

Description

DESCRIÇÃO

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO VISANDO MÚLTIPLOS RECEPTORES DO TIPO TOLL E A SUA UTILIZAÇÃO

Dominio da invenção A presente invenção tem por objecto, de uma forma geral, composições que contêm vários anticorpos, por exemplo, vários anticorpos de neutralização, que se ligam imunoespecificamente a um ou mais receptores do tipo Toll, por exemplo, dois ou mais receptores do tipo Toll e ainda processos de utilização destas composições no tratamento de processos inflamatórios.

Antecedentes

Os receptores Toll, que foram descobertos, pela primeira vez, na Drosophila, são proteínas da transmembrana do tipo I com repetições ricas em leucina (RRLs) na porção extracelular da proteína e um ou dois domínios ricos em cisteína. Os homólogos de mamíferos dos receptores Toll de Drosophila são conhecidos como "receptores semelhantes aos Toll" (RSTs, TLRs na terminologia inglesa). Os RSTs têm mostrado desempenhar um papel na imunidade inata por meio do reconhecimentos de partículas microbianas e activação de células imunitárias contra a fonte destas partículas microbianas.

Actualmente, identificaram-se já dez tipos de receptores semelhantes a Toll, RSTs 1-10. Estes RSTs são caracterizados pela homologia dos seus domínios intracelulares com os do receptor de IL-1 e pela presença de repetições extracelulares ricas em leucina. 2

Os RSTs são activados por diferentes tipos de partículas microbianas conhecidas como modelos moleculares associados a agentes patogénicos (MMAPs). Por exemplo, o RST4 é activado principalmente por lipopolissacáridos (LPS), enquanto o RST2 é activado pelo ácido lipoteicóico (ALT), pelo lipoarabinomanano (LAM), pela lipoproteína (BLP) e pelos peptidoglicanos (PGN). Assim, é possível que qualquer micróbio possa estimular vários RSTs diferentes em paralelo num dado momento durante uma infecção.

Além disso, certos RSTs têm demonstrado exigir a presença de proteínas acessórias para funcionarem. Por exemplo, o RST4 forma um complexo com uma proteína de diferenciação mielóide 2 (DM-2) na superfície da célula. Verificou-se que a proteína DM-2 interage directamente com RST4 e DM-2 tem a capacidade de permitir modificações pós-translacionais de RST4, bem como facilitar o seu transporte para a superfície da célula. CD14 é uma outra proteína que tem sido associada à função de RST4 e, além disso, CD14 também tem sido implicada no reconhecimento do RST2 de micróbios.

Sumário da invenção A presente invenção tem por objecto composições que contêm uma combinação de anticorpos, por exemplo, vários anticorpos monoclonais de neutralização (AcMs) ou um ou mais anticorpos polivalentes que se ligam imunoespecificamente a um ou mais receptores do tipo Toll, por exemplo, dois ou mais receptores do tipo Toll, em que a combinação compreende um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente a receptores semelhantes a Toll 4 (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente a receptores semelhantes a Toll 2 (RST2), em que o anticorpo anti-RST4 é composto por três RDCs de cadeia pesada pelo menos 90 % 3 idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 inclui uma região variável da cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59. A descrição também providencia processos de utilização destas combinações de anticorpos no tratamento de doenças inflamatórias. A doença inflamatória é, por exemplo septicémia, inflamação aguda e inflamação crónica. Por exemplo, a inflamação crónica está associada a uma doença auto-imune ou a uma doença inflamatória, tal como um distúrbio inflamatório intestinal, osteoartrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, arteriosclerose, asma ou DPOC (Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica). A presente invenção também diz respeito à identificação da contribuição relativa de RST4, RST2 e CD14 no reconhecimento e na resposta imunológica à bactéria gram-negativa Escherichia coli no sangue total humano através de anticorpos monoclonais de neutralização para cada componente do receptor. Além disso, a presente invenção tem por objecto processos para detectar o efeito da combinação do tratamento com AcM na inibição da resposta imunitária. A presente invenção também tem por objecto composições que contêm múltiplos anticorpos ou composições que contêm um ou mais anticorpos polivalentes, em que as composições compreendem um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor do tipo Toll 4 (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor do tipo Toll 2 (RST2) , em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 4 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 inclui uma região variável da cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59. A referida combinação ou composição de anticorpos inclui dois ou mais anticorpos, em que os anticorpos se ligam imunoespecificamente a dois ou mais alvos, tais como, nomeadamente, pelo menos o receptor semelhante a Toll 4 (RST4) e o receptor semelhante a Toll 2 (RST2) e, por exemplo, o receptor semelhante a Toll 1 (RST1), o receptor semelhante a Toll 5 (RST5), o receptor semelhante a Toll 6 (RST6) , DM-2 e CD14. Por exemplo, a combinação contém pelo menos dois anticorpos, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4 e o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2. Por exemplo, a combinação contém pelo menos três anticorpos, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a DM-2. A combinação contém pelo menos, três anticorpos, por exemplo, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD14. A combinação contém pelo menos quatro anticorpos, o anticorpo que se liga imuno- especificamente a RST4, o anticorpo que se liga imuno- especificamente a RST2, um anticorpo que se liga imuno- especificamente a DM-2 e um anticorpo que se liga imuno- especificamente a CD14.

Os anticorpos são, por exemplo, anticorpos monoclonais e, mais especificamente, anticorpos monoclonais de neutralização que são capazes de bloquear, isto é, de neutralizar a actividade biológica ou a função do alvo. Tal como se utilizam aqui, os termos "anticorpo" e "anticorpos" referem-se a anticorpos monovalentes (isto é, mono- 5 específicos) e polivalentes (por exemplo, biespecífico, triespecífico). Anticorpos adequados incluem, por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos completamente humanos e os seus fragmentos. Por exemplo, os anticorpos são capazes de bloquear a produção de citocinas pró-inflamatórias induzida por LPS. Tal como se utiliza aqui, a expressão "citocina pró-inflamatória" refere-se às citocinas imunomoduladoras que promovem a inflamação e/ou estão associadas com uma inflamação. As citocinas pró-inflamatórias incluem, por exemplo, IL-6, IL-8, FNT-alfa, ILl-alfa, ILl-beta, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, IL-10, IL12, IL-23, IL17 e IL18.

Os anticorpos reconhecem, por exemplo, o complexo receptor de RST4/DM-2 expresso na superfície celular. Os anticorpos utilizados nas composições e nos processos da presente invenção incluem anticorpos que se ligam ao complexo do receptor humano RST4/DM-2 e também se ligam a RST4 de forma independente da presença de DM-2. Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos que se ligam a parte de RST4 do complexo do receptor humano RST4/DM-2, mas a ligação é totalmente dependente da presença de DM-2. Além disso, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos que se ligam ao complexo do receptor humano RST4/DM-2 e também se ligam a DM-2, mas apenas na presença de RST4. Outros anticorpos adequados incluem anticorpos que se ligam a DM-2, quando não está complexada com RST4, anticorpos que se ligam a RST2, anticorpos que se ligam a RST1, anticorpos que se ligam a RST5, anticorpos que se ligam a RST6 e anticorpos que se ligam a CD14.

Exemplos de anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, o anticorpo de murino 18H10, o anticorpo de murino 16G7, o anticorpo de murino 15C1, o anticorpo de murino 7E3, 6 o anticorpo humanizado 18H10, o anticorpo humanizado 16G7, o anticorpo humanizado 15C1, o anticorpo humanizado 7E3. Estes anticorpos mostram especificidade para o complexo do receptor humano RST4/DM-2 e têm mostrado ser capazes de inibir a activação do receptor e a posterior sinalização intracelular por via de LPS. Estes anticorpos têm especificidades distintas. Por exemplo, 15C1 liga-se a RST4 independentemente da presença de DM-2, 7E3 liga-se a RST4, mas a ligação está dependente da presença de DM-2 e 18H10 liga-se a DM-2, mas exige a presença de RST4, como o AcM que não se liga a formas solúveis de DM-2.

Outros exemplos de anticorpos incluem anticorpos que reconhecem CD14, tal como o anticorpo monoclonal anti-CD14 conhecido como 28C5 (ver, por exemplo, a patente U.S. No. 6.444.206) e anticorpos que reconhecem RST4, incluindo, por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-RST2 conhecido como T2.5 (ver, por exemplo, WO 2005/028509). Anticorpos adequados utilizados nas combinações e composições da presente invenção compreendem um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor 4 do tipo Toll (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor 2 do tipo Toll (RST2) , em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada, pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 inclui uma região variável da cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59.

Os anticorpos adequados utilizados nas combinações e composições da presente invenção contêm uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID 7 NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47, 48, 51 e 56. Os anticorpos adequados contêm uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 43, 44, 46, 49, 53 e 59. As três RDCs de cadeia pesada incluem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idênticas a uma sequência seleccionada no grupo constituído por GGYSWH (SEQ ID NO: 23); YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24); KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25); DSYIH (SEQ ID NO: 3); WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4), GYN-VYYAMDY (SEQ ID NO: 5); TYNIGVG (SEQ ID NO: 33); HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34); MAE- GRYDAMDY (SEQ ID NO: 35), TYGIN (SEQ ID NO: 62); GFTFTTYG (SEQ ID NO: 63); WIYPRDGSTNFNENFKD (SEQ ID NO: 64); IYPRDGST (SEQ ID NO: 65); ARLT-GGTFLDY (SEQ ID NO: 66); SDSAWN (SEQ ID NO: 72), YISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 73) e GLR-FAY (SEQ ID NO: 74) . As três RDCs de cadeia leve incluem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, 92 %, 95%, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idênticas a uma sequência seleccionada no grupo constituído por RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 28); YASH AIS (SEQ ID NO: 29); QNGHSFPLT (SEQ ID NO: 30); SASSSVIYMH (SEQ ID NO: 8); RTYNLAS (SEQ ID NO: 9); HQWSSF-PYT (SEQ ID NO: 10); RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 38); YTSKLHS (SEQ ID NO: 39); QQGNTFPWT (SEQ ID NO: 40); RASESVEYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 67); ESVEYY-GTSL (SEQ ID NO: 68); GASNVES (SEQ ID NO: 69); GAS (SEQ ID NO: 70); QQSRKLPWT (SEQ ID NO: 71), RASESVDSYVNSFLH (SEQ ID NO: 75); RASNLQS (SEQ ID NO: 76) e QQSNEDPYT (SEQ ID NO: 77) .

Para os anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um complexo de RST4/DM-2, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se a um epitopo que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos no RST4 humano entre os resíduos 289 e 375 da SEQ ID NO: 61. Por exemplo, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se inclui um epítopo que resíduos especificamente a seleccionados no grupo que consiste, pelo menos, nos resíduos 293 a 295 da SEQ ID NO: 61; pelo menos nos resíduos 296 e 297 da SEQ ID NO: 61; pelo menos, nos resíduos 319 a

321 da SEQ ID NO: 61; pelo menos, nos resíduos 328 e 329 da SEQ ID NO: 61; pelo menos, nos resíduos 349 a 351 da SEQ ID NO: 61; e pelo menos, nos resíduos 369 a 371 da SEQ ID NO: 61. Por exemplo, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se especificamente a um epítopo que contém, pelo menos os resíduos 328, 329, 349 a 351 e 369 a 371 da, SEQ ID NO: 61. Noutro exemplo, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se especificamente a um epítopo que inclui pelo menos os resíduos 293 a 295, 296, 297 e 319 a 321 da SEQ ID NO: 61.

Para os anticorpos que se ligam imunoespecificamente ao complexo RST4/DM2, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se a um epítopo na DM-2 humana entre os resíduos 19 e 57 da SEQ ID NO: 60. Por exemplo, o anticorpo liga-se especificamente a um epítopo que contém pelo menos os resíduos 53 da SEQ ID NO: 60.

Para os anticorpos que se ligam a RST2, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se a um epítopo na porção do terminal C do domínio extracelular de RST2 (isto é, RST2ECD). A presente invenção também tem por objecto uma combinação de anticorpos para se utilizarem num processo para aliviar um sintoma de uma patologia associada a um distúrbio inflamatório num indivíduo em que esse alívio seja desejado. O indivíduo é, por exemplo, um ser humano. A combinação dos anticorpos utilizados nos processos da 9 presente invenção inclui dois ou mais anticorpos, tal como definido na reivindicação 1, em que os anticorpos se ligam imunoespecificamente a dois ou mais alvos, como por exemplo o receptor 4 semelhante a Toll (RST4), o receptor 2 semelhante a Toll (RST2), DM-2 e CD14. Por exemplo, a combinação contém pelo menos dois anticorpos, o anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2. Por exemplo, a combinação contém pelo menos três anticorpos, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a DM-2. A combinação contém pelo menos três anticorpos, um anticorpo que se liga imuno- especificamente a RST4, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD14. A combinação contém pelo menos quatro anticorpos , um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST4, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a RST2, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a DM-2 e um anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD14. Os anticorpos utilizados nos processos da presente invenção incluem também anticorpos polivalentes que se ligam imunoespecificamente a pelo menos dois alvos seleccionados entre RST4, DM-2, RST2 e CD14. A combinação de anticorpos está presente em quantidade suficiente para prevenir ou reduzir o início de uma resposta imunitária no indivíduo a ser tratado.

Breve descrição dos desenhos A figura IA é um gráfico que mostra o efeito de um anticorpo monoclonal anti-RST4 (denominado 15C1) e um anticorpo monoclonal anti-RST2 (aqui referido como T2 .5) na 10 produção de IL-8 induzida por LPS em qualquer um dos transfectantes de HEK 293 RST4h/DM2 (Figura IA). A figura 1B é um gráfico que mostra o efeito do AcM 15C1 anti-RST4 e do ACM T2.5 anti-RST2 na produção de IL-8 induzida por PAM3CSK4 num transfectante estável de HEK 2 93 RST2h (figura 1B). A figura 2A é uma série de gráficos que mostra o efeito do AcM 15C1 anti-RST4, o AcM T2.5 anti-RST2 e o AcM 28C5 anti-CDl4 na produção de IL-8 induzida por LPS no sangue total. A figura 2B é uma série de gráficos que mostra o efeito do AcM 15C1 anti-RST4, o AcM T2.5 anti-RST2 e o AcM 28C5 anti-CD14 na produção de IL-8 induzida por PAM3CSK4 no sangue total.

As figuras 3A e 3B são uma série de gráficos sobre o efeito da combinação do AcM 15C1 anti-RST4, o AcM T2.5 anti- RST2 e o AcM 28C5 anti-CD14 na produção de IL-6 no sangue total estimulada por E. coli de tipo selvagem inactivada.

As figuras 4A-4D são uma série de gráficos sobre a expressão de superfície de RST2, RST4, DM-2 e CD14 em leucócitos, HUVEC e células BEAS 2B.

As figuras 5A e 5B são uma série de gráficos sobre a inibição da produção de IL-6 no sangue humano completo induzida por MMAP de bactérias por meio de AcMs específicos anti-RST.

As figuras 6A e 6B são uma série de gráficos sobre a indução da produção de IL-8 em células HEK 293 transfectadas 11 por bactérias inactivadas pelo calor.

As figuras 7A-7C são uma série de gráficos sobre a indução da produção de IL-6 pelas bactérias inactivadas pelo calor.

As figuras 8A-8D são uma série de gráficos sobre a inibição da produção de IL-6 induzida por bactérias por meio de AcMs anti-RST específicos. A figura 9 é uma série de gráficos sobre a comparação da produção de IL-6 induzida em sangue humano completo por bactérias inactivadas pelo calor e inactivadas por antibióticos.

As Figuras 10A-10F são uma série de ilustrações mostrando a sequência de nucleótidos VP (SEQ ID NO: 1) (figura 10A) , a sequência de aminoácidos VP (SEQ ID NO: 2) (figura 10B) , a sequência de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 6) (figura 10D) e sequência de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 7) para 18H10mu (figuralOE). As regiões de determinação de complementaridade (RDCs) de VP (SEQ ID NOs: 3, 4 e 5) (figura 10C) e as RDCs de VL (SEQ ID NOs: 8, 9 e 10) (figura 10F) estão em destaque no texto sublinhado, em itálico nas FIGS. 10B e 10E.

As Figuras 11A-11F são uma série de ilustrações mostrando a sequência de nucleótidos VP (SEQ ID NO: 11) (figura 11A) , a sequência de aminoácidos VP (SEQ ID NO: 12) (figura 11B) , a sequência de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 16) (figura 11D) e sequência de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 17) (figurallE) para 16G7mu. As regiões de determinação de complementaridade (RDCs) de VP (SEQ ID NOs: 13, 14 e 15) (figura 11C) e as RDCs de VL (SEQ ID NOs: 8, 9 e 20) (figura 12 11F) estão em destaque no texto sublinhado, em itálico nas FIGS. 11B e 11E.

As Figuras 12A-12F são uma série de ilustrações mostrando a sequência de nucleótidos VP (SEQ ID NO: 21) (figura 12A) , a sequência de aminoácidos VP (SEQ ID NO: 22) (figura 12B), a sequência de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 26) (figura 12D) e sequência de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 27) (figural2E) para 15Clmu. As regiões de determinação de complementaridade (RDCs) de VP (SEQ ID NOs: 23, 24 e 25) (figura 12C) e as RDCs de VL (SEQ ID NOs: 28, 29 e 30) (figura 12F) estão em destaque no texto sublinhado, em itálico nas FIGS. 12B e 12E.

As Figuras 13A-13F são uma série de ilustrações mostrando a sequência de nucleótidos VP (SEQ ID NO: 31) (figura 13A) , a sequência de aminoácidos VP (SEQ ID NO: 32) (figura 13B) , a sequência de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 36) (figura 13D) e sequência de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 37) (figural3E) para 16G7mu. As regiões de determinação de complementaridade (RDCs) de VP (SEQ ID NOs: 33, 34 e 35) (figura 13C) e as RDCs de VL (SEQ ID NOs: 38, 39 e 40) (figura 13F) estão em destaque no texto sublinhado, em itálico nas FIGS. 13B e 13E.

As figuras 14A e 14B são uma série de ilustrações que mostram duas versões da sequência de aminoácidos de VP humanizada (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42) (Figura 14A) e duas versões da sequência de aminoácidos de VL humanizada (SEQ ID NO: 43), (SEQ ID NO: 44) (figura 14B) para 15Clhu. Também estão ilustradas as RDCs de VP e VL. A figura 15 é uma ilustração que mostra a sequência de aminoácidos de VP (SEQ ID NO: 45) e a sequência de aminoácidos de VL (SEQ ID NO: 46) para 18H10hu. Também 13 estão ilustradas as RDCs de VP e VL. A figura 16 é uma ilustração que mostra duas versões da sequência de aminoácidos de VP humanizada (SEQ ID NO: 47), (SEQ ID NO: 48) e a sequência de aminoácidos de VL (SEQ ID NO: 4 9) para 7E3hu. Também estão ilustradas as RDCs de VP e VL. A figura 17 é uma ilustração que mostra as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos da cadeia pesada de 28C5 (SEQ ID NOS: 50 e 51, respectivamente). A figura 18 é uma ilustração que mostra as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de cadeia leve 28C5 (SEQ ID NOS: 52 e 53, respectivamente). A figura 19 é uma ilustração que mostra as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos da cadeia pesada variável de T2.5 (SEQ ID NOS: 54-55 e 56 respectivamente). A figura 20 é uma ilustração que mostra as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos da cadeia leve variável de T2.5 (SEQ ID NOS: 57-58 e 59 respectivamente). A figura 21 é uma ilustração que mostra uma sequência de uma proteína madura acessória de DM-2 (SEQ ID NO: 60) . A figura 22 é uma ilustração que mostra a sequência de aminoácidos do receptor humano semelhante a Toll 4 (RST4)) (SEQ ID NO: 61).

Descrição detalhada da invenção

Os RSTs reconhecem partículas microbianas e células do 14 sistema imunológico activas contra a fonte dessas partículas microbianas. (Ver Takeda et al., Annu. Rev. Immunol., 21: 335-76 (2003),). Por exemplo, RST4 e DM-2 têm mostrado que formam um complexo na superfície da célula e a presença de DM-2 parece ser essencial para a capacidade de resposta de RST4 aos diferentes ligandos, incluindo LPS. LPS é um glicolípido da membrana externa de bactérias gram-negativas que é capaz de activar fortemente o sistema imunológico inato. LPS tem sido apontado como um dos principais factores de activação do sistema imunológico durante a inflamação generalizada severa resultante de infecções gram-negativas. (Lakhani et al., Curr. Opin. Pediatr. 15: 278-282 (2003),).

Desde a descoberta dos RSTs de mamíferos na última parte da década de90 (Medzhitov et al, Nature 1997; Rock et al, PNAS 1998), tem sido identificado um grande número de ligandos de activação (revisto em Akira, Nat Immun 2004) . A maioria destes ligandos consiste em moléculas purificadas ou sintéticas conhecidas como MMAPs, derivadas de uma variedade de microrganismos. Estes ligandos demonstram um alto nível de especificidade para RSTs individuais e permitem que o hospedeiro detecte a presença de micróbios patogénicos invasivos para os tecidos. Em geral, estas MMAPs são essenciais para a sobrevivência dos microrganismos e, portanto, não podem ser modificadas para evitar a detecção.

Mais recentemente, verificou-se que uma segunda classe de ligandos derivados de moléculas endógenas é capaz de iniciar a imunidade inata por meio da estimulação da sinalização de RST (revisto em Johnson, Crit. Rev. Immunol 2003). Estes ligandos são geralmente gerados através da degradação de macromoléculas que surgem como resultado de uma inflamação, ruptura celular, activação de cascatas proteolíticas etc e podem ser considerados como o início de "sinais de perigo" em 15 épocas de stresse ou lesão de tecidos. Por exemplo, foram identificados ligandos endógenos para RST2, RST4 e RST9 (Johnson et al., Crit. Rev. Immunol., vol. 23 (1-2) (2003)). A sinalização de RST tem sido estudada com ligandos de RST altamente purificados. Os exemplos apresentados aqui demonstram a utilização de RST elativo de um microrganismo completo durante o inicio da resposta imunitária inata. A E. coli é composta por uma série de MMAPs capazes de estimular a sinalização de RST. Por exemplo, o componente integral da membrana exterior LPS é um estimulante muito forte de RST4. As bactérias gram-negativas também possuem lipoproteinas, conhecidas por estimularem o sistema imunitário especifica-mente por via do RST2., TLR2 (Akira e Takeda, Nat. Rev. Immunol., vol. 4 (7): 499-511 (2004)). Assim, uma bactéria gram-negativa inteira pode ser capaz de iniciar uma resposta imune através de dois RSTs em paralelo. O modelo utilizado nos estudos descritos nos exemplos dados neste documento exige a administração da bactéria gram-negativa E.coli, inactivada pelo calor em sangue humano completo. A produção de IL-6 foi monitorizada como uma leitura da resposta imunitária induzida pela E. Coli inactivada pelo calor. Utilizou-se AcMs de bloqueio contra RST4, RST2 e CD14 na tentativa de determinar a contribuição de cada uma dessas proteínas para a reacção imunológica resultante. Observou-se uma inibição parcial da IL-6 com um tratamento com cxRST4, ao passo que o tratamento com aRST2 não afectou os niveis de citocinas. Estes resultados indicam que os ligandos de RST4 (por exemplo, LPS) são os principais promotores da resposta imunitária. No entanto, um co-tratamento com AcMs de RST4 e RST2 reduziu significativamente os niveis de IL-6 em todos os dadores (n = 3) para um nivel bem abaixo dos niveis detectados apenas com o AcM de RST4. 16

Estes dados indicam que os ligandos do RST2 desempenha um papel na iniciação da resposta imunitária, embora não sejam predominantes. Os AcMs de aCD têm uma actividade de neutralização maior do que os AcMs de RST4 e RST2 isoladamente, devido ao facto de CD14 ser um co-receptor para ambos os ligandos de RST4 e RST2 (figura 2, figura 5) . Observou-se uma inibição maior quando os AcMs de CD14 foram co-administrados quer com RST4 quer com RST2 ou com ambos. Isto indica que os ligandos de RST2 e RST4 na E. coli podem induzir a sinalização do receptor através de um mecanismo independente de CD14.

As utilizações em medicina aqui descritas têm muitas aplicações. Por exemplo, as utilizações em medicina aqui descritas são utilizadas para atingir RSTs no contexto de doenças inflamatórias agudas, tais como septicémia e em doenças inflamatórias crónicas tais como distúrbio inflamatória intestinal (DII), artrite reumatóide, esclerose múltipla e aterosclerose (0' Neill, Curr. Op. Pharmacology, vol. 3: 396-403 (2003)). As utilizações em medicina aqui descritas atingem vários RSTs ou as suas proteínas acessórias em paralelo, ao contrário das monoterapias. Por exemplo, a inflamação sistémica resultante de infecções causadas por bactérias gram-negativas tem sido implicada no início da septicémia e do choque séptico. A abordagem terapêutica com o objectivo de reduzir a inflamação, recorrendo aos usos médicos aqui descritos, atinge mais do que um RST ou as proteínas relacionadas. Além disso, as utilizações em medicina aqui descritas são utilizadas nos DII, em que a flora polimicrobiana desempenha um papel importante no surgimento da doença, para atingir mais do que um RST ou proteínas relacionadas, em vez de um RST individual ou proteínas relacionadas. As utilizações em medicina aqui descritas podem também ser utilizadas para atingir RST2 e 17 RST4 simultaneamente em doenças em que os produtos de degradação macromolecular ou os ligandos endógenos potencialmente exacerbam a inflamação (osteoartrose e artrite reumatóide são hipotéticas indicações para isto), providenciando uma vantagem em relação à utilização do RST isolado.

De acordo com isto, atingir mais do que um RST ou proteínas relacionadas é uma estratégia terapêutica potencial no tratamento de distúrbios tais como, por exemplo, inflamação sistémica aguda e septicémia induzida por infecções causadas por bactérias gram-negativas. Uehori, J. et al, Infection and Immunity, páginas 4238 a 4249 (2003) descreve como é que o bloqueio simultâneo dos receptores 2 e 4 semelhantes a Toll, por meio dos anticorpos, suprime a activação de células dendríticas mielóides induzida pelo peptidoglicano de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG). A combinação dos dois anticorpos providencia um pequeno efeito aditivo em relação ao uso dos anticorpos isoladamente.

Definições:

Salvo indicação em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são normalmente entendidos pelos especialistas na matéria. Além disso, salvo disposição em contrário exigida pelo contexto, os termos singulares incluem os plurais e os termos no plural incluem o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão e as técnicas da cultura de células e de tecidos, biologia molecular e química e hibridação das proteínas e dos oligo-ou polinucleótidos descritas neste documento são bem conhecidas e usadas normalmente nesta técnica. Utilizam-se 18 técnicas normalizadas para o ADN recombinante, sintese de oligonucleótidos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação lipofilica). As reacções enzimáticas e as técnicas de purificação realizam-se de acordo com as especificações do fabricante ou como é normalmente realizado na técnica ou como aqui descrito. As técnicas e procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com os processos convencionais conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas ao longo da presente memória descritiva.

Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ) . As nomenclaturas utilizadas relativamente aos procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica de síntese e química médica e farmacêutica descritas neste documento são as que são bem conhecidos e usados normalmente na técnica. Utilizam-se técnicas normalizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparações farmacêuticas, formulação e distribuição e tratamento dos pacientes.

De acordo com a presente memória descritiva, os termos que se seguem, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções activas, sob o ponto de vista imunológico, de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação do antigénio que se liga especificamente (imunorreage) com um antigénio. Por "ligam-se especificamente" ou "imunorreage com" ou "liga-se imunoespecificalmente" significa que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigénicos do antigénio desejado e não reage com outros polipéptidos ou liga-se com uma afinidade 19 muito menor (¾ > 10 . Anticorpos incluem, mas não se limitam a anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico, Acd (anticorpo de dominio) , cadeia única, fragmentos Fac, Fac· e F(Ac') 2r scFvs e uma biblioteca de expressão de Fac. A unidade estrutural básica do anticorpo é conhecida por incluir um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "cadeia" pesada (cerca de 50-70 kDa) . A porção do terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, principais responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção do terminal carboxilo de cada cadeia define uma região constante principal responsável pela função efectora. Em geral, as moléculas de anticorpos obtidas de seres humanos estão relacionadas com uma qualquer das classes IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem entre si pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Algumas classes têm sub-classes, tal como IgGi, IgG2 e outras. Além disso, nos seres humanos, a cadeia leve pode ser uma cadeia kapa ou uma cadeia lambda. O "anticorpo monoclonal" (AcM) ou "composição de anticorpos monoclonais", como utilizado aqui, refere-se a uma população de moléculas de anticorpos que contêm apenas uma espécie molecular da molécula de anticorpo que consiste num produto único gene de cadeia leve e um produto único de gene da cadeia pesada. Em particular, as regiões de determinação de complementaridade (RDCs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. Os AcMs contêm um sitio de ligação do antigénio capaz de imunorreagir com um epitopo especifico do antigénio caracterizado por uma afinidade de ligação única para ele. 20 A expressão "sítio de ligação do antigénio" ou "porção de ligação" refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação do antigénio. 0 sítio de ligação do antigénio é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis ("V") das cadeias pesada ("P") e leve ("L") . Três trechos muito divergentes no interior das regiões V das cadeias pesadas e leves, referidas como " regiões hipervariáveis" interpõem-se entre os trechos mais conservados de flanqueio conhecidos como "regiões-quadro ", ou "RQs". Assim, o termo "RQ" refere-se a sequências de aminoácidos que se encontram naturalmente entre e adjacentes às regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Numa molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão localizadas umas em relação às outras no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação do antigénio. A superfície de ligação ao antigénio é complementar à superfície tridimensional de um antigénio ligado e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidos como "regiões de determinação de complementaridade" ou "RDCs." A atribuição dos aminoácidos a cada domínio está em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).

Tal como se utiliza aqui, o termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina, um scFv ou um receptor de célula T. O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou a um receptor de células T. Os determinantes de epítopo consistem geralmente em grupos de 21 moléculas de superfície quimicamente activas tal como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, geralmente, tem três características estruturais tridimensionais específicas, assim características específicas de carga. Por exemplo, os anticorpos podem competir contra péptidos de terminal ou de terminal C de um polipéptido. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando a constante de dissociação é ^ 1 μΜ, de preferência ^ 100 nM e o mais preferencial < 10 nM.

Tal como se utilizam aqui, as expressões "ligação imunológica" e "propriedades da ligação imunológica" referem-se as interacções não covalentes do tipo das que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antigénio para o qual a imunoglobulina é específica. A força ou a afinidade das interacções de ligação imunológica podem ser expressas em termos da constante de dissociação (Kd) da interacção em que um K d menor representa uma maior afinidade. As propriedades da ligação imunológica dos polipéptido seleccionados podem ser quantificadas através de processos bem conhecidos na técnica. Esses processos implicam a medição das taxas de formação e de dissociação do complexo de sítio de ligação do antigénio/antigénio, em que essas taxas dependem da concentração dos parceiros do complexo, da afinidade da interacção e dos parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa em ambos os sentidos. Assim, tanto a "constante de associação"(Kon) como a "constante de dissociação" (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e das taxas reais de associação e de dissociação. (Ver Nature 361: 186-87 (1993)). A relação entre K0ff/K0n permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados com a afinidade e é igual à constante de dissociação K^. (Ver, em geral, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Diz-se que um anticorpo da 22 presente invenção se liga especificamente ao complexo de receptor semelhante a Toll 4 (RST4)/DM-2 ou com RST4 quando não está complexado com DM-2, quando a constante de ligação de equilíbrio (Kd) é ^ 1 μΜ, de preferência h 100 nM, mais preferencialmente < 10 nM e o mais preferível h 100 pM a cerca de 1 pM, medida por ensaios tal como ensaios de ligação de radioligandos ou ensaios semelhantes conhecido dos especialistas na matéria. A expressão "polinucleótido isolado", usado aqui, deve significar um polinucleótido genómico, ADNc ou de origem sintética ou alguma combinação destes que, em virtude da sua origem, o "polinucleótido isolado" (1) não está associado nem à totalidade nem a uma parte de um polinucleótido em que "polinucleótido isolado" se encontra na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleótido que não está ligada na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. Os polinucleótidos de acordo com a presente invenção incluem as moléculas de ácido nucleico codificando as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada apresentadas nas SEQ ID NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47 e 48 e as moléculas de ácidos nucleicos que codificam as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve representadas nas SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 43, 44, 46 e 53. A expressão "proteina isolada" referida aqui significa uma proteina de ADNc, ARN recombinante ou de origem sintética ou algum tipo de combinação que, por força da sua origem ou da fonte de derivação, a "proteina isolada" (1) não está associada a proteínas encontradas na natureza, (2) está isenta de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, isenta de proteínas marinhas (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. 23 0 termo "polipéptido" é usado aqui como um termo genérico para referir a proteina nativa, fragmentos ou análogos de uma sequência polipeptidica. Assim, fragmentos de proteínas nativa e os seus análogos são espécies do género polipéptido. Os polipéptidos, de acordo com a presente invençã, compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada representadas nas SEQ ID NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47 e 48 e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve representadas nas SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 43, 44, 46 e 49, bem como moléculas de anticorpos formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tal como moléculas de imunoglobulinas kapa de cadeia leve e vice-versa, bem como os seus fragmentos e análogos. 0 termo "de ocorrência natural", tal como usado aqui, aplicado a um objecto refere-se ao facto de um objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptido ou de polinucleótido que está presente num organismo (inclusive num vírus) que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente alterada pelo homem no laboratório ou de alguma forma é de ocorrência natural. 0 termo "ligado operacionalmente" tal como utilizado aqui refere-se às posições dos componentes descritos que estão numa relação que lhes permite funcionarem na forma pretendida. Uma sequência de controlo "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação está ligada de modo a que a expressão da sequência de codificação é realizada em condições compatíveis com as sequências de controlo. A expressão "sequência de controlo", tal como utilizada 24 aqui refere-se a sequências de polinucleótidos que são necessários para efectuar a expressão e a transformação das sequências de codificação a que estão ligadas. A natureza dessas sequências de controlo difere consoante o organismo hospedeiro em procariotos, essas sequências de controlo geralmente incluem promotor, sitio de ligação ribossómico e a sequência de terminação da transcrição em eucariotos, em geral, essas sequências de controlo incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. A expressão "sequências de controlo" é entendida como incluindo, no minimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e a transformação e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências, lider e sequências parceiras da fusão. 0 termo "polinucleótido" tal como se refere aqui significa um boro polimérico de nucleótidos com pelo menos 10 bases de comprimento, quer sob a forma de ribonucleótidos ou desoxinucleótidos ou uma versão modificada de qualquer tipo de nucleótidos. O termo inclui formas de ADN de hélice simples e dupla. O termo oligonucleótido referido aqui inclui nucleótidos de ocorrência natura e nucleótidos modificados ligados entre si por ligações de oligonucleótidos de ocorrência natural, e de ocorrência não natural. Oligonucleótidos são um subconjunto de polinucleótidos geralmente composto por 200 bases de comprimento ou menos. Preferencialmente, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases de comprimento e, mais preferencialmente, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são geralmente de hélice única, por exemplo, para sondas, embora os oligonucleótidos possam ser de hélice dupla, por exemplo, para utilização na preparação de um gene mutante. Os oligonucleótidos da presente invenção são oligonucleótidos 25 paralelos ou anti-paralelos. A expressão "nucleótidos de ocorrência natural" aqui referida inclui desoxiribonucleótidos e ribonucleótidos. A expressão "nucleótidos modificados" aqui referida inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. A expressão "ligações de oligonucleótidos", aqui referida, inclui ligações de oligonucleótidos tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fósforo-diselenoato, fosforoaniltioato, fosforaniladato, fosforono-amidato e similares. Ver, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem.

Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16 :3209 (1988), Zon et al. Anti Câncer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University

Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patente U.S. No. 5.151.510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Um oligonucleótido pode incluir um marcador para detecção, se desejado. A expressão "híbrida selectivamente", referida aqui, significa uma ligação detectável e específica. Os polinucleótidos, oligonucleótidos e os seus fragmentos, de acordo com a presente invenção, híbrida selectivamente com as hélices de ácido nucleico em condições de hibridação e de lavagem que minimizem quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Podem utilizar-se condições de grande severidade para atingir as condições de hibridação selectiva como é conhecido na técnica e discutido aqui. Geralmente, a homologia das sequências de ácidos nucleicos entre os polinucleótidos, oligonucleótidos e fragmentos da presente invenção e uma sequência de ácidos nucleicos de interesse será pelo menos de 80 % e, mais 26 normalmente, com homologia preferenciais crescentes de pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e 100 %. Duas sequências de aminoácidos são homólogas se existir uma identidade total ou parcial entre as sequências. Por exemplo, uma homologia de 85 % significa que 85 % dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências estão alinhadas para um emparelhamento máximo. São permitidos intervalos (em qualquer uma das duas sequências que estão a ser emparelhadas) na maximização dos comprimentos preferidos dos intervalos que se emparelham de 5 ou menos, sendo mais preferidos os intervalos de 2 ou menos. Alternativamente e de preferência, duas sequências de proteínas (ou sequências polipeptidicas delas derivadas de pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, tal como este termo é usado aqui, se tiverem uma pontuação de alinhamento de mais de 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz dos dados da mutação e de uma penalização do intervalo 6 ou mais. Ver Dayhoff, M.O., em Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e suplemento 2 a este volume, pp. 1-10. As duas sequências ou partes delas são mais preferencialmente homólogas se os seus aminoácidos são 50 % ou mais idênticos quando alinhados de forma optimizada usando o programa ALIGN. O termo "corresponde a" é usado aqui para significar que uma sequência de polinucleótido é homóloga (isto é, é idêntica, não estritamente relacionada de forma evolutiva) a todo ou a parte de uma sequência polinucleótidos de referência ou que uma sequência polipeptídica é idêntica a uma sequência de polipéptidos de referência. Em contraposição, o termo "complementar" é usado aqui para significar que a sequência complementar é homóloga da totalidade ou de parte de uma sequência de polinucleótido de referência. A titulo de ilustração, a sequência de nucleótidos "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar a uma 27 sequência de referência "GTATA".

Os termos que se seguem são usados para descrever as relações das sequências entre duas ou mais sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade da sequência", "percentagem de identidade da sequência" e "identidade substancial". A "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para a comparação de sequências de uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um ADNc completo ou sequência do gene dada numa lista de sequências ou pode incluir um ADNc completo ou uma sequência de genes. Geralmente, uma sequência de referência tem de pelo menos 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos de comprimento e, muitas vezes, pelo menos 48 nucleótidos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos podem cada uma (1) compreender uma sequência (isto é, uma parte da sequência completa de polinucleótidos ou de aminoácidos) que é semelhante entre as duas moléculas e (2) pode ainda incluir uma sequência que é divergente entre as duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos, as comparações das sequências entre duas (ou mais) moléculas são normalmente realizados por comparação das sequências das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequências. Uma "janela de comparação", tal como utilizada aqui, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 18 nucleótidos contíguos, posições ou 6 aminoácidos em que uma sequência polinucleótidos ou uma sequência de aminoácidos podem ser comparadas com uma sequência de referência de pelo menos 18 nucleótidos contíguos ou 6 aminoácidos e nas quais a parte da sequência 28 de polinucleótido na janela de comparação pode incluir acréscimos, supressões, substituições e similares (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, em comparação com a sequência de referência (que não inclui acréscimos nem supressões) para o alinhamento ideal das duas sequências. O alinhamento óptimo das sequências para o alinhamento de uma janela de comparação pode ser realizado através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman. Appl. Math. 2: 482 (1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa por um método de semelhança de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. (E.U.A.) 85: 2444 (1988), por implementações informatizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package versão 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), Geneworks, ou pacotes de programas MacVector) ou por inspecção e selecciona-se o melhor alinhamento (isto é, aquele que resulta percentagem mais elevada de homologia na janela de comparação) gerado por diferentes processos. A expressão "identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleótido ou de aminoácidos são idênticas (isto é, numa base de nucleótido por nucleótido ou residuo por residuo) sobre a janela de comparação. A expressão "percentagem de identidade da sequência" é calculada pela comparação de duas sequências alinhadas de forma optimizada na janela de comparação, determinando o número de posições em que as bases de ácidos nucleicos (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou de residuos idênticos ocorrem em ambas as sequências para determinar o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para se obter a 29 percentagem de identidade das sequências. A expressão "identidade substancial", tal como usada aqui denota uma caracteristica de uma sequência de polinucleótidos ou de uma sequência de aminoácidos, em que o polinucleótido ou o aminoácido compreende uma sequência que tenha pelo menos 85 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência, mais geralmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência, comparada com uma sequência de referência numa janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleótidos (6 aminoácidos), muitas vezes numa janela de pelo menos 24-48 posições de nucleótidos (8-16 aminoácidos) , em que a percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação da sequência de referência com a sequência que pode incluir supressões ou adições que totalizem 20 por cento ou menos da sequência de referência em relação à janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior.

Tal como se utilizam aqui, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a edição, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Os estereoisómeros (por exemplo, os D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tal como aminoácidos dissubstituidos em duas posições a, N-alquil-minoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para os polipéptidos de presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxi-glutamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxil-lisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4- 30 hidroxiprolina). Na notação dos polipéptidos aqui utilizada, a direcção do lado esquerdo é a direcção do terminal amino e a direcção do lado direito é a direcção do terminal carboxilo, de acordo com o padrão de utilização e as convenções.

Do mesmo modo, salvo indicação em contrário, a extremidade do lado esquerdo das sequências de polinucleótido de hélice simples é a extremidade 5' e a direcção para o lado esquerdo das sequências de polinucleótido de hélice dupla é referida como a direcção 5' . A adição de transcritos de ARN nascente na direcção de 5' para 3' , é referida como regiões das sequências na direcção da transcrição nas hélices de ADN que têm a mesma sequência do ARN e que são de 5' para a extremidade 5' do transcrito de ARN referidas como " sequências a montante", regiões da sequência na hélice do ADN com a mesma sequência do ARN e que são de 3' para a extremidade 3' do transcrito de ARN são referidos como "sequências a jusante".

Quando aplicada a polipéptidos, a expressão "identidade substancial" significa que duas sequências de péptidos, quando alinhadas de forma optimizada, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos sem os intervalos, partilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência e o que é mais preferencial pelo menos 99 por cento de identidade de sequência.

Preferencialmente, as posições dos residuos que não são idênticos diferem entre si por substituições conservadoras de aminoácidos. 31

As substituições conservadoras de aminoácidos referem-se à intermutabilidade de residuos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas de hidroxilo é p de serina e treonina, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida é o de asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas é o de fenilalanina, tirosina e triptofano, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas é o de lisina arginina e histidina e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre tendo é o de cisteina e metionina. Grupos com substituições conservadoras de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Como foi discutido aqui, pequenas variações nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou de moléculas de imunoglobulina estão contempladas como estando englobadas na presente invenção, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, 90 %, 95 % e o que é mais preferencial 99 %. Em particular, contemplam-se as substituições conservadoras de aminoácidos. As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma familia de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados estão geralmente divididos em familias: (1) os aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato; (2) os aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina; (3) os aminoácidos não polares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) os aminoácidos polares não carregados são glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. 32

Os aminoácidos hidrofílicos incluem arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina e treonina. Os aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, cisteina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Outras familias de aminoácidos incluem (i) serina e treonina, que são a família de hidroxi-alifáticos, (ii) asparagina e glutamina, que são a família contendo amida, (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que são a família alifática e (iv) fenilalanina, triptofano e tirosina, que são a família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou uma valina, um aspartato um com um glutamato, uma treonina com uma serina ou uma substituição similar de um aminoácido com um ácido amino estruturalmente relacionado não terá um grande efeito na ligação ou nas propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um sítio da estrutura. Se uma alteração do aminoácidos resulta num péptido funcional, pode ser facilmente determinado analisando a actividade específica do derivado de polipéptido. Os ensaios estão descritos em detalhe a seguir. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados por especialistas nesta técnica. Fragmentos com terminal amino ou carboxilo preferidos ou análogos ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados das sequência de nucleótidos e/ou de aminoácidos com de bases de dados de sequências públicas ou privadas. Preferencialmente, os processos de comparação computadorizados são usados para identificar os elementos da sequência ou os domínios da conformação de proteínas previstos e que ocorrem noutras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. Os processos para identificar as sequências de proteínas que se 33 dobram numa estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Assim, os exemplos anteriores demonstram que os especialistas nesta técnica são capazes de reconhecer os elementos da sequência e as conformações estruturais que podem ser usados para definir os domínios estruturais e funcionais, de acordo com a presente invenção.

As substituições preferidas de aminoácidos são aquelas em que: (1) reduzir a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzir a susceptibilidade à oxidação, (3) alterar a afinidade de ligação para a formação de complexos de proteína, (4) alterar as afinidades de ligação e (4) conferir ou modificar outras propriedades físico-químicas ou funcionais desses análogos. Os análogos podem incluir vários muteínas de uma sequência diferente da sequência de péptido que ocorre naturalmente. Por exemplo, pode-se fazer uma ou várias substituições de aminoácidos (de preferência substituições conservadoras de aminoácidos) na sequência de ocorrência natural (de preferência na parte do polipéptido fora do domínio (s) que formam os contactos intermoleculares. A substituição conservador do aminoácido não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência parental (por exemplo, a substituição de aminoácidos não tende a quebrar uma hélice que ocorre na sequência parental ou perturbar outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência parental). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipéptidos de técnica reconhecida estão descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J: Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et at. Nature 354: 105 (1991). 34 A expressão "fragmento de polipéptido", tal como aqui utilizado, refere-se a um polipéptido que possui uma eliminação do terminal amino e/ou de um terminal carboxilo, mas em que a sequência de aminoácidos remanescente é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural, deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de ADN de comprimento completo. Os fragmentos normalmente são pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geralmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento e ainda mais preferencialmente pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo", tal como utilizado aqui, refere-se a polipéptidos que são compostos por um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que têm uma identidade substancial com uma parte de uma sequência de aminoácidos deduzida e que têm uma ligação especifica ao complexo de RST4/DM2 ou RST4 sozinho, em condições de ligação apropriadas. Normalmente, os análogos de polipéptidos compreendem uma substituição conservadora do aminoácido (ou uma adição ou uma supressão) no que diz respeito à sequência de ocorrência natural. Os análogos normalmente têm pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 50 aminoácidos de comprimento ou mais e muitas vezes podem ser tão longos como um polipéptido de comprimento completo de ocorrência natural.

Os análogos de péptidos são normalmente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas às da matriz do péptido. Estes tipos de compostos não peptidicos são denominados "péptidos miméticos" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986), Veber e Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Esses compostos são muitas vezes desenvolvidos com o auxilio de modelos moleculares 35 informatizados. Os péptidos miméticos que são estruturalmente semelhantes aos péptidos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito equivalente terapêutico ou profiláctico. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido paradigmático (isto é, um polipéptido que tem uma propriedade bioquimica ou uma actividade farmacológica), tais como anticorpos humanos, mas têm uma ou mais ligações peptidicas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada no grupo constituído por: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=GH- (cis e trans), -CO-CH2-, CH(0H)CH2_ e -CH2SO-, através de processos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em vez de L-lisina) pode ser usada para gerar péptidos mais estáveis. Além disso, os péptidos dependentes que compreendem uma sequência de consenso ou uma variação da sequência consenso praticamente idêntica podem ser gerados por processos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch. Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)); por exemplo, pela adição de residuos internos de cisteina capazes de formarem pontes de dissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. 0 termo "agente" é usado aqui para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito a partir de materiais biológicos.

Tal como se utiliza aqui, os termos "marcador" ou "marcado" referem-se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, à incorporação de um aminoácido marcado com rádio ou à ligação, a um polipéptido, de partes de biotinilo que podem ser detectadas pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador 36 fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada através de processos ópticos ou calorimétricos). Em determinadas situações, o marcador também pode ser terapêutico. Podem utilizar-se vários processos de marcação de polipéptidos e de glicoproteinas que são conhecidos na técnica. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não se limitam aos seguintes: radioisótopos ou radionuclideos (por exemplo, 3h, 14çf 15n, 35s, 90γ^ 99tc, Hlln, 125j/ 131j) r marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanido, fósforo), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos de biotinilo, epítopos de polipéptido pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de fechos de leucina, sitios de ligação para anticorpos secundários, os domínios de ligação ao metal, marcadores de epítopos). Nalguns enquadramentos, os marcadores estão ligados por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir a potencial charneira estérica. A expressão "agente farmacêutico ou fármaco", tal como utilizada aqui, refere-se a um composto químico ou a uma composição química capazes de induzirem um efeito terapêutico desejado quando administrados correctamente a um paciente.

Outros termos químicos são utilizados aqui de acordo com as utilizações tradicionais da técnica, como exemplificado pelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Tal como se utiliza aqui, "substancialmente pura" significa uma espécie de objecto que é a espécie predominante presente (ou seja, numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, de preferência, uma fracção substancialmente purificada é uma 37 composição em que as espécies objecto compreendem pelo menos cerca de 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.

Geralmente, uma composição praticamente pura incluirá mais de cerca de 80 por cento de todas as espécies de macromoléculas presentes na composição, mais preferencialmente mais do que cerca de 85 %, 90 %, 95 % e 99 %. O mais preferencial é que as espécies objecto sejam purificadas até a uma homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por meio dos processos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em espécies macromoleculares únicas. O termo "paciente" inclui seres humanos e veterinários.

Anticorpos

Os anticorpos monoclonais da presente invenção (por exemplo, anticorpos monoclonais de murino ou humanizados) têm a capacidade de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias induzida por LPS. A inibição é determinada, por exemplo, no sangue humano completo e nos ensaios de células HEK 293 transfectadas com RST4hu/DM2 aqui descritos. Exemplos de anticorpos monoclonais incluem, por exemplo, os anticorpos aqui referidos como anticorpo monoclonal de murino 18H10 ("18H10mu"), o anticorpo monoclonal humano 18H10 ("18H10hu"), o anticorpo monoclonal de murino 16G7 ("16G7mu"), anticorpo monoclonal de murino 15C1 ("15Clmu"), o anticorpo monoclonal humano 15C1 ("15Clhu"), anticorpo monoclonal de murino 7E3 ("7E3mu") e o anticorpo monoclonal humano 7E3 ("7E3hu"). Os anticorpos 18H10mu e 18H10hu reconhecem o complexo de RST4/DM-2, mas não reconhecem uma proteína DM-2, quando a proteína não está complexado com RST4. Os anticorpos 38 monoclonais 16G7mu, 15Clmu, 15Clhu, 7E3mu e 7E3hu reconhecem o complexo de RST4/DM-2. 15Clmu, 15Clhu e 16G7 também reconhecem RST4 quando não está complexado com DM-2. Outros exemplos de anticorpos incluem anticorpos monoclonais que reconhecem RST2, DM-2 ou CD14, tal como o anticorpo monoclonal anti-CD14 conhecidos como "28C5" e o anticorpo monoclonal anti-RST2 conhecido como"T2.5".

Também estão incluídos na presente invenção os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos aqui descritos. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção ligam-se imunoespecificamente a um complexo de RST4/DM-2, em que o anticorpo se liga a um epítopo que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos no RST4 humano entre os resíduos 289 e 375 da SEQ ID NO: 61. Os anticorpos da presente invenção ligam-se imunoespecificamente a um complexo de RST4/DM2, em que o anticorpo se liga a um epítopo na MD-2 humana, entre os resíduos 19 e 57 de SEQ ID NO: 60. Para os anticorpos que se ligam a RST2, o anticorpo ou uma porção de um anticorpo polivalente liga-se a um epítopo na porção do terminal C do domínio extracelular de RST2 (isto é, RST2ECD).

Os especialistas na matéria reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação desnecessária, se um anticorpo monoclonal (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino ou humanizado) tem a mesma especificidade que um anticorpo monoclonal aqui descrito (por exemplo, 18H10mu, 18H10hu, 16G7mu, 15Clmu, 15Clhu, 7E3mu, 7E3hu, 28C5 e/ou T2.5) determinandose o primeiro impede a ligação do último ao anticorpo-alvo, por exemplo, o complexo de RST4/DM-2, RST4 quando não complexado com DM-2, DM-2, quando complexado com RST4, DM-2, quando não complexado com RST4, RST2 e CD14. Se o anticorpo monoclonal que está a ser ensaiado concorre com o anticorpo monoclonal da presente invenção, como se mostra por 39 uma diminuição da ligação pelo anticorpo monoclonal da presente invenção, então os dois anticorpos monoclonais ligam-se ao mesmo ou a um epitopo intimamente relacionado. Um método alternativo para determinar se um anticorpo monoclonal tem a especificidade do anticorpo monoclonal da presente invenção consiste em pré-incubar o anticorpo monoclonal da presente invenção com o complexo de RST4/DM-2 ou uma proteína de RST4 solúvel (com a qual normalmente é reactiva) e, em seguida, adicionar o anticorpo monoclonal que está a ser ensaiado para determinar se o anticorpo monoclonal a ser ensaiado é inibido na sua capacidade de se ligar ao alvo, por exemplo, o complexo de RST4/DM-2, RST4, DM-2, RST2 ou CD14. Se o anticorpo monoclonal a ser ensaiado é inibido, então, com toda a probabilidade, tem a mesmo especificidade epitópica ou uma funcionalidade equivalente à do anticorpo monoclonal da presente invenção. A triagem de anticorpos monoclonais da presente invenção também pode ser realizada através da medição da produção de IL-8 induzida por LPS e a determinação se o anticorpo monoclonal do ensaio é capaz de neutralizar a produção de IL-8 induzida por LPS. A triagem pode também ser realizada através da medição da produção de IL-6 induzida por PAM3CSK4 e a determinação se o se o anticorpo monoclonal do ensaio é capaz de neutralizar a produção de IL-6 induzida por PAM3CSK4. Vários procedimentos conhecido na técnica podem ser utilizados para a produção de anticorpos policlonais ou monoclonais dirigidos contra o complexo RST4/DM-2, RST4 quando não complexado com DM-2, DM-2, RST2 ou CD 14 ou contra os seus derivados, fragmentos, análogos ou homólogos ou ortólogos. (Ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E e Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). 40

Os anticorpos são purificados por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade usando proteína A ou proteína G, que providencia principalmente a fracção IgG de soro imune. Posteriormente ou alternativamente, o antigénio específico que é o alvo da imunoglobulina visada ou um seu epítopo, pode ser imobilizado numa coluna para purificar o anticorpo imunitário específico por cromatografia de imunoafinidade. A purificação das imunoglobulinas é discutida, por exemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado pelo The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (17 de Abril 17 de 2000), pp. 25-28).

Os anticorpos da presente invenção (por exemplo, 18Hl0hu, 16G7, 15Clhu e 7E3hu) são anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais que neutralizam a sinalização de LPS que é mediada pelo complexo de RST4/DM-2 são gerados, por exemplo, por imunização de murganhos BALB/c com combinações de transfectantes celulares expressando níveis elevados de RST4 e DM-2 na sua superfície e uma proteína recombinante solúvel quimérica compreendendo tanto RST4 como DM-2 presas por uma sequência ligante flexível. Os hibridomas resultantes das fusões de mieloma/células B são então rastreados para a reactividade para este complexo de RST4/DM-2.

Os anticorpos monoclonais são preparados, por exemplo, utilizando processos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Num método de hibridomas, normalmente imuniza-se um murganho, hamster, ou outro animal hospedeiro adequado, com um agente imunizante para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente de imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 41 0 agente de imunização incluirá normalmente o antigénio da proteína, um seu fragmento ou uma sua proteína de fusão. Geralmente, tanto se utilizam os linfócitos do sangue periférico se se desejam células de origem humana ou células do baço ou células de nódulos linfáticos se se desejam fontes de mamíferos não humanos. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada através de um agente de fusão apropriado, tal como o polietileno-glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). As linhas de células imortalizadas são geralmente em células de mamíferos transformadas, especialmente células de mieloma de roedor, de origem bovina e de origem humana. Normalmente, utilizam-se linhas de células de mieloma de ratos ou de murganhos. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado, que contém, de preferência, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células fundidas imortalizadas. Por exemplo, se as células parentais têm falta da enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas normalmente inclui hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que impedem o crescimento das células a que falta HGPRT.

As linhas de células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem de forma eficiente, suportam um elevado nível de expressão estável do anticorpo por meio das células seleccionadas que produzem anticorpos e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. As linhas celulares imortalizadas mais preferidas são as linhas de mieloma de murino, que se podem obter, por exemplo, do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e a American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. As linhas de células de mieloma humano e heteromieloma de murganho-humano também 42 já foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais. (Ver Kozbor, J. Immunol. , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode então ser ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferencialmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) e ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980) . Além disso, em aplicações terapêuticas dos anticorpos monoclonais é importante identificar anticorpos com um elevado grau de especificidade e uma elevada afinidade de ligação para o antigénio alvo.

Depois se terem identificado as células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e fazendo-os crescer por meio de processos normalizados. (Ver Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103) . Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco's e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridomas podem crescer in vivo como ascites num mamífero.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou dos fluidos das ascites por processos convencionais de 43 purificação das imunoglobulinas, tal como, por exemplo, a proteína A-sefarose, cromatografia com hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por processos de ADN recombinante, tal como nos descritos na patente U.S. No. 4.816.567. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais da presente invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado através de processos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleótidos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murinos). As células de hibridoma da presente invenção servem como fonte preferencial desse ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão que são então transfectados em células hospedeiras, tais como células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (OHC) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem a proteína da imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. 0 ADN também pode também ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para os domínios constantes humanos de cadeia leve e pesada em lugar das sequências homólogas de murino (ver a patente U.S. No. 4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) ou juntando, covalentemente, à sequência de codificação da imunoglobulina, a totalidade ou parte da sequência que codifica para um polipéptido que não seja imunoglobulina. Tais polipéptidos que não são imunoglobulina podem ser substituídos por domínios constantes de um anticorpo da presente invenção ou podem ser substituídos por domínios variáveis de um sítio de combinação de um antigénio de um anticorpo da presente invenção para criar um anticorpo quimérico bivalente. 44

Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Estes anticorpos são adequados para administração a seres humanos sem provocarem uma resposta imunitária por parte do ser humano contra a imunoglobulina administrada. As formas humanizadas de anticorpos são imunoglobulinas quiméricas, as suas cadeias de imunoglobulina ou os seus fragmentos (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antigénios dos anticorpos) que são principalmente compostas pela sequência de uma imunoglobulina humana e contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. A humanização é realizada, por exemplo, seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 2 3 9:1534-1536 (1988)), substituindo as RDCs de roedor ou as sequências RDC pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. (Ver também a patente U.S. No. 5.225.539.) Nalguns casos, os resíduos da estrutura de Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não-humanos. Os anticorpos humanizados também compreendem, por exemplo, resíduos que não são se encontram nem no anticorpo receptor nem na RDC importada ou sequências da estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado inclui praticamente todos de pelo menos um e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou quase todas as regiões RDC correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou praticamente todas as regiões da estrutura são os de uma sequência de consenso de uma imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também inclui, de uma forma optimizada, pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, normalmente de uma imunoglobulina humana (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)). 45

Os anticorpos totalmente humanos são moléculas de anticorpos em que toda a sequência tanto de cadeias leves como de cadeias pesadas, incluindo as RDCs surgem a partir de genes humanos. Esses anticorpos são designados aqui por "anticorpos humanos" ou"anticorpos completamente humanos. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por meio da técnica que utiliza o trioma; a técnica de hibridomas de células B humanas (ver Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); e a técnica de hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais (ver Cole, et al., 1985 em: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Os anticorpos monoclonais podem ser utilizados e podem ser

produzidas através de hibridomas humanos (Ver Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sei USA 80: 2026-2030) ou pela transformação de células B humanas com o virus de Epstein Barr in vitro (ver Cole, et al., 1985 em: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77- 96) .

Além disso, os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando técnicas adicionais, incluindo as bibliotecas de exibição de fagos. (Ver Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581

Do mesmo modo, os anticorpos humanos podem ser preparados através de introdução de locais de imunoglobulina humana em animais transgénicos, por exemplo, murganhos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inactivados. Após um estímulo, observa-se a produção de anticorpos humanos, que se assemelha muito à observada em seres humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo dos genes, a junção e o repertório de anticorpos. Esta abordagem está descrita, por exemplo, nas patentes U.S. 46

Nos. 5.545.807, 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 e em Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotech nology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995) . Os anticorpos humanos podem também ser produzido utilizando animais transgénicos não humanos que são modificados de modo a produzir anticorpos inteiramente humanos em vez de anticorpos endógenos do animal, em resposta ao estímulo causado por um antigénio. (Ver a publicação PCT WO94/02602). Os genes endógenos que codificam as cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas num hospedeiro não humans têm sido incapazes, e os locais activos que codificam as imunoglobulinas humanas de cadeia pesada e leve são inseridos no genoma do hospedeiro. Os genes humanos são incorporados, por exemplo, utilizando cromossomas artificiais de leveduras contendo os segmentos necessários de ADN humano. Obtém-se então um animal que providencia todas as modificações desejadas como descendentes de cruzamentos por intermédio de animais transgénicos contendo menos do que o complemento completo das modificações. Um exemplo de um desses animais não humanos é um murganho denominado Xenomouse” conforme divulgado nas publicações PCT WO 96/33735 e WO 96/34096. Este animal produz células B que segregam imunoglobulinas totalmente humanas. Os anticorpos podem ser obtidos directamente do animal após imunização com um imunogénio de interesse, como por exemplo, a preparação de um anticorpo policlonal ou, alternativamente, a partir de células B imortalizadas derivadas do animal, tal como anticorpos monoclonais que produzem hibridomas. Além disso, os genes que codificam as imunoglobulinas com regiões variáveis humanas podem ser recuperados e expressos para se obter os anticorpos directamente ou podem ainda ser modificados para se obter 47 análogos de anticorpos, tais como, por exemplo, moléculas de Fv (scFv) de cadeia única.

Um exemplo de um método de produção de um hospedeiro nãohumano, exemplificado como um murganho a que falta a expressão de uma cadeia pesada de imunoglobulina endógena está descrito Pode ser obtido através de um processo que inclui a eliminação dos genes do segmento J de pelo menos um locus da cadeia pesada endógena numa célula estaminal embrionária para evitar o rearranjo do locus e para evitar a formação de um transcrito de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina reorganizados, sendo a supressão efectuada por um vector alvo contendo um gene que codifica um marcador seleccionável e produzindo a partir da célula estaminal embrionária um murganho transgénico cujas células somáticas e germinais contêm o gene que codifica o marcador seleccionável.

Um processo para a produção de um anticorpo de interesse, tal como um anticorpo humano, está descrito na patente U.S. Patent No. 5.916.771. Este processo inclui a introdução de um vector de expressão que contém uma sequência de nucleótidos que codifica uma cadeia pesada numa célula hospedeira de mamifero em cultura, a introdução de um vector de expressão contendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma cadeia leve noutra célula hospedeira de mamifero e a fusão das duas células para formar uma célula hibrida. A célula hibrida expressa um anticorpo que contém a cadeia pesada e a cadeia leve.

Num aperfeiçoamento deste procedimento, um processo para identificar um epítopo clinicamente relevante num imunógenio e um processo correlacionado para seleccionar um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao epitopo relevante, com 48 alta afinidade, estão descritos na publicação PCT WO 99/53049. O anticorpo pode ser expresso por um vector contendo um segmento de ADN que codifica o anticorpo de cadeia única descrito antes.

Estes vectores podem incluir lipossomas, ADN nu, ADN assistido por um adjuvante, pistola de gene, catéteres, etc. Os vectores incluem conjugados químicos tais como os descritos na WO 93/64701, que têm uma porção-alvo (por exemplo, um ligando a um receptor da superfície celular) e uma parte de ligação de ácidos nucleicos (por exemplo, polilisina), vectores virais (por exemplo, um vector virai de ADN ou de ARN) , proteínas de fusão, tal como as descritas na PCT/US 95/02140 (WO 95/22618), que é uma proteína de fusão contendo uma porção-alvo (por exemplo, um anticorpo específico para uma célula-alvo) e uma parte de ligação do ácido nucleico (por exemplo, uma protamina), plasmidos, fagos, etc Os vectores podem ser cromossómicos, não cromossómicos ou sintéticos.

Os vectores preferidos incluem vectores virais, proteínas de fusão e conjugados químicos. Os vectores retrovirais incluem os vírus da leucemia murina de Moloney. Os vectores virais de ADN são os preferidos. Estes vectores incluem vectores de varicela, tais como vectores de ortopox ou de varíola aviaria, vectores do vírus do herpes, tais como vectores do vírus do herpes simplex I (vector VHS) (ver Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., em DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sei.: U.S.A. 90: 7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sei USA 87:1149 49 (1990), vectores de adenovírus (ver LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995) e vectores de vírus associados ao adenovírus (ver Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994).

Esses vectores podem ser usados para expressar grandes quantidades de anticorpos que podem ser usados de muitas maneiras. Por exemplo, para detectar a presença do complexo de RST4/DM-2 ou outro alvo, tal como RST4, DM2, RST2 e/ou CD14, numa amostra. Os anticorpos também podem ser usados para tentar ligar e perturbar a sinalização que está relacionada e é mediada ou regulada pelo complexo de RST4/DM2, RST2 e/ou CD14.

Podem-se adaptar técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única específicos para uma proteína antigénica da presente invenção (ver, por exemplo, patente U.S. No. 4.946.778). Além disso, os processos podem ser adaptados para a construção de bibliotecas de expressão de Fac (ver, por exemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir uma identificação rápida e eficaz de fragmentos monoclonais de Fac com a especificidade desejada para uma proteína desejada ou os seus derivados, fragmentos, análogos ou homólogos. Os fragmentos de anticorpos que contêm os idiotipos a um antigénio da proteína pode ser produzida através de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a: (i) um fragmento de F(ac')2 produzido pela digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo; (ii) um fragmento Fac gerado pela redução das pontes de dissulfureto de um fragmento F(aç'>2? (iii) um fragmento Fac gerado pelo tratamento da molécula 50 de anticorpo com papaína e um agente redutor e (iv) fragmentos Fv. A presente invenção também inclui fragmentos do complexo anti-RST2/DM2 Fv, Fac, FaC' e F(aC')2, fragmentos anti-RST4, fragmentos anti-MD2, fragmentos anti-RST2, fragmentos anti-CD14, anticorpos de cadeia única que reconhecem e se ligam ao complexo de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14, anticorpos bi-especificos que reconhecem e se ligam a complexo RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14 e anticorpos heteroconjugados que reconhecem e se ligam ao complexo RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14.

Anticorpos bi-especificos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos, dois antigénios diferentes. No caso em apreço, uma das especificidades de ligação é para o complexo RST4/DM2, RST4, DM-2, RST2 ou CD14. 0 segundo alvo de ligação é qualquer outro antigénio e vantajosamente é uma proteína da superfície celular ou um receptor ou subunidade do receptor.

Os processos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada/cadeia leve, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido à variedade aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas diferentes de anticorpos, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta geralmente é realizada por etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos semelhantes estão divulgados na 51 WO 93/08829, publicada em 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antigénio-anticorpo) podem ser fundidos com as sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina de compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CPI), contendo o sítio necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADNs de codificação das fusões de cadeia pesada de e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfecados num organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986) .

De acordo com outra abordagem descrita na WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpos podem ser tratadas por engenharia para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste processo, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos a partir da interface da molécula do primeiro anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das cadeias laterais grande(s) são criadas na interface na molécula do segundo anticorpo, substituindo as grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou 52 treonina). Isto providencia um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodimero em relação a outros sub-produtos indesejáveis, tais como homodimeros.

Os anticorpos biespecificos podem ser preparados como anticorpos comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo anticorpos biespecificos F(ac')2). As técnicas para a gerar anticorpos biespecificos de fragmentos de anticorpos têm sido descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecificos podem ser preparados usando a ligação quimica. Brennan et al. Science. 229: 81 (1985) descrevem um procedimento no qual os anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ac')2-Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de arsenito de sódio complexante de ditiol para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fac' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fac' - TNB é então reconvertido para o Fac'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar dos outros derivados de Fab' - TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Além disso, os fragmentos de Fac' podem ser recuperado directamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar de anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecifico totalmente humanizado F(ac')2. Cada fragmento Fac' foi segregado separadamente de E. coli e submetido a acoplamento química dirigido ín vitro, para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar às células que 53 sobrexpressam o receptor ErbB2 e as células T humanas normais, bem como desencadear a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humana. Já foram descritas várias técnicas de produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecificos directamente a partir de cultura de células recombinantes. Por exemplo, os anticorpos biespecificos já foram produzidos através de fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Os péptidos de fechos de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados a partes do Fac' de dois anticorpos diferentes, por fusão do gene. Os homodimeros de anticorpos foram reduzidos na região charneira para formar monómeros e, em seguida, re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este processo também pode ser utilizado para a produção de anticorpos homodimeros. A tecnologia do "diacorpo" tecnologia descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) providenciou um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VP) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) por meio de um ligante, que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. De acordo com isto, os domínios Vp e Vp de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios complementares de VL e VP de outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação ao antigénio. Também já foi referida uma outra estratégia para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecificos consiste em utilizar dímeros de Fv (sFv) de cadeia única. Ver, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. 54

Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecificos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Exemplos de anticorpos biespecificos podem ligar dois epitopos diferentes, pelo menos, um das quais é originário do antigénio da proteina da presente invenção. Alternativamente, um braço anti-antigénico de uma molécula de imunoglobulina pode ser combinada com uma cadeia que se liga a uma molécula de desencadeamento de um leucócito, tal como uma molécula do receptor de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou de receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64 ), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de modo a concentrar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa o antigénio específico. Os anticorpos biespecificos também podem ser usados para dirigir agentes citotóxicos para as células que expressam um antigénio específico. Estes anticorpos possuem um braço de ligação ao antigénio e um braço que se liga um agente citotóxico ou um agente quelante de radionuclideos, tais como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecifico de interesse liga o antigénio da proteína aqui descrita e ainda liga o factor de tecido (TF).

Anticorpos heteroconjugados também estão no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos têm sido propostos, por exemplo, para atingir células do sistema imunitário com células indesejadas (ver patente U.S. No. 4.676.980) e para o tratamento de infecções pelo VIH (ver WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089) . Considera-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando processos conhecidos na química das proteínas sintéticas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser preparadas usando uma reacção de permuta de dissulfureto ou pela formação de uma 55 ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4 mercaptobutirimidato e os descritos, por exemplo, na patente U.S. No. 4.676.980.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da presente invenção com relação à função efectora, de modo a melhorar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de doenças e distúrbios associados com a sinalização aberrante de LPS. Por exemplo, o resíduo de cisteína pode ser introduzido na região de Fc, permitindo assim a formação de ligações de dissulfureto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter melhor capacidade de internalização e/ou de aumentar a morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) . (Ver Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, um anticorpo pode ser tratado por engenharia que tem regiões de Fc duplas e pode assim ter maior lise do complemento e maiores capacidades de CCDA. (Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989) ) . A presente invenção também em por objecto imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa de bactérias, plantas, fungos, ou de origem animal ou os seus fragmentos) ou um isótopo radioactivo (isto é, um radioconjugado).

As toxinas enzimaticamente activas e os seus fragmentos que podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos activos da toxina da difteria não ligados, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, 56 proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de officinalis sapaonaria, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exempos incluem 212βί, 131i/ 131in, 90Y e 18βρ>θ.

Os conjugados do anticorpo e o agente citotóxico são preparados usando uma variedade de agentes bifuncionais de acoplamento de proteína, tais como propionatos de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (PSPD), imino-tiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetilo HCL) , ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldeídos (tal como como glutaraldeído) , compostos de bis-azido (como os derivados de bis (p-azidoniumbenzoílo)hexanodiamina) , derivados de bis-diazónio (tal como bis-(p-diazoniuinbenzoílo)-etileno-diamina), di-isocianatos (como 2,6-di-isocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). O ácido l-isotiocianatobenzil-metildietileno-3-triaminopenta-aético (MY-DTPA) marcado com carbono 14 é um exemplo de um agente quelante para a conjugação do radionucleótido com o anticorpo. (Ver WO94/11026).

Um especialista na matéria reconhecerá que uma grande variedade de porções possíveis pode ser acoplada aos anticorpos resultantes da presente invenção. (Ver, por exemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989). 57 0 acoplamento pode ser feito por meio de uma reacção quimica que ligará as duas moléculas, desde que o anticorpo e a outra metade mantenham as suas respectivas actividades. Esta ligação pode incluir muitos mecanismos químicos, por exemplo, ligação covalente, ligação de afinidade, intercalação, ligação coordenada e complexação. Contudo, a ligação preferível é a ligação covalente. A ligação covalente pode ser conseguida quer por condensação directa de cadeias laterais existentes ou pela incorporação de moléculas externas que formam pontes. Muitos agentes de ligação bivalentes ou polivalentes são úteis no acoplamento de moléculas de proteínas, tal como os anticorpos da presente invenção, com outras moléculas. Por exemplo, agentes de acoplamento representativos podem incluir compostos orgânicos, tais como tioésteres, carbodi-imidas, ésteres de succinimida, di-isocianatos, glutaraldeído, diazobenzenos e diaminas de hexametileno. Esta lista não pretende ser exaustiva das várias classes de agentes de acoplamento conhecidas na técnica, mas, em vez disso, é exemplificativa dos agentes de acoplamento mais comuns. (Ver Killen e Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335 -2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); e Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).

Os ligantes preferidos estão descritos na literatura. (Ver, por exemplo Ramakrishnan, S. et al., Câncer Res. 44: 201-208 (1984) que descreve a utilização de MBS (éster de M-maleimido-benzoil-N-hydroxisuccinimida). Ver também a patente U.S. No. 5.030.719, que descreve a utilização de derivados halogenados de acetil-hidrazida acoplados a um anticorpo através de um ligante de oligopéptidos. Os ligantes particularmente preferidos incluem: (i) EDC (cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodi-imida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxi-carbonil-alfa-metil- 58

Cat. alfa-(2- pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., (21558G); (iii) SPDP (hexanoato de succinimidil-6[3-(2-piridilditio)propionamido] (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (hexanoato de sulfosuccinimidil-6 [ 3 — (2 — piridilditio)-propianamida] (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); e (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. #24510) conjugado com EDC.

Os ligantes descritos antes contêm componentes que têm atributos diferentes, levando a conjugados com diferentes propriedades fisico-químicas. Por exemplo, os sulfo-NHS- ésteres de carboxilatos de alquilo são mais estáveis do que os sulfo-NHS-ésteres de carboxilatos aromáticos. Os NHS-ésteres contendo ligantes são menos solúveis do que os sulfo-NHS-ésteres. Além disso, o ligante SMPT contém uma ligação dissulfureto estericamente bloqueada e podem formar conjugados com maior estabilidade. As ligações de dissulfureto são, em geral, menos estáveis do que outras ligações porque a ligação dissulfureto é clivada in vitro, resultando em menos conjugado disponível. Sulfo-NHS, em particular, podem aumentar a estabilidade dos acoplamentos carbodi-imida. Os acoplamentos de carbodi-imida (tal como EDC) , quando utilizados em conjunto com sulfo-NHS, formam ésteres que são mais resistentes à hidrólise do que a reacção de acoplamento de carbodi-imida isoladamente.

Os anticorpos aqui descritos também podem ser formulados como imunoliposomas. Os lipossomas contendo os anticorpos são preparados por processos conhecidos na técnica, como descrito no Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); e nas patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Os lipossomas com maior tempo de circulação estão descritos na patente U.S. No. 5.013.556. 59

Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo processo da evaporação em fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina (PEG-PE) derivada de PEG. Os lipossomas são extrudidos através de filtros com um tamanho de poros definido para se obter lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fac' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas, conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por via de uma reacção de permuta de dissulfuretos.

Utilização de anticorpos contra o complexo de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2, CD14 e as suas combinações

Deve entender-se que a administração de entidades terapêuticas de acordo com a presente invenção será feita administrando com veiculos, excipientes e outros agentes apropriados que estão incorporados em formulações para providenciar uma melhor transferência, distribuição, tolerância e similares. Uma quantidade de formulações

adequadas pode ser encontrada no formulário conhecido de todos os quimicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente no seu capitulo 87 de Blaug, Seymour. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipidos, vesículas contendo lipidos (catiónicos ou aniónicos) (tal como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorção anidras, emulsões de óleo em água e de água em óleo, emulsões de carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas contendo carbowax. Qualquer uma das misturas anteriores pode ser adequadas em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, desde que o 60 ingrediente activo na formulação não esteja inactivado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Ver também Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32 (2) : 210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203 (1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sei. 89 (8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol. 52: 238-311 (1998) e as respectivas citações para se obter informações adicionais relacionadas com formulações, excipientes e veículos bem conhecidos pelos químicos farmacêuticos.

As formulações terapêuticas da presente invenção, que incluem um anticorpo monoclonal da presente invenção (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino ou humanizado), são utilizados para tratar ou aliviar um sintoma associado a um distúrbio relacionado com o sistema imunitário. A presente invenção também providencia processos para tratar ou aliviar um sintoma associado a um distúrbio relacionado com o sistema imunitário. Estabelece-se um regime terapêutico através da identificação de um indivíduo, por exemplo, um paciente humano que sofre (ou está em risco de desenvolver) um desordem distúrbio relacionado com o sistema imunitário, usando processos padrão.

Os anticorpos da presente invenção, que são capazes de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, induzida por LPS, são ferramentas terapêuticas úteis no tratamento de distúrbios, tal como, por exemplo, inflamação aguda e septicémia induzida por produtos microbianos (por exemplo LPS) e exacerbações decorrentes desta inflamação aguda, tal 61 como, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crónica e asma (ver 0'Neill, Curr. Opin. Pharmacol, 3: 396-403 (2003)). Tais anticorpos também são úteis no tratamento de doenças auto-imunes neurodegenerativas. (Lehnardt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 8514-8519 (2003),).

Além disso, os anticorpos da presente invenção também são úteis como reagentes terapêuticos no tratamento de doenças tal como, por exemplo, osteoartrite, que são causadas por stress mecânico que, por sua vez, induz factores de "stress" endógeno eliminável que desencadeiam RST4. Um factor de stress endógeno eliminável inclui, Hsp60 (ver Ohashi et al., J. Immunol. 164: 558-561 (2000)) e fibronectina (ver Okamura et al., J. Biol. Chem. 276: 10229-10233 (2001) e sulfato de heparanol hialuronano, gp96, β-defensina-2 ou proteína A de um tensioactivo (ver, por exemplo, Johnson et al., Crit. Rev. Immunol., 23 (1-2): 15-44 (2003)). Os anticorpos da presente invenção também são úteis no tratamento de uma variedade de distúrbios relacionados com stress mecânico, tal como, por exemplo, stress mecânico que está associado com indivíduos e pacientes colocados em respiradores, ventiladores e outros dispositivos de assistência respiratória. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento de lesões pulmonar induzida pelo ventilador ("LPIV"), também referida como uma lesão pulmonar associada à ventilação ("LPAV").

Outras áreas da doença em que a inibição da função de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14 pode ser benéfica incluem, por exemplo, a inflamação crónica (por exemplo, a inflamação crónica associada com condições alérgicas e asma), doenças auto-imunes (por exemplo, distúrbio inflamatória do intestino, artrite reumatóide, esclerose múltipla) e aterosclerose (ver 0'Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 62 (2003)).

Os sintomas associados com estes distúrbios relacionados com a imunidade incluem, por exemplo, inflamação, febre mal-estar geral, dor muitas vezes localizada na área inflamada, aceleração do ritmo cardíaco, dores articulares ou dores (artralgia), respiração rápida ou outros padrões respiratórios anormais, tremores, confusão, desorientação, agitação, tontura, tosse, dispneia, infecções pulmonares, insuficiência cardíaca, insuficiência respiratória, edema, ganho de peso, recaídas mucopurulentas, caquexia, ruídos respiratórios, dor de cabeça e sintomas abdominais tais como, por exemplo, dor abdominal, diarreia ou obstipação.

Determina-se a eficácia do tratamento em associação com qualquer processo conhecido para diagnosticar ou tratar um distúrbio particular relacionado com a imunidade. O alívio de um ou mais sintomas do distúrbio relacionado com a imunidade indica que o anticorpo confere um benefício clínico.

Os processos para a selecção de anticorpos que possuem a especificidade desejada incluem, mas não se limitam ao ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) e outras técnicas conhecidas neste domínio, mediadas imunológicamente.

Combinações de anticorpos dirigidos contra o complexo de RST4 RST4/DM-2 ou contra RST4, quando não complexado com DM-2 (ou um seu fragmento), DM2, quando não complexado com RST4 (ou um seu fragmento), RST2 (ou um seu fragmento) ou CD14 (ou um seu fragmento) ou anticorpos multiespecíficos que reconhecem dois ou mais alvos seleccionados entre o complexo de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e CD14, podem ser usados em processos conhecidos na arte relativos à localização e/ou à quantificação destes alvos para utilização, por exemplo, na 63 medição dos níveis dos alvos em amostras fisiológicas apropriadas, para uso em processos de diagnóstico, para o uso na visualização de proteína e similares. Num dado enquadramento, as combinações de anticorpos específicos para o complexo de RST4/DM-2, RST4, DM2, RST2 ou CD14 ou anticorpos multiespecíficos que reconhecem dois ou mais destes alvos ou um seu derivado, fragmento, análogo ou homólogo, que contêm o anticorpo derivado do domínio de ligação ao antigénio, são utilizados como compostos activos sob o ponto de vista farmacológico (a seguir designadas por "terapêutica").

As combinações de anticorpos específicos para o complexo de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 ou RDC14 ou um anticorpo multiespecífico que reconhece pelo menos dois destes alvos, podem ser usadas para o complexo de RST4/MD2 isolado, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14 por meio de técnicas padrão, tais como imunoafinidade, cromatografia ou imunoprecipitação. Os anticorpos dirigidos contra o complexos de RST4/DM2, RST4, DM2, RST2 e/ou CD14 (ou um seu fragmento) podem ser usados para diagnóstico para monitorizar os níveis de proteína no tecido, como parte de um processo de ensaios clínicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento {ou seja, ligando fisicamente) do anticorpo a uma substância detectada. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protético, materiais fluorescentes, material luminescente, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetil-colinaesterase; exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferone, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, 64 rodamina, diclorotriazinilamina-fluores-ceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina, um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bio-luminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina e exemplos de material radioactivo apropriado incluem 125χ/ 131i, 35s ou 3h.

Os anticorpos aqui descritos, incluindo anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados e completamente humanos, podem ser utilizados em combinações como agentes terapêuticos. Esses agentes serão geralmente utilizados para tratar ou prevenir uma doença ou uma patologia associada com a sinalização aberrante de RST4, RST2 ou CD14 num indivíduo. Administra-se uma preparação de anticorpos, de preferência com uma elevada especificidade e alta afinidade para os seus antigénios alvo, ao indivíduo e geralmente tem um efeito devido à sua ligação ao alvo(s). A administração do anticorpo ou das combinações de anticorpos poderá anular ou inibir ou interferir com a função de sinalização do alvo (por exemplo, o complexo de RST4/DM-2, RST2, CD14). A administração do anticorpo pode anular ou inibir ou interferir com a ligação do alvo (por exemplo, RST4) com um ligando endógeno (por exemplo, RST4 ou a proteína acessória de DM-2) a que se liga naturalmente. Por exemplo, o anticorpo ou a combinação de anticorpos liga-se ao alvo e neutraliza a produção de citocinas pró-inflamatórias induzida por LPS. A quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um anticorpo ou de uma combinação de anticorpos, aqui descrita, geralmente refere-se à quantidade necessária para atingir um objectivo terapêutico. Como mencionado antes, pode ser uma interacção de ligação entre o anticorpo e seu antigénio alvo que, em certos casos , interfere com 0 funcionamento do alvo. A quantidade necessária a ser 65 administrada deve ainda depender da afinidade de ligação do anticorpo para o antigénio especifico (s) e também vai depender da velocidade à qual o anticorpo administrado é empobrecido do volume livre do indivíduo a quem é administrado. Os intervalos vulgares para as doses eficazes, sob o ponto de vista terapêutico, de um anticorpo, combinação de anticorpos ou fragmento de anticorpo descritos neste documento podem ser, a título de exemplo não limitativo, de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal até cerca de 50 mg/kg de peso corporal. As frequências de dosagem comuns podem variar, por exemplo, de duas vezes por dia até uma vez por semana.

Os anticorpos que se ligam especificamente ao complexo de RST4/DM-2, a RST4, a DM2, a RST2 ou a CD14 ou um fragmento desse anticorpo podem ser administrados, para o tratamento de distúrbios relacionados com a sinalização aberrante de LPS, sob a forma de composições farmacêuticas. Os princípios e considerações envolvidos na preparação dessas composições, bem como a orientação na escolha dos componentes são dados, por exemplo, em Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; e Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Decker, New York.

Sempre que se utilizam fragmentos de anticorpos, é preferível o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína-alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, as moléculas de péptido pode ser concebidas para reterem a capacidade de se ligar à sequência da proteína alvo. Esses péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou 66 produzidos pela tecnologia do ADN recombinante. (Lehnardt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 7889-7893 (1993)). A formulação também pode conter mais do que um composto activo, conforme necessário para a indicação especial a ser tratada, de preferência os que têm actividades complementares que não se afectem adversamente umas às outras. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode incluir um agente que melhora a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citocinas, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento. Essas moléculas estão presentes, adequadamente, em associação, em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

Os ingredientes activos também podem estar retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectiva-mente, em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões.

As formulações para serem usadas em administrações in vivo devem ser esterilizadas. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração esterilizadas.

Podem preparar-se preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticorpo, matrizes essas que estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato 67 de 2-hidroxietilo) ou álcool de polivinilo), polilactídeos (patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico - ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostos por copolímero de ácido láctico - ácido glicólico e acetato de leuprolide ) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido glicólico-ácido láctico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, alguns hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos.

Composições farmacêuticas

Os anticorpos ou os polipéptidos quiméricos solúveis da presente invenção (também referidos aqui como "compostos activos") e os seus derivados, fragmentos, análogos e homólogos, podem ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para administração. Tais composições normalmente incluem o anticorpo ou um polipéptido quimérico solúvel e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Tal como se utiliza aqui, a expressão " veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" destina-se a incluir todas e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Veículos apropriados estão descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto padrão de referência neste campo. Exemplos preferidos desses veículos ou diluentes incluem, mas não se limitam a água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano a 5 %. Podem utilizar-se também lipossomas e veículos não aquosos tais como óleos não voláteis. O uso desses meios e 68 agentes para substâncias activas sob o ponto de vista farmacêutico é bem conhecido na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o princípio activo, considera-se a sua utilização nas composições. Também se podem incorporar compostos activos suplementares nas composições. A composição farmacêutica da presente invenção é formulada para ser compatível com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração parentérica incluem, por exemplo, a administração endovenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (isto é, tópica) transmucosa e administração rectal. As soluções e suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado tal como água para injecção, solução salina, óleos não voláteis, polietileno-glicóis, glicerina, propileno-glicol ou outros dissolventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou parabenos metílicos; substâncias antioxidantes tal como o ácido ascórbico ou bissulfureto de sódio, agentes quelantes tais como ácido etilenodiamino-tetracético (EDTA), tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajustar a tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode estar incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas de vidro ou de plástico.

As composições farmacêuticas adequadas para uma utilização injectável incluem soluções aquosas esterilizadas (solúveis em água) ou dispersões e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções estéreis injectáveis ou 69 os veículos dispersões. Para administração intravenosa, adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (STF). Em todos os casos, a composição deve ser esterilizada e deve ser fluida, de modo a assegurar a facilidade de utilização numa seringa. Deve ser estável nas condições de fabrico e armazenagem e deve ser preservada contra a acção de contaminação por microrganismos tal como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um meio dissolvente ou uma dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, polióis (por exemplo, glicerol, propileno-glicol e polietileno-glicol e similares) e as suas misturas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho necessário das partículas no caso de dispersão e pelo uso de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser conseguida por meio de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível a inclusão na composição de agentes isotónicos, por exemplo , açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injectáveis esterilizadas podem ser preparadas pela incorporação do composto activo na quantidade necessária num dissolvente adequado, com um ou uma combinação dos ingredientes mencionados, se necessário, seguido de filtração esterilizada. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto activo num veículo esterilizado que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados antes. No 70 caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injectáveis esterilizadas, os processos de preparação são secagem em vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada em meio esterilizado.

As composições orais incluem geralmente um diluente inerte ou um veiculo comestível. Podem ser encapsuladas em cápsulas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para efeitos de administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizado sob a forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas utilizando um veículo liquido para ser usado como colutório, em que o composto no veiculo fluido é aplicado por via oral e gargarejado e expectorado ou deglutido. Os agentes de ligação compatíveis, sob o ponto de vista farmacêutico e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e similares podem conter qualquer um dos ingredientes ou compostos de natureza semelhante que se seguem: um ligante tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um agente de deslizamento tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como a sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.

Para administração por inalação, os compostos são libertados sob a forma de um aerossol de uma embalagem pressurizada ou um distribuidor, que contém um propelente 71 adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono ou um nebulizador. A administração sistémica também pode ser feita por meio de uma via transmucosa ou transdérmica. Para a administração transmucosa ou transdérmica, utilizam-se, na formulação, penetrantes adequadas à barreira a ser permeada. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para a administração transmucosa, detergentes, sais biliares e derivados do ácido fusidico. A administração transmucosa pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, os compostos activos são formulados em pomadas, unguentos, géis ou cremes, como é geralmente conhecido na técnica.

Os compostos também podem ser preparados sob a forma de supositórios (por exemplo, com bases convencionais de supositórios, tais como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou irrigadores de retenção para libertação rectal.

Num enquadramento, os compostos activos são preparados com veiculos que irão proteger o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de libertação microencapsulados. Podem utilizar-se copolimeros biodegradáveis, biocompativeis, tal como acetato de etileno e vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colágenio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os processos de preparação de tais formulações serão evidentes para os especialistas na matéria. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation e na Nova Pharmaceuticals Inc. As suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direccionados para as células infectadas com 72 anticorpos monoclonais para antigénios virais) podem também ser usadas como veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Podem ser preparados de acordo com processos já conhecidos dos especialistas na matéria, conforme descrito na patente U.S. No. 4.522.811. É especialmente vantajoso para formular composições orais ou parentéricas sob a forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dose. Forma de dosagem unitária, tal como se utiliza aqui, refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como doses unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem da presente invenção é ditada e depende directamente das caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a atingir e das limitações inerentes à técnica de formação de composições tal como o composto activo para o tratamento de indivíduos.

As composições farmacêuticas podem ser incluídas numa embalagem, invólucro ou distribuidor em conjunto com as instruções para a administração. A presente invenção será ainda descrita nos exemplos que se seguem, que não limitam o âmbito da presente invenção descrita nas reivindicações.

Exemplos

Exemplo 1: Materiais e processos

Reagentes: 73

Tanto o AcM α-humano α de CD14, 28C5 como o AcM a-humano de RST2, T2.5 já foram descritos previamente (Ver Weingarten et al., J Leukoc Biol. 53 (5): 518-24 (1993); Pugin et al., Blood, 104 (13): 4071-79 (2004); Meng et al., J. Clin. Invest., 113 (10): 1473-81 (2004); patente U.S. No. 6.444.206 e publicação da patente internacional WO 2005/028509) . T2.5 foi comprado na eBioscience. O AcM α-humano de RST4, 15C1 (IgGl kapa de murganho) e o AcM α-humano de DM-2, 18H10 (IgG2b de murganho) foram gerados no sitio, utilizando protocolos previamente descritos (Ver, por exemplo, Pugin et al., Blood, vol. 104 (13): 4071-79 (2004)). Todos os controlos do isotipo de IgG foram adquiridos na BD biosciences (San Jose CA) . Nas experiências apresentados nas figuras 1 e 2, comprou-se LPS Re595 puríssima (um ligando de RST4) na List Biochemicals e PAM3CSK4 (um lipido sintético triacilado que interage com RST2) foi adquirido na Invivogen. As estirpes bacterianas selvagens de E. coli 1 e K12 W3110 foram obtidas junto do Dr. J. Pugin, CMU, Genebra. Nas restantes experiências, LPS K12 e 10 LPS de Pseudomonas aeruginosa foram adquiridos na Sigma Aldrich. A flagelina purificada e PAM3CSK4 foram comparados na Invivogen. As estirpes bacterianas de tipo selvagem 1 de E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia e Staphilococcus aureus (SAUR2) foram obtidas na partir do HCG, Genebra e W3110 K12 foi obtida em Pierre Genevaux, CMU, em Genebra. As células BEAS 2B e HEK 293 foram obtidas na ATCC. A E.coli foi inactivada por aquecimento durante 30 minutos a 90 °C ou por tratamento com gentamicina numa concentração de 20 ug/ml. A inactivação foi verificada por colocação em placa de agar LB para verificar a ausência de colónias. Ensaios das células HECK 293, HUVEC BEAS 2B:

Para os resultados ilustrados nas figuras 1A-1B, as células transfectadas estáveis que expressam quer RST4h/DM-2 74 quer RST2h (aqui referidas como "transfectante de HEK 293 RST4h/DM2" (figura IA) e "transfectante estável de HEK 293 RST2h" (figura 1B)) foram geradas através utilizando a metodologia descrita anteriormente (Ver, por exemplo, Pugin et al., Blood 2004). As células foram cultivadas em placas a 6xl04 células/poço em 200 μΐ de meio MEMD com SBF a 10 % no dia anterior à experiência. Os AcMs (15C1 (anti-RST4) e T2.5 (anti-RST2)) foram diluídos em 50 μΐ de meio básico MEMD até a uma concentração de 150 pg/ml, adicionaram-se às células e incubou-se durante 1 hora a 37 °C. Diluiu-se LPS Re595 (concentração final de lOng/ml) (figura IA) ou PAM3CSK4 (concentração final de 100 ng/ml) (figura 1B) em 100 μΐ de RPMI 1640contendo SBF a 1 %, adicionou-se às células e deixou-se em incubação durante 21 horas a 37 °C. A secreção de IL-8 no sobrenadante da cultura foi monitorizada por ELISA (Endogen).

Para os restantes experiências à base de células, as células foram semeadas em placas a 6xl04 células/poço em 200 μΐ de meio com SBF a 10 % no dia anterior à experiência. Para as células HUVEC, revestiram-se as placas durante 10 minutos com gelatina a 2 % (Sigma Aldrich) antes da colocação em placas. O meio foi retirado no dia da experiência e adicionou-se 30 μΐ de meio contendo 6 % de soro humano inactivado (concentração final de 2%) . Em seguida, diluíram-se os AcMs adequados em 30μ1 meio básico até à concentração adequada e adicionou-se às células durante uma hora a 37 °C. Diluíram-se as bactérias inactivadas pelo calor (na concentração apropriada) em 30 μΐ de meio, adicionou-se às células e deixou-se a incubar durante 21 horas a 37 °C. Monitorizou-se a secreção de IL-6 (HUVEC e BEAS 2B) ou IL-8 (HEK 293) no sobrenadante da cultura por ELISA (Endogen). 75

Citometria de fluxo

Para detectar RST2, RST4, DM-2 e CD14 na superfície das células HUVEC e BEAS 2B, fez-se a incubação de lx 107 células/ml em lx SBF complementado com ASB a 1 % BSA e qualquer anticorpo apropriado a 10 yg/ml. As células foram lavadas uma vez e depois foram incubadas com o anticorpo IgG (H+L) anti-murganho, de cabra, conjugado com APC (diluição de 1:250; Molecular Probes) . As células foram analisadas usando o FACScalibur no canal FL-4. Para os leucócitos circulantes, os anticorpos apropriados foram adicionados a sangue humano completo até a uma concentração final de 10 yg/ml. Após duas etapas de lavagem em 1 x SBF, ASB a 1%, as células foram incubadas com anticorpo secundário (IgG (H + L) anti-rato conjugada com APC, diluído a 1:250), contendo 100 yg/ml de IgG humana, a fim de evitar interacções mediadas por Fc (Sigma Aldrich). Os glóbulos vermelhos foram eliminados por lise com tampão de lise (Becton Dickinson) e as células remanescentes foram lavados duas vezes. As células foram analisadas usando o FACScalibur no canal FL-4. As diferentes populações de leucócitos foram distinguidas com base na dispersão frontal e lateral.

Ensaios de sangue completo:

Num primeiro conjunto de experiências apresentadas nas figuras 1 e 2, o sangue fresco de dois voluntários humanos saudáveis (punção venosa na veia do braço) foi misturado com heparina 10 μΐ/ml de sangue) e diluído a 1:2 em meio básico RPMI 1640. O sangue foi colocado em placa num volume de 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso durante 15 minutos a 37 °C. Prepararam-se os AcMs 15C1 (anti-RST4), T2.5 (anti-RST2) e 28C5 (anti-CD14) nas concentrações indicadas, diluídos em meio básico RPMI 1640 (volume final de 50 μΐ) e adicionou-se 76 ao sangue. Em cada caso, a quantidade total do AcM preparado foi normalizada até à quantidade indicada no tratamento triplo com AcM usando o AcM de controlo de IgG. Após a incubação durante 1 hora a 37 °C, adicionou-se 50 μΐ de cada um de E. coli inactivada pelo calor (10 6 UFC/ ml de concentração final), Re595 LPS (1 ng/ml de concentração final) (figura 2A) ou PAM3CSK4 (concentração final de 100 ng/ml) (figura 2B) ao sangue e incubou-se durante 6 horas. O plasma foi então analisado quanto ao teor de IL-6 por ELISA (Endogen).

Num segundo conjunto de experiências, ilustradas nas figuras 3A e 3B, misturou-se sangue fresco de três voluntários saudáveis com heparina (10 μΐ/ml de sangue), diluiu-se a 1:2 em meio básico RPMI 1640 e colocou-se em placas a um volume de 100 μΐ/poço. Prepararam-se os AcMs de murino 15C1 (anti-RST4), T2.5 (anti-RST2) e 28C5 (anti-CD14) e as suas combinações, nas concentrações indicadas diluídos em meio básico RPMI 1640 (50 μΐ de volume final), adicionou- se ao sangue e incubou-se durante uma hora na célula. Adicionou-se ao sangue um volume de 50 ml de E. coli inactivada pelo calor a 10^ UFC/ml. A E. coli inactivada pelo calor ou era uma estirpe de tipo selvagem (figura 3A) ou a estirpe comum de laboratório de E Coli conhecida como K12 W3110 (figura 3B) . Após um período de incubação de 6 horas, mediram-se os níveis de IL-6 no plasma por ELISA.

Num terceiro conjunto de experiências apresentadas nas figuras 5, 7 e 8, o sangue fresco de dois voluntários humanos saudáveis (punção venosa na veia do braço) foi misturado com heparina 10 μΐ/ml de sangue) e diluído a 1:2 em meio básico RPMI 1640. O sangue foi colocado em placa a um volume de 60 μΐ/poço e deixou-se repousar durante 15 minutos a 37 °C.

Quando apropriado, prepararam-se os AcMs nas concentrações 77 indicadas, diluídos em meio básico RPMI 1640 (30 μΐ de volume final) e adicionou-se ao sangue. Após uma hora, adicionou-se ao sangue 30μ1 de uma bactéria inactivada pelo calor (na concentração adequada), LPS K12 (concentração final de 4 ng/ml) , PAM3GSK4 (concentração final de 100 ng/ml) ou flagelina (concentração final de 300 ng/ml) e incubou-se durante 6 horas. O plasma foi posteriormente analisado, quanto ao teor de IL-6, por ELISA (Endogen).

Exemplo 2. Expressão de RST2, RST4, DM-2 e CD14 nos leucócitos do sangue, células HUVEC e BEAS 2B A fim de prever a capacidade de resposta das populações de células, neste estudo, a diferentes ligandos de RST, examinou-se a expressão, na superfície celular, de RST2, RST4 e moléculas acessórias de RST, DM-2 e CD14 por meio de análise por SCAF utilizando AcMs específicos.

Em populações de células humanas de sangue total, que se distinguem pelo tamanho e pela granulosidade, observaram-se, na superfície, níveis significativos de RST4, MD-2 e RST2, com níveis elevados de CD14 de superfície. Os granulócitos foram positivos para CD14 e expressaram níveis fracos, mas detectáveis de RST2, RST4 e DM-2 (figura 4, A-B). Os linfócitos não expressaram níveis detectáveis de qualquer uma das proteínas ensaiadas.

As HUVEC foram positivas para RST4 e a expressão de MD-2, mas negativas para RST2 e CD14 enquanto as células BEAS 2B expressaram níveis baixos mas detectáveis de RST2, RST4 e DM-2, com um nível significativo de CD14 (figura 4, C-D). 78

Exemplo 3. Inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias no sangue humano, induzida pelo agonista de RST, com bloqueio dos AcMs de RST2, RST4, DM-2 e CD14

Nas figuras 1A-1B, a especificidade de cada AcM foi investigada usando os ligandos específicos de RST4 e RST2, LPS e PAM3CSK4 respectivamente. A figura IA mostra que o AcM que bloqueia a-RST4, 15C1, inibiu eficientemente a produção de IL-8 dependente de LPS em células humanas HEK 293 transfectadas com RST4/DM-2 humanos. 0 AcM específico anti-RST2, T2.5, como AcM de controlo, não teve nenhum efeito na produção de IL-8. Inversamente, T2.5 bloqueou a produção de IL-8 induzida por PAM3CSK4 em que 15C1 e o AcM de controlo não teve nenhum efeito (figura 1B).

No sangue humano completo, tanto 15C1 como o AcM que bloqueia anti-CD14, 28C5, bloqueou a produção de IL-6 induzida por LPS de uma forma dependente da dose enquanto T2.5 e o AcM de controlo não tiveram nenhum efeito (figura 2a) . Tanto T2.5 como 28C5 bloquearam a produção de IL-6 induzida por PAM3CSK4 de uma forma dependente da dose enquanto 15C1 e o AcM de controlo não tiveram nenhum efeito (figura 2b).

Na figura 5, examina-se a especificidade e a potência de neutralização dos AcMs de RST2, RST4, DM-2 e CD14 no sangue humano completo estimulado com K12 LPS de E.coli (agonista de RST4) e PAM3CSK4 (agonista de RST2). K12 LPS de E. coli é um potente indutor da produção de IL-6. Esta produção foi fortemente inibida pelos AcMs antiRST4 e CD14. 0 AcM anti-DM-2 inibiu os níveis de IL-6 para um efeito menor, embora significativo, ao passo que o AcM anti-RST2 não mostrou nenhuma capacidade de neutralização 79 significativa. Estes resultados estão de acordo com um papel para RST4, DM-2 e CD 14 no reconhecimento de LPS de E. coli. A produção de IL-6 induzida por LPS de Pseudomonas podia ser parcialmente inibida (—50 %) pelos AcMs anti-RST2, RST4, DM-2 e CD14. Uma combinação dos AcMs de RST2 e RST4 inibiram completamente a produção de IL -6, sugerindo que esta estirpe particular do LPS pode ser reconhecida por RST2 e RST4.

Pam3CSK4 é um lipopéptido sintético tripalmitoilado que imita o terminal aminoacilado das lipoproteínas bacterianas e os sinais através de RST2. No sangue humano completo, um nivel baixo mas significativo de IL-β poderia ser detectado após o tratamento com este agonista purificado. A indução de IL-6 foi consideravelmente reduzida com os AcMs de RST2. Além disso, também o tratamento anti-CD14 inibiu fortemente este efeito, sugerindo um papel para esta proteína adaptadora no reconhecimento da molécula por meio de RST2. Os AcMs anti-RST4 e DM-2 não tiveram efeito significativo nos níveis de IL-6. A flagelina é o principal componente do filamento flagelar bacteriano, o que confere mobilidade a uma vasta gama de espécies bacterianas. Tem demonstrado que assinala por via de RST5, possivelmente como um heterodímeros com RST4 (Mizel et al., J. Immunol., vol. 170: 6217-6223 (2003)). No sangue humano completo, a flagelina induziu fortemente a produção de IL-6. O tratamento com o AcM anti-RST2 não teve nenhum efeito sobre esta indução. Pelo contrário, os AcMs anti-RST4, DM-2 e CD14 podem inibir significativamente esta resposta, o que sugere um papel para estas proteínas na resposta imunitária inata à flagelina, conforme relatado anteriormente ((Mizel et al., J. Immunol., vol. 170: 6217- 6223 (2003))). 80

Em conjunto, estes resultados confirmam a especificidade e demonstram a potência dos AcMs bloqueadores anti RST2, RST4, DM-2 e anti-CD14 utilizados neste estudo.

Exemplo 4. Iinibição de E. coli, inactivada pelo calor, em sangue total humano com <x-RST2, a-RST4 e a-CD14

Para testar a hipótese de que os micróbios são capazes de estimular mais do que um receptor RST em paralelo, investigou-se o efeito dos AcMs de bloqueio de oí-RST4, RST2 e CD14 na inibição da reacção imunitária inata contra E.coli inactivada pelo calor, em sangue humano completo. Utilizaram-se duas estirpes de E. coli (WT e K12) com diferentes combinações de AcM e utilizou-se tratamentos quer únicos, duplos ou triplos para determinar a RST dominante na activação das respostas imunitárias e o efeito de bloqueio de mais do que um receptor RST na inibição destes respostas imunitárias. A figura 3a mostra a capacidade das diferentes combinações de AcM para inibir a produção de IL-6 no sangue completo estimulada por WT de E. coli inactivada pelo calor. 0 sangue dos 3 dadores saudáveis diferentes respondeu fortemente à preparação de E. coli (106 ufc/ml) . Esta resposta foi ligeiramente reduzida pela adição do AcM de bloqueio de aRST4, mas não pelo AcM DE bloqueio DE oíRST2 . Uma combinação de ambos os AcMs inibiu fortemente a resposta de sangue completo a E. coli. 0 tratamento apenas com o AcM de oíCD14 também era muito potente. Uma combinação de um de cxCD14 e aRST4 ou aCDl4 e oíRST2 mostrou um bloqueio mais eficiente do que o bloqueio de aCD14 sozinho. Isto indica que alguns ligandos dos derivados RST4 e RST2 de E. coli funcionam através de um mecanismo independente de CD14. 0 bloqueio de CD14, RST4 e RST2 foi o tratamento mais potente para inibir a 81 produção de IL-6. Obtiveram-se resultados semelhantes usando uma estirpe comum de laboratório de E. coli (K12 W3110, ver figura 3b).

Exemplo 5. Indução da produção de citocinas pró-inflamatórias em HEK 293 células transfectadas, sangue humano completo e células HUVEC e BEAS 2B por meio de diferentes estirpes de bactérias A fim de demonstrar a capacidade de diferentes estirpes de bactérias para estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias, trataram-se os tipos de células anteriores com doses crescentes das estirpes WT e K12 de E. coli inactivadas pelo calor, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia e staphylococcus aureus.

Ensaiou-se a capacidade de cada estirpe bacteriana para estimular as células HEK 293 transfectadas tanto com RST2 como com o complexo de RST4/DM-2. Nas células HEK 293 transfectadas com RST2, todas as estirpes gram-negativas ensaiadas induziram uma resposta detectável a partir de 5 x 105 ufc/ml com uma resposta máxima de IL-8 à dose mais elevada ensaiada (107 ufc/ml)). A Pseudomonas produziu a maior resposta de todas as estirpes ensaiadas. Estes resultados confirmam, conforme relatado anteriormente, a presença MMAPs tal como lipoproteinas capazes de estimular RST2 dentro das estirpes de bactérias gram-negativas ensaiadas neste estudo. Curiosamente, a aureas S., gram-positiva falhou na indução de qualquer resposta de IL-8, sugerindo que RST2 sozinho é insuficiente para reconhecer MMAPs desta estirpe bacteriana (tal como LTA) e que outros RSTs em combinação com RST2, mas ausentes nas células HEK 293 transfectadas com RST2 (isto é, RST1 e RST6) são provavelmente necessários para induzir uma resposta. As 82 células HEK 293 transfectadas com RST4 e DM-2 também responderam com eficácia tanto às estirpes de E. coli como a Klebsiella. 5 x 104 ufc/ml foi a dose mais baixa capaz de induzir uma resposta. As células responderam mal à pseudomonas, com uma resposta fraca, mas significativa observada a 5 x 106 e 1 x 107 ufc/ml. As células foram insensíveis à S. aureas em todas as concentrações ensaiadas. As células HEK 293 não transfectadas não responderam a nenhuma das bactérias (dados não mostrados).

No sangue humano total, observou-se uma resposta sólida para todas as estirpes de bactérias gram-negativas (figura 7A). A indução da produção de IL-6 pode ser observado com tão pouco quanto 2 x 103 ufc/ml, com um patamar de resposta à volta de 5x10^ ufc/ml. Em geral, a estirpe de bactéria gram-positiva S. aureas foi ineficiente na indução de uma resposta no sangue total. Com o dador particular representado na figura 7A, verificou-se uma resposta pequena mas significativa apenas com doses de bactérias acima de 106 ufc/ml (figura 7A) . Noutros dadores ensaiados, pode-se detectar um baixo nivel de resposta de IL-β com tão pouco quanto 104 ufc/ml de bactérias. Esta resposta geralmente aumenta ligeiramente até à dose mais elevada ensaiada (107 ufc/ml). Nas HUVEC (figura 7B), a produção de IL-β foi induzido por doses acima de 104 ufc/ml para as estirpes bacterianas E. coli e Klebsiella. Observou-se um patamar de resposta acima de 106 ufc/ml. A Pseudomonas foi um indutor fraco da produção de IL-6, com uma resposta muito fraca observada apenas com a dose mais elevada ensaiada (107 ufc/ml). O Staphylococcus foi ineficaz nas HUVEC em todas as doses ensaiadas. As células BEAS 2B responderam a todas as estirpes de bactérias ensaiadas acima de 106 ufc/ml. A resposta máxima para cada estirpe foi observada a 107 ufc/ml, a dose mais elevada ensaiada (figura 6C). 83

Com base nestes resultados, escolheu-se 104 e 106 ufc/ml de bactérias para estimular o sangue total humano, com 107 escolhida como a dose de bactérias para HUVEC e BEAS 2B.

Exemplo 6. Inibição das respostas de IL-6, às bactérias completas, com os AcMs anti RST2, RST4, DM-2 e CD14

Para entender a contribuição dada pelos diferentes RSTs à resposta celular a bactérias inteiras, os diferentes tipos de células incluidos neste estudo foram expostos a bactérias inactivadas pelo calor na sequência de uma pré-incubação com os AcMs de bloqueio sublinhados antes. A 104 ufc/ml em sangue total humano (figura 8A) , RST4 bloqueado reduziu fortemente a produção de IL-6 induzida pelas estirpes de E. coli e Klebsiella e reduziu parcialmente os niveis observados com pseudomonas. Os AcMs anti-RST4 não tiveram efeito na indução de IL-6 por Staphylococcus. 0 bloqueio de DM-2, em grande parte, espelhou o bloqueio de RST4, com a ressalva de que a produção de IL-6 induzida por Pseudomonas foi inibida de forma mais potente. 0 bloqueio de RST2 não teve efeito significativo na produção de IL-6 induzida por E. coli e Kelbsiella e inibiu parcialmente tanto pseudomonas como staphylococcus. Uma combinação de RST2 e RST4 bloqueados inibiu fortemente as respostas a todas as estirpes gram-negativas ensaiadas, embora tenha inibido apenas parcialmente Staphylococcus. 0 tratamento anti-CD14 em grande parte assemelhou-se ao co-tratamento de RST2/RST4. Em conjunto, estes resultados sugerem que, para esta dose escolhida de bactérias, os MMAPs que sinalizam através de RST4/DM-2 são largamente dominantes na indução de uma resposta imunitária a E. coli e Klebsiella. A Pseudomonas parece sinalizar exclusivamente por via de RST4/MD-2 e de complexos receptores contendo RST2, enquanto a produção de 84 IL-6 induzida por Staphylococcus é parcialmente dependente de RST2 e independente de RST4/DM-2. Este resultado sugere que outros RSTs ou proteínas relacionadas devem estar implicados na produção de IL-6 induzida por Staphylococcus. 0 padrão de inibição observado com o AcM anti-CD14 implica um papel para esta proteína no reconhecimento da sinalização de ligandos por via tanto de RST2 como de RST4. A 106 ufc/ml em sangue total humano (figura 8B) , RST4 e MD-2 bloqueados resultaram numa inibição parcial da indução de IL-6 por E. coli, Klebsiella e Pseudomonas. 0 bloqueio de RST2 foi ineficaz com todas as estirpes de bactérias ensaiadas. Curiosamente, o tratamento de combinação de RST2 e RST4 resultou numa inibição completa da produção de IL-6 induzida por E. coli e Klebsiella. Isto sugere que com doses mais altas das bactérias, os ligandos de RST2 podem estimular a produção de IL-6 na ausência da sinalização de RST4. A indução de IL-6 por 105 ufc/ml de pseudomonas foi parcialmente inibida pelo bloqueio de RST4/DM-2 ou RST2, observando-se uma forte inibição no seguimento do co-aquecimento de RST2 e RST4, reflectindo o que foi observado com 104 ufc /ml. 0 padrão de bloqueio de CD14 a 106 ufc/ml de bactérias também espelhou o que se verificou com 104 ufc/ml e também a inibição foi geralmente ligeiramente menos potente.

Analisaram-se os efeitos do bloqueio da sinalização de RST2 e RST4 n a produção de IL-6 em HUVEC tratadas quer com E. coli ou com Klebsiella a 107 ufc/ml. Como era esperado a partir do perfil de expressão dos RSTs na superfície de HUVECs (RST2, RST4/DM-2+), a actividade tanto de E. coli como de Klebsiella foi inibida pelos AcMs de bloqueio anti RST4, DM-2 e CD14, enquanto os AcMs anti-RST2 não tiveram efeito (figura 8C). 85

Ensaiou-se o bloqueio do RST na estimulação por bactérias de BEAS-2B, a 107 ufc/ml. Embora a superficie de coloração revelasse um baixo nivel de expressão dos RSTs 2 e 4 (figura 4D), as células responderam de uma forma relativamente sólida à estimulação com concentrações elevadas tanto de estirpes de bactérias gram-negativas como gram-positivas (figura 70 · 0 bloqueio de um de RST4 ou de DM-2 resultou num efeito inibidor mínimo na produção de IL-6. Pelo contrário, o bloqueio de RST2 diminuiu fortemente a produção de IL-6, sugerindo que RST2, ao invés de RST4 é funcionalmente responsável pela estimulação bacteriana desta linha de células epiteliais. Foi este o caso de todas as bactérias ensaiadas, incluindo a estirpe gram-positiva de S. aureas. A contribuição de CD14 no reconhecimento das quatro estirpes de bactérias ensaiadas foi também demonstrada através do bloqueio do AcM anti-CD14 (figura 8D).

Exemplo 7. Avaliação da inactivação pelo calor versus a inactivação com antibiótico na estimulação bacteriana de sangue total

Avaliou-se o efeito da inactivação térmica na integridade do MMAPs e a capacidade posterior das estirpes bacterianas ensaiadas para estimular respostas imunitárias inatas. A produção de IL-β induzida por bactéria inactivada pelo calor foi comparada com a de bactérias inactivadas pelo tratamento com antibiótico (gentamicina). A gentamicina foi escolhida como o antibiótico que age ao nível do ADN das bactérias e portanto os MMAPs estruturais permanecem intactos com este processo de inactivação. Conforme ilustrado na figura 9, as bactérias inactivados por ambos os processos retêm uma capacidade equivalente, numa dose de 106 ufc/ml (107 ufc/ml para Staphylococcus aureus), para estimular monócitos circulantes para a produção de IL-6. Os níveis de inibição da 86 produção de citocinas usando anti RST2, RST4, DM-2 e CD14 também foram comparados, sugerindo que os ligandos relevantes dos RST retêm a sua potência, independentemente do processo de inactivação utilizado. Estes resultados sugerem que a inactivação térmica de bactérias é um processo válido para o estudo da estimulação do sistema imunitário inato por meio de agonistas dos RST derivados de bactérias.

Lisboa, 23 de Agosto de 2010. 87

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Combinação de anticorpos para uso médico num individuo, caracterizada pelo facto de a referida combinação de anticorpos compreender um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecif icamente ao receptor 4 do tipo Toll (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor 2 do tipo Toll (RST2), em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada, pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 inclui uma região variável da cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, como se mostra na SEQ ID NO: 59.
2. Combinação de anticorpos para o tratamento de um distúrbio inflamatório num individuo, caracterizada pelo facto de a referida combinação de anticorpos compreender um anticorpo de neutralização que se liga imuno especif icamente ao receptor 4 do tipo Toll (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imuno especif icamente ao receptor 2 do tipo Toll (RST2), em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada, pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 25, respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 inclui uma região variável de cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59. 1
3. Combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o anticorpo anti-RST4 compreender RDCs de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 e RDCs de cadeia leve com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 28, 29 e 30.
4. Combinação de anticorpos, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de o anticorpo anti-RST4 conter uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
5. Combinação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de a combinação de anticorpos ainda compreender um anticorpo neutralizante que se liga imunoespecificamente a DM-2.
6. Combinação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de a combinação de anticorpos ainda compreender um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente a um receptor semelhante a Toll seleccionado no grupo que consiste nos receptores 1 do tipo Toll (RST1), receptores 5 do tipo Toll (RST5) e receptores 6 do tipo Toll (RST6).
7. Combinação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de a combinação de anticorpos estar compreendida numa composição.
8. Combinação, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelo facto de o sujeito ser um ser humano. 2
9. Combinação, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo facto de o distúrbio inflamatório ser septicémia, uma doença auto-imune, um distúrbio inflamatório crónico ou um distúrbio inflamatório agudo.
10. Combinação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de o distúrbio inflamatório crónico se seleccionar no grupo consistindo em distúrbio inflamatório do intestino, artrite reumatóide, osteoartrose, esclerose múltipla, aterosclerose, asma e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC).
11. Utilização de uma combinação de anticorpos, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio inflamatório num individuo, caracterizada pelo facto de a referida combinação de anticorpos compreender um anticorpo de neutralização que se liga imuno-especificamente ao receptor 4 do tipo Toll (RST4) e um anticorpo de neutralização que se liga imuno-especificamente ao receptor 2 do tipo Toll (RST2) , em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada, pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 25, respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 incluir uma região variável da cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59.
12. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo facto de o anticorpo anti-RST4 compreender RDCs de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 23, 24 e 25 e RDCs de cadeia 3 13. leve com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 28, 29 e 30. Utilização, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o anticorpo anti-RST4 conter uma região variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. 14. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo facto de a combinação de anticorpos ainda compreender um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente a DM-2 ou um anticorpo de neutralização que liga imunoespecif icamente um receptor semelhante a Toll, seleccionado no grupo que consiste no receptor semelhante a Toll 1 (RST1), receptor semelhante a Toll 5 (RST5) e receptor semelhante a Toll 6 (RST6). 15. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo facto de o indivíduo ser um ser humano. 16. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo facto de o distúrbio inflamatório ser septicémia, uma doença auto-imune, um distúrbio inflamatório crónico ou um distúrbio inflamatório agudo. Utilização, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo facto de o distúrbio inflamatório crónico se seleccionar no grupo consistindo em distúrbio inflamatório do intestino, artrite reumatóide, 4 17. osteoartrite, esclerose múltipla, aterosclerose, asma e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC).
18. Composição, caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo de neutralização que se liga imuno-especificamente ao receptor semelhante a Toll 4 (RST4), um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente ao receptor semelhante a Toll 2 (RST2) e um anticorpo de neutralização que se liga imunoespecificamente a DM-2, em que o anticorpo anti-RST4 compreende três RDCs de cadeia pesada pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 23, 24 e 25, respectivamente e três RDCs de cadeia leve pelo menos 90 % idênticas às SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente e o anticorpo anti-RST2 incluir uma região variável de cadeia pesada, como se mostra na SEQ ID NO: 56 e uma região variável da cadeia leve, conforme se mostra na SEQ ID NO: 59. Lisboa, 23 de Agosto de 2010. 5