JP7016184B2 - microRNA-21を標的とした変形性関節症による疼痛の緩和 - Google Patents
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Description
[1] miR-21阻害薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[2] miR-21阻害薬が、関節液中のmiR-21に結合し機能阻害する、[1]の変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[3] miR-21阻害薬がmiR-21に結合し機能阻害する核酸である、[1]または[2]の変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[4] miR-21阻害薬が、配列番号1で表される塩基配列の全部または連続した一部配列に相補的な配列を含む配列からなる核酸である、[1]~[3]のいずれかの変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[5] TLR拮抗薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[6] TLR拮抗薬がTLR7、TLR8またはTLR9の拮抗薬である、[5]の変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[7] TLR拮抗薬がTLR7またはTLR8の拮抗薬である、[6]の変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[8] TLR拮抗薬がTLR8の拮抗薬である、[7]の変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[9] TLR拮抗薬が、inhibitoryオリゴデオキシヌクレオチドである、[5]~[8]のいずれかの変形性関節症による疼痛の緩和薬。
[10] [1]~[4]のいずれかのmiR-21阻害薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬と[5]~[9]のいずれかのTLR拮抗薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬とを組合せた、変形性関節症による疼痛の緩和薬。
本発明において、miR-21阻害薬は、miR-21の発現を阻害するものも、miR-21のサイレンシング機能を阻害するものも含み、miR-21に結合し最終的にmiR-21の活性および機能を阻害し得る。miR-21阻害薬をmiR-21活性阻害薬ともいう。
TLR拮抗薬は、TLR7、TLR8、TLR9のいずれかに作用し、これらの作用を阻害する。従って、TLR拮抗薬として、TLR7、TLR8およびTLR9のいずれかの作用を阻害することがわかっている化合物を用いることができる。TLR7およびTLR8はイミダゾキノリン等の低分子化合物や1本鎖RNAをリガンドとし、TLR9は非メチル化CpGDNAをリガンドとし、これらのリガンドと類似した構造を有する化合物がTLRに結合すると、TLRとリガンドの結合を阻害し、TLR拮抗薬として作用する。TLR拮抗薬をTLRアンタゴニストあるいはTLR阻害薬とも呼ぶ。
配列番号3において、「2OMeG」は2'-O-メチルグアノシンを、「2OMeU」は2'-O-メチルウリジンを、「5Med」は5-メチル-2'-デオキシシチジンを、「7deazadG」は7-デアザ-2'-デオキシグアノシンを示す。
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3'(IRS661)(配列番号4)
5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3’(IRS954)(配列番号5)
5'-TCCTGGCGGGGAAGT-3'(INH-ODN-24888(iODN2088))(配列番号6)
5'-TTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(iODN(ttaggg)4)(配列番号7)
5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3’(Dual-iODN)(配列番号8)
本発明者はラットの変形性関節症モデルを用いて、仮説を確認することとした。
変形性関節症の疼痛は関節病変ではなく滑膜炎と相関することが報告されていることから、滑膜におけるmicroRNAの発現上昇が変形性関節症の疼痛に関与している可能性が考えられる。
後記の参考例3の検討を行い、滑膜および関節液のquantitative polymerase chain reaction(定量的PCR)で、microRNA-21(miR-21)の発現が増加していることを確認した。
後記の参考例1~3の結果により、変形性関節症の疼痛患者では、miR-21の発現が増えることが明らかになったことから、miR-21の発現を抑制できれば、疼痛が緩和されることが予測される。
最近の研究では、細胞外microRNAが細胞内にあるTLR7に結合後、様々な生理作用を示すことが報告されている。TLR7は、痛みなどの感覚機能に関係している小径の脊髄後根神経節(DRG)ニューロン(知覚神経)に発現しており、疼痛制御に関与していることが知られている。このように細胞外microRNA が痛みに関与していることを示唆する論文は散見されるものの、細胞外microRNA が知覚神経の活性化を介して、直接痛みを誘発するかどうかは不明である。
後記の実施例2において、miR-21の機能を阻害するS-TuDを関節内に投与したところ、ACLTモデルラットに生じた疼痛を長期的に緩和した。
後記の実施例4において、miR-21 阻害薬と同様にTLR 拮抗薬でも鎮痛作用が得られることを確認した。
ヒトでは前十字靭帯を断裂した患者では、経年的に変形性関節症を発症することが報告されている。そのため、この患者を模した動物モデルであり鎮痛薬の効能評価に用いられるACLTモデルラットと、sham surgery(偽手術)群を用いて、経時的な痛覚の変化を評価することとした。
参考例1でACLTモデルラットでは、ACLT術後14日目の段階で痛覚過敏になっていることから、疼痛を発症していると考え、ACLT術後14日目のACLTモデルラットとsham surgery群の膝関節の滑膜においてmicroRNAの発現変化をマイクロアレイにより網羅的に解析した。その結果、複数のmicroRNAが増加することを確認した。このうち最も発現量が多く、増加率の高かったmiR-21に注目することにした。
ACLT術後14日目のACLTモデルラット群とsham surgery群の滑膜および関節液におけるmiR-21の発現量を定量的PCRで確認したところACLTモデル群で有意に発現が増加していた。図3に滑膜(A)および関節液中(B)のmiR-21の発現量を示す。
正常ラットの膝の関節腔内にmiR-21またはコントロールとしてmiR-21の塩基配列のうちTLRによって認識されるために重要な部分の1塩基を変更したmutant miRNA(5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUGGA-3')(配列番号10)を注射し、von Frey testで痛覚の評価を行ったところ、miR-21投与群では注射後1時間で有意に痛覚過敏が生じたが、mutant miRNA投与群では、痛覚の閾値に大きな変化がないことが分かった。図4に結果を示す。
つまり、膝関節腔内のmiR-21が増加することにより、疼痛が発生することが分かった。
正常ラットの膝の関節腔内にmiR-21とユーロフィンジェノミクス株式会社に注文して作製したTLR 7、 8、 9 拮抗薬(CTATCT[2OMeG][2OMeU][5MedC][7deazadG]TTCTCT[2OMeG][2OMeU])(配列番号3)を同時に注射した後、von Frey testで痛覚の評価を行ったところ、control核酸(CTATCTCACCTTCTCTGT)(配列番号9)を投与した場合と比べて、有意に痛覚過敏を改善させた。結果を図5に示す。
ACLT術後14日目のACLTモデルラットの膝関節腔内にmiR-21の機能を阻害するS-TuD(株式会社ジーンデザインより入手)を注射し、痛覚の評価を行ったところ、PAMでは投与後7、14、21日目、von Frey testでは投与後7、14日目の疼痛閾値を有意に緩和させた。図6AにPAMの結果を、図6Bにvon Frey testの結果を示す。
疼痛発症後、1回miR-21阻害薬を関節内に注射投与することで、継続的に疼痛緩和効果があることが分かる。
ACLT術後14日目のACLTモデルラットの膝の関節腔内にmiR-21阻害薬であるIDT(登録商標)miRNA Inhibitor(Integrated DNA Technologies(IDT)より入手)を注射し、PAM、von Frey testで痛覚の評価を行った。S-TuDの時と同様に、投与後に疼痛閾値が緩和したことが分かる。図7AにPAMの結果を、図7Bにvon Frey testの結果を示す。
このことにより、miR-21阻害薬であれば、疼痛閾値が緩和することが予測される。
ACLT術後14日目のACLTモデルラットの膝の関節腔内にTLR7、8、9 拮抗薬を注射で投与し、痛覚の評価を行ったところ、PAMでは投与後7、14、21日目、von Frey testでは投与後7、14日目の疼痛閾値を有意に緩和させた。図8AにPAMの結果を、図8Bにvon Frey testの結果を示す。
図9AにACLT術後のPAMの結果、図9BにACLT術後のvon Frey testの経過を示す。
参考例1はACLT後28日までのデータであったが、さらにACLT後56日まで調査を行った。PAMでは術後14日目から56日目までACLT施行群で有意に疼痛の閾値が低下していた。von Frey testでは術後14日目から28日目までACLT施行群で有意に疼痛の閾値が低下しており、術後35日から56日目もACLT群で閾値が低い傾向を認めた。
参考例3に加えて、ACLT術後42日目のACLTモデルラット群とSham Surgery群の滑膜(A)および関節液(B)におけるmiR-21の発現量を定量的PCRで確認したところ、ACLTモデル群で有意に発現が増加していた。図10では参考例3の結果も含め、散布図で結果を示した。
関節液のmiR-21の由来を調査するために、正常ラットの滑膜と軟骨を24時間培養し、培養液中に放出されたmiR-21量を定量的PCRで調べた。図11で示すように滑膜の方が約270倍多くmiR-21を放出していた。
von Frey testで疼痛を評価した参考例4に加えて、miR-21の関節腔投与後の疼痛をPAMでも評価した。図12のようにmiR-21投与群では投与1時間後に疼痛の閾値が低下した。一方mutant(miR-21から1塩基を変更した核酸)投与群では閾値に大きな変化はなかった。
つまり関節腔内のmiR-21が増加することにより、疼痛が発生することが分かった。
関節内の細胞外miR-21が作用するTLR7を発現している標的細胞を調べるために、関節内に分布している感覚神経の細胞体を逆行性トレーサーであるDiIの関節腔内投与により標識し、TLR7が存在するかを蛍光免疫染色で確認した。図13に結果を示す。図13(A)はDiIによる染色、図13(B)はTLR7に対する免疫化学染色、図13(C)は(A)と(B)の2つを重ね合せた染色像を示す。DiIで標識された細胞の約26.7%はTLR7を発現していた。
これらによって、miR-21の作用部位が関節内にあることを示すことができた。
動物モデルと同様にヒトの滑膜・関節液中でもmiR-21が増加しているかを調査した。日本医科大学付属病院整形外科・リウマチ外科を受診した20歳以上の患者のうち(1)外来診察室で膝関節穿刺を受ける変形性膝関節症(Kellgren-Lawrence分類 グレード3以上)の患者で痛みのVisual Analog Score(VAS、100点満点で点数が高いほど痛みが強い)が50mm未満の患者、(2)変形性関節症を有さない膝関節鏡視下手術を受ける患者で痛みのVASが50mm未満の患者、(3)変形性関節症に対して片側人工膝関節置換術を受ける患者について、(1)~(3)の関節液、(2)・(3)の滑膜を採取し、miR-21量を調べた。
von Frey testでmiR-21とTLR7、8、9拮抗薬を同時に関節内投与した実施例1に加えて、注射後の疼痛をPAMでも評価した。図17で示すように、miR-21と同時にTLR7、8、9拮抗薬を投与した群では、miR-21と対照薬を投与した群に比べて投与1時間後に疼痛の閾値が有意に高かった。
つまりmiR-21関節腔内投与による疼痛はTLR7、8、9拮抗薬で緩和されることが分かった。
TLR7、8、9拮抗薬を用いた実施例1および5と同様の実験を、TLR7特異的拮抗薬を用いて行った。miR-21と同時にTLR7特異的拮抗薬を投与した群では、miR-21と対照薬を投与した群に比べて、投与1時間後にPAMおよびvon Frey testのいずれの試験でも疼痛の閾値が有意に高かった。図18はPAMの結果を、図19はvon Frey testの結果を示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (4)
- 配列番号1で表される塩基配列の全部または連続した一部配列に相補的な配列を含む配列からなる核酸であるmiR-21阻害薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬。
- 配列番号1で表される塩基配列の全部または連続した一部配列に相補的な配列を含む配列からなる核酸が、S-TuD及び2-O-MetとZENで修飾されたオリゴヌクレオチドであるIDT(登録商標)miRNA inhibitorからなる群から選択される、請求項1に記載のmiR-21阻害薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬。
- 配列番号3で表される配列からなる化合物であるTLR7、TLR8またはTLR9の拮抗薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬。
- 請求項1又は2に記載のmiR-21阻害薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬と請求項3に記載のTLR拮抗薬を有効成分として含む変形性関節症による疼痛の緩和薬とを組合せた、変形性関節症による疼痛の緩和薬。
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