ES2773489T3 - Modulación de enfermedades relacionadas con el sistema renina-angiotensina (RAS) mediante angiotensinógenos - Google Patents

Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado está dirigido a un ácido nucleico de angiotensinógeno (AGT), para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS, en donde la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS es hipertensión resistente.

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de enfermedades relacionadas con el sistema renina-angiotensina (RAS) mediante angiotensinógenos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la vía de RAS mediante la administración de un modulador de angiotensinógeno a un animal. La presente invención también se refiere a compuestos para su uso en el tratamiento de la hipertensión y el daño de órganos mediante la administración de un inhibidor de angiotensinógeno a un animal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El angiotensinógeno (AGT), también conocido como SERPINA8 o ANHU, es un miembro de la familia de las serpinas y es un componente de la vía del sistema renina-angiotensina (RAS) (también conocido como sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS)). Se produce principalmente en el hígado y se libera a la circulación, donde la renina la convierte en angiotensina I. La angiotensina I se convierte posteriormente en angiotensina II por la enzima convertidora de angiotensión (ECA). La angiotensina II es una hormona peptídica que provoca vasoconstricción que, a su vez, puede aumentar la presión sanguínea. La angiotensina II también estimula la secreción de la hormona aldosterona desde la corteza suprarrenal. La aldosterona hace que los riñones aumenten la reabsorción de sodio y agua llevando a un aumento del volumen de líquido en un cuerpo que, a su vez, puede aumentar la presión sanguínea. La sobreestimulación o la actividad de la vía RAS puede llevar a presión sanguínea alta arterial. La presión sanguínea alta crónica se conoce como hipertensión. La presión sanguínea alta en un sujeto hipertenso requiere que el corazón trabaje más para hacer circular la sangre a través de los vasos sanguíneos.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha identificado la hipertensión como una de las principales causas de morbilidad cardiovascular. La hipertensión es un factor de riesgo importante para varias enfermedades, trastornos y afecciones, como una esperanza de vida acortada, enfermedad renal crónica, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas de los vasos sanguíneos (por ejemplo, aneurisma aórtico), arteriopatía periférica, daño cardíaco (por ejemplo, agrandamiento o hipertrofia del corazón) y otras enfermedades, trastornos y/o afecciones relacionadas con enfermedades cardiovasculares.

La prevalencia de la hipertensión resistente (RHTN), hipertensión resistente al tratamiento farmacológico, ha aumentado constantemente en número debido probablemente al envejecimiento de la población y a una incidencia cada vez mayor de la obesidad. Se espera que la proyección actual de aproximadamente 10 millones de adultos con RHTN en los Estados Unidos continúe aumentando.

Los fármacos antihipertensivos, la denervación renal, la terapia de activación de los barorreceptores, los cambios en la dieta y los cambios en el estilo de vida pueden reducir la hipertensión y reducir las enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con la hipertensión (Paulis et al., Nat Rev Cardiol, 2012, 9:276-285). Sin embargo, existen limitaciones para las terapias actualmente aprobadas para tratar la hipertensión, ya que un subconjunto significativo de todos los pacientes hipertensos no logran un control adecuado de la presión sanguínea. Por ejemplo, los fármacos como los inhibidores de la ECA y los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) que se dirigen a partes de la vía RAS tienen una capacidad limitada para inhibir la vía RAS (Nobakht et al., Nat Rev Nephrol, 2011, 7:356-359).

Por consiguiente, hay una necesidad de encontrar tratamientos alternativos para inhibir la vía RAS y tratar la hipertensión, especialmente la hipertensión resistente. La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de ciertos productos genéticos. Ciertos oligonucleótidos antisentido tempranos dirigidos a AGT han proporcionado un beneficio limitado (WO 1997/33623). Las composiciones divulgadas en la presente son excepcionalmente útiles para aplicaciones terapéuticas para la modulación de AGT.

RMA van de Wal et al. (Int J Cardiol, 2006, 3: 367-372) describe determinantes de los niveles de angiotensina II aumentados en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica grave a pesar de la inhibición de la ECA.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente se proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado está dirigido a un ácido nucleico de angiotensinógeno (AGT), para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS, en donde la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS es hipertensión resistente.

En la presente se divulgan métodos, compuestos y composiciones para modular los niveles de ARNm y/o proteína de AGT en un animal. En la presente se divulgan métodos, compuestos y composiciones para modular los niveles de ARNm y/o proteína de AGT en un animal para modular una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía ^rA^s en el animal. También se divulgan en la presente métodos, compuestos y composiciones para identificar a un animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a AGT al animal para: mejorar la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS en el animal; tratar al animal en riesgo de enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS; inhibir la expresión de AGT en el animal que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS; reducir el riesgo de enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS en el animal; tratar el daño a los órganos dependiente de RAS en un animal que padece una enfermedad relacionada con la vía RAS. En ciertas realizaciones, el modulador de AGT o compuesto dirigido a AGT es un inhibidor específico de AGT.

En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT disminuyen los niveles de ARNm y/o proteína de AGT. En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT son ácidos nucleicos, proteínas o moléculas pequeñas. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado.

En ciertas realizaciones, un animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS se trata seleccionando al animal que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS y administrando al animal un cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados. El oligonucleótido modificado puede ser complementario a un ácido nucleico de AGT como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16.

En ciertas realizaciones, un animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS se trata seleccionando el animal que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS y administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazado y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas complementarias a un segmento objetivo o región objetivo de las SEQ ID NO: 1-16 como se describe en la presente.

En ciertas realizaciones, la modulación de AGT se produce en una célula, tejido, órgano u organismo. En ciertas realizaciones, la célula, tejido u órgano está en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm de AGT se reducen. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de proteína de AGT. Tal reducción puede producirse de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.

También se divulgan métodos, compuestos y composiciones útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con RAS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativa. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los encabezados de sección usados en la presente son solo para propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos del contenido descrito.

Definiciones

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritos en la presente son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.

"Nucleótido de 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende una fracción de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo.

"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.

"Aproximadamente" significa dentro del ±10% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos inhibieron la AGT en por lo menos aproximadamente un 70%", se implica que los niveles de AGT se inhiben dentro de un intervalo del 63% al 77%.

El "escape de la ECA", también conocido como reactivación de la angiotensina II, se refiere a la incapacidad del tratamiento con inhibidores de ECA actualmente disponible para suprimir de manera fiable los niveles de angiotensina II plasmáticos. El aumento en los niveles plasmáticos de angiotensina II durante la inhibición de ECA se produce a través de otras enzimas que convierten la angiotensina I en angiotensina. Este bloqueo incompleto de los niveles de angiotensina II impide que los inhibidores de ECA traten eficazmente a algunos sujetos hipertensos. Los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) también pueden ser susceptibles al escape de ECA ya que otros receptores además del receptor AT1 se acoplan a los metabolitos de angiotensina.

"Agente farmacéutico activo" o "agente farmacéutico" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a AGT es un agente farmacéutico activo. "Región objetivo activa" o "región objetivo" significa una región a la que se dirige uno o más compuestos antisentido activos.

"Compuestos antisentido activos" significa los compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico o los niveles de proteína objetivo.

"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación, o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no necesitan ser co-extensivos.

"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo e incluye, pero no está limitado a, la administración por un profesional médico y la autoadministración.

"Escape de aldosterona" o "desprendimiento de aldosterona" se refieren a la incapacidad del inhibidor de ECA actualmente disponible, bloqueador del receptor de angiotensina (ARB) y/o el tratamiento con inhibidor directo de la renina (DRI) para suprimir de manera fiable la liberación de aldosterona en algunos sujetos tratados. Este bloqueo incompleto de la aldosterona impide que los inhibidores de ECA, los DRI y los ARB traten eficazmente a algunos sujetos hipertensos.

"Mejora" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. En ciertas realizaciones, la mejora incluye un retraso o ralentización en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la mejora de la hipertensión puede evaluarse midiendo la presión sanguínea sistólica y diastólica. "Angiotensinógeno" y "AGT" se usan indistintamente en la presente. El angiotensinógeno también se conoce como SERPINA8 y ANHU.

"Ácido nucleico de angiotensinógeno" o "ácido nucleico de AGT" significa cualquier ácido nucleico que codifica AGT. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de AGT incluye una secuencia de ADN que codifica AGT, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica AGT (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica AGT. "ARNm de AGT" significa un ARNm que codifica una proteína de AGT.

"Inhibidor específico de AGT" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de ARNm de ^a G^t y/o proteína AGT a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de AGT incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido como ARNhc, ARNip y compuestos antisentido blockmer), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir específicamente la expresión de ARNm de AGT y/o proteína de AGT. En ciertas realizaciones, al modular específicamente el nivel de ARNm de AGT y/o la expresión de la proteína de AGT, los inhibidores específicos de AGT pueden afectar a los componentes de la vía del sistema renina-angiotensina (RAS). En ciertas realizaciones, modulando específicamente el nivel de ARNm de AGT y/o la expresión de la proteína de AGT, los inhibidores específicos de AGT pueden afectar a enfermedades, trastornos y/o afecciones relacionadas con la vía RAS como la presión sanguínea. De manera similar, en ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT pueden afectar a otros procesos moleculares en un animal.

"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero no están limitados a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés. "Fármaco antihipertensivo" se refiere a un fármaco capaz de bajar la presión sanguínea. Los ejemplos de tales fármacos incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de RAS, diuréticos, bloqueadores de los canales de calcio, antagonistas de los receptores adrenérgicos, agonistas y vasodilatadores adrenérgicos. En un ejemplo, puede usarse el fármaco antihipertensivo captopril en combinación con el compuesto de AGT descrito en la presente para tratar a un animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS.

"Procedimiento antihipertensivo" se refiere a un procedimiento médico realizado en un sujeto para reducir la hipertensión. Ejemplos de tales procedimientos incluyen la denervación renal y la terapia de activación de barorreceptores,

"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo.

"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de unión a hidrógeno.

"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína objetivo en ausencia del compuesto antisentido.

“Oligonucleótido antisentido” significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.

"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado por el puente de dos átomos del anillo no germinal. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.

"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico.

"Presión sanguínea" se refiere a la presión de la sangre en el sistema circulatorio contra las paredes del vaso sanguíneo. La presión sanguínea se debe principalmente a los latidos del corazón en un animal. Durante cada latido, la presión sanguínea varía entre una presión sanguínea máxima (sistólica) (PAS) y una presión sanguínea mínima (diastólica) (PAD). La presión sanguínea media (PAM) es la presión sanguínea media durante un ciclo de latidos cardíacos. La presión sanguínea puede medirse con un medidor de presión sanguínea (es decir, un esfigmomanómetro). La presión sanguínea normal en reposo está dentro del intervalo de 100-140 mmHg sistólica y 60-90 mmHg diastólica y se expresa comúnmente como la presión sistólica (lectura superior)/presión diastólica (lectura inferior) mmHg.

"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.

"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas.

"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración abarca la administración concomitante, paralela o secuencial.

"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.

"Etilo restringido" o "cEt" se refiere a un nucleósido bicíclico que tiene un azúcar furanosilo que comprende un puente de metil(metileneoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') entre los átomos de carbono 4' y 2'.

"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.

"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.

"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no fácilmente acomodado por una única inyección, por lo tanto, pueden usarse dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de manera continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.

"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo con necesidad del agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a ser tratado, el grupo taxonómico de los individuos a ser tratados, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes. En un ejemplo, una cantidad eficaz de un oligonucleótido antisentido de AGT disminuye la presión sanguínea y/o mejora el daño a los órganos debido a la hipertensión.

"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.

"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H está colocada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o los nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "segmento de hueco" y las regiones externas pueden denominarse "segmentos de ala".

"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.

"Hipertensión" o "HTN" se refiere a una afección médica crónica en la que la presión sanguínea en un animal está elevada. La presión sanguínea elevada requiere que el corazón trabaje más para hacer circular la sangre a través de los vasos sanguíneos. Se dice que la presión sanguínea alta está presente si es persistentemente igual o superior a 140/90 mmHg. La hipertensión se clasifica como primaria (esencial) o secundaria. La hipertensión primaria no tiene una causa clara y se piensa que está relacionada con la genética, la dieta, la falta de ejercicio y la obesidad. La hipertensión secundaria está provocada por otra afección médica. La hipertensión es un factor de riesgo importante para la esperanza de vida acortada, enfermedad renal crónica, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas de los vasos sanguíneos (por ejemplo, aneurisma aórtico), arteriopatía periférica, daño orgánico (por ejemplo, agrandamiento o hipertrofia del corazón) y otras enfermedades, trastornos y/o afecciones cardiovasculares o síntomas de los mismos. Los fármacos antihipertensivos, los cambios en la dieta y los cambios en el estilo de vida pueden reducir la hipertensión y las enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con la hipertensión. La hipertensión puede ser no resistente a la intervención farmacológica (es decir, controlable mediante terapias farmacológicas disponibles comercialmente) o resistente a la intervención farmacológica. "Identificar un animal que tiene, o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS" significa identificar a un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS o identificar un animal predispuesto a desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS incluyen, por ejemplo, individuos con antecedentes familiares de una enfermedad relacionada con RAS como la hipertensión. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar.

"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.

"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.

Nucleósidos enlazados” significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.

"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).

“Nucleobase modificada” se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado y/o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.

"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.

"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.

"Modular" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ARNm de AGT puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de AGT y/o proteína de AGT en una célula, tejido, órgano u organismo. La modulación del ARNm y/o proteína de AGT puede llevar a un aumento o disminución de una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de AGT puede ser un modulador que aumenta o disminuye la cantidad de ARNm de AGT y/o proteína de AGT en una célula, tejido, órgano u organismo. "Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.

"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.

"Fracción de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).

"Hipertensión no resistente", "hipertensión no refractaria" o "hipertensión controlada" se define como la hipertensión que responde al tratamiento que da como resultado, por ejemplo, presión sanguínea <140 mmHg PAS o <90 mmHg PAD con el uso concurrente de hasta 3 agentes antihipertensivos.

"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de cadena doble, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (ARNmi).

“Nucleobase” significa una fracción heterocíclica capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico. "Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace, o modificación de nucleobase.

"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada a un azúcar.

"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.

"Daño a órganos" o "daño a órganos final" se refiere al daño que se produce en los órganos principales alimentado por el sistema circulatorio como el corazón (por ejemplo, hipertrofia del músculo cardíaco, función cardíaca reducida y/o insuficiencia cardíaca), riñón (por ejemplo, albuminurea, proteinurea, función renal reducida y/o insuficiencia renal), ojos (por ejemplo, retinopatía hipertensiva), cerebro (por ejemplo, accidente cerebrovascular) y similares. Los órganos pueden dañarse por la hipertensión en un animal. En ciertas realizaciones, el daño cardíaco es fibrosis, hipertrofia de células cardíacas y/o musculares que lleva a agrandamiento del corazón.

"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.

"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno del otro.

"Administración parenteral" significa administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.

"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuada para administrarse a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.

"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.

"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.

“Porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.

"Prevenir" se refiere a retrasar o impedir el inicio, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.

"Sistema renina-angiotensina", "vía del sistema renina-angiotensina", "vía RAS" o "RAS" se refieren a una vía enzimática de múltiples componentes donde un componente precursor (angiotensinógeno) es convertido por varias enzimas como la renina y la enzima convertidora de angiotensina (ECA) en componentes en sentido descendente, como angiotensina I y angiotensina II. La angiotensina I estimula la secreción de la aldosterona esteroidea en la vía. Varios componentes de esta vía han sido objetivo de agonistas o antagonistas para bloquear la producción de los componentes. Por ejemplo, se han desarrollado inhibidores de renina, inhibidores de ECA, bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) y similares para inhibir o bloquear la vía RAS. Sin embargo, las terapias disponibles comercialmente dirigidas a varios componentes de la vía RAS han sido ineficaces para inhibir o bloquear completamente la vía RAS debido a varios mecanismos (Nobakht et al., Nat Rev Nephrol, 2011, 7:356-359).

"Enfermedad, trastorno y/o afección relacionado con RAS" o "Enfermedad, trastorno y/o afección relacionado con la vía RAS" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o afección relacionado con RAS o RAAS (Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona) en un animal. Los ejemplos de enfermedades, trastornos y/o afecciones relacionados con RAS incluyen una esperanza de vida acortada, hipertensión (por ejemplo, hipertensión no resistente, hipertensión resistente), enfermedad renal (por ejemplo, enfermedad renal crónica, enfermedad renal poliquística), accidente cerebrovascular, enfermedad cardíaca (por ejemplo, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, cardiopatía valvular), aneurismas de los vasos sanguíneos (por ejemplo, aneurisma aórtico), arteriopatía periférica, daño de los órganos (por ejemplo, daño o hipertrofia del corazón), fibrosis tisular y otras enfermedades cardiovasculares, trastornos y/o afecciones o síntomas de los mismos. En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno y/o afección relacionado con RAS no incluye hipertensión. "Hipertensión resistente" o "RHTN" se define como (1) presión sanguínea >140 mmHg PAS o >90 mmHg PAD a pesar del uso concurrente de 3 agentes antihipertensivos de diferentes clases de fármacos o (2) uso de >4 fármacos antihipertensivos independientemente de la presión sanguínea.

"Efectos secundarios" significa enfermedad y/o afecciones fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintos de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de inyección, anormalidades de la prueba de función hepática, anormalidades de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de la bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.

“Oligonucleótido de cadena sencilla” significa un oligonucleótido que no hibrida con una cadena complementaria.

"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. En un ejemplo, un compuesto antisentido es específicamente hibridable con un objetivo cuando la unión del compuesto al ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico objetivo para provocar una pérdida de actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar unión no específica del compuesto antisentido con secuencias de ácido nucleico no objetivo en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.

"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcripción de ARN objetivo" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser objetivo de compuestos antisentido.

"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.

"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para realizar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertas realizaciones, pueden administrarse una o más composiciones farmacéuticas al animal.

"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos de origen natural. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleótido) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleótido).

Ciertas realizaciones

En ciertas realizaciones, se divulgan en la presente compuestos que modulan específicamente AGT. En ciertas realizaciones, los moduladores específicos de AGT son inhibidores específicos de AGT, para uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno y/o afección relacionado con RAS. En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT son ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión del ARNm de AGT y/o proteína de AGT. En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT son oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son oligonucleótidos antisentido modificados.

En ciertas realizaciones, los compuestos se dirigen a un ácido nucleico de AGT. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de AGT es cualquiera de las secuencias humanas expuestas en el N° de registro GENBANK NM_000029.3 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), el N° de registro GENBANK CR606672.1 (incorporado en la presente como s Eq ID NO: 2), N° de registro GENBANK AK307978.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de registro GENBANK AK303755.1 (incorporado en la presente como SEQ ID ⁿO: 4), N° de registro GENBANK AK293507.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5), y el complemento de los nucleótidos 24354000 a 24370100 de N° de registro GENBANK NT_167186.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 6). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de AGT es cualquiera de las secuencias de ratón establecidas en N° de Registro GENBANK NM_007428.3 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de Registro GENBANK W13136.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de Registro GENBANK AI785758.1 (incorporado en la presente como SEQ ⁱD NO: 9), N° de Registro GENBANK BG863202.1 (incorporado en la presente como SEQ ID nO: 10), el complemento del N° de Registro GENBANK BF020372.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 11), y el complemento de los nucleótidos 51911800 a 51928000 del N° de Registro GENBANK NT_078575.6 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 12). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de AGT es cualquiera de las secuencias de ratas expuestas en el N° de Registro GENBANK NM_134432.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 13), N° de Registro GENBANK CV104009.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 14), N° de Registro G^e N^bANK BF549490.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 15), y el complemento de los nucleótidos 17172500 a 17188250 del N° de Registro GENBANK NW_047536.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 16).

En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a AGT descritos en la presente son para su uso en la modulación de la expresión de AGT. En ciertas realizaciones, los moduladores de AGT son inhibidores específicos de AGT. En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de AGT disminuyen la expresión de AGT y/o la vía RAS. En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a AGT inhiben la vía RAS en por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se usan para inhibir la expresión de AGT en un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS que comprende seleccionar el animal que padece la enfermedad, trastorno o afección relacionado con la vía RAS y, administrar un compuesto dirigido a AGT al animal, en donde el compuesto administrado al animal inhibe la expresión de AGT en el animal que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente son para su uso en el tratamiento de un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS que comprende seleccionar el animal que tiene, o está en riesgo de tener, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS, y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a AGT al animal, en donde el compuesto administrado al animal trata al animal que tiene, o está en riesgo de tener, la enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS, en el animal.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente son para su uso en el tratamiento de un animal que tiene, o está en riesgo de tener, daño en los órganos dependiente de RAS que comprende seleccionar un animal que padece una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS, y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dirigido a AGT al animal, en donde el compuesto administrado al animal trata y/o revierte el daño al órgano final dependiente de RAS en el animal con la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía de RAS. En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS es hipertensión. En ciertas realizaciones, el daño al órgano final es hipertrofia del músculo cardíaco.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente son para su uso en el tratamiento de un animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad relacionada con la vía RAS que comprende seleccionar al animal que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad relacionada con la vía RAS y administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado es complementario a un ácido nucleico de AGT como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16, y en donde el compuesto administrado al animal trata al animal que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad relacionada con la vía RAS.

En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS es esperanza de vida acortada, hipertensión, enfermedad renal (por ejemplo, enfermedad renal crónica), accidente cerebrovascular, enfermedad cardíaca (por ejemplo, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, enfermedad cardíaca valvular), aneurismas de los vasos sanguíneos, enfermedad arterial periférica, daño a órganos y otras enfermedades cardiovasculares, trastornos y/o afecciones o síntomas de los mismos. En ciertas realizaciones, la hipertensión es hipertensión no resistente o hipertensión resistente. En ciertas realizaciones, el aneurisma de los vasos sanguíneos es aneurisma aórtico. En ciertas realizaciones, el daño a los órganos es hipertrofia o fibrosis del músculo cardíaco en un órgano o tejido. En ciertas realizaciones, el órgano es corazón, hígado o riñón y el tejido se deriva del corazón, hígado o riñón. En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS no es hipertensión.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se usan para tratar la hipertensión no resistente que comprende seleccionar el animal que tiene o está en riesgo de tener hipertensión no resistente, y administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado es complementario a un ácido nucleico de AGT como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16, y en donde el compuesto administrado al animal trata al animal que tiene o está en riesgo de tener hipertensión no resistente. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado se administra en combinación con uno o más fármacos antihipertensivos.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se usan para tratar la hipertensión resistente que comprende seleccionar el animal que tiene o está en riesgo de tener hipertensión resistente, y administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado es complementario a un ácido nucleico de AGT como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16, y en donde el compuesto administrado al animal trata al animal que tiene o está en riesgo de tener hipertensión resistente. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado se administra en combinación con uno o más fármacos antihipertensivos.

En ciertas realizaciones, se divulgan métodos, compuestos y composiciones para modular un síntoma o marcador de una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS. En ciertas realizaciones, el marcador puede seleccionarse de uno o más de esperanza de vida acortada, hipertensión, enfermedad renal crónica, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, enfermedad cardíaca valvular, aneurismas de los vasos sanguíneos, enfermedad arterial periférica, daño a los órganos y otras enfermedades cardiovasculares, trastornos y/o afecciones o síntomas de las mismas.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleobases por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% complementaria a una porción de igual longitud de las SEQ ID NO: 1-16. En ciertas realizaciones, el compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobases 100% complementaria a una porción de igual longitud de las SEQ ID NO: 1-16.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19 o por lo menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobases complementaria a cualquiera de las secuencias mencionadas en las SEQ ID NO: 1-16.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleósidos enlazados.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos consisten de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden por lo menos un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden por lo menos un nucleósido que comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo (2'MOE).

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden por lo menos un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido modificado que comprende: (i) un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados, en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido modificado que comprende: (i) un segmento de hueco que consiste de ocho a dieciséis desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste de dos a seis nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste de dos a seis nucleósidos enlazados, en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

En ciertas realizaciones, los compuestos para su uso en los métodos comprenden un oligonucleótido antisentido modificado que comprende: (i) un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados, en donde el segmento de hueco se coloca inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.

En ciertas realizaciones, el animal es un humano.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en la presente se administran a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS. En ciertas realizaciones, la administración a un animal es por vía parenteral. En ciertas realizaciones, la administración parenteral es cualquiera de administración subcutánea o intravenosa. En ciertas realizaciones, el compuesto se administra al animal como máximo una vez al día, como máximo una vez a la semana, como máximo una vez cada dos semanas, como máximo una vez al mes, como máximo una vez al trimestre, como máximo una vez cada medio año, como máximo una vez al año, como máximo una vez cada cinco años o como máximo una vez cada diez años.

En ciertas realizaciones, el compuesto se coadministra con uno o más segundos agentes. El compuesto divulgado en la presente y uno o más segundos agentes pueden administrarse concomitantemente o secuencialmente.

En ciertas realizaciones, el segundo agente es un fármaco antihipertensivo, un procedimiento para disminuir la hipertensión, un cambio de dieta y/o un cambio de estilo de vida.

Los ejemplos del fármaco antihipertensivo incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de un inhibidor de RAS, diurético, bloqueador de los canales de calcio, antagonista del receptor adrenérgico, agonista adrenérgico y vasodilatador.

En ciertas realizaciones, el compuesto u oligonucleótido está en forma de sal.

En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones se formulan con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, se divulga el uso de un compuesto dirigido a AGT como se describe en la presente en la fabricación de un medicamento. En ciertas realizaciones, se divulga el uso de un compuesto dirigido a AGT como se describe en la presente para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico de AGT, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con RAS. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de AGT es un ácido nucleico (incluyendo un compuesto antisentido), péptido, anticuerpo, molécula pequeña u otro agente capaz de inhibir la expresión del ARNm de AGT y/o proteína de AGT. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de AGT es un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado. En ciertas realizaciones, el AGT tiene una secuencia como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16.

En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de AGT se usa para reducir la expresión de AGT. El compuesto de AGT puede usarse en terapia de combinación con uno o más agentes o terapias adicionales como se describe en la presente. Los agentes o terapias pueden administrarse concomitante o secuencialmente a un animal.

En ciertas realizaciones, se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad y/o afección, enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS, en donde el kit comprende: (i) un inhibidor específico de AGT como se describe en la presente; y opcionalmente (ii) un agente o terapia adicional como se describe en la presente.

Un kit de la presente divulgación puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS como se describe en la presente.

Compuestos antisentido

Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico de AGT tiene una longitud de 10 a 30 nucleótidos. En otras palabras, los compuestos antisentido son de 10 a 30 nucleobases enlazadas. En otras realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 8 a 80, 10 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 nucleobases enlazadas. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleobases enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.

En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un único nucleósido eliminado del extremo 5' (truncamiento 5'), la porción central o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos o más nucleósidos eliminados del extremo 5', dos o más nucleósidos eliminados de la porción central o, alternativamente, puede tener dos o más nucleósidos eliminados del extremo 3'. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse a través del oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene uno o más nucleósidos eliminados del extremo 5', uno o más nucleósidos eliminados de la porción central y/o uno o más nucleósidos eliminados del extremo 3'.

En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado alargado o largo. Cuando un único nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede localizarse en el extremo 5', el extremo 3' o la porción central del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5' (adición 5'), al extremo 3' (adición 3') o la porción central, del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido puede dispersarse a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene uno o más nucleósidos añadidos al extremo 5', uno o más nucleósidos añadidos al extremo 3', y/o uno o más nucleósidos añadidos a la porción central.

Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.

Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.

Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases, en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuesto por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.

Motivos de compuestos antisentido

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de AGT tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como una actividad inhibidora aumentada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia aumentada a la degradación de las nucleasas, una captación celular aumentada, una afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico objetivo y/o una actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.

Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2'-modificados (tales nucleósidos 2'-modificados pueden incluir 2'-MOE, y 2'-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados en el azúcar bicíclicos (tales nucleósidos modificados en el azúcar bicíclicos pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2) Cada región distinta comprende fracciones de azúcar uniformes o comprende diferentes tipos de fracciones de azúcar. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región del ala 5', "Y" representa la longitud de la región de hueco, y "Z" representa la longitud de la región de ala 3'. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada uno del segmentos del ala 5' y el segmento del ala 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de hueco, o el segmento de hueco y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar en el segmento de ala X son iguales. En algunas realizaciones, los tipos de fracciones de azúcar en el segmento de ala X son diferentes. En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar en el segmento de ala Z son iguales. En algunas realizaciones, los tipos de fracciones de azúcar en el segmento de ala Z son diferentes.

En una realización preferida, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden tener cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmers incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1, 2-6-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1, 2-6-2, 2-13-2, 1-8-2, 2-8­ 3, 3-10-2, 1-18-2, o 2-18-2.

En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido como un motivo "wingmer", que tiene una configuración de ala-huecoo hueco-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describe anteriormente para la configuración gapmer. Por tanto, las configuraciones wingmer incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 o 5-13.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico AGT poseen un motivo gapmer 5-10-5. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de AGT poseen un motivo gapmer 3-14-3. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico AGT poseen un motivo gapmer 2-13-5.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT tiene un motivo de hueco ampliado. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de hueco ampliado dirigido a un ácido nucleico de AGT tiene un segmento de hueco de catorce 2'-desoxirribonucleósidos colocados inmediatamente adyacentes y entre segmentos de ala de tres nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'. En otra realización, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE.

En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de hueco ampliado dirigido a un ácido nucleico de AGT tiene un segmento de hueco de trece 2'-desoxirribonucleósidos colocados inmediatamente adyacentes y entre un segmento de ala 5' de dos nucleósidos modificados químicamente y un segmento de ala 3' de cinco nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'. En otra realización, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE.

Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos

Las secuencias de nucleótidos que codifican AGT humana incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de registro GENBANK NM_000029.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de registro GENBANK CR606672.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de registro GENBa Nk AK307978.1 (incorporada en la presente como SEQ ID ⁿO: 3), N° de registro GENBANK AK303755.1 (incorporada en la presente como SEQ ID nO: 4), N° de registro GENBANK AK293507.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 5), y el complemento de los nucleótidos 24354000 a 24370100 del N° de registro GENBANK NT_167186.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6).

Las secuencias de nucleótidos que codifican AGT de ratón incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de registro GENBANK NM_007428.3 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 7), N° de registro GENBANK W13136.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de registro GENBANK AI785758.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 9), N° de registro GENBANK BG863202.1 (incorporada en la presente como SEQ ID ⁿO: 10), el complemento del N° de registro GENBANK BF020372.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 11), y el complemento de los nucleótidos 51911800 a 51928000 del N° de registro GENBANK NT_078575.6 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 12). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de AGT es cualquiera de las secuencias de rata expuestas en N° de registro GENBANK NM_134432.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 13), N° de registro GENBANK CV104009.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 14), N° de registro GENBANK BF549490.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 15), y el complemento de los nucleótidos 17172500 a 17188250 de N° de registro GENBANK NW_047536.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 16).

Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (N° Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo. En ciertas realizaciones, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida del ácido nucleico. Las regiones estructuralmente definidas para AGT pueden obtenerse mediante el número de registro de bases de datos de secuencia como NCBI. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la región objetivo.

En ciertas realizaciones, un "segmento objetivo" es una sub-porción más pequeña de una región objetivo dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un segmento objetivo puede ser la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido. "Sitio objetivo 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.

Dirigir incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo con el que hibrida un compuesto antisentido, de tal manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.

Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden no estar superpuestos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por una cantidad de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de, aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios objetivo 5' o sitios objetivo 3' enumerados en la presente.

Segmentos objetivo adecuados pueden encontrarse dentro de una 5' UTR, una región de codificación, una 3' UTR, un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de parada.

La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera de objetivo).

Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles del ARNm de AGT son indicativas de inhibición de la expresión de AGT. Las reducciones en los niveles de una proteína de AGT también son indicativas de la inhibición de los niveles de ARNm objetivo. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de inhibición de la expresión de AGT. Por ejemplo, una disminución en la hipertensión puede ser indicativa de inhibición de la expresión de AGT. En otro ejemplo, una disminución en el tamaño del corazón puede ser indicativa de inhibición de la expresión de AGT. En otro ejemplo, una disminución en el nivel de angiotensina puede ser indicativa de inhibición de la expresión de AGT.

Hibridación

En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de AGT. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno de Hoogsteen invertido) entre las nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.

La hibridación puede producirse en varias condiciones. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán.

Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente son específicamente hibridables con un ácido nucleico de AGT.

Complementaríedad

Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de AGT).

Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de AGT pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de ^a G^t de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malaparemaiento o estructura de horquilla).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente, o una porción especificada de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de AGT, una región objetivo, segmento objetivo, o una porción especificada del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos de rutina. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo y, por lo tanto, caería dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básicas) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico objetivo, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de AGT, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases entero puede ser o no completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.

La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud no comprenden más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de AGT, o una porción especificada del mismo.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como como un ácido nucleico de AGT, o una porción especificada del mismo.

Los compuestos antisentido divulgados en la presente también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a por lo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones de nucleobase de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. Identidad

Los compuestos antisentido divulgados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número de Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como los compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido divulgados en la presente. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.

Modificaciones

Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, los grupos fosfato son referidos comúnmente como formando los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.

Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por la objetivo de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora mejorada.

Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.

Enlaces internucleosídicos modificados

El enlace internucleosídico de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, se seleccionan a menudo sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.

Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de AGT comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.

Fracciones de azúcar modificado

Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasas mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluiyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puentes de átomos de anillo no germinales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional de PCT WO2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) o la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (ver la Solicitud Internacional de PCT WO2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).

Los ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2-OCH3, 2-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2 'O-(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.

Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido divulgados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2 '(también denominado etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, ver la Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos ver la solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de, 2008); 4'-CH2-ON(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver la patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).

Informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos también pueden encontrarse en la bibliografía publicada (ver, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patente de Estados Unidos N° de serie 60/989.574; 61/026.995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes Internacionales de PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/10 6356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas incluyendo, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la Solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).

En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' de la fracción de azúcar pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y-N(Ra) -;

en donde:

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada Ra y R b es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radica alicíclico l C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, DO1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y

cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido, o un grupo protector.

En ciertas realizaciones, el puente de una fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O-o-C(RaRb)-ON(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-ON(R)-2'y4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por su configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, desde 6365 hasta 6372).

En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2 -O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-ON(R)-2') BNA, (E) oxiamino BNA (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metileneoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3 -2') BNA y (K) vinil BNA como se representa a continuación.

en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12.

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

-Qa-Qb-Qc -es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2 -, -CH2-ON(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;

Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X) NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;

cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;

o qe y qf juntos son = C(qg)(qh);

qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.

Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metileneoxi (4-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.

También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA, (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222) También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2-metilamino-BNA y se ha informado previamente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:

en donde:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, sustituido, alcoxilo C1-C12, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJ k, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y

qi y qj o ql y qk juntos son = C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.

Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).

Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4'-2' " o "nucleósido bicíclico 4' a 2' " se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de fracción de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.

Como se usa en la presente, "azúcar 2'-modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, incluyendo, pero no limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)bCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos 2'-sustituyentes también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-0-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:

En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar se seleccionan de los que tienen la Fórmula VII:

en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3'-terminal; q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, o C(=X)J1, OC(=X)NJJ2, NJ3 C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se divulgan nucleósidos de THP de fórmula VII en donde uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.

En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y las Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la fórmula siguiente:

En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos de azúcar son referidos en la presente como "morfolinos modificados".

También se divulgan sin limitación combinaciones, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos sustituidos 5', 2'-bis divulgados) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11/07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o uno 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la Solicitud de PCT publicada de propiedad compartida WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008,130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595­ 8602; Solicitud de PCT publicada, WO 06/047842; y la Solicitud PCT publicada WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.

en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:

Bx es una fracción de base heterocíclica;

T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de ciclohexenilo con un compuesto antisentido, o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5'-o 3'-terminal; y

q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.

Como se usa en la presente, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' diferente de H u OH. Los nucleósidos 2'-modificados, incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' sin puente como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, Oalquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2'-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.

Como se usa en la presente, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "2'-OMe" o "2-OCH3" o "2'-O-metil" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "2-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).

También se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo en la técnica que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillo pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.

Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, las US: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.

En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcares modificados, las fracciones de nucleobases (naturales, modificadas o una combinación de las mismas) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcares modificados. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.

Nucleobases modificadas

Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases de origen natural como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobases pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de dúplex de ácidos nucleicos en 0.6-1.20 C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).

Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Las fracciones de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas con N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilocitosina.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de AGT comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido con hueco ampliado dirigidos a un ácido nucleico de AGT comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.

Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas

Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con una sustancia farmacéuticamente activa o inerte aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitados a, la vía de administración, el alcance de la enfermedad, o la dosis a administrar.

Puede utilizarse un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado.

En ciertas realizaciones, el "portador farmacéutico" o "excipiente" es un solvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte farmacéuticamente aceptable para la administración de uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y puede seleccionarse, teniendo en cuenta la manera de administración planificada, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no están limitados a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno y calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón de sodio, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).

También pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables, que no reaccionan de manera perjudicial con ácidos nucleicos, adecuados para la administración parenteral o no parenteral para formular las composiciones. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). El PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones para ser administradas por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, en los métodos descritos en la presente se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sal de tales ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales de sodio y potasio.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración por inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En ciertas de tales realizaciones, una composición farmacéutica comprende un portador y se formula en solución acuosa, como agua o tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico (por ejemplo, PBS). En ciertas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan usando portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis.

Dosificación

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con un régimen de dosificación (por ejemplo, dosis, frecuencia de dosis y duración) en donde el régimen de dosificación puede seleccionarse para lograr un efecto deseado. El efecto deseado puede ser, por ejemplo, la reducción de AGT o la prevención, reducción, mejora o ralentización de la progresión de una enfermedad, trastorno o afección asociada con AGT o la vía RAS.

En ciertas realizaciones, las variables del régimen de dosificación se ajustan para dar como resultado una concentración deseada de composición farmacéutica en un sujeto. La "concentración de composición farmacéutica" tal como se usa con respecto al régimen de dosis puede referirse al compuesto, oligonucleótido o ingrediente activo de la composición farmacéutica. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la dosis y la frecuencia de dosis se ajustan para proporcionar una concentración de tejido o concentración en plasma de una composición farmacéutica a una cantidad suficiente para lograr un efecto deseado.

La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado de la enfermedad a tratar, y el curso del tratamiento dura de varios días a varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado de la enfermedad. La dosificación también depende de la potencia y el metabolismo del fármaco. En ciertas realizaciones, la dosificación es de 0,01 pg a 100mg por kg de peso corporal, o dentro de un intervalo de dosificación de 0,001mg a 1000mg, y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente, trimestralmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Después de un tratamiento con éxito, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de la enfermedad, en donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que van de 0,01 pg a 100mg por kg de peso corporal, una vez o más al día, una vez o más a la semana, una vez o más al mes, una vez o más al trimestre, una vez o más al año, hasta una vez cada 20 años o variando de 0,001mg a 1000mg de dosificación. En ciertas realizaciones, puede ser deseable administrar el oligonucleótido como máximo una vez al día, una vez a la semana, una vez al mes, una vez al trimestre, una vez al año, una vez cada dos años, una vez cada tres años, una vez cada cuatro años, una vez cada cinco años, una vez cada diez años, hasta una vez cada 20 años.

Administración

Los compuestos o composiciones farmacéuticas pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser oral, inhalada o parenteral.

En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones como se describen en la presente se administran parenteralmente. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.

En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos infundidos se administran con una bomba.

En ciertas realizaciones, la administración parenteral es por inyección. La inyección puede administrarse con una jeringuilla o una bomba. En ciertas realizaciones, la inyección es una inyección en bolo. En ciertas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido u órgano.

En ciertas realizaciones, las formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados como, pero no limitados a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, las formulaciones para la administración oral de los compuestos o composiciones pueden incluir, pero no están limitados a, portadores farmacéuticos, excipientes, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, ayudantes de la dispersión o aglutinantes. En ciertas realizaciones, las formulaciones orales son aquellas en las que los compuestos divulgados en la presente se administran junto con uno o más potenciadores de la penetración, surfactantes y quelantes.

Compuestos antisentido conjugados

En ciertas realizaciones, los compuestos divulgados en la presente pueden enlazarse covalentemente con una o más fracciones o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de las nucleasas. En los grupos estabilizadores se incluyen las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas, y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5'-terminal ( tapa 5', o en el extremo 3'-terminal (tapa 3'), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Las estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas abásicas desoxi invertidas. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleassa incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003. Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido

Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de AGT pueden probarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células usados para tales análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor usando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativas incluyen, pero no están limitadas a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.

Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido

En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.

En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.

Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que varía típicamente de 2 a 12 pg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE® en medio sérico reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que generalmente varía de 2 a 12 pg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio sérico reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que generalmente varía de 2 a 12 pg/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Oligofectamine™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Oligofectamine™ en medio sérico reducido Opti-MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de Oligofectamine™ a oligonucleótido de aproximadamente 0,2 a 0,8 pl por 100 nM.

Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN). El compuesto oligomérico antisentido se mezcló con FuGENE 6 en 1 ml de RPMI libre de suero para lograr la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de FuGENE 6 a compuesto oligomérico de 1 a 4 pl de FuGENE 6 por 100 nM.

Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación (Sambrook y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001).

Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual lse miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente (Sambrook y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001). En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.

La concentración de oligonucleótido antisentido usado varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell en Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Tercera Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. 2001). Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectin o Citofectin. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.

Aislamiento de ARN

El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.

Análisis de inhibición de niveles objetivo o expresión

La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de AGT puede analizarse de varias maneras conocidas en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia de Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN objetivo

La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede lograrse mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencia ABI PRlSM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.

Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las cantidades objetivo del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A o GAPDH, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A o GAPDH se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexando, o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L.J. et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368­ 374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia del RIBOGREEN®.

Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de AGT. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como PRI^m E^r EXPRESS® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Las sondas de PCR pueden tener JOE o FAM enlazadas covalentemente al extremo 5' y TAMRA o MGB enlazadas covalentemente al extremo 3', donde JOE o FAM es el colorante informador fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante inactivador. En algunos tipos de células, se usan cebadores y sondas diseñados para una secuencia de una especie diferente para medir la expresión. Por ejemplo, se puede usar un conjunto de sonda y cebador de GAPDH humano para medir la expresión de GAPDH en células y líneas celulares derivadas de monos.

Las cantidades objetivo del gen obtenidas por RT, PCR en tiempo real pueden normalizarse usando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total usando RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH puede cuantificarse por RT, PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexando o por separado. El ARN total puede cuantificarse usando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).

Análisis de niveles de proteínas

La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de AGT puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de AGT. Los niveles de proteína de AGT pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3° Ed., 2001). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de AGT humano y de rata están disponibles comercialmente.

Pruebas in vivo de compuestos antisentido

Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad de inhibir la expresión de AGT y/o la vía RAS y producir cambios fenotípicos como una disminución en una o más enfermedades relacionadas con la vía RAS. Las pruebas pueden realizarse en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación dependen de factores como la vía de administración y el peso corporal del animal. En una realización, después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido hepático y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico de AGT. También pueden medirse los cambios en los niveles de proteína de AGT. Los cambios en la expresión de AGT también pueden medirse determinando el nivel de inhibición de la vía RAS. Las enfermedades, trastornos y/o afecciones relacionadas con la vía RAS pueden usarse como marcadores para determinar el nivel de inhibición de AGT.

Ciertas indicaciones

En ciertas realizaciones, se divulgan en la presente métodos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se divulga en la presente. En ciertas realizaciones, el individuo tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS. En ciertas realizaciones, se divulgan en la presente métodos para reducir profilácticamente la expresión de AGT en un individuo. Ciertas realizaciones incluyen tratar a un individuo con necesidad de ello mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT.

En ciertas realizaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT se acompaña de la monitorización de los niveles de AGT en el suero o tejido de un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido es usada por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.

En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT da como resultado la reducción de la expresión de AGT en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% o 100% o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT da como resultado la inhibición de la vía RAS en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% o 100% o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de AGT da como resultado un cambio en la enfermedad, trastorno, afección, síntoma o marcador relacionado con la vía RAS (por ejemplo, hipertensión o daño a los órganos). En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido de AGT aumenta o disminuye la enfermedad, trastorno, afección, síntoma o marcador relacionado con RAS en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% o 100% o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a AGT se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección relacionada con ^rA^s .

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobases contigua 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 complementaria a AGT.

Ciertas terapias de combinación

En ciertas realizaciones, un primer agente que comprende un compuesto antisentido divulgado en la presente se coadministra con uno o más agentes secundarios. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido modificado.

En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS que el primer agente descrito en la presente. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente que el primer agente descrito en la presente. En ciertas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, dichos primeros agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de un segundo agente. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto combinatorio o aditivo. En ciertas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto sinérgico.

En ciertas realizaciones, la coadministración del primer y el segundo agente permite el uso de dosificaciones más bajas de las que se requerirían para lograr un efecto terapéutico o profiláctico si los agentes se administraran como terapia independiente. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo agente coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el segundo agente se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo agente coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el segundo agente se administrara solo.

En ciertas realizaciones, se administran un primer agente y uno o más segundos agentes al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.

En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero no están limitados a, ciertos procedimientos para reducir la hipertensión, cambios en la dieta, cambios en el estilo de vida, fármacos antifibróticos y fármacos antihipertensivos como inhibidores de RAS, diuréticos, bloqueadores de los canales de calcio, antagonistas de los receptores adrenérgicos, agonistas y vasodilatadores adrenérgicos.

Los ejemplos de procedimientos que pueden reducir la hipertensión incluyen, pero no están limitados a, denervación renal y terapia de activación de los barorreceptores.

Los ejemplos de inhibidores de RAS incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de ECA (por ejemplo, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, perindopril, quinapril, ramipril, trandolapril y benazepril), antagonistas de los receptores de angiotensina II (por ejemplo, candesartán, eprosartán, irbesartán, losartan, olmesartán, telmisartán y valsartán), inhibidores de renina (por ejemplo, aliskiren), antagonistas de los receptores de aldosterona (por ejemplo, eplerenona y espironolactona).

Los ejemplos de diuréticos incluyen diuréticos de asa (por ejemplo, bumetanida, ácido etacrínico, furosemida, torsemida), diuréticos tiazídicos (por ejemplo, epitizida, hidroclorotiazida, clorotiazida y bendroflumetiazida), diuréticos del tipo tiazida (por ejemplo, indapamida, clortalidona y metolazona) diuréticos ahorradores de potasio (por ejemplo, amilorida, triamtereno y espironolactona).

Los ejemplos de bloqueadores de los canales de calcio incluyen dihidropiridinas (por ejemplo, amlodipino, felodipino, isradipino, lercanidipino, nicardipino, nifedipino, nimodipino y nitrendipino) y no dihidropiridinas (por ejemplo, diltiazem y verapamilo).

Los ejemplos de antagonistas de los receptores adrenérgicos incluyen beta bloqueantes (por ejemplo, atenolol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, pindolol, propranolol y timolol), alfa bloqueantes (por ejemplo, doxazosina, fentolamina, indoramina, fenoxibenzamina, prazosina, terazosina y tolazolina) y alfa beta mixta bloqueantes (por ejemplo, bucindolol, carvedilol y labetalol).

Los ejemplos de vasodilatadores incluyen nitroprusiato de sodio e hidralazina y sus derivados.

Los ejemplos de agonistas adrenérgicos incluyen agonistas adel fa-2 (por ejemplo, clonidina, guanabenz, metildopa y moxonidina).

Ejemplos adicionales de fármacos antihipertensivos incluyen guanetidina, reserpina y similares.

Los segundos agentes pueden usarse en combinación con los compuestos terapéuticos descritos en la presente para disminuir una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS como hipertensión, daño a los órganos y similares.

VENTAJAS DE LA INVENCIÓN

En la presente se divulgan métodos y composiciones para la modulación de AGT que pueden tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS tal como hipertensión o daño a los órganos. En una realización particular, se proporcionan oligonucleótidos antisentido de AGT (oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico que codifica la proteína de AGT) para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS o síntomas de los mismos como se describe en la presente.

Actualmente, las terapias comercialmente disponibles dirigidas a varios componentes de la vía RAS han sido ineficaces para inhibir o bloquear completamente la vía RAS. Los mecanismos para esta inhibición ineficaz no se ha dilucidado completamente, pero pueden producirse por vías de escape de ACE y/o de aldosterona. El oligonucleótido antisentido dirigido a AGT descrito en la presente ha demostrado que bloquea completamente la vía RAS. Por consiguiente, la inhibición de AGT no es susceptible a los mecanismos de escape de ACE o de escape de aldosterona que confunden las terapias para la hipertensión aprobadas comercialmente. Por lo tanto, un oligonucleótido antisentido de AGT puede proporcionar una eficacia terapéutica superior a la de los agentes terapéuticos comerciales actuales usados para tratar, prevenir y/o mejorar la hipertensión en un sujeto, especialmente aquellos sujetos que padecen hipertensión resistente. Una duración de acción prolongada y una inhibición más completa de la actividad de RAS tisular también contribuyen a la superioridad de un oligonucleótido antisentido AGT en relación con los agentes terapéuticos comerciales actuales. Además, el oligonucleótido antisentido de AGT puede usarse en combinación con medicamentos antihipertensivos comercialmente disponibles (por ejemplo, inhibidores de ECA y/o BRA) para proporcionar un efecto terapéutico aditivo.

Adicionalmente, se ha demostrado que el oligonucleótido antisentido dirigido a AGT se localiza y disminuye AGT en el hígado, corazón y riñón. La capacidad de disminuir la AGT en el tejido hepático indica que el oligonucleótido puede dirigirse e inhibir la fuente principal de producción de AGT. Una capacidad para disminuir la AGT en el tejido cardíaco indica que el oligonucleótido puede ser útil en el tratamiento de enfermedades cardíacas como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, enfermedad cardíaca valvular, hipertrofia del tejido cardíaco y similares. Una capacidad para disminuir la AGT en el tejido renal indica que el oligonucleótido puede ser útil en el tratamiento de enfermedades relacionadas con los riñones como hipertensión, enfermedad renal crónica y similares. Se predice que la reducción de AGT, y por lo tanto todos los fragmentos de angiotensina, en tejidos extrahepáticos es el medio más eficaz para limitar la actividad de RAS del tejido patógeno.

Otra ventaja de la invención es que el oligonucleótido antisentido dirigido a AGT ha demostrado que revierte la hipertrofia cardíaca en el plazo de dos semanas después de la administración de oligonucleótido antisentido. Por lo tanto, un oligonucleótido antisentido de AGT puede revertir el daño a los órganos y/o la fibrosis provocados por la hipertensión en un sujeto.

EJEMPLOS

Divulgación no limitativa

Aunque se han descrito ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos solo sirven para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretenden que los limiten.

Ejemplo 1: inhibición antisentido in vivo del angiotensinógeno murino

Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito usado para evaluaciones de seguridad y eficacia. En este modelo se estudió el efecto de la inhibición antisentido del angiotensinógeno con ISIS 552668.

ISIS 552668 (CACTGATTTTTGCCCAGGAT; SEQ ID NO: 17), que fue uno de los oligonucleótidos antisentido probados en el ensayo, fue diseñado como un gapmer 5-10-5 MOE, y tiene 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de hueco central está compuesto a menudo de 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en todo el gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5-metilcitosinas. ISIS 552668 está dirigido a las nucleobases 1679 a 1698 de angiotensinógeno de rata (N° de registro GENBANK NM_134432.2, incorporada en la presente como SEQ ID NO: 13).

Tratamiento

Se inyectaron a grupos de ratas Sprague-Dawley 10 mg/kg/semana, 20 mg/kg/semana, 40 mg/kg/semana u 80 mg/kg/semana de ISIS 552668 administrados durante 4 semanas. A un grupo control de ratas se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 4 semanas. Las ratas se sacrificaron al final del estudio en la semana 4. Se recogieron hígado y riñón completos para análisis de ARN y se recogió plasma para análisis de proteínas.

Análisis de ARN de angiotensinógeno

El ARN se extrajo del tejido hepático para análisis de PCR en tiempo real del angiotensinógeno, usando el conjunto de cebador sonda RTS3550 (secuencia directa AGCACGACTTCCTGACTTGGA, designada en la presente como SEQ ID NO: 18; secuencia inversa TTGTAGGATCCCCGAATTTCC, designada en la presente como SEQ ID NO: 19; secuencia de sonda AACCCGCCTCCTCGGGCCAT, designada en la presente como SEQ ID NO: 20). Los niveles de ARNm se normalizaron usando el gen constitutivo, GAPDH. Como se muestra en la Tabla 1, los oligonucleótidos antisentido lograron una reducción significativa del angiotensinógeno sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del angiotensinógeno, con respecto al control. Se calculó que el ED50 para el hígado y el riñón era 17,0 y 9,5 respectivamente.

Tabla 1

Análisis de proteínas

Se midieron los niveles plasmáticos de angiotensinógeno mediante ELISA (IBL International, Toronto, Canadá). Como se muestra en la Tabla 2, la inhibición antisentido del angiotensinógeno por ISIS 552668 dio como resultado una reducción significativa dependiente de la dosis de la proteína del angiotensinógeno. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del angiotensinógeno, con respecto al control de PBS. El ED50 para la reducción de proteínas en plasma fue de 23,6 mg/kg.

Tabla 2

Efecto sobre la presión sanguínea

Se midió la presión sanguínea sistólica (PAS), la presión sanguínea media (PAM) y la presión sanguínea diastólica (PAD) en las ratas mediante el método de presión de volumen del manguito de la cola (Kent Scientific, Torrington, CT). Los resultados se presentan en la Tabla 3 e indican que la inhibición antisentido del angiotensinógeno dio como resultado reducciones dependientes de la dosis en los tres parámetros en las ratas.

Tabla 3

Ejemplo 2: inhibición antisentido in vivo del angiotensinógeno en ratas SHR hembra

Las ratas espontáneamente hipertensas (SHR) son un modelo usado para la hipertensión genética y la investigación de fármacos hipertensivos (Okamoto, A.K. y Aoki K. Jpn. Circ. J. 1963. 27: 282-293). En este modelo se estudió el efecto de la inhibición antisentido del angiotensinógeno con ISIS 552668.

Estudio 1

Se inyectaron a grupos de ratas SHR hembra 50 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana, o 100 mg/kg/semana de ISIS 552668 administrados durante 2 semanas. A un grupo de control de ratas SHR hembra se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 2 semanas. Otro grupo de control constituía un grupo de ratas de tipo salvaje a las que se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 2 semanas.

Efecto sobre la presión sanguínea

Se midieron la presión sanguínea sistólica (PAS), la presión sanguínea media (PAM) y la presión sanguínea diastólica (PAD) en las ratas mediante el método de presión de volumen del manguito de la cola (Kent Scientific, Torrington, CT). Los resultados se presentan en la Tabla 4. Los resultados indican que la inhibición antisentido del angiotensinógeno dio como resultado reducciones dependientes de la dosis en los tres parámetros en las ratas en comparación con el grupo control.

Tabla 4

Estudio 2

Se inyectaron a grupos de ratas SHR hembra 50 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana, o 100 mg/kg/semana de ISIS 552668 administrado durante 2 semanas. A un grupo de control de ratas SHR hembra se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 2 semanas. Otro grupo de control constituía un grupo de ratas de tipo salvaje a las que se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 2 semanas. Después de 2 semanas, las ratas se trataron con Captopril a 50 mg/kg/día y se midió la presión sanguínea después de 4 días de este tratamiento.

Efecto sobre la presión sanguínea

Se midió la presión sanguínea sistólica (PAS), la presión sanguínea media (PAM) y la presión sanguínea diastólica (PAD) en las ratas mediante el método de presión de volumen del manguito de la cola (Kent Scientific, Torrington, CT). Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5

Los resultados indican que la inhibición antisentido del angiotensinógeno dio como resultado generalmente reducciones dependientes de la dosis en los tres parámetros en las ratas. Los resultados también indican que el tratamiento de las ratas con ISIS 552668 a dosis de 50 mg/kg/semana y 75 mg/kg/semana antes del tratamiento con Captopril disminuyó aún más los parámetros de presión sanguínea en comparación con el tratamiento con Captopril solo. Por lo tanto, la reducción de la presión sanguínea aditiva se logró con la combinación del oligonucleótido antisentido de angiotensinógeno y el tratamiento con Captopril, lo que sugiere que son posibles mejoras en la eficacia cuando se añaden oligonucleótidos antisentido a agentes terapéuticos inhibidores de RAS existentes. Tal mejora en los tratamientos podría ser deseable en sujetos hipertensos resistentes o sujetos que no logran su objetivo de presión sanguínea con los inhibidores de RAS existentes y/o pacientes que experimentan escape de a Ce y/o desprendimiento de aldosterona.

Además, el tratamiento con Captopril no dio como resultado reducciones adicionales de la presión sanguínea en ratas que recibieron 100 mg/kg/semana de ISIS 552668, lo que demuestra que la inhibición máxima de la señalización de RAS ya se logró mediante el tratamiento con ISIS 552668 en este grupo. Los datos indican que la inhibición completa del control de la presión sanguínea dependiente de RAS podría lograrse en el plazo de 2 semanas del tratamiento con ASO.

Efecto sobre el tamaño del corazón

El tamaño del corazón se midió inmediatamente después de la recogida. Los resultados de cada grupo se presentan en la Tabla 6, expresados como un porcentaje del peso corporal. Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 552668 después de 3 semanas revirtió el aumento en el tamaño del corazón de las ratas SHR al observado en los controles de tipo salvaje.

Tabla 6

Estudio 3

Se inyectaron a un grupo de SHR 100 mg/kg/semana de ISIS 552668 administrado durante 3 semanas. A un grupo control de SHR se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas. A otro grupo de control de SHR se le inyectaron 100 mg/kg/semana de un oligonucleótido de control (un nucleótido no dirigido al angiotensinógeno) administrado durante 3 semanas. A otro grupo de control de SHR se le trató con Captopril a 150 mg/kg/día administrado durante 3 semanas.

Efecto sobre la presión sanguínea

Se midió la presión sanguínea media (PAM) en las ratas medianteel método de presión de volumen del manguito de la cola (Kent Scientific, Torrington, CT). Los resultados se presentan en la Tabla 7 e indican que el tratamiento con ISIS 552668 y Captopril redujo los niveles de PAM a niveles comparables.

Tabla 7

Análisis de ARN

Se extrajo ARN del tejido hepático para análisis por PCR en tiempo real del angiotensinógeno, usando el conjunto de cebador sonda RTS3550. Los niveles de ARNm se normalizaron usando el gen constitutivo, GAPDH. Como se muestra en la Tabla 8, ISIS 552668 logró una reducción significativa del angiotensinógeno sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del angiotensinógeno, con respecto al control.

Tabla 8

Se extrajo ARN del tejido renal para el análisis por PCR en tiempo real de renina, usando el conjunto de cebador sonda rRenin2 (secuencia directa GCTTTGGACGAATCTTGCTCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 21; secuencia inversa TCCCCGCTCCTCCAGG, designada en la presente como SEQ iD NO: 22; secuencia de sonda AAAATGCCCTCGGTCCGGGAAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 23). Los niveles de ARNm se normalizaron usando el gen constitutivo, GAPDH. Como se muestra en la Tabla 9, el tratamiento con Captopril dio como resultado una inducción de aproximadamente el triple de la expresión de renina renal en comparación con ISIS 552668. El aumento de la renina en el cuerpo es perjudicial para la salud general del animal (Nguyen y Muller, The Biology of the (Pro)Renin Receptor, J Am Soc Nephrol, 2010 Ene, 21(1):18-23). Por lo tanto, el aumento relativamente menor de la renina después del tratamiento con ISIS 552668 indica que es un tratamiento más seguro para sujetos hipertensos en comparación con el tratamiento con Captopril. Los resultados se presentan como porcentaje de expresión de renina, con respecto al control.

Tabla 9

Análisis de proteínas

Los niveles en plasma de angiotensinógeno se midieron mediante ELISA (IBL International, Toronto, Canadá). Como se muestra en la Tabla 10, la inhibición antisentido del angiotensinógeno por ISIS 552668 dio como resultado una reducción significativa de la proteína del angiotensinógeno. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del angiotensinógeno, con respecto al control de PBS.

El análisis inmunohistoquímico de tejidos hepáticos, cardíacos y renales también demostró una reducción significativa del angiotensinógeno de estos tejidos después del tratamiento con ISIS 552668 en comparación con el control de PBS.

Tabla 10

Estudio 4

Se inyectaron a grupos de SHR 25 mg/kg/día, 50 mg/kg/día, 100 mg/kg/día, o 200 mg/kg/día de Captopril administrado durante 10 semanas. Después de 10 semanas, se administró ISIS 552668 como una dosis única de 50 mg/kg a cada uno de estos grupos. A dos grupos más de ratas se les administró ISIS 552668 en una dosis única de 50 mg/kg y 100 mg/kg, pero no se les dio tratamiento con Captopril. A un grupo control de SHR se le inyectó PBS y no se le dio otro tratamiento. A otro grupo de control de SHR se le administró un oligonucleótido de control (un nucleótido no dirigido al angiotensinógeno) como una dosis única de 50 mg/kg y no se le dio otro tratamiento.

Efecto sobre la presión sanguínea

La presión sanguínea sistólica (PAS) en las ratas se midió antes y después de la dosificación con ISIS 552668 mediante el método de presión de volumen del manguito de la cola (Kent Scientific, Torrington, CT). Los resultados se presentan en la Tabla 11 e indican que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS fue comparable al del Captopril. Tanto ISIS 552668 como Captopril redujeron los niveles de presión sanguínea (PA) en comparación con el control de PBS.

Tabla 11

Los resultados indican que el tratamiento de las ratas con ISIS 552668 a una dosis de 50 mg/kg/semana con tratamiento con Captopril disminuyó aún más los parámetros de presión sanguínea en comparación con el tratamiento con Captopril solo. Por lo tanto, la reducción de la presión sanguínea aditiva se logró con la combinación de oligonucleótidos antisentido de angiotensinógeno en animales tratados crónicamente con Captopril, lo que sugiere que son posibles mejoras en la eficacia cuando se añaden oligonucleótidos antisentido a los agentes terapéuticos inhibidores de RAS existentes. Tal mejora en los tratamientos podría ser deseable en sujetos hipertensos resistentes o sujetos que no logran su objetivo de presión sanguínea con los inhibidores de RAS existentes y/o pacientes que experimentan escape de ACE y/o desprendimiento de aldosterona.

Ejemplo 3: inhibición antisentido in vivo del angiotensinógeno en ratas Dahl/SS

Las ratas Dahl/Salt Sensititive (Dahl/SS) son un modelo usado para enfermedades asociadas con la presión sanguínea alta (Cowley, A.W. Jr. et al., Physiol. Genomics. 2000. 2: 107-115). En este modelo se estudió el efecto de la inhibición antisentido del angiotensinógeno con ISIS 552668.

Tratamiento

Las ratas fueron alimentadas con una dieta con un 8% de NaCl. A un grupo de ratas Dahl/SS hembra se le inyectaron 40 mg/kg/semana de ISIS 552668 administrado durante 3 semanas. A un grupo de ratas Dahl/SS hembra se le inyectaron 40 mg/kg/semana de oligonucleótidos de control ISIS 141923 administrados durante 3 semanas. A un grupo de ratas Dahl/SS hembra se le inyectaron 150 mg/kg de Captopril administrado diariamente durante 3 semanas. A un grupo control de ratas Dahl/SS hembra se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas. Otro grupo de control constituía un grupo de ratas Dahl/Resistente a la sal (Dahl/SR) a las que se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas.

Efecto sobre la presión sanguínea

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado está dirigido a un ácido nucleico de angiotensinógeno (AGT), para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la vía RAS, en donde la enfermedad, trastorno o afección relacionada con la vía RAS es hipertensión resistente.

2. El compuesto para el uso de la reivindicación 1, en donde el compuesto disminuye la presión sanguínea.

3. El compuesto para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el compuesto trata y/o revierte el daño a los órganos.

4. El compuesto para el uso de la reivindicación 3, en donde el daño a los órganos es hipertrofia del músculo cardíaco o fibrosis en un órgano, y en donde opcionalmente el órgano es corazón, hígado o riñón.

5. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el animal experimenta escape de ACE y/o escape de aldosterona.

6. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido antisentido modificado consiste de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla.

7. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido antisentido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.

8. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende:

(i) por lo menos un enlace internucleosídico modificado, en donde opcionalmente el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato;

(ii) por lo menos un azúcar modificado, en donde opcionalmente el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, un 2'-F, un 2'-O-metilo o un 2'-O-metoxietilo, y/o

(iii) por lo menos una nucleobase modificada, en donde opcionalmente la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

9. El compuesto para el uso de la reivindicación 8, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende:

(a) un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;

(b) un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y

(c) un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;

en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado, y en donde opcionalmente el oligonucleótido antisentido modificado comprende:

(a) un segmento de hueco que consiste de ocho a dieciséis desoxinucleósidos enlazados;

(b) un segmento de ala 5' que consiste de dos a seis nucleósidos enlazados; y

(c) un segmento de ala 3' que consiste de dos a seis nucleósidos enlazados;

en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente, y entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato, o

(a) un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;

(b) un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y

(c) un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;

en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato.

10. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el animal es un humano.

11. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el oligonucleótido antisentido modificado es complementario a un ácido nucleico de AGT que tiene una secuencia como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16.

12. El compuesto para el uso de la reivindicación 11, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende una secuencia de nucleobases por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleobases mencionadas en las SEQ ID NO: 1­ 16.

13. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto comprende un grupo conjugado.

14. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto es una forma de sal.

15. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto se formula con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.