JP6930913B2 - 炎症を阻害するためのcdk9及びbrd4阻害剤の使用法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年10月14日出願の米国仮出願第62/063,839号に対して米国特許法119(e)条に基づく利益を主張するものであり、目的を問わずその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた認可番号AR063348、及び国防総省によって与えられた認可番号PRMRP IIRA PR110507に基づく政府支援で行われた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。
サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤とブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤との併用により、軟骨変性及び全身外傷性炎症を低減、阻害及び/または防止する方法を提供する。CDK9阻害剤とBRD4阻害剤の併用は、同種異系移植片の保存時に、軟骨変性及び軟骨生存性損失を低減、阻害及び/または防止するために使用することができる。CDK9阻害剤とBRD4阻害剤の併用を傷害後の介入治療として用いて、将来的に軟骨変性及び変形性関節症に至る急性細胞応答を低減、阻害及び/または防止することができる。
大量の炎症誘発性ストレス及び細胞ストレスは、軟骨細胞の炎症反応を誘導し、軟骨マトリックスを破壊するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)及びアグリカナーゼの上方調節をもたらす。これらの異化経路の慢性的な調節解除は、変形性関節症の原因であると疑われている。炎症源に関係なく、下流のシグナルはすべて、あらゆる初期応答遺伝子の転写を活性化する共通の機構に集約される。この調節ポイントは、転写因子サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)とそのT型サイクリンパートナーによって制御される。長年にわたり、転写活性化の律速段階は、転写因子及びRNAポリメラーゼII(Pol II)の遺伝子プロモーターへの動員であると考えられてきた。しかしながら、初期応答遺伝子に関する最近の研究によると、基底状態及び非刺激状態で、Pol IIはすでにプレアセンブリされているが、プロモーターで一時停止していることがわかった(Hargreaves,et al.,Cell 2009,138:129−45(非特許文献1);Zippo,et al.,Cell 2009,138:1122−36(非特許文献2))。初期応答遺伝子の急速な活性化は、シグナル誘導によるCDK9のプロモーターへの動員の結果であり、それがPol IIをリン酸化する。CDK9によるリン酸化は、コンフォメーションの変化を誘導し、それによりPol IIは独占的な伸長(possessive elongation)に入り、完全長mRNAを効率的に転写することができる(Zhou and Yik,MMBR 2006,70(3):646−659(非特許文献3))。CDK9が誘導性遺伝子の転写活性化の共通機構を制御しているとすれば、CDK9は多様な細胞ストレス(例えばスポーツに伴う傷害)による望ましくない炎症反応を阻害する有効な標的である。本発明は、薬学的CDK9阻害剤、例えば、フラボピリドール、ならびにその類似体及び塩が、in vitroでヒト関節軟骨細胞の主要な炎症性遺伝子を効果的に抑制できるという発見に部分的に基づいている。炎症反応の効果的な抑制は、軟骨修復に一般に使用される骨軟骨外植片の貯蔵寿命の延長を可能にするとともに、外傷後変形性関節症の軟骨破壊を防止する上で治療的意味を有する。
一態様では、軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを含む。更なる態様では、外傷後変形性関節症の発症及び/または進行を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の外傷後変形性関節症を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを含む。様々な実施形態において、対象は軟骨組織に外傷を受傷している。様々な実施形態において、外傷は初期応答遺伝子の急性過剰発現を誘導する。様々な実施形態において、対象は関節外科手術を受けたことがある。一態様では、重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤を対象に投与することにより、対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを含む。関連する態様では、重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法には、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を対象に同時投与することにより、対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、例えば急性全身性炎症、更に多臓器系不全へと至る外傷を受傷している場合がある。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、急性反応段階で最初に同時投与され、外傷受傷後の1つ以上の初期応答遺伝子の転写活性化を低減及び/または阻害する。いくつかの実施形態では、1つ以上の初期応答遺伝子は、IL−1β、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、IL−6、TNF−α、MMP−1、MMP−3、MMP−9、MMP−13及びADAMTS4(アグリカナーゼ)からなる群から選択される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、外傷受傷後、約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、例えば、約22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1時間またはそれ未満の時間内に最初に同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、損傷または傷害後約10日以内に対象に投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、10日間にわたって投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、複数回投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、傷害後3日連続して毎日投与される。様々な実施形態において、対象は、損傷した軟骨組織を修復するための手術を受けたことがある。様々な実施形態において、対象は、骨軟骨外植片の移植を受けたことがある。様々な実施形態において、骨軟骨外植片は、軟骨同種異系移植片である。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、手術と同時に、または手術前に同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、手術後、約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、例えば、約22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1時間またはそれ未満の時間内に最初に同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、全身に同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、静脈内に同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、傷害を受けた軟骨組織部位に直接、同時投与される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、マトリックスから送達される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、CDK9阻害剤はフラボピリドールである。様々な実施形態において、請求項1〜16のいずれかで、BRD4阻害剤は低分子有機化合物である。様々な実施形態において、BRD4阻害剤は、JQ1及びGSK525762Aから選択される。様々な実施形態において、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤の一方または両方は、個々の阻害剤の治療量以下の用量または非有効用量で投与される。
[本発明1001]
軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善する段階を含む、前記方法。
[本発明1002]
外傷後変形性関節症の発症及び/または進行を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の外傷後変形性関節症を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善する段階を含む、前記方法。
[本発明1003]
前記対象が軟骨組織に外傷を受傷したことがある、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記対象が関節手術を受けたことがある、本発明1003の方法。
[本発明1005]
重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤を前記対象に投与することにより、前記対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善する段階を含む、前記方法。
[本発明1006]
重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善することを、その必要がある対象において行う方法であって、有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の重度の多発外傷または全身性炎症反応症候群(SIRS)を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善する段階を含む、前記方法。
[本発明1007]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、急性反応段階で最初に同時投与され、外傷受傷後の1つ以上の初期応答遺伝子の転写活性化を抑制及び/または阻害する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記1つ以上の初期応答遺伝子が、IL−1β、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、IL−6、TNF−α、MMP−1、MMP−3、MMP−9、MMP−13及びADAMTS4(アグリカナーゼ)からなる群から選択される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、外傷受傷後、約72時間以内に最初に同時投与される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、損傷または傷害後、約10日以内に前記対象に投与される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、10日間にわたって投与される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、複数回投与される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記対象が損傷した軟骨組織の修復手術を受けたことがある、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記対象が骨軟骨外植片を移植されたことがある、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記骨軟骨外植片が軟骨同種異系移植片である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、手術と同時に、または手術前に同時投与される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、手術後24時間以内に同時投与される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、全身に同時投与される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、静脈内に同時投与される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、傷害を受けた軟骨組織部位に直接、同時投与される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、マトリックスから送達される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記CDK9阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記CDK9阻害剤がフラボピリドールである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記BRD4阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記BRD4阻害剤が、JQ1及びGSK525762Aからなる群から選択される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、個々の阻害剤の治療量以下の用量または非有効用量で投与される、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
骨軟骨外植片の変性を抑制、防止もしくは阻害する、及び/または保存期間中の軟骨細胞死を低減、防止もしくは阻害する方法であって、サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を含んでいる溶液中に骨軟骨外植片及び/または軟骨細胞を保存する段階を含む、前記方法。
[本発明1028]
前記骨軟骨外植片が同種異系移植軟骨である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記CDK9阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
前記CDK9阻害剤がフラボピリドールである、本発明1027〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記BRD4阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1027〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記BRD4阻害剤が、JQ1及びGSK525762Aから選択される、本発明1027〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記骨軟骨外植片が、前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される、本発明1027〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記溶液が、有効量以下である前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方を含む、本発明1027〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を含んでいる溶液中の骨軟骨外植片を含む、組成物。
[本発明1036]
前記骨軟骨外植片が同種異系移植軟骨である、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
前記CDK9阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1035または1036の組成物。
[本発明1038]
前記CDK9阻害剤がフラボピリドールである、本発明1035〜1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
前記BRD4阻害剤が低分子有機化合物である、本発明1035〜1038のいずれかの組成物。
[本発明1040]
前記BRD4阻害剤が、JQ1及びGSK525762Aから選択される、本発明1035〜1039のいずれかの組成物。
[本発明1041]
前記骨軟骨外植片が、前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される、本発明1035〜1040のいずれかの組成物。
[本発明1042]
前記溶液が、有効量以下である前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方を含む、本発明1035〜1041のいずれかの組成物。
[本発明1043]
本発明1035〜1042のいずれかの組成物を含む、キット。
「サイクリン依存性キナーゼ9」または「CDK9」という用語は、サイクリン依存性プロテインキナーゼ(CDK)ファミリーのメンバーを指す。CDKファミリーは、出芽酵母(S.cerevisiae) cdc28及び分裂酵母(S.pombe) cdc2の遺伝子産物と極めて類似しており、重要な細胞周期調節因子として公知である。CDK9は多タンパク質複合体TAK/P−TEFbの構成物であることがわかっており、RNAポリメラーゼIIが開始する転写の伸長因子であり、RNAポリメラーゼIIの最大サブユニットのC末端ドメインをリン酸化することにより機能する。CDK9はその調節因子のサブユニットであるサイクリンTまたはサイクリンKと複合体を形成して、これらによる調節を受ける。HIV−1 Tatタンパク質は、このタンパク質及びサイクリンTと相互作用することが見出された。構造的に「CDK9」とは、次のような核酸及びポリペプチドの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間ホモログを指す。(1)CDK9核酸(例えば、GenBankアクセッション番号NM_001261.3を参照)によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、400、またはそれ以上のアミノ酸領域にわたって、または完全長のアミノ酸にわたって、約90%超のアミノ酸配列同一性、例えば、約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する;(2)CDK9ポリペプチド(例えば、GenBankアクセッション番号NP_001252.1)のアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起される抗体(例えば、ポリクローナル抗体)、またはCDK9核酸(例えば、本明細書に記載のCDK9ポリヌクレオチド)によってコードされるアミノ酸配列、及びそれらの保存的修飾変異体と結合する;(3)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、CDK9タンパク質及びその保存的修飾変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズする;(4)CDK9核酸(例えば、本明細書に記載のCDK9ポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のCDK9ポリペプチドをコードするCDK9ポリヌクレオチド)に対して、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000、2000、またはそれ以上のヌクレオチドにわたって、または完全長のヌクレオチドにわたって、約90%超、好ましくは91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。当業者は、CDK9ホモログの知見に基づいて、より置換が許容される残基位置を容易に決定することができる。例えば、種間で保存されるアミノ酸残基は、置換または欠失の許容性が低い。同様に、種間で保存されないアミノ酸残基は、置換または欠失に対して許容性が高く、CDK9タンパク質の機能が保持される。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニンI、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);及び
7)セリン(S)、スレオニン(T)
(例えば、Creighton,Proteins(1984)を参照)。
1.緒言
CDK9及びBRD4活性の複合阻害が、多発外傷またはSIRSを防止、軽減及び/または緩和すること、傷害(例えば、外傷及び/または外科的傷害)後の軟骨及び保存中の軟骨(例えば、同種異系移植片)を保持することに使用できるという発見に部分的に基づく方法を提供する。阻害性核酸及び阻害性化合物(例えば、フラボピリドール、JQ1、GSK525762A、ならびにその類似体及び塩)を含む、当技術分野で既知であるCDK9及びBRD4阻害剤のいかなる併用も本方法に使用することができる。
(1)軟骨の剛性及び弾力の減少により、軟骨細胞の機械的ストレスが増加する、
(2)軟骨の透水率が増加し、間質液の喪失及び溶質(すなわち分解酵素、プロテオグリカン)の拡散増加をもたらす、
(3)残存する軟骨マトリックス構造が酵素消化の影響を受けやすくなる、
(4)軟骨下骨板が肥厚化する、
(5)骨梁への構造変化、ならびに
(6)骨棘及び異所骨の形成(8)。
1種以上のCDK9阻害剤及び1種以上のBRD4阻害剤の併用療法から利益を受け得る対象は一般に急性全身性炎症をもたらす外傷及び/または軟骨組織への傷害を受傷しているか、または差し迫って受ける可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、例えば軟骨組織に損傷を与える傷害(例えば、外傷)を受傷している場合がある。いくつかの実施形態では、対象は、例えば急性全身性炎症、及び場合により多臓器系不全に至る外傷を受傷している場合がある。対象はまた、例えば、損傷した軟骨組織を修復する及び/または骨軟骨外植片を移植するための手術を受けるかまたは受けたことがある場合がある。
一般に、CDK9、例えば、NP_001252.1のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、例えば、少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリペプチドの活性を阻害または低減することによって、軟骨の変性及び/または外傷後変形性関節症の発症または進行を防止、低減、遅延または阻害する。
i.CDK9阻害剤
CDK9はサイクリン依存性キナーゼファミリーのメンバーであり、このファミリーの大部分のタンパク質は細胞周期進行を調節する。過去20年にわたり、癌の細胞周期進行を停止する抗増殖剤としてCDK阻害剤が精力的に研究されてきた。また多数のCDK阻害剤が第II相及び第III相臨床試験段階である(19、20)。細胞周期進行を調節する大部分のCDKタンパク質とは異なり、CDK9は主に、RNA合成及び転写伸長を調節すると考えられている(21)。CDK9に対して比較的良好な特異性を有する小分子阻害剤があり、これにはフラボピリドールならびにその類似体及び塩が含まれる。フラボピリドールの市販製剤は、Alvocidibと呼ばれている。フラボピリドールのIUPAC名は、2−(2−クロロフェニル)−5,7−ジヒドロキシ−8−[(3S,4R)−3−ヒドロキシ−1−メチル−4−ピペリジニル]−4−クロメノン)である。フラボピリドールの構造を以下に示す。
Cdk9のキナーゼ活性を直接の標的として炎症を抑制することに加え、ブロモドメインタンパク質Brd4による活性遺伝子プロモーターへの動員を遮断する新しいクラスの小分子阻害剤が、有効なCdk9阻害剤として近年発見された(Filippakopoulos,et al.,(2010)Nature 468,1067−1073)。化合物JQ1(図2及び以下)は、Brd4が活性化初期応答遺伝子のプロモーター近傍の染色体でアセチル化ヒストンを結合することを防止するブロモドメイン阻害剤である。これによって、JQ1は、Brd4によるCdk9の動員を間接的に妨害するとともに、動物モデルで広域抗炎症薬として有望な可能性を示している(Belkina,et al.,(2013)J.Immunol 190,3670−3678)。本明細書の我々のデータでは、炎症性メディエーターの低減及び防止に関して、Cdk9阻害剤とBrd4阻害剤間の強力な相乗効果を実証している。
JQ1 − Brd4を標的とする。
CDK9遺伝子発現及びBRD4遺伝子発現を並行して、または同時に減少させることまたは阻害することは、阻害性核酸(例えば、小分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、リボザイムなど)の使用によるものを含む、当技術分野のいずれかの方法を使用して達成することができる。阻害性核酸は、相補的な核酸配列と特異的に結合できる一本鎖の核酸であり得る。適切な標的配列と結合することにより、RNA−RNA、DNA−DNAまたはRNA−DNAの二重鎖または三重鎖が形成される。このような阻害性核酸は、「センス」方向または「アンチセンス」方向のいずれでもあり得る。例えば、Tafech,et al.,Curr Med Chem(2006)13:863−81;Mahato,et al.,Expert Opin Drug Deliv(2005)2:3−28;Scanlon,Curr Pharm Biotechnol(2004)5:415−20;及びScherer and Rossi,Nat Biotechnol(2003)21:1457−65を参照のこと。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸はアンチセンス分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CDK9及び/またはBRD4をコードするmRNAのコーディング鎖(センス鎖)に対して相補的(すなわちアンチセンス)である比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、RNAをベースとするが、これはDNAをベースとすることもできる。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、その安定性を増加させるために修飾される。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、低分子干渉RNA(siRNAまたはRNAi)分子である。RNAi構築物は、標的遺伝子の発現を特異的に遮断できる二本鎖RNAを含む。「RNA干渉」または「RNAi」は本来、二本鎖RNA(dsRNA)が特異的かつ転写後に遺伝子発現を遮断する現象に適用される用語である。RNAiは、in vitroまたはin vivoでの遺伝子発現の阻害に有用な方法を提供する。RNAi構築物には、低分子干渉RNA(siRNA)、ヘアピンRNA、及びin vivoで切断されてsiRNAを形成できる他のRNA種を含むことができる。また、本明細書でのRNAi構築物には、細胞内でdsRNAまたはヘアピンRNAを形成する転写物、及び/またはin vivoでsiRNAを産生できる転写物を誘発できる発現ベクター(「RNAi発現ベクター」)が含まれる。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸はリボザイムである。mRNA転写物を触媒により切断するように設計されたリボザイム分子も、mRNAの翻訳防止に使用することができる(例えば、PCT国際公開WO90/11364;Sarver et al.,1990,Science 247:1222−1225及び米国特許第5,093,246号を参照)。部位特異的認識配列の位置でmRNAを切断するリボザイムを特定のmRNAを破壊するために使用できるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補塩基対を形成する領域をフランキングすることにより決定される位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件は以下の2塩基配列、すなわち5’−UG−3’を標的mRNAが有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は当技術分野で周知であり、Haseloff and Gerlach,1988、Nature,334:585−591に詳細に記載されている。
治療用途において、1種以上のCDK9阻害剤及び1種以上のBRD4阻害剤を組み合わせて、軟骨組織に外傷を受けた個体、軟骨組織の修復手術を受けた個体、及び/または軟骨同種異系移植片の移植を受けた個体に投与することができる。1種以上のCDK9阻害剤及び1種以上のBRD4阻害剤の組み合わせを含む組成物は、望ましくない炎症を抑制して、症状及び/または合併症を解消する、または少なくとも部分的に阻止する十分量で患者に投与される。これを達成する十分量を「治療的有効量」と定義する。この用途のための有効量は、例えば、阻害剤組成物、投与様式、治療される疾患のステージ及び重症度、患者の全身健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存することになる。CDK9及びBRD4活性の阻害剤を組み合わせて慢性投与または急性投与し、軟骨変性及び外傷後変形性関節症を軽減、阻害、または防止することができる。ある特定の場合には、1種以上のCDK9活性の阻害剤及び1種以上のBRD4活性の阻害剤を、例えば、軟骨変性及び/または外傷後変形性関節症の発症のリスクがある、または発症の疑いがある対象に予防的に投与するのに適している。
様々な実施形態において、1種以上のCDK9阻害剤及び1種以上のBRD4阻害剤の組み合わせを、マトリックスまたはデポー内に含有することができる。マトリックスは、軟骨病変または骨病変の部位に組成物を送達するための送達ビヒクルとして、1容積で供給することができる。マトリックスはまた、軟骨修復及び再生が生じ得る好適な足場を提供する。一実施形態では、マトリックスは生体吸収性または生分解性である。
関連する態様において、本発明は、サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を含んでいる溶液中の骨軟骨外植片(例えば、ex vivo軟骨組織)及び/または軟骨細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、骨軟骨外植片は同種異系移植軟骨である。いくつかの実施形態では、CDK9阻害剤は、低分子有機化合物、例えば、フラボピリドールまたはその類似体及び塩である。いくつかの実施形態では、BRD4阻害剤は、低分子有機化合物、例えばJQ1、GSK525762Aまたはその類似体及び塩である。いくつかの実施形態では、骨軟骨外植片は、CDK9阻害剤及びBRD4阻害剤を含んでいる溶液中に浸漬される。様々な実施形態において、溶液は水溶液、例えば生理学的に等張な溶液である。いくつかの実施形態では、溶液は、約100nM〜約1000nM、例えば約300nM、または以下の範囲の濃度でフラボピリドールを含む。いくつかの実施形態では、溶液は、約100nM〜約1000nM、例えば約300nM、または以下の範囲の濃度でJQ1及び/またはGSK525762Aを含む。溶液がCDK9阻害剤(例えば、フラボピリドール)及びBRD4阻害剤(例えば、JQ1及び/またはGSK525762A)の組み合わせを含むとき、一方または両方の化合物は非有効濃度、例えば、約100nM〜約1000nM、例えば約300nMの範囲の75%、50%または25%の濃度であり得る。溶液は、本明細書に記載する付加的な薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、組成物はパッケージ化されたキットとして提供される。
炎症性刺激下の軟骨細胞におけるCDK9及びBRD4の阻害
材料及び方法
軟骨細胞の処理。初代軟骨細胞を、IRB承認を得た健康なヒトドナーの軟骨から単離し、10%のFBSを加えたDMEM中で培養した。統計実験計画はJMP 10.0ソフトウェアを使用して実施し、各薬物単独のまたは併用での、IL−1β誘導型iNOS転写の完全阻害に要する最小濃度を特定した。炎症性刺激として10ng/mlのIL−1βまたは10ng/mlのTNF−αのいずれかで5時間、軟骨細胞を処理し、以下のような5群の組み合わせで薬物を加えた。
1)薬物なし、サイトカイン刺激なし(対照群)
2)薬物なし、刺激あり(刺激群)
3)JQ1、刺激あり(J群)
4)フラボピリドール、刺激あり(F群)
5)JQ1及びフラボピリドール、刺激あり(JF群)。
各細胞を採取してRNAを抽出した。
外傷誘導性全身炎症反応の転写制御
膝外傷後のCdk9の阻害は、局所炎症反応の防止に極めて効果的であり、更に外傷後変形性関節症の防止に効果的である(Yik,et al.,Arthritis&Rheumatology(2014)66,1537−1546)。SIRS及び外傷性全身性炎症の治療方法は、我々の外傷性膝傷害の研究を、例えば複数の長骨骨折などの、全身性炎症の主要な危険因子である他の整形関連外傷に発展させたものである。全身性炎症は、骨折治癒を大幅に遅延させ、医療費を増加させる(Bastian,et al.,Journal of Leukocyte Biology(2011)89,669−673)。したがって、SIRSに対する効果的な治療は、整形外傷を有する患者に利益をもたらし得る。後述のように、我々のデータは、CDK9単独の阻害、及びCdk9とBrd4の同時阻害が、多数の免疫学的攻撃から生じる初期炎症反応遺伝子の活性化を効果的に抑制し、かつ炎症が誘導する二次的な健康への影響を防止することを明示している。
CDK9の阻害は、軟骨外植片での機械的傷害で誘導される炎症、アポトーシス及びマトリックスの分解を防止する
本実施例では、ウシ軟骨外植片を用いて、単一衝撃傷害モデルでのCDK9阻害剤フラボピリドールの治療的可能性を検討した。傷害誘導性の炎症反応及び異化反応、軟骨細胞アポトーシスならびに軟骨マトリックス変性の活性化を防止するフラボピリドールの能力を判定した。
関節傷害は、外傷後変形性関節症(PTOA)に至る場合が多い。外傷に対する急性傷害反応は、炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素の産生を誘導し、それは軟骨細胞アポトーシスを促進し、軟骨を変性させ、POTAの発症可能性を高める。最近の研究では、傷害反応遺伝子の転写活性化のための律速段階がサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)によって制御されることがわかっており、ゆえにCDK9は傷害反応を制限する興味深い標的となっている。そこで我々は、機械的傷害を受けた軟骨外植片において、CDK9の阻害が、傷害反応を抑制する効果を判定した。ウシ軟骨外植片を、100%/秒で歪み30%の単一の圧縮荷重により損傷させた後、CDK9阻害剤フラボピリドールにより処理した。急性傷害反応を評価するために、炎症誘発性サイトカイン、異化酵素及びアポトーシス遺伝子のmRNA発現をRT−PCRにより測定し、TUNEL染色により軟骨細胞の生存性及びアポトーシスを測定した。長期的転帰に関しては、溶解性グリコサミノグリカンの放出によって、ならびに瞬間弾性率及び緩和弾性率を用いて機械的特性を決定することによって軟骨マトリックスの分解を評価した。本データは、傷害誘導性の炎症性サイトカイン及び異化遺伝子の発現をCDK9阻害剤が著しく低減することを示した。CDK9阻害剤はまた、軟骨細胞アポトーシスを減衰させて、軟骨マトリックスの分解を低減させた。最後に、傷害を受けた外植片の機械的特性が、CDK9阻害剤によって保持された。この結果から、機械的衝撃、すなわち急性傷害反応から、それに続く軟骨細胞アポトーシス及び軟骨マトリックスの分解の誘導に至る連鎖的事象を結びつける時間的プロファイルが得られる。したがって、CDK9は、PTOAの発症を防止または遅延させる、膝外傷後の傷害反応の潜在的な疾患修飾薬である。
軟骨外植片−仔ウシ(約2か月齢、n=40関節、性別不明)の後膝関節を、屠殺後1日以内に現地屠殺場(Petaluma,CA)から入手した。6mmの生検パンチを関節面の荷重領域に対して垂直に挿入し、各大腿骨顆から、6〜8の円筒状軟骨外植片を採取した。次に、個別仕様のジグを使用して、外植片を約3mm厚に切り揃えた(関節面は無傷なまま、深層を平坦に切る)。外植片をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、10%のウシ胎児血清(Invitrogen)、ペニシリン(1X104ユニット/ml)及びストレプトマイシン(1X104μg/ml)を補充した高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、37℃、5%CO2及び相対湿度95%にて24時間培養した。
CDK9の阻害は傷害誘導性の炎症誘発性遺伝子及び異化遺伝子を抑制する−CDK9は炎症性遺伝子活性化の律速段階を制御しており(Hargreaves et al.,2009;Zippo et al.,2009)、我々は、in vitroでのCDK9阻害は、外因的に付加される炎症誘発性サイトカインの異化作用の影響から軟骨細胞及び軟骨を保護することを以前に示している(Yik et al.,2014)。しかしながら、膝傷害で起こり得るものと類似した、直接的な衝撃による傷害を受ける軟骨でのCDK9阻害の効果は検討されていなかった。我々は、機械的傷害を受けた軟骨でのCDK9の阻害が炎症反応を防止し、それにより軟骨細胞及び軟骨マトリックスに対するその後の有害作用を軽減するという仮説を立てた。我々の仮説を検証するために、ウシ軟骨外植片に歪み率30%で衝撃荷重を加えることにより、機械的な傷害を与えた(図9A)。この規模の荷重は、軟骨細胞アポトーシス及び軟骨マトリックスの分解を誘導する(Borrelli et al.,2003;D’Lima et al.,2001;Hembree et al.,2007;Loening et al.,2000;Morel and Quinn,2004;Rosenzweig et al.,2012;Waters et al.,2014)。傷害を受けた外植片をCDK9阻害剤フラボピリドールの存在下または非存在下で種々の時間培養した。傷害を受けた外植片で誘導された炎症性サイトカイン及び異化遺伝子のmRNA発現を測定して、無傷の対照と比較した。フラボピリドールの添加は、傷害によるサイトカインmRNAの誘導を低減した(図9B及びC、灰色バー)。この効果は、IL−6のmRNAの発現で最も顕著であった。IL−6のmRNAは試験された全時点で傷害により有意に誘導され(図9B、白抜きバー)、かつIL−6の誘導はフラボピリドールによって顕著に抑制された(図9B、灰色バー)。類似の傾向がIL−1βで観察された(図9C)が、これは統計的有意性に達しなかった。これらのデータは、予測通りに、軟骨外植片でのCDK9の阻害が、機械的傷害に応答した炎症性サイトカインの誘導を抑制することを示している。
この研究は、傷害後の軟骨外植片の生物学的及び機械的特性に対するCDK9阻害の効果を圧縮荷重によって検討した。この傷害モデルは、最初の24時間以内に炎症誘発性サイトカイン及び異化酵素の有意な誘導を引き起こした(図9)。アポトーシス遺伝子がこの期間内に変化することはなかった(図10)が、アポトーシス軟骨細胞は傷害後1日で外植片に検出でき、5日後にピークに達した(図11)。傷害はまた、GAGの放出により測定される軟骨マトリックスの分解を加速した(図12)。しかしながら、フラボピリドールによるCDK9阻害はこのような変化すべてを抑制し、天然軟骨のものと類似した機械的特性を維持し(図13)、その結果、物理的傷害及びそれに続く炎症反応の有害作用から軟骨細胞及び軟骨を効果的に保護した。
Claims (16)
- 有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を含む、その必要がある対象において軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善するとともに、ならびに軟骨の機械的特性を保持または増強するための医薬組成物であって、
前記サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤がフラボピリドールであり、
前記ブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤がJQ1であり、
前記対象が関節、靱帯、または軟骨組織に外傷を受傷したことがあり、
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、前記傷害を受けた関節、靱帯、または軟骨組織部位に直接、同時投与され、
有効量の前記サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及び前記ブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の軟骨変性及び/または軟骨細胞死を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善し、ならびに軟骨の機械的特性を保持または増強する、前記医薬組成物。 - 有効量のサイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及びブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を含む、その必要がある対象において外傷後変形性関節症の発症及び/または進行を低減、防止、阻害、緩和及び/または改善するとともに、ならびに軟骨の機械的特性を保持または増強するための医薬組成物であって、
前記サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤がフラボピリドールであり、
前記ブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤がJQ1であり、
前記対象が関節、靱帯、または軟骨組織に外傷を受傷したことがあり、
前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、前記傷害を受けた関節、靱帯、または軟骨組織部位に直接、同時投与され、
有効量の前記サイクリン依存性キナーゼ9(CDK9)阻害剤及び前記ブロモドメイン含有4(BRD4)阻害剤を前記対象に同時投与することにより、前記対象の外傷後変形性関節症を軽減、防止、阻害、緩和及び/または改善し、ならびに軟骨の機械的特性を保持または増強する、前記医薬組成物。 - 前記対象が関節手術を受けたことがある、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、急性反応段階で最初に同時投与され、外傷受傷後の1つ以上の初期応答遺伝子の転写活性化を抑制及び/または阻害する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記1つ以上の初期応答遺伝子が、IL−1β、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、IL−6、TNF−α、MMP−1、MMP−3、MMP−9、MMP−13及びADAMTS4(アグリカナーゼ)からなる群から選択される、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、外傷受傷後、約72時間以内に最初に同時投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、損傷または傷害後、約10日以内に前記対象に投与される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、10日間にわたって投与される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、複数回投与される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記対象が損傷した軟骨組織の修復手術を受けたことがある、請求項1〜9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記対象が骨軟骨外植片を移植されたことがある、請求項1〜10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記骨軟骨外植片が軟骨同種異系移植片である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、手術と同時に、または手術前に同時投与される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の両方が、手術後24時間以内に同時投与される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、マトリックスから送達される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記CDK9阻害剤及び前記BRD4阻害剤の一方または両方が、個々の阻害剤の治療量以下の用量または非有効用量で投与される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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