ES2348792T3

ES2348792T3 - TERAPIAS COMBINADAS DIRIGIDAS A MÃšLTIPLES RECEPTORES TIPO TOLL Y USO DE LAS MISMAS.

Info

Publication number: ES2348792T3
Application number: ES05856275T
Authority: ES
Inventors: Greg Elson; Olivier Leger
Original assignee: Novimmune SA
Current assignee: Novimmune SA
Priority date: 2004-12-10
Filing date: 2005-12-12
Publication date: 2010-12-14
Anticipated expiration: 2025-12-12
Also published as: JP2012197316A; EP1830881A2; EP1830881B1; WO2006077471A2; US8029794B2; CA2593561C; CA2593561A1; PL1830881T3; DK1830881T3; DE602005021694D1; JP2008523048A; US20060165686A1; AU2005325482A1; PT1830881E; JP5118491B2; WO2006077471A3; ATE469658T1; AU2005325482B2

Abstract

Una combinación de anticuerpos para uso médico en un sujeto, en la que dicha combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4), y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), en la que el anticuerpo anti-TLR4 comprende tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59.

Description

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a composiciones que contienen anticuerpos múltiples, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes múltiples que se unen inmunoespecíficamente a uno o más receptores de tipo toll, por ejemplo, dos o más receptores de tipo toll, y a procedimientos de uso de estas composiciones en el tratamiento de dolencias inflamatorias.

Antecedentes

Los receptores toll, que fueron descubiertos por primera vez en Drosophila, son proteínas transmembrana tipo I que tienen repeticiones ricas en leucina (LRR) en la porción extracelular de la proteína, y uno o dos dominios ricos en cisteína. Los homólogos mamíferos de los receptores toll de Drosophila se conocen como “Receptores de tipo toll” (TLR). Se ha demostrado que los TLR desempeñan una función en la inmunidad innata reconociendo partículas microbianas y activando células inmunes contra la fuente de estas partículas microbianas.

En la actualidad se han identificado diez tipos de receptores de tipo toll, TLR 1-10. Estos TLR se caracterizan por la homología de sus dominios intracelulares con los del receptor IL-1 y por la presencia de repeticiones extracelulares ricas en leucina.

Los TLR se activan por diferentes tipos de partículas microbianas conocidas como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Por ejemplo, TLR4 se activa principalmente por lipopolisacárido (LPS), mientras que TLR2 se activa por ácido lipoteicoico (LTA), lipoarabinomanano (LAM), lipoproteína (BLP) y peptidoglicanos (PGN). Por tanto, es posible que cualquier microbio dado pueda estimular varios TLR diferentes en paralelo en cualquier momento temporal dado durante una infección.

Además, se ha demostrado que ciertos TLR requieren la presencia de proteínas accesorias para funcionar. Por ejemplo, el TLR4 forma un complejo con la proteína 2 de diferenciación mieloide (MD-2) sobre la superficie celular. Se ha encontrado que la proteína MD-2 interactúa directamente con TLR4, y la MD-2 tiene la capacidad de permitir modificaciones postraduccionales de TLR4, además de facilitar su transporte a la superficie celular. CD14 es otra proteína que se ha relacionado con a la función de TLR4, y además CD14 también se ha relacionado con el reconocimiento de TLR2 de microbios.

Resumen de la invención

La invención proporciona composiciones que contienen una combinación de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizantes múltiples o uno o más anticuerpos multivalentes que se unen inmunoespecíficamente a uno o más receptores de tipo toll, por ejemplo, dos o más receptores de tipo toll, comprendiendo la combinación un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), comprendiendo el anticuerpo anti-TLR4 tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25 respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59. La divulgación también proporciona procedimientos de uso de estas combinaciones de anticuerpos en el tratamiento de dolencias inflamatorias. El trastorno inflamatorio es, por ejemplo, septicemia, inflamación aguda e inflamación crónica. Por ejemplo, la inflamación crónica está asociada a una enfermedad autoinmunitaria o trastorno inflamatorio tal como trastorno inflamatorio del intestino, osteoartritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, aterosclerosis, asma o EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica).

La invención también se refiere a la identificación de la contribución relativa de TLR4, TLR2 y CD14 al reconocimiento de y a la respuesta inmunitaria a la bacteria gram-negativa Escherichia coli en sangre completa humana usando anticuerpos monoclonales neutralizantes para cada componente de receptor. Además, la invención se refiere a procedimientos de detección del efecto de tratamiento con MAb de combinación en la inhibición de respuesta inmunitaria.

La invención proporciona composiciones que contienen anticuerpos múltiples o composiciones que contienen uno o más anticuerpos multivalentes, comprendiendo las composiciones un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), comprendiendo el anticuerpo anti-TLR4 tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59. Dicha combinación o composición de anticuerpos incluye dos o más anticuerpos, uniéndose los anticuerpos inmunoespecíficamente a dos o más dianas tales como concretamente al menos receptor 4 similar a toll (TLR4) y receptor 2 similar a toll (TLR2) y por ejemplo receptor 1 similar a toll (TLR1), receptor 5 similar a toll (TLR5), receptor 6 similar a toll (TLR6), MD-2 y CD14. Por ejemplo, la combinación contiene al menos dos anticuerpos, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4 y el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2. Por ejemplo, la combinación contiene al menos tres anticuerpos, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a MD-2. La combinación contiene al menos tres anticuerpos, por ejemplo, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CD14. La combinación contiene al menos cuatro anticuerpos, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, el anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a MD-2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CD14.

Los anticuerpos son, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y más específicamente anticuerpos monoclonales neutralizantes que pueden bloquear, es decir, neutralizar la actividad biológica

o función de la diana. Como se usa en este documento, los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” se refieren a anticuerpos monovalentes (es decir, monoespecíficos) y anticuerpos multivalentes (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos). Anticuerpos adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos y fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS. Como se usa en este documento, el término “citocina proinflamatoria” se refiere a aquellas citocinas inmunoreguladoras que promueven la inflamación y/o están asociadas a inflamación. Las citocinas proinflamatorias incluyen, por ejemplo, IL-6, IL-8, TNF-alfa, IL1-alfa, IL1-beta, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IL-10, IL12, IL-23, IL17 y IL18.

Los anticuerpos reconocen, por ejemplo, el complejo de receptores de TLR4/MD-2 expresado sobre la superficie celular. Los anticuerpos usados en las composiciones y procedimientos de la invención incluyen anticuerpos que se unen al complejo de receptores de TLR4/MD-2 humano y también se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2. Los anticuerpos de la invención también incluyen anticuerpos que se unen a la porción TLR4 del complejo de receptores de TLR4/MD-2 humano, pero la unión es completamente dependiente de la presencia de MD-2. Además, los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos que se unen al complejo de receptores de TLR4/MD-2 humano y también se unen a MD-2, pero sólo en presencia de TLR4. Otros anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos que se unen a MD-2 cuando no se complejan a TLR4, anticuerpos que se unen a TLR2, anticuerpos que se unen a TLR1, anticuerpos que se unen a TLR5, anticuerpos que se unen a TLR6 y anticuerpos que se unen a CD14.

Anticuerpos a modo de ejemplo de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 18H10 murino, el anticuerpo 16G7 murino, el anticuerpo 15C1 murino, el anticuerpo 7E3 murino, el anticuerpo 18H10 humanizado, el anticuerpo 16G7 humanizado, el anticuerpo 15C1 humanizado, el 7E3 humanizado. Estos anticuerpos muestran especificidad por el complejo de receptores de TLR4/MD-2 humano y se ha mostrado que inhiben la activación de receptores y la posterior señalización intracelular por LPS. Estos anticuerpos tienen distintas especificidades. Por ejemplo, 15C1 se une a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2, 7E3 se une a TLR4, pero la unión depende de la presencia de MD-2, y 18H10 se une a MD-2, pero requiere la presencia de TLR4, ya que el MAb no se une a formas solubles de MD-2.

Otros anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos que reconocen CD14 tales como el anticuerpo monoclonal anti-CD14 conocido como 28C5 (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.444.206) y anticuerpos que reconocen TLR4 que incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-TLR2 conocido como T2.5 (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/028509).

Los anticuerpos adecuados usados en las combinaciones y composiciones de la presente invención comprenden un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), comprendiendo el anticuerpo anti-TLR4 tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59.

Los anticuerpos adecuados usados en las combinaciones y composiciones de esta divulgación contienen una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47, 48, 51 y 56. Los anticuerpos adecuados contienen una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 7, 17, 27,37, 43, 44, 46, 49, 53 y 59. Las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más a una secuencia seleccionada del grupo que está constituido por GGYSWH (SEQ ID NO:23); YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO:24); KDPSDGFPY (SEQ ID NO:25); DSYIH (SEQ ID NO:3); WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO:4), GYNVYYAMDY (SEQ ID NO:5); TYNIGVG (SEQ ID NO:33); HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO:34); MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO:35), TYGIN (SEQ ID NO:62); GFTFTTYG (SEQ ID NO:63); WIYPRDGSTNFNENFKD (SEQ ID NO: 64); IYPRDGST (SEQ ID NO: 65); ARLTGGTFLDY (SEQ ID NO: 66); SDSAWN (SEQ ID NO: 72), YISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 73) y GLRFAY (SEQ ID NO: 74). Las tres CDR de cadena ligera incluyen una secuencia de aminoácidos idéntica al menos el 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más a una secuencia seleccionada del grupo que está constituido por la secuencia de aminoácidos de RASQSISDHLH (SEQ ID NO:28); YASH AIS (SEQ ID NO:29); QNGHSFPLT (SEQ ID NO:30); SASSSVIYMH (SEQ ID NO:8); RTYNLAS (SEQ ID NO:9); HQWSSFPYT (SEQ ID NO:10); RASQDITNILN (SEQ ID NO:38); YTSKLHS (SEQ ID NO:39); QQGNTFPWT (SEQ ID NO:40); RASESVEYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 67); ESVEYYGTSL (SEQ ID NO: 68); GASNVES (SEQ ID NO:69); GAS (SEQ ID NO:70); QQSRKLPWT (SEQ ID NO:71), RASESVDSYVNSFLH (SEQ ID NO: 75); RASNLQS (SEQ ID NO: 76) y QQSNEDPYT (SEQ ID NO:77).

Para los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un complejo de TLR4/MD-2, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une a un epítope que incluye uno o más residuos de aminoácidos en el TLR4 humano entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO:61. Por ejemplo, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une específicamente a un epítope que incluye residuos seleccionados del grupo que está constituido por al menos los residuos 293 a 295 de la SEQ ID NO:61; al menos los residuos 296 y 297 de la SEQ ID NO:61; al menos los residuos 319 a 321 de la SEQ ID NO: 61; al menos los residuos 328 y 329 de la SEQ ID NO:61; al menos los residuos 349 a 351 de la SEQ ID NO:61; y al menos los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO:61. Por ejemplo, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une específicamente a un epítope que contiene al menos los residuos 328, 329, 349 a 351 y 369 a 371 de la SEQ ID NO:61. En otro ejemplo, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une específicamente a un epítope que incluye al menos los residuos 293 a 295, 296, 297 y 319 a 321 de la SEQ ID NO:61.

Para anticuerpos que se unen al complejo de TLR4/MD2, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une a un epítope en la MD-2 humana entre los residuos 19 y 57 de la SEQ ID NO:60. Por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítope que contiene al menos los residuos 53 de la SEQ ID NO:60.

Para anticuerpos que se unen a TLR2, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une a un epítope en la porción del extremo C del dominio extracelular de TLR2 (es decir, TLR2ECD).

La invención también proporciona una combinación de anticuerpos para uso en un procedimiento de alivio de un síntoma de una patología asociada a un trastorno inflamatorio en un sujeto en el que se desea tal alivio. El sujeto es, por ejemplo, un ser humano.

La combinación de anticuerpos usada en los procedimientos de la invención incluye dos o más anticuerpos como se define en la reivindicación 1, uniéndose los anticuerpos inmunoespecíficamente a dos o más dianas tales como, por ejemplo, receptor 4 similar a toll (TLR4), receptor 2 similar a toll (TLR2), MD-2 y CD14. Por ejemplo, la combinación contiene al menos dos anticuerpos, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2. Por ejemplo, la combinación contiene al menos tres anticuerpos, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a MD-2. La combinación contiene al menos tres anticuerpos, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CD14. La combinación contiene al menos cuatro anticuerpos, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR4, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a TLR2, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a MD-2 y un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CD14. Los anticuerpos usados en los procedimientos de la invención también incluyen anticuerpos multivalentes que se unen inmunoespecíficamente a al menos dos dianas seleccionadas de TLR4, MD-2, TLR2 y CD14.

La combinación de anticuerpos está presente en cantidad que es suficiente para prevenir o reducir la iniciación de una respuesta inmunitaria en el sujeto que va a tratarse.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A: es una gráfica que representa el efecto de un anticuerpo monoclonal anti

TLR4 (denominado en lo sucesivo 15C1) y un anticuerpo monoclonal anti

TLR2 (denominado en este documento T2.5) sobre la producción de IL-8 in

ducida por LPS en cualquier transfectante de HEK 293 hTLR4/MD2 (Figura

1A).

La Figura 1B: es una gráfica que representa el efecto del MAb anti-TLR4 15C1 y el MAb

anti-TLR2 T2.5 sobre la producción de IL-8 inducida por PAM3CSK4 en un

transfectante estable de HEK 293 hTLR2 (Figura 1B).

La Figura 2A: es una serie de gráficas que representan el efecto del MAb anti-TLR4 15C1,

el MAb anti-TLR2 T2.5 y el MAb anti-CD14 28C5 sobre la producción de IL

6 inducida por LPS en sangre completa.

La Figura 2B: es una serie de gráficas que representan el efecto del MAb anti-TLR4 15C1,

el MAb anti-TLR2 T2.5 y el MAb anti-CD14 28C5 sobre la producción de IL

6 inducida por PAM3CSK4 en sangre completa.

Las Figuras 3A y 3B: son una serie de gráficas que representan el efecto de combinaciones del

MAb anti-TLR4 15C1, el MAb anti-TLR2 T2.5 y el MAb anti-CD14 28C5 so

bre la producción de IL-6 en sangre completa estimulada por E. coli natural

inactivada.

Las Figuras 4A-4D: son una serie de gráficas que representan la expresión superficial de TLR2,

TLR4, MD-2 y CD14 sobre leucocitos sanguíneos, células HUVEC y BEAS

2B.

Las Figuras 5A y 5B: son una serie de gráficas que representan la inhibición de la producción de

IL-6 inducida por PAMP bacterianos en sangre completa humana por MAb

anti-TLR específicos.

Las Figuras 6A y 6B: son una serie de gráficas que representan la inducción de la producción de

Las Figuras 7A -7C Las Figuras 8A -8D La Figura 9

Las Figuras 10A-10F

Las Figuras 11A-11F

Las Figuras 12A-12F

Las Figuras 13A-13F

Las Figuras 14A y 14B

-6

IL-8 en células HEK 293 transfectadas por bacterias inactivadas por calor. son una serie de gráficas que representan la inducción de la producción de IL-6 por bacterias inactivadas por calor. son una serie de gráficas que representan la inhibición de la producción de IL-6 inducida por bacterias por MAb anti-TLR específicos. es una serie de gráficas que representan la comparación de la producción de IL-6 inducida en sangre completa humana por bacterias inactivadas por calor e inactivadas por antibióticos. son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos de VH (SEQ ID NO:1) (Figura 10A), la secuencia de aminoácidos de VH (SEQ ID NO:2) (Figura 10B), la secuencia de nucleótidos de VL (SEQ ID NO:6) (Figura 10D) y la secuencia de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:7) para mu18H10 (Figura 10E). Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs:3, 4 y 5) (Figura 10C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 8, 9 y 10) (Figura 10F) están marcadas en el texto en cursiva subrayado en las FIGS. 10B y 10E. son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos de VH (SEQ ID NO:11) (Figura 11A), la secuencia de aminoácidos de VH (SEQ ID NO:12) (Figura 11B), la secuencia de nucleótidos de VL (SEQ ID NO:16) (Figura 11D) y la secuencia de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:17) (Figura 11E) para mu16G7. Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs: 13, 14 y 15) (Figura 11C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 18, 19 y 20) (Figura 11F) están marcadas en el texto en cursiva subrayado en las FIGS. 11B y 11E. son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos de VH (SEQ ID NO:21) (Figura 12A), la secuencia de aminoácidos de VH (SEQ ID NO:22) (Figura 12B), la secuencia de nucleótidos de VL (SEQ ID NO:26) (Figura 12D) y la secuencia de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:27) (Figura 12E) para mu15C1. Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs: 23, 24 y 25) (Figura 12C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 28, 29 y 30) (Figura 12F) están marcadas en el texto en cursiva subrayado en las FIGS. 12B y 12E. son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos de VH (SEQ ID NO:31) (Figura 13A), la secuencia de aminoácidos de VH (SEQ ID NO:32) (Figura 13B), la secuencia de nucleótidos de VL (SEQ ID NO:36) (Figura 13D) y la secuencia de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:37) (Figura 13E) para mu7E3. Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs: 33, 34 y 35) (FIG. 13C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 38, 39 y 40) (FIG. 13F) están marcadas en el texto en cursiva subrayado en las FIGS. 13B y 13E. son una serie de ilustraciones que representan dos versiones de la secuen

cia de aminoácidos de VH humanizada (SEQ ID NO:41), (SEQ ID NO:42)

(Figura 14A) y dos versiones de la secuencia de aminoácidos de VL huma

nizada (SEQ ID NO:43), (SEQ ID NO:44) (Figura 14B) para hu15C1. Tam

bién se muestran las CDR de VH y VL.

La Figura 15: es una ilustración que representa la secuencia de aminoácidos de VH (SEQ

ID NO:45) y la secuencia de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:46) para

hu18H10. También se muestran las CDR de VH y VL.

La Figura 16: es una ilustración que representa dos versiones de la secuencia de aminoá

cidos de VH humanizada (SEQ ID NO:47), (SEQ ID NO:48) y la secuencia

de aminoácidos de VL (SEQ ID NO:49) para hu7E3. También se muestran

las CDR de VH y VL.

La Figura 17: es una ilustración que representa las secuencias de ácidos nucleicos y de

aminoácidos de la cadena pesada de 28C5 (SEQ ID NOS:50 y 51, respecti

vamente).

La Figura 18: es una ilustración que representa las secuencias de ácidos nucleicos y de

aminoácidos de la cadena ligera de 28C5 (SEQ ID NOS:52 y 53, respecti

vamente).

La Figura 19: es una ilustración que representa las secuencias de ácidos nucleicos y de

aminoácidos de la cadena pesada variable de T2.5 (SEQ ID NOS:54-55 y

56, respectivamente).

La Figura 20: es una ilustración que representa las secuencias de ácidos nucleicos y de

aminoácidos de la cadena ligera variable de T2.5 (SEQ ID NOS:57-58 y 59,

respectivamente).

La Figura 21: es una ilustración que representa una secuencia de aminoácidos de una

proteína accesoria MD-2 madura (SEQ ID NO:60).

La Figura 22: es una ilustración que representa la secuencia de aminoácidos del receptor

4 similar a toll humano (TLR4) (SEQ ID NO:61).

Descripción detallada de la invención

Los TLR reconocen partículas microbianas y activan células inmunitarias contra la fuente de estas partículas microbianas (véase Takeda y col., Annu. Rev. Immunol., 21: 335-76 (2003)). Por ejemplo, se ha demostrado que TLR4 y MD-2 forman un complejo sobre la superficie celular, y la presencia de MD-2 parece esencial para la receptividad de TLR4 a diversos ligandos que incluyen LPS. LPS es un glicolípido de la membrana externa de bacterias gram-negativas que puede activar fuertemente el sistema inmunitario innato. El LPS se ha considerado uno de los factores principales en la activación del sistema inmunitario durante la inflamación generalizada grave resultante de infección por gram-negativos (Lakhani y col., Curr. Opin. Pediatr. 15: 278-282 (2003)).

Desde el descubrimiento de los TLR de mamíferos al final de los años 90 (Medzhitov y col., Nature 1997; Rock y col., PNAS 1998), se ha identificado un gran número de ligandos activadores (revisado en Akira, Nat Immun 2004). La mayoría de estos ligandos son moléculas purificadas o sintéticas conocidas como PAMP derivadas de una variedad de microorganismos. Estos ligandos demuestran un alto nivel de especificidad para TLR individuales y permiten que el huésped detecte la presencia de patógenos invasores dentro de tejidos. En general, estos PAMP son esenciales para la supervivencia del microorganismo y, por tanto, no pueden modificarse para evitar la detección.

Más recientemente ha surgido que una segunda clase de ligandos derivada de moléculas endógenas puede iniciar la inmunidad innata estimulando la señalización de TLR (revisado en Johnson, Crit. Rev. Immunol 2003). Estos ligandos se generan en general mediante la degradación de macromoléculas que se producen como resultado de inflamación, rotura celular, activación de cascadas proteolíticas, etc. y pueden considerarse como “señales peligrosas” iniciadoras durante momentos de lesión tisular o estrés. Por ejemplo, se han identificado ligandos endógenos para TLR2, TLR4 y TLR9 (Johnson y col., Crit. Rev. Immunol., vol. 23(1-2) (2003)).

La señalización de TLR se ha estudiado con ligandos de TLR altamente purificados. Los ejemplos proporcionados en este documento demuestran la utilización relativa de TLR de un microorganismo completo durante la iniciación de la respuesta inmunitaria innata. La E. coli está compuesta por varios PAMP que pueden estimular la señalización de TLR. Por ejemplo, el componente de la membrana externa integral LPS es un estimulante muy fuerte de TLR4. Las bacterias gram-negativas también poseen lipoproteínas, conocidas por estimular el sistema inmunitario específicamente mediante TLR2 (Akira y Takeda, Nat. Rev. Immunol., vol. 4(7):499-511 (2004)). Por tanto, una bacteria gram-negativa entera puede iniciar una respuesta inmunitaria mediante dos TLR en paralelo.

El modelo usado en los estudios descritos en los ejemplos proporcionados en este documento requiere la administración de bacterias gram-negativas E. coli inactivadas por calor en sangre completa humana. La producción de IL-6 se monitorizó como una lectura de la respuesta inmunitaria inducida por E. coli inactivada por calor. Se usaron MAb bloqueantes dirigidos contra TLR4, TLR2 y CD14 en un intento por determinar la contribución de cada una de estas proteínas a la reacción inmunitaria resultante. Se observó una inhibición parcial de IL-6 con tratamiento con αTLR4, mientras que el tratamiento con αTLR2 no afectó los niveles de citocinas. Estos resultados indican que los ligandos de TLR4 (por ejemplo, LPS) son los principales iniciadores de la respuesta inmunitaria. Sin embargo, un co-tratamiento de MAb de TLR4 y TLR2 redujo significativamente los niveles de IL-6 en todos los donantes (n=3) a un nivel muy por debajo de los niveles detectados con el MAb de TLR4 solo. Estos datos indican que los ligandos de TLR2 están desempeñando una función en la iniciación de la respuesta inmunitaria, aunque estos no son predominantes. Los MAb de αCD14 tenían una mayor actividad neutralizante que los MAb de TLR4 y TLR2 solos debido al hecho de que CD14 es un co-receptor para tanto ligandos de TLR4 como de TLR2 (Figura 2, Figura 5). Se observó un aumento de la inhibición cuando se coadministraron MAb de CD14 con o TLR4 o TLR2 o ambos. Esto indica que los ligandos de TLR2 y TLR4 en E. coli pueden inducir señalización de receptores mediante un mecanismo independiente de CD14.

Los usos médicos descritos en este documento tienen muchas aplicaciones. Por ejemplo, los usos médicos descritos en este documento se usan para elegir como diana TLR en el contexto de enfermedades inflamatorias agudas tales como septicemia y en enfermedades inflamatorias crónicas tales como trastorno inflamatorio del intestino (EII), artritis reumatoide, esclerosis múltiple y aterosclerosis (O'Neill, Curr. Op. Pharmacology, vol. 3:396-403 (2003)). Los usos médicos descritos en este documento eligen como diana múltiples TLR o sus proteínas accesorias en paralelo, en vez de como una mono-terapia. Por ejemplo, la inflamación sistémica resultante de infecciones por bacterias gramnegativas se ha relacionado con la aparición de septicemia y choque séptico. Una solución terapéutica que apunta a reducir la inflamación usando los usos médicos descritos en este documento elige como diana más de un TLR o proteína relacionada. Además, los usos médicos descritos en este documento se usan en EII, en la que la flora polimicrobiana desempeña una función importante en la aparición de enfermedad, para elegir como diana más de un TLR o proteína relacionada, en vez de un TLR individual o proteína relacionada. Los usos médicos descritos en este documento también puede usarse para elegir como diana TLR2 y TLR4 simultáneamente en enfermedades en las que los productos de degradación macromolecular o ligandos endógenos están posiblemente exacerbando la inflamación (la osteoartritis y la artritis reumatoide son indicaciones hipotéticas para esto), proporcionando una ventaja con respecto a la elección como diana de cualquier TLR solo.

Por consiguiente, la elección como diana de más de un TLR o proteína relacionada es una posible estrategia terapéutica en el tratamiento de trastornos tales como, por ejemplo, inflamación sistémica aguda y septicemia inducida por infección por bacterias gram-negativas.

Uehori, J. y col., Infection and Immunity, páginas 4238 a 4249 (2003), describen cómo el bloqueo simultáneo del receptor 2 y 4 similar a toll humano por anticuerpos suprime la activación de células dendríticas mieloides inducidas por el peptidoglicano de bacilo de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG). La combinación de los dos anticuerpos proporciona un pequeño efecto aditivo con respecto al uso de anticuerpos individuales.

Definiciones:

A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos usados a efecto de la presente invención deben tener los significados que son comúnmente entendidos por aquellos expertos en la materia. Además, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos en singular deberán incluir pluralidades y los términos en plural deberán incluir el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas a propósito de, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos e hibridación descritas en este documento son aquellas muy conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según especificaciones del fabricante o como comúnmente se realizan en la técnica o como se describen en este documento. Las anteriores técnicas y procedimientos se realizan en general según procedimientos convencionales muy conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se tratan en toda la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas a propósito de, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica farmacéutica descritas en este documento son aquellas muy conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas y tratamiento de pacientes.

Como se utiliza según la presente divulgación, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, deberán entenderse que tienen los siguientes significados:

Como se usa en este documento, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno. Por “unir específicamente” o “inmunorreacciona con” o “unir inmunoespecíficamente” se indica que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con mucha menor afinidad (Kd > 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, scFvs, y una biblioteca de expresión de Fab.

Se sabe que la unidad básica estructural del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos. La porción del extremo carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpos obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferencian entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases tales como IgG1, IgG2 y otras. Además, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

El término “anticuerpo monoclonal” (MAb) o “composición de anticuerpos monoclonales” como se usa en este documento se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que sólo contienen una especie molecular de molécula de anticuerpo constituida por un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión a antígeno que puede inmunorreaccionar con un epítope particular del antígeno caracterizado por una única afinidad de unión por él.

El término “sitio de unión a antígeno” o “porción de unión” se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que se ha relacionado con la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables (“V”) del extremo N de las cadenas pesadas (“H”) y ligeras (“L”). Tres estiramientos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesadas y ligeras, denominadas en lo sucesivo “regiones hipervariables”, están interpuestas entre estiramientos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones estructurales” o “FR”. Por tanto, el término “FR” se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas las una respecto a las otras en espacios tridimensionales para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se denominan en lo sucesivo “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia y col. Nature 342:878-883 (1989).

Como se usa en este documento, el término “epítope” incluye cualquier determinante de proteína que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células

T. El término “epítope” incluye cualquier determinante de proteína que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos están normalmente constituidos por agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, además de características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse contra los péptidos del extremo N o del extremo C de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es ≤ 1 µM; preferentemente ≤ 100 nM y lo más preferentemente ≤ 10 nM.

Como se usa en este documento, los términos “unión inmunológica” y “propiedades de unión inmunológica” se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, representando una Kd más pequeña una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Un procedimiento tal implica medir las tasas de formación y disociación de complejos de sitio de unión a antígeno/antígeno, dependiendo aquellas tasas de las concentraciones de los componentes del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por tanto, tanto la “constante de afinidad” (Kaf) como la “constante de disociación” (Kdis) pueden determinarse calculando las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación (véase Nature 361:186-87 (1993)). La relación de Kdis /Kaf permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd (véase, en general, Davies y col. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente invención se une específicamente al complejo de receptor 4 similar a toll (TLR4)/MD-2 o a TLR4 cuando no se compleja a MD-2, cuando la constante de unión de equilibrio (Kd) es ≤ 1 µM, preferentemente ≤ 100 nM, más preferentemente ≤ 10 nM, y lo más preferentemente ≤ 100 pM a aproximadamente 1 pM, como se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos para aquellos expertos en la materia.

El término “polinucleótido aislado” como se usa en este documento deberá significar un polinucleótido de ADN genómico, ADNc o de origen sintético o alguna combinación de los mismos que en virtud de su origen el “polinucleótido aislado” (1) no está asociado a todo o una parte de un polinucleótido en que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (2) está operativamente ligado a un polinucleótido que no está ligado en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más larga. Los polinucleótidos según la invención incluyen las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada presentadas en SEQ ID NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47 y 48 y moléculas de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera representadas en SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 43, 44, 46 y53.

El término “proteína aislada” mencionada en este documento significa una proteína de ADNc, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de los mismos que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no está asociada a proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza.

El término “polipéptido” se usa en este documento como un término genérico para referirse a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por tanto, los fragmentos de proteínas nativas y análogos son especies del género de los polipéptidos. Los polipéptidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada representadas en SEQ ID NOS: 2, 12, 22, 32, 41, 42, 45, 47 y 48 y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera representadas en SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 43, 44, 46 y 49, además de moléculas de anticuerpos formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, además de fragmentos y análogos de las mismas.

El término “que se produce naturalmente” como se usa en este documento cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueda encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente en el laboratorio o de otro modo se produce naturalmente.

El término “operativamente ligado” como se usa en este documento se refiere a posiciones de componentes así descritos que guardan una relación que les permite funcionar en su modo previsto. Una secuencia de control “operativamente ligada” a una secuencia codificante está ligada de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El término “secuencia de control” como se usa en este documento se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control se diferencia dependiendo del organismo huésped en procariotas, tales secuencias de control incluyen en general promotor, sitio de unión ribosómico y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, en general, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias de componentes de fusión. El término “polinucleótido” como se menciona en este documento significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases en longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.

El término oligonucleótido mencionado en este documento incluye nucleótidos que se producen naturalmente y modificados ligados juntos por enlaces de oligonucleótidos que se producen naturalmente y que no se producen naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que en general comprende una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen 10 a 60 bases en longitud y lo más preferentemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos son normalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos de la invención son oligonucleótidos tanto sentido como antisentido.

El término “nucleótidos que se producen naturalmente” mencionado en este documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término “nucleótidos modificados” mencionado en este documento incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término “enlaces de oligonucleótidos” mencionado en este documento incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleniato, fosforodiseleniato, fosforanilotioato, fosforaniladato, fosforamidato y similares. Véanse, por ejemplo, LaPlanche y col. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein y col., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon y col. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y col. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pág. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec y col., patente de EE.UU. nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews

90:543 (1990). Si se desea, un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección.

El término “hibridar selectivamente” mencionado en este documento significa unir detectablemente y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos según la invención se hibridan selectivamente a cadenas de ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectivas como se conocen en la técnica y se tratan en este documento. En general, la homología de secuencias de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácidos nucleicos de interés será al menos el 80%, y más normalmente con homologías preferentemente crecientes de al menos el 85%, 90%, 95%, 99% y el 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para el apareamiento máximo. Los huecos (en cualquiera de las dos secuencias que van a aparearse) se permiten en la maximización del apareamiento; se prefieren longitudes de huecos de 5 o menos siendo más preferidas 2 o menos. Alternativamente y preferentemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en este documento, si tienen una puntuación de alineamiento superior a 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o superior. Véanse Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pág. 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 en este volumen, pág. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferentemente homólogas si sus aminoácidos son superiores a o iguales al 50% de identidad cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN. El término “se corresponde con” se usa en este documento para significar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no está evolutivamente relacionada) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. En contradicción, el término “complementario a” se usa en este documento para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos “TATAC” se corresponde con una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencias”, “porcentaje de identidad de secuencias” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de genes dada en una lista de secuencias o puede comprender un ADNc completo o secuencia de genes. En general, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos en longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos o 8 aminoácidos en longitud, y frecuentemente al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos en longitud. Como dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos pueden comprender cada una (1) una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender adicional-mente una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan normalmente comparando secuencias de las dos moléculas con respecto a una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una “ventana de comparación”, como se usa en este documento se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos, o 6 aminoácidos, pudiendo compararse una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos y pudiendo comprender la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación adiciones, deleciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamientos con homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de software Geneworks, o MacVector, o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, dando como resultado el mayor porcentaje de homología con respecto a la ventana de comparación) generado por los diversos procedimientos.

El término “identidad de secuencias” significa que dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) con respecto a la ventana de comparación. El término “porcentaje de identidad de secuencias” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas con respecto a la ventana de la comparación, determinando el número de posiciones en las que la base o residuo de ácido nucleico idéntico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) se produce en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias. Los términos “identidad sustancial” como se usa en este documento denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos, comprendiendo el polinucleótido o aminoácido una secuencia que tiene al menos el 85 por ciento de identidad de secuencias, preferentemente al menos el 90 al 95 por ciento de identidad de secuencias, más normalmente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencias con respecto a una secuencia de referencia con respecto a una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente con respecto a una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), calculándose el porcentaje de identidad de secuencias comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que asciende al 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia con respecto a la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor.

Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (2ª edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, Daminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α,α-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5hidroxilisina, σ-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en este documento, la dirección de la mano izquierda es la dirección del extremo amino y la dirección de la mano derecha es la dirección del extremo carboxi, según uso y convención estándar.

Similarmente, a menos que se especifique lo contrario, el extremo de la mano izquierda de secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'. La dirección de la mano izquierda de secuencias de polinucleótidos bicatenarias se denomina en lo sucesivo la dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina en lo sucesivo la dirección de transcripción; las regiones de secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 5' con respecto al extremo 5' del trascrito de ARN se denominan en lo sucesivo “secuencias aguas arriba”, las regiones de secuencias en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que son 3' con respecto al extremo 3' del trascrito de ARN se denominan en lo sucesivo “secuencias aguas abajo”.

Como se aplica a polipéptidos, el término “identidad sustancial” significa que dos secuencias de péptidos, cuando están óptimamente alineadas, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencias, preferentemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencias, más preferentemente al menos el 95 por ciento de identidad de secuencias, y lo más preferentemente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencias.

Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones conservativas de aminoácidos.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservativas de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.

Como se trata en este documento, se contempla que las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están englobadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, 90%, 95%, y lo más preferentemente el 99%. En particular, se contemplan sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares sin carga son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante en la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio estructural. Si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional puede determinarse fácilmente ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en este documento. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos de experto en la materia. Los extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se producen próximos a límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de datos de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o registradas. Preferentemente se usan procedimientos de comparación computerizada para identificar motivos de secuencias o dominios de conformación de proteínas predichas que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen procedimientos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional, Bowie y col. Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según la invención.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión formando complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia de péptidos que se produce naturalmente. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones individuales o múltiples de aminoácidos (preferentemente sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia que se produce naturalmente (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio(s) que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservativa de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, o perturbar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J: Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y col. Nature

354:105 (1991).

El término “fragmento de polipéptido” como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción del extremo amino y/o del extremo carboxi, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia deducida que se produce naturalmente, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen normalmente al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término “análogo” como se usa en este documento se refiere a polipéptidos que están constituidos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene unión específica al complejo de TLR4/MD2 o TLR4 solo bajo condiciones de unión adecuadas. Normalmente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservativa de aminoácidos (o adición o deleción) con respecto a la secuencia que se produce naturalmente. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más largos, y frecuentemente pueden ser tan largos como un polipéptido de longitud completa que se produce naturalmente.

Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos

no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan “miméticos de péptidos” o “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv. Drug Res.

15:29 (1986), Veber y Freidinger TINS pág. 392 (1985); y Evans y col. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computerizado. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico equivalente o profiláctico. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que está constituido por: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=GH-(cis y trans), -COCH2-, CH(OH)CH2y -CH2SO-, mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno

o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, Dlisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencias consenso sustancialmente idénticas pueden generarse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos internos de cisteína que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

El término “agente” se usa en este documento para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos.

Como se usa en este documento, los términos “marca” o “marcado” se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la marca o el marcador también pueden ser terapéuticos. En la técnica se conocen y pueden usarse diversos procedimientos de marcado de polipéptidos y glicoproteínas. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 355, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos de biotinilo quimioluminiscentes, epítopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epítopes). En algunas realizaciones, las marcas están unidas por brazos separadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. El término “agente farmacéutico o fármaco” como se usa en este documento se refiere a un compuesto químico o composición que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.

Otros términos de química en este documento se usan según el uso convencional en la técnica como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Como se usa en este documento, “sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie de individuos en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y el 99%. Lo más preferentemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por procedimientos de detección convencionales), estando constituida esencialmente la composición por una única especie macromolecular.

El término paciente “incluye” sujetos humanos y veterinarios.

Anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales de la invención (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos o humanizados) tienen la capacidad de inhibir la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS. La inhibición se determina, por ejemplo, en la sangre completa humana y ensayos de células HEK 293 transfectadas con huTLR4/MD2 descritos en este documento. Anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, los anticuerpos denominados en este documento anticuerpo monoclonal 18H10 murino (“mu18H10”), anticuerpo monoclonal 18H10 humano (“hu18H10”), anticuerpo monoclonal 16G7 murino (“mu16G7”), anticuerpo monoclonal 15Cl murino (“mu15C1”), anticuerpo monoclonal 15C1 humano (“hu15C1”), anticuerpo monoclonal 7E3 murino (“mu7E3'') y anticuerpo monoclonal 7E3 humano (“hu7E3”). Los anticuerpos mu18H10 y hu18H10 reconocen el complejo de TLR4/MD-2, pero no reconocen una proteína de MD-2 cuando no está complejada con TLR4. Los anticuerpos monoclonales mu16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3 y hu7E3 reconocen el complejo de TLR4/MD-2. mu15C1, hu15C1 y 16G7 también reconocen TLR4 cuando no están complejados con MD-2. Otros anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos monoclonales que reconocen TLR2, MD-2 o CD14 tales como el anticuerpo monoclonal anti-CD14 conocido como “28C5” y el anticuerpo monoclonal anti-TLR2 conocido como “T2.5”.

En la invención también están incluidos anticuerpos que se unen al mismo epítope que los anticuerpos descritos en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente a un complejo de TLR4/MD-2, uniéndose el anticuerpo a un epítope que incluye uno o más residuos de aminoácidos en el TLR4 humano entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO:61. Los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente al complejo de TLR4/MD2, uniéndose el anticuerpo a un epítope en la MD-2 humana entre los residuos 19 y 57 de la SEQ ID NO:60. Para anticuerpos que se unen a TLR2, el anticuerpo o una parte de un anticuerpo multivalente se une a un epítope en la porción del extremo C del dominio extracelular de TLR2 (es decir, TLR2ECD).

Aquellos expertos en la materia reconocerán que es posible determinar sin demasiada experimentación si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o humanizado murino) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal descrito en este documento (por ejemplo, mu18H10, hu18H10, mu16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3, hu7E3, 28C5 y/o T2.5) determinando si el anterior previene que el último se una al anticuerpo diana, por ejemplo, el complejo de TLR4/MD-2, TLR4 cuando no está complejado con MD-2, MD-2 cuando no está complejado con TLR4, MD-2 cuando no está complejado con TLR4, TLR2 y CD14. Si el anticuerpo monoclonal que está siendo probado compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítope, o uno muy relacionado. Un procedimiento alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de anticuerpo monoclonal de la invención es preincubar el anticuerpo monoclonal de la invención con el complejo de TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 soluble (con la que normalmente es reactiva), y luego añadir el anticuerpo monoclonal que está siendo probado para determinar si el anticuerpo monoclonal que está siendo probado es inhibido en su capacidad para unirse a la diana, por ejemplo, complejo de TLR4/MD-2, TLR4, MD-2, TLR2 o CD14. Si el anticuerpo monoclonal que está siendo probado es inhibido, entonces, lo más probable, tiene la misma especificidad epitópica o funcionalmente equivalente que el anticuerpo monoclonal de la invención. El cribado de anticuerpos monoclonales de la invención también puede llevarse a cabo midiendo la producción de IL-8 inducida por LPS y determinando si el anticuerpo monoclonal de prueba puede neutralizar la producción de IL-8 inducida por LPS. El cribado también puede llevarse a cabo midiendo la producción de IL-6 inducida por PAM3CSK4 y determinando si el anticuerpo monoclonal de prueba puede neutralizar la producción de IL-6 inducida por PAM3CSK4.

Pueden usarse diversos procedimientos conocidos dentro de la técnica para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el complejo de TLR4/MD-2, TLR4 cuando no está complejado con MD-2, MD-2, TLR2 o CD14 o contra derivados, fragmentos, homólogos de análogos o ortólogos de los mismos (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Los anticuerpos se purifican por técnicas muy conocidas tales como cromatografía de afinidad usando proteína A o proteína G que proporcionan principalmente la fracción de IgG del inmunosuero. Posteriormente, o alternativamente, el antígeno específico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o un epítope de la misma, puede inmovilizarse sobre una columna para purificar el anticuerpo inmunoespecífico por cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas se trata, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Filadelfia PA, vol. 14, nº 8 (17 de abril de 2000), pág. 25-28).

Los anticuerpos de la invención (por ejemplo, hu18H10, 16G7, hu15C1 y hu7E3) son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales que neutralizan la señalización de LPS que está mediada por el complejo de TLR4/MD-2 se generan, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c con combinaciones de transfectantes de células que expresan altos niveles de TLR4 y MD-2 sobre su superficie y una proteína quimérica soluble recombinante que comprende tanto TLR4 como MD-2 unidos por una secuencia de ligador flexible. Los hibridomas resultantes de fusiones de células de mieloma/células B se criban entonces para la reactividad para este complejo de TLR4/MD-2.

Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, usando procedimientos de hibridomas tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridomas, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado se inmuniza normalmente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá normalmente el antígeno de proteína, un fragmento del mismo

o una proteína de fusión del mismo. En general se usan o linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células del ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Entonces, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado tal como polietilenglicol para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pág. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, origen bovino y humano. Normalmente se emplean líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células hibridomas pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un alto nivel de expresión estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino que pueden obtenerse, por ejemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la Colección americana de cultivos tipo, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales (véanse Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pág. 51-63).

El medio de cultivo en el que las células hibridomas se cultivan puede ensayarse entonces para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Además, en aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales es importante identificar anticuerpos que tienen un alto grado de especificidad y la afinidad de unión para el antígeno diana.

Después de identificarse las células hibridomas deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por procedimientos convencionales (véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pág. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células hibridomas pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o fluido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante tales como aquellos descritos en la patente U.S. No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células hibridomas de la invención sirven de fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión que entonces se transfectan en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra forma proteína de inmunoglobulina para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes humanos de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homólogas (véase la patente U.S. No. 4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniéndose covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulinas toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido de no inmunoglobulina. Un polipéptido de no inmunoglobulina tal puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos son adecuados para administración a seres humanos sin engendrar una respuesta inmunitaria por el ser humano contra la inmunoglobulina administrada. Las formas humanizadas de anticuerpos son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que están compuestos principalmente por la secuencia de una inmunoglobulina humana y contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. La humanización se realiza, por ejemplo, siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)) sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (véase también la patente U.S. No. 5.225.539). En algunos casos, los residuos estructurales Fv de la inmunoglobulina humana están sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también comprenden, por ejemplo, residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado incluye sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluye óptimamente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., 1986; Riechmann y col., 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-S96 (1992)).

Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpos en las que la secuencia completa de tanto la cadena ligera como la cadena pesada, que incluyen las CDR, se producen a partir de genes humanos. Tales anticuerpos se llaman “anticuerpos humanos” o “anticuerpos completamente humanos” en este documento. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando la técnica de triomas; la técnica de hibridomas de células B humano (véase Kozbor y col., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridomas de EBV para producir anticuerpos monoclonales (véase Cole y col., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse y puede producirse usando hibridomas humanos (véase Cote y col., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando células B humanas con virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole y col., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96).

Además, los anticuerpos humanos también pueden producirse usando técnicas adicionales que incluyen bibliotecas de expresión en fagos (véanse Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Similarmente, los anticuerpos humanos pueden prepararse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes endógenos de inmunoglobulina se han inactivado parcial o completamente. Tras la exposición se observa la producción de anticuerpos humanos que se asemeja mucho a la observada en seres humanos en todo sentido, incluyendo transposición de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Esta solución se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. No. 5.545.807, 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en Marks y col., Bio/Technology 10, 779783 (1992); Lonberg y col., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente usando animales transgénicos no humanos que se modifican de manera que se produzcan anticuerpos completamente humanos en vez de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a exposición a un antígeno (véase la publicación PCT WO94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras en el huésped no humano han sido incapacitados, y los loci activos que codifican inmunoglobulinas humanas de cadenas pesadas y ligeras se insertan en el genoma del huésped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano requeridos. Entonces, como progenie se obtiene un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas mediante cría cruzada de animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento completo de las modificaciones. Un ejemplo de un animal no humano tal es un ratón llamado Xenomouse ™ como se desvela en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente a partir del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o alternativamente a partir de células B inmortalizadas derivadas del animal tales como anticuerpos monoclonales productores de hibridomas. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener análo

gos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas monocatenarias Fv (scFv).

Un ejemplo de un procedimiento para producir un huésped no humano, ejemplificado como un ratón que carece de expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina endógena, se desvela en la patente U.S. No. 5.939.598. Puede obtenerse mediante un procedimiento que incluye delecionar los genes del segmento J de al menos un locus de cadena pesada endógena en una célula madre embriónica para prevenir la transposición del locus y para prevenir la formación de un transcrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina transpuesto, efectuándose la deleción por un vector elegido como diana que contiene un gen que codifica un marcador de selección; y producir a partir de la célula madre embriónica un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador de selección.

Un procedimiento para producir un anticuerpo de interés tal como un anticuerpo humano se desvela en la patente U.S. No. 5.916.771. Este procedimiento incluye introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada en una célula huésped de mamífero en cultivo, introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera en otra célula huésped de mamífero y fusionar las dos células para forma una célula híbrida. La célula híbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.

En una mejora adicional de este procedimiento, en la publicación PCT WO 99/53049 se desvelan un procedimiento para identificar un epítope clínicamente relevante en un inmunógeno y un procedimiento correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al epítope relevante con alta afinidad.

El anticuerpo puede expresarse por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.

Éstos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola de genes, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos tales como se describen en el documento WO 93/64701 que tiene un resto como diana (por ejemplo, un ligando para un receptor de la superficie celular) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo, polilisina), vector viral (por ejemplo, un vector viral de ADN o ARN), proteínas de fusión tales como se describen en el documento PCT/US 95/02140 (documento WO 95/22618) que es una proteína de fusión que contiene un resto diana (por ejemplo, un anticuerpo específico para una célula diana) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo, una protamina), plásmidos, fago, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.

Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de Moloney. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de la viruela tales como vectores ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (VHS) (véanse Geller, A. I. y col., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F. y col., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra) (1995); Geller, A. I. y col., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I. y col., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), vectores de adenovirus (véanse LeGal LaSalle y col., Science, 259:988 (1993); Davidson y col., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang y col., J. Virol. 69:2004 (1995) y vectores de virus adenoasociados (véase Kaplitt, M. G. y col.,

Nat. Genet. 8:148 (1994).

Estos vectores pueden usarse para expresar grandes cantidades de anticuerpos que pueden usarse en una variedad de formas. Por ejemplo, para detectar la presencia del complejo de TLR4/MD-2 u otra diana tal como TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14 en una muestra. El anticuerpo también puede usarse para intentar unirse a y perturbar la señalización que está relacionada con, mediada por

o modulada por el complejo de TLR4/MD2, TLR2 y/o CD14.

Las técnicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos para una proteína antigénica de la invención (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 4.946.778). Además, pueden adaptarse procedimientos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (véase, por ejemplo, Huse y col., 1989 Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una proteína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos para un antígeno de proteína pueden producirse por técnicas conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a: (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestión con pepsina de un molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por la reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.

La invención también incluye fragmentos Fv, Fab, Fab, y F(ab')2 del complejo anti-TLR4/MD2, fragmentos anti-TLR4, fragmentos anti-MD2, fragmentos anti-TLR2, anti-CD14, anticuerpos monocatenarios que reconocen y se unen al complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14, anticuerpos biespecíficos que reconocen y se unen al complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14 y anticuerpos heteroconjugados que reconocen y se unen al complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14.

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD-2, TLR2 o CD14. La segunda diana de unión es cualquier otro antígeno, y ventajosamente es una proteína o receptor o subunidad de receptor de la superficie celular.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas/cadenas ligeras de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la colección aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de diez moléculas diferentes de anticuerpos de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza normalmente por etapas de cromatografía de afinidad. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otra solución descrita en documento WO 96/27011, la superficie de separación entre un par de moléculas de anticuerpos puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La superficie de separación preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la superficie de separación de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las “cavidades” de compensación de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean sobre la superficie de separación de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de longitud completa (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Brennan y col., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro Fab'-TNB derivado para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Adicionalmente, los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por tanto, el anticuerpo biespecífico formado podía unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, además de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y entonces se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de “diacuerpos” descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento están obligados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formándose así dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv (sFv). Véase, Gruber y col., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt y col., J. Immunol. 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epítopes diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno de proteína de la invención. Alternativamente, un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina puede combinarse con un brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula del receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16) de manera que se enfocan los mecanismos de defensa celulares para que la célula exprese el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclido tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno de proteína descrito en este documento y adicionalmente se une al factor tisular (TF).

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para elegir como diana células del sistema inmunitario para células no deseadas (véase la patente U.S. No. 4.676.980) y para el tratamiento de infección por VIH (véanse los documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas que incluyen aquellos que implican agente reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los desvelados, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4.676.980.

Puede desearse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora de manera que se potencie, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados a la señalización anómala de LPS. Por ejemplo, el (los) residuo(s) de cisteína puede(n) introducirse en la región Fc, permitiéndose así la formación de enlaces disulfuro entrecadenas en esta región. Por tanto, el anticuerpo homodimérico generado puede haber mejorado la capacidad de internalización y/o aumentado la destrucción de células mediadas por complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véanse Caron y col., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente puede manipularse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y así puede tener una lisis del complemento y capacidades de ADCC potenciadas (véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Está disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluilen2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y col., Science

238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MY-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo (véase el documento WO94/11026).

Aquellos expertos en la materia reconocerán que puede acoplarse una gran variedad de posibles restos a los anticuerpos resultantes de la invención (véase, por ejemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nueva York, (1989)).

El acoplamiento puede llevarse a cabo mediante cualquier reacción química que unirá las dos moléculas mientras que el anticuerpo y el resto conservan sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. La unión preferida es, sin embargo, la unión covalente. La unión covalente puede lograrse o bien por condensación directa de cadenas laterales existentes o bien por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de ligado bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas tales como los anticuerpos de la presente invención a otras moléculas. Por ejemplo, agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, pero es un poco a modo de ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes (véanse Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y col., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y col., Science 238:1098 (1987).

Los ligadores preferidos se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Ramakrishnan,

S. y col., Cancer Res. 44:201-208 (1984), que describen el uso de MBS (éster de Mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también la patente U.S. No. 5.030.719 que describe el uso de derivado de acetilhidracida hidrogenada acoplado a un anticuerpo a modo de un ligador de oligopéptidos. Los ligadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilamino-propil)carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (6[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato de succinimidilo (Pierce Chem. Co., nº de cat 21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (6[3-(2-piridilditio)propianamida]hexanoato de sulfosuccinimidilo (Pierce Chem. Co. Nº de cat 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., nº de cat 24510) conjugada a EDC.

Los ligadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo por tanto a conjugados con propiedades fisicoquímicas diferentes. Por ejemplo, los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los ésteres de NHS que contienen ligadores son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el ligador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido y puede formar conjugados con estabilidad aumentada. Los enlaces de disulfuro son en general menos estables que otros enlaces debido a que el enlace de disulfuro se escinde in vitro dando menos conjugado disponible. La sulfo-NHS, en particular, puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimidas. Los acoplamientos de carbodiimidas (tales como EDC) cuando se usan conjuntamente con sulfo-NHS forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimidas sola.

Los anticuerpos desvelados en este documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como se describen en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las patentes U.S. No. 4.485.045 y

4.544.545. En la patente U.S. No. 5.013.556 se desvelan liposomas con tiempo de circulación potenciado.

Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro.

Uso de anticuerpos contra el complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2, CD14 y combinaciones de los mismos

Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según la invención se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar la transferencia, administración, tolerancia mejoradas y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el vademécum conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15ª ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el capítulo 87 por Blaug, Seymour, en su interior. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónico o aniónicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no esté inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véanse también Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance”. Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts”, J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell y col. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en su interior para información adicional referida a formulaciones, excipientes y vehículos muy conocidos para los químicos farmacéuticos.

Las formulaciones terapéuticas de la invención, que incluyen un anticuerpo monoclonal de la invención (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o monoclonal humanizado), se usan para tratar o aliviar un síntoma asociado a un trastorno relacionado con la inmunidad. La presente invención también proporciona procedimientos para tratar o aliviar un síntoma asociado a un trastorno relacionado con la inmunidad. Se lleva a cabo una pauta terapéutica identificando un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que padece (o está en riesgo de desarrollar) un trastorno relacionado con la inmunidad usando procedimientos convencionales.

Los anticuerpos de la invención, que pueden inhibir la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS, son herramientas terapéuticas útiles en el tratamiento de trastornos tales como, por ejemplo, inflamación aguda y septicemia inducida por productos microbianos (por ejemplo, LPS) y exacerbaciones que se producen a partir de esta inflamación aguda tales como, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma (véase O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol, 3: 396-403 (2003)). Tales anticuerpos también son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias neurodegenerativas (Lehnardt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8514-8519 (2003)).

Además, los anticuerpos de la invención también son útiles como reactivos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo, osteoartritis, que se producen por estrés mecánico que, a su vez, induce factores de “estrés” solubles endógenos que desencadenan TLR4. El factor de estrés soluble endógeno incluye, por ejemplo, Hsp60 (véase Ohashi y col., J. Immunol. 164: 558-561 (2000)) y fibronectina (véase Okamura y col., J. Biol. Chem. 276: 10229-10233 (2001) y sulfato de heparano, hialuronano, gp96, β-defensina 2 o proteína A tensioactiva (véase, por ejemplo, Johnson y col., Crit. Rev. Immunol., 23(1-2):15-44 (2003)). Los anticuerpos de la invención también son útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos asociados a estrés mecánico tales como, por ejemplo, estrés mecánico que está asociado a sujetos y pacientes conectados a respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles en el tratamiento de lesión pulmonar inducida por ventilador (“LPIV'), también denominada en lo sucesivo lesión pulmonar asociada a ventilación (“LPAV”).

Otras áreas de enfermedad en las que inhibir la función de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14 podría ser beneficioso incluyen, por ejemplo, inflamación crónica (por ejemplo, inflamación crónica asociada a afecciones alérgicas y asma), enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, trastorno inflamatorio del intestino, artritis reumatoide, esclerosis múltiple) y aterosclerosis (véase O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003),).

Los síntomas asociados a estos trastornos relacionados con la inmunidad incluyen, por ejemplo, inflamación, fiebre, malestar general, fiebre, dolor, frecuentemente localizado en el área inflamada, frecuencia del pulso rápida, dolor de articulaciones (artralgia), respiración rápida u otros patrones de respiración anormales, escalofríos, confusión, desorientación, agitación, mareos, tos, disnea, infecciones pulmonares, insuficiencia cardiaca, fallo respiratorio, edema, aumento de peso, recaídas mucopurulentas, caquexia, sibilancias, cefalea y síntomas abdominales tales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento.

La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier procedimiento conocido para diagnosticar o tratar el trastorno relacionado con la inmunidad particular. El alivio de uno o más síntomas del trastorno relacionado con la inmunidad indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.

Los procedimientos para el cribado de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras técnicas inmunológicamente mediadas conocidas dentro de la técnica.

Las combinaciones de anticuerpos dirigidos contra el complejo de TLR4/MD-2 o TLR4 cuando no está complejado con MD-2 (o un fragmento del mismo), MD2 cuando no está complejado con TLR4 (o un fragmento del mismo), TLR2 (o un fragmento del mismo) o CD14 (o un fragmento del mismo), o anticuerpos multiespecíficos que reconocen dos o más dianas seleccionadas de complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y CD14 pueden usarse en procedimientos conocidos dentro de la técnica que se refieren a la localización y/o cuantificación de estas dianas para uso, por ejemplo, en la medida de niveles de estas dianas dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para uso en procedimientos de diagnóstico, para uso en obtención de imágenes de la proteína y similares. En una realización dada, las combinaciones de anticuerpos específicas para el complejo de TLR4/MD-2, TLR4, MD2, TLR2 o CD14, o anticuerpos multiespecíficos que reconocen dos o más de estas dianas,

: o un derivado, fragmento, análogo u homólogo de los mismos que contienen el dominio de unión a antígeno derivado del anticuerpo se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo “agentes terapéuticos”).

Las combinaciones de anticuerpos específicos para el complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 o CDR14, o un anticuerpo multiespecífico que reconoce al menos dos estos dianas, pueden

usarse para aislar el complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14 por técnicas convencionales tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos dirigidos contra el complejo de TLR4/MD2, TLR4, MD2, TLR2 y/o CD14 (o un fragmento de los mismos) pueden usarse diagnósticamente para monitorizar niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar, por ejemplo, la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La detección puede facilitarse acoplando (es decir, ligando físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y ecuorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

Los anticuerpos descritos en este documento, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados y completamente humanos, pueden usarse en combinaciones como agentes terapéuticos. Tales agentes se emplearán en general para tratar o prevenir una enfermedad o patología asociada a señalización anómala de TLR4, TLR2 o CD14 en un sujeto. Una preparación de anticuerpos, preferentemente una que tiene alta especificidad y alta afinidad por su(s) antígeno(s) diana, se administra al sujeto y en general tendrá un efecto debido a su unión con la(s) diana(s). La administración del anticuerpo o combinaciones de anticuerpos puede derogar o inhibir o interferir con la función de señalización de la diana (por ejemplo, el complejo de TLR4/MD-2, TLR2, CD14). La administración del anticuerpo puede derogar o inhibir o interferir con la unión de la diana (por ejemplo, TLR4) con un ligando endógeno (por ejemplo, TLR4 o la proteína accesoria MD-2) a la que se une naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo o combinación de anticuerpos se une a la diana y neutraliza la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o combinación de anticuerpos descrita en este documento se refiere en general a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se observa anteriormente, esto pueden ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su(s) antígeno(s) diana que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento de la(s) diana(s). La cantidad requerida que va a administrarse dependerá además de la afinidad de unión del anticuerpo por su(s) antígeno(s) específico(s), y también dependerá de la tasa a la que un anticuerpo administrado se reduce a partir del volumen libre del sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o fragmento de anticuerpo descritos en este documento pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación comunes pueden oscilar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez a la semana.

Los anticuerpos que se unen específicamente al complejo de TLR4/MD-2, TLR4, MD2, TLR2

: o CD14 o un fragmento de los mismos pueden administrarse para el tratamiento de trastornos asociados a señalización anómala de LPS en forma de composiciones farmacéuticas. Se proporcionan

principios y consideraciones implicados en la preparación de tales composiciones, además de la orientación en la elección de componentes, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice of Pharmacy, 19ª ed. (Alfonso R. Gennaro y col., editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, vol. 4), 1991, M. Decker, Nueva York.

Si se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibitorio más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas de péptidos pueden diseñarse para retener la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencia su función tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

Los principios activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.

Las formulaciones que van a usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo cuyas matrices tienen forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y γ-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT ™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprorelina) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

Composiciones farmacéuticas

Los anticuerpos o polipéptidos quiméricos solubles de la invención (también denominados en este documento “compuestos activos”) y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Tales composiciones comprenden normalmente el anticuerpo o polipéptido quimérico soluble y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, el término “vehículo farmacéuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, isotónicos y retardadores de la absorción y similares compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Los ejemplos preferidos de tales vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites no volátiles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para administración parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles (en las que son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta tal punto que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerina, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos pueden lograrse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un componente o una combinación de componentes enumerada anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado de una disolución previamente esterilizada por filtración de la misma.

Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Con el fin de la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo fluido para uso como un enjuague bucal, en las que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se hace borbotear y se expectora o se traga. Los aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden incluirse como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de disgregación tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Para administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un spray en aerosol de un recipiente a presión o dosificador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para permear la barrera. Tales penetrantes son en general conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede llevarse a cabo usando sprays nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como en general se conocen en la técnica.

Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto de la rápida eliminación del cuerpo tales como una formulación de liberación controlada que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poliácido glicólico, colágeno, poliortoésteres y poliácido láctico. Procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Como vehículos farmacéuticamente aceptables también pueden usarse suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales). Éstas pueden prepararse según procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente U.S. No. 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictadas por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que va a lograrse, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar un compuesto activo tal para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dosificador junto con instrucciones para administración.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y Procedimientos

Reactivos:

Previamente se han descrito tanto el MAb de CD14 α-humano 28C5 como el MAb de TLR2 α-humano T2.5 (véanse Weingarten y col., J Leukoc Biol. 53(5):518-24 (1993); Pugin y col., Blood, 104(13):4071-79 (2004); Meng y col., J. Clin. Invest., 113(10):1473-81 (2004); la patente U.S. No.

6.444.206 y la publicación internacional WO 2005/028509). T2.5 se compró de eBioscience. El MAb de TLR4 α-humano 15C1 (IgG1 kappa de ratón) y el MAb de MD-2 α-humano 18H10 (IgG2b de ratón) se generaron en casa usando protocolos previamente descritos (véase, por ejemplo, Pugin y col., Blood, vol. 104(13):4071-79 (2004)). Todos los controles de isotipo de IgG se compraron de BD Biosciences (San Jose CA). En los experimentos mostrados en las Figuras 1 y 2, LPS Re595 ultrapuro (un ligando de TLR4) se compró de List Biochemicals y PAM3CSK4 (un lípido triacilado sintético que interactúa con TLR2) se compró de Invivogen. Las cepas bacterianas natural 1 y K12 W3110 de

E. coli se obtuvieron de Dr. J. Pugin, CMU, Ginebra. En los experimentos restantes, LPS K12 ultrapuro y Pseudomonas aeruginosa 10 LPS se compraron de Sigma Aldrich. La flagelina purificada y PAM3CSK4 se compraron de Invivogen. Las cepas bacterianas E. coli natural 1, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y Staphlococcus aureus (SAUR2) se obtuvieron de HCG, Ginebra; y K12 W3110 se obtuvo de Pierre Genevaux, CMU, Ginebra. Las células BEAS 2B y HEK 293 se obtuvieron de la ATCC. La E. coli se inactivó por calentamiento durante 30 minutos a 90ºC o mediante tratamiento con gentamicina a una concentración de 20 ug/ml. La inactivación se verificó sembrando en placa sobre agar LB para comprobar la ausencia de colonias.

Ensayos de células HECK 293, HUVEC BEAS 2B:

Para los resultados mostrados en las Figuras 1A-1B se generaron células estables transfectadas que expresan tanto hTLR4/MD-2 como hTLR2 (denominado en este documento el “transfectante HEK 293 hTLR4/MD2” (Figura 1A) y el “transfectante estable HEK 293 hTLR2” (Figura 1B)) usando la metodología descrita previamente (véase, por ejemplo, Pugin y col., Blood 2004). Las células se sembraron en placa a 6x104 células/pocillo en 200 µl de medio de SBF al 10% en DMEM el día antes del experimento. Los MAb (15C1 (anti-TLR4) y T2.5 (anti-TLR2)) se diluyeron en 50 µl de medio basal DMEM hasta una concentración de 150 µg/ml, se añadieron a las células y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. LPS Re595 (concentración final de 10 ng/ml) (Figura 1A) o PAM3CSK4 (concentración final de 100 ng/ml) (Figura 1B) se diluyeron en 100 µl de RPMI 1640 que contenía SBF al 1%, se añadió a las células y se dejó incubar durante 21 horas a 37ºC. La secreción de IL-8 en el sobrenadante de cultivo se monitorizó por ELISA (Endogen).

Para el resto de los experimentos basados en células, las células se sembraron en placa a 6x104 células/pocillo en 200 µl de medio SBF al 10% el día antes del experimento. Para células HUVEC, las placas se recubrieron durante 10 minutos con 2% de gelatina (Sigma Aldrich) antes de sembrar en placa. El medio se eliminó el día del experimento y se añadieron 30 µl de medio que contenía 6% de suero humano inactivado por calor (concentración final 2%). Entonces, los MAb apropiados se diluyeron en 30 µl de medio basal hasta la concentración apropiada y se añadieron a las células durante 1 hora a 37ºC. Las bacterias inactivadas por calor (a la concentración apropiada) se diluyeron en 30 µl de medio, se añadieron a las células y se dejaron incubar durante 21 horas a 37ºC. La secreción de IL-6 (HUVEC y BEAS 2B) o IL-8 (HEK 293) en el sobrenadante de cultivo se monitorizó por ELISA (Endogen).

Citometría de flujo

Para detectar TLR2, TLR4, MD-2 y CD14 sobre la superficie de células HUVEC y BEAS 2B se incubaron 1x107 células/ml en 1x PBS complementado con BSA al 1% y 10 µg/ml del anticuerpo apropiado. Las células se lavaron una vez y luego se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con APC (dilución 1:250; Molecular Probes). Las células se analizaron usando el FACScalibur en el canal FL-4. Para los leucocitos circulantes, los anticuerpos apropiados se añadieron a sangre completa humana a una concentración final de 10 µg/ml. Tras dos etapas de lavado en 1 x PBS, BSA al 1%, las células se incubaron con anticuerpo secundario (IgG (H+L) anti-ratón conjugado con APC diluido 1:250) que contenía 100 µg/ml de IgG humana con el fin de prevenir interacciones mediadas por Fc (Sigma Aldrich). Los glóbulos rojos sanguíneos se eliminaron mediante lisis usando tampón de lisis (Becton Dickinson) y las células restantes se lavaron dos veces. Las células se analizaron usando el FACScalibur en el canal FL-4. Se distinguieron diferentes poblaciones de leucocitos basándose en dispersión hacia adelante y lateral.

Ensayos en sangre completa:

En un primer conjunto de experimentos mostrado en las Figuras 1 y 2, sangre reciente de dos voluntarios humanos sanos (venopunción en la vena del brazo) se mezcló con heparina (10 µl/ml de sangre) y se diluyó 1:2 con medio basal RPMI 1640. La sangre se sembró a un volumen de 100 µl/pocillo y se dejó reposar durante 15 minutos a 37ºC. Los MAb murinos 15C1 (anti-TLR4), T2.5 (anti-TLR2) y 28C5 (anti-CD 14) se prepararon a las concentraciones indicadas diluidas en medio basal RPMI 1640 (volumen final de 50 µl) y se añadieron a la sangre. En cada caso, la cantidad total de MAb preparado se normalizó a la cantidad dada en el tratamiento con MAb triple usando MAb de IgG de control. Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC, a la sangre se añadieron 50 µl de o

E. coli inactivada por calor (106 UFC/ml de concentración final), LPS Re595 (1 ng/ml de concentración final) (Figura 2A) o PAM3CSK4 (100 ng/ml de concentración final) (Figura 2B) y se incubaron durante 6 horas. Luego se analizó el plasma para el contenido de IL-6 por ELISA (Endogen).

En un segundo conjunto de experimentos mostrado en las Figuras 3A y 3B, sangre reciente de tres voluntarios humanos sanos se mezcló con heparina (10 µl/ml de sangre), se diluyó 1:2 con medio basal RPMI 1640 y se sembró en placa a un volumen de 100 µl/pocillo. Los MAb murinos 15C1 (anti-TLR4), T2.5 (anti-TLR2) y 28C5 (anti-CD14) y combinaciones de los mismos se prepararon a las concentraciones indicadas diluidas en medio basal RPMI 1640 (volumen final de 50 µl), se añadieron a la sangre y se incubaron durante 1 hora sobre la célula. A la sangre se añadió un volumen de 50 ml de E. coli inactivada por calor a 106 UFC/ml. La E. coli inactivada por calor era o una cepa natural (Figura 3A) o la cepa de laboratorio común de E. coli conocida como K12 W3110 (Figura 3B). Tras una incubación de 6 horas, los niveles de IL-6 en plasma se midieron por ELISA.

En un tercer conjunto de experimentos mostrado en las Figuras 5, 7 y 8, sangre reciente de voluntarios humanos sanos (venopunción en la vena del brazo) se mezcló con heparina (10 µl/ml de sangre) y se diluyó 1:2 con medio basal RPMI 1640. La sangre se sembró en placa a un volumen de 60 µl/pocillo y se dejó reposar durante 15 minutos a 37ºC. Cuando correspondió, los MAb se prepararon a las concentraciones indicadas diluidas en medio basal RPMI 1640 (30 µl de volumen final) y se añadieron a la sangre. Después de 1 hora, a la sangre se añadieron 30 µl de o bacterias inactivadas por calor (a la concentración apropiada), LPS K12 (4 ng/ml de concentración final), PAM3CSK4 (100 ng/ml de concentración final) o flagelina (300 ng/ml de concentración final) y se incubaron durante 6 horas. El plasma se analizó posteriormente para el contenido de IL-6 por ELISA (Endogen).

Ejemplo 2. Expresión de TLR2, TLR4, MD-2 y CD14 sobre leucocitos sanguíneos, células HUVEC y BEAS 2B

Con el fin de predecir la receptividad de las poblaciones de células en este estudio para diferentes ligandos de TLR, la expresión de la superficie celular de TLR2, TLR4 y las moléculas accesorias de TLR MD-2 y CD14 se examinó por análisis de FACS usando MAb específicos.

En poblaciones de células de sangre completa humana distinguidas por tamaño y granularidad se observaron niveles significativos en superficie de TLR4, MD-2 y TLR2, con altos niveles en superficie de CD14. Los granulocitos fueron positivos para CD14 y expresaron niveles débiles, pero detectables, de TLR2, TLR4 y MD-2 (Figura 4, A-B). Los linfocitos no expresaron niveles detectables de ninguna de las proteínas probadas.

HUVEC fueron positivas para la expresión de TLR4 y MD-2, pero negativas para TLR2 y CD14, mientras que las células BEAS 2B expresaron niveles débiles, pero detectables, de TLR2, TLR4 y MD-2, con un nivel significativo de CD14 (Figura 4, C-D).

Ejemplo 3. Inhibición de la producción de citocinas proinflamatorias inducida por agonistas de TLR en sangre completa humana con MAb bloqueantes de TLR2, TLR4, MD-2 y CD14

En las Figuras 1A-1B se investigó la especificidad de cada MAb usando los ligandos específicos de TLR4 y TLR2 LPS y PAM3CSK4, respectivamente. La Figura 1A muestra que el MAb bloqueante de α-TLR4, 15C1, inhibió eficazmente la producción de IL-8 dependiente de LPS en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 humano. Los MAb específicos anti-TLR2, T2.5, como el MAb de control, no tuvieron efecto en la producción de IL-8. En cambio, T2.5 bloqueó la producción de IL-8 inducida por PAM3CSK4, mientras que 15C1 y el MAb de control no tuvieron efecto (Figura 1B).

En sangre completa humana, tanto 15C1 como el MAb bloqueante anti-CD14 28C5 bloquearon la producción de IL-6 inducida por LPS en un modo dependiente de la dosis, mientras que T2.5 y el MAb de control no tuvieron efecto (Figura 2a). Tanto T2.5 como 28C5 bloquearon la producción de IL-6 inducida por PAM3CSK4 en un modo dependiente de la dosis, mientras que 15C1 y el MAb de control no tuvieron efecto (Figura 2b).

En la Figura 5 se examinaron la especificidad y la potencia del MAb neutralizante de TLR2, TLR4, MD-2 y CD14 en sangre completa humana estimulado con LPS de K12 de E. coli (agonista de TLR4) y PAM3CSK4 (agonista de TLR2).

El LPS de K12 de E. coli indujo potentemente la producción de IL-6. Esta producción se inhibió fuertemente por MAb anti-TLR4 y de CD14. El MAb anti-MD-2 inhibió niveles de IL-6 a un menor efecto, pero significativo, mientras que el MAb anti-TLR2 no mostró capacidad neutralizante significativa. Estos resultados está de acuerdo con una regla para TLR4, MD-2 y CD14 en el reconocimiento de LPS de E. coli.

La producción de IL-6 inducida por LPS de Pseudomonas podría inhibirse parcialmente (~50%) por MAb anti-TLR2, de TLR4, MD-2 y de CD14. Una combinación de MAb de TLR2 y TLR4 inhibió completamente la producción de IL-6, sugiriendo que esta cepa particular de LPS puede ser reconocida por TLR2 y TLR4.

Pam3CSK4 es un lipopéptido tripalmitoilado sintético que imita al extremo amino acilado de lipoproteínas bacterianas y señaliza un TLR2. En sangre completa humana pudo detectarse un nivel de IL-6 bajo, pero significativo, tras el tratamiento con este agonista purificado. La inducción de IL-6 disminuyó enormemente con MAb de TLR2. Además, el tratamiento con anti-CD14 también inhibió fuertemente este efecto, sugiriendo una función para esta proteína adaptadora en el reconocimiento de la molécula por TLR2. Los MAb anti-TLR4 y de MD-2 no tuvieron efecto significativo sobre los niveles de IL-6.

La flagelina es el principal componente del filamento flagelar bacteriano que confiere motilidad a una amplia variedad de especies bacterianas. Se ha mostrado que señaliza mediante TLR5, posiblemente como un heterodímero con TLR4 (Mizel y col., J. Immunol., vol. 170:6217-6223 (2003)). En sangre completa humana, la flagelina indujo fuertemente la producción de IL-6. El tratamiento con MAb anti-TLR2 no tuvo efecto en esta inducción. A diferencia, los MAb anti-TLR4, de MD-2 y CD14 pudieron inhibir significativamente esta respuesta, sugiriendo una función para estas proteínas en la respuesta inmunitaria innata a flagelina, como previamente se notificó (Mizel y col., J. Immunol., vol. 170:6217-6223 (2003)).

En resumen, estos resultados confirman la especificidad y demuestran la potencia de los MAb bloqueantes anti-TLR2, de TLR4, de MD-2 y anti-CD14 usados en este estudio.

Ejemplo 4. Inhibición de E. coli inactivada por calor en sangre completa humana con MAb de imagen1 -TLR2, imagen1 -TLR4 y imagen1 -CD14

Para probar la hipótesis de que los microbios pueden estimular más que un receptor de TLR en paralelo se investigó el efecto de los MAb bloqueantes α-TLR4, TLR2 y CD14 en la inhibición de la reacción inmunitaria innata contra E. coli inactivada por calor en sangre completa humana. Se usaron dos cepas de E. coli (WT y K12) con diferentes combinaciones de MAb y tratamiento con anticuerpo sencillo, doble o triple para determinar el TLR dominante en respuestas inmunitarias activadoras y el efecto de bloquear más que un receptor de TLR en la inhibición de estas respuestas inmunitarias.

La Figura 3a muestra la capacidad de diferentes combinaciones de MAb para inhibir la producción de IL-6 en sangre completa estimulada por WT de E. coli inactivada por calor. Sangre de 3 donantes sanos diferentes respondió fuertemente a la preparación de E. coli (106 ufc/ml). Esta respuesta disminuyó ligeramente mediante la adición del MAb bloqueantes αTLR4, pero no por el MAb bloqueante αTLR2. Una combinación de ambos MAb inhibió fuertemente la respuesta de sangre completa con respecto a E. coli. El tratamiento con MAb de αCD14 solo también fue muy potente. Una combinación de tanto αCD14 y αTLR4 como de αCD14 y αTLR2 mostró un bloqueo más eficaz que αCD14 solo. Esto indica que algunos ligandos de TLR4 y TLR2 derivados de E. coli están trabajando mediante un mecanismo independiente de CD14. El bloqueo de CD14, TLR4 y TLR2 era el tratamiento más potente en la inhibición de la producción de IL-6. Se encontraron resultados similares usando una cepa de laboratorio común de E. coli (K12 W3110; véase la Figura 3b).

Ejemplo 5. Inducción de la producción de citocinas proinflamatorias en células HEK 293 transfectadas, células de sangre completa humana, HUVEC y BEAS 2B por diferentes cepas bacterianas

Con el fin de demostrar la capacidad de diferentes cepas bacterianas para estimular la producción de citocinas proinflamatorias, los tipos de células anteriores se trataron con dosis crecientes de cepas WT y K12 de E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia y Staphylococcus aureas inactivadas por calor.

Se probó la capacidad de cada cepa bacteriana para estimular células HEK 293 transfectadas tanto con TLR2 como el complejo de TLR4/MD-2. En células HEK 293 transfectadas con TLR2, todas las cepas gram-negativas probadas indujeron una respuesta detectable de 5 x 105 ufc/ml ascendente con una respuesta de IL-8 máxima a la mayor dosis probada (107 ufc/ml). Pseudomonas produjo la mayor respuesta de todas las cepas probadas. Estos resultados confirman, como se notificó previamente, la presencia de PAMP tales como lipoproteínas que pueden estimular TLR2 dentro de las cepas bacterianas gram-negativas probadas en este estudio. De manera interesante, S. aureas grampositiva dejó de inducir respuesta de IL-8, sugiriendo que TLR2 solo es insuficiente para reconocer PAMP de esta cepa bacteriana (tal como LTA), y que otros TLR en combinación con TLR2, pero ausentes en las células HEK 293 transfectadas con TLR2 (es decir, TLR1 y TLR6), son probablemente requeridos para inducir una respuesta. Las células HEK 293 transfectadas con TLR4 y MD-2 también respondieron enérgicamente a ambas cepas de E. coli ya Klebsiella. 5 x 104 ufc/ml fue la dosis más baja que pudo inducir una respuesta. Las células respondieron escasamente a Pseudomonas, observándose una respuesta débil, pero significativa, a 5 x 106 y 1 x 107 ufc/ml. Las células fueron resistentes a S. aureas a todas las concentraciones probadas. Las células HEK 293 sin transfectar fueron resistentes a todas las bacterias (datos no mostrados).

En sangre completa humana se observó una fuerte respuesta a todas las cepas bacterianas gram-negativas (Figura 7A). La inducción de la producción de IL-6 pudo observarse con tan sólo 2 x 103 ufc/ml, con una meseta de respuesta a aproximadamente 5x105 ufc/ml. En general, la cepa bacteriana gram-positiva de S. aureas fue ineficaz en la inducción de una respuesta en sangre completa. Con el donante particular representado en la Figura 7A se observó una pequeña respuesta, pero significativa, sólo a dosis de bacterias superiores a 106 ufc/ml (Figura 7A). En otros donantes probados, las respuestas de IL-6 de bajo nivel pudieron detectarse con tan sólo 104 ufc/ml de bacterias. Esta respuesta se aumentó normalmente ligeramente hasta la mayor dosis probada (107 ufc/ml). En HUVEC (Figura 7B), la producción de IL-6 se indujo por dosis superiores a 104 ufc/ml para cepas bacterianas de E. coli y Klebsiella. La meseta de respuesta se observó por encima de 106 ufc/ml. Pseudomonas era un pobre inductor de la producción de IL-6, con una respuesta muy débil observada a la mayor dosis probada (107 ufc/ml). Staphylococcus era ineficaz en HUVEC a todas las dosis probadas. Las células BEAS 2B respondieron a todas las cepas bacterianas probadas por encima de 106 ufc/ml. La máxima respuesta para cada cepa se observó a 107 ufc/ml, la máxima dosis probada (Figura 6C).

Basándose en estos resultados se eligieron 104 y 106 ufc/ml de bacterias para estimular sangre completa humana, eligiéndose 107 como la dosis bacteriana para HUVEC y BEAS 2B.

Ejemplo 6. Inhibición de respuestas de IL-6 a bacterias completas con MAb anti-TLR2, de TLR4, MD-2 y de CD14

Para entender la contribución hecha por diferentes TLR a la respuesta celular a bacterias completas, los diferentes tipos de células incluidos en este estudio se expusieron a bacterias inactivadas por calor tras una preincubación con el MAb bloqueante explicado resumidamente anteriormente.

A 104 ufc/ml en sangre completa humana (Figura 8A), el bloqueo de TLR4 redujo fuertemente la producción de IL-6 inducida por cepas de E. coli y Klebsiella y redujo parcialmente los niveles observados con Pseudomonas. Los MAb anti-TLR4 no tuvieron efecto en la inducción por Staphylococcus de IL-6. El bloqueo de MD-2 reflejó ampliamente el bloqueo de TLR4, con la excepción de que la producción de IL-6 inducida por Pseudomonas se inhibió más potentemente. El bloqueo de TLR2 no tuvo efecto significativo sobre la producción de IL-6 inducida por E. coli y Klebsiella e inhibió parcialmente tanto Pseudomonas como Staphylococcus. Una combinación del bloqueo de TLR2 y TLR4 inhibió fuertemente respuestas a todas las cepas gram-negativas probadas, mientras que sólo inhibió parcialmente Staphylococcus. El tratamiento con anti-CD14 se pareció mucho al cotratamiento con TLR2/TLR4. En resumen, estos resultados sugieren que a esta dosis elegida de bacterias, los PAMP que señalizan mediante TLR4/MD-2 son ampliamente dominantes en la inducción de respuesta inmunitaria a E. coli y Klebsiella. Parece que la Pseudomonas señaliza exclusivamente mediante complejos de receptores que contienen TLR4/MD-2 y TLR2, mientras que la producción de IL-6 inducida por Staphylococcus es parcialmente dependiente de TLR2 e independiente de TLR4/MD-2. Este resultado sugiere que otros TLR o proteínas relacionadas deben relacionarse con la producción de IL-6 inducida por Staphylococcus. El patrón de inhibición observado con el MAb anti-CD14 implica una función de esta proteína en el reconocimiento de ligandos que señalizan mediante tanto TLR2 como TLR4.

A 106 ufc/ml en sangre completa humana (Figura 8B), el bloqueo de TLR4 y MD-2 dio como resultado la inhibición parcial de la inducción de IL-6 por E. coli, Klebsiella y Pseudomonas. El bloqueo de TLR2 fue ineficaz con todas las cepas bacterianas probadas. De manera interesante, el tratamiento de combinación de TLR2 y TLR4 dio como resultado una inhibición completa de la producción de IL-6 inducida por E. coli y Klebsiella. Esto sugiere que a dosis mayores de bacterias, los ligandos de TLR2 pueden estimular la producción de IL-6 en ausencia de señalización de TLR4. La inducción de IL-6 por 106 ufc/ml de Pseudomonas se inhibió parcialmente tanto por el bloqueo de TLR4/MD-2 como de TLR2, observándose una fuerte inhibición tras el cotratamiento de TLR2 y TLR4, reflejando lo que se observó a 104 ufc/ml. El patrón de bloqueo de CD14 a 106 ufc/ml de bacteria también reflejó lo que se observó con 104 ufc/ml, es decir, la inhibición fue en general ligeramente menos potente.

Se probaron los efectos de bloquear la señalización de TLR2 y TLR4 en la producción de IL-6 en HUVEC tratadas con o bien E. coli o Klebsiella a 107 ufc/ml. Como se espera del perfil de expresión de TLR sobre la superficie de HUVEC (TLR2-, TLR4/MD-2+), la actividad de tanto E. coli como de Klebsiella se inhibió por MAb bloqueantes anti-TLR4, de MD-2 y CD14, mientras que los MAb antiTLR2 no tuvieron efecto (Figura 8C).

Se probó el bloqueo de TLR en la estimulación bacteriana de BEAS-2B a 107 ufc/ml. Aunque la tinción superficial reveló un bajo nivel expresión de TLR 2 y 4 (Figura 4D), las células respondieron de un modo relativamente fuerte a la estimulación con altas concentraciones de cepas bacterianas tanto gram-negativas como positivas (Figura 7C). El bloqueo de tanto TLR4 como de MD-2 dio como resultado un efecto inhibidor mínimo sobre la producción de IL-6. A diferencia, el bloqueo de TLR2 disminuyó fuertemente la producción de IL-6, sugiriendo que TLR2, en vez de TLR4, es funcional-mente responsable de la estimulación bacteriana de la línea de células epiteliales. Esto era el caso de todas las bacterias probadas que incluyen la cepa gram-positiva de S. aureas. La contribución de CD14 al reconocimiento de las cuatro cepas bacterianas probadas también se demostró usando el MAb bloqueante anti-CD14 (Figura 8D).

Ejemplo 7. Evaluación de la inactivación por calor frente a la inactivación por antibiótico en la estimulación bacteriana de sangre completa

5

Se probó el efecto de la inactivación por calor sobre la integridad de PAMP y la posterior capacidad de las cepas bacterianas probadas para estimular respuestas inmunitarias innatas. La producción de IL-6 inducida por bacterias inactivadas por calor se comparó con la de bacterias inactivadas por tratamiento por antibiótico (gentamicina). Se eligió la gentamicina ya que este antibiótico

10 actúa a nivel de ADN bacteriano y, por tanto, los PAMP estructurales quedan intactos con este procedimiento de inactivación. Como se muestra en la Figura 9, las bacterias inactivadas por ambos procedimientos conservaron su capacidad equivalente, a una dosis de 106 ufc/ml (107 ufc/ml para Staphylococcus aureus), para estimular monocitos en circulación para producir IL-6. Los niveles de inhibición de la producción de citocinas usando anti-TLR2, TLR4, MD-2 y CD14 también fueron comparables,

15 sugiriendo que los ligandos de TLR relevantes conservaron su potencia sin importar cuál era el procedimiento de inactivación usado. Estos resultados sugieren que la inactivación por calor de bacterias es un procedimiento válido para estudiar la estimulación del sistema inmunitario innato por agonistas de TLR derivados de bacterias.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una combinación de anticuerpos para uso médico en un sujeto, en la que dicha combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4), y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), en la que el anticuerpo anti-TLR4 comprende tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59.
2.

Una combinación de anticuerpos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un sujeto, en la que dicha combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), en la que el anticuerpo anti-TLR4 comprende tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59.
3.

La combinación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el anticuerpo anti-TLR4 comprende CDR de cadena pesada que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25 y CDR de cadena ligera que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30.
4.

La combinación de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo anti-TLR4 contiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
5.

La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la combinación de anticuerpos comprende además un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente a MD-2.
6.

La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la combinación de anticuerpos comprende además un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente a un receptor similar a toll seleccionado del grupo que está constituido por receptor 1 similar a toll (TLR1), receptor 5 similar a toll (TLR5) y receptor 6 similar a toll (TLR6).
7.

La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la combinación de anticuerpos está comprendida en una composición.
8.

La combinación de cualquier reivindicación previa, en la que el sujeto es un ser humano.
9.

La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que el trastorno inflamatorio es septicemia, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno inflamatorio crónico o un trastorno inflamatorio agudo.
10.

La combinación de la reivindicación 9, en la que el trastorno inflamatorio crónico se selecciona del grupo que está constituido por trastorno inflamatorio del intestino, artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis múltiple, aterosclerosis, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
11.

Uso de una combinación de anticuerpos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un sujeto, en el que dicha combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2), en el que el anticuerpo anti-TLR4 comprende tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO:
59.
12.

El uso de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo anti-TLR4 comprende CDR de cadena pesada que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25 y CDR de cadena ligera que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30.
13.

El uso de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo anti-TLR4 contiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
14.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la combinación de anticuerpos comprende además un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente a MD-2 o un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente a un receptor similar a toll seleccionado del grupo que está constituido por receptor 1 similar a toll (TLR1), receptor 5 similar a toll (TLR5) y receptor 6 similar a toll (TLR6).
15.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el sujeto es un ser humano.
16.

El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el trastorno inflamatorio es septicemia, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno inflamatorio crónico o un trastorno inflamatorio agudo.

5 17. El uso de la reivindicación 16, en el que el trastorno inflamatorio crónico se selecciona del grupo que está constituido por trastorno inflamatorio del intestino, artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis múltiple, aterosclerosis, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

10 18. Una composición que comprende un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 4 similar a toll (TLR4), un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente al receptor 2 similar a toll (TLR2) y un anticuerpo neutralizante que se une inmunoespecíficamente a MD-2, en la que el anticuerpo anti-TLR4 comprende tres CDR de cadena pesada idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 23, 24 y 25, respectivamente, y tres

15 CDR de cadena ligera idénticas al menos el 90% a la SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, respectivamente, y el anticuerpo anti-TLR2 comprende una región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: 59.