ES2727487T3 - Anticuerpos neutralizantes y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un complejo del receptor 4 similar a Toll (TLR4)/MD- 2, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 45, y la secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera de ID SEQ NO: 48.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos neutralizantes y métodos de uso de los mismos.
Campo de la invención
Esta divulgación se refiere en general a la generación de anticuerpos monoclonales neutralizantes, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanizados, que reconocen el complejo del receptor 4/MD-2 de tipo Toll, a anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanizados, que reconocen el complejo del receptor tipo Toll 4/MD-2 y el receptor tipo Toll 4 cuando no estan complejados con MD-2, y a métodos de uso de anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Los receptores Toll, descubiertos por primera vez en Drosophila, son proteínas transmembrana de tipo I que tienen repeticiones ricas en leucina (LRR) en la porción extracelular de la proteína y uno o dos dominios ricos en cisteína. Los homólogos de mamíferos de los receptores Toll de Drosophila se conocen como "receptores tipo Toll" (TLR). Los TLR desempeñan un papel en la inmunidad innata al reconocer las partículas microbianas y activar las células inmunitarias contra la fuente de estas partículas microbianas.
Actualmente, se han identificado diez tipos de receptores similares a Toll en seres humanos, TLR 1-10. Estos TLR se caracterizan por la homología de sus dominios intracelulares al del receptor de IL-1, y por la presencia de repeticiones extracelulares ricas en leucina. Los diferentes tipos de TLR son activados por diferentes tipos de partículas microbianas. Por ejemplo, TLR4 se activa principalmente por lipopolisacárido (LPS), mientras que TLR2 se activa por lipoteicoico (LTA), lipoarabinomanano (LAM); lipoproteínas (BLP), y peptidoglicanos (PGN). También se han identificado homólogos de receptores Toll, tales como RP105.
La proteína de diferenciación mieloide-2 (MD-2), una proteína accesoria TLR4, ha sido identificada y caracterizada. Se ha encontrado que esta proteína interactúa directamente con TLR4, y el MD-2 tiene la capacidad de habilitar modificaciones postraducción de TLR4, así como facilitar su transporte a la superficie celular. TLR4 y MD-2 forman un complejo en la superficie celular.
El lipopolisacárido (LPS), un componente de las bacterias gram negativas, es una partícula microbiana capaz de activar fuertemente el sistema inmune innato. El LPS envía señales a las células inmunitarias a través de su receptor de cadena múltiple, que comprende el complejo TLR4/MD-2 como el componente de señalización principal.
Wang Rong et al. discute la caracterización del anticuerpo monoclonal HTA125 reportado que tiene especificidad para TLR4 humano, y declara que HTA125 se adquirió de una fuente comercial (WANG RONG EL AL: "Characterization of monoclonal antibody HTA125 with specificity for human TLR4"; Hybridoma and Hybridomics; Vol. 22; No. 6; diciembre de 2003; Páginas 357-365).
Pugin et al. discuten la actividad soluble de MD-2 en plasma de pacientes con sepsis severa y choque séptico, y analiza un mAb del que se informa que es generado contra la superficie de células humanas que expresan TLR4/MD-2 en la superficie celular (18H10 mAb) (PUGIN JEROME ET AL: "Soluble MD-2 activity in plasma from patients with severe sepsis­ ., and septic shock"; Blood; Vol. 104; No. 13; 24 de agosto de 2004, páginas 4071-4079).
Por consiguiente, existe una necesidad de métodos y composiciones que modulen la señalización que está mediada por el complejo TLR4/MD-2.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un receptor tipo Toll 4 (TLR4)/MD-2, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 45 y la secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 48.
La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor TLR4/MD-2 expresado en la superficie celular. Los anticuerpos son capaces de bloquear, por ejemplo, neutralizar, la producción de citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS. El anticuerpo monoclonal es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor de TLR4/MD-2 humano y también se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2. Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen anticuerpos que se unen a la porción de TLR4 del complejo receptor de TLR4/MD-2 humano, pero la unión depende completamente de la presencia de MD-2. Además, los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor de TLR4/MD-2 humano y también se unen a MD-2, pero solo en presencia de TLR4.
Los anticuerpos de ejemplo descritos en este documento incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 18H10, el anticuerpo 16G7, el anticuerpo 15C1 y el anticuerpo 7E3. Estos anticuerpos muestran especificidad por el complejo receptor TLR4/MD-2 humano, y se ha demostrado que inhiben la activación del receptor y la señalización intracelular posterior a través de LPS. Estos anticuerpos tienen especificidades distintas. Por ejemplo, 15C1 se une a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2, 7E3 se une a TLR4, pero la unión depende de la presencia de MD-2, y 18H10 se une a MD-2, pero requiere la presencia de TLR4, ya que el MAb no se une a formas solubles de MD-2.
Como se usan en el presente documento, los términos "16G7", "mu16G7", "7E3", "mu7E3", "15C1", "mu15C1", "18H10" o "mu18H10" se refieren al anticuerpo monoclonal murino, y los términos "hu7E3", "hu15C1" o "hu18H10" se refieren al anticuerpo monoclonal humanizado.
Los anticuerpos monoclonales murinos descritos en este documento contienen una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 12, 22 o 32 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7, 17, 27 o 37. Las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más de una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en DSYIH (SEQ ID NO: 3); WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4), GYNGVYYAMDY (SEQ ID NO: 5); DYWIE (SEQ ID NO: 13); EILPGSGSTNYNEDFKD (SEQ ID NO: 14); EERAYYFGY (SEQ ID NO: 15); GGYSWH (SEQ ID NO: 23); YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24); KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25); TYNIGVG (SEQ ID NO: 33); HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34); y MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO: 35) y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SASSSVIYMH (SEQ ID NO: 8); RTYNLAS (SEQ ID NO: 9); HQWSSFPYT (SEQ ID NO: 10); RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 18); RVSNRFS (SEQ ID NO: 19); LQVTHVPPT (SEQ ID NO: 20); RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 28); YASHAIS (SEQ ID NO: 29); QNGHSFPLT (SEQ ID NO: 30); RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 38); YTSKLHS (SEQ ID NO: 39); y QQGNTFPWT (SEQ ID NO: 40). El anticuerpo se une al complejo TLR4/MD-2, a TLR4 cuando no está complejado con MD-2, o a ambos.
Los anticuerpos humanizados descritos en este documento contienen una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 46, 49, 51 y 52. Los anticuerpos humanizados descritos en este documento contienen una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID. NOS: 47, 48 50 y 53. Las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGYSWH (SEQ ID NO: 23); YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24); KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25); DSYIH (SEQ ID NO: 3); WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4), GYNGVYYAMDY (SEQ ID NO: 5); TYNIGVG (SEQ ID NO: 33); HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34); y MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO: 35). Las tres CDR de cadena ligera incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 28); YASHAIS (SEQ BD NO: 29); QNGHSFPLT (SEQ ID NO: 30); SASSSVIYMH (SEQ ID NO: 8); RTYNLAS (SEQ ID NO: 9); HQWSSFPYT (SEQ ID NO: 10); RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 38); YTSKLHS (SEQ ID NO: 39); y QQGNTFPWT (SEQ ID NO: 40). El anticuerpo se une al complejo TLR4/MD-2, a TLR4 cuando no está complejado con MD-2, o a ambos.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen inmunoespecíficamente a un complejo TLR4/MD-2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de aminoácidos en TLR4 humano entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO: 54. Por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que incluye residuos seleccionados del grupo que consiste en al menos los residuos 293 a 295 de la SEQ ID NO: 54; al menos los residuos 296 y 297 de la SEQ ID NO: 54; al menos los residuos 319 a 321 de la SEQ ID NO: 54; al menos los residuos 328 y 329 de la SEQ ID NO: 54; al menos los residuos 349 a 351 de la SEQ ID NO: 54; y al menos los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO: 54. Por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que contiene al menos los residuos 328, 329, 349 a 351 y 369 a 371 de la SEQ ID NO: 54. En otro ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que incluye al menos los residuos 293 a 295, 296, 297 y 319 a 321 de la SEQ ID NO: 54.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen al complejo TLR4/MD2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo en la MD-2 humana entre los residuos 19 y 57 de la SEQ ID NO: 44. Por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que contiene al menos los residuos 53 de la SEQ ID NO: 44.
Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen anticuerpos humanizados que se unen inmunoespecíficamente a un complejo TLR4/MD-2, en donde el anticuerpo exhibe más del 50% de inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias inducida por lipopolisacáridos (LPS) en humanos transfectados con TLR4/MD-2 células HEK293 a una concentración de 1 pg/ml. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en este documento muestran más del 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 99% de inhibición de producción de citoquinas proinflamatorias inducida por LPS en células HEK293 transfectadas con TLR4/MD-2 humanos a una concentración de 1 pg/ml. Como se usa en el presente documento, el término "citoquina proinflamatoria" se refiere a aquellas citoquinas inmunorreguladoras que promueven la inflamación y/o están asociadas con la inflamación. Las citoquinas proinflamatorias incluyen, por ejemplo, IL-6, IL-8, TNF-alfa, IL1-alfa, IL1-beta, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IL-10, IL12, IL-23, IL17, e IL18.
Los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS al menos dos veces, cinco veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces, o 100 veces más que las comercialmente disponible, anti-TLR4 anticuerpo monoclonal no bloqueante HTA125.
En un segundo aspecto, la invención proporciona el anticuerpo humanizado del primer aspecto, para uso como un medicamento. En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo como en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para aliviar un síntoma de una patología asociada con la señalización de TLR4 aberrante en un sujeto, en donde la patología se selecciona del grupo que consiste en sepsis, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedades y trastornos autoinmunes inducidos por factores de estrés solubles endógenos, en los que dicho trastorno inducido por factores de estrés solubles endógenos es osteoartritis o artritis reumatoide.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir patologías asociadas con la activación aberrante de TLR4/MD-2 y/o actividad aberrante de LPS (por ejemplo, producción de citoquinas proinflamatorias aberrantes como la producción de IL-8 aberrante), o aliviar un síntoma asociado con dichas patologías, mediante la administración de un anticuerpo monoclonal descrito en este documento (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o monoclonal humanizado) a un sujeto en donde se desea dicho tratamiento o prevención. El sujeto por tratar es, por ejemplo, humano. El anticuerpo monoclonal se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado con la patología. La cantidad de anticuerpo monoclonal suficiente para tratar o prevenir la patología en el sujeto es, por ejemplo, una cantidad que es suficiente para reducir la producción inducida por LPS de una o más citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-8). Como se usa en el presente documento, el término "reducido" se refiere a una producción disminuida de una citoquina proinflamatoria en presencia de un anticuerpo monoclonal descrito aquí, en donde la producción es, por ejemplo, producción local de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un sitio de tejido inflamado) o producción de citoquinas proinflamatorias sistémicas. La producción inducida por LPS de una citoquina proinflamatoria, como la IL-8, disminuye cuando el nivel de producción de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-8) en presencia de un anticuerpo monoclonal descrito aquí es mayor o igual al 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% más bajo que un nivel de control de producción de citoquinas inflamatorias (es decir, el nivel de producción de citoquinas proinflamatorias en ausencia del anticuerpo monoclonal). El nivel de la producción de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-8 o IL-6) se mide, por ejemplo, utilizando sangre humana completa o los ensayos celulares HEK293 transfectados con huTLR4/MD2 descritos aquí. Los expertos en la materia apreciarán que el nivel de producción de citoquinas proinflamatorias se puede medir utilizando una variedad de ensayos, incluidos, por ejemplo, kits ELISA disponibles comercialmente.
Las patologías tratadas y/o prevenidas utilizando los anticuerpos monoclonales descritos aquí (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o monoclonal humanizado) incluyen, por ejemplo, sepsis inducida por productos microbianos, inflamación aguda, inflamación crónica (por ejemplo, inflamación crónica asociada con afecciones alérgicas y asma), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, IBD y aterosclerosis) y enfermedades en las que el estrés mecánico induce la expresión de factores de estrés solubles endógenos (por ejemplo, Hsp60, fibronectina, sulfato de heparano, hialuronano, gp96, p-Defensina-2 y proteína surfactante A), en donde dicho trastorno inducido por factores de estrés solubles endógenos es la osteoartritis o la artritis reumatoide. Las patologías en las que el estrés mecánico induce la expresión de factores de estrés solubles endógenos incluyen, por ejemplo, la osteoartritis y la artritis reumatoide. Las patologías asociadas con el estrés mecánico también pueden ocurrir en sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Tales patologías incluyen, por ejemplo, lesión pulmonar inducida por ventilador ("VILI"), también denominada lesión pulmonar asociada a ventilación ("VALI").
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden incluir un anticuerpo descrito en el presente documento y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
La presente divulgación también proporciona proteínas de receptor Toll quiméricas solubles (también denominadas en este documento proteínas de receptor Toll), métodos para expresar proteínas de receptor Toll y métodos para purificar dichas proteínas en una forma soluble.
La presente divulgación proporciona polipéptidos quiméricos en los que un polipéptido de receptor de tipo Toll, o un derivado biológicamente activo del mismo, está unido operativamente a un polipéptido accesorio MD, o un derivado biológicamente activo del mismo. El polipéptido del receptor tipo Toll es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en TLR 1-10 y RP105.
El polipéptido accesorio MD es, por ejemplo, MD-1 o MD-2. El polipéptido del receptor tipo Toll está, en algunos casos, unido operativamente al polipéptido accesorio MD usando un enlazador flexible de glicina-serina, que hace que el receptor del Toll sea estable durante la expresión y soluble durante la purificación. Por ejemplo, un polipéptido quimérico de la presente divulgación incluye la porción extracelular de un receptor Toll fusionado en su extremo C al extremo N de una proteína MD madura (es decir, MD-1 o MD-2) a través de un enlazador flexible de glicina/serina.
La presente divulgación también proporciona métodos para producir proteínas de fusión quiméricas solubles mediante el acoplamiento de un polipéptido receptor tipo Toll, o un derivado biológicamente activo del mismo, a un polipéptido accesorio MD, o un derivado biológicamente activo del mismo. La presente divulgación también proporciona métodos para producir proteínas de fusión quiméricas solubles mediante la construcción de un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido receptor Toll (o un derivado biológicamente activo del mismo) acoplado a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido accesorio MD (o un derivado biológicamente activo del mismo); transfectando una célula con este vector; cultivar la célula en condiciones que permitan la producción de una proteína de fusión que tiene un polipéptido receptor similar a Toll acoplado a un polipéptido accesorio MD; y aislar esa proteína de fusión. El polipéptido accesorio MD es, por ejemplo, MD-1 o MD-2, y el polipéptido receptor tipo Toll puede ser un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en TLRs 1-10 y RP105. El polipéptido del receptor tipo Toll está unido operativamente al polipéptido accesorio MD mediante un enlazador flexible de glicina-serina, que hace que el receptor se establezca tanto durante la expresión como soluble durante la purificación.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir patologías asociadas con la función aberrante del receptor tipo Toll, o aliviar un síntoma asociado con estas patologías, administrando un polipéptido quimérico soluble descrito aquí a un sujeto en donde se desea dicho tratamiento, prevención o alivio. en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar la patología, o un síntoma de la misma, en el sujeto. El sujeto por tratar es, por ejemplo, humano. La cantidad de polipéptido quimérico soluble suficiente para tratar o prevenir la patología en el sujeto es una cantidad que es suficiente para modular (por ejemplo, reducir o prevenir) la activación de un receptor similar al Toll en el sujeto por tratar. La activación de un receptor Toll se reduce o disminuye cuando el nivel de activación del receptor Toll en presencia de una proteína quimérica descrita en el presente documento es mayor o igual al 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% más bajo que un nivel de control de activación del receptor tipo Toll (es decir, el nivel de activación es la ausencia de proteína quimérica). El nivel de activación del receptor Toll se mide utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el nivel de activación de TLR4 puede medirse detectando el nivel de producción de IL-8 inducida por LPS. Los expertos en la materia apreciarán que el nivel de activación del receptor Toll también se puede medir, por ejemplo, detectando la activación, en su caso, de NF-kappa B o JNK (c-jun terminal quinasa), que inician la transcripción de genes que codifican citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL1 -alfa, IL1-beta, IL6 y TNF-alfa). La activación de JNK y/o NF-kappa B puede detectarse midiendo los niveles de una o más citoquinas proinflamatorias.
En algunas realizaciones, la patología por tratar es sepsis, inflamación aguda, inflamación crónica o una enfermedad autoinmune. Por ejemplo, la patología es cualquiera de una variedad de tipos de artritis.
La presente divulgación también incluye anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a los polipéptidos quiméricos solubles de la presente divulgación, tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o anticuerpos humanizados.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden incluir un polipéptido quimérico soluble descrito en el presente documento y un vehículo, y/o un anticuerpo descrito en el presente documento y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
La presente divulgación también proporciona métodos de selección de un ligando que se une a un receptor similar al Toll y modula la actividad del receptor similar al Toll. De acuerdo con estos métodos, estos ligandos se identifican proporcionando un polipéptido quimérico como se describe en el presente documento que tiene una propiedad o función que es atribuible a ese polipéptido; poner en contacto el polipéptido quimérico con un compuesto candidato; y determinar si el compuesto candidato altera la propiedad o función atribuible al polipéptido, en donde una alteración en la propiedad o función atribuible al polipéptido en presencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un ligando que modula la actividad del receptor tipo T o ll.
Un experto en la materia apreciará que los polipéptidos y anticuerpos quiméricos descritos en este documento tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las proteínas quiméricas se utilizan como agentes terapéuticos para prevenir la activación de los TLR en trastornos como, por ejemplo, sepsis, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedades autoinmunes y diversas formas de artritis. Las proteínas quiméricas también se usan como inmunógenos en métodos más eficientes de generar y bloquear anticuerpos anti-TLR, y/o estos polipéptidos quiméricos pueden usarse como reactivos en ensayos que seleccionan los ligantes de peso molecular pequeño y los bloqueadores de la actividad de los TLR. Las proteínas y/o anticuerpos quiméricos también se usan como reactivos en kits de diagnóstico o como herramientas de diagnóstico, o estas proteínas y/o anticuerpos quiméricos pueden usarse en ensayos competitivos para generar reactivos terapéuticos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa la unión de un anticuerpo monoclonal murino, denominado en este documento "18H10", al complejo TLR4/MD-2. La especificidad de la unión se muestra mediante citometría de flujo utilizando células transfectadas de forma simulada o transfectadas con TLR4/MD-2. Los resultados que utilizan células transfectadas de manera simulada se muestran en el gráfico lleno (izquierda), mientras que los resultados que usan células transfectadas con TLR4/MD-2 se muestran como en el gráfico de esquema (derecha).
La Figura 2 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el anticuerpo monoclonal mu18H10. Las células se incubaron con mu18H10, HTA 125 (un MAb no bloqueante de TLR4 antihumano disponible en el mercado) o un control de anticuerpos en las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 3 es una serie de gráficos que representan la inhibición de la producción de IL-8 inducida por LPS en sangre entera humana por el anticuerpo monoclonal mu18H10. Se extrajo sangre completa de 3 voluntarios sanos, se trató con heparina y se diluyó 1:4 en medio RPMI. Se añadieron los siguientes anticuerpos a las concentraciones indicadas: control de anticuerpo monoclonal; HTA125 y mu18H10. Posteriormente, se agregó LPS para una concentración final de 10 ng/ml, y los niveles de IL-8 se midieron 6 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 4 es una serie de gráficos que representan la especificidad del anticuerpo monoclonal mu18H10 para MD-2. La especificidad del anticuerpo mu18H10 se muestra mediante el análisis de citometría de flujo de células HEK 293 transfectadas transitoriamente con TLR4 humano y MD-2 humano (paneles A, E e I); TLR4 de conejo y MD-2 de conejo (paneles B, F y J); TLR4 humano y MD-2 de conejo (paneles C, G y K); o conejo TLR4 y MD-2 humano (paneles D, H y L). Las células se incubaron con un anticuerpo a-FLAG™ (para detectar la expresión de TLR4); anticuerpo a-C-myc (para detectar la expresión de MD-2) o el anticuerpo monoclonal mu18H10, seguido de un anticuerpo a-ratón (H+L) acoplado a APC.
La Figura 5A es un gráfico que demuestra la falta de especificidad de mu18H10 para MD-2 soluble recombinante purificado a partir de sobrenadantes de células de insecto infectadas con baculovirus según lo determinado por ELISA. La proteína se recubrió directamente en placas de 96 pozos (5 pg/ml) seguido de MAb purificado a la concentración indicada y anti-IgG de ratón (H+L) HRP.
La Figura 5B es una gráfica que demuestra que MD-2 debe estar asociado con TLR4 para que el anticuerpo mu18H10 lo reconozca. Los lisados (Panel 1, es decir, el panel superior) o los sobrenadantes (Panel 2, es decir, el panel inferior) de células HEK 293, transfectadas transitoriamente como se indica, se incubaron en pozos recubiertos con anti-FLAG M2. La unión de una forma biotinilada de mu18H10 se detectó utilizando estreptavidina-HRP. El 12D4 biotinilado (un MAb anti-TLR4) con estreptavidina-HRP o un Ab policlonal de conejo elevado contra MD-2 soluble con una IgG-HRP anti-conejo controló la presencia de TLR4 y MD-2 respectivamente. En este experimento, TLR4 tenía una etiqueta FLAG en el extremo N y se expresó utilizando el vector pCNDA3.1(-)higro (Invitrogen). MD-2 tenía etiquetas FLAG y 6 x Histidina en el extremo C y se expresó utilizando el vector pADNC3 (Invitrogen). Las células simuladas se transfectaron con plásmido vacío.
Las Figuras 6A-6F son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos VH (SEQ ID NO: 1) (Figura 6A), la secuencia de aminoácidos VH (SEQ ID NO: 2) (Figura 6B), la secuencia de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 6) (Figura 6D), y la secuencia de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 7) para mu18H10 (Figura 6E). Las regiones determinantes (CDR) VH (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) (Figura 6C) y las CDR VL (SEQ ID NO: 8, 9 y 10) (Figura 6F) están resaltadas en el subrayado, texto en cursiva en las Figuras. 6B y 6E.
La Figura 7 es un gráfico que muestra que la secuencia de nucleótidos VH y VL de mu18H10 expresada como un MAb quimérico ("18H10 quimérico") es capaz de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb a las células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo usando 18H10 quimérico o un MAb de control de isotipo coincidente en las concentraciones indicadas.
La Figura 8 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el MAb 18H10 quimérico. Las células se incubaron con mu18H10, o 18H10 quimérico a las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS. La inhibición de la producción de IL-8 inducida por LPS por el 18H10 quimérico fue similar a la inhibición por el MAb de ratón 18H10 de la presente divulgación.
La Figura 9 es un gráfico que representa la unión de un anticuerpo monoclonal murino, denominado en este documento como "16G7", al complejo TLR4/MD-2. La especificidad de la unión se muestra mediante citometría de flujo utilizando células transfectadas de manera simulada o transfectadas con TLR4/MD-2. Los resultados que utilizan células transfectadas de manera simulada se muestran en el gráfico lleno (izquierda), mientras que los resultados que usan células transfectadas con TLR4/MD-2 se muestran como en el gráfico de esquema (derecha).
La Figura 10 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el anticuerpo monoclonal mu16G7. Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal mu16G7, el MAb anti-TLR4 HTA 125 o un control de anticuerpos en las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 11 es una serie de gráficos que representan la inhibición de la producción de IL-8 inducida por LPS en sangre completa humana por el anticuerpo monoclonal mu16G7. Se extrajo sangre completa de 3 voluntarios sanos, se trató con heparina y se diluyó 1:4 en medio RPMI. Se añadieron los siguientes anticuerpos en las concentraciones indicadas: control de isotipo coincidente; HTA125 (anticuerpo monoclonal antibloqueo TLR4 antihumano); mu16G7 y 28C5 (anticuerpo monoclonal bloqueador de CD14 antihumano). Posteriormente, se añadió LPS para una concentración final de 10 ng/ml.
La Figura 12 es una serie de gráficos que representan la especificidad del anticuerpo monoclonal mu16G7 para TLR4. La especificidad del anticuerpo mu16G7 se muestra mediante análisis de citometría de flujo de células HEK 293 transfectadas de forma transitoria con TLR4 de conejo y MD-2 de conejo (Paneles A, E e I); TLR4 humano y MD-2 humano (paneles B, F y J); TLR4 de conejo y MD-2 humana (paneles C, G y K); o TLR4 humano y MD-2 de conejo (paneles D, H y L). Las células se incubaron con un anticuerpo a-FLAG™ (para detectar la expresión de TLR4); anticuerpo a-C-myc (para detectar la expresión de MD-2) o el anticuerpo monoclonal mu16G7, seguido de un anticuerpo a-ratón (H+L) acoplado a APC.
Las Figuras 13A-13F son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos VH (SEQ ID NO: 11) (Figura 13A), la secuencia de aminoácidos VH (SEQ ID NO: 12) (Figura 13B), la secuencia de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 16) (Figura 13D), y la secuencia de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 17) (Figura 13E) para mu16G7. Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs: 13, 14 y 15) (Figura 13C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 18, 19 y 20) (Figura 13F) están resaltadas en el subrayado, texto en cursiva en las Figuras 13B y 13E.
La Figura 14 es un gráfico que representa la unión de un anticuerpo monoclonal murino, denominado en este documento como "15C1", al complejo TLR4/MD-2. La especificidad de la unión se muestra mediante citometría de flujo utilizando células transfectadas de forma simulada o transfectadas con TLR4/MD-2. Los resultados que utilizan células transfectadas de manera simulada se muestran en el gráfico lleno (izquierda), mientras que los resultados que usan células transfectadas con TLR4/MD-2 se muestran como en el gráfico de esquema (derecha).
La Figura 15 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el anticuerpo monoclonal mu15C1. Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal mu15C1, HTA 125 (anticuerpo monoclonal antibloqueo no humano TLR4) y un control de isotipo coincidente (IgG1) a las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 16 es una serie de gráficos que representan la inhibición de la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre completa humana por el anticuerpo monoclonal mu15C1. Se extrajo sangre completa de 3 voluntarios sanos, se trató con heparina y se diluyó 1:4 en medio RPMI. Se añadieron los siguientes anticuerpos a las concentraciones indicadas: control de isotipo coincidente (IgG1); HTA125 (anticuerpo monoclonal antibloqueo TLR4 antihumano); mu15C1 y 28C5 (anticuerpo monoclonal bloqueador de CD14 antihumano). Posteriormente, se añadió LPS para una concentración final de 10 ng/ml.
La Figura 17 es una serie de gráficos que representan la especificidad del anticuerpo monoclonal mu15C1 para TLR4. La especificidad del anticuerpo mu15C1 se muestra mediante análisis de citometría de flujo de células HEK293 transfectadas transitoriamente con cualquier vector simulado, es decir, vector vacío (Panel A), TLR4 humano (Panel B), TLR4 humano y MD-2 humano (Panel C), TLR4 de conejo y MD-2 de conejo (Panel D), TLR4 humano y MD-2 de conejo (Panel E), o TLR4 de conejo y MD-2 humano (Panel F). Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal mu15C1 (10 pg/ml), seguido de un anticuerpo a-ratón (H+L) acoplado a APC.
Las Figuras 18A-18F son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos VH (SEQ ID NO: 21) (Figura 18A), la secuencia de aminoácidos VH (SEQ ID NO: 22) (Figura 18B), la secuencia de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 26) (Figura 18D), y la secuencia de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 27) (Figura 18E) para mu15C1. Las regiones determinantes de complementariedad VH (CDR) (SEQ ID NOs: 23, 24 y 25) (Figura 18C) y las CDRs VL (SEQ ID NOs: 28, 29 y 30) (Figura 18F) están resaltadas en el subrayado, texto en cursiva en las Figuras 18B y 18E.
La Figura 19 es un gráfico que muestra que la secuencia de nucleótidos VH y VL de mu15C1 expresada como un MAb quimérico ("15C1 quimérico") es capaz de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb al complejo TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo usando 15C1 quimérico o un anticuerpo monoclonal de control de isotipo compatible en la concentración indicada.
La Figura 20 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el MAb 15C1 quimérico. Las células se incubaron con mu15C1 o 15C1 quimérico a las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS. La inhibición de la producción de IL-8 inducida por LPS por el 15C1 quimérico fue similar a la inhibición por el MAb de ratón mu15C1 de la presente divulgación.
La Figura 21 es un gráfico que representa la unión de un anticuerpo monoclonal murino, denominado en este documento "7E3", al complejo TLR4/MD-2. La especificidad de la unión se muestra mediante citometría de flujo utilizando células transfectadas de forma simulada o transfectadas con TLR4/MD-2. Los resultados que utilizan células transfectadas de manera simulada se muestran en el gráfico lleno (izquierda), mientras que los resultados que usan células transfectadas con TLR4/MD-2 se muestran como en el gráfico de esquema (derecha).
La Figura 22 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el anticuerpo monoclonal mu7E3. Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal mu7E3, HTA 125 (anticuerpo monoclonal antibloqueo no humano TLR4) y un control de isotipo coincidente (IgG1) a las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 23 es una serie de gráficos que representan la inhibición de la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre entera humana por el anticuerpo monoclonal mu7E3. Se extrajo sangre completa de 3 voluntarios sanos, se trató con heparina y se diluyó 1:4 en medio RPMI. Se añadieron los siguientes anticuerpos a las concentraciones indicadas: control de isotipo coincidente (IgG1); HTA125 (anticuerpo monoclonal antibloqueo TLR4 antihumano); mu7E3 y 28C5 (anticuerpo monoclonal bloqueador de CD14 antihumano). Posteriormente, se añadió LPS para una concentración final de 10 ng/ml.
La Figura 24 es una serie de gráficos que representan la especificidad del anticuerpo monoclonal mu7E3 para el complejo TLR4/MD-2. La especificidad del anticuerpo mu7E3 se muestra mediante análisis de citometría de flujo de células HEK 293 transfectadas transitoriamente con un vector simulado (Panel A), TLR4 humano (Panel B), TLR4 humano y MD-2 humano (Panel C), TLR4 de conejo y conejo MD-2 (Panel D), TLR4 humano y MD-2 de conejo (Panel E), o TLR4 de conejo y MD-2 humano (Panel F). Las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal mu7E3 (10 pg/ml), seguido de un anticuerpo a-ratón (H+L) acoplado a APC.
Las Figuras 25A-25F son una serie de ilustraciones que representan la secuencia de nucleótidos VH (SEQ ID NO: 31) (Figura 25A), la secuencia de aminoácidos VH (SEQ ID NO: 32) (Figura 25B), la secuencia de nucleótidos VL (SEQ ID NO: 36) (Figura 25D), y la secuencia de aminoácidos VL (SEQ ID NO: 37) (Figura 25E) para mu7E3. Las regiones determinantes de complementariedad de VH (CDR) (SEQ ID NOs: 33, 34 y 35) (Figura 25C) y las CDR de VL (SEQ ID NOs: 38, 39 y 40) (Figura 25F) se destacan en la cursiva subrayada texto en las Figuras 25B y 25E.
La Figura 26 es un gráfico que ilustra que la secuencia de nucleótidos VH y VL de mu7E3 expresada como un MAb quimérico ("7E3 quimérico") es capaz de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión del anticuerpo monoclonal a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo utilizando 7E3 quimérico o un MAb de control de isotipo coincidente en las concentraciones indicadas.
La Figura 27 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 por el MAb 7E3 quimérico. Las células se incubaron con 7E3 quimérico o un control de MAb de isotipo coincidente en las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (15 ng/ml). Los niveles de IL-8 se evaluaron 16 horas después del tratamiento con LPS.
La Figura 28 es una ilustración que representa la construcción de un ADNc de proteína de fusión TLR4/MD-2.
La Figura 29 es una ilustración que representa la expresión de una proteína quimérica TLR4/MD-2 de la presente divulgación en lisados de células Sf9 y sobrenadante.
La Figura 30 es una ilustración que representa la purificación de una proteína quimérica TLR4/MD-2 de acuerdo con la presente divulgación a partir de lisados de células Sf9 infectadas.
La Figura 31 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de IL-8 inducida por lipopolisacáridos (LPS) utilizando una proteína TLR4/MD-2 quimérica soluble de acuerdo con la presente divulgación.
La Figura 32A ilustra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína accesoria MD-1 (SEQ ID NO: 41).
La Figura 32B representa una secuencia de aminoácidos de una proteína accesoria madura MD-1 en un ejemplo (SEQ ID NO: 42).
La Figura 33A ilustra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína accesoria MD-2 (SEQ ID NO: 43).
La Figura 33B representa una secuencia de aminoácidos de una proteína accesoria MD-2 madura (SEQ ID NO: 44).
Las Figuras 34A, 34B y 34C son una representación esquemática y una serie de gráficos que representan la unión de hu15C1 y hu7E3 a versiones híbridas de ratón humano de TLR4. La Figura 34A es una representación esquemática y una tabla de resumen de los mutantes híbridos TLR4 de ratón-humano y la unión del anticuerpo a estos mutantes. Las regiones rojas en la representación esquemática representan la secuencia derivada del ratón y las regiones azules representan la secuencia derivada de humanos. En la tabla de resumen de la unión del anticuerpo, (++) representa una fuerte unión, (+) representa la unión intermedia y (-) indica una unión débil o nula. La Figura 34B es una serie de histogramas de citometría de flujo que representan la unión del anticuerpo monoclonal a células transfectadas que expresan los híbridos humano-ratón. Las células HEK 293 se transfectaron con TLR4 de tipo salvaje (fila 1); ratónhumano-humano-humano (MHHH) TLR4 (fila 2); ratón-ratón-humano-humano (fila 3); ratón-humano-ratón-humano (MHMH) TLR4 (fila 4) o humano-humano-humano-ratón (HHHM) TLR4 (fila 5). Las células se incubaron con un anticuerpo a-FLAG™ (para detectar la expresión de TLR4); anticuerpo a-C-myc (para detectar la expresión de MD-2) o el anticuerpo monoclonal hu15C1 o hu7E3, seguido de un anticuerpo conjugado con APC. La Figura 34C es una serie de histogramas de citometría de flujo que representan la unión del anticuerpo monoclonal a células transfectadas que expresan los híbridos humano-ratón.
Las Figuras 35A y 35B son una representación esquemática y una serie de gráficos que representan la unión de hu15C1 y hu7E3 a versiones híbridas de ratón-humano de "resolución fina" de TLR4. La Figura 35A es una representación esquemática y una tabla de resumen de los mutantes híbridos TLR4 de ratón y humano de "resolución fina" y la unión del anticuerpo a estos mutantes. Las regiones rojas representan la secuencia derivada del ratón y las regiones azules representan la secuencia derivada de humanos. En la tabla de resumen de la unión del anticuerpo, (++) representa una fuerte unión, (+) representa la unión intermedia y (-) indica una unión débil o nula. La Figura 35B es una serie de histogramas de citometría de flujo que representan la unión de MAb a células transfectadas que expresan los híbridos humano-ratón.
Las figuras 36A y 36B son una representación esquemática y una serie de gráficos que representan la unión de hu15C1 y hu7E3 a mutantes de escaneo de alanina de TLR4. La Figura 36A es una representación esquemática de los mutantes de escaneo de alanina (QC1-QC20; encuadrados de 1 a 20 en la secuencia humana) seleccionados después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos de TLR4 humano y de ratón de los aminoácidos 289-375 y los aminoácidos 288-373, respectivamente. Los mutantes se diseñaron de modo que cualquier diferencia de aminoácidos entre las secuencias humanas y de ratón dentro de las cajas se convirtiera en una alanina en la secuencia humana (por ejemplo, el QC2 se modifica de YL a AA). La Figura 36B es una serie de gráficos de barras que representan la unión de MAb a células transfectadas que expresan los mutantes de escaneo de alanina TLR4. Para C-myc, se muestra la IMF real obtenida después del análisis de citometría de flujo. Para hu18H10, hu15C1 y hu7E3, los valores representan la unión del anticuerpo "normalizado" al dividir el MFI obtenido para el MAb dado por el obtenido para el C-myc.
Las Figuras 37A y 37B son una representación esquemática y una serie de gráficos que representan la unión de hu18H10 a versiones híbridas de ratón-humano de MD-2. La Figura 37A es una representación esquemática y una tabla de resumen de los mutantes híbridos de ratón-humano MD-2 y la unión del anticuerpo a estos mutantes. Las regiones rojas representan la secuencia derivada del ratón y las regiones azules representan la secuencia derivada de humanos. En la tabla de resumen de la unión del anticuerpo, (++) representa una fuerte unión, (+) representa la unión intermedia y (-) indica una unión débil o nula. La Figura 37B es una serie de histogramas de citometría de flujo que representan la unión de MAb a células transfectadas que expresan los híbridos humano-ratón.
Las Figuras 38A y 38B son una representación esquemática y una serie de gráficos que representan la unión de hu18H10 a mutantes de escaneo de alanina de MD-2. La Figura 38A es una representación esquemática de los mutantes de escaneo de alanina (QC1-QC14; encajonados de 1 a 14 en la secuencia humana) seleccionados después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos MD-2 humanas y de ratón de los aminoácidos 19-57. Los mutantes se diseñaron de modo que cualquier diferencia de aminoácidos entre las secuencias humanas y de ratón se convirtiera en una alanina en la secuencia humana (por ejemplo, QC1 se modifica de Q a A). La Figura 38B es una serie de gráficos de barras que representan la unión de MAb a células transfectadas que coexpresan wt TLR4 junto con los mutantes MD-2. Para los MAb anti-6xHIS y hu15C1, se muestra la MFI real obtenida después del análisis de citometría de flujo. Para hu18H10, se muestran tanto las IMF reales como los valores representan una unión de anticuerpo "normalizada" (dividiendo la IMF obtenida para el MAb por la obtenida para anti-6xHIS).
La Figura 39 es un gráfico que muestra que el anticuerpo monoclonal humanizado hu18H10 ("zumbido 18H10") es capaz de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb a las células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo utilizando el anticuerpo hu18H10 o el 18H10 quimérico ("18H10chim") (descrito anteriormente) a las concentraciones indicadas. La unión se mide como un valor de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) celular.
La Figura 40 es una gráfica que muestra que el anticuerpo monoclonal humanizado hu7E3 que incluye Vh2-70 mostrado en la SEQ ID NO: 51 ("7E32-70/L-19") y el anticuerpo monoclonal humanizado hu7E3 que incluye Vh 3-66 (SEQ ID NO: 52) ("7E3 3-66/L19") son capaces de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb a las células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos hu7E3 o el 7E3 quimérico ("7E3 CHIM") (descrito anteriormente) a las concentraciones indicadas. La unión se mide como un valor de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) celular.
La Figura 41 es un gráfico que muestra que el anticuerpo humanizado hu15C1 que incluye Vh 4-28 se muestra en la SEQ ID NO: 45 ("15C1 4-28/A26") y sus variantes en las cuales los residuos en las posiciones elegidas se han reemplazado por el aminoácido correspondiente en la línea germinal humana dada ("15C1 4-28 QC 30/A26"; "15C1 4-28 QC 48/A26"; "15C1 4-28 QC 67/A26" y "15C1 4-28 QC 69/A26", ver la TABLA 1) son capaces de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb a las células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos hu15C1 o el 15C1 quimérico ("15C1 CHIM") (descrito anteriormente) a las concentraciones indicadas. La unión se mide como un valor de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) celular.
La Figura 42 es un gráfico que muestra que el anticuerpo humanizado hu15C1 que incluye Vh 3-66 mostrado en la SEQ ID NO: 46 y Vl L6 mostrado en la SEQ ID NO: 47 (15C1 3-66 L6) y el anticuerpo humanizado hu15C1 que incluye Vh 3­ 66 mostrada en la SEQ ID NO: 46 y Vl A26 mostrada en la SEQ ID NO: 48 (15C1 3-66 A26) son capaces de unirse específicamente al complejo humano TLR4/MD-2 en la superficie de las células CHO transfectadas. La unión de MAb a las células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 se muestra por citometría de flujo utilizando los anticuerpos hu15C1 3-66 L6 y hu15C1 3-66 A26 hu15C1, el anticuerpo hu15C1 4-28 A26 o el 15C1 quimérico ("15C1 CHIM") (descrito anteriormente) a las concentraciones indicadas. La unión se mide como un valor de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) celular.
La Figura 43 representa la secuencia de aminoácidos del receptor 4 similar a Toll humano (TLR4).
La Figura 44 es una serie de gráficos que representan la inhibición de la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre total humana por el anticuerpo monoclonal hu15C1 que tiene la región variable de cadena pesada 4-28 y la región variable de cadena ligera A26 ("4-28/A26"). El hu15C1 4-28/A26 se comparó con un control de isotipo coincidente (IgG1) y el anticuerpo quimérico 15C1 descrito aquí.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales (MAbs) que se unen específicamente al complejo del receptor humano TLR4/MD-2. Este complejo receptor es activado por el lipopolisacárido (LPS), el componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Los anticuerpos monoclonales de la divulgación inhiben la activación del receptor y la señalización intracelular posterior a través de LPS. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales neutralizan la activación del complejo receptor TLR4/MD-2. En particular, la descripción proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen el complejo del receptor TLR4/MD-2 expresado en la superficie celular. Estos anticuerpos monoclonales bloquean la producción de IL-8 inducida por LPS. Además, algunos anticuerpos monoclonales de la divulgación también reconocen TLR4 cuando no están complejados con MD-2. El anticuerpo monoclonal es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos de la presente divulgación incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor de TLR4/MD-2 humano y también se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2. Los anticuerpos de la divulgación también incluyen anticuerpos que se unen a la porción TLR4 del complejo receptor TLR4/MD-2 humano, pero la unión depende de la presencia de MD-2, pero la unión se ve muy favorecida por la presencia de MD-2, lo que sugiere que la presencia del MD-2 causa un cambio conformacional en TLR4, exponiendo así un epítopo unido por el anticuerpo. Además, los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor de TLR4/MD-2 humano y también se unen a MD-2 en presencia de TLR4.
Los anticuerpos de la divulgación se unen de forma inmunoespecífica a un complejo TLR4/MD-2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de aminoácidos en TLR4 humano entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO: 54. Los anticuerpos de la divulgación se unen de forma inmunoespecífica al complejo TLR4/MD2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo en MD-2 humano entre los residuos 19 y 57 de la SEQ ID NO: 44.
Los ejemplos de anticuerpos de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 18H10, el anticuerpo 16G7, el anticuerpo 15C1 y el anticuerpo 7E3. Estos anticuerpos muestran especificidad por el complejo receptor TLR4/MD-2 humano, y se ha demostrado que inhiben la activación del receptor y la señalización intracelular posterior a través de LPS. Estos anticuerpos tienen especificidades distintas. Por ejemplo, 16G7 y 15C1 se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2, 7E3 se une a TLR4, pero la unión depende de la presencia de MD-2, y 18H10 se une a MD-2, pero requiere la presencia de TLR4, como El MAb no se une a formas solubles de MD-2.
Como se usan en el presente documento, los términos "16G7", "mu16G7", "7E3", "mu7E3", "15C1", "mu15C1", "18H10" o "mu18H10" se refieren al anticuerpo monoclonal murino, y los términos "hu7E3", "hu15C1" o "hu18H10" se refieren al anticuerpo monoclonal humanizado.
La presente divulgación también proporciona proteínas de receptor Toll quiméricas solubles (también denominadas en el presente documento proteínas de receptor de tipo de Toll), métodos para expresar proteínas de receptor Toll y métodos para purificar dichas proteínas en una forma soluble. Las proteínas quiméricas son útiles, por ejemplo, para generar anticuerpos.
Los TLR reconocen las partículas microbianas y activan las células inmunitarias contra la fuente de estas partículas microbianas. (Véase Takeda et al., Annu. Rev. Immunol., 21: 335-76 (2003)). Se ha demostrado que TLR4 y MD-2 forman un complejo en la superficie celular, y la presencia de MD-2 parece esencial para la capacidad de respuesta de TLR4 a varios ligandos, incluido el LPS. El LPS es un glicolípido de membrana externa bacteriano gramnegativo que es capaz de activar fuertemente el sistema inmunitario innato. El LPS ha sido implicado como uno de los principales factores que activan el sistema inmunológico durante la inflamación generalizada grave que resulta de una infección gramnegativa. (Lakhani et al., Curr. Opin. Pediatr. 15: 278-282 (2003)).
El LPS envía señales a las células inmunitarias a través de su receptor de cadena múltiple en donde el complejo de señalización principal es el complejo TLR4/MD-2. Se ha demostrado que el LPS ejerce sus efectos en el sistema inmunológico a través de la señalización a través de TLR4. El LPS se une rápidamente a la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP) en el torrente sanguíneo y, en esta forma, el LPS interactúa con la proteína de superficie celular anclada a GPI CD14. El LPS se transfiere a TLR4, que transduce una señal de activación intracelular. Se ha encontrado que otra proteína, MD-2, es necesaria para que se produzca la transducción de señales a través de TLR4. MD-2 interactúa directamente con TLR4 y desempeña un papel importante en su modificación postraducción y el tráfico intracelular. Además, se ha demostrado que MD-2 se une directamente a LPS, lo que demuestra la importancia de esta proteína accesoria en el complejo receptor de LPS. (Véase Miyake K., Int. Immunopharmacol. 3: 119-128 (2003)).
Por consiguiente, la neutralización de la señalización de LPS mediada por el complejo TLR4/MD-2 es una estrategia terapéutica potencial en el tratamiento de trastornos tales como, por ejemplo, inflamación sistémica aguda y sepsis inducida por infección bacteriana gram-negativa.
Definiciones:
A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de oligo y polinucleótidos descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
Según se utiliza de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "específicamente unir" o "inmunorreaccionar con" o "inmunoespecíficamente unir" significa que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une a una afinidad mucho menor (Kd >10'6). Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), cadena simple, Fab, Fab' y fragmentos F(ab')2, scFvs, y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básico comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares de cadenas polipeptídicas idénticas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La parte carboxiterminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpos obtenidas de humanos se relacionan con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Algunas clases también tienen subclases, como IgG-i, IgG2 y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (MAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un producto génico de cadena ligera único y un gen de cadena pesada único producto. En particular, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única para él.
El término "sitio de unión a antígeno", o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión de antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FRs". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a las secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre las regiones hipervariables y las adyacentes a ellas en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en grupos de moléculas químicamente activas en la superficie, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y por lo general tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse contra los péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 pM; preferiblemente <100 nM y lo más preferiblemente <10 nM.
Como se usa en el presente documento, los términos "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se puede expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en la que una Kd menor representa una afinidad mayor. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos implica medir las tasas de formación y disociación del sitio de unión a antígeno/complejo antígeno, en donde esas tasas dependen de las concentraciones de los socios complejos, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de velocidad de activación" (Kactivación) como la "constante de velocidad de respuesta" (desactivación) se pueden determinar mediante el cálculo de las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación. (Véase Nature 361: 186-87 (1993)). La relación de Kdesactivación/Kactivación permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente al complejo del Receptor 4 tipo Toll (TLR4)/MD-2 o al TLR4 cuando no está complejado a MD-2, cuando la constante de enlace de equilibrio (Kd) es <1 pM, preferiblemente <100 nM, más preferiblemente <10 nM, y lo más preferiblemente <100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide mediante ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado" como se usa en el presente documento significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una parte de un el polinucleótido en donde el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está operativamente vinculado a un polinucleótido al que no está vinculado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada presentadas en las SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51 y 52, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera. representado en SEQ ID NOS: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50 y 53.
El término "proteína aislada" referida aquí significa una proteína de ADNc, ARN recombinante, u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) es no asociado con las proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptido. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipeptídico. Los polipéptidos de la presente divulgación comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada representadas en las SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51 y 52, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera representadas en la SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50 y 53, así como moléculas de anticuerpos formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de los mismos.
El término "que ocurre naturalmente" como se usa en este documento cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que el hombre no ha modificado intencionalmente en el laboratorio o está presente de forma natural.
El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a las posiciones de los componentes descritos de esta manera que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosomal y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, en general, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, las secuencias líder y las secuencias asociadas de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere aquí significa un boro polimérico de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de cadena simple y doble.
El término oligonucleótido al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos naturales y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos naturales y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprenden una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y lo más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son generalmente de cadena sencilla, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble cadena, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la presente divulgación son oligonucleótidos con sentido o antisentido.
El término "nucleótidos naturales" al que se hace referencia en este documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" al que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoniladato, fosforonmidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, páginas 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente de los Estados Unidos No 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para la detección, si se desea.
El término "hibridar selectivamente" al que se hace referencia aquí significa un enlace detectable y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente divulgación hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectivas como se conocen en la técnica y se discuten en este documento. En general, la homología de la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos tal como se describe en el presente documento y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 80%, y más típicamente con homologías cada vez mayores preferiblemente de al menos el 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias están alineadas para una máxima coincidencia. Se permiten espacios (en cualquiera de las dos secuencias que están emparejadas) para maximizar el emparejamiento, se prefieren longitudes de espacio de 5 o menos, siendo más preferido 2 o menos. Como alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias polipeptídicas derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en este documento, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 de este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son mayores o iguales al 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se usa en el presente documento para indicar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no está estrictamente relacionada con la evolución) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a un polipéptido de referencia secuencia. En contraposición, el término "complementario a" se usa en el presente documento para indicar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustrar, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de genes que se proporciona en una lista de secuencias o puede comprender una secuencia completa de ADNc o gen. En general, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos, frecuentemente de al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos, y con frecuencia de al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos. Dado que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa de polinucleótido o aminoácido) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente comparando secuencias de las dos moléculas en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos contiguas o 6 aminoácidos en donde una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos y en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, eliminaciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson and Lipman Proc. Natl Acad Sci. (USA) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, o paquetes de software MacVector), o por inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, que resulta en el porcentaje más alto de homología en la ventana de comparación) generada por los diversos métodos.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o de residuo por residuo) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico es idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o el residuo se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se usa en este documento denota una característica de un polinucleótido o secuencia de aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más generalmente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), con frecuencia en una ventana de al menos 24­ 48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir eliminaciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.
Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a edición, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland 7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales como los aminoácidos a-, a-disustituidos, los aminoácidos N-alquilos, el ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente divulgación. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetilsilina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxiinina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada en el presente documento, la dirección de la mano izquierda es la dirección amino terminal y la dirección de la mano derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.
De manera similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias polinucleotídicas monocatenarias es el extremo 5', la dirección izquierda de las secuencias polinucleotídicas bicatenarias se denomina dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes se denomina regiones de secuencia de dirección de transcripción en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 5' al extremo 5' de la transcripción del ARN como "secuencias ascendentes", las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 3' al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias descendentes".
Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, como los programas GAP o BESTFIT que usan ponderaciones por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo más preferiblemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia.
Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones conservativas de aminoácidos.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.
Tal como se analiza en el presente documento, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos que se incluyen en la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan al menos en un 75%, más preferiblemente en al menos un 80%, 90%, 95%, y lo más preferiblemente 99%. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, senil y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia alifática-hidroxi; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Si un cambio de aminoácido produce un péptido funcional se puede determinar fácilmente analizando la actividad específica del derivado polipeptídico. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se encuentran cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o propietarias. Preferiblemente, los métodos de comparación computarizados se usan para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas predichos que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la presente divulgación.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica que se produce naturalmente. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera del dominio(s) que forma contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservadora no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia principal (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia principal, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia principal). Ejemplos de polipéptidos reconocidos en la técnica, estructuras secundarias y terciarias se describen en proteínas, estructuras y principios moleculares (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introducción a la estructura de las proteínas (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) and Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino terminal y/o carboxi terminal, pero cuando la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen una longitud de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 14 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, usualmente una longitud de al menos 50 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo" como se usa en el presente documento se refiere a polipéptidos que comprenden un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica al complejo TLR4/MD2 o TLR4 solo, bajo condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia que se produce naturalmente. Los análogos típicamente tienen una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 50 aminoácidos, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido natural de longitud completa.
Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelos moleculares computarizados. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigmático (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2-, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, CH(OH)CH2--, y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
El término "agente" se usa en el presente documento para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos.
Como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de unidades estructurales biotinilo que puede detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen diversos métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas en la técnica y se pueden usar. Ejemplos de etiquetas para los polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánidos de fósforo), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, metal dominios de unión, etiquetas de epítopo). En algunos ejemplos, las etiquetas están unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico. El término "agente o fármaco farmacéutico", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos de química en el presente documento se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ilustra en el Diccionario de Términos Químicos de McGraw-Hill (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
El término "agente antineoplásico" se usa en el presente documento para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o la progresión de una neoplasia en un ser humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa), como un carcinoma, sarcoma, linfoma, o leucemia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad de los agentes antineoplásicos.
Como se usa en este documento, "sustancialmente pura" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales descritos en este documento (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos o humanizados) tienen la capacidad de inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS. La inhibición se determina, por ejemplo, en la sangre humana completa y en los ensayos celulares HEK 293 transfectados con huTLR4/MD2 descritos aquí. Los anticuerpos monoclonales de ejemplo incluyen, por ejemplo, los anticuerpos a los que se hace referencia en el presente documento como "mu18H10", "hu18H10", "mu16G7", "mu15C1", "hu15C1", "mu7E3" y "hu7E3". Los anticuerpos mu18H10 y hu18H10 reconocen el complejo TLR4/MD-2, pero no reconocen una proteína MD-2 cuando no están complejados con TLR4. Los anticuerpos monoclonales mu16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3 y hu7E3 reconocen el complejo TLR4/MD-2. mu15C1, hu15C1 y 16G7 también reconocen TLR4 cuando no están complejados con MD-2.
También se incluyen en la presente divulgación los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos descritos en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación se unen inmunoespecíficamente a un complejo TLR4/MD-2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de aminoácidos en TLR4 humano entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO: 54. Los anticuerpos de la presente divulgación se unen inmunoespecíficamente al complejo TLR4/MD2, en donde el anticuerpo se une a un epítopo en MD-2 humano entre los residuos 19 y 57 de la SEQ ID NO: 44. Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin experimentación excesiva, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o humanizado murino) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la presente divulgación (por ejemplo, mu18H10, hu18H10, mu16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3 y/o hu7E3) al determinar si el primero evita que el último se una al complejo TLR4/MD-2 o al TLR4 cuando no está complejado con el MD-2. Si el anticuerpo monoclonal que se está probando compite con el anticuerpo monoclonal de la presente divulgación, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la presente divulgación, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o muy relacionado. Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad del anticuerpo monoclonal de la presente divulgación es preincubar el anticuerpo monoclonal de la divulgación con el complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 soluble (con la que normalmente es reactivo), y luego agregue el anticuerpo monoclonal que se está probando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está probando está inhibido en su capacidad para unirse al complejo TLR4/MD-2 o para unirse a TLR4 y TLR4 en complejo con MD-2. Si se inhibe el anticuerpo monoclonal que se está probando, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la presente divulgación. La selección de anticuerpos monoclonales de la presente divulgación, también se puede llevar a cabo midiendo la producción de IL-8 inducida por LPS y determinando si el anticuerpo monoclonal de prueba es capaz de neutralizar la producción de IL-8 inducida por LPS.
Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el complejo TLR4/MD-2, o para TLR4 cuando no están complejados con MD-2, o contra derivados, fragmentos, homólogos análogos u ortólogos de los mismos. (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los anticuerpos se purifican mediante técnicas bien conocidas, como la cromatografía de afinidad utilizando proteína A o proteína G, que proporcionan principalmente la fracción de IgG de suero inmune. Posteriormente, o alternativamente, el antígeno específico que es el objetivo de la inmunoglobulina buscada, o un epítopo de la misma, puede inmovilizarse en una columna para purificar el anticuerpo inmune específico mediante cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de las inmunoglobulinas se discute, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (17 de abril de 2000), pp. 25-28).
Los anticuerpos de la presente divulgación (por ejemplo, hu18H10, 16G7, hu15C1 y hu7E3) son anticuerpos monoclonales. Se generan anticuerpos monoclonales que neutralizan la señalización de LPS que está mediada por el complejo TLR4/MD-2, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c con combinaciones de transfectantes celulares que expresan niveles altos de TLR4 y MD-2 en su superficie y una proteína soluble recombinante quimérica que comprende tanto TLR4 como MD-2 atadas por una secuencia de enlace flexible. Los hibridomas resultantes de las fusiones de células de mieloma/B se analizan luego para determinar la reactividad a este complejo TLR4/MD-2.
Se preparan anticuerpos monoclonales, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.
El agente inmunizante incluirá típicamente el antígeno proteico, un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. En general, se usan linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Luego, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas suelen ser células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias impiden el crecimiento de HGPRT células deficientes.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una expresión estable de alto nivel de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales. (Véase Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)).
El medio de cultivo en donde se cultivan las células de hibridoma puede ensayarse para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Además, en aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de unión por el antígeno diana.
Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y cultivarlos mediante métodos estándar. (Véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar a partir del medio de cultivo o líquido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente divulgación sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped, como las células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de la secuencia de codificación en lugar de las secuencias murinas homólogas (véase la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniéndose covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo de la presente divulgación, o puede sustituir a los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos son adecuados para la administración a seres humanos sin generar una respuesta inmune por parte del ser humano contra la inmunoglobulina administrada. Las formas humanizadas de anticuerpos son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos) que comprenden principalmente la secuencia de una inmunoglobulina humana, y contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. La humanización se realiza, por ejemplo, siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. (Véase también la Patente de los Estados Unidos No.
5,225,539). En algunos casos, los residuos del marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también comprenden, por ejemplo, residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o secuencias marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado incluye sustancialmente todos al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluye de manera óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)).
Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpos en las que la secuencia completa tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las CDR, proviene de genes humanos. Tales anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos", o "anticuerpos completamente humanos" en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando la técnica de trioma; la técnica de hibridoma de células B humanas (Véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales (Véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales y pueden producirse utilizando hibridomas humanos (Véase Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando células B humanas con el virus de Epstein Barr in vitro (Véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER. THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Además, los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando técnicas adicionales, incluidas las bibliotecas de presentación de fagos. (Véase Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991) ). De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden producir mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Tras el desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluido el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992) ; Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995).
Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente utilizando animales transgénicos no humanos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta al desafío por un antígeno. (Véase publicación PCT WO94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el huésped no humano se han incapacitado, y los loci activos que codifican las inmunoglobulinas humanas de cadena pesada y ligera se insertan en el genoma del huésped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, utilizando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano necesarios. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se obtiene luego como progenie mediante el cruce de animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento completo de las modificaciones. Un ejemplo de tal animal no humano es un ratón denominado Xenomouse™ como se describe en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas totalmente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés, como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de células B inmortalizadas derivadas del animal, como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Además, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse aún más para obtener análogos de anticuerpos como, por ejemplo, moléculas Fv de cadena sencilla (scFv).
Un ejemplo de un método para producir un huésped no humano, ejemplificado como un ratón, que carece de expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina endógena, se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,939,598. Puede obtenerse mediante un método, que incluye la eliminación de los genes del segmento J de al menos un locus de cadena pesada endógeno en una célula madre embrionaria para evitar la reorganización del locus y para prevenir la formación de una transcripción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado, realizándose la eliminación mediante un vector de direccionamiento que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y producir a partir de células madre embrionarias un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.
Un método para producir un anticuerpo de interés, tal como un anticuerpo humano, se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,916,771. Este método incluye la introducción de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada en una célula huésped de mamífero en cultivo, la introducción de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera en otra célula huésped de mamíferos y la fusión de las dos células para formar una célula híbrida. La célula híbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.
En una mejora adicional en este procedimiento, un método para identificar un epítopo clínicamente relevante en un inmunógeno, y un método correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al epítopo relevante con alta afinidad, se describen en la publicación PCT WO 99/53049.
El anticuerpo puede expresarse por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo de cadena simple descrito anteriormente.
Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola de genes, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos tales como los descritos en el documento WO 93/64701, que tiene un resto dirigido (por ejemplo, un ligando a un receptor de superficie celular), y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo, polilisina), vector viral (por ejemplo, un vector viral de ADN o ARN), proteínas de fusión como las descritas en PCT/US 95/02140 (documento WO 95/22618) que es una proteína de fusión que contiene un resto objetivo (por ejemplo, un anticuerpo específico para una célula diana) y una unidad estructural de unión a ácido nucleico (por ejemplo, una protamina), plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.
Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen los virus de la leucemia murina Moloney. Se prefieren los vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores ortopox o avipox, vectores de virus herpes tales como un vector del virus herpes simplex I (HSV) (véase Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: USA 90: 7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990), vectores de adenovirus (Véase LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995) y vectores de virus asociados a adeno (Véase Kaplitt, M.G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994).
Los vectores virales de viruela introducen el gen en el citoplasma de las células. Los vectores del virus Avipox dan como resultado solo una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Se prefieren vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados y vectores de virus herpes simplex (HSV) para introducir el ácido nucleico en células neurales. El vector de adenovirus da como resultado una expresión a más corto plazo (aproximadamente 2 meses) que el virus adenoasociado (aproximadamente 4 meses), que a su vez es más corto que los vectores de HSV. El vector particular elegido dependerá de la célula diana y de la condición por tratar. La introducción puede ser por técnicas estándar, por ejemplo infección, transfección, transducción o transformación. Ejemplos de modos de transferencia de genes incluyen, por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con CaPO4, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección de células y vectores virales.
El vector puede emplearse para apuntare esencialmente a cualquier célula diana deseada. Por ejemplo, se puede usar una inyección estereotáxica para dirigir los vectores (por ejemplo, adenovirus, HSV) a una ubicación deseada. Además, las partículas pueden administrarse mediante infusión intracerebroventricular (icv) utilizando un sistema de infusión de minibomba, como un sistema de infusión SynchroMed. Un método basado en el flujo en masa, denominado convección, también ha demostrado ser eficaz para administrar moléculas grandes en áreas extensas del cerebro y puede ser útil para administrar el vector a la célula diana. (Véase Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266: 292-305 (1994)). Otros métodos que pueden usarse incluyen catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y orales u otras vías de administración conocidas.
Estos vectores se pueden usar para expresar grandes cantidades de anticuerpos que se pueden usar de varias maneras. Por ejemplo, para detectar la presencia del complejo TLR4/MD-2 y/o TLR4 en una muestra. El anticuerpo también se puede usar para intentar unir e interrumpir la señalización relacionada con el complejo TLR4/MD-2.
Las técnicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para una proteína antigénica de la presente divulgación (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778). Además, los métodos pueden adaptarse para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Véase, por ejemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y efectiva de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una proteína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos de un antígeno proteico pueden producirse mediante técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras: (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento de Fab generado por la reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.
La presente divulgación también incluye los fragmentos del complejo Fv, Fab, Fab' y F(ab')2anti-TLR4/MD2 o los fragmentos anti-TLR4, anticuerpos anti-TLR4/MD2 de cadena simple o anti-TLR4, anticuerpos anti-TLR4/MD2 biespecíficos o anticuerpos anti-TLR4 y anticuerpos heteroconjugados anti-TLR4/MD2 o anti-TLR4.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el complejo TLR4/MD2 y/o TLR4 cuando no está complejado con MD-2. El segundo objetivo de unión es cualquier otro antígeno, y ventajosamente es una proteína de la superficie celular o un receptor o subunidad del receptor.
Los métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta generalmente se realiza mediante pasos de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traimecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpoantígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) Se forman "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes. creado en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de aminoácidos con cadenas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando un enlace químico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del arsenito sódico del agente complejante de ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten luego en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte luego en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Además, los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Medicina. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos contra objetivos de tumores de mama humanos.
También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios Vh y Vl de un fragmento se obligan a emparejarse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado sobre otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv). véase, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden unirse a dos epítopos diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno proteico de la presente divulgación. Alternativamente, un brazo antigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fc para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno proteico descrito en este documento y además se une al factor tisular (TF).
También se describen anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (Véase la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (Véase WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la presente divulgación con respecto a la función efectora, para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la señalización de LPS aberrante. Por ejemplo, los residuos de cisteína se pueden introducir en la región Fc, lo que permite la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de la destrucción celular mediada por el complemento y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse para que tenga regiones Fc duales y, por lo tanto, puede tener capacidades mejoradas de lisis y ADCC. (Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
La presente divulgación también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena de la difteria A, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena de la ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, la cadena alfa-sarcina, Aleurites fordii proteínas, proteínas diantinas, Phytolaca americana proteínas (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de la momordica charantia, curcin, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Una variedad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 131 i 131In 90y y 186Re
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales como el N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (como el suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutareldehído), compuestos bis-azido (como el bis-(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados del bisdiazonio (como el bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. (Véase WO94/11026).
Los expertos en la técnica reconocerán que puede acoplarse una gran variedad de posibles unidades estructurales a los anticuerpos resultantes de la presente divulgación. (Véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
El acoplamiento puede realizarse mediante cualquier reacción química que se una a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el otro resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión de afinidad, intercalación, unión de coordenadas y complejación. La unión preferida es, sin embargo, la unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente divulgación, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes. (Véase Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335­ 2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); and Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).
Los enlazadores preferidos se describen en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, Patente de los Estados Unidos No. 5,030,719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida clorhidrato; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat. #21651G); (iv) hexanoato de sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6[3-(2-piridilditio)propianamida] (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); y v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida: Pierce Chem. Co., Cat. #24510) conjugada con EDC.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con propiedades fisicoquímicas diferentes. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de los carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de los carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen NHS-éster son menos solubles que los ésteres sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces debido a que el enlace disulfuro se escinde in vitro, dando como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (como el EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y la Patente de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de los Estados Unidos No 5,013,556.
Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente divulgación pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro.
Uso de anticuerpos contra el complejo TLR4/MD2 y anticuerpos contra TLR4
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la presente divulgación se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, administración, tolerancia y similares mejorados. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, Emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente divulgación, siempre que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul Toxicol Pharmacol. 32(2): 210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J. Pharm Sci.89(8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) y las citas en el mismo para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Las formulaciones terapéuticas de la presente divulgación, que incluyen un anticuerpo monoclonal de la divulgación (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o monoclonal humanizado), se usan para tratar o aliviar un síntoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmunitario. La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o aliviar un síntoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmunitario. Un régimen terapéutico se lleva a cabo mediante la identificación de un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que sufre (o está en riesgo de desarrollar) un trastorno relacionado con el sistema inmunológico, utilizando métodos estándar.
Los anticuerpos de la presente divulgación, que son capaces de inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias inducida por LPS, son herramientas terapéuticas útiles en el tratamiento de trastornos, tales como, por ejemplo, inflamación aguda y sepsis inducida por productos microbianos (por ejemplo, LPS) y exacerbaciones que surgen de esta inflamación aguda, como, por ejemplo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y el asma (Véase O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003)). Tales anticuerpos también son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes neurodegenerativas. (Lehnardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8514-8519 (2003)).
Además, los anticuerpos de la presente divulgación también son útiles como reactivos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo, la osteoartritis, causada por estrés mecánico, que a su vez induce factores de "estrés" solubles endógenos que desencadenan TLR4. El factor de estrés soluble endógeno incluye, por ejemplo, Hsp60 (Véase Ohashi et al., J. Immunol. 164: 558-561 (2000)) y fibronectina (Véase Okamura et al., J. Biol. Chem. 276: 10229­ 10233 (2001) y sulfato de heparán, hialuronano, gp96, p-Defensina-2 o proteína A surfactante A (véase, por ejemplo, Johnson et al., Crit. Rev. Immunol., 23(1-2): 15-44 (2003)). Los anticuerpos de la presente divulgación también son útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos asociados con el estrés mecánico, como, por ejemplo, el estrés mecánico que se asocia con sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación son útiles en el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por ventilador ("VILI"), también denominada lesión pulmonar asociada a la ventilación ("VALI").
Otras áreas de enfermedad en las que la inhibición de la función de TLR4 podría ser beneficiosa incluyen, por ejemplo, inflamación crónica (por ejemplo, inflamación crónica asociada con condiciones alérgicas y asma), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, trastorno inflamatorio del intestino) y aterosclerosis (véase O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003)).
Los síntomas asociados con estos trastornos relacionados con el sistema inmunitario incluyen, por ejemplo, inflamación, fiebre, malestar general, fiebre, dolor, a menudo localizado en el área inflamada, pulso rápido, dolor en las articulaciones o dolores (artralgia), respiración rápida u otros patrones de respiración anormales, escalofríos, confusión, desorientación, agitación, mareos, tos, disnea, infecciones pulmonares, insuficiencia cardíaca, insuficiencia respiratoria, edema, aumento de peso, recaídas mucopurulentas, caquexia, sibilancias, dolor de cabeza y síntomas abdominales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento.
La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el trastorno particular relacionado con el sistema inmunitario. El alivio de uno o más síntomas del trastorno relacionado con el sistema inmunitario indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.
Los métodos para la selección de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoenzimático (ELISA) y otras técnicas mediadas inmunológicamente conocidas en la técnica.
Los anticuerpos dirigidos contra el complejo TLR4/MD-2 o contra TLR4 cuando no están complejados con MD-2 (o un fragmento del mismo) pueden usarse en métodos conocidos dentro de la técnica relacionados con la localización y/o cuantificación de TLR4/MD-2. complejo o TLR4 (por ejemplo, para uso en la medición de niveles del complejo TLR4/MD-2 o TLR4 en muestras fisiológicas apropiadas, para uso en métodos de diagnóstico, para uso en imágenes de la proteína y similares). En un ejemplo dado, los anticuerpos específicos para el complejo TLR4/MD-2, o TLR4, o derivado, fragmento, análogo u homólogo del mismo, que contienen el dominio de unión a antígeno derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo "agentes terapéuticos").
Se puede usar un anticuerpo específico para el complejo TLR4/MD-2 o TLR4 para aislar el complejo TLR4/MD-2 o un polipéptido TLR4 mediante técnicas estándar, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos dirigidos contra el complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 (o un fragmento del mismo) pueden usarse a manera de diagnóstico para controlar los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
Los anticuerpos de la presente divulgación, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados y completamente humanos, pueden usarse como agentes terapéuticos. Dichos agentes generalmente se emplearán para tratar o prevenir una enfermedad o patología asociada con la señalización TLR4 aberrante en un sujeto. Se administra al sujeto una preparación de anticuerpo, preferiblemente una que tiene alta especificidad y alta afinidad por su antígeno diana, y generalmente tendrá un efecto debido a su unión con la diana. La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la función de señalización del objetivo (por ejemplo, el complejo TLR4/MD-2). La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la unión del objetivo (por ejemplo, TLR4) con un ligando endógeno (por ejemplo, TLR4 o la proteína accesoria MD-2) a la que se une naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo se une a la diana y neutraliza la producción de citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente divulgación se refiere en general a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se señaló anteriormente, esta puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno objetivo que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento del objetivo. La cantidad requerida para ser administrada dependerá además de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la velocidad a la que un anticuerpo administrado se agota del volumen libre del otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente divulgación pueden ser, a modo de ejemplo no limitativo, de aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez por semana.
Los anticuerpos que se unen específicamente al complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 o un fragmento del mismo de la presente divulgación se pueden administrar para el tratamiento de trastornos asociados con la señalización de LPS aberrante en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones involucrados en la preparación de tales composiciones, así como una guía en la elección de los componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., Editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en función de las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conservan la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. (Véase, por ejemplo, Marasco et a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o, además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito previsto.
Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato, etilen-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-glicólico degradables como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación se puede usar como un agente para detectar la presencia del complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 (o un fragmento de proteína del mismo) en una muestra. En algunos ejemplos, el anticuerpo contiene una etiqueta detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv o F(ab)2). El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar la marcación directa de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Ejemplos de marcación indirecta incluyen la detección de un anticuerpo primario que usa un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y la marcación final de una sonda de ADN con biotina de tal manera que se puede detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Incluido dentro del uso del término "muestra biológica", por lo tanto, está en la sangre y una fracción o componente de la sangre que incluye suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el método de detección de la presente divulgación se puede usar para detectar un ARNm analítico, una proteína o un ADN genómico en una muestra biológica tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de un ARNm analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína analítica incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de un ADN genómico analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology ", vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Inmunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, 1985. Además, entre las técnicas de detección de una proteína analítica se incluye la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína etiquetado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se pueden detectar mediante técnicas estándar de generación de imágenes.
Polipéptidos quiméricos
Los péptidos quiméricos de la presente divulgación incluyen un primer y segundo dominio unidos operativamente entre sí. El primer dominio incluye al menos una porción de un polipéptido del receptor tipo Toll, mientras que el segundo dominio incluye al menos una porción de una proteína accesoria MD. El primer y segundo dominios pueden aparecer en cualquier orden en el péptido, y el péptido puede incluir uno o más de cada dominio. La proteína quimérica comprende al menos una parte biológicamente activa de un polipéptido del receptor tipo Toll o proteína accesoria MD. El péptido quimérico es soluble. Por soluble se entiende la capacidad de disolverse en un fluido.
Un "polipéptido del receptor tipo Toll" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos una porción de un polipéptido receptor del tipo Toll. Un polipéptido de receptor tipo Toll incluye, por ejemplo, los TLR 1-10 y RP105. El polipéptido del receptor de tipo Toll, y/o los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido del receptor de tipo Toll, se pueden construir utilizando secuencias codificantes del polipéptido del receptor de tipo Toll que se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Números de acceso GenBank; (CAH72620; CAH72619; NP_003254; NP_003255; NP_003259; NP_006059; NP_057646; NP_003256; AAH33651; CAD99157; AAM23001; BAB43955; AAF05316; AAK26744; AAF78037; AAF78036; AAF78035; BAB19259; AAF64061; AAF60188; AAF89753; AAF07823; BAA78631; AAC34135; AAC34134; AAC34133; AAC34137). Dentro de la proteína quimérica, el polipéptido del receptor tipo Toll puede corresponder a la totalidad o una parte de un polipéptido receptor tipo Toll. Preferiblemente, el polipéptido del receptor tipo Toll incluye la porción extracelular del polipéptido.
Una "proteína accesoria MD" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos una porción de una proteína accesoria MD. La proteína MD es, por ejemplo, MD-1 o MD-2. La proteína accesoria MD, y/o los ácidos nucleicos que codifican la proteína accesoria MD, pueden construirse utilizando secuencias codificantes de la proteína accesoria MD que se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Números de acceso de números de acceso de GenBank 095711 (MD-1); AAC98152 (MD-1); Q9Y6Y9 (MD-2); NP_056179 (MD-2); AAH20690 (MD-2); y BAA78717 (MD-2). Las secuencias de proteínas accesorias y ácidos nucleicos de ejemplo de MD se muestran en las Figuras 32A, 32B, 33A y 33B. Dentro de la proteína quimérica, la proteína accesoria MD puede corresponder a toda o una porción de una proteína accesoria MD.
La proteína quimérica se puede unir a una o más unidades estructurales adicionales. Por ejemplo, la proteína quimérica puede unirse adicionalmente a una proteína de fusión GST en la que las secuencias de la proteína de fusión de la glucoproteína Iba se fusionan al extremo C de las secuencias GST (es decir, glutatión S-transferasa). Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la proteína quimérica.
En otro ejemplo, la proteína quimérica incluye una secuencia de señal heteróloga (es decir, una secuencia polipeptídica que no está presente en un polipéptido codificado por un polipéptido de receptor tipo Toll o ácido nucleico de la proteína accesoria MD) en su extremo N-terminal. Por ejemplo, la secuencia de señal del polipéptido del receptor tipo Toll nativo puede eliminarse y reemplazarse con una secuencia de señal de otra proteína. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o la secreción de proteína quimérica puede incrementarse mediante el uso de una secuencia de señal heteróloga.
Una proteína quimérica de la presente divulgación puede producirse mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en el marco de acuerdo con las técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos de extremos romos o escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos, según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligadura enzimática. En otro ejemplo, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden ser recocidos y reamplificados para generar una secuencia de genes quiméricos (Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que codifican un resto de fusión (por ejemplo, una región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica para la glucoproteína Iba en dicho vector de expresión de tal manera que el resto de fusión se enlaza dentro del marco a la proteína de inmunoglobulina.
Dentro de la proteína quimérica, el término "enlazado operativamente" pretende indicar que el primer y segundo polipéptidos están unidos químicamente (más típicamente a través de un enlace covalente como un enlace peptídico) de una manera que permite al menos una función asociada con el receptor tipo Toll polipéptido y proteína accesoria MD. Cuando se usa para referirse a los ácidos nucleicos que codifican la proteína quimérica, el término enlazado operativamente significa que un ácido nucleico que codifica el polipéptido del receptor tipo Toll o la proteína accesoria MD se fusionan entre sí. La proteína accesoria MD puede fusionarse al extremo N o al extremo C del polipéptido receptor tipo Toll. Opcionalmente, el polipéptido receptor tipo Toll y la proteína accesoria MD se unen a través de un brazo espaciador. Los brazos espaciadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre las unidades estructurales conjugadas y, por lo tanto, pueden ayudar a preservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede estar en forma de una unidad estructural polipeptídica que incluye aminoácidos espaciadores, por ejemplo, prolina, serina o glicina. Preferiblemente, el polipéptido del receptor tipo Toll y la proteína accesoria MD se enlazan a través de un enlazador flexible de glicina/serina. Alternativamente, un brazo espaciador puede ser parte del reactivo de reticulación, como en el "SPDP de cadena larga" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, cat. No. 21651 H).
En otros ejemplos, el polipéptido del receptor tipo Toll y la proteína accesoria MD están unidos por acoplamiento químico de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Muchos métodos de reticulación química conocidos son inespecíficos, es decir; no dirigen el punto de acoplamiento a ningún sitio en particular en el polipéptido tipo Toll o la proteína accesoria MD. Como resultado, el uso de agentes de reticulación no específicos puede atacar los sitios funcionales o bloquear estéricamente los sitios activos, haciendo que las proteínas conjugadas sean biológicamente inactivas.
Una forma de aumentar la especificidad de acoplamiento es el acoplamiento químico directo a un grupo funcional encontrado solo una o varias veces en uno o ambos de los polipéptidos que están reticulados. Por ejemplo, en muchas proteínas, la cisteína, que es la única proteína aminoácida que contiene un grupo tiol, se produce solo unas pocas veces. Además, por ejemplo, si un polipéptido no contiene residuos de lisina, un reactivo de reticulación específico para aminas primarias será selectivo para el extremo amino de ese polipéptido. La utilización exitosa de este enfoque para aumentar la especificidad de acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los residuos reactivos en las áreas de la molécula que pueden alterarse sin perder la actividad biológica de la molécula.
Los residuos de cisteína pueden reemplazarse cuando ocurren en partes de una secuencia polipeptídica donde su participación en una reacción de entrecruzamiento probablemente interferiría con la actividad biológica. Cuando se reemplaza un residuo de cisteína, típicamente es deseable minimizar los cambios resultantes en el plegamiento del polipéptido. Los cambios en el plegamiento de polipéptidos se minimizan cuando la sustitución es química y estéricamente similar a la cisteína. Por estas razones, se prefiere la serina como reemplazo de la cisteína. Como se demuestra en los ejemplos a continuación, se puede introducir un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con fines de reticulación. Cuando se introduce un residuo de cisteína, se prefiere la introducción en o cerca del extremo amino o carboxi. Los métodos convencionales están disponibles para tales modificaciones de secuencia de aminoácidos, ya sea que el polipéptido de interés se produzca por síntesis química o expresión de ADN recombinante.
El acoplamiento de los dos constituyentes se puede lograr a través de un agente de acoplamiento o conjugación. Hay varios reactivos de reticulación intermolecular que pueden utilizarse, véase, por ejemplo, Means and Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, págs. 39-43. Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de J-succinimidilo (SPDP) o N,N'-(1,3-fenileno)bismaleimida (los cuales son altamente específicos para los grupos sulfhidrilo y forman enlaces irreversibles); N,N'-etileno-bis-(yodoacetamida) u otro reactivo de este tipo que tenga puentes metileno de 6 a 11 carbonos (que es relativamente específico para los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de entrecruzamiento útiles para este propósito incluyen: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona (que forma enlaces cruzados irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos amino); cloruro de fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilendiisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).
Los reactivos de reticulación pueden ser homobifuncionales, es decir, que tienen dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferido es bismaleimidohexano ("BHM"). BMH contiene dos grupos funcionales maleimida, que reaccionan específicamente con compuestos que contienen sulfhidrilo en condiciones suaves (pH 6.5-7.7). Los dos grupos maleimida están conectados por una cadena de hidrocarburo. Por lo tanto, el BMH es útil para la reticulación irreversible de polipéptidos que contienen residuos de cisteína.
Los reactivos de reticulación también pueden ser heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo, un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que entrecruzarán dos proteínas que tienen aminas libres y tioles, respectivamente. Ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales son 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo ("SMCC"), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster ("MBS") y 4-(p-maleimidofenilo)butirato succinimida ("SMPB"), un análogo de cadena extendida de MBS. El grupo succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria, y la maleimida reactiva con tiol forma un enlace covalente con el tiol de un residuo de cisteína.
Los reactivos de reticulación a menudo tienen baja solubilidad en agua. Se puede añadir un resto hidrófilo, como un grupo sulfonato, al reactivo de reticulación para mejorar su solubilidad en agua. Sulfo-MBS y sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación modificados para la solubilidad en agua.
Muchos reactivos de reticulación producen un conjugado que es esencialmente no escindible en condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación contienen un enlace covalente, como un disulfuro, que es escindible en condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, el ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP") y el 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo ("SPDP") son bien conocidos reticulantes escindibles. El uso de un reactivo de reticulación escindible permite que el resto de carga se separe del polipéptido de transporte después de su entrega en la célula diana. El enlace disulfuro directo también puede ser útil.
Numerosos reactivos de reticulación, incluidos los mencionados anteriormente, están disponibles comercialmente. Las instrucciones detalladas para su uso están disponibles en los proveedores comerciales. Una referencia general sobre la reticulación de proteínas y la preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991).
También se incluyen en la presente divulgación los derivados, fragmentos, homólogos, análogos y variantes de los péptidos quiméricos y ácidos nucleicos que codifican estos péptidos. Para los ácidos nucleicos, los derivados, fragmentos y análogos proporcionados en este documento se definen como secuencias de al menos 6 ácidos nucleicos (contiguos), y que tienen una longitud suficiente para permitir la hibridación específica. Para los aminoácidos, los derivados, fragmentos y análogos proporcionados en este documento se definen como secuencias de al menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir el reconocimiento específico de un epítopo.
La longitud de los fragmentos es menor que la longitud del correspondiente ácido nucleico o polipéptido de longitud completa del cual se deriva el péptido quimérico, o ácido nucleico que codifica el mismo. Los derivados y los análogos pueden ser de longitud completa o diferente a la longitud completa, si el derivado o análogo contiene un ácido nucleico o aminoácido modificado. Los derivados o análogos de los péptidos quiméricos incluyen, por ejemplo, moléculas que incluyen regiones que son sustancialmente homólogas a los péptidos, en varios ejemplos, en al menos aproximadamente 30%, 50%, 70%, 80%, o 95%, 98%, o incluso el 99% de identidad sobre una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se compara con una secuencia alineada en la que la alineación se realiza mediante un programa de homología por computadora conocido en la técnica. Por ejemplo, la identidad de la secuencia se puede medir utilizando el software de análisis de secuencia (Paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), con los parámetros predeterminados en él.
Cuando se dice que un polipéptido particular tiene un porcentaje específico de identidad con un polipéptido de referencia de una longitud definida, el porcentaje de identidad es relativo al péptido de referencia. Por lo tanto, un péptido que es idéntico en un 50% a un polipéptido de referencia que tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos del polipéptido de referencia. También podría ser un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud, que es idéntico en un 50% al polipéptido de referencia en toda su longitud. Por supuesto, otros polipéptidos cumplirán los mismos criterios.
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos o polipéptidos quiméricos solubles de la presente divulgación (también denominados en el presente documento como "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Dichas composiciones comprenden típicamente el anticuerpo o polipéptido quimérico soluble y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en este campo. Ejemplos preferidos de tales vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y 5% de albúmina de suero humano. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Los compuestos activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la presente divulgación se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una capacidad de jeringación fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada y filtrada del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un portador fluido para usar como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se agita y expectora o traga. Agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esteroides; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal.
En un ejemplo, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Aiza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la presente divulgación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes a la técnica de composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de los individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.
Métodos de selección
La presente divulgación proporciona métodos (también denominados en el presente documento como "ensayos de selección") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que modulan o interfieren de otro modo con la unión de TLR4 a la proteína accesoria MD-2, o compuestos o agentes de prueba o candidatos que modulan o interfieren con la función de señalización de TLR4 y/o el complejo TLR4/MD-2. También se proporcionan métodos para identificar compuestos útiles para tratar trastornos asociados con la señalización de LPS aberrante. La presente divulgación también incluye compuestos identificados en los ensayos de cribado descritos en el presente documento.
En un ejemplo, se proporcionan ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de prueba que modulan la función de señalización del complejo TLR4/MD-2 y/o la interacción entre TLR4 y MD-2. Los compuestos de ensayo de la presente divulgación se pueden obtener usando cualquiera de las numerosas metodologías en métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida o de fase de solución paralelas espacialmente direccionables métodos de biblioteca sintética que requieren la desconvolución; el método de biblioteca de"una perla un compuesto"; y métodos de bibliotecas sintéticas que utilizan la selección por cromatografía de afinidad. La metodología de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro metodologías son aplicables a las bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no péptidos o moléculas pequeñas. (Véase, por ejemplo, Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145).
Una "molécula pequeña", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y lo más preferiblemente de menos de aproximadamente 4 kD. Las moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos de hongos, bacterias o algas, son conocidas en la técnica y pueden analizarse con cualquiera de los ensayos de la presente divulgación.
En la técnica se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo, en: DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (Véase, por ejemplo, Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Véase Lam, 1991. Nature 354: 82-84), en chips (Véase Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bacterias (Véase Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409), esporas (Véase Patente de los Estados Unidos No.
5,233,409), plásmidos (Véase Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) o en fagos (véase Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378- 6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; y Patente de los Estados Unidos No. 5,233,409).
En un ejemplo, un compuesto candidato se introduce en un complejo antígeno-anticuerpo y determina si el compuesto candidato rompe el complejo antígeno-anticuerpo, en donde una interrupción de este complejo indica que el compuesto candidato modula la función de señalización del TLR4/MD-2 complejo y/o la interacción entre TLR4 y MD-2. Por ejemplo, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal mu18H10, hu18H10 y el antígeno es el complejo TLR4/MD-2. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal es 16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3 o hu7E3 y el antígeno es el complejo TLR4/MD-2 o TLR4.
En otro ejemplo, se proporciona un complejo TLR4/MD-2 y se expone a al menos un anticuerpo monoclonal neutralizante. Se detecta la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, y se introducen uno o más compuestos candidatos en el complejo. Si el complejo anticuerpo-antígeno se rompe después de la introducción de uno o más compuestos candidatos, los compuestos candidatos son útiles para tratar trastornos asociados con la señalización de LPS aberrante.
En otro ejemplo, se proporciona una proteína quimérica soluble de la presente divulgación y se expone a al menos un anticuerpo monoclonal neutralizante. Se detecta la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, y se introducen uno o más compuestos candidatos en el complejo. Si el complejo anticuerpo-antígeno se rompe después de la introducción de uno o más compuestos candidatos, los compuestos candidatos son útiles para tratar trastornos asociados con la señalización de LPS aberrante.
La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interferir o interrumpir el complejo antígeno-anticuerpo se puede lograr, por ejemplo, mediante el acoplamiento del compuesto de prueba con un radioisótopo o un marcador enzimático tal que la unión del compuesto de prueba al antígeno o la porción biológicamente activa del mismo puede determinarse detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden marcarse con 125I, 35S, 14C o 3H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo puede detectarse mediante el recuento directo de la radioemisión o el recuento por centelleo. Alternativamente, los compuestos de ensayo pueden marcarse enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca enzimática detectada mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.
En un ejemplo, el ensayo comprende poner en contacto un complejo anticuerpo-antígeno con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con el antígeno o interrumpir el complejo de anticuerpo-antígeno existente. En este ejemplo, determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con el antígeno y/o interrumpir el complejo anticuerpo-antígeno comprende determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferentemente al antígeno o una parte biológicamente activa del mismo, en comparación con el anticuerpo
En otro ejemplo, el ensayo comprende poner en contacto un complejo anticuerpo-antígeno con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular el complejo anticuerpo-antígeno. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular el complejo antígeno-anticuerpo se puede lograr, por ejemplo, determinando la capacidad del antígeno para unirse o interactuar con el anticuerpo, en presencia del compuesto de prueba.
Los expertos en la técnica reconocerán que, en cualquiera de los métodos de selección descritos en el presente documento, el anticuerpo puede ser un anticuerpo neutralizante, como el anticuerpo monoclonal hu18H10, hu15C1 y/o hu7E3, cada uno de los cuales modula o de otra manera interfiere con el LPS. Producción de citoquinas proinflamatorias inducidas.
Los métodos de selección descritos en el presente documento pueden realizarse como un ensayo basado en células o como un ensayo libre de células. Los ensayos sin células de la presente divulgación son susceptibles de uso de la forma soluble o la forma unida a la membrana de TLR4 y/o TLR4 cuando se complejan con MD-2, y fragmentos de los mismos. En el caso de ensayos libres de células que comprenden las formas unidas a la membrana de TLR4 y/o el complejo TLR4/MD-2, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante tal que la forma unida a la membrana de las proteínas se mantenga en solución. Ejemplos de dichos agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como noctilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltosida, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton®X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecipoli(etilenglicol éter)n, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-I-propano sulfonato, 3-(3-colamidopropilo) dimetilamminiol-1-propano sulfonato (CHAPS), o sulfonato de 3-(3-colamidopropilo)dimetilaminiol-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO).
En más de un ejemplo, puede ser deseable inmovilizar el anticuerpo o el antígeno para facilitar la separación de formas complejas de uno o ambos después de la introducción del compuesto candidato, así como para adaptar la automatización del ensayo. La observación del complejo antígeno-anticuerpo en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede realizar en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En un ejemplo, se puede proporcionar una proteína de fusión que agrega un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión GST-anticuerpo o las proteínas de fusión GST-antígeno se pueden adsorber en glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivadas de glutatión, que luego se combinan con el compuesto de prueba, y la mezcla es incubado en condiciones propicias para la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación, las perlas o los pozos de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente no unido, la matriz inmovilizada en el caso de las perlas, el complejo se determina directa o indirectamente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y el nivel de formación de complejos antígeno-anticuerpo puede determinarse utilizando técnicas estándar.
También se pueden usar otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices en los ensayos de selección de la presente divulgación. Por ejemplo, el anticuerpo (por ejemplo, hu18H10, hu15C1 y/o hu7E3) o el antígeno (por ejemplo, el complejo TLR4/MD-2 y/o una proteína TLR4) pueden inmovilizarse utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas de anticuerpo o antígeno biotiniladas se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III), e inmovilizadas en los pozos de estreptavidina. Placas recubiertas de 96 pozos (Pierce Chemical). Alternativamente, otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antígeno de interés, pero que no interfieren con la formación del complejo anticuerpo-antígeno de interés, pueden derivarse a los pozos de la placa, y el anticuerpo no unido o antígeno atrapado en los pozos por conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos usando tales otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antígeno.
La presente divulgación se refiere además a nuevos agentes identificados por cualquiera de los ensayos de cribado mencionados anteriormente y usos de los mismos para tratamientos como se describe en el presente documento.
Ensayos de diagnostico
Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden detectar mediante ensayos apropiados, por ejemplo, tipos convencionales de inmunoensayos. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo en sándwich en donde el complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 o un fragmento del mismo se fija a una fase sólida. La incubación se mantiene durante un período de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo en la muestra se una al polipéptido inmovilizado en la fase sólida. Después de esta primera incubación, la fase sólida se separa de la muestra. La fase sólida se lava para eliminar los materiales no unidos y las sustancias interferentes, como las proteínas no específicas, que también pueden estar presentes en la muestra. La fase sólida que contiene el anticuerpo de interés (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal hu18H10, hu15C1 y/o hu7E3) unido al polipéptido inmovilizado se incuba posteriormente con un segundo anticuerpo marcado o un anticuerpo unido a un agente de acoplamiento tal como biotina o avidina. Este segundo anticuerpo puede ser otro anticuerpo complejo anti-TLR4/MD-2, otro anticuerpo anti-TLR4 u otro anticuerpo. Las etiquetas para los anticuerpos son bien conocidas en la técnica e incluyen radionúclidos, enzimas (por ejemplo, maleato deshidrogenasa, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, catalasa), fluores (isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficocianina, fluorescina), biotina y similares. Los anticuerpos marcados se incuban con el sólido y se mide la etiqueta unida a la fase sólida. Estos y otros inmunoensayos pueden realizarse fácilmente por los expertos en la técnica.
Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia del complejo TLR4/MD-2 o una proteína TLR4 en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo monoclonal marcado de acuerdo con la presente divulgación. que la presencia del complejo TLR4/MD-2 o TLR4 se detecta en la muestra biológica.
Como se usa en este documento, el término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, como, así como el etiquetado indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Ejemplos de marcación indirecta incluyen la detección de un anticuerpo primario que usa un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina de tal manera que se puede detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el método de detección de la presente divulgación se puede usar para detectar el complejo TLR4/MD-2 o TLR4 en una muestra biológica tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección del complejo TLR4/MD-2 o TLR4 incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Además, las técnicas in vivo para la detección del complejo TLR4/MD-2 o TLR4 incluyen la introducción en un sujeto de un complejo anti-TLR4/MD-2 marcado o un anticuerpo anti-TLR4. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se pueden detectar mediante técnicas de imagen estándar.
En un ejemplo, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de prueba. Una muestra biológica preferida es una muestra de leucocitos de sangre periférica aislada por medios convencionales de un sujeto.
La presente divulgación también abarca kits para detectar la presencia de complejos TLR4/MD-2 o TLR4 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender: un compuesto o agente marcado capaz de detectar el complejo TLR4/MD-2 o TLR4, cuando no está complejado con MD-2, (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TLR4/MD-2 complejo o un anti-TLR4 anticuerpo monoclonal) en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de complejo TLR4/MD-2 o TLR4 en la muestra; y medios para comparar la cantidad de complejo TLR4/MD-2 o TLR4 en la muestra con un estándar. El compuesto o agente puede envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones para usar el kit para detectar el complejo TLR4/MD-2 o TLR4 en una muestra.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y métodos para la generación de anticuerpo monoclonal murino 18H10
A. Generación de transfectantes TLR4/MD-2 estables
Se generaron transfectantes de TLR4/MD-2 estables en células CHO-K1 y HEK 293. Para las células CHO-K1, se clonó el ADNc de TLR4 humano que codifica una etiqueta del epítopo c-myc N-terminal en pADNC3.1(-)higro (Invitrogen), y el ADNc de MD-2 humano que codifica el c-Myc C-terminal y el epítopo de proteína C las etiquetas se clonaron en pADNC3 (Invitrogen). Ambas construcciones se cotransfectaron en células CHO utilizando el reactivo Fugene 6 ™ (Roche), de acuerdo con las pautas del fabricante. Se seleccionaron células resistentes a los antibióticos en medio de cultivo que contenía 500 pg/ml de G418 y 250 pg/ml de higromicina B (ambas de Invitrogen).
Para seleccionar las células que expresan el complejo TLR4/MD-2, se incubaron 1x 107 células/ml en 1x PBS suplementado con BSA al 1% y 10 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-proteína C (Roche). Las células se lavaron una vez y luego se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con PE (dilución 1:200; Anwara). Las células se incubaron posteriormente con microperlas anti-PE (Miltenyi Biotec) y se pasaron a través de una columna Midi MACS LS. Las células retenidas en la columna se eluyeron y se pusieron de nuevo en cultivo con selección de antibióticos. Las rondas de clasificación continuaron hasta que se obtuvo una población de células uniformemente positiva que expresaba el complejo TLR4/MD-2.
B. Generación de MD-2 recombinante y proteína quimérica TLR4/MD-2
Para generar MD-2 soluble recombinante, se clonó en pFASTBACI el ADNc que codifica la proteína C FLAG y 6 X HIS para fines de detección y purificación, y posteriormente se insertó en el ADN del bacmid por recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 fueron sobreinfectadas. 48 horas más tarde, la proteína recombinante se purificó a partir de sobrenadantes de células infectadas utilizando una matriz de afinidad de NiNTA (Qiagen).
Para generar la proteína quimérica TLR4/MD-2 recombinante, se ensambla el ADNc que codifica la porción extracelular de TLR4 humano unido a MD-2 a través de un enlazador de serina de glicina (GGGGS3) utilizando PCR. Las etiquetas FLAG y 6 xHIS se incluyeron en el extremo C de MD-2 para fines de detección y purificación. El casete de ADNc se clonó en el vector de expresión de baculovirus pFASTBACI (Invitrogen) y posteriormente se insertó en el ADN de bacmid mediante recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 fueron sobreinfectadas.
48 horas más tarde, la proteína de fusión recombinante se purificó a partir de lisados celulares utilizando una matriz de afinidad de MAb anti-FLAG™ M2 (Sigma).
C. Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas (IFFA CREDO) con una inyección subcutánea (s.c.) de 106 células CHO/ml en adyuvante RIBI (Sigma) en los días 0, 7 y 28 como se describió anteriormente en Buell et al., Blood 92: 3521­ 3528 (1998).
D. Titulaciones séricas específicas.
Los ratones se sangraron en los días 0 y 14. Se evaluaron títulos de anticuerpos específicos de TLR4/MD-2 en los sueros mediante análisis FACS en células 293 transfectadas con TLR4/MD-2. Las células se incubaron con sueros de ratones a diluciones 1:250, 1:2500 y 1:25000, se lavaron, se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con APC (H+L) (Molecular Probes) y se analizaron en un FACScalibur (Becton Dickenson) en el canal FL-4
E. Fusiones de células B/mieloma
Los ratones que tenían anticuerpos séricos TLR4/MD-2 específicos se "hiperimpulsaron" por vía subcutánea (s.c.) con la proteína de fusión quimérica TLR4/MD-2 ya sea 3 o 4 días antes de la fusión. Los nódulos linfáticos drenantes se obtuvieron como una fuente de células B para la fusión con la línea celular de mieloma de ratón P3-X63-Ag8.653. La extracción de células B y las fusiones celulares se realizaron como se describe previamente en Buell et al., Blood 92: 3521-3528 (1998). Las células se colocaron en placas a una concentración aproximada de 104 células de mieloma/pozo y se cultivaron durante 10-14 días en medio de cultivo suplementado con HAT (Sigma).
F. Detección de hibridomas
Los sobrenadantes de los pozos que contienen células de hibridoma viables se examinaron en células transfectadas simuladas frente a células de mieloma transfectadas con TLR4/MD-2 para determinar la especificidad de TLR4/MD-2 mediante análisis FACS. Las células se incubaron luego con sobrenadante y anticuerpo IgG (H+L) anti ratón de cabra (Molecular Probes). Las células se analizaron en un FACScalibur en el canal FL-4.
G. Especificidad de anticuerpos monoclonales por FACS
Se sembraron células HEK 293 en placas de 6 pozos a una densidad de 2.5 x 105 células/pozo en 2 ml de medio de cultivo que contenía FBS al 10%. 16 horas después de la siembra, las células se transfectaron con 0.75 pg del vector o los vectores apropiados utilizando el reactivo Fugene™ (Roche) de acuerdo con las pautas del fabricante. 48 horas después de la transfección, las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal apropiado (como se indica en la Figura 4) y un anticuerpo de cabra anti-ratón IgG (H+L) acoplado a APC (Molecular Probes) y se analizaron utilizando el FACScalibur en el canal FL-4.
H. Especificidad de anticuerpos monoclonales por ELISA directo.
El MD-2 soluble recombinante con FLAG C terminal y las etiquetas del epítopo de histidina se recubrió a una concentración de 5 |jg/ml en 50 j l de PBS en placas ELISA (Nunc Maxisorp). Los pozos se bloquearon con 200 j l de PBS al 2% de BSA y posteriormente se incubaron con el MAb apropiado a la concentración indicada en PBS al 1% de BSA. Después de 3 pasos de lavado con PBS al 0.05% de Tween 20, se añadieron a los pozos 50 j l de IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP a una dilución de 1:5000. Después de una etapa de lavado adicional, la unión se reveló utilizando un sustrato TMB. Las placas se leyeron a una longitud de onda de 650 nm.
I. Especificidad de anticuerpos monoclonales por sándwich ELISA.
Para la preparación de la muestra, se transfectaron células HEK 293 con las construcciones de plásmidos apropiadas utilizando el reactivo de transfección Fugene 6 ™ como se describe en el párrafo G anterior. 48 horas después de la transfección, las células se recogieron y se eliminaron por centrifugación. Las células se incubaron posteriormente con mu18H10 biotinilado (10 jig/ml) y se lisaron en Tris 20 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, NP40 al 1% que contenía inhibidores de la proteasa COMPLETE™ (Roche).
Para realizar el ELISA sándwich, los pozos de la placa Nunc maxisorp se recubrieron con 50 j l de MAb anti-FLAG™ M2 (Sigma) a una concentración de 5 jig/ml en PBS. Los pozos se bloquearon con 200 j l de PBS al 2% de BSA y posteriormente se incubaron con 50 j l de las muestras apropiadas a la dilución indicada. Los pozos se lavaron tres veces con 200 j l de PBS al 0.05% de Tween 20 y se incubaron con 50 j l del anticuerpo apropiado (10 jg/m l para mu18H10 y 12D4 biotinilados, 1 jg/m l para el MAb policlonal anti-MD-2). Después de una etapa de lavado como la anterior, los pozos se incubaron con 50 j l del anticuerpo de detección apropiado (estreptavidina conjugada con HRP a una dilución de 1:1500 para los MAbs biotinilados y la IgG anti-conejo conjugada con HRP (H+L) a una dilución de 1:5000 para el Ab policlonal de conejo). Después de una etapa de lavado adicional, la unión se reveló utilizando un sustrato TMB. Las placas se leyeron a una longitud de onda de 650 nm.
J. Ensayo celular 1
El anticuerpo monoclonal se purificó por primera vez a partir de sobrenadante de células de hibridoma usando cromatografía de afinidad con proteína G.
Se sembraron células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 en medio de cultivo que contenía FBS al 10% a 5 x 105 células/ml en placas de 96 pozos y se dejaron adherir durante la noche. El medio de cultivo se eliminó posteriormente y se reemplazó con 100 j l de medio de cultivo que contenía FBS al 2% y el anticuerpo monoclonal apropiado al doble de la concentración final deseada durante 30 minutos a 37°C. Luego se añadió LPS (K12LD25, Sigma) a las células a una concentración de 30 ng/ml en 100 j l de medio de cultivo que contenía FBS al 2%. Las células se incubaron a 37°C durante 16 horas y se recogieron los sobrenadantes. El contenido de IL- 8 se midió mediante ELISA tipo sándwich utilizando el par de anticuerpos monoclonales 801E y M802B (Endogen).
K. Ensayo celular 2
La sangre entera humana se diluyó 1:4 en RPMI (Sigma) y se sembró en placa a 100 jl/pozo en placas de 96 pozos con el anticuerpo monoclonal apropiado al doble de la concentración final deseada durante 30 minutos a 37°C. El LPS (K12LD25, Sigma), dosificado al doble de la concentración final deseada, se añadió posteriormente en 100 j l de RPMI que contenía 5 mg/ml de HSA y se incubó durante 6 horas a 37°C. Las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos y se retuvo el sobrenadante de cada pozo. Las concentraciones de IL- 8 se determinaron mediante ELISA tipo sándwich utilizando el par de anticuerpos monoclonales 801E y M802B (Endogen), como se describió anteriormente.
L. 18H10 secuencias VH y VL
Se recogieron 107 células de hibridoma y se lavaron una vez con PBS antes de resuspenderse en 1 ml de reactivo Trizol™ (Invitrogen). Posteriormente, se extrajo el ARN total de acuerdo con las directrices del fabricante. El ADNc que codifica el VH y el VL a partir de tres subclones independientes del hibridoma mu18H10 se generó mediante RT-PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para secuencias líder de ratón y dominios constantes (Jones and Bendig, Biotechnology, 9: 88-89 (1991)). Los productos amplificados se clonaron en el vector fácil pGEM-T (Promega Corp.) y se secuenciaron utilizando los cebadores T7 y SP6.
Los ADNc de VH y VL se clonaron posteriormente en vectores de expresión de mamíferos que contenían las regiones constantes kappa de IgG1 humana y humana respectivamente para expresar 7E3 como un MAb quimérico ("7E3 quimérico"). Para producir MAb quimérico recombinante, las células HEK 293 se colocaron en placas de 6 pozos a una densidad de 2.5 x 105 células/pozo en 2 ml de medio de cultivo que contenía FBS al 10%. 16 horas después de la siembra, las células se transfectaron con 0.75 jg del vector o los vectores apropiados utilizando el reactivo Fugene™ (Roche) de acuerdo con las pautas del fabricante. 48 horas después de la transfección, el sobrenadante se recogió y el anticuerpo se purificó utilizando cromatografía de afinidad con proteína G.
Ejemplo 2: Generación de MAb mu18H10 dirigidos contra el complejo TLR4/MD-2 humano
Los ratones inmunizados con células CHO que expresan TLR4/MD-2 de superficie se monitorizaron para determinar títulos de suero específicos. Aquellos que mostraron una respuesta a TLR4/MD-2 fueron "hiperimpulsados" con la proteína quimérica TLR4/MD-2 recombinante. Esta estrategia se eligió para garantizar que el sistema inmunitario se expusiera inicialmente a un complejo conformacional TLR4/MD-2 y minimizar la respuesta a antígenos celulares CHO no específicos y, al mismo tiempo, maximizar la respuesta específica de TLR4/MD-2 al hiperbolar. La selección por FACS de sobrenadantes de hibridomas resultantes de fusiones de células B/mieloma se realizó en células CHO transfectadas simuladas frente a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2. El anticuerpo monoclonal de un clon particular, denominado en este documento mu18H10, demostró la unión específica a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 (Figura 1). Se encontró que este anticuerpo tenía el isotipo IgG2b k, según lo determinado por FACS utilizando el kit de CBA de isotipado de Ig de ratón (Beckton Dickenson).
Ejemplo 3: mu18H10 MAb Neutralización de la actividad de LPS en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2
Se sabe que el LPS tiene la capacidad de inducir la producción de IL- 8 en células HEK 293 transfectadas con el complejo TLR4/MD-2. La capacidad de mu18H10 para inhibir esta inducción de IL- 8 se analizó preincubando células con el anticuerpo durante 30 minutos antes de la administración de LPS. La Figura 2 muestra que el mu18H10 inhibió los efectos del LPS en las células HEK 293, incluso en concentraciones por debajo de 1 pg/ml.
Ejemplo 4: Neutralización con mu18H10 MAb de la actividad de LPS en sangre entera humana
Se probó la capacidad de mu18H10 para inhibir la producción de IL- 8 inducida por LPS en sangre completa humana. La actividad neutralizante de mu18H10 se probó en sangre de 3 donantes diferentes utilizando un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales de 0.5 a 10 pg/ml. La Figura 3 demuestra que mu18H10 redujo significativamente el nivel de IL- 8 inducida por LPS en los 3 donantes, en comparación con un control de isotipo coincidente. Se encontró que el mu18H10 es más potente que un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-TLR4 descrito anteriormente (adquirido de ebiosciences). Estos resultados indican que el epítopo neutralizante reconocido por mu18H10 en células HEK 293 transfectadas también se expone en la superficie de las células en sangre total, y que mu18H10 es lo suficientemente potente como para inhibir la actividad del LPS en sangre total, incluso en concentraciones por debajo de 1 pg/ml.
Ejemplo 5: Especificidad mu18H10
Para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal mu18H10, se explotó el hecho de que mu18H10 no reconoce al ortólogo de conejo del complejo TLR4/MD-2 (previamente clonado). Se transfectaron ADNc para TLR4 humano o de conejo con etiqueta del epítopo FLAG™ N-terminal y MD-2 humano o de conejo con etiquetas del epítopo C-Myc y proteína C del terminal C en células HEK 293 en las siguientes combinaciones: (1) humano TLR4 y MD-2 humano; (2) conejo TLR4 y conejo MD-2; (3) TLR4 humano y MD-2 de conejo; (4) conejo TLR4 y MD-2 humano. La Figura 4 muestra el análisis de FACS de estas células después de la tinción de anticuerpos, que reveló que mu18H10 reconoció las células que expresaban el complejo TLR4/MD-2 humano y una combinación de TLR4 humano y MD-2 de conejo, pero no el complejo TLR4/MD-2 de conejo ni una combinación de de TLR4conejo y MD-2 humano. Estos resultados indican que el epítopo reconocido por mu18H10 está situado en MD-2 humano (Figura 4).
Aunque mu18H10 muestra especificidad por MD-2, se determinó que mu18H10 solo reconoce MD-2 en el contexto de su interacción con TLR4. Usando ELISA directo, no se detectó unión de mu18H10 a MD-2 soluble recombinante generado con el sistema de expresión de baculovirus (Figura 5a). Además, la figura 5b revela que mu18H10 solo se unió a un complejo de TLR4 y MD-2 como se muestra a partir de lisados celulares cotransfectados, y no reconoció MD-2 solo en lisados/sobrenadantes celulares transfectados o TLR4 solo en lisados celulares transfectados. Estos datos indican que mu18H10 es específico para el complejo TLR4/MD-2 y no reconoce ninguno de los componentes del complejo por separado.
Ejemplo 6 : Secuencias mu18H10 VH y VL
Las secuencias VH y VL del clon del hibridoma mu18H10 se amplificaron a partir del ARN total mediante RT-PCR. El análisis de secuencia se muestra en las Figuras 6 A-6 F.
El anticuerpo mu18H10 incluye una región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2, Figura 6 B) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 que se muestra en la Figura 6 A, y una región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 7, Figura 6 E) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6 que se muestra en la Figura 6 D. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 se destacan en texto subrayado y en cursiva en las Figuras 6 B y 6 E y se muestran en las Figuras 6 C y 6 F. (Véase Chothia, C, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office. (1991)). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo mu18H10 tienen las siguientes secuencias: DSYIH (SEQ ID NO: 3); WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID NO: 4) y GYNGVYYAMDY (SEQ ID NO: 5). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo mu18H10 tienen las siguientes secuencias: SASSSVIYMH (SEQ ID NO: 8 ); RTYNLAS (SEQ ID NO: 9); y HQWSSFPYT (SEQ ID NO: 10).
Ejemplo 7: 18H10 quimérico se une a hTLR4 hMD2 células CHO transfectadas
Con el fin de demostrar la especificidad de 18H10 VH y VL clonados para el complejo hTLR4/MD-2, se realizó un análisis de FACS en células CHO transfectadas con hTLR4/MD-2 utilizando el MAb quimérico 18H10 (Figura 6 ). La unión específica de MAb a la concentración indicada se detectó utilizando un anticuerpo secundario IgG (H+L) de cabra anti­ humano marcado con APC. Como control se usó un MAb IgG1 humano irrelevante con el mismo isotipo emparejado. Ejemplo 8 : 18H10 quimérico inhibe la producción de IL- 8 inducida por LPS en hTLR4 hMD2 células HEK 293 transfectadas Con el fin de demostrar la capacidad neutralizadora de 18H10 VH y VL clonados para LPS, se probó la capacidad de 18H10 para inhibir la inducción de IL- 8 dependiente de LPS de células HEK 293 transfectadas con hTLR4/MD-2 (como se describe anteriormente). La Figura 7 muestra que el 18H10 quimérico inhibió los efectos del LPS en las células HEK 293 de una manera muy similar a la del MAb original del ratón 18H10.
Ejemplo 9: Materiales y métodos para la generación de anticuerpo monoclonal mu16G7
A. Generación de transfectantes TLR4/MD-2 estables
Se generaron transfectantes de TLR4/MD-2 estables en células CHO-K1 y HEK 293. Para las células CHO-K1, se clonó el ADNc de TLR4 humano que codifica una etiqueta del epítopo c-myc N-terminal en pADNC3.1(-)higro (Invitrogen), y el ADNc de MD-2 humano que codifica las etiquetas de c-Myc C-terminal y el epítopo de proteína C, se clonaron en pADNC3 (Invitrogen). Ambos constructos se cotransfectaron en células CHO utilizando el reactivo Fugene 6 ™ (Roche), de acuerdo con las pautas del fabricante. Las células resistentes a los antibióticos se seleccionaron en medio de cultivo que contenía 500 |jg/ml de G418 y 250 jg/m l de higromicina B (ambas de Invitrogen).
Para las células HEK 293, el ADNc de TLR4 humano que codifica una etiqueta del epítopo FLAG™ N-terminal se clonó en pADNC3.1(-)higro (Invitrogen), y el ADNc MD-2 humano que codifica FLAG™ C-terminal y 6 x etiquetas de epítopo d histidina se clonaron en pADNC3 (Invitrogen). Ambos constructos se transfectaron en células HEK 293 y se seleccionaron células resistentes a los antibióticos en un medio de cultivo que contenía 500 jg/m l de G418 y 250 jg/m l de higromicina B (ambas de Invitrogen), como se describió anteriormente.
Para seleccionar las células que expresan el complejo TLR4/MD-2, se incubaron 1x 107 células/ml en 1x PBS suplementado con BSA al 1% y 10 jg/m l de anticuerpo monoclonal anti-proteína C (para células CHO; Roche) o anticuerpo monoclonal anti-FLAG (para células 293; Sigma). Las células se lavaron una vez y luego se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con PE (dilución 1:200; Anwara). Las células se incubaron posteriormente con microperlas anti-PE (Miltenyi Biotec) y se pasaron a través de una columna Midi MACS LS. Las células retenidas en la columna se eluyeron y se pusieron de nuevo en cultivo con selección de antibióticos. Las rondas de clasificación continuaron hasta que se obtuvo una población de células uniformemente positiva que expresaba el complejo TLR4/MD-2.
B. Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas (IFFA CREDO) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección C.
C. Titulaciones específicas en suero
Las titulaciones de sueros de ratones se realizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección D. D. Fusiones de células B/mieloma
Los ratones que tenían anticuerpos séricos TLR4/MD-2 específicos fueron "hiperimpulsados" por vía subcutánea (s.c.) con HER 293 transfectado con TLR4/MD-2 3 o 4 días antes de la fusión. Los nódulos linfáticos drenantes se obtuvieron como una fuente de células B para la fusión con la línea celular de mieloma de ratón P3-X63-Ag8.653. La extracción de células B y las fusiones celulares se realizaron como se describe previamente en Buell et al., Blood 92: 3521-3528 (1998). Las células se colocaron en placas a una concentración aproximada de 104 células de mieloma/pozo y se cultivaron durante 10-14 días en medio de cultivo suplementado con HAT (Sigma).
E. Cribado de hibridomas
Los hibridomas se seleccionaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección F.
F. Especificidad de anticuerpos monoclonales.
La especificidad del anticuerpo monoclonal mu16G7 se determinó como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, subsección G.
G. Ensayo celular 1
El ensayo celular I se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección J.
H. Ensayo celular 2
El ensayo celular II se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección K.
I. Secuencias 16G7 VH y VL
Se recogieron 107 células de hibridoma y se lavaron una vez con PBS antes de resuspenderse en 1 ml de reactivo Trizol™ (Invitrogen). Posteriormente, se extrajo el ARN total de acuerdo con las directrices del fabricante. El ADNc que codifica el VH y el VL del clon mu16G7 se generó mediante RT-PCR con el módulo ScFv de ratón (Amersham Biosciences) de acuerdo con las pautas del fabricante. Los productos amplificados se clonaron en el vector fácil pGEM-T (Promega Corp.) y se secuenciaron utilizando los cebadores T7 y SP6.
Ejemplo 10: Generación de MAb mu16G7 dirigidos contra el complejo humano TLR4/MD-2
Los ratones inmunizados con células CHO que expresan TLR4/MD-2 de superficie se monitorizaron para determinar los títulos séricos específicos. Aquellos que mostraron una respuesta a TLR4/MD-2 fueron "hiperimpulsados" con transfectantes HEK 293 TLR4/MD-2. Esta estrategia se eligió para minimizar la respuesta a antígenos celulares CHO no específicos, mientras que al mismo tiempo maximiza la respuesta específica de TLR4/MD-2. La selección por FACS de sobrenadantes de hibridomas resultantes de fusiones de células B/mieloma se realizó en células CHO transfectadas simuladas frente a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2. El anticuerpo monoclonal de un clon específico, denominado aquí como mu16G7, demostró la unión específica a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 (Figura 9). Se encontró que mu16G7 tiene el isotipo IgG1 k, según lo determinado por FACS utilizando el kit de CBA de isotipado de Ig de ratón (Beckton Dickenson).
Ejemplo 11: Neutralización pormu16G7 de la actividad de LPS en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 Se sabe que la LPS tiene capacidad para inducir la producción de IL- 8 en células HEK 293 transfectadas con el complejo TLR4/MD-2. La capacidad de mu16G7 para inhibir esta inducción de IL- 8 se analizó preincubando células con cada anticuerpo durante 30 minutos antes de la administración de LPS. La Figura 10 muestra que mu16G7 inhibió los efectos de LPS en células HEK 293, incluso en concentraciones de sub-microgramos/ml.
Ejemplo 12: Neutralización por mu16G7 de la actividad de LPS en sangre entera humana
Se probó la capacidad de mu16G7 para inhibir la producción de IL- 8 inducida por LPS en sangre total humana. La actividad neutralizante de mu16G7 se probó en sangre de 3 donantes diferentes utilizando un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales de 0.5 a 5 pg/ml. La Figura 11 demuestra que mu16G7 redujo significativamente el nivel de IL-8 inducida por LPS en los 3 donantes, en comparación con un control de isotipo coincidente. Se encontró que mu16G7 es más potente que un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-TLR4 descrito previamente (de e-biosciences). (Véase Shimazu et al. J. Exp. Med. 189: 1777-1782 (1999)). En algunos casos, se encontró que el mu16G7 es tan potente como un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-CD14 que también se incluyó en el estudio. (Véase Kirkland et al. J.Biol. Chem.
268: 24818-24823 (1993)). Estos resultados indican que el epítopo neutralizante reconocido por mu16G7 en células HEK 293 transfectadas también se expone en la superficie en células en sangre completa, y que mu16G7 es lo suficientemente potente como para inhibir la actividad del LPS en sangre completa, incluso en concentraciones por debajo de 1 pg/ml. Ejemplo 13: Especificidad de mu16G7
Para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal mu16G7, se explotó el hecho de que mu16G7 no reconoce al ortólogo de conejo del complejo TLR4/MD-2 (clonado previamente). Los ADNc para TLR4 de conejo o humano con etiqueta de epítopo FLAG™ N-terminal y MD-2 con etiqueta de epítopo C-Myc y proteína C-terminal se transfectaron en células HEK 293 en las siguientes combinaciones: (1) TLR4 de conejo y MD-2 de conejo; (2) TLR4 humano y MD-2 humano; (3) conejo TLR4 y MD-2 humana; (4) TLR4 humano y MD-2 de conejo. La Figura 12 muestra el análisis de FACS de estas células después de la tinción de anticuerpos, que reveló que mu16G7 reconoció células que expresaban el complejo TLR4/MD-2 humano y una combinación de TLR4 humano y MD-2 de conejo, pero no el complejo TLR4/MD-2 de conejo ni una combinación de conejo TLR4 y MD-2 humano. Estos resultados indican que el epítopo reconocido por mu16G7 está situado en TLR4 humano (Figura 12).
Ejemplo 14: mu16G7 secuencias VH y VL
Las secuencias VH y VL del clon de hibridoma mu16G7 se amplificaron a partir del ARN total mediante RT-PCR. El análisis de secuencia se muestra en las Figuras 13A-13F. La alineación de las secuencias de nucleótidos mu16G7 VH y VL con las secuencias conocidas de VH y VL de ratón (utilizando el International Immunogenetics Information System; que se puede encontrar en http://imgt.cines.fr) revela que la secuencia mu16G7 VH se parece más a la subfamilia IgHV1, mientras que el mu16G7 VL pertenece a la subfamilia IgKV1.
El anticuerpo mu16G7 incluye una región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 12, Figura 13B) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 11 que se muestra en la Figura 13A, y una región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 17, Figura 13E) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 16 que se muestra en la Figura 13D. Los aminoácidos que abarcan la CDR según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 se destacan en texto subrayado y en cursiva en las Figuras 13B y 13E y se muestran en las Figuras 13C y 13F. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo mu16G7 tienen las siguientes secuencias: DYWIE (SEQ ID NO: 13); EILPGSGSTNYNEDFKD (SEQ ID NO: 14); y EERAYYFGY (SEQ ID NO: 15). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo mu16G7 tienen las siguientes secuencias: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 18); RVSNRFS (SEQ ID NO: 19); y LQVTHVPPT (SEQ ID NO: 20).
Ejemplo 15: Materiales y métodos para la generación de anticuerpo monoclonal mu15C1
A. Generación de transfectantes TLR4/MD-2 estables
Se generaron transfectantes de TLR4/MD-2 estables en células CHO-K1 y HEK 293 como se describió anteriormente en el Ejemplo 9, subsección A.
B. Generación de MD-2 recombinante y proteína quimérica TLR4/MD-2
Para generar MD-2 soluble recombinante, se clonó en pFASTBAC1 el ADNc que codifica la proteína con terminal C FLAG y etiquetas 6 X HIS para fines de detección y purificación, y posteriormente se insertó en el ADN del bacmid por recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 fueron sobreinfectadas. 48 horas más tarde, la proteína recombinante se purificó a partir de sobrenadantes de células infectadas utilizando una matriz de afinidad de NiNTA (Qiagen).
Para generar la proteína quimérica TLR4/MD-2 recombinante, se ensambla el ADNc que codifica la porción extracelular de TLR4 humano unido a MD-2 a través de un enlazador de glicina serina (GGGGS3) utilizando PCR. Las etiquetas FLAG y 6 xHIS se incluyeron en el extremo C de MD-2 para fines de detección y purificación. El casete de ADNc se clonó en el vector de expresión de baculovirus pFASTBAC1 (Invitrogen) y posteriormente se insertó en el ADN de bacmid mediante recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 fueron sobreinfectadas. 48 horas más tarde, la proteína de fusión recombinante se purificó a partir de lisados celulares utilizando una matriz de afinidad de MAb anti-FLAG™ M2 (Sigma).
C. Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas (IFFA CREDO) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección C.
D. Titulaciones séricas específicas.
Las valoraciones de suero de ratones se realizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección D. E. Fusiones de células B/mieloma
La extracción de células B y la fusión celular se realizaron y analizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 9, subsección D.
F. Detección de hibridomas
La exploración de hibridomas se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección F.
G. Especificidad de anticuerpos monoclonales.
La especificidad del anticuerpo monoclonal mu15C1 se determinó como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, subsección G.
H. Ensayo celular 1
El ensayo celular I se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección J.
I. Ensayo celular 2
El ensayo celular II se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección K.
J. 15C1 VII y secuencias VL
Se recogieron 107 células de hibridoma y se lavaron una vez con PBS antes de resuspenderse en 1 ml de reactivo Trizol™ (Invitrogen). Posteriormente, se extrajo el ARN total de acuerdo con las directrices del fabricante. El ADNc que codifica el VH y el VL del clon mu15C1 se generó mediante RT-PCR con el módulo ScFv de ratón (Amersham Biosciences) de acuerdo con las pautas del fabricante. Los productos amplificados se clonaron en el vector fácil pGEM-T (Promega Corp.) y se secuenciaron utilizando los cebadores T7 y SP6.
Los ADNc de VH y VL se clonaron posteriormente en vectores de expresión de mamíferos que contenían las regiones constantes kappa de IgG1 humana y humana respectivamente para expresar mu15C1 como un MAb quimérico ("15C1 quimérico"). Para producir MAb quimérico recombinante, las células HEK 293 se colocaron en placas de 6 pozos a una densidad de 2.5 x 105 células/pozo en 2 ml de medio de cultivo que contenía FBS al 10%. 16 horas después de la siembra, las células se transfectaron con 0.75 |jg del vector o los vectores apropiados utilizando el reactivo Fugene™ (Roche) de acuerdo con las pautas del fabricante. 48 horas después de la transfección, el sobrenadante se recogió y el anticuerpo se purificó utilizando cromatografía de afinidad con proteína G.
Ejemplo 16: Generación de MAb dirigidos contra el complejo humano TLR4/MD-2
Los ratones inmunizados con células CHO que expresan TLR4/MD-2 de superficie se monitorizaron para determinar títulos de suero específicos. Aquellos que mostraron una respuesta a TLR4/MD-2 fueron "hiperimpulsados" con transfectantes HEK 293 TLR4/MD-2. Esta estrategia se eligió para minimizar la respuesta a antígenos celulares CHO no específicos, mientras que al mismo tiempo maximiza la respuesta específica de TLR4/MD-2. La selección por FACS de sobrenadantes de hibridomas resultantes de fusiones de células B/mieloma se realizó en células CHO transfectadas de forma simulada frente a células transfectadas con TLR4/MD-2. El anticuerpo monoclonal de un clon específico, denominado en este documento como mu15C1, demostró la unión específica a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 (Figura 14). Se encontró que mu15C1 tenía el isotipo IgG1 k, según lo determinado por FACS utilizando el kit de CBA de isotipado de Ig de ratón (Beckton Dickenson).
Ejemplo 17: Neutralización de la actividad de LPS en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2
Se sabe que LPS tiene capacidad para inducir la producción de IL- 8 en células HEK 293 transfectadas con el complejo TLR4/MD-2. La capacidad de mu15C1 para inhibir esta inducción de IL- 8 se analizó preincubando células con cada anticuerpo durante 30 minutos antes de la administración de LPS. La Figura 15 muestra que mu15C1 inhibió los efectos de LPS en células HEK 293, incluso en concentraciones de microgramos/ml.
Ejemplo 18: Neutralización de la actividad de LPS en sangre entera humana
Se ensayó la capacidad de mu15C1 para inhibir la producción de IL- 8 inducida por LPS en sangre completa humana. La actividad neutralizante de mu15C1 se probó en sangre de 3 donantes diferentes utilizando un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales de 0.5 a 5 jg/ml. La Figura 16 demuestra que mu15C1 redujo significativamente el nivel de IL- 8 inducido por LPS en los 3 donantes, en comparación con un control de isotipo coincidente. Se encontró que mu15C1 es más potente que un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-TLR4 descrito anteriormente (de e-biosciences). (Véase Shimazu et al. J. Exp. Med. 189: 1777-1782 (1999)). En algunos casos, se encontró que el mu15C1 es tan potente como un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-CD14 que también se incluyó en el estudio. (Véase Kirkland et al. J.Biol. Chem.
268: 24818-24823 (1993)). Estos resultados indican que el epítopo neutralizante reconocido por mu15C1 en células HEK 293 transfectadas también se expone en la superficie de las células en sangre total, y que mu15C1 es lo suficientemente potente como para inhibir la actividad del LPS en sangre completa, incluso en concentraciones por debajo de 1 jg/ml. Ejemplo 19: Especificidad de mu15C1
Para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal mu15C1, se explotó el hecho de que mu15C1 no reconoce al ortólogo de conejo del complejo TLR4/MD-2 (previamente clonado). Se transfectaron ADNcs para TLR4 de conejo o humano con etiqueta de epítopo FLAG™ N-terminal y MD-2 con etiquetas de epítopo C-Myc y proteína C-terminal en células HEK 293 en las siguientes combinaciones: (1) vector simulado (2) TLR4 humano solo (3) TLR4 humano y MD-2 humano (4) TLR4 de conejo y MD-2 de conejo; (5) TLR4 humano y MD-2 de conejo; (6 ) conejo TLR4 y MD-2 humano. La Figura 17 muestra el análisis de FACS de estas células después de la tinción de anticuerpos, que reveló que mu15C1 reconoció células que expresaban TLR4 humano solo, el complejo TLR4/MD-2 humano y una combinación de TLR4 humano y MD-2 de conejo, pero no el TLR4/MD-2 de conejo complejo ni una combinación de conejo TLR4 y MD-2 humano. Estos resultados indican que el epítopo reconocido por mu15C1 está situado en TLR4 humano (Figura 17). Ejemplo 20: Secuencias mu15C1 VII y VL
Las secuencias VH y VL del clon del hibridoma mu15C1 se amplificaron a partir del ARN total mediante RT-PCR usando cebadores oligonucleótidos específicos para las secuencias líder del ratón y dominios constantes (Jones and Bendig, Biotechnology, 9: 88-89 (1991)). El análisis de secuencia se muestra en las Figuras 18A-18F.
El anticuerpo mu15C1 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 22, Figura 18B) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 21 mostrada en la Figura 18A, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 27, Figura 18E) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 26 mostrada en la Figura 18D. Los aminoácidos que abarcan la CDR según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 se destacan en texto subrayado y en cursiva en las Figuras 18B y 18E y se muestran en las Figuras 18C y 18F. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo mu15C1 tienen las siguientes secuencias: GGYSWH (SEQ ID NO: 23); YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO: 24); y KDPSDGFPY (SEQ ID NO: 25). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo mu15C1 tienen las siguientes secuencias: RASQSISDHLH (SEQ ID NO: 28); YASHAIS (SEQ ID NO: 29); y QNGHSFPLT (SEQ ID NO: 30). Ejemplo 21: 15C1 quimérico se une a hTLR4 hMD2 de células CHO transfectadas
Con el fin de demostrar la especificidad de 15C1 VH y VL clonados para el complejo hTLR4/MD-2, se realizó un análisis de FACS en células CHO transfectadas con hTLR4/MD-2 utilizando el MAb 15C1 quimérico (Figura 19). La unión específica de MAb a la concentración indicada se detectó utilizando un anticuerpo secundario IgG (H+L) de cabra anti­ humano marcado con APC. Como control se usó un MAb IgG1 humano irrelevante con el mismo isotipo emparejado. Ejemplo 22: 15C1 quimérico inhibe la producción de IL- 8 inducida por LPS en hTLR4 hMD2 de células HEK 293 transfectadas
Con el fin de demostrar la capacidad neutralizadora de 15C1 VH y VL clonados para LPS, se probó la capacidad de 15C1 para inhibir la inducción de IL- 8 dependiente de LPS de células HEK 293 transfectadas con hTLR4/MD-2 (como se describe anteriormente). La Figura 20 muestra que el 15C1 quimérico inhibió los efectos del LPS en las células HEK 293 de una manera muy similar a la del MAb 15C1.
Ejemplo 23: Materiales y métodos para la generación de anticuerpo monoclonal mu7E3
A. Generación de transfectantes TLR4/MD-2 estables
Se generaron transfectantes de TLR4/MD-2 estables en células CHO-K1 y HEK 293 como se describe anteriormente en el Ejemplo 9, subsección A.
B. Generación de MD-2 recombinante y proteína quimérica TLR4/MD-2
Se generó MD-2 soluble recombinante como se describió anteriormente en el Ejemplo 15, subsección B.
Para generar la proteína quimérica TLR4/MD-2 recombinante, se ensambla el ADNc que codifica la porción extracelular de TLR4 humano unido a MD-2 a través de un enlazador de serina de glicina (GGGGS3) usando PCR. Las etiquetas FLAG y 6 xHIS se incluyeron en el extremo C de MD-2 para fines de detección y purificación. El casete de ADNc se clonó en el vector de expresión de baculovirus pFASTBAC1 (Invitrogen) y posteriormente se insertó en el ADN de bacmid mediante recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 fueron sobreinfectadas.
48 horas más tarde, la proteína de fusión recombinante se purificó a partir de lisados celulares utilizando una matriz de afinidad de MAb anti-FLAG™ M2 (Sigma).
C. Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad (IFFA CREDO) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección C.
D. Titulaciones séricas específicas.
Las valoraciones de suero de ratones se realizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección D. E. Fusiones de células B/mieloma
La extracción de células B y la fusión celular se realizaron y analizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 9, subsección D.
F. Detección de hibridomas
La exploración de hibridomas se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección F.
G. Especificidad de anticuerpos monoclonales.
La especificidad del anticuerpo monoclonal mu7E3 se determinó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección G.
H. Ensayo celular 1
El anticuerpo monoclonal se purificó por primera vez a partir de sobrenadante de células de hibridoma usando cromatografía de afinidad de proteína G.
El ensayo celular I se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección J.
I. Ensayo celular 2
El ensayo celular II se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, subsección K.
J. 7E3 secuencias VH y VL
Se recogieron 107 células de hibridoma y se lavaron una vez con PBS antes de resuspenderse en 1 ml de reactivo Trizol™ (Invitrogen). Posteriormente, se extrajo el ARN total de acuerdo con las directrices del fabricante. El ADNc que codifica el VH y el VL del clon mu7E3 se generó mediante RT-PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para secuencias líder de ratón y dominios constantes (Jones and Bendig, Biotechnology, 9: 88-89 (1991)). Los productos amplificados se clonaron en el vector fácil pGEM-T (Promega Corp.) y se secuenciaron utilizando los cebadores T7 y SP6. Los ADNc de VH y VL se clonaron posteriormente en vectores de expresión de mamíferos que contenían las regiones constantes kappa de IgG1 humana y humana respectivamente para expresar mu7E3 como un MAb quimérico ("7E3 quimérico"). Para producir MAb quimérico recombinante, las células HEK 293 se colocaron en placas de 6 pozos a una densidad de 2.5 x 105 células/pozo en 2 ml de medio de cultivo que contenía FBS al 10%. 16 horas después de la siembra, las células se transfectaron con 0.75 |jg del vector o los vectores apropiados utilizando el reactivo Fugene™ (Roche) de acuerdo con las pautas del fabricante. 48 horas después de la transfección, el sobrenadante se recogió y el anticuerpo se purificó utilizando cromatografía de afinidad con proteína G.
Ejemplo 24: Generación de MAb dirigidos contra el complejo humano TLR4/MD-2
Los ratones inmunizados con células CHO que expresaban TLR4/MD-2 de superficie se monitorizaron para determinar títulos de suero específicos. Aquellos que mostraron una respuesta a TLR4/MD-2 fueron "hiperimpulsados" con transfectantes HEK 293 TLR4/MD-2. Esta estrategia se eligió para minimizar la respuesta a antígenos celulares CHO no específicos, mientras que al mismo tiempo maximiza la respuesta específica de TLR4/MD-2. La selección por FACS de sobrenadantes de hibridomas resultantes de fusiones de células B/mieloma se realizó en células CHO transfectadas simuladas frente a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2. El anticuerpo monoclonal de un clon específico, denominado aquí como mu7E3, demostró la unión específica a células CHO transfectadas con TLR4/MD-2 (Figura 21). Se encontró que mu7E3 tiene el isotipo IgG1 k, según lo determinado por FACS utilizando el kit de CBA de isotipado de Ig de ratón (Beckton Dickenson).
Ejemplo 25: Neutralización de la actividad de LPS en células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2
Se sabe que el LPS tiene capacidad para inducir la producción de IL- 8 en células HEK 293 transfectadas con el complejo TLR4/MD-2. La capacidad de mu7E3 para inhibir esta inducción de IL- 8 se analizó preincubando células con cada anticuerpo durante 30 minutos antes de la administración de LPS. La Figura 22 muestra que mu7E3 inhibió los efectos de LPS en células HEK 293, incluso en concentraciones de submicrogramos/ml.
Ejemplo 26: Neutralización de la actividad de LPS en sangre entera humana
Se probó la capacidad de mu7E3 para inhibir la producción de IL- 8 inducida por LPS en sangre entera humana. La actividad neutralizante de mu7E3 se probó en sangre de 3 donantes diferentes utilizando un rango de concentraciones de anticuerpos monoclonales de 0.5 a 5 jg/ml. La Figura 23 demuestra que mu7E3 redujo significativamente el nivel de IL- 8 inducido por LPS en los 3 donantes, en comparación con un control de isotipo coincidente. Se encontró que mu7E3 es más potente que un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-TLR4 descrito anteriormente (adquirido de e-biosciences). (Véase Shimazu et al. J. Exp. Med. 189: 1777-1782 (1999)). En algunos casos, se encontró que mu7E3 es tan potente como un anticuerpo monoclonal bloqueador de a-CD14 que también se incluyó en el estudio. (Véase Kirkland et al. J.Biol. Chem. 268: 24818-24823 (1993)). Estos resultados indican que el epítopo neutralizante reconocido por mu7E3 en células HEK 293 transfectadas también se expone en la superficie de las células en sangre total, y que mu7E3 es lo suficientemente potente como para inhibir la actividad del LPS en sangre total, incluso en concentraciones por debajo de 1 |jg/ml.
Ejemplo 27: Especificidad de mu7E3
Para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal mu7E3, se explotó el hecho de que mu7E3 no reconoce al ortólogo de conejo del complejo TLR4/MD-2 (previamente clonado). Se transfectaron ADNcs para TLR4 de conejo o humano con etiqueta de epítopo FLAG™ N-terminal y MD-2 con etiquetas de epítopo C-Myc y proteína C-terminal en células HEK 293 en las siguientes combinaciones: (1) vector simulado (2) TLR4 humano solo (3) TLR4 humano y MD-2 humano (4) TLR4 de conejo y MD-2 de conejo; (5) TLR4 humano y MD-2 de conejo; (6 ) conejo TLR4 y MD-2 humano. La Figura 24 muestra el análisis FACS de estas células después de la tinción con anticuerpos, que reveló que mu7E3 reconoció las células que expresaban el complejo TLR4/MD-2 humano y una combinación de TLR4 humano y MD-2 de conejo, pero no el complejo TLR4/MD-2 de conejo ni una combinación de conejo TLR4 y MD-2 humano. Estos resultados indican que el epítopo reconocido por mu7E3 es TLR4 humano situado, pero la presencia de MD-2 es esencial para la unión de MAb (Figura 24).
Ejemplo 28: secuencias VH y VL de nmu7E3
Las secuencias VH y VL del clon del hibridoma mu7E3 se amplificaron a partir del ARN total mediante RT-PCR. El análisis de secuencia se muestra en las Figuras 25A-25F.
El anticuerpo mu7E3 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 32, Figura 25B) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 31 mostrada en la Figura 25A, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 37, Figura 25E) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 36 mostrada en la Figura 25D. Los aminoácidos que abarcan la CDR según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 se destacan en texto subrayado y en cursiva en las Figuras 25B y 25E y se muestran en las Figuras 25C y 25F. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo mu7E3 tienen las siguientes secuencias: TYNIGVG (SEQ ID NO: 33); HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO: 34); y MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO: 35). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo mu7E3 tienen las siguientes secuencias: RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 38); YTSKLHS (SEQ ID NO: 39); y QQGNTFPWT (SEQ ID NO: 40).
Ejemplo 29: 7E3 quimérico se une a hTLR4 hMD2 células CHO transfectadas
Para demostrar la especificidad de 7E3 VH y VL clonados para el complejo hTLR4/MD-2, se realizó un análisis FACS en células CHO transfectadas con hTLR4/MD-2 utilizando el MAb 7E3 quimérico (Figura 26). La unión específica de MAb a la concentración indicada se detectó utilizando un anticuerpo secundario IgG (H+L) de cabra anti-humano marcado con APC. Como control se usó un MAb IgG1 humano irrelevante con el mismo isotipo emparejado.
Ejemplo 30: 7E3 quimérico inhibe la producción de IL- 8 inducida por LPS en hTLR4 hMD2 células HEK 293 transfectadas
Con el fin de demostrar la capacidad neutralizadora de 7E3 VH y VL clonados para LPS, se probó la capacidad de 7E3 para inhibir la inducción de IL- 8 dependiente de LPS de células HEK 293 transfectadas con hTLR4/MD-2 como se describió anteriormente. La Figura 27 muestra que el 7E3 quimérico inhibió los efectos del LPS en las células HEK 293.
Ejemplo 31: Construcción de ADNc de proteína de fusión TLR4/MD-2 y clonación en pFASTBAC1.
La porción extracelular de TLR4 unida a MD-2 a través de un enlazador de glicina serina (GGGGS)3 se ensambla usando PCR. Las etiquetas FLAG y 6 xHIS se incluyeron en el extremo C de MD-2 para fines de detección y purificación. (Figura 28).
Las Figuras 28A-C ilustran la construcción de este ADNc de proteína de fusión TLR4/MD-2 de acuerdo con la presente divulgación. El ADNc que codifica la porción extracelular de TLR4 humano (sTLR4) se amplificó por PCR, y se introdujeron sitios de restricción NheI/XhoI únicos en las extensiones de cebadores no hibridantes 5'. La secuencia codificante (GGGGS)3 y el sitio XhoI único se introdujeron en la extensión 5' no hibridante del cebador sentido, y se introdujo un sitio HindIII único en la extensión 5' no hibridante del cebador antisentido. (Panel A). El panel B representa la clonación secuencial de los cADNs amplificados de sTLR4 y (GGGGS)3/MD- 2 en pFASTBAC1 entre el sitio de restricción único XbaI y HindIII. El panel C representa un producto proteico propuesto después de la expresión del ADNc sTLR4/MD-2 en células Sf9.
Ejemplo 32: Expresión de la proteína quimérica TLR4/MD-2 en lisados y sobrenadantes de células SF9
El casete de ADNc del Ejemplo 1 se clonó en el vector de expresión de baculovirus pFASTBAC1 (Invitrogen) y posteriormente se insertó en el ADN del bacmid mediante recombinación homóloga. Después de la generación de una reserva viral, las células Sf9 se sobreinfectaron y la expresión de la proteína de fusión TLR4/MD-2 se analizó en el lisado celular a las 48 y 72 horas posteriores a la infección por inmunotransferencia Western. (Figura 29).
La Figura 29 demuestra la expresión de una proteína quimérica TLR4/MD-2 de la presente divulgación en lisados y sobrenadantes de células Sf9. La expresión de la proteína en los lisados de células Sf9 y los sobrenadantes se detectó mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-FLAG M2: el carril 1 representa el lisado aclarado a las 48 horas de la infección; el carril 2 muestra el lisado despejado 72 horas después de la infección; el carril 3 muestra el sobrenadante aclarado 48 horas después de la infección; el carril 4 muestra el sobrenadante aclarado 72 horas después de la infección; y el carril 5 contiene una proteína de referencia (etiquetada FLAG). Los tamaños de los marcadores de peso molecular en la Figura 29 se muestran en KDa. El peso molecular previsto de la proteína quimérica TLR4/MD-2 es de aproximadamente 90 KDa, y la aparición del producto de degradación probable se produce a aproximadamente 28KDa.
Ejemplo 33: Purificación de la proteína quimérica TLR4/MD-2 a partir de lisados de células SF9 infectadas
Para purificar la proteína de fusión, las células Sf9 se recogieron 48 horas después de la superinfección y se lisaron en Tris 20 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, NP40 al 1% con inhibidores de proteasa COMPLETE™ (Roche) a una concentración de 5 volúmenes/ de células gramo. Después de una incubación de quince horas (15') a 4°C, los lisados se eliminaron mediante centrifugación (4000 rpm) y filtración (0.22 pm) y se pasaron a través de una matriz de afinidad de MAb anti-FLAG M2 (Sigma). La proteína no unida se eliminó de la matriz mediante lavado sucesivo con Tris 20 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM, NP40 al 1% y Tris 20 mM (pH 7.4), NaCl 150 mM. La proteína unida se eluyó de la columna con glicina 100 mM (pH 2.75) y se recogió en fracciones de 0.5 ml. Las fracciones se llevaron rápidamente a pH neutro mediante la adición de 50 pl de Tris 1M (pH 9). El contenido de proteína se analizó mediante inmunotransferencia Western (con anti-FLAG M2 conjugado con peroxidasa) y tinción con azul brillante de Coomassie. (Figura 30).
La Figura 30 demuestra la presencia de proteína quimérica TLR4/MD-2 purificada en lisados de células Sf9 infectadas. La proteína en los lisados celulares se detectó mediante tinción con azul brillante de Coomassie (Figura 30, panel izquierdo) o transferencia Western (Figura 30, panel derecho) utilizando el anticuerpo anti-FLAG M2. Los carriles 1-5 representan 0.5 ml de fracciones eluidas de la columna de afinidad anti-FLAG M2.
Ejemplo 34: La inhibición de la producción de IL- 8 inducida por LPS utilizando TLR4/MD-2 quimérico soluble
Se preincubó lipopolisacárido (LPS) (15 ng/ml) con un TLR4/MD-2 quimérico purificado de acuerdo con la presente divulgación a concentraciones variables y posteriormente se incubó con células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2. La Figura 31 es un gráfico que representa la producción de IL- 8 en el medio de cultivo celular 24 horas después del tratamiento.
Como se ve en la Figura 31, se demostró que el TLR4/MD-2 quimérico purificado tiene un efecto inhibitorio sobre la producción de IL- 8 inducida por LPS en células HEK transfectadas con TLR4/MD-2, lo que indica que el TLR4/MD-2 purificado de proteína de la presente divulgación era al menos parcialmente conformacionalmente correcta.
Ejemplo 35: Humanización de los anticuerpos 18H10, 15C1 y 7E3
Diseño y construcción de las regiones variables injertadas en CDR.
Los anticuerpos Mu15C1, mu18H10 y mu7 E3 se humanizaron mediante injertos de CDR (Jones et al, Nature 321: 522­ 525, 1986; Verhofyen et al. Science, 239: 1634-1536, 1988). El "injerto de CDR" implica el rediseño de la región variable para que los aminoácidos que comprenden el sitio de unión no humano (es decir, el ratón) se integren en el marco de una región variable de anticuerpo humano. Para llevar a cabo el proceso de humanización, se determina la elección del marco humano y la extensión de la secuencia de la región variable del ratón a transferir.
El marco humano para el proceso de humanización se seleccionó de todas las secuencias publicadas para los genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana que se utilizan para crear el repertorio de anticuerpos humanos (consulte la base de datos internacional ImMunoGeneTics, IMGT, disponible en línea). Para mu15C1, se eligieron dos candidatos para cada gen V, a saber, IGHV3-66 (también conocido como DP-8 6 ) e IGHV4-28 (también conocido como DP-48) para la cadena pesada e IGKV3-11 (también conocido como L6 ) e IGKV6-21 (también conocido como A26) para la cadena ligera Kappa. Para mu7E3, se eligieron dos candidatos para las cadenas pesadas, a saber, IGHV3-66 (o DP-8 6 ) e IGHV2-70 (también conocido como DP-27) y un candidato para la cadena ligera Kappa IGKV1-12 (también conocido como L19). Para mu18H10 se eligió un candidato para cada gen V:IGHV1-69 (también conocido como DP-10) para la cadena pesada e IGKV3-11 (o L6 ) para la cadena ligera.
La extensión de las secuencias de ratón que deben transferirse se determina como sigue. En primer lugar, la superficie de unión al antígeno se encuentra predominantemente en una serie de bucles, conocidos como CDR, tres por gen V, que se extienden desde el marco del barril p. En todos los casos, los residuos elegidos para la transferencia correspondieron a la definición amplia de CDR según lo definido por Kabat (regiones hipervariables; Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office) y Chothia (bucles estructurales; Chothia et al, Nature, 342: 877-883, 1989). Además, los residuos no identificados en los bucles estructurales o regiones hipervariables pueden contribuir a la unión del antígeno directa o indirectamente al afectar la topología del sitio de unión, al inducir un empaquetamiento estable de los dominios variables individuales, o al estabilizar la interacción del dominio intervariable. Dichos residuos se identificaron mediante análisis de alineación de secuencias y observaron residuos "idiosincrásicos", seguido de un examen de su ubicación estructural y efectos probables.
Una vez que se han realizado las elecciones de secuencia relevantes, se generó el ADN de la región variable humanizada utilizando cualquiera de los siguientes procedimientos: por síntesis génica utilizando oligonucleótidos superpuestos adecuados (ejemplificados por Kolbinger et al., Protein Eng. 6 , 971-980, 1993)), o mediante el uso simultáneo o secuencial de mutagénesis por PCR de secuencias de ADN existentes (Kammann et al., Nucleic Acids Res. 17, 5404). Por ejemplo, los cebadores de PCR que codifican las nuevas CDR se hibridaron a una plantilla de ADN que era una región variable completamente humana o humanizada que se diseñó en base a la misma región variable, o una región variable humana muy similar (ejemplificada por Sato et al., Cancer Res 53, 851-856 1993). Se obtuvieron varias variantes menores en el diseño de los genes V humanizados utilizando la técnica de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange originalmente descrita por Stratagene.
Tras la construcción y secuenciación de las secuencias de ADN que codifican las secuencias líder de las cadenas ligeras y pesadas más las regiones variables humanizadas, las regiones variables del líder se convirtieron en genes IgG completos humanizados para la expresión en células de mamíferos mediante la subclonación en vectores que contiene un casete de expresión humano ligero o pesado.
Versiones humanizadas del anticuerpo 15C1
Los anticuerpos hu15C1 de la presente divulgación incluyen la cadena pesada variable (V h ) 4-28 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 45 o la V h 3-66 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 46. Los anticuerpos hu15C1 de la presente divulgación incluyen la cadena ligera variable (V l ) L6 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 47 o A26 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 48. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están recuadrados en las secuencias que se proporcionan a continuación. (Véase Chothia, C, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).
15C1 Hu Vh versión 4-28
QVQLQESGPG LVKPSDTLSL TCAVSGYSI X,. jGQYSWHjWIRQ PPGKGLEW X2G Y1HYSGYTDF NPSLKlfe XjT X< SRDTSKNQFS LKLSSVTAVD TAVYYCAR{KE{ PSDGFPYJWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO:45)
CDR 1 GGYSWH (SEQ ID NO:23)
CDR 2 YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO:24)
CDR 3 KDPSDGFPY (SEQ ID NO:25)
Donde Xx es Thr o Ser
Donde X3 es lie o Met
Donde X3 es Val o lie
Donde X* es Met o lie
15C1 Hu V„ versión 3-66
EVQLVBSGGG LVQPGGSLRL SCAXiSGYSIT fGGY~SW^WVRQ APGKGLEWXjS
I SRDNSKNTX3Y LQMNSLRAED TAVYYCArJkÉ]
Figure imgf000046_0001
(SEQ ID NO:46)
CDR 1 GGYSWH (SEQ ID NO:23)
CDR 2 YIHYSGYTDFNPSLKT (SEQ ID NO:24)
CDR 3 KDPSDGFPY (SEQ ID NO:25)
Donde Xx es Ala o Val
Donde X2 es Val o Met
Donde X3 es Leu o Phe
15C1 Hu VL versión L6
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCjRÁSQSIS" DHLH¡WYQQKP GQAPRLLIXjg
ASHAIS)3IPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCfáN GHSFPLljFGG GTKVEIK
(SEQ ID NO:47)
CDR1: RASQSISDHLH (SEQ ID NO:28)
CDR2: YASHAIS (SEQ ID NO:29>
CDR3: QNGHSFPLT (SEQ ID NO:30)
Donde Xx es Lys o Tyr
15C1 Hu VL versión A26
EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT ITCjRASQSIS DHLHjWYQQKP DQSPKLLIKjxj
ASHAISjGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCjQN GHSFPLT^FGG GTKVEIK
(SEQ ID NO:48)
CDR1: RASQSISDHLH (SEQ ID NO:28)
CDR2: YASHAIS (SEQ ID NO:29)
CDR3: QNGHSFPLT (SEQ ID NO:30)
Las tablas 1 y 2 presentan alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar las regiones Vh 15C1 humanizadas:
TABLA 1: 15C1 cadena pesada humanizada 4-28
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Leyenda: La primera columna (numeración de Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); la segunda columna (numeración de Chothia) da el número de residuo según Chothia; la tercera columna (numeración IMGT) proporciona la numeración Lefranc única de IMGT para 15C1 Vh; la cuarta columna (15C1 Vh de ratón) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh del anticuerpo 15C1 anti-TLR4 MD2 de ratón utilizado como secuencia donante para el injerto de CDR; la quinta columna (Línea Germinal Humana IGHV4-28) proporciona la secuencia de aminoácidos de la variable pesada de la línea germinal humana de inmunoglobulina 4-28 utilizada como secuencia aceptora para el injerto de CDR; y la sexta columna (Versión remodelada 115C1 VH) proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión humanizada de la región VH 15C1. Las posiciones de los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se muestran en la columna uno.
Tal como se utiliza en las Tablas 1, (*) indica partes de la estructura canónica principal de los bucles de CDR según lo definido por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita sin subrayar representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humanizada.
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Leyenda: La primera columna (numeración de Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); la segunda columna (numeración de Chothia) da el número de residuo según Chothia; la tercera columna (numeración IMGT) proporciona la numeración Lefranc única de IMGT para 15C1 VH; la cuarta columna (15C1 VH de ratón) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh del anticuerpo 15C1 anti-TLR4 MD2 de ratón utilizado como secuencia donante para el injerto de CDR; la quinta columna (Línea Germinal Humana IGHV 3-66) proporciona la secuencia de aminoácidos de la variable pesada 3-66 de inmunoglobulina de la línea germinal humana utilizada como secuencia aceptora para el injerto de CDR; y la sexta columna (versión humanizada 3-66) proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión humanizada de la región Vh de 15C1. Las posiciones de los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se muestran en la columna uno.
Tal como se utiliza en la Tabla 2, (*) indica partes de la estructura canónica principal de los bucles de CDR según lo definido por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humanizada.
Las tablas 3 y 4 presentan alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar las regiones Vl de 15C1 humanizadas:
TABLA 3: 15C1 cadena ligera humanizada A26
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Leyenda: La primera columna (Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (#) da el número de residuo en secuencia regular; La tercera columna (FR o CDR) es conveniente para identificar los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las tres CDR que separan las cuatro FR; La cuarta columna (ratón 15C1 Liviana) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vl del anticuerpo 15C1 de ratón; La quinta columna (Línea Germinal Humana A26 IGKV6-21) proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Kappa A26 o IGKV6-21; La sexta columna (15C1 VL A26 humanizada) proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión humanizada de 15C1 VL A26.
Como se usa en la Tabla 3, (*) representa parte de la estructura canónica principal de los bucles de CDR como se define por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente.
TABLA 4: 15C1 cadena ligera humanizada L6
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_____________________
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Leyenda: La primera columna (Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (#) da el número de residuo en secuencia regular; La tercera columna (FR o CDR) es conveniente para identificar los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las tres CDR que separan las cuatro FR; La cuarta columna (15C1 de ratón Liviana) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vl del anticuerpo 15C1 anti-TLR4 MD2 de ratón; la quinta columna (Línea Germina1Humana L6 o IGKV3-11) proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Kappa L6 o IGKV3. La sexta columna (15C1 VL L6 humanizada) proporciona las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de 15C1 humanizada.
Tal como se utiliza en la Tabla 4, (*) representa parte de la estructura canónica principal de los bucles de CDR como se define por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente.
Versiones humanizadas del anticuerpo 18H10
Los anticuerpos hu18H10 de la presente divulgación incluyen el Vh 1-69 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 49. Los anticuerpos hu18H10 de la presente divulgación incluyen el Vl L6 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 50. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están recuadrados en las secuencias que se proporcionan a continuación. (Véase Chothia, C, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).
18H 10 Hu VH versión 1 - 69
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFNIK (DSYIHjWVRQA PGQGLEWXi
DPRFQG^RVTI TADXjSTSTAY XjELSSLRSED TAVYYC
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GQGTTVTVSS (SEQ ID NO :49)
CDR1: DSYIH (SEQ ID N O :3)
CDR2: WTDPENVNSIYDPRFQG (SEQ ID N O :4 SEQ ID N O :4)
CDR3: GYNGVYYAMDY (SEQ ID N O :5)
Donde Xi es M et o l i e
Donde Xj es L ys o Thr
Donde X 3 es M et o L e u
18H 10 Hu VL v e r s i ó n L6
E l VLTQSPAT LSLS PGERAT LSCfSASSSVI YMHjWYQQKPG QAPRLLIY|RT]
YÑ1a s )GIPAR FSGSGSGTDXi TLTISSLEPE DFAVYYCfoQW SSFPY T^GQG TKVEIK (SEQ ID NO: 50)
CDR1: SASSSVIYMH (SEQ ID N O :8)
CDR2: RTYNLAS (SEQ ID N O :9)
CDR3: HQWSSFPYT (SEQ ID N O :10)
Donde Xi es Phe o T y r
La Tabla 5 presenta las alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar la región Vh 15C1 humanizada:
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Leyenda: La primera columna (numeración de Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (numeración de Chothia) da el número de residuo según Chothia; La tercera columna (numeración IMGT) proporciona la numeración Lefranc única IMGT para 15C1 VH. La cuarta columna (15C1 VH de ratón) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh del anticuerpo 15C1 anti-TLR4 MD2 de ratón utilizado como secuencia donante para el injerto de CDR; La quinta columna (Línea Germinal Humana IGHV1-69) proporciona la secuencia aminoácido de la variable pesada de inmunoglobulina humana de línea germinal 1-69 (IMGTdenomination) utilizada como secuencia aceptora para el injerto de CDR. La sexta columna (18H10 VH 1-69 humanizada) proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión humanizada de la cadena pesada 18H10. Las posiciones de los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se muestran en la columna uno.
Como se usa en la Tabla 5, (*) indica partes de la estructura canónica principal para los bucles de CDR como se define por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humanizada.
La tabla 6 presenta alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar la región Vl de 15C1 humanizada:
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Figure imgf000069_0002
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___ ___
Leyenda: La primera columna (Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (#) da el número de residuo en secuencia regular; La tercera columna (FR o CDR) es conveniente para identificar los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las tres CDR que separan las cuatro FR; La cuarta columna (18H10 De ratón Liviana) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vl del anticuerpo 18H10 anti-TLR4 MD2 de ratón; La quinta columna (Línea Germina1Humana L6 o IGKV3-11) proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Kappa L6 o IGKV3. La sexta columna (18H10 VL L6 humanizada) proporciona las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de 18H10 humanizada.
Como se usa en la Tabla 6, (*) representa parte de la estructura canónica principal de los bucles de CDR como se define por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR y CDR donde los residuos humanos difieren de los números de residuos del ratón análogos. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humanizada.
Versiones humanizadas del anticuerpo 7E3
Los anticuerpos hu7E3 de la presente divulgación incluyen el Vh 2-70 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 51 o el Vh 3-66 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 52. Los anticuerpos hu7E3 de la presente divulgación incluyen el Vl L19 que se muestra a continuación en la SEQ ID NO: 53. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según lo definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están recuadrados en las secuencias que se proporcionan a continuación. (Véase Chothia, C, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Secuencias de proteínas de interés inmunológico, Quinta edición, Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office(1991)).
7E3 Hu VH versión 2-70
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLX, fTYNIGVG|WIR QPPGKALEWL
AHIWWNDNIY YNTVLKSlRLT XjSKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCXiRQ
AEGRYDAMDY WGQGTLVTVS S (SEQ ID NO: 51)
CDR1: TYNIGVG (SEQ ID NO:33)
CDR2: HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO:34]
CDR3: MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO:35)
Donde Xi es Ser o Thr
Donde X2 es lie o Phe
Donde Xj es lie o Ala
7E3 Hu VH versión 3-66
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAXiSGFSLT frYNIGVGjWVR QAPGKGLEWXj
SjHIWWNDNIY YNTVLKSjRLT X3SX«DNSKNTX5 YLQMNSLRAE DTAVYYCX«R@
AEGRYDAMDY! WGQGTLVTVS S (SEQ ID NO: 52)
CDR1: TYNIGVG (SEQ ID NO:33)
CDR2: HIWWNDNIYYNTVLKS (SEQ ID NO:34)
CDR3: MAEGRYDAMDY (SEQ ID NO:35)
es Phe O Ala
es Val o Leu
es lie o Phe
es Lys o Arg
es Leu o Val
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es lie o Ala
7E3 Hu VL versión L19
DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCjRASQDIT NYLNjWYQQKP GKAPKLLIY0
TSKLHS)GVPS RFSGSGSGTD XxTLTISSLQP EDFATYXjC^Q GNTFPW^FGG
GTKVEIK (SEQ ID NO:53)
CDR1: RASQDITNYLN (SEQ ID NO:38)
CDR2: YTSKLHS (SEQ ID NO:39)
CDR3: QQGNTFPWT (SEQ ID N0:40)
Donde Xi es Phe o Tyr
Donde xa es Tyr o Phe
Las tablas 7 y 8 presentan alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar las regiones Vh 15C1 humanizadas:
TABLA 7: 18H10 cadena ligera humanizada L6
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Leyenda: La primera columna (numeración de Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (numeración de Chothia) da el número de residuo según Chothia; La tercera columna (numeración IMGT) proporciona la numeración Lefranc única IMGT. La cuarta columna (ratón 7E3 VH) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh del anticuerpo 7E3 anti-TLR4 MD2 de ratón utilizado como secuencia donante para el injerto de CDR; La quinta columna (Línea Germinal Humana IGHV3-66) proporciona la secuencia de aminoácidos de la variable pesada 2-26 de inmunoglobulina humana de línea germinal usada como secuencia aceptora para el injerto de CDR. La sexta columna (Versión remodelada 3-667E3 VH) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh 7E3 humana remodelada. Los residuos de aminoácidos del ratón que se mantienen en la versión humanizada están en amarillo.
Las posiciones de los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se muestran en la columna uno. (*) indica partes de la estructura canónica principal de los bucles de CDR según lo definido por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humana reformada.
TABLA 8 7E3 cadena pesada humanizada 2-70
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Leyenda: La primera columna (numeración de Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); la segunda columna (numeración de Chothia) da el número de residuo según Chothia; la tercera columna (numeración IMGT) proporciona la numeración Lefranc única IMGT. La cuarta columna (ratón 7E3 VH) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vh del anticuerpo 7E3 anti-TLR4 MD2 de ratón utilizado como secuencia donante para el injerto de CDR; La quinta columna (Línea Germinal Humana IGHV2-70) proporciona la secuencia de aminoácidos de la variable pesada de inmunoglobulina humana de la línea germinal 2-70 utilizada como secuencia aceptora para el injerto de CDR. La sexta columna (versión humanizada 2-707E3 VH) proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión humanizada de la región Vh 7E3. Los residuos de aminoácidos del ratón que se mantienen en la versión humanizada están en amarillo.
Las posiciones de los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) se muestran en la columna uno. (*) indica partes de la estructura canónica principal de los bucles de CDR según lo definido por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos humanos conservados en la versión humana reformada.
La tabla 9 presenta alineaciones de las secuencias de aminoácidos que se usaron para diseñar la región Vl de 15C1 humanizada:
TABLA 9: 7E3 cadena ligera humanizada L19
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Leyenda: La primera columna (Kabat) da el número de residuo según Kabat et al. (1991); La segunda columna (Chothia) da el número de residuo según Chothia; La tercera columna (FR o CDR) es conveniente para identificar los segmentos marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y los segmentos determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las tres CDR que separan las cuatro FR; La cuarta columna (7E3 De ratón Liviana) proporciona la secuencia de aminoácidos de la región Vl del anticuerpo 7E3 anti-TLR4 MD2 de ratón; La quinta columna (línea germinal humana L19 IGKV1-12 IGKV1D-12) proporciona la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Kappa cadena ligera L19 IGKV1-12 IGKV1D-12. La sexta columna (7E3 humano remodelado) proporciona las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera 7E3 humanizada.
Como se usa en la Tabla 9, (*) representa parte de la estructura canónica principal de los bucles de CDR como se define por Chothia et al. (1989). Las entradas en negrita, no subrayadas, representan posiciones en las FR y las CDR donde los residuos de aminoácidos del humano y del ratón son idénticos. Las entradas en cursiva representan posiciones en las FR donde el residuo humano difiere del número de residuo de ratón análogo. Las entradas subrayadas (en negrita o no en negrita) representan posiciones en las FR y las CDR en las que el residuo de aminoácido humano se reemplazó por el residuo del ratón correspondiente. Las entradas en caja representan residuos de genes de la línea germinal humana.
Ejemplo 36: hu18H10 se une a hTLR4 hMD2 expresado en células CHO
Con el fin de demostrar la capacidad del anticuerpo monoclonal humanizado hu18H10 para unirse al complejo humano TLR4/MD-2, se realizaron experimentos de citometría de flujo (como se describió anteriormente) utilizando 18H10 quimérico como control positivo. La Figura 39 muestra que hu18H10 se unió a TLR4/MD-2 de una manera muy similar a la del anticuerpo quimérico 18H10 descrito anteriormente.
Ejemplo 37: Los anticuerpos monoclonales humanizados hu7E3 se unen a hTLR4 hMD2 expresado en células CHO
Para demostrar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados hu7E3 para unirse al complejo humano TLR4/MD-2, se realizaron experimentos de citometría de flujo (como se describió anteriormente) utilizando 7E3 quimérico como control positivo. Los anticuerpos hu7E3 probados incluyeron un anticuerpo hu7E3 que incluye Vh 2-70 mostrado en la SEQ ID NO: 51 y el VlL19 mostrado en la SEQ ID NO: 53 ("7E32-70/L19") y un anticuerpo hu7E3 que incluye Vh 3- 66 mostrado en la SEQ ID NO: 52 y el Vl L19 mostrado en la SEQ ID NO: 53 ("7E3 3-66/L19") Figura 40 muestra que los MAb hu7E3 se unen a TLR4/MD-2 de una manera similar a la del 7E3 Anticuerpo quimérico descrito anteriormente.
Ejemplo 38: Los anticuerpos monoclonales humanizados hu15C1 se unen a hTLR4 hMD2 expresado en células CHO Para demostrar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados hu7E3 para unirse al complejo humano TLR4/MD-2, se realizaron experimentos de citometría de flujo (como se describió anteriormente) utilizando 15C1 quimérico como control positivo. Los anticuerpos hu15C1 probados incluyeron el anticuerpo hu15C1 que incluye Vh 4-28 mostrado en la SEQ ID NO: 45 y el Vl A26 mostrado en la SEQ ID NO: 48 ("15C1 4-28/A26") y sus variantes en las que se encuentran residuos las posiciones (QC##, numeración de Kabat) se han reemplazado por los aminoácidos correspondientes en la línea germinal humana dada ("15C1 4-28 QC 30/A26"; "15C1 4-28 QC 48/A26"; "15C1 4-28 QC 67/A26" y "15C1 4-28 QC 69/A26", ver TABLA 1). Otros anticuerpos hu15C1 probados incluyen un anticuerpo hu15C1 que incluye Vh 3-66 mostrado en la SEQ ID NO: 46 y el Vl L6 mostrado en la SEQ ID NO: 47 ("15C1 3-66/L6") y un anticuerpo hu15C1 que incluye Vh 3-66 mostrado en la SEQ ID NO: 46 y el VlA26 mostrado en la SEQ ID NO: 48 ("15C1 3-66/L6"). Las Figuras 41 y 42 demuestran que los MAb de anticuerpos hu15C1 se unieron a TLR4/MD-2 de una manera similar a la del anticuerpo quimérico 15C1 descrito anteriormente.
Ejemplo 39: Estudios de mapeo de epítopos TLR4 y MD2
hu15C1, hu7E3 y hu18H10 son tres anticuerpos monoclonales (MAbs) que muestran especificidad por el complejo del receptor humano TLR4/MD-2. Este complejo receptor es activado por el lipopolisacárido (LPS), el componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Los tres MAb son capaces de inhibir la activación del receptor y la señalización intracelular posterior a través de LPS, pero curiosamente, los tres tienen especificidades distintas. hu15C1 se une a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2. hu7E3 se une a TLR4, pero la unión con MD-2 aumenta mucho, lo que sugiere que la presencia de este último provoca un cambio conformacional en TLR4 que expone un epítopo unido por hu7E3. hu18H10 se une a MD-2, pero requiere la presencia de TLR4, ya que el MAb no se une a formas solubles de MD-2.
El objetivo de este estudio fue identificar regiones pequeñas y aminoácidos individuales tanto de las secuencias de TLR4 como de MD-2 importantes para la unión de hu15C1, hu7E3 y hu18H10. La secuencia de aminoácidos de TLR4 humano (No. de acceso de GenBank O00206) se muestra en la Figura 43. La secuencia de aminoácidos de MD2 humana (No. de acceso de GenBank Q9Y6Y9) se muestra en la Figura 33B.
Como ninguno de los MAb hu15C1, hu7E3 y hu18H10 demuestran reactividad cruzada con el complejo receptor de TLR4/MD-2 de ratón, una estrategia que utiliza híbridos ratón-humano, por lo que los segmentos de las proteínas humanas TLR4 y MD-2 fueron reemplazados por los segmentos de ratón equivalentes utilizados para identificar regiones lineales definidas de TLR4 humano y MD-2 esenciales para la unión de los MAb. Además, estas regiones se mutaron en los residuos de aminoácidos que difieren entre las secuencias humanas y de ratón para identificar aminoácidos individuales esenciales para la unión de estos MAbs.
Generación de mutantes TLR4 híbridos ratón-humano.
Para generar el ratón-humano-humano-humano (MHHH), el TLR4 humano, clonado en el vector de expresión de mamíferos pADNC3.1(-)higro (Invitrogen) se modificó introduciendo un nuevo sitio HpaI y destruyendo un sitio HpaI existente por mutagénesis dirigida al sitio con los siguientes oligonucleótidos:
5' GACCATTGAAGAATTCCGGTTCTCTTGCTCTCCTCG 3' (SEQ ID NO: 55); 5' CGAGGTAGTAGTCTAAGTATGTTAACCGGAATTCTTCAATGGTC 3' (SEQ ID NO: 56) (introducción del nuevo sitio HpaI) y 5' GGCAACATTTAGAATTAGTCAA CTGTAAATTTGGACAG 3' (SEQ ID NO: 57); 5' CTGTCCAAATTTACAGTTG ACTAATTCTAAATGTTGCC 3' (SEQ ID NO: 58) (introducción del sitio HpaI existente). La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando el kit QuikChange™ (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. La región N-terminal de TLR4 de ratón se amplificó por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' ATTTGTATAGTTAACCTGAACTACTCATC 3' (SEQ ID NO: 59) y 5' GGGGCGGCCGGGGAAGCTTG AATCCCTGCATAG 3' (SEQ ID NO: 60). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector TLR4 humano mutado con HpaI (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción únicos NotI y HpaI.
Para generar HHHM, la región C-terminal de TLR4 de ratón se amplificó por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' GGGGATATCTTTGCAAACAC AACAAACTTGAC 3' (SEQ ID NO: 61) y 5' GGGCTCGAGCTTGTACATATAACAG GTAG 3' (SEQ ID NO: 62). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector TLR4 humano mediante la clonación en los sitios de restricción únicos EcoRV y XhoI.
Para generar MMHH, la construcción MHHH se modificó mediante mutagénesis dirigida (como anteriormente) para introducir un sitio de restricción Agel único en la secuencia TLR4 utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' GCTTTTTCAGAAGTTGATCTACCGGTCCTTG AGTTTCTAGATCTCAGT 3' (SEQ ID NO:63) y 5' ACTGAGATCTAG AAACTCAAGGACCGGTAGATCAACTTCTGAAAAAGC 3' (SEQ ID NO:64). En paralelo, se amplificó una región interna de TLR4 de ratón mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' CATTGATGAGTTCAGGTTAAC 3' (SEQ ID NO: 65) y 5' ATGCACCGGTAGGGCCACTTTTTTAAAACTG 3' (SEQ ID NO: 66). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MHHH mutado con Agel (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción HpaI y Agel únicos.
Para generar el híbrido de ratón-ratón-humano humano (MHMH), una región interna de ratón TLR4 se amplificó por PCR usando los siguientes oligonucleótidos: 5' ATGCACCGGTTCTCAGCTATCTAGATCTTAG 3' (SEQ ID NO: 67) y 5' ATGCGATATCTGAAAGGGTGTTGTCTTTGAAAG 3' (SEQ ID NO: 68). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MHHH mutado por Agel (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción únicos de Agel y EcoRV.
Para generar MMHHa, se amplificó una región interna de TLR4 humano mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' CCGTT AACATATACAAATGATTTT TCAGATGATATTGTTAAGTTCCATTGCTTGGCGAATGTTTCTGCAATGTCTCTGGC AGGTGTGACTATTGAAAGGGTAAAAG 3' (SEQ ID NO:69) y 5' CCACCGG TAGATCAACTTCTGAAAAAGC 3' (SEQ ID NO:70). Este fragmento de ADN reemplazó al fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MHHH mutado por Agel (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción HpaI y Agel únicos.
Para generar MMHHb, una región interna de TLR4 humano se amplificó por PCR usando los siguientes oligonucleótidos: 5' CCGTTAACATACTTAGACTACTA C 3' (SEQ ID NO: 71) y 5' GATATCTGAAAGGGTGTTGTCTTTGAAAGAATTGCCAGCC ATTTTTAATGTGTTGAGACTGGTCAAGCCAAGAAATATACCATCGAAGTCAATTT TGGTGTTAGTATGAGAAATGTCAAG 3' (SEQ ID NO: 72). Este fragmento de ADN reemplazó al fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MHHH mutado por Agel (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción HpaI y Agel únicos.
Generación de mutantes MD-2 híbridos ratón-humano.
En primer lugar, se modificó el MD-2 humano, clonado en el vector de expresión de mamíferos pADNC3.1(-) (Invitrogen) por mutagénesis dirigida al sitio (como anteriormente) para introducir un sitio de restricción AflII nuevo con los siguientes oligonucleótidos: 5' CTCTTTTTGCAGAGCTCTTAAGGGAGAGACTGTGAA 3' (SEQ ID NO: 73) y 5' TTCACAGTCTCTCCCTTAAGAGCTCTGCAAAAAAGAG 3' (SEQ ID NO: 74).
Para generar MHH, la región N-terminal de MD-2 de ratón se amplificó por PCR usando los siguientes oligonucleótidos: 5' GGAAGCTTAACCACCATG TTGCC 3' y 5' CCGGATCCCCTCAGTCTTATGC 3' (SEQ ID NO: 75). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MD-2 humano mutado en AflII (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción únicos de HindIII y BamHI.
Para generar HMH, se amplificó una región interna de MD-2 de ratón mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' CCGGATCCAATGGATTTGTG CATG 3' (SEQ ID NO: 76) y 5' GGCTTAAGAGCTCTGCAAAAGAATAGTC 3' (SEQ ID NO: 77). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MD-2 humano mutado en AflII (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción únicos de BamHI y AflII.
Para generar HHM, la región C-terminal de MD-2 de ratón se amplificó por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5' GGCTTAAGGGAGAGACTG TGAATACATC 3' (SEQ ID NO: 78) y 5' CCGCTAGCATTGACATCACGGC 3' (SEQ ID NO: 79). Este fragmento de ADN de ratón reemplazó el fragmento de ADN humano correspondiente en el vector MD-2 humano mutado en AflII (arriba) mediante clonación en los sitios de restricción únicos de AflII y NheI.
Generación de mutantes de escaneo de alanina TLR4 y MD-2 humanos.
Todos los mutantes se generaron por mutagénesis dirigida usando el kit QuikChange™ (Stratagene) como se indica anteriormente. Los oligonucleótidos de ADN que albergan las mutaciones de desajuste apropiadas se utilizaron con TLR4 humano en pADNC3.1(-)higro o MD-2 humano en pADNC3.1(-), según corresponda. La introducción de las mutaciones deseadas se verificó mediante secuenciación de ADN.
Transfección transitoria de células HEK 293.
Las células HEK 293, que expresan los antígenos T y EBNA grandes para permitir la replicación del plásmido episomal, se sembraron en 1 ml de medio de cultivo a 1x105 células/pozo en placas de cultivo de 24 pozos. Al día siguiente, las células se transfectaron con 1 |jg de ADN/pozo (0.5 |jg 0.5 |jg de cada plásmido para cotransfecciones) utilizando 1.5 jl/pozo de reactivo de transfección Fugene6™ (Roche), siguiendo las pautas del fabricante. Las células fueron analizadas 48-72 horas después de la transfección.
Citometría de flujo.
La unión de MAb a la superficie de células HEK 293 transfectadas con TLR4/MD-2 se midió mediante citometría de flujo. Se incubaron 1 x 105 células en placas de 96 pozos con fondo en V con el MAb adecuado a una concentración final de 10 |jg/ml en un volumen de 50-100 j l de tampón inFACS (1 x PBS, 100 jg/m l BSA, 0.05% NaN3). Después de una incubación de 30 minutos a 4°C, las células se sedimentaron, se lavaron una vez con 200 j l de tampón FACS, se repelieron y se resuspendieron con anticuerpo secundario conjugado con aloficocianina (APC) (Sondas moleculares) a una dilución de 1:250 en tampón FACS. Después de una incubación de 30 minutos a 4°C, las células se lavaron una vez en 200 j l de tampón FACS, se fijaron en paraformaldehído al 1%, 1 x PBS y se analizaron para determinar la fluorescencia usando un FACScalibur (Becton Dickinson) en el canal FL-4.
hu15C1 y hu7E3 se unen a una región interna de 87 aminoácidos de TLR4.
Se generaron cuatro mutantes híbridos ratón-humano de TLR4 para determinar la región precisa de TLR4 responsable de la unión a hu15C1 y hu7E3. La transfección transitoria de células HEK 293 permitió la presentación de formas de tipo salvaje (wt) o mutadas de TLR4 junto con wt MD-2 en la superficie celular. El análisis FACS (Figura 34 a y b) reveló que el complejo se expresó correctamente en tres de los cuatro casos (como se muestra en la tinción con c-myc y FLAG). La versión mutante de TLR4 MHMH tenía una expresión pobre en la superficie celular y no apoyaba la interacción con MD-2, lo que sugiere que la proteína no era conformacionalmente correcta. Esta observación significó que los resultados de la unión con hu15C1 y hu7E3 no se pudieron tener en cuenta. Mientras que las versiones MHHH y HHHM se unían a los pozos hu15C1 y hu7E3, MMHH fue negativa para la unión de ambos anticuerpos, lo que sugiere que una región interna de TLR4 de 87 aminoácidos (destacada en la Figura 34a) es esencial para la interacción entre TLR4 y hu15C1 o hu7E3.
Para determinar con más detalle los residuos importantes para la unión de hu15C1 y hu7E3, se generaron dos mutantes adicionales, por lo que los primeros 30 aminoácidos (MMHHa) o los últimos 32 aminoácidos (MMHHb) de esta región interna fueron reemplazados por la secuencia de ratón correspondiente (figura 35a). El análisis FACS (Figura 35 a y b) de células HEK 293 transfectadas reveló que el complejo se expresó correctamente en ambos casos (como se muestra mediante la tinción con c-myc y FLAG). hu15C1 se unió bien a MMHHa pero no mostró unión a MMHHb, lo que sugiere que los residuos situados hacia el extremo C de esta región interna son críticos para la unión. A la inversa, hu7E3 se unió bien a MMHHb pero no mostró unión a MMHHa, lo que sugiere que los residuos situados hacia el extremo N de esta región interna son críticos para la unión.
HTA125 reconoce una región N-terminal de TLR4.
HTA125 es un MAb no neutralizante disponible comercialmente dirigido contra TLR4 humano (E-biosciences). HTA125 se probó contra los cuatro híbridos ratón-humano y se encontró, en contraste con los MAbs 15C1 y 7E3 neutralizantes, una ausencia de unión cuando la región N-terminal de TLR4 se cambia de humano a ratón (Figura 34 a y c).
Residuos de aminoácidos esenciales de TLR4 para la unión de hu15C1 y hu7E3.
Con el fin de identificar residuos importantes dentro de la región de 87 aminoácidos de TLR4 identificada anteriormente, la secuencia humana se alineó con la secuencia de TLR4 de ratón correspondiente dentro de esta región (alineaciones realizadas utilizando el programa bl2seq). Dado que hu15C1 y hu7E3 no reaccionan de forma cruzada con TLR4/MD-2 de ratón, se asumió que los residuos esenciales para la unión de MAb no se conservarían entre las dos especies. Todos los residuos no conservados en la secuencia humana se mutaron a alanina. Se construyeron 20 versiones mutantes (QC 1 a QC 20), cada una con dos o tres residuos convertidos en alaninas (Figura 36a).
Después de la transfección transitoria de estos mutantes junto con wt MD-2 en células HEK 293, se utilizaron MAb C-myc y hu18H10 para detectar la presencia de TLR4 y MD-2, respectivamente, en la superficie celular. El análisis FACS (Figura 36b) mostró que todos los mutantes de TLR4 se expresaron a un nivel muy por encima del fondo. Todos los mutantes se unieron al pozo MD-2 con la excepción de QC 6. Para determinar el nivel de unión de hu15C1 y hu7E3 al TLR4 mutante, se obtuvo un valor "normalizado" al dividir la intensidad de fluorescencia media (MFI) obtenida con el MAb por el obtenido con C-myc. Esto permitió la variación en el nivel de expresión en la superficie celular entre los mutantes de TLR4. Para hu15C1, se observó que la unión normalizada estaba muy disminuida para las versiones QC 10, QC 15 y QC 20. Para hu7E3, QC 1, QC 2, QC 6 y QC 7 mostraron una unión hu7E3 muy reducida, aunque como hu7E3 requería la presencia de MD-2 para la unión, la falta de unión a QC 6 podría explicarse simplemente por la ausencia de MD-2 en la superficie celular (Véase hu18H10 MFI para QC 6). Estos resultados confirman que los residuos importantes para la unión de hu15C1 se encuentran en el extremo C terminal de la sección de 87 aminoácidos identificada anteriormente, mientras que los residuos importantes para la unión de hu15C1 están ubicados hacia el extremo N terminal.
hu18H10 se une a una región N-terminal de 39 aminoácidos de MD-2.
Se generaron tres mutantes híbridos ratón-humano de MD-2 para determinar la región precisa de la proteína responsable de la unión a hu18H10. La transfección transitoria de células HEK 293 permitió la presentación de formas de tipo salvaje (wt) o mutadas de MD-2 junto con wt TLR4 en la superficie celular. El análisis FACS (Figura 37 a y b) reveló que el complejo se expresó correctamente en los tres casos (como se muestra en la tinción con hu15C1 y C-myc). Mientras que las versiones HMH y HHM se unieron a ambos hu18H10, MHH fue negativa para la unión, lo que sugiere que una región N-terminal de 39 aminoácidos de MD-2 (destacada en la Figura 37a) es esencial para la interacción entre MD-2 y hu18H10.
Residuos de aminoácidos MD-2 esenciales para la unión de hu18H10.
Con el fin de identificar residuos importantes dentro de la región de 39 aminoácidos de MD-2 identificada anteriormente, la secuencia humana se alineó con la secuencia de MD-2 de ratón correspondiente dentro de esta región (alineaciones realizadas utilizando el programa bl2seq). Dado que hu18H10 no reacciona de forma cruzada con el ratón TLR4/MD-2, se asumió que los residuos esenciales para la unión de Mab no se conservarían entre las dos especies. Por lo tanto, mutar todos los residuos no conservados en la secuencia humana se mutaron a alanina. Se construyeron 14 versiones mutantes (QC 1 a QC 14), cada una conteniendo un único residuo convertido en alanina (Figura 38a).
Después de la transfección transitoria de estos mutantes junto con TLR4 wt en células HEK 293, se usaron MAb hu15C1 y anti-6xHIS para detectar la presencia de TLR4 y MD-2, respectivamente, en la superficie celular. El análisis FACS (Figura 38b) mostró que todos los mutantes de TLR4 se expresaron a un nivel muy por encima del fondo, con la excepción de QC7 que parece estar mal expresado o ha perdido su capacidad de interactuar con TLR4 (n.b. TLR4 se expresó bien después de la cotransfección con QC 7). Para determinar el nivel de unión de hu18H10 a las versiones mutadas MD-2, se obtuvo un valor "normalizado" al dividir la intensidad de fluorescencia media (MFI) obtenida con el hu18H10 por la obtenida con C-myc. Esto permitió la variación en el nivel de expresión en la superficie celular entre los mutantes MD-2. Para hu18H10, se observó que la unión normalizada estaba muy disminuida para la versión QC 13. Estos resultados confirman que un residuo importante para la unión de hu18H10 se encuentra dentro de la sección terminal de 37 aminoácidos N de MD-2 identificada anteriormente.
Ejemplo 40: El anticuerpo monoclonal humanizado hu18H10 inhibe la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre entera humana
Con el fin de demostrar la capacidad neutralizadora del anticuerpo monoclonal humanizado hu18H10 para LPS, se prueba la capacidad de hu18H10 para inhibir la inducción de IL-6 de la sangre entera humana dependiente de LPS (como se describe anteriormente). La capacidad del anticuerpo hu18H10 para inhibir los efectos del LPS en los leucocitos de la sangre se compara con la del anticuerpo quimérico 18H10 descrito anteriormente.
Ejemplo 41: El anticuerpo monoclonal humanizado hu7E3 inhibe la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre entera humana
Para demostrar la capacidad neutralizadora de los anticuerpos monoclonales humanizados hu7E3 para LPS, se prueba la capacidad del anticuerpo hu7E3 para inhibir la inducción de IL-6 de la sangre entera humana dependiente de LPS (como se describió anteriormente). La capacidad del anticuerpo hu7E3 para inhibir los efectos del LPS en los leucocitos de la sangre se compara con la del anticuerpo quimérico 7E3 descrito anteriormente.
Ejemplo 42: El anticuerpo monoclonal humanizado hu15C1 inhibe la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre entera humana
Para demostrar la capacidad neutralizadora de los anticuerpos monoclonales humanizados hu15C1 para LPS, se probó la capacidad del anticuerpo hu15C1 para inhibir la inducción de IL-6 de la sangre entera humana dependiente de LPS (como se describió anteriormente). La capacidad del anticuerpo hu15C1 para inhibir los efectos del LPS en los leucocitos de la sangre se comparó con la del anticuerpo quimérico 15C1 descrito anteriormente (Figura 44).
Otras realizaciones
Aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente a un complejo del receptor 4 similar a Toll (TLR4)/MD-2. en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 45, y la secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera de ID SEQ NO: 48.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, para uso como un medicamento.
3. Un uso de un anticuerpo como en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para aliviar un síntoma de una patología asociada con una señalización TLR4 aberrante en un sujeto, en donde la patología se selecciona del grupo que consiste en sepsis, lesión pulmonar inducida por ventilador, inflamación aguda, inflamación crónica, enfermedades autoinmunes y trastornos inducidos por factores de estrés solubles endógenos, en los que dicho trastorno inducido por factores de estrés solubles endógenos es la osteoartritis o la artritis reumatoide.
4. El uso de la reivindicación 3, en donde el sujeto es un ser humano.
5. El uso de la reivindicación 3, en donde el medicamento se administra en una cantidad de dicho anticuerpo suficiente para aliviar el síntoma de la patología asociada con la señalización TLR4 aberrante y en donde dicha cantidad es una cantidad suficiente para reducir la producción de citoquinas proinflamatorias inducida por LPS.
6. El uso de la reivindicación 3, en donde dicha inflamación crónica está asociada con una afección alérgica o asma.
7. El uso de la reivindicación 3, en donde dicha patología es un trastorno inflamatorio del intestino o aterosclerosis.
8. El uso de la reivindicación 3, en donde dicho factor de estrés soluble endógeno es Hsp60, fibronectina, sulfato de heparano, hialuronano, gp96, P-Defensina-2 o proteína surfactante A.
9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como en la reivindicación 1 y un vehículo.
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