JP2011190273A - 中和抗体およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるシグナリングをモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する方法および組成物の提供。
【解決手段】本発明は、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識するモノクローナル抗体、ならびにＴＬＲ４／ＭＤ２複合体およびＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４を認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、療薬としてヒト化モノクローナル抗体を使用する方法をさらに提供する。本発明はまた、可溶性キメラタンパク質、可溶性キメラタンパク質を発現させる方法および可溶性キメラタンパク質を精製する方法、ならびに治療薬として可溶性キメラタンパク質を使用する方法、可溶性キメラタンパク質を抗体のスクリーニングアッセイにおいて使用する方法、および可溶性キメラタンパク質を抗体の産生において使用する方法を提供する。
【選択図】図４４

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識する中和モノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）の産生、Ｔｏｌｌ様レセプター４／ＭＤ−２レセプター複合体およびＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴｏｌｌ様レセプター４の両方を認識するモノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）の産生、ならびに治療薬としてそのモノクローナル抗体を使用する方法に関する。
（発明の背景）
最初にショウジョウバエにおいて見出されたＴｏｌｌレセプターは、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、そのタンパク質の細胞外部分にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）および１つまたは２つのシステインリッチドメインを有する。上記ショウジョウバエＴｏｌｌレセプターの哺乳動物のホモログは、「Ｔｏｌｌ様レセプター」（ＴＬＲ）として公知である。ＴＬＲは、微生物粒子を認識し、そしてこれらの微生物粒子の供給源に対して免疫細胞を活性化することによって先天免疫において役割を果たす。
現在、Ｔｏｌｌ様レセプターの１０種の型が、ヒトにおいて同定されている（ＴＬＲ １〜ＴＬＲ １０）。これらのＴＬＲは、ＩＬ−１レセプターの細胞内ドメインに対するそれらの細胞内ドメインの相同性、および細胞外のロイシンリッチリピートの存在によって特徴付けられる。異なる型のＴＬＲは、異なる型の微生物粒子によって活性化される。例えば、ＴＬＲ４は、主にリポ多糖類（ＬＰＳ）によって活性化されるが、ＴＬＲ２は、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）；リポタンパク質（ＢＬＰ）、およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）によって活性化される。Ｔｏｌｌレセプターホモログ（例えば、ＲＰ１０５）もまた、同定されている。
骨髄分化タンパク質−２（ＭＤ−２）（ＴＬＲ４アクセサリータンパク質）が、同定され、そして特徴付けられている。このタンパク質は、ＴＬＲ４と直接相互作用することが見出されており、そしてＭＤ−２は、ＴＬＲ４の翻訳後修飾を可能にし、そして細胞表面へのＴＬＲ４の輸送を容易にする能力を有する。ＴＬＲ４およびＭＤ−２は、その細胞表面上で複合体を形成する。
グラム陰性菌の成分であるリポ多糖類（ＬＰＳ）は、先天免疫系を強力に活性化し得る微生物粒子である。ＬＰＳは、免疫細胞にその多鎖レセプター（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｉｎ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介してシグナルを伝達し、その多鎖レセプターは、シグナリングの主成分（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）としてＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を含む。
したがって、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるシグナリングをモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する方法および組成物に対する必要性が、存在する。
（発明の要旨）
本発明は、細胞表面上に発現されたＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプターを認識するモノクローナル抗体を提供する。上記抗体は、ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を遮断（例えば、中和）し得る。上記モノクローナル抗体は、例えば、ヒト化抗体である。本発明の抗体は、上記ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を結合する抗体を含み、そしてまた、ＭＤ−２の存在とは独立してＴＬＲ４を結合する抗体を含む。本発明の抗体はまた、上記ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体のＴＬＲ４部分を結合する抗体を含むが、その結合は、完全にＭＤ−２の存在に依存する。さらに、本発明の抗体は、上記ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を結合する抗体を含み、そしてまた、ＴＬＲ４の存在下においてのみＭＤ−２を結合する抗体を含む。
本発明の例示の抗体としては、例えば、１８Ｈ１０抗体、１６Ｇ７抗体、１５Ｃ１抗体および７Ｅ３抗体が挙げられる。これらの抗体は、上記ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体に対する特異性を示し、そしてそれらの抗体は、ＬＰＳによるレセプター活性化、およびその後の細胞内シグナリングを阻害することが示されている。これらの抗体は、異なる特異性を有する。例えば、１５Ｃ１は、ＭＤ−２の存在とは独立してＴＬＲ４を結合し、７Ｅ３は、ＴＬＲ４に結合するが、その結合は、ＭＤ−２の存在に依存し、そして１８Ｈ１０は、ＭＤ−２に結合するが、このＭＡｂは、ＭＤ−２の可溶性形態を結合しないので、ＴＬＲ４の存在を必要とする。
本明細書中で使用される場合、用語「１６Ｇ７」、「ｍｕ１６Ｇ７」、「７Ｅ３」、「ｍｕ７Ｅ３」、「１５Ｃ１」、「ｍｕ１５Ｃ１」、「１８Ｈ１０」または「ｍｕ１８Ｈ１０」とは、マウスモノクローナル抗体をいい、そして用語「ｈｕ７Ｅ３」、「ｈｕ１５Ｃ１」、または「ｈｕ１８Ｈ１０」とは、ヒト化モノクローナル抗体をいう。
本発明のマウスモノクローナル抗体は、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７、配列番号１７、配列番号２７または配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。３個の重鎖ＣＤＲは、ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；ＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）；ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択される配列と、少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖は、ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；ＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）；ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む３個のＣＤＲを有する。上記抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合するか、ＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４に結合するか、またはその両方に結合する。
本発明のヒト化抗体は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１および配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。本発明のヒト化抗体は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、および配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。上記３個の重鎖ＣＤＲは、ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。３個の軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。上記抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合するか、ＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４に結合するか、またはその両方に結合する。
本発明の抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合し、その抗体は、配列番号５４の残基２８９と残基３７５との間のヒトＴＬＲ４上の１個以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。例えば、上記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基２９３〜残基２９５；配列番号５４の少なくとも残基２９６および残基２９７；配列番号５４の少なくとも残基３１９〜残基３２１；配列番号５４の少なくとも残基３２８および残基３２９；配列番号５４の少なくとも残基３４９〜残基３５１；ならびに配列番号５４の少なくとも残基３６９〜残基３７１からなる群より選択される残基を含むエピトープに特異的に結合する。例えば、上記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３２８、残基３２９、残基３４９〜残基３５１および残基３６９〜残基３７１を含むエピトープに特異的に結合する。別の例において、上記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基２９３〜残基２９５、残基２９６、残基２９７および残基３１９〜残基３２１を含むエピトープに特異的に結合する。
本発明の抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ複合体を結合し、その抗体は、配列番号４４の残基１９と残基５７との間のヒトＭＤ−２上のエピトープに結合する。例えば、上記抗体は、配列番号４４の少なくとも残基５３を含むエピトープに特異的に結合する。
本発明の抗体はまた、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合するヒト化抗体を含み、その抗体は、１μｇ／ｍｌの濃度にて、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性の炎症促進性サイトカイン産生の、５０％より大きい阻害を示す。例えば、本発明の抗体は、１μｇ／ｍｌの濃度にてヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生の、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％より大きい阻害を示す。本明細書中で使用される場合、用語「炎症促進性サイトカイン」とは、炎症を促進しそして／または炎症と関連する免疫調節性サイトカインをいう。炎症促進性サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１７、およびＩＬ１８が挙げられる。
本発明の抗体は、例えば、ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を、市販の抗ＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体ＨＴＡ１２５の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、または１００倍以上阻害する。
本発明はまた、異常なＴＬＲ４／ＭＤ−２活性化および／もしくは異常なＬＰＳ活性（例えば、異常なＩＬ−８産生などの異常な炎症促進性サイトカイン産生）に関連する病理を処置するか、または予防する方法、あるいは本発明のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）を、このような処置または予防が望まれる被験体に投与することによってこのような病理に関連する症状を緩和する方法を提供する。処置される被験体は、例えば、ヒトである。上記モノクローナル抗体は、病理に関連する症状を処置するか、予防するか、または緩和するのに十分な量で投与される。上記被験体において病理を処置するか、または予防するのに十分なモノクローナル抗体の量は、例えば、１種以上の炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−８）のＬＰＳ誘導性の産生を減少させるのに十分である量である。本明細書中で使用される場合、用語「減少させる」とは、本発明のモノクローナル抗体の存在下における炎症促進性サイトカイン産生の低下をいい、その産生は、例えば、局所性（例えば、炎症を起こした組織の一部）の炎症促進性サイトカイン産生または全身性の炎症促進性サイトカイン産生である。炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−８）のＬＰＳ誘導性の産生は、低下し、このとき本発明のモノクローナル抗体の存在下における炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−８）産生のレベルは、炎症促進性サイトカイン産生のコントロールレベル（すなわち、上記モノクローナル抗体の非存在下における炎症促進性サイトカイン産生のレベル）より、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％以上低い。炎症促進性サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−８またはＩＬ−６）のレベルは、例えば、本明細書中に記載されるヒト全血のアッセイまたはｈｕＴＬＲ４／ＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のアッセイを使用して測定される。当業者は、炎症促進性サイトカイン産生のレベルが種々のアッセイ（例えば、市販のＥＬＩＳＡキットが挙げられる）を使用して測定され得ることを認識する。
本発明のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナルまたはヒト化モノクローナル抗体）を使用して処置および／または予防される病理としては、例えば、微生物の生成物によって誘導される敗血症、急性炎症、慢性炎症（例えば、アレルギー状態に関連する慢性炎症および喘息）、自己免疫疾患（例えば、ＩＢＤおよびアテローム硬化症）、および機械的ストレスが内因性の可溶性ストレス因子（例えば、Ｈｓｐ６０、フィブロネクチン、硫酸ヘパリン、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２およびサーファクタント蛋白Ａ）の発現を誘導する疾患が挙げられる。機械的ストレスが内因性の可溶性ストレス因子の発現を誘導する病理としては、例えば、変形性関節症および関節リウマチが挙げられる。機械的ストレスに関連する病理はまた、レスピレータ、人工呼吸器および他の呼吸補助デバイスにおかれる被験体および患者において生じ得る。このような病理としては、例えば、人工呼吸器関連肺傷害（「ＶＡＬＩ」）とも称される人工呼吸による肺の傷害（「ＶＩＬＩ」）が挙げられる。
本発明に従う薬学的組成物は、本発明の抗体およびキャリアを含み得る。これらの薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキット中に含まれ得る。
本発明はまた、可溶性キメラｔｏｌｌレセプタータンパク質（本明細書中でｔｏｌｌ様レセプタータンパク質とも称される）、ｔｏｌｌレセプタータンパク質を発現させるための方法、および可溶性形態でこのようなタンパク質を精製するための方法を提供する。
本発明は、キメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドにおいて、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、もしくはその生物学的に活性な誘導体が、ＭＤアクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体に作動可能に結合される。上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、ＴＬＲ １〜ＴＬＲ １０およびＲＰ１０５からなる群より選択されるポリペプチドである。
上記ＭＤアクセサリーポリペプチドは、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２である。上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、いくつかの場合において、柔軟なグリシン−セリンリンカーを使用してＭＤアクセサリーポリペプチドに結合され、このリンカーは、そのｔｏｌｌレセプターを、発現の間、安定にし、かつ精製の間、可溶性にする。例えば、本発明のキメラポリペプチドは、ｔｏｌｌレセプターの細胞外部分を含み、そのｔｏｌｌレセプターは、そのＣ末端において柔軟なグリシン／セリンリンカーを介して成熟ＭＤタンパク質（すなわち、ＭＤ−１またはＭＤ−２）のＮ末端に融合される。
本発明はまた、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、もしくはその生物学的に活性な誘導体を、ＭＤアクセサリーポリペプチド、またはその生物学的に活性な誘導体にカップリングすることによって可溶性キメラ融合タンパク質を産生するための方法を提供する。本発明はまた、ＭＤアクセサリーポリペプチド（またはその生物学的に活性な誘導体）をコードする核酸配列にカップリングされた、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド（またはその生物学的に活性な誘導体）をコードする核酸配列を含むベクターを構築し；このベクターを用いて細胞をトランスフェクトし；ＭＤアクセサリーポリペプチドにカップリングされたｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドを有する融合タンパク質の産生を許容する条件下でその細胞を培養し；そしてその融合タンパク質を単離することによって、可溶性キメラ融合タンパク質を産生するための方法を提供する。上記ＭＤアクセサリーポリペプチドは、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２であり、そして上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、ＴＬＲ １〜ＴＬＲ １０およびＲＰ１０５からなる群より選択されるポリペプチドであり得る。上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、柔軟なグリシン−セリンリンカーによって上記ＭＤアクセサリーポリペプチドに作動可能に結合され、このリンカーは、そのｔｏｌｌレセプターを、発現の間、安定にし、かつ精製の間、可溶性にする。
本発明はまた、本発明の可溶性キメラポリペプチドを被験体に投与することによって、異常なｔｏｌｌ様レセプターの機能に関連する病理を処置するか、もしくは予防する方法、またはこれらの病理に関連する症状を緩和する方法を提供し、上記被験体において、このような処置もしくは予防または緩和が、望まれ、上記可溶性キメラポリペプチドは、上記被験体において上記病理もしくはその症状を、処置もしくは予防または緩和するのに十分な量で投与される。処置される被験体は、例えば、ヒトである。上記被験体において上記病理を処置するか、または予防するのに十分な可溶性キメラポリペプチドの量は、処置される被験体におけるｔｏｌｌ様レセプター活性化をモジュレート（例えば、減少または妨害）するのに十分である。ｔｏｌｌ−レセプター活性化は、減少するか、または低下し、このとき本発明のキメラタンパク質の存在下におけるｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルは、ｔｏｌｌ様レセプター活性化のコントロールレベル（すなわち、上記キメラタンパク質の非存在下におけるレベル）より、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％以上低い。ｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルは、当該分野において公知である任意の種々の技術を使用して測定される。例えば、ＴＬＲ４活性化のレベルは、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生のレベルを検出することによって測定され得る。当業者は、ｔｏｌｌ−レセプター活性化のレベルが、例えば、あるならば、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＩＬ６、およびＴＮＦ−α）をコードする遺伝子の転写を開始するＮＦ−κＢまたはＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎ末端キナーゼ）の活性化を検出することによって測定され得ることを認識する。ＪＮＫおよび／またはＮＦ−κＢの活性化は、１種以上の炎症促進性サイトカインのレベルを測定することによって検出され得る。
いくつかの実施形態において、処置される病理は、敗血症、急性炎症、慢性炎症または自己免疫疾患である。例えば、上記病理は、種々の型の関節炎のうちのいずれか１つである。
本発明はまた、例えば、モノクローナル抗体またはヒト化抗体などの、本発明の可溶性キメラポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を含む。
本発明に従う薬学的組成物は、本発明の可溶性キメラポリペプチドおよびキャリア、ならびに／または本発明の抗体およびキャリアを含み得る。これらの薬学的組成物は、例えば、診断キットのようなキット中に含まれ得る。
本発明はまた、ｔｏｌｌ様レセプターを結合し、そしてｔｏｌｌ様レセプター活性をモジュレートするリガンドについてスクリーニングする方法を提供する。本発明のこれらの方法に従って、これらのリガンドは、本発明のキメラポリペプチド（このポリペプチドに起因する特性または機能を有する）を提供し；そのキメラポリペプチドと候補化合物とを接触させ；そしてその候補化合物がそのポリペプチドに起因する特性または機能を変化させるか否かを決定することによって同定され、その候補化合物の存在におけるそのポリペプチドに起因する特性または機能の変化は、その候補化合物がｔｏｌｌ様レセプター活性をモジュレートするリガンドであることを示す。
当業者は、本発明のキメラポリペプチドおよび抗体が種々の用途を有することを認識する。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、敗血症、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患および種々の形態の関節炎などの障害においてＴＬＲの活性化を予防する治療剤として使用される。本発明のキメラタンパク質はまた、結合する抗ＴＬＲ抗体および遮断する抗ＴＬＲ抗体を産生する、より効率的な方法において免疫原として使用され、そして／またはこれらのキメラポリペプチドは、ＴＬＲの低分子量結合因子およびＴＬＲ活性の低分子量遮断因子についてスクリーニングするアッセイにおいて、試薬として使用され得る。本発明のキメラタンパク質および／もしくは抗体はまた、診断キットにおける試薬または診断ツールとして使用され、あるいはこれらのキメラタンパク質および／もしくは抗体は、治療用試薬を生成するための競合アッセイにおいて使用され得る。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合する抗体であって、該抗体は、配列番号５４の残基２８９と残基３７５との間のヒトＴＬＲ４上の１個以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、抗体。
（項目２）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３２８と残基３２９とを含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３４９〜残基３５１を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３６９〜残基３７１を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３２８、残基３２９、残基３４９〜残基３５１および残基３６９〜残基３７１を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基２９３〜残基２９５を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基２９６と残基２９７とを含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目８）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基３１９〜残基３２１を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記抗体は、配列番号５４の少なくとも残基２９３〜残基２９５、残基２９６、残基２９７および残基３１９〜残基３２１を含むエピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目１０）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合する抗体であって、該抗体は、配列番号４４の残基１９と残基５７との間のヒトＭＤ−２上のエピトープに結合する、抗体。
（項目１１）
前記抗体は、配列番号４４の少なくとも残基５３を含むエピトープに特異的に結合する、項目１０に記載の抗体。
（項目１２）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に免疫特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖を含む、ヒト化抗体。
（項目１３）
前記抗体は、ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３個のＣＤＲを有する軽鎖をさらに含む、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に免疫特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；ＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）；ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；ＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）；ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３個のＣＤＲを有する軽鎖を含む、ヒト化抗体。
（項目１５）
前記抗体は、ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；ＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）；ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、ＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）；ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖をさらに含む、項目１４に記載の抗体。
（項目１６）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に免疫特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１および配列番号５２からなる群より選択される重鎖可変アミノ酸配列を含む、ヒト化抗体。
（項目１７）
前記抗体は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５３からなる群より選択される軽鎖可変アミノ酸配列をさらに含む、項目１６に記載の抗体。
（項目１８）
Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体に免疫特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５３からなる群より選択される軽鎖可変アミノ酸配列を含む、ヒト化抗体。
（項目１９）
前記抗体は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１および配列番号５２からなる群より選択される重鎖可変アミノ酸配列をさらに含む、項目１８に記載の抗体。
（項目２０）
異常なＴＬＲ４シグナリングに関連する病理の症状を緩和する方法であって、該方法は、項目１、１２、１４、１６および１８のいずれか１項に記載の抗体を、その必要がある被験体に、該被験体において該病理の症状を緩和するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記被験体は、ヒトである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
異常なＴＬＲ４シグナリングに関連する前記病理の症状を緩和するのに十分な前記抗体の量は、ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を減少させるのに十分な量である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記病理は、敗血症、人工呼吸による肺の傷害、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患、および内因性の可溶性ストレス因子によって誘導される障害からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記慢性炎症は、アレルギー状態または喘息に関連する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記病理は、炎症性腸障害またはアテローム硬化症である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記内因性の可溶性ストレス因子によって誘導される障害は、変形性関節症または関節リウマチである、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記内因性の可溶性ストレス因子は、Ｈｓｐ６０、フィブロネクチン、硫酸ヘパリン、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２またはサーファクタント蛋白Ａである、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
項目１、１２、１４、１６および１８のいずれか１項に記載の抗体ならびにキャリアを含有する、薬学的組成物。
（項目２９）
項目１、１２、１４、１６および１８のいずれか１項に記載の抗体を備える、キット。
図１は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する本明細書中で「１８Ｈ１０」と称されるマウスモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結合の特異性は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用したフローサイトメトリーによって示される。ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞を使用した結果は、塗りつぶした（ｆｉｌｌｅｄ）グラフ（左）において示され、一方で、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用した結果は、輪郭のグラフ（右）として示される。 図２は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ１８Ｈ１０による阻害を示すグラフである。上記細胞は、ｍｕ１８Ｈ１０、ＨＴＡ １２５（市販の抗ヒトＴＬＲ４非遮断ＭＡｂ）または抗体コントロールのいずれかと一緒に、示される濃度にてインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。 図３は、ヒト全血におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生の、モノクローナル抗体ｍｕ１８Ｈ１０による阻害を示す一連のグラフである。全血は、３人の健康なボランティアから引き出され、ヘパリンによって処理され、そしてＲＰＭＩ培地において１：４に希釈された。以下の抗体が、示される濃度にて添加された：コントロールモノクローナル抗体、ＨＴＡ１２５およびｍｕ１８Ｈ１０。次いでＬＰＳが、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にわたって添加され、そしてＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の６時間後に測定された。 図４は、ＭＤ−２に対する上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図４は、ＭＤ−２に対する上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図４は、ＭＤ−２に対する上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１８Ｈ１０抗体の特異性は、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された場合の、バキュロウイルス感染昆虫細胞の上清から精製された組換え可溶性ＭＤ−２に対するｍｕ１８Ｈ１０の特異性の欠如を示すグラフである。タンパク質を、９６ウェルプレート（５μｇ／ｍｌ）上に直接コーティングし、次いで示された濃度における精製ＭＡｂ、および抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰをコーティングした。 図５Ｂは、上記ｍｕ１８Ｈ１０抗体がＭＤ−２を認識するためには、ＭＤ−２がＴＬＲ４と結合される必要があることを示すグラフである。示されるように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞由来の溶解物（パネル１、すなわち、上のパネル）または上清（パネル２、すなわち、下のパネル）は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２によってコーティングされたウェル中でインキュベートされた。ｍｕ１８Ｈ１０のビオチン化形態の結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して検出された。ストレプトアビジン−ＨＲＰを伴うビオチン化１２Ｄ４（抗ＴＬＲ４ ＭＡｂ）、または抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを伴う可溶性ＭＤ−２に対して惹起されたポリクローナルウサギＡｂは、それぞれ、ＴＬＲ４の存在およびＭＤ−２の存在を制御した。この実験において、ＴＬＲ４は、そのＮ末端にＦＬＡＧタグを有し、そしてそのＴＬＲ４は、ベクターｐＣＮＤＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して発現された。ＭＤ−２は、そのＣ末端にＦＬＡＧタグおよび６×ヒスチジンタグを有し、そしてそのＭＤ−２は、ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して発現された。ｍｏｃｋ細胞は、空プラスミドによってトランスフェクトされた。 図６Ａ〜図６Ｆは、ｍｕ１８Ｈ１０の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１）（図６Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２）（図６Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号６）（図６Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号７）（図６Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３、４および５）（図６Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号８、９および１０）（図６Ｆ）は、図６Ｂおよび図６Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図６Ａ〜図６Ｆは、ｍｕ１８Ｈ１０の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１）（図６Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２）（図６Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号６）（図６Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号７）（図６Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３、４および５）（図６Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号８、９および１０）（図６Ｆ）は、図６Ｂおよび図６Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図７は、キメラＭＡｂとして発現されたｍｕ１８Ｈ１０（「キメラ１８Ｈ１０」）のＶＨヌクレオチド配列およびＶＬヌクレオチド配列がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にて、キメラ１８Ｈ１０、またはアイソタイプが一致するコントロールＭＡｂを使用したフローサイトメトリーによって示される。 図８は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記キメラ１８Ｈ１０ＭＡｂによる阻害を示すグラフである。細胞は、示された濃度におけるｍｕ１８Ｈ１０またはキメラ１８Ｈ１０と一緒にインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。上記キメラ１８Ｈ１０によるＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生の阻害は、本発明の１８Ｈ１０マウスＭＡｂによる阻害と同様であった。 図９は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する本明細書中で「１６Ｇ７」と称されるマウスモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結合の特異性は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用したフローサイトメトリーによって示される。ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞を使用した結果は、塗りつぶしたグラフ（左）において示され、一方で、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用した結果は、輪郭のグラフ（右）として示される。 図１０は、上記モノクローナル抗体ｍｕ１６Ｇ７による、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。上記細胞は、ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体、ＨＴＡ １２５抗ＴＬＲ４ ＭＡｂまたは抗体コントロールのいずれかと一緒に、示される濃度にてインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。 図１１は、ヒト全血におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ１６Ｇ７による阻害を示す一連のグラフである。全血は、３人の健康なボランティアから引き出され、ヘパリンによって処理され、そしてＲＰＭＩ培地において１：４に希釈された。以下の抗体が、示される濃度にて添加された：アイソタイプが一致するコントロール；ＨＴＡ１２５（抗ヒトＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体）；ｍｕ１６Ｇ７および２８Ｃ５（抗ヒトＣＤ１４遮断モノクローナル抗体）。次いでＬＰＳが、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にわたって添加された。 図１２は、ＴＬＲ４に対する上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図１２は、ＴＬＲ４に対する上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図１２は、ＴＬＲ４に対する上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１６Ｇ７抗体の特異性は、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＡ、ＥおよびＩ）；ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＢ、ＦおよびＪ）；ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ、ＧおよびＫ）；またはヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ、ＨおよびＬ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図１３Ａ〜図１３Ｆは、ｍｕ１６Ｇ７の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１１）（図１３Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号１２）（図１３Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号１６）（図１３Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号１７）（図１３Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号１３、１４および１５）（図１３Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号１８、１９および２０）（図１３Ｆ）は、図１３Ｂおよび図１３Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図１３Ａ〜図１３Ｆは、ｍｕ１６Ｇ７の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号１１）（図１３Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号１２）（図１３Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号１６）（図１３Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号１７）（図１３Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号１３、１４および１５）（図１３Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号１８、１９および２０）（図１３Ｆ）は、図１３Ｂおよび図１３Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図１４は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する本明細書中で「１５Ｃ１」と称されるマウスモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結合の特異性は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用したフローサイトメトリーによって示される。ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞を使用した結果は、塗りつぶしたグラフ（左）において示され、一方で、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用した結果は、輪郭のグラフ（右）として示される。 図１５は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ１５Ｃ１による阻害を示すグラフである。上記細胞は、上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体、ＨＴＡ １２５（抗ヒトＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体）およびアイソタイプが一致するコントロール（ＩｇＧ１）と一緒に、示される濃度にてインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。 図１６は、ヒト全血におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ１５Ｃ１による阻害を示す一連のグラフである。全血は、３人の健康なボランティアから引き出され、ヘパリンによって処理され、そしてＲＰＭＩ培地において１：４に希釈された。以下の抗体が、示される濃度にて添加された：アイソタイプが一致するコントロール（ＩｇＧ１）；ＨＴＡ１２５（抗ヒトＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体）；ｍｕ１５Ｃ１および２８Ｃ５（抗ヒトＣＤ１４遮断モノクローナル抗体）。次いでＬＰＳが、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にわたって添加された。 図１７は、ＴＬＲ４に対する上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１５Ｃ１抗体の特異性は、ｍｏｃｋベクター（すなわち、空ベクター）（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図１７は、ＴＬＲ４に対する上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ１５Ｃ１抗体の特異性は、ｍｏｃｋベクター（すなわち、空ベクター）（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図１８Ａ〜図１８Ｆは、ｍｕ１５Ｃ１の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号２１）（図１８Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２２）（図１８Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号２６）（図１８Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号２７）（図１８Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号２３、２４および２５）（図１８Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号２８、２９および３０）（図１８Ｆ）は、図１８Ｂおよび図１８Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図１８Ａ〜図１８Ｆは、ｍｕ１５Ｃ１の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号２１）（図１８Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号２２）（図１８Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号２６）（図１８Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号２７）（図１８Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号２３、２４および２５）（図１８Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号２８、２９および３０）（図１８Ｆ）は、図１８Ｂおよび図１８Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図１９は、キメラＭＡｂとして発現されたｍｕ１５Ｃ１（「キメラ１５Ｃ１」）のＶＨヌクレオチド配列およびＶＬヌクレオチド配列がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にて、キメラ１５Ｃ１、またはアイソタイプが一致するコントロールモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって示される。 図２０は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記キメラ１５Ｃ１ ＭＡｂによる阻害を示すグラフである。細胞は、示された濃度におけるｍｕ１５Ｃ１またはキメラ１５Ｃ１と一緒にインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。上記キメラ１５Ｃ１によるＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生の阻害は、本発明の１５Ｃ１マウスＭＡｂによる阻害と同様であった。 図２１は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する本明細書中で「７Ｅ３」と称されるマウスモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結合の特異性は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞またはＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用したフローサイトメトリーによって示される。ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞を使用した結果は、塗りつぶしたグラフ（左）において示され、一方で、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト細胞を使用した結果は、輪郭のグラフ（右）として示される。 図２２は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ７Ｅ３による阻害を示すグラフである。上記細胞は、上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体、ＨＴＡ １２５（抗ヒトＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体）およびアイソタイプが一致するコントロール（ＩｇＧ１）と一緒に、示される濃度にてインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。 図２３は、ヒト全血におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生の、上記モノクローナル抗体ｍｕ７Ｅ３による阻害を示す一連のグラフである。全血は、３人の健康なボランティアから引き出され、ヘパリンによって処理され、そしてＲＰＭＩ培地において１：４に希釈された。以下の抗体が、示される濃度にて添加された：アイソタイプが一致するコントロール（ＩｇＧ１）；ＨＴＡ１２５（抗ヒトＴＬＲ４非遮断モノクローナル抗体）；ｍｕ７Ｅ３および２８Ｃ５（抗ヒトＣＤ１４遮断モノクローナル抗体）。次いでＬＰＳが、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にわたって添加された。 図２４は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ７Ｅ３抗体の特異性は、ｍｏｃｋベクター（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図２４は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を示す一連のグラフである。上記ｍｕ７Ｅ３抗体の特異性は、ｍｏｃｋベクター（パネルＡ）、ヒトＴＬＲ４（パネルＢ）、ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＣ）、ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＤ）、ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２（パネルＥ）、またはウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（パネルＦ）のいずれかによって一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析によって示される。細胞は、上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣカップリングα−マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体と一緒にインキュベートされた。 図２５Ａ〜図２５Ｆは、ｍｕ７Ｅ３の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号３１）（図２５Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号３２）（図２５Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号３６）（図２５Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号３７）（図２５Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３３、３４および３５）（図２５Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号３８、３９および４０）（図２５Ｆ）は、図２５Ｂおよび図２５Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図２５Ａ〜図２５Ｆは、ｍｕ７Ｅ３の、ＶＨヌクレオチド配列（配列番号３１）（図２５Ａ）、ＶＨアミノ酸配列（配列番号３２）（図２５Ｂ）、ＶＬヌクレオチド配列（配列番号３６）（図２５Ｄ）、およびＶＬアミノ酸配列（配列番号３７）（図２５Ｅ）を示す一連の図である。そのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列番号３３、３４および３５）（図２５Ｃ）およびそのＶＬ ＣＤＲ（配列番号３８、３９および４０）（図２５Ｆ）は、図２５Ｂおよび図２５Ｅにおいて、下線付きのイタリック体で強調される。 図２６は、キメラＭＡｂとして発現されたｍｕ７Ｅ３（「キメラ７Ｅ３」）のＶＨヌクレオチド配列およびＶＬヌクレオチド配列がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するモノクローナル抗体の結合は、示される濃度にて、キメラ７Ｅ３、またはアイソタイプが一致するコントロールＭＡｂを使用したフローサイトメトリーによって示される。 図２７は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の、上記キメラ７Ｅ３ ＭＡｂによる阻害を示すグラフである。細胞は、示された濃度におけるキメラ７Ｅ３またはアイソタイプが一致するＭＡｂコントロールと一緒にインキュベートされ、次いでＬＰＳ（１５ｎｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートされた。ＩＬ−８レベルは、ＬＰＳ処理の１６時間後に評価された。 図２８は、本発明に従うＴＬＲ４／ＭＤ−２融合タンパク質のｃＤＮＡの構築を示す図である。 図２９は、Ｓｆ９細胞の溶解物および上清における本発明のＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の発現を示す図である。 図３０は、感染Ｓｆ９細胞の溶解物からの本発明に従うＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の精製を示す図である。 図３１は、本発明に従う可溶性キメラＴＬＲ４／ＭＤ−２タンパク質を使用した、リポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性のＩＬ−８産生の阻害を示すグラフである。 図３２Ａは、上記アクセサリータンパク質ＭＤ−１をコードする核酸配列（配列番号４１）を示す。図３２Ｂは、本発明の好ましい実施形態における成熟ＭＤ−１アクセサリータンパク質のアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。 図３３Ａは、上記アクセサリータンパク質ＭＤ−２をコードする核酸配列（配列番号４３）を示す。図３３Ｂは、成熟ＭＤ−２アクセサリータンパク質のアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。 図３４Ａ、図３４Ｂおよび図３４Ｃは、ＴＬＲ４のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対するｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合を示す略図および一連のグラフである。図３４Ａは、上記マウス−ヒトＴＬＲ４ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。略図における赤色の領域は、マウス由来の配列を示し、そしてその青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３４Ｂは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。上記ＨＥＫ ２９３細胞は、野生型ＴＬＲ４（行１）；マウス−ヒト−ヒト−ヒト（ＭＨＨＨ）ＴＬＲ４（行２）；マウス−マウス−ヒト−ヒト（行３）；マウス−ヒト−マウス−ヒト（ＭＨＭＨ）ＴＬＲ４（行４）またはヒト−ヒト−ヒト−マウス（ＨＨＨＭ）ＴＬＲ４（行５）によってトランスフェクトされた。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｈｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体もしくはｈｕ７Ｅ３モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣ結合体化抗体と一緒にインキュベートされた。図３４Ｃは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３４Ａ、図３４Ｂおよび図３４Ｃは、ＴＬＲ４のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対するｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合を示す略図および一連のグラフである。図３４Ａは、上記マウス−ヒトＴＬＲ４ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。略図における赤色の領域は、マウス由来の配列を示し、そしてその青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３４Ｂは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。上記ＨＥＫ ２９３細胞は、野生型ＴＬＲ４（行１）；マウス−ヒト−ヒト−ヒト（ＭＨＨＨ）ＴＬＲ４（行２）；マウス−マウス−ヒト−ヒト（行３）；マウス−ヒト−マウス−ヒト（ＭＨＭＨ）ＴＬＲ４（行４）またはヒト−ヒト−ヒト−マウス（ＨＨＨＭ）ＴＬＲ４（行５）によってトランスフェクトされた。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｈｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体もしくはｈｕ７Ｅ３モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣ結合体化抗体と一緒にインキュベートされた。図３４Ｃは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３４Ａ、図３４Ｂおよび図３４Ｃは、ＴＬＲ４のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対するｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合を示す略図および一連のグラフである。図３４Ａは、上記マウス−ヒトＴＬＲ４ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。略図における赤色の領域は、マウス由来の配列を示し、そしてその青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３４Ｂは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。上記ＨＥＫ ２９３細胞は、野生型ＴＬＲ４（行１）；マウス−ヒト−ヒト−ヒト（ＭＨＨＨ）ＴＬＲ４（行２）；マウス−マウス−ヒト−ヒト（行３）；マウス−ヒト−マウス−ヒト（ＭＨＭＨ）ＴＬＲ４（行４）またはヒト−ヒト−ヒト−マウス（ＨＨＨＭ）ＴＬＲ４（行５）によってトランスフェクトされた。細胞は、α−ＦＬＡＧＴＭ抗体（ＴＬＲ４発現を検出する）；α−Ｃ−ｍｙｃ抗体（ＭＤ−２発現を検出する）または上記ｈｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体もしくはｈｕ７Ｅ３モノクローナル抗体のいずれかと一緒にインキュベートされ、次いでＡＰＣ結合体化抗体と一緒にインキュベートされた。図３４Ｃは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するモノクローナル抗体の結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３５Ａおよび図３５Ｂは、ＴＬＲ４の「細かい分節（ｆｉｎｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対する、ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合を示す略図ならびに一連のグラフである。図３５Ａは、上記「細かい分節」のマウス−ヒトＴＬＲ４ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。赤色の領域は、マウス由来の配列を表し、そして青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３５Ｂは、上記ヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するＭＡｂの結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３６Ａおよび図３６Ｂは、ＴＬＲ４のアラニン取り込み変異体に対するｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合を示す略図ならびに一連のグラフである。図３６Ａは、それぞれ、アミノ酸２８９〜３７５のアミノ酸配列およびアミノ酸２８８〜３７３のアミノ酸配列に由来するヒトＴＬＲ４のアミノ酸配列とマウスＴＬＲ４のアミノ酸配列とのアライメント後に選択されたアラニン取り込み変異体（ＱＣ１〜ＱＣ２０；ヒト配列において枠で囲まれた１〜２０）の略図である。変異体は、その枠内のヒト配列とマウス配列との間の任意のアミノ酸の違いがそのヒト配列においてアラニンに変換されるように設計された（例えば、ＱＣ２は、ＹＬからＡＡに改変される）。図３６Ｂは、ＴＬＲ４アラニン取り込み変異体を発現するトランスフェクト細胞に対するＭＡｂの結合を表す一連の棒グラフである。Ｃ−ｍｙｃについては、フローサイトメトリー分析後に得られた実際のＭＦＩが示される。ｈｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３については、値は、その所定のＭＡｂについて得られたＭＦＩを上記Ｃ−ｍｙｃについて得られたＭＦＩで除算するによって「正規化された」抗体の結合を表す。 図３７Ａおよび図３７Ｂは、ＭＤ−２のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対するｈｕ１８Ｈ１０の結合を示す略図および一連のグラフである。図３７Ａは、上記マウス−ヒトＭＤ−２ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。赤色の領域は、マウス由来の配列を表し、そして青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３７Ｂは、そのヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するＭＡｂの結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３７Ａおよび図３７Ｂは、ＭＤ−２のヒト−マウスハイブリッドバージョンに対するｈｕ１８Ｈ１０の結合を示す略図および一連のグラフである。図３７Ａは、上記マウス−ヒトＭＤ−２ハイブリッド変異体およびこれらの変異体に対する抗体の結合の、略図ならびに集計表である。赤色の領域は、マウス由来の配列を表し、そして青色の領域は、ヒト由来の配列を表す。抗体の結合の集計表において、（＋＋）は、強い結合を表し、（＋）は、中程度の結合を表し、そして（−）は、弱い結合を表すか、または結合しないことを表す。図３７Ｂは、そのヒト−マウスハイブリッドを発現するトランスフェクト細胞に対するＭＡｂの結合を示す一連のフローサイトメトリーのヒストグラムである。 図３８Ａおよび図３８Ｂは、ＭＤ−２のアラニン取り込み変異体に対するｈｕ１８Ｈ１０の結合を示す略図および一連のグラフである。図３８Ａは、アミノ酸１９〜５７に由来するヒトのアミノ酸配列とマウスＭＤ−２のアミノ酸配列とのアライメント後に選択されたアラニン取り込み変異体（ＱＣ１〜ＱＣ１４；ヒト配列において枠で囲まれた１〜１４）の略図である。変異体は、その囲み内のヒト配列とマウス配列との間の任意のアミノ酸の違いがそのヒト配列においてアラニンに変換されるように設計された（例えば、ＱＣ１は、ＱからＡに改変される）。図３８Ｂは、そのＭＤ−２変異体と一緒にｗｔ ＴＬＲ４を同時発現するトランスフェクト細胞に対するＭＡｂの結合を表す一連の棒グラフである。抗６×ＨＩＳおよびｈｕ１５Ｃ１ ＭＡｂについては、フローサイトメトリー分析後に得られた実際のＭＦＩを示す。ｈｕ１８Ｈ１０については、実際のＭＦＩ、および（そのＭＡｂについて得られたＭＦＩを抗６×ＨＩＳについて得られたＭＦＩで除算することによって）「正規化された」抗体の結合を表す値の両方が示される。 図３９は、ｈｕ１８Ｈ１０ヒト化モノクローナル抗体（「１８Ｈ１０ ｈｕｍ」）がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にてｈｕ１８Ｈ１０抗体またはキメラ１８Ｈ１０（「１８Ｈ１０ｃｈｉｍ」）（上に記載される）を使用したフローサイトメトリーによって示される。結合は、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される。 図４０は、配列番号５１に示されるＶＨ ２−７０を含むｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体（「７Ｅ３ ２−７０／Ｌ−１９」）およびＶＨ ３−６６（配列番号５２）を含むｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体（「７Ｅ３ ３−６６／Ｌ１９」）がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にてｈｕ７Ｅ３抗体またはキメラ７Ｅ３（「７Ｅ３ ＣＨＩＭ」）（上に記載される）を使用したフローサイトメトリーによって示される。結合は、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される。 図４１は、配列番号４５に示されるＶＨ ４−２８を含むｈｕ１５Ｃ１ヒト化抗体（「１５Ｃ１ ４−２８／Ａ２６」）およびその改変体（選択された部分における残基が、所定のヒト生殖系列において対応するアミノ酸によって置換される（「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ３０／Ａ２６」；「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ４８／Ａ２６」；「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ６７／Ａ２６」および「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ６９／Ａ２６」；表１を参照のこと））がトランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にてｈｕ１５Ｃ１抗体またはキメラ１５Ｃ１（「１５Ｃ１ ＣＨＩＭ」）（上に記載される）を使用したフローサイトメトリーによって示される。結合は、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される。 図４２は、配列番号４６に示されるＶＨ ３−６６および配列番号４７に示されるＶＬ Ｌ６（１５Ｃ１３−６６ Ｌ６）を含むｈｕ１５Ｃ１ヒト化抗体、ならびに配列番号４６に示されるＶＨ ３−６６および配列番号４８に示されるＶＬ Ａ２６（１５Ｃ１ ３−６６ Ａ２６）を含むｈｕ１５Ｃ１ヒト化抗体が、トランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に特異的に結合し得ることを示すグラフである。ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＡｂの結合は、示される濃度にて、ｈｕ１５Ｃ１ ３−６６ Ｌ６抗体およびｈｕ１５Ｃ１ ３−６６ Ａ２６ ｈｕ１５Ｃ１抗体、ｈｕ１５Ｃ１ ４−２８ Ａ２６抗体またはキメラ１５Ｃ１（「１５Ｃ１ ＣＨＩＭ」）（上に記載される）を使用したフローサイトメトリーによって示される。結合は、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として測定される。 図４３は、ヒトｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）のアミノ酸配列を示す。 図４４は、ヒト全血におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生の、重鎖可変領域４−２８および軽鎖可変領域Ａ２６（「４−２８／Ａ２６」）を有するモノクローナル抗体ｈｕ１５Ｃ１による阻害を示す一連のグラフである。上記ｈｕ１５Ｃ１ ４−２８／Ａ２６は、本明細書中に記載されるアイソタイプが一致するコントロール（ＩｇＧ１）および１５Ｃ１キメラ抗体と比較される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、上記ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を免疫特異的に結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を提供する。このレセプター複合体は、リポ多糖類（ＬＰＳ）（グラム陰性菌の外膜の主要な成分）によって活性化される。本発明のモノクローナル抗体は、ＬＰＳを介するレセプターの活性化、およびその後の細胞内シグナリングを阻害する。したがって、上記モノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体の活性化を中和する。特に、本発明は、細胞表面上に発現されるＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を認識するモノクローナル抗体を提供する。これらのモノクローナル抗体は、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を遮断する。さらに、本発明のいくつかのモノクローナル抗体はまた、ＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４を認識する。上記モノクローナル抗体は、例えば、ヒト化抗体である。
本発明の抗体は、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を結合する抗体を含み、そしてまた、ＭＤ−２の存在とは独立してＴＬＲ４を結合する。本発明の抗体はまた、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体のＴＬＲ４部分を結合する抗体を含むが、その結合は、ＭＤ−２の存在に依存し、その結合は、ＭＤ−２の存在によって穏やかに増強し、このことは、ＭＤ−２の存在がＴＬＲ４の構造の変化を引き起こし、それによりその抗体によって結合されるエピトープを露出させることを示唆する。さらに、本発明の抗体は、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体を結合する抗体を含み、そしてその抗体はまた、ＴＬＲ４の存在下においてＭＤ−２を結合する。
本発明の抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合し、その抗体は、配列番号５４の残基２８９と残基３７５との間のヒトＴＬＲ４上の１個以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、その抗体は、配列番号４４の残基１９と残基５７との間のヒトＭＤ−２上のエピトープに結合する。
本発明の例示の抗体としては、例えば、１８Ｈ１０抗体、１６Ｇ７抗体、１５Ｃ１抗体および７Ｅ３抗体が挙げられる。これらの抗体は、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体に対する特異性を示し、そしてそれらは、ＬＰＳを介するレセプター活性化およびその後の細胞内シグナリングを阻害することが示されている。これらの抗体は、異なる特異性を有する。例えば、１６Ｇ７および１５Ｃ１は、ＭＤ−２の存在とは独立してＴＬＲ４を結合し、７Ｅ３は、ＴＬＲ４に結合するが、その結合は、ＭＤ−２の存在に依存し、そして１８Ｈ１０は、ＭＤ−２に結合するが、ＴＬＲ４の存在を必要とする。なぜならＭＡｂは、ＭＤ−２の可溶性形態を結合しないからである。
本明細書中で使用される場合、用語「１６Ｇ７」、「ｍｕ１６Ｇ７」、「７Ｅ３」、「ｍｕ７Ｅ３」、「１５Ｃ１」、「ｍｕ１５Ｃ１」、「１８Ｈ１０」または「ｍｕ１８Ｈ１０」とは、そのマウスモノクローナル抗体をいい、そして用語「ｈｕ７Ｅ３」、「ｈｕ１５Ｃ１」、または「ｈｕ１８Ｈ１０」とは、ヒト化モノクローナル抗体をいう。
本発明はまた、可溶性キメラｔｏｌｌレセプタータンパク質（本明細書中でｔｏｌｌ様レセプタータンパク質とも称される）、ｔｏｌｌレセプタータンパク質を発現させるための方法、および可溶性形態でこのようなタンパク質を精製するための方法を提供する。キメラタンパク質は、例えば、抗体を産生するのに有用である。
ＴＬＲは、微生物粒子を認識し、そしてこれらの微生物粒子の供給源に対する免疫細胞を活性化する（Ｔａｋｅｄａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：３３５−７６（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される）を参照のこと）。ＴＬＲ４およびＭＤ−２は、細胞表面上に複合体を形成し、そしてＭＤ−２の存在は、ＬＰＳを含む種々のリガンドに対するＴＬＲ４の反応性に必須であるらしい。ＬＰＳは、先天免疫系を強力に活性化し得るグラム陰性菌の外膜糖脂質である。ＬＰＳは、グラム陰性菌感染から生じる重篤な全身性の炎症の間に免疫系を活性化する主要な因子の１つとして示唆されている（Ｌａｋｈａｎｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１５：２７８−２８２（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される））。
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体がシグナリングの主成分であるその多鎖レセプターを介して免疫細胞にシグナルを伝達する。ＬＰＳは、ＴＬＲ４によるシグナリングを介して、免疫系に対してその効果を発揮することが示されている。ＬＰＳは、血流中でリポ多糖類結合タンパク質（ＬＢＰ）に迅速に結合し、そしてこの形態において、ＬＰＳは、ＧＰＩに固定される細胞表面タンパク質ＣＤ１４と相互作用する。次いでＬＰＳは、ＴＬＲ４に移され、このことは、細胞内の活性化シグナルを伝達する。別のタンパク質（ＭＤ−２）は、ＴＬＲ４を介するシグナル伝達が生じるために必要であることが見出されている。ＭＤ−２は、ＴＬＲ４と直接相互作用し、そしてその翻訳後修飾および細胞内輸送において重要な役割を果たす。さらに、ＭＤ−２は、ＬＰＳを直接結合することが示されており、このことは、ＬＰＳレセプター複合体におけるこのアクセサリータンパク質の重要性を示す（Ｍｉｙａｋｅ Ｋ．、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：１１９−１２８（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される）を参照のこと）。
したがって、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるＬＰＳシグナリングの中和は、例えば、グラム陰性菌感染によって誘導される急性の全身性炎症および敗血症などの障害の処置における強力な治療ストラテジーである。
（定義）
別に明記しない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は、複数の存在を含み、そして複数形の用語は、単数の存在を含む。一般に、本明細書中に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質化学およびオリゴヌクレオチド化学またはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して利用される用語、ならびにそれらの技術は、当該分野において周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養ならびに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の指示書に従って行なわれるか、当該分野において一般的に実行されるように行なわれるか、または本明細書中に記載されるように行われる。上述の技術および手順は、一般に、当該分野で周知である従来の方法に従って行なわれ、そして本明細書全体を通して引用され、そして議論される種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関して利用される用語、ならびにそれらの実験室手順および技術は、周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的な調製、処方、および送達、ならびに患者の処置に使用される。
本発明の開示に従って利用される場合、特に示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解される。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。「特異的に結合する」または「と免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」は、所望の抗原の１以上の抗原決定基と反応し、かつ他のポリペプチドと反応しないか、またはずっと低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）でそれを結合する抗体を意味する。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
基本的な抗体構造単位は、四量体を構成することが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連し、これらのクラスは、上記分子に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびその他）をも有する。さらに、ヒトにおいて、上記軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」とは、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、上記集団の全ての分子において同一である。ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
用語「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原の結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変領域（「Ｖ」）のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される重鎖および軽鎖のＶ領域内の３個の高度に分岐した範囲は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知であるより保存された隣接する範囲の間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリンにおける超可変領域の間、およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３個の超可変領域および重鎖の３個の超可変領域は、抗原結合表面を形成するために、３次元空間で互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合された抗原の３次元表面に対して相補性であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３個の超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る任意のタンパク質決定因子を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常、分子の化学的に活性な表面集団（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、そして特定の３次元構造の特徴、および特定の電荷の特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチドに対して惹起され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ；好ましくは≦１００ｎＭそして最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に抗原を特異的に結合するといわれる。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」とは、免疫グロブリン分子と上記免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる型の非共有結合的相互作用をいう。免疫学的結合の相互作用の強度または親和性は、その相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表され得、より小さいＫｄは、より大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度の測定を伴い、これらの速度は、その複合体パートナーの濃度、その相互作用の親和性、および両方向における速度に等しく影響する幾何的パラメータに依存する。したがって、「結合（ｏｎ）速度定数」（Ｋｏｎ）および「解離（ｏｆｆ）速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度の計算ならびに会合および解離の実際の速度によって決定され得る（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−８７（１９９３）を参照のこと）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋｄに等しい（一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９−４７３を参照のこと）。本発明の抗体は、放射リガンド結合アッセイまたは当業者に公知である同様のアッセイなどのアッセイによって測定された場合に、平衡結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、そして最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭであるとき、Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）／ＭＤ−２複合体またはＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４に特異的に結合するといわれる。
本明細書中で使用される場合、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源またはそのいくつかの組み合わせからなるポリヌクレオチドを意味し、その起源によって、上記「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）その「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部に関連しないか、（２）天然において結合されないポリヌクレオチドに作動可能に結合されるか、または（３）大きい配列の一部として天然に生じない。本発明に従うポリヌクレオチドは、配列番号２、１２、２２、３２、４５、４６、４９、５１および５２にて示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、ならびに配列番号７、１７、２７、３７、４７、４８、５０および５３にて示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
本明細書中に言及される用語「単離されたタンパク質」は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、もしくは合成起源またはそのいくつかの組み合わせからなるタンパク質を意味し、その起源もしくは由来する供給源によって、上記「単離されたタンパク質」は、（１）天然に見出されるタンパク質に関連しないか、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質を含まない（例えば、マウスタンパク質を含まない）か、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に存在しない。
用語「ポリペプチド」は、ネイティブなタンパク質、フラグメント、またはポリペプチド配列のアナログをいう一般用語として本明細書中で使用される。したがって、ネイティブなタンパク質のフラグメント、およびアナログは、ポリペプチド分類（ｇｅｎｕｓ）の種である。本発明に従うポリペプチドは、配列番号２、１２、２２、３２、４５、４６、４９、５１および５２にて示される重鎖免疫グロブリン分子、ならびに配列番号７、１７、２７、３７、４７、４８、５０および５３にて示される軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに軽鎖免疫グロブリン分子（例えば、κ軽鎖免疫グロブリン分子）を有する重鎖免疫グロブリン分子（逆もまた同じ）を含む組み合わせによって形成される抗体分子を含み、そしてそのフラグメントおよびそのアナログを含む。
本明細書中で使用される場合、対象に対して適用される用語「天然に存在する」とは、対象が天然において見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得る生物体（ウイルスを含む）において存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列であり、そしてそれは、実験室において人によって意図的に改変されていないか、またはそうでなければ天然に存在する。
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に結合される」とは、成分の意図された様式でその成分が機能することを許容する関係にあるそのように記載されるような成分の位置をいう。コード配列に「作動可能に結合される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合性の条件下において達成されるような方法でカップリングされる。
本明細書中で使用される場合、用語「制御配列」とは、それらがカップリングされるコード配列の発現およびプロセシングを達成するために必要なポリヌクレオチド配列をいう。このようなコントロール配列の性質は、原核生物においては宿主生物体に依存して異なり、このような制御配列としては、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および真核生物における転写終結配列が挙げられ、一般に、このような制御配列としては、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である全ての成分、そしてまた、その存在が有益であるさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得ることが意図される。本明細書中に言及される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー性ホウ素（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｂｏｒｏｎ）、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかの型のヌクレオチドの改変形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
本明細書中に言及される用語オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって１つに結合された、天然に存在するヌクレオチドならびに改変ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドのサブセットである。好ましいオリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長であり、そして最も好ましくは１２塩基長、１３塩基長、１４塩基長、１５塩基長、１６塩基長、１７塩基長、１８塩基長、１９塩基長、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、一本鎖（例えば、プローブのため）であるが、オリゴヌクレオチドは、二本鎖（例えば、遺伝子変異体の構築に使用するため）であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
本明細書中に言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中に言及される用語「改変ヌクレオチド」は、改変または置換の糖質基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書中に言及される用語「オリゴヌクレオチド結合」は、オリゴヌクレオチド結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレロエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｒｌｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロンミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｎｍｉｄａｔｅ）など）を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）、Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望される場合、検出のための標識を含み得る。
本明細書中に言及される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本発明に従うポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらのフラグメントは、不特定の核酸に検出可能に結合する認識可能な量を最小限にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下において、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、当該分野において公知であるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得、そして本明細書中で考察される。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％であり、そしてより代表的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％のより上昇した相同性を有することが好ましい。２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に、部分的かまたは完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、８５％相同は、２つの配列が最大限の整合を目的として整列される場合に、そのアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。整合の最大化において許容されるギャップ（整合させられる２つの配列のいずれかにおける）は、５以下のギャップの長さが好ましい（２以下のギャップの長さがより好ましい）。あるいは、そして好ましくは、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸長のタンパク質に由来するポリペプチド配列）は、それらが、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーを用いたプログラムＡＬＩＧＮを使用して５（標準偏差単位（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）において）のアライメントスコアを有する場合、相同である（この用語が、本明細書中で使用される場合）。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｐｐ．１０１−１１０（第５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻に対する補遺２、ｐｐ．１−１０を参照のこと。２つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列されるときに５０％以上同一である場合に、より好ましい相同である。用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同（すなわち、同一であり、厳密には、進化的に関連しない）であること、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書中で使用される。対比して、用語「と相補的」は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味するために本明細書中で使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の、配列の関係を記載するために使用される：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の％」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定の配列であり、参照配列は、例えば、配列表において与えられる完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントのようなより大きい配列のサブセットであり得るか、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。一般に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長または６アミノ酸長であり、頻繁に少なくとも２４ヌクレオチド長または８アミノ酸長であり、そしてしばしば少なくとも４８ヌクレオチド長または１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それぞれ、（１）２つの分子間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み得、そして（２）その２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で相違する配列をさらに含み得るので、２つ（またはそれ以上）分子の間の配列比較は、代表的に、その２つの分子の配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも１８個の連続したヌクレオチド位置または６アミノ酸の概念的なセグメントをいい、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも１８個の連続したヌクレオチドまたは６アミノ酸の参照配列と比較され得、そしてその比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、その２つの配列の最適なアライメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較される場合に２０％以下の付加、欠失、置換など（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似法についての調査、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視診によって行われ得、そして種々の方法によって生成される最良のアライメント（すなわち、その比較ウィンドウに対して最も高い％の相同性をもたらす）が、選択される。
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がその比較ウィンドウにわたって同一（すなわち、それぞれのヌクレオチドベースまたはそれぞれの残基ベースで同一）であることを意味する。用語「配列同一性の％」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して一致した位置の数を与え、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の合計（すなわち、ウィンドウの大きさ）で除算し、そして配列同一の％を与えるために１００を乗算することによって算出される。本明細書中で使用される場合、用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、そのポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウ、頻繁に少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウィンドウにわたる参照配列と比較した場合に、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の％は、参照配列を、比較ウィンドウにわたって合計で２０％以下の参照配列に欠失または付加を有し得る配列と比較することによって算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであり得る。
本明細書中で使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびそれらの略記は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７ Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。上記２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の異例のアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。異例のアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似するアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプチドの表記法において、標準的な使用法および慣例に従って、左手方向は、アミノ末端方向であり、そして右手方向は、カルボキシ末端方向である。
同様に、特に明記されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側の末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生のＲＮＡ転写物の付加の５’から３’の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖における配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、そしてＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖における配列領域は、「下流配列」と称される。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、（例えば、初期設定のギャップの重みを使用するプログラムＧＡＰまたはプログラムＢＥＳＴＦＩＴによって）最適に整列された場合に、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
本明細書中で考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における軽微なバリエーションは、本発明に包含されることが企図されるが、但しそのアミノ酸配列におけるバリエーションは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、そして最も好ましくは９９％を維持する。特に、保存的アミノ酸の置換が、企図される。保存的置換は、アミノ酸の側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起きる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に、ファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては、（ｉ）セリンおよびトレオニン（これらは、脂肪族−ヒドロキシファミリーである）；（ｉｉ）アスパラギンおよびグルタミン（これらは、アミド含有ファミリーである）；（ｉｉｉ）アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン（これらは、脂肪族ファミリーである）；ならびに（ｉｖ）フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン（これらは、芳香族ファミリーである）が挙げられる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの独立した置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の独立した置換、セリンによるトレオニンの独立した置換、あるいは構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換が、特にそれらの置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合に、得られる分子の結合または特性に対して大きく作用しないと予想することは、妥当である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。アッセイは、本明細書中に、詳細に記載される。抗体もしくは免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログは、当業者によって容易に調製され得る。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的ドメインおよび機能的ドメインは、ヌクレオチド配列データおよび／またはアミノ酸配列データと、公的または私的な配列データベースとの比較によって同定され得る。好ましくは、コンピューターによる比較方法は、公知の構造および／または機能からなる他のタンパク質に存在する、配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用される。公知の３次元構造へと折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。したがって、上述の例は、当業者が、本発明に従う構造的ドメインおよび機能的ドメインを規定するために使用され得る配列モチーフおよび構造的コンホメーションを認識し得ることを示す。
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる置換、（２）酸化に対する感受性を減少させる置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換、および（４）このようなアナログの他の物理化学的特性または機能的特性を与えるか、あるいは改変する置換である。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の、配列の種々のムテインを含む。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（好ましくは、分子間の接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分）において行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないはずである（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊する傾向を有さないか、または親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊しないはずである）。当該分野において認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドフラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいうが、その残りのアミノ酸配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列において対応する位置と同一である。フラグメントは、代表的に、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり、通常は少なくとも５０アミノ酸長であり、そしてよりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書中で使用される場合、用語「アナログ」とは、推定されるアミノ酸配列の一部に対する実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントから構成され、かつ適切な結合条件下でＴＬＲ４／ＭＤ２複合体または単独のＴＬＲ４に対する特異的な結合を有するポリペプチドをいう、代表的に、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。アナログは、代表的に、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり、そしてしばしば、天然に存在する完全長ポリペプチドと同じ長さであり得る。
ペプチドアナログは、鋳型のペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において一般的に使用される。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」と称される。Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）、ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。このような化合物は、しばしば、コンピューターによる分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、等価な治療効果または予防効果をもたらすために使用され得る。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、当該分野で周知の方法により、以下からなる群より選択される結合によって必要に応じて置換される１以上のペプチド結合を有する：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−。同じ型のＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１個以上のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを産生するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列のバリエーションを含む制約されたペプチドは、当該分野において公知である方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）；例えば、そのペプチドを環状にする分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加すること）によって産生され得る。
用語「薬剤」は、本明細書中で、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製される抽出物を記載するために使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「標識」または「標識される」とは、検出可能なマーカーの組み込み（例えば、放射性標識アミノ酸の組み込みまたは特徴的なアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定の方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドに対する結合による）をいう。特定の状況において、標識またはマーカーはまた、治療的であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野において公知であり、そしてそれらの方法が、使用され得る。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対の配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）によって結合される。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的因子または薬物」とは、患者に対して適切に投与される場合に所望の治療効果を誘導し得る化学物質または組成物をいう。
本明細書中の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））によって例示されるような、当該分野における従来の使用法に従って使用される。
用語「抗腫瘍性薬剤」は、本明細書中で、ヒトにおいて新生物（特に、悪性（癌性）の病変（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病）の発生または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤をいう。転移の阻害は、頻繁に、抗腫瘍性薬剤の特性である。
本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋」は、対象の化学種が、存在する優勢な化学種である（すなわち、モル濃度に基づいて、その化学種が、その組成におけるあらゆる他の個別の化学種より豊富である）ことを意味し、そして好ましくは、実質的に精製された分画は、対象の化学種が、存在する全ての高分子化学種うちの少なくとも約５０％（モル濃度に基づく）を構成する組成である。
一般に、実質的に純粋な組成は、その組成に存在する全ての高分子化学種の、約８０％より多くを構成し、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、および９９％より多くを構成する。最も好ましくは、対象の化学種は、本質的に均一（夾雑物の化学種が、従来の検出方法によって、その組成において検出される可能性がない）になるまで精製され、その組成は、本質的に、単一の高分子化学種からなる。
用語「患者」は、ヒト被験体および獣医学の被験体を含む。
（抗体）
本発明のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒト化抗体）は、ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を阻害する能力を有する。阻害は、例えば、本明細書中に記載されるヒト全血のアッセイおよびｈｕＴＬＲ４／ＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞のアッセイにおいて決定される。例示のモノクローナル抗体は、例えば、本明細書中で、「ｍｕ１８Ｈ１０」、「ｈｕ１８Ｈ１０」、「ｍｕ１６Ｇ７」、「ｍｕ１５Ｃ１」、「ｈｕ１５Ｃ１」、「ｍｕ７Ｅ３」および「ｈｕ７Ｅ３」と称される抗体を含む。上記ｍｕ１８Ｈ１０抗体およびｈｕ１８Ｈ１０抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を認識するが、ＴＬＲ４と複合体形成されない場合のＭＤ−２タンパク質を認識しない。上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体、ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体、ｈｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体、ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体およびｈｕ７Ｅ３モノクローナル抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を認識する。ｍｕ１５Ｃ１、ｈｕ１５Ｃ１および１６Ｇ７はまた、ＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４を認識する。
本明細書中に記載される抗体と同じエピトープに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を免疫特異的に結合し、その抗体は、配列番号５４の残基２８９と残基３７５との間のヒトＴＬＲ４上の１個以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。本発明の抗体は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を免疫特異的に結合し、その抗体は、配列番号４４の残基１９と残基５７との間のヒトＭＤ−２上のエピトープに結合する。当業者は、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒト化抗体）が本発明のモノクローナル抗体（例えば、ｍｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１８Ｈ１０、ｍｕ１６Ｇ７、ｍｕ１５Ｃ１、ｈｕ１５Ｃ１、ｍｕ７Ｅ３および／またはｈｕ７Ｅ３）と同じ特異性を有する場合、後者がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４に結合することを、前者が妨げるか否かを確認することによって、過度の実験を伴わずに決定することが可能であることを認識する。試験されるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体よる結合の低下によって示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、その２つのモノクローナル抗体は、同じか、または密接な関係にあるエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを決定するための代替的な方法は、本発明のモノクローナル抗体を、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体または可溶性ＴＬＲ４タンパク質（それは、正常に反応する）と一緒にプレインキュベートし、次いで試験されるモノクローナル抗体が、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を結合するその能力、またはＴＬＲ４およびＭＤ−２と複合体形成したＴＬＲ４を結合するその能力において阻害されるか否かを決定するために、試験されるモノクローナル抗体を添加することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、その抗体は、本発明のモノクローナル抗体と同じか、または機能的に等価であるエピトープに対する特異性を有する。本発明のモノクローナル抗体をスクリーニングする方法はまた、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を測定し、そして試験モノクローナル抗体がＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を中和できるか否かを決定することによって実施され得る。
当該分野で公知である種々の手順は、上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体もしくはＭＤ−２に複合体形成されない場合のＴＬＲ４に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ、およびＬａｎｅ Ｄ、１９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
抗体は、周知の技術（例えば、主に免疫血清のＩｇＧ分画を提供する、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティーカラムクロマトグラフィー）によって精製される。その後か、または代替的に、求められた免疫グロブリンの標的である特定の抗原、またはそのエピトープは、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製するためにカラム上に固定化され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．出版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、ｐｐ．２５−２８）によって考察される。
本発明の抗体（例えば、ｈｕ１８Ｈｌ０、１６Ｇ７、ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３）は、モノクローナル抗体である。上記ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって媒介されるＬＰＳ−シグナリングを中和するモノクローナル抗体は、例えば、それらの表面上に高レベルのＴＬＲ４およびＭＤ−２を発現する細胞形質移入体と、柔軟なリンカー配列によって係合（ｔｅｔｈｅｒ）されたＴＬＲ４およびＭＤ−２の両方を含む組換え可溶性キメラタンパク質との組み合わせによってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化することによって産生される。次いで、骨髄腫／Ｂ細胞融合から生じるハイブリドーマが、このＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する反応性についてスクリーニングされる。
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法）を使用して調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫化因子に特異的に結合する抗体を産生するか、またはそれを産生し得るリンパ球を引き出すために、免疫化因子によって免疫化される。あるいは、上記リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
上記免疫化因子は、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物の供給源が望ましい場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで上記リンパ球は、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、ハイブリドーマ細胞由来の不死化細胞株と融合される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞（特に、げっ歯類起源、ウシ起源およびヒト起源の骨髄腫細胞）である。通常、ラット骨髄腫細胞株またはマウス骨髄腫細胞株が、利用される。上記ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含む適切な培地において培養され得る。例えば、親細胞が、酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、上記ハイブリドーマのための培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を補助し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に対して感受性である不死化細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手され得るマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、モノクローナル抗体の産生に関して記載されている。（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８７）ｐｐ．５１−６３）を参照のこと）。
上記ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、次いで、上記抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、上記ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野において公知である。上記モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療適用において、高い程度の特異性および標的抗原に対する高い結合親和性を有する抗体を同定することが、重要である。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的な方法によって増殖され得る。（Ｃｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）ｐｐ．５９−１０３を参照のこと）。この目的に適した培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、上記ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水のような、インビボで増殖され得る。
上記サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、上記培地または腹水流体から、単離あるいは精製され得る。
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブの使用）を用いて、容易に、同定および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、上記ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでその発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされる。上記ＤＮＡはまた、例えば、相同性のマウス配列の代わりに、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８１２−１３（１９９４））か、または上記免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部もしくは一部を共有結合させることによって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を作製するために、本発明の抗体の定常ドメインに置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の可変ドメインに置換され得る。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こさないでヒトに投与することに適している。抗体のヒト化形態は、原理的に、ヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性の下位配列）である。ヒト化は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがって（対応するヒト抗体の配列をげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって）行なわれる。（米国特許第５，２２５，５３９号も参照のこと）。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、例えば、レシピエント抗体にも取り入れられたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む。一般に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１個の可変ドメイン、および代表的に２個の可変ドメインを含み、ここで非ヒト免疫グロブリンおよびフレームワーク領域の全てか、または実質的に全てに対応するＣＤＲ領域の、全てかあるいは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。上記ヒト化抗体はまた、必要に応じて、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、代表的にヒト免疫グロブリンの一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｎａｎｎ．ら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３−５９６（１９９２））。
完全ヒト抗体は、軽鎖および重鎖の両方の完全な配列（ＣＤＲを含む）がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。このような抗体は、本明細書中で、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」と称される。モノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）；およびモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６を参照のこと）を用いて調製され得る。モノクローナル抗体が、利用され得、そしてそのモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを使用すること（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）によってか、またはインビトロでエプスタイン−バーウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換すること（Ｃｏｌｅら、１９８５、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ
ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）によって調製され得る。
さらに、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含むさらなる技術を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１（１９９１）を参照のこと）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が一部かまたは完全に不活化されているマウス）に導入することによって作製され得る。チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際に、ヒト抗体産生は、観察され、それは、あらゆる点でヒトにおいて見られるもの（遺伝子の再配列、組み立て、および抗体レパートリーを含む）に近似する。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）に記載される。
ヒト抗体はさらに、抗原によるチャレンジに応じた動物の内因性抗体よりもむしろ完全ヒト抗体を産生するように改変されるトランスジェニック非ヒト動物を使用して産生され得る。（ＰＣＴ公開Ｗ０９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主中の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子は、不能にされ、そしてヒト重鎖免疫グロブリンおよびヒト軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座は、宿主のゲノムに挿入される。上記ヒト遺伝子は、例えば、必須のヒトのＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して組み込まれる。所望の改変の全てを提供する動物は、次いで、改変の完全補体より少ないものを含む中間トランスジェニック動物を雑種にすることによって子孫として得られる。このような非ヒト動物の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／３３７３５および同ＷＯ ９６／３４０９６に開示されるようなＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと称されるマウスである。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。上記抗体は、目的の免疫原によって免疫化された後の動物（例えば、ポリクローナル抗体の調製として）、あるいは動物に由来する不死化Ｂ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から直接得られ得る。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収および発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子のような）を得るためにさらに改変され得る。
非ヒト宿主（内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠くマウスとして例示される）を産生する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。その宿主は、その遺伝子座の再配列を妨害するため、および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を妨害するために、胚性幹細胞中の少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を削除すること（選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含むベクターを標的化すること；および体細胞および生殖細胞が選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から産生することによって達成される削除）を含む方法によって得られ得る。
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生するための１つの方法は、米国特許第５，９１６，７７１号において開示される。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを１つの哺乳動物宿主細胞に導入すること（培養において）、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入すること、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞を融合することを包含する。上記ハイブリッド細胞は、その重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
この手順に対するさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定するための方法、および高い親和性を有する、関連するエピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択するための相互関係のある方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／５３０４９において開示される。
上記抗体は、上に記載される単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターによって発現され得る。
これらは、ベクター、リポソーム、むき出し（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡ、アジュバントに補助されるＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含み得る。ベクターは、ＷＯ ９３／６４７０１に記載されるような化学的結合体を含み、それは、標的化する部分（例えば、細胞表面レセプターに対するリガンド）、および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクター）、ＰＣＴ／ＵＳ ９５／０２１４０（ＷＯ ９５／２２６１８）に記載されるような融合タンパク質（これは、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質である）、プラスミド、ファージなどを有する。上記ベクターは、染色体性、非染色体性または合成のものであり得る。
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的結合体を含む。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスベクターが、好ましい。これらのベクターとしては、ポックスベクター（例えば、オルトポックスベクターまたはアビポックスベクター）、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１１４９（１９９０）を参照のこと）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照のこと）が挙げられる。
ポックスウイルスベクターは、細胞質に上記遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、上記核酸の短期間のみの発現をもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、上記核酸を神経細胞に導入するのに好ましい。上記アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月間）より短期間（約２ヶ月間）の発現をもたらし、次にその期間は、ＨＳＶベクターより短い。選択された特定のベクターは、標的細胞および処理される条件に依存する。上記導入は、標準的な技術（例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換）によって行われ得る。遺伝子移入の様式の例としては、例えば、むき出しのＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＦ、デキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。
上記ベクターは、任意の所望の標的細胞を本質的に標的化するために使用され得る。例えば、定位注入が、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に指向させるために使用され得る。さらに、その粒子は、小型ポンプ注入システム（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用する脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達され得る。対流と称される大きな流れ（ｂｕｌｋ ｆｌｏｗ）に基づく方法はまた、大きい分子を脳の拡大した領域に送達することにおいて有効であることを証明し、そして上記ベクターを上記標的細胞に送達するのに有用であり得る（Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５（１９９４）を参照のこと）。使用され得る他の方法としては、カテーテル、静脈内注射、非経口注射、腹腔内注射および皮下注射、ならびに経口経路または他の公知である投与経路が挙げられる。
これらのベクターは、種々の方法（例えば、サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体および／またはＴＬＲ４の存在を検出すること）において使用され得る大量の抗体を発現するために使用され得る。上記抗体はまた、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合し、そしてＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に関連するシグナリングを途絶させる試みのために使用され得る。
技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、タンパク質あるいはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合され得る（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野において公知である技術によって産生され得、その技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによってもたらされるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いる抗体分子の処理によってもたらされるＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
本発明はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の抗ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体フラグメントまたは抗ＴＬＲ４フラグメント、単鎖抗ＴＬＲ４／ＭＤ２または単鎖抗ＴＬＲ４抗体、二重特異性抗ＴＬＲ４／ＭＤ２抗体または二重特異性抗ＴＬＲ４抗体、ならびにヘテロ結合体化抗ＴＬＲ４／ＭＤ２抗体またはヘテロ結合体化抗ＴＬＲ４抗体を含む。
二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。本発明の場合において、結合特異性の１つは、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体および／またはＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４に対するものである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして好都合には、細胞表面タンパク質または細胞表面レセプターもしくは細胞表面レセプターサブユニットである。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、その２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のランダムな組み合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））は、１種のみが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。上記正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。類似の手順が、ＷＯ ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５−３６５９（１９９１）において開示される。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。上記融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。少なくとも１つの融合体に存在する軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡおよび必要とされる場合に、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時にトランスフェクトされる。二重特異性抗体の産生のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
ＷＯ ９６／２７０１１に記載される別のアプローチにしたがって、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養から回収されるのへテロダイマーの割合を最大にするように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）によって置換される。そのより大きい側鎖と同一か、または類似するサイズの代償性の「腔（ｃａｖｉｔｙ）」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）によって置換することによって、第２の抗体分子の界面上に形成される。これは、他の望ましくない最終産物（例えば、ホモダイマー）を上回るヘテロダイマーの産生を増加させるための機構を提供する。
二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的架橋を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するためにタンパク質分解によって切断される手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合体形成因子である亜ヒ酸ナトリウムの存在下において還元されて、近接するジチオールが安定化され、そして分子間のジスルフィド形成が妨げられる。次いで、産生されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換され、そして二重特異性抗体を形成するために等モル濃度の量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための因子として使用され得る。
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして二重特異性抗体を形成するように化学的にカップリングされ得る。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．．ｃｏｌｉから別個に分泌され、そして二重特異性抗体を形成するようにインビトロでの化学的なカップリングに供された。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳房腫瘤標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を引き起こす。
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製および単離するための種々の技術もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。上記抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域にて還元されてモノマーを形成し、次いで再度酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生に利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載される「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供している。上記フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、は別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成させられ、したがって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
２より多い価を有する抗体が、企図される。例えば、三重特異性抗体が、調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
例示の二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、そのエピトープの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原において生じる。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性のアームは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に集中するように、Ｔ細胞レセプター分子などの白血球上の誘発分子（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、またはＩｇＧ（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に対するＦｃレセプターに結合するアームと合わされ得る。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性因子を指向させるために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレート剤（ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）を結合するアームを有する。目的とする別の二重特異性抗体は、本明細書中に記載されるタンパク質抗原を結合し、そして組織因子（ＴＦ）をさらに結合する。
ヘテロ結合体化抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体化抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的性にすること（米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、およびＨＩＶ感染の処置（ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９を参照のこと）について提案されている。抗体が、架橋剤を含むものが挙げられる合成タンパク質化学において公知の方法を使用してインビトロで調製され得ることが、企図され。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用するか、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチリミデート（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）ならびに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されるものが挙げられる。
エフェクター機能に関して本発明の抗体を、例えば、異常なＬＰＳシグナリングに関連する疾患および障害の処置において上記抗体の有効性を増強するために改変することが、望まれ得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、それによってこの領域において鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。したがって、産生されるホモダイマーの抗体は、改善した内在化性能（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を有し得るか、そして／または補体媒介性の細胞の殺傷および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させ得る。（Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと）。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体が、操作され得、そして増強した補体による溶解およびＡＤＣＣ性能を有し得る。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと）。
本発明はまた、細胞傷害性因子（例えば、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのフラグメント））、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））に結合体化される抗体を含む免疫結合体に付随する。
使用され得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖（ジフテリア毒素の非結合性の活性フラグメント）、体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｅｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合体化抗体の産生に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
抗体と細胞傷害性因子との結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミノエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性なエステル（例えば、ジスクシニミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−ジアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、上記抗体に対する放射性核種の結合体化のための例示の錯化剤である。（Ｗ０９４／１１０２６を参照のこと）。
当業者は、多様な可能である部分が本発明の結果的に得られる抗体にカップリングされ得ることを認識する。（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）（その内容全体は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
カップリングは、抗体およびその他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限りは、２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この結合は、多くの化学的機構を含み得、例えば、共有結合、親和結合（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）、インターカレーション、配意結合および複合体形成を含み得る。しかし、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接的な縮合または外部架橋分子の組み込みのいずれかによって達成され得る。多くの二価カップリング剤または多価カップリング剤は、タンパク質分子（例えば、本発明の抗体）を他の分子にカップリングするのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、チオエステル、カルボジイミド、スクシニミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物が挙げられ得る。この一覧は、当該分野において公知である種々のクラスのカップリング剤を包括することを意図しないが、むしろより一般的なカップリング剤の例示である。（ＫｉｌｌｅｎおよびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ、Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５−２１６（１９８２）；ならびにＶｉｔｅｔｔａ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）を参照のこと）。
好ましいリンカーは、文献に記載される。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）の使用を記載するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）を参照のこと）。オリゴペプチドリンカーによって抗体をカップリングするハロゲン化アセチルハイブリダイズ誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号もまた参照のこと。特に好ましいリンカーとしては、以下が挙げられる：（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．，（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシニミジル−６ ［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシニミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナミド（ｐｒｏｐｉａｎａｍｉｄｅ）］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５−Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに結合体化されたスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシニミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２４５１０）。
上に記載されるリンカーは、異なる特質を有する成分を含み、したがって異なる物理学的特性を有する結合体をもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルより安定である。ＮＨＳ−エステル含有リンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルより可溶性が低い。さらに、上記リンカーＳＭＰＴは、立体障害の大きいジスルフィド結合を含み、そして上昇した安定性を有する結合体を形成し得る。ジスルフィド結合は、一般に、他の結合より安定性が低い。なぜならばそのジスルフィド結合はインビトロで切断されて、より利用性の低い結合体を生じるからである。特に、スルホ−ＮＨＳは、カルボジイミドカップリング剤の安定性を上昇させ得る。スルホ−ＮＨＳとの結合体化において使用される場合のカルボジイミドカップリング剤（例えば、ＥＤＣ）は、カルボジイミドカップリング反応単独より加水分解に対して抵抗性であるエステルを形成する。
本明細書中に開示される抗体はまた、イムノリポソームとして処方され得る。上記抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されるような当該分野において公知である方法によって調製される。上昇した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む資質組成物を用いた逆相エバポレーション法によって産生され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために規定された孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。
（ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に対する抗体の使用およびＴＬＲ４に対する抗体の使用）
本発明に従う治療的実体の投与が、改善された輸送、送達、耐性などを提供するために処方物中に組み込まれる、適切なキャリア、賦形剤、および他の薬剤と一緒に投与されることが、認識される。多くの適切な処方物が、全ての薬剤師において公知である処方集において見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９７５）、その中の特に第８７章、Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオンまたはアニオン）含有小胞（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）、ＤＮＡ結合体、無水物吸着ペースト、水中油型エマルションおよび油中水型エマルション、エマルションカルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。任意の前述の混合物は、本発明に従う処置および治療において適切であり得るが、処方物中の活性成分は、処方によって不活化されず、そして生理学的に適合性であり、かつ投与経路に関して許容され得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ
ｇｕｉｄａｎｃｅ．」、Ｒｅｇａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８ （２０００）、Ｗａｎｇ Ｗ．、「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ、「Ｌｉｐｉｄｓ、ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒａｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．」、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、ならびに薬剤師に公知である処方物、賦形剤、およびキャリアに関連するさらなる情報に関する本明細書中の引用を参照のこと。
本発明のモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナルまたはヒト化モノクローナル抗体）を含む本発明の治療用処方物は、免疫に関連する障害に関する症状を処置するか、または緩和するために使用される。本発明はまた、免疫に関連する障害に関する症状を処置する方法、または免疫に関連する障害に関する症状を緩和する方法を提供する。治療レジメンは、免疫に関連する障害を罹患する（または免疫に関連する障害を発症する危険性がある）被験体（例えば、ヒト患者）を、標準的な方法を使用して同定することによって実施される。
ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を阻害し得る本発明の抗体は、例えば、急性炎症および微生物生成物（例えば、ＬＰＳ）によって誘導される敗血症およびこの急性炎症から生じる増悪（例えば、慢性閉塞性肺疾患および喘息）などの障害の処置において有用な治療手段である（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３９６−４０３（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される）を参照のこと）。このような抗体はまた、神経変性性の自己免疫疾患を処置するのに有用である（Ｌｅｈｎａｒｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８５１４−８５１９（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される））。
さらに、本発明の抗体はまた、機械的ストレスによって引き起こされ、次にＴＬＲ４を誘発する内因性の可溶性「ストレス」因子を誘導する、例えば、変形性関節症のような疾患において治療用試薬として有用である。内因性の可溶性ストレス因子としては、例えば、Ｈｓｐ６０（Ｏｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｉｒｍｎｕｎｏｌ．１６４：５５８−５６１（２０００）を参照のこと）およびフィブロネクチン（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１０２２９−１０２３３（２００１）を参照のこと）および硫酸ヘパリン、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−ディフェンシン−２またはサーファクタント蛋白Ａ（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（１−２）：１５−４４（２００３）（これらの各々は、その全体が本明細書によって参考として援用される））が挙げられる。本発明の抗体はまた、例えば、レスピレータ、人工呼吸器および他の呼吸補助デバイスにおかれる被験体および患者に関連する機械的ストレスなどの機械的ストレスに関連する種々の障害の処置において有用である。例えば、本発明の抗体は、人工呼吸器関連肺傷害（「ＶＡＬＩ」）とも称される人工呼吸による肺の傷害（「ＶＩＬＩ」）の処置に有用である。
ＴＬＲ４の機能を阻害することが有益であり得る他の疾患の領域としては、例えば、慢性炎症（例えば、アレルギー状態に関連する慢性炎症および喘息）、自己免疫疾患（例えば、炎症性腸障害）およびアテローム硬化症が挙げられる（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３９６−４０３（２００３）（その全体が本明細書によって参考として援用される））。
これらの免疫に関連する障害に関する症状としては、例えば、炎症、発熱、全身倦怠、発熱、疼痛（しばしば炎症領域に局在する）、早い脈拍数、関節の疼痛または痛み（関節痛）、早い呼吸または他の異常な呼吸パターン、悪寒、錯乱、失見当、激越、めまい感、咳、呼吸困難、肺感染、心不全、呼吸器不全、浮腫、体重増加、粘液膿性の再発（ｍｕｃｏｐｕｒｕｌｅｎｔ ｒｅｌａｐｓ）、悪液質、喘鳴、頭痛、および異常な症状（例えば、異常な疼痛、下痢または便秘）が挙げられる。
処置の効力（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）は、特定の免疫に関連する障害を診断するか、または処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。免疫に関連する障害の１つ以上の症状の緩和は、抗体が臨床上の利益を提供することを示す。
所望の特異性を有する抗体のスクリーニングのための方法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当該分野において公知である免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＭＤ−２（またはそのフラグメント）に複合体形成されない場合のＴＬＲ４に対する抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体もしくはＴＬＲ４の位置決定および／または定量化に関連する分野において公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４のレベルの測定に使用するため、診断方法において使用するため、上記タンパク質の画像化に使用するためなど）。所与の実施形態において、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体もしくはＴＬＲ４に特異的な抗体、または抗体由来の抗原結合ドメインを含むその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログが、薬理学的に活性な化合物（以下、本明細書中で「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」と称される）として利用される。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４に特異的な抗体は、イムノアフィニティー、クロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によってＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４ポリペプチドを単離するために使用され得る。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４タンパク質（またはそのフラグメント）に対する抗体は、臨床試験手順の一部（例えば、所与の処置レジメンの効力を決定するため）として組織のタンパク質レベルをモニタリングするために診断的に使用され得る。検出は、その抗体を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによって促され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般に、被験体において異常なＴＬＲ４シグナリングに関連する疾患もしくは病理を処置するか、または予防するために利用される。抗体調製物（好ましくは、その標的抗原に対する高い特異性および高い親和性を有するもの）は、上記被験体に投与され、そしてその抗体調製物は、一般に、その標的に対するその結合に起因する効果を有する。上記抗体の投与は、上記標的（例えば、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体）のシグナリング機能を廃絶し得るか、阻害し得るか、または妨害し得る。上記抗体の投与は、標的（例えば、ＴＬＲ４）と、その標的が天然に結合する内因性リガンド（例えば、ＴＬＲ４またはＭＤ−２アクセサリータンパク質）との結合を廃絶し得るか、阻害し得るか、または妨害し得る。例えば、上記抗体は、上記標的に結合し、そしてＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生を中和する。
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療対象を達成するのに必要とされる量に関連する。上に記載されるように、これは、特定の場合において、上記標的の機能することを妨害する、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。さらに、投与されるのに必要とされる量は、その特定の抗原に対する上記抗体の結合親和性に依存し、そしてその量はまた、投与される抗体がその抗体が投与される他の被験体の自由体積（ｆｒｅｅ ｖｏｌｕｍｅ）から枯渇する速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投薬のための一般的な範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、これに限定されない。一般的な投薬頻度は、例えば、１日２回〜週に１回の範囲であり得る。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体もしくはＴＬＲ４タンパク質またはそのフラグメントを特異的に結合する本発明の抗体は、異常なＬＰＳシグナリングに関連する障害の処置のために、薬学的組成物の形態で投与され得る。このような組成物の調製に関する原則および検討事項、ならびに成分の選択における指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら、編集者）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ、Ｐａ．、１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４巻）、１９９１、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて提供される。
抗体フラグメントが使用される場合、上記標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい抑制性フラグメントが、好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、上記標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が、設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得るか、そして／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと）。処方物はまた、処置される特定の適応に必要であるような１種より多い活性化合物（好ましくは、互いに不利に影響しない補完的な活性を有する化合物）を含み得る。代替的か、またはそれに加えて、上記組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖抑制剤）を含み得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量で、組み合わせにおいて安定に存在する。
上記活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル中に捕捉され得、そのマイクロカプセルは、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）である。
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、上記抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性のエチレン−ビニルアセテート、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間以上にわたって分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
本発明に従う抗体は、サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４タンパク質（またはそのタンパク質フラグメント）の存在を検出するための薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態において、上記抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル抗体であるか、またはより好ましくは、モノクローナル抗体である。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ）２）が、使用される。プローブまたは抗体に関して、用語「標識される」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブあるいは抗体の直接的な標識化、および直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を包含することが、意図される。間接的な標識化の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、およびビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化（その結果、それが、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出され得る）が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内部に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。したがって、血液、および血清、血漿、もしくはリンパを含む血液の分画または成分が、用語「生物学的サンプル」の使用の範囲内に含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、生物学的サンプル中の被検体であるｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよびインビボで検出するために使用され得る。例えば、被検体ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。被検体タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。被検体ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを実行するための手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４２巻、Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ．（編）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９５；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｅ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９６；ならびに「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、．Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５に記載される。さらに、被検体タンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験体に、標識された抗被検体タンパク質抗体を導入することが挙げられる。例えば、上記抗体は、被験体における存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーによって標識され得る。
（キメラポリペプチド）
本発明のキメラペプチドは、作動可能に１つに結合された第１および第２のドメインを含む。上記第１のドメインは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの少なくとも一部を含み、一方で、上記第２のドメインは、ＭＤアクセサリータンパク質の少なくとも一部を含む。上記第１のドメインおよび上記第２のドメインは、上記ペプチドにおいて任意の順序で存在し得、そしてそのペプチドは、各ドメインの１つ以上を含み得る。上記キメラタンパク質は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの少なくとも１つの生物学的に活性な部分またはＭＤアクセサリータンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。上記キメラペプチドは、可溶性である。可溶性によって、流体に溶解する能力が意味される。
「ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド」とは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドとしては、例えば、ＴＬＲ １〜ＴＬＲ １０およびＲＰ１０５が挙げられる。上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチド、および／またはｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドをコードする核酸は、当該分野において公知であり、そして例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＣＡＨ７２６２０；ＣＡＨ７２６１９；ＮＰ＿００３２５４；ＮＰ＿００３２５５；ＮＰ＿００３２５９；ＮＰ＿００６０５９；ＮＰ＿０５７６４６；ＮＰ＿００３２５６；ＡＡＨ３３６５１；ＣＡＤ９９１５７；ＡＡＭ２３００１；ＢＡＢ４３９５５；ＡＡＦ０５３１６；ＡＡＫ２６７４４；ＡＡＦ７８０３７；ＡＡＦ７８０３６；ＡＡＦ７８０３５；ＢＡＢ１９２５９；ＡＡＦ６４０６１；ＡＡＦ６０１８８；ＡＡＦ８９７５３；ＡＡＦ０７８２３；ＢＡＡ７８６３１；ＡＡＣ３４１３５；ＡＡＣ３４１３４；ＡＡＣ３４１３３；ＡＡＣ３４１３７）に記載され、かつその全体が本明細書中に参考として援用される、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドをコードする配列を使用して構築され得る。上記キメラタンパク質において、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドの全部または一部に対応し得る。好ましくは、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドは、上記ポリペプチドの細胞外部分を含む。
「ＭＤアクセサリータンパク質」とは、ＭＤアクセサリータンパク質の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。上記ＭＤタンパク質は、例えば、ＭＤ−１またはＭＤ−２である。上記ＭＤアクセサリータンパク質、および／またはＭＤアクセサリータンパク質をコードする核酸は、当該分野において公知であり、そして例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に記載される、ＭＤアクセサリータンパク質をコードする配列を使用して構築され得る。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０９５７１１（ＭＤ−１）；ＡＡＣ９８１５２（ＭＤ−１）；Ｑ９Ｙ６Ｙ９（ＭＤ−２）；ＮＰ＿０５６１７９（ＭＤ−２）；ＡＡＨ２０６９０（ＭＤ−２）；およびＢＡＡ７８７１７（ＭＤ−２）。例示のＭＤアクセサリータンパク質配列および核酸配列は、図３２Ａ、３２Ｂ、３３Ａおよび３３Ｂに示される。上記キメラタンパク質において、上記ＭＤアクセサリータンパク質は、ＭＤアクセサリータンパク質の全部または一部に対応し得る。
上記キメラタンパク質は、１つ以上のさらなる部分に結合され得る。例えば、上記キメラタンパク質は、糖タンパク質Ｉｂα融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ融合タンパク質に、さらに結合され得る。このような融合タンパク質は、キメラタンパク質の精製を容易にし得る。
別の実施形態において、上記キメラタンパク質は、そのＮ末端に、異種シグナル配列（すなわち、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドまたはＭＤアクセサリータンパク質の核酸によってコードされるポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）を含む。例えば、ネイティブのｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドシグナル配列は、取り除かれ得、そして別のタンパク質由来のシグナル配列によって置換され得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、キメラタンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増加し得る。
本発明のキメラタンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術にしたがって（例えば、ライゲーションのための平滑末端または突出末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な粘着末端の充足、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを利用することによって）、インフレームで１つにライゲーションされる。別の実施形態において、上記融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を産生するために、その後にアニーリングされ、そして再度増幅され得る２つの連続した遺伝子フラグメントの間に、相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して行なわれ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。糖タンパク質Ｉｂαをコードする核酸は、上記融合部分が上記免疫グロブリンタンパク質にインフレームで結合されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
上記キメラタンパク質において、用語「作動可能に結合される」は、上記第１のポリペプチドおよび上記第２のポリペプチドが、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリータンパク質に関連する少なくとも１つの機能を可能にする様式で化学的に結合される（最も代表的には、ペプチド結合などの共有結合を介して）ことを示すことが、意図される。上記キメラタンパク質をコードする核酸をいうために使用される場合、用語「作動可能に結合される」は、ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドまたはＭＤアクセサリータンパク質をコードする核酸が互いにインフレームで融合されることを意味する。上記ＭＤアクセサリータンパク質は、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。必要に応じて、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリータンパク質は、スペーサーアームを介して結合される。スペーサーアームは、分子内の可撓性を提供するか、または結合体化部分の間の分子内の距離を調整し、それによって生物学的活性の保存を補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸（例えば、プロリン、セリンまたはグリシン）を含むポリペプチド部分の形態であり得る。好ましくは、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよびＭＤアクセサリータンパク質は、柔軟なグリシン／セリンリンカーを介して結合される。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、カタログ番号２１６５１ Ｈ）にあるような架橋試薬の一部であり得る。
他の実施形態において、上記ｔｏｌｌ様レセプターポリペプチドおよび上記ＭＤアクセサリータンパク質は、当該分野において公知である任意の適切な様式で、化学的にカップリングすることによって結合される。多くの公知である化学的な架橋形成方法は、非特異的である、すなわち；それらは、カップリングの点を、上記ｔｏｌｌ様ポリペプチドまたはＭＤアクセサリータンパク質上の任意の特定の部位に指向させない。結果として、非特異的架橋剤の使用は、機能的部位を攻撃し得るか、または活性部位を立体化学的にブロックし得、上記結合体化タンパク質を生物学的に不活性にする。
カップリングの特異性を増加させる１つの方法は、架橋されるポリペプチドの一方もしくは両方において１回のみか、または数回見出される官能基に、直接、化学的にカップリングを行なうことである。例えば、多くのタンパク質において、チオール基を含む唯一のタンパク質のアミノ酸であるシステインは、数回のみ見出される。また、例えば、ポリペプチドがリジン残基を含まない場合、第１級アミンに特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的である。カップリングの特異性を増加させるためのこのアプローチの上首尾の利用は、上記ポリペプチドがその分子の生物学的活性の喪失を伴わずに変えられ得る分子の領域に、適切に数が少なく、かつ反応性の残基を有することを必要とする。
システイン残基は、それらがポリペプチド配列の部分に存在する場合に、置換され得、その部分において、架橋形成反応におけるシステイン残基の関与が、置換されなければ生物学的活性を妨害する可能性がある。システイン残基が置換される場合、代表的に、ポリペプチドの折り畳みにもたらす変化を最小限にすることが、望ましい。ポリペプチドの折り畳みの変化は、上記置換体（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が化学的かつ立体化学的にシステインに類似する場合に、最小限にされる。これらの理由から、セリンが、システインに対する置換体として好ましい。下の実施例において示されるように、システイン残基は、架橋形成を目的として、ポリペプチドのアミノ酸配列中に導入され得る。システイン残基が導入される場合、アミノ末端もしくはカルボキシ末端か、またはそれらの近傍における導入が、好ましい。従来の方法は、目的のポリペプチドが、化学合成によって産生されるか、または組換えＤＮＡの発現によって産生されるかにかかわらず、このようなアミノ酸配列の改変に利用可能である。
上記２つの構成物のカップリングは、カップリング剤または結合体化剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって達成され得る。利用され得る数種の分子間架橋試薬が、存在する。例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、ｐｐ．３９−４３を参照のこと。とりわけ、これらの試薬は、例えば、Ｊ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらの両方は、スルフヒドリル基に対して高度に特異的であり、そして不可逆的な結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６個〜１１個の炭素メチレン架橋を有する他のこのような試薬（スルフヒドリル基に対して比較的に特異的）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基およびチロシン基と不可逆的な結合を形成する）である。この目的に対して有用な他の架橋試薬としては、以下が挙げられる：ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール基との不可逆的な架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（数種の異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾベンゼンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）。
架橋試薬はまた、ホモ二官能性であり得る（すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する）。好ましいホモ二官能性試薬は、ビスマレイミドへキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）においてスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含む。上記２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって連結される。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチド不可逆的な架橋に有用である。
架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤は、それぞれ、遊離のアミンおよび遊離のチオールを有する２つのタンパク質を架橋する２つの異なる官能基（例えば、アミン反応性基およびチオール反応性基）を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（「ＭＳＳ」）、およびスクシニミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）（ＭＢＳの延長した鎖のアナログ）である。これらの架橋因子のスクシニミジル基は、第１級アミンと反応し、そしてチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
架橋試薬は、しばしば、水において低い溶解度を有する。親水性部分（例えば、スルホネート基）が、その水に対する溶解度を改良するために、上記架橋試薬に付加され得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水に対する溶解度について改変された架橋試薬の例である。
多くの架橋試薬は、細胞条件下において本質的に非開裂性である結合体を生じる。しかし、いくつかの架橋試薬は、細胞条件下において開裂可能である共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を含む。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬、ジチオールビス（スクシニミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、およびＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の開裂可能な架橋因子である。開裂可能な架橋試薬の使用は、標的細胞中への送達後に、載荷部分（ｃａｒｇｏ ｍｏｉｅｔｙ）を輸送ポリペプチドから離れさせる。直接的なジスルフィド結合もまた、有用であり得る。
上で考察されるものを含む多くの架橋試薬が、市販されている。それらの使用のための詳細な指示書は、商業的な供給業者から容易に入手可能である。タンパク質の架橋および結合体の調製における一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
キメラペプチドの誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび改変体ならびにこれらのペプチドをコードする核酸もまた、本発明に含まれる。核酸に関して、本明細書中に提供される誘導体、フラグメント、およびアナログは、少なくとも６個の（隣接する）核酸の配列として規定され、そしてそれらは、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する。アミノ酸に関して、本明細書中に提供される誘導体、フラグメント、およびアナログは、少なくとも４個の（隣接する）アミノ酸の配列（エピトープの特異的な認識を可能にするのに十分な長さ）として規定される。
上記フラグメントの長さは、キメラペプチド、もしくはそれをコードする核酸が得られる対応する完全長の核酸またはポリペプチドの長さより短い。誘導体およびアナログは、完全長であり得るか、またはその誘導体もしくはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合には、完全長以外であり得る。上記キメラペプチドの誘導体またはアナログとしては、例えば、種々の実施形態において、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、もしくは９５％、９８％、または９９％でさえも（同一の大きさのアミノ酸配列にわたる同一性またはアライメントが当該分野において公知であるコンピューター相同性プログラムによって行なわれる整列された配列と比較した場合）、そのペプチドと実質的に相同である領域を含む分子が挙げられる。例えば、配列同一性は、配列分析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５）を使用し、その中の初期設定のパラメータを用いて測定され得る。
特定のポリペプチドが、規定された長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性の％を有するといわれる場合、その同一性の％は、参照ペプチドに関連する。したがって、１００アミノ酸長である参照ポリペプチドに対して５０％の同一性であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸長の部分と完全に同一である５０アミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、参照ポリペプチドに対して、その全体の長さにわたって５０％の同一性である１００アミノ酸長のポリペプチドであり得る。当然に、他のポリペプチドは、同じ基準を満たす。
（薬学的組成物）
本発明の抗体または可溶性キメラポリペプチド（本明細書中で「活性化合物」とも称される）、ならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した薬学的組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記抗体または可溶性キメラポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野における標準的な参考の教科書）の最新版（本明細書中に参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、固定油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が上記活性化合物と不適合である限りを除いて、上記組成物におけるその使用が企図される。補足の活性化合物もまた、上記組成物中に組み込まれ得る。
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方され得る。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（すなわち、局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤（例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成の溶液）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製もしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能な注射器または複数用量バイアルに入れられ得る。
注射可能な用途に適した薬学的組成物としては、無菌の水溶液（水溶性である）または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｗａｔｅｒ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、上記組成物は、無菌でなければならず、そしてその組成物は、容易な注射器通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りは流体であるはずである。それは、製造および保管の条件下において安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。上記キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動率は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用、必要とされる粒径の維持（分散物の場合）、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張化剤（例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、その組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量で活性化合物を、上に列挙される成分の１つまたはその組み合わせと一緒に適切な溶媒中に取り込み、必要とされる場合、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基礎の分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む無菌のビヒクル中に上記活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合において、調製の方法は、活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、その予め濾過滅菌した溶液から生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、上記活性化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、含そう剤として使用するための流体キャリアを使用して調製され得、その流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてスウィッシュ（ｓｗｉｓｈ）されて、吐き出されるか、または嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料が、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、または同様の性質の化合物を含み得る：バインダー（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジ香味料）。
吸入による投与について、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与に関して、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が、上記処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野において公知であり、そしてその浸透剤としては、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与に関して、上記活性化合物は、一般に、当該分野において公知であるような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
上記化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、従来の坐剤の基剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリド）を用いる）または保留浣腸の形態で調製され得る。
１つの実施形態において、上記活性化合物は、その化合物を、身体からの迅速な排泄に対して保護するキャリアを用いて調製される（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化した送達システムを含む制御放出処方物）。生分解性の、生体適合性ポリマーが、使用され得る（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。その材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的化するリポソームが挙げられる）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知である方法に従って調製され得る。
経口組成物または非経口組成物を投与の容易さおよび投薬の均一性のために投薬単位形態で処方するとこは、特に有益である。本明細書中で使用されるような投薬単位形態とは、処置される被験体に対する統一された投薬として適した物理的に別個の単位をいう；必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果をもたらすために算出される所定の量の活性化合物を含む各単位。本発明の投薬単位形態についての明細は、上記活性化合物の独特な特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにこのような活性化合物を調合する分野における固有の制限によって決定付けられる
上記薬学的組成物は、投与のための指示書と一緒に容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
（スクリーニング方法）
本発明は、ＭＤ−２アクセサリータンパク質に対するＴＬＲ４の結合をモジュレートするか、もしくはそうでなければそれを妨害するモジュレーター（すなわち、候補化合物もしくは候補薬剤または試験化合物もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体、低分子または他の薬物）、あるいはＴＬＲ４および／もしくはＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナリング機能をモジュレートするか、またはそうでなければそれを妨害する候補化合物もしくは候補薬剤または試験化合物もしくは試験薬剤を同定する方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。異常なＬＰＳ−シグナリングに関連する障害を処置するのに有用な化合物を同定する方法も、提供される。本発明はまた、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナリングおよび／もしくはＴＬＲ４とＭＤ−２との間の相互作用をモジュレートする候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野で公知であるコンビナトリアルライブラリー方法における任意の多くのアプローチを使用して得られ得、その方法としては、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリーまたはパラレル液相ライブラリー；分注（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」のライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法。上記生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種のアプローチは、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。（例えば、Ｌａｍ、１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １２：１４５）。
本明細書中で使用される場合、「低分子」は、約５ｋＤ未満の分子量、そして最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成をいうことが意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、リピドまたは他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的混合物のライブラリーおよび／または生物学的混合物（真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物）のライブラリーが、当該分野において公知であり、そしてそれらは、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングされ得る。
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当該分野において見出され得る（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３）。
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１を参照のこと）、またはビーズ（Ｌａｍ、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４を参照のこと）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３．Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６を参照のこと）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号を参照のこと）、胞子（米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９を参照のこと）またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；ならびに米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと）にて与えられ得る。
１つの実施形態において、候補化合物は、抗体−抗原複合体に導入され、そしてその候補化合物がその抗体−抗原複合体を破壊するか否かが、決定され、この複合体の破壊は、その候補化合物がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体のシグナリング機能および／またはＴＬＲ４とＭＤ−２との間の相互作用をモジュレートすることを示す。例えば、上記抗体は、モノクローナル抗体ｍｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１８Ｈ１０であり、そして上記抗原は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体である。あるいは、上記モノクローナル抗体は、１６Ｇ７、ｍｕ１５Ｃ１、ｈｕ１５Ｃ１、ｍｕ７Ｅ３またはｈｕ７Ｅ３であり、そして上記抗原は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４である。
別の実施形態において、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体が、提供され、そしてそのＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体は、少なくとも１種の中和モノクローナル抗体に曝される。抗体−抗原複合体の形成が、検出され、そして１種以上の候補化合物が、その複合体に導入される。Ｉｆ 上記抗体−抗原複合体が、上記１種以上の候補化合物の導入後に破壊される場合、その候補化合物は、異常なＬＰＳ−シグナリングに関連する障害を処置するのに有用である。
別の実施形態において、本発明の可溶性キメラタンパク質が、提供され、そしてその可溶性キメラタンパク質は、少なくとも１種の中和モノクローナル抗体に曝される。抗体−抗原複合体の形成が、検出され、そして１種以上の候補化合物が、その複合体に導入される。上記抗体−抗原複合体が、上記１種以上の候補化合物の導入後に破壊される場合、その候補化合物は、異常なＬＰＳ−シグナリングに関連する障害を処置するのに有用である。
上記試験化合物の上記抗体−抗原複合体を妨害するかまたは、破壊する能力を決定することは、例えば、その試験化合物と放射性同位体または酵素標識とを、抗原もしくはその生物学的に活性な部分に対するその試験化合物の結合が複合体において標識された化合物を検出することによって決定され得るようにカップリングすることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、もしくは３Ｈによって、直接的かまたは間接的かのいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体は、放射線放出を直接計測することか、またはシンチレーションを計測することによって検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識され得、そしてその酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を決定することによって検出される。
１つの実施形態において、上記アッセイは、抗体−抗原複合体と試験化合物とを接触させること、およびその試験化合物の、その抗原と相互作用するか、またはそうでなければ存在する抗体−抗原複合体を破壊する能力を決定することを包含する。この実施形態において、上記試験化合物の上記抗原と相互作用する能力および／または上記抗体−抗原複合体を破壊する能力を決定することは、その試験化合物の、上記抗原またはその生物学的に活性な部分に対してその抗体と比較して優先的に結合する能力を決定することを包含する。
別の実施形態において、上記アッセイは、抗体−抗原複合体と試験化合物とを接触させること、およびその試験化合物のその抗体−抗原複合体をモジュレートする能力を決定することを包含する。上記試験化合物の上記抗体−抗原複合体をモジュレートする能力を決定することは、例えば、上記抗原の、その試験化合物の存在下において、上記抗体に結合するか、またはその抗体と相互作用する能力を決定することによって達成され得る。
当業者は、本明細書中に開示される任意のスクリーニング方法において、上記抗体は、中和抗体（例えば、モノクローナル抗体ｈｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１５Ｃ１および／またはｈｕ７Ｅ３）であり得、それらの各々が、ＬＰＳ誘導性の炎症促進性サイトカイン産生をモジュレートするか、またはそうでなければそれを妨害することを、認識する。
本明細書中に開示されるスクリーニング方法は、細胞ベースのアッセイまたは細胞を含まないアッセイとして行われ得る。本発明の細胞を含まないアッセイは、ＴＬＲ４および／またはＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４ならびにそのフラグメントの、可溶性形態あるいは膜結合形態のいずれかの使用に従う。ＴＬＲ４および／またはＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体の膜結合形態を含む細胞を含まないアッセイの場合において、それらのタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが、望まれ得る。このような可溶化剤の例としては、非イオン性洗浄剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ）（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。
１つより多くの実施形態において、上記抗体または上記抗原のいずれかを固定化して、候補化合物の導入後に、一方または両方の複合体形成されていない形態から複合体形成された形態を分離することを容易にすること、および上記アッセイの自動化を提供することが、望まれ得る。候補化合物の存在下または非存在下における抗体−抗原複合体の観察は、反応物を含むのに適したあらゆる容器において達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブが挙げられる。１つの実施形態において、上記タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−抗体融合タンパク質またはＧＳＴ−抗原融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート（これらは、次いで、上記試験化合物と混合される）上に吸着され得、そしてその混合物は、複合体形成をもたらす条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件）においてインキュベートされる。インキュベーション後、上記ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルは、任意の結合されなかった成分（ビーズの場合において固定化されたマトリックス）を除去するために洗浄され、複合体が、直接的または間接的に決定される。あるいは、上記複合体は、上記マトリックスから解離され得、そして抗体−抗原複合体形成のレベルが、標準的な技術を使用して決定され得る。
マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、上記抗体（例えば、ｈｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１５Ｃ１、および／またはｈｕ７Ｅ３）または上記抗原（例えば、ＴＬＲ４／ＮＭ−２複合体および／またはＴＬＲ４タンパク質）のいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体を利用して固定化され得る。ビオチン化抗体分子またはビオチン化抗原分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製され得、そしてそれらの分子は、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化され得る。あるいは、目的の抗体または目的の抗原と反応性であるが、目的の抗体−抗原複合体の形成を妨害しない他の抗体は、プレートのウェルに対して誘導体化され得、そして非結合の抗体または抗原は、抗体の結合体化によってそのウェル中に捕捉され得る。ＧＳＴによって固定化される複合体について上に記載される方法に加えて、このような複合体を検出するための方法としては、上記抗体または抗原と反応性であるこのような他の抗体を使用する複合体の免疫検出が挙げられる。
本発明は、さらに、任意の上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのその使用に関連する。
（診断アッセイ）
本発明の抗体は、適切なアッセイ（例えば、従来の型のイムノアッセイ）によって検出され得る。例えば、サンドイッチアッセイが行われ得、ここでＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体もしくはＴＬＲ４タンパク質またはそれらのフラグメントは、固相に固定される。インキュベーションは、サンプル中の抗体をその固相上の固定化されたポリペプチドに結合させるのに十分な期間にわたって維持される。この第１のインキュベーション後、上記固相は、上記サンプルから離される。上記固相は、非結合材料および妨害物質（例えば、上記サンプル中にまた存在し得る非特異的なタンパク質）を除去するために洗浄される。次いで、上記固定化されたポリペプチドに結合された目的の抗体（例えば、モノクローナル抗体ｈｕ１８Ｈ１０、ｈｕ１５Ｃ１および／またはｈｕ７Ｅ３）を含む固相は、第２の、標識された抗体またはカップリング剤（例えば、ビオチンまたはアビジン）に結合された抗体と一緒にインキュベートされる。この第２の抗体は、別の抗ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体抗体、別の抗ＴＬＲ４抗体または別の抗体であり得る。抗体のための標識は、当該分野において周知であり、そしてその標識としては、放射性核種、酵素（例えば、マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌｅａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒ）（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレスカルミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｒｍｉｎｅ））、ビオチンなどが挙げられる。上記標識された抗体は、上記固相と一緒にインキュベートされ、そしてその固相に結合されたその標識が、測定される。これらのイムノアッセイまたは他のイムノアッセイは、当業者によって容易に実施され得る。
生物学的サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４タンパク質の存在または非存在を検出するための例示の方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得ること、およびＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の存在がその生物学的サンプルにおいて検出されるように、その生物学的サンプルと、本発明に従う標識されたモノクローナル抗体とを接触させることを包含する。
本明細書中で使用される場合、プローブまたは抗体に関して、用語「標識される」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブあるいは抗体の直接的な標識化、および直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を包含することが、意図される。間接的な標識化の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、およびビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化（その結果、それが、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出され得る）が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内部に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法は、生物学的サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４をインビトロおよびインビボで検出するために使用され得る。例えば、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。さらに、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の検出のためのインビボ技術としては、被験体に、標識された抗ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体または標識された抗ＴＬＲ４抗体を導入することが挙げられる。例えば、上記抗体は、被験体における存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーによって標識され得る。
１つの実施形態において、上記生物学的サンプルは、試験被験体由来のタンパク質分子を含む。１つの好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
本発明はまた、生物学的サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、上記キットは、以下を備え得る：生物学的サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体、もしくはＭＤ−２と複合体形成されない場合のＴＬＲ４を検出し得る標識化合物または標識薬剤（例えば、抗ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体モノクローナル抗体または抗ＴＬＲ４モノクローナル抗体）；そのサンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の量を決定する手段；およびそのサンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４の量と、標準とを比較するための手段。上記化合物または薬剤は、適切な容器中にパッケージ化され得る。上記キットは、サンプル中のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＴＬＲ４を検出するためにそのキットを使用するための指示書をさらに備え得る。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
（実施例１：マウス１８Ｈ１０モノクローナル抗体の産生のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体の産生）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ ２９３細胞において産生した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して、Ｎ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そしてＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグとプロテインＣエピトープタグとをコードするヒトＭＤ−２ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。両方の構築物を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅ ６ＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８および２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む培地において選択した。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞を選択するために、１ｍｌあたり１×１０７個の細胞を、１％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌ抗プロテインＣモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を補充した１×ＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を、１回洗浄し、次いでＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：２００希釈；Ａｎｗａｒａ）を含む同じ緩衝液中でインキュベートした。次いで細胞を、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と一緒にインキュベートし、そしてそれを、Ｍｉｄｉ ＭＡＣＳ
ＬＳカラムに通した。そのカラム上に保持された細胞を、溶出させ、そして抗生物質選択を伴う培養に戻した。分取のラウンドを、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞の均一なポジティブの集団が得られるまで続けた。
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２タンパク質の産生）
組換え可溶性ＭＤ−２を産生するために、検出目的および精製目的のためのＣ末端のＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させた。４８時間後、上記組換えタンパク質を、ＮｉＮＴＡアフィニティーマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、感染細胞の上清から精製した。
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質を産生するために、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に結合したヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを使用して組み立てた。ＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを、検出目的および精製目的のために、ＭＤ−２のＣ末端に含めた。上記ｃＤＮＡカセットを、バキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させた。４８時間後、上記組換えタンパク質を、抗ＦＬＡＧＴＭＭ２ ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞溶解物から精製した。
（Ｃ．マウスの免疫化）
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を、Ｂｕｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ ９２：３５２１−３５２８（１９９８）（その全体が本明細書によって参考として援用される）において先に記載されるように、ＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ）において１ｍｌあたり１０６個のＣＨＯ細胞の皮下注射（ｓ．ｃ．）によって、０日目、７日目および２８日目にて免疫化した。
（Ｄ．特異的な血清の滴定）
上記マウスを、０日目および１４日目に出血させた。ＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的な抗体力価を、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト２９３細胞に対するＦＡＣＳ分析によって、血清において評価した。細胞を、１：２５０希釈、１：２５００希釈および１：２５０００希釈にてマウス血清と一緒にインキュベートし、洗浄し、ＡＰＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒にインキュベートし、そしてＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で分析した。
（Ｅ．Ｂ細胞／骨髄腫融合）
特異的ＴＬＲ４／ＭＤ−２血清抗体を有するマウスを、融合の３日前または４日前のいずれかにて、キメラＴＬＲ４／ＭＤ−２融合タンパク質によって皮下（ｓ．ｃ．）に「過剰ブースト（ｈｙｐｅｒｂｏｏｓｔ）した」。流入領域リンパ節（Ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との融合のために、Ｂ細胞の供給源として得た。Ｂ細胞抽出および細胞融合を、Ｂｕｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ ９２：３５２１−３５２８（１９９８）（その全体が本明細書によって参考として援用される）において先に記載されるように行った。細胞を、ウェル１つあたり約１０４個の骨髄腫細胞の濃度にてプレートし、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を補充した培地において１０〜１４日間にわたって増殖させた。
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
生存可能なハイブリドーマ細胞を含むウェル由来の上清を、ｍｏｃｋトランスフェクトＣＨＯ細胞 対 ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト骨髄腫細胞において、ＴＬＲ４／ＭＤ−２特異性についてＦＡＣＳ分析によってスクリーニングした。次いで細胞を、上清およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒にインキュベートした。細胞を、ＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。
（Ｇ． ＦＡＣＳによるモノクローナル抗体特異性）
ＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳを含む２ｍｌの培地においてウェル１つあたり２．５×１０５個の細胞の密度にて６ウェルプレートにプレートした。プレートした１６時間後、細胞を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、０．７５μｇの適切なベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、適切なモノクローナル抗体（図４に示すような）およびＡＰＣとカップリングしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって染色し、そしてＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用して分析した。
（Ｈ．直接ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体特異性）
Ｃ末端のＦＬＡＧエピトープタグおよびヒスチジンエピトープタグを有する組換え可溶性ＭＤ−２を、５０μｌ ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌの濃度で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上にコーティングした。ウェルを、２００μｌ ＰＢＳ ２％
ＢＳＡによってブロックし、次いでＰＢＳ １％ ＢＳＡにおいて、示された濃度の適切なＭＡｂと一緒にインキュベートした。３ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０による３回の洗浄工程の後、１：５０００希釈における５０μｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、そのウェルに添加した。さらなる洗浄工程の後、結合を、ＴＭＢ基質を使用して示した。プレートを、６５０ｎｍの波長にて読み取った。
（Ｉ．サンドイッチＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体特異性）
サンプルの調製のために、ＨＥＫ ２９３細胞を、上の段落Ｇにおいて記載されるように、Ｆｕｇｅｎｅ ６ＴＭトランスフェクション試薬を使用して、適切なプラスミド構築物によってトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、回収し、そして遠心分離によって除去処理した（ｃｌｅａｒｅｄ）。次いで細胞を、ビオチン化ｍｕ１８Ｈ１０（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％ ＮＰ４０に溶解した。
サンドイッチＥＬＩＳＡを行なうために、Ｎｕｎｅ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌにて５０μｌの抗ＦＬＡＧＴＭＭ２ ＭＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングした。ウェルを、２００μｌ ＰＢＳ ２％ ＢＳＡによってブロックし、次いで示された希釈にて５０μｌの適切なサンプルと一緒にインキュベートした。ウェルを、２００μｌ ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０によって３回洗浄し、そして５０μｌの適切な抗体（ビオチン化ｍｕ１８Ｈ１０および１２Ｄ４について１０μｇ／ｍｌ、ポリクローナル抗ＭＤ−２ ＭＡｂについて１μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。上記のような洗浄工程の後、ウェルを、５０μｌの適切な検出抗体（ビオチン化ＭＡｂに対して、１：１５００の希釈におけるＨＲＰ結合体化ストレプトアビジンおよびポリクローナルウサギＡｂに対して、１：５０００の希釈におけるＨＲＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））と一緒にインキュベートした。さらなる洗浄工程の後、結合を、ＴＭＢ基質を使用して示した。プレートを、６５０ｎｍの波長にて読み取った。
（Ｊ．細胞のアッセイ１）
モノクローナル抗体を、最初に、ハイブリドーマ細胞の上清から、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞を、９６ウェルプレートにおいて１ｍｌあたり５×１０５個の細胞にて、１０％ ＦＢＳを含む培地中にプレートし、そして付着させるために一晩放置した。次いでその培地を、除去し、そして２％ ＦＢＳと所望の最終濃度の２倍の適切なモノクローナル抗体とを含む１００μｌの培地に、３７℃にて３０分間置換した。次いでＬＰＳ（Ｋ１２ＬＤ２５、Ｓｉｇｍａ）を、２％ ＦＢＳを含む１００μｌの培地中の３０ｎｇ／ｍｌの濃度にて、その細胞に添加した。細胞を３７℃にて１６時間インキュベートし、そして上清を回収した。ＩＬ−８含量を、モノクローナル抗体の対８０１ＥおよびＭ８０２Ｂ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
（Ｋ．細胞のアッセイ２）
ヒト全血を、ＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）において１：４に希釈し、そして９６ウェルプレートにおいて、ウェル１つあたり１００μｌにて、所望の最終濃度の２倍の適切なモノクローナル抗体と一緒に３７℃にて３０分間プレートした。次いでＬＰＳ（Ｋ１２ＬＤ２５、Ｓｉｇｍａ）（所望の最終濃度の２倍の用量）を、５ｍｇ／ｍｌ ＨＡＳを含む１００μｌ ＲＰＭＩにおいて添加し、そして３７℃にて６時間インキュベートした。次いでプレートを、２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、そして各ウェルからの上清を、保った。ＩＬ−８濃度を、上に記載されるように、モノクローナル抗体の対８０１ＥおよびＭ８０２Ｂ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。
（Ｌ．１８Ｈ１０ ＶＨ配列および１８Ｈ１０ ＶＬ配列）
１０７個のハイブリドーマ細胞を、回収し、そして１ｍｌ ＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する前にＰＢＳで１回洗浄した。次いで全ＲＮＡを、製造業者の指針に従って抽出した。ｍｕ１８Ｈ１０ハイブリドーマの３つの独立したサブクローン由来のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、マウスリーダー配列および定常ドメイン（ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８−８９（１９９１））に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって産生した。増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）にクローニングし、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。
次いで上記ＶＨ ｃＤＮＡおよびＶＬ ｃＤＮＡを、７Ｅ３をキメラＭＡｂ（「キメラ７Ｅ３」）として発現するために、それぞれ、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。組換えキメラＭＡｂを産生するために、ＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳを含む２ｍｌの培地においてウェル１つあたり２．５×１０５個の細胞の密度にて６ウェルプレートにプレートした。プレートした１６時間後、細胞を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、０．７５μｇの適切なベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、そして抗体を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
（実施例２：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するｍｕ１８Ｈ１０ ＭＡｂの産生）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞によって免疫化したマウスを、特異的な血清力価についてモニタリングした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すマウスを、組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質によって「過剰ブースト」した。このストラテジーは、過剰ブーストする際に、免疫系が最初にコンホメーションのＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に曝され、そして非特異的なＣＨＯ細胞の抗原に対する応答を最小限にし、同時にＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的応答を最大にすることを可能にするために選択された。Ｂ細胞／骨髄腫融合から生じるハイブリドーマ由来の上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、ｍｏｃｋトランスフェクトＣＨＯ細胞 対 ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった。１つの特定のクローン由来のモノクローナル抗体（本明細書中でｍｕ１８Ｈ１０と称される）は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に特異的に結合することを示した（図１）。この抗体は、マウスＩｇアイソタイプ分析（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）ＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳによって決定したところ、ＩｇＧ２ｂκアイソタイプを有することが見出された。
（実施例３：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるＬＰＳ活性のｍｕ１８Ｈ１０ ＭＡｂによる中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが公知である。ｍｕ１８Ｈ１０のこのＩＬ−８産生を阻害する能力は、細胞をＬＰＳ投与前に３０分間にわたって上記抗体と一緒にプレインキュベートすることによって分析した。図２は、ｍｕ１８Ｈ１０がＨＥＫ
２９３細胞において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例４：ヒト全血におけるＬＰＳ活性のｍｕ１８Ｈ１０ ＭＡｂによる中和）
ｍｕ１８Ｈ１０のヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する能力を、試験した。ｍｕ１８Ｈ１０による中和活性を、０．５〜１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体濃度の範囲を使用して、３人の異なるドナー由来の血液において試験した。図３は、ｍｕ１８Ｈ１０が、アイソタイプが一致するコントロールと比較して、３人全てのドナーにおいて、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−８のレベルを有意に減少させたことを示す。ｍｕ１８Ｈ１０は、先に記載されるα−ＴＬＲ４遮断モノクローナル抗体（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売される）よりも強力であることが見出された。これらの結果は、トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞においてｍｕ１８Ｈ１０によって認識される中和エピトープがまた、全血中の細胞の表面上に露出されること、およびｍｕ１８Ｈ１０が、全血において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの活性を阻害するほど強力であることを示す。
（実施例５：ｍｕ１８Ｈ１０特異性）
上記ｍｕ１８Ｈ１０モノクローナル抗体の特異性を決定するために、ｍｕ１８Ｈ１０がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体（先にクローニングした）のウサギオルソログを認識しないという事実を、利用した。Ｎ末端のＦＬＡＧエピトープタグを有するヒトＴＬＲ４またはウサギＴＬＲ４のいずれか、ならびにＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグおよびプロテインＣエピトープタグを有するヒトＭＤ−２またはウサギＭＤ−２のいずれかについてのｃＤＮＡを、以下の組み合わせでＨＥＲ ２９３細胞にトランスフェクトした：（１）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（２）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（３）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（４）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図４は、抗体染色後のこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、それは、ｍｕ１８Ｈ１０が、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞およびヒトＴＬＲ４とウサギＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞を認識したが、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞も、ウサギＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞も認識しなかったことを示した。これらの結果は、ｍｕ１８Ｈ１０によって認識されるエピトープがヒトＭＤ−２上に存在すること示す（図４）。
ｍｕ１８Ｈ１０は、ＭＤ−２に対する特異性を示すが、ｍｕ１８Ｈ１０がＴＬＲ４とのその相互作用の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてＭＤ−２のみを認識することが、決定された。直接ＥＬＩＳＡを使用した場合、バキュロウイルス発現系によって産生される組換え可溶性ＭＤ−２に対するｍｕ１８Ｈ１０の結合は、検出されなかった（図５ａ）。さらに、図５ｂは、ｍｕ１８Ｈ１０が、同時トランスフェクト細胞の溶解物から示されるように、ＴＬＲ４とＭＤ−２との複合体のみに結合したこと、およびトランスフェクト細胞の溶解物／上清において単独のＭＤ−２を認識せず、トランスフェクト細胞の溶解物において単独のＴＬＲ４も認識しなかったことを示す。これらのデータは、ｍｕ１８Ｈ１０が、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対して特異的であること、およびｍｕ１８Ｈ１０が、上記複合体の成分のいずれをも個別に認識しないことを示す。
（実施例６：ｍｕ１８Ｈ１０ ＶＨ配列およびｍｕ１８Ｈ１０ ＶＬ配列）
ｍｕ１８Ｈ１０ハイブリドーマクローン由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析を、図６Ａ〜６Ｆに示す。
ｍｕ１８Ｈ１０抗体は、図６Ａに示す配列番号１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号２、図６Ｂ）、および図６Ｄに示す配列番号６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号７、図６Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸を、図６Ｂおよび図６Ｅにおいて下線付きのイタリック体で強調し、そして図６Ｃおよび図６Ｆにおいて示す。（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ
Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照のこと）。ｍｕ１８Ｈ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、以下の配列の配列を有する：ＤＳＹＩＨ（配列番号３）；ＷＴＤＰＥＮＶＮＳＩＹＤＰＲＦＱＧ（配列番号４）、およびＧＹＮＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号５）。ｍｕ１８Ｈ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＳＡＳＳＳＶＩＹＭＨ（配列番号８）；ＲＴＹＮＬＡＳ（配列番号９）；およびＨＱＷＳＳＦＰＹＴ（配列番号１０）。
（実施例７：キメラ１８Ｈ１０は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する、クローン１８Ｈ１０ ＶＨおよびクローン１８Ｈ１０ ＶＬの特異性を示すために、ＦＡＣＳ分析を、キメラ１８Ｈ１０ ＭＡｂを使用して、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった（図６）。示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合を、ＡＰＣで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用して検出した。不適切なアイソタイプが一致するヒトＩｇＧ１ ＭＡｂを、コントロールとして使用した。
（実施例８：キメラ１８Ｈ１０は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳに対するクローン１８Ｈ１０ ＶＨおよびクローン１８Ｈ１０ ＶＬの中和能を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞のＬＰＳ依存性のＩＬ−８誘導を阻害する１８Ｈ１０の能力を、（上に記載するように）試験した。図７は、キメラ１８Ｈ１０が、本来の１８Ｈ１０マウスＭＡｂと非常に類似した様式で、ＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例９：ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の産生のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体の産生）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ ２９３細胞において産生した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に関して、Ｎ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そしてＣ末端のＦＬＡＧＴＴＭエピトープタグと６×ヒスチジンエピトープタグとをコードするヒトＭＤ−２ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。両方の構築物を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅ ６ＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８および２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む培地において選択した。
ＨＥＫ ２９３細胞に関して、Ｎ末端のＦＬＡＧエピトープタグをコードするヒトＴＬＲ４ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そしてＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグとプロテインＣエピトープタグとをコードするヒトＭＤ−２ ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。両方の構築物を、ＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトし、そして抗生物質耐性細胞を、上に記載した通り、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８および２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む培地において選択した。
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞を選択するために、１ｍｌあたり１×１０７個の細胞を、１％ＢＳＡ、および１０μｇ／ｍｌの抗プロテインＣモノクローナル抗体（ＣＨＯ細胞用；Ｒｏｃｈｅ）または１０μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（２９３細胞用；Ｓｉｇｍａ）のいずれかを補充した１×ＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を、１回洗浄し、次いでＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：２００希釈；Ａｎｗａｒａ）を含む同じ緩衝液中でインキュベートした。次いで細胞を、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と一緒にインキュベートし、そしてそれを、Ｍｉｄｉ ＭＡＣＳ ＬＳカラムに通した。そのカラム上に保持された細胞を、溶出させ、そして抗生物質選択を伴う培養に戻した。分取のラウンドを、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞の均一なポジティブの集団が得られるまで続けた。
（Ｂ．マウスの免疫化）
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を、実施例１の小節Ｃにおいて上に記載した通りに免疫化した。
（Ｃ．特異的な血清の滴定）
マウス血清の滴定を、実施例１の小節Ｄにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｄ．Ｂ細胞／骨髄腫融合）
特異的ＴＬＲ４／ＭＤ−２血清抗体を有するマウスを、融合の３日前または４日前のいずれかにて、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３によって皮下（ｓ．ｃ．）に「過剰ブーストした」。流入領域リンパ節を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との融合のために、Ｂ細胞の供給源として得た。Ｂ細胞抽出および細胞融合を、Ｂｕｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ ９２：３５２１−３５２８（１９９８）（その全体が本明細書によって参考として援用される）において先に記載されるように行った。細胞を、ウェル１つあたり約１０４個の骨髄腫細胞の濃度にてプレートし、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を補充した培地において１０〜１４日間にわたって増殖させた。
（Ｅ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマを、実施例１の小節Ｆにおいて上に記載した通りにスクリーニングした。
（Ｆ．モノクローナル抗体特異性）
ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を、実施例１の小節Ｇにおいて上に記載した通りに決定した。
（Ｇ．細胞のアッセイ１）
細胞のアッセイＩを、実施例１の小節Ｊにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｈ．細胞のアッセイ２）
細胞のアッセイＩＩを、実施例１の小節Ｋにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｉ．１６Ｇ７ ＶＨ配列および１６Ｇ７ ＶＬ配列）
１０７個のハイブリドーマ細胞を、回収し、そして１ｍｌ ＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する前にＰＢＳで１回洗浄した。次いで全ＲＮＡを、製造業者の指針に従って抽出した。ｍｕ１６Ｇ７クローン由来のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、製造業者の指針に従い、マウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって産生した。増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）にクローニングし、Ｔ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。
（実施例１０：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するｍｕ１６Ｇ７ ＭＡｂの産生）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞によって免疫化したマウスを、特異的な血清力価についてモニタリングした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すマウスを、ＨＥＫ ２９３ ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体によって「過剰ブーストした」。このストラテジーは、非特異的なＣＨＯ細胞の抗原に対する応答を最小限にする一方で、同時にＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的応答を最大にするために選択された。Ｂ細胞／骨髄腫融合から生じるハイブリドーマ由来の上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、ｍｏｃｋトランスフェクトＣＨＯ細胞 対 ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった。特定のクローン由来のモノクローナル抗体（本明細書中でｍｕ１６Ｇ７と称される）は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に特異的に結合することを示した（図９）。ｍｕ１６Ｇ７は、マウスＩｇアイソタイプ分析ＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳによって決定したところ、ＩｇＧ１κアイソタイプを有することが見出された。
（実施例１１：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるＬＰＳ活性のｍｕ１６Ｇ７による中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが公知である。ｍｕ１６Ｇ７のこのＩＬ−８誘導を阻害する能力を、細胞をＬＰＳ投与前に３０分間にわたって各抗体と一緒にプレインキュベートすることによって分析した。図１０は、ｍｕ１６Ｇ７がＨＥＫ ２９３細胞において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例１２：ヒト全血におけるＬＰＳ活性のｍｕ１６Ｇ７による中和）
ｍｕ１６Ｇ７の、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する能力を、試験した。ｍｕ１６Ｇ７による中和活性を、０．５〜５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体濃度の範囲を使用して、３人の異なるドナー由来の血液において試験した。図１１は、ｍｕ１６Ｇ７が、アイソタイプが一致するコントロールと比較して、３人全てのドナーにおいて、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−８のレベルを有意に減少させたことを示す。ｍｕ１６Ｇ７は、先に記載されるα−ＴＬＲ４遮断モノクローナル抗体（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売される）よりも強力であることが見出された。（Ｓｈｉｍａｚｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）を参照のこと）。いくつかの場合において、ｍｕ１６Ｇ７は、上記研究にも含まれたα−ＣＤ１４遮断モノクローナル抗体と同程度に強力であることが見出された。（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）を参照のこと）。これらの結果は、トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞上においてｍｕ１６Ｇ７によって認識される中和エピトープがまた、全血中の細胞の表面上に露出されること、およびｍｕ１６Ｇ７が、全血において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの活性を阻害するほど強力であることを示す。
（実施例１３：ｍｕ１６Ｇ７特異性）
上記ｍｕ１６Ｇ７モノクローナル抗体の特異性を決定するために、ｍｕ１６Ｇ７がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体（先にクローニングした）のウサギオルソログを認識しないという事実を、利用した。Ｎ末端のＦＬＡＧエピトープタグを有するヒトＴＬＲ４またはウサギＴＬＲ４のいずれか、ならびにＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグおよびプロテインＣエピトープタグを有するヒトＭＤ−２またはウサギＭＤ−２のいずれかについてのｃＤＮＡを、以下の組み合わせでＨＥＲ ２９３細胞にトランスフェクトした：（１）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（２）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（３）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２；（４）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２。図１２は、抗体染色後のこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、それは、ｍｕ１６Ｇ７が、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞およびヒトＴＬＲ４とウサギＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞を認識したが、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞も、ウサギＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞も認識しなかったことを示した。これらの結果は、ｍｕ１６Ｇ７によって認識されるエピトープがヒトＴＬＲ４上に存在すること示す（図１２）。
（実施例１４：ｍｕ１６Ｇ７ ＶＨ配列およびｍｕ１６Ｇ７ ＶＬ配列）
ｍｕ１６Ｇ７ハイブリドーマクローン由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析を、図１３Ａ〜図１３Ｆに示す。ｍｕ１６Ｇ７
ＶＨヌクレオチド配列およびｍｕ１６Ｇ７ ＶＬヌクレオチド配列と、公知のマウスＶＨ配列およびマウスＶＬ配列とのアライメント（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用する；これは、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒにおいて見出され得る）は、ｍｕ１６Ｇ７ ＶＨ配列が、ＩｇＨＶ１サブファミリーに最も酷似している一方で、ｍｕ１６Ｇ７ ＶＬは、ＩｇＫＶ１サブファミリーに属することを示す。
ｍｕ１６Ｇ７抗体は、図１３Ａに示す配列番号１１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号１２、図１３Ｂ）、および図１３Ｄに示す配列番号１６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号１７、図１３Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１に定義されるようなＣＤＲを含むアミノ酸を、図１３Ｂおよび図１３Ｅにおいて下線付きのイタリック体で強調し、そして図１３Ｃおよび図１３Ｆに示す。ｍｕ１６Ｇ７抗体の重鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＤＹＷＩＥ（配列番号１３）；ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＤＦＫＤ（配列番号１４）；およびＥＥＲＡＹＹＦＧＹ（配列番号１５）。ｍｕ１６Ｇ７抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＲＳＳＱＳＬＥＮＳＮＧＮＴＹＬＮ（配列番号１８）；ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号１９）；およびＬＱＶＴＨＶＰＰＴ（配列番号２０）。
（実施例１５：ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体の産生のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体の産生）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体を、実施例９の小節Ａにおいて上に記載した通りに、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ ２９３細胞において産生した。
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２タンパク質の産生）
組換え可溶性ＭＤ−２を産生するために、検出目的および精製目的のためのＣ末端のＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させた。４８時間後、上記組換えタンパク質を、ＮｉＮＴＡアフィニティーマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、感染細胞の上清から精製した。
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質を産生するために、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に結合したヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを使用して組み立てた。ＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを、検出目的および精製目的のために、ＭＤ−２のＣ末端に含めた。上記ｃＤＮＡカセットを、バキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させた。４８時間後、上記組換えタンパク質を、抗ＦＬＡＧＴＭＭ２ ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞溶解物から精製した。
（Ｃ．マウスの免疫化）
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を、実施例１の小節Ｃにおいて上に記載した通りに免疫化した。
（Ｄ．特異的な血清の滴定）
マウス血清の滴定を、実施例１の小節Ｄにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｅ．Ｂ細胞／骨髄腫融合体）
Ｂ細胞抽出および細胞融合を、実施例９の小節Ｄにおいて上に記載した通りに行い、そして分析した。
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマのスクリーニングを、実施例１の小節Ｆにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｇ．モノクローナル抗体特異性）
ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を、実施例１の小節Ｇにおいて上に記載した通りに決定した。
（Ｈ．細胞のアッセイ１）
細胞のアッセイＩを、実施例１の小節Ｊにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｉ．細胞のアッセイ２）
細胞のアッセイＩＩを、実施例１の小節Ｋにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｊ．１５Ｃ１ ＶＨ配列および１５Ｃ１ ＶＬ 配列）
１０７個のハイブリドーマ細胞を、回収し、そして１ｍｌ ＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する前にＰＢＳで１回洗浄した。次いで全ＲＮＡを、製造業者の指針に従って抽出した。ｍｕ１５Ｃ１クローン由来のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、製造業者の指針に従い、マウスＳｃＦｖモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって産生した。増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）にクローニングし、そしてＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。
次いで上記ＶＨ ｃＤＮＡおよびＶＬ ｃＤＮＡを、ｍｕ１５Ｃ１をキメラＭＡｂ（「キメラ１５Ｃ１」）として発現するために、それぞれ、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。組換えキメラＭＡｂを産生するために、ＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳを含む２ｍｌの培地においてウェル１つあたり２．５×１０５個の細胞の密度にて６ウェルプレートにプレートした。プレートした１６時間後、細胞を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、０．７５μｇの適切なベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、そして抗体を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
（実施例１６：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するＭＡｂの産生）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞によって免疫化したマウスを、特異的な血清力価についてモニタリングした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すマウスを、ＨＥＫ ２９３ ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体によって「過剰ブーストした」。このストラテジーは、非特異的なＣＨＯ細胞の抗原に対する応答を最小限にする一方で、同時にＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的応答を最大にするために選択された。Ｂ細胞／骨髄腫融合から生じるハイブリドーマ由来の上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、ｍｏｃｋトランスフェクトＣＨＯ細胞 対 ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった。特定のクローン由来のモノクローナル抗体（本明細書中でｍｕ１５Ｃ１と称される）は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に特異的に結合することを示した（図１４）。ｍｕ１６Ｇ７は、マウスＩｇアイソタイプ分析ＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳによって決定したところ、ＩｇＧ１κアイソタイプを有することが見出された。
（実施例１７：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるＬＰＳ活性の中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが公知である。ｍｕ１５Ｃ１のこのＩＬ−８誘導を阻害する能力を、細胞をＬＰＳ投与前に３０分間にわたって各抗体と一緒にプレインキュベートすることによって分析した。図１５は、ｍｕ１５Ｃ１がＨＥＫ ２９３細胞において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例１８：ヒト全血におけるＬＰＳ活性の中和）
ｍｕ１５Ｃ１の、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する能力を、試験した。ｍｕ１５Ｃ１による中和活性を、０．５〜５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体濃度の範囲を使用して、３人の異なるドナー由来の血液において試験した。図１６は、ｍｕ１５Ｃ１が、アイソタイプが一致するコントロールと比較して、３人全てのドナーにおいて、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−８のレベルを有意に減少させたことを示す。ｍｕ１５Ｃ１は、先に記載されるα−ＴＬＲ４遮断モノクローナル抗体（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売される）よりも強力であることが見出された。（Ｓｈｉｍａｚｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）を参照のこと）。いくつかの場合において、ｍｕ１５Ｃ１は、上記研究にも含まれたα−ＣＤ１４遮断モノクローナル抗体と同程度に強力であることが見出された。（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）を参照のこと）。これらの結果は、トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞上においてｍｕ１５Ｃ１によって認識される中和エピトープがまた、全血中の細胞の表面上に露出されること、およびｍｕ１５Ｃ１が、全血において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの活性を阻害するほど強力であることを示す。
（実施例１９：ｍｕ１５Ｃ１特異性）
上記ｍｕ１５Ｃ１モノクローナル抗体の特異性を決定するために、ｍｕ１５Ｃ１がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体（先にクローニングした）のウサギオルソログを認識しないという事実を、利用した。Ｎ末端のＦＬＡＧＴＭエピトープタグを有するウサギＴＬＲ４またはヒトＴＬＲ４のいずれか、ならびにＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグおよびプロテインＣエピトープタグを有するヒトＭＤ−２またはウサギＭＤ−２のいずれかについてのｃＤＮＡを、以下の組み合わせでＨＥＲ ２９３細胞にトランスフェクトした：（１）ｍｏｃｋベクター（２）ヒトＴＬＲ４単独（３）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（４）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；；（５）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（６）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図１７は、抗体染色後のこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、それは、ｍｕ１５Ｃ１が、ヒトＴＬＲ４を単独で発現する細胞、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞およびヒトＴＬＲ４とウサギＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞を認識したが、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞も、ウサギＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞も認識しなかったことを示した。これらの結果は、ｍｕ１５Ｃ１によって認識されるエピトープがヒトＴＬＲ４上に存在すること示す（図１７）。
（実施例２０：ｍｕ１５Ｃ１ ＶＨ配列およびｍｕ１５Ｃ１ ＶＬ配列）
ｍｕ１５Ｃ１ハイブリドーマクローン由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウスリーダー配列および定常ドメイン（ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８−８９（１９９１））に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析を、図１８Ａ〜図１８Ｆに示す。
ｍｕ１５Ｃ１抗体は、図１８Ａに示す配列番号２１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号２２、図１８Ｂ）、および図１８Ｄに示す配列番号２６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号２７、図１８Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるようなＣＤＲを含むアミノ酸を、図１８Ｂおよび図１８Ｅにおいて下線付きのイタリック体で強調し、そして図１８Ｃおよび図１８Ｆに示す。ｍｕ１５Ｃ１抗体の重鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＧＧＹＳＷＨ（配列番号２３）；ＹＩＨＹＳＧＹＴＤＦＮＰＳＬＫＴ（配列番号２４）；およびＫＤＰＳＤＧＦＰＹ（配列番号２５）。ｍｕ１５Ｃ１抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＲＡＳＱＳＩＳＤＨＬＨ（配列番号２８）；ＹＡＳＨＡＩＳ（配列番号２９）；およびＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号３０）。
（実施例２１：キメラ１５Ｃ１は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する、クローン１５Ｃ１ ＶＨおよびクローン１５Ｃ１ ＶＬの特異性を示すために、ＦＡＣＳ分析を、キメラ１５Ｃ１ ＭＡｂを使用して、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった（図１９）。示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合を、ＡＰＣで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用して検出した。不適切なアイソタイプが一致するヒトＩｇＧ１ ＭＡｂを、コントロールとして使用した。
（実施例２２：キメラ１５Ｃ１は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳに対するクローン１５Ｃ１ ＶＨおよびクローン１５Ｃ１ ＶＬの中和能を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞のＬＰＳ依存性のＩＬ−８誘導を阻害する１５Ｃ１の能力を、（上に記載するように）試験した。図２０は、キメラ１５Ｃ１が、上記１５Ｃ１ ＭＡｂと非常に類似した様式で、ＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例２３：ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体の産生のための材料および方法）
（Ａ．安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体の産生）
安定なＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体を、実施例９の小節Ａにおいて上に記載した通りに、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＥＫ ２９３細胞において産生した。
（Ｂ．組換えＭＤ−２およびキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２タンパク質の産生）
組換え可溶性ＭＤ−２を、実施例１５の小節Ｂにおいて上に記載した通りに産生した。
組換えＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質を産生するために、グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に結合したヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを使用して組み立てた。ＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを、検出目的および精製目的のために、ＭＤ−２のＣ末端に含めた。上記ｃＤＮＡカセットを、バキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させた。４８時間後、上記組換え融合タンパク質を、抗ＦＬＡＧＴＭＭ２ ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞溶解物から精製した。
（Ｃ．マウスの免疫化）
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を、実施例１の小節Ｃにおいて上に記載した通りに免疫化した。
（Ｄ．特異的な血清の滴定）
マウス血清の滴定を、実施例１の小節Ｄにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｅ．Ｂ細胞／骨髄腫融合体）
Ｂ細胞抽出および細胞融合を、実施例９の小節Ｄにおいて上に記載した通りに行い、そして分析した。
（Ｆ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマのスクリーニングを、実施例１の小節Ｆにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｇ．モノクローナル抗体特異性）
ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を、実施例１の小節Ｇにおいて上に記載した通りに決定した。
（Ｈ．細胞のアッセイ１）
モノクローナル抗体を、最初に、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用してハイブリドーマ細胞の上清から精製した。
細胞のアッセイＩを、実施例１の小節Ｊにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｉ．細胞のアッセイ２）
細胞のアッセイＩＩを、実施例１の小節Ｋにおいて上に記載した通りに行った。
（Ｊ．７Ｅ３ ＶＨ配列および７Ｅ３ ＶＬ 配列）
１０７個のハイブリドーマ細胞を、回収し、そして１ｍｌ ＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する前にＰＢＳで１回洗浄した。次いで全ＲＮＡを、製造業者の指針に従って抽出した。ｍｕ７Ｅ３クローン由来のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、マウスリーダー配列および定常ドメイン（ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８−８９（１９９１））に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって産生した。増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）にクローニングし、そしてＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。
次いで上記ＶＨ ｃＤＮＡおよびＶＬ ｃＤＮＡを、ｍｕ７Ｅ３をキメラＭＡｂ（「キメラ７Ｅ３」）として発現するために、それぞれ、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。組換えキメラＭＡｂを産生するために、ＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳを含む２ｍｌの培地においてウェル１つあたり２．５×１０５個の細胞の密度にて６ウェルプレートにプレートした。プレートした１６時間後、細胞を、製造業者の指針に従ってＦｕｇｅｎｅＴＭ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、０．７５μｇの適切なベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、そして抗体を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。
（実施例２４：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するＭＡｂの産生）
表面ＴＬＲ４／ＭＤ−２を発現するＣＨＯ細胞によって免疫化したマウスを、特異的な血清力価についてモニタリングした。ＴＬＲ４／ＭＤ−２に対する応答を示すマウスを、ＨＥＫ ２９３ ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクト体によって「過剰ブーストした」。このストラテジーは、非特異的なＣＨＯ細胞の抗原に対する応答を最小限にする一方で、同時にＴＬＲ４／ＭＤ−２特異的応答を最大にするために選択された。Ｂ細胞／骨髄腫融合から生じるハイブリドーマ由来の上清のＦＡＣＳによるスクリーニングを、ｍｏｃｋトランスフェクトＣＨＯ細胞 対 ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対して行なった。特定のクローン由来のモノクローナル抗体（本明細書中でｍｕ７Ｅ３と称される）は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に特異的に結合することを示した（図２１）。ｍｕ７Ｅ３は、マウスＩｇアイソタイプ分析ＣＢＡキット（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳによって決定したところ、ＩｇＧ１κアイソタイプを有することが見出された。
（実施例２５：ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞におけるＬＰＳ活性の中和）
ＬＰＳは、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞においてＩＬ−８産生を誘導する能力を有することが公知である。ｍｕ７Ｅ３のこのＩＬ−８誘導を阻害する能力を、細胞をＬＰＳ投与前に３０分間にわたって各抗体と一緒にプレインキュベートすることによって分析した。図２２は、ｍｕ７Ｅ３がＨＥＫ ２９３細胞において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例２６：ヒト全血におけるＬＰＳ活性の中和）
ｍｕ７Ｅ３の、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する能力を、試験した。ｍｕ７Ｅ３による中和活性を、０．５〜５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体濃度の範囲を使用して、３人の異なるドナー由来の血液において試験した。図２３は、ｍｕ７Ｅ３が、アイソタイプが一致するコントロールと比較して、３人全てのドナーにおいて、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−８のレベルを有意に減少させたことを示す。ｍｕ７Ｅ３は、先に記載されるα−ＴＬＲ４遮断モノクローナル抗体（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売される）よりも強力であることが見出された。（Ｓｈｉｍａｚｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１７７７−１７８２（１９９９）を参照のこと）。いくつかの場合において、ｍｕ７Ｅ３は、上記研究にも含まれたα−ＣＤ１４遮断モノクローナル抗体と同程度に強力であることが見出された。（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８１８−２４８２３（１９９３）を参照のこと）。これらの結果は、トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞上においてｍｕ７Ｅ３によって認識される中和エピトープがまた、全血中の細胞の表面上に露出されること、およびｍｕ７Ｅ３が、全血において１μｇ／ｍｌを下回る濃度でさえＬＰＳの活性を阻害するほど強力であることを示す。
（実施例２７：ｍｕ７Ｅ３特異性）
上記ｍｕ７Ｅ３モノクローナル抗体の特異性を決定するために、ｍｕ７Ｅ３がＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体（先にクローニングした）のウサギオルソログを認識しないという事実を、利用した。Ｎ末端のＦＬＡＧＴＭエピトープタグを有するウサギＴＬＲ４またはヒトＴＬＲ４のいずれか、ならびにＣ末端のｃ−ＭｙｃエピトープタグおよびプロテインＣエピトープタグを有するヒトＭＤ−２またはウサギＭＤ−２のいずれかについてのｃＤＮＡを、以下の組み合わせでＨＥＲ ２９３細胞にトランスフェクトした：（１）ｍｏｃｋベクター（２）ヒトＴＬＲ４単独（３）ヒトＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２（４）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；；（５）ヒトＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２；（６）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。図２４は、抗体染色後のこれらの細胞のＦＡＣＳ分析を示し、それは、ｍｕ７Ｅ３が、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞およびヒトＴＬＲ４とウサギＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞を認識したが、ウサギＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現する細胞も、ウサギＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合わせを発現する細胞も認識しなかったことを示した。これらの結果は、ｍｕ７Ｅ３によって認識されるエピトープは、ヒトＴＬＲ４に存在するが、ＭＤ−２の存在が、ＭＡｂ結合に必須であること示す（図２４）。
（実施例２８：ｍｕ７Ｅ３ ＶＨ配列およびｍｕ７Ｅ３ ＶＬ配列）
ｍｕ７Ｅ３ハイブリドーマクローン由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによって全ＲＮＡから増幅した。配列分析を、図２５Ａ〜図２５Ｆに示す。
ｍｕ７Ｅ３抗体は、図２５Ａに示す配列番号３１の核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号３２、図２５Ｂ）、および図２５Ｄに示す配列番号３６の核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号３７、図２５Ｅ）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるようなＣＤＲを含むアミノ酸を、図２５Ｂおよび図２５Ｅにおいて下線付きのイタリック体で強調し、そして図２５Ｃおよび図２５Ｆに示す。ｍｕ７Ｅ３抗体の重鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＴＹＮＩＧＶＧ（配列番号３３）；ＨＩＷＷＮＤＮＩＹＹＮＴＶＬＫＳ（配列番号３４）；およびＭＡＥＧＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号３５）。ｍｕ７Ｅ３抗体の軽鎖ＣＤＲは、以下の配列を有する：ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号３８）；ＹＴＳＫＬＨＳ（配列番号３９）；およびＱＱＧＮＴＦＰＷＴ（配列番号４０）。
（実施例２９：キメラ７Ｅ３は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＣＨＯ細胞に結合する）
ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対する、クローン７Ｅ３ ＶＨおよびクローン７Ｅ３ ＶＬの特異性を示すために、キメラ７Ｅ３ ＭＡｂを使用したｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＦＡＣＳ分析を、行なった（図２６）。示された濃度におけるＭＡｂの特異的結合を、ＡＰＣで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を使用して検出した。不適切なアイソタイプが一致するヒトＩｇＧ１ ＭＡｂを、コントロールとして使用した。
（実施例３０：キメラ７Ｅ３は、ｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生を阻害する）
ＬＰＳに対するクローン７Ｅ３ ＶＨおよびクローン７Ｅ３ ＶＬの中和能を示すために、ｈＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞のＬＰＳ依存性のＩＬ−８誘導を阻害する７Ｅ３の能力を、上に記載するように試験した。図２７は、キメラ７Ｅ３が、ＨＥＫ ２９３細胞においてＬＰＳの効果を阻害したことを示す。
（実施例３１：ＴＬＲ４／ＭＤ−２融合タンパク質ｃＤＮＡの構築およびｐＦＡＳＴＢＡＣ１へのクローニング）
グリシンセリン（ＧＧＧＧＳ３）リンカーを介してＭＤ−２に結合したヒトＴＬＲ４の細胞外部分をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを使用して組み立てた。ＦＬＡＧタグおよび６×ＨＩＳタグを、検出目的および精製目的のために、ＭＤ−２のＣ末端に含めた（図２８）。
図２８Ａ〜図２８Ｃは、本発明に従うこのＴＬＲ４／ＭＤ−２融合タンパク質ｃＤＮＡの構築を示す。ヒトＴＬＲ４の細胞外部分（ｓＴＬＲ４）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、そして特有のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を、５’非アニーリングプライマー伸長に導入した。（ＧＧＧＧＳ）３コード配列および特有のＸｈｏＩ部位を、センスプライマーの５’非アニーリング伸長に導入し、そして特有のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、アンチセンスプライマーの５’非アニーリング伸長に導入した。（パネルＡ）。パネルＢは、増幅したｓＴＬＲ４および（ＧＧＧＧＳ）３ ｃＤＮＡ／ＭＤ−２ ｃＤＮＡの、上記特有のＸｂａＩ制限酵素認識部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位との間におけるｐＦＡＳＴＢＡＣ１への連続的なクローニングを示す。パネルＣは、Ｓｆ９細胞におけるｓＴＬＲ４／ＭＤ−２ ｃＤＮＡの発現後の企図されるタンパク質産物を示す。
（実施例３２：ＳＦ９細胞の溶解物および上清におけるＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の発現）
実施例１のｃＤＮＡカセットを、バキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで相同組換えによってバクミドＤＮＡに挿入した。ウイルスストックの産生後、Ｓｆ９細胞を、重感染させ、そしてＴＬＲ４／ＭＤ−２融合タンパク質の発現を、細胞溶解物において、感染の４８時間後および７２時間後にウェスタンブロッティングによって分析した（図２９）。
図２９は、Ｓｆ９細胞の溶解物および上清における本発明のＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の発現を示す。Ｓｆ９細胞の溶解物および上清におけるタンパク質発現を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を使用したウェスタンブロッティングによって検出した：レーン１は、感染の４８時間後における除去処理した溶解物を示し；レーン２は、感染の７２時間後における除去処理した溶解物を示し；レーン３は、感染の４８時間後における除去処理した上清を示し；レーン４は、感染の７２時間後における除去処理した上清を示し；そしてレーン５は、参照タンパク質（ＦＬＡＧタグ化）を含む。図２９における分子量マーカーの大きさは、ＫＤａで示される。ＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の予想される分子量は、約９０ＫＤａであり、そして蓋然的な分解産物の出現は、約２８ＫＤａにて見出される。
（実施例３３：感染ＳＦ９細胞の溶解物からのＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の精製）
上記融合タンパク質を精製するために、Ｓｆ９細胞を、重感染の４８時間後に回収し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む１％ ＮＰ４０に、細胞１グラムあたり５容量の濃度にて溶解した。４℃における１５時間（１５’）のインキュベーション後、溶解物を、遠心分離（４０００ｒｐｍ）および濾過（０．２２μｍ）によって除去処理し、そして抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＭＡｂアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ）に通した。結合しなかったタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣＩを用いた連続的な洗浄によってそのマトリックスから除去した。結合したタンパク質を、１００ｍＭ グリシン（ｐＨ２．７５）を用いてカラムから溶出させ、そして０．５ｍｌ分画で収集した。分画を、迅速に、５０μ１の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）の添加によって中性ｐＨにした。タンパク質含量を、ウェスタンブロッティング（ペルオキシダーゼ結合体化抗ＦＬＡＧ Ｍ２を用いた）およびクマーシーブリリアントブルー染色によって分析した（図３０）。
図３０は、感染Ｓｆ９細胞の溶解物中の精製されたＴＬＲ４／ＭＤ−２キメラタンパク質の存在を示す。上記細胞溶解物中のタンパク質を、クマーシーブリリアントブルー染色（図３０、左のパネル）、または抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を使用したウェスタンブロッティング（図３０、右のパネル）によって検出した。レーン１〜５は、上記抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーカラムから溶出した０．５ｍｌ分画を示す。
（実施例３４：ＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生の、キメラ可溶性ＴＬＲ４／ＭＤ−２を使用した阻害）
リポ多糖類（ＬＰＳ）（１５ｎｇ／ｍｌ）を、変動する濃度にて、本発明に従う精製したキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２と一緒にプレインキュベートし、次いでＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞と一緒にインキュベートした。図３１は、処理の２４時間後の細胞培養培地中のＩＬ−８産生を示すグラフである。
図３１において見られる通り、精製したキメラＴＬＲ４／ＭＤ−２は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−８産生に対して抑制性の効果を有することが示され、それによって本発明の精製したＴＬＲ４／ＭＤ−２タンパク質は少なくとも部分的に正しいコンホメーションであったことが、示される。
（実施例３５：１８Ｈ１０抗体、１５Ｃ１抗体、および７Ｅ３抗体のヒト化）
（ＣＤＲグラフト可変領域の設計および構築）
ｍｕ１５Ｃ１抗体、ｍｕ１８Ｈ１０抗体およびｍｕ７Ｅ３抗体を、ＣＤＲグラフト化（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、１９８６；Ｖｅｒｈｏｆｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１６３４−１５３６、１９８８）によってヒト化した「ＣＤＲグラフト化」は、非ヒト（すなわち、マウス）結合領域を含むアミノ酸がヒト抗体可変領域のフレームワークに組み込まれるように、可変領域を再設計することを包含する。ヒト化プロセスを達成するために、ヒトフレームワークの選択および移植されるマウス可変領域配列の範囲が、決定される。
ヒト化プロセスのためのヒトフレームワークを、ヒト抗体レパートリーを作製するために使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子に関する全ての公開された配列から選択した（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース、ＩＭＧＴ（オンラインで利用可能）を参照のこと）。ｍｕ１５Ｃ１に関して、各Ｖ遺伝子に対して２つの候補を、選択した（すなわち、重鎖に対してＩＧＨＶ３−６６（ＤＰ−８６としても公知である）およびＩＧＨＶ４−２８（ＤＰ−４８としても公知である）ならびにκ軽鎖に対してＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６としても公知である）およびＩＧＫＶ６−２１（Ａ２６としても公知である））。ｍｕ７Ｅ３に関して、その重鎖に対して２つの候補を、選択し（すなわち、ＩＧＨＶ３−６６（すなわち、ＤＰ−８６）およびＩＧＨＶ２−７０（ＤＰ−２７としても公知である））、そしてκ軽鎖に対して１つの候補を、選択した（ＩＧＫＶ１−１２（Ｌ１９としても公知である））。ｍｕ１８Ｈ１０に関して、各Ｖ遺伝子に対して１つの候補を、選択した：重鎖に対してＩＧＨＶ１−６９（ＤＰ−１０としても公知である）および軽鎖に対してＩＧＫＶ３−１１（すなわち、Ｌ６））。
移植されるべきマウス配列の範囲を、以下の通りに決定する。第１に、上記抗原結合表面を、β−バレルフレームワークから伸びた一連のループ（ＣＤＲとして公知である、Ｖ遺伝子あたり３個）上に優先的に配置する。全ての場合において、移植のために選択した残基は、Ｋａｂａｔ（超可変領域；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ））およびＣｈｏｔｈｉａ（構造ループ；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７−８８３、１９８９）によって定義されるようなＣＤＲの広い定義に対応した。さらに、上記構造ループまたは超可変領域において同定されなかった残基は、結合部位のトポロジーに影響を及ぼすか、個々の可変ドメインの安定な詰め込み（ｐａｃｋｉｎｇ）を誘導するか、もしくは可変ドメイン間の相互作用を安定化することによって、直接的または間接的に抗原結合に寄与し得る。このような残基を、配列アライメント分析を行い、そして「特異な（ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ）」残基に注目し、次いでそれらの構造位置および可能な効果を試験することによって同定した。
一旦関連する配列の選択を行うと、ヒト化可変領域ＤＮＡを、任意の以下の手順を使用して産生した：適切な重複するオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子合成（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６，９７１−９８０、１９９３によって例示される）、または存在するＤＮＡ配列の同時的または連続的な部位特異的ＰＣＲ変異誘発の使用（Ｋａｍｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７、５４０４）。例えば、新規のＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーを、完全ヒト可変領域またはそれに基づいて設計したヒト化可変領域、あるいは非常に類似するヒト可変領域（Ｓａｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３、８５１−８５６ １９９３によって例示される）であるＤＮＡテンプレートにハイブリダイズさせた。ヒト化Ｖ遺伝子の設計における数種の少数の改変体を、最初にＳｔｒａｔａｇｅｎｅによって記載されたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発技術を使用して得た。
ヒト化可変領域を加えた軽鎖リーダー配列および重鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、そして配列決定した後、そのリーダー−可変領域を、哺乳動物細胞における発現のために、ヒト軽鎖発現カセットまたは重鎖発現カセットを含むベクターにサブクローニングすることによって、ヒト化完全ＩｇＧ遺伝子に変換した。
（１５Ｃ１抗体のヒト化バージョン）
本発明のｈｕ１５Ｃ１抗体は、配列番号４５において下に示す可変重鎖（ＶＨ）４−２８または配列番号４６において下に示すＶＨ ３−６６を含む。本発明のｈｕ１５Ｃ１抗体は、配列番号４７において下に示す可変軽鎖（ＶＬ）Ｌ６または配列番号４８において下に示すＡ２６を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸を、下に提供する配列において枠で囲む。（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照のこと）。
表１および表２は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＨ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを提供する。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔの番号付け）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＩＭＧＴの番号付け）は、１５Ｃ１ ＶＨに対する、ＩＭＧＴ特有のＬｅｆｒａｎｃの番号付けを与え；第４欄（マウス１５Ｃ１ ＶＨ）は、ＣＤＲグラフト化のためにドナー配列として使用されるマウス１５Ｃ１抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列ＩＧＨＶ４−２８）は、ＣＤＲグラフト化のためにアクセプター配列として使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖可変４−２８のアミノ酸配列を与え；そして第６欄（再形成バージョン１ １５Ｃ１ ＶＨ）は、１５Ｃ１ ＶＨ領域のヒト化バージョンのアミノ酸配列を与える。フレームワークセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の位置および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置は、１つのカラムに示される。
表１において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、ヒト化バージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔの番号付け）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＩＭＧＴの番号付け）は、１５Ｃ１ ＶＨに対する、ＩＭＧＴ特有のＬｅｆｒａｎｃの番号付けを与え；第４欄（マウス１５Ｃ１ ＶＨ）は、ＣＤＲグラフト化のためにドナー配列として使用されるマウス１５Ｃ１抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−６６）は、ＣＤＲグラフト化のためにアクセプター配列として使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖可変３−６６のアミノ酸配列を与え；そして第６欄（ヒト化バージョン３−６６）は、１５Ｃ１ ＶＨ領域のヒト化バージョンのアミノ酸配列を与える。フレームワークセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の位置および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置は、１つのカラムに示される。
表２において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、ヒト化バージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
表３および表４は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＬ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを提供する。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔ）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（＃）は、通常の配列における残基番号を与え；第３欄（ＦＲまたはＣＤＲ）は、フレームワークセグメント（ＦＲＩ、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を同定するのに好都合であり、その３個のＣＤＲは、４個のＦＲを分離する；第４欄（マウス１５Ｃ１軽鎖）は、マウス１５Ｃ１抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（Ｈｕｍａｎ ＧｅｒｍｌｉｎｅＡ２６ ＩＧＫＶ６−２１）は、ヒト生殖系列κ軽鎖Ａ２６（すなわち、ＩＧＫＶ６−２１）のアミノ酸配列を与え；第６欄（ヒト化１５Ｃ１ ＶＬ Ａ２６）は、１５Ｃ１ ＶＬ
Ａ２６のヒト化バージョンのアミノ酸配列を与える。
表３において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔ）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（＃）は、通常の配列における残基番号を与え；第３欄（ＦＲまたはＣＤＲ）は、フレームワークセグメント（ＦＲＩ、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を同定するのに好都合であり、その３個のＣＤＲは、４個のＦＲを分離する；第４欄（マウス１５Ｃ１軽鎖）は、マウス１５Ｃ１抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列Ｌ６（すなわちＩＧＫＶ３−１１））は、ヒト生殖系列κ軽鎖Ｌ６（すなわち、ＩＧＫＶ３−１１）のアミノ酸配列を与え；第６欄（ヒト化１５Ｃ１ ＶＬ Ｌ６）は、ヒト化１５Ｃ１のアミノ酸配列を与える。
表４において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。
（１８Ｈ１０抗体のヒト化バージョン）
本発明のｈｕ１８Ｈ１０抗体は、配列番号４９において下に示すＶＨ １−６９を含む。本発明のｈｕ１８Ｈ１０抗体は、配列番号５０において下に示すＶＬ Ｌ６を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸を、下に提供する配列において枠で囲む。（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照のこと）。
表５は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＨ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを提供する。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔの番号付け）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＩＭＧＴの番号付け）は、１５Ｃ１ ＶＨに対する、ＩＭＧＴ特有のＬｅｆｒａｎｃの番号付けを与える。第４欄（マウス１５Ｃ１ ＶＨ）は、ＣＤＲグラフト化のためにドナー配列として使用されるマウス１５Ｃ１抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列ＩＧＨＶ １−６９）は、ＣＤＲグラフト化のためにアクセプター配列として使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖可変１−６９（ＩＭＧＴの呼称単位）のアミノ酸配列を与える。第６欄（ヒト化１８Ｈ１０ ＶＨ
１−６９）は、１８Ｈ１０重鎖のヒト化バージョンのアミノ酸配列を与える。フレームワークセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の位置および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置は、１つのカラムに示される。
表５において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、ヒト化バージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
表６は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＬ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを提供する。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔ）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（＃）は、通常の配列における残基番号を与え；第３欄（ＦＲまたはＣＤＲ）は、フレームワークセグメント（ＦＲＩ、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を同定するのに好都合であり、その３個のＣＤＲは、４個のＦＲを分離する；第４欄（マウス１８Ｈ１０軽鎖）は、マウス１８Ｈ１０抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列Ｌ６（すなわちＩＧＫＶ３−１１））は、ヒト生殖系列κ軽鎖Ｌ６（すなわち、ＩＧＫＶ３）のアミノ酸配列を与え；第６欄（ヒト化１８Ｈ１０ ＶＬ Ｌ６）は、ヒト化１８Ｈ１０軽鎖のアミノ酸配列を与える。
表６において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、ヒト化バージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
（７Ｅ３抗体のヒト化バージョン）
本発明のｈｕ７Ｅ３抗体は、配列番号５１において下に示すＶＨ ２−７０または配列番号５２において下に示すＶＨ ３−６６を含む。本発明のｈｕ７Ｅ３抗体は、配列番号５３において下に示すＶＬ Ｌ１９を含む。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸を、下に提供する配列において枠で囲む。（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照のこと）。
表７および表８は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＨ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを提供する。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔの番号付け）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＩＭＧＴの番号付け）は、ＩＭＧＴ特有のＬｅｆｒａｎｃの番号付けを与える。第４欄（マウス７Ｅ３ ＶＨ）は、ＣＤＲグラフト化のためにドナー配列として使用されるマウス７Ｅ３抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−６６）は、ＣＤＲグラフト化のためにアクセプター配列として使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖可変２−２６のアミノ酸配列を与える。第６欄（再形成バージョン３−６６ ７Ｅ３ ＶＨ）は、再形成したヒト７Ｅ３ ＶＨ領域のアミノ酸配列を与える。ヒト化バージョンにおいて保たれるマウスアミノ酸残基は、黄色である。
フレームワークセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の位置および相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置は、１つのカラムに示される。（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、再形成したヒトバージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔの番号付け）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＩＭＧＴの番号付け）は、ＩＭＧＴ特有のＬｅｆｒａｎｃの番号付けを与える。第４欄（マウス７Ｅ３ ＶＨ）は、ＣＤＲグラフト化のためにドナー配列として使用されるマウス７Ｅ３抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列ＩＧＨＶ２−７０）は、ＣＤＲグラフト化のためにアクセプター配列として使用されるヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖可変２−７０のアミノ酸配列を与える。第６欄（ヒト化バージョン２−７０ ７Ｅ３ ＶＨ）は、７Ｅ３ ＶＨ領域のヒト化バージョンのアミノ酸配列を与える。ヒト化バージョンにおいて保たれるマウスアミノ酸残基は、黄色である。
フレームワークセグメント（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）の位置および相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の位置は、１つのカラムに示される。（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、再形成したヒトバージョンにおいて変換されたヒト残基を表す。
表９は、ヒト化１５Ｃ１ ＶＬ領域を設計するために使用されたアミノ酸配列のアライメントを示す。
説明文：第１欄（Ｋａｂａｔ）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に従う残基番号を与え；第２欄（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）は、Ｃｈｏｔｈｉａに従う残基番号を与え；第３欄（ＦＲまたはＣＤＲ）は、フレームワークセグメント（ＦＲＩ、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）および相補性決定セグメント（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を同定するのに好都合であり、その３個のＣＤＲは、４個のＦＲを分離する；第４欄（マウス７Ｅ３軽鎖）は、マウス７Ｅ３抗ＴＬＲ４ ＭＤ２抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列を与え；第５欄（ヒト生殖系列Ｌ１９ ＩＧＫＶ１−１２ ＩＧＫＶ１Ｄ−１２）は、ヒト生殖系列κ軽鎖Ｌ１９ ＩＧＫＶ１−１２ ＩＧＫＶ１Ｄ−１２のアミノ酸配列を与え；第６欄（再形成ヒト７Ｅ３）は、ヒト化７Ｅ３軽鎖のアミノ酸配列を与える。
表９において使用される場合、（＊）は、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）によって定義されるようなＣＤＲループの主要な正規化構造の部分を示す。下線を伴わない太字の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいてヒトアミノ酸残基およびマウスアミノ酸残基が同一である位置を表す。イタリック体の記入事項は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置を表す。下線付きの記入事項（太字であっても太字でなくても）は、ＦＲおよびＣＤＲにおいて、ヒトアミノ酸残基が、対応するマウス残基によって置換された位置を表す。枠で囲まれた記入事項は、ヒト生殖系列遺伝子の残基を表す。
（実施例３６：ｈｕ１８Ｈ１０は、ＣＨＯ細胞上に発現したｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２を結合する）
ｈｕ１８Ｈ１０ヒト化モノクローナル抗体の、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合する能力を示すために、（上に示すような）フローサイトメトリー実験を、キメラ１８Ｈ１０をポジティブコントロールとして使用して行なった。図３９は、ｈｕ１８Ｈ１０が、上に記載した１８Ｈ１０キメラ抗体と非常に類似した様式でＴＬＲ４／ＭＤ−２を結合したことを示す。
（実施例３７：ｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞上に発現したｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２を結合する）
ｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体の、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合する能力を示すために、（上に示すような）フローサイトメトリー実験を、キメラ７Ｅ３をポジティブコントロールとして使用して行なった。試験したｈｕ７Ｅ３抗体は、配列番号５１に示すＶＨ ２−７０および配列番号５３に示すＶＬ Ｌ１９を含むｈｕ７Ｅ３抗体（「７Ｅ３ ２−７０／Ｌｌ９」）、ならびに配列番号５２に示すＶＨ ３−６６および配列番号５３に示すＶＬ Ｌ１９を含むｈｕ７Ｅ３抗体（「７Ｅ３ ３−６６／Ｌ１９」）を含んだ。図４０は、ｈｕ７Ｅ３ ＭＡｂが、上に記載した７Ｅ３キメラ抗体と非常に類似した様式でＴＬＲ４／ＭＤ−２を結合したことを示す。
（実施例３８：ｈｕ１５Ｃ１ヒト化モノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞上に発現したｈＴＬＲ４ ｈＭＤ２を結合する）
ｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体の、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に結合する能力を示すために、（上に示すような）フローサイトメトリー実験を、キメラ１５Ｃ１をポジティブコントロールとして使用して行なった。試験したｈｕ１５Ｃ１抗体は、配列番号４５に示すＶＨ ４−２８および配列番号４８に示すＶＬ Ａ２６を含むｈｕ１５Ｃ１抗体（「１５Ｃ１４−２８／Ａ２６」）ならびにその改変体（特定の位置（ＱＣ ＃＃、Ｋａｂａｔの番号付け）における残基が所与のヒト生殖系列における対応するアミノ酸によって置換されている）（「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ３０／Ａ２６」；「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ４８／Ａ２６」；「１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ６７／Ａ２６」および１５Ｃ１ ４−２８ ＱＣ ６９／Ａ２６」（表１を参照のこと））を含んだ。試験した他のｈｕ１５Ｃ１抗体は、配列番号４６に示すＶＨ ３−６６および配列番号４７に示すＶＬ Ｌ６を含むｈｕ１５Ｃ１抗体（「１５Ｃ１ ３−６６／Ｌ６」）ならびに配列番号４６に示すＶＨ ３−６６および配列番号４８に示すＶＬ Ａ２６を含むｈｕ１５Ｃ１抗体（「１５Ｃ１ ３−６６／Ｌ６」）を含む。図４１および図４２は、ｈｕ１５Ｃ１抗体ＭＡｂが、上に記載した１５Ｃ１キメラ抗体と非常に類似した様式でＴＬＲ４／ＭＤ−２を結合したことを示す。
（実施例３９：ＴＬＲ４およびＭＤ２のエピトープマッピング研究）
ｈｕ１５Ｃ１、ｈｕ７Ｅ３およびｈｕ１８Ｈ１０は、ヒトＴＬＲ４／ＮＩＤ−２レセプター複合体に対する特異性を示す３種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。このレセプター複合体は、リポ多糖類（ＬＰＳ）（グラム陰性菌の外膜の主要な成分）によって活性化される。３種全てのＭＡｂは、ＬＰＳを介する、レセプター活性化およびその後の細胞内シグナリングを阻害し得るが、興味深いことに、３種全ては、異なる特異性を有する。ｈｕ１５Ｃ１は、ＭＤ−２の存在とは独立してＴＬＲ４に結合する。ｈｕ７Ｅ３は、ＴＬＲ４に結合するが、その結合は、ＭＤ−２の存在によって大きく増強され、このことは、後者の存在が、ｈｕ７Ｅ３によって結合されるエピトープを露出するＴＬＲ４のコンホメーションの変化を引き起こすことを示唆する。ｈｕ１８Ｈ１０は、ＭＤ−２に結合するが、ＴＬＲ４の存在を必要とする。なぜならそのＭＡｂは、ＭＤ−２の可溶性形態を結合しないからである。
この研究の目的は、ｈｕ１５Ｃ１、ｈｕ７Ｅ３およびｈｕ１８Ｈ１０の結合に重要なＴＬＲ４配列ならびにＭＤ−２配列の両方の小さい領域および個々のアミノ酸を同定することであった。ヒトＴＬＲ４のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０００２０６）を、図４３に示す。ヒトＭＤ２のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９Ｙ６Ｙ９）を、図３３Ｂに示す。
ｈｕ１５Ｃ１ ＭＡｂ、ｈｕ７Ｅ３ ＭＡｂおよびｈｕ１８Ｈ１０ ＭＡｂは、いずれもマウスＴＬＲ４／ＭＤ−２レセプター複合体に対して交差反応性を示さないので、ヒトＴＬＲ４タンパク質のセグメントおよびヒトＭＤ−２タンパク質を等価なマウスセグメントによって置換したマウス−ヒトハイブリッドを利用するストラテジーを、それらのＭＡｂの結合に必須であるヒトＴＬＲ４の規定された直線領域およびヒトＭＤ−２の規定された直線領域を同定するために使用した。さらに、これらの領域を、これらのＭＡｂの結合に必須である個々のアミノ酸を同定するために、ヒト配列とマウス配列との間で異なるアミノ酸残基において変異させた。
（マウス−ヒトハイブリッドＴＬＲ４変異体の産生）
マウス−ヒト−ヒト−ヒト（ＭＨＨＨ）を産生するために、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングしたヒトＴＬＲ４を、以下のオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発により、新規のＨｐａＩ部位を導入し、そして既存のＨｐａＩ部位を破壊することによって改変した：５’ＧＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧ３’（配列番号５５）；５’ＣＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＣ３’（配列番号５６）（新規のＨｐａＩ部位の導入）および５’ＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＣＡＧ３’（配列番号５７）；５’ＣＴＧＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＴＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣ３’（配列番号５８）（既存のＨｐａＩ部位の破壊）。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ったＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行なった。マウスＴＬＲ４のＮ末端領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＴＣ３’（配列番号５９）および５’ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＡＧ３’（配列番号６０）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＮｏｔＩ制限酵素認識部位およびＨｐａＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＨｐａＩ変異型ヒトＴＬＲ４ベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＨＨＨＭを産生するために、マウスＴＬＲ４のＣ末端領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＧＡＣ３’（配列番号６１）および５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＧＧＴＡＧ３’（配列番号６２）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＥｃｏＲＶ制限酵素認識部位およびＸｈｏＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ヒトＴＬＲ４ベクター中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＭＭＨＨを産生するために、上記ＭＨＨＨ構築物を、特有のＡｇｅＩ制限酵素認識部位を上記ＴＬＲ４配列に導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発（上記のような）によって改変した：５’ＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴ３’（配列番号６３）および５’ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣ３’（配列番号６４）。平行して、マウスＴＬＲ４の内部領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＴＴＡＡＣ３’（配列番号６５）および５’ＡＴＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＧ３’（配列番号６６）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＨｐａＩ制限酵素認識部位およびＡｇｅＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｇｅＩ変異型ＭＨＨＨベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
マウス−ヒト−マウス−ヒト（ＭＨＭＨ）ハイブリッドを産生するために、マウスＴＬＲ４の内部領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＡＴＧＣＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＧ３’（配列番号６７）および５’ＡＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧ３’（配列番号６８）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＡｇｅＩ制限酵素認識部位およびＥｃｏＲＶ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｇｅＩ変異型ＭＨＨＨベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＭＭＨＨａを産生するために、ヒトＴＬＲ４の内部領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＧＧＧＴＡＡＡＡＧ３’（配列番号６９）および５’ＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣ３’（配列番号７０）。このＤＮＡフラグメントを特有のＨｐａＩ制限酵素認識部位およびＡｇｅＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｇｅＩ変異型ＭＨＨＨベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＭＭＨＨｂを産生するために、ヒトＴＬＲ４の内部領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣ３’（配列番号７１）および５’ＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧ３’（配列番号７２）。このＤＮＡフラグメントを特有のＨｐａＩ制限酵素認識部位およびＡｇｅＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｇｅＩ変異型ＭＨＨＨベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
（マウス−ヒトハイブリッドＭＤ−２変異体の産生）
第１に、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたヒトＭＤ−２を、新規のＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発（上記のような）によって改変した：５’ＣＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＡ３’（配列番号７３）および５’ＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧ３’（配列番号７４）。
ＭＨＨを産生するために、マウスＭＤ−２のＮ末端領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣ３’および５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣ３’（配列番号７５）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｆｌＩＩ変異型ヒトＭＤ−２ベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＨＭＨを産生するために、マウスＭＤ−２の内部領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧ３’（配列番号７６）および５’ＧＧＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＣ３’（配列番号７７）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＢａｍＨＩ制限酵素認識部位およびＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｆｌＩＩ変異型ヒトＭＤ−２ベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
ＨＨＭ、マウスＭＤ−２のＣ末端領域を、以下のオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって増幅した：５’ＧＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴＣ３’（配列番号７８）および５’ＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣ３’（配列番号７９）。このマウスＤＮＡフラグメントを特有のＡｆｌＩＩ制限酵素認識部位およびＮｈｅＩ制限酵素認識部位にてクローニングすることによって、ＡｆｌＩＩ変異型ヒトＭＤ−２ベクター（上記）中の対応するヒトＤＮＡフラグメントを置換した。
（ヒトＴＬＲ４アラニン取り込み（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）変異体およびヒトＭＤ−２アラニン取り込み変異体の産生）
全ての変異体を、上記のようなＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した部位特異的変異誘発によって産生した。適切なミスマッチ変異を収容するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ｐＣＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ中のヒトＴＬＲ４または適切な場合にｐＣＤＮＡ３．１（−）中のヒトＭＤ−２のいずれかと一緒に使用した。所望の変異の導入を、ＤＮＡ配列決定によって確かめた。
（ＨＥＫ ２９３細胞の一過性のトランスフェクション）
エピソームプラスミドの複製を可能にするためにラージＴ抗原およびＥＢＮＡ抗原の両方を発現するＨＥＫ ２９３細胞を、２４ウェル培養プレートにおいて、ウェル１つあたり１×１０５個の細胞にて１ｍｌの培地中にプレートした。翌日、細胞を、製造業者の指針に従ってウェル１つあたり１．５μｌのＦｕｇｅｎｅ６ＴＭトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ウェル１つあたり１μｇのＤＮＡ（同時トランスフェクションのための各プラスミドからなる０．５μｇ＋０．５μｇ）を用いてトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後〜７２時間後に分析した。
（フローサイトメトリー）
ＴＬＲ４／ＭＤ−２トランスフェクトＨＥＫ ２９３細胞の表面に対するＭＡｂの結合を、フローサイトメトリーによって測定した。１×１０５個の細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ３）中の５０〜１００μｌの容量で１０μｇ／ｍｌの最終濃度にて、９６ウェルＶ底プレート中で適切なＭＡｂと一緒にインキュベートした。４℃におけるインキュベーションの３０分後、細胞を、ペレットにし、２００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、再度ペレットにし、そしてＦＡＣＳ緩衝液中で、１：２５０希釈のアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に再懸濁した。４℃におけるインキュベーションの３０分後、細胞を、２００μ１ ＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド、１×ＰＢＳ中に固定し、そしてＦＬ−４チャネルにおいてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用して蛍光について分析した。
（ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３は、ＴＬＲ４の８７アミノ酸の内部領域に結合する）
ＴＬＲ４の４種のマウス−ヒトハイブリッド変異体を、ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３に対する結合を担う、ＴＬＲ４の正確な領域を決定するために産生した。ＨＥＫ ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、ＭＤ−２と一緒になった野生型（ｗｔ）ＴＬＲ４またはＴＬＲ４の変異形態のいずれかの、細胞表面における提示を可能にした。ＦＡＣＳ分析（図３４ａおよび図３４ｂ）は、上記複合体が上記４つの場合のうちの３つにおいて正しく発現したことを示した（ｃ−ｍｙｃ染色およびＦＬＡＧ染色によって示される場合）。ＴＬＲ４変異体バージョンＭＨＭＨは、細胞表面上の発現が乏しく、そしてＭＤ−２との相互作用を補助せず、このことは、そのタンパク質が正しいコンホメーションではなかったことを示唆する。この観察は、ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３による結合の結果が考慮されない可能性があることを示した。バージョンＭＨＨＨおよびバージョンＨＨＨＭが、両方とも、１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３を良好に結合した一方で、ＭＭＨＨは、両方の抗体の結合についてネガティブであり、このことは、ＴＬＲ４の８７アミノ酸の内部領域（図３４ａにおいて強調される）が、ＴＬＲ４と、ｈｕ１５Ｃ１またはｈｕ７Ｅ３との間の相互作用に必須であることを示唆する。
ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合に重要な残基をより詳細に決定するために、この内部領域の最初の３０アミノ酸（ＭＭＨＨａ）またはこの内部領域の最後の３２アミノ酸（ＭＭＨＨｂ）のいずれかを対応するマウス配列によって置換した２種のさらなる変異体を、産生した（図３５ａ）。トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞のＦＡＣＳ分析（図３５ａおよび図３５ｂ）は、上記複合体を両方の場合において正しく発現したことを示した（ｃ−ｍｙｃ染色およびＦＬＡＧ染色によって示される場合）。ｈｕ１５Ｃ１は、ＭＭＨＨａに良好に結合したが、ＭＭＨＨｂに対する結合を示さず、このことは、この内部領域のＣ末端側に存在する残基がその結合に重要であることを示唆する。対照的に、ｈｕ７Ｅ３は、ＭＭＨＨｂに良好に結合したが、ＭＭＨＨａに対する結合を示さず、このことは、この内部領域のＮ末端に存在する残基がその結合に重要であることを示唆する。
（ＨＴＡ１２５は、ＴＬＲ４のＮ末端領域を認識する）
ＨＴＡ１２５は、ヒトＴＬＲ４に対する市販の非中和ＭＡｂである（Ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＨＴＡ１２５を、上記４種のマウス−ヒトハイブリッドに対して試験し、そしてＨＴＡ１２５は、中和ＭＡｂ １５Ｃ１および中和ＭＡｂ ７Ｅ３とは対照的に、ＴＬＲ４のＮ末端領域がヒトからマウスに変わった場合に、結合の欠如が見出された（図３４ａおよび図３４ｃ）。
（ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合に必須であるＴＬＲ４アミノ酸残基）
上で同定したＴＬＲ４の８７アミノ酸の領域内で重要な残基を同定するために、ヒト配列を、この領域内の対応するマウスＴＬＲ４配列に対して整列した（ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して行なったアライメント）。ｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３は、マウスＴＬＲ４／ＭＤ−２と交差反応しないので、ＭＡｂ結合に必須である残基はこの２つの種の間で保存されていないと、仮定された。ヒト配列において保存されていない残基の全てを、アラニンに変異させた。２０種の変異体（ＱＣ １〜ＱＣ ２０）バージョンを構築し、それらの各々は、アラニンに変換された２個または３個の残基を含んだ（図３６ａ）。
これらの変異体をｗｔ ＭＤ−２と一緒に、ＨＥＫ ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした後、Ｃ−ｍｙｃおよびｈｕ１８Ｈ１０ ＭＡｂを、それぞれ、細胞表面におけるＴＬＲ４およびＭＤ−２の存在を検出するために使用した。ＦＡＣＳ分析（図３６ｂ）は、全てのＴＬＲ４変異体が、バックグラウンドを十分に上回るレベルで発現されたことを示した。ＱＣ ６を除いて、全ての変異体は、ＭＤ−２を良好に結合した。変異体ＴＬＲ４に対するｈｕ１５Ｃ１およびｈｕ７Ｅ３の結合のレベルを決定するために、「正規化した」値を、ＭＡｂによって得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｃ−ｍｙｃによって得られた平気蛍光強度で除算することによって得た。このことは、上記ＴＬＲ４変異体の間で、上記細胞表面での発現のレベルにおける変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を可能にした。ｈｕ１５Ｃ１に関して、正規化した結合は、バージョンＱＣ １０、ＱＣ １５およびＱＣ ２０について大きく消失することが分かった。ｈｕ７Ｅ３に関して、ＱＣ １、ＱＣ ２、ＱＣ ６およびＱＣ ７は、大きく減少したｈｕ７Ｅ３結合を示したが、ｈｕ７Ｅ３は、結合のためにＭＤ−２の存在を必要としたので、ＱＣ ６に対する結合を欠くことは、上記細胞表面におけるＭＤ−２の欠如によって簡単に説明され得る（ＱＣ ６についてのｈｕ１８Ｈ１０のＭＦＩを参照のこと）。これらの結果は、ｈｕ１５Ｃ１の結合に重要な残基が、上で同定した８７アミノ酸の区画のＣ末端に位置するするのに対し、ｈｕ１５Ｃ１の結合に重要な残基は、Ｎ末端側に位置することを確証する。
（ｈｕ１８Ｈ１０は、ＭＤ−２の３９アミノ酸のＮ末端領域に結合する）
ＭＤ−２の３種のマウス−ヒトハイブリッド変異体を、ｈｕ１８Ｈ１０似に対する結合を担う、上記タンパク質の正確な領域を決定するために産生した。ＨＥＫ ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、ｗｔ ＴＬＲ４と一緒になった野生型（ｗｔ）ＭＤ−２またはＭＤ−２の変異形態のいずれかの、細胞表面における提示を可能にした。ＦＡＣＳ分析（図３７ａおよび図３７ｂ）は、上記複合体が３つ全ての場合において正しく発現したことを示した（ｈｕ１５Ｃ１染色およびＣ−ｍｙｃ染色によって示される場合）。バージョンＨＭＨおよびバージョンＨＨＭが、両方とも、ｈｕ１８Ｈ１０を良好に結合した一方で、ＭＨＨは、結合についてネガティブであり、このことは、ＭＤ−２の３９アミノ酸のＮ末端領域（図３７ａにおいて強調される）が、ＭＤ−２とｈｕ１８Ｈ１０との間の相互作用に必須であることを示唆する。
（ｈｕ１８Ｈ１０の結合に必須であるＭＤ−２アミノ酸残基）
上で同定したＭＤ−２の３９アミノ酸の領域内で重要な残基を同定するために、ヒト配列を、この領域内の対応するマウスＭＤ−２配列に対して整列した（ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して行なったアライメント）。ｈｕ１８Ｈ１０は、マウスＴＬＲ４／ＭＤ−２と交差反応しないので、ＭＡｂ結合に必須である残基はこの２つの種の間で保存されていないと、仮定された。したがって、ヒト配列において保存されていない変異する残基の全てを、アラニンに変異させた。１４種の変異体（ＱＣ １〜ＱＣ １４）バージョンを、構築し、その各々は、アラニンに変換される単一の残基を含んだ（図３８ａ）。
これらの変異体をｗｔ ＴＬＲ４と一緒に、ＨＥＫ ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした後、ｈｕ１５Ｃ１ ＭＡｂおよび抗６×ＨＩＳ ＭＡｂを、それぞれ、細胞表面におけるＴＬＲ４およびＭＤ−２の存在を検出するために使用した。ＦＡＣＳ分析（図３８ｂ）は、ＱＣ ７を除いて、全てのＴＬＲ４変異体が、バックグラウンドを十分に上回るレベルで発現されたことを示した。このＱＣ ７は、発現が乏しいか、またはＴＬＲ４と相互作用するその能力を失っているようである（ＴＬＲ４がＱＣ ７との同時トランスフェクションにおいて良好に発現されたことに留意すること）。変異型バージョンのＭＤ−２に対するｈｕ１８Ｈ１０の結合レベルを決定するために、「正規化した」値を、ｈｕ１８Ｈ１０によって得られる平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｃ−ｍｙｃによって得られる平均蛍光強度で除算することによって得た。このことは、上記ＭＤ−２変異体の間で、上記細胞表面での発現のレベルにおける変化を可能にした。ｈｕ１８Ｈ１０に関して、正規化した結合は、バージョンＱＣ １３について大きく消失することが分かった。これらの結果は、ｈｕ１５Ｃ１の結合に重要な残基が、上で同定した８７アミノ酸の区画のＣ末端に位置するするのに対し、ｈｕ１８Ｈ１０の結合に重要な残基は、上で同定したＭＤ−２の３７アミノ酸のＮ末端区画内に位置することを確証する。
（実施例４０：ｈｕ１８Ｈ１０ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生を阻害する）
ＬＰＳに対するｈｕ１８Ｈｌ０ヒト化モノクローナル抗体の中和能を示すために、ｈｕ１８Ｈ１０の、ヒト全血のＬＰＳ依存性のＩＬ−６産生を阻害する能力を、（上に記載したように）試験する。ｈｕ１８Ｈ１０抗体の、血液の白血球に対するＬＰＳの効果を阻害する能力を、上に記載した１８Ｈ１０キメラ抗体のその能力と比較する。
（実施例４１：ｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生を阻害する）
ＬＰＳに対するｈｕ７Ｅ３ヒト化モノクローナル抗体の中和能を示すために、ｈｕ７Ｅ３抗体の、ヒト全血のＬＰＳ依存性のＩＬ−６産生を阻害する能力を、（上に記載したように）試験する。ｈｕ７Ｅ３抗体の、血液の白血球に対するＬＰＳの効果を阻害する能力を、上に記載した７Ｅ３キメラ抗体のその能力と比較する。
（実施例４２：ｈｕ１５Ｃ１ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト全血においてＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生を阻害する）
ＬＰＳに対するｈｕ１５Ｃ１ヒト化モノクローナル抗体の中和能を示すために、ｈｕ１５Ｃ１抗体の、ヒト全血のＬＰＳ依存性のＩＬ−６産生を阻害する能力を、（上に記載したように）試験した。ｈｕ１５Ｃ１抗体の、血液の白血球に対するＬＰＳの効果を阻害する能力を、上に記載した１５Ｃ１キメラ抗体のその能力と比較した（図４４）。
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、上述の説明は、例示を目的とし、かつ添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
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