ES2441189T3 - Polipéptidos de unión al receptor de Fc con funciones efectoras modificadas - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une con TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2, o tanto TLR4 solublecomo el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo: (i) una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende lasecuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23), una región CDR2 de cadena pesada que comprende lasecuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24), y una región CDR3 de cadena pesada quecomprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80); (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende lasecuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28), una región CDR2 de cadena ligera que comprendela secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº:29), y una región CDR3 de cadena ligera que comprende lasecuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); y (iii) al menos una parte de unión a FcγR de una región Fc, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos dos mutaciones en comparación con unpolipéptido de partida y en el que una mutación es una sustitución con serina en la posición de aminoácido EU 325,y una mutación es una sustitución con fenilalanina en la posición de aminoácido EU 328.

Description

Polipéptidos de unión al receptor de Fc con funciones efectoras modificadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que incluyen una región Fc variante en los que dicha región Fc variante incluye al menos una modificación de aminoácidos en relación con una región Fc natural, cuando la región Fc variante tiene características de unión modificadas para el receptor Fc gamma humano IIA (CD32A) que conducen a la prevención de liberación de mediadores proinflamatorios (por ejemplo, TNF-alfa , Interleucina (IL)-1, IL-6, IL-8 y quimiocinas), y una región CDR3 variante, en los que la región CDR3 variante incluye al menos un aminoácido modificado en relación con una región CDR3 natural.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, estando cada cadena ligera unida a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro. La estructura general de un anticuerpo de clase IgG (es decir, una inmunoglobulina (Ig) de clase gamma (G) se muestra de forma esquemática en la Figura 1 A.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, estando el dominio variable de cadena ligera alineado con el dominio variable de la cadena pesada y estando el dominio constante de cadena ligera alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada.

El antígeno se une a los anticuerpos mediante un sitio de unión a antígeno en los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada. Otras moléculas, conocidas como moléculas efectoras, se unen a otros sitios en el resto de la molécula, es decir, distintos de los sitios de unión a antígeno, y esta parte del anticuerpo se denominará “la parte constante” de un anticuerpo, estando dichos sitios localizados particularmente en la región Fc constituida por las partes de las cadenas pesadas que se extienden más allá de los extremos de las cadenas ligeras.

La parte constante de los anticuerpos interacciona específicamente con receptores en células “efectoras”. Por ejemplo, la región Fc media en las funciones efectoras que se han dividido en dos categorías. En la primera están las funciones que aparecen independientemente de la unión de antígenos; estas funciones debido al receptor relacionado con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I FcRn confieren persistencia de IgG en la circulación y la capacidad de transferirse entre barreras celulares por transcitosis (véase Ghetie V y Ward S). En la segunda están las funciones que actúan después de que un anticuerpo se una a un antígeno; estas funciones implican la participación de la cascada de complementos o células que portan receptor de Fc (FcR).

Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulina. Por ejemplo los receptores de Fc para anticuerpos IgG se denominan Fc!R. Los FcR son receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas que median tanto la retirada de patógenos recubiertos con anticuerpo por fagocitosis de complejos inmunitarios, como la lisis de eritrocitos y otras diversas dianas celulares (por ejemplo, células tumorales) recubiertas con el anticuerpo correspondiente.

Los Fc!R desempeñan un papel crítico en la anulación o potenciación del reclutamiento inmunitario. En la actualidad, se distinguen tres clases de Fc!R en células del sistema inmunitario: el receptor de alta afinidad Fc RI (CD64), capaz de unirse a IgG monomérico; y los receptores de baja afinidad Fc!RII (CD32) y Fc!RIII (CD16), que interaccionan preferentemente con IgG en complejo. Además, las clases Fc!RII y Fc!RIII comprenden formas tanto “A” como “B” (Gessner -JE et al Ann Heamatol, 1998, The IgG Fc receptor family, 76: 231-248).

Las proteínas Fc!RII son glicoproteínas integrales de membrana de 40 kDa que se unen solamente al IgG en complejo debido a una baja afinidad por Ig monomérico (106 M-1). Este receptor es el Fc!R más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. Fc!RII tiene solamente dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y por lo tanto una afinidad mucho menor por IgG que Fc!RI. Hay tres genes de Fc!RII humanos (Fc!RII-A, Fc!RII-B, Fc!RII-C), todos los cuales se unen a IgG en agregados o complejos inmunitarios. El gen para el receptor de Fc!RII contiene G o A en el codón 131, que da como resultado arginina (CGT) o histidina (CAT), respectivamente, en el segundo dominio extracelular. Este cambio altera la capacidad del receptor para unirse a IgG. Las células con Fc!RIIA His-131, el genotipo A/A, se unen a IgG2 con afinidad considerablemente mayor que las de Arg en la posición 131; por el contrario, las células con Arg-131, el genotipo G/G, se unen a IgG1 murino con afinidad considerablemente mayor que las de His en la posición 131 (Salmon et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:1274-1281). Originalmente, los estudios que usaban interacción de monocitos con un anticuerpo anti-CD3 de la subclase IgG1 murina como un desencadenante de proliferación de linfocitos T clasificaban a los individuos fenotípicamente como de respuesta baja o de respuesta alta (Tax et al., 1983, Nature: 304: 445-447). Se sabe ahora que las células de respuesta alta en este ensayo tienen el genotipo G/G o A/G mientras que las células de respuesta baja tienen el genotipo A/A. El genotipo Fc!RIIa 131 R/R es un factor de riesgo para la susceptibilidad a algunas

enfermedades infecciosas y autoinmunitarias (Van der Pol W.L. y Van de Winkel J.G.J., 1998, Immunogenetics 48: 222-232).

Las diferencias características dentro de los dominios citoplasmáticos de Fc!RII-A y Fc!RII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas a la ligación de receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a activación celular tal como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia la señal inhibidora, por ejemplo, que inhibe la activación de linfocitos B.

Se han usado ahora anticuerpos monoclonales (mAb) para tratar enfermedades en pacientes humanos. Aunque algunos mAb pueden actuar eficazmente sin utilizar funciones efectoras de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos neutralizadores), en muchos casos puede ser deseable modificar por ingeniería genética la parte Fc del anticuerpo para reclutar el sistema inmunitario para inducir una respuesta inmunitaria. Existe la necesidad en la técnica de producir anticuerpos que incluyan una región Fc variante que tenga potencia aumentada conservando la capacidad para unirse a una diana dada. En consecuencia, existe la necesidad de producir anticuerpos IgG alterados que induzcan una actividad de receptor de Fc modificada conservando a la vez la unión con un antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado.

El documento WO2006/085967 describe anticuerpos que se unen a CD20 y tienen una región de unión a receptor Fc gamma modificada.

El documento US2006/0134709 describe anticuerpos que se unen a un antígeno de cáncer y tienen una región Fc modificada.

El documento US6.528.624 describe anticuerpos que se unen a un ligando o receptor y tienen una región Fc modificada.

Los documentos WO2006/077471 y WO2005/065015 describen anticuerpos que se unen al complejo TLR4/MD-2.

Compendio de la invención y divulgación

De acuerdo con la invención se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2 o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo:

(i)

una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23), una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24) y una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80);

(ii)

una región de cadena ligera variable que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28), una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº: 29) y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); y

(iii) al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc,

en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos dos mutaciones en comparación con un polipéptido de partida y en el que una mutación es una sustitución con serina en la posición de aminoácido EU 325, y una mutación es una sustitución con fenilalanina en la posición de aminoácido EU 328.

También de acuerdo con la invención, se proporciona el anticuerpo o fragmento de la invención para su uso en la activación de la señalización de ICAM.

De acuerdo con la invención, también se proporciona en la presente memoria el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o trastorno inflamatorio.

Los polipéptidos alterados descritos en la presente memoria incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina. Los anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen un anticuerpo alterado que tiene una región CDR3 variante en la que se ha modificado al menos un resto de aminoácido en la región CDR3 del anticuerpo. Los anticuerpos alterados y el polipéptido alterado de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una región Fc variante de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante.

Los polipéptidos alterados descritos en la presente memoria incluyen anticuerpos que incluyen al menos una sustitución de aminoácidos específica dentro de, por ejemplo, una región Fc o un fragmento de unión a FcR de la misma (por ejemplo, polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos dentro de un dominio constante de IgG) de modo que el anticuerpo modificado induzca alteraciones en la función efectora dependiente de antígeno

conservando a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, los anticuerpos alterados inducen la prevención de la liberación de mediador proinflamatorio. Preferentemente, los anticuerpos alterados son humanos y del isotipo IgG. Por ejemplo, los anticuerpos alterados son de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano. Los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria tienen una potencia aumentada en comparación con un anticuerpo inalterado.

Los anticuerpos alterados de la divulgación incluyen un anticuerpo alterado en el que se ha modificado al menos un resto de aminoácido en la región constante de la parte Fc del anticuerpo. Por ejemplo, se ha reemplazado al menos un aminoácido en el dominio CH2 de la parte Fc por un resto diferente, es decir, una sustitución de aminoácidos. En los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria, se sustituyen uno o más de los restos de aminoácidos que corresponden a los restos 325, 326 y 328 con un resto diferente en comparación con un anticuerpo inalterado. La numeración de los restos en la cadena pesada gamma es la del índice EU (véase Edelman, G.M. et al., 1969; Kabat, E, A., T. T. Wu, H. M. Perry K. S. Gottesman y C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, Publicación de NIH Nº 91-3242).

Estos anticuerpos alterados pueden inducir con una parte Fc mutada funciones efectoras modificadas, por ejemplo, una actividad del receptor de Fc modificada, en comparación con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, el receptor de Fc humano es CD32A. Los anticuerpos alterados inducen inhibición aumentada de la liberación de mediador proinflamatorio después de ligación con CD32A, en comparación con un anticuerpo inalterado. Por lo tanto, los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria inducen una actividad del receptor de Fc modificada, tal como aumentar la inhibición de la liberación de mediadores proinflamatorios, conservando a la vez la capacidad para unirse a un antígeno diana. Opcionalmente, el anticuerpo alterado es un anticuerpo neutralizador, en el que el anticuerpo alterado induce una actividad del receptor de Fc modificado, conservando a la vez la capacidad para neutralizar una o más actividades biológicas de un antígeno diana mediante unión con Fv.

Cuando el anticuerpo alterado es un isotipo de IgG1 humano, los anticuerpos alterados incluyen la sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido EU 328 solamente o junto con las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG1 de ratón en comparación con un anticuerpo inalterado. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido polar tal como arginina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, serina o treonina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos alterados pueden contener la posición de aminoácido EU 328 con una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de la región constante de cadena pesada gamma IgG1 humana, en la que las sustituciones se producen en uno o dos restos de aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326. Opcionalmente, el anticuerpo IgG1 humano alterado contiene las sustituciones de aminoácidos en las posiciones EU 326 y 328. Por ejemplo, el resto 326 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG1 humana se sustituye con alanina y el resto 328 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG1 humana se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, las posiciones EU 325 a 328 de la región constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG1 humano alterado consisten en una secuencia seleccionada de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF.

Cuando el anticuerpo alterado es un isotipo de IgG2 humano, los anticuerpos alterados incluyen la sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido EU 328 solamente o junto con las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326 en comparación con un anticuerpo inalterado. En una realización, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido polar tal como arginina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, serina o treonina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. La posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. Los anticuerpos alterados pueden contener la posición de aminoácidos EU 328 con una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de la región constante de cadena pesada gamma de IgG2 humana, en la que las sustituciones se producen en uno o dos restos de aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326. Opcionalmente, el anticuerpo IgG2 humano alterado contiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones EU 326 y 328. Por ejemplo, el resto 326 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG2 humana se sustituye con alanina y el resto 328 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG2 humana se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, las posiciones EU 325 a 328 de la

región constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG2 humano alterado consisten en una secuencia seleccionada de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF.

Cuando el anticuerpo alterado es un isotipo IgG3 humano, los anticuerpos alterados incluyen la sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido EU 328 solamente o junto con las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326 en comparación con el anticuerpo inalterado. La posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido polar tal como arginina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, serina o treonina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. La posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. Opcionalmente, los anticuerpos alterados contienen la posición de aminoácido EU 328 con una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de la región constante de cadena pesada gamma de IgG3 humana, en la que las sustituciones se realizan en uno o dos restos de aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326. Opcionalmente, el anticuerpo IgG3 humano alterado contiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones EU 326 y 328. Por ejemplo, el resto 326 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG3 humana se sustituye con alanina y el resto 328 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG3 humana se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, las posiciones EU 325 a 328 de la región constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG3 humano alterado consisten en una secuencia seleccionada de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF.

Cuando el anticuerpo alterado es un isotipo IgG4 humano, los anticuerpos alterados incluyen la sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido EU 328 solamente o junto con las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326 en comparación con el anticuerpo inalterado. La posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con un aminoácido polar tal como arginina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, histidina, lisina, serina o treonina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. La posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma puede sustituirse con un aminoácido no polar, tal como alanina, cisteína, leucina, isoleucina, valina, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano y tirosina. Más preferentemente, la posición de aminoácido EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. Opcionalmente, los anticuerpos alterados contienen la posición de aminoácido EU 328 con una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de la región constante de cadena pesada gamma de IgG4 humana, en la que las sustituciones se realizan en uno o dos restos de aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326. Opcionalmente, el anticuerpo IgG4 humano alterado contiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones EU 326 y 328. Por ejemplo, el resto de 326 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG4 humana se sustituye con alanina y el resto 328 de la región constante de cadena pesada gamma de IgG4 humana se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, las posiciones EU 325 a 328 de la región constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG4 humano alterado consisten en una secuencia seleccionada de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF.

Los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria también incluyen un anticuerpo alterado que tiene una región CDR3 variante en la que se ha modificado al menos un resto de aminoácido en la región CDR3 del anticuerpo. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Los polipéptidos alterados descritos en la presente memoria incluyen anticuerpos que incluyen una región CDR3 variante y al menos una sustitución de aminoácido específica dentro de, por ejemplo, una región Fc o un fragmento de unión a FcR de la misma (por ejemplo, polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácidos dentro de un dominio constante de IgG) de modo que el anticuerpo modificado induzca alteraciones en la función efectora dependiente de antígeno conservando a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado.

Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VH variantes mostradas en el Ejemplo 4: KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) y KDPSEGFPY (SEC ID Nº: 81). Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VL variantes mostradas en el Ejemplo 4: QNSHSFPLT (SEC ID Nº: 82); QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); QNSSSFPLT (SEC ID Nº: 84) y QQSHSFPLT (SEC ID Nº: 85).

Los anticuerpos alterados pueden incluir tanto una región Fc variante como una región CDR3 variante. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen tanto una región Fc variante mostrada en el Ejemplo 3 como una región CDR3 variante mostrada en el Ejemplo 4, por ejemplo, SEC ID Nº: 80-85. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen tanto un dominio CH2 variante en la región Fc como una región CDR3 variante. Opcionalmente,

los anticuerpos alterados incluyen tanto un dominio CH2 variante en la región Fc mostrada en el Ejemplo 3 como una región CDR3 variante mostrada en el Ejemplo 4, por ejemplo, SEC ID Nº: 80-85. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen tanto un dominio CH2 variante en la región Fc que se muta en uno o más de los restos que corresponden a los restos 325, 326 y/o 328 (usando la numeración de los restos en la cadena pesada gamma como en el índice EU, Edelman, et al.) y una región CDR3 variante. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen tanto un dominio CH2 variante en la región Fc que está mutado en uno o más de los restos que corresponden a los restos 325, 326 y/o 328 (usando la numeración de los restos en la cadena pesada gamma como en el índice EU, Edelman, et al.) mostrados en el Ejemplo 3 como una región CDR3 variante mostrada en el Ejemplo 4, por ejemplo, SEC ID Nº: 80-85.

Los polipéptidos y anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen anticuerpos que incluyen una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51, 52, 66 o 68, y/o un aminoácido variable de cadena ligera que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50, 53, 71, 73, 75 o 77.

Los polipéptidos y anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina, e incluyen una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51, 52, 66 o 68, y/o un aminoácido variable de cadena ligera que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50, 53, 71, 73, 75 o 77. Los anticuerpos alterados pueden incluir ambos un dominio CH2 variante en la región Fc mostrada en el Ejemplo 3. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen ambos un dominio CH2 variante en la región Fc que está mutado en uno o más de los restos que corresponden a los restos 325, 326 y/o 328 (usando la numeración de los restos en la cadena pesada gamma como en el índice EU, Edelman , et al.).

Los polipéptidos y anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos y anticuerpos que incluyen una región Fc variante, e incluyen una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51, 52, 66 o 68, y/o un aminoácido variable de cadena ligera que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50, 53, 71, 73, 75 o 77. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen ambos un dominio CH2 variante en la región Fc mostrada en el Ejemplo 3. Los anticuerpos alterados pueden incluir ambos un dominio CH2 variante en la región Fc que está mutado en uno o más de los restos que corresponden a los restos 325, 326 y/o 328 (usando la numeración de los restos en la cadena pesada gamma como en el índice EU, Edelman , et al.).

Los polipéptidos y anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos y anticuerpos que incluyen un dominio CH2 variante en la región Fc, e incluyen una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 12, 22, 32, 45, 46, 49, 51, 52, 66 o 68, y/o un aminoácido variable de cadena ligera que es al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 7, 17, 27, 37, 47, 48, 50, 53, 71, 73, 75 o 77. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen ambos un dominio CH2 variante en la región Fc mostrada en el Ejemplo 3. Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen ambos un dominio CH2 variante en la región Fc que está mutado en uno o más de los restos que corresponden a los restos 325, 326 y/o 328 (usando la numeración de los restos en la cadena pesada gamma como en el índice EU, Edelman, et al.).

Los anticuerpos y polipéptidos alterados descritos en la presente memoria también incluyen polipéptidos y anticuerpos que incluyen tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a cada una de: (i) una secuencia de CDR1 VH seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 13, 23 y 33; (ii) una secuencia de CDR2 VH seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, 14, 24 y 34; (iii) una secuencia de CDR3 VH seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 5, 15, 25, 35, 80 y 81; y/o una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a cada una de (iv) una secuencia de CDR1 VL seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 18, 28 y 38; (v) una secuencia de CDR2 VL seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, 19, 29 y 39; y (vi) una secuencia de CDR3 VL seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, 20, 30, 40, 82, 83, 84 y 85.

La divulgación también proporciona métodos para dirigir a CD32A humano un anticuerpo monoclonal en el que al menos la posición de aminoácido EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma junto con uno o dos de los restos de aminoácidos que corresponden a las posiciones EU 325 y 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituyen con el resto de aminoácido EU correspondiente de IgG1 de ratón en la misma posición que es diferente del resto de aminoácido correspondiente en un anticuerpo inalterado, de modo que el anticuerpo induce aumento de la inhibición de la liberación de mediadores proinflamatorios tras su unión con CD32A humana conservando a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado. El anticuerpo alterado puede incluir además una región CDR3 VH variante mostrada en el Ejemplo 4: KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) y KDPSEGFPY (SEC ID Nº: 81) y/o una región CDR3 variante mostrada en el Ejemplo 4: QNSHSFPLT (SEC ID Nº:

82); QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); QNSSSFPLT (SEC ID Nº: 84) y QQSHSFPLT (SEC ID Nº: 85).

Opcionalmente, el resto de aminoácido que corresponde a la posición EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. Opcionalmente, el resto de aminoácido que corresponde a la posición EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. Opcionalmente, el resto de aminoácido que corresponde a la posición EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina. Opcionalmente, el anticuerpo alterado incluye además una región CDR3 VH variante mostrada en el Ejemplo 4: KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) y KDPSEGFPY (SEC ID Nº: 81) y/o una región CDR3 variante mostrada en el Ejemplo 4: QNSHSFPLT (SEC ID Nº: 82); QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); QNSSSFPLT (SEC ID Nº: 84) y QQSHSFPLT (SEC ID Nº: 85).

El anticuerpo alterado puede unirse a una diana seleccionada de un receptor de tipo Toll (TLR), proteína accesoria MD2 y CD14. Por ejemplo, el anticuerpo alterado se une a TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2 o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2. Opcionalmente, el anticuerpo alterado se une a TLR2. Por ejemplo, los anticuerpos son capaces de bloquear, por ejemplo, neutralizar, la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS.

El anticuerpo alterado puede ser un anticuerpo de isotipo IgG1 humano que incluye al menos la modificación del resto de aminoácido en la posición EU 328 posiblemente con al menos un resto de aminoácido de la región constante de cadena pesada gamma seleccionado de los restos de aminoácidos 325 y 326 en el que el anticuerpo alterado induce una actividad efectora de Fc modificada tras su unión con CD32A humano conservando a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado, y en el que el anticuerpo incluye (a) una región CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, 13, 23 o 33; (b) una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 14, 24 o 34; (c) una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5, 15, 25, 35, 80 u 81; (d) una región CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8, 18, 28 o 38; (e) una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 9, 19, 29 o 39; y (f) una región CDR3 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 10, 20, 30, 40, 82, 83, 84 u 85, en el que el anticuerpo se une a TLR4 soluble, MD2, el complejo TLR4/MD2 o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2. En una realización, la posición EU 325 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con serina. Opcionalmente, la posición EU 326 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con alanina. Opcionalmente, la posición EU 328 de la región constante de cadena pesada gamma se sustituye con fenilalanina.

Opcionalmente, los anticuerpos alterados incluyen una región constante de cadena pesada gamma que tiene dos o más sustituciones con un resto de aminoácido que es diferente del resto de aminoácido correspondiente en un anticuerpo inalterado, en el que las sustituciones se realizan en la posición EU 328 y uno o dos restos de aminoácidos seleccionados de los restos 325 y 326 de la región constante de cadena pesada gamma. Opcionalmente, las sustituciones son en los restos 326 y 328. Por ejemplo, la posición EU 326 de la región constante de cadena pesada se sustituye con alanina, y la posición EU 328 de la región constante de cadena pesada se sustituye con fenilalanina. Los anticuerpos alterados pueden contener una región constante de cadena pesada en la que la posición EU 325-328 de la región constante de cadena pesada gamma consiste en una secuencia seleccionada de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF. En una realización, la región CDR1 VH del anticuerpo IgG1 humano alterado incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 23, la región CDR2 VH incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 24, la región CDR3 VH incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 25 o SEC ID Nº: 80 o SEC ID Nº: 81, la región CDR1 VL incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 28, la región CDR2 VL incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 29, y la región CDR3 VL incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 84 o SEC ID Nº: 85.

Opcionalmente, los anticuerpos alterados son versiones alteradas de los anticuerpos denominados en la presente memoria 16G7, mu16G7, 7E3, mu7E3, 15C1 mu15C1, 18H10 y mu18H10. Versiones modificadas de estos anticuerpos, que reconocen el complejo TLR4/MD2, inducen una actividad de CD32A humana modificada, por ejemplo, inhibidora e inhiben la producción de citocina proinflamatoria inducida por LPS al menos dos veces, cinco veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces que el anticuerpo monoclonal no de bloqueo anti-TLR4 disponible en el mercado HTA125.

Opcionalmente, los anticuerpos alterados son versiones modificadas de los anticuerpos que reconocen CD14, tales como el anticuerpo monoclonal anti-CD14 conocido como 28C5 (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 6.444.206) y versiones alteradas de los anticuerpos que reconocen TLR2, incluyendo, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-TLR2 conocido como T2.5 (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/028509).

La divulgación también proporciona polipéptidos aislados que incluyen una región gamma 1 Fc (!1Fc), en la que los restos de aminoácidos en las posiciones EU 325-328 de la región consisten en un motivo de aminoácidos seleccionado de SAAF, SKAF, NAAF y NKAF.

Los anticuerpos alterados de la invención y la divulgación se producen usando cualquier técnica adecuada incluyendo técnicas que se conocen bien por los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos alterados se producen modificando anticuerpos conocidos para incluir al menos una mutación en la región Fc, particularmente en

el dominio CH2, y más particularmente en una localización seleccionada de las posiciones EU 325, 326 y 328. La numeración de los restos en la cadena pesada gamma es la del índice EU (Edelman, G.M. et al., 1969; Kabat, E, A.,

T.T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, y C. Foeller., 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.

U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, Publicación NIH Nº 91-3242). La numeración para las regiones variables de inmunoglobulina para los anticuerpos descritos en la presente memoria son como se define en EA Kabat et al., 1991. (Kabat, E, A., T.T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, y C. Foeller., 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, Publicación NIH Nº 91-3242).

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la divulgación pueden incluir un anticuerpo alterado de la invención y un vehículo. Los anticuerpos alterados pueden ser igualmente de origen murino, humano y de rata dada la alta homología de secuencia entre las diferentes inmunoglobulinas. La composición puede incluir una única clase de isotipo, por ejemplo, un anticuerpo alterado de isotipo IgG1, o cualquier combinación de clases de isotipo de IgG de rata, de ratón y humano, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4 y combinaciones de los mismos. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es una representación esquemática de anticuerpos IgG1 15C1 de ratón y quiméricos. Los dominios variables y constantes de ratón de la cadena ligera y pesada están en negro continuo. Los dominios constantes humanos de cadenas ligera y pesada están en negro discontinuo. IgG1 15C1 de ratón es una inmunoglobulina de ratón de la subclase IgG1 específica para TLR4 humano. IgG1 15C1 quimérico es una inmunoglobulina recombinante que consiste en las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón de 15C1 en fusión con regiones constantes pesada y ligera kappa de IgG1 humano. V = dominio variable; L = cadena ligera; H = cadena pesada; CK = dominio constante kappa de la cadena ligera; CH1, CH2, CH3 = dominios constantes de la cadena pesada.

La Figura 1B es una gráfica que representa la producción de IL-8 dependiente de LPS en células 293 de riñón embrionario humano (HEK 293) que expresan TLR4/MD2 humano por IgG1 15C1 de ratón y quimérico.

La Figura 2 es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por anticuerpos IgG1 15C1 de ratón y quiméricos.

La Figura 3 es una gráfica que representa la producción de IL6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por anticuerpos mutantes D265A e IgG1 15C1 de ratón recombinantes.

Figura 4A. La adición de un mAb AT10 anti-CD32A o mAb IV.3 anti CD32 a redujo la inhibición por mAb 15C1 de LPS en un grado similar, como se mide por producción de IL-6 en sangre completa.

Figura 4B. Bloqueo mediado por 15C1 de la activación de TLR4 dependiente de LPS en sangre completa derivada de individuos homocigotos y heterocigotos usando la versión IgG 1 de ratón o IgG4 humana de 15C1. Debido a que la magnitud de producción de IL-6 era variable entre los diferentes donantes, se proporcionan resultados como el porcentaje de inhibición de la liberación de IL-6 en comparación con valores obtenidos con el anticuerpo de control de isotipo (que corresponde al 100 % de activación de LPS). Las barras de error muestran ∀ ETM.

La Figura 5A es una representación esquemática de anticuerpos quiméricos y de ratón IgG1 15C1 que contienen los dominios CH2 de IgG1 de ratón y humanos, respectivamente. Los dominios variables y constantes de ratón de la cadena ligera y pesada están en negro. Los dominios constantes humanos de las cadenas ligera y pesada están en negro discontinuo. IgG1 15C1 de ratón es una inmunoglobulina de ratón de la subclase IgG1 específica para TLR4 humano. IgG1 15C1 quimérico es una inmunoglobulina recombinante que consiste en las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón de 15C1 en fusión con regiones constantes pesadas y ligeras kappa de IgG1 humana. V = dominio variable; L = cadena ligera; H = cadena pesada; CK = dominio constante kappa de la cadena ligera; CH1, CH2, CH3 = dominios constantes de la cadena pesada.

La Figura 5B es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana intercambiando el dominio CH2 entre los anticuerpos IgG1 15C1 de ratón y quiméricos.

La Figura 6A es una representación esquemática de cuatro mutantes CH2 de ratón (A, B, C y D), que contienen cada uno la subregión CH2 de IgG1 humana correspondiente homóloga; restos 231-262, 318-340, 295-318 y 262295 para los mutantes A, B, C y D, respectivamente.

La Figura 6B es una gráfica que representa la unión con la línea celular estable CHO que expresa el complejo TLR4-MD2 humano en su superficie.

La Figura 6C es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por IgG1 15C1 quimérico que contiene dominios de subregión CH2 híbridos entre IgG1 de ratón y humano.

La Figura 7A es una representación esquemática de IgG1 15C1 quimérico que contiene los restos del dominio CH2 de IgG1 de ratón 319 a 340. Los dominios variables y constantes de ratón de la cadena ligera y pesada están en negro. Los dominios constantes humanos de las cadenas ligera y pesada están en negro discontinuo. IgG1 15C1 quimérico es una inmunoglobulina recombinante que consiste en las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón de 15C1 en fusión con regiones constantes ligeras kappa y pesadas de IgG1 humano. V = dominio variable; L = cadena ligera; H = cadena pesada; CK = dominio constante kappa de la cadena ligera; CH1, CH2, CH3 = dominios constantes de la cadena pesada.

La Figura 7B es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en un ensayo de sangre completa humana por IgG1 15C1 quimérico o IgG1 15C1 quimérico que contiene el dominio CH2 de ratón 319-340 de longitud completa o mutante.

La Figura 8A es una ilustración que representa un alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas del extremo C terminal de IgG1 de ratón (resto 319 a 340) del dominio CH2 de cadena pesada con el extremo C terminal de IgG1 humano (resto 319 a 340) del dominio CH2 de cadena pesada. Los guiones indican aminoácidos idénticos a los de la secuencia de ratón. Las secuencias se alinearon basándose en el alineamiento de ácidos nucleicos máximo de acuerdo con la numeración EU.

La Figura 8B es una ilustración que representa una alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas del extremo C terminal de IgG1 de ratón (restos 319 a 340) del dominio CH2 de cadena pesada con los 5 mutantes (A a E) y extremo C terminal de IgG1 humano (restos 319 a 340) del dominio CH2 de cadena pesada. Los guiones indican aminoácidos idénticos a los de la secuencia de ratón. Las secuencias se alinearon basándose en el alineamiento de ácidos nucleicos máximo de acuerdo con la numeración EU. Las mutaciones se indican por el resto de aminoácido de ratón seguido de un número de 1 a 7 que corresponde a las siete diferencias entre las secuencias de ratón y humanas y finalmente el aminoácido humano al que se ha mutado.

La Figura 8C es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por el IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 quimérico que contiene el CH2 de ratón 319-340 de longitud completa o mutante.

La Figura 9A es una gráfica que representa la unión con la línea celular estable CHO que expresa TLR4-MD2 humano en su superficie.

La Figura 9B es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por los anticuerpos IgG1 15C1 quimérico, muCH2 15C1 e IgG1 15C1 quimérico mutante.

La Figura 10 es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por el IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 de ratón, IgG1 15C1 quimérico que contiene CH2 de ratón y 15C1 humanizado que contiene CH2 de ratón.

La Figura 11A es una gráfica que representa la unión con línea celular estable CHO que expresa TLR4-MD2 humano en su superficie.

La Figura 11B es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por los mutantes de 15C1 humanizados C, F, G y H y 15C1 humanizado que contienen el CH2 de ratón.

La Figura 12 es una gráfica que representa la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por IgG1 15C1 quimérico, mutante C de 15C1 humanizado y 15C1 humanizado que contiene CH2 de ratón.

Las Figuras 13A-3C son una serie de gráficas que representan la producción de IL-6 dependiente de LPS en ensayo de sangre completa humana por mAb de ratón anti-TLR2 (13 A), de ratón anti-MD2 (18H10, 13B) y de ratón anti -CD14 (13C) con o sin anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD32 humano.

La Figura 14A es una ilustración que representa una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína accesoria MD-2 (SEC ID Nº: 41).

La Figura 14B es una ilustración que representa una secuencia de aminoácidos de una proteína accesoria MD-2 madura (SEC ID Nº: 42).

La Figura 15 es una ilustración que representa la secuencia de aminoácidos del receptor de tipo toll humano 4 (TLR4) (SEC ID Nº: 43).

La Figura 16 es una ilustración que representa el despliegue proteico del dominio CH2 de isotipos IgG humanos, de ratón y de rata. “*” Significa que los restos de esa columna son idénticos en todas las secuencias en el alineamiento.

Las Figuras 17A-17G son una serie de gráficas que representan el análisis de mutantes humanizados 15C1 por citometría de flujo en células que expresan TLR4-MD2 humano recombinante.

Descripción detallada de la invención y la divulgación

Los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria son anticuerpos que incluyen al menos una sustitución de aminoácidos específica en la región constante de cadena pesada gamma de modo que el anticuerpo alterado induce alteraciones en la función efectora dependiente de antígeno manteniendo a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado. Preferentemente, los anticuerpos alterados son humanos. Por ejemplo, los anticuerpos alterados son de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Los anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen un anticuerpo alterado que tiene una región CDR3 variante en la que se ha modificado al menos un resto de aminoácido en la región CDR3 del anticuerpo. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una región Fc variante de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VH variantes mostradas en el Ejemplo 4: KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) y KDPSEGFPY (SEC ID Nº: 81). Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VL variantes mostradas en el Ejemplo 4: QNSHSFPLT (SEC ID Nº: 82); QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); QNSSSFPLT (SEC ID Nº: 84) y QQSHSFPLT (SEC ID Nº: 85).

Los anticuerpos alterados de la divulgación incluyen un anticuerpo alterado en el que se ha modificado al menos el resto de aminoácido en la posición EU 328 en el dominio CH2 de la parte Fc del anticuerpo. Por ejemplo, al menos el resto de aminoácido en la posición EU 328 se ha sustituido con fenilalanina. En los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria, al menos el resto de aminoácido en la posición EU 328 solamente o junto con las posiciones de aminoácidos EU 325 y 326 se sustituyen con un resto diferente en comparación con un anticuerpo inalterado.

Estos anticuerpos alterados con una parte Fc modificada inducen funciones efectoras modificadas, por ejemplo, una actividad del receptor de Fc modificada, en comparación con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, el receptor de Fc humano es CD32A. Los anticuerpos alterados pueden inducir una prevención de la liberación de mediadores proinflamatorios después de ligación con CD32A en comparación con un anticuerpo inalterado. Por lo tanto, los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria inducen una actividad del receptor de Fc modificado, tal como la prevención de la liberación de mediadores proinflamatorios manteniendo a la vez la capacidad para unirse a un antígeno diana. Opcionalmente, el anticuerpo alterado es un anticuerpo neutralizador, en el que el anticuerpo alterado induce una actividad del receptor de Fc modificada manteniendo a la vez la capacidad para neutralizar una

o más actividades biológicas de un antígeno diana.

Por ejemplo, los anticuerpos alterados incluyen anticuerpos monoclonales que se unen al complejo receptor TLR4/MD-2 humano. Este complejo receptor se activa por lipopolisacárido (LPS), el componente principal de la membrana externa de las bacterias gram-negativas. Los anticuerpos alterados de la divulgación inhiben la activación del receptor y la posterior señalización intracelular mediante LPS. Por lo tanto, los anticuerpos alterados neutralizan la activación del complejo receptor TLR4/MD-2. En particular, la divulgación proporciona anticuerpos alterados que reconocen el complejo receptor TLR4/MD-2 expresado en la superficie celular. Estos anticuerpos alterados bloquean la producción de IL-8 inducida por LPS. Además, algunos anticuerpos alterados también reconocen TLR4 cuando no están en complejo con MD-2. El anticuerpo alterado es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.

Los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor TLR4/MD-2 humano y también se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2. Los anticuerpos de la divulgación también incluyen anticuerpos que se unen a la parte TLR4 del complejo receptor TLR4/MD-2 humano pero la unión depende de la presencia de MD-2, no obstante la unión se potencia en gran medida por la presencia de MD-2, lo que sugiere que la presencia del MD-2 provoca un cambio conformacional en TLR4, exponiendo de este modo un epítopo unido al anticuerpo. Además, los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor TLR4/MD-2 humano y también se unen a MD-2 en presencia de TLR4.

Los anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen anticuerpos que reconocen dianas tales como cualquier receptor de tipo Toll. Los receptores Toll, descubiertos en primer lugar en Drosophila, son proteínas transmembrana de tipo I que tienen repeticiones ricas en leucina (LRR) en la parte extracelular de la proteína, y uno

o dos dominios ricos en cisteína. Los homólogos de mamíferos de los receptores Toll de Drosophila se conocen como “receptores de tipo Toll” (TLR). Los TLR desempeñan un papel en la inmunidad innata reconociendo partículas microbianas y activando células inmunitarias contra la fuente de estas partículas microbianas.

En la actualidad, se han identificado once tipos de receptores tipo Toll en seres humanos, los TLR 1-11 (Pandey S y Agrawal DK, Immunobiology of Toll-like-receptors: emerging trends. Immunol. Cell Biol., 2006; 84:333-341). Estos TLR se caracterizan por la homología de sus dominios intracelulares con el del receptor de IL-1, y por la presencia de repeticiones ricas en leucina extracelulares. Los diferentes tipos de TLR se activan por diferentes tipos de partículas microbianas. Por ejemplo, TLR4 se activa principalmente por lipopolisacáridos (LPS), mientras que TLR2 se activa por ácido lipoteicoico (LTA), lipoarabinomanano (LAM); lipoproteínas (BLP), y peptidoglicanos (PGN). También se han identificado homólogos de receptores de Toll, tales como RP105.

Por ejemplo, los anticuerpos alterados de la divulgación incluyen anticuerpos que reconocen TLR2, incluyendo, por ejemplo, una o más versiones modificadas del anticuerpo monoclonal anti-TLR2 conocido como T2.5 (véase, por ejemplo, documento WO 2005/028509).

Otros anticuerpos alterados adecuados incluyen anticuerpos que reconocen CD 14, tales como una o más versiones modificadas del anticuerpo monoclonal anti-CD 14 conocido como 28C5 (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 6.444.206).

Definiciones:

A no ser que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención y divulgación tendrán los significados que se entienden habitualmente por los expertos habituales en la materia. Además, a no ser que se requiera de otro modo por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos e hibridación descritas en la presente memoria son las bien conocidas y usadas habitualmente en este campo. Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realizan habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en este campo y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son las bien conocidas y usadas habitualmente en este campo. Se usan técnicas convencionales para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes.

Como se utilizan de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a no ser que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:

Como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Por “se une específicamente” o “inmunorreacciona con” o “se une inmunoespecíficamente” se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une a una afinidad mucho menor (Kd > 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), fragmentos de cadena sencilla, Fab, Fab, y F(ab’)2, scFv, y una biblioteca de expresión de Fab.

Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La parte carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases tienen subclases, tales como IgG1, IgG2, y otras. Además, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

La expresión “anticuerpo monoclonal” (mAb) o “composición de anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única para él.

La expresión “sitio de unión a antígeno” o “parte de unión” se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno se forma por restos de aminoácidos de las regiones variables (“V”) N terminales de las cadenas pesada (“H”) y ligera (“L”). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominados “regiones hipervariables”, se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones marco” o “FR“. Por lo tanto, el término “FR” se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran de forma natural entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen entre sí en espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de

acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878883 (1989).

Como se usa en la presente memoria, el término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente con una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de linfocitos T. El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente con una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inducirse contra péptidos N terminales o C terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es # 1 ∃M; por ejemplo, # 100 nm, preferentemente # 10 nM y más preferentemente # 1 nM.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones “unión inmunológica” y “propiedades de unión inmunológica” se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que aparece entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que es específica la inmunoglobulina. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológicas puede expresarse con respecto a la constante de disociación (Kd) de la interacción, representando una Kd menor una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológicas de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir las velocidades de formación y disociación de complejo antígeno/sitio de unión a antígeno, en el que dichas velocidades dependen de las concentraciones de los compañeros del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la “constante de velocidad de asociación” (Kon) como la “constante de velocidad de disociación” (Koff) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Véase Nature 361:186-87 (1993)). La relación de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente invención y divulgación se une específicamente a su diana, cuando la constante de unión en equilibrio (Kd) es % 1 ∃M, por ejemplo, % 100 nm, preferentemente % 10 nM, y más preferentemente % 1 nM, como se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la materia.

La expresión “polinucleótido aislado” como se usa en la presente memoria significará un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que según su origen, el “polinucleótido aislado”

(1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente con un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza, o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Los polinucleótidos de acuerdo con la divulgación incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas en la presente memoria.

La expresión “proteína aislada” a la que se hace referencia en la presente memoria significa una proteína de origen de ADNc, ARN recombinante o sintético o alguna combinación de los mismos, que según su origen, o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no está asociada con proteínas halladas en la naturaleza, (2) está sin otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, sin proteínas marinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no aparece en la naturaleza.

El término “polipéptido” se usa en la presente memoria como un término genérico para hacer referencia a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y análogos son especies del género del polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la divulgación comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas en la presente memoria, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.

La expresión “de origen natural” como se usa en la presente memoria aplicada a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otro modo es de origen natural.

La expresión “unido operativamente” como se usa en la presente memoria se refiere a posiciones de componentes descritos de modo que están en una relación que les permite actuar de su manera pretendida. Una secuencia de control “unida operativamente” a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión “secuencia de control” como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes con las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que la expresión “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión. El término “polinucleótido” como se hace referencia en la presente memoria significa un grupo polimérico de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, bien de ribonucleótidos o bien desoxinucleótidos o una forma modificada de uno de los tipos de nucleótidos. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.

Como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos &,&-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, !-carboxiglutamato, ∋-N,N,N-trimetil-lisina, ∋-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, N-metilhistidina, 5hidroxilisina, (-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en la presente memoria, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxilo terminal, de acuerdo con el uso habitual y la convención.

Como se aplica a los polipéptidos, la expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando los pesos de hueco por defecto, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y más preferentemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia.

Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de los restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo - alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina -leucina - isoleucina, fenilalanina - tirosina, lisina -arginina, alanina - valina, ácido glutámico - aspártico y asparagina - glutamina.

Como se analiza en la presente memoria, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina abarcadas en la presente memoria, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75 %, más preferentemente al menos 80 %, 90 %, 95 % y más preferentemente 99 %. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácidos conservativos. Los reemplazos conservativos son los que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante en la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio de marco conservado. Si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional, puede determinarse fácilmente ensayando la actividad específica del derivado polipeptídico. Los ensayos se describen en detalle en la presente memoria. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por los expertos habituales en la materia. Los extremos amino y carboxilo preferidos de fragmentos o análogos aparecen cerca de los extremos de los dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales por comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas.

Preferentemente, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación proteica predichos que aparecen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención y la divulgación.

Son sustituciones de aminoácidos preferidas las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferentemente en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental,

o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caractericen a la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105 (1991).

Como se usa en la presente memoria, los términos “marcador” o “marcado” se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión con un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, el marcador o etiqueta también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C,15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I,131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, biotinilados, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, marcadores epitópicos). Los marcadores pueden unirse por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. La expresión “agente farmacéutico o fármaco” como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administre de forma apropiada a un paciente.

Otros términos químicos en la presente memoria se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Como se usa en la presente memoria "sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en concentración molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en concentración molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de aproximadamente 85 %, 90 %, 95 % y 99 %. Más preferentemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.

Anticuerpos

Los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria son anticuerpos que incluyen al menos una sustitución de aminoácidos específica en la región constante de cadena pesada gamma de modo que el anticuerpo alterado induce alteraciones en la función efectora dependiente de antígeno conservando a la vez la unión con el antígeno en comparación con un anticuerpo inalterado. Preferentemente, los anticuerpos alterados son humanos. Por ejemplo, los anticuerpos alterados son de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Los anticuerpos alterados de la divulgación también incluyen un anticuerpo alterado que tiene una región CDR3 variante en la que se ha modificado al menos un resto de aminoácido en la región CDR3 del anticuerpo. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Los anticuerpos alterados y polipéptidos alterados de la divulgación también incluyen polipéptidos que incluyen al menos

una región Fc variante de un polipéptido de inmunoglobulina y una región CDR3 variante. Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VH variantes mostradas en el Ejemplo 4: KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80) y KDPSEGFPY (SEC ID Nº: 81). Las regiones CDR3 variantes incluyen las regiones CDR3 VL variantes mostradas en el Ejemplo 4: QNSHSFPLT (SEC ID Nº: 82); QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); QNSSSFPLT (SEC ID Nº: 84) y QQSHSFPLT (SEC ID Nº: 85).

Los anticuerpos alterados que reconocen TLR4, MD2 y/o el complejo TLR4/MD2 tienen la capacidad de inhibir la producción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS. Esta inhibición se consigue mediante un mecanismo de interacción entre la parte Fv del anticuerpo alterado que se une a su antígeno diana mientras que su parte Fc modificada interacciona con CD32A humano. La inhibición se determina, por ejemplo, en los ensayos de sangre completa humana y celulares de HEK 293 transfectadas con huTLR4/MD2 descritos en la presente memoria. El anticuerpo alterado es, por ejemplo, una versión modificada de los anticuerpos monoclonales denominados en la presente memoria “mu18H10”, “hu18H10”, “mu16G7”, “mu15C1”, “hu15C1”, “mu7E3” y “hu7E3”. Los anticuerpos mu18H10 y hu18H10 reconocen el complejo TLR4/MD-2, pero no reconocen una proteína MD-2 cuando no está en complejo con TLR4. Los anticuerpos monoclonales mu16G7, mu15C1, hu15C1, mu7E3 y hu7E3 reconocen el complejo TLR4/MD-2. mu15C1, hu15C1 y 16G7 también reconocen TLR4 cuando no está en complejo con MD-2.

También se incluyen en la divulgación anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos alterados de la divulgación se unen específicamente a un complejo TLR4/MD-2, en el que el anticuerpo se une a un epítopo que incluye uno o más restos de aminoácidos en TLR4 humano entre los restos 289 y 375 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 15. En otro ejemplo los anticuerpos alterados se unen específicamente al complejo TLR4/MD2, en los que el anticuerpo se une a un epítopo en MD-2 humano entre los restos 19 y 57 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 14B. Los expertos en la materia reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que un anticuerpo alterado de la invención determinando si el primero evita que el segundo se una a la diana (por ejemplo, TLR2, CD14, complejo TLR4/MD-2 o TLR4 cuando no está en complejo con MD-2). Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya compite con el anticuerpo alterado de la invención o divulgación, como se muestra por una reducción en la unión del anticuerpo alterado de la invención o divulgación, entonces los dos anticuerpos se unen al mismo epítopo, o uno estrechamente relacionado. Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo alterado de la invención o divulgación es preincubar el anticuerpo alterado de la invención o divulgación con la diana con la que normalmente es reactivo, y después añadir el anticuerpo monoclonal que se ensaya para determinar si el anticuerpo monoclonal que se ensaya se inhibe en su capacidad para unirse a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya se inhibe entonces, probablemente, tenga la misma especificidad epitópica, o una funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la invención o divulgación.

Pueden usarse diversos procedimientos conocidos dentro de la técnica para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra una diana dada, tales como, por ejemplo, un receptor de tipo toll, el complejo TLR4/MD-2, o TLR4 cuando no está en complejo con MD-2, TLR2, CD 14, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de los mismos. (Véase, por ejemplo , Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Los anticuerpos se purifican por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de afinidad usando proteína A o proteína G, que proporcionan principalmente la fracción IgG de suero inmunitario. Posteriormente, o como alternativa, el antígeno específico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o un epítopo del mismo, puede inmovilizarse en una columna para purificar el anticuerpo específico inmunitario por cromatografía de inmunoafinidad. Se analiza la purificación de inmunoglobulinas, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Filadelfia PA, Vol. 14, Nº 8 (17 de abril de 2000), pp. 25-28).

Preferentemente, los anticuerpos alterados de la divulgación son anticuerpos monoclonales. Se generan anticuerpos alterados, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c con combinaciones de transfectantes de células que expresan altos niveles de una diana dada en su superficie. Los hibridomas resultantes de fusiones de mieloma/linfocitos B se exploran después con respecto a reactividad a la diana seleccionada.

Se preparan anticuerpos monoclonales, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, típicamente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado con un agente inmunizador para inducir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente con el agente inmunizador. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante típicamente incluirá el antígeno proteico, un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice. Academic Press, (1986) pp. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Habitualmente, se

emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Son líneas celulares inmortalizadas preferidas las que se fusionan eficazmente, soportan expresión de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Más líneas inmortalizadas preferidas son líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Centro de Distribución Celular del Instituto Salk, San Diego, California y la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales (Véase Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede después ensayarse con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en este campo. La afinidad de unión de anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Además, en aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de unión por el antígeno diana.

Después de identificarse las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y cultivarse por métodos convencionales. (Véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice. Academic Press, (1986) pp. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo Medio de Eagle Modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como líquido ascítico en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o líquido ascítico por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

También pueden prepararse anticuerpos monoclonales por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la divulgación puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifiquen las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención actúan como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede situarse en vectores de expresión, que después se transfectan a células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo con la secuencia codificante dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (véase Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniendo covalentemente con la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no de inmunoglobulina. Dicho polipéptido de inmunoglobulina puede sustituir los dominios constantes de un anticuerpo de la divulgación, o puede sustituir los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo de la divulgación para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos monoclonales de la divulgación incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos son adecuados para administración a seres humanos sin generar una respuesta inmunitaria por el ser humano contra la inmunoglobulina administrada. Las formas humanizadas de anticuerpo son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que están comprendidas principalmente por la secuencia de una inmunoglobulina humana, y contienen secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Se realiza humanización, por ejemplo, siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo con CDR de roedores o secuencias de CDR las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (Véase también Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539). En algunos casos, los restos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también comprenden, por ejemplo, restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco conservadas importadas. En general, el anticuerpo humanizado incluye sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco

conservadas son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluye de forma óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)).

Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en las que la secuencia completa tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluyendo las CDR, surgen de genes humanos. Dichos anticuerpos se denominan “anticuerpos humanos” o “anticuerpos completamente humanos” en la presente memoria. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando la técnica del trioma; la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales (véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse y pueden producirse usando hibridomas humanos (véase Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con Virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole, et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan

R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Además, también pueden producirse anticuerpos humanos usando técnicas adicionales, incluyendo bibliotecas de presentación de fagos (Véase Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). De forma similar, pueden realizarse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Tras la presentación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente a la vista en seres humanos en todos sus aspectos, incluyendo la reordenación génica, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en Marks et al., Bio/Technology 10,779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368,812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14,826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intem. Rev. Immunol. 13 65-93(1995).

Pueden producirse anticuerpos humanos adicionalmente usando animales no humanos transgénicos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a exposición a un antígeno (véase publicación de PCT WO94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el hospedador no humano se han incapacitado, y los loci activos que codifican inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del hospedador. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humanos necesarios. Después se obtiene un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas como descendencia cruzando animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento completo de las modificaciones. Un ejemplo de uno de dichos animales no humanos es un ratón denominado el Xenomouse™ como se desvela en las publicaciones de PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce linfocitos B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos pueden obtenerse directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés, como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o como alternativa de linfocitos B inmortalizados derivados del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas Fv de cadena sencilla (scFv).

Un ejemplo de un método para producir un hospedador no humano, ejemplificado como un ratón, que carezca de expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina endógena se desvela en la Patente de Estados Unidos Nº

5.939.598. Puede obtenerse por un método, que incluye suprimir los genes del segmento J de al menos un locus de cadena pesada endógena en una célula madre embrionaria para evitar la reordenación del locus y para evitar la formación de un transcrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reordenado, efectuándose la deleción por un vector de dirección que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y producir a partir de la célula madre embrionaria un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.

Se desvela un método para producir un anticuerpo de interés, tal como un anticuerpo humano, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.916.771. Este método incluye introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada en una célula hospedadora de mamífero en cultivo, introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera en otra célula hospedadora de mamífero, y fusionar las dos células para formar una célula híbrida. La célula híbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.

En una mejora adicional de este procedimiento, se desvelan un método para identificar un epítopo clínicamente relevante en un inmunógeno, y un método correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une específicamente al epítopo relevante con alta afinidad, en la publicación de PCT WO 99/53049.

El anticuerpo puede expresarse por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.

Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola génica, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos tales como los descritos en el documento WO 93/64701, que tiene un resto de dirección (por ejemplo, un ligando con un receptor de superficie celular) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo polilisina), vector viral (por ejemplo un vector viral de ADN o ARN), proteínas de fusión tales como las descritas en el documento PCT/US 95/02140 (documento WO 95/22618) que es una proteína de fusión que contiene un resto diana (por ejemplo un anticuerpo específico para una célula diana) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo una protamina), plásmidos, fago, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.

Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de moloney. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores de orthopox o avipox, vectores de herpes virus tales como un vector del virus del herpes simple I (VHS) (véase Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90: 7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990)), Vectores Adenovirales (véase LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)) y Vectores de Virus Adenoasociados (véase Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)).

Los vectores virales de viruela introducen el gen en el citoplasma de las células. Los vectores de virus avipox dan como resultado solamente una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Los vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados y vectores de virus de herpes simple (VHS) se prefieren para introducir el ácido nucleico en células neurales. El vector de adenovirus da como resultado una expresión a más corto plazo (aproximadamente 2 meses) que el virus adenoasociado (aproximadamente 4 meses), que a su vez es más corto que los vectores de VHS. El vector particular seleccionado dependerá de la célula diana y la afección que se trate. La introducción puede ser por técnicas convencionales, por ejemplo, infección, transfección, transducción o transformación. Los ejemplos de modos de transferencia génica incluyen por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con CaPU4, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección celular y vectores virales.

El vector puede emplearse para dirigirse esencialmente a cualquier célula diana deseada. Por ejemplo, puede usarse inyección estereotáctica para dirigir los vectores (por ejemplo adenovirus, VHS) a una localización deseada. Adicionalmente, las partículas pueden suministrarse por infusión intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusión de minibomba, tal como un Sistema de Infusión SynchroMed. También se ha demostrado que un método basado en el flujo global, denominado convección, también es eficaz para suministrar moléculas grandes a áreas extensas del cerebro y puede ser útil en el suministro del vector a la célula diana (véase Bobo et al., Proa Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266: 292-305 (1994)). Otros métodos que pueden usarse incluyen catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y oral u otras vías conocidas de administración.

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para una diana tal como TLR4, MD2, complejo TLR4/MD2, TLR2, CD14 o cualquier receptor de tipo toll. La segunda diana de unión es cualquier otro antígeno, y provechosamente es una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Se conocen en la técnica métodos para realizar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature,

305: 537-539 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpos diferentes, de las que solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se consigue habitualmente por etapas de cromatografía de afinidad. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991).

Pueden fusionarse dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para unión de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210(1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede modificarse por ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfaz preferida incluye al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes con otras más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la producción del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab’ de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de “diacuerpo” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un domino variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, se obliga a los dominios VH y VL de un fragmento a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha indicado otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno proteico de la divulgación. Como alternativa, puede combinarse una rama anti antigénica de una molécula de inmunoglobulina con una rama que se una a una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores de Fe para IgG (Fc!R), tales como Fc!RI (CD64), Fc!RII (CD32) y Fc!RIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el antígeno particular. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen una rama de unión a antígeno y una rama que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno proteico descrito en la presente memoria y se une además al factor tisular (TF).

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente divulgación. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (véase Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980) y para el tratamiento de infección por VIH (véase documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los desvelados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la divulgación con respecto a la función efectora, para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con señalización de LPS aberrante. Por ejemplo, puede introducirse un resto o restos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular mediada por complemento aumentada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). (Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176: 11911195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Como alternativa, puede modificarse por ingeniería genética un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles y puede de este modo tener capacidades de lisis de complemento y ADCC potenciadas. (Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).

La divulgación también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal

o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos. Está disponible una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotóxico usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético marcado en el carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de un radionucleótido con el anticuerpo. (Véase documento WO94/11026).

Los expertos en la materia reconocerán que puede acoplarse una gran diversidad de restos posible con los anticuerpos resultantes de la invención y divulgación. (Véase, por ejemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nueva York, (1989).

Puede conseguirse acoplamiento por cualquier reacción química que una las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el otro resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace pude incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo unión covalente, unión de afinidad, intercalación, unión coordinada y formación de complejos. La unión preferida es, sin embargo, unión covalente. Puede conseguirse unión covalente bien por condensación directa de cadenas laterales existentes o bien por la incorporación de moléculas de enlace externo. Son útiles muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes en el acoplamiento de moléculas proteicas, tales como los anticuerpos de la presente divulgación, con otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilen diaminas. Esta numeración no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica sino, más bien, es ejemplar de los agentes de acoplamiento más comunes (Véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al., inmunological Reviews 62: 185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).

Se describen enlazadores preferidos en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res.

44: 201-208 (1984) que describe el uso de MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster). Véase también Patente de Estados Unidos Nº 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado con un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonilalfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat Nº 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. Nº 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. Nº 24510) conjugado con EDC.

Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo de este modo a conjugados con diferentes propiedades físico químicas. Por ejemplo, los sulfo-NHS ésteres de alquil carboxilatos son más estables que los sulfo-NHS ésteres de carboxilatos aromáticos. Los NHS-ésteres que contienen enlazadores son menos solubles que los sulfo-NHS ésteres. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro con impedimento estérico y puede formar conjugados con estabilidad aumentada. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro está escindido in vitro, dando como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tales como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimida por sí sola.

Los anticuerpos desvelados en la presente memoria también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proa Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y Patentes de Estados Unidos Nº 4.485.045 y 4.544.545. Se desvelan liposomas con tiempo de circulación potenciado en la Patente de Estados Unidos Nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas descritos en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro.

Uso de anticuerpos alterados

Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención y divulgación se administrará con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporen en formulaciones para proporcionar transferencia mejorada, suministro, tolerancia y similares. Pueden encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences (15ª ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhídridas, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2): 210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000), Fowell et al. “Compendium of excipiente for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) y las citas en las mismas para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.

Las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen un anticuerpo alterado de la divulgación se usan para tratar o aliviar un síntoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmunitario. La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o aliviar un síntoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmunitario. Se lleva a cabo un régimen terapéutico identificando un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que padece (o está en riesgo de desarrollar) un trastorno relacionado con el sistema inmunitario, usando métodos convencionales. Por ejemplo, los anticuerpos alterados de la invención y la divulgación son herramientas terapéuticas útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y/o trastornos inflamatorios. El uso de anticuerpos alterados que modulan, por ejemplo, inhiben, neutralizan o interfieren con, la señalización de TLR se contempla para tratar enfermedades autoinmunitarias y/o trastornos inflamatorios.

Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmunitario), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad del oído interno autoinmunitaria (AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, esprue celiacodermatitis herpetiforme; síndrome de disfunción inmunitaria de fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CEPD), penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fría, síndrome de Crest, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgiafibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Ménière, enfermedad del tejido conectivo mixta, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia (esclerosis sistémica progresiva (PSS), también conocida como esclerosis sistémica (SS)), síndrome de Sjögren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Los trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios crónicos y agudos. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen enfermedad de Alzheimer, asma, alergia atópica, alergia, aterosclerosis, asma bronquial, eccema, glomerulonefritis, enfermedad de injerto contra hospedador, anemias hemolíticas, osteoartritis, septicemia, ictus, trasplante de tejidos y órganos, vasculitis, retinopatía diabética y lesión pulmonar inducida por ventilador.

Por ejemplo, los anticuerpos alterados son útiles en el tratamiento de inflamación aguda y septicemia inducida por productos microbianos (por ejemplo, LPS) y empeoramientos que surgen de esta inflamación aguda, tales como, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma (véase O’Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003)). Dichos anticuerpos también son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias neurodegenerativas (Lehnardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8514-8519(2003)).

Además, los anticuerpos de la divulgación también son útiles como reactivos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo, osteoartritis, que están provocadas por tensión mecánica, que, a su vez, induce factores de “tensión” solubles endógenos que desencadenan TLR4. Los factores de tensión solubles endógenos incluyen por ejemplo, Hsp60 (véase Ohashi et al., J. Immunol. 164: 558-561 (2000)) y fibronectina (véase Okamura et al., J. Biol. Chem. 276: 10229-10233 (2001) y sulfato de heparina, hialuronano, gp96, )-Defensina-2 o

proteína tensioactiva A (véase por ejemplo, Johnson et al., Crit. Rev. Immunol., 23(1-2): 1 5-44 (2003)). Los anticuerpos de la divulgación también son útiles en el tratamiento de una diversidad de trastornos asociados con la tensión mecánica, tales como, por ejemplo, tensión mecánica que está asociada con sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación son útiles en el tratamiento de lesión pulmonar inducida por ventilador (“VILI”), también denominada lesión pulmonar asociada con ventilación (“VALI”).

Otras áreas de enfermedad en las que la inhibición de la función de TLR4 podría ser beneficiosa incluyen, por ejemplo, inflamación crónica (por ejemplo, inflamación crónica asociada con afecciones alérgicas y asma), enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, trastorno inflamatorio del intestino) y aterosclerosis (véase O’Neill, Curr. Opin. Pharmacol. 3: 396-403 (2003).

Los síntomas asociados con estos trastornos relacionados con el sistema inmunitario incluyen, por ejemplo, inflamación, fiebre, malestar general, fiebre, dolor, con frecuencia localizado en el área inflamada, rápida velocidad de las pulsaciones, dolor de las articulaciones (artralgia), respiración rápida u otros patrones de respiración anómalos, escalofríos, confusión, desorientación, agitación, mareo, tos, disnea, infecciones pulmonares, insuficiencia cardiaca, insuficiencia respiratoria, edema, aumento de peso, recaídas mucopurulentas, caquexia, sibilancias, cefalea y síntomas abdominales tales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento.

La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el trastorno relacionado con el sistema inmunitario particular. El alivio de uno o más síntomas del trastorno relacionado con el sistema inmunitario indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.

Los métodos para la exploración de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero sin limitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras técnicas mediadas de forma inmunológica conocidas dentro de este campo.

Los anticuerpos dirigidos contra una diana tal como TLR2, CD14, TLR4, MD2, el complejo TLR4/MD-2 o cualquier receptor de tipo toll (o un fragmento del mismo) pueden usarse en métodos conocidos dentro de la técnica relacionada con la localización y/o cuantificación de estas dianas, por ejemplo, para su uso en la medición de niveles de estas dianas dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en métodos de diagnóstico, para su uso en la formación de imágenes de la proteína y similares. Pueden utilizarse anticuerpos específicos de cualquiera de estas dianas, o derivados, fragmentos, análogos y homólogos de las mismas, que contienen el dominio de unión a antígeno derivado de anticuerpo, como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo en la presente memoria “productos terapéuticos”).

Puede usarse un anticuerpo alterado de la divulgación para aislar una diana particular usando técnicas convencionales, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Pueden usarse anticuerpos alterados de la invención (o un fragmento de los mismos) como diagnóstico para controlar los niveles de proteínas en el tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el acoplamiento (es decir, el enlace físico) del anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, )-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostáticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriacinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 1311, 35S o 3H.

Los anticuerpos de la invención y divulgación, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados y completamente humanos, pueden usarse como agentes terapéuticos. Dichos agentes se emplearán en general para tratar o prevenir una enfermedad o patología asociada con expresión o activación aberrante de una diana dada en un sujeto. Se administra una preparación de anticuerpo, preferentemente una que tenga alta especificidad y alta afinidad por su antígeno diana, al sujeto y generalmente tendrá un efecto debido a su unión con la diana. La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la función de señalización de la diana. La administración del anticuerpo puede anular, inhibir o interferir con la unión de la diana con un ligando endógeno al que se une de forma natural. Por ejemplo, el anticuerpo se une a la diana y neutraliza la producción de citocina proinflamatoria inducida por LPS.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo se refiere en general a la cantidad necesaria para conseguir un objetivo terapéutico. Como se ha observado anteriormente, esta puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento de la diana. La cantidad requerida para administrar dependerá además de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la velocidad a la que se agote un anticuerpo administrado del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención pueden ser, como ejemplo no limitante, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso

corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación habituales pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez a la semana.

Pueden administrarse anticuerpos o un fragmento de los mismos para el tratamiento de una diversidad de enfermedades y trastornos en forma de composiciones farmacéuticas. Se proporcionan principios y consideraciones implicados en la preparación de dichas composiciones, así como directrices en la elección de componentes, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19ª ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhome, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, Nueva York.

Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente con el dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas que conserven la capacidad para unirse a la secuencia proteica diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante (véase por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trate, preferentemente los que tengan actividades complementarias que no se afecten de forma adversa entre sí. Como alternativa, o además, la composición puede comprender un agente que potencie su función, tal como, por ejemplo un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.

Los principio activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro farmacológico coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.

Las formulaciones para usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido Lglutámico y ! etil-L-glutamato, etilenvinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etilenvinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

Puede usarse un anticuerpo de acuerdo con la divulgación como un agente para detectar la presencia de una diana dada (o un fragmento proteico de la misma) en una muestra. El anticuerpo puede contener un marcador detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv o F(ab)2). Se pretende que el término “marcado”, con respecto a la sonda o anticuerpo, abarque el marcaje directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable con la sonda o anticuerpo, así como marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y marcaje terminal de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. Se entiende que la expresión “muestra biológica” incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Se incluyen dentro del uso de la expresión “muestra biológica”, por lo tanto, la sangre y una fracción o componente de la sangre incluyendo suero de sangre, plasma de sangre o linfa. Es decir, el método de detección de la divulgación puede usarse para detectar un analito de ARNm, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detección de un analito de ARNm incluyen hibridaciones de Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para detección de un analito de proteína incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detección de un analito de ADN genómico incluyen hibridaciones de Southern. Se describen procedimientos para realizar inmunoensayos, por ejemplo, en “ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, 1985. Además, las técnicas in vivo para detección de un analito de proteína incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti analito de proteína marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto pueda detectarse por técnicas de formación de imágenes convencionales.

Composiciones farmacéuticas de la divulgación

Los anticuerpos o polipéptidos quiméricos solubles de la divulgación (también denominados en la presente memoria “compuestos activos”), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Dichas composiciones típicamente comprenden el anticuerpo o polipéptido quimérico soluble y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, se pretende que la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se describen vehículos adecuados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en el campo. Los ejemplos preferidos de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano 5 %. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía pretendida de administración. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL∗ (BASF, Parsippany, N. J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede conseguirse prevención de la acción de los microorganismos por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. Puede conseguirse absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtrado. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, son métodos de preparación el secado al vacío y la liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. También pueden prepararse composiciones orales usando un vehículo fluido para su uso como un colutorio, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se usa como enjuague y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes de unión y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saporífero tal como menta, metilsalicilato

o saporífero de naranja.

Para administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol de un recipiente presurizado o dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medio transmucoso o transdérmico. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera para permear en la formulación. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede conseguirse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenvinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para preparación de dichas formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº

4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto para tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación se dictan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular para conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de preparar un compuesto activo tal para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para su administración.

La invención y divulgación se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales

Los siguientes estudios describen el uso de anticuerpos que reconocen un epítopo en TLR4, MD2 y/o el complejo TLR4/MD2. Los anticuerpos usados en los estudios presentados en la presente memoria se generaron usando los métodos descritos en las solicitudes de Estados Unidos relacionadas 11/009939, presentada el 10 de diciembre de 2004 y 11/151916, presentada el 15 de junio de 2004 y en el documento WO 05/065015, presentado el 10 de diciembre de 2004 y el documento PCT/US2005/020930, presentado el 15 de junio de 2004.

Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de las regiones variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VL) de los anticuerpos anti-TLR4/MD2 se muestran a continuación. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se definen por Chothia et al. 1989, E. A. Kabat et al., 1991 se destacan en texto subrayado y en cursiva a continuación (véase Chothia, C, et al., Nature 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Quinta Edición, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).

Secuencia de nucleótidos de VH de 18H10

Secuencia proteica de VH de 18H10

Secuencias proteicas de CDR de VH de 18H10

Secuencia de nucleótidos de VL de 18H10

Secuencia proteica de VL de 18H10

Secuencias proteicas de CDR de VL de 18H10

Secuencia de nucleótidos de VH de 16G7

Secuencia proteica de VH de 16G7

Secuencias proteicas de CDR de VH de 16G7

Secuencia de nucleótidos de VL de 16G7

Secuencia proteica de VL de 16G7

Secuencias proteicas de CDR de VL de 16G7

Secuencia de nucleótidos de VH de 15C1

Secuencia proteica de VH de 15C1

Secuencias proteicas de CDR de VH de 15C1

Secuencia de nucleótidos de VL de 15C1

Secuencia proteica de VL de 15C1

Secuencias proteicas de CDR de VL de 15C1

Secuencia de nucleótidos de VH de 7E3 Secuencia proteica de VH de 7E3

Secuencias proteicas de CDR de VH de 7E3

Secuencia de nucleótidos de VL de 7E3

Secuencia proteica de VL de 7E3

Secuencias proteicas de CDR de VL de 7E3

Se analizó la capacidad de cada anticuerpo monoclonal para neutralizar la inducción de IL-8 inducida por LPS en células transfectadas con TLR4/MD2 preincubando las células transfectadas con cada anticuerpo monoclonal durante 30 minutos antes de la administración de LPS. Además, cada anticuerpo monoclonal se ensayó con respecto a la capacidad para neutralizar la inducción de IL-8 inducida por LPS en sangre completa.

15 Se ensayó la especificidad de cada anticuerpo monoclonal evaluando la unión de cada anticuerpo monoclonal con células transfectadas con las siguientes combinaciones: (1) TLR4 humano y MD-2 humano; (2) TLR4 de conejo y MD-2 de conejo; (3) TLR4 humano y MD-2 de conejo; (4) TLR4 de conejo y MD-2 humano.

Ejemplo 2: humanización de anticuerpos monoclonales murinos

Los siguientes estudios describen la humanización de anticuerpos que reconocen un epítopo en TLR4, MD2 y/o el

20 complejo de TLR4/MD2. Los anticuerpos se humanizaron usando los métodos descritos en la solicitud de Estados Unidos relacionada 11/151916, presentada el 15 de junio de 2004 (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº US 2008-0050366 A1) y en el documento PCT/IB2005/004206, presentado el 15 de junio de 2004 (Publicación de PCT Nº WO 07/110678).

Los anticuerpos hu15C1 incluyen la cadena pesada variable (VH) 4-28 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 45 o

25 la VH 3-66 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 46. Los anticuerpos hu15C1 incluyen la cadena ligera variable (VL) L6 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 47 o A26 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 48. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se definen por Chothia et al. 1989, E. A. Kabat et al., 1991 están encuadradas en las secuencias proporcionadas a continuación. (Véase Chothia, C, et al., Natura 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest,

30 Quinta Edición, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).

VH 15C1 Hu versión 4-28

En la que X1 es Thr o Ser En la que X2 es lle o Met En la que X3 es Val o Ile En la que X4 es Met o Ile

VH 15C1 Hu versión 3-66

En la que X1 es Ala o Val 10 En la que X2 es Val o Met En la que X3 es Leu o Phe

VL 15C1 Hu versión L66

En la que X1 es Lys o Tyr 15 VL 15C1 Hu versión A26

Los anticuerpos hu18h10 incluyen la VH 1-69 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 49. Los anticuerpos hu18h10 incluyen la VL L6 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 50. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se definen en Chothia et al. 1989, E. A. Kabat et al., 1991 están

20 encuadradas en las secuencias proporcionadas posteriormente. (Véase Chothia, C, et al., Natura 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Quinta Edición, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).

VH 18H10 Hu versión 1-69

En la que X1 es Met o Ile En la que X2 es Lys o Thr En la que X3 es Met o Leu

VL 18H10 Hu versión L6

En la que X1 es Phe o Tyr

Los anticuerpos hu7E3 incluyen la VH 2-70 mostrada posteriormente en SEC ID Nº: 51 o la VH 3-66 mostrada 10 posteriormente en SEC ID Nº: 52. Los anticuerpos hu7E3 incluyen la VL L19 mostrada posteriormente en SEC ID Nº:

53. Los aminoácidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se definen por Chothia et al. 1989, E. A. Kabat et al., 1991 están encuadradas en las secuencias proporcionadas a continuación. (Véase Chothia, C, et al., Natura 342: 877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Quinta Edición, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).

15 VH 7E3 Hu versión 2-70

En la que X1 es Ser o Thr En la que X2 es Ile o Phe En la que X3 es Ile o Ala

20 VH 7E3 Hu versión 3-66

En la que X1 es Phe o Ala En la que X2 es Val o Leu En la queX3 es Ile o Phe

En la queX4 es Lys o Arg En la que X5 es Leu o Val En la queX6 es Ile o Ala

VL 7E3 Hu versión L19

En la que X1 es Phe o Tyr En la que X2 es Tyr o Phe

Los anticuerpos quiméricos descritos anteriormente en el Ejemplo 1 se usaron para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados para unirse con el complejo TLR4/MD2 humano. Se descubrió que cada uno de los anticuerpos monoclonales humanizados se unían a TLR4/MD2 de una manera similar al anticuerpo quimérico correspondiente. Además, los anticuerpos quiméricos se usaron para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados para inhibir la producción de IL-6 inducida por LPS en sangre completa humana. Se descubrió que cada uno de los anticuerpos monoclonales humanizados inhibía los efectos de LPS en los leucocitos de la sangre de una manera similar al anticuerpo quimérico correspondiente.

Ejemplo 3: aumentar la potencia de anticuerpos monoclonales modificados

Los estudios descritos en la presente memoria se refieren a métodos para aumentar la potencia de anticuerpos neutralizadores modificando uno o más restos en la parte Fc de un anticuerpo. En particular, los estudios descritos en la presente memoria usan un anticuerpo neutralizador alterado que reconoce el complejo TLR4/MD2. Estos anticuerpos anti-TLR4/MD2 se modifican para incluir una o más mutaciones en la parte Fc, específicamente en el dominio CH2 de la parte Fc.

El anticuerpo monoclonal anti TLR4/MD2 humano IgG1/K murino analizado anteriormente y denominado en la presente memoria “mu15C1” se modificó reemplazando las regiones constantes de ratón de mu15C1 con las de un IgG1 humano para producir un anticuerpo quimérico, denominado en la presente memoria “IgG1 15C1 quimérico” (Figura 1A). La afinidad de unión relativa de los mAb correspondientes permaneció sin cambios.

La capacidad del anticuerpo IgG1 15C1 quimérico para neutralizar los efectos de LPS se evaluó usando la línea celular transfectada con TLR4/MD-2. Las células HEK 293 se sembraron en placas de 96 pocillos a 6 x 104 células/pocillo. El medio se retiró el día del experimento y se añadieron 30 ∃l de medio que contenía plasma humano inactivado por calor al 6 %. Se diluyeron mAb IgG1 15C1 de ratón (cuadrado) o IgG1 15C1 quimérico (triángulo) en 30 ∃l de medio basal hasta la concentración apropiada, y se añadieron a las células durante 1 hora a 37 ºC. Se diluyó LPS en 30 ∃l de medio, se añadió a las células y se dejó incubar durante 24 horas a 37 ºC. La secreción de IL-8 en el sobrenadante de cultivo se controló por ELISA (Endogen).

El anticuerpo quimérico pudo neutralizar los efectos de LPS en la línea celular transfectada con TLR4/MD-2 HEK 293 (como se mide por producción de IL-8). La Figura 1B muestra que 15C1 en una cadena principal de IgG de ratón (denominado IgG1 15C1 de ratón; véase descripción esquemática en la Figura 1A) y 15C1 en una cadena principal de IgG1 humano (denominado IgG1 15C1 quimérico; véase descripción esquemática en la Figura 1A) son equivalentes en su capacidad de neutralización en esta línea celular.

También se evaluó la capacidad del anticuerpo quimérico para neutralizar los efectos de LPS en sangre humana completa. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 de ratón y quimérico a la sangre y se incubaron durante una hora a 37 ºC. Las células sanguíneas se estimularon después añadiendo 30 ∃l de LPS K12 de E. coli (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. La producción de IL-6 se midió después por ELISA.

En el ensayo de sangre completa humana, se vio un perfil diferente para los anticuerpos murinos y quiméricos. La Figura 2 muestra que IgG1 15C1 de ratón era significativamente más potente en su capacidad para neutralizar LPS que IgG1 15C1 quimérico (como se midió por producción de IL-6). Esta observación fue más sorprendente cuanto menor era la concentración de mAb usado en el ensayo. Se concluyó que esta diferencia debía atribuirse a la región Fc de la molécula, ya que la afinidad de unión de los dos mAb (que implicaban típicamente la región Fab) era equivalente.

Además, se creía que esta diferencia estaba mediada por un mecanismo dependiente de receptor de Fc. En células HEK 293 (Figura 1B) negativas para expresión de receptores Fc gamma, los dos mAb, 15C1 quimérico y murino, eran igualmente potentes mientras que en un ensayo de sangre completa humana ex vivo, en el que los leucocitos eran positivos para expresión de receptores Fc gamma, se vio una clara diferencia entre ellos.

Para demostrar adicionalmente la implicación de la interacción entre la parte Fc de mAb y receptores Fc! en una respuesta inhibidora potencial, se obtuvo por ingeniería genética una modificación de IgG1 15C1 de ratón para alterar la capacidad del anticuerpo para interaccionar con receptores Fc! celulares conservando a la vez su afinidad por su antígeno afín TLR4/MD2. La mutación de Asp a Ala en la posición del resto de aminoácido EU 265 (D265A) se introdujo en el gen de cadena pesada gamma de IgG1 15C1 de ratón, y esta secuencia mutada se expresó junto con la cadena kappa de ratón de 15C1 en células PEAK para producir anticuerpos mutantes (D265A). En paralelo se expresaron conjuntamente cadenas pesadas y ligeras de 15C1 de tipo silvestre recombinantes en células PEAK para producir IgG1 15C1 de ratón recombinante. Se ha mostrado que la mutación D265A, cuando se introduce por ingeniería genética en un isotipo de IgG1 de ratón (IgG1-D265A), hibrida la unión de complejos inmunitarios que contienen IgG1-D265A con receptores Fc gamma de ratón IIB (Fc!RIIB), III (Fc!III) y IV (F!RIV) (Nimmerjahn et al., Immunity, 2005,23: 41-51) así como anula (Fc!RI) o reduce en gran medida su unión con todos los receptores Fc gamma humanos (Fc!RIIA, Fc!RIIB y Fc!RIII).(ShieIds et al., JBC, 2001; 276: 6591-6604).

La capacidad de neutralización de los anticuerpos IgG1 15C1 de ratón recombinante e IgG1-D265A 15C1 de ratón recombinante se evaluó en el ensayo de sangre completa humana. En particular, se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 de ratón recombinante (IgG1 15C1 de ratón rec) e IgG1 15C1 de ratón recombinante que contenía la mutación Asp a Ala en la posición EU 265 (15C1 D265A de ratón rec) a la sangre y se incubaron durante una hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenían HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubó durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un experimento de sangre completa humana (Figura 3) D265A IgG1 de ratón recombinante (IgG1 15C1 D265A de ratón rec) fue significativamente menos potente en la inhibición de los efectos de LPS (como se midió por la producción de IL-6) que IgG1 15C1 WT IgG1 de ratón recombinante (IgG1 15C1 de ratón rec). Este resultado confirmó la hipótesis de que la unión de la parte Fc de IgG1 de ratón con receptores Fc! humanos contribuye a la potencia de 15C1 para neutralizar la estimulación proinflamatoria de LPS.

Se ha descrito en la bibliografía que IgG1 de ratón tiene una alta afinidad por el Fc!RII humano o CD32. De hecho, esta alta afinidad de IgG1 de ratón por CD32 humano hizo posible el descubrimiento de este receptor. Se planteó la hipótesis, por lo tanto, de que CD32 sería el receptor diana clave para el Fc de IgG1 de ratón en leucocitos humanos. Para verificar esta posibilidad, se realizó un ensayo de sangre completa humana usando dos anticuerpos anti CD32 humano diferentes (AT10 que reconoce igualmente bien CD32A y CD32B; y IV.3 que se une a CD32A y débilmente a CD32B) para evitar la unión del Fc de IgG1 de ratón con este receptor. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 de ratón con o sin anticuerpo monoclonal anti CD32 humano de ratón (Clon AT10, IgG1 de ratón, número de Catálogo MCA1075XZ, AbD Serotec, clon IV.3, IgG2b, número de Catálogo 01470, StemCell Technologies) a la sangre y se incubaron durante una hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI1640 que contenían HSA a 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana se demostró (Figura 4A) que los anticuerpos anti CD32 humano tanto AT10 como IV.3 reducen la potencia de IgG1 15C1 de ratón a un nivel similar al visto con IgG1 15C1 quimérico. El hecho de que IV.3 se une fuertemente a CD32A, reconoce ambas formas fenotípicas de Fc!RIIA igualmente bien y débilmente con CD32B, apunta a la implicación de CD32A humano en lugar de CD32B.

CD32A contiene un polimorfismo (histidina o arginina) en su dominio extracelular en el aminoácido 131. La naturaleza de este polimorfismo tiene influencia en la unión de IgG1 de ratón con CD32A, teniendo los individuos homocigotos para arginina una afinidad mucho mayor para IgG1 de ratón que los homocigotos de histidina. Los heterocigotos de arginina/histidina tienen una afinidad intermedia (Dijstelbloem, H. M. et al., 2001. Trends Immunol.

22: 510-516). Los individuos sanos se exploraron con respecto a su genotipo de CD32A en este polimorfismo y se ensayó el bloqueo mediado por 15C1 de la activación de TLR4 dependiente de LPS en sangre completa derivada de individuos homocigotos y heterocigotos. Para este experimento, se produjo 15C1 en células PEAK en su forma original (es decir en una cadena principal de IgG1 de ratón) o como un mAb quimérico con la región variable de 15C1 en una cadena principal de IgG4 humana. Se eligió este formato ya que se sabe que IgG4 humano tiene una afinidad muy escasa por CD32. Después de purificación de cromatografía de afinidad de proteína A, se confirmó la integridad de ambos mAb para unión de TLR4/MD-2 en células CHO transfectadas y se mostró que era equivalente. En experimentos de activación de LPS de sangre completa, la versión mIgG1 de 15C1 era considerablemente más

potente en la inhibición de TLR4 que la versión hIgG4 cuando se ensayaron donadores Arg/Arg y Arg/His. Por el contrario, mlgG1 15C1 era solamente ligeramente más potente que hIgG4 15C1 en donadores His/His (Figura 4B). Se muestran los valores de CI50 obtenidos para cada curva de respuesta a dosis en la tabla 3. Estos valores destacan las diferencias de potencia entre las construcciones de 15C1 mIgG1 y hIgG4 para los diferentes donadores de genotipo CD32 diferentes. La construcción de mIgG1 muestra una pérdida dramática de potencia de los donadores Arg/Arg a los His/His (+35 veces), mientras que la construcción de hIgG4 muestra una pérdida marginal de potencia (+3 veces). Estos resultados refuerzan la contribución de CD32A a las actividades inhibidoras del mAb 15C1 en la señalización de TLR4.

Se obtuvieron resultados idénticos en sangre completa humana de los mismos donadores usando E. coli inactivada por calor como un estímulo (106 ufc/ml).

Se diseñaron después estudios para determinar la región crítica dentro de la región Fc de un anticuerpo IgG1 de ratón que es suficiente para mantener la contribución biológica de la región Fc completa. Se sabe en la bibliografía que los dominios tanto CH2 como CH3 de la región Fc pueden contribuir directamente a la interacción con receptores de Fc!. En una primera etapa para la identificación de la región crítica que contribuye a este efecto inhibidor, se diseñaron estudios para centrarse en la importancia del dominio CH2 (posiciones EU 231 a 340, véase alineamiento de los dominios CH2 en la Figura 16) puesto que su papel en la interacción del Fc con receptores Fc! está bien documentado. El dominio CH2 de IgG1 humano se reemplazó con el de IgG1 de ratón (denominado posteriormente IgG1 15C1 quimérico para muCH2; véase Figura 5A) y de forma recíproca el dominio CH2 de IgG1 de ratón se reemplazó con el de IgG1 humano (denominado posteriormente IgG1 15C1 de ratón-huCH2; véase Figura 5A). Los anticuerpos se produjeron en células PEAK y se purificaron de sobrenadantes celulares transfectados por cromatografía en columna de afinidad de proteína G. Se observó unión equivalente con transfectantes CHO de TLR4/MD2 por FACS lo que indica que el cambio de dominio CH2 no tuvo influencia significativa en la afinidad relativa por el antígeno. La capacidad neutralizadora de 15C1 murino, IgG1 15C1 de ratón-huCH2, IgG1 15C1 quimérico e IgG1 15C1 quimérico-muCH2 se evaluó en el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 de ratón, IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 de ratón que contenía CH2 humano e IgG1 15C1 quimérico que contenía CH2 de ratón a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. La producción de IL-6 se midió después por ELISA.

En el ensayo de sangre completa humana, se descubrió que la versión recombinante que contenía el domino CH2 de ratón tenía una actividad inhibidora similar a la del IgG1 15C1 IgC1 completamente de ratón. Por otro lado, la versión recombinante que contenía el CH2 humano no era tan potente como el IgG1 15C1 IgG1 completamente de ratón, sino que tenía una actividad reducida a la del IgG1 15C1 quimérico (Figura 5B). A partir de estos datos, se concluyó que la contribución inhibidora mediada por Fc se restringe al dominio CH2 de la cadena pesada de IgG1 de ratón.

Después se diseñaron estudios para evaluar qué restos del domino CH2 de ratón son necesarios para actividad inhibidora mediada por Fc. Comenzando con el IgG1 15C1 quimérico que contiene el dominio CH2 de ratón de longitud completa, el enfoque era identificar la región crítica del domino CH2 introduciendo un número máximo de restos humanos sin observar una pérdida de la actividad inhibidora mediada por Fc. La identificación de estos restos críticos se determinó subdividiendo el CH2 de ratón en 4 partes (A: posiciones EU 231 a 261; B: posiciones EU 319 a 340; C: posiciones EU 296-318 y D: posiciones EU 262 a 295) e introduciendo para cada una de las 4 subregiones la secuencia de aminoácidos de CH2 correspondiente de un IgG1 humano (véase Figura 6A). La subdivisión del CH2 de ratón en cuatro subregiones se basó puramente en la homología de secuencia de aminoácidos con el CH2 humano. Los cuatro mutantes de cadena pesada se modificaron por ingeniería genética por PCR solapante y los mAb recombinantes se expresaron en PEAK. Los anticuerpos correspondientes se purificaron a partir de sobrenadantes celulares transfectados por cromatografía en columna de afinidad de proteína G y se determinó la unión con la línea celular estable CHO que expresaba el complejo TLR4-MD2 humano en su superficie de los siguientes anticuerpos: IgG1 15C1 quimérico-muCH2; IgG1 15C1 quimérico; IgG1 15C1 quimérico CH2 231-261 mu A; IgG1 15C1 quimérico CH2 319-340 mu B; IgG1 15C1 quimérico CH2 296-318 mu C; e IgG1 15C1 quimérico CH2 262-295 mu D. Se incubaron 4 x 105 células/pocillo durante 30 minutos a 4 ºC en 50 ∃l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con albúmina de suero bovino al 1 % (PBS-BSA 1 %) y dilución en serie del anticuerpo apropiado

o un control de isotipo de IgG1 humano irrelevante. Las células se lavaron una vez con PBS-BSA 1 % y se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo de cadena ligera Kappa antihumano de cabra conjugado con FMAT-Blue® (dilución 1:250, Sigma K3502) durante 30 minutos a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA 1 % y se analizaron usando un citómetro de flujo FACScalibur® (Applied Biosystems) en el canal de FL-4.

La unión equivalente con TLR4/MD2 se demostró por análisis de FACS (véase Figura 6B). La capacidad neutralizadora de estos anticuerpos se evaluó después usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron

30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de mAb mutantes IgG1 15C1 quiméricos que contenían diferentes subregiones de CH2 de ratón a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana (Figura 6C), se descubrió que la actividad inhibidora del anticuerpo que contenía el domino CH2 de ratón se reducía drásticamente cuando se introducían los restos de aminoácidos de IgG1 humano en las posiciones EU 319 a 340 (mutante B). Se concluyó a partir de este conjunto de mutantes que la actividad inhibidora dentro del dominio CH2 de ratón se restringe predominantemente a la secuencia de aminoácidos que contiene los restos de IgG1 de ratón en las posiciones EU 319 a 340.

Después se diseñaron estudios para determinar el efecto de injertar restos de aminoácidos de CH2 IgG1 de ratón en las posiciones 319 a 340 en el dominio CH2 humano del anticuerpo quimérico IgG1 15C1. Los restos en las posiciones EU 319 a 340 del CH2 de IgG1 de ratón se introdujeron dentro del CH2 del IgG1 15C1 quimérico por PCR solapante (véase Figura 7A). El mAb mutante se expresó en células PEAK y se purificó a partir de sobrenadantes de células transfectadas por cromatografía en columna de afinidad de proteína G. La capacidad neutralizadora de los anticuerpos IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 quimérico muCH2 e IgG1 15C1 quimérico mu391-340 se evaluó usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 quimérico e IgG1 15C1 quimérico que contenían CH2 de ratón de longitud completa o restos 319 a 340 de CH2 de ratón (numeración EU) a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenían HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana (Figura 7B), se aumentó la actividad inhibidora del anticuerpo que contenía los restos de aminoácido de CH2 de ratón en las posiciones EU 319 a 340 a un nivel similar al de anticuerpos 15C1 que contenían el domino CH2 de ratón de longitud completa. Se concluyó que el injerto en el CH2 humano de un tramo de 22 restos de aminoácidos de IgG1 de ratón (posiciones EU 319 a 340) era suficiente para recuperar la actividad inhibidora completa a un nivel equivalente al visto con el IgG1 15C1 de ratón completo.

Después se diseñaron estudios para determinar el número mínimo de restos dentro del domino CH2, posiciones EU 319 a 340, de IgG1 de ratón que son necesarios y suficientes para mantener la actividad inhibidora global del Fc de IgG1 de ratón. A partir del alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos en las posiciones 319 a 340 entre el IgG1 de ratón y humano, se vieron 7 diferencias (numeradas de 1 a 7 en la Figura 8A). Para determinar entre estos 7 restos los que son críticos para mantener la actividad biológica, se examinó el efecto de intercambiar los restos de IgG1 de ratón con los de IgG1 humano. Para este fin, comenzando a partir del IgG1 15C1 quimérico que contenía la posición EU 319 a 340 de la región CH2 de ratón, se obtuvo por ingeniería genética un conjunto de 5 mutantes usando el protocolo de mutagénesis QuickChange de Stratagene (mutantes A a E en la Figura 8B). Los 5 mutantes mAb se expresaron en PEAK y se purificaron a partir de sobrenadantes de células transfectadas por cromatografía en columna de afinidad de proteína G.

La capacidad neutralizadora de los 5 mAb mutantes se evaluó en el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 quimérico que contenía restos de aminoácidos CH2 de ratón en las posiciones EU 319 a 340 y mutantes A a E a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana (Figura 8C) los mutantes D y E mostraron la misma actividad inhibidora que IgG1 15C1 quimérico mientras que los mutantes A, B y C mostraron una actividad inhibidora al menos tan buena como la de IgG1 15C1 quimérico que contenía las posiciones EU 319 a 340 de región CH2 de ratón. Se concluyó a partir de los resultados del ensayo de sangre completa humana y el análisis de las secuencias de aminoácidos de los 5 mutantes que, por un lado, la introducción de los 4 restos de aminoácidos humanos; Y1 (posición EU 319), K2 (posición EU 322), S3 (posición EU 324) y A7 (posición EU 339) (véase Figura 8B) no tenían efectos deletéreos en la actividad inhibidora de los anticuerpos correspondientes, pero por otro lado la introducción de los dos restos de aminoácidos humanos N4 (posición EU 325) y L6 (posición EU 326) tuvieron un efecto negativo con la pérdida del efecto inhibidor debido a la parte Fc. En general, se concluyó que de los 7 restos de ratón potencialmente responsables del efecto inhibidor del Fc de IgG1 de ratón, solamente tres; Ser 4 (posición EU 325), Ala 5 (posición EU 326) y Phe 6 (posición EU 328); parecían ser críticos para la actividad inhibidora global del Fc de IgG1 de ratón.

Se diseñaron después estudios para determinar el número mínimo de restos de ratón que cuando se injertan en el domino CH2 humano del anticuerpo IgG1 15C1 quimérico en las posiciones EU correspondientes, recuperarían la

potencia inhibidora del anticuerpo IgG1 15C1 de ratón nativo. Habiendo identificado dentro del dominio CH2 de IgG1 de ratón, tres restos de aminoácidos, Ser 326, Ala 327 y Phe 329 (numeración EU) como responsables de la actividad inhibidora global de IgG1 15C1 de ratón, se diseñó un nuevo conjunto de mutantes para introducir dentro del IgG1 quimérico las seis posibles combinaciones combinatorias entre secuencias humanas y de ratón en estas tres posiciones EU. Las secuencias de los nuevos mutantes, F, G y H, junto con las secuencias de los mutantes C, D y E (previamente descritos en la Figura 8B) se muestran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de los 6 mutantes (C a H) en las posiciones EU 325 a 328 dentro del dominio CH2 de IgG1 15C1 quimérico. Los restos humanos están en negrita.

restos de aminoácidos en las posiciones EU 325 a 328

NKAL

NKAF

NAAL

SAAL

NAAF

SKAF

SAAF

SAAF

Los 3 mutantes se modificaron por ingeniería genética usando el protocolo de mutagénesis Quick Change de Stratagene, se expresaron en células PEAK y se purificaron de sobrenadantes de células transfectadas por cromatografía en columna de afinidad de proteína G.

La afinidad de unión relativa de estos anticuerpos mutantes se determinó usando una línea celular estable CHO que expresaba TLR4/MD2 humano en la superficie celular. Se incubaron 4 x 105 células/pocillo durante 30 minutos a 4 ºC en 50 ∃l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con albúmina de suero bovino 1 % (PBS-BSA 1 %) y dilución en serie del anticuerpo apropiado o un control de isotipo de IgG1 humano irrelevante. Las células se lavaron una vez con PBS-BSA 1 % y se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo de cadena ligera Kappa anti humano de cabra conjugado con FMAT-Blue, (dilución 1:250, Sigma K3502) durante 30 minutos a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA 1 % y se analizaron usando un citómetro de flujo FACScalibur, (Applied Biosystems) en el canal FL-4.

La capacidad neutralizadora de estos anticuerpos mutados también se evaluó usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 quimérico que contenía CH2 de ratón y mutantes C, F y H a la sangre y se incubaron durante una hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL6 por ELISA.

Mediante análisis de FACS se mostró que todos los mutantes tenían una afinidad relativa similar por el complejo TLR4/MD2 expresado en células CHO (véase Figura 9A). En un ensayo de sangre completa humana (Figura 9B), los mutantes C y F mostraron una actividad inhibidora mejor que la de IgG1 15C1 quimérico que contenía el CH2 de ratón, siendo el mutante C el más potente de los dos. El mutante H era más potente que el IgG1 15C1 quimérico pero menos potente que IgG1 15C1 quimérico que contenía el CH2 de ratón. El mutante D, E y G tenía una actividad inhibidora similar pero no mejor que la del IgG1 15C1 quimérico.

En conclusión, se han identificado dos mutantes dentro del dominio CH2 de IgG1 15C1 quimérico que tienen una actividad inhibidora al menos tan buena como la del IgG1 15C1 de ratón nativo. Estos dos mutantes, C y F, tienen respectivamente 3 y 2 restos de aminoácidos mutados al resto de ratón correspondiente de un domino CH2 de IgG1 en la misma posición EU. El mutante C que parece tener la actividad inhibidora más fuerte de los dos mutantes tiene los siguientes tres restos de ratón Ser, Ala y Phe en las posiciones EU 325, 326 y 328, respectivamente. El mutante F consiste en las mismas mutaciones pero solamente en las posiciones EU 325 y 328.

Después se diseñaron estudios para evaluar si los resultados obtenidos con IgG1 15C1 quimérico también eran válidos para la versión humanizada de 15C1. La versión humanizada de mAb 15C1 de ratón, que consistía en la versión de cadena pesada 4-28 (15C1 Hu VH versión 4-28) emparejada con la versión de cadena ligera A26 (15C1 Hu VL versión A26) se ha construido mediante injerto de CDR como se describe en la presente memoria y en la solicitud de Patente Internacional Nº PCT/IB2005/004174. Se mostró previamente por análisis de FACS que esta versión humanizada, denominada posteriormente IgG1 15C1 humanizada, tenía una afinidad relativa por el complejo TLR4/MD2 expresado en la superficie de células CHO similar a la del IgG1 15C1 quimérico.

En un primer conjunto de experimentos la actividad inhibidora del IgG1 15C1 quimérico que contiene el CH2 de ratón (muCH2 quim 15C1) se comparó con la del IgG1 15C1 humanizado con el CH2 (muCH2 hum 15C1). Estos mAb se expresaron en células PEAK y se purificaron a partir de sobrenadantes de células transfectadas por cromatografía en columna de afinidad de proteína G. Se demostró una unión equivalente con CHO que expresaban TLR4/MD2 por análisis de FACS.

La capacidad neutralizadora del anticuerpo 15C1 humanizado muCH2 se evaluó usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 de ratón, IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 de ratón que contenía CH2 de ratón e IgG1 15C1 humanizado que contenía CH2 de ratón a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana (Figura 10), se descubrió que las versiones tanto quiméricas como humanizadas que contenían el dominio CH2 de ratón tenían una actividad inhibidora similar a la del IgG1 15C1 de ratón y que esta actividad era mayor que la vista con IgG1 15C1 quimérico. Se concluyó a partir de estos resultados que como se ha visto previamente para el IgG1 15C1 quimérico, la actividad inhibidora del mAb IgG1 15C1 humanizado puede aumentarse hasta un nivel similar al del IgG1 15C1 de ratón nativo por la introducción del domino CH2 de ratón en su parte Fc.

De forma similar al trabajo realizado con IgG1 15C1 quimérico, se construyó un conjunto de 6 mutantes C a H (véase Tabla 1) basándose en el uso del resto de aminoácido humano o de ratón en las posiciones EU 325, 326 y 328 dentro del domino CH2. Los anticuerpos correspondientes se purificaron a partir de sobrenadantes de células transfectadas mediante cromatografía en columna de afinidad de proteína G. La afinidad de unión de estos anticuerpos mutantes se determinó usando una línea celular estable CHO que expresaba TLR4/MD2 humano en la superficie celular. Se incubaron 4 x 105 células/pocillo durante 30 minutos a 4 ºC en 50 ∃l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con albúmina de suero bovino 1 % (PBS-BSA 1 %) y dilución en serie del anticuerpo apropiado o un control de isotipo de IgG1 humano irrelevante. Las células se lavaron una vez con PBS-BSA 1 % y se incubaron en el mismo tampón con anticuerpo de cadena ligera Kappa anti humano de cabra conjugado con FMAT-Blue, (dilución 1:250, Sigma K3502) durante 30 minutos a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA 1 % y se analizaron usando un citómetro de flujo FACScalibur, (Applied Biosystems) en el canal FL-4.

Por análisis de FACS, se mostró que todos los mutantes tenían una afinidad relativa similar por el complejo TLR4/MD2 expresado en células CHO (véase Figura 11 A).

La capacidad neutralizadora de los diversos anticuerpos humanizados mutantes se evaluó usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó

1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de los mAb IgG1 15C1 humanizado mutantes C, F, G y H e IgG1 15C1 humanizado que contenía el CH2 de ratón a la sangre y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

En un ensayo de sangre completa humana se comparó la actividad inhibidora de los 6 mutantes con la de IgG1 15C1 humanizado muCH2. Los resultados presentados en la Figura 11B muestran claramente que los mutantes C y F son al menos tan potentes como IgG1 15C1 humanizado muCH2 mientras que los mutantes G y H son menos eficaces. También se mostró que los mutantes D y E eran menos eficaces que IgG1 15C1 humanizado muCH2. Los resultados concuerdan bien con los obtenidos previamente para IgG1 15C1 quimérico (Figura 9B).

Finalmente, la actividad inhibidora del mejor mutante CH2 humanizado, mutante C, que contenía tres restos de aminoácidos de ratón en las posiciones EU 325 (Ser), 326 (Ala) y 328 (Phe) se ensayó en un ensayo de sangre completa humana junto con el IgG1 15C1 quimérico y el IgG1 15C1 humanizado que contenía el domino CH2 de ratón (15C1 humanizado muCH2). Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de mAb IgG1 15C1 quimérico, IgG1 15C1 humanizado mutante C y 15C1 humanizado que contenía CH2 de ratón a la sangre y se

incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA. Los datos presentados en la Figura 12 muestran que el mutante C tiene una actividad inhibidora similar a la de IgG1 15C1 humanizado muCH2 y muchos más potente que la IgG1 15C1 quimérico.

La implicación de CD32 en el aumento del efecto inhibidor de anticuerpos monoclonales IgG1 de ratón anti-TLR2, anti-MD2 y anti-CD14 como se controla por la inhibición de la citocina proinflamatoria IL-6 se evaluó usando el ensayo de sangre completa humana. Se obtuvo sangre heparinizada nueva de voluntarios sanos por venopunción y se diluyó 1:2 con RPMI 1640. La sangre diluida se sembró a 60 ∃l/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Después se añadieron 30 ∃l de diluciones en serie en RPMI 1640 de mAb anti-TLR2 de ratón (13A), anti-MD2 de ratón (18H10,13B) y anti-CD14 de ratón (13C) con o sin anticuerpo monoclonal anti CD32 humano de ratón (Clon AT10, número de Catálogo 2125-3210, AbD Serotec) a la sangre y se incubaron durante una hora a 37 ºC. Después se estimularon las células sanguíneas añadiendo 30 ∃l de LPS de E. coli K12 (2 ng/ml final en RPMI 1640 que contenía HSA 0,1 %) a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Después se midió la producción de IL-6 por ELISA.

Los resultados mostrados en las Figuras 13A-13C tienden a demostrar la implicación de las interacciones entre la parte Fc de mAb y Fc!RIIA humano en una respuesta inhibidora potencial en otros sistemas distintos del TLR4 es decir, TLR2, MD2 y CD14.

El alineamiento del dominio CH2 de todos los isotipos de IgG humano, de ratón y de rata en la Figura 16, muestra que aparte de IgG1 de ratón, IgG2a de rata también contiene un motivo SAAF en las posiciones EU 325-328 mientras que IgG1 de rata contiene una secuencia SGAF homóloga en las mismas posiciones EU. Ninguno de los otros isotipos de IgG humano, de ratón o de rata contiene este motivo SAAF. La numeración EU (Edelman, G. M. et al., 1969, Proc. Natl Acad. Sci. USA 63, 78-85) para las cadenas gamma del dominio CH2 comienza en 231 y termina en 340. Los exones CH2 de IgG1, IgG3 e IgG4 humanos, IgG2ab, IgG2aa, IgG2b e IgG3 de ratón e IgG2b de rata codifican 110 aminoácidos. El exón CH2 de IgG2 humano e IgG2c de rata codifica 109 aminoácidos debido a una deleción de tres nucleótidos (nt). El exón CH2 de IgG1 de ratón, IgG1 e IgG2a de rata codifica 107 aminoácidos debido a una deleción de nueve nt.

Ejemplo 4: anticuerpos neutralizadores mutados en CDR3

Los estudios descritos en la presente memoria se refieren a métodos para aumentar la potencia de anticuerpos neutralizadores modificando uno o más restos en la parte CDR3 de un anticuerpo. En particular, los estudios descritos en la presente memoria usan un anticuerpo neutralizador alterado que reconoce el complejo TLR4/MD2. Estos anticuerpos anti-TLR4/MD2 se modifican para incluir una o más mutaciones en la parte CDR3. Estos anticuerpos incluyen las siguientes secuencias, en las que la mutación puntual individual con la región CDR3 se ha subrayado dentro de la secuencia de aminoácidos:

Secuencia de aminoácidos de VH humanizada de 15C1 mutante 1:

QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYS GYTDFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDAFPYWGQG TLVTVSS (SEC ID Nº: 66)

Secuencia de ácido nucleico de VH humanizada de 15C1 mutante 1: CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCT GTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCAC TGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTA CAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACTCGAATCACCATATCACG TGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGTGGA CACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATCCGTCCGACGCCTTTCCTTACTG GGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEC ID Nº: 67)

Secuencia de aminoácidos de VH humanizada de 15C1 mutante 2: QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYS GYTDFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSEGFPYWGQGT LVTVSS (SEC ID Nº: 68) Secuencia de ácido nucleico de VH humanizada de 15C1 mutante 2: CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCT GTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCAC TGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTA

5 CAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACTCGAATCACCATATCACG TGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGTGGA CACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATCCGTCCGAGGGATTTCCTTACTG GGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEC ID Nº: 69)

En comparación con la secuencia de VH de 15C1 4-28 humanizada de referencia:

10 Secuencia de aminoácidos de VH 4-28 humanizada de 15C1:

QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYS GYTDFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDGFPYWGQG TLVTVSS (SEC ID Nº: 45)

Secuencia de ácido nucleico de VH 4-28 humanizada de 15C1:

15 CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCT GTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCAC TGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTA CAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACTCGAATCACCATATCACG TGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGTGGA

20 CACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATCCGTCCGACGGATTTCCTTACTG GGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEC ID Nº: 70)

Secuencia de aminoácidos de VL humanizada de 15C1 mutante 1: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGV PSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNSHSFPLTFGGGTKVEIK (SEC ID Nº: 71)

25 Secuencia de ácido nucleico de VL humanizada de 15C1 mutante 1: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAA GTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTAC CAACAGAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCC ATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT

30 CTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCAGAAT AGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEC ID Nº: 72)

Secuencia de aminoácidos de VL humanizada de 15C1 mutante 2: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGV

35 PSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEC ID Nº: 73)

Secuencia de ácido nucleico de VL humanizada de 15C1 mutante 2: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAA GTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTAC CAACAGAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCC

40 ATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT CTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCAGCAG GGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEC ID Nº: 74)

Secuencia de aminoácidos de VL humanizada de 15C1 mutante 3:

45 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGV PSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNSSSFPLTFGGGTKVEIK (SEC ID Nº: 75)

Secuencia de ácido nucleico de VL humanizada de 15C1 mutante 3: GAAATTGTGTTGACGGAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAA GTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTAC

50 CAACAGAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCC ATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGGAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT CTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCAGAAT AGTAGTAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEC ID Nº: 76)

Secuencia de aminoácidos de VL humanizada de 15C1 mutante 4: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGV PSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSFPLTFGGGTKVEIK (SEC ID Nº: 77)

Secuencia de ácido nucleico de VL humanizada de 15C1 mutante 4: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAA GTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTAC CAACAGAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCC ATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT CTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCAGCAG AGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEC ID Nº: 78)

En comparación con la VL humanizada de 15C1 A26 de referencia:

Secuencia de aminoácidos de VL humanizada de 15C1 A26: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGV PSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEC ID Nº: 48)

Secuencia de ácido nucleico de VL humanizada de 15C1 A26: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAA GTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTAC CAACAGAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCC ATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACT CTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCAGAAT GGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEC ID Nº: 79)

La unión de estos mutantes se analizó por FACS en células que expresaban TLR4-MD2 humano recombinante. Las células PEAK se cotransfectaron con 1 ∃g de combinaciones de vectores de expresión que codificaban VH humanizada de 15C1 mutante 1 o 2 junto con VL humanizada de 15C1 A26 o VH humanizada de 15C1 4-28 junto con VL humanizada de 15C1 mutante 1, 2, 3 o 4 mostrados en el Ejemplo 4 usando el reactivo de transfección Trans IT-LT1 (Mirus Bio Corporation, Madison WI). Todas las transfecciones se llevaron a cabo por duplicado. 72 horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes de células PEAK y se midió la concentración de IgG1/Kappa humano recombinante por ELISA. Las concentraciones de anticuerpo de todos los sobrenadantes se ajustaron después a 0,33 ∃g/ml. Estos sobrenadantes y dos diluciones en serie de 0,11 y 0,04 ∃g/ml se ensayaron después con respecto a unión con células CHO que expresaban TLR4-MD2 humano en su superficie por FACS. Se incubaron 5 x 105 células con el sobrenadante de PEAK diluido durante 1 hora a 4 ºC. Después de dos lavados, se incubaron las células con anticuerpo secundario (anticuerpo anti IgG humano de cabra conjugado con aloficocianina (dilución 1:200; Molecular Probes)). Las células se analizaron usando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) en el canal FL-4 (Figuras 17A-17G). La unión de las versiones mutantes humanizadas de 15C1 con TLR4 en las Figuras 17A-17G se expresa como la intensidad de fluorescencia media para las diferentes concentraciones de anticuerpo. Un experimento representativo de cuatro. Las barras de error muestran ∀ D.T.

La versión VH mutante 1 y VL mutante 2 parece tener un mayor IFM que la versión humanizada patentada lo que indica que estas dos versiones tienen una mayor afinidad relativa que la versión humanizada.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une con TLR4 soluble, el complejo TLR4/MD2, o tanto TLR4 soluble como el complejo TLR4/MD2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento del mismo:

   (i) una región variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la

   5 secuencia de aminoácidos GGYSWH (SEC ID Nº: 23), una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos YIHYSGYTDFNPSLKT (SEC ID Nº: 24), y una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de KDPSDAFPY (SEC ID Nº: 80);

   (ii) una región variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISDHLH (SEC ID Nº: 28), una región CDR2 de cadena ligera que comprende

   10 la secuencia de aminoácidos YASHAIS (SEC ID Nº:29), y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de QQGHSFPLT (SEC ID Nº: 83); y

   (iii) al menos una parte de unión a Fc!R de una región Fc,

   en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además al menos dos mutaciones en comparación con un

   polipéptido de partida y en el que una mutación es una sustitución con serina en la posición de aminoácido EU 325, 15 y una mutación es una sustitución con fenilalanina en la posición de aminoácido EU 328.

2. 2.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo induce una actividad del receptor Fc gamma modificado.

3. 3.

   El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que

   a) la actividad del receptor Fc gamma modificado es la inhibición de la liberación de mediadores proinflamatorios, 20 o

   b) dicho receptor Fc gamma es el CD32A humano.

4. 4.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es isotipo IgG1 humano, isotipo IgG2 humano, isotipo IgG3 humano o isotipo IgG4 humano.

5. 5.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la región variable de cadena pesada

   25 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 66 y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 73.
6. 6. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en la activación de la señalización de ICAM.
7. 7. El anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el 30 tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o trastorno inflamatorio.