JP2020111613A - 改変されたエフェクター機能を有するＦｃ受容体結合ポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】改変されたエフェクター機能を有するＦｃ受容体結合抗体またはポリペプチドを提供する。【解決手段】本発明は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域の少なくともＦｃγＲ結合部分を含む改変ポリペプチドを提供する。本発明は、抗体のＣＤＲ３領域中の少なくとも１つのアミノ酸残基が改変された改変体ＣＤＲ３領域を有する、改変抗体も提供する。本発明はまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域の少なくともＦｃγＲ結合部分および改変体ＣＤＲ３領域を含む改変抗体および改変ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも改変体Ｆｃ領域および改変体ＣＤＲ３領域を含む改変抗体および改変ポリペプチドを提供する。【選択図】なし

Description

（関連出願）
本特許出願は、２００７年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／９３０，２
７６号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９３０，２７６号の内容は、その全体
が参考として本明細書中に援用される。

（発明の分野）
本発明は、改変体Ｆｃ領域を含む分子、詳細にはポリペプチド、より詳細には免疫グロ
ブリン（たとえば抗体）に関し、前記改変体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少な
くとも１つのアミノ酸改変を含み、改変体Ｆｃ領域は、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＡ（ＣＤ３
２Ａ）に対する改変された結合特徴を有し、これは前炎症性メディエーターの放出の予防
をもたらす（たとえば、ＴＮＦ−α、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−
８およびケモカイン）。本発明はまた、野生型ＣＤＲ３領域と比較して改変された少なく
とも１つのアミノ酸を含む改変体ＣＤＲ３領域を含む分子、詳細にはポリペプチド、より
詳細には免疫グロブリン（たとえば抗体）にも関する。本発明はまた、一般に、そのよう
な分子を産生する方法、エフェクター機能を改変する方法、ならびにそのような改変され
た抗体を治療剤および診断剤として使用する方法にも関する。

抗体、または免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２本の重
鎖、および２本の軽鎖を含み、それぞれの軽鎖は、ジスルフィド結合によって対応する重
鎖と連結されている。クラスＩｇＧの抗体（すなわち、クラスγ（Ｇ）の免疫グロブリン
（Ｉｇ）の一般的構造の模式図を、図１Ａに示す。

それぞれの重鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、いくつかの定常ドメインが続く
。それぞれの軽鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、その他方の末端に定常ドメイン
を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列しており、軽鎖定常ドメインは重
鎖の第１の定常ドメインと整列している。

抗原は、軽鎖および重鎖のそれぞれの対の可変ドメイン中の抗原結合部位を介して、抗
体と結合する。エフェクター分子として知られる他の分子は、分子の残りの部分中の他の
部位、すなわち、抗原結合部位以外と結合し、抗体のこの部分は、抗体の「定常部分」と
呼ばれ、そのような部位は、特に、軽鎖の末端を越えて伸びる重鎖の部分によって構成さ
れるＦｃ領域中に位置する。

抗体の定常部分は、「エフェクター」細胞上の受容体と特異的に相互作用する。たとえ
ば、Ｆｃ領域は、２つの分類に分けられているエフェクター機能を媒介する。第１の分類
は、抗原結合とは独立して起こる機能である。主要組織適合複合体クラスＩ関連の受容体
ＦｃＲｎによるこれらの機能は、ＩｇＧに、循環中の残留性、および経細胞輸送によって
細胞障壁を超えて移行される能力を与える（Ｇｈｅｔｉｅ ＶおよびＷａｒｄ Ｓ参照）
。第２の分類は、抗体が抗原と結合した後に作動する機能である。これらの機能は、補体
カスケードまたはＦｃ受容体（ＦｃＲ）を保有する細胞の関与を含む。

ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性によって定義される。たと
えば、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。ＦｃＲは、免疫複合体の貪
食による抗体でコーティングされた病原体の除去と、対応する抗体でコーティングされた
赤血球および様々な他の細胞標的（たとえば腫瘍細胞）の溶解をどちらも媒介する、造血
細胞上の特殊な細胞表面受容体である。

ＦｃγＲは、免疫動員の抑止または増強において重要な役割を果たす。現在、３つのク
ラスのＦｃγＲが免疫系の細胞上で識別されている：単量体ＩｇＧと結合することができ
る高親和性受容体Ｆｃ ＲＩ（ＣＤ６４）、ならびに低親和性受容体ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ
３２）、および複合体形成したＩｇＧと優先的に相互作用するＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６
）である。さらに、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩクラスは、「Ａ」型と「Ｂ」型を
どちらも含む（Ｇｅｓｓｎｅｒ−ＪＥら、Ａｎｎ Ｈｅａｍａｔｏｌ、１９９８年、Ｔｈ
ｅ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ、７６：２３１〜２４８頁）。

ＦｃγＲＩＩタンパク質は、単量体Ｉｇに対する低い親和性が原因で（１０^６Ｍ^−１）
複合体形成したＩｇＧとしか結合しない、４０ＫＤａの膜内在性糖タンパク質である。こ
の受容体は最も幅広く発現されるＦｃγＲであり、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ
細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めたすべての造血細胞上に存在する。Ｆｃγ
ＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖中に２つの免疫グロブリン様領域しか持たず、した
がって、ＩｇＧに対する親和性がＦｃγＲＩよりもはるかに低い。３つのヒトＦｃγＲＩ
Ｉ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ、ＦｃγＲＩＩ−Ｃ）が存在し、これら
はすべて、ＩｇＧと凝集体または免疫複合体中で結合する。ＦｃγＲＩＩａ受容体の遺伝
子は、コドン１３１にＧまたはＡのどちらかを含み、第２の細胞外ドメイン中でそれぞれ
アルギニン（ＣＧＴ）またはヒスチジン（ＣＡＴ）のどちらかをもたらす。この変化は、
受容体がＩｇＧと結合する能力を改変する。ＦｃγＲＩＩＡ Ｈｉｓ−１３１、Ａ／Ａ遺
伝子型を有する細胞は、位置１３１にＡｒｇを有するものよりも相当に高い親和性でヒト
ＩｇＧ２と結合し、逆に、Ａｒｇ−１３１、Ｇ／Ｇ遺伝子型を有する細胞は、位置１３１
にＨｉｓを有するものよりも相当に高い親和性でネズミＩｇＧ１と結合する（非特許文献
１）。当初、Ｔ細胞増殖を始動させるためのネズミＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＤ３抗体と
の単球の相互作用を用いた研究では、個体を高レスポンダーまたは低レスポンダーとして
表現型で分類していた（非特許文献２）。現在では、このアッセイにおける高レスポンダ
ーの細胞はＧ／ＧまたはＡ／Ｇ遺伝子型を有する一方で、低レスポンダー細胞はＡ／Ａ遺
伝子型を有することが知られている。ＦｃγＲＩＩａ１３１Ｒ／Ｒ遺伝子型は、一部の感
染症および自己免疫疾患に対する感受性の危険因子である（非特許文献３）。

ＦｃγＲＩＩ−ＡおよびＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質ドメイン内の明確な差異が、受容体
ライゲーションに対して２つの機能的に異種な応答を生じる。基本的な差異は、Ａアイソ
フォームは貪食および呼吸バーストなどの細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開
始する一方で、ＢアイソフォームはたとえばＢ細胞活性化を阻害する阻害性シグナルを開
始することである。

Ｓａｌｍｏｎら、１９９２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２７４〜１２８１頁 Ｔａｘら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ：３０４：４４５〜４４７頁 Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ Ｗ．Ｌ．およびＶａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ Ｊ．Ｇ．Ｊ、１９９８年、Ｉｍｒｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：２２２〜２３２頁

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は現在、ヒト患者において疾患を治療するために使用さ
れている。一部のｍＡｂは抗体のエフェクター機能を利用せずに有効に機能し得るが（た
とえば中和抗体）、多くの場合、免疫応答が誘発されるように免疫系を動員するように、
抗体のＦｃ部分を操作することが望ましい場合がある。当分野では、所定の標的と結合す
る能力を保持したままで増加した力価を有する改変体Ｆｃ領域を含む抗体を生成する必要
性が存在する。したがって、改変されていない抗体と比較して、抗原との結合を保持した
ままで改変されたＦｃ受容体活性を誘発する、改変されたＩｇＧ抗体を生成する必要性が
存在する。

本明細書に記載する改変ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域の少
なくともＦｃγＲ結合部分を含む。本発明の改変された抗体にはまた、抗体のＣＤＲ３領
域中の少なくとも１つのアミノ酸残基が改変されている改変体ＣＤＲ３領域を有する、改
変された抗体も含まれる。本発明の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免
疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域の少なくともＦｃγＲ結合部分および改変体ＣＤＲ
３領域を含むポリペプチドも含まれる。本発明の改変された抗体および改変ポリペプチド
にはまた、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも改変体Ｆｃ領域および改変体ＣＤＲ
３領域を含むポリペプチドも含まれる。

本明細書に記載する改変ポリペプチドには、改変された抗体が、改変されていない抗体
と比較して、抗原との結合を保持したままで抗原依存性のエフェクター機能の改変を誘発
するように、たとえば、Ｆｃ領域またはそのＦｃＲ結合断片内に少なくとも１つの特異的
なアミノ酸置換を含む抗体（たとえば、ＩｇＧ定常ドメイン内にアミノ酸置換を有するポ
リペプチド）が含まれる。たとえば、改変された抗体は、前炎症性メディエーターの放出
の阻止を誘発する。好ましい実施形態では、改変された抗体は、ヒトかつＩｇＧアイソタ
イプの抗体である。たとえば、改変された抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３ま
たはＩｇＧ４アイソタイプである。本明細書に記載する改変された抗体は、改変されてい
ない抗体と比較して、増加した力価を有する。

本発明の改変された抗体には、抗体のＦｃ部分の定常領域中の少なくとも１つのアミノ
酸残基が改変されている、改変された抗体が含まれる。たとえば、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメ
イン中の少なくとも１つのアミノ酸は、異なる残基、すなわちアミノ酸置換によって置き
換えられている。本明細書に記載する改変された抗体中では、残基３２５、３２６および
３２８に対応するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数は、改変されていない抗体と比較
して、異なる残基で置換されている。γ重鎖中の残基の番号付けは、ＥＵインデックスの
ものである（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、１９６９年；Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ａ．、Ｔ．Ｔ
．Ｗｕ、Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ、Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、およびＣ．Ｆｏｅｌｌｅｒ
．、１９９１年。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａ
ｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＮＩＨ Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２頁参照）。

突然変異したＦｃ部分を有するこれらの改変された抗体は、改変されていない抗体と比
較して、改変されたエフェクター機能、たとえば、改変されたＦｃ受容体活性を誘発する
。たとえば、ヒトＦｃ受容体はＣＤ３２Ａである。一部の実施形態では、改変された抗体
は、改変されていない抗体と比較して、ＣＤ３２Ａとのライゲーションに続いて、前炎症
性メディエーターの放出の阻害の増加を誘発する。したがって、本明細書に記載する改変
された抗体は、標的抗原と結合する能力を保持したままで、前炎症性メディエーターの放
出の阻害を増加させるなど、改変されたＦｃ受容体活性を誘発する。一部の実施形態では
、改変された抗体は中和抗体であり、改変された抗体は、Ｆｖ結合を介して標的抗原の１
つまたは複数の生物活性を中和する能力を保持したままで、改変されたＦｃ受容体活性を
誘発する。

改変された抗体がヒトＩｇＧ１アイソタイプである実施形態では、改変された抗体は、
改変されていない抗体と比較して、マウスＩｇＧ１γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３
２８のアミノ酸置換を、単独で、またはＥＵアミノ酸位置３２５および３２６と一緒に含
む。一実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２８が、アラニン、システイ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプ
トファンおよびチロシンなどの非極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重
鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一実施形
態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２５が、アルギニン、アスパラギン、グル
タミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンまたはスレオニンなどの極性アミノ
酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２５が、セ
リンで置換されている。一実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２６が、
アラニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン
、プロリン、トリプトファンおよびチロシンなどの非極性アミノ酸で置換されている。最
も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２６が、アラニンで置換されている
。一部の実施形態では、改変された抗体は、ヒトＩｇＧ１γ重鎖定常領域中の１つまたは
２つのアミノ酸置換を伴うＥＵアミノ酸位置３２８を含み、置換は、ＥＵアミノ酸位置３
２５および３２６から選択される１つまたは２つのアミノ酸残基で起こる。一実施形態で
は、改変されたヒトＩｇＧ１抗体は、ＥＵ位置３２６および３２８でアミノ酸置換を含む
。たとえば、ヒトＩｇＧ１γ重鎖定常領域の残基３２６が、アラニンで置換されており、
ヒトＩｇＧ１γ重鎖定常領域の残基３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一部
の実施形態では、改変されたヒトＩｇＧ１抗体のγ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２
８は、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、ＮＡＡＦおよびＮＫＡＦから選択される配列からなる。

改変された抗体がヒトＩｇＧ２アイソタイプである実施形態では、改変された抗体は、
改変されていない抗体と比較して、ＥＵアミノ酸位置３２８のアミノ酸置換を、単独で、
またはＥＵアミノ酸位置３２５および３２６と一緒に含む。一実施形態では、γ重鎖定常
領域のＥＵアミノ酸位置３２８が、アラニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびチロシンなどの非
極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３
２８が、フェニアラニンで置換されている。一実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミ
ノ酸位置３２５が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン
、リシン、セリンまたはスレオニンなどの極性アミノ酸で置換されている。最も好ましく
は、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２５が、セリンで置換されている。一実施形態
では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２６が、アラニン、システイン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよび
チロシンなどの非極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥ
Ｕアミノ酸位置３２６が、アラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変された
抗体は、ヒトＩｇＧ２γ重鎖定常領域中の１つまたは２つのアミノ酸置換を伴うＥＵアミ
ノ酸位置３２８を含み、置換は、ＥＵアミノ酸位置３２５および３２６から選択される１
つまたは２つのアミノ酸残基で起こる。一実施形態では、改変されたヒトＩｇＧ２抗体は
、ＥＵ位置３２６および３２８でアミノ酸置換を含む。たとえば、ヒトＩｇＧ２γ重鎖定
常領域の残基３２６が、アラニンで置換されており、ヒトＩｇＧ２γ重鎖定常領域の残基
３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変されたヒトＩ
ｇＧ２抗体のγ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２８は、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、ＮＡＡ
ＦおよびＮＫＡＦから選択される配列からなる。

改変された抗体がヒトＩｇＧ３アイソタイプである実施形態では、改変された抗体は、
改変されていない抗体と比較して、ＥＵアミノ酸位置３２８のアミノ酸置換を、単独で、
またはＥＵアミノ酸位置３２５および３２６と一緒に含む。一実施形態では、γ重鎖定常
領域のＥＵアミノ酸位置３２８が、アラニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびチロシンなどの非
極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３
２８が、フェニアラニンで置換されている。一実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミ
ノ酸位置３２５が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン
、リシン、セリンまたはスレオニンなどの極性アミノ酸で置換されている。最も好ましく
は、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２５が、セリンで置換されている。一実施形態
では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２６が、アラニン、システイン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよび
チロシンなどの非極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥ
Ｕアミノ酸位置３２６が、アラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変された
抗体は、ヒトＩｇＧ３γ重鎖定常領域中の１つまたは２つのアミノ酸置換を伴うＥＵアミ
ノ酸位置３２８を含み、置換は、ＥＵアミノ酸位置３２５および３２６から選択される１
つまたは２つのアミノ酸残基で起こる。一実施形態では、改変されたヒトＩｇＧ３抗体は
、ＥＵ位置３２６および３２８でアミノ酸置換を含む。たとえば、ヒトＩｇＧ３γ重鎖定
常領域の残基３２６が、アラニンで置換されており、ヒトＩｇＧ３γ重鎖定常領域の残基
３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変されたヒトＩ
ｇＧ３抗体のγ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２８は、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、ＮＡＡ
ＦおよびＮＫＡＦから選択される配列からなる。

改変された抗体がヒトＩｇＧ４アイソタイプである実施形態では、改変された抗体は、
改変されていない抗体と比較して、ＥＵアミノ酸位置３２８のアミノ酸置換を、単独で、
またはＥＵアミノ酸位置３２５および３２６と一緒に含む。一実施形態では、γ重鎖定常
領域のＥＵアミノ酸位置３２８が、アラニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびチロシンなどの非
極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３
２８が、フェニアラニンで置換されている。一実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵアミ
ノ酸位置３２５が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン
、リシン、セリンまたはスレオニンなどの極性アミノ酸で置換されている。最も好ましく
は、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２５が、セリンで置換されている。一実施形態
では、γ重鎖定常領域のＥＵアミノ酸位置３２６が、アラニン、システイン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよび
チロシンなどの非極性アミノ酸で置換されている。最も好ましくは、γ重鎖定常領域のＥ
Ｕアミノ酸位置３２６が、アラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変された
抗体は、ヒトＩｇＧ４γ重鎖定常領域中の１つまたは２つのアミノ酸置換を伴うＥＵアミ
ノ酸位置３２８を含み、置換は、ＥＵアミノ酸位置３２５および３２６から選択される１
つまたは２つのアミノ酸残基で起こる。一実施形態では、改変されたヒトＩｇＧ４抗体は
、ＥＵ位置３２６および３２８でアミノ酸置換を含む。たとえば、ヒトＩｇＧ４γ重鎖定
常領域の残基３２６が、アラニンで置換されており、ヒトＩｇＧ４γ重鎖定常領域の残基
３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一部の実施形態では、改変されたヒトＩ
ｇＧ４抗体のγ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２８は、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、ＮＡＡ
ＦおよびＮＫＡＦから選択される配列からなる。

本発明の改変された抗体にはまた、抗体のＣＤＲ３領域中の少なくとも１つのアミノ酸
残基が改変されている改変体ＣＤＲ３領域を有する、改変された抗体も含まれる。本発明
の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ
領域の少なくともＦｃγＲ結合部分および改変体ＣＤＲ３領域を含むポリペプチドも含ま
れる。本明細書に記載する改変ポリペプチドには、改変された抗体が、改変されていない
抗体と比較して、抗原との結合を保持したままで抗原依存性のエフェクター機能の改変を
誘発するように、たとえば、Ｆｃ領域またはそのＦｃＲ結合断片内に改変体ＣＤＲ３領域
および少なくとも１つの特異的なアミノ酸置換を含む抗体（たとえば、ＩｇＧ定常ドメイ
ン内にアミノ酸置換を有するポリペプチド）が含まれる。

改変体ＣＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＨ ＣＤＲ３領域が含まれる：ＫＤ
ＰＳＤＡＦＰＹ（配列番号８０）およびＫＤＰＳＥＧＦＰＹ（配列番号８１）。改変体Ｃ
ＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＬ ＣＤＲ３領域が含まれる：ＱＮＳＨＳＦＰ
ＬＴ（配列番号８２）、ＱＱＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号８３）、ＱＮＳＳＳＦＰＬＴ（配
列番号８４）、およびＱＱＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８５）。

一部の実施形態では、改変された抗体は、改変体Ｆｃ領域と改変体ＣＤＲ３領域をどち
らも含む。一部の実施形態では、改変された抗体は、実施例３に示す改変体Ｆｃ領域と実
施例４に示す改変体ＣＤＲ３領域、たとえば配列番号８０〜８５をどちらも含む。一部の
実施形態では、改変された抗体は、Ｆｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインと改変体ＣＤＲ３
領域をどちらも含む。一部の実施形態では、改変された抗体は、実施例３に示すＦｃ領域
中の改変体ＣＨ２ドメインと実施例４に示す改変体ＣＤＲ３領域、たとえば配列番号８０
〜８５をどちらも含む。一部の実施形態では、改変された抗体は、残基３２５、３２６お
よび／または３２８（ｔｈｅ ＥＵ ｉｎｄｅｘ、Ｅｄｅｌｍａｎらのようにγ重鎖中の
残基の番号付けを使用）に対応する残基のうちの１つまたは複数が突然変異したＦｃ領域
中の改変体ＣＨ２ドメインと改変体ＣＤＲ３領域をどちらも含む。一部の実施形態では、
改変された抗体は、実施例３に示す残基３２５、３２６および／または３２８（ｔｈｅ
ＥＵ ｉｎｄｅｘ、Ｅｄｅｌｍａｎらのようにγ重鎖中の残基の番号付けを使用）に対応
する残基のうちの１つまたは複数が突然変異したＦｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインと実
施例４に示す改変体ＣＤＲ３領域、たとえば配列番号８０〜８５をどちらも含む。

本発明の改変ポリペプチドおよび抗体にはまた、配列番号２、１２、２２、３２、４５
、４６、４９、５１、５２、６６、もしくは６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９
２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有する重鎖可変ア
ミノ酸配列、および／または配列番号７、１７、２７、３７、４７、４８、５０、５３、
７１、７３、７５もしくは７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９
７％、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有する軽鎖可変アミノ酸を含む抗体
も含まれる。

本発明の改変ポリペプチドおよび抗体にはまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領
域の少なくともＦｃγＲ結合部分を含み、かつ配列番号２、１２、２２、３２、４５、４
６、４９、５１、５２、６６、もしくは６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％
、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有する重鎖可変アミノ
酸配列、および／または配列番号７、１７、２７、３７、４７、４８、５０、５３、７１
、７３、７５もしくは７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％
、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有する軽鎖可変アミノ酸を含むポリペプ
チドも含まれる。一部の実施形態では、改変された抗体には、実施例３に示すＦｃ領域中
の改変体ＣＨ２ドメインをどちらも含む。一部の実施形態では、改変された抗体は、残基
３２５、３２６および／または３２８（ｔｈｅ ＥＵ ｉｎｄｅｘ、Ｅｄｅｌｍａｎらの
ようにγ重鎖中の残基の番号付けを使用）に対応する残基のうちの１つまたは複数が突然
変異したＦｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインをどちらも含む。

本発明の改変ポリペプチドおよび抗体にはまた、改変体Ｆｃ領域を含み、かつ配列番号
２、１２、２２、３２、４５、４６、４９、５１、５２、６６、もしくは６８のアミノ酸
配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高
い同一性を有する重鎖可変アミノ酸配列、および／または配列番号７、１７、２７、３７
、４７、４８、５０、５３、７１、７３、７５もしくは７７のアミノ酸配列と少なくとも
９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有する
軽鎖可変アミノ酸を含むポリペプチドおよび抗体も含まれる。一部の実施形態では、改変
された抗体は、実施例３に示すＦｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインをどちらも含む。一部
の実施形態では、改変された抗体は、残基３２５、３２６および／または３２８（ｔｈｅ
ＥＵ ｉｎｄｅｘ、Ｅｄｅｌｍａｎらのようにγ重鎖中の残基の番号付けを使用）に対
応する残基のうちの１つまたは複数が突然変異したＦｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインを
どちらも含む。

本発明の改変ポリペプチドおよび抗体にはまた、Ｆｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメインを
含み、かつ配列番号２、１２、２２、３２、４５、４６、４９、５１、５２、６６、もし
くは６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％
もしくはそれより高い同一性を有する重鎖可変アミノ酸配列、および／または配列番号７
、１７、２７、３７、４７、４８、５０、５３、７１、７３、７５もしくは７７のアミノ
酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより
高い同一性を有する軽鎖可変アミノ酸を含むポリペプチドおよび抗体も含まれる。一部の
実施形態では、改変された抗体には、実施例３に示すＦｃ領域中の改変体ＣＨ２ドメイン
をどちらも含む。一部の実施形態では、改変された抗体には、残基３２５、３２６および
／または３２８（ｔｈｅ ＥＵ ｉｎｄｅｘ、Ｅｄｅｌｍａｎらのようにγ重鎖中の残基
の番号付けを使用）に対応する残基のうちの１つまたは複数が突然変異したＦｃ領域中の
改変体ＣＨ２ドメインをどちらも含む。

本発明の改変された抗体およびポリペプチドにはまた、（ｉ）配列番号３、１３、２３
、および３３からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号４、１４
、２４、および３４からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２配列、（ｉｉｉ）配列番号
５、１５、２５、３５、８０および８１からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３配列の
それぞれと、少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ
より高い同一性を有するアミノ酸配列を有する、３つの重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）
、ならびに／または（ｉｖ）配列番号８、１８、２８、および３８からなる群から選択さ
れるＶＬ ＣＤＲ１配列、（ｖ）配列番号９、１９、２９および３９からなる群から選択
されるＶＬ ＣＤＲ２配列、（ｖｉ）配列番号１０、２０、３０、４０、８２、８３、８
４および８５からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ３配列のそれぞれと、少なくとも９
０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い同一性を有するア
ミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を含む、ポリペプチドおよび抗体も含まれる
。

本発明はまた、抗体が、改変されていない抗体と比較して、ヒトＣＤ３２Ａと結合した
際に抗原との結合を保持したままで前炎症性メディエーターの放出の阻害の増加を誘発す
るように、γ重鎖定常領域の少なくともＥＵアミノ酸位置３２８が、改変されていない抗
体中の対応するアミノ酸残基とは異なる同じ位置で、重鎖γ鎖定常領域のＥＵ位置３２５
および３２６に対応するアミノ酸残基のうちの１つまたは２つと一緒に、マウスＩｇＧ１
の対応するＥＵアミノ酸残基で置換されている、モノクローナル抗体によってヒトＣＤ３
２Ａを標的化する方法も提供する。一部の実施形態では、改変された抗体は、実施例４に
示す改変体ＶＨ ＣＤＲ３領域をさらに含む：ＫＤＰＳＤＡＦＰＹ（配列番号８０）およ
びＫＤＰＳＥＧＦＰＹ（配列番号８１）ならびに／または実施例４に示す改変体ＣＤＲ３
領域：ＱＮＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８２）、ＱＱＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号８３）、Ｑ
ＮＳＳＳＦＰＬＴ（配列番号８４）、およびＱＱＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８５）。

一部の実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５に対応するアミノ酸残基が、セ
リンで置換されている。一部の実施形態では、γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２６に対応す
るアミノ酸残基が、アラニンで置換されている。一部の実施形態では、γ重鎖定常領域の
ＥＵ位置３２８に対応するアミノ酸残基が、フェニルアラニンで置換されている。一部の
実施形態では、改変された抗体は、実施例４に示す改変体ＶＨ ＣＤＲ３領域をさらに含
む：ＫＤＰＳＤＡＦＰＹ（配列番号８０）およびＫＤＰＳＥＧＦＰＹ（配列番号８１）な
らびに／または実施例４に示す改変体ＣＤＲ３領域：ＱＮＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８２
）、ＱＱＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号８３）、ＱＮＳＳＳＦＰＬＴ（配列番号８４）、およ
びＱＱＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８５）。

一部の実施形態では、改変された抗体は、トル様受容体（ＴＬＲ）、ＭＤ２アクセサリ
ータンパク質およびＣＤ１４から選択される標的と結合する。たとえば、改変された抗体
は、可溶性ＴＬＲ４、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体、または可溶性ＴＬＲ４とＴＬＲ４／ＭＤ
２複合体の両方と結合する。一部の実施形態では、改変された抗体は、ＴＬＲ２と結合す
る。たとえば、抗体は、ＬＰＳに誘発される炎症誘発性サイトカインの産生を遮断、たと
えば中和することができる。

一部の実施形態では、改変された抗体は、少なくともＥＵ位置３２８のアミノ酸残基の
改変を、可能な場合はアミノ酸残基３２５および３２６から選択されるγ重鎖定常領域の
少なくとも１つのアミノ酸残基の改変と一緒に含むヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体であり
、改変された抗体は、改変されていない抗体と比較して、ヒトＣＤ３２Ａと結合した際に
、抗原との結合を保持したままで改変されたＦｃエフェクター活性を誘発し、抗体は、（
ａ）配列番号３、１３、２３または３３のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域、（ｂ
）配列番号４、１４、２４または３４のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域、（ｃ）
配列番号５、１５、２５、３５、８０または８１のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３領
域、（ｄ）配列番号８、１８、２８または３８のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域
、（ｅ）配列番号９、１９、２９または３９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域、
および（ｆ）配列番号１０、２０、３０、４０、８２、８３、８４、または８５のアミノ
酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域を含み、抗体は、可溶性ＴＬＲ４、ＭＤ２、ＴＬＲ４／
ＭＤ２複合体または可溶性ＴＬＲ４とＴＬＲ４／ＭＤ２複合体の両方と結合する。一実施
形態では、γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５が、セリンで置換されている。一実施形態で
は、γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２６が、アラニンで置換されている。一実施形態では、
γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２８が、フェニルアラニンで置換されている。

一部の実施形態では、改変された抗体は、改変されていない抗体中の対応するアミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基による２つ以上の置換を有するγ重鎖定常領域を含み、置換
は、ＥＵ位置３２８ならびにγ重鎖定常領域の残基３２５および３２６から選択される１
つまたは２つのアミノ酸残基で起こる。一実施形態では、置換は残基３２６および３２８
である。たとえば、重鎖定常領域のＥＵ位置３２６が、アラニンで置換されており、重鎖
定常領域のＥＵ位置３２８が、フェニルアラニンで置換されている。一部の実施形態では
、改変された抗体は、γ重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２８がＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、
ＮＡＡＦおよびＮＫＡＦから選択される配列からなる重鎖定常領域を含む。一実施形態で
は、改変されたヒトＩｇＧ１抗体のＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域には配列番号２３のアミノ酸配列
が含まれ、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２領域には配列番号２４のアミノ酸配列が含まれ、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ
３領域には配列番号２５または配列番号８０または配列番号８１のアミノ酸配列が含まれ
、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１領域には配列番号２８のアミノ酸配列が含まれ、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２領域に
は配列番号２９のアミノ酸配列が含まれ、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ３領域には配列番号３０、配列番
号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号８５のアミノ酸配列が含まれる。

一部の実施形態では、改変された抗体は、本明細書で１６Ｇ７、ｍｕ１６Ｇ７、７Ｅ３
、ｍｕ７Ｅ３、１５Ｃ１、ｍｕ１５Ｃ１、１８Ｈ１０およびｍｕ１８Ｈ１０と呼ぶ、抗体
の改変されたバージョンである。ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を認識するこれらの抗体の改変
されたバージョンは、改変された、たとえば阻害性のヒトＣＤ３２Ａ活性を誘発し、ＬＰ
Ｓに誘発される炎症誘発性サイトカインの産生を、市販の抗ＴＬＲ４非遮断モノクローナ
ル抗体ＨＴＡ１２５よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、ま
たは１００倍多く阻害する。

一部の実施形態では、改変された抗体は、ＣＤ１４を認識する抗体の改変されたバージ
ョン、たとえば２８Ｃ５として知られている抗ＣＤ１４モノクローナル抗体（たとえば、
その全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，４４４，２０６号参照
）、および、たとえばＴ２．５として知られている抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体を含め
た、ＴＬＲ２を認識する抗体の改変されたバージョン（たとえば、その全体が本明細書に
参照により組み込まれているＷＯ２００５／０２８５０９参照）である。

本発明はまた、ガンマ１Ｆｃ（γ１Ｆｃ）領域が含まれる単離したポリペプチドも提供
し、領域のＥＵ位置３２５〜３２８のアミノ酸残基は、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦ、ＮＡＡＦお
よびＮＫＡＦから選択されるアミノ酸モチーフからなる。

本発明の改変された抗体は、当業者に周知の技術を含めた、任意の適切な技術を用いて
産生する。たとえば、改変された抗体は、既知の抗体を、Ｆｃ領域中、詳細にはＣＨ２ド
メイン中、より詳細にはＥＵ位置３２５、３２６および３２８から選択される位置に少な
くとも１つの突然変異が含まれるように改変することによって産生する。γ重鎖中の残基
の番号付けは、ＥＵインデックスのものである（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、１９６９
年；Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ａ．、Ｔ．Ｔ．Ｗｕ、Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ、Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓ
ｍａｎ、およびＣ．Ｆｏｅｌｌｅｒ．、１９９１年。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．
Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、メリーランド
州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２頁参照）。本明
細書に記載する抗体の免疫グロブリンの可変領域の番号付けは、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、
１９９１年によって定義されるとおりである。（Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ａ．、Ｔ．Ｔ．Ｗｕ、
Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ、Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、およびＣ．Ｆｏｅｌｌｅｒ．、１９
９１年。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈ
ｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎ ９１〜３２４２頁）。

本発明による薬剤組成物には、本発明の改変された抗体および担体が含まれることがで
きる。改変された抗体は、様々な免疫グロブリン間で配列相同性が高い限りは、等しくネ
ズミ、ヒトおよびラット起源であり得る。組成物には、単一のアイソタイプクラス、たと
えばＩｇＧ１アイソタイプの改変された抗体、またはラット、マウスおよびヒトのＩｇＧ
アイソタイプクラスの任意の組合せ、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ
Ｇ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびそれらの組合せが含まれることができる
。これらの薬剤組成物は、たとえば診断的キットなどのキット中に含めることができる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
開始ポリペプチドと比較して少なくとも１つの突然変異を含み、少なくとも１つの突然
変異が、ＥＵアミノ酸位置３２５での置換、３２６での置換および３２８での置換からな
る群から選択される、Ｆｃ領域の少なくともＦｃγＲ結合部分を含む改変ポリペプチド。
（項目２）
改変されたＦｃγ受容体活性を誘発する、項目１に記載の改変ポリペプチド。
（項目３）
抗体またはその断片である、項目１または２に記載の改変ポリペプチド。
（項目４）
融合タンパク質である、項目１または２に記載の改変ポリペプチド。
（項目５）
前記ＦｃγＲ結合部分または前記Ｆｃ領域が、マウス、ラットまたはヒト抗体に由来す
る、項目１または２に記載の改変ポリペプチド。
（項目６）
前記ＦｃγＲ結合部分が完全Ｆｃ領域を含む、項目５に記載の改変ポリペプチド。
（項目７）
前記改変されたＦｃγ受容体活性が、前炎症性メディエーターの放出の阻害である、項
目２に記載の改変ポリペプチド。
（項目８）
前記Ｆｃγ受容体がヒトＣＤ３２Ａである、項目２に記載の改変ポリペプチド。
（項目９）
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ、ヒトＩｇＧ３ア
イソタイプまたはヒトＩｇＧ４アイソタイプである、項目３に記載の改変ポリペプチド。
（項目１０）
ＥＵ位置３２５のアミノ酸残基が、極性アミノ酸、たとえばセリンで置換されている、
項目９に記載の改変ポリペプチド。
（項目１１）
ＥＵ位置３２６のアミノ酸残基が、非極性アミノ酸、たとえばアラニンで置換されてい
る、項目９に記載の改変ポリペプチド。
（項目１２）
ＥＵ位置３２８のアミノ酸残基が、非極性アミノ酸、たとえばフェニルアラニンで置換
されている、項目９に記載の改変ポリペプチド。
（項目１３）
重鎖定常領域が、改変されていない抗体中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸
残基による２つ以上のアミノ酸置換を含み、前記置換が、前記重鎖定常領域のＥＵ位置３
２５、３２６および３２８から選択される２つ以上のアミノ酸残基で起こる、項目９に記
載の改変ポリペプチド。
（項目１４）
前記置換がＥＵ位置３２６および３２８での置換である、項目１３に記載の改変ポリペ
プチド。
（項目１５）
前記重鎖定常領域のＥＵ位置３２６がアラニンで置換されており、前記重鎖定常領域の
ＥＵ位置３２８がフェニルアラニンで置換されている、項目１４に記載の改変ポリペプチ
ド。
（項目１６）
前記重鎖定常領域のＥＵ位置３２５〜３２８が、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦおよびＮＫＡＦか
ら選択される配列からなる、項目９に記載の改変ポリペプチド。
（項目１７）
トル様受容体（ＴＬＲ）、ＭＤ２アクセサリータンパク質およびＣＤ１４から選択され
る標的と結合する、項目１または２に記載の改変ポリペプチド。
（項目１８）
可溶性ＴＬＲ４、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体、または可溶性ＴＬＲ４とＴＬＲ４／ＭＤ２
複合体の両方と結合する、項目１７に記載の改変ポリペプチド。
（項目１９）
ＴＬＲ２と結合する、項目１７に記載の改変ポリペプチド。
（項目２０）
改変体ＣＤＲ３領域をさらに含む、項目１に記載の改変ポリペプチド。
（項目２１）
前記改変体ＣＤＲ３が、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、
配列番号８４および配列番号８５のアミノ酸配列から選択される、項目２０に記載の改変
ポリペプチド。
（項目２２）
ヒトＦｃγＲ ＣＤ３２Ａを、Ｆｃ領域の少なくともＦｃγＲ結合部分を含む改変ポリ
ペプチドと結合させることを含み、前記ポリペプチドが、ＥＵ位置３２５、３２６および
３２８に対応するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数から選択される前記重鎖定常領域
の少なくとも１つの改変されていない突然変異アミノ酸を含み、前記突然変異アミノ酸は
、改変されていないポリペプチド中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基であ
り、前記改変ポリペプチドが、改変されていないポリペプチドと比較して、そのＦｖ領域
を介した抗原との結合を保持したままで、ヒトＦｃγＲ ＣＤ３２Ａとのライゲーション
による前炎症性メディエーターの放出の阻害を誘発する、ＩＣＡＭシグナル伝達を活性化
させる方法。
（項目２３）
前記改変ポリペプチドが、改変された抗体である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記改変された抗体のＥＵ位置３２５のアミノ酸残基が、セリンで置換されている、項
目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記改変された抗体のＥＵ位置３２６のアミノ酸残基が、アラニンで置換されている、
項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記改変された抗体のＥＵ位置３２８のアミノ酸残基が、フェニルアラニンで置換され
ている、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記改変された抗体の前記重鎖定常領域が改変されていない抗体中の対応するアミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基による２つ以上の置換を含み、前記置換が、ＥＵ位置３２５
、３２６および３２８に対応する残基から選択される２つ以上のアミノ酸残基で起こる、
項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記置換が、前記改変された抗体のＥＵ位置３２６および３２８に対応する残基での置
換である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記改変された抗体のＥＵ位置３２６の残基がアラニンで置換されており、前記改変さ
れた抗体のＥＵ位置３２８の残基がフェニルアラニンで置換されている、項目２８に記載
の方法。
（項目３０）
前記改変された抗体のＥＵ位置３２５〜３２８の残基が、ＳＡＡＦ、ＳＫＡＦおよびＮ
ＫＡＦから選択される配列からなる、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記改変された抗体が、トル様受容体（ＴＬＲ）、ＭＤ２アクセサリータンパク質およ
びＣＤ１４から選択される標的と結合する、項目２３に記載の方法。
（項目３２）
前記改変された抗体が、可溶性ＴＬＲ４、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体、または可溶性ＴＬ
Ｒ４とＴＬＲ４／ＭＤ２複合体の両方と結合する、項目２３に記載の方法。
（項目３３）
前記改変された抗体がＴＬＲ２と結合する、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
前記改変ポリペプチドが改変体ＣＤＲ３領域をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記改変体ＣＤＲ３が、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、
配列番号８４および配列番号８５のアミノ酸配列から選択される、項目３４に記載の方法
。
（項目３６）
ガンマＦｃ（γＦｃ）領域を含む単離したポリペプチドであって、前記領域のＥＵ位置
３２５〜３２８の残基がＳＡＡＦおよびＳＫＡＦから選択されるアミノ酸モチーフからな
る単離したポリペプチド。

マウスおよびキメラのＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体の模式図である。軽鎖および重鎖のマウスの可変および定常ドメインを無地の黒色で示す。軽鎖および重鎖のヒト定常ドメインを斜線の黒色で示す。マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１は、ヒトＴＬＲ４に特異的なＩｇＧ１サブクラスのマウス免疫グロブリンである。キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１は、ヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖定常領域と融合した１５Ｃ１のマウスの重鎖および軽鎖可変領域からなる、組換え免疫グロブリンである。Ｖ＝可変ドメイン、Ｌ＝軽鎖、Ｈ＝重鎖、ＣＫ＝軽鎖のκ定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３＝重鎖の定常ドメイン。 マウスおよびキメラのＩｇＧ１ １５Ｃ１による、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２を発現するヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）上のＬＰＳ依存性のＩＬ−８の産生を示すグラフである。 マウスおよびキメラのＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１およびＤ２６５Ａ突然変異抗体による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 全血中のＩＬ−６の産生によって測定して、α−ＣＤ３２ ＭＡｂ ＡＴ１０またはα−ＣＤ３２Ａ ＭＡｂ ＩＶ．３のどちらかを加えることで、ＬＰＳのＭＡｂ １５Ｃ１阻害が同程度まで減少したことを示す図である。 １５Ｃ１のマウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のバージョンを用いた、ホモ接合性およびヘテロ接合性の個体に由来する全血における、ＬＰＳ依存性のＴＬＲ４活性化の１５Ｃ１媒介性の遮断を示す図である。ＩＬ−６の産生の度合が様々なドナー間で変動していたため、結果は、アイソタイプ対照抗体（１００％のＬＰＳ活性化に対応する）で得られた値と比較したＩＬ−６放出の阻害のパーセンテージとして示す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。 １５Ｃ１のマウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のバージョンを用いた、ホモ接合性およびヘテロ接合性の個体に由来する全血における、ＬＰＳ依存性のＴＬＲ４活性化の１５Ｃ１媒介性の遮断を示す図である。ＩＬ−６の産生の度合が様々なドナー間で変動していたため、結果は、アイソタイプ対照抗体（１００％のＬＰＳ活性化に対応する）で得られた値と比較したＩＬ−６放出の阻害のパーセンテージとして示す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。 マウスおよびヒトのＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインをそれぞれ含むキメラおよびマウスのＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体の模式図である。軽鎖および重鎖のマウスの可変および定常ドメインを黒色で示す。軽鎖および重鎖のヒト定常ドメインを斜線の黒色で示す。マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１は、ヒトＴＬＲ４に特異的なＩｇＧ１サブクラスのマウス免疫グロブリンである。キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１は、ヒトＩｇＧ１の重鎖およびκ軽鎖定常領域と融合した１５Ｃ１のマウスの重鎖および軽鎖可変領域からなる、組換え免疫グロブリンである。Ｖ＝可変ドメイン、Ｌ＝軽鎖、Ｈ＝重鎖、ＣＫ＝軽鎖のκ定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３＝重鎖の定常ドメイン。 マウスおよびキメラのＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体間でＣＨ２ドメインを交換することによる、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 突然変異体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤについて、それぞれ相同的な対応するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２サブ領域、残基２３１〜２６２、３１８〜３４０、２９５〜３１８および２６２〜２９５を含む、４つのマウスＣＨ２突然変異体（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）の模式図である。 その表面上にヒトＴＬＲ４−ＭＤ２複合体を発現するＣＨＯ安定細胞系との結合を示すグラフである。 マウスとヒトのＩｇＧ１の間のハイブリッドＣＨ２サブ領域ドメインを含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 マウスＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン残基３１９〜３４０を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１の模式図である。軽鎖および重鎖のマウスの可変および定常ドメインを黒色で示す。軽鎖および重鎖のヒト定常ドメインを斜線の黒色で示す。キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１は、ヒトＩｇＧ１の重鎖およびκ軽鎖定常領域と融合した１５Ｃ１のマウスの重鎖および軽鎖可変領域からなる、組換え免疫グロブリンである。Ｖ＝可変ドメイン、Ｌ＝軽鎖、Ｈ＝重鎖、ＣＫ＝軽鎖のκ定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３＝重鎖の定常ドメイン。 キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１または完全長もしくは突然変異体の３１９〜３４０マウスＣＨ２ドメインのどちらかを含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 重鎖ＣＨ２ドメインのマウスＩｇＧ１ Ｃ末端（残基３１９〜３４０）および重鎖ＣＨ２ドメインのヒトＩｇＧ１ Ｃ末端（残基３１９〜３４０）の推定アミノ酸配列のアラインメントを例示する図である。ダッシュ記号は、マウス配列中のものと同一のアミノ酸を示す。配列は、ＥＵの番号付けに従った最大の核酸アラインメントに基づいて、アラインメントを行った。 重鎖ＣＨ２ドメインのマウスＩｇＧ１ Ｃ末端（残基３１９〜３４０）および５つの突然変異体（Ａ〜Ｅ）ならびに重鎖ＣＨ２ドメインのヒトＩｇＧ１ Ｃ末端（残基３１９〜３４０）の推定アミノ酸配列のアラインメントを例示する図である。ダッシュ記号は、マウス配列中のものと同一のアミノ酸を示す。配列は、ＥＵの番号付けに従った最大の核酸アラインメントに基づいて、アラインメントを行った。突然変異は、マウスアミノ酸残基、続いてマウスとヒトの配列間の７つの差異に対応する１から７の番号、最後に、それが突然変異したヒトアミノ酸によって示す。 キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、完全長または突然変異体３１９〜３４０マウスＣＨ２のどちらかを含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 その表面上にヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現するＣＨＯ安定細胞系との結合を示すグラフである。 キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、ｍｕＣＨ２ １５Ｃ１および突然変異体キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１、マウスＣＨ２を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１およびマウスＣＨ２を含むヒト化１５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 その表面上にヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現するＣＨＯ安定細胞系との結合を示すグラフである。 ヒト化１５Ｃ１突然変異体Ｃ、Ｆ、ＧおよびＨならびにマウスＣＨ２を含むヒト化１５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、ヒト化１５Ｃ１突然変異体ＣおよびマウスＣＨ２を含むヒト化１５Ｃ１による、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示すグラフである。 マウス抗ＴＬＲ２（１３Ａ）、マウス抗ＭＤ２（１８Ｈ１０、１３Ｂ）およびマウス抗ＣＤ１４（１３Ｃ）ＭＡによる、マウス抗ヒトＣＤ３２モノクローナル抗体を用いたまたは用いない、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示す一連のグラフである。 マウス抗ＴＬＲ２（１３Ａ）、マウス抗ＭＤ２（１８Ｈ１０、１３Ｂ）およびマウス抗ＣＤ１４（１３Ｃ）ＭＡによる、マウス抗ヒトＣＤ３２モノクローナル抗体を用いたまたは用いない、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示す一連のグラフである。 マウス抗ＴＬＲ２（１３Ａ）、マウス抗ＭＤ２（１８Ｈ１０、１３Ｂ）およびマウス抗ＣＤ１４（１３Ｃ）ＭＡによる、マウス抗ヒトＣＤ３２モノクローナル抗体を用いたまたは用いない、ヒト全血アッセイにおけるＬＰＳ依存性のＩＬ−６の産生を示す一連のグラフである。 アクセサリータンパク質ＭＤ−２をコードしている核酸配列を例示する図である（配列番号４１）。 成熟ＭＤ−２アクセサリータンパク質のアミノ酸配列を例示する図である（配列番号４２）。 ヒトトル様受容体４（ＴＬＲ４）のアミノ酸配列を例示する図である（配列番号４３）。 ヒト、マウスおよびラットのＩｇＧアイソタイプのＣＨ２ドメインのタンパク質ディスプレイを例示する図である。「^＊」は、その行の残基が、アラインメント中のすべての配列で同一であることを意味する。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。 組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のフローサイトメトリーによる、１５Ｃ１ヒト化突然変異体の分析を示す一連のグラフである。

本明細書に記載する改変された抗体は、改変された抗体が、改変されていない抗体と比
較して、抗原との結合を保持したままで抗原依存性のエフェクター機能の改変を誘発する
ように、γ重鎖定常領域中に少なくとも１つの特異的なアミノ酸置換を含む抗体である。
好ましい実施形態では、改変された抗体は、ヒトである。たとえば、改変された抗体は、
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプである。

本発明の改変された抗体にはまた、抗体のＣＤＲ３領域中の少なくとも１つのアミノ酸
残基が改変されている改変体ＣＤＲ３領域を有する、改変された抗体も含まれる。本発明
の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ
領域の少なくともＦｃγＲ結合部分および改変体ＣＤＲ３領域を含むポリペプチドも含ま
れる。本発明の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免疫グロブリンポリペ
プチドの少なくとも改変体Ｆｃ領域および改変体ＣＤＲ３領域を含むポリペプチドも含ま
れる。改変体ＣＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＨ ＣＤＲ３領域が含まれる：
ＫＤＰＳＤＡＦＰＹ（配列番号８０）およびＫＤＰＳＥＧＦＰＹ（配列番号８１）。改変
体ＣＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＬ ＣＤＲ３領域が含まれる：ＱＮＳＨＳ
ＦＰＬＴ（配列番号８２）、ＱＱＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号８３）、ＱＮＳＳＳＦＰＬＴ
（配列番号８４）、およびＱＱＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８５）。

本発明の改変された抗体には、抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中の少なくともＥＵ位
置３２８のアミノ酸残基が改変されている、改変された抗体が含まれる。たとえば、少な
くともＥＵ位置３２８のアミノ酸残基がフェニルアラニンで置換されている。本明細書に
記載する改変された抗体中では、改変されていない抗体と比較して、少なくともＥＵ位置
３２８のアミノ酸残基が、単独で、またはＥＵアミノ酸位置３２５および３２６と一緒に
、異なる残基で置換されている。

改変されたＦｃ部分を有するこれらの改変された抗体は、改変されていない抗体と比較
して、改変されたエフェクター機能、たとえば改変されたＦｃ受容体活性を誘発する。た
とえば、ヒトＦｃ受容体は、ＣＤ３２Ａである。一部の実施形態では、改変された抗体は
、改変されていない抗体と比較して、ＣＤ３２Ａとのライゲーションに続いて、前炎症性
メディエーターの放出の防止を誘発する。したがって、本明細書に記載する改変された抗
体は、標的抗原と結合する能力を保持したままで、前炎症性メディエーターの放出の阻止
などの改変されたＦｃ受容体活性を誘発する。一部の実施形態では、改変された抗体は中
和抗体であり、改変された抗体は、標的抗原の１つまたは複数の生物活性を中和する能力
を保持したままで、改変されたＦｃ受容体活性を誘発する。

たとえば、本発明の改変された抗体には、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体の複合体と結
合するモノクローナル抗体が含まれる。この受容体複合体は、グラム陰性細菌の外膜の主
要な構成要素であるリポ多糖（ＬＰＳ）によって活性化される。本発明の改変された抗体
は、ＬＰＳを介して受容体活性化および続く細胞内シグナル伝達を阻害する。したがって
、改変された抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体の複合体の活性化を中和する。具体的に
は、本発明は、細胞表面上に発現されるＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体の複合体を認識する、
改変された抗体を提供する。これらの改変された抗体は、ＬＰＳに誘発されるＩＬ−８の
産生を遮断する。さらに、本発明の一部の改変された抗体はまた、ＭＤ−２と複合体形成
していない場合にもＴＬＲ４を認識する。改変された抗体は、たとえばヒト化抗体である
。

本発明の抗体には、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体の複合体と結合し、また、ＭＤ−２
の存在とは独立してもＴＬＲ４と結合する抗体が含まれる。本発明の抗体にはまた、ヒト
ＴＬＲ４／ＭＤ−２受容体の複合体のＴＬＲ４部分と結合するが、結合がＭＤ−２の存在
に依存する抗体も含まれるが、ＭＤ−２の存在によって結合が大きく増強され、これは、
ＭＤ−２の存在がＴＬＲ４中のコンホメーション変化を引き起こして、抗体によって結合
されるエピトープが曝露することを示唆している。さらに、本発明の抗体には、ヒトＴＬ
Ｒ４／ＭＤ−２受容体の複合体と結合し、ＴＬＲ４の存在下でＭＤ−２とも結合する抗体
が含まれる。

本発明の改変された抗体にはまた、任意のトル様受容体などの標的を認識する抗体も含
まれる。トール受容体は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ中で最初に発見され、タンパク質の細胞
外部分にロイシンに富んだ反復（ＬＲＲ）を有し、１つまたは２つのシステインに富んだ
ドメインを有する、Ｉ型膜貫通タンパク質である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトール受容体の
哺乳動物の相同体は、「トル様受容体」（ＴＬＲ）として知られている。ＴＬＲは、微生
物粒子を認識し、これらの微生物粒子源に対して免疫細胞を活性化することによって、自
然免疫において役割を果たす。

現在、１１種類のトル様受容体、ＴＬＲ１〜１１がヒトで同定されている（Ｐａｎｄｅ
ｙ ＳおよびＡｇｒａｗａｌ ＤＫ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌ
ｉｋｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｒｅｎｄｓ。Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００６年；８４：３３３〜３４１頁）。これらのＴＬＲは、その細
胞内ドメインの、ＩＬ−１受容体のそれに対する相同性によって、かつ細胞外のロイシン
に富んだ反復の存在によって、特徴づけられている。様々な種類のＴＬＲは様々な種類の
微生物粒子によって活性化される。たとえば、ＴＬＲ４は、主にリポ多糖（ＬＰＳ）によ
って活性化される一方で、ＴＬＲ２はリポテイコ酸（ＬＴＡ）、リポアラビノマンナン（
ＬＡＭ）、リポタンパク質（ＢＬＰ）、およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）によって活性
化される。ＲＰ１０５などのトール受容体相同体も同定されている。

たとえば、本発明の改変された抗体には、たとえば、Ｔ２．５として知られている抗Ｔ
ＬＲ２モノクローナル抗体の１つまたは複数の改変されたバージョンを含めた、ＴＬＲ２
を認識する抗体が含まれる（たとえば、その全体が本明細書に参照により組み込まれてい
るＷＯ２００５／０２８５０９参照）。

他の適切な改変された抗体には、ＣＤ１４を認識する抗体、たとえば、２８Ｃ５として
知られている抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の１つまたは複数の改変されたバージョンが
含まれる（たとえば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，
４４４，２０６号参照）。
定義：
別段に定義しない限りは、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業
者に一般的に理解される意味を有する。さらに、内容からそうでないことが必要でない限
りは、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、
本明細書に記載する、細胞および組織の培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオ
リゴ−またはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用する
学名、またその技術は、当分野で周知かつ一般的に使用されているものである。標準の技
術を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（たと
えば、電気穿孔、リポフェクション）に用いる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕
様書に従って、または当分野で一般的に達成されているもしくは本明細書に記載するよう
に行う。前述の技術および手順は、一般に、当分野で周知の慣用の方法に従って、および
本明細書全体にわたって引用かつ記述した、様々な一般的かつより具体的な参考文献に記
載のように行う。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化
学、および医薬や製薬化学に関連して利用する学名、ならびにその実験室の手順および技
術は、当分野で周知かつ一般的に使用されているものである。標準の技術を、化学合成、
化学分析、製薬の調製、配合、および送達、ならびに患者の治療に用いる。

本開示に従って利用する以下の用語は、別段に指定しない限りは、以下の意味を有する
と理解されたい。

本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉ
ｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）
抗原結合部位を含む分子をいう。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「
免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し
、他のポリペプチドとは反応しない、またははるかに低い親和性（Ｋ_ｄ＞１０^−６）で結
合することを意味する。抗体には、それだけには限定されないが、ポリクローナル、モノ
クローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’およびＦ_{（ａｂ
’）２}断片、ｓｃＦｖ、ならびにＦ_ａｂ発現ライブラリが含まれる。

基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は２つ
の同一のポリペプチド鎖の対からなり、それぞれの対は、１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ
）および１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部
分には、主に抗原認識を担っている、約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸
の可変領域が含まれる。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を
担っている定常領域を定義する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのうちのいずれかに関連し、これらは、分子中に存
在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスにはサブクラスも存在し、たとえ
ば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などである。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得
る。

本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗
体組成物」とは、一意の軽鎖遺伝子産物および一意の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の
１つの分子種のみを含む、抗体分子の集団をいう。具体的には、モノクローナル抗体の相
補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子で同一である。ＭＡｂは、それに対する
独特の結合親和性によって特徴づけられた抗原の特定のエピトープと、免疫反応すること
ができる抗原結合部位を含む。

用語「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分
子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（
「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖および
軽鎖のＶ領域内の３つの相違性が高いストレッチが、「フレームワーク領域」または「Ｆ
Ｒ」として知られている、より保存されているフランキングストレッチの間に挿入されて
いる。したがって、用語「ＦＲ」とは、天然では、免疫グロブリン中の超可変領域の間お
よびそれに隣接して見つかる、アミノ酸配列をいう。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変
領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間内で互
いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり
、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ
」と呼ばれる。それぞれのドメインのアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａら
、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従う。

本明細書で使用する用語「エピトープ」には、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細
胞受容体と特異的結合することができる任意のタンパク質決定因子が含まれる。用語「エ
ピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的結合することができる任意
のタンパク質決定因子が含まれる。エピトープ決定因子は、通常、アミノ酸または糖側鎖
などの分子の化学的に活性のある表面基からなり、通常、特異的な三次元構造的特徴、お
よび特異的な荷電特徴を有する。たとえば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端
ペプチドに対して産生し得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ、たとえば≦１００ｎＭ、好
ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭである場合に、抗原と特異的に結合すると
言われる。

本明細書で使用する用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」とは、免疫グロ
ブリン分子と免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こる種類の非共有的相互作用をい
う。免疫学的結合の相互作用の強度、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_ｄ）の観
点から表すことができ、より小さなＫ_ｄがより高い親和性を表す。選択したポリペプチド
の免疫学的結合特性は、当分野で周知の方法を用いて定量することができる。１つのその
ような方法は、抗原結合部位／抗原の複合体の形成および解離の速度の測定を伴い、これ
らの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および速度に両方向で同等に
影響を与える幾何学的パラメータに依存する。したがって、「会合速度定数」（Ｋ_ｏｎ）
と「解離速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）はどちらも、濃度ならびに会合および解離の実際の速度
を計算することによって決定できる。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６〜８７頁（１９９
３年）参照）。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比により、親和性に関連しないすべてのパラメータの
相殺が可能となり、これが解離定数Ｋ_ｄに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９
０年）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９〜４７３頁参照）。本発明
の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に知られている同様のアッセイなど
のアッセイによって測定して、平衡結合定数（Ｋ_ｄ）が≦１μＭ、たとえば≦１００ｎＭ
、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭである場合に、その標的と特異的に結
合すると言われる。

本明細書で使用する用語「単離したポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、もし
くは合成起源のまたはその何らかの組合せポリヌクレオチドを意味し、その起源が原因で
、「単離したポリヌクレオチド」は、（１）「単離したポリヌクレオチド」が天然で見つ
かるポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と会合していないか、（２）天然では連結し
ていないポリヌクレオチドと作動可能に連結しているか、または（３）天然においてより
大きな配列の一部として存在しない。本発明によるポリヌクレオチドには、本明細書に記
載する、重鎖免疫グロブリン分子をコードしている核酸分子、および軽鎖免疫グロブリン
分子をコードしている核酸分子が含まれる。

本明細書で言及する用語「単離したタンパク質」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、もし
くは合成起源またはその何らかの組合せのタンパク質を意味し、その起源または由来源が
原因で、「単離したタンパク質」は、（１）天然で見つかるタンパク質と会合していない
か、（２）同じ供給源からの他のタンパク質を含まない、たとえば、ネズミタンパク質を
含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に存在
しない。

本明細書において、用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列のネイティブタンパク
質、断片、または類似体に言及する一般用語として使用する。したがって、ネイティブタ
ンパク質断片および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明によるポリペプチドは
、本明細書に記載する重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子、重鎖免疫
グロブリン分子とκ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子、およびその
逆を含む組合せによって形成される抗体分子、ならびにそれらの断片および類似体を含む
。

物体に適用して本明細書で使用する用語「天然に存在する」とは、物体を天然で見つけ
ることができることをいう。たとえば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然での供
給源から単離することができ、実験室内または他の様式で意図的に人工改変されていない
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」とは、そのように記載した構成要素の
位置が、その意図した様式で機能することを可能にする関係にあることをいう。コード配
列と「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合した条件下
で達成されるように、ライゲーションする。

本明細書で使用する用語「制御配列」とは、それがライゲーションしているコード配列
の発現およびプロセシングをもたらすために必要なポリヌクレオチド配列をいう。そのよ
うな制御配列の性質は宿主生物に応じて変化し、原核生物では、そのような制御配列には
、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ、真核生物
では、一般に、そのような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。
用語「制御配列」には、最小でも、その存在が発現およびプロセシングに必須であるすべ
ての構成要素が含まれることを意図し、その存在が有利である追加の構成要素、たとえば
、リーダー配列および融合パートナー配列も含まれることができる。本明細書で言及する
用語「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１０個の塩基長のヌクレオチドのポリマーホ
ウ素、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのどちらか、またはいずれかの種
のヌクレオチドの改変された形態を意味する。この用語には、ＤＮＡの一本鎖および二本
鎖形態が含まれる。

本明細書で使用する２０個の慣用のアミノ酸およびその略記は、慣用の用法に従う。Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂおよび
Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、マサチューセッツ州Ｓｕ
ｎｄｅｒｌａｎｄ（１９９１年））を参照されたい。２０個の慣用のアミノ酸の立体異性
体（たとえばＤ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−ア
ルキルアミノ酸、乳酸、および他の慣用でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切
な構成要素であり得る。慣用でないアミノ酸の例には、４ヒドロキシプロリン、γ−カル
ボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ
−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン
、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およ
びイミノ酸（たとえば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用するポリペ
プチドの表示では、標準の用法および慣例に従って、左側の方向がアミノ末端の方向であ
り、右側の方向がカルボキシ末端の方向である。

ポリペプチドに適用する用語「実質的な同一性」とは、２つのペプチド配列が、初期設
定のギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってなど、最
適にアラインメントした場合に、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも
９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少
なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。

好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性をいう。たとえば、脂肪
族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイ
シンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニン
であり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、
芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン
であり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであ
り、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい
保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロ
シン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、および
アスパラギン−グルタミンである。

本明細書に記載する、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の軽微な変動は、
アミノ酸配列中の変動が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、
９５％、最も好ましくは９９％であることを維持している限りは、本発明によって包含さ
れることを企図する。具体的には、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換とは、
その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝子にコードさ
れているアミノ酸は、一般に、ファミリーに分類される。（１）酸性アミノ酸は、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチ
ジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プ
ロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）無電荷の極性ア
ミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チ
ロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン、およびスレオニンが含まれる。疎
水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェ
ニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる。他のアミ
ノ酸のファミリーには、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオ
ニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）
脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、ならびに（ｉ
ｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含ま
れる。たとえば、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで、アスパラギン酸をグルタミ
ン酸で、スレオニンをセリンで置き換える隔離した置き換え、または１つのアミノ酸を構
造的に関連したアミノ酸で置き換える同様の置き換えは、特に置き換えがフレームワーク
部位内のアミノ酸に関与しない場合、生じる分子の結合または特性に大きな影響は与えな
いと予測することが妥当である。アミノ酸の変化が機能的なペプチドをもたらすかどうか
は、ポリペプチド誘導体の特異的活性のアッセイを行うことによって、容易に決定するこ
とができる。アッセイは、本明細書に詳述されている。抗体または免疫グロブリン分子の
断片または類似体は、当業者によって容易に調製することができる。断片または類似体の
好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的お
よび機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公共または独
自所有の配列データベースと比較することによって、同定することができる。好ましくは
、コンピュータによる比較方法を用いて、既知の構造および／または機能の他のタンパク
質中で生じる、配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同
定する。既知の三次元構造へと折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、知られて
いる。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４頁（１９９１年）。したがって、
前述の例は、当業者が、本発明による構造的および機能的ドメインを定義するために使用
し得る配列モチーフおよび構造的コンホメーションを認識できることを、実証している。

好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（
２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体を形成する結合親和
性を改変するもの、（４）結合親和性を改変するもの、および（４）そのような類似体に
他の物理化学的または機能的特性を与えるまたはそれを改変させるものである。類似体に
は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の、様々な突然変異体タンパク質が含まれる
ことができる。たとえば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置
換）は、天然に存在する配列中（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペ
プチドの部分に行い得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を相当に変化させ
ないべきである（たとえば、置換するアミノ酸は、親配列中に存在するらせんを破壊した
り、または親配列を特徴づける他の種類の二次構造を乱したりする傾向を持たないべきで
ある）。当分野で認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１年））；ならびにＴｈｏｒｎｔ
ｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５頁（１９９１年）に記載されている。

本明細書で使用する用語「標識」または「標識した」とは、検出可能なマーカーの取り
込み、たとえば、放射標識したアミノ酸の取り込み、またはポリペプチドに印を付けたア
ビジン（たとえば、光学的もしくは熱量的方法によって検出することができる蛍光マーカ
ーもしくは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニ
ル部分を付着させることによるものをいう。特定の状況では、標識またはマーカーは治療
的であることもできる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当分野
で知られており、使用し得る。ポリペプチドの標識の例には、それだけには限定されない
が、以下のものが含まれる：放射性同位体または放射性核種（たとえば、^３Ｈ、^１４Ｃ、
^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（た
とえば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（たとえば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
、化学発光性、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される事前に決定されたポリ
ペプチドエピトープ（たとえば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結
合ドメイン、エピトープタグ）。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を減少
するために、様々な長さのスペーサーアームによって付着させる。本明細書で使用する用
語「製薬または薬物」とは、患者に適切に投与した場合に所望の治療効果を誘発すること
ができる化学物質または組成物をいう。

本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ
ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ
ｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））によって例示されるように、当分野の
慣用の用法に従って使用する。

本明細書で使用する「実質的に純粋」とは、１つの物体種が、存在する優勢の種であり
（すなわち、モル濃度に基づいて、組成物中のすべての他の個々の種よりも多く存在する
）、好ましくは、実質的に精製した画分とは、物体種が存在するすべての巨大分子種の少
なくとも約５０％（モル濃度に基づく）を構成する組成物である。

一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０％
より多く、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％より多くを構成する
。最も好ましくは、物体種を、本質的に均質（汚染物質種が、慣用の検出方法によって組
成物中に検出できない）まで精製し、組成物が本質的に単一の巨大分子種からなる。

用語、患者には、ヒトおよび獣医学上の対象が含まれる。
抗体
本明細書に記載する改変された抗体とは、改変された抗体が、改変されていない抗体と
比較して、抗原との結合を保持したままで抗原依存性のエフェクター機能の改変を誘発す
るように、γ重鎖定常領域中に少なくとも１つの特異的なアミノ酸置換を含む抗体である
。好ましい実施形態では、改変された抗体は、ヒトである。たとえば、改変された抗体は
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプである。

本発明の改変された抗体にはまた、抗体のＣＤＲ３領域中の少なくとも１つのアミノ酸
残基が改変されている改変体ＣＤＲ３領域を有する、改変された抗体も含まれる。本発明
の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ
領域の少なくともＦｃγＲ結合部分および改変体ＣＤＲ３領域を含むポリペプチドが含ま
れる。本発明の改変された抗体および改変ポリペプチドにはまた、免疫グロブリンポリペ
プチドの少なくとも改変体Ｆｃ領域および改変体ＣＤＲ３領域を含むポリペプチドも含ま
れる。改変体ＣＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＨ ＣＤＲ３領域が含まれる：
ＫＤＰＳＤＡＦＰＹ（配列番号８０）およびＫＤＰＳＥＧＦＰＹ（配列番号８１）。改変
体ＣＤＲ３領域には、実施例４に示す改変体ＶＬ ＣＤＲ３領域が含まれる：ＱＮＳＨＳ
ＦＰＬＴ（配列番号８２）、ＱＱＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号８３）、ＱＮＳＳＳＦＰＬＴ
（配列番号８４）、およびＱＱＳＨＳＦＰＬＴ（配列番号８５）。

一実施形態では、ＴＬＲ４、ＭＤ２および／またはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を認識する
改変された抗体は、ＬＰＳに誘発される炎症誘発性サイトカインの産生を阻害する能力を
有する。この阻害は、その改変されたＦｃ部分がヒトＣＤ３２Ａと結合している間に、改
変された抗体のＦｖ部分がその標的抗原と結合することのクロストーク機構によって達成
される。阻害は、たとえば、ヒト全血および本明細書に記載するｈｕＴＬＲ４／ＭＤ２で
形質移入したＨＥＫ２９３細胞アッセイにおいて決定される。本実施形態では、改変され
た抗体は、たとえば、本明細書で「ｍｕ１８Ｈ１０」、「ｈｕ１８Ｈ１０」、「ｍｕ１６
Ｇ７」、「ｍｕ１５Ｃ１」、「ｈｕ１５Ｃ１」、「ｍｕ７Ｅ３」および「ｈｕ７Ｅ３」と
呼ぶ、モノクローナル抗体の改変されたバージョンである。ｍｕ１８Ｈ１０およびｈｕ１
８Ｈ１０抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を認識するが、ＴＬＲ４と複合体形成してい
ない場合にはＭＤ−２タンパク質を認識しない。ｍｕ１６Ｇ７、ｍｕ１５Ｃ１、ｈｕ１５
Ｃ１、ｍｕ７Ｅ３およびｈｕ７Ｅ３モノクローナル抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を
認識する。ｍｕ１５Ｃ１、ｈｕ１５Ｃ１および１６Ｇ７はまた、ＭＤ−２と複合体形成し
ていない場合でもＴＬＲ４を認識する。

本発明にはまた、本明細書に記載する改変された抗体と同じエピトープと結合する抗体
も含まれる。たとえば、本発明の改変された抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体と特異的
に結合し、抗体は、図１５に示すアミノ酸配列の残基２８９〜３７５のヒトＴＬＲ４上の
１つまたは複数のアミノ酸残基が含まれるエピトープと結合する。別の例では、改変され
た抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体と特異的に結合し、抗体は、図１４Ｂに示すアミノ酸
配列の残基１９〜５７のヒトＭＤ−２上のエピトープと結合する。当業者には、必要以上
の実験を行わずに、モノクローナル抗体が、本発明の改変された抗体と同じ特異性を有す
るかどうかを決定することが、前者が、後者が標的（たとえば、ＴＬＲ２、ＣＤ１４、Ｔ
ＬＲ４／ＭＤ−２複合体またはＭＤ−２と複合体形成していない場合のＴＬＲ４）と結合
することを妨げるかどうかを確認することによって可能であることを、理解されよう。試
験するモノクローナル抗体が、本発明の改変された抗体による結合の減少によって示され
るように本発明の改変された抗体と競合する場合、２つの抗体は、同じ、または密に関連
するエピトープと結合する。モノクローナル抗体が本発明の改変された抗体の特異性を有
するかどうかを決定する代替方法は、本発明の改変された抗体を、それが通常反応性を有
する標的とプレインキュベーションし、その後、試験するモノクローナル抗体を加えて、
試験するモノクローナル抗体の標的と結合するその能力が阻害されているかどうかを決定
する。試験するモノクローナル抗体が阻害されている場合は、これは、ほとんど確実に、
本発明のモノクローナル抗体と同じ、または機能的に等価なエピトープ特異性を有する。

当分野で知られている様々な手順を用いて、所定の標的、たとえば、トル様受容体、Ｔ
ＬＲ４／ＭＤ−２複合体、もしくはＭＤ−２と複合体形成していない場合のＴＬＲ４、Ｔ
ＬＲ２、ＣＤ１４などに対する、またはそれらの誘導体、断片、類似体、相同体もしくは
相同分子種に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生に用い得る。（たと
えば、本明細書に参照により組み込まれているＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ＥおよびＬａｎｅ Ｄ、１９８８年、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照）。

抗体は、主に免疫血清のＩｇＧ画分をもたらすプロテインＡまたはプロテインＧを用い
たアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製する。続いて、また
はその代わりに、求める免疫グロブリンの標的の特異的な抗原、またはそのエピトープを
、カラム上に固定して、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗
体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、たとえば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．出版、ペンシルベニア州
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁
）によって記載されている。

好ましくは、本発明の改変された抗体は、モノクローナル抗体である。改変された抗体
は、たとえば、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、その表面上に高レベルの所定の標的を発現する細
胞形質移入体の組合せで免疫化することによって、作製する。その後、骨髄腫／Ｂ細胞の
融合から生じるハイブリドーマを、選択した標的に対する反応性についてスクリーニング
する。

モノクローナル抗体は、たとえば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）によって記載されているものなどのハイブリドーマ
方法を用いて調製する。ハイブリドーマ方法では、典型的には、マウス、ハムスター、ま
たは他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫化して、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生す
るまたは産生する能力を有するリンパ球を誘発させる。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで免疫化することができる。

免疫剤には、典型的には、タンパク質抗原、その断片またはその融合タンパク質が含ま
れる。一般に、ヒト起源の細胞を所望する場合は末梢血リンパ球を使用し、または非ヒト
哺乳動物起源を所望する場合は脾臓細胞もしくはリンパ節細胞を使用する。その後、リン
パ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞系と融合して、
ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、（１９８６年）５９〜１０３頁）。不死化細胞系は、通常、形質転換させた哺乳動
物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマ
ウスの骨髄腫細胞系を用いる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化
細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培地中で、培養する
ことができる。たとえば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培地には、典型
的には、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、およびチミジンが含まれる（「ＨＡＴ培地」）。

好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定し
た高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のあるものである。より好まし
い不死化細胞系は、たとえば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏおよびＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａ
ｓから得ることができるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄
腫の細胞系も、モノクローナル抗体の産生について記載されている。（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、（１９８７年）５１〜６３頁）参照）。

その後、ハイブリドーマ細胞を培養した培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存
在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生さ
れたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってまたはラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結
合アッセイによって決定する。そのような技術およびアッセイは当分野で知られている。
モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード分析に
よって決定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療的な応用では、標的抗
原に対して高い度合の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要で
ある。

所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手順によってサブクロー
ニングし、標準の方法によって増殖させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）５９〜１０３頁参照）。この目的に適し
た培養培地には、たとえば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地
が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてｉｎ ｖｉｖｏ
で増殖させることができる。

サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、たとえば、プロテインＡ−セ
ファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または
アフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製手順によって、培地
または腹水から単離または精製することができる。

モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のものなどの、組
換えＤＮＡ方法によっても産生することができる。本発明のモノクローナル抗体をコード
しているＤＮＡは、慣用の手順を用いて（たとえば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコー
ドしている遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用す
ることによって）容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ
細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役割を果たす。単離した後、ＤＮＡを
発現ベクター内に入れることができ、その後、これを、そうでなければ免疫グロブリンタ
ンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ま
たは骨髄腫細胞などの宿主細胞内に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗
体の合成が得られる。ＤＮＡはまた、たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコ
ード配列を相同的なネズミ配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６
，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８１２〜１３頁（１９９４年）
参照）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配
列の全体もしくは一部を共有結合させることによっても、改変することができる。そのよ
うな非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインで置換するか、また
は本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換して、キメラ二価抗体を作製
することができる。

本発明のモノクローナル抗体には、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれる。これらの抗
体は、投与した免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を発生させずに、ヒトに投与
するために適している。抗体のヒト化形態は、主にヒト免疫グロブリンの配列からなり、
非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロ
ブリン鎖またはその断片である（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または他の抗
体の抗原結合部分配列など）。ヒト化は、たとえば、Ｗｉｎｔｅｒおよび同僚の方法（Ｊ
ｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａ
ｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従うことによっ
て、げっ歯類のＣＤＲまたはヒト抗体の対応する配列のＣＤＲ配列を置換することによっ
て行う。（米国特許第５，２２５，５３９号も参照。）一部の例では、ヒト免疫グロブリ
ンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基によって置き換える。ヒト化抗体はま
た、たとえば、レシピエント抗体中にも、輸入したＣＤＲまたはフレームワーク配列中に
も見つからない残基も含む。一般に、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、典型的には２つ
の、可変ドメインの実質的にすべてが含まれ、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべて
が非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にす
べてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体にはまた、免疫グ
ロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも
、最適に含まれる（Ｊｏｎｅｓら、１９８６年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年；お
よびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６頁
（１９９２年））。

完全にヒトの抗体とは、ＣＤＲを含めた軽鎖と重鎖の両方の配列全体が、ヒト遺伝子か
ら生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書で「ヒト抗体」または「完全にヒ
トの抗体」と呼ぶ。モノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２頁参照）、
およびモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５
年、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡ
ＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁参照）を用いることによって調
製することができる。モノクローナル抗体を利用してよく、ヒトハイブリドーマを用いる
ことによって（Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８０：２０２６〜２０３０頁参照）、またはヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルス
で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換させることによって（Ｃｏｌｅら、１９８５年、ＭＯＮ
ＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁参照）、産生し得る。

さらに、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含めたさらなる技術を用
いて産生することもできる。（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
、２２２：５８１頁（１９９１年）参照）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座
位を、内在性の免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に失活させたトランスジェニッ
ク動物、たとえば、マウス内に導入することによって、産生することができる。免疫誘発
後、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子の再配置、アセンブリ、および抗体レパ
ートリーを含めた、すべての観点からヒトで見られるものとよく似ている。この手法は、
たとえば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，
８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号
、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、７７９〜７８３頁（１
９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８５６〜８５９頁（１９９４年
）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、８１２〜１３頁（１９９４年）；Ｆｉｓ
ｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８４５〜５１頁（１
９９６年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、
８２６頁（１９９６年）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３、６５〜９３頁（１９９５年）に記載されている。

ヒト抗体はさらに、抗原による免疫誘発に応答して動物の内在性抗体ではなく完全にヒ
トの抗体を産生するように改変した、トランスジェニック非ヒト動物を用いて産生し得る
。（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２６０２参照）。非ヒト宿主中の重鎖および軽鎖免疫グロブ
リン鎖をコードしている内在性遺伝子を無能力にし、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリ
ンをコードしている活性座位を宿主のゲノム内に挿入する。たとえば必須のヒトＤＮＡセ
グメントを含む酵母人工染色体を用いて、ヒト遺伝子を取り込ませる。その後、改変の、
完全より少ない補体を含む中間トランスジェニック動物を交雑させることによって、すべ
ての所望の改変を提供する動物が子孫として得られる。そのような非ヒト動物の例は、Ｐ
ＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されている、Ｘｅｎｏ
ｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれるマウスである。この動物は、完全にヒトの免疫グロブリン
を分泌するＢ細胞を生じる。抗体は、目的の免疫原で免疫化した後に動物から直接、たと
えばポリクローナル抗体の調製物として、あるいは、モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマなどの動物に由来する不死化Ｂ細胞から、得ることができる。さらに、ヒト可
変領域を有する免疫グロブリンをコードしている遺伝子を回収し、発現させて、抗体を直
接得ることができるか、またはさらに改変して、抗体の類似体、たとえば単鎖Ｆｖ（ｓｃ
Ｆｖ）分子などを得ることができる。

内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠くマウスとして例示されている、非ヒト宿主を生
成する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。これは、座位の
再配置を防止し、再配置された免疫グロブリン重鎖座位の転写物の形成を防止するために
、胚性幹細胞中の少なくとも１つの内在性重鎖座位からＪセグメント遺伝子を欠失させる
ことであって、欠失が、選択マーカーをコードしている遺伝子を含む標的化ベクターによ
り行われることと、胚性幹細胞から、体性細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードし
ている遺伝子を含むトランスジェニックマウスを作製することとを含む方法によって得る
ことができる。

ヒト抗体などの目的の抗体を産生するための１つの方法が、米国特許第５，９１６，７
７１号に開示されている。この方法は、重鎖をコードしているヌクレオチド配列を含む発
現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞内に導入することと、軽鎖をコードして
いるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞内に導入することと
、２つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することとを含む。ハイブリッド細胞
は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。

本手順のさらなる改善では、免疫原上の臨床的に意味のあるエピトープを同定する方法
、および関連するエピトープと高い親和性で特異的に結合する抗体を選択するための相関
性の方法が、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。

抗体は、上述の単鎖抗体をコードしているＤＮＡセグメントを含むベクターによって発
現させることができる。

これらには、ベクター、リポソーム、裸ＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、
カテーテルなどが含まれることができる。ベクターには、ＷＯ９３／６４７０１に記載の
ものなどの、標的化部分（たとえば細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部
分（たとえばポリリシン）を有する化学コンジュゲート、ウイルスベクター（たとえば、
ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２
２６１８）に記載のものなどの、標的部分（たとえば標的細胞に特異的な抗体）および核
酸結合部分（たとえばプロタミン）を含む融合タンパク質である融合タンパク質、プラス
ミド、ファージなどが含まれる。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。

好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学コンジュゲート
が含まれる。レトロウイルスベクターには、モロニーネズミ白血病ウイルスが含まれる。
ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックスまたはトリ
ポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクタ
ーなどのヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ、６４：４８７頁（１９９５年）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅ
ｓｓ、英国Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９５年）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３頁（１９９３年）；Ｇｅｌｌｅ
ｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１１４９頁（
１９９０年）参照、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５９：９８８頁（１９９３年）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ
３：２１９頁（１９９３年）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４頁（１９９
５年）参照、ならびにアデノ関連ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａ
ｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８頁（１９９４年）参照が含まれる。

ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質内に導入する。トリポックスウイ
ルスベクターは、短期間の核酸の発現しかもたらさない。アデノウイルスベクター、アデ
ノ関連ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経
細胞内に導入するために好ましい。アデノウイルスベクターは、ＨＳＶベクターより短い
アデノ関連ウイルス（約４カ月）よりも短期間の発現（約２カ月）をもたらす。選択する
具体的なベクターは、標的細胞および治療する状態に依存する。導入は、標準の技術、た
とえば、感染、形質移入、形質導入または形質転換によるものであり得る。遺伝子導入様
式の例には、たとえば、裸ＤＮＡ、ＣａＰＯ_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、
プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入、およびウイルスベクターが含ま
れる。

ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために用いることができる。
たとえば、定位注入を用いて、ベクター（たとえば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の
位置に向けることができる。さらに、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプインフュージョンシステムを用いて、側脳室内（ｉｃｖ
）インフュージョンによって送達することができる。また、対流と呼ばれるバルク流に基
づく方法が、大分子を脳の広範な領域に送達することにおいて有効性が示され、ベクター
を標的細胞に送達することにおいて有用であり得る。（Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６〜２０８０頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２〜３０５頁（１９９４年）参照）
。使用できる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、なら
びに経口または他の既知の投与経路が含まれる。

二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体で
ある。本例では、結合特異性のうちの１つは、ＴＬＲ４、ＭＤ２、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合
体、ＴＬＲ２、ＣＤ１４または任意のトル様受容体などの標的に対するものである。第２
の結合標的は任意の他の抗原であり、有利には、細胞表面タンパク質または受容体もしく
は受容体サブユニットである。

二重特異性抗体を産生する方法は、当分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗
体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づいており、２
本の重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ
、３０５：５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖がラン
ダムな組合せであるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる
抗体分子の潜在的な混合物を生じ、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する
。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーステップによって達成
する。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示
されている。

所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原の結合部位）は、免疫グロブ
リン定常ドメイン配列と融合させることができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２
、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。
融合体のうちの少なくとも１つ中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常
領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードしているＤ
ＮＡ、および、所望する場合は、免疫グロブリン軽鎖は、別々の発現ベクター内に挿入さ
れ、適切な宿主生物内に同時形質移入する。二重特異性抗体の産生のさらなる詳細には、
たとえば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２
１０頁（１９８６年）を参照されたい。

ＷＯ９６／２７０１１に記載の別の手法によれば、一対の抗体分子間の境界を、組換え
細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合が最大となるように操作することができる
。好ましい境界には、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部が含まれる。本方
法では、第１の抗体分子の境界からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大き
な側鎖（たとえば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖
をより小さなもの（たとえば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、
大きな側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの代償的な「空洞」が、第２の抗体分子
の境界上に生じる。これは、ヘテロ二量体の収率をホモ二量体などの他の望ましくない最
終産物を超えて増加させる機構をもたらす。

抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術は、文献に記載されている。たとえば、二
重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。産生された二重特異性抗体は
、酵素を選択的に固定する薬剤として使用することができる。

二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接産生および単離するための様々な技術
も、記載されている。たとえば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生され
ている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３
頁（１９９２年）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、
２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合によって連結させた。抗体ホモ二量体を
ヒンジ領域で還元させて単量体を形成し、その後、再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成
した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎ
ｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８
頁（１９９３年）によって記載されている「二重特異性抗体」技術により、二重特異性抗
体断片を産生する代替機構が提供されている。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対
合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と結合した重鎖
可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。したがって、１つの断片のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、別
の断片の相補的Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインと対合することが強いられ、それにより２つの抗
原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性
抗体断片を産生する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５２：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。

２つよりも多い結合価を有する抗体が企図される。たとえば、三重特異性抗体を調製す
ることができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０頁（１９９１年）。

例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープと結合することができ、その少な
くとも１つは本発明のタンパク質抗原を起源とする。あるいは、細胞防御機構を、特定の
抗原を発現する細胞に集中させるために、免疫グロブリン分子の抗抗原アームを、Ｔ細胞
受容体分子（たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＢ７）などの白血球上の始
動分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩ
Ｉ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃ受容体と結合するアームと合わせ
ることができる。二重特異性抗体はまた、細胞毒性剤を、特定の抗原を発現する細胞に向
けるためにも使用することができる。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞毒性剤
または放射性核種キレート剤、たとえば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴ
ＥＴＡと結合するアームを保有する。別の目的の二重特異性抗体は、本明細書に記載する
タンパク質抗原と結合し、さらに組織因子（ＴＦ）と結合する。

ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、
２つの共有結合した抗体からなる。そのような抗体は、たとえば、免疫系細胞を望ましく
ない細胞へと標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号参照）、およびＨＩＶ
感染症を治療するため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８
９参照）に提案されている。抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、架橋剤を含むものを含めた、
合成タンパク質化学の知られている方法を用いて調製できることが企図される。たとえば
、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成すること
によって、構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートお
よびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびにたとえば米国特許第４，６７６，
９８０号に開示のものが含まれる。

たとえば、異常なＬＰＳシグナル伝達に関連する疾患および障害の治療における抗体の
有効性を増強するために、本発明の抗体を、エフェクター機能に関して改変することが望
ましい場合がある。たとえば、システイン残基（複数可）をＦｃ領域内に導入し、それに
より、この領域中に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。したがって
、産生されたホモ二量体抗体は、向上した内部移行能力ならびに／または増加した補体媒
介性細胞死滅および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。（Ｃ
ａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１７６：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およ
びＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）
参照）。あるいは、抗体は、二重のＦｃ領域を有し、したがって増強した補体溶解および
ＡＤＣＣ能力を有することができるように、抗体を操作することができる。（Ｓｔｅｖｅ
ｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、３：２１９〜２３０頁
（１９８９年）参照）。

本発明はまた、毒素（たとえば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性
のある毒素、またはその断片）などの細胞毒性剤、あるいは放射性同位体（すなわち放射
性コンジュゲート）とコンジュゲートした抗体を含む、免疫コンジュゲートにも関する。

使用できる酵素的に活性のある毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア
毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由
来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ
ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａ
ｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃ
ｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイ
シン、およびトリコテセンが含まれる。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体
を産生するために利用可能である。例には、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ
、および^１８６Ｒｅが含まれる。

抗体および細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル
の二官能性誘導体（ジメチルアジピイミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシン
イミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合
物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体
（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート
（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−
ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）等の、様々な二官能性タンパク質カップリ
ング剤を用いて作製する。たとえば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３８：１０９８頁（１９８７年）に記載のように調製することができる。炭素−
１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸
（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体とコンジュゲートさせるための例示的
なキレート化剤である。（ＷＯ９４／１１０２６参照）。

当業者は、様々な可能な部分を生じた本発明の抗体とカップリングさせることができる
ことを、認識されよう。（たとえば、その内容全体が本明細書に参照により組み込まれて
いる、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅおよ
びＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（
１９８９年）参照）。

カップリングは、抗体および他の部分がそのそれぞれの活性を保持する限りは、２つの
分子を結合させる任意の化学反応によって達成し得る。結合には、多くの化学機構、たと
えば、共有結合、親和性結合、挿入、配位結合および複合体形成が含まれることができる
。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合によって
、または外部架橋分子の取り込みによって、達成することができる。多くの二価または多
価の結合剤が、本発明の抗体などのタンパク質分子を他の分子とカップリングさせるため
に有用である。たとえば、代表的なカップリング剤には、チオエステル、カルボジイミド
、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンお
よびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物が含まれることができる。このリストは、
当分野で知られている様々なカップリング剤のクラスを網羅していることを意図せず、む
しろ、より一般的なカップリング剤の例示である。（ＫｉｌｌｅｎおよびＬｉｎｄｓｔｒ
ｏｍ、Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５〜２５４９頁（１９８４年）；Ｊａｎｓ
ｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２：１８５〜２１６頁（１９
８２年）；ならびにＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８頁（１９８７
年）参照。

好ましいリンカーは文献中に記載されている。（たとえば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用を記載している、Ｒａｍａｋｒ
ｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４：２０１〜２０８頁（１９８４年）
を参照されたい）。また、オリゴペプチドリンカーによって抗体とカップリングしたハロ
ゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している、米国特許第５，０３０，７１９
号も参照されたい。特に好ましいリンカーには、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−ス
クシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエ
ン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ（２１５５８Ｇ）、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ
（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエー
ト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）スルホ−Ｌ
Ｃ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンア
ミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ＃２１６５−Ｇ）、お
よび（ｖ）ＥＤＣとコンジュゲートしたスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシ
ンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ＃２４５１０）が含まれる。

上述のリンカーは、異なる特質を有する構成要素を含み、したがって、異なる物理化学
的特性を有するコンジュゲートがもたらされる。たとえば、アルキルカルボキシレートの
スルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも安
定である。ＮＨＳ−エステルを含むリンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも可溶性が
低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害のあるジスルフィド結合を含み、増加した
安定性を有するコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合はｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで切断され、利用可能なコンジュゲートの減少をもたらすため、ジスルフィド結合
は、一般に、他の結合よりも安定性が低い。特に、スルホ−ＮＨＳは、カルボジイミドカ
ップリングの安定性を増強させることができる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣな
ど）は、スルホ−ＮＨＳと併せて使用した場合に、カルボジイミドカップリング反応単独
よりも加水分解に対して耐性があるエステルを形成する。

本明細書に開示する抗体はまた、免疫リポソームとしても配合し得る。抗体を含むリポ
ソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：
３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、７７：４０３０頁（１９８０年）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号およ
び第４，５４４，５４５号に記載のものなどの、当分野で知られている方法によって調製
する。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開
示されている。

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導
体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相
蒸発方法によって作製することができる。リポソームは、定義された孔径のフィルターを
通して押し出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２８６〜２８８頁（１９８２年）に記載のように、ジスル
フィド交換反応によって、本発明の抗体のＦａｂ’断片をリポソームとコンジュゲートさ
せることができる。
改変された抗体の使用
本発明による治療部分の投与は、適切な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、
耐性などをもたらすために配合物中に取り込ませる他の薬剤と共に投与することを、理解
されよう。多数の適切な配合物を、すべての薬剤師に知られている処方集の中に見つける
ことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州
Ｅａｓｔｏｎ（１９７５年））、特にその中のＢｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒによる第８７
章。これらの配合物には、たとえば、散剤、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂
質、脂質（陽イオンまたは陰イオン性）を含有する小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）
など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水の乳濁液、乳濁
液カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカ
ーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。配合物中の活性成分が配合物によって失活
されず、配合物が投与経路と生理的に適合しており、かつそれに耐えられる限りは、前述
の混合物のうちの任意のものが、本発明による処置および治療において適切であり得る。
薬剤師に周知の配合物、賦形剤および担体に関するさらなる情報には、Ｂａｌｄｒｉｃｋ
Ｐ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．」Ｒｅｇｕ
ｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０〜８頁（２０００年）、
Ｗａｎｇ Ｗ．「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏ
ｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍ．２０３（１〜２）：１〜６０頁（２０００年）、Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ「Ｌｉ
ｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ
．８９（８）：９６７〜７８頁（２０００年）、Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕ
ｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉ
ｏｎｓ」ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８〜３１１頁（
１９９８年）およびその中の引用文献も参照されたい。

本発明の改変された抗体を含む本発明の治療配合物は、免疫関連障害に関連する症状を
治療または緩和させるために使用する。本発明はまた、免疫関連障害に関連する症状を治
療または緩和させる方法を提供する。治療レジメンは、標準の方法を用いて対象、たとえ
ば、免疫関連障害を患っている（またはそれを発生する危険性にある）ヒト患者を同定す
ることによって、実施する。たとえば、本発明の改変された抗体は、自己免疫疾患および
／または炎症性障害の治療における有用な治療的手段である。特定の実施形態では、ＴＬ
Ｒシグナル伝達を変調、たとえば、阻害、中和、またはそれと干渉する、改変された抗体
の使用は、自己免疫疾患および／または炎症性障害の治療に企図される。

自己免疫疾患には、たとえば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫の構成要素
を有するウイルス性疾患）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性
アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）
、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴ
Ｐ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病−ヘルペス状皮膚炎、慢性疲労免疫機能不
全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡
、寒冷凝集素病、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ルー
プス、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギラ
ン−バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ
）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性真性糖尿病、若年性慢性関節炎（スチル病）、若年性
関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧
血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋炎、多発性
筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬
性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシ
ス、強皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても知られてい
る）、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側
頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症
が含まれる。

炎症性障害には、たとえば、慢性および急性の炎症性障害が含まれる。炎症性障害の例
には、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈
硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血
症、脳卒中、組織および器官の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発肺
損傷が含まれる。

たとえば、改変された抗体は、微生物の産物（たとえばＬＰＳ）によって誘発された急
性炎症および敗血症ならびにこの急性炎症から生じる再燃、たとえば、慢性閉塞性肺疾患
および喘息などの治療に有用である（その全体が本明細書に参照により組み込まれている
、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３９６〜４０３頁（
２００３年）参照）。そのような抗体はまた、神経変性自己免疫疾患の治療においても有
用である。（その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Ｌｅｈｎａｒｄｔら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８５１４〜８５１９頁（２０
０３年））。

さらに、本発明の抗体はまた、機械的ストレスによって引き起こされ、ひいてはＴＬＲ
４を始動させる内在性の可溶性「ストレス」因子を誘発させる、たとえば骨関節炎などの
疾患の治療における治療試薬としても、有用である。内在性の可溶性ストレス因子には、
たとえば、Ｈｓｐ６０（Ｏｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５８〜５６１
頁（２０００年）参照）およびフィブロネクチン（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７６：１０２２９〜１０２３３頁（２００１年）参照、ならびにヘパリン硫酸
、ヒアルロナン、ｇｐ９６、β−デフェンシン−２または界面活性プロテインＡ（たとえ
ば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３（１〜２）：１５〜
４４頁（２００３年）参照、それぞれその全体が本明細書に参照により組み込まれている
）が含まれる。本発明の抗体はまた、機械的ストレス、たとえば、レスピレーター、人工
呼吸器および他の呼吸器支援装置を行っている対象および患者に関連する機械的ストレス
などに関連する様々な障害の治療にも有用である。たとえば、本発明の抗体は、人工呼吸
関連肺損傷（「ＶＡＬＩ」）とも呼ばれる人工呼吸器誘発肺損傷（「ＶＩＬＩ」）の治療
において有用である。

ＴＬＲ４機能の阻害が有益な場合がある他の疾患領域には、たとえば、慢性炎症（たと
えば、アレルギー状態および喘息に関連する慢性炎症）、自己免疫疾患（たとえば、炎症
性腸障害）ならびにアテローム性動脈硬化症が含まれる（その全体が本明細書に参照によ
り組み込まれている、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：
３９６〜４０３頁（２００３年）参照）。

これらの免疫関連障害に関連する症状には、たとえば、炎症、発熱、全身倦怠感、発熱
、疼痛、多くの場合炎症領域に局在するもの、速い脈拍速度、関節痛または疼痛（ｊｏｉ
ｎｔ ｐａｉｎまたはａｃｈｅ）（関節痛（ａｒｔｈｒａｌｇｉａ））、速い呼吸または
他の異常な呼吸パターン、悪寒、錯乱、失見当識、扇動、眩暈、咳、呼吸困難、肺感染症
、心不全、呼吸不全、浮腫、体重増加、粘液膿性再発、悪液質、喘鳴、頭痛、および腹部
の症状、たとえば、腹痛、下痢または便秘などが含まれる。

治療の有効性は、特定の免疫関連障害を診断または治療するための任意の既知の方法に
関連して決定する。免疫関連障害の１つまたは複数の症状の緩和は、抗体が臨床上の利点
を与えることを示している。

所望の特異性を保有する抗体をスクリーニングする方法には、それだけには限定されな
いが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当分野で知られている他の免疫学
的に媒介される技術が含まれる。

ＴＬＲ２、ＣＤ１４、ＴＬＲ４、ＭＤ２、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体または任意のトル
様受容体（またはその断片）などの標的に対する抗体は、これらの標的の位置特定および
／または定量に関連する、当分野で知られている方法で、たとえば、適切な生理的試料中
のこれらの標的のレベル測定における使用、診断方法における使用、タンパク質のイメー
ジングにおける使用など）において使用し得る。所定の実施形態では、これらの標的のう
ちの任意のものに特異的な抗体、またはその抗体に由来する抗原結合ドメインを含むその
誘導体、断片、類似体もしくは相同体を、薬理学的に活性な化合物として利用する（本明
細書において以降「治療薬」と呼ぶ）。

本発明の改変された抗体を使用して、免疫親和性、クロマトグラフィーまたは免疫沈降
などの標準の技術を用いて特定の標的を単離することができる。本発明の改変された抗体
（またはその断片）は、臨床的試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルを監視す
るために、たとえば、たとえば所定の治療レジメンの有効性を決定するために、診断的に
使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質とカップリング（すなわち、物理
的に連結）させることによって、容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様
々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれ
る。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族の複
合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適切
な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたは
フィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例
には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、適切な放射性物質の
例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが含まれる。

ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全にヒトの抗体を含めた本発明の抗
体は、治療剤として用い得る。そのような薬剤は、一般に、対象における所定の標的の異
常な発現または活性化に関連する疾患または病理を治療または予防するために用いる。抗
体調製物、好ましくは、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するもの
を、対象に投与し、一般に、標的とのその結合が原因で効果をもたらす。抗体の投与は、
標的のシグナル伝達機能を抑止または阻害またはそれと干渉し得る。抗体の投与は、標的
とそれが天然に結合する内在性リガンドとの結合を、抑止または阻害またはそれと干渉し
得る。たとえば、抗体は標的と結合し、ＬＰＳに誘発される炎症誘発性サイトカインの産
生を中和する。

治療上有効な量の本発明の抗体は、一般に、治療目的を達成するために必要な量に関連
する。上に注記したように、これは、特定の場合では標的が機能することと干渉する、抗
体とその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与する必要がある量はさらに、抗
体の、その特異的抗原に対する結合親和性に依存し、また、投与した抗体が、それを投与
する他の対象の自由体積から枯渇する速度にも依存する。本発明の抗体または抗体断片の
治療上有効な投薬の一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜
約５０ｍｇ／体重１ｋｇであり得る。一般的な投薬頻度は、たとえば、１日２回から週に
１回の範囲であり得る。

本発明の抗体またはその断片は、様々な疾患および障害を治療するために、薬剤組成物
の形態で投与することができる。そのような組成物の調製に関与する原理および考察、な
らびに構成要素の選択における指針は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ａｌｆｏｎ
ｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ペンシルベニア州Ｅａｓｔ
ｏｎ：１９９５年；Ｄｒｕｇ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎ
ｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎ
ｄｓ、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ペンシルベニア州Ｌ
ａｎｇｈｏｒｎｅ、１９９４年；およびＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒ
ｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、第４巻）、１９９１年、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供されている
。

抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインと特異的に結合する、阻害が
最も小さい断片が好ましい。たとえば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質
配列と結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチ
ドは、組換えＤＮＡ技術によって化学合成および／または産生することができる。（たと
えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８
８９〜７８９３頁（１９９３年）参照）。配合物はまた、必要に応じて治療する具体的な
適応症のための複数の活性化合物、好ましくは、互いに有害効果をもたらさない相補的活
性を有するものも含むことができる。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を増
強する薬剤、たとえば、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤など
を含むことができる。そのような分子は、組み合わせて、意図する目的のために有効な量
で適切に存在する。

活性成分はまた、たとえば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製した
マイクロカプセル、たとえば、それぞれコロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、
アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）ま
たはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカ
プセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入することもでき
る。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用する配合物は、無菌的でなければならない。これは、滅菌濾
過膜を通して濾過することによって、容易に達成することができる。

持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含む
固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、成形した物品、た
とえば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態にある。持続放出マトリックスの例に
は、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレー
ト）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号
）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−
酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび
酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポ
リマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビ
ニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間を超える分子の放出を可能に
する一方で、特定のヒドロゲルはより短い期間にわたってタンパク質を放出する。

本発明による抗体は、試料中の所定の標的（またはそのタンパク質断片）の存在を検出
するための薬剤として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は検出可能な標
識を含む。抗体は、ポリクローナルであるか、またはより好ましくはモノクローナルであ
る。インタクトな抗体、またはその断片（たとえば、Ｆ_ａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ_{（ａｂ
）２}）を使用する。プローブまたは抗体に関する用語「標識した」には、検出可能な物質
をプローブまたは抗体とカップリング（すなわち、物理的に連結）させることによって、
プローブまたは抗体を直接標識すること、および直接標識されている別の試薬と反応させ
ることによってプローブまたは抗体を間接的に標識することが包含されることを意図する
。間接的に標識することの例には、蛍光標識した二次抗体を用いて一次抗体を検出するこ
と、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるように、ＤＮＡプローブをビオ
チンで末端標識することが含まれる。用語「生体試料」には、対象から単離した組織、細
胞および生体液、ならびに対象中に存在する組織、細胞および生体液が含まれることを意
図する。したがって、用語「生体試料」の用法には、血清、血漿、またはリンパ液を含め
た、血液および血液の画分または構成要素が含まれる。すなわち、本発明の検出方法を用
いて、生体試料中の分析物であるｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを、ｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで検出することができる。たとえば、分析物ｍＲＮＡを
検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。分析物タンパク質を検出するためのｉｎ
ｖｉｔｒｏ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット
、免疫沈降、および免疫蛍光が含まれる。分析物ゲノムＤＮＡを検出するためのｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。免疫アッセイを実施する
手順は、たとえば、「ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４２巻、Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔ
ｈｅｒ（編）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ、１９９５年；
「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｅ．ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕ
ｌｕｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、１９９６年；ならびに「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５年に記載されている。さ
らに、分析物タンパク質を検出するためのｉｎ ｖｉｖｏ技術には、対象内に、標識した
抗分析物タンパク質抗体を導入することが含まれる。たとえば、抗体を、対象中の存在お
よび位置を標準のイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーで標識
することができる。
薬剤組成物
本発明の抗体または可溶性キメラポリペプチド（本明細書で「活性化合物」とも呼ぶ）
、ならびにその誘導体、断片、類似体および相同体を、投与に適した薬剤組成物内に取り
込ませることができる。そのような組成物は、典型的には、抗体または可溶性キメラポリ
ペプチドおよび製薬上許容される担体を含む。本明細書で使用する用語「製薬上許容され
る担体」には、製薬の投与に適合した、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、
抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることを意図する。適切
な担体は、当分野の標準の参考教科書であり、本明細書に参照により組み込まれている、
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に
記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、それだけには限定され
ないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％のヒト血清アル
ブミンが含まれる。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビヒクルも使用し得る。製
薬活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。任
意の慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合以外は、組成物中でのその使
用が企図される。補足の活性化合物も、組成物内に取り込ませることができる。

本発明の薬剤組成物は、その意図する投与経路と適合するように配合する。投与経路の
例には、非経口、たとえば、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（すなわ
ち局所的）、経粘膜、および直腸の投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下の施用に
使用する液剤または懸濁液には、以下の構成要素が含まれることができる：注射用水、生
理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールま
たは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗
細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートな
どの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節する薬剤。
ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経
口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジまたは複数用
量バイアル中に封入することができる。

注射での使用に適した薬剤組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）または無菌注射用
液剤もしくは分散液を即時調製するための分散液および無菌散剤が含まれる。静脈内投与
では、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡ
ＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易なシリンジ通過
性が存在する程度まで流体であるべきである。これは、製造および保管の条件下で安定で
なければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければ
ならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、
プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な
混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、たとえば、レシチンなど
のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒子径を維持することに
よって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の作
用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの
場合、等張化剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトー
ル、塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、
組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼ
ラチンを含めることによって、もたらすことができる。

無菌注射用液剤は、活性化合物を必要な量で、適切な溶媒中で、必要に応じて上に列挙
した成分の１つまたは組合せと共に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって、調製
することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本の分散媒および上に列挙した
ものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル内に取り込ませることによって、調製する
。無菌注射用液剤を調製するための無菌散剤の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾
燥であり、これにより、事前に滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意の追加の所
望の成分の散剤が得られる。

経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。これらは、ゼラチ
ンカプセル中に封入するか、または錠剤へと圧縮することができる。経口の治療的投与の
目的には、活性化合物を賦形剤と共に取り込ませ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形
態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口液として使用するために流体担体を
用いて調製することもでき、流体担体中の化合物を経口的に施用し、クチュクチュとして
吐き出すまたは飲み込む。製薬的に適合した結合剤および／またはアジュバント物質を、
組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下
の成分のうちの任意のもの、または同様の性質の化合物を含むことができる：結晶セルロ
ース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースな
どの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ス
テアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ
素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント
、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。

吸入による投与には、化合物は、適切な噴霧剤、たとえば二酸化炭素などの気体を含む
加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達
する。

全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与に
は、透過する障壁に適した浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分
野で知られており、たとえば、経粘膜投与には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導
体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を使用することで達成することが
できる。経皮投与には、活性化合物を、当分野で一般に知られているように軟膏、膏薬、
ゲル、またはクリームへと配合する。

化合物はまた、直腸送達用の坐薬（たとえば、カカオ脂および他のグリセリドなどの慣
用の坐薬基剤を用いて）または保留浣腸の形態で調製することもできる。

一実施形態では、活性化合物は、植込錠およびミクロカプセル封入の送達系を含めた徐
放性配合物などの、化合物を身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。
エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステ
ル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。
そのような配合物を調製する方法は、当業者に明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購
入して入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル
抗体を有する感染細胞を標的としたリポソームを含む）も、製薬上許容される担体として
使用することができる。これらは、当業者に知られている方法に従って、たとえば米国特
許第４，５２２，８１１号に記載のように調製することができる。

投与を容易にし、用量を均一にするために、経口または非経口組成物を単位用量形態で
配合することが特に有利である。本明細書で使用する単位用量形態とは、治療する対象の
単位用量として適した物理的に別々の単位をいい、それぞれの単位は、必要な製薬担体と
会合して所望の治療効果をもたらすように計算した、事前に決定された量の活性化合物を
含む。本発明の単位用量形態の仕様は、活性化合物の独特な特徴および達成する具体的な
治療効果、ならびに個体を治療するための活性化合物などの配合の分野に固有の制限によ
って指示され、それに直接依存する。

薬剤組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与の指示と一緒に含める
ことができる。

本発明を、以下の実施例でさらに記載するが、これらは特許請求の範囲に記載した本発
明の範囲を限定しない。

（実施例１）
モノクローナル抗体の産生
以下の研究は、ＴＬＲ４、ＭＤ２および／またはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体上のエピトー
プを認識する抗体の使用を記載する。本明細書に提示する研究中で使用する抗体は、それ
ぞれその全体が本明細書に参照により組み込まれている、同時係属中の２００４年１２月
１０日出願の米国出願第１１／００９９３９号および２００４年６月１５日出願の第１１
／１５１９１６号ならびに２００４年１２月１０日出願のＷＯ０５／０６５０１５および
２００４年６月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２０９３０に記載の方法を用いて
産生した。

抗ＴＬＲ４／ＭＤ２抗体の重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸お
よび核酸配列を以下に示す。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１
９９１年によって定義される相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸は、以下に下
線および斜体の文字で強調する。（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７
７〜８８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ
Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１年）参照）。
１８Ｈ１０ ＶＨヌクレオチド配列

それぞれのモノクローナル抗体が、ＴＬＲ４／ＭＤ２で形質移入した細胞上におけるＬ
ＰＳに誘発されるＩＬ−８の誘発を中和する能力を、形質移入した細胞を、それぞれのモ
ノクローナル抗体と共に、ＬＰＳ投与の前に３０分間プレインキュベートすることによっ
て、分析した。さらに、それぞれのモノクローナル抗体を、全血中でＬＰＳに誘発される
ＩＬ−８誘発を中和する能力について試験した。

それぞれのモノクローナル抗体の特異性は、それぞれのモノクローナル抗体と以下の組
合せで形質移入した細胞との結合を評価することによって、試験した：（１）ヒトＴＬＲ
４およびヒトＭＤ−２、（２）ウサギＴＬＲ４およびウサギＭＤ−２、（３）ヒトＴＬＲ
４およびウサギＭＤ−２、（４）ウサギＴＬＲ４およびヒトＭＤ−２。

（実施例２）
ネズミモノクローナル抗体のヒト化
以下の研究は、ＴＬＲ４、ＭＤ２および／またはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体上のエピトー
プを認識する抗体のヒト化を記載する。抗体は、それぞれその全体が本明細書に参照によ
り組み込まれている、同時係属中の２００４年６月１５日出願の米国出願第１１／１５１
９１６号（米国特許公開第ＵＳ２００８−００５０３６６ Ａ１号）および２００４年６
月１５日出願のＰＣＴ／ＩＢ２００５／００４２０６（ＰＣＴ公報ＷＯ０７／１１０６７
８）に記載の方法を用いてヒト化した。

ｈｕ１５Ｃ１抗体には、以下の配列番号４５に示す可変重鎖（Ｖ_Ｈ）４〜２８または以
下の配列番号４６に示すＶ_Ｈ３〜６６が含まれる。ｈｕ１５Ｃ１抗体には、以下の配列番
号４７に示す可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）Ｌ６または以下の配列番号４８に示すＡ２６が含まれる。
Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義される
相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸は、以下に提供する配列中に四角で囲む。
（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３頁（１９８９年）；Ｋ
ａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１年）参照）。
１５Ｃ１ Ｈｕ Ｖ_Ｈバージョン４〜２８

式中、Ｘ_１はＴｈｒまたはＳｅｒであり、
式中、Ｘ_２はＩｌｅまたはＭｅｔであり、
式中、Ｘ_３はＶａｌまたはＩｌｅであり、
式中、Ｘ_４はＭｅｔまたはＩｌｅである。
１５Ｃ１ Ｈｕ Ｖ_Ｈバージョン３〜６６

式中、Ｘ_１はＡｌａまたはＶａｌであり、
式中、Ｘ_２はＶａｌまたはＭｅｔであり、
式中、Ｘ_３はＬｅｕまたはＰｈｅである。
１５Ｃ１ Ｈｕ ＶＬバージョンＬ６

式中、Ｘ_１はＬｙｓまたはＴｙｒである。
１５Ｃ１ Ｈｕ ＶＬバージョンＡ２６

ｈｕ１８Ｈ１０抗体には、以下の配列番号４９に示すＶ_Ｈ１〜６９が含まれる。ｈｕ１
８Ｈ１０抗体には、以下の配列番号５０に示すＶ_ＬＬ６が含まれる。Ｃｈｏｔｈｉａら、
１９８９年、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義される相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）を包含するアミノ酸は、以下に提供する配列中に四角で囲む。（Ｃｈｏｔｈｉａ，
Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎ
ｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈ
ｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆ
ｉｃｅ（１９９１年）参照）。
１８Ｈ１０ Ｈｕ ＶＨバージョン１〜６９

式中、Ｘ_１はＭｅｔまたはＩｌｅであり、
式中、Ｘ_２はＬｙｓまたはＴｈｒであり、
式中、Ｘ_３はＭｅｔまたはＬｅｕである。
１８Ｈ１０ Ｈｕ ＶＬバージョンＬ６

式中、Ｘ_１はＰｈｅまたはＴｙｒである。

ｈｕ７Ｅ３抗体には、以下の配列番号５１に示すＶ_Ｈ２〜７０または以下の配列番号５
２に示すＶ_Ｈ３〜６６が含まれる。ｈｕ７Ｅ３抗体には、以下の配列番号５３に示すＶ_Ｌ
Ｌ１９が含まれる。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、１９９１年
によって定義される相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸は、以下に提供する配
列中に四角で囲む。（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３頁
（１９８９年）；Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏ
ｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ Ｇｏｖｅｒ
ｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１年）参照）。
７Ｅ３ Ｈｕ ＶＨバージョン２〜７０

式中、Ｘ_１はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
式中、Ｘ_２はＩｌｅまたはＰｈｅであり、
式中、Ｘ_３はＩｌｅまたはＡｌａである。
７Ｅ３ Ｈｕ ＶＨバージョン３〜６６

式中、Ｘ_１はＰｈｅまたはＡｌａであり、
式中、Ｘ_２はＶａｌまたはＬｅｕであり、
式中、Ｘ_３はＩｌｅまたはＰｈｅであり、
式中、Ｘ_４はＬｙｓまたはＡｒｇであり、
式中、Ｘ_５はＬｅｕまたはＶａｌであり、
式中、Ｘ_６はＩｌｅまたはＡｌａである。
７Ｅ３ Ｈｕ ＶＬバージョンＬ１９

式中、Ｘ_１はＰｈｅまたはＴｙｒであり、
式中、Ｘ_２はＴｙｒまたはＰｈｅである。

実施例１に上述したキメラ抗体を用いて、ヒト化したモノクローナル抗体がヒトＴＬＲ
４／ＭＤ２複合体と結合する能力を評価した。ヒト化したモノクローナル抗体のそれぞれ
は、対応するキメラ抗体と類似の様式でＴＬＲ４／ＭＤ２と結合することが見い出された
。さらに、キメラ抗体を用いて、ヒト化したモノクローナル抗体がヒト全血中でＬＰＳに
誘発されるＩＬ−６の産生を阻害する能力を評価した。ヒト化したモノクローナル抗体の
それぞれは、対応するキメラ抗体と類似の様式で血液白血球に対するＬＰＳの効果を阻害
することが見い出された。

（実施例３）
改変したモノクローナル抗体の力価の増加
本明細書に記載する研究は、抗体のＦｃ部分中の１つまたは複数の残基を改変すること
によって中和抗体の力価を増加させる方法に関する。具体的には、本明細書に記載する研
究では、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を認識する改変された中和抗体を使用する。これらの抗
ＴＬＲ４／ＭＤ２抗体は、Ｆｃ部分、具体的にはＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中に１つまた
は複数の突然変異が含まれるように改変する。

上述し、本明細書で「ｍｕ１５Ｃ１」と呼ぶネズミＩｇＧ１／Ｋ抗ヒトＴＬＲ４／ＭＤ
２モノクローナル抗体を、ｍｕ１５Ｃ１のマウス定常領域をヒトＩｇＧ１のそれで置き換
えることによって改変して、本明細書で「キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１」（図１Ａ）と呼ぶ
キメラ抗体を産生した。対応するＭＡｂの相対結合親和性は変化がなかった。

ＬＰＳの効果を中和するキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体の能力を、ＴＬＲ４／ＭＤ−２
で形質移入した細胞系を用いて評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレート中に
６×１０^４個の細胞／ウェルで蒔いた。培地を実験当日に除去し、３０μｌの、６％の熱
失活させたヒト血漿を含む培地を加えた。マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１（四角）またはキメ
ラＩｇＧ１ １５Ｃ１（三角）のＭＡｂを３０μｌの基本培地で適切な濃度まで希釈し、
細胞に１時間３７℃で加えた。ＬＰＳを３０μｌの培地で希釈し、細胞に加え、２４時間
３７℃でインキュベーションした。培養上清中のＩＬ−８分泌をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇ
ｅｎ）によって監視した。

キメラ抗体は、ＴＬＲ４／ＭＤ−２で形質移入した細胞系ＨＥＫ２９３に対するＬＰＳ
の効果を中和することができた（ＩＬ−８産生によって測定）。図１Ｂは、マウスＩｇＧ
１主鎖上の１５Ｃ１（マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１と呼ぶ；図１Ａの模式的説明を参照）お
よびヒトＩｇＧ１主鎖上の１５Ｃ１（キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１と呼ぶ；図１Ａの模式的
説明を参照）が、この細胞系に対するその中和能力が等価であることを示している。

ヒト全血中でキメラ抗体がＬＰＳの効果を中和する能力も評価した。健康なボランティ
ア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１：
２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５分
間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、マウスおよびキメラのＩｇＧ
１ １５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃で
インキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％
のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキ
ュベーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩ
ＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイでは、ネズミおよびキメラの抗体で異なるプロフィールが見られた。
図２は、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１が、ＬＰＳを中和するその能力において、キメラＩｇ
Ｇ１ １５Ｃ１よりも有意に強力であったことを示す（ＩＬ−６の産生によって測定）。
この観察は、アッセイ中で使用するＭＡｂの濃度が低いほど、より著しかった。２つのＭ
Ａｂ（典型的にはＦａｂ領域を含む）の結合親和性は等価であるため、この差異は分子の
Ｆｃ領域に起因していると結論づけられた。

さらに、この差異はＦｃ受容体依存性の機構に媒介されると考察された。Ｆｃγ受容体
の発現に対して陰性のＨＥＫ２９３細胞（図１Ｂ）上では、２つのＭＡｂ、すなわちキメ
ラおよびネズミの１５Ｃ１は同等に強力であった一方で、白血球がＦｃγ受容体の発現に
対して陽性であるｅｘ−ｖｉｖｏヒト全血アッセイでは、これらの間で明白な差異が見ら
れた。

推定上の阻害性応答におけるＭＡｂのＦｃ部分とＦｃγ受容体との間の相互作用の関与
をさらに実証するために、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１の改変体を、抗体が細胞Ｆｃγ受容
体と結合する能力が、その同族抗原ＴＬＲ４／ＭＤ２に対するその親和性を保持したまま
で破壊されるように、操作した。ＥＵアミノ酸残基位置２６５でＡｓｐからＡｌａへの突
然変異（Ｄ２６５Ａ）をマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１γ重鎖遺伝子内に導入し、この突然変
異配列を、１５Ｃ１マウスκ鎖と共に、ＰＥＡＫ細胞中で発現させて、突然変異（Ｄ２６
５Ａ）抗体を産生させた。平行組換えでは、野生型１５Ｃ１の重鎖および軽鎖をＰＥＡＫ
細胞中で同時発現させて、組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１を産生させた。突然変異Ｄ２
６５Ａは、マウスＩｇＧ１アイソタイプ中で操作した場合（ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ）、Ｉ
ｇＧ１−Ｄ２６５Ａ含有免疫複合体とマウスＦｃ−γ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ）、
ＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＩＶ（ＦγＲＩＶ）との結合を強固にする（Ｎｉｍｍｅ
ｒｊａｈｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００５年、２３：４１〜５１頁）、ならびに（Ｆｃ
γＲＩ）を無効にするまたはすべてのヒトＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩ
ＢおよびＦｃγＲＩＩＩ）とのその結合を大きく減少させる（Ｓｈｉｅｌｄｓら、ＪＢＣ
、２００１年；２７６：６５９１〜６６０４頁）ことが、示されている。

組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１および組換えマウスＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ １５Ｃ１
抗体の中和能力を、ヒト全血アッセイで評価した。具体的には、健康なボランティア由来
の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希
釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５分間３７
℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１（
ｒｅｃ−マウスＩｇＧ１ １５０）およびＥＵ位置２６５でＡｓｐからＡｌａへの突然変
異を含む組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１（ｒｅｃ−マウスＤ２６５Ａ １５Ｃ１）のＭ
ＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でインキュベーショ
ンした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨＳＡを含むＲ
ＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュベーションする
ことによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによって測定
した。

ヒト全血実験（図３）では、組換えマウスＤ２６５Ａ ＩｇＧ１（ｒｅｃ−Ｄ２６５Ａ
マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１）は、ＬＰＳの効果を阻害することにおいて（ＩＬ−６の産生
によって測定）、組換えマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１ ＷＴ ＩｇＧ１（ｒｅｃマウスＩｇ
Ｇ１ １５Ｃ１）よりも、顕著に弱かった。この結果により、マウスＩｇＧ１のＦｃ部分
とヒトＦｃγ受容体との結合が、１５Ｃ１がＬＰＳの炎症誘発性刺激を中和する力価に寄
与するという仮説を確認した。

マウスＩｇＧ１は、文献に、ヒトＦｃγＲＩＩまたはＣＤ３２に対して高い親和性を有
すると記載されている。実際、ヒトＣＤ３２に対するマウスＩｇＧ１のこの高い親和性に
より、この受容体の発見が可能となった。したがって、ＣＤ３２がヒト白血球上のマウス
ＩｇＧ１のＦｃの主要な標的受容体となると仮定された。この可能性を確認するために、
この受容体に対するマウスＩｇＧ１のＦｃの結合を防止するために、２つの異なる抗ヒト
ＣＤ３２抗体（ＣＤ３２ＡおよびＣＤ３２Ｂを同等に良好に認識するＡＴ１０、ならびに
ＣＤ３２Ａと結合し、ＣＤ３２Ｂと弱く結合するＩＶ．３）を用いて、ヒト全血アッセイ
を行った。健康なボランティア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得
て、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェ
ルプレート中に蒔き、１５分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、
マウス抗ヒトＣＤ３２モノクローナル抗体（クローンＡＴ１０、マウスＩｇＧ１、カタロ
グ番号ＭＣＡ１０７５ＸＺ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、クローンＩＶ．３、マウスＩｇＧ
２ｂ、カタログ番号０１４７０、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む
または含まない、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１ ＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物
を血液に加え、１時間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）
をウェルに加え、６時間インキュベーションすることによって、血液細胞を刺激した。そ
の後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイでは、ＡＴ１０抗体とＩＶ．３抗ヒトＣＤ３２抗体がどちらも、マウ
スＩｇＧ１ １５Ｃ１の力価をキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１で見られるものと同様のレベル
まで減少させることが実証された（図４Ａ）。ＩＶ．３が、ＣＤ３２Ａと強力に結合し、
ＦｃγＲＩＩＡのどちらの表現型も同等に良好に認識し、ＣＤ３２Ｂと弱く結合すること
は、ＣＤ３２ＢではなくヒトＣＤ３２Ａの関与を指し示している。

ＣＤ３２Ａは、その細胞外ドメイン中のアミノ酸１３１で多型性（ヒスチジンまたはア
ルギニン）を含む。この多型性の性質は、マウスＩｇＧ１とＣＤ３２Ａとの結合に影響を
及ぼし、アルギニンホモ接合性個体は、マウスＩｇＧ１に対する親和性がヒスチジンホモ
接合体よりもはるかに高い。アルギニン／ヒスチジンヘテロ接合体は中間の親和性を有す
る（Ｄｉｊｓｔｅｌｂｌｏｅｍ，Ｈ．Ｍ．ら、２００１年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２２：５１０〜５１６頁）。健康な個体を、この多型性でそのＣＤ３２Ａ遺伝子型に
ついてスクリーニングし、ホモ接合性およびヘテロ接合性の個体に由来する全血における
、ＬＰＳ依存性のＴＬＲ４活性化の１５Ｃ１媒介性の遮断を試験した。この実験では、１
５Ｃ１は、その元々の形態（すなわち、マウスＩｇＧ１主鎖上）で、またはヒトＩｇＧ４
主鎖上の１５Ｃ１可変領域を用いたキメラＭＡｂとして、ＰＥＡＫ細胞中で産生させた。
ヒトＩｇＧ４はＣＤ３２に対して非常に乏しい親和性しか有さないことが知られているた
め、この形態を選択した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後、形質
移入したＣＨＯ細胞上でのＴＬＲ４／ＭＤ−２の結合における、両方のＭＡｂの完全性が
確認され、等価であることが示された。全血ＬＰＳ活性化実験では、１５Ｃ１のｍＩｇＧ
１バージョンは、Ａｒｇ／ＡｒｇおよびＡｒｇ／Ｈｉｓドナーを試験した場合に、ＴＬＲ
４を阻害することにおいて、ｈＩｇＧ４バージョンよりも相当に強力であった。対照的に
、ｍＩｇＧ１ １５Ｃ１は、Ｈｉｓ／Ｈｉｓドナーにおいて、ｈＩｇＧ４ １５Ｃ１より
もわずかだけ強力だった（図４Ｂ）。それぞれの用量応答曲線について得られたＩＣ５０
値を表３に示す。これらの値は、様々なＣＤ３２遺伝子型ドナーの１５Ｃ１ ｍＩｇＧ１
およびｈＩｇＧ４構築体間の力価の差異を強調している。ｍＩｇＧ１構築体は、Ａｒｇ／
ＡｒｇからＨｉｓ／Ｈｉｓドナーで力価の劇的な損失を示している一方で（約３５倍まで
）、ｈＩｇＧ４構築体は力価のわずかな損失しか示していない（約３倍まで）。これらの
結果は、ＴＬＲ４シグナル伝達に対する１５Ｃ１ ＭＡｂの阻害活性における、ＣＤ３２
Ａの寄与を強めている。

同じドナー由来のヒト全血において、熱失活させたＥ．ｃｏｌｉを刺激として使用して
（１０^６ｃｆｕ／ｍｌ）、同一の結果が得られた。

その後、研究を、Ｆｃ領域全体の生物学的寄与を維持するために十分な、マウスＩｇＧ
１抗体のＦｃ領域内の重要な領域を決定するために設計した。文献中で、Ｆｃ領域のＣＨ
２とＣＨ３のドメインがどちらも、Ｆｃγ受容体との相互作用に直接寄与できることが知
られている。この阻害効果に寄与する重要な領域の同定に向かった第１のステップでは、
ＦｃとＦｃγ受容体との相互作用におけるその役割が十分に文献に記載されているため、
ＣＨ２ドメイン（ＥＵ位置２３１〜３４０、図１６のＣＨ２ドメインのアラインメント参
照）の重要性に焦点を当てるように研究を設計した。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインをマ
ウスＩｇＧ１のそれで置き換え（後にｍｕＣＨ２−キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１と呼ぶ、図
５Ａ参照）、相反的に、マウスＩｇＧ１のＣＨ２ドメインをヒトＩｇＧ１のそれで置き換
えた（後にｈｕＣＨ２−マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１と呼ぶ、図５Ａ参照）。抗体をＰＥＡ
Ｋ細胞中で産生させ、形質移入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラムクロマトグ
ラフィーによって精製した。ＦＡＣＳによってＣＨＯ ＴＬＲ４／ＭＤ２形質移入体との
等価な結合が観察され、これは、ＣＨ２ドメインの変化が、抗原に対する相対親和性に有
意な影響を与えなかったことを示している。ネズミ１５Ｃ１、ｈｕＣＨ２−マウスＩｇＧ
１ １５Ｃ１、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１およびｍｕＣＨ２−キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１
の中和能力を、ヒト全血アッセイで評価した。健康なボランティア由来の新鮮なヘパリン
処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希釈した。希釈した
血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５分間３７℃でインキュベー
ションした。その後、３０μｌの、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ
１、ヒトＣＨ２を含むマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１およびマウスＣＨ２を含むキメラＩｇＧ
１ １５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃で
インキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％
のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキ
ュベーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩ
ＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイでは、マウスＣＨ２ドメインを含む組換えバージョンは、完全にマウ
スのＩｇＧ１ １５Ｃ１ ＩｇＧ１と同様の阻害活性を有していることが見い出された。
他方で、ヒトＣＨ２を含む組換えバージョンは、完全にマウスのＩｇＧ１ １５Ｃ１ Ｉ
ｇＧ１ほど強力ではなかったが、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１まで減少された活性を有して
いた（図５Ｂ）。これらのデータから、Ｆｃに媒介される阻害の寄与は、マウスＩｇＧ１
の重鎖のＣＨ２ドメインに限定されると結論づけられた。

その後、研究を、マウスＣＨ２ドメインのどの残基がＦｃに媒介される阻害活性に必要
であるかを評価するために設計した。完全長マウスＣＨ２ドメインを含むキメラＩｇＧ１
１５Ｃ１から開始して、手法は、Ｆｃに媒介される阻害活性の損失が観察されない最大
数のヒト残基を導入することによって、ＣＨ２ドメインの重要な領域を同定することであ
った。これらの重要な残基の同定は、マウスＣＨ２を４つの部分（Ａ：ＥＵ位置２３１〜
２６１、Ｂ：ＥＵ位置３１９〜３４０、Ｃ：ＥＵ位置２９６〜３１８およびＤ：ＥＵ位置
２６２〜２９５）に細分し、４つのサブ領域のそれぞれを、ヒトＩｇＧ１の対応するＣＨ
２アミノ酸配列内に導入することによって決定した（図６Ａ参照）。マウスＣＨ２の４つ
のサブ領域への細分は、純粋にヒトＣＨ２とのアミノ酸配列相同性に基づくものであった
。４つの重鎖突然変異体は重複ＰＣＲによって操作し、組換えＭＡｂはＰＥＡＫ中で発現
させた。対応する抗体は、形質移入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラムクロマ
トグラフィーによって精製し、以下の抗体の、その表面上にヒトＴＬＲ４−ＭＤ２複合体
を発現するＣＨＯ安定細胞系との結合を決定した：ｍｕＣＨ２−キメラＩｇＧ１ １５Ｃ
１、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、Ａ ｍｕ２３１〜２６１ ＣＨ２キメラＩｇＧ１ １５
Ｃ１、Ｂ ｍｕ３１９〜３４０ ＣＨ２キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、Ｃ ｍｕ２９６〜３
１８ ＣＨ２キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、およびＤ ｍｕ２６２〜２９５ ＣＨ２キメラ
ＩｇＧ１ １５Ｃ１。４×１０^５個の細胞／ウェルを、３０分間４℃で、５０μｌの１％
のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−１％のＢＳＡ）
、および適切な抗体の段階希釈物または無関係のヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照のいずれ
か中でインキュベーションした。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで１回洗浄し、ＦＭＡＴ−
Ｂｌｕｅ（登録商標）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体（１：２５０希釈、Ｓ
ｉｇｍａ Ｋ３５０２）を含む同じ緩衝液中で、３０分間４℃でインキュベーションした
。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フロ
ーサイトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＦＬ−４チャネ
ルで分析した。

ＴＬＲ４／ＭＤ２との等価な結合は、ＦＡＣＳ分析によって実証した（図６Ｂ参照）。
その後、これらの抗体中和能力を、ヒト全血アッセイを用いて評価した。健康なボランテ
ィア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１
：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５
分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、マウスＣＨ２の様々なサブ
領域を含む突然変異体キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希
釈物を血液に加え、１時間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍ
ｌ）をウェルに加え、６時間インキュベーションすることによって、血液細胞を刺激した
。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイ（図６Ｃ）では、マウスＣＨ２ドメインを含む抗体の阻害活性は、Ｅ
Ｕ位置３１９〜３４０のヒトＩｇＧ１アミノ酸残基（突然変異体Ｂ）を導入した場合に、
劇的に減少することが判明した。この突然変異体の組から、マウスＣＨ２ドメイン内の阻
害活性は、ＥＵ位置３１９〜３４０にマウスＩｇＧ１残基を含むアミノ酸配列に主に限定
されることが結論づけられた。

その後、研究を、マウスＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸残基を位置３１９〜３４０で、キメ
ラＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体内のヒトＣＨ２ドメイン内に移植する効果を決定するために設
計した。マウスＩｇＧ１ ＣＨ２のＥＵ位置３１９〜３４０の残基を、キメラＩｇＧ１
１５Ｃ１のＣＨ２内に重複ＰＣＲによって導入した（図７Ａ参照）。突然変異体ＭＡｂを
ＰＥＡＫ細胞中で発現させ、形質移入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラムクロ
マトグラフィーによって精製した。キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、ｍｕＣＨ２−キメラＩｇ
Ｇ１ １５Ｃ１およびｍｕ３１９〜３４０キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体の中和能力を、
ヒト全血アッセイを用いて評価した。健康なボランティア由来の新鮮なヘパリン処理した
血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希釈した。希釈した血液を６
０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５分間３７℃でインキュベーションし
た。その後、３０μｌの、完全長のマウスＣＨ２またはマウスＣＨ２残基３１９〜３４０
（ＥＵの番号付け）のどちらかを含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１およびキメラＩｇＧ１
１５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でイン
キュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨ
ＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュベ
ーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡ
によって測定した。

ヒト全血アッセイ（図７Ｂ）では、マウスＣＨ２アミノ酸残基をＥＵ位置３１９〜３４
０で含む抗体の阻害活性が、完全長マウスＣＨ２ドメインを含む１５Ｃ１抗体と同様のレ
ベルまで増加した。ヒトＣＨ２内に２２個のマウスＩｇＧ１アミノ酸残基のストレッチ（
ＥＵ位置３１９〜３４０）を移植することが、完全マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１で見られる
ものと等価なレベルまで完全な阻害活性を回復させるために十分であることが、結論づけ
られた。

その後、研究を、マウスＩｇＧ１ Ｆｃの全体的な阻害活性を維持するために必要かつ
十分な、マウスＩｇＧ１、ＥＵ位置３１９〜３４０、ＣＨ２ドメイン内の最小の残基数を
決定するために設計した。マウスおよびヒトのＩｇＧ１間で位置３１９〜３４０のアミノ
酸残基のアミノ酸配列のアラインメントから、７つの差異が見られた（図８Ａで１〜７と
番号付け）。これらの７残基の中から生物活性を維持するために重要なものを決定するた
めに、マウスＩｇＧ１の残基をヒトＩｇＧ１の残基で交換する効果を検査した。この目的
のために、マウスＣＨ２領域のＥＵ位置３１９〜３４０を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１
から開始して、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異プロトコルを用
いて、５個の突然変異体の組を操作した（図８Ｂの突然変異体Ａ〜Ｅ）。５つの突然変異
体ＭＡｂをＰＥＡＫ中で発現させ、形質移入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。

５つの突然変異体ＭＡｂの中和能力を、ヒト全血アッセイで評価した。健康なボランテ
ィア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１
：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５
分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１
、ＥＵ位置３１９〜３４０にマウスＣＨ２アミノ酸残基を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１
および突然変異体Ａ〜ＥのＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時
間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ
（０．１％のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６
時間インキュベーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産
生をＥＬＩＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイ（図８Ｃ）では、突然変異体ＤおよびＥは、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ
１と同じ阻害活性を示した一方で、突然変異体Ａ、ＢおよびＣは、少なくともマウスＣＨ
２領域のＥＵ位置３１９〜３４０を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１と同程度である阻害活
性を示した。５つの突然変異体のヒト全血アッセイの結果およびアミノ酸配列の分析から
、一方で、４個のヒトアミノ酸残基、Ｙ１（ＥＵ位置３１９）、Ｋ２（ＥＵ位置３２２）
、Ｓ３（ＥＵ位置３２４）およびＡ７（ＥＵ位置３３９）（図８Ｂ参照）の導入は、対応
する抗体の阻害活性に対して有害効果を与えないが、他方で、２個のヒトアミノ酸残基、
Ｎ４（ＥＵ位置３２５）およびＬ６（ＥＵ位置３２６）の導入は、Ｆｃ部分が原因で阻害
効果の損失を伴う負の効果を有することが、結論づけられた。全体的に、マウスＩｇＧ１
Ｆｃの阻害効果を潜在的に担っている７つのマウス残基のうち、３つのみ、すなわち、
Ｓｅｒ４（ＥＵ位置３２５）、Ａｌａ５（ＥＵ位置３２６）およびＰｈｅ６（ＥＵ位置３
２８）が、マウスＩｇＧ１ Ｆｃの全体的な阻害活性に重要であると考えられることが、
結論づけられた。

その後、研究を、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体のヒトＣＨ２ドメイン内に対応するＥ
Ｕ位置で移植した場合に、ネイティブマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１抗体の阻害力価を回復さ
せるマウス残基の最小数を決定するために設計した。マウスＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン内
で、３つのアミノ酸残基、すなわち、Ｓｅｒ３２６、Ａｌａ３２７およびＰｈｅ３２９（
ＥＵの番号付け）がマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１の全体的な阻害活性を担っていると同定し
た後、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１内に、マウスおよびヒトの配列間の６つの可能なコンビ
ナトリアル組合せすべてをこれら３つのＥＵ位置で導入するために、新しい組の突然変異
体を設計した。新しい突然変異体Ｆ、ＧおよびＨの配列、ならびに突然変異体Ｃ、Ｄおよ
びＥの配列（図８Ｂに以前に記載）を、以下の表１に示す。
表１．キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１のＣＨ２ドメイン内のＥＵ位置３２５〜３２８における
６つの突然変異体（ＣからＨ）のアミノ酸配列

３つの突然変異体は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発
プロトコルを用いて操作し、ＰＥＡＫ細胞中で発現させ、形質移入した細胞の上清からプ
ロテインＧ親和性カラムクロマトグラフィーによって精製した。

これらの突然変異抗体の相対結合親和性は、細胞表面上にヒトＴＬＲ４／ＭＤ２を発現
するＣＨＯ安定細胞系を用いて決定した。４×１０^５個の細胞／ウェルを、３０分間４℃
で、１％のウシ血清アルブミンを含む５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢ
Ｓ−１％のＢＳＡ）、および適切な抗体の段階希釈または無関係のヒトＩｇＧ１アイソタ
イプ対照のいずれか中でインキュベーションした。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで１回洗
浄し、ＦＭＡＴ−Ｂｌｕｅ（登録商標）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体（１
：２５０希釈、Ｓｉｇｍａ Ｋ３５０２）を含む同じ緩衝液中で、３０分間４℃でインキ
ュベーションした。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ
（登録商標）フローサイトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて
、ＦＬ−４チャネルで分析した。

これらの突然変異抗体の中和能力も、ヒト全血アッセイを用いて評価した。健康なボラ
ンティア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０
で１：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、
１５分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、キメラＩｇＧ１ １５
Ｃ１、マウスＣＨ２を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、ならびに突然変異体Ｃ、Ｆおよび
ＨのＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でインキュベ
ーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨＳＡを
含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュベーショ
ンすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによっ
て測定した。

ＦＡＣＳ分析によって、すべての突然変異体が、ＣＨＯ細胞上に発現されるＴＬＲ４／
ＭＤ２複合体に対して同様の相対親和性を有することが示された（図９Ａ参照）。ヒト全
血アッセイ（図９Ｂ）では、突然変異体ＣおよびＦは、マウスＣＨ２を含むキメラＩｇＧ
１ １５Ｃ１よりも良好な阻害活性を示し、突然変異体Ｃは、２つのうちより強力であっ
た。突然変異体ＨはキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１よりも強力であったが、マウスＣＨ２を含
むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１よりは弱かった。突然変異体Ｄ、ＥおよびＧの阻害活性は、
キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１と同様であったが、それより良好ではなかった。

結論として、ネイティブマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１と少なくとも同じほど良好な阻害活
性を有する、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１のＣＨ２ドメイン内の２つの突然変異体が同定さ
れた。これら２つの突然変異体ＣおよびＦは、それぞれ３個および２個のアミノ酸残基が
、同じＥＵ位置でＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの対応するマウス残基に突然変異している。
２つの突然変異体のうち最も強力な阻害活性を有すると考えられる突然変異体Ｃは、以下
の３個のマウス残基、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＰｈｅをそれぞれＥＵ位置３２５、３２６お
よび３２８で有する。突然変異体Ｆは、同じ突然変異からなるが、ＥＵ位置３２５および
３２８のみである。

その後、研究を、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１で得られた結果が、１５Ｃ１のヒト化した
バージョンにも当てはまるかどうかを評価するために設計した。軽鎖バージョンＡ２６（
１５Ｃ１ Ｈｕ ＶＬバージョンＡ２６）と対合した重鎖バージョン４〜２８（１５Ｃ１
Ｈｕ ＶＨバージョン４〜２８）からなるマウスｍＡｂ １５Ｃ１のヒト化したバージ
ョンを、本明細書およびその内容全体が本明細書に参照により組み込まれている国際特許
出願ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００４１７４に記載のように、ＣＤＲ移植によって構築した
。このヒト化したバージョンは、後にヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ１と呼び、ＦＡＣＳ分析に
よって、ＣＨＯ細胞の表面で発現されるＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に対して、キメラＩｇＧ
１ １５Ｃ１と類似の相対親和性を有することが以前に示されている。

第１の組の実験では、マウスＣＨ２を含むキメラＩｇＧ１ １５Ｃ１（ｍｕＣＨ２ ｃ
ｈｉｍ１５Ｃ１）の阻害活性を、マウスＣＨ２を含むヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ１（ｍｕＣ
Ｈ２ ｈｕｍ１５Ｃ１）と比較した。これらのＭＡｂは、ＰＥＡＫ細胞中で発現させ、形
質移入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラムクロマトグラフィーによって精製し
た。ＴＬＲ４／ＭＤ２を発現するＣＨＯに対する等価な結合が、ＦＡＣＳ分析によって実
証された。

ｍｕＣＨ２ヒト化１５Ｃ１抗体の中和能力を、ヒト全血アッセイを用いて評価した。健
康なボランティア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ
１６４０で１：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中
に蒔き、１５分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、マウスＩｇＧ
１ １５Ｃ１、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１、マウスＣＨ２を含むマウスＩｇＧ１ １５Ｃ
１およびマウスＣＨ２を含むヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の
段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎ
ｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュベーションすることによって、血液細胞を刺
激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによって測定した。

ヒト全血アッセイ（図１０）では、マウスＣＨ２ドメインを含むキメラとヒト化したバ
ージョンがどちらも、マウスＩｇＧ１ １５Ｃ１と類似の阻害活性を有し、この活性は、
キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１で見られるものよりも高かったことが見い出された。これらの
結果から、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１で以前に見られたように、ヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ
１ ＭＡｂの阻害活性は、マウスＣＨ２ドメインをそのＦｃ部分内に導入することによっ
て、ネイティブマウスＩｇＧ１ １５Ｃ１と同様のレベルまで増加させることができるこ
とが結論づけられた。

キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１で行った作業と同様に、ＣＨ２ドメイン内のＥＵ位置３２５
、３２６および３２８でヒトまたはマウスのアミノ酸残基のいずれかを使用することに基
づいて、６つの突然変異体Ｃ〜Ｈの組（表１参照）を構築した。対応する抗体は、形質移
入した細胞の上清からプロテインＧ親和性カラムクロマトグラフィーによって精製した。
これらの突然変異抗体の結合親和性は、細胞表面上にヒトＴＬＲ４／ＭＤ２を発現するＣ
ＨＯ安定細胞系を用いて決定した。４×１０^５個の細胞／ウェルを、３０分間４℃で、５
０μｌの１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−１
％のＢＳＡ）、および適切な抗体の段階希釈または無関係のヒトＩｇＧ１アイソタイプ対
照のどちらか中でインキュベーションした。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで１回洗浄し、
ＦＭＡＴ−Ｂｌｕｅ（登録商標）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体（１：２５
０希釈、Ｓｉｇｍａ Ｋ３５０２）を含む同じ緩衝液中で、３０分間４℃でインキュベー
ションした。細胞をＰＢＳ−１％のＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録
商標）フローサイトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＦＬ
−４チャネルで分析した。

ＦＡＣＳ分析によって、すべての突然変異体が、ＣＨＯ細胞上に発現されるＴＬＲ４／
ＭＤ２複合体に対して同様の相対親和性を有することが示された（図１１Ａ参照）。

様々な突然変異体ヒト化抗体の中和能力を、ヒト全血アッセイを用いて評価した。健康
なボランティア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１
６４０で１：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に
蒔き、１５分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、ヒト化ＩｇＧ１
１５Ｃ１突然変異体Ｃ、Ｆ、ＧおよびＨならびにマウスＣＨ２を含むヒト化ＩｇＧ１
１５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でイン
キュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％のＨ
ＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュベ
ーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡ
によって測定した。

ヒト全血アッセイでは、６つの突然変異体の阻害活性を、ｍｕＣＨ２ヒト化ＩｇＧ１
１５Ｃ１と比較した。図１１Ｂに示す結果は、突然変異体ＣおよびＦはｍｕＣＨ２ヒト化
ＩｇＧ１ １５Ｃ１と少なくとも同じほど強力である一方で、突然変異体ＧおよびＨは効
率性がより低いことを、明らかに示している。突然変異体ＤおよびＥも、ｍｕＣＨ２ヒト
化ＩｇＧ１ １５Ｃ１よりも効率性が低いことが示された。結果は、キメラＩｇＧ１ １
５Ｃ１について上記で得られたものと十分に一致している（図９Ｂ）。

最後に、最良のヒト化ＣＨ２突然変異体、すなわち、ＥＵ位置３２５（Ｓｅｒ）、３２
６（Ａｌａ）および３２８（Ｐｈｅ）で３個のマウスアミノ酸残基を含む突然変異体＃Ｃ
の阻害活性を、ヒト全血アッセイで、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１およびマウスＣＨ２ドメ
インを含むヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ１（ｍｕＣＨ２ヒト化１５Ｃ１）と共に試験した。健
康なボランティア由来の新鮮なヘパリン処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ
１６４０で１：２に希釈した。希釈した血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中
に蒔き、１５分間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌの、キメラＩｇＧ
１ １５Ｃ１、ヒト化ＩｇＧ１ １５Ｃ１突然変異体＃ＣおよびマウスＣＨ２を含むヒト
化１５Ｃ１のＭＡｂのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時間３７℃でイ
ンキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ（０．１％の
ＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６時間インキュ
ベーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳ
Ａによって測定した。図１２に示すデータは、突然変異体＃Ｃが、ｍｕＣＨ２ヒト化Ｉｇ
Ｇ１ １５Ｃ１と類似であり、キメラＩｇＧ１ １５Ｃ１よりもはるかに強力な阻害活性
を有することを示している。

炎症誘発性サイトカインＩＬ−６の阻害によって監視される、抗ＴＬＲ２、抗ＭＤ２お
よび抗ＣＤ１４マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体の阻害効果の増加におけるＣＤ３２の
関連を、ヒト全血アッセイを用いて評価した。健康なボランティア由来の新鮮なヘパリン
処理した血液を静脈穿刺によって得て、ＲＰＭＩ１６４０で１：２に希釈した。希釈した
血液を６０μｌ／ウェルで９６ウェルプレート中に蒔き、１５分間３７℃でインキュベー
ションした。その後、３０μｌの、マウス抗ヒトＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン
ＡＴ１０、カタログ番号２１２５−３２１０、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）を含むまたは含
まない、マウス抗ＴＬＲ２（１３Ａ）、マウス抗ＭＤ２（１８Ｈ１０、１３Ｂ）およびマ
ウス抗ＣＤ１４（１３Ｃ）のＭＡのＲＰＭＩ１６４０中の段階希釈物を血液に加え、１時
間３７℃でインキュベーションした。その後、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＬＰＳ
（０．１％のＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０中で最終２ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、６
時間インキュベーションすることによって、血液細胞を刺激した。その後、ＩＬ−６の産
生をＥＬＩＳＡによって測定した。

図１３Ａ〜１３Ｃに示す結果は、ＴＬＲ４以外の他の系、すなわち、ＴＬＲ２、ＭＤ２
およびＣＤ１４において、推定上の阻害性応答におけるＭＡｂのＦｃ部分およびヒトＦｃ
γＲＩＩＡとの間の相互作用の関与を実証する傾向にある。

図１６のすべてのヒト、マウスおよびラットのＩｇＧアイソタイプのＣＨ２ドメインの
アラインメントは、マウスＩｇＧ１以外に、ラットＩｇＧ２ａもＥＵ位置３２５〜３２８
でＳＡＡＦモチーフを含む一方で、ラットＩｇＧ１は、同じＥＵ位置で非常に相同的なＳ
ＧＡＦ配列を含むことを示している。他のヒト、マウスまたはラットのＩｇＧアイソタイ
プはどれも、このＳＡＡＦモチーフを含まない。ＣＨ２ドメインのγ鎖のＥＵの番号付け
（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、１９６９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ６３、７８〜８５頁）は、２３１から開始して３４０で終わる。ヒトＩｇＧ１、
ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、マウスＩｇＧ２ａｂ、ＩｇＧ２ａａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ
３、ならびにラットＩｇＧ２ｂのＣＨ２エクソンは、１１０個のアミノ酸をコードしてい
る。ヒトＩｇＧ２およびラットＩｇＧ２ｃのＣＨ２エクソンは、３個のヌクレオチド（ｎ
ｔ）の欠失が原因で、１０９個のアミノ酸をコードしている。マウスＩｇＧ１、ラットＩ
ｇＧ１およびＩｇＧ２ａのＣＨ２エクソンは、９個のｎｔの欠失が原因で、１０７個のア
ミノ酸をコードしている。

（実施例４）
ＣＤＲ３が突然変異した中和抗体。

本明細書に記載する研究は、抗体のＣＤＲ３部分中の１つまたは複数の残基を改変する
ことによって中和抗体の力価を増加させる方法に関する。具体的には、本明細書に記載す
る研究では、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を認識する改変された中和抗体を使用する。これら
の抗ＴＬＲ４／ＭＤ２抗体は、ＣＤＲ３部分中に１つまたは複数の突然変異が含まれるよ
うに改変する。これらの抗体には以下の配列が含まれ、ＣＤＲ３領域内の単一の点突然変
異を、アミノ酸配列内で下線を引いた：

これらの突然変異体の結合は、組換えヒトＴＬＲ４−ＭＤ２を発現する細胞上のＦＡＣ
Ｓによって分析した。ＰＥＡＫ細胞を、１ｕｇの、１５Ｃ１ヒト化ＶＨ突然変異体１また
は２、および１５Ｃ１ヒト化ＶＬ Ａ２６または１５Ｃ１ヒト化ＶＨ４〜２８、および実
施例４に示す１５Ｃ１ヒト化ＶＬ突然変異体１、２、３または４をコードしている発現ベ
クターの組合せを用いて、Ｔｒａｎｓ ＩＴ−ＬＴ１形質移入試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、同時形質移
入した。すべての形質移入は、２つ組で実施した。形質移入の７２時間後、ＰＥＡＫ細胞
の上清を収集し、組換えヒトＩｇＧ１／κの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。その後
、すべての上清の抗体濃度を０．３３μｇ／ｍｌに調節した。その後、これらの上清なら
びに０．１１および０．０４ｕｇ／ｍｌの２つの段階希釈物を、その表面にヒトＴＬＲ４
−ＭＤ２を発現するＣＨＯ細胞との結合について、ＦＡＣＳによって試験した。５×１０
^５個の細胞を、希釈したＰＥＡＫ上清と共に、１時間４℃でインキュベーションした。２
回の洗浄後、細胞を、二次抗体（アロフィコシアニンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（１：２００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベーシ
ョンした。細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）を用いて、ＦＬ−４チャネルで分析した（図１７Ａ〜１７Ｇ）。図１７Ａ−
１７Ｇの、１５Ｃ１のヒト化突然変異バージョンとＴＬＲ４との結合は、様々な抗体濃度
の平均蛍光強度として表す。４つの実験のうちの代表的な１つ。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．
を示す。ＶＨ変異１およびＶＬ変異２のバージョンは、特許取得されているヒト化したバ
ージョンよりも高いＭＦＩを有すると考えられ、これは、これら２つのバージョンが、ヒ
ト化したバージョンよりも高い相対親和性を有することを示している。
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲
によって定義されている本発明の範囲を例示することを意図し、それを限定することを意
図しない。他の態様、利点、および変形は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (1)

1. 改変ポリペプチドまたは方法または単離したポリペプチド。

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