EA009559B1 - КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ - Google Patents

КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Download PDF

Info

Publication number
EA009559B1
EA009559B1 EA200601168A EA200601168A EA009559B1 EA 009559 B1 EA009559 B1 EA 009559B1 EA 200601168 A EA200601168 A EA 200601168A EA 200601168 A EA200601168 A EA 200601168A EA 009559 B1 EA009559 B1 EA 009559B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
peptide
carrier
polypeptide carrier
polypeptide
Prior art date
Application number
EA200601168A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601168A1 (ru
Inventor
Расаппа Г. Арумугхам
А. Кришна Прасад
Original Assignee
Элан Фармасьютикелз, Инк.
Вайет
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34700143&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA009559(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Элан Фармасьютикелз, Инк., Вайет filed Critical Элан Фармасьютикелз, Инк.
Publication of EA200601168A1 publication Critical patent/EA200601168A1/ru
Publication of EA009559B1 publication Critical patent/EA009559B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов Aβ пептидных иммуногенов с молекулами белковых/полипептидных носителей, применимых в качестве иммуногенов, причём пептидные иммуногены конъюгируются с белками-носителями за счёт активированных функциональных групп на аминокислотных остатках носителя или необязательно связанной линкерной молекулы, а неконъюгированные реактивные функциональные группы на аминокислотных остатках инактивируют "кэпированием", тем самым сохраняя иммунологическую функциональность молекулы носителя, но уменьшая предрасположенность к нежелательным реакциям, которые могут сделать конъюгат менее безопасным или менее эффективным. Кроме того, данное изобретение относится также к иммуногенным продуктам и иммуногенным композициям, содержащим такие иммуногенные продукты, полученные такими способами.

Description

Предпосылки создания изобретения
Сущностью приобретённого иммунитета является способность организма реагировать на присутствие чужеродных веществ и продуцировать компоненты (антитела и клетки), способные специфически взаимодействовать с ними и защищать хозяина от их инвазии. Антиген или иммуноген представляет собой вещество, способное вызывать этот тип иммунного ответа, а также способное взаимодействовать с сенсибилизированными клетками и антителами, которые вырабатываются против них.
Антигены или иммуногены обычно представляют собой макромолекулы, которые содержат определённые антигенные сайты или эпитопы, узнаваемые различными компонентами иммунной системы и взаимодействующие с ними. Они могут существовать в виде отдельных молекул, представляющих собой синтетические органические вещества, белки, липопротеины, гликопротеины, РНК, ДНК или полисахариды, или они могут представлять собой часть клеточных структур (бактерии или грибки) или вирусы (Наг1о\г апб Бале 1988а, Ь, с; Ма1е е! а1., 1987).
Малые молекулы, такие как короткие пептиды, несмотря на то, что обычно способны реагировать с продуктами иммунного ответа, часто не могут вызвать ответ на себя самих. Эти пептидные иммуногены или гаптены, как их также называют, на самом деле являются неполными антигенами и хотя не способны сами по себе вызвать иммуногенность или продуцирование антител, их можно сделать иммуногенными, связывая их с подходящим носителем. Носителями обычно являются более высокомолекулярные белковые антигены, способные вызывать иммунологический ответ при введении ίη νίνο.
При иммунном ответе антитела продуцируются и секретируются В-лимфоцитами вместе с Т-хелперными (Тн) клетками. В большинстве систем гаптен-носитель В-клетки продуцируют антитела, специфические как к гаптену, так и к носителю. В этих случаях Т-лимфоциты имеют домены специфического связывания на носителе, но не распознают один гаптен. Проявляя своего рода синергизм, В- и Т-клетки кооперируются, индуцируя гаптен-специфический антительный ответ. Если после того, как возникает такой иммунный ответ, хозяина заражают только гаптеном, обычно он отвечает, продуцируя гаптен-специфические антитела при использовании клеток памяти, образовавшихся после начальной иммунизации.
Синтетические гаптены, имитирующие некоторые важные эпитопные структуры на макромолекулах с более высокой молекулярной массой, часто конъюгируются с носителями, обеспечивая иммунный ответ на более высокомолекулярную родительскую молекулу. Например, короткие пептидные сегменты можно синтезировать из известных последовательностей белка и связать с носителем, чтобы индуцировать иммуногенность к нативному белку. Этот тип синтетического подхода к получению иммуногена стал основой многих современных исследований по созданию вакцин. Однако во многих случаях создание только лишь В-клеточного ответа с применением синтетических конъюгатов пептид-носитель, как бы ни был хорош их дизайн, не всегда является гарантией абсолютного защитного иммунитета к интактному антигену. Иммунного ответа, выработанного коротким пептидным эпитопом из вирусной частицы большего размера или бактериальной клетки, может быть достаточно только для того, чтобы формировать память на В-клеточном уровне. В этих случаях общепринято в настоящее время, что ответ цитотоксических Т-клеток является более важным показателем защитного иммунитета. Создание пептидных иммуногенов с подходящими эпитопными сайтами связывания для узнавания как В-, так и Т-клеток является одним из наиболее перспективных областей современной иммунологии.
Десятилетиями успешно применялся способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул конъюгацией этих молекул с большими молекулами носителей (см., например, ОоЬе1 е! а1. 1. Ехр. Меб. 1939, 69: 53). Например, описаны многие иммуногенные композиции, в которые очищенные капсулированные полимеры конъюгируют с белками носителей, образуя более эффективные композиции с использованием этого эффекта носителя (8ейпеег8оп е! а1. 1пГес1. 1шшип.1984, 45: 582591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у детей, иммунизированных свободным полисахаридом (Апбегаоп е! а1. 1. Реб1а!г. 1985, 107: 346; 1п§е1 е! а1. 1. Ехр. Меб. 1986, 158:294).
Конъюгаты гаптен-носитель успешно получали, используя различные сшивающие/связывающие реагенты, такие как гомобифункциональные, гетеробифункциональные или сшивающие линкеры нулевой длины. В настоящее время имеются многие такие методы связывания сахаридов, белков и пептидов в пептидные носители. В большинстве таких методов создают аминную, амидную, уретановую, изотиомочевинную или дисульфидную связи или в некоторых случаях - тиоэфирную. Недостатком применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты (реакционные центры) в боковые цепи реактивных аминокислотных молекул в молекулах носителя и/или гаптена, является то, что реактивные сайты, если они не нейтрализованы, свободны для реакции с нежелательной молекулой либо ίη ν 11го (тем самым вредно влияя на стабильность конъюгата(ов)), либо ίη νί\Ό (тем самым вызывая повышенный риск побочных явлений у людей или животных, иммунизированных этими препаратами). Такие избыточные реактивные сайты могут реагировать или их можно кэпировать, так чтобы инактивировать эти сайты, используя различные известные химические реакции, но, с другой стороны, эти реакции могут быть деструктивными для функциональности конъюгатов. Но могут возникнуть особые сложности, когда пытаются создать конъюгат введением реактивных сайтов в молекулу носителя, так как более значи- 1 009559 тельный размер и более сложная структура (по сравнению с гаптеном) могут сделать конъюгат более восприимчивым к разрушительному действию химической реакции. В действительности, неизвестны примеры способов получения конъюгата, когда активируют носитель, затем его конъюгируют с гаптеном и, наконец, копируют остальные реактивные сайты, при этом сохраняя способность полученного конъюгата функционировать как иммуногенная композиция, имеющая заданные свойства эффекта носителя.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения иммуногенного конъюгата пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагмент Αβ, или его аналоги, с белковым/полипептидным носителем, причём Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или их аналоги конъюгируют с носителем по дериватизированным функциональным группам аминокислотных остатков носителей, таких как остатки лизина, а любые неконъюгированные дериватизированные функциональные группы аминокислотных остатков инактивируют кэпированием, блокируя их реакции с другими молекулами, включая белки/полипептиды, тем самым защищая функциональность носителя, так что он сохраняет способность вызывать заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, что в отсутствие носителя было бы невозможно. Кроме того, данное изобретение также относится к конъюгатам, полученным вышеописанными методами, и к иммуногенным композициям, содержащим такие конъюгаты.
В одном варианте настоящее изобретение относится к первому способу конъюгации пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагмент Αβ-пептида, или его аналог, реакцией реакционноспособной (реактивной) группы аминокислотного остатка пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, причём данный способ включает стадии:
а) реакция одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя с образованием дериватизированной молекулы с реактивными (реакционноспособными) сайтами;
б) реакция дериватизированного белкового/полипептидного носителя со стадии (а) с реакционноспособной (реактивной) группой аминокислотного остатка пептидного иммуногена в таких условиях реакции, при которых пептидный иммуноген конъюгируется с дериватизированным белковым/полипептидным носителем за счёт функциональных групп;
в) дальнейшая реакция конъюгата с копирующим реагентом для инактивации свободных реакционноспособных (реактивных) функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, тем самым защищается функциональность носителя, так что сохраняется его способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, чего в отсутствие носителя не могло бы быть.
В одном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки, молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, ΡΑΝ-ΌΡ. связывающего пептида (ΡΑΌΡΕ полипептида), сйсшпхрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ?Ад|9-;х). белка теплового шока (Η8Ρ) 65, бациллы Кальметта-Герена (ВСС), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 81гер1ососсих рюдепех ОКТ1224, 81гер1ососсих рюдепех ОКТ1664, 81гер1ососспх рюдепех ΘΚΓ2452, пневмолизина 81гер1ососспх рпеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, С1ашуб1а рпеитошае ОКТ Т367, С1атуб1а рпеитошае ОКТ Т858, столбнячного токсина, ВИЧ др120 Т1, компонентов, узнающих адгезивные матричные молекулы поверхности микробных клеток (М8СКΑММ8), фактора/гормона роста, цитокинов и хемокинов.
В другом варианте изобретения белковый/полипептидный носитель содержит Т-клеточный эпитоп.
Ещё в одном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель является бактериальным токсоидом, таким как столбнячный токсоид, холерный токсин или мутант холерного токсина, описанные выше. В предпочтительном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель представляет собой СКМ197.
Ещё в одном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель представляет собой гемагглютинин вируса гриппа, полипептид ΡΑΌΡΕ, С8 белок возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (ΗΒ8Α§19-28), белка теплового шока 65 (Η8Ρ 65) или полипептида из МусоЬас!егшт 1пЬегсп1ох1Х (ВСС).
В предпочтительном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель выбирают из рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 81гер1ососспх рюдепех ОКТ 1224, 81гер!ососсих рюдепех ОКТ1664 или 81гер1ососспх рюдепех ОКТ2452, пневмолизина 81гер1ососспх рпеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, С1атуб1арпеитошае ОКТ Т367 и С1атуб1а рпеитошае ОКТ Т858.
В одном варианте изобретения белковый/полипептидный носитель представляет собой фактор или гормон роста, который стимулирует или повышает иммунный ответ и выбирается из группы, состоящей из 1Ь-1, Ш-2, γ-интерферона, Ш-10, СМ-С8Г, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β и ΒΑΝΊΈδ.
- 2 009559
В одном аспекте изобретение включает пептидный иммуноген, содержащий Αβ-пептид, или фрагмент Αβ, или его аналог, выявляющий (вызывающий) иммунный ответ против некоторых эпитопов в Αβ. Иммуногенные пептиды по изобретению включают иммуногенные гетерологичные пептиды. В некоторых иммуногенных пептидах Ав фрагмент связан с носителем с образованием иммуногенного гетерологичного пептида, а затем этот гетерологичный пептид связывается с носителем с применением способа по настоящему изобретению с образованием конъюгата.
В другом аспекте настоящего изобретения пептидный иммуноген является полипептидом, содержащим Ν-концевой сегмент по меньшей мере из 1-5 остатков Αβ, причём первый остаток является Ν-концевым остатком полипептида, в котором полипептид не содержит С-концевого сегмента Αβ. Ещё в одном аспекте изобретения пептидный иммуноген представляет собой полипептид, содержащий Ν-концевой сегмент Αβ, причём этот сегмент начинается с остатка 1-3 Аβ и заканчивается остатками 7-11 Αβ. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой агент, который индуцирует иммуногенный ответ против Ν-концевого сегмента Αβ, причём сегмент начинается с остатка 1-3 Αβ и кончается остатками 7-11 Αβ, не индуцируя иммунного ответа против эпитопа в остатках 12-43 Аβ43.
В другом аспекте настоящего изобретения пептидный иммуноген представляет собой гетерологичный полипептид, содержащий сегмент Αβ, связанный с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Т-хелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, тем самым, В-клеточный ответ против Ν-концевого сегмента.
В некоторых пептидных иммуногенах Ν-концевой сегмент Аβ связан на С-конце с гетерологичным полипептидом;
на Ν-конце с гетерологичным полипептидом;
на Ν-конце и С-конце с первым и вторым гетерологичными полипептидами;
на Ν-конце с гетерологичным полипептидом и на С-конце по меньшей мере с одной добавочной копией Ν-концевого сегмента.
В некоторых пептидных иммуногенах полипептид содержит, от Ν- до С-конца, Ν-концевой сегмент Αβ, множество добавочных копий Ν-концевого сегмента и гетерологичный аминокислотный фрагмент.
В некоторых из вышеописанных пептидных иммуногенов полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну добавочную копию Ν-концевого сегмента. В некоторых из вышеописанных пептидных иммуногенов фрагмент не содержит по меньшей мере 5 С-концевых аминокислот в Аβ43.
В некоторых аспектах вышеописанных пептидных иммуногенов фрагмент содержит до 10 непрерывных аминокислот из Αβ.
В другом аспекте изобретение включает пептидный иммуноген, содержащий Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или их аналоги, вызывающие иммунный ответ против некоторых эпитопов в Αβ, возможно, в конфигурации, называемой конфигурацией множественных антигенных пептидов (МАП, ΜΑΡ).
В некоторых из вышеприведённых аспектов изобретения пептидный иммуноген образован из Ν-концевой половины Αβ. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Αβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3-6 и 3-7.
В некоторых из вышеприведённых аспектов изобретения пептидный иммуноген образован из внутренней области Αβ. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Αβ13-28, 15-24, 17-28 и 25-35.
В некоторых из вышеприведённых аспектов изобретения пептидный иммуноген образован из С-конца Αβ.
В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из:
Аβ33-42, 35-40 и 35-42;
Αβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42;
Αβ1-5, Αβ1-7, Αβ1-9 и Αβ1-12;
Αβ1-5-Ε, Αβ1-7-Ε, Αβ1-9-Ε и Αβ1-12-Ε, где Ь обозначает линкер;
Αβ1-5-Ε-0, ΑβΤ-7-Ь-С, ΑβΤ-9-Ь-С и Αβ 1-12-И-С. где С обозначает цистеиновый аминокислотный остаток;
Αβ16-22, Αβ16-23, Αβ17-23, Αβ17-24, Αβ18-24 и Αβ18-25;
Αβ16-22-Ο Αβ16-23-Ο ΑβΠ-23-С, ΑβΠ-24-С, Αβ18-24< и Αβ18-25< где С обозначает цистеиновый аминокислотный остаток.
В других аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из С-Αβ 16-22, С-Αβ 16-23, Αβ17-23, ^Αβ17-24, С-Αβ 18-24 и Ο-Αβ18-25-Ο, где С обозначает цистеиновый аминокислотный остаток.
- 3 009559
В некоторых из вышеописанных пептидных иммуногенов гетерологичные полипептиды выбирают из группы, состоящей из пептидов, имеющих Т-клеточный эпитоп, В-клеточный эпитоп и их комбинацию.
В одном варианте изобретения функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового/полипептидного носителя или возможно присоединённого полипептидного линкера дериватизирована с применением сшивающего реагента. В другом варианте изобретения дериватизирующий реагент представляет собой сшивающий реагент нулевой длины. В другом варианте изобретения дериватизирующий реагент представляет собой гомобифункциональный сшивающий реагент. Ещё в одном варианте изобретения дериватизирующий реагент представляет собой гетеробифункциональный сшивающий реагент.
В предпочтительном варианте изобретения гетеробифункциональный реагент представляет собой реагент, который реагирует с первичной или функциональной ε-аминогруппой одной или более аминокислотных молекул белкового/полипептидного носителя и боковой тиольной группой одной или более аминокислотных молекул пептидного иммуногена. В одном варианте изобретения гетеробифункциональный реагент представляет собой Ν-сукцинимидилбромацетат.
В другом варианте изобретения первичная функциональная ε-аминогруппа представляет собой ε-аминогруппу лизина. Ещё в одном варианте изобретения дериватизация функциональной первичной аминогруппы и ε-аминогруппы лизина белкового/полипептидного носителя с помощью Ν-сукцинимидилбромацетата приводит к бромацетилированию первичной аминогруппы и ε-аминогруппы лизина белкового/полипептидного носителя. В более предпочтительном варианте изобретения боковая тиольная группа представляет собой тиольную группу цистеинового остатка пептидного иммуногена, который может быть локализован на карбоксиконце пептидного иммуногена или внутри пептидного иммуногена.
В другом варианте изобретения боковую тиольную группу вводят (образуют) по реакции тиолирования с помощью таких реагентов как Ν-ацетилгомоцистеинтиолактон, реагент Траута (2-иминотиолан), 8ΑΤΑ (№сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат), 8МРТ (4-сукцинимидилоксикарбонилметил-2пиридилтиотолуол), 8и1£о ЬС 8ΡΌΡ (сульфосукцинимидил пиридилдитио пропион-амидогексаноат), 8ΡΌΡ (сукцинимидилпиридилдитиопропионат). В предпочтительном варианте изобретения кэпирующий реагент, который используют для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, выбирают из группы реагентов, состоящей из цистеамина, Ν-ацетилцистеамина и этаноламина.
В особенно предпочтительном варианте изобретения кэпирующий реагент, который используют для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, выбирают из группы реагентов, состоящих из гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
В одном варианте изобретения реакционная (реактивная) группа аминокислотного остатка пептидного иммуногена представляет собой свободную сульфгидрильную группу.
В другом варианте изобретения одна или более функциональных групп расположены на линкере, который, необязательно (возможно), связан с белковым/полипептидным носителем. В предпочтительном варианте изобретения линкер представляет собой пептидный линкер. В более предпочтительном варианте изобретения пептидный линкер представляет собой полилизин.
В другом варианте изобретение относится ко второму способу конъюгации пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или аналоги Αβ, или их аналоги с белковым/полипептидным носителем, имеющим структуру (X)» где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на белковом/полипептидном носителе или, возможно, аминокислотного остатка пептидноголинкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85.
Причём этот способ содержит стадии:
а) дериватизации одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя или необязательно связанной с белковым полипептидным носителем молекулы линкера с образованием дериватизированной молекулы с реактивными сайтами;
б) реакции дериватизированного белкового/полипептидного носителя со стадии (а) с реактивной (реакционной) группой аминокислотного остатка пептидного иммуногена с образованием ковалентно связанного конъюгата: пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель;
- 4 009559
в) последующей реакции указанного конъюгата с копирующим реагентом для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, в результате чего копированные группы не могут реагировать с другими молекулами, включая белки/полипептиды, тем самым защищается функциональность носителя, т.е. он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, что в отсутствие носителя было бы невозможно, таким образом образуется конъюгат: копированный пептидный иммуногенбелковый/полипептидный носитель, имеющий формулу
где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X'1 обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
В обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, связанного с белковым/полипептидным носителем;
п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
Полные варианты первого способа по изобретению, приведённые выше, также применимы для конъюгатов, полученных вышеописанным вторым способом.
В одном варианте данное изобретение относится к конъюгатам пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или их аналоги, с белковым/полипептидным носителем, где белковый/полипептидный носитель имеет формулу
где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на белковом/полипептидном носителе или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, конъюгат: копированный пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель имеет формулу
где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X' обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
Р обозначает молекулу пептидного иммуногена, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
В обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, так что он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, иначе, без носителя, ото было бы невозможно;
п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
Полные варианты первого и второго способов по изобретению, подробно описанные ранее, также применимы к вышеописанным конъюгатам.
- 5 009559
В другом варианте изобретение относится к конъюгатам пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид либо фрагменты Ав или их аналоги, с белковым/полипептидным носителем, полученным по второму способу по изобретению и имеющим формулу (X»—Р)п
(Х^)
Р где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X0 обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
Р обозначает молекулу пептидного иммуногена, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
В обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, так что он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, иначе без носителя это было бы невозможно;
η обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
Полные варианты второго способа изобретения, подробно описанные ранее, также применимы к конъюгатам, полученным вторым вышеописанным способом.
В другом варианте изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим конъюгат пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, полученный вторым способом по изобретению, вместе с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей и адъювантов.
Полные варианты второго способа изобретения, подробно описанные ранее, и полученные таким образом конъюгаты также применимы к вышеописанным иммуногенным композициям, содержащим эти конъюгаты.
В другом варианте изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа у млекопитающего, который заключается во введении субъекту эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению.
Подробно описанные (полные) варианты изобретения, применимые к иммуногенной композиции, содержащей конъюгаты по настоящему изобретению, также применимы к варианту изобретения, относящемуся к способу применения иммуногенных композиций.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - схематически показан химический процесс, применяемый для конъюгации фрагментов Αβ-пептида с белковым/полипептидным носителем 0ΒΜ197 с образованием конъюгата Αβ/ΟΚΜ197.
Фиг. 2 - схематически показан процесс кислотного гидролиза, применяемый для количественного определения 8-карбоксиметилцистеина и 8-карбоксиметилцистеамина для оценки степени конъюгации конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид, таких как конъюгат АР/СВМ197.
Фиг. 3 - изображена зависимость реакции конъюгации Αβ-пептид/СВМ от рН.
Фиг. 4 - изображена зависимость конъюгации Αβ-пептид/СВМ от соотношения пептид:СВМ.
Фиг. 5 - показана верификация процесса копирования при конъюгации Αβ-7/СВМ. Значение рН реакционной смеси в ходе реакции 9,15. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, копирование с помощью Ν-ацетилцистеина длится 8 ч.
Фиг. 6 - показаны конъюгация и копирование с различными пептидами: отношения СВМ:пептид. рН реакционной смеси во время реакции 9,0. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, копирование с помощью Ν-ацетилцистеина длится 8 ч.
Фиг. 7 - приведены титры сыворотки приматов на 36 день после иммунизации приматов конъюгатами Αβ-пептида с различными адъювантами.
Фиг. 8 - приведены титры сыворотки приматов на 64 день после иммунизации приматов конъюгатами Αβ-пептида с различными адъювантами.
Фиг. 9 - приведены титры сыворотки приматов по дням и по группам обработки. Приматов иммунизируют с помощью конъюгатов Αβ1-7 или Αβ1-5 СРМ19- с квасцами или ВС529 в качестве адъювантов и титры антител против Αβ определяют на день 29, 36, 57 и 64.
Фиг. 10 - показаны пептид-белковые конъюгаты, которые характеризуют с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ вестерн-блоттинга с применением готового геля с трис-трицином. Дорожки (полоски): маркер (дорожка
- 6 009559
1); Ь-28375 24/01 (дорожка 2); Ь-28375 24/02 (дорожка 3); Ь-28375 24/03 (дорожка 4); Ь-28375 24/04 (дорожка 5); Ь-28375 24/05 (дорожка 6); Ь-28375 24/06 (дорожка 7); Ь-28375 24/07 (дорожка 8); Ь-28375 24/08 (дорожка 9); Ь-28375 24/09 (проверочный, мнимый) (дорожка 10) и ВгЛеСКМ^ (дорожка 11).
Краткое описание последовательностей
8ЕС ГО ΝΟ Последовательность Описание
1 ВАЕГК-С ΑβΙ-5-С
2 ОАЕЕКНВ-С ΑβΙ-7-С
3 ОАЕГКНВ8С-С ΑβΙ-9-С
4 1>А Е Е Η11 Г)8(, Υ Е УС ΑβΙ-12-С
5 ВАЕЕЯ-САСА-С ΑβΙ-5-Ь-С
6 ВАЕГКНО-САСА-С ΑβΙ-7-Ь-С
7 ОАЕЕКНВ8С-САСА С ΑβΙ-9-Ь-С
8 ВАЕГЯНВЗСУЕУ-САСА-С ΑβΙ-12-Ь-С
9 УЕ¥С8ВНКЕЕ ΑΏ-С АР12-1-С
10 САСА Линкерный пептид
11 ΡΚΥνΚΟΝΤυΚΕΑΤ Гемагглютинин гриппа; НАМ7.
12 ЛКХУАДУСТЬКААА Пептид ΡΑΝ- ϋΡ (РАВРЕ пептид)
13 ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑ88ΎΓΝν Белок возбудителя малярии С8; ТЗ эпитоп
14 ГЕЬЬТКП.Т! Поверхностный антиген гепатита В; НВ5А§]9.28
15 Ο08Ι6ΒΙΛΑΕΑΜΒΚνθΝΕΟ Белок теплового шока 65: ] 71
16 ЦУНРЦРЬРРАУУКЪ Бацилла Кальметта- Герена (ВСО)
17 9 У1КА№КЕ1С1ТЕЬ Столбнячный токсоид; ΤΤ8Ι().
18 Е\ХЕТУ'8ГУУЬПУ'РКУ8Л8НЬЕ Столбнячный токсоид; ТТ,Ц-.,1Г,-
19 Κ<2ΙΙΝΜ3¥(2Εν<;ΚΑΜΥ НГУ§р120Т1
20 ВАЕЕВНВ- р¥1КА>8КЫС1ТЕЬ-СΓΝΝΓΤν8ΓννίΚνΡΚν8Α8ΗΕΕ- ΒΑΈΓΚΗΒ Αβι.γ.ΤΤίίο. 844/С/ТТ947.%7/АР|.7
- 7 009559
21 1)АЕГКНО8С¥ЕУННУКЬУГГАЕО¥(;^ КСАПСЬМУССУМА Αβι ·«
22 1>АЕГКНП9¥1КА.Ч8КЕ1С1ТЕЕ ΑΝ90549: Αβ^/ΤΤ^. 844 (использ. в конфигурации МАР4)
23 ОАЕЕКН1)ЕММЕТУ8РЗ¥ШУТК¥8А8НЕЕ ΑΝ90550: Αβι,/ΤΤ^γ.96-(использ. в конфигурации МАР4)
24 ΟΑΕΓΚΗΙ) ^ΥIΚΑN8ΚΓIСIΤΕ^ΓNNБΤV8Γ^V^ΚVΡΚ У8А8НЬЕ ΑΝ90542: Ар|.7/ТТ8зо-844+ ТТ^-.ч^т (в линейной конфигурации)
25 ΕΓΚΗΡδΟ-ςΥΙΚΑΝδΚΠΟΙΤΕΕ ΑΝ90576: Αβ4.9/ΤΤ83()-м4 (использ. в конфигурации МАР4)
26 АКХУААЗУТЬКАААОАЕЕКШ> ΑΝ90562: Αβ,.ι/ΡΑΟΚΕ
27 ΟΑΕίΚΗΙΓΟΑΕΕΚΗυΟ- АЕГКНВАКХУАААТЬКААА ΑΝ90543: Αβ,., х 3/ΡΑϋΚΕ
28 АКХУААУУТЬКААА-ОАЕРВНОЛАЕЕННП-ОАЕЕКШ) РАОКЕ/Ар,., х 3
29 ОАЕГКНБ-АКХУАААТЬКААА Αβ,., х 3/ΡΑϋΚΕ
30 ОАЕЕВНМвЦАУНААНАЕПЧЕАСК Αβι-7/фрагмент альбумина
31 ГКНОЗСУЧЙЦАУНААНАЕНЧЕАСК Αβ4. щ/фрагмент альбумина
32 ЕЕКНОКОВЦАУНААНАЕШЕАСК АрзУфрагмеит альбумина
33 РКУУКрМ'ЕКЕАГ-ПАЕЕКНО-ПАЕЕКНП ОАЕГК1Ю НАзо?.} и/Αβ] ,7 X 3
34 ПАЕЕКНП-РКУУКрХТЕКЬАТ-ОАЕЕКШ) Αβ|-τ/ΗΑ307.3Ι9/Αβ|-7
35 РАЕРВНВПАЕРКНЮ-ПАЕНШЮРКУУКЦМТЕКЬАТ Αβι.,χ З/НАзот.зг,
36 ОАЕГ1ШО-ПАЕГКНО-РКУУК(2МТЬКЬАТ Αβ)-7 х2/НАз07-Л9
37 0ΑΕΓΚΗϋ-ΡΚΥνΚ9>ΤΕΚ_ΕΑΤ- ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑ88νΓΝν- ΟΥΙΚΑΝδΚΕΙΟΓΓΕΕ- ΓΝΝΕΤν8ΕΛνΕΚνΡκν8Α8ΗΕΕ-ΡΑΕΠ<ΗΟ Ар|.7/НАз0?.з19/С8 малярия/ ТТазо_$+4/ТТ947.967/ Αβ|-7
38 ОАЕГКНО-ОАЕГКНО-ОАЕГКНО- ΟΥΙΚΑΝ8ΚΕΙΟΙΤΕΕ-(’- ΕΝΝΕΤν8ΕΑΈΚνΡΚν8Α8ΗΕΕ Αβ(.? X 3/ТТ83о-844/С/ТТч47.чп7
39 Ι)ΑΕΓΚΗΕ)-9ΥΙΚΑΝ8ΚΕΙ(;ΐΤΕΕ-Γ- ГМЧГТУ$ЕЗ¥ЕЙУРКУ8А8НЬЕ А Р1.7/ТТ330-8+4/С/ТТ947-967
40 ΟΑΟθννθ88Κ8ΓνΜΕΝΕ88ΥΗ&ΓΚΡΟΥ \08ϊ9ΚΓ.Ι9ΚΡΚ8€ΪΤΟΟΝΥΕ>ΒΟ\νΚΕΕΥ δΤϋΝΚΥΟΑΑΟΥδνΒΝΕΝΡίβΟΚΑΟΟνν ΚνΤΥΡϋΕΤΚνΕΑί.ΚΧΤΟ.ΜΑΕΤΙΚΚΕΕΒΕδ ЕТЕРЬМЕЦУСТЕЕПККГСОСАвКУУЪв ЕРГАЕС888УЕУ1МЖ¥ЕОАКАЬ8УЕЬЕПЧ РЕТКСККСР[)АМ¥Е¥МАОАСАСУКУК К8УС88Ь8С!!ЧЕО1УОУ1КПКТКТК1Е8ЕК Ε ΗΟΡΙΚΝΚΜ8Ε8ΡΝΚΤ У8ЕЕКАКЧ¥ ЕЕЕ ЕНЦТАЬЕНРЕЬЗЕЬКТУтаТМРУЕАСАМ ΥΑΑΛΑνΝνΑΟνίυΞΕΤΑϋΝΕΕΚΤΤΑΑΙ. 81ЕРС1С8УМС1АПСАУННГЧТЕЕ1УА<381 АЬ85ЕМУА0А1РЬУСЕЬУВ1СЕАА¥ХГУ Ε 8ΠΝΕΓ9ννΗΝ8ΥΝΒΡΑΥ8ΡΟΗΚΤΟΡΕΕ ΗϋΌΥΑν5\¥ΝτνΕΟ8ΙΙΒ.Τ<ϊΡ<}ΟΕ8ϋΗ1)Ι ΚΓΓΑΕΝΤΡ1ΡΙΑΟΥΕΕΡΤΙΡΟΚΕΟνΝΚΑΚ ТН18¥7ЧСВК1КМКСВА1ОСОУТГСКРК8Р νΥνΟΝΟνΗΑΝΕΗΥΑΕΗΚδδδΕΚΙΗδΝΕΙ 0ΚΜβΙ44
- 8 009559
88В81СУЬОУ(2КТУПНТК™8КЕ8ЕГГЕ1 К8
41 18ОАУНААНАЕПЧЕАСК Фрагмент альбумина
42 ВАЕЕКНВвСГЕУКНОКЬУЕГАЕВУСвНКС АПСЬМУССУУЗА Мышиный А( 1 -42
43 УГГАЕВУС-С А(18-25-С
44 ЬУГГАЕВУ-С А(17-24-С
45 К1ЛТГАЕВ-С А(16-23-С
46 С-УГГАЕВУ'С С-А(18-25
47 С-ЬУЕГАЕВУ С-А( 17-24
48 С-К1ЛТГАЕВ С-А( 16-23
49 УЕЕАЕВУ-С А(18-24-С
50 ЬУГГАЕВ-С А(17-23-С
51 КЬУГГАЕ-С А(16-22-С
52 С-УЕГАЕВУ С-Арц.и
53 С-ЬУЕЕАЕВ с-а₽„.23
54 С-КЬУЕЕАЕ С-А₽16.,:
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов пептидный иммуногенноситель, в которых непрореагировавшие активные функциональные группы на носителе, образующиеся при активации, инактивируют, используя кэпирующие реагенты, такие как Ν-ацетилцистеамин, для того, чтобы предотвратить их последующие реакции. Настоящее изобретение относится также к конъюгатам копированный носитель-пептидный иммуноген, полученным этими способами, и к иммуногенным композициям, содержащим указанные конъюгаты.
Способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул, таких как сахариды, с использованием конъюгации успешно применялся десятилетиями (см., например, СоеЬе1 е! а1. 1. Ехр. Меб. 1939, 69: 53) и описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсулированные полимеры конъюгированы с белками-носителями с целью получения более эффективных иммуногенных композиций, используя этот эффект носителя. Например, 8сйиеегкои е! а1. (1. Ехр. Меб. 152: 361-376, 1980) описывают конъюгаты НаеторйШк шПиепхае Ь полисахарида с белком, которые наделяют иммунитетом к инвазивным заболеваниям, вызванным микроорганизмами. Показано, что конъюгаты РКР (полирибозилрибитолфосфат, капсулированный полимер Н. шПиепхае Ь) являются более эффективными, чем иммуногенные композиции на основе одного полисахарида (С1ш е! а1., 1иГес1. 1ттии. 1983, 40: 245; 8с1теег5оп е! а1. 1иГес!. 1ттии. 1984, 45: 582-591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у детей, иммунизированных свободным полисахаридом (Апбегкоп е! а1. 1. Реб1а!г. 1985, 107: 346; 1пке1 е! а1. 1. Ехр. Меб. 1986, 158:294).
Другим преимуществом применения в качестве белкового носителя бактериального токсина или токсоида, против которого обычная иммунизация людей (например, столбнячного или дифтерийного) является стандартной практикой, заключается в том, что заданный иммунитет к токсину или токсоиду индуцируется наряду с иммунитетом против патогенов, ассоциированных с капсулированным полимером.
Конъюгаты антигенная детерминанта/гаптен-носитель также использовались для получения высокоспецифических моноклональных антител, которые могут узнавать дискретные химические эпитопы на связанном гаптене. Полученные моноклональные антитела часто используют для изучения эпитопной структуры и взаимодействий между нативными белками. Во многих случаях антигенные детерминанты, используемые для получения этих моноклональных антител, являются малыми пептидными сегментами, представляющими ключевые антигенные сайты на поверхности белков большего размера. Критериями для хороших носителей, используемых при получении конъюгата антигенная детерминанта/гаптенноситель, являются потенциал для иммуногенности, наличие функциональных групп, подходящих для конъюгации с антигенной детерминантой/гаптеном, достаточная растворимость даже после дериватизации и отсутствие токсичности ίη у1уо.
Этим критериям отвечают конъюгаты, полученные способами по данному изобретению. Конъюгаты могут представлять собой любые стабильные конъюгаты пептидный иммуноген-носитель, полученные способом конъюгации по настоящему описанию. Конъюгаты получают, используя способ по настоящему изобретению, в котором белковый/полипептидный носитель, имеющий следующую структуру:
- 9 009559 где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на белковом/полипептидном носителе или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, ковалентно связан с пептидным иммуногеном и где конъюгат пептидный иммуногенбелковый/полипептидный носитель представлен следующей формулой:
где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
X0 обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителемы;
Я обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, так что он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, иначе, без носителя, это было бы невозможно;
η обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
Выбор носителей.
Некоторые пептидные иммуногены содержат подходящий эпитоп для индуцирования иммунного ответа, но слишком малый для того, чтобы быть иммуногенным. В таком случае пептидные иммуногены связывают с подходящим носителем, что способствует выявлению иммунного ответа. В вышеприведённом схематическом изображении конъюгата пептидный иммуноген-носитель, получаемого способом по настоящему изобретению, С обозначает белковый/полипептидный носитель, с которым пептидные иммуногены конъюгируются непосредственно за счёт дериватизированных функциональных групп аминокислотных остатков на самих носителях либо опосредованно за счёт дериватизированных функциональных групп на пептидных линкерах, ковалентно связанных с носителями. Подходящие белковые/полипептидные носители включают, но без ограничения, альбумин (включая человеческий сывороточный альбумин), гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулинов, тиреоглобулин, овальбумин, М8СЯАММ8, столбнячный токсоид (анатоксин) или токсоид других патогенных бактерий с пониженной токсичностью, включая мутанты, такой как дифтерийный, Е. сой, холерный или Н. ру1огг или ослабленное производное токсина. Одним из таких носителей является белок СЯМ197 (8Еф ΙΌ N0: 40), перекрёстно реактивный с дифтерийным токсином.
Другие носители включают Т-клеточные эпитопы, которые связываются с множественными МНС аллелями, например, по меньшей степени с 75% всех человеческих МНС аллелей. Такие носители в уровне техники иногда называют универсальные Т-клеточные эпитопы. Типичные носители с универсальными Т-клеточными эпитопами включают
- 10 009559
Гемагглютинин гриппа: НА307.319
Пептид ΡΑΝ- ϋΚ (пептид РАОКЕ)
ΡΚΥνΚΟΝΤΓΚΣΑΤ (8Εζ). ΠΟΝΟ. 11)
АКХУААЗУТЕКААА (8Ες. ГО ΝΟ. 12)
СЗ малярии: ТЗ эпитоп
ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑδδνΕΝν (8Ε<2. ГО ΝΟ. 13)
Поверхностный антиген гепатита В:
НВ5А§|5.г8
Белок теплового шока 65: Ь$р651)7|
ЕЕЫЛШЕТ1 (8Еф. ГО ΝΟ. 14)
ΟδΙΟΏΕΙΑΕΑΜΟΚνβΝΕΟ (8Е0. ΠΟΝΟ. 15)
Бацилла Кальметта- Герена (ВСО) <У/И?()РЕРРАУУКЬ (8Εζ). Ц) N0. 16)
Столбнячный токсоид: ТТ^о-ем
ΟΥΊΚΑΝ8ΚΓΙΟΙΤΕΕ (8Βζ). ΙΟΝΟ. 17)
Столбнячный токсоид: ΤΤ947.967
ГЛ9ГТУ8РУ/ЪКУРКУ5А8НЕЕ (8Εζ), ΓΟΝΟ. 18)
ВИЧер120Т1:
СИМ 197
Фрагмент альбумина
ΚΟΙΣΝΛΓΛ'ΡΕνΟΚΑΜΥ (8Εζ>. ΠΟΝΟ. 19)
См. краткое описание (8Е(?. Ю ΝΟ. 40)
ИОАУНААНАЕГЖАСР (8Еф ГО N0: 41)
Другие носители для стимулирования или повышения иммунного ответа, с которыми может конъюгироваться пептидный иммуноген или гаптен, включают цитокины, такие как 1Ь-1, 1Ь-1а и β-пептиды, 1Ь-2, γΙΝΕ, 1Ь-10, СМ-С8Е, и хемокины, такие как ΜΙΡ 1α и β и ΒΑΝΤΕ8. Иммуногенные пептиды могут также быть связаны с белковыми/пептидными носителями, которые повышают транспорт через ткани, как описано в О'Макопу, Международные заявки \О 97/17163 и \О 97/17614, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки во всей полноте для любых целей.
Другие носители включают 8!гер!ососса1 С5а пептидазу. 81гер!ососсиз рюдепез ОВЕ1224, 1664 и 2452, С1атуб1а рпеитошае ОВЕ Τ367 и Τ858, пневмолизин Б1гер1ососсиз рпеитошае, мутанты пневмолизина с пониженной токсичностью, факторы и гормоны роста.
В одном предпочтительном варианте настоящего изобретения белок-носитель представляет собой СВМ197, нетоксический мутант дифтерийного токсина с одной аминокислотной заменой в первичной последовательности. Глицин в аминокислотном положении 52 молекулы заменяется на глутаминовую кислоту в результате единичной замены нуклеотидного кодона. Вследствие отой замены белок не содержит ΑΌΡ-рибозилтрансферазной активности и становится нетоксическим. Его молекулярная масса составляет 58408 Да. СВМ197 получают в больших количествах при использовании рекомбинантной окспрессии в соответствии с патентом США 5614382, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Конъюгация сахаридов, а также пептидов с СВМ197 осуществляется путём связывания за счёт ε-аминогрупп лизиновых остатков. На примере некоторых промышленных продуктов чётко установлено, что СВМ197 является прекрасным и безопасным носителем для В-клеточных опитопов.
Иммуногенные пептиды.
Применяемый в данном описании термин пептидный иммуноген или гаптен представляет собой любой белок или образованные из него субъединичную структуру/фрагмент/аналог, которые при введении млекопитающему могут выявлять иммунный ответ, способствовать иммунному ответу или индуцироваться, вызывая иммунный ответ. В частности, термин применяется для обозначения полипептидной антигенной детерминанты из любого источника (бактерий, вируса или оукариот), которая может связываться с носителем способом по данному описанию. Такие полипептидный иммуноген/антигенные детерминанты могут происходить из вирусных, бактериальных клеток и клеток млекопитающих.
Пептидные иммуногены можно конъюгировать с носителем для применения в качестве иммунотерапевтических средств для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности различных заболеваний человека. Такие пептидные иммуногены включают пептидные иммуногены, образованные из Αβ-пептида из 39-43 аминокислот, предпочтительно из 42 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера (ΑΌ) (см. патент США 4666829; С1епиег & Аопу. Вюскет. Вюркуз. Вез. Соттип. 1984, 120: 1131; Нагбу (1984) ΤΙΝ8 20: 1131; Нагбу (197(9?)7, ΤΙΝ8 20: 154), которые образуются из амилоидных пептидов амилина, полипептидного материала, продуцируемого островковыми клетками поджелудочной железы, непосредственно связанными с диабетом типа ΙΙ, пептидов, образованных из генных продуктов липопротеинов низкой плотности, связанных с атеросклерозом, и антигенных пептидов из воспалительных цитокинов и факторов роста, таких как интерлейкин 6 (1Ь-6), фактор некроза опухолей α (ΤΝΕα) и СБЕ-8. Такие оукариотические пептидные им
- 11 009559 муногены могут включать либо Т-клеточный (СТЬ, ЦТЛ), либо В-клеточный эпитоп, также известный как β-амилоидный белок, или А4 пептид.
Αβ, также известный как β-амилоидный белок, или А4 пептид (см. патент США 4666829; С1епиег & \Уопд. Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. 1984, 120: 1131), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Αβ образуется при процессировании белка большего размера ΑΡΡ под действием двух ферментов, называемых βи γ-секретазами (см. Нагбу ΤΙΝ8 20: 154 (1997)). Известные мутации в ΑΡΡ, ассоциированном с болезнью Альцгеймера, происходят близ (проксимально) к сайту расщепления β- или γ-секретазами или внутри Αβ. Например, положение 717 находится проксимально к сайту расщепления ΑΡΡ γ-секретазой при его процессировании в Αβ, а положения 670/671 - проксимально к сайту расщепления β-секретазой. Полагают, что мутации вызывают ΑΟ путём взаимодействия в реакциях расщепления, в результате которых образуется Αβ, так что повышается количество 42/43 аминокислотной формы образующегося Αβ.
Αβ обладает необычным свойством, он может фиксировать и активировать как классические, так и альтернативные каскады комплемента. В частности, он связывается с С 1с.| и, в конечном счёте, с С3Ы. Эта ассоциация способствует связыванию с макрофагами, приводя к активации В-клеток, кроме того, С3Ы далее разрушается, а затем связывается с СК2 на В-клетках в зависимости от Т-клеток, приводя к 10000-кратному увеличению активации этих клеток. Этот механизм заставляет Αβ вырабатывать иммунный ответ в избытке этого или других антигенов.
Αβ имеет несколько природных форм. Человеческие формы Αβ обозначаются Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 и Аβ43. Последовательности этих пептидов и их связь с белком-предшественником ΑΡΡ иллюстрируется на фиг. 1 в Нагбу е! а1., ΤΙΝ8 20: 155- 158, 1997. Например, Αβ42 имеет последовательность
НаЫ-Азр-А1а<}1и-И1е-Аг8-Н18-Азр-5ег-О1у-Туг-СЛи-Уа1-1П8Ш8-О1п-Ьув-Ьси-Уа1-И1®-РЬе>А1а-О1и-Азр-Уа1’С}1у-8еГ'Ая1Сув-С1у-АЬ-Пе-Пе-СНу-1лв-Ме1-Уа1-СИу-61у-Уа1-Уа1-СеА1а-ОН(8ЕфГОЧО. 21).
Аβ41, Αβ40 и Αβ39 отличаются от Αβ42 тем, что в них отсутствуют Αία, Αία-Не и Л1а-11е-Уа1 соответственно на С-конце. Αβ43 отличается от Αβ42 присутствием треонинового остатка на С-конце.
Пептидные иммуногены, которые представляют собой фрагменты Αβ, эффективны по сравнению с интактной молекулой для применения в способах по настоящему изобретению по нескольким причинам. Во-первых, так как только определённые эпитопы внутри Αβ индуцируют иммуногенный ответ, полезный для лечения болезни Альцгеймера, доза фрагмента, содержащего такие эпитопы, даёт более высокую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем равная по массе доза интактного Αβ. Во-вторых, некоторые пептидные иммуногены Αβ вызывают иммуногенный ответ против амилоидных отложений, не вызывая заметного иммуногенного ответа против белка ΑΡΡ, из которого образован Αβ. В третьих, пептидные иммуногены Αβ проще получать, чем интактный Αβ из-за их более короткой длины. В четвёртых, пептидные иммуногены Αβ не агрегируются таким же образом, что и интактный Αβ, это упрощает получение конъюгатов с носителями.
Некоторые пептидные иммуногены Αβ имеют последовательность по меньшей мере из 2, 3, 5, 6, 10 или 20 непрерывных аминокислот природного пептида. Некоторые пептидные иммуногены содержат не более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непрерывных остатков Αβ. В предпочтительном варианте изобретения пептидные иммуногены Ν-концевой половины Αβ используют для приготовления конъюгатов. Предпочтительные пептидные иммуногены включают Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение Аβ1-5, например, указывает на Ν-концевой фрагмент, включающий 1 -5 аминокислотные остатки Αβ. Особенно предпочтительны фрагменты Αβ, начиная с Ν-конца и кончая остатком, входящим в остатки 7-11 Αβ. В некоторых способах фрагмент представляет собой Ν-концевой фрагмент, иной, нежели Αβ1-10. Другие предпочтительные фрагменты включают Αβ13-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 и другие внутренние фрагменты и фрагменты на С-конце.
Некоторые Αβ-пептиды по изобретению являются иммуногенными пептидами, которые при введении их пациенту - человеку или животному - генерируют антитела, специфически связывающиеся с одним или более эпитопов между остатками 16 и 25 Αβ. Предпочтительные фрагменты включают Αβ16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24 и 18-25. Антитела, специфически связывающиеся с эпитопами между остатками 16 и 25, специфически связываются с растворимым Αβ, не связываясь с бляшками Αβ. Эти типы антитела могут специфически связываться с растворимым Αβ в кровотоке пациента или животной модели, не связываясь специфически с бляшками из Αβ отложений в мозге пациента или модели. Специфическое связывание антител с растворимым Αβ ингибирует включение Αβ в бляшки, тем самым ингибируя прогрессирование бляшек у пациента или ингибируя дальнейшее увеличение размера или частоты встречаемости бляшек, если такие бляшки уже появились до начала лечения (до введения препарата).
- 12 009559
Предпочтительно, во вводимом фрагменте Αβ отсутствует эпитоп, который вызывает Т-клеточный ответ на фрагмент. Обычно Т-клеточные эпитопы по размеру протяжённее, чем 10 непрерывных аминокислот. Поэтому размер предпочтительных фрагментов Αβ составляет 5-10, или более предпочтительно 7-10 непрерывных аминокислот, или наиболее предпочтительно 7 непрерывных аминокислот; т.е. достаточная протяжённость, чтобы вызвать антительный ответ, не вызывая Т-клеточный ответ. Отсутствие Т-клеточных эпитопов является предпочтительным, так как эти эпитопы не нужны для иммуногенной активности фрагментов и могут вызвать нежелательный воспалительный ответ в субпопуляции пациентов (Апбегзоп е1 а1. 1. 1ттипо1. 2002, 168, 3697-3701; 8ешог. Ьапсе! №иго1. 2002, 1, 3).
Фрагмент Αβ15-25 и его субфрагменты из 7-8 непрерывных аминокислот являются предпочтительными, так как эти пептиды постоянно генерируют (вырабатывают) высокий иммуногенный ответ на Αβ-пептид. Эти фрагменты включают Αβ16-22, Αβ16-23, Ав16-24, Ав17-23, Ав17-24, Ав18-24 и Αβ18-25. Особенно предпочтительные субфрагменты Αβ15-25 имеют протяжённость 7 непрерывных аминокислот. Обозначение Αβ15-21, например, показывает, что фрагмент включает остатки 15-21 Αβ и не содержит других остатков Αβ и предпочтительно содержит 7-10 непрерывных аминокислот. Эти фрагменты могут вырабатывать антительный ответ, который включает антитела, специфические к концу.
Пептидные иммуногены Αβ требуют скрининга на активность клиринга или предупреждения амилоидных отложений (см. международную заявку АО 00/72880). Введение Ν-концевых фрагментов Αβ индуцирует продуцирование антител, которые узнают Αβ отложения ш νίνο и ш νίίτο. В некоторых способах применяются фрагменты, в которых отсутствует по меньшей мере один, а иногда по меньшей мере 5 или 10 С-концевых аминокислот, имеющихся в природных формах Αβ. Например, фрагмент, в котором отсутствуют 5 С-концевых аминокислот Αβ, включает первые Ν-концевые 38 аминокислот Αβ.
Если не указано иначе, ссылка на Αβ включает природные человеческие аминокислотные последовательности, указанные выше, а также аналоги, включая аллели, виды и осуществляемые варианты. Аналоги обычно отличаются от природных пептидов в одном, двух или нескольких положениях, часто за счёт консервативных замен. Обычно аналоги имеют последовательности, на 80 или 90% идентичные последовательностям природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Ν- или С-концевых аминокислот в одном, двух или нескольких положениях. Например, остаток природной аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 Αβ может быть замещён изоаспарагиновой кислотой.
Примерами неприродных аминокислот являются Ό, α,α-дизамещённые аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Νтриметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин,
3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, ω-Ν-метиларгинин, β-аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, γ-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота. Иммуногенные пептиды также включают аналоги Αβ и их фрагменты. Некоторые терапевтические агенты по изобретению представляют собой полностью Ό-пептиды, например полностью Ό Αβ, полностью Ό Αβ фрагмент или аналоги полностью Ό Αβ или полностью Ό Αβ фрагмента. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на профилактическую или терапевтическую эффективность в отношении трансгенных животных моделей по сравнению с непролеченными или пролеченными плацебоконтрольными животными, как описано в международной заявке АО 00/72880.
Пептидные иммуногены охватывают также более длинные полипептиды, которые включают, например, иммуногенный участок Αβ-пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные иммуногенные пептиды включают составные (химерные, гибридные) белки, содержащие сегмент Αβ, связанный с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Т-хелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательностью и, тем самым, Вклеточный ответ против сегмента Αβ. Такие полипептиды можно подвергать скринингу на профилактическую или терапевтическую эффективность в отношении трансгенных животных моделей по сравнению с непролеченными или пролеченными плацебо-контрольными животными, как описано в международной заявке АО 00/72880.
Αβ-пептид, аналог, иммуногенный фрагмент или другой полипептид можно вводить в дезагрегированной или агрегированной форме. Дезагрегированный Αβ или его фрагменты означают мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный Αβ или его фрагменты обычно являются растворимыми и способны к самоагрегации с образованием растворимых олигомеров, протофибрилл и ΑΌΌΕ. Олигомеры Αβ и их фрагменты обычно являются растворимыми и существуют преимущественно в виде α-спиралей или случайных спиралей. Агрегированный Αβ или его фрагменты означают олигомеры Αβ или их фрагменты, которые ассоциированы в нерастворимые ансамбли в виде β-складок. Агрегированный Αβ или его фрагменты также означают фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связывают либо растворимый Αβ или его фрагменты, либо агрегированный Αβ или его фрагменты. Некоторые антитела связывают как растворимый Αβ или его фрагменты, так и агрегиро
- 13 009559 ванный Αβ или его фрагменты.
Иммуногенные пептиды также включают мультимеры мономерных иммуногенных пептидов. Иммуногенные пептиды, отличные от Αβ-пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов Αβ (например, Αβ1-3, 1-7, 1-10 и 3-7).
Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению связываются с носителем по способу по настоящему изобретению с образованием конъюгата. Иммуногенный пептид может связываться на своём аминоконце, карбоксильным конце или по обоим концам с носителем с образованием конъюгата. Необязательно, в конъюгате могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида.
Ν-концевой фрагмент Αβ может связываться на своём С-конце с пептидом-носителем с образованием конъюгата. В таких конъюгатах Ν-концевой остаток Αβ является Ν-концевым остатком конъюгата. Соответственно, такие конъюгаты эффективно индуцируют антитела, связывающиеся с эпитопом, которому требуется свободный Ν-концевой остаток Αβ. Некоторые иммуногенные пептиды по изобретению содержат множество повторов Ν-концевого сегмента Αβ, связанного на С-конце с одной или более копий пептида-носителя с образованием конъюгата. Ν-концевой фрагмент Αβ, включённый в такие конъюгаты, иногда начинается Αβ1-3 и заканчивается Аβ7-11. Αβ1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 являются предпочтительными Ν-концевыми фрагментами Αβ. Некоторые конъюгаты содержат отличающиеся Ν-концевые Αβ в тандеме (связанные последовательно). Например, конъюгат может содержать Αβ1-7 с последующим Αβ1-3, связанным с носителем.
В некоторых конъюгатах Ν-концевой сегмент Αβ связан на своём Ν-конце с носителем-пептидом. Можно использовать такое же множество Ν-концевых сегментов Αβ, как и в случае С-концевого связывания. Некоторые конъюгаты содержат пептидный носитель, связанный с Ν-концом Ν-концевого сегмента Αβ, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительных Ν-концевых сегментов Αβ в тандеме (связанные последовательно). Предпочтительно, такие иммуногенные Αβ фрагменты, будучи связаны с подходящим носителем, индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на определённый Αβ фрагмент, не будучи направлен на другие фрагменты Αβ.
Иммуногенные пептиды по изобретению включают иммуногенные гетерологичные пептиды. В некоторых иммуногенных пептидах Αβ фрагмент связан с носителем с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Этот гетерологичный пептид связывается с носителем с применением способа по данному изобретению с образованием конъюгата. Некоторые из таких иммуногенных гетерологичных пептидов содержат фрагменты Αβ, связанные с эпитопами столбнячного токсоида, такими, как описанные в патенте США 5196512, Европейских патентах ЕР378881 и ЕР427347. Необязательно, иммуногенный пептид может быть связан с одной или множеством копий носителя, например, как по Ν, так и по Сконцу носителя, с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Другие такие иммуногенные гетерологичные пептиды содержат фрагменты Αβ, связанные с носителями-пептидами, описанными в патенте США 5736142. Например, иммуногенный гетерологичный пептид может содержать Αβ1-7, связанный с последующим Αβ1-3, связанный с последующим носителем. Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают
Αβ 1 -7/Столбнячный токсоид 830- 844 + 947-967 в линейной конфигурации
ΟΑΕΕΚΗϋ- φΥΙΚΑΝ8ΚΓΙ6ΙΤΕΕΓΝΝΓΤν3ΕλνΕΚνΡΚνδΑ3ΗΕΕ (8Еф ГО ΝΟ.:24)
Пептиды, описанные в патенте США 5736142 (все в линейной конфигурации):
ΡΑΟΚΕ/ΑβΙ-7:
ΑΚΧνΑΑ'Λ'ΤΙ.Κ А А А- ОАЕЕКНО (5Ер ГО ΝΟ.:26)
Αβ1-7 х 3/ΡΑϋΚΕ:
□ΑΕΕΚΗϋ- ΩΑΕΡΚΗΟ- ϋΑΕΡΡΗϋ- АКХУАА\¥ТЬКААА (5ЕС> ГО ΝΟ.:27)
- 14 009559
РА ОКЕ/ΑβΙ-7χ3:
АКХУАА'Л’ТЬКААЛ- ОАЕРКНО- ОАЕРКНО- ОАЕРКНО (ЗЕО Ю ΝΟ.-.28)
А₽1-7/ РАЕЖЕ:
ОЛЕЕКНО- АКХУААУПЪКААА (ЗЕО ГО ΝΟ.:29)
ΑβΙ-7/фрагмент альбумина:
ОАЕРКНО- КрАУНААНАЕП+ЕАСК (ЗЕО ГО ΝΟ.:30)
Αβ4- 10/ΑΗΓυνΤΥΝ РКМ,ЕУВУР:
РКНЭЗСУ- ΙδφΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕО ГО ΝΟ.:31)
Αβ3-9/ фрагмент альбумина:
ΕΡΚΗΟ3Ο- βφΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕО ГО ΝΟ.:32)
ΗΑ3ο7.3ΐΐ/Αβι-7 х 3:
РКУУКОИТЬКЬАТ- ОАЕРКНО- ϋΑΕΡΚΗϋ- ϋΑΕΡΚΗϋ (ЗЕО Ю ΝΟ.:33)
Ар|.7/НАзо7_з19/ Αβι_7:
ОЛЕЕКНО- ΡΚΥΥΚΟΝΤίΚΕΑΤ- ОАЕРКНО (ЗЕО ГО ΝΟ.:34)
Αβ|.7χ 3/НАзо7-з19:
ΟΑΕΡΚΗΏ- ΌΑΕΡΚΗϋ- ϋΑΕΡΚΗϋ- РКУУКОШЪКЬАТ (ЗЕО Ю ΝΟ.:35)
Αβ|-7 X 2/ΗΑ307. .319:
ϋΑΕΡΚΗϋ- ΟΑΕΡΚΗϋ- РКУУКОНТЬКБАТ (ЗЕО Ю ΝΟ.:36)
Λβι .7·'ΗА7ч7- 319/Малярии СЗ/ТТйо- Е44/ТТ447.777/ Αβ ι _7 ϋΑΕΡΚΗϋ- ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΧΑΤ- ЕКИАКМЕКАЗЗУРМУΟΥΙΚΑΝδΚΡΙΟΙΤΕΕ- ЕННГТУЗРАЛЬКУРКУЗАЗНЬЕ- ϋΑΒΡΚΗϋ (ЗЕО Ю
ΝΟ/.37)
Αβ|л X 3/ ТТязо-844/ТТ947-967 ϋΑΕΡΚΗϋ- ϋΑΕΡΚΗϋ- ϋΑΕΡΚΗϋ- 0ΥΙΚΑΝ3ΚΕΙΟ1ΊΈΕ- СΓΝΝΓΤνδΡΨΕ,ΚνρΚνδΑδΗΕΕ (8ЕО ГО ΝΟ.:38)
Αβ ι .?/ТГ8зи. 844/С/ГТ947.967 ϋΑΕΡΚΗϋ- 0ΥΙΚΑΝ3ΚΡΙ6ΙΤΕΙ.- С- ΡΝΝΓΤν8Γλ¥ΕΚνΡΚνδΑ8ΗΕΕ (8Е0 ГО
ΝΟ.:39)
Αβ | л/ТТвзо- 844/Ο/ΤΤ947.967/Αβ| .7 ϋΑΕΡΚΗϋ- ΟΥΙΚΑΝ8ΚΓΙΟΓΓΕΕ- С- ΡΝΝΡΤν8Ρ\νΕΚνΡΚУЗАЗНЬЕϋΑΕΡΚΗϋ (8Е<2 ГО ΝΟ. 20)
Некоторые иммуногенные гетерологичные пептиды содержат мультимер иммуногенных пептидов, представленных формулой 2х, в которой х обозначает целое число от 1 до 5. Предпочтительно, х обозначает 2, так что мультимер содержит 4 иммуногенных пептида, связанных в предпочтительной конфигурации, называемой ΜΑΡ4 (см. патент США 5229490). Такие иммуногенные пептиды затем связаны с носителем способом по настоящему изобретению с образованием конъюгата.
Конфигурация ΜΑΡ4 показана ниже, где разветвлённые структуры получают, инициируя пептидный синтез как по Ν-концевой аминогруппе, так и по аминогруппе боковой цепи лизина. В зависимости от того, сколько раз лизиновые остатки включаются в последовательность и имеют возможность разветвляться, в конечной структуре присутствуют множественные Ν-концы. В данном примере 4 идентич
- 15 009559 ных Ν-конца дают разветвлённое лизинсодержащее ядро. Такая мультиплетность значительно повышает отвечаемость родственных В клеток:
Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают
Αβ 1-7/Столбнячный токсоид 830- 844 в конфигурации МАР4:
ϋΑΕΕΚΗϋ- ζ)ΥΙΚΑΝ8ΚΕΊΟΙΤΕΙ. (5Е<2 ГО ΝΟ.:22)
Αβ 1-7/Столбнячный токсоид 947-967 в конфигурации МАР4:
ОАЕРКЕГО- ΕΝΝΕΤνί>Ρ\νΐ_ΚΛ'ΡΚν8Α8ΗΕΕ (5Еф Ш ЫО.:23)
Αβ З-9/Столбнячный токсоид 830- 844 в конфигурации МАР4:
ЕГКЕГО56- φΥΙΚΑΝδΚΓΙΟΠΈΕ (ЗЕС^ Ιϋ ΝΟ.:25)
ОАЕЕКЕГО- φΥΙΚΑΝ8ΚΡΙ6ΙΤΕΕ на 2х- разветвлённой смоле
Рерббе
Еуя-СНу-Суз
РерЦбе -Αβ-пептид, аналог, активный фрагмент или другой полипептид можно вводить в ассоциированной форме, или в форме мультимера, или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры или мономерные иммуногенные агенты. Агенты, отличные от Αβ-пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов Αβ (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7) и могут также конъюгироваться с носителем способом по настоящему изобретению. Предпочтительно, такие агенты, конъюгированные с подходящим носителем, индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на один из этих фрагментов, не будучи направлен на другие фрагменты Αβ. Для того чтобы облегчить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, к концам антигенных детерминант могут быть добавлены дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или Ν-конце пептидного иммуногена. Кроме того, можно также ввести пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо этого, антигенные детерминанты могут отличаться от природной последовательности, будучи модифицированы ацилированием концевой ХН2-группы. например, алканоил- или тиогликолил- ацилированием (ацилирование алкановыми (С1-С20) кислотами или тиогликолевой кислотой), амидированием по карбокси-концу, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых примерах эти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой.
Пептидные иммуногены, используемые для получения конъюгатов по настоящему изобретению способом по данному описанию, можно объединять связыванием с образованием полимеров (мультимеров), или из них можно готовить композиции без связывания, в виде смеси. Если пептид связан с идентичным пептидом, тем самым образуя гомополимер, то присутствует множество повторяющихся эпитопных единиц. Например, метод множественных антигенных пептидов (МАП, ΜΑΡ) применяют для конструирования полимеров, содержащих как СТЬ эпитоп, так и/или пептиды антител и пептиды. СТЬ эпитоп представляет собой эпитоп, образованный из выбранных эпитопных областей потенциальных целевых антигенов. Когда пептиды различаются, например смесь, представляющая различные вирусные субтипы, различные эпитопы внутри субтипа, различные специфичности рестрикции ГКГ (ΗΚΑ) или пептиды, которые содержат Т-хелперные эпитопы, получают гетерополимеры с повторяющимися единицами. Помимо ковалентного связывания, также рассматривается нековалентное связывание, при котором могут образоваться межмолекулярные и внутриструктурные связи.
Такие пептидные иммуногены и их аналоги синтезируют твердофазным пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией, или получают из природных источников. Автоматические пептидные синтезаторы можно получить от многих поставщиков, таких как Αρρίίβά Вю8у81етв, Роз1ег СИу, СаШотша.
Рекомбинантная экспрессия может осуществляться в бактериальных клетках (таких как Е. сой), клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны в ЗатЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬота1огу Мапиа1 (Со1б 8рппд НагЬог Ргезз, ΝΥ, 2пб еб., 1989). Некоторые иммуногенные пептиды также выпускаются промышленно (например, ΑιικγΚηι'ι Рерббе Сотрапу, 1пс., 8иппууа1е, СΑ, и СаШогша Рерббе ВезеагсЬ, 1пс., №ра, СΑ).
- 16 009559
Можно также провести скрининг библиотек случайный пептидов или других соединений на пригодность их в качестве пептидных иммуногенов. Комбинаторные библиотека можно получать для многих типов соединений, которые можно синтезировать постадийно. Такие соединения включают полипептиды, миметики бета-поворотов, гормоны, олигомерные Ν-замещённые глицины и олигокарбаматы и т.п. Большие комбинаторные библиотеки соединений можно создавать методом кодированных синтетических библиотек (Е8Ь), описанным в международных заявках \¥О 95/12608, \УО 93/06121, \УО 94/08051, \νϋ 95/35503 и \УО 95/30642. Пептидные библиотеки можно также получать методами фагового дисплея (см., например, Όβνΐίπ, ^№О 91/18980).
Дериватизация и конъюгация иммуногенного пептида с белком-носителем.
Сайт соединения пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем и природа сшивающего агента, который используется для связывания пептидного иммуногена с носителем, являются важными для специфичности полученного в результате антитела против него. Для корректного узнавания пептидный иммуноген должен быть связан с носителем в соответствующей ориентации. Для того чтобы антитело узнало затем свободные пептидные иммуногены без носителя, конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель должен презентировать пептидные иммуногены в экспонированной и доступной форме. Оптимальная ориентация часто достигается при направлении реакции сшивания на специфические сайты на пептидных иммуногенах. Один способ для пептидного иммуногена достигнуть этого заключается в связывании конечного цистеинового остатка в процессе пептидного синтеза. Это создаёт на одном конце пептида сульфгидрильную группу для конъюгации с носителем. Сшивание (перекрёстное связывание) с использованием этой группы обеспечивает присоединение пептидного иммуногена только на одном конце, тем самым гарантируя постоянную ориентацию.
При конъюгации пептидный иммуноген-носитель целью является не сохранение исходного (нативного) состояния устойчивости носителя, но презентация гаптена наилучшим образом, возможным для иммунной системы. При достижении этой цели выбор химического метода конъюгации может регулировать полученный титр и специфичность антител, полученных против гаптена. В некоторых случаях может быть важно выбрать сшивающий агент, содержащий спейсерную ножку, достаточно длинную для презентации антигена в нерестриктированной форме. Также может быть важно контролировать плотность пептидного иммуногена на поверхности носителя. Слишком маленькая замена в пептидном иммуногене может привести к малому ответу или к отсутствию ответа. Слишком высокая плотность пептидного иммуногена в действительности может вызвать иммунологическую супрессию и снижение ответа. Это необходимо принимать во внимание при выборе не только подходящих сшивающих реагентов, но также соответствующих соотношений белкового/полипептидного носителя и пептидного иммуногена.
Возможны различные способы связывания беловых/пептидных носителей с пептидными иммуногенами. Ионные взаимодействия возможны по концевым группам или по ε-аминогруппе лизина. Также возможно образование водородной связи между боковыми группами остатков и пептидным иммуногеном. Наконец, конформационные взаимодействия между белковыми/пептидными носителями и иммуногенным пептидом могут привести к стабильному связыванию.
Конъюгаты пептидные иммуногены-носитель успешно получают, используя различные сшивающие агенты, такие как нулевой длины, гомобифункциональные или гетеробифункциональные кросслинкеры. Наименьшие доступные реагирующие системы для биоконъюгации представляют собой так называемые кросслинкеры нулевой длины. Эти соединения опосредуют конъюгацию двух молекул, образующих связь, не содержащую дополнительных атомов. Таким образом, один атом молекулы является спейсером. Во многих схемах конъюгации конечный комплекс связывается вместе с помощью химических компонентов, которые при сшивании вносят чужеродные структуры в вещества. В некоторых применениях присутствие этих промежуточных линкеров может быть вредным для предполагаемого применения. Например, при приготовлении конъюгатов пептидный иммуноген-носитель получают комплекс с намерением генерировать иммунный ответ на присоединённый гаптен. Иногда (случайно) участок антител, продуцированных этим ответом, может иметь специфичность к сшивающему агенту (кросслинкеру), применяемому при конъюгации. Сшивающие агенты (крос-линкеры) нулевой длины исключают возможность такого типа кросс-реактивности, опосредуя непосредственное связывание двух веществ.
Гомобифункциональные реагенты, которые были первыми сшивающими (перекрёстно связывающими) реагентами, применяемыми для модификации и конъюгации макромолекул, состояли из биреактивных соединений, содержащих по обоим концам одну и ту же функциональную группу (НаПшап апб νο16, 1966). Эти реагенты могут связывать один белок с другим, связываясь ковалентной связью с одинаковыми общими группами в обеих молекулах. Так, ε-аминогруппы лизина или Ν-концевые аминогруппы одного белка могут сшиваться (перекрёстно связываться) с теми же самыми функциональными группами на втором белке просто при их смешении в присутствии гомобифункционального реагента.
Гетеробифункциональные реагенты для конъюгации содержат две различных реакционноспособных (реактивных) группы, которые могут связываться с двумя различными функциональными мишенями на белках и других макромолекулах. Например, один участок кросслинкера может содержать аминореактивную группу, тогда как другой участок может состоять из сульфгидрилреактивной группы. Ре
- 17 009559 зультатом является способность направлять реакцию сшивания на выбранные участки целевых молекул, тем самым лучше осуществляется контроль над процессом конъюгации.
Гетеробифункциональные реагенты используют для сшивания (перекрёстного связывания) белков и других молекул в двух- или трёхстадийном процессе, который ограничивает степень полимеризации, часто достигаемой при использовании гомобифункциональных кросслинкеров.
В настоящее время имеется множество методов связывания пептидных иммуногенов с белковыми/полипептидными носителями с помощью кросслинкеров нулевой длины, гомобифункциональных или гетеробифункциональных кросслинкеров. С помощью большинства методов создают аминные, амидные, уретановые, тиоизомочевино или дисульфидные связи, или, в некоторых случаях, тиоофирные связи. В более общем методе связывания белков используются бифункциональные сшивающие реагенты. Они представляют собой малые спейсерные молекулы, содержащие на конце активные группы. Спейсерные молекулы могут иметь идентичные или различные активные группы на каждом конце. Наиболее обычные активные функциональности, связывающие группы и образующиеся связи представлены ниже:
1. Альдегид - амино вторичный амин
2. Малеимидо - сульфгидрил (тиоофир
3. Сукцинимидо - амино (амин
4. Имидат (иминоофир) - амино (-амид
5. Фенилазиды - амино (фениламин
6. Ацилгалогенид - сульфгидрил (тиоофир
7. Пиридилсульфиды - сульфгидрил (дисульфид
8. Изотиоцианат - амино (изотиомочевина
Реактивность данного белка-носителя, с точки зрения его способности модифицироваться сшивающим агентом таким образом, чтобы конъюгироваться с пептидным иммуногеном, определяется аминокислотным составом и последовательной локализацией отдельных аминокислот в трёхмерной структуре молекулы, а также составом аминокислотным составом пептидного иммуногена.
Для линкеров (Ь) между белковыми/пептидными носителями и другими пептидами (например между белковыми/пептидными носителями и пептидным иммуногеном) спейсеры обычно выбирают из Αία, О1у или других нейтральных спейсеров из неполярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. В некоторых вариантах изобретения нейтральный спейсер представляет собой Αία. Следует понимать, что возможно присутствующий спейсер не обязательно состоит из одинаковых остатков и, следовательно, может быть гетеро- или гомоолигомером. Типичные спейсеры включают гомоолигомеры Αία. В случае присутствия спейсера он обычно состоит по меньшей мере из двух остатков, более обычно из трёх-шести остатков. В других вариантах изобретения белковый/полипептидный носитель конъюгируется с пептидным иммуногеном, предпочтительно с белковым/пептидным носителем, позиционированным на аминоконце. Пептид может соединяться нейтральным линкером, таким как Α1α-Α1α-Α1α или подобным ему, и предпочтительно содержать липидный остаток, такой как остаток пальмитиновой кислоты или т.п., который связан с α- или ε-аминогруппами Ьу§ остатка ((ΡΑΜ)2^у8), связанного с аминоконцом пептидного конъюгата, как правило, 8ег-8ег связью или т.п.
В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Αβ1-5-Ε, Αβ1-7-Ε, Αβ1-9-Ε и Αβ1-12-Ε. В некоторых аспектах изобретения линкер представляет собой ΟΑΟΑ (8ЕЦ ΙΌ N0: 10).
Для того чтобы упростить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, можно по концам антигенных детерминант добавить дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или Ν-конце пептидного иммуногена. Кроме того, можно также вводить пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо отого, антигенные детерминанты могут отличаться природной последовательности модификацией концевой NΗ2-группы ацилированием, например ацилированием с помощью (С1-С20)алкановой или тиогликолевой кислот, амидированием по карбокси концу, например аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых примерах оти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой.
В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Αβ 1-5-0 Αβ 1-7-0 Αβ1-9-ί.’ и Αβ1-12-Ο В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из ΑβΤ-5-Ь-С, ΑβΤ-7-Ь-С, ΑβΤ-9-Ь-С и Αβ1-12-Ε-Ο
Пептидный иммуноген связан с белковым/пептидным носителем либо непосредственно, либо через линкер либо по амино- или по карбоксиконцу пептидного иммуногена. Аминоконец либо пептидного иммуногена, либо белкового/пептидного носителя может быть ацилированным. Кроме того, конъюгат пептидный иммуногенбелковый/пептидный носитель может быть связан с алканоил(С1-С20)липидами через один или более связывающих остатков, таких как 01у, 01у- 01у, 8ег, 8ег-8ег, как описано ниже.
- 18 009559
Другие применяемые липиды включают холестерин, жирные кислоты и т.п.
Пептидные иммуногены могут связываться с носителем химическим сшиванием. Методы связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с помощью М-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (8ΡΌΡ) (Саг188ощ 1. е! а1. ВюсНет. 1., 1978, 173: 723) и сукцинимидил 4-(М-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС) (если пептид не содержит сульфгидрильную группу, её можно создать добавлением цистеинового остатка к гаптену). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между ними и пептидным цистеином, расположенным на одном белке, и амидную связь за счёт ε-аминогруппы лизина или другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Различные такие дисульфид/амидобразующие агенты описаны в 1ттипе Κ^ν. 62: 85 (1982). Другие бифункциональные связывающие агенты образуют скорее тиоэфирную, нежели дисульфидную связь. Агенты, образующие тиоэфир, включают реакционноспособный эфир 6-малеинимидкапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-(Ы-малеинимидометил)циклогексан-1карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активировать, объединяя их с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты.
Лизиновые остатки являются наиболее распространёнными аминокислотными остатками, и чаще всего эти остатки модифицируют с помощью сшивающих реагентов для получения нуклеофильных сайтов, которые затем связывают с гаптеном. Это соединение проводят за счёт любой химически активной гидрофильной боковой цепи на молекулах гаптена. Такие химические активные боковые группы включают гуанидильную группу аргинина, карбоксильные группы глутамата и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильную группу цистеина и ε-аминогруппу лизина, ещё некоторые. Модификацию белка таким образом, чтобы они в конечном счёте могли связываться с другими частицами, проводят, сшивая реагенты, которые реагируют с любой из боковых цепей молекул белка-носителя или гаптена.
В одном аспекте настоящего изобретения белок-носитель с молекулой линкера или без неё функционализируют (или дериватизируют) реагентом, который вводит реактивные сайты в молекулу белканосителя, способные к дальнейшей модификации с введением нуклеофильных групп. В одном варианте изобретения носитель реагирует с галогенацетилирующим реагентом, который предпочтительно реагирует с рядом функциональных групп на аминокислотных остатках белков, такими как сульфгидрильная группа цистеина, первичная ε-аминогруппа лизинового остатка, а конец α-аминов, тиоэфир метионина и оба азота имидазолильной боковой цепи гистидина (Сигб, 1967). В предпочтительном варианте изобретения первичные ε-аминогруппы лизиновых остатков белка-носителя дериватизируют с помощью Ν-гидроксисукцинимидилбромацетата с целью получения бромацетилированного носителя. Конъюгирование пептидного иммуногена и активированного белка-носителя проводят, медленно добавляя активированный носитель к раствору, содержащему пептидный иммуноген.
Применяя способ по данному изобретению, можно конъюгировать пептидные иммуногены, обсуждавшиеся в разделе В, с любыми носителями, обсуждавшимися в разделе А. Конъюгаты, получающиеся по способу по данному изобретению, используются в качестве иммуногенов для получения антител против Αβ с целью применения их в пассивной/активной иммунотерапии. Кроме того, Ав или Αβ фрагмент, связанный с носителем, можно вводить лабораторным животным при получении моноклональных антител к Αβ.
В аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из следующих групп, состоящих из:
Ав1-7-СВМ197, (Ав1-7х3)-СВМ197 и (Ав1-7х5)-СВМ197;
СВМ197-Ав1-5, СВМ197-Ав1-7, СВМ197-Ав1-9 и СВМ197-Ав1-12;
Ав1-5-С-СВМ197, Ав1-7-С-СВМ197, Ав1-9-С-СВМ197 и Ав1-12-С-СВМ197, Ав16-23-С-СВМ197, Ав17-24-С-СВМ197, Ав18-25-С-СВМ197, СВМ197-С-Ав16-23, СВМ197-С-Ав17-24, СВМ197-С-Ав18-25, Ав16-22-С-СВМ197, Ав17-23-С-СВМ197, Ав18-24-С-СВМ197, СВМ197-С-Ав16-22, СВМ197-С-Ав17-23 и СВМ197-С-Ав18-24. Ав1-9-С-СВМ197 и Ав1-12-С-СВМ197;
Ав1-5-Ь-С-СВМ197, Ав1-7-Ь-С-СВМ197, Ав1-9-Ь-С-СВМ197 и Ав1-12-Ь-С-СВМ197.
Кэпирование.
Недостатком применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты в боковые цепи реактивных молекул аминокислот на молекулах носителя и/или молекулах гаптенов, заключается в том, что реактивные сайты, если они не нейтрализованы, могут реагировать с любой нежелательной молекулой либо ίη νίΡΌ, либо ίη νί\Ό. В способе по настоящему изобретению кэпирование непрореагировавших функциональных групп осуществляют реакцией конъюгатов с боковыми реактивными группами с реагентами, которые инактивируют/кэпируют реактивные группы. Типичные инактивирующие/кэпирующие реагенты для применения со способом конъюгации по настоящему изобретению включают цистеамин, Ν-ацетилцистеамин и этаноламин. Или же кэпирование осуществляют реакцией с аммиаком или бикарбонатом аммония, каждый из которых переводит галогенацетильные группы в аминоацетильные группы. Кэпирование также выполняют в щелочной среде (рН 9,0-9,8) с применением гидроксида натрия или карбоната натрия, в результате чего галогенацетильные группы гидролизуются до гидроксиацетильных групп. Одним потенциальным преимуществом превращения галогенацетиль
- 19 009559 ных групп в аминоацетильные или гидроксиацетильные группы, в отличие от реакции с производными цистеамина, этаноламина и т.д., является введение по реакции с аммиаком или гидроксидом/карбонатом химических функциональностей (функциональных групп) сравнительно меньшего размера. Полученные в результате кэпированные функциональные группы, например аминоацетильная или гидроксиацетильная, вызывают значительно меньшие нарушения на участке белка-носителя конъюгата. Кэпированный конъюгат пептидный иммуноген-белок-носитель при необходимости очищают известными методами, такими как хроматография (гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобное взаимодействие или аффинная), диализ, ультрафильтрация-диафильтрация, селективная преципитация с применением сульфата аммония или спирта и т. п.
Иммуногенные конъюгаты и композиции.
Кэпированные конъюгаты пептидный иммуноген-белок-носитель вводят в виде иммуногенных композиций млекопитающим, в частности людям, в профилактических и/или терапевтических целях. Конъюгаты по настоящему изобретению применяются для выявления и/или повышения иммунного ответа против иммуногенов. Например, конъюгаты СТЬ-носитель применяют для лечения и/или предупреждения вирусной инфекции, амилоидогенных заболеваний, рака и т.д. Или используют также конъюгаты полипептидный иммуноген-носитель, которые индуцируют антительный ответ.
При терапевтическом применении конъюгат по настоящему изобретению вводят индивидууму, уже страдающему амилоидогенным заболеванием, таким как болезнь Альцгеймера. Больным в инкубационном периоде или в острой фазе заболевания можно вводить конъюгат по настоящему изобретению отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, в зависимости от ситуации.
При терапевтическом применении иммуногенную композицию по настоящему изобретению вводят пациенту в количестве, достаточном для выявления (выработки) эффективного СТЬ (Т-клеточного) ответа или гуморального ответа на амилоидную бляшку и для лечения или, по меньшей мере, частичного прекращения прогрессирования заболевания, симптомов и/или осложнений. Количество, достаточное для достижения такого результата, определяется как терапевтически эффективная доза. Эффективное для этого количество частично зависит от пептидной композиции, способа введения, стадии и тяжести подвергаемого лечению заболевания, веса и общего состояния здоровья пациента, суждения лечащего врача.
Терапевтически эффективные количества иммуногенных композиций по настоящему изобретению для начальной иммунизации с целью терапии или профилактики обычно находятся в пределах примерно от 1 до примерно 10000 мкг пептида для пациента весом 70 кг, обычно около 0,1-8000 мкг, предпочтительно около 0,1-5000 мкг и наиболее предпочтительно около 0,1-1000 мкг. После этих доз следуют бустерные дозы около 0,1-1000 мкг пептида по схеме повторной иммунизации в течение от недель до месяцев в зависимости от реакции пациента и состояния, определяемых специфическим иммунным ответом.
Помимо этого, настоящее изобретение применяется в целях профилактики для предупреждения и/или уменьшения интенсивности амилоидогенного заболевания. Эффективные количества описаны выше. Кроме того, специалист в данной области техники также знает, как корректировать или модифицировать профилактическое лечение в зависимости от ситуации, например, повторной иммунизацией и корректируя дозы и схемы лечения.
Терапевтическое лечение можно начинать при первых признаках заболевания. После этого следуют бустерные дозы до прекращения прогрессирования или до реверсирования заболевания, или до заметного ослабления симптомов и в последующий период.
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению для терапевтического или профилактического лечения можно вводить парентеральным, топическим, внутривенным, оральным, подкожным, внутриартериальным, интракраниальным, интраперитонеальным, интраназальным или внутримышечным способом для профилактического и/или терапевтического лечения. Типичным способом введения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы одинаково эффективны. Другим обычным способом является внутримышечная инъекция. Этот вид инъекции обычно осуществляют в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулированы отложения, например интракраниальная (внутричерепная) инъекция. Внутримышечная инъекция предпочтительна для введения антитела. В некоторых способах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в череп. Из-за простоты введения иммуногенные композиции по изобретению особенно пригодны для орального применения. Кроме того, изобретение включает иммуногенные композиции для парентерального применения, которые содержат раствор пептидов или конъюгатов, растворенных или суспендированных в приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе.
Можно применять различные разбавители, эксципиенты и буферы, например воду, забуференную воду, фосфатный буфер, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции можно стерилизовать обычными общеизвестными методами стерилизации или можно стерильно фильтровать. Полученные водные растворы можно упаковывать для применения как есть или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат объединяют со стерильным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требующиеся для приближения к
- 20 009559 физиологическим условиям, такие как буферизующие агенты, агенты, корректирующие тонус, увлажнители и т.п., например ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитан монолаурат. триэтаноламина олеат и т.д.
Для твёрдых композиций можно использовать обычные нетоксические твёрдые носители. Эти носители могут включать, например, манит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрий, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.д. - все фармацевтической степени чистоты. Для орального применения фармацевтически приемлемую нетоксическую композицию готовят, включая любые обычные эксципиенты, такие как вышеперечисленные носители, и обычно 10-95% активного ингредиента, т.е. одного или более конъюгатов по изобретению, и более предпочтительно в концентрации 25-75%.
Концентрация иммуногенных композиций по настоящему изобретению в фармацевтических препаратах может варьироваться в широких пределах, т.е. обычно от менее чем 0,1 вес.% или по меньшей мере от около 2 до 20-50 вес.%, и выбирается прежде всего по объёму, вязкости жидкостей и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Конъюгаты по настоящему изобретению можно также вводить в липосомах, которые служат для нацеливания конъюгатов на конкретную ткань, такую как лимфоидная ткань, или нацелены селективно на инфицированные клетки, а также служат для повышения периода полужизни пептидной композиции. Липосомы включают эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, дисперсии фосфолипидов, ламеллярные слои и т.п. В этих препаратах доставляемую композицию включают как часть липосомы, индивидуально или в сочетании с молекулой, которая связывается, например, с рецептором, преобладающим среди лимфоидных клеток. Эти молекулы включают моноклональные антитела, которые связываются с ΟΌ45 антигеном или с другими терапевтическими или иммуногенными композициями. Так, липосомы, заполненные заданной композицией по настоящему изобретению, можно направить на сайт лимфоидных клеток, куда липосомы затем доставляют выбранные терапевтические/иммуногенные пептидные композиции. Липосомы для применения по изобретению готовят из липидов, образующих стандартные везикулы, эти липиды обычно включают нейтральные или отрицательно заряженные фосфолипиды и стерин(ол), такой как холестерин. При отборе липидов обычно руководствуются соображениями о размере частиц, лабильности или устойчивости липосом к кислоте в кровотоке. Известны различные способы получения липосом, описанные, например, в 8хока, е1 а1., Апп. Рсу. Вюрйук. Вюепд. 1980, 9: 467, патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
Для введения в виде аэрозолей композиции по настоящему изобретению применяют, предпочтительно, в тонко измельчённом виде вместе с поверхностно-активным веществом и газом-вытеснителем. Обычно процентное содержание композиции составляет 0,01-20 вес.%, предпочтительно 1-10 вес.%. Естественно, поверхностно-активное вещество должно быть нетоксическим и, предпочтительно, растворимым в газе-вытеснителе. Типичными такими агентами являются эфиры или частичные эфиры жирных кислот, содержащих 6-22 углеродных атома, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая и олеиновая кислоты, и алифатического многоатомного спирта, или их циклического дегидратированного производного. Можно применять смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-20 вес.% от веса композиции, предпочтительно 0,25-5 вес.%. Остальное содержимое композиции обычно составляет газ-вытеснитель. При необходимости можно также включать носитель, такой как лецитин для интраназальной доставки.
Конъюгаты по настоящему изобретению можно, необязательно, применять в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны для лечения и/или облегчения амилоидного заболевания и/или его симптомов. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых амилоидные отложения наблюдаются в мозге, конъюгаты по изобретению можно применять в сочетании с другими агентами, которые повышают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер.
Иммуногенная композиция обычно содержит адъювант. Адъювант представляет собой вещество, которое повышает иммунный ответ при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Показано, что ряд цитокинов или лимфокинов обладают иммуномодулирующей активностью и, следовательно, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, но без ограничения, интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, патент США 5723127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и мутантные формы), интерфероны-α, β и γ, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (см., например, патент США 5078996), макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, С8Р и фактор некроза опухолей α и β. Другие адъюванты, применимые по данному изобретению, включают хемокин, в том числе, без ограничения МСР-1, ΜΙΡ-α, ΜΙΡ-β и ΒΑΝΤΕ8. Адгезивные молекулы, такие как селектин, например Ь-селектин, Р-селектин и Е-селектин, также могут применяться в качестве адъювантов. Другие применяемые адъюванты включают, без ограничения, муциноподобную молекулу, например СЭ34, С1уСАМ-1 и МабСАМ-1, представитель семейства интегринов, такой как ЬРА-1, УЪА-1, Мас-1 и р150,95, член суперсемейства иммуноглобулинов, такой как РЕСАМ,
- 21 009559
ΙΟΆΜ, например ΚΑΜ-1, Κ'.ΆΜ-2 и ^ΑΜ-3, СЭ2 и ΕΡΑ-3, молекулы костимуляторов, такие как СЭ40 и 0’0400 факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервной ткани, фактор роста фибробластов, опидермальный фактор роста, В7.2, ΡΌΟΡ, ВБ-1 и ондотелиальный фактор роста сосудов, рецепторные молекулы, включая Рак, ΤΝΡ рецептор, Е11, Αρο-1, р55, №8Б-1, ΤΚΑΜΡ, Аро-3, ΑΙΡ, ΕΑΒΌ, ΝΟΒΡ, ΌΚ4, ΌΚ.5, КШЕ-ЕВ, ΤΚΑΙΕ-Κ2, ТВ1СК2 и ΌΚ.6. Другая молекула адъюванта включает каспазу (1СЕ). См. также международные заявки №0 98/17799 и №0 99/43839.
Подходящие адъюванты, применяемые для повышения иммунного ответа, включают, без ограничения, МРБ™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид А); (Сопха, НатШоп, МТ), который описан в патенте США 49120914. Также пригодны для применения в качестве адъювантов аналоги синтетического липида А или аминоалкил глюкозамин фосфаты (ΑΟΡ) или их производные или аналоги, поставляемые Сопха (НатШоп, МТ) и описанные в патенте США 6113918. Один такой ΑΟΡ представляет собой 2-[(В)-3-тетрадеканоилокси-тетрадеканоиламино]отил 2-дезокси-4-О-фосфоно-3-0-[(8)-3тетрадеканоилокси-тетрадеканоил] -2-[(В)-3-тетрадеканоилокси-тетрадеканоил-амино ]-Ь-0глюкопиранозид, который известен как 529 (также известный как ВС529; Сопха). Этот адъювант 529 готовят в виде водного раствора (529 ΑΡ) или в виде стабильной омульсии.
Другие адъюванты включают омульсии в минеральном масле и в воде, соли кальция, такие как фосфат кальция, соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и т.д., амфиген, авридин, Е121/сквален, Ό-лактид-полилактид/гликозид, поверхностно- активные кислоты, полиолы, мурамил-дипептид, убитая бацилла Вогбе!е11а, сапонины, такие как стимулон (8бти1оп™ 08-21, Αηйдешск, Ргаттдйат, ΜΑ), описанный в патенте США 5057540, и полученные из него частицы, такие как искомы (18СОМ8, иммуностимулирующие комплексы), МусоЬас!егшт !иЬегси1о515, бактериальные липополисахариды, синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив СрО (патент США 6207646), коклюшный токсин (РТ) или Е. со11 термолабильный токсин (БТ), в частности ΕΤ-Κ63, ЕТ-В72, РТ-К9/О129; см., например, международные заявки №0 93/13302 и №0 92/19265.
Также применимы в качестве адъювантов токсины холеры и их мутанты, включая описанные в международной заявке №0 00/18434, в которых глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена другой аминокислотой, отличной от аспарагиновой кислоты, предпочтительно, гистидином. Аналогичные СТ токсины или мутанты описаны в международной заявке №0 02/098368 (в них изолейцин в аминокислотном положении 16 заменён на другую аминокислоту либо индивидуально, либо в сочетании с заменой серина в аминокислотном положении 68 на другую аминокислоту; и/или в них валин в аминокислотном положении 72 заменён на другую аминокислоту). Другие СТ токсины описаны в международной заявке №0 02/098369 (в них аргинин в аминокислотном положении 25 заменён другой аминокислотой; и/или аминокислота встроена (инсерция) в аминокислотное положение 49; и/или вводятся (инсерция) две аминокислоты в аминокислотные положения 35 и 36).
Следует понимать, что ссылка в данном описании на любую теорию для объяснения описанных результатов не ограничивает объём изобретения. Независимо от способа по изобретению результатов и преимуществ по данному описанию можно достичь со ссылкой на нижеприведённые примеры изобретения.
Для рядового специалиста в данной области техники очевидно, что можно сделать многие модификации, не отходя от сущности или объёма прилагаемой формулы изобретения. Все публикации и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, вводятся ссылкой во всей полноте для любых целей в той степени, как если бы в отношении каждой отдельной публикации, каждого отдельного патента или каждой отдельной патентной заявки конкретно и отдельно указано, что он или она вводится ссылкой.
Пример 1. Конъюгация СРМ19- с Αβ-пептидом.
Конъюгацию гаптенов/антигенных пептидов проводят реакцией активированного носителя СРМ197, содержащего 39 остатков лизина, с гаптен/антигенным пептидом, содержащим тиольную группу в боковой цепи, описанными ниже методами (фиг. 1). Все Αβ-пептиды содержат цистеиновый остаток на карбоксиконце для того, чтобы упростить конъюгацию отих пептидов за счёт сульфгидрильной группы цистеина с белком-носителем. Эти пептиды получают твердофазным синтезом.
Ι. Активация.
Свободные аминогруппы СРМ19- бромацетилируют избытком офира Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (8щта Сйетюа1 Со., 8ΐ. Бошк, М0) (Вегпа1о\\'1сх апб Ма!киеба, 1986). К охлаждаемому льдом раствору СРМ19- (~15 мг) прибавляют 10% (об./об.) 1,0 М NаНСОз (рН 8,4). Эфир Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты в количестве, равном по весу количеству СВМ197, растворяют в 200 мл диметилформамида (ДМФА), медленно прибавляют к СВМ197 и осторожно перемешивают при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, пропуская через обессоливающую колонку (Ρ6-Ό0), используя в качестве олюента ΡΒ8/1 мМ ΕΌΤΑ (рН 7,0). После очистки фракции, соответствующие активированному СВМ197, собирают и концентрацию белка определяют ВСА анализом. Аминогруппы белка как до, так и после обработки офиром Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты, реагируют с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒ8Α), которая служат индикатором бромацетилирова
- 22 009559 ния (Меаик с1 а1., 1972).
II. Конъюгация.
Перед конъюгацией пептиды реагируют с 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) [реагент Эльмана] для проверки содержания свободных -ЗН-групп (около 62-88% восстановленных). Для первых четырёх Αβ-пептидов (аминокислоты 1-7 без линкера, аминокислоты 1-12 с САСА (8ЕО ГО: 10) линкером, аминокислоты 1-9 с 6А6А (8Εζ) ГО: 10) линкером и аминокислоты 1-7 с САСА (8Εζ) ГО: 10) линкером) около 8-10 мг пептида растворяют в стерильной дистиллированной воде до примерной концентрации 20 мг/мл. Пептид медленно добавляют к холодному активированному СК.М19- в отношении 1:1 (вес./вес.) и рН доводят примерно до 7,0-7,2, добавляя 20-36 мкл ΙΝ ΝηΟΗ. Полученный материал осторожно перемешивают в течение ночи при 4°С в темноте с последующим диализом в темноте против двух 1 л смен РВ8, рН 7,2. Для следующих четырёх Αβ-пептидов (аминокислоты 1-5 без линкера, аминокислоты 1-9 без линкера, аминокислоты 1-12 без линкера и аминокислоты 1-5 без линкера) используют регент Эльмана для проверки свободных -8Н-групп. СК.М19- бромацетилируют, очищают и проводят реакцию с ΤΝΒ8Α, как описано ранее. рН каждого пептида доводят до 7,0, добавляя 0,1 М МаНРО4 (рН 8,5) в 2,2х объёме растворённого пептида. Пептид медленно добавляют к холодному активированному СВМ19- в отношении 1:1 и реакцию оставляют на ночь при 4°С в темноте. Полученный материал подвергают диализу. Конечный контрольный пептид (1-12 мер в обратной ориентации) конъюгируют с СВМ19-. как описано выше с последующей модификацией. Предпочтительнее довести рН активированного СВМ19- примерно до 7,5, добавляя 20% (об./об.) 0,5 М МаНРО4 (рН 8,0), чем корректировать рН пептида до 7,0. Каждый конъюгат после диализа переносят в стерильную пробирку на 15 мл из полипропилена, закрывают алюминиевой фольгой и хранят при 4°С. Затем методом масс-спектрометрии последовательно проверяют активацию реактивных аминокислотных остатков на носителе.
Конъюгат
Иммуногенный пептид
А|в 1-5-С-СКМ1я ϋΑΕΕΚ-С (8Е<Э. Ю. ΝΟ.:1)
Α,βΙ-7-С-СКМ^
ОАЕРКНП-С (8Е0. Ю ΝΟ.:2)
А/31-9-С-СКМ1ЭТ
ЦАЕИКНО8О-С (8Е<2 ГО N0:3)
А^1-12-С-СВМ1я
РАБИИП)5ОУВУ-С (8Е<} ГО N0:4)
Ар1-5-Ъ-С-екМ1й
ЦАЕЖ-САОА-С (8Ε<2 ГОЖ>.:5)
Αβ 1-7-Ь-С-СКМ157
ОАЕЕКНО-ОАСА-С (8ЕО ГО ΝΟ.:6)
АЩ-9-Ц-С-СЖМ1И
ЦАЕЕКНО8О-ОАСАС (8ЕС? ГО ΝΟ.:7)
АЩ-12-Ь-С-СКМ1эт
ЦАЕИШОЗОУЕУ-ОАОА-С (8Е<3 ГО
ΝΟ.:8)
АВ12-1-С-СКМ1Я (-УВ СОКПЮЬ)
УЕУСЗЦНКРЕАО-С (8Е0 ГО ΝΟ.: 9)
Ь= линкер (САСА) (5Е(? ГО: 10)
Пример 2. Получение конъюгата Αβ-πεπτΗη-ΟΚΜ^γ и очистка ультрафильтрацией.
Бромацетилирование СКМ197.
СКМ197 (100 мг) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, 0,9% №1С1. рН 7,0, в атмосфере аргона реагирует с эфиром Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (растворённым в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл) в весовом отношении 1:1. Реакционную смесь титруют, так как необходимо поддерживать рН 7,0. Смесь перемешивают в темноте в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы ИЕГОЕ (Μίΐΐίροτε ЬаЬзсак ТЕЕ, ВШепса, МА). Очистку проводят на мембране ЮК или ЗОК диафильтрацией (30-кратной) против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% №1С1. рН 7,0. Бромацетилированный СРМ|9- фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Степень бромацетилирования определяют реакцией активированного СКМ197 с цистеином с последующим аминокислотным анализом и количественным определением полученного карбоксиметилцистеина (СМС).
Конъюгация Αβ-пептида и бромацетилированного СКМ197 и кэпирование Ν-ацетилцистеамином.
Бромацетилированный СКМ197 (50 мг) переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8°С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения рН 9,0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида Αβ и растворяют в воде для инъекций (λΥΕΙ, В ДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до рН 9,0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного СВМ| 9и смесь перемешивают при 2-8°С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы кэпируют 20-кратным молярным избытком Ν-ацетилцистеамина в течение 3-6 ч при 2-8°С.
-23 009559
Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы ЬР/ЬР (М1Шроге ХЬ) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10К или 30К МАС0 (М1Шроге) против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% №С1, рН 7,0. Ретентат собирают, фильтруют и анализируют через фильтр 0,2 мкм и на содержание белка (колориметрический анализ Ьо^гу или М1сго-ВСА) методом 8О8-РАСЕ, аминокислотным анализом и на иммуногенность на мышах.
Пример 3. Превращение непрореагировавших бромацетильных групп в аминоацетильные группы с помощью кэпирования.
Бромацетилированный СКМ19- (50 мг), полученный как описано в примере 2, переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8°С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения рН 9,0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида Αβ и растворяют в АР1 (ВДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до рН 9,0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного СЯМ197 и смесь перемешивают при 2-8°С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы кэпируют 20-кратным молярным 8% раствором бикарбоната аммония течение 4 ч при 2-8°С.
Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы ЬР/ЬР (М1Шроге ХЬ) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10К или 30К МАС0 против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% №С1, рН 7,0. Ретентат собирают, фильтруют и анализируют через фильтр 0,2 мкм и на содержание белка (колориметрический анализ Ьо^гу или Мюго-ВСА) методом 8Ό8-ΡΑΟΕ, аминокислотным анализом и на иммуногенность на мышах.
Пример 4. Количественное определение 8-карбоксиметилцистеина и 8-карбоксиметилцистеамина как оценка степени конъюгации и кэпирования конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид.
Кислотный гидролиз пептид-пептидных конъюгатов, полученных с помощью бромацетильной активации, приводит к образованию устойчивого к кислоте 8-карбоксиметилцистеина (СМС) из цистеинов в конъюгированных сайтах и образованию устойчивого к кислоте 8-карбоксиметилцистеамина (СМСА) из цистеинов в кэпированных сайтах (фиг. 2). Все конъюгированные и кэпированные лизины превращают обратно в лизин и детектируют в виде лизина. Все другие аминокислоты гидролизуют до свободных аминокислот, за исключением триптофана и цистеина, которые в условиях гидролиза разрушаются. Аспарагин и глутамин превращают в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно.
Образцы конъюгатов разводят деионизированной водой до общей концентрации белка менее 1 мг/мл. Аликвоты 10 мкг каждого конъюгата сушат и ресуспендируют в 100 мкл 6Ν НС1 [Р1егсе], 5 мкл расплавленного фенола |8фта-А16пс11| и 1 мкл 2-меркаптоэтанола |8фта-А16пс11|. Затем образцы инкубируют в вакууме (100 мл) при 110°С в течение 22 ч. Полученные гидролизаты сушат, ресуспендируют в 250 мкл буфера цитрата натрия для разведения образцов Весктап Να-8 (рН 2,2) [Весктап Шйгитепк, 1пс., Ри11ейоп, СА] и фильтруют, используя 0,2 мкм нейлоновые мундштучные фильтры А11а1тап и шприцы на 1 мл.
Каждый образец затем вносят в петлю для жидких образцов аминокислотного анализатора Весктап 6300 и помещают в анализатор. Аминокислоты из каждого гидролизованного образца и контрольного образца разделяют ионообменной хроматографией с последующей реакцией с раствором нингидрина Весктап Мпйубгт ΝίηΚΧ при 135°С. Дериватизированные аминокислоты затем дериватизируют в частотном интервале видимого излучения при 570 и 440 нм (см. табл. 1). В каждой серии аначизов наряду с образцами и контрольными образцами используют стандартный набор аминокислот [Р1егсе Атто АсИ 8!ап6аг6 Н], содержащий по 500 пмоль каждой кислоты. К стандарту добавляют 8-карбоксиметилцистеин |8|дта-А16пс11|.
- 24 009559
Таблица 1
Время удерживания аминокислот, определённое с помощью Сгаб1еи1 Игодгат 1 на аминокислотном анализаторе Весктап 6300
Время удерживания (мин) Аминокислота Длина волны обнаружения
8.3 Карбоксиметилцистеин СМС 570
9.6 Аспарагиновая кислота и аспарагин Азх 570
11.3 Треонин ТЬг 570
12.2 Серин 5ег 570
15.8 Глутаминовая кислота и глутамин О1х 570 и 440
18.5 Пролин Рго 440
21.8 Глицин <31у 570
23.3 Аланин А1а 570
29.0 Валин Уа1 570
32.8 Метионин Ме1 570
35.5 Изолейцин Не 570
36.8 Лейцин Ьеи 570
40.5 Тирозин Туг 570
42.3 Фенилаланин Рйе 570
45.4 Карбоксиметилцистеин СМСА 570
48.8 Г истидин Ηί3 570
53.6 Лизин Ι.ίϊ 570
70.8 Аргинин Аге 570
Площади каждого стандартного пика используют как количественный эквивалент для пропорциональной оценки каждого образца. Пролин определяют от 440 нм и превращают в эквивалент при 570 нм, используя глутаминовую кислоту, ближайшую аминокислоту.
Каждое из этих значений в пикомолях превращают в молярное отношение аминокислотных остатков, используя сравнение пикомолей лизина к теоретической величине лизина в белке. Для такой оценки выбирают лизин, исходя из его ковалентного связывания с цистеином и цистеамином и ожидаемым аналогичным гидролизом. Полученное число молей аминокислот сравнивают затем с аминокислотным составом белка и сообщают наряду с величинами для СМС и СМСА. Величину СМС применяют непосредственно для оценки степени конъюгации, а величину СМСА применяют непосредственно для оценки степени кэпирования.
Пример 5. Характеристики и оптимизация пептидных конъюгатов Αβ-СКМ^.
Для проверки конъюгации все конъюгаты пептид-СКМ197 анализируют аминокислотным анализом и время - пролётной масс-спектрометрией с лазерной десорбцией и ионизацией пробы (ΜΑΕΌΙ-ТОР). Для каждого конъюгата моли пептида, конъюгированного с каждым молем СКМ197, определяют аминокислотным анализом (число 8-карбоксиметилцистеиновых остатков) и ΜΑΤΏΙ-ΤΘΕ спектрометрией. В целом, значения, полученные каждым методом, согласуются друг с другом.
Ι. Эксклюзионная хроматография по размеру частиц.
Образцы партий концентрата берут из места хранения и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Образец конъюгата Αβ-пептида осторожно перемешивают для того, чтобы гарантировать однородность препарата. Образец конъюгата Αβ-пептида центрифугируют на микроцентрифуге от Эппендорфа для удаления всех частиц. Супернатант хроматографируют на колонке ТокоНаак Т8К-Се1 С30008Ч (ТокоНаак, 81и11даг1, Сегтапу). Колонку ТокоНаак Т8К- Се1 С30008Ч соединяют с ВЭЖХ системой и предельное давление повышают до 1,4 МПа. Колонку уравновешивают, используя по меньшей мере 30 мл ΡΒ8 (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1, рН 7,2±0,1), при скорости потока 0,75 мл/мин. Образец конъюгата Αβ-пептида наносят на колонку ТокоНаак Т8К-Се1 С30008Ч, используя следующие показатели:
Концентрация образца конъюгата Αβ-пептида: 1,5±1,0 мг/мл.
Скорость потока: 0,75 мл/мин.
Объём образца: 0,1 мл.
Время прогона: 30 мин.
Оптическую плотность определяют как при 280 нм, так и при 210 нм. Для продолжительного хранения колонку ТокоНаак Т8К-Се1 С30008Ч уравновешивают по меньшей мере 50 мл 20% этанола при
- 25 009559 скорости потока 0,5-1,0 мл/мин.
II. ΡΑΟΕ (Электрофорез на полиакриламидном геле).
Активированный (бромацетилированный) СРМ19- и конъюгаты Αβ-^Ηΐ^-ΟΚΜι97 изучают на δΌδ-гелях методом электрофореза с ΝυΡΑΟΕ Βίδ-Τήδ (Νονβχ, ЕгапкГигГ Сегтапу), с нейтральным рН, готовой (заводской) полиакриламидной мини-гель системой и рабочим буфером NυΡΑСΕ ΜΕ8 8Ό8. Аликвоту 8 мкг каждого активированного СКМ или конъюгата смешивают с буфером для восстановления образца и нагревают при 100°С в течение 5 мин. Конъюгаты и стандарты молекулярных масс (МВ) (Ιηνίίτο^η, СагПЬаб, СΑ) наносят на 10% (вес./об., акриламид) гель ШРаде (Nονеx) на основе Βίδ-ΤηδНС1 забуференной системы и проводят электрофорез в рабочем буфере ΜΕ8 8Э8-РЛСЕ (ЬаеттИ). После 8Э8-РЛСЕ гель окрашивают с помощью Р1егсе Се1 Собе В1ие (Р1егсе, ВоскГогб, 1Ь). Конъюгат Αβ-пептид-СΚΜ197 представлен основной полосой около 66 кДа, выше полосы нативного СВМ и полосы димера около 120 кДа, наряду с полосами минорных мультимеров (данные не показаны).
III. Масс-спектрометрический анализ ΜΑΕΌΙ- ΤΘΕ конъюгатов пептид-СРМ19-.
Масс-спектрометрические измерения проводят для непосредственного определения примерной степени конъюгации. Соответствующие аликвоты активированного СКМ197 и образцов конъюгатов анализируют с помощью ΜΑΕ^-ΤΟΕ масс-спектрометрии с 3,5-диметокси-4-гидроксикоричной кислотой (синапиновой кислоты) в качестве матрицы. Молекулярная масса активированного СКМ197, определённая методом ΜΑΒΌΚΤΟΕ масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ештдап ΜΑΤ Ьазегта! 2000, К1пдое8, ΝΥ), составляет около 60,5 кДа, а для конъюгатов варьируется от 65 до 74 кДа в зависимости от степени конъюгации (данные не показаны). Найдено, что до 22 лизиновых остатка (~50%) в СРМ19- модифицировано в отношении 1:1.
IV. Эксперименты по оптимизации.
Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент: белок, температуры реакции и рН реакционного буфера. Ниже даны некоторые примеры для иллюстрации оптимальных условий конъюгации, проведённые с целью определения оптимальной величины рН для получения воспроизводимых контрольных показателей процесса в реакциях конъюгации. Результаты (фиг. 3) показывают, что реакция конъюгации в Αβ 5-мер (ΌΑΕΕΚ^ (8ΕΟ ГО ΝΟ:1), так же как в Αβ 7-мер (^ΑΕΕΚН^С) (8ΕΟ ГО ΝΟ:2) зависит от рН и более высокую степень модификации/конъюгации получают при повышенном значении рН. При использовании ТФК (ΤΕΑ) соли 5- и 7-мерного пептидов, меняя пептидную нагрузку, оценивают степень конъюгации при рН 9,0 (фиг. 4). Из этих результатов видно, что пептидные конъюгаты с определённым числом пептидных копий на молекулу СВМ можно получать, меняя в процессе конъюгации отношение пептид/активированный СВМ. Аналогичные эксперименты проводят с ацетатом (уксусно-кислой солью) Αβ7-мерного пептида.
При конъюгации Αβ1-7^ΚΜ процесс кэпирования оценивают, сравнивая число молей СΜСΑ на СВМ с числом молей СМС на СВМ. Когда сумма СМС и СΜСΑ для каждого тестированного соотношения пептид: СВМ остаётся постоянной, предполагают, что процесс кэпирования закончен (фиг. 5). Общая (тотальная) модификация в конъюгате остаётся между 19 и 21, что сравнимо с числом бромацетилированных лизиновых остатков (фиг. 5). Эти эксперименты проводят с ТФК (ΤΕΑ) в качестве противоиона для пептида. Конъюгацию Αβ 1-7/СВМ повторяют, предпочтительно используя не ТФК соль, а ацетат, и эти данные показаны на фиг. 5 и 6. Процесс кэпирования очевидно, закончен, при этом общее число СМС и СМСА для каждой точки остаётся между значениями 20 и 22. Условия реакции конъюгации ΑΡСВМ оптимизируют при рН 9,0, причём степень в ходе реакции конъюгации регулируется отношением пептида к СВМ. Варьируя отношения от 0,1 до 1,5, можно менять степень конъюгации (фиг. 6).
Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент: белок, температуры реакции и рН реакционного буфера. Степень модификации (конъюгации) для каждого конъюгата рассчитывают, вычитая величину массы активированного СВМ197 из величины массы каждого конъюгата, а затем делят на массу пептида, использованного для получения конъюгата. Степень модификации (конъюгации) для всех конъюгатов дана в табл. 2.
Степень конъюгации также сравнивают со значениями, полученными при определении числа образовавшихся 8-карбоксиметилцистеиновых остатков на моль СРМ19- (также показано в табл. 2).
- 26 009559
Таблица 2
Степень модификации: сравнение данных ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ и ΑΑΑ
Образец Да (Массспектрометрия) Степень конъюгации (Массспектрометрия) Степень конъюгации (СМСаминокислотный анализ)
СКМ]9? 58408 —- ....
ВгАс- СКМ 60752 19 ....
ΑβΙ-7/СКМ 74463 14 15
ΑβΙ-7/СИЛ 72375 12 14
ΑβΙ-5/СИЛ 75425 20 21
ΑβΙ-5/СКМ 71690 15 18
Пример 6. Исследование иммуногенности конъюгатов Αβ-пептида.
Пептиды, охватываемые Ν-концевыми остатками 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 Αβ (с линкерной последовательностью ΟΑΟΑΟ или без неё), и пептид, соответствующий Ν-концу Αβ в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), каждый из них конъюгирован с СКМ197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным Αβ 1-12-мерным пептидом в композиции со 8ΤΙΜυΕΟΝ™ 08-21. Каждую группу мышей иммунизируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъюванта 8ΤΙΜυΕΟΝ™ 08-21. в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Протокол исследования представлен в табл. 3.
Как показано в табл. 3, пептиды, охватывающие Ν-концевые остатки 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 Αβ (с линкерной последовательностью ΟΑΟΑί.' или без неё), и пептид, соответствующий Ν-концу Αβ в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), конъюгированые с СКМ197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным Αβ 1-12-мерным пептидом в композиции с 08-21. Каждую группу мышей вакцинируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъюванта 08-21, в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Для полного исследования берут мышей 8г188АеЬз!ег, по 5 мышей в каждой группе. Объём инъекции = 100 мкл; В = взятие пробы крови; V = вакцинация; Е = кровопускание.
Анти-Αβ титры определяют методом ΕΕΙ8Α против Αβ и СКМ197, как описано далее. В нескольких словах: на 96-луночных планшетах Со81аг (#3591) в течение ночи при комнатной температуре иммобилизуют 2 мкг/мл Αβ1-42 в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты опорожняют и блокируют в течение 2 ч при комнатной температуре с помощью 200 мкл/лунка 0,05% Β8Α в IX ΡΒ8/0,05% Тетееп 20. Блокированные планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего ΤΒ8, 0,1% Вгу-35 (не содержащий азида) буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят с 0,05% Β8Α в IX ΡΒ8, содержащем 0,05% Агееп 20/0,02% азид, и 100 мкл каждого разведения затем переносят в соответствующие лунки планшета и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного 1дО, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от 8ои111егп Βω^Οι (город, штат), разводят 1:1000 с 0,05% Β8Α в ΡΒ8, содержащем Агееп 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1мг/мл раствора субстрата п-нитрофенилфосфата, приготовленного в диэтеноламине/МдС12, рН 9,8. Проявление цвета прекращают, добавляя 50 мкг/лунка 3Ν раствора ΝαΟΗ. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при Ο.Ό (оптической плотности) 0,1 Αυ (Ед.).
- 27 009559
Таблица 3
Протокол исследования иммунизации мышей
Код группы Описание Доза (мкг) Неделя 0 Неделя 3 Неделя 6 Неделя 8 Неделя 13 Неделя 16
АЕ488 СКМ/1-7 с/без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ489 СКМ/1-12с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ490 СКМ/1-9 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ491 СКМ/1-7 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ492 СКМ/1-5 с/без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ493 СКМ/1-9 с/без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
АЕ494 СКМ/1-12 с/без линкера 30 Β,ν Β,ν Β.ν Β Β Ε
ΑΕ495 СЕМ/1-5С линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ496 СКМ/1-7 с/без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ497 СКМ/1-12 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ498 СКМ/1-9 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ499 СКМ/1-7 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ500 СКМ/1-5 с/без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ501 СКМ/1-9 с/без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ502 СКМ/1-12 с/без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ5Ο3 СКМ/1-5 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ504 СКМ,97С16151 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ5Ο5 СКМ197С1- 6151 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ506 СКМ/12- 1мер 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ507 СКМ/12- 1мер 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ508 пептид 1- 12мер 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ509 пептид 112мер 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ510 АЬ 30 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
ΑΕ511 АЬ 5 Β,ν Β,ν Β,ν Β Β Ε
Метод ЕЫ8А для СК.М19-.
96-луночные планшеты Сгешег (#650011) при 37°С в течение 90 мин покрывают плёнкой 5,0 мкг/мл (100 мкл/лунка) СК.М19- в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего IX ТВ8, 0,1% Вгу-35 буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят в IX ΗΌ8, содержащем 0,3% Т\уеен 20/ ЕЭТА. и 100 мкл каждого разведения переносят затем в соответствующие лунки планшета и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного 1дС, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от ЗоШНегп Вю1еск разводят 1:1000 с IX РВ8, содержащем 0,05% Т^ееη 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1 мг/мл раствора субстрата пнитрофенилфосфата, приготовленного в диэтеноламине/МдС12, рН 9,8. Проявление прекращают, добавляя 50 мкг/лунка 3Ν раствора №1ОН. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при Ο.Ό (оптической плотности) 0,1 Аи (Ед.).
Табл. 4-6 иллюстрируют ЕЫ8А титры в конечной точке против Ав. После первичной иммунизации все восемь конъюгатов (исключая негативный контроль) индуцируют заметный (измеримый) 1дС иммунный ответ против Ав. Однако доза 30 мкг, но не доза 5 мкг Ав вызывает позитивный ответ на 3-й неделе после первичной иммунизации. Среди конъюгатов, по-видимому, пептид Ав 1-7, конъюгированный без линкера, вызывает такой же или лучший ответ, чем другие изученные конъюгаты. В дозе 5 мкг Ав1-5С лучше действует на 8-16 неделях. Ав1-7С является лучшим в дозе 30 мкг. Анализ титров антител
- 28 009559 после второй и третьей иммунизации в дозе 5 или 30 мкг показывает, что максимальный иммунный ответ на Αβ для большинства конъюгатов наблюдается после второй иммунизации. По меньшей мере, у мышей третья иммунизация, по-видимому, не повышает иммунный ответ. Однако в случае Αβ-пептида требуется три иммунизации в дозе 30 мкг для достижения максимального иммунного ответа против пептида (табл. 5). Что касается распада антитела через продолжительный период времени, уровень антител в группах, иммунизированных конъюгатами, понижается в 2-3 раза по сравнению с наивысшим уровнем в этой группе. Отдельные образцы в группах на 6 и 8 неделях анализируют для расчёта ОМТ (среднегеометрических титров антител) против Αβ для каждой группы (табл. 6), чтобы узнать, действительно ли какой-либо конъюгат значительно лучше других. Статистический анализ титров на неделе 6 в группах конъюгатов Αβ1-5Ο Αβ 1-7С? и Αβ1-9ί.' показывает, что конъюгат Αβ 1-7 индуцирует значительно более высокий титр. Также из этого эксперимента очевидно, что линкерная последовательность ОАОАС не способствует повышению иммунного ответа на пептид.
Таблица 4
Группа Неделя 3 Неделя 6 Неделя 8 Неделя 13 Неделя 16
1-5С <100 14,960 687,691 882,012 625,208 771,828
1-7С <100 51,253 1,280,181 860,463 520,060 571,043
1-9С <100 18,615 1,008,872 622,325 348,967 380,755
1-12С <100 615 132,009 390,624 166,162 184,170
1-5ЬС <100 4,999 458,075 454,631 237,573 220,091
1-7ЬС <100 17,693 849,170 842,402 446,089 400,536
1-9ЬС <100 18,5441 1,465,115 1,180,347 571,127 579,477
1-12ЬС <100 12,644 908,360 598,867 368,101 316,075
<100 <100 <100 <100 <100 <100
1-42 <100 <100 <100 <100 <100 <100
1-12 <100 <100 <100 <100 <100 <100
12-1С <100 <100 <100 <100 <100 <100
Таблица 4. Конечные титры антител против Αβ на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методом ЕЫ8А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 5 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые амилоидные Αβ-пептиды различной протяжённости. Ссылка: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1аи #592 = 3073307. Конечная точка при Θ.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей Ανίκκ^еЬк!ег иммунизируют БС-Ν (подкожно) дозой 5 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг §ТМиЬО№м р§-21 на 0, 3 и 6 неделях.
Таблица 5
Группа Неделя 0 Неделя 3 Неделя 6 Неделя 8 Неделя 13 Неделя 16
1-5С <100 18,150 590,355 332,832 204,645 176,159
1-7С <100 100,672 1,840,741 647,470 592,638 779,072
1-9С <100 18,520 1,184,696 713,494 363,459 327,065
1-12С <100 7,837 1,325,725 1,126,389 681,268 577,604
1-5ЬС <100 16,347 469,191 184,077 177,358 164,680
1-7ЬС <100 47,866 971,229 462,200 463,466 529,726
1-91.С <100 59,002 921,544 787,273 405,023 500,468
1-12ЬС <100 27,348 697,150 483,320 284,800 397,816
СИМ 197 <100 <100 <100 <100 <100 <100
1-42 <100 160 3,327 109,718 48,646 27,901
1-12 <100 <100 <100 <100 <100 <100
12-1С <100 <100 <100 <100 <100 <100
Таблица 5. Конечные титры антител против Αβ на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методом ЕЫ8А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые амилоидные Αβ-пептиды различной протяжённости. Ссылка: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1аи #592=3073307. Конечная точка при Ο.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей Ανίκκ^еЬк!ег иммунизируют БС-Ν (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг ЧТЧМЕИ .ΟΝ™ р§- 21 на 0, 3 и 6 неделях.
- 29 009559
Таблица 6
Группа Неделя 6 Ншеля8
1-5С 237,668 а 161,671 ь
1-7С 1,866,702 ° 881,146 ь
1-9С 963,323 а 595,414 ь
1-12С 940,260 955,470
1-5ЬС 395,553 141,084
1-7ЬС 516,921 394,521
1-9ЬС 826,773 562,458
1-121X2 544,768 376,952
1-42 365 4,565
Таблица 6. Конечные ΟΜΤ антител против Ав через 6 и 8 недель, полученные методом ЕЬ18А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые пептиды амилоида-Ав различной протяжённости. Ссылка: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1ап #592=3073307. Конечная точка при Θ.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей 8^188- ХУеЬЛег иммунизируют 8С-Ы (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг 8ΤΙΜυΕΘΝ™ Р8-21 на 0, 3 и 6 неделях.
a. Статистический анализ титров антител на 6 неделе после введения 1-5С, 1-7С и 1-9С с применением критерия Тьюки-Крамера показывает статистическую разницу только между 1-5С по сравнению с 1-7С, тогда как анализ с применением Т-теста Стьюдента показывает статистическую разницу между 1-5С по сравнению с 1-7С и между 1-5С по сравнению с 1-9С.
b. Статистический анализ титров антител на 8 неделе после введения 1-5С, 1-7С и 1-9С не показывает статистической разницы между этими тремя группами. Однако, очевидно, имеется тенденция, которая может указывать на разницу между 1-5С по сравнению с 1-7С.
Окрашивание тканей мозга мышей линии РЭАРР.
Анализ окрашивания тканей мозга мышей линии РЭАРР указывает на функциональность конъюгатов Ав-пептида и/или Ав 1-42-антисыворотки. Образцы сыворотки отдельных групп мышей анализируют отдельно на их способность узнавать бляшки, содержащие амилоидный пептид, в тканях мозга мышей РЭАРР. Результаты показаны в табл. 7А и 7В. За исключением антисывороток конъюгата Ав 5-мера, наблюдается зависящий от дозы (доза-эффект) ответ узнавания бляшек. Вне зависимости от линкера антисыворотки, полученные в результате введения 30 мкг конъюгата, имеют лучший паттерн реактивности по сравнению с антисыворотками, полученными в результате введения 5 мкг конъюгата. Однако в случае антисывороток, полученных в результате введения конъюгата Ав 5-мера, наблюдается, по-видимому, сходная или лучшая реактивность в группе, получавшей дозу 5 мкг. Сравнение всех этих результатов приводит к выводу, что конъюгаты, полученные из Ав 1-5-мера по Ав 1-9-мер, достаточны для выявления распознающего бляшки иммунного ответа у мышей и присутствие линкера не является существенным. Из данного исследования можно сделать следующие заключения:
а) все пептидные конъюгаты индуцируют высокие титры антител против белка-носителя 0ΚΜ197, с равными или более высокими уровнями по сравнению с контрольным неконъюгированным 0ΚΜ19,- (не показано);
б) конъюгаты с линкером САСАС не повышают иммуногенность или функциональность по сравнению с конъюгатами без линкера;
в) данные по иммуногенности и окрашиванию тканей мозга мышей РЭАРР (первичный показатель функционального антитела) показывают, что конъюгаты Ав 1-5-мера и Ав 1-7-мера, очевидно, являются предпочтительными иммуногенами для дальнейшей разработки.
- 30 009559
Таблица 7А
Окрашивание тканей мозга мышей линии РОЛОВ
Доза 5 мкг
В отсутствие линкера С линкером
Вакцина Животное # Окрашивание Вакцина Животное # Окрашивание
РВАРР РВАРР
СКМ/Αβ,.; 1 +(нет диффузии) СКМ/Αβυ -
2 ++/+++ 2
3 ++/+++
4 4*4- 4 ±
5 ++ 5 *
СКМ/Αβ,.τ 1 ++ СКМ/А₽|.7 4-
2 ++ 2 +-+
3 4-4- 3 ++
4 ++ 4 +
5 ++ 5 ++
СКМ/Αβ,., 1 + СКМ/Αβ,., ++
2 +/++ 2 ++
3 3
4 + 4 +
5 + 5 т
скм/Αβ,.,, ΐ - скм/аз,.|2 +
2 9 2 +
3 ± 3 +-ь
4 4
5 + 5 ±
СКМ/АР|2-]Мер 1 2 Αβ42 2
3 ± 3
4 4
5 + 5
Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания.
Таблица 7В Окрашивание тканей мозга мышей линии ΓΟΑΟΟ
Доза 30 мкг
В отсутствие линкера С линкером
Вакцина Животное # Окрашивание РВАРР Вакцина Животное # Окрашивание РВАРР
СКМ/Αβ,.ϊ 1 2 +(нет диффузии) ++/4-++ СКМ/Αβ, 5 1 2
3 ++/+++ 3 £
4 ++ 4 *
5 ++ 5 *
СКМ/Αβ,., 1 2 ++ ++ СКМ/Αβ, .7 1 2 ++
3 +4- 3 ++
4 ++ 4 +
5 ++ 5 +4-
СКМ/Αβ,., 1 2 + +/++ СКМ/Αβ,., 1 2 ++ ++
3 ± 3 +
4 5 ± ± 4 5 + +
СКМ/Αβ ,.и 1 2 9 СКМ/Αβ,.,, 1 2 + +
3 ± 3 + +
4 5 ± 4 5
СКМ/АР|2.|мер 1 2 Αβ42 1 2
3 ± 3
4 5 ± 4 5
Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания.
Пример 7. Изучение иммуногенности на обезьянах.
Группы из 6 обезьян получают 30 мкг конъюгата 7-мера (тотальный конъюгат) с адъювантом, в качестве которого берут δΤΕΜυΕΘΝ™ 08-21, соли алюминия (а1ит) или препарат КС5298Е, в дни 0, 29 и 58. Дополнительные группы получают 30 мкг конъюгата 5-мера либо с соединением (гидроксидом) алюминия (а1ит, Α1(ΟΗ)3), либо с КС5298Е, 75 и 300 мкг Αβ со 8ΤΙΜυΕΟΝ™ 08-21 в качестве позитивного контроля. Позитивный контроль вводят каждые две недели. На 36 и 64 день определяют титры антител против Αβ (фиг. 7-9). На 36 день ОМТ титры антител, вырабатываемых конъюгатами 7-мер/СМК плюс 8ΤΙΜυΕΟΝ™ 08-21, гидроксид алюминия и К.С5298Е, составляют 10110, 13330 и 17090 соответственно (фиг. 7). Напротив, Αβ 1-42 плюс 8ΤIΜυ^ΟN™ 08-21 выявляют 6ΜΤ антител 223 и 1734 при уровнях доз 75 и 300 мкг соответственно. Конъюгат Αβ 5-мера даёт титр 2134 с соединением алюминия и 15980 с КС5298Е. На 64 день, т.е. после 3 доз, конъюгаты либо со 8ΤIΜυ^ΟN™ Р8-21, либо с КС5298Е индуцируют значительно более высокие титры, чем после второй дозы (^ΜΤ 69910 для конъюгата 7-мера/КС529 8Е; 21640 для конъюгата Αβ 5-мера/КС529 8Е и 30310 для конъюгата Αβ Т-мераЧПМиЕОК™ 08-21) (фиг. 8). Конъюгаты с соединением алюминия индуцируют пониженные титры после третьей иммунизации по сравнению с результатами после второй иммунизацией. Повидимому, конъюгат Αβ 7-мера вызывает лучший (более высокий) ответ по сравнению с конъюгатом Αβ
- 31 009559
5-мера. У обезьян введение конъюгата Αβ 7-мера с КС529 8Е или со 8Т1МиБОН™ 08-21 вызывает самый высокий ответ (фиг. 9). Ответ на конъюгат Αβ 7-мера с соединением алюминия умеренный и сходен с ответом на введение 300 мкг Αβ 1-42 плюс 8Т1МиЬО№м 08-21.
Из данного примера можно сделать несколько выводов. Во-первых, оба конъюгата являются в высокой степени иммуногенными в отношении приматов. Во-вторых, присутствие адъювантов в препарате для иммунизации заметно влияет на иммунный ответ. В-третьих, за исключением алюминиевого адъюванта, КС529 8Е и 8Т1МийОН™ 08-21 повышают иммунный ответ после каждой вводимой при иммунизации дозы, по меньшей мере, вплоть до трёх доз (фиг. 9). В целом конъюгат Αβ 7-мера вызывает более высокий антительный ответ в присутствии 529, а затем следует 8Т1МийОН™ 08-21.
Пример 8. Получение конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП, ΜЛΡ) и изучение их иммуногенности.
Имеется несколько методов получения множественных антигенных сайтов на носителях. В предыдущих примерах каждый антигенный сайт по отдельности конъюгировался с носителем с помощью описанных реакций конъюгации и кэпирования. В данном примере множественные антигенные сайты создают твёрдофазным синтезом тандемных повторов Αβ1-7-мера или же эти тандемные повторы могут связываться с Т-клеточными эпитопами с соединением или без соединения через лизиновое ядро, как описано в другом месте. Эти множественные антигенные пептиды синтезируют с дополнительным цистеиновым остатком для конъюгации с белком-носителем. Синтезируют пептиды, содержащие одну единицу повтора (1-7), три единицы повтора (1-7)3 и пять единиц повтора (1-7)5 с дополнительным цистеинильным остатком на карбоксильном конце. Эти пептиды ковалентно связывают с бромацетилированным СКМ в течение ночи через С-концевые цистеиновые остатки. Реакцию проводят при рН 9,0-9,2 при соотношениях пептид:СКМ, приведённых в табл. 8. Бромацетильные группы, не прореагировавшие с пептидом, кэпируют Ν-ацетилцистеамином. Эти группы представляют собой конъюгаты, содержащие, соответственно, одну единичную копию, три тандемных копии и пять тандемных копий пептида Αβ1-7, конъюгированные с СКМ. В табл. 8 показаны свойства образцов.
Таблица 8 Образцы конъюгатов множественных антигенных пептидов ________________(МАП, ΜЛΡ)________________
Конъюгат Пептид: СИМ (вес/вес) рН реакции
Αβ( 1-7) ,/СКМ 0.37 8.99
Ар(1-7)з/СКМ 1.02 8.95
АР(1-7)5/СКМ 1.67 9.17
Пептидная нагрузка (среднее число Αβ1-7 пептидов на носитель) и число кэпирований (табл. 9) представляют собой число уникальных аминокислот (СМС или СМСА) на носитель, определённое аминокислотным анализом. Величины СМС и СМСА отнесены к лизину.
Таблица 9
Степень конъюгации и кэпирования каждого конъюгата
Конъюгат Пептидная нагрузка (СМС) Кэпирование' (СМСА)
Ар(1-7)1/СКМ 0.37 8.99
Ар(1-7)3/СКМ 1.02 8.95
Ар(1-7);/СКМ 1.67 9.17
Мышей 8\У1кк-\УеЬк1ег (по 10 в группе) иммунизируют, вводя подкожно 1 или 0,1 мкг конъюгированного пептида Αρ/СКМ. Половину мышей иммунизируют композицией, приготовленной со 100 мкг адъюванта Α1(ОН)з, а половину иммунизируют без адъюванта. Иммунизацию проводят на 0 и 3 неделе. Отбор проб крови проводят на 0, 3 и 6 неделе. Образцы сыворотки анализируют на антительный ответ против Αβ1-42-мерного пептида. Результаты показаны в табл. 10.
- 32 009559
Таблица 10
Конечные титры антител против Ав для конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП)
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 СМТ Неделя 6 СМТ
АС332 1 мкг Αβ (1-7),/СЕМ А1(ОН)3 <100 18,096 100,279
АСЗЗЗ 1 мкг Αβ (1-7)3/СКМ А1(ОН)3 <100 44,911 420,235
АС334 1 мкг Αβ(Ι-7)5/€ΚΜ А1(ОН)3 <100 27,032 394,488
АО335 0,1 мкг Αβ (1-7),/СЕМ А1(ОН)3 <100 19,350 66,834
АО336 0,1 мкг Αβ(1-7)3/€ΚΜ А1(ОН)3 <100 13,307 208,272
АС337 0,1 ΜΚΓΑβ(1-7)5/ΟΚΜ А1(ОН)3 <100 1,196 22,665
АС338 1 мкг Αβ (1-7),/СЯМ Нет <100 5,273 370,980
АО339 1 мкг Αβ (1-7)3/СЯМ Нет <100 9,299 541,093
АО340 1 мкг Αβ (1-7)5/СКМ Нет <100 3,100 185,272
АС341 0,1 мкг Αβ (1-7)|/СКМ Нет <100 340 25,839
АО342 0,1 мкг Αβ (1 -7)3/СЯМ Нет <100 128 5,553
АО343 0,1 мкг Αβ(1-7)3/ΟΚΜ Нет <100 668 2,098
Все конъюгаты индуцируют титр антитела против Ав 1-42 после первичной иммунизации, и уровни заметно повышаются после бустерной дозы. В отсутствие алюминиевого адъюванта разница доза-эффект очевидна в пробах крови как на 3, так и на 6 неделе. Более высокая доза вызывает антительный ответ с высоким титром. Алюминиевый адъювант вызывает значительно более высокий антительный ответ на 3 неделе в случае обоих уровней доз (0,1 и 1 мкг) по сравнению с группами, не получающими адъюванта. После вторичной иммунизации конъюгаты в дозе 1 мкг вызывают 5-10-кратное повышение уровней антител. В таком уровне доз пептидные конъюгаты с 3 и 5 повторами индуцируют более высокий антительный ответ, чем конъюгат, содержащий одиночный (однократный) повтор. Также определяют титры против носителя СЯМ, они представлены в табл. 11.
Таблица 11
Конечные титры антител против СЯМ для конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП)
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 СМТ Неделя 6 СМТ
АС332 1 мкг Αβ (1-7);/СЯМ А1(ОН)3 <50 10,531 11,602
АСЗЗЗ 1 мкг Αβ (1-7),/СЯМ А1(ОН)3 <50 4,274 83,065
АО334 1 мкг Αβ (1-7)5/СКМ А1(ОН)3 <50 1,680 49,320
АС335 0,1 мкг Αβ (1-7);/СкМ А1(ОН)3 <50 1,114 13,231
АС336 0,1 мкг АР(1-7)3/СКМ А1(ОН)3 <50 197 1,484
АС337 0,1 мкг Αβ(1-7);/εΚΜ А1(ОН)3 <50 65 222
АО338 1 мкг Αβ (1-7)|/СКМ Нет <50 35 309
АС339 1 мкг Αβ (1-7)3/СКМ Нет <50 29 1,085
АС340 1 мкг Αβ (1-7)5/СЯМ Нет <50 29 542
АС341 0,1 мкг Αβ(1-7);/σΚΜ Нет <50 25 55
А6342 0,1 мкг Ар(1-7)3/СКМ Нет <50 25 34
А6343 0,1 мкг Αβ (1-7)5/СЕМ Нет <50 29 ΝΟ
Животных иммунизируют на 0 и 3 неделе и пробы крови берут на 0, 3 и 6 неделе. Адъювант 100 мкг А1(0Н)3 или отсутствует. ΝΌ = не определялся.
Данные в табл. 11 показывают, что в группах, не получающих адъюванта, индуцируются очень низкие уровни антительного ответа против СЯМ при введении дозы как 1 мкг, так и 0,1 мкг даже после двух иммунизаций. Однако конъюгаты с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта индуцируют значительные уровни антительного ответа против СЯМ в дозе 1 мкг и значительно более низкий ответ в дозе 0,1 мкг. В присутствии адъюванта титры СЯМ наиболее высоки для конъюгата с единичным повтором, имеют промежуточное значение для конъюгата с тройным повтором, и наиболее низкие для конъюгата с пятикратным повтором. Это и ожидалось, так как доза СЯМ на дозу пептида является наиболее низкой для Ав(1-7)5/СЯМ и наиболее высокой для АР(1-7)з/СЯМ. Разница становится статистически значимой только на 6 неделе при дозе 0,1 мкг.
Целью настоящего исследования является вызвать иммуногенный ответ с высокими титрами против антигенного пептида и необязательно против белка-носителя. В некоторых обстоятельствах жела
- 33 009559 тельно вызвать оптимальный иммунный ответ против антигенной детерминанты гаптена при наименьшем или нулевом иммунной ответе против белка-носителя. Для такого применения служат конъюгаты с тандемными повторами множественных антигенных детерминант в препаратах, не содержащих адъюванта.
Пример 9. Получение конъюгатов Αβ-пептидов с различными белками-носителями и их иммуногенность.
В данном примере проводится сравнение иммуногенности конъюгатов при использовании шести различных белков-носителей. Соль ацетат Αβ1-7 прибавляют к бромацетилированным носителям в весовом соотношении 1:1 при рН 9. Все конъюгаты, за исключением Αβ1-7/^С5аρ, копируют Ν-ацетилцистеамином. Все альтернативные носители представляют собой рекомбинантные бактериальные белки, включая СВМ (дифтерийный токсоид), рекомбинантную С5а пептидазу (г5ар; клонируют при использовании 8!гер!ососсик ада1асбае, включает мутации Ό130Α и 8512Α), 0ВР 1224, 1664, 2452 (все клонируют при использовании 8!гер!ососсик руодепек) и Т367, Т858 (каждый клонируют при использовании СЪ1атуб1а рпеитошае). Результаты оксперимента представлены в табл. 12. Степень конъюгации и копирования каждого конъюгата Αβ1-7 с отими носителями даны в табл. 13.
В данном исследовании показано, что конъюгат рекомбинантной С5а пептидазы вырабатывает более высокие титры антитела против Αβ, чем большинство других тестированных носителей, включая СРМ. Эта разница статистически значима для титров в группах на 6 неделе, которые получают гидроксид алюминия. Кроме того, конъюгат Αβ1-7/Т858 является значительно более иммуногенным, чем большинство других конъюгатов в отсутствие адъюванта. Единственным конъюгатом, вызывающим слабый ответ по сравнению с контрольным СРМ конъюгатом, является Αβ1-7/Т367, конъюгат, который также не реагирует со специфическим к Αβ моноклональным антителом при анализе Вестернблоттингом. Это исследование подтверждает, что для иммунизации против Αβ-пептида можно успешно использовать многие другие носители.
Таблица 12
Носители и свойства конъюгатов
Белок- М.в. носителя (Да) # лизинов носитель
СКМ 58408 39
гС'ар 108560 85
ОКТ 1224 30950 18
ОКР1664 31270 38
ОВР2452 31790 29
Т367 49700 29
Т858 37190 23
Таблица 13
Степень конъюгации и копирования каждого конъюгата
Конъюгат Пептидная нагрузка Копирование (СМСА)
(СМС)
Ар1-7/г€5ар 25.9 -
Αβ1-7/ΟΚΡ1664 12.8 5.7
Αβ1-7/ΟΚΓ1664 13.4 10.8
Αβ 1-7/0812452 12.03 10.5
Αβ1-7/Τ367 13.2 8.2
Αβ1-7/Τ858 5.2 1.7
Результаты конъюгации.
Пептидная нагрузка (среднее число Αβ1-7 пептидов на носитель) и число (степень) копирования и число уникальных аминокислот (СМС или СМСА) на носитель, определённые аминокислотным анализом. Значения СМС и СМСА отнесены к лизину.
Результаты иммунизации.
Средние геометрические титры для каждой группы в данном исследовании представлены в табл. 14. На 3 неделе, вне зависимости от присутствия адъюванта. Αβ1-7/^С5ар индуцирует значительно более высокие титры антитела против Αβ, чем соответствующие конъюгаты, приготовленные с 8!гер!ососсик руодепек 0ВР 1224, 1664, 2452, или СЪ1атуб1а рпеитошае Т367 и Т858. На 3 неделе в отсутствие адъюванта Αβ1-7/^С5ар также является более иммуногенным, чем все другие адъюванты, за исключением Αβ1-7^858. Конъюгат Т858 в отсутствие Α1(0Η)3 индуцирует более высокие титры, чем конъюгаты
- 34 009559
ОВЕ1224, ОВЕ1664, ОВЕ2452 и СВМ без адъюванта. Единственным конъюгатом, значительно менее иммуногенным, чем Αβ1-7/СΒΜ, является Αβ1-7/Τ367 (р<0,00002). Носитель Т367 плохо работает в присутствии и в отсутствие адъюванта как на 3, так и на 6 неделе. На 6 неделе конъюгат гС5ар с гидроксидом алюминия является более иммуногенным (р<0,04), чем все остальные конъюгаты, за исключением Αβ1-7/ОΒΕ2452. В отсутствие адъюванта как Αβ1-7/^С5ар, так и Αβ1-7/Τ858 вызывают значительно более высокие титры, чем конъюгаты с ОВЕ 1224, 1664 или Т367. Конъюгат Αβ1-7/СΒΜ без гидроксида алюминия вызывает более высокие титры, чем Αβ1-7/ОΒΕ1664 или Αβ1-7^367.
Таблица 14
Конечные титры антител против Αβ1-42
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 смт Неделя 6 СМТ
А6344 5 мкг ΑβΙ-7/СКМ А1(ОН)3 <100 21,404 54,157
АС345 5 мкг ΑβΙ-7/гСЗар А1(ОН)з <100 61,967 402,972
А6346 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΓ1224 А1(ОН)3 <100 10,711 30,084
АС347 5 мкг Αβ 1-7/ОКЕ 1664 А1(ОН)3 <100 7,188 43,226
АС348 5 мкг Αβ1-7/ОКР2452 А1(ОН)3 <100 11,437 109,091
АС349 5 мкг Αβ1-7/Τ367 А1(ОН)3 <100 321 5,139
АС350 5 мкг Αβ1-7/Τ858 А1(ОН)3 <100 16,656 33,328
АС351 5 мкг ΑβΙ-7/СКМ Нет <100 2,615 119,488
АС352 5 мкг Αβ 1 -7/ гС5ар Нет <100 11,858 279,113
АО353 5ΜΚΓΑβ1-7/ΟΚΕ1224 Нет <100 1,674 18,719
А6354 5 мкг Αβ 1-7/1664 Нет <100 119 9,832
АС355 5 мкг Αβ 1-7/245 2 Нет <100 2,493 76,038
АО356 5 мкг Αβ1-7/Т367 Нет <100 50 620
А6357 5 мкг Αβ1-7/Τ858 Нет <100 28,820 275,202
Животных иммунизируют на 0 и 3 неделе и пробы крови берут на 0, 3 и 6 неделе. Доза соответствует общему количеству конъюгата. Адъювант 100 мкг Α1(ΟΗ)3 или отсутствует.
Пример 10. Получение других (дополнительных) конъюгатов Αβ пептид-белок.
Ι. Активация.
Размороженный СВМ197 (8 мл, 59,84 мг с концентрацией 7,48 мг/мл) растворяют в 0,1 М боратном буфере (рН 9, 3,968 мл), получают концентрацию 5 мг/мл. Раствор охлаждают в бане со льдом до 0-5°С. К раствору СВМ197 по каплям прибавляют раствор офира Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (59,9 мг) (Л1бпск-Б|дта) в 100 мкл ДМФА (Л1бпск-Б|дта). После прибавления офира Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты выпадает осадок. При проверке рН оказывается, что его значение понижается до рН 6. рН реакционной смеси снова доводят до 9, добавляя 0,1 боратный буфер. Затем реакционную смесь перемешивают при 4°С в течение 1 ч при слабом вихревом движении. Смесь очищают, концентрируют на препаративной центрифуге УМ-10 и повторно очищают на носителе Сефадекс-25, используя в качестве олюента 10 мМ раствор бората. Фракции, позитивные к реагенту Бродфорд, собирают и концентрируют на препаративной центрифуге УМ-10. Степень бромацетилирования определяют методом Бродфорд (линейным). Найдено, что концентрация составляет 5,36 мг/мл (выход 30 мг). Конечную концентрацию доводят до 5 мг/мл и хранят в морозильнике в 5% сахарозе до последующего применения.
ΙΙ. Конъюгация.
Для каждой конъюгации используют размороженный бромацетилированный СВМ197. Пептиды растворяют в боратном буфере (2,5 мг в 125 мл 0,1 М боратного буфера). Неполная растворимость наблюдается в случае Αβ-пептидов МАТЕ/ХЕОС (БВЕ) ΙΌ ^:45), ^νΕΕΑΕΌν (БЕО ΙΌ ^:47), СΚ^VΕΕΑΕ^ (БЕЦ ΙΌ NО:48) и ^VΕΕΑΕ^С (БЕО ΙΌ NО:50). Бромацетилированный СВМ!97 (5 мг/мл) обрабатывают растворам/суспензиями пептидов. Соотношение пептида и белка в смеси равно 1:2. В смесях конъюгата с пептидами ΚΕνΕΕ/\ΕΙ)Ο (БЕО ΙΌ ^:45), ΟΕνΕΕ/\ΕΙ)ν (БЕО ΙΌ ^:47), (ΚΕνΕΕ/ΕΕΙ) (БЕО ΙΌ ^:48) и Κ^VΕΕΑΕ^С (БЕО ΙΌ NО:45) являются мутными. Затем проверяют рН смесей (рН 9) и инкубируют при 4°С в течение ночи при медленном перемешивании. Перед инкубацией концентрацию смесей доводят до 3 мг/мл. Помутнение смесей конъюгатов с пептидами С^VΕΕЛΕ^V (БЕО ΙΌ NО:47) и ^VΕΕЛΕ^С (БВО ΙΌ NО:50) после инкубации исчезает. Однако смеси с Κ^VΕΕЛΕ^С (БЕО ΙΌ NО:45) и СΚ^VΕΕΑΕ^ (БЕО ΙΌ NО:48) остаются слегка мутными. Растворимый проверочный конъюгат с белком также готовят с цистеамином в отношении 1:1 (вес./вес.). Синтезированные пептиды получают от
- 35 009559
ВЮЗОИКСЕ с чистотой около 95%.
Октамеры
ЬУЕЕАЕОУС (ЗЕр ГО N0:44)
КЬУГГАЕОС (ЗЕР ГО N0:45) УЕГАЕОУСС (8Е(3 ГО N0:43) СЬУЕЕАЕОУ (ЗЕР ГО N0:47) СКЬУГЕАЕО (ЗЕр ГО N0:48) СУЕЕЛЕ0У6 (ЗЕр ГО N0:46) Гептамеры УЕЕАЕОУС (ЗЕр ГО N0:49) ЬУЕЕАЕОС (ЗВр ГО N0:50)
III. Копирование непрореагировавших лизиновых групп белка.
Непрореагировавшие лизиновые остатки кэпируют Ν-ацетилцистеином (СМСА; А1бпс11-Зрта) в соотношении 1:1 (вес./вес.) в течение 4 ч при 4°С при встряхивании в темноте. Непрореагировавшие пептиды и кэпирующие реагенты удаляют из конъюгатов диализом с применением кассеты ЗШе-А-Ьазет (Μν срез 10000) (Йетсе) против РВЗ буфера (2 л) в течение ночи (13 ч). Замену буфера и диализ проводят дважды (2x14 ч). Неполная растворимость наблюдается в конъюгатах КЬУРЕАЕОС (ЗЕр Ш N0:45) и СКЬУЕЕАЕЭ (ЗЕр Ш N0:48). Все конъюгаты хранят в холодильнике при 4°С с защитным покрытием.
IV. Характеристика белка-носителя.
МАЬЬЬТОЕ МЗ применяют для определения массы бромацетилированного СКМ197 и массы проверочного конъюгата №ацетилцистеамин-СКМ197.
На основании массы СКМ197 и бромацетилированного СКМ197 делают вывод, что модифицировано 11 лизиновых остатков.
(59941,46-58590,29)/122=11, где Μν СКМ197 составляет 58624,29,
Μν бромацетилированного СКМ197 составляет 59941,46,
Μν бромацетата составляет 122.
Степень бромацетилирования составляет более 28%. (Общее число лизиновых остатков в СКМ197 составляет 39). Из этих 11 модифицированных лизиновых остатков 10 связывается с цистеамином. Эффективность связывания составляет 90%.
(61143-59941)7119=10, где Μν бромацетилированного СКМ197 составляет 59941,46,
Μν проверочного конъюгата составляет 61143,
Μν Ν- ацетилцистеамина составляет 119 (10/11)х 100=90.
V. Характеристика конъюгатов с помощью ЗЭЗ-РАСЕ Вестерн-блоттинга.
Анализ с применением готового геля Тпз-Тпсше.
Конъюгаты белок-пептид анализируют Вестерн-блоттингом. Дорожки суть следующие: маркер (дорожка 1); Ь-28375 24/01 (дорожка 2); Ь-28375 24/02 (дорожка 3); Ь-28375 24/03 (дорожка 4); Ь-28375 24/04 (дорожка 5); Ь-28375 24/05 (дорожка 6); Ь-28375 24/06 (дорожка 7); Ь-28375 24/07 (дорожка 8); Ь-28375 24/08 (дорожка 9); Ь-28375 24/08 (проверочная) (дорожка 10); и ВтАсСКМ197 (дорожка 11). Пептидспецифическое моноклональное антитело мышей (248-6Н9-806 Αβ 17-28) используют в качестве первичного антитела (антисыворотки) (найдено, что наилучшим является разведение 1:3000). Вторичным антителом является антитело козы против мышиного (Н+Ь)-НРВ (разведение 1:1000). Наблюдают, что все конъюгаты узнаются первичным антителом, за исключением проверочного конъюгата и активированного СКМ197 (см. фиг. 10).
Концентрация белка.
Концентрации белка в образцах конъюгата определяют Р1егсе ВСА анализом (см. табл. 15). Аминокислотный анализ.
Аминокислотный анализ проводят для определения степени конъюгации, степень конъюгации рассчитывают на основании остатков СМСА (карбоксиметилцистеамина), обнаруживаемых после конъюгации. СМСА применяют для кэпирования непрореагировавших сайтов после конъюгации с пептидами (см. табл. 15).
- 36 009559
Таблица 15
Степень конъюгации пептидов с ВгАсСКМ197
Кац конъюгата Пептидная последовательность (5Еф ΟΝΟ:) Конечная копнеитрацнн (мт/мл) Степень конъюгации (поСМСА)
Ь-28375 24/01 ЬУЕЕАЕПУ-С (ЗЕЦ И) N0:44) 1.67 8/10
Ь-28375 24/02 КЬУРЕАЕО-С (8ΕρΠΟΝΟ:45) 0.82 5/10
Ь-28375 24/03 УЕЕАЕОУС-С (8Ε(2ΙΟΝΟ:43) 1.43 8/10
Ь-28375 24/04 С-ЬУГЕАЕОУ (5Е(2 Ю N0:47) 1.04 9/10
Ь-28375 24/05 С-КЬУИРАЕП (5Εζ> Ю N0:48) 0.78 1/10
Ь-28375 24/06 С-νΚΕΑΕϋνθ (5В0 ГО N0:46) 0.97 9/10
Ь-28375 24/07 νΤΡΑΕβν-Ο (8Εζ) Π) N0:49) 1.00 7/10
Ь-28375 24/08 1ЛГГГАВП-С 0.99 8/10
(БЕЦ Ю N0:50)
Ь-28375 24/09 (Моск) 1.89 10/11
Все колориметрические анализы проводят на спектрофотометре для микропланшет с применением ЗОРТшах Рго.
Пример 11.
Изучение иммуногенности конъюгатов Αβ-пептидов на мышах 8\\Ь5-\УсЬ51сг.
Аутбредных мышей 8\\155-\УсЬ51сг иммунизируют с помощью УЕЕАЕОУС-С (8Εζ) ГО N0:43), ЬУЕЕАЕОУ-С (8Εζ) ГО N0:44), КЬУЕЕАЕО-С (8Е<3 ГО N0:45), САТТАЕОУО (8Εξ> ГО N0:46), С-ЬУЕЕАЕОУ (8Εζ) ГО N0:47), С-КЬУЕЕАЕО (8Е<3 ГО N0:48), УЕЕАЕОУ-С (8Εξ> ГО N0:49), ЬУЕЕАЕО-С (8В0 ГО N0:50), каждый из которых конъюгирован с СКМ197, или с помощью Αβ 1-7СВМ|9-. все приготовлены с адъювантом ВС 529 8Е. Девять групп по 10 животных в группе иммунизируют подкожно одним из пептидных конъюгатов в начале исследования (неделя 0) и затем на 4 неделе. Сыворотку отбирают перед иммунизацией, но в тот же день.
Исследование иммуногенности конъюгатов Αβ-пептидов на инбредных мышах Ва1Ь/с.
Инбредных мышей Ва1Ь/с иммунизируют как в предыдущем абзаце, но повторно иммунизируют (бустерная инъекция) конъюгатом и адъювантом на 12 неделе.
Результаты.
Сыворотки от обоих исследований собирают для анализа титра антитела 1дС, специфического к пептиду Αβ13-28. Сыворотки мышей Ва1Ь/с также собирают для анализа за один день до бустерной инъекции на 12 неделе. Клетки селезёнки животных из примера 11 оценивают на их возможность отвечать ίη νίίτο на стимуляцию пулом перекрывающихся пептидов, охватывающих Αβι.42, полноразмерным Αβι_42, СВМ197 или поликлональными активаторами. Анализ включает считывания показаний реакции ΕΙίφοΙ для интерлейкинов 4 и 5 и интерферона гамма. По завершении Αβ-пептидные конъюгаты оценивают, как описано выше и в примере 6.
Пример 12.
Изучение иммуногенности Αβ-пептидных конъюгатов на мышах Р8АРР.
Мышей Р8АРР иммунизируют с помощью УЕЕАЕОУС-С (8Εζ) ГО N0:43), ЬУЕЕАЕОУ-С (8Е0 ГО N0:44), КЬУЕЕАЕО-С (8Εζ) ГО N0:45), С-УЕЕАЕОУ6 (8Εζ) ГО N0:46), С-ЬУЕЕАЕОУ (8Εζ) ГО N0:47), С-КЬУЕЕАЕО (8Е0 ГО N0:48), УЕЕАЕОУ-С (8Е0 ГО N0:49), ЬУЕЕАЕО-С (8В0 ГО N0:50). Мышь Р8АРР, дважды трансгенная мышь (Р8АРР), сверхэкспрессирующая мутантные АРР и Р81 трансгены, описаны в Но1сошЬ, с! а1. №1Шгс Месйсте. 1998, 4: 97-11.
Изучение иммуногенности Αβ-пептидных конъюгатов на мышах Ρϋ АРР.
Мышей РИАРР иммунизируют с помощью УЕЕАЕОУ6-С (8Е0 ГО N0:43), ЬУЕЕАЕОУ-С (8Е0 ГО N0:44), КЬУЕЕАЕО-С (8Εζ) ГО N0:45), С-УЕЕАЕОУ6 (8Εζ) ГО N0:46), С-ЬУЕЕАЕОУ (8Εζ) ГО N0:47), С-КЬУЕЕАЕО (8Е0 ГО N0:48), УЕЕАЕОУ- С (8Е0 ГО N0:49), ЬУЕЕАЕО-С (8В0 ГО N0:50). Мышь РОАРР экспрессирует мутантную форму человеческого АРР (ΑΡΡν71ρ), и у неё в раннем возрасте развивается болезнь Альцгеймера (Вал!, с! а1. №1Шгс Месйсте. 2000, 6: 916-919; Макйай Е, с! а1. 1. Νοιποδοί. 1996, 15; 16(18): 5795-811).
-37009559
Результаты.
Сыворотки в обоих исследованиях собирают для анализа титра 1дС антитела, специфического к Ав13-28 пептиду. По завершении Ав-пептидные конъюгаты оценивают, как описано выше и в примерах 6 и 11, а также анализируя выработку ситуативного страха (СРС).
Выработка ситуативного страха является обычной формой обучения, исключительно надёжной и быстро усваиваемой большинством животных, например млекопитающими. Испытуемые животные обучаются бояться нейтральных ранее раздражителей и/или окружения (среды) вследствие их ассоциации с аверсивным опытом, (см., например, Рап8е1оте, Атт. Ьеагп. ВеНауе. 18: 264-270 (1990); ХУеНпег е! а1., Уинге Сене!. 1997, 17: 331-334; Са1багопе с1 а1., ХаИие Сене!. 1997, 17: 335-337).
Выработка (условного рефлекса) ситуативного страха особенно применима для определения когнитивной функции или дисфункции, например, в результате заболевания или нарушения, такого как нейродегенеративное заболевание или нарушение, Ав-зависимое заболевание или нарушение, амилоидогенное заболевание или нарушение, наличие нежелательного генетического изменения, влияющего на когнитивную функцию (например, генетической мутации, дизрупции гена или нежелательного генотипа), и/или эффективности агента, например, Ав конъюгата, в отношении когнитивной способности. Следовательно, СРС анализ обеспечивает способ независимого тестирования/или оценки терапевтического действия агентов для предупреждения или лечения когнитивного заболевания или нарушения, и в частности заболевания или нарушения, влияющих на одну или более областей мозга, например гиппокамп, субикулум (основание), цингулярную кору, префронтальную кору, околоносовую область коры, сенсорную область коры и среднюю височную долю.
Обычно СРС анализ проводят, используя стандартные камеры для животных и обучение-выработка условного рефлекса, включающая слабый шок (например, шок в результате пропускания через лапу тока 0,35 мА) одновременно со слуховым (например, белый шум 85 дБ в течение некоторого периода), обонятельным (например, экстракт лимона или миндаля), осязательным (например, текстура дна клетки) и/или визуальным сигналом (световая вспышка). Ответ на аверсивный опыт (шок) обычно представляет собой замирание (отсутствие движения, за исключением дыхания), но может также включать моргание глазами или изменение рефлекса моргающей мембраны, в зависимости от выбранного опытного животного. Аверсивный ответ обычно характеризуют в первый день обучения, чтобы определить фон (базовую линию) для неситуативного страха, при этом аверсивный ответ возникает в последующие дни испытания, например, замирание при создании определённой ситуации и/или в присутствии сигнала, но в отсутствие аверсивного опыта, характеризуется как страх, обусловленный сигналом или ситуацией (сигнальный или ситуативный), соответственно. Для повышения надёжности опытных животных обычно тестируют отдельно независимые специалисты и оценивают в динамике. Дополнительные детали экспериментального дизайна можно найти, например, в СгаМеу, Ι.Ν., ХУНаХ ХУгопд \νί11ι ту Μοι.^; Вейауюга1 РНепоКртд о! Тгалкдешс апб кпоскои! Μ^, ^йеу-Шк, ΝΥ, 2000.
Типичные опытные животные (например, животные модели) включают млекопитающих (например, грызунов или нечеловеческих приматов), которые проявляют заметные симптомы или патологию, характерные для амилоидогенного нарушения, такого как болезнь Альцгеймера. Животные модели можно создать селективным инбридингом или их можно получить с помощью рекомбинантной ДНК трансгенными методами, общеизвестными в технике, такими как целенаправленное генетическое изменение (например, генетическая мутация, дизрупция гена) в гене, которое обусловлено деменцией, ведущее к аберрантной экспрессии или аберрантному функционированию целевого гена. Например, имеется несколько штаммов трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют АРР и у которых развивается патология в виде амилоидных бляшек и/или развивается когнитивная недостаточность, характерные для болезни Альцгеймера (см., например, Сате5 е! ай, кирга, 1оНп5оп-^ооб е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1 и8А. 1997, 94: 1550; ΜηκΗ/Πι Е. апб Роскеп51ет Ε. I. №ига1. Тгапкт. 8ирр1. 2000, 59: 175-83).
Или же животную модель можно создать, используя химические соединения (например, нейротоксины, анестетики), или хирургические методы (например, такие как стереотаксическая абляция, аксотомия, трансекция, аспирация), когда происходит удаление или иное вмешательство в нормальную функцию анатомической области мозга (например, гиппокампа, миндалевидного тела, околоносовой области коры, среднего септального ядра, голубого пятна, татта1агу Ьоб1С5) или специфических нейронов (например, серотонергических холинергических или допаминергических нейронов), которые связаны с характерными симптомами или патологией амилоидогенного нарушения. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения животная модель проявляет заметную когнитивную недостаточность, связанную с обучением или памятью, помимо нейродегенеративной патологией, обусловленной амилоидогенным нарушением. Более предпочтительно, когнитивная недостаточность значительно ухудшается с возрастом так что прогрессирование заболевания у животной модели соответствует прогрессированию заболевания у субъекта, страдающего от амилоидогенного нарушения.
Выработка ситуативного страха (условный рефлекс ситуативного страха) и другие ίπ у1уо анализы для проверки функциональности конъюгатов по данному описанию можно проводить на мышах дикого типа или мышах, имеющих определённое генетическое изменение, ведущее к ослаблению памяти или
- 38 009559 мышиной модели нейродегенеративного заболевания, например болезни Альцгеймера, включая мышиные модели, у которых наблюдаются повышенные уровни растворимого Αβ в спинномозговой жидкости (ликворе) (С8Е) или плазме. Например, животные модели болезни Альцгеймера включают трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют шведскую мутацию человеческого амилоидного белкапредшественника (ΙιΑΡΡδ^; Τд2576), что свидетельствует о возрастном ослаблении памяти и бляшках (Нв1ао е! а1. 8с1епсе. 1996, 274: 99-102). Ш νίνο функциональность конъюгатов по данному описанию можно также проверять на мутантной мыши Ρδ-1, описанной в ИиГГ, е! а1. №1Шге. 1996, 383, 710-713. Другие генетически изменённые трансгенные модели болезни Альцгеймера описаны в Мавкак Ε. апб Воскепв1ет Ε. ί. №ига1. Τπιπδΐη. διιρρί. 2000, 59: 175-83.
В различных аспектах способы по изобретению включают введение Αβ конъюгата, который способен улучшать познавательную способность субъекта, причём Αβ конъюгат идентифицируют с помощью анализа, который соответствующим образом предсказывает иммунотерапевтическую эффективность в отношении субъекта. В типичных примерах анализ является анализом на животной модели, основанным, по меньшей мере, частично, на сравнении познавательной способности, определённой при исследовании выработки ситуативной памяти, животного после введения животному тестируемого иммунологического реагента, по сравнению с соответствующим контрольным. СЕС анализ позволяет оценить изменения познавательной способности животного (обычно мыши или крысы) при обработке потенциальным терапевтическим соединением. В некоторых вариантах изобретения изменение познавательной способности представляет собой улучшение статуса нарушенной (ослабленной) памяти или реверсию ослабления памяти. Следовательно, анализ СЕС даёт прямой (непосредственный) метод определения терапевтического эффекта агентов по предупреждению или лечению когнитивного заболевания, и в частности заболевания или нарушения, влияющего на одну или более областей мозга, например на гиппокамп, субикулум (основание), цингулярную кору, префронтальную кору, околоносовую область коры, сенсорную область коры и среднюю височную долю. Такие СЕС анализы обсуждаются в одновременно рассматриваемой патентной заявке США, озаглавленной Выработка ситуативного страха для прогнозирования иммунотерапевтической активности, поданной 15 декабря 2004 г., и патентной заявке США, озаглавленной Выработка ситуативного страха для прогнозирования иммунотерапевтической активности.
Библиография
Вегпа!о^^, М.8., апб Майнеба, С.В. Αпа1уί^са1 Вюскет1в!гу. 1986, 155: 95-102.
Кшвкет, Ρ.Ι, апб МагЬигд, δ. Эеуе1ортеп1 апб Скшса1 Ивее оГ НаеторШив Ь Соп)ида1е νη^ίι^: Сон)ида!юп: Иевгдп, Скет1в!гу, апб Αпа1ув^в Ε11Ϊ8 В.^., апб СгапоГГ, И.М., Ббв; Магсе1 Иеккег, Мс: №\г Уогк, ΝΥ, 1994, 37-70.
Α^^^ζοи, V., В1еск1ег, В., Ситттдв, к, апб НаГЬаидк, ί. Н^дк-Ρе^Гο^тапсе кк|Мб С11гота1одгар11у оГ Ρеρ!^бе апб Ρ^ο!е^пв: Зерагайоп, Αпа1ув^в, апб СопГогтаНоп Мап!, Ο.Τ. апб Нобдев, В.8., Ббв; СВС Ρ^еββ: Воса Ва!оп, ЕЬ, 1991, 859-863.
Саг1ввоп, I. е! а1. Вюскет. I., 1978, 173: 723.
Меапв, Ο.Ε., Сапдбоп, ^.к, апб Вепбег, М.к Вюскет1вку. 1972, 11: 3564-3574.
С1еппег & ^опд. Вюскет. Вюркув. Вев. Соттип. 1984, 120: 1131.
Нагбу. ^епбв т №иговс1епсев. 1084, 20: 1131.
Нагбу. ^епбв т №иговс1епсев. 1977, 20: 154. 81ои!е е! а1. Ν. Бпд!. I. Меб. 1977, 336: 86-91.
СоеЬе1 е! а1. I. Εχρ. Меб. 1939, 69: 53.
8скпеегвоп е! а1. I. Εχρ. Меб. 1980, 152: 361-376.
Ски е! а1. Ыеск Митт. 1983, 40: 245.
8скпеегвоп е! а1. МГеск Iттип. 1984, 45: 582-591.
Αпбе^вοп е! а1. I. Ρеб^аί^. 1985, 107: 346.
Шве1 е!а1. I. Εχρ. Меб. 1986, 158: 294.
υδ Ρа!еп! № 4,673,574 1ип., 1987 Αпбе^вοп.
υδ Ρа!еп! № 4,902,506 ЕеЬ., 1990 Αпбе^вοп е! а1.
υδ Ρа!еп! № 5,192,540 Маг., 1993 Кио е! а1.
υδ Ρа!еп! № 5,306,492 Αρτ., 1994 Ρο^^ο.
υδ Ρа!еп! № 5,360,897 Ναν., 1994 Αпбе^вοп е! а1.
υδ Ρа!еп! № 5,785,973 1и1., 1998 В1х1ег е! а1.
υδ Ρа!еп! № 6,361,777 Маг., 2002 Ноодегкои!.
δатЬ^οοк е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬога!огу Мапиа1 (СХН. Ρ. Ρ^ев, ΝΥ, 2б еб., 1989).

Claims (37)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ конъюгации пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, содержащий стадии:
    а) дериватизации одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя или, необязательно, связанного с белковым/полипептидным носителем полипептидного линкера с образованием дериватизированной молекулы с реактивными сайтами;
    б) реакции дериватизированного белкового/полипептидного носителя со стадии (а) с реактивной группой аминокислоты пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, в таких условиях, при которых пептидный иммуноген конъюгируется с дериватизированным белковым/полипептидным носителем по меньшей мере по одному из реактивных сайтов, образуя при этом конъюгат;
    в) последующей реакции этого конъюгата с кэпирующим реагентом для инактивации свободных реакционных непрореагировавших сайтов на дериватизированном белковом/полипептидном носителе, в результате чего данный конъюгат вызывает заданный иммунный ответ против Αβ-пептида.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАЙКЕ полипептида, сиситкрого/йе (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад19-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулёзной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ497, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 8!гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдеиек ОКР1224, 81гер!ососсик рюдеиек ОКР1664, 81гер!ососсик рюдеиек ОКР2452, пневмолизина 8!гер!ососсик риеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, С11атуб1а риеитошае ОКЕ Т367, С11атуб1а риеитошае ОКЕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СКАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель представляет собой СКМ197.
  4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент.
  5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что Αβ фрагмент выбирают из группы, состоящей из Аβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что Αβ фрагмент представляет собой Αβ1-7.
  7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового/полипептидного носителя или, необязательно, связанного полипептидного линкера дериватизирована с помощью сшивающего реагента.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель реагирует с галогенацетилирующим агентом.
  9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что кэпирующий реагент, который применяют для инактивации свободных реактивных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, выбирают из группы реагентов, состоящей из цистеамина, Ν-ацетилцистеамина, этаноламина, гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
  10. 10. Способ конъюгации пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, с белковым/полипептидным носителем, имеющим структуру где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
    X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, содержащий стадии:
    а) дериватизации одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя или необязательно связанной молекулы линкера с образованием дериватизированной молекулы с реактивными сайтами;
    б) реакции дериватизированного белкового/полипептидного носителя со стадии (а) с реактивной
    - 40 009559 группой аминокислотного остатка пептидного иммуногена, содержащего Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, с образованием ковалентно связанного конъюгата: пептидный иммуногенбелковый/полипептидный носитель;
    в) последующей реакции указанного конъюгата с кэпирующим реагентом для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, в ре зультате чего кэпированные группы не могут реагировать с другими молекулами, тем самым защищается функциональность носителя, т. е. он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, что в отсутствие носителя было бы невозможно, при этом образуется кэпированный конъюгат: пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель, имеющий формулу где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
    Хб обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    Р обозначает молекулу пептидного иммуногена, содержащую Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белка-носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    К обозначает кэпирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, связанного с белковым/полипептидным носителем;
    п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
    р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
  11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, ΡΑΟΚΕ полипептида, сйситкрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НΒ8Αд19-28), белка теплового шока (Ή8Ρ) 65, МусоЬасГегшт ГиЬегси1ок1к (туберкулёзной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 8ГгерГососсик рюдеиек ОКЕ1224, 8ГгерГососсик рюдеиек ОКЕ1664, 81гер1ососсик рюдепек ОКЕ2452, пневмолизина 8ГгерГососсик рпеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, Сй1атуб1а рпеитошае ОКЕ Т367, СЪ1атуб1а рпеитошае ОКЕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СК^ММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель представляет собой СКМ197.
  13. 13. Способ по п.10, отличающийся тем, что пептидный иммуноген представляет собой Αβ фраг мент.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что Αβ фрагмент выбирают из группы, состоящей из Аβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42.
  15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что Αβ фрагмент представляет собой Αβ1-7.
  16. 16. Способ по п.10, отличающийся тем, что функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового/полипептидного носителя или, необязательно, связанного полипептидного линкера дериватизирована с помощью сшивающего реагента.
  17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель реагирует с галогенацетилирующим агентом.
  18. 18. Способ по п.10, отличающийся тем, что кэпирующий реагент, который применяют для инактивации свободных реактивных функциональных групп активированного белкового/полипептидного носителя, выбирают из группы реагентов, состоящей из цистеамина, Ν-ацетилцистеамина, этаноламина, гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
    - 41 009559
  19. 19. Конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель имеет формулу (Χλη где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
    X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, причём конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель имеет формулу где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
    X'1 обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    Р обозначает пептидный иммуноген, содержащий Ав-пептид, или фрагменты Ав, или его аналоги, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белканосителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    К обозначает кэпирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, в результате чего он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, содержащего Ав-пептид, или фрагменты Ав, или его аналоги, чего в отсутствие носителя не могло бы произойти;
    η обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
    р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
  20. 20. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАЭКЕ полипептида, спситкрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад19-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулёзной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 81герЮсоссик рюдег1ек ОКЕ1224, 8!гер!ососсик рюдег1ек ОКЕ1664, 8!гер!ососсик рюдегюк ОКЕ2452, пневмолизина 8!гер!ососсик рηеитοη^ае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, СЬ1атуб1а рηеитοη^ае ОКЕ Т367, СЬ1атуб1а рηеитοη^ае ОКЕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СКАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  21. 21. Конъюгат по п.20, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель представляет собой СКМ197.
  22. 22. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что пептидный иммуноген представляет собой Ав фраг мент.
  23. 23. Конъюгат по п.22, отличающийся тем, что Ав фрагмент выбирают из группы, состоящей из Ав1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42.
  24. 24. Конъюгат по п.23, отличающийся тем, что Ав фрагмент представляет собой Ав1-7.
  25. 25. Конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель, полученный способом по п.10 и имеющий формулу где С обозначает белковый/полипептидный носитель;
    - 42 009559
    Хб обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    Р обозначает пептидный иммуноген, содержащий Αβ-пептид, или фрагменты Αβ, или его аналоги, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белканосителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем;
    В обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, в результате чего он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, чего в отсутствие носителя не могло бы произойти;
    п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85;
    р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
  26. 26. Конъюгат по п.25, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, ΡΑΌΒΕ полипептида, с1гситкрого/Не (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (ΗΒ8Αд19-28), белка теплового шока (Ή8Ρ) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулёзной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СВМ197, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 8!гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдепек 0ВР1224, 8!гер!ососсик рюдепек 0ВР1664, 8!гер!ососсик рюдепек ОΒΡ2452, пневмолизина 8!гер!ососсик рпеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, С111атуб1а рпеитошае 0ВР Т367, СЫатуб1а рпеитошае 0ВР Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (Μ8СΒΑΜΜ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  27. 27. Конъюгат по п.26, отличающийся тем, что белковый/полипептидный носитель представляет собой СВМ197.
  28. 28. Конъюгат по п.25, отличающийся тем, что пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент.
  29. 29. Конъюгат по п.28, отличающийся тем, что Αβ фрагмент выбирают из группы, состоящей из Αβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42.
  30. 30. Конъюгат по п.29, отличающийся тем, что Αβ фрагмент представляет собой Αβ1-7.
  31. 31. Иммуногенная композиция, содержащая конъюгат пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, полученный способом по п.10, совместно с одним или более фармацевтически приемлемым оксципиентом, разбавителем и/или адъювантом.
  32. 32. Иммуногенная композиция по п.31, отличающаяся тем, что белковый/полипептидный носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, ΡΑ^ΒΕ полипептида, сйситкрого/Не (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (ΗΒ8Αд19-28), белка теплового шока (Ή8Ρ) 65, МусоЬас1егшт !иЬегси1ок1к (туберкулёзной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СВМ197, перекрёстно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 8!гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдепек 0ВР1224, 8!гер!ососсик рюдепек 0ВР1664, 8!гер!ососсик рюдепек 0ВР2452, пневмолизина 8!гер!ососсик рпеитошае, мутантов пневмолизина с пониженной токсичностью, СЫашуб1а рпеитошае 0ВР Т367, СЫатуб1а рпеитошае 0ВР Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (Μ8СΒΑΜΜ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  33. 33. Иммуногенная композиция по п.32, отличающаяся тем, что белковый/полипептидный носитель представляет собой СВМ197.
  34. 34. Иммуногенная композиция по п.31, отличающаяся тем, что пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент.
  35. 35. Иммуногенная композиция по п.34, отличающаяся тем, что Αβ фрагмент выбирают из группы, состоящей из Αβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 и 35-42.
  36. 36. Иммуногенная композиция по п.35, отличающаяся тем, что Αβ фрагмент представляет собой Αβ1-7.
  37. 37. Иммуногенная композиция по п.31, отличающаяся тем, что один или более адъювантов выбирают из группы, состоящей из ОМ-С8Р, 529 8Е, 1Ь-12, фосфата алюминия, гидроксида алюминия, Мусо
EA200601168A 2003-12-17 2004-12-17 КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ EA009559B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53048103P 2003-12-17 2003-12-17
PCT/US2004/044093 WO2005058941A2 (en) 2003-12-17 2004-12-17 Aβ IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200601168A1 EA200601168A1 (ru) 2006-12-29
EA009559B1 true EA009559B1 (ru) 2008-02-28

Family

ID=34700143

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702209A EA011239B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
EA200601168A EA009559B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702209A EA011239B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Country Status (26)

Country Link
US (5) US8227403B2 (ru)
EP (4) EP2460813A1 (ru)
JP (1) JP4696079B2 (ru)
KR (2) KR101201120B1 (ru)
CN (1) CN1934127B (ru)
AR (1) AR047062A1 (ru)
AU (2) AU2004299512B2 (ru)
BR (1) BRPI0417689A8 (ru)
CA (1) CA2549552A1 (ru)
CR (1) CR8445A (ru)
DK (1) DK2336147T3 (ru)
EA (2) EA011239B1 (ru)
EC (1) ECSP066646A (ru)
ES (1) ES2474173T3 (ru)
HK (2) HK1104826A1 (ru)
IL (2) IL176250A (ru)
MX (1) MXPA06006821A (ru)
MY (1) MY144231A (ru)
NO (1) NO20062765L (ru)
PL (1) PL2336147T3 (ru)
PT (1) PT2336147E (ru)
SG (2) SG149039A1 (ru)
SI (1) SI2336147T1 (ru)
TW (2) TWI357414B (ru)
UA (1) UA84728C2 (ru)
WO (1) WO2005058941A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2533806C2 (ru) * 2009-05-26 2014-11-20 Араклон Байотек С.Л. Способ лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков (варианты)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CN1745175A (zh) * 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
SG182163A1 (en) * 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
PT2336147E (pt) * 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
EP1711208A2 (en) * 2004-01-28 2006-10-18 Curix APS Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases
ZA200703561B (en) * 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
ES2402650T3 (es) * 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2008011348A2 (en) 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
US8080645B2 (en) * 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
US8652782B2 (en) 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
WO2008124646A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 The Government Of The U.S.A, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Use of amyloid proteins as vaccine scaffolds
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2149584B1 (en) * 2007-04-20 2017-12-13 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for enhancing immune response with peptide
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
EP2185196B1 (en) 2007-08-27 2014-06-11 Longhorn Vaccines & Diagnostics, LLC Immunogenic compositions and methods
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
EP3020832A1 (en) 2007-10-01 2016-05-18 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Biological specimen collection and transport system and methods of use
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
CA2701793C (en) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
ITNA20080006A1 (it) * 2008-01-28 2009-07-29 Consiglio Nazionale Ricerche Proteine chimeriche capaci di formare particelle virus-like, che contengono sequenze peptidiche del beta-amiloide e la componente e2 della alfachetoacido deidrogenasi di "geobacillus stearothermophilus", utili per l'induzione di una risposta anticorp
WO2010016912A2 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Mercia Pharma, Llc Immunotherapeutic compositions for the treatment of alzheimer's disease
JP5474807B2 (ja) * 2008-10-16 2014-04-16 一般財団法人化学及血清療法研究所 改変アミロイドβペプチド
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
DE102008037564A1 (de) * 2008-11-19 2010-05-20 Forschungszentrum Jülich GmbH Zusammensetzung zur Herstellung von anti-Amyloid beta-Peptid-Antikörpern mit D-Peptiden
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
CN102279269A (zh) * 2011-04-12 2011-12-14 王贤俊 胱抑素c检测剂盒的制备方法
BR112013030963B1 (pt) * 2011-06-01 2020-12-01 Xiamen University proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo
WO2013013056A1 (en) * 2011-07-19 2013-01-24 New York University Method for treating amyloid disease
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US9504759B2 (en) 2011-08-11 2016-11-29 Bar-Ilan University Surface modified proteinaceous spherical particles and uses thereof
KR102129220B1 (ko) * 2011-09-23 2020-07-02 에이씨 이뮨 에스.에이. 백신 요법
CN104203272A (zh) 2012-01-26 2014-12-10 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 复合抗原序列及疫苗
SI2668959T1 (sl) * 2012-05-31 2015-03-31 Innavirvax Genopole Enterprises Imunogenske spojine, ki vsebujejo HIV gp41 peptid, spojen z nosilnim proteinom CRM197
KR101451797B1 (ko) * 2012-11-07 2014-10-16 가천대학교 산학협력단 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체
BR112016001775A2 (pt) * 2013-07-31 2017-09-05 Univ Arkansas Composição, métodos de tratamento de um humano que foi diagnosticado com câncer, de prevenção de câncer em um humano com alto risco de ter câncer e de produção de uma composição, de uma população de células nk humanas antitumorais isoladas e de uma população de células dendríticas humanas antitumorais isoladas, células nk e dendríticas humanas isoladas, e, kit
EP2870974A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN104069504B (zh) * 2014-05-11 2019-09-24 江苏康泰生物医学技术有限公司 一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法
US10428112B2 (en) * 2014-06-11 2019-10-01 Riken Multiplexed same type-antigenic peptide
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3294448A4 (en) 2015-05-14 2018-12-12 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
EP4147715A1 (en) * 2016-07-21 2023-03-15 VAC4all Pte. Ltd. Biofusion proteins as anti-malaria vaccines
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CA3095216A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 University Of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
WO2020257315A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Citranvi Biosciences, Llc Multiple antigen protein displayed adjuvant systems
CA3197971A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Andrew Lawrence Feldhaus Protein-based nanoparticle vaccine for metapneumovirus
AU2021409394A1 (en) 2020-12-21 2023-07-27 Cornell University Peptide-linked drug delivery system
CN114137203A (zh) * 2021-10-21 2022-03-04 广州万孚生物技术股份有限公司 抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法
WO2023225562A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Icosavax, Inc. Multivalent vaccine for paramyxoviruses and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5866129A (en) * 1989-06-21 1999-02-02 Tanox Biosystems, Inc. Method of producing an antibody with a peptide corresponding to membrane-bound IgA
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
US20030135035A1 (en) * 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
US20030207828A1 (en) * 1996-12-05 2003-11-06 Tetsuyoshi Ishiwata IgA nephropathy-related DNA

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2982084A (en) * 1957-05-29 1961-05-02 Ebauches Sa Alarm device
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US5360897A (en) 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5192540A (en) 1988-04-19 1993-03-09 American Cyanamid Company Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
WO1993013302A1 (de) 1991-12-23 1993-07-08 Michael Zoche Motor mit einer vorrichtung zur entölung
AU685047B2 (en) * 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
ATE244769T1 (de) 1992-10-01 2003-07-15 Univ Columbia Komplexe kombinatorische chemische banken, die mit markierungen versehen sind
DE69434079T2 (de) 1993-03-05 2005-02-24 Wyeth Holdings Corp. Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin
ES2318848T3 (es) 1993-09-14 2009-05-01 Pharmexa Inc. Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
CA2175587A1 (en) 1993-11-02 1995-05-11 Jeffrey H. Sugarman Synthesizing and screening molecular diversity
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
IL115933A0 (en) 1995-11-09 1996-01-31 Oramir Semiconductor Ltd Process and apparatus for oblique beam revolution for the effective laser stripping of sidewalls
ES2203722T3 (es) 1995-11-10 2004-04-16 Elan Corporation, Plc Peptidos que faccilitan el transporte a traves de tejidos y metodos de identificarlos y usarlos.
CA2269074A1 (en) 1996-10-23 1998-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
DK0848011T3 (da) 1996-12-16 2001-07-16 Nederlanden Staat Køleelement og køleanordning
US5877220A (en) * 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
GB2333706A (en) 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
KR20070039615A (ko) 1998-02-27 2007-04-12 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법
US6645503B1 (en) * 1998-03-10 2003-11-11 Wyeth Holdings Corporation Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria
CA2264970A1 (en) 1998-03-10 1999-09-10 American Cyanamid Company Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria
US20050059591A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
EP1117435B1 (en) 1998-09-30 2007-11-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
US6245015B1 (en) * 1998-12-07 2001-06-12 General Electric Company Photosonic diffusion wave-based tumor detector
EP1156825A2 (en) * 1999-02-25 2001-11-28 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
US6945135B1 (en) * 1999-09-09 2005-09-20 L. H. Thomson Company, Inc. Bicycle stem for enlarged handlebar portions and associated methods
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
AU784312B2 (en) * 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1259251B1 (en) 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
US20030190322A1 (en) * 2000-03-31 2003-10-09 Peter Kaastrup Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
DE60108111T2 (de) * 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP2004509846A (ja) * 2000-06-02 2004-04-02 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 肝炎ｃ型ウイルスコンジュゲート
US7033593B2 (en) 2000-09-22 2006-04-25 Duke University Immunogen comprising an HIV envelope protein, a ligand and H2 peptide
BR0115271A (pt) 2000-11-10 2005-12-13 Wyeth Corp Composição antigênica, método para incrementar a capacidade de uma composição antigênica em elicitar a resposta imunológica de um hospedeiro vertebrado, em elicitar linfócitos t citotóxicos em um hospedeiro vertebrado, em elicitar um efeito terapêutico ou profilático anti-câncer em um hospedeiro vertebrado, em moderar uma resposta alérgica em um hospedeiro vertebrado, e em prevenir ou tratar doença caracterizada por deposição amilóide em um hospedeiro vertebrado, e, formulação adjuvante
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
US20030224011A1 (en) * 2001-05-29 2003-12-04 Conley Anthony J Hepatitis c virus conjugates
KR100898648B1 (ko) 2001-06-07 2009-05-22 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제로서 콜레라 홀로톡신의 돌연변이체 형태
IL159209A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
ES2361907T3 (es) 2001-12-20 2011-06-24 Randox Laboratories Ltd. Haptenos, inmunógenos, anticuerpos y conjugados para lsd 2-oxo-3-hidroxi.
FR2833840B1 (fr) * 2001-12-21 2010-06-18 Rytek Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires
AU2003231279A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Wyeth Holdings Corporation Prevention and treatment of type 2 diabetes
AU2003230155A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method of correcting an erroneous frame by a receiver
BR0317747A (pt) * 2002-12-24 2005-11-22 Neurochem Int Ltd Método de tratamento terapêutico concomitante de um indivìduo, composição farmacêutica, kit, uso de um primeiro agente e um segundo agente, e, métodos de prevenir ou tratar uma doença relacionada com amilóide-b, doença de alzheimer e insuficiência cognitiva suave
KR20060035581A (ko) * 2003-03-07 2006-04-26 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 병원내 감염에 대한 면역화에 유용한다당류-스타필로코커스 표면 부착소 운반체 단백질 접합체
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CN100409896C (zh) * 2003-03-31 2008-08-13 姚志彬 一种老年性痴呆疫苗及其制备方法
PT2336147E (pt) 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
SG182163A1 (en) 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
JP5045349B2 (ja) 2007-10-01 2012-10-10 パナソニック株式会社 左手系フィルタ

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866129A (en) * 1989-06-21 1999-02-02 Tanox Biosystems, Inc. Method of producing an antibody with a peptide corresponding to membrane-bound IgA
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US20030207828A1 (en) * 1996-12-05 2003-11-06 Tetsuyoshi Ishiwata IgA nephropathy-related DNA
US6962984B2 (en) * 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
US20030135035A1 (en) * 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2533806C2 (ru) * 2009-05-26 2014-11-20 Араклон Байотек С.Л. Способ лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков (варианты)
US9163062B2 (en) 2009-05-26 2015-10-20 Aracion Biotech S.L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004299512B2 (en) 2010-11-25
US20080145373A1 (en) 2008-06-19
BRPI0417689A (pt) 2007-04-03
HK1104826A1 (en) 2008-01-25
UA84728C2 (ru) 2008-11-25
MY144231A (en) 2011-08-15
BRPI0417689A8 (pt) 2017-04-25
IL213156A (en) 2014-05-28
AU2004299512A1 (en) 2005-06-30
US8227403B2 (en) 2012-07-24
KR101201120B1 (ko) 2012-12-03
AU2011200785A1 (en) 2011-03-17
EP2336147B1 (en) 2014-04-30
AR047062A1 (es) 2006-01-04
SG149039A1 (en) 2009-01-29
EP2460813A1 (en) 2012-06-06
US9095536B2 (en) 2015-08-04
KR20070026363A (ko) 2007-03-08
EP1699810A2 (en) 2006-09-13
SI2336147T1 (sl) 2014-08-29
US20120207706A1 (en) 2012-08-16
IL176250A (en) 2011-11-30
DK2336147T3 (da) 2014-06-10
NO20062765L (no) 2006-09-14
WO2005058941A3 (en) 2006-06-01
MXPA06006821A (es) 2006-08-23
PT2336147E (pt) 2014-07-16
US9089510B2 (en) 2015-07-28
ECSP066646A (es) 2006-12-20
EP2479184A2 (en) 2012-07-25
US20070161088A1 (en) 2007-07-12
CN1934127A (zh) 2007-03-21
EP2336147A3 (en) 2011-07-27
IL213156A0 (en) 2011-07-31
EP2479184A3 (en) 2013-09-04
EA200702209A1 (ru) 2008-02-28
IL176250A0 (en) 2006-10-05
CN1934127B (zh) 2015-08-19
EA200601168A1 (ru) 2006-12-29
CA2549552A1 (en) 2005-06-30
AU2011200785B2 (en) 2012-12-06
EA011239B1 (ru) 2009-02-27
KR20110117210A (ko) 2011-10-26
US20080299074A1 (en) 2008-12-04
JP2007534650A (ja) 2007-11-29
ES2474173T3 (es) 2014-07-08
EP2336147A2 (en) 2011-06-22
TW200533679A (en) 2005-10-16
KR101158147B1 (ko) 2012-07-17
US20110287042A1 (en) 2011-11-24
EP1699810A4 (en) 2009-10-21
SG182189A1 (en) 2012-07-30
JP4696079B2 (ja) 2011-06-08
HK1157795A1 (en) 2012-07-06
TWI379839B (en) 2012-12-21
TW201206956A (en) 2012-02-16
CR8445A (es) 2008-02-20
US9125847B2 (en) 2015-09-08
WO2005058941A2 (en) 2005-06-30
TWI357414B (en) 2012-02-01
PL2336147T3 (pl) 2015-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009559B1 (ru) КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
EA010060B1 (ru) Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
ARUMUGHAM et al. Patent 2549132 Summary
MXPA06006822A (en) Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU