KR20070039615A - 백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법 - Google Patents

백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법 Download PDF

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KR20070039615A
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데이비드 비. 와이너
종 제이. 김
정임 신
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 개선된 백신을 개시하고 있다. 개선된 백신은 외래 항원 및 약독화된 생백신을 전달하기 위한 DNA 백신, 재조합 백신을 포함한다. 본 발명은 개체를 면역시키는 방법을 개시하고 있다. 본 발명은 자가 면역 질환이 있는 개체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시하고 있다.
면역 조절 단백질, 개선된 백신, 약독화된 생백신, DNA 백신, 재조합 백신, 자가 면역 질환

Description

백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법 {Vaccines, Immunotherapeutics and Methods for Using the Same}
도 1a 및 도 1b는 실시예 2에서 논의된 바와 같은 프로세싱전 및 성숙 IL-18을 도시한 것이다.
도 2는 pCDNA3 발현 벡터에 클로닝된 ICAM-1(pCICAM-1), LFA-3(pCLFA-3) 및 VCAM-1(pCVCAM-1)을 나타낸다.
본 발명은 개선된 백신, 면역원에 대해 개체를 예방 및(또는) 치료적으로 면역시키는 개선된 방법 및 개선된 면역 치료 조성물 및 개선된 면역 치료 방법에 관한 것이다.
본 출원은 본원에 참고로 포함된 1998년 2월 27일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Improved Vaccines"의 미국 출원 제 60/076,207호를 기초로 하여 우선권을 주장하고 있다. 면역 치료법은 바람직한 치료 효과를 주도록 개체의 면역 반응을 조절하는 것을 의미한다. 면역 치료제는, 개체에게 투여될 경우, 바람직하지 못한 면역 반응에 의해 발생되는 증상 및 증상의 원인을 감소시키거나, 바람직한 면역 반응을 증가시켜 증상을 약화시키거나 증상의 원인을 제거/감소시키기에 충분한 개체의 면역을 조절하는 조성물을 의미한다.
일부 경우에, 면역 치료법은 개체를 면역원에 노출시키는 백신을 개체에게 투여하는 백신 처리 방법의 일부분이 될 수 있다. 상기 경우에는, 면역치료제는 면역 반응의 증가시키고(시키거나) 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킨다. 일부 경우에는 면역치료제는 면역원 없이 전달될 수 있다. 이 경우, 면역 치료제는 면역반응의 감소 또는 억제, 면역 반응의 상승 또는 증가, 면역계의 일부의 감소 또는 억제, 면역계의 일부의 상승 또는 증가에 의해 면역계를 조절하도록 제공된다. 일부 경우에는, 면역치료제는 생체 내로 투여될 때 면역 반응의 조절에 관계하는 단백질에 결합하는 항체를 포함한다. 항체와 상기 단백질과의 상호 작용은 면역 반응을 변화시킨다. 단백질이 자가 면역 질병과 관련될 때, 항체는 자가 면역 질환에서의 활성을 억제하고 증상 또는 질환을 감소 또는 제거할 수 있다.
백신은 표적 항원, 예를 들어 알레르기원, 병원균 항원 또는 사람 질환과 관련된 세포와 연관된 항원에 대해 개체를 면역시키는 데 유용하다. 사람 질환과 관련된 세포와 연관된 항원은 암 연관 종양 항원 및 자가 면역 질환과 관련된 세포와 연관된 항원을 포함한다.
상기 백신을 고안하는 데 있어, 백신 처리된 개체의 세포 내에서 표적 항원을 생산하는 백신이 면역계의 세포내 반응을 유도하는 데 효과적임이 알려져 있다. 특히, 생약독화 백신, 비독성 벡터를 이용하는 재조합 백신 및 DNA 백신은 모두 면 역계의 세포 반응을 유도하여 백신 처리된 개체의 세포 내에서 항원을 생산시킨다. 한편, 체액성 반응을 유도하는, 단백질만을 포함하는 서브유닛 백신 및 사멸 또는 불활성화된 백신은 효과있는 세포 면역 반응을 유도하지 못한다.
세포 면역 반응은 병원균 감염에 대해 보호를 제공하고, 병원균 감염, 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 효과적인 면역 매개 치료법을 제공하는 데 흔히 필요하다. 따라서, 백신처리된 개체의 세포내에서 표적 항원을 생산하는 백신, 예를 들어 생약독화 백신, 비독성의 벡터를 이용하는 재조합 백신 및 DNA 백신이 바람직하다.
상기 백신이 병원균 감염 또는 사람 질환에 대해 예방적 또는 치료적으로 개체를 면역화시키는 데 종종 효과적이지만, 개선된 백신에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 개선된 백신을 제공하고, 상기 백신을 이용하여 개체를 자가 면역 질환이 있는 개체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
<발명의 요약>
본 발명은 면역 조절 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 면역 반응을 상승 및(또는) 조절하는 조성물과 상기 단백질 및 핵산 분자를 이용하는 방법에 관한 것이다. 면역 조절 단백질의 운반은 면역 치료법 및 백신 운반과 관련된 면역 반응을 상승시키거나 적응시키는 데 유용하다. 면역 조절 단 백질에는 MCP-1, MIP-1α , MIP-1β , IL-8 및 RANTES를 포함하는 케모카인, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 같은 셀렉틴을 포함하는 부착 분자, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1과 같은 뮤신-유사 분자, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95와 같은 인테그린 패밀리의 일원, PECAM, ICAMs 예를 들어 ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3과 같은 면역글로불린 수퍼 패밀리의 일원, M-CSF, G-CSF, GSF, IL-4, IL-18의 변이형을 포함하는 사이토카인, CD40 및 CD40L과 같은 동시 자극 분자, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하는 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6를 포함하는 수용체 분자 및 그외에 Caspase(ICE)가 있다.
본 발명은 진핵 세포 내에서 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 진핵 세포 내에서 발현에 필요한 조절 성분와 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 면역원은 바람직하게는 병원균 항원, 암-관련 항원 또는 자기면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대한 면역 반응을 개체 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 세포 내 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분와 작동 가능하게 연결된 면역원(여기서, 면역원은 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원임)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균, 암 또는 자가 면역 질환에 대해 개체를 면역화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 진핵 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 진핵 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 면역원은 병원균 항원, 암-관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포와 연관된 항원이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원(여기서, 면역원은 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포와 연결된 항원임)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균, 암 또는 자가 면역 질환에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결 된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 진핵 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 진핵 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개선된 재조합 백신 벡터에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 표적 항원은 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환관 관련된 세포에 연결된 항원이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 표적 항원(여기서, 표적 항원은 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원임)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백신 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균, 암 또는 자가 면역 질환에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백신 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 진핵 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개선된 생약독화 백신에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약독화 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균, 암 또는 자가 면역 질환에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 세포 내의 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약독화 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대한 면역 반응을 개체 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 개체의 면역계를 조절하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 면역 조절 단백질의 투여, 또는 발현 벡터 또는 발현 가능한 형태로 뉴클레오티드 서열을 개체에 운반할 수 있는 다른 담체의 일부로서 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 투여에 의해 면역 조절 단백질을 개체에 운반하는 것을 포함한다.
본 발명은 자가 면역 질환 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것 이다. 본 발명의 방법은 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, 및 RANTES를 포함하는 케모카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 상기 환자에 투여하는 것을 포함한다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 특정 단백질이 면역 반응을 상승 및(또는) 조절한다는 발견에서 시작되었다. 따라서, 상기 단백질은 면역 치료제 또는 백신의 구성 성분으로서 운반될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "면역 조절 단백질"은 면역 반응을 상승 및(또는) 조절하는 본 발명에 따른 단백질 및 핵산 분자 발현 산물을 나타낸다. 따라서, 면역 조절 단백질은 면역 치료제 또는 백신의 구성 성분으로서 운반될 수 있다.
면역 조절 단백질은 케모카인, 부착 분자, 사이토카인, 동시 자극 분자, 성장 인자 및 수용체 분자를 포함한다.
면역 조절 단백질인 케모카인은 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 및 MCP-1을 포함한다.
면역 조절 단백질인 부착 분자는 셀렉틴 패밀리의 일원, 뮤신 유사 분자, 인테그린 패밀리의 일원 및 면역글로불린 수퍼 패밀리의 일원을 포함한다.
셀렉틴 패밀리의 일원은 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴을 포함하는 면역 조절 단백질이다.
뮤신 유사 분자는 셀렉틴 패밀리 일원의 리간드이다. 면역 조절 단백질인 뮤신 유사 분자는 CD34, GlyCAM-1 및 MAdCAM-1을 포함한다.
면역 조절 단백질인 인테그린 패밀리의 일원은 LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95을 포함한다.
면역 조절 단백질인 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 일원에 PECAM, ICAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 및 LFA-3이 포함된다.
면역 조절 단백질인 사이토카인에는 M-CSF, GM-CSF, G-CSF, GSF, IL-4 및 성숙형에는 존재하지 않으나 단백질의 전구형에 존재하는 처음 약 35개의 아미노산 잔기가 결실된 IL-18의 변이형이 포함된다.
면역 조절 단백질인 동시 자극 분자에는 CD40 및 CD40 리간드(CD40L)이 포함된다.
면역 조절 단백질인 성장 인자에는 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자가 포함된다.
면역 조절 단백질인 수용체 분자에는 Fas "사멸 유전자" 발현 산물, 종양 괴사 인자 TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6이 포함되며, 그외에 Caspase(ICE)가 포함된다.
기타 분자에는 Caspase-1(ICE)이 포함된다.
본 발명의 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질은 세포에 획득되어 발현됨으로써 면역 조절 단백질을 생산하는 핵산 분자를 투여함으로써 전달된다. 본 발명의 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질은 단백질 그 자체를 투여함으로써 전 달된다. 본 발명의 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질은 핵산 분자 또는 단백질을 투여함으로써 전달된다. 본 발명의 일부 실시 태양에서는, 면역 조절 단백질은 핵산 분자 및 단백질을 동시에 투여하여 전달된다.
본 발명의 일부 실시 태양에서는, 면역 조절 단백질은 단백질 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자로서 백신 조성물의 구성 성분으로서 또는 백신 조성물과 함께 보조제로서 투여될 수 있다. 백신은 서브유닛 백신, 사멸 백신, 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 경우, 면역 조절 단백질은 이들 백신의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다.
면역 조절 단백질은 세포 독성의 T 세포(CTL) 반응의 유도 및 상승 및(또는) 항체 반응의 유도 및 상승 및(또는) T 세포 증식 반응의 유도 및 상승에 유용하다.
CTL 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 세포내 병원균 또는 자가 면역 질환 또는 암에 관련된 세포에 대한 백신과 함께 또는 백신의 일부로서 투여될 때 특히 유용하다. CTL 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질을 특히 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 및 핵산/DNA 백신과 함께 투여될 때 유용하다. 별법으로, CTL 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 암 또는 세포내 감염에 걸린 환자에 투여되는 면역 치료제로 유용하다. CTL 반응을 유도 및 상승 시키는 면역 조절 단백질은 면역능이 손상된 환자에 투여 시 유용하다.
항체 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 특히 세균, 그외 세포외 병원균 또는 B 형 간염 바이러스와 같이 항체 반응이 방어하는 바이러스에 대한 백신과 함께 또는 백신의 일부로 투여될 때 유용하다. 항체 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 특히 서브유닛 백신과 함께 투여될 때 유용하다. 별법으로, 항체 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 바람직하지 않은 CTL 면역 반응을 갖는 환자에 투여되는 면역 치료제로서 유용하다. 상기 환자의 면역계의 변화는 CTL 반응에 의해 유발되는 병변을 감소시킨다. 항체 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 면역능이 손상된 환자에 투여될 때 유용하다.
T 세포 증식 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 특히 백신과 함께 또는 백신의 일부로서 투여될 때 유용하다. 별법으로, T 세포 증식 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 면역 치료제로서 유용하다. T 세포 증식 반응을 유도 및 상승시키는 면역 조절 단백질은 면역능이 손상된 환자에 투여될 때 융용하다.
케모카인:
케모카인 또는 케모카인을 코딩하는 핵산 분자의 투여는 세포의 케모카인 발현을 증가시킨다.
MCP-1은 특히 CD8++ CTL의 유도 및 상승에 유용하다.
MIP-1α는 특히 항체 유도에 유용하다.
IL-8은 특히 항체의 유도에 유용하며, T 헬퍼 반응의 강한 유도물질이다.
RANTES는 TH1 반응 및 CTL 반응을 유도한다.
MIP-1β는 예를 들어, pCDNA3에 클로닝되어 pCDNA3-MIP-1β를 제조할 수 있 는 구조물이 사용될 수 있다.
부착 분자:
셀렉틴 패밀리의 일원
L-셀렉틴,
P-셀렉틴,
E-셀렉틴,
뮤신 유사 분자
CD34,
GlyCAM-1, 예를 들어 pCDNA3에 클로닝되어 pCDNA3-GlyCAM-1을 생성시키는 구조물
MadCAM-1.
인테그린 패밀리의 일원
LFA-1,
VLA-1,
Mac-1,
p150.95.
면역글로불리 수퍼 패밀리의 일원
PECAM,
ICAMs,
ICAM-1,
ICAM-2,
ICAM-3,
CD2,
LFA-3.
부착 분자는 핵산 분자로 투여될 때 가장 유용하다.
부착 분자는 백신, 특히 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 및 핵산/DNA 백신과 함께 또는 그 일부로서 핵산 분자로 투여될 때 가장 유용하다.
부착 분자는 종양내 또는 병소 내에 핵산 분자로서 전달될 때 유용하다.
바람직한 부착 분자는 ICAM-1, LFA-3 및 E-셀렉틴을 포함한다.
ICAM-1은 CTL 및 증식에 가장 좋다.
사이토카인
M-CSF,
G-CSF,
CSF,
IL-4,
IL-18의 변이형.
동시 자극 분자
CD40은 예를 들어 CD40을 코딩하는 cDNA가 pCDNA3에 클로닝되어 pCDNA3-CD40을 생성시키는 구조물이 사용될 수 있다.
CD40L
성장 인자
혈관 성장 인자는 예를 들어 혈관 성장 인자를 코딩하는 cDNA가 pCDNA3에 클로닝되어 pCDNA3-VGF를 생성시키는 구조물이 사용될 수 있자.
IL-7,
신경 성장 인자,
혈관 내피 성장 인자.
수용체 분자
Fas "사멸 유전자" 발현 산물,
TNF 수용체,
Flt,
Apo-1,
p55,
WSL-1,
DR3,
TRAMP,
Apo-3,
AIR,
LARD,
NGRF,
DR4,
DR5,
KILLER,
TRAIL-R2,
TRICK2,
DR6.
기타
Caspase(ICE)
표 1은 상기 면역 조절 단백질 및 CD86(B7.2) 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 젠 뱅크(GENBANK) 승인 번호 및 인용 문헌을 열거하고 있다.
DNA 백신은 본원의 참고 문헌인 PCT/US90/01515, PCT/US93/02338, PCT/US93/048131 및 PCT/US94/00899, 및 이들 문헌에 인용된 우선권 출원에 기재되어 있다. 상기 출원에 기재된 전달 방법 외에, DNA를 전달하는 다른 방법이 본원의 참고 문헌인 미국 특허 제 4,945,050호 및 제 5,036,006호에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 특징에 따르면, 유전 물질에 의해 코딩되는 단백질 및 펩티드에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체의 세포 내로 유전 물질을 도입시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 목적하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 핵산 분자, 또는 하나는 목적하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 하나는 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 두 개의 핵산 분자를 갖는 조성물을 상기 개체의 조직에 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 분자(들)은 플라스미드 DNA, 재조합 벡터의 핵산 분자 또는 약독화 백신 또는 세포 백신 내에 제공되는 유전 물질의 일부로서 제공될 수 있다. 별법으로, 일부 실시 태양에서는 면역 조절 단백질은 단백질로서 전달될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 두가지 이상의 면역 조절 단백질의 조합물이 개체에 투여될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 두가지 이상의 면역 조절 단백질의 조합물을 코딩하는 유전자가 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질과 면역 조절 단백질을 코딩하는 유전자의 조합물이 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, 두 가지 이상의 면역 조절 단백질의 조합물이 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다.
일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질은 동시 자극 분자 CD86(B7.2)과 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, CD86 및 한 가지 이상의 면역 조절 단백질의 조합물을 코딩하는 유전자가 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서 CD86 단백질 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 유전자의 조합물이 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질 및 CD86 단백질을 코딩하는 유전자의 조합물은 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, CD86 및 한 개 이상의 면역 조절 단백질의 조합물 이 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, CD86 및 한가지 이상의 케모카인 및(또는) 부착 분자의 조합물을 코딩하는 유전자가 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다. 일부 실시 태양에서, CD86 및 ICAM-1의 조합물을 코딩하는 유전자가 백신법의 일부로서 면역원 및(또는) 면역원성 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 개체에 투여된다.
본 발명의 일부 특징에서, 병원균 또는 비정상의 질병 관련 세포에 대해 개체를 예방 및(또는) 치료적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 표적화되는 병원균 또는 세포에서 발견되는 면역원성 단백질과 한 개 이상의 에피토프를 공유하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전 물질 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 유전 물질이 투여된다. 별법으로, 일부 실시 태양에서 면역 조절 단백질은 단백질로서 전달될 수 있다.
유전 물질은 개체의 세포에서 발현되고 면역 반응을 유도하는 면역원성 표적으로 작용한다. 결과 면역 반응은 광범위하여, 체액성 면역 반응 외에도 두 종류의 세포 면역 반응이 모두 유도된다. 본 발명의 방법은 예방 및 치료적인 면역성을 제공하는 데 유용하다. 따라서, 면역화 방법은 면역원에 대해 면역시키는 방법, 예를 들어 개체를 병원균 침입 또는 특이 세포 발생 또는 증식으로부터 개체를 보호하는 방법과 병원균 감염, 과증식 질환 또는 자가 면역 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법을 포함한다.
본원에서 사용된 "표적 단백질"은 면역 반응에 대한 표적 단백질로 작용을 하는 본 발명의 유전자 구조물에 의해 코딩된 펩티드 및 단백질을 나타낸다. "표적 단백질" 및 "면역원"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 면역 반응이 유도될 수 있는 단백질을 나타낸다. 표적 단백질은 병원균 또는 바람직하지 못한 세포 타입, 예를 들어 암 세포 또는 면역이 필요한 자가 면역 질환에 관계된 세포로부터 유래된 단백질과 하나 이상의 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질을 나타낸다. 표적 단백질에 대한 면역 반응은 표적 단백질이 관련된 특이적 감염 또는 질환에 대해 개체를 보호하고 치료할 수 있다.
본 발명은 표적 단백질, 즉 병원균, 알레르기원 또는 개체 자신의 "비정상" 세포와 특이적으로 연관된 단백질에 대해 광범위한 면역 반응을 유도하는 데 유용하다. 본 발명은 병원성 활성물질 및 유기체에 대하여 개체를 면역화시키는 데 유용하여 병원균 단백질에 대한 면역 반응이 병원균에 대한 방어 면역성을 제공한다. 본 발명은 특히 과증식 세포와 특이적으로 연관된 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도함으로써 암과 같은 과증식 질환 및 질병을 치료하는 데 유용하다. 본 발명은 자가 면역 질환과 관련된 세포와 특이적으로 연관된 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도하여 자가 면역 질환 및 질병을 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 일부 특징에서, 표적 단백질과 면역 조절 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열은 발현되어 표적 단백질을 생산할 수 있는 개체의 조직 세포로 도입될 수 있다. 표적 단백질 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열은 개체의 세포 내에서 발현되는데 필요한 조절 성분에 연결되어 있다. DNA 발현을 위한 조절 성분은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 또한, 코 작(Kozak) 부위와 같은 다른 성분도 유전자 구조물에 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 구조물"은 표적 단백질을 코딩하고, 백신처리된 개체의 세포 내에서 발현되도록 할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종료 시그날을 포함하는 뉴클레오티드 서열 및(또는) 면역 조절 단백질을 코딩하고 백신처리된 개체의 세포 내에서 발현되도록 할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종료 시그날을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA분자를 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 표적 단백질을 코딩하는 발현 가능한 형태의 서열 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 발현 가능한 형태의 서열은 개체에 전달되는 동일한 핵산 분자에서 발견된다. 일부 실시 태양에서, 표적 단백질을 코딩하는 발현 가능한 형태의 서열은 면역 조절 단백질을 코딩하는 발현 가능한 형태의 서열을 포함하는 핵산 분자와 별개의 동일한 핵산 분자에 존재한다. 상기 경우, 두 분자 모두 개체에 전달된다.
본원에서 사용된 용어 "발현 가능한 형태"는 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 성분을 포함하는 유전자 구조물을 나타내며, 개체의 세포 내에 존재할 때 코딩 서열은 발현된다.
본원에서 사용된 "에피토프 공유"는 다른 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 유사한 에피토프"는 단백질의 한 에피토프와 동일하지는 않으나 이 단백질과 교차 반응하여 세포성 또는 체액성 면역 반응 을 유발할 수 있는 구조를 갖는 에피토프를 의미한다.
유전자 구조물은 유전자 발현에 필요한 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형태를 포함하는 유전자 구조물과 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형태를 포함하는 유전자 구조물의 조합물을 제공한다. 유전자 구조물의 조합을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자(들)을 생세포 내에 도입하면 DNA 또는 RNA가 발현되어 표적 단백질 및 면역 조절 단백질이 생산된다. 표적 단백질에 대한 상승된 면역 반응이 일어나게 된다.
유전자 구조물(들)이 세포에 획득될 때, 유전자 구조물(들)은 세포 내에서 염색체 외 분자로 작용하고(하거나) 세포의 염색체 DNA에 통합된다. DNA는 이들이 플라스미드(들) 형태의 별개의 유전 물질로 존재하는 세포 내로 도입될 수 있다. 별법으로, 염색체에 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 내로 도입될 수 있다. DNA가 세포 내로 도입될 때, DNA의 염색체 내로의 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진하는 데 유용한 DNA 서열도 DNA 분자에 포함될 수 있다. 별법으로, RNA가 세포내에 도입될 수 있다. 유전자 구조물을 중심립, 말단소립 및 복제 기점을 포함하는 선형의 미니염색체로 제공하는 것도 고려된다. 유전자 구조물은 생 약독화된 미생물 또는 세포에 생존하는 재조합 미생물 벡터 내의 유전 물질의 일부가 될 수 있다. 유전자 구조물은 유전 물질이 세포의 염색체내에 통합되거나 염색체 외에 존재하는 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부일 수 있다.
유전자 구조물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 성분을 포함한다. 상기 성분은 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 또한, 인핸서는 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 코딩하는 서열의 유전자 발현에 종종 요구된다. 이들 성분은 목적 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되고 조절 성분은 투여될 개체 내에서 작동 가능해야만 한다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다. 그러나, 이들 성분은 유전자 구조물이 투여된 개체 내에서 작용을 해야한다. 개시 코돈 및 정지 코돈은 코딩 서열과 인프레임(inframe)으로 존재해야 한다.
사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 기능을 해야한다.
본 발명을 실시하는 데 유용한, 특히 사람의 유전자 백신 생산에 유용한 프로모터의 예에는, 이로 한정되는 것은 아니나, 시미안 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들어 HIV의 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들어 CMV 초기 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 사람 메탈로티오네인과 같은 사람 유전자의 프로모터가 있다.
본 발명을 실시하는 데 유용한, 특히 사람의 유전자 백신을 제조하는 데 있어 유용한 폴리아데닐화 시그날은, 이에 한정되는 것은 아니나, 소 성장 호르몬 폴 리아데닐화 시그날, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날을 예로 들 수 있다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날은 pCEP4 플라스미드(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디애고 소재) 내에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그날을 사용한다.
유전자 발현에 필요한 조절 성분 외에, 다른 성분이 DNA 분자에 포함될 수 있다. 이같은 추가 성분에는 인핸서가 포함된다. 인핸서는 이로 한정되는 것은 아니나, 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV에서 유래된 것과 같은 바이러스 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
유전자 구조물을 염색체 외에 유지하고 세포 내에서 구조물의 다중 카피를 생산하기 위해서 유전자 구조물에 포유동물의 복제 개시점을 제공할 수 있다. 인비트로젠에서 구입한 플라스미드 pCEP4 및 pREP4는 엡스타인 바 바이러스 복제 개시점 및 염색체 내에 통합되지 않고 높은 카피수의 에피솜 복제를 하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 부위를 포함하고 있다. 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질을 코딩하는 cDNA가 pCDNA3에 삽입된다.
면역화 적용에 관계된 일부 바람직한 실시예에서, 표적 단백질, 면역 조절 단백질 및 추가로 상기 표적 단백질에 대한 면역 반응을 상승시키는 단백질의 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자(들)이 전달된다. 상기 유전자의 예로는 다른 사이토카인 및 림포카인, 예를 들어 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNF, 상피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12를 코딩하는 유전자가 있다. 일부 실시 태양에서, GM-CSF의 유전자가 면역화 조성물에 사용되는 유전자 구조물에 포함되는 것이 바람직하다.
경우에 따라 유전자 구조물을 획득한 세포를 제거하는 것이 바람직한 경우에 세포 파괴의 표적으로 기능하는 추가의 성분이 첨가될 수 있다. 발현 가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제(tk) 유전자가 유전자 구조물에 포함될 수 있다. 강시클로비르 약물은 개체에 투여되어 tk를 생산하는 모든 세포를 선택적으로 사멸시키고, 따라서 상기 유전자 구조물을 갖는 세포의 선택적 파괴의 수단을 제공한다.
단백질 생산을 최대화하기 위해서, 구조물이 투여되는 세포 내의 유전자 발현에 적합하도록 조절 서열이 선택될 수 있다. 또한, 세포 내에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 당업계의 통상의 숙련자라면 세포 내에서 작용을 하는 DNA 구조물을 생산할 수 있다.
투여 경로는 이에 한정되는 것은 아니나, 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 구강 및 국부, 경피, 점막조직에 대한 흡입 또는 좌약식, 예를 들어 질, 직장, 요도, 협강 및 설하 조직에 대한 세정액 투여를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 점막 조직내, 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사이다. 유전자 구조물은, 이에 한정되는 것은 아니나, 전통적인 주사, 무바늘(needless) 주사 기구 또는 "미세주사 충격 유전자 주입기"를 포함하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 제약 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 제약 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 제약 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 제약 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 제약 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 사용될 투여 형태에 따라 제제화된다. 제약 조성물이 주사 가능한 제약 조성물일 경우, 이들은 멸균 상태, 무발열원 및 무미립자 상태로 제공된다. 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로 등장성 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부 경우에는, 등장액, 예를 들어 인산염 완충 식염수가 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부 실시 태양에서, 혈관 수축제가 제제에 첨가된다.
일부 실시 태양에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 함께 세포로 전달된다. 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서는 본원의 참고 문헌의 1993. 1. 26자 출원된 미국 특허 출원 제 08/008,342호, 1993. 3.11자 미국 특허 출원 제 08/029,336호, 1993. 9. 21자 미국 특허 출원 제 08/125,012호 및 1994. 1.26자 출원된 국제 출원 제 PCT/US94/00899호에 기재되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 본원의 참고 문헌인 1994. 4. 1자 미국 특허 출원 제 08/221,579호에 기재되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 보조제는 핵산 분자와 혼합물로 또는 별개로 동시에, 핵산 분자 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 트랜스펙션 및(또는) 복제 및(또는) 염증 제제로 기능을 할 수 있고 GVF와 동시에 투여될 수 있는 그 밖의 제제에는 성장 인자, 사이토카인 및 림포카인, 예를 들어 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12, 섬유아세포 성장 인자, 표면 활성제, 예를 들어 면역 자극 복합체(ISCOMS), 프로인드 불완전 보조제, 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌과 같은 소포를 포함하는 LPS 유사체가 포함되며, 히알루론산도 유전자 구조물과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 면역 조절 단백질은 GVF로 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 세포로 전달된 핵산 분자는 예방 및(또는) 치료 목적의 면역화제로서 작용을 하는 단백질의 유전자 주형으로 기능할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산 분자는 동물 세포 내에서 코딩 부위의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 포함한다.
본 발명은 모든 병원균, 예를 들어 바이러스, 원핵생물 및 병원성 진핵 유기체, 예를 들어 단세포 병원성 유기체 및 다세포 기생생물에 대해 개체를 면역화하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 세포를 감염시키는 병원균, 바이러스와 같이 캡슐화되지 않는 병원균, 및 임질균, 리스테리아 및 이질균과 같은 원핵 생물에 대해 개체를 면역시키기에 특히 유용하다. 또한, 본 발명은 생활 주기에서 세포내 병원 균으로 존재하는 단계를 포함하는 원생동물에 대해 개체를 면역화시키는 데에도 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "세포내 병원균"은 생식 또는 생활 주기의 적어도 일부가 숙주 세포 내에 존재하고 병원균 단백질을 생산하거나 생산을 유도하는 바이러스 또는 병원성 유기체를 의미한다. 표 2는 본 발명에 따라 백신이 제조될 수 있는 바이러스 과 및 속의 일부를 열거하고 있다. 표에 열거된 항원과 같이 병원균 항원에 제시되는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체가 백신에 유용하다. 또한, 본 발명은 표 3에 열거된 바와 같은 진핵 및 원핵의 원생동물 병원균 및 기생생물에 대해 개체를 면역시키는데 유용하다.
병원균 감염에 대해 보호하는 유전자 백신을 제조하기 위해서, 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 단백질을 코딩하는 유전 물질은 표적에 대한 코딩 서열로서 유전자 구조물에 포함된다. 병원균이 세포내(본 발명이 특히 유용함)로 또는 세포외로 감염되든지 간에 모든 병원균 항원은 방어 반응을 유도할 것이다. DNA 및 RNA는 비교적 작고 쉽게 생산될 수 있기 때문에, 본 발명은 복합 병원균 항원에 백신 처리를 가능하게 하는 추가의 잇점을 제공한다. 유전자 백신에 사용되는 유전자 구조물은 많은 병원균 항원을 코딩하는 유전 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여러 바이러스 유전자가 한 구조물에 포함되어 다중의 표적을 제공할 수 있다.
표 2 및 3은 병원성 제제 및 유기체의 일부를 열거하고 있으며, 이들 감염에 대해 개체를 보호할 수 있는 유전자 백신이 제조될 수 있다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 병원균에 대해 개체를 면역시키는 방법은 HIV, HTLV 또는 HBV에 대한 것이다.
본 발명의 다른 특징은 과증식 질환의 특징을 갖는 과증식 세포에 대해 광범위한 보호 면역 반응을 제공하는 방법 및 과증식 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공하고 있다. 본원에서 사용된 용어 "과증식 질환"은 세포의 과증식이라는 특징을 갖는 질환 및 이상을 언급한다. 과증식 질환의 예에는 암 및 건선의 모든 형태를 포함된다.
면역원성의 "과증식 세포" 관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조물을 개체의 세포에 도입하면 개체의 백신처리된 세포 내에서 상기 단백질이 생산된다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 용어 "과증식 관련 단백질"은 과증식 질환과 연과된 단백질을 의미한다. 과증식 질환에 대해 면역시키기 위해서는 과증식 질환에 관련된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조물은 개체에 투여한다.
과증식 연관 단백질이 효과적인 면역원성 표적이 되기 위해서는, 정상 세포와 비교해 볼 때 과증식 세포내에서 독점적으로 또는 높은 수준으로 발현되는 단백질이어야 한다. 표적 항원은 상기 단백질, 그의 단편 및 상기 단백질에서 발견되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 포함한다. 경우에 따라, 과증식 관련 단백질은 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이의 산물이다. 변이된 유전자는 상 단백질에 발견되지 않는 다른 에피토프를 만들수 있는 약간 다른 아미노산 서열을 갖는다는 것을 제외하고는 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 코딩한다. 상 기 표적 단백질은 종양 유전자, 예를 들어 myb, myc, fyn, 전위 유전자, 예를 들어 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다. 표적 항원으로서 종양 유전자 산물 외에도, 항암 치료 및 보호 요법을 위한 표적 항원으로 B 세포 림프종이 생산한 항체의 가변 부위 및 일부 실시 태양에서 자가 면역 질환을 위해 표적 항원으로 사용될 수 있는 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 부위를 포함한다. 그밖의 종양 관련 단백질은 모노클로날 항체 17-1A 및 폴레이트 결합 단백질에 의해 인지되는 단백질을 포함하여 종양 세포 내에서 높은 수준으로 발견되는 단백질과 같이 표적 단백질로서 사용될 수 있다.
본 발명은 한가지 이상의 여러 형태의 암에 대해 개체를 면역시키는 데 사용될 수 있는 한편, 본 발명은 특정 암으로 발전되기 쉽거나 암을 보유하여 재발되기 쉬운 개체를 예방적으로 면역시키는 데 특히 유용하다. 유전학, 기술 및 역학의 발전으로 개체의 암의 발생의 가능성 및 위험 판단을 할 수 있다. 유전자 스크리닝 및(또는) 가족 병력을 이용하여, 특정 개체에서 여러 종류의 암이 발생할 가능성을 예견할 수 있다.
유사하게, 이미 암으로 발전하거나 암을 제거하도록 치료를 받거나 완화된 개체는 특히 재발되기 쉽다. 치료 요법의 일부로서, 재발을 방지하기 위해 상기 개체는 보유했던 것으로 진단받은 종양에 대해 면역될 수 있다. 따라서, 한 종류의 암을 보유하였고 재발의 위험이 있는 개체는 앞으로 암 재발을 방지하기 위해 면역계를 준비하도록 면역될 수 있다.
본 발명은 과증식 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방 법에서, 유전자 구조물의 도입은 면역 치료제로서 기능을 하여 개체의 면역게를 표적 단백질을 생산하는 과증식 세포를 제거하도록 지시하고 촉진시킨다.
본 발명은 세포 수용체 및 "자기" 지향 항체를 생산하는 세포를 포함하는 자기면역과 관련된 표적에 대한 광범위 보호 면역 반응을 부여하여 자가 면역 질환 및 질병에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
T 세포 매개 자가 면역 질환에는 류마티스성 관절염(RA), 다발성경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가 면역 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성 근염, 피부근염, 건선, 맥관염, 베그너 육아종증, 크론병 및 궤양성 대장염이 있다. 이들 질병은 내생의 항원에 결합하여 자가 면역 질환과 관련된 염증 캐스캐이드를 개시하는 T 세포 수용체를 특징으로 한다. T 세포의 가변 부위에 대한 백신처리는 T 세포를 제거하는 CTL을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다.
RA의 경우, 질환에 관련되는 T 세포 수용체 (TCR)의 여러가지 특이적 가변 부위라는 특징을 갖는다. 이 TCR은 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 상기 단백질을 코딩하는 DNA 구조물을 사용한 백신처리는 RA에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유도할 수 있다[본원의 참고 문헌 Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253;325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-333 참조].
MS의 경우, 질환에 관련되는 T 세포 수용체 (TCR)의 여러가지 특이적 가변 부위라는 특징을 갖는다. 이 TCR은 Vβ-7 및 Vα-10을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 상기 단백질을 코딩하는 DNA 구조물을 사용한 백신처리는 MS에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유도할 수 있다[본원의 참고문헌 Wucherpfenning, K.W., et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345:344-346 참조].
경피증의 경우, 질환에 관련되는 T 세포 수용체 (TCR)의 여러가지 특이적 가변 부위라는 특징을 갖는다. 이 TCR은 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 상기 단백질을 코딩하는 DNA 구조물을 사용한 백신처리는 경피증에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유도할 수 있다.
T 세포 매개 자가 면역 질환, 특히 TCR의 가변 부위가 아직 특징이 밝혀지지 않은 질환에 걸린 환자를 치료하기 위해서, 활액 생체 검사를 수행할 수 있다. T세포가 존재하는 시료를 취해 표준 기술을 이용하여 TCR의 가변 부위를 확인하였다. 유전자 백신은 이 정보를 이용하여 제조될 수 있다.
B 세포 매개 자가 면역 질환에는 루프스(SLE), 그레이브스병, 중증 근무력증, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 혈소판 감소증, 천식, 한성글로불린 혈증, 원발성 담관 경화증 및 악성 빈혈이 포함된다. 이들 질환은 내생의 항원에 결합하여 자가 면역 질환과 관련된 염증 캐스케이드를 개시하는 항체라는 특징을 갖는다. 항체의 가변 부위에 대한 백신처리는 항체를 생산하는 B 세포를 제거하는 CTL을 포함하는 면역 반응을 유도한다.
B 세포 매개 자가 면역 질환 환자를 치료하기 위해서, 자가 면역 활성과 관련된 항체의 가변 부위가 확인되야 한다. 생체 검사가 수행 될 수 있으며 염증 부위에 존재하는 항체를 시료로 준비할 수 있다. 이들 항체의 가변 부위는 표준 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 유전자 백신은 이 정보를 이용하여 제조될 수 있다.
SLE의 경우, DNA가 항원의 하나라고 생각된다. 따라서, SLE에 대해 면역된 환자의 혈청에서 항 DNA 항체를 스크리닝할 수 있고, 혈청에서 확인된 상기 항 DNA 항체의 가변 부위를 코딩하는 DNA 구조물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.
TCR 및 항체 모두의 가변 부위의 일반적인 구조의 특성은 잘 알려져 있다. 일반적으로, 특정 TCR 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열은 문헌[본원의 참고 문헌 Kabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD]에 기재된 바와 같이 잘 알려진 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 항체의 기능적인 가변 부위를 클로닝하기 위한 일반적 방법은 본원의 참고 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066]에서 볼 수 있다.
본 발명은 유전 백신을 개선하기 위하여 면역 조절 단백질을 코딩하는 서열의 발현 가능한 형태를 이용하는 것 외에, 개선된 약독화 생백신 및 항원을 코딩하는 외래 유전자를 전달하는 재조합 벡터를 이용하는 개선된 백신에 관한 것이다. 약독화 생백신 및 외래 항원을 전달하는 재조합 벡터를 이용하는 백신은 본원의 참고 문헌인 미국 특허 제 4,722,848호, 제 5,017,487호, 제 5,077,044호, 제 5,110,587호, 제 5,112,749호, 제 5,174,993호, 제 5,223,424호, 제 5,225,336호, 제 5,240,703호, 제 5,242,829호, 제 5,294,441호, 제 5,294,548호, 제 5,310,668호, 제 5,387,744호, 제 5,389,368호, 제 5,424,065호, 제 5,451,499호, 제 5,453,364호, 제 5,462,734호, 제 5,470,734호 및 제 5,482,713호에 기재되어 있다. 면역 조절 단백질을 코딩하고 백신 수여자 내에서 발현시키는 기능을 수행할 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조물이 제공된다. 유전자 구조물은 약독화 생백신 및 재조합 백신에 도입되어 본 발명에 따른 개선된 백신을 생산한다.
본 발명은 DNA 백신, 약독화 생백신 및 재조합 백신을 포함하는 백신 조성물의 일부로서 유전자 구조물을 개체의 세포 내에 전달하는 단계를 포함하는, 개체를 면역시키는 개선된 방법을 제공한다. 유전자 구조물은 면역 조절 단백질을 코딩하고 백신 수여자 내에서 발현시키는 기능을 수행하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 개선된 백신은 결과적으로 세포 면역 반응을 상승시킨다.
본 발명의 다른 면은 GM-CSF 또는 GM-CSF를 코딩하는 핵산의 사용, 또는 강한 항체 반응 또는 헬퍼 T 세포 반응에 특히 바람직한 DNA 백신과 함께 GM-CSF 및 GM-CSF를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 관한 것이다. 상기 백신의 한 예가 B 형 간염 백신이다. 다른 예는 세포외 병원균 및 알레르기원을 포함한다. GM-CSF 또는 GM-CSF를 코딩하는 핵산 분자, 또는 DNA 백신과 함께 GM-CSF 및 GM-CSF를 코딩하는 핵산 분자의 투여는 면역능 손상으로 확인된 개체를 면역처리하는 데 유용하 다.
본 발명의 다른 실시 태양은 자가 면역 질환의 환자를 치료하는 항 케모카인 항체의 사용에 관한 것이다. 자가 면역 질환은 상기 언급한 바와 같다. 항 케모카인 항체는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 또는 RANTES에 특이적인 항체를 포함한다. 항 케모카인 항체는 증상을 감소 또는 약화시키는 치료 유효량으로 상기 질환이 있는 것으로 추측되는 환자에 투여될 수 있다.
자가 면역 질환을 위한 제약 조성물은 케모카인 특이적 항체 및 제약적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 바람직한 실시 태양에서 조성물은 주사가능한 것이다. 멸균된, 무발열원, 무미립자의 주사 가능한 조성물은 하나 이상의 케모카인 특이적 항체 및 제약적으로 허용 가능한 담체 또는 주사 부형제를 포함한다.
항체는 모노클로날 항체를 생산하는 통상적 방법에 따라 제조된다. 당업계에 잘 알려진 담체가 선택된다. 담체의 한 예로 멸균된 식염수가 있다.
당업자는 표준 기술 및 용이하게 입수 가능한 출발물질을 이용하여 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 및 RANTES에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 모노클로날 항체의 생산 기술은 본원의 참고 문헌[Harlow, E. 및 D. Lane,(1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY]에 기술되어 있다. 상기 문헌은 하이브리도마 및 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 자세한 지침을 제공하고 있다.
간단히, 케모카인은 마우스에 주사된다. 마우스의 비장을 제거해 내서, 비 장 세포를 단리하고 불멸화된(immortalized) 마우스 세포와 융합시킨다. 하이브리드 세포 또는 하이브리도마를 배양하고 항체를 분비하는 세포를 선별한다. 항체를 분석하고, 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 확인될 경우, 이를 생산하는 하이브리도마를 배양하여 항원 특이 항체를 계속적으로 생산한다.
본 발명에 따라, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 또는 RANTES 특이적 항체는 자가 면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 또는 RANTES는 하이브리도마를 제조하는 데 사용된다. 이들 단백질을 코딩하는 유전자는 널리 알려져 있으며 당업자가 용이하게 입수 가능하다. 따라서,당업자는 본 발명을 실시하는데에 유용한 항체를 제조할 수 있다. 설치류 항체 외에, 본 발명은 당업자가 통상적으로 생산할 수 있는, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 또는 RANTES에 결합하는, 사람 항체, 인간화 항체, Fab 및 키메라 항체에 관한 것이다.
당업자는 자가 면역 질환이 발생했거나, 발생하기 쉬운 사람을 쉽게 확인할 수 있다.
조성물은 효과를 높이기 위해 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 다른 케모카인에 특이적인 항체 및 동일 케모카인의 다른 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 복합 항 케모카인을 포함할 수 있다.
약 5 ㎍ 내지 5,000 mg의 항체가 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 50 ㎍ 내지 500 mg의 항체가 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 500 ㎍ 내지 50 mg의 항체가 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시 태양에서, 5 mg의 항체가 투여될 수 있다.
조성물은 적절한 경로, 예를 들어 경구, 비내, 근내, 복강내 또는 피하 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시 태양에서는 정맥내 투여가 바람직하다.
초기 투여 후에 개체들은 재투여에 의해 부스팅될 수 있다. 일부 바람직한 실시 태양에서 다중 투여가 수행된다.
[실시예]
실시예 1
<서론>
면역반응에서 케모카인의 특이적 기능을 분자생물학적으로 분석하기 위해서 개별적으로 발현 벡터에 α-케모카인 IL-8을 코딩하는 cDNA 및 β-케모카인 MIP-1α, RANTES 및 MCP-1을 코딩하는 cDNA를 클로닝하고 이들을 HIV-1 피막 또는 gag/pol 단백질을 코딩하는 DNA 면역원과 함께 동시 면역시켰다. 모델 항원으로서 이들 DNA 백신 구조물을 이용하여, 본 발명자들은 상기 면역에 따라 유도되는 항원 특이적 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 분석하여 면역 반응의 발생에 있어 케모카인 유전자 발현의 특이적 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 항원 특이적 면역 반응의 활성 및 조절에 있어 케모카인이 특이적이고 확인 가능한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
<결과>
DNA 백신처리에 의한 케모카인의 유도
마우스를 pCDNA3(대조군), pCEnv 또는 pCGag/pol 50 ㎍으로 면역시켰다. 2 주일 후에, 마우스를 희생시켜 비장을 회수하여 림프구를 단리하였다. 이들 세포를 시험관 내에서 항원 특이적 자극(고정된 재조합 백시니아 감염된 자극 세포를 이용)으로 5일간 자극시켰다. 이펙터 세포로부터 배양 상등액을 회수하여 케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 분비를 시험하였다. 본 발명자들은 pCEnv 또는 pCGag/pol을 이용한 DNA 면역이 대조군 벡터에 비해 β-케포카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 상당히 큰 발현 수준을 유도한다는 것을 확인하였다. 첫 면역처리후 2주일에 증가가 있었으며, 이는 β-케모카인이 생체 내에서 면역 반응을 조절하고 있다는 것을 보여준다. 항원 특이적 반응에 케모카인이 영향을 측정하기 위해 DNA 백신에 의해 유도된 면역 반응에 대한 효과를 조사하였다.
케모카인 발현 카세트의 제작
케모카인 IL-8, MIP-1α, MCP-1α, MCP-1 및 RANTES의 유전자를 본원의 참고 문헌[Kim, J.J., D.B.Weiner(1997) Springer Sem Immnopathol 19 174-195; Kim,J.J. et al. (1997) Nature Biot. 15, 641-645; 및 Kim, J.J., et al(1997) J. Immunol. 158, 816-826]에 기재된 방법을 이용하여 pCDNA3 플라스미드 발현 벡터에 각각 클로닝하였다. 이 케모카인 발현 카세트는 전체 삽입체(5' 및 3' 인접 서열을 포함)의 서열을 분석하여 확인하였다. 또한, 이 케모카인 구조물을 RD 세포로 시험관 내에서 트랜스펙션시켜 이들 구조물의 발현을 적절한 항체를 이용한 면역 침전법 또는 케모카인 ELISA로 의해 확인하였다. 또한, IL-8, MIP-1α , MCP-1 및 RANTES의 발현 구조물이 백신으로 사용되었으며 마우스로 면역되었다. 이들 구조물이 마우스 근육 조직 내에서 자신이 코딩하는 케모카인을 발현하였는 가를 재료 및 방법에 기재된 생체 내 발현 기술로 확인하였다.
IL -8은 T 보조 반응의 강한 유도제이다 .
백신 유도 반응에 대한 여러 케모카인의 효과를 각각 분석하였다. pCEnv 및 pCEnv+IL-8 면역된 마우스에서 항혈청을 회수하여 ELISA를 이용하여 HIV-1 gp120 단백질에 대한 특이적 항체 반응을 분석하였다. DNA 면역 후 제 0, 2, 4 및 6주에 회수된 혈청으로부터 gp120 특이적 항체 역가를 측정하였다. 1:128 희석율에서, pCEnv+IL-8로 면역된 군의 혈청에서 pCEnv 단독으로 면역된 군보다 더 크게 gp120 단백질에 대한 항체 반응을 보였다. pCGag/pol로 면역된 군에서도 유사한 결과를 보였다. 또한, IL-8 유전자와 동시 투여에 의해 유도된 gp120 특이적 IgGs의 서브클래스가 확인되었다. IgG1 형의 생산은 Th2 형 사이토카인에 의해 유도되지만 IgG2a 형 생산은 Th1 형 사이토카인에 의해 유도된다. IgG1과 IgG2a의 상대적 비율(Th2 대 Th1)을 측정하였다. pCEnv 면역된 군은 1.3의 IgG1 대 IgG2a의 비율을 보였다. 반면, pCEnv+IL-8이 동시 투여는 상대비를 0.9로 감소시켰으며, 이는 Th-1 형 반응으로 변화를 나타낸다. 그러므로, IL-8은 항원 특이적 반응의 특성 및 양 모두에 영향을 주었다.
T 헬퍼 세포 증식 반응에 대한 IL-8 발현의 효과를 조사하였다. HIV-1 면역원(pCEnv 또는 pCGag/pol)과 IL-8의 동시 발현은 효과적인 수준의 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 일으켰다. 세포 증식의 증가는 4 내지 6 배로 항원 특이적 반응의 큰 증가를 보였다. 또한, 유도된 CTL 반응에 대한 IL-8의 동시 발현의 효과를 조사하였다. 특이적 살해의 기본 수준을 대조군 동물에서 확인하였고, pCEnv 단독으로 면역된 동물은 작으나 지속적인 CTL 반응을 보였다. IL-8 동시 투여는 항원 특이적 CTL 반응에 상승 효과를 보이지 않았다. 유사한 CTL 결과가 pCGag/pol+IL-8 동시 면역에서 확인되었다.
사이토카인은 면역 반응시 면역 세포를 지시하고 표적화하는 중요한 역할을 한다. 예를 들어, IFN-γ는 T 세포 매개 세포독성 면역 반응의 조절에 밀접하게 관련된 반면, IL-4는 B세포 매개 면역 반응에서 우세한 역할을 하였다. TNF-α는 활성화된 대식세포 및 단핵세포, 호중구, 활성화된 림프구 및 NK 세포에 의해 생산되며 다른 전염증성 사이토카인의 합성을 조절하는 데 중추적 역할을 하는 것으로 제시되었다. 본 발명자들은 CTL 분석을 위해 시험관 내 자극된 이펙터 세포로부터 상등액을 분석하여 사이토카인 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비를 시험하였다. 본 발명자들은 IL-8 발현은 IFN-γ 수준을 약간을 증가시켰으나 사이토카인 IL-4 및 TNF-α 수준에는 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다. 이 사실은 체액성 반응에 대한 IL-8 동시 전달의 큰 효과가 IL-4에 현저한 효과를 갖을 것으로 기대될 수 있었기 때문에 다소 놀라웠으나 확인되지는 않았다.
MIP -1α는 항체 반응의 강한 유도제이다 .
MIP-1α 동시 발현은 항원 특이적 체액성 반응의 유도에 IL-8보다 더 큰 효과를 보였다. pCEnv+MIP-1α의 동시 면역은 외피 특이적 항체 반응에을 크게 상승시켰다. 유사한 결과가 pCGag/pol로 면역된 군에서 확인되었다. pCEnv+MIP-1α와 동시 투여 후에 IgG1 대 IgG2a의 상대 비율을 측정하였다. pCEnv 면역된 군에서 IgG1 대 IgG2a의 상대 비율은 1.3이었다. 반면, pCEnv+MIP-1α와 동시 주사는 상 대 비율을 1.7로 증가시켰으며, 이것은 Th2 형 반응으로의 변화를 나타낸다. HIV-1 면역원(pCEnv 또는 pcGag/pol)과 MIP-1α의 동시 발현은 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 일으켰다. 반면, MIP-1α 면역은 항원 특이적 CTL 반응 또는 사이토카인 유도에 극소 효과를 갖는다. 다시 말해서, IL-8의 분석에서 사이토카인에 대한 효과가 관찰되었고, IL-4 수준에 대한 효과는 확인되지 않았다.
RANTES 는 Th1 및 CLT 반응을 유도한다
본 발명자들은 RANTES 동시 전달의 백신 유도 면역 반응에 대한 효과를 조사하였다. IL-8 및 MIP-1α와는 달리, pCEnv와 RANTES의 동시 발현은 HIV-1 외피 특이적 항체 반응을 상승시키지 않았다. 또한, pCEnv 단독으로 면역된 군과 비교해볼 때 pCEnv-RANTES 동시 면역은 IgG1-IgG2a 비율에 영향을 주지 않았다. 항체 반응과는 반대로, HIV-1 면역원(pCEnv 또는 pCGag/pol)과 RANTES의 동시 백신처리는 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응에 큰 증가를 가져왔다. 또한, Th1 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 2배 높은 수준의 발현이 pCEnv+RANTES로 동시 투여된 군에서 확인되었다. CTL 활성에 최소 효과를 주는 pCEnv+IL-8 또는 pCEnv-MIP-1α와의 동시 주사와는 다르게, pCEnv+RANTES와 동시 주사 후에 HIV-1 외피를 발현하는 백시니아(vMN462)로 감염된 표적의 특이적 사멸이 더 크게 증가하였다. 50:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 pCEnv+RANTES의 동시 주사 후에 표적 세포의 36% 이상의 비용해율이 확인되었다. 유사하게, pCGag/pol+RANTES로 면역된 마우스는 HIV-1 gag/pol을 발현하는 백시니아(vVK1)로 감염된 표적의 항원 특이적 CTL 용해를 크게 증가 시켰다. IL-4에 대한 효과가 확인되지 않았기 때문에 RANTES 동시 전달은 Th1 형의 표현형에 대해 생성되는 반응을 극성화시키는 것으로 보였다.
MCP -1은 CTL 반응을 유도한다
MCP-1 cDNA의 보조제 특성을 확인하였다. MCP-1은 pCEnv 면역에 의해 유도되는 특이적 항체 결합 형태에 최소 효과를 같는 것으로 보였다. 또한, HIV-1 면역원(pCEnv 또는 pCGag/pol)과 MCP-1의 동시 발현은 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 양성이나 비교적 적게(2배) 상승시켰다. pCEnv+MCP-1으로 동시 투여 후 IgG1 대 IgG2a의 상대비를 측정하였다. pCEnv로 면역된 군은 1.3의 IgG1-IgG2a비를 보였다. 반면에, pCEnv+MCP-1와 동시 주입은 상대비를 1.0으로 감소시켰으며 이는 Th1 형 반응으로 변화를 나타낸다. pCEnv+MCP-1의 동시 주사후에 특이적 사멸의 큰 증가가 확인되었다. 50:1의 이펙터 대 표적(E:T)비율로 pCEnv+MCP-1의 동시 주사 후에 36% 이상의 표적 세포의 비용해율이 확인되었다. 유사하게, pCGag/pol+MCP-1로 면역된 마우스는 표적을 발현하는 HIV-1 gag/pol의 항원 특이적 CTL 용해를 크게 상승 시켰다. pCEnv+MCP-1로 면역된 마우스에 의한 IFN-γ 분비 수준은 pCEnv 면역되거나 대조군에 비해 훨씬 높았다. 또한, 모든 군에서 분비된 IL-4의 수준은 유사하였다. 또한, pCEnv+MCP-1로 면역된 군에 의한 TNF-α의 분비 수준은 pCEnv 면역된 군 또는 대조군에 비해 매우 컸다. 이 사이토카인 분비 자료는 CD8+ CTL의 활성화에 있어 MCP-1의 역할을 증명하는 CTL 결과를 뒷받침해준다.
CLT 반응에서 CD8 제한의 측정
MCP-1 및 RANTES에 대한 동시 발현으로 인한 CTL 반응의 증가가 CD8+ T 세포 에 제한되는 지를 확인하기 위해, balb/c 마우스의 MHC 클래스 I-제한 CTL에 대한 특이적 에피토프로 제시된 HIV-1 외피 펩티드(RIHIGPGRAFYTTKN)을 이용하여 CTL 분석을 실시하였다. 마우스를 2주 마다 각 DNA 구조물 50 ㎍으로 두차례 면역시키고 2차 면역후 1주일째 비장을 회수하였다. 외피 특이적 펩티드로 시험관 내 자극시킨 후 비장세포에서 CTL 분석을 실시하였다. 본 발명자들은 50:1의 E:T 비율에서 MCP-1 및 RANTES의 동시 주사 후에 35% 및 26%의 비사멸율로 크게 상승된 CTL 반응을 확인하였다. 보체 용해를 이용하여 이펙터 세포군으로부터 CD8+ T 세포를 제거한 후에 CTL 활성을 측정하여 이같은 사실을 증명하였다. CD8+ 세포의 제거는 MCP-1 및 RANTES의 동시 주입후에 관찰된 항원 특이적 CTL 상승을 억제시켰다. 이러한 결과는 세포용해 활성의 상승이 항원 특이적이며, 클래스 I 제한적이고 CD8+ T 세포 의존적이라는 것을 나타낸다.
케모카인 발현의 상승
특이적 케모카인 보조된 면역원이 상기 케모카인 생산에 대해 효과가 있다면, 그 효과를 측정하는 것은 중요하다. 본 발명자들은 면역된 동물에서 회수한 자극된 세포에 의한 케모카인 MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및 MCP-1의 발현을 조사하였다. 케모카인 동시 주사는 케모카인 특이적 형태로 케모카인 생산을 조절하였다. 본 발명자들은 몇가지 중요한 발견을 하였다. 또한, 케모카인 유전자의 동시 주사는 자극된 세포에 의해 케모카인의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 예를 들어, MIP-1α 발현은 pCEnv 단독 면역에 의한 발현 수준에 비해 pCEnv+MIP-1α 의 동시 면역에 의해 크게 상승될 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, MIP-1β의 발현은 CTL 반응의 가장 큰 두가지 유도제인 pCEnv+MCP-1 및 pCEnv+RANTES 면역에 의해 크게 상승되었다. 또한, pCEnv+MIP-1α, pCEnv+MCP-1 및 pCEnv+RANTES의 동시 면역은 자극된 세포에 의한 RANTES의 발현을 크게 상승시켰다. 결과적으로, pCEnv+MIP-1α 및 pCEnv+MCP-1의 동시 면역으로 MCP-1은 발현이 가장 높았다.
<고찰>
염증 반응의 면역 개시는 세포의 부착 분자, 사이토카인 및 케모카인의 밀접하게 통합된 발현이 관계된 복잡한 과정이다. 특히, 케모카인은 혈관에서 개체 방어의 말초 부위로 백혈구 운반의 분자 조절에서 특히 중요하다. 케모카인 수퍼패밀리는 20 개 이상의 관련 단백질의 배열로 구성된다. 케모카인은 보존된 시스테인 잔기의 존재 및 위치에 따라 크게 C-X-C(α), C-C(β) 및 C(γ)의 3 클래스로 분류된다. α 패밀리는 처음 두 시스테인이 다른 아미노산에 의해 분리되어 있고, 반면에 β 패밀리에서는 바로 옆에 위치하고 있다. γ패밀리는 지금까지 단지 2개가 확인되었으며, 이들은 N-말단에 두개의 시스테인 대신 하나의 시스테인을 포함한다.
각 수퍼패밀리의 일원은 고유하면서 중복된 활성을 갖는다. 정확한 생리학적 및 병리학적 기능이 아직 명료하게 정의되지는 않았으나 문헌에서 단순화하는 보편성을 볼 수 있다. 일반적으로 C-X-C 패밀리의 일원은 호중구, 호산구 및 호염기구를 포함하는 다형핵의 백혈구의 화학유인제 및 활성화이다. 반면, C-C 패밀리의 일원은 단핵세포 및 림프구와 같은 단핵의 세포에 화학주성 인자로 기능한다. 한편, C-X-C 케모카인인 IL-8 및 IP-10은 T 림프구에 화학주성을 갖는다고 보고되었으며, C-C 케모카인인 MCP-1, MCP-3, RANTES 및 MIP-1α도 호염기구에 화학주성을 갖는다. 일반적으로 케모카인의 기능은 염증 부위에서 백혈구을 모집하고 활성화시키는 것으로 추측된다.
또한, 염증 및 면역 반응에 있어서의 역할 외에도, 일부 케모카인은 AIDS의 원인인 HIV-1 및 HIV-2 바이러스의 전달 및 진행에 중요한 역할을 한다. 10년에 걸쳐 HIV 외피 당단백질 gp120의 CD4에의 결합이 바이러스 용해 및 침입에 충분하지 않다고 추측되었으며, 이는 HIV 감염에 추가적인 세포 표면 보조인자가 필요하다는 것을 의미한다. 최근 연구에서 T 세포성 및 대식 세포성 바이러스와 이들의 표적세포의 융합에 필요한 보조 수용체가 각각 CXCR-4 및 CCR-5라는 것이 확인되었다.
융합 또는 LESTR로 알려진 CXCR-4는 원래 케모카인 수용체와 구조적으로 유사하여 오르판(orphan) 수용체로 발견되었다. 이후에 CXCR-4는 T 세포성 HIV 바이러스가 CD4+ 세포로 침입하기 위한 필수적인 보조인자로 확인되었다. β-케모카인 SDF-1은 CXCR-4의 리간드이며, T 세포성 HIV-1 종에 의한 감염에 강력한 억제제이다. 유사하게, β-케모카인, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES는 CCR-5의 천연 리간드이면서 T 세포성이 아닌 대식 세포성의 HIV 단리체에 대해 CD8+ T 세포가 생산하는 주요 HIV 억제 인자이다.
본 연구에서, DNA 면역원의 주사 후에 케모카인의 상당한 수준의 발현이 관 찰되었다. 이 결과는 면역 반응에 중요한 활성화제 및 조절제로서 가능한 역할을 의미하는 것이다. 면역 유도 및 조절에 케모카인의 특이적 기능을 밝히기 위해서, 항원 전달 모델로서 케모카인 DNA 발현 카세트의 동시 전달을 이용하였다. DNA 동시 면역은 DNA 백신이 MHC 클래스 I 및 II 경로를 통해 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하기 때문에 생체 내 케모카인의 기능을 조사하기 위한 적절한 모델이다. 또한, 본 발명자 및 다른 연구자들은 DNA 백신에 대한 항원 특이적 면역 반응이 동시 자극 분자 및 사이토카인 유전자와 DNA 면역원 카세트를 동시 주사에 의해 조절될 수 있다는 것을 보였다. 따라서, 본 발명자들은 동시 면역 케모카인 발현 벡터에 HIV-1 DNA 면역원을 클로닝하여 면역 활성화에 대한 케모카인의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 α-케모카인 IL-8 및 β-케모타인 MIP-1α, RANTES 및 MCP-1이 항원 특이적 면역 반응을 활성화시키는 데 특이적이고 확인가능한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
예를 들어, IL-8은 호중구에 대한 화학주성 인자이며, 호중구가 혈류를 벗어나 주변 조직으로 이동을 유발시킨다. 본 발명자들은 IL-8이 강한 T 헬퍼 증식 반응과 항체 반응에 의해 나타나는 CD4+ T 세포의 강한 유도제라는 것을 확인하였다. IL-8의 동시 발현은 면역 반응이 IgG1 대 IgG2a 비의 감소 및 IFN-γ의 상승된 발현으로 나타나는 Th-1 형 면역 반응으로 변화를 조절하였다. 반면, CTL 반응에 대한 상승 효과를 갖지 않기 때문에, IL-8 동시 투여는 CD8+ 세포에 확연한 효과를 보이지 않았다.
MIP-1α는 호산구를 화학유인하고 호산구를 탈과립화할 수 있다. 또한 MIP-1α는 호염기구 및 비만세포에서 히스타민 분비를 유도하며 호염기구 및 B 세포의 화학주성 인자이다. 이러한 보고는 MIP-1α가 항체 반응에 가장 큰 효과를 보인다는 본 발명자의 보고를 뒷받침해 준다. 또한, MIP-1α는 효과있는 T 헬퍼 증식 반응 및 CD4+ 세포의 강한 유도제였다. 또한, MIP-1α 동시 발현은 또한 면역 반응이 IgG1 대 IgG2a 비의 증가로 나타나는 Th-2 형으로 면역 반응의 변화를 조절하였다. 반면, MIP-1α 동시 면역은 CD8+ T 세포 반응의 최소 효과를 나타냈다.
IL-8 및 MIP-1α의 효과와 다르게, RANTES 동시 면역은 항체 반응에 대해 최소 효과를 보인다. RANTES는 단핵세포 화학유인제이다. 또한, RANTES는 비자극된 CD4+/CD45RO+ 기억 T 세포 및 자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 화학 유인할 수 있다. 본 발명자들은 RANTES가 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 DNA 면역 위치로 화학적 유인하는 능력은 T 헬퍼 세포 증식 반응 및 CTL 반응을 유도하는 데 중요한 기능을 한다는 것을 확인하였다. Th1 반응의 상승된 활성화는 Th1 사이토카인 IFN-γ 및 IFN-γ 및 TNF-α의 증가된 발현에 의해 뒷받침 된다. RANTES 발현에 의해 유도된 높은 수준의 CTL 반응은 클래스 I 한정적이거나 CD8+ 세포 의존적임이 확인되었다.
단핵세포의 가능한 화학 주성 인자, MCP-1은 만성 염증 질환에 가장 중요한 케모카인으로 생각된다. MCP-1은 단핵세포가 혈류에서 이동하여 조직 대식 세포가 되도록 유도한다. MCP-1는 활성화된 기억 서브셋의 T 림프구를 화학적 유인을 한다는 것이 확인되었다. 살펴본 모든 케모카인 중에서, MCP-1은 가장 강력한 CD8+ CTL의 활성제이다. MCP-1 발현에 의해 유도된 CTL 반응의 상승은 클래스 1-한정적이며 CD8+ T 세포 의존적이다. 상승된 CTL 결과는 Th1 사이토카인 IFN-γ 및 IFN-α의 상승된 발현 및 IgG1 대 IgG2a 비의 감소에 의해 뒤받침된다. RANTES와 다르게 MCP-1은 T 헬퍼 세포 증식 반응에 대해 양성이나 적정한 효과를 갖는다. RANTES와 같이 MCP-1 동시 투여는 항체 반응에 최소 효과를 갖는다. 이같은 비교는 체액성, T 헬퍼 및 T 세포독성 반응은 서로 독립적으로 조절될 수 있다는 것을 강조한다.
면역 반응에 대한 직접적 효과 외에, 케모카인 유전자의 동시 발현은 자가 분비형태로 발현을 증가시켰다. 예를 들어, 본 발명자들은 MIP-1α의 발현은 pCEnv 단독 면역에 의해 발현되는 수준에 비해 pCEnv+MIP-1α의 면역에 의해 크게 증가될 수 있다는 것을 확인하였다. RANTES에서 유사한 증가는 RANTES 동시전달 및 증가된 MCP-1로부터 확인되었다.
또한, 케모카인의 동시 발현은 다른 케모카인의 발현을 상승시켰다. 이러한 결과는 케모카인이 면역 반응을 조절하는데 직접적인 기능 뿐 아니라 다른 케모카인의 생산을 조절하는 기능을 한다는 것을 나타낸다.
TNF-α 발현 유도시에 케모카인 RANTES 및 MCP-1가 수행하는 기능은 중요한 발견이었다. TNF-α는 활성화된 대식세포 및 단핵세포, 호중구, 활성화된 림프구 및 NK 세포에 의해 생산되며, TNF-β는 림프구에 의해 생산된다. TNF-α는 또한 그람 음성 박테리아에 의한 감염 후의 패혈증 쇼크 및 류마티스 관절염에 관련된다. 또한, TNF-α는 다른 전염증성 사이토카인의 합성 조절에 중추적 기능을 수행한다. 여러가지 질병에서 TNF-α의 중추적 역할을 고려하여 류마티스성 관절염과 같은 질병의 효과적인 치료로서 TNF-α의 생체내 수준을 감소시키는데 주로 노력해왔다. 본 발명자들은 RANTES 또는 MCP-1의 동시 발현이 TNF-α의 발현을 상승시키다는 것을 확인하였다. 이 결과는 RANTES 및 MCP-1의 억제가 생체내 TNF-α 발현을 늦추는 적절한 전략을 구성할 수 있다는 것을 의미한다.
Th1 대 Th2 표현형이 다른 면역 기능과 무관하게 분리되어 나타난다는 것은 흥미로운 사실이다. IL-8은 체액성 반응을 부스팅하나 Th1 표현형으로 반응을 유도하고 IgG1/IgG2a 비를 절반으로 낮춘다. 반면에, 아마도 혈청학의 가장 많은 유도제인 MIP-1α는 IgG1/IgG2a 비를 Th2 반응쪽으로 극적으로 전환시켰다. 이 조작이 독립적으로 면역 글로불린 이소타입 및 목적하는 표현형 쪽으로 전환된 1차 항원 특이적 면역 반응의 유도를 가능하게 할 수 있다는 것은 명백하다. 또한, 세포성 대 보다 높은 체액성 반응의 유도는 상대적으로 편향된 면역 기능인 것으로 보였다. 체액성 반응에 가장 큰 효과를 갖는 케모카인인 IL-8 및 MIP-1α는 CTL 반응에 거의 효과를 보이지 않았으며, 반면에 CTL 반응에 가장 큰 효과를 매개한 RANTES 및 MCP-1은 혈청 시험에 최소 효과를 보였다. 동일한 CTL 유도 케모카인 RANTES 및 MCP-1은 IFN-γ 및 TNF-α를 모두 자극하였고, 반면에 체액성 반응자는 면역 활성화의 이들 사이토카인 제조자에 최소 효과를 보였다.
실시예 2
IL-18을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 백신 또는 면역 치료제의 일부로 세포에 전달은 전체 길이 형태로 불활성이면서 성숙형으로 프로세싱될 때만 활성화가 되기 때문에 덜 효과적이다.
도 1a에서, IL-18의 처음 35 개의 아미노산이 Caspase-1(ICE)의해 절단된다. 도 1b의 변이 IL-18로 번역되는 변이 IL-8의 뉴클레오티드 서열이 제조되었다. IL-18의 변이형은 본 발명의 효과적인 면역 단백질로서 작용한다. 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드와 함께 변이 IL-18을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 일으킨다. 변이형을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 pCDNA3에 삽입될 수 있다.
실시예 3
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열와 함께 CD40를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 CD40를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 CD40L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 Fas를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 ICAM-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 ICAM-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 LFA-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 LFA-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 VCAM-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 PECAM-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 E-셀렉틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MC-SF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 GC-SF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 M-CSF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 G-CSF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 IL-4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 E-셀렉틴을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 IL-7을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 NGF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 VEGF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 IL-7를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 NGF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 VEGF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MCP-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 RANTES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 CTL 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MCP-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다. 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 RANTES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MCP-1α를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다. 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 IL-8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 상승된 헬퍼 T 세포 반응을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MCP-1, RANTES, MIP-1α 및 IL-8 중 어느 하나의 전달은 상승된 항체 반응을 유발하였다.
MCP-1 또는 RANTES 중 어느 하나의 전달은 상승된 TNF-α 생산을 유발하였다.
면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 MCP-1, RANTES, MIP-1α 및 IL-8 중 어느 하나의 전달은 상승된 IFN-γ 생산을 유발하였다.
실시예 4
본 발명자들은 HIV-1 DNA 면역원 구조물과 함께 M-CSF(대식세포 집락 자극 인자), G-CSF(과립구-CSF) 및 GM-CSF(과립구/단핵세포-CSF)의 유전자 발현 카세트의 동시 전달에 따른 항원 특이적 면역 반응에 대한 효과를 조사하였다. 이들 사이토카인의 유전자는 각각 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 조절되는 발현 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 유전자 플라스미드 발현 카세트를 HIV-1 면역 원의 DNA 백신 카세트와 함께 마우스에 주사하였다. 본 발명자들은 항원 특이적 면역 반응의 방향과 크기에 대한 이들 유전자 보조 카세트의 동시 주입의 면역학적 효과를 분석하였다. 이 결과를 기본형의 Th1 및 Th2 형의 사이토카인(각각, IL-12 및 IL-4)의 유전자의 동시 전달과 본 발명자가 관찰한 결과를 비교하였다. 모델 항원으로서 이들 DNA 백신 구조물을 이용하여, 본 발명자는 CSF 유전자가 생체내 항원 특이적 면역 반응을 크고 현저하게 조절할 수 있으며 백신 특이적 형태로 β-케모카인 생산을 유도한다는 것을 확인하였다.
<재료 및 방법>
DNA 플라스미드
HIV-1 외피 단백질(pCEnv) 및 gag/pol 단백질(pCGag/Pol)을 발현하는 DNA 백신 구조물을 본원의 참고 문헌[Boyer, J.D., et al.(1997) Nature Med. 3,526-532)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사람 G-CSF 및 M-CSF, 쥐 GM-CSF의 유전자를 본원의 참고 문헌[Kim,J.J., et al.(1998) Eur.J. Immunol. 28, 1089-1103 및 Kim, J.J., et al. (1998) J. Clin. Invest. 102, 1112-1124]에 기재된 바와 같이 pCDNA3 발현 벡터(Invitrogen, Inc., San Diego, CA)에 클로닝하였다. 사람 G-CSF 및 M-CSF는 마우스 세포에서 활성을 갖는다고 보고되었다. 순수한 플라스미드 DNA를 세균 내에서 생산하여 Qiagen Maxi Prep kit(Qiagen, Santa Clara, CA)를 이용하여 정제하였다.
시약 및 세포주
마우스 비만세포종 P815 세포주를 ATCC(Rockville, MD)로부터 얻었다. HIV- 1 외피(vMN462), gag/pol(vVK1) 및 β-갈락토시다제(vSC8)를 발현하는 재조합 백시니아를 NIH AIDS Research 및 Reference Reagent Program으로부터 얻었다. 재조합 gp120 또는 p24 단백질을 ImmunoDiagnostics, Inc.(Bedford,MA)로부터 얻었다.
마우스에 DNA 접종
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Harlan Sprague Dawly, Inc., Indianapolis, IN)의 대퇴 사두근에 인산염 완충 식염수(PBS) 및 0.25% 부피바카인-HCl(Sigma, St.Louis,MO) 내에 조성화된 각각의 DNA 구조물 50 ㎍을 주사하였다. 여러 유전자 발현 카세트의 동시 투여하기 위해 주사에 앞서 선택된 플라스미드를 혼합하였다. 대조군 마우스를 pCDNA3 벡터 50 ㎍으로 면역시켰다. 각 연구는 3 개씩 수행하고 하나의 대포적인 결과를 제시하였다. 부스팅 주사 후 1주일에, 마우스를 희생시키고 비장을 회수하여 세포(Th 또는 CTL) 반응을 시험하기 위해 림프구를 단리하고 세포 반응을 시험하였다. 모든 동물을 펜실바니아 주립대학에서 온도 조절되고, 광주기 시설에 수용하고, 국립 보건원 및 펜실바니아 주립대학의 지침에 따라 관리하였다.
ELISA
0.1 M의 탄산-중탄산 완충액(pH 9.5) 내에 2 mg/㎖ 의 농도가 되도록 희석된 p24 또는 gp120 단백질 50 ㎕를 4℃에서 밤새 마이크로타이터 웰에 흡착시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈-20으로 세척하고 0.05% 트윈20을 포함하는 PBS 내의 3% BSA로 37도에서 1시간 동안 블록킹하였다. 마우스 항혈청을 0.05% 트윈-20으로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 나서 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma, St. Louis, MO)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 3'3'5'5' TMB(Sigma) 완충 용액으로 세척하고 현상하였다. gp120 특이적 IgG 서브클래스의 상대적 수준을 측정하기 위하여 HRP(Zymed, San Francisco, CA)에 접합된 항-쥐 IgG1 및 IgG2a로 항-쥐 IgG-HRP를 치환하였다. 이어서 ABTS 기질 용액(Chemicon, Temecula, CA)를 첨가하였다. 각 단계에서 플레이트를 세척 완충액(PBS + 0.05% 트윈-X)로 세차례 세척하였다. 플레이트를 광학 밀도 450nm에서 Dynatech MR5000 플레이터 판독기에서 판독하였다.
T 헬퍼 세포 증식 분석법
림프구를 비장에서 회수하여 적혈구를 제거하고 신선한 배지로 수차례 세척하고 이펙터 세포를 준비하였다. 단리된 세포 현탁액을 농도 5×106세포/㎖가 되도록 현탁시켰다. 5×105 세포를 포함하는 100 ㎕ 분취액을 편평한 바닥의 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 즉시 첨가하였다. 최종 농도 5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 재조합 p24 또는 gp120 단백질을 세개씩 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 3일간 인큐베이션하였다. 삼중수소화된 티민 1 mCi를 각 웰에 첨가하고 세포를 37℃에서 12 내지 18시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 회수하고 결합된 삼중수소화된 티민의 양을 Beta Plate 판독기(Wallac, Turku, Finland)에서 측정하였다. 자극 지수는 다음 식으로부터 결정되었다.
자극 지수(SI)=(실험회수/자연발생 수)
자동 발생 수 웰은 무관한 단백질 대조군으로서 10% 소 태아 혈청을 포함한 다.
세포 독성 T 림프구 분석법
5시간 51Cr 방출 CTL 분석법을 백시니아 감염 표적을 이용하여 수행하였다. 분석법은 시험관 내 이펙터 자극으로 수행하였으며, 이펙터는 CTL 배지에 5×106세포/㎖ 농도로 5일 동안 0.1% 글루타르알데히드로 고정된, 적절한 백시니아 감염 세포(외피의 경우 vMN462 및 gag/pol의 경우 vVK1)로 자극하였다. 이펙터를 2일간 RPMI 1640(Gibco-BRL, Grand Island, NY), 10% 소 태아 혈청(Gibco-BRL) 및 10% RAT-T-STIM로 구성된, ConA(Becton DIckinson Labware, Beddford, MA) 무첨가 CTL 배지로 비특이적으로 자극하였다. 백시니아 감염된 표적은 3×106 P815 세포를 37℃에서 12시간동안 10 내지 20의 다중 감염도(MOI)로 감염시켜 제조하였다. 표준 크롬 방출 분석법을 표적세포를 100mCi/㎖ Na2 51CrO2로 60 내지 120분 동안 표지하고 자극된 이펙터 비장세포와 37℃에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하는 데 이용하여 실시하였다. CTL 용해는 이펙터:표적(E:T)비가 50:1 내지 12.5:1의 범위에서 측정하였다. 상등액을 회수하여 LKB CliniGamma 감마 카운터에서 카운트하였다. 비용해율을 다음식에서 결정하였다.
100×(실험 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출)
최대 방출은 배지를 포함하는 1% 트리톤 X-100 내의 표적 세포의 용해에 의해 결정하였다. '자연 방출' 측정값이 '최대 방출'의 20%를 초과할 경우 본 분석 법은 유효하지 않다.
CD8 + T세포의 보체 용해
α-CD8 모노클로날 항체(Pharminge, San Diego, CA)로 처리하여 비장세포로부터 회수하고 CD8+ T 세포를 토끼 보체(Sigma)와 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
사이토카인/ 케모카인 발현 분석
CTL 분석을 위해 이펙터 자극된 상등액을 제 6일에 회수하여 IFN-γ 및 IL-4(Biosource Internatioanl, Inc., Camarillo, CA) 및 MIP-1α(R&D Systems, Minneapolis, MN), MIP-1β 및 RANTES(Intergen, Pace, NY)에 대한 ELISA 키트를 이용하여 사이토카인 및 케모카인의 양상을 측정 시험을 하였다.
<결과>
사이토카인 발현 카세트의 제작
사이토카인 유전자를 각각 pCDNA3 플라스미드 발현 벡터에 클로닝하였다. 사이토카인 구조물이 해당 단백질로 발현되는 지를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 이 구조물을 시험관 내에서 RD 근육 세포주에 트랜스펙션시켜 구조물의 발현을 사이토카인 ELISA로 분석하였다. 결과는 각 발현 카세트가 특이적 사이토카인(G-CSF -40-60 pg/㎖; GM-CSF >70pg/㎖; M-CSF ~60-70 pg/㎖)을 생산하였음을 증명하였다.
G- CSF 는 T 헬퍼 반응의 상승을 유도한다.
G-CSF는 대식세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 골수 기질 세포에 의해 생산되는 성장인자이다. G-CSF는 호중구, 내피 세포 및 혈소판을 활성화시키나 항원 제시 세포에 거의 직접적인 효과를 주지않는다고 생각된다. 본 발명자들은 항원 특이적 항체 반응에 대한 G-CSF 동시-발현을 조사하였다. pCEnv 및 pCEnv+G-CSF 면역된 마우스로부터 혈청을 회수하여 HIV-1 gp120 단백질에 대한 특이적 항체 반응을 ELISA로 분석하였다. DNA 면역후 제 6주에 회수한 혈청으로부터 gp 120 특이 항체 역가를 측정하였다. G-CSF 동시 면역은 gpl2O 특이적 항체 반응 수준에 크게 영향을 주지 않았다. pCGag/pol로 면역된 군에서 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, G-CSF 유전자와 동시 투여에 의해 유도된 gpl2O 특이적 IgG의 서브클래스가 결정되었다. IgG1형은 Th2 형 사이토카인에 의해 유도되고 IgG2a형 생산은 Thl 형 사이토카인에 의해 유도된다고 보고되었다. IgG2a 대 IgG1 (Thl 대 Th2)의 상대비를 측정하였다. pCEnv 면역된 군은 0.8의 IgG2a 대 IgG1을 보였다. 한편, 기본형의 Thl 사이토카인 IL-12 유전자의 동시 면역은 비율을 1.28로 증가시켰고, Th2 사이토카인 IL-4 유전자의 동시 주사는 상대비를 0.68로 감소시켰다. G-CSF의 동시 투여는 상대비를 1.1로 증가시켰다. 이것은 Th1형 반응으로 변화를 나타낸다.
T 헬퍼 세포 증식 반응에 대한 G-CSF 동시 발현의 효과도 조사하였다. T 헬퍼 림프구는 B 세포를 통한 체액성 면역 반응 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 통한 세포 면역 반응을 모두 유도하는 중요한 기능을 한다. IL-12 유전자와 동시 면역은 항원 특이적 Th 증식 반응 수준을 크게 상승시켰다. 반면, IL-4 유전자와 동시 면 역은 Th 증식 반응에 최소 효과를 보였다. HIV-1 면역원과 G-CSF의 동시 발현은 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 상승시켰다.
또한, CTL 반응에 대한 사이토카인 동시 발현도 조사하였다. 특이적 사멸의 기본 수준이 대조군 동물로부터 확인되었으며, 한편, pCEnv 또는 pCGag/pol로 면역된 동물은 작으나 양성인 항원 특이적 CTL 반응을 보였다. IL-12 유전자와 동시 주사는 항원 특이적 CTL 반응을 크게 상승시켰다. 반면, IL-4 유전자로 동시 면역은 반응에 대해 최소 효과를 보였다. 유사하게, G-CSF의 동시 면역은 항원 특이적 CTL 반응에 상승효과를 보이지 않았다.
사이토카인은 면역 반응시 면역 세포를 지시하고 표적화하는 데 중요한 역할을 한다. 예를 들어, IFN-γ는 T 세포 매개 세포독성의 면역 반응에 밀접하게 관계하는 반면, IL-4 는 B 세포 매개 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 CTL 분석을 위해 시험관 내에서 자극된 이펙터 세포의 상등액을 분석하고, 사이토카인 IFN-γ 및 IL-4의 분비에 대해 이펙터 세포를 시험하였다. 본 발명자들은 G-CSF 발현이 IFN-g(2배)의 수준을 증가시켰으나 IL-4의 생산에는 영향을 주지 않았다.
GM - CSF 는 항체 및 T 헬퍼 반응의 강력한 유도제이다 .
GM-CSF은 과립구 세포를 활성화시키고 분화시키며 내피세포, 적혈구, 거핵세포 및 T 헬퍼 세포의 성장 인자로 기능할 수 있다. GM-CSF가 사멸 T 세포에 영향을 줄 수 있는 지는 분명하지 않다. G-CSF 동시 발현에 비해, GM-CSF 동시 발현은 항원 특이적 체액성 반응의 유도에 큰 상승 효과(세포군 중에 가장 높음)를 보였 다. IL-4 동시 주사와 유사하게, GM-CSF 동시 면역은 외피 특이적 항체 반응에 최고 수준의 효과를 보였다. 유사한 결과가 pCGag/pol로 면역된 군에서 보여졌다. 한편, pCEnv로만 면역된 군과 비교해 볼때 pCEnv+GM-CSF 동시 면역은 IgG2a/IgG1 비율에 효과를 보이지 않았다. 또한, IL-12 동시 면역과 함께 HIV-1 면역원(pCEnv or pCGag/pol)과 GM-CSF 동시 발현은 최고 수준의 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 보였다. 또한, 본 발명자들은 GM-CSF 발현이 IFN-γ(2배) 발현을 증가시켰으나 IL-4 발현에는 영향을 주지 않음을 발견하였다. 반면, GM-CSF 동시 면역만이 항원 특이적 CTL 반응에 약간의 효과를 보였다.
M- CSF 는 CTL 반응의 강력한 유도제이다 .
M-CSF는 대식세포 및 대식 세포 근원 세포의 강력한 활성화제이다. M-CSF 수용체는 제한된, 다시 말해서 대식세포에 한정된 발현 형태를 갖는다. 상기와 같이 APC군에 대한 M-CSF의 직접적인 효과를 측정할 수 있다. GM-CSF와 달리, M-CSF의 pCEnv와 동시 발현은 HIV-1 외피 특이적 항체 반응에 대해 양성 상승 효과를 보였다(그러나, IL-4 또는 GM-CSF보다 더 적은 효과를 보임). pCEnv+M-CSF의 동시 투여 후, IgG2a 대 IgG1의 상대적인 비를 측정하였다. pCEnv로 면역된 군은 0.8의 IgG2a 대 IgG1의 비율을 보였다. 한편, pCEnv+M-CSF의 동시 주사는 상대비를 1.2로 증가시켰으며 이는 Th1 형 반응으로 변화를 의미한다. 또한, HIV-1 면역원(pCEnv 또는 pCGag/pol)과 함께 M-CSF의 동시 발현은 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응의 큰 증가를 보였다. CTL 활성에 최소 효과를 유발하는 pCEnv+G-CSF 또는 pCEnv+GM-CSF의 동시 주사한 경우와 다르게, pCEnv+M-CSF로 동시 주사 후에 HIV-1 외피를 발현하는 백시니아(vNN462)로 감염된 표적의 특이적인 사멸에서 더 큰 증가가 관찰되었다. 50:1의 이펙터:표적(E:T) 비율로 pCEnv+M-CSF로 동시 주사 후에 표적 세포에서 거의 40% 비용해율이 관찰되었다. 유사하게 pCGag/pol+M-CSF로 면역된 마우스는 HIV-1 Gag/pol을 발현하는 백시니아(vVK1)로 감염된 표적의 항원 특이적 CTL 용해에 큰 상승을 보였다. pCEnv+M-CSF로 면역된 마우스에 의한 IFN-γ 분비 수준은 pCEnv로 면역되거나 대조군에 비해 훨씬 크다. 반면, 이들 군의 IL-4의 수준은 매우 유사하였다.
M- CSF 동시 면역에 의한 CTL 반응의 상승은 CD8 T 세포 제한적이다.
M-CSF의 동시 발현을 통한 CTL 반응의 증가가 CD8+ T 세포에 제한되는 가를 확인하기 위해, balb/c 마우스에 대한 MHC 클래스 I 제한된 CTL에 특이적 에피토프로 제시된 HIV-1 외피 펩티드(RIHIGPGRAFYTTKN)를 이용하여 CTL 분석법을 실시하였다. 마우스를 50 ㎍의 DNA 구조물로 2주 간격으로 두차례 면역시키고, 2차 면역후 일주일에 비장을 회수하였다. 기술되어진 바와 같이 외피 특이적 펩티드로 시험관 내 자극후 단리된 비장세포에서 CTL 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 50:1의 E:T 비율에서 40% 비사멸율에서 M-CSF의 동시 주사 후에 CTL 반응의 큰 상승을 관찰하였다. 이것을 보체 용해에 의해 이펙터 세포군으로부터 CD8+ T 세포를 제거한 후 CTL 활성을 측정하여 확인하였다. CD8+ T 세포의 제거로 M-CSF와 동시 주사 후에 관찰된 항원 특이적 CTL 상승이 억제되었다. 이러한 결과는 세포 용해 활성의 상승이 항원 특이적이고, 클레스 I 제한적이며 CD8+ T 세포 의존적임을 나타낸다.
M- CSF 유전자의 동시 전달은 자극된 T 세포의 β- 케모카인 생산을 조절한다.
본 발명자들은 자극된 T 세포에서 β-케모카인(MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES)의 발현 형태를 조사하였다. 이 β-케모카인은 대식세포성이나 T 세포성이 아닌 바이러스에 대해 CD8+ T 세포가 생산하는 주요 HIV 억제 인자이다. 또한, 이 CD8+ T 세포 생산된 케모카인은 말초에서 세포 면역 확장에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 본 발명자들은 pCEnv의 DNA 면역은 β-케모카인인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 유도한다는 것을 확인하였다. 또한, 조혈 사이토카인 유전자와 동시 면역은 자극된 T 세포에 의한 케모카인의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 MIP-1α 발현은 pCEnv 단독 면역에 의한 발현 수준에 비해 pCFnv+G-CSF의 동시 면역에 의해 크게 상승되는 것을 확인하였다. 또한, MIP-1β의 발현이 pCEnv+M-CSF 동시 면역에 의해 크게 상승되었다. 한편, pCEnv+M-CSF, pCEnv+G-CSF 및 pCEnv+GM-CSF 동시 발현은 DNA 백신 카세트 단독에 의해 유도된 것에 비해 자극된 이펙터 세포에 의한 RANTES 발현을 크게 상승시키지 않았다. 그러나, 흥미롭게도, M-CSF는 자신의 유전자 면역에 의해 유도된 수준보다 훨씬 낮게 MIP-1α 수준을 감소 조절하는 것으로 보인다. 이 결과는 MIP-1α가 CTL 반응을 유도하는데 직접 관계하지 않고, 실제로 그 유도를 방해할 수 있다는 것을 제시한다.
<고찰>
아마도 주사 위치 또는 근육의 국부 림프절의 말초에서 국부적 면역 환경의 조작은 면역 반응의 크기 및 방향에 영향을 줄 수 있다. 본 발명자들은 DNA 백신의 분자 보조제로서 G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF의 동시 전달 유전자에서 유도된 면역 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF cDNA 구조물 모두 DNA 백신의 면역 형태를 고유하게 조절하는 것을 관찰하였다. G-CSF는 호중성의 과립구 계통의 조혈 세포의 증식, 분화 및 활성에 특이적 효과를 나타낸다고 가장 잘 알려진 다면발현성 케모카인이다. G-CSF는 엔도톡신, IL-1, TNF-α 및 IFN-γ를 포함하는 여러가지 자극에 의해 활성화시 단핵세포 및 대식세포에 의해 주로 생산된다. G-CSF는 호중성 과립구 전구체의 증식 및 성숙을 조절하며 식작용, ADCC, 과산화물 생성, 화학주성 및 세포 표면 부착 분자의 발현에 직접적으로 작용한다. G-CSF의 시험관 내 투여는 골수 조혈 조상 세포로부터 호중성 콜로니 형성을 자극할 수 있다. 임상적으로, G-CSF는 화학요법 및 방사선 요법 유도된 호중구 감소증의 치료에 가장 일반적으로 투여된다. 본 발명자들은 G-CSF 동시 면역이 전반적인 항체 반응에 최소 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. G-CSF 동시 발현은 IgG2a/IgG1 비의 증가 및 IFN-γ의 상승된 발현으로 나타나는 Th1형으로 면역 반응의 변화를 조절하였다. 또한, G-CSF 동시 발현은 T 헬퍼 증식 반응을 적절히 상승시켰다. 항원 제시에 직접적으로 영향을 주지 않는 전체 G-CSF는 항원 특이적 면역 반응에 최대한 적당한 효과를 갖는다.
GM-CSF는 여러가지 조혈 세포의 증식, 성숙 및 기능을 자극할 수 있는 다면 발현성 사이토카인이다. 처음에는 GM-CSF는 호중구, 단핵세포/대식세포 및 호산구 콜로니 형성을 자극할 수 있다고 확인되었다. GM-CSF는 사이토카인 또는 면역 및 염증 자극에 대해 T 세포, B 세포, 대식세포, 비만세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하는 여러 종류의 세포에서 생산된다. 본 발명자들은 GM-CSF는 강한 T 헬퍼 증식 반응 및 항체 반응의 강한 부스팅으로 나타나는 CD4+ Th 세포의 강한 유도제임을 확인하였다. 한편, pCEnv+GM-CSF 동시 면역은 IgG2a/IgG1 비에 영향을 주지 않았다. 또한, 항원 특이적 CTL 반응 유도에 효과를 보이지 않았다는 것은, GM-CSF 동시 투여가 CD8+ T 세포에 확연한 효과를 보이지 않음을 증명해 준다. 따라서, 이 사이토카인에 의해 유도된 백신의 도움은 완전히 T 헬퍼 세포에 집중된다. 이러한 결과는 분자 보조제로서 GM-CSF cDNA 구조물의 이용에 대한 앞선 연구를 뒷받침 하고 확장시켜 준다. 광견병 바이러스 당단백질을 발현하는 플라스미드 및 마우스 CM-CSF를 코딩하는 플라스미드의 근육내 동시 투여는 B 및 T 헬퍼 세포 활성을 상승시켰다고 보고되었다. 유사하게, 본 발명자들은 DNA 백신 구조물과 GM-CSF cDNA의 동시면역은 항원 특이적 항체 및 Th 세포 증식 반응을 증가시켰다고 보고하였다. 반면, GM-CSF 유전자를 이용한 상기 연구에서 CTL 유도에 거의 효과가 없음이 확인되었다. 인플루엔자 핵단백질(NP)을 코딩하는 DNA 면역원과 GM-CSF 동시 전달을 이용하여 유사한 결과가 보고되었다. 본 발명자들은 HSV-2 gD 단백질을 코딩하는 DNA 발현 구조물과 GM-CSF cDNA를 동시에 전달하였다. 이어서, 이 결과의 면역 표현형과 HSV 치사 후 면역된 동물의 사망률과 질병룰에 대한 백신 조절 효과를 분석하였다. GM-CSF 유전자 동시 투여는 생존율을 상승시켰을 뿐 아니라 질내 HSV 감염에 따른 진균성 손상의 빈도 및 손상 정도를 감소시켰다.
M-CSF는 단핵 식세포의 성장, 분화 및 기능의 조절자로 알려져 있다. M-CSF는 부착 분자 및 Fc 수용체의 발현을 증가시키고, 종양 파괴 활성을 증가시키고, IL-1, TNF-α 및 IFN-γ를 포함하는 사이토카인의 2차 분비를 상승시킨다. M-CSF는 본래, 혈청, 소변 및 다른 생물학적 유체에서 골수 조혈 조상 세포에서 대식 세포 콜로니 형성을 자극할 수 있는 인자로서 발견되었다. M-CSF는 섬유아세포, 자궁 내막의 분비 상피 세포, 골수 간질 세포, 뇌 성상세포, 골모세포, 신장 사구체간질세포, 각질 세포 및 LPS 또는 사이토카인 활성화된 대식 세포, B 세포, T 세포 및 내피 세포를 포함하는 많은 세포에서 생산될 수 있다. 조사된 CSF 중, M-CSF는 CD8+ CTL의 가장 강력한 활성화제이다. M-CSF 발현에 의해 유도된 CTL 반응의 상승은 MHC 클래스 I 제한되고 CD8+ T 세포 의존적이다. 상승된 CTL 결과는 IFN-γ의 생산 증가 및 IgG2a/IgG1 비율의 증가에 의해 뒷받침된다. GM-CSF 효과와 달리 M-CSF 동시 면역은 항체 반응에 약한 효과를 갖는다. GM-CSF의 효과와 유사하게, HIV-1 면역원과 M-CSF의 동시 발현은 정도는 약하지만 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식 반응을 증가시켰다. CTL 경로는 특히 이 사이토카인에 의해 특히 유리하다.
Th1/Th2 형 사이토카인 및 CSF 유전자의 면역 조절 효과를 비교하는 것은 흥미롭다. 예를 들어, GM-CSF 동시 주사는 IL-4 동시 면역과 유사하게 항체 반응 수준을 양성으로 조절하였다. 반면, IL-4 동시 면역은 IgG2a/IgG1비의 큰 감소를 보이는 더 큰 Th2 형 반응을 유도하였다. 또한, GM-CSF 동시 주사의 Th 증식 반응에 대한 큰 상승 효과는 단지 IL-12 동시 투여와 일치하였다. 반면, G-CSF 또는 GM-CSF가 아닌 M-CSF 유전자의 동시 전달은 CD8+ T 세포 제한 CTL 반응을 크게 상승시켰다. 이 결과는 면역 활성화 부위에서 이들 성장 인자의 생산이 DNA 백신 유도된 생체 내 면역 반응의 수준을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 이 결과는 이 성장 인자가 고유의 Th1 및 Th2 사이토카인의 도메인 하에 존재하는 것으로 고려되었던 면역 반응 캐스케이드를 조절하는 데 더 활동적인 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.
세포 기초 반응의 분석 외에, 본 발명자들은 CSF 유전자의 동시 발현의 결과로 생성되는 케모카인 생산의 조절을 조사하였다. 케모카인은 면역 및 염증 반응의 중요한 조절자이다. 이들은 특히 혈관에서 개체 방어의 말초 부위로 백혈구를 운반하는 분자의 조절에 특히 중요하다. 또한, 일부 케모카인은 말초 내 면역 확장을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 CD+8 이펙터 T 세포가 케모카인 발현 수준을 상승시켰으며, 반면에 면역 반응을 프라이밍시켰고, 이것은 항원 특이적 면역 반응의 확장기에서 마지막 단계의 이펙터 세포에 대한 조절 역할을 시사한다는 것을 확인하였다. 염증 및 면역 반응에서 기능 외에도, 일부 케모카인은 AIDS의 전이 및 진행에 중요한 역할을 할 수 있다. HIV 외피 당단백질 gp120의 CD4에 대한 결합은 바이러스 융합 및 침입에 충분하지 않다는 것이 10년 이상 예상되어 왔으며, 이는 HIV 감염에 추가적인 세포 표면 보조 인자가 필요하다는 것을 의미한다. 최근 연구에서 T 세포 반응성 및 대식세포 반응성 HIV 종이 표적 세포와 융합하는 데 필요한 보조 수용체가 각각 CXCR-4 및 CCR-5임을 확인하였다. β-케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES는 CCR-5의 천연 리간드이며 대식세포 반응성이면서 T 세포 반응성이 아닌 HIV 단리체에 대한 CD8+ T 세포에 의해 생산되는 주요한 HIV 억제 인자 중의 하나이다.
본 발명자들은 생체 내 백신 자극된 세포에 의한 MIP-1α, MCP-1 및 RANTES의 발현을 조사하였으며, CSF 유전자의 동시 면역 처리는 항원 자극된 T 세포에 의한 케모카인의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 MIP-1α 생산은 pCEnv 단독 면역에 의해 생산된 수준에 비해 pCEnv+G-CSF의 동시 면역 처리에 의해 크게 상승될 수 있다는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 MIP-1β 발현이 pCEnv+M-CSF 동시 면역 처리에 의해 크게 상승된다는 것을 확인하였다. 반면, 어떠한 동시 주사 방법도 자극된 이펙터 세포에 의한 RANTES의 발현을 유의하게 상승시키지 못하였다. 그 밖에 확인된 새로운 효과는 RANTES 및 MIP-1β의 큰 증가와 동시에 MIP-1α의 감소이다. 실제로, M-CSF에 의해 유도된 MIP-1α의 수준은 대조군 수준보다 더 낮다. 이 결과는 CCR1, CCR4 및 CCR5을 통한 MIP-1α의 신호 전달은 CCR3 또는 CCR9을 통하여 RANTES 또는 MIP-1β에 의해 전달되는 신호와 다른 신호라는 것을 의미한다. 이 결과로 면역 반응에 대해 추정되는 수용체 효과를 구별할 수 있다.
상기 결과는 성장 인자 cDNA 구조물의 동시 전달이 체액성 및 세포성(케모카인의 생산을 포함) 면역 반응을 조절한다는 것을 보여준다. 특히, M-CSF의 동시 주사는 항원 특이적 CTL 유도 및 케모카인 생산에 대한 대부분의 조절 효과를 갖는다.
실시예 5: ICAM-1은 T 세포 동시 자극 및 케모카인 생산을 제공한다.
본 발명자들은 케모카인에 의해 밀접하게 조절되는 세개의 특이적 부착 분자의 면역 조절 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 생체 내 면역 활성화에 있어 ICAM-1, LFA-3 및 VCAM-1의 기능을 조사하기 위해 DNA 백신 기술을 이용하였다. 특히, 본 발명자들은 ICAM-1, LFA-3 및 VCAM-1의 유전자를 각각 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에 발현 벡터에 개별적으로 클로닝하였다. 이어서, 이 구조물을 HIV-1 외피 또는 gag/pol 항원을 코딩하는 DNA 면역원과 함께 동시 면역하였다. 본 발명자들은 이 부착 분자 카세트의 동시 주사의 항원 특이적 면역 반응 수준에 대한 면역학적 효과를 분석하였다.
본 발명자들은 항원 특이적 T 세포반응이 DNA 면역원 및 부착 분자 ICAM-1 및 LFA-3의 동시 발현에 의해 상승될 수 있다는 것을 확인하였다. 그러나, ICAM-1 및 LFA-3은 항원 특이적 체액성 반응의 발현에는 역할을 하지 않는 것으로 보인다. 오히려, T 세포 반응에 특이적으로 영향을 주는 것으로 보인다. LFA-3은 CD4+ T 세포 반응을 상승시키고 CD8+ T 세포 기능에는 부수적인 영향을 보였다. 더 중요한 것은 ICAM-1 동시 투여는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응 모두를 크게 증가시켰다. ICAM-1 동시 발현은 항원 특이적 β-케모카인 생산을 크게 상승시켰으며 이는 말초의 T 세포 확장에 LFA-1의 라이게이션에 중요한 역할을 의미한다. 이 분자의 활 성화 표현형은 기본형 CD80/CD86 동시 자극 분자와 다른 것으로 보인다. 이 결과는 사이토카인, 케모카인 및 부착 분자의 말초 네트워크는 이펙터 작용 위치에서 이펙터 T 세포 반응을 통합적으로 조절한다는 것으로 보인다.
<재료 및 방법>
DNA 플라스미드
HIV-1 외피 단백질(pCEnv) 및 gag/pol 단백질(pCGag/Pol)을 발현하는 DNA 백신 구조물을 본원의 참고 문헌[Kim, J. J., et al Nature Biot. 15:641 645]에 기재된 바와 같이 제조하였다. ICAM-1, LFA-3 및 VCAM-1을 본원의 참고 문헌[Kim,J.J., et al.(1998) Eur.J. Immunol. 28, 1089-1103]에 기재된 바와 같이 pCDNA3 발현 벡터(Invitrogen, Inc., San Diego, CA)에 클로닝하였다. 순수한 플라스미드 DNA를 문헌[Kim, J. J., et al. Eur. J. Immunol 28:1089-1103]에 기재된 바와 같이 생산하였다.
시약 및 세포주
사람 횡문근육종(RD) 및 마우스 비만세포종 P815 세포주를 ATCC(Rockville, MD)로부터 얻었다. HIV-1 외피(vMN462), gag/pol(vVK1) 및 β-갈락토시다제(vSC8)를 발현하는 재조합 백시니아를 NIH AIDS Research 및 Reference Reagent Program으로부터 얻었다. 재조합 gp120 또는 p24 단백질을 ImmunoDiagnostics, Inc.(Bedford,MA)로부터 얻었다.
부착 분자 발현 구조물
ICAM-1, LFA-3, VCAM-1 구조물을 RD 세포로 트랜스펙션하여 분석하였다. 세 포를 트랜스펙션 72 시간 후에 회수하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 ICAM-1, LFA-3, VCAM-1의 모노클로날 항체(Pharmingen, San Diego, CA)로 FACS 분석법을 이용하여 발현을 시험하였다.
마우스에 DNA 접종
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Harlan Sprague Dawly, Inc., Indianapolis, IN)의 대퇴 사두근에 인산염 완충 식염수(PBS) 및 0.25% 부피바카인-HCl(Sigma, St.Louis,MO) 내에 제제화된 각각의 DNA 구조물 50 ㎍을 주사하였다. 여러 유전자 발현 카세트의 동시 투여하기 위해 주사에 앞서 선택된 플라스미드를 혼합하였다. 대조군 마우스를 50 ㎍ pCDNA3 벡터로 면역시켰다. 부스팅 주사 1주일 후에, 마우스를 희생시키고 비장을 회수하여 세포(Th 또는 CTL(세포독성 T 림프구)) 반응을 시험하기 위해 림프구를 단리하였다.
ELISA
0.1 M의 탄산-중탄산 완충액 내에 2 ㎍/㎖ 의 농도가 되도록 희석된 p24 또는 gp120 단백질 50 ㎕를 4℃에서 밤새 마이크로타이터 웰에 흡착시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈-20으로 세척하고 0.05% 트윈20을 포함하는 PBS 내의 3% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블록킹하였다. 마우스 항혈청을 0.05% 트윈-20으로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma, St. Louis, MO)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 3'3'5'5' TMB(Sigma) 완충 용액으로 세척하고 현상하였다. 플레이트를 광학 밀도 450nm에서 Dynatech MR5000 플레이터 판독기에서 판독하였다.
T 헬퍼 세포 증식 분석법
림프구를 비장에서 회수하여 적혈구를 제거하고 신선한 배지로 수차례 세척하고 이펙터 세포를 준비하였다. 단리된 세포 현탁액을 농도 5×106세포/㎖가 되도록 현탁시켰다. 5×105 세포를 포함하는 100 ㎕ 분취액을 편평한 바닥의 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 즉시 첨가하였다. 최종 농도 5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 재조합 p24 또는 gp120 단백질을 세개씩 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO2, 37℃에서 3일간 인큐베이션하였다. 삼중수소화된 티민 1 mCi를 각 웰에 첨가하고 세포를 37℃에서 12 내지 18시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 회수하고 결합된 삼중수소화된 티민의 양을 Beta Plate 판독기(Wallac, Turku, Finland)에서 측정하였다. 자극 지수는 다음 식으로부터 결정되었다.
자극 지수(SI)=(실험회수/자연발생 수)
자동 발생 수 웰은 무관한 단백질 대조군으로서 10% 소 태아 혈청을 포함한다. 또한, pCEnv 또는 대조군으로 면역된 동물은 보통 Pr55 단백질에 대해 1의 SI를 갖는다. 유사하게, pCGag/pol 또는 대조는 보통 gp120 단백질에 대해 1의 SI를 갖는다. 세포가 건강하도록 하기 위해서, PHA 또는 con A(Sigma)를 폴리클로날 작극제 양성 대조군으로 이용하였다. PHA 또는 con A 대조군 시료는 20 내지 40의 SI를 갖는다.
세포 독성 T 림프구 분석법
5시간 51Cr 방출 CTL 분석법을 백시니아 감염 표적을 이용하여 수행하였다. 분석법은 시험관 내 이펙터 자극으로 수행하였으며, 이펙터는 CTL 배지에 5×106세포/㎖ 농도로 5일 동안 0.1% 글루타르알데히드로 고정된, 적절한 백시니아 감염 세포(외피의 경우 vMN462 및 gag/pol의 경우 vVK1)로 자극하였다. 이펙터를 2일간 RPMI 1640(Gibco-BRL, Grand Island, NY), 10% 소 태아 혈청(Gibco-BRL) 및 10% RAT-T-STIM로 구성된, ConA(Becton DIckinson Labware, Beddford, MA) 무첨가 CTL 배지로 비특이적으로 자극하였다. 백시니아 감염된 표적은 3×106 P815 세포를 37℃에서 12시간동안 10 내지 20의 다중 감염도(MOI)로 감염시켜 제조하였다. 표준 크롬 방출 분석법을 표적세포를 100mCi/㎖ Na2 51CrO2로 60 내지 120분 동안 표지하고 자극된 이펙터 비장세포와 37℃에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하는 데 이용하여 실시하였다. CTL 용해는 이펙터:표적(E:T)비가 50:1 내지 12.5:1의 범위에서 측정하였다. 상등액을 회수하여 LKB CliniGamma 감마 카운터에서 카운트하였다. 비용해율을 다음식에서 결정하였다.
100×(실험 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출)
최대 방출은 배지를 포함하는 1% 트리톤 X-100 내의 표적 세포의 용해에 의해 결정하였다. '자연 방출' 측정값이 '최대 방출'의 20%를 초과할 경우 본 분석법은 유효하지 않다.
CD8 + T세포의 보체 용해
α-CD8 모노클로날 항체(Pharminge, San Diego, CA)로 처리하여 비장세포로부터 회수하고 CD8+ T 세포를 토끼 보체(Sigma)와 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
사이토카인/ 케모카인 발현 분석
CTL 분석을 위해 이펙터 자극된 상등액을 제 6일에 회수하여 IFN-γ 및 IL-4(Biosource Internatioanl, Inc., Camarillo, CA) 및 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES((R&D Systems, Minneapolis, MN; Intergen, Purchase, NY)에 대한 ELISA 키트를 이용하여 사이토카인 및 케모카인의 양상을 측정 시험을 하였다.
<결과>
ICAM -1, LFA -3 및 VCAM -1은 트랜스펙션된 세포에서 발현될 수 있다.
ICAM-1(pCICAM-1), LFA-3(pCLFA-3) 및 VCAM-1 (pCVCAM-1)의 유전자를 개별적으로 pCDNA3 발현 벡터에 클로닝하였다(도 2) pCICAM-1, pCLFA-3 및 PCVCAM-1 구조물이 해당 단백질을 발현하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 구조물을 시험관 내에서 사람 횡문 근육종(RD) 세포로 트랜스펙션시켰다. FACS 분석을 이용하여, 본 발명자들은 pCICAM-1, pCLFA-3 및 pCVCAM-1 발현 카세트를 트랜스펙션하여 ICAM-1, LFA-3 및 VCAM-1을 각각 특이적 발현시켰다. 또한, 본 발명자들은 두개의 DNA 발현 카세트를 근육 내로 동시 면역시켜 동일한 근육세포 내에서 코딩된 단백질을 모두 생체 내 동시 발현시켰다.
부착 분자의 동시 발현은 Ag 특이적 체액성 면역 반응에 영향을 주지 않는다
본 발명자들은 부착 분자의 동시 발현이 항원 특이적 면역 반응 유도에 갖는 효과를 조사하였다. 모든 실험에서, 각 50 ㎍의 DNA 발현 구조물 제 0주 및 2주에 BALB/c 마우스에 근육내 주사하였다. 조사된 제1 면역 파라미터는 항원 특이적 체액성 반응이었다. 면역된 마우스의 항혈청을 제 0, 2 및 6주에 회수하고 HIV-1 gp120 단백질에 대한 특이적 항체 반응을 ELISA로 분석하였다. ICAM-1, LFA-3 또는 VCAM-1의 동시발현은 pCEnv 면역에 의해 유도된 특이적 항체 결합 형태에 최소 효과를 갖는 것으로 보였다. 유사한 결과가 pCGag/pol로 동시 면역된 군에서 관찰되었다.
ICAM -1 또는 LFA -3의 동시 발현은 Ag 특이적 Th 증식 반응을 상승시킨다
세포 면역 반응의 크기에 대한 부착 분자 동시 발현의 효과를 조사하였다. CD4+ T 헬퍼 세포 증식 반응의 유도는 Th 세포가 B 세포를 통한 체액성 면역 반응 및 CD8+ T 세포를 통한 CTL 반응을 유도하는 데 중요한 기능을 하기 때문에 중요하다. pCGag/pol로 면역된 마우스 및 pCICAM-1, pCLFA-3 또는 pCVCAM-1으로 동시 면역된 마우스의 Th 증식 반응을 측정하였다. 재조합 gp12O HIV-1 외피 단백질(5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖)을 T 세포 증식의 특이적 자극을 위해 각 웰에 도말하였다. 또한, 본 발명자들은 무관한 단백질을 이용하여 T 세포의 비특이적 자극에 대해 이들 군을 분석하고 비 특이적 항원이 시험관 내의 T 세포 증식 반응을 유도하지 않는 것을 확인하였다. 대조군 벡터로 면역된 대조군에서 증식의 기본 수준을 확인하고 pCEnv 단독으로 면역된 군에서 적당한 수준의 증식을 확인하였다. 반면, pCICAM-1 또는 CLFA-3으로 동시 면역된 군은 매우 높은 수준의 증식 반응을 보였다. 한편, VCAM-1 유전자로 동시 면역된 군은 항원 특이적 Th 반응의 상승을 보이지 않았다. 유사한 결과를 pCGag/Pol로 동시 면역된 군에서 발견하였다. 면역원을 이용한 반복 실험에서, pCICAM-1 또는 pCLFA-3의 동시 전달은 항원 특이적 증식 반응을 3 내지 4배 증가되었다.
ICAM -1 또는 LFA -3의 동시 발현은 Ag 특이적 CTL 반응을 상승시킨다
세포 면역성의 상승을 더 조사하기 위해서, 본 발명자들은 pCEnv 및 pCGag/Pol로 동시 면역된 마우스의 비장 세포를 이용하여 CTL 분석을 실시하였다. 이펙터 비장 세포의 시험관 내 자극한 후 특이적 및 비특이적 백시니아 감염되거나 펩티드 처리된 표적으로부터 크롬 방출을 측정하여 분석을 수행하였다. 표적의 비용해를 계산하기 위해서 무관한 표적의 용해율을 특이적 표적의 용해율에서 빼주었다. pCDNA3, pCICAM-1, pCLFA-3 또는 pCVCAM-1 면역과 대조군 동물에서 특이적 사멸의 기본 수준이 확인되었으며, pCEnv로 면역된 동물은 낮은 수준의 CTL 반응을 보였다. 한편, pCEnv+pCICAM-1의 동시 면역은 CTL 활성에 큰 영향을 주었다. 50:1 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 pCEnv+pCICAM-1로 동시 면역 후에 HIV-1 외피 백시니아(vMN462) 감염된 표적의 40%이상의 비사멸율이 확인되었다. CTL 활성은 12.5:1의 E:T 비에서 20% 비용해율로 역가하였다. 반면, pCEnv+pCLFA-3의 동시 면역은 CTL 활성의 더 온건한 증가를 보였다. 유사한 CTL 결과는 pCGag+pol/pCICAM- 1 및 pCGag/pol+pCLFA-3로 동시 면역 후에 관찰되었다.
pCICAM-1 및 pCLFA-3의 동시 발현에 의한 CTL 반응에서의 증가가 CD8+ T 세포에 제한적임을 확인하기 위하여, 보체 용해에 의한 이펙터 세포군에서 CD8+ T 세포를 제거하거나/제거하지 않고 CTL 활성을 측정하여 CTL 분석법을 수행하였다. CD8+ T 세포의 제거는 pCICAM-1 및 pCLFA-3으로 동시 주사 후에 관찰된 항원 특이적 CTL 상승을 억제하였다. 이 결과는 세포 용해 활성의 상승이 항원 특이적 및 CD8+ T 세포 의존적이라는 것을 시사한다.
ICAM -1 또는 LFA -3의 동시 발현은 자극된 T 세포의 IFN -γ의 생산을 증가시킨다
면역된 동물 내에서 자극된 CTL이 생산하는 사이토카인의 분석은 확인된 CTL 결과를 뒷받침해 준다. 사이토카인은 면역 반응이 전개되는 동안 면역 세포를 지시하고 표적화하는 데 중요한 가능을 한다. 예를 들어, IFN-γ은 T 세포 매개된 세포독성의 면역 반응의 조절과 밀접하게 관계되어 있는 반면, IL-4는 B 세포 매개된 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 CTL 분석을 위해 시험관 내 자극된 이펙터 세포의 상등액을 분석하고 사이토카인 IFN-γ 및 IL-4의 분비를 시험하였다. 본 발명자들은 pCICAM-1의 동시 주사는 IFN-γ의 수준을 크게 증가시켰다. pCLFA-3의 동시 면역은 IFN-γ 생산을 더 온건한 증가를 보였다. 한편, 모든 군에서 분비된 IL-4의 수준은 유사하였다.
ICAM -1의 동시 발현은 자극된 T 세포의 β- 케모카인의 생산을 크게 증가시킨 다
최근, 본 발명자들은 CD8+ 이펙터 T 세포가 감염 말초 부위에서 특이적 케모카인을 생산하여 생체 내의 항원 특이적 반응을 확장시켰다고 보고하였다. 따라서, 본 발명자들은 자극된 CTL의 β-케모카인의 생산을 분석하였다. 본 발명자들은 CTL 분석을 위해 시험관 내 자극된 이펙터 세포로부터 상등액을 분석하고 β-케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 분비를 시험하였다. 본 발명자가 앞서 확인한 바에 따라, 본 발명자들은 pCEnv로 DNA 면역은 대조군 벡터에 비해 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 상당히 큰 수준의 발현을 유도하였다. 또한, 본 발명자들은 pCEnv+pCLFA-3 동시 주사가 pCEnv 면역된 군에 비해 β-케모카인 생산 수준을 증가시킨다는 것을 확인하였다. pCEnv+pCICAM-1의 동시 면역은 pCEnv로 면역된 군에 비해 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES 생산 수준을 더 크게 증가시켰다(2 내지 4배). 반면, pCVCAM-1의 동시 투여는 케모카인 발현 수준을 상승시키지 못하였다. 이 결과는 ICAM-1 및 LFA-3가 직접적으로 T 세포를 동시 자극한다는 것을 뒷받침한다.
ICAM -1 및 CD86 의 동시 발현은 Ag 특이적 CTL 반응을 공동으로 상승시킨다
B7 (CD80 및 CD86) 경로는 T 세포 반응을 개시 및 확장시키는 중요한 2차 시그날 전달을 위한 주 동시자극 경로로 간주된다. 이들 분자는 DNA 백신 내에서 조절제로서 조사되었다. 이러한 상황에서, CD86 분자는 백신 보조제로 전달될 때 CD8+ T 림프구의 항원 특이적 유도에 주요 역할을 한다. DNA 면역원과 함께 CD86 cDNA의 동시 투여는 항원 특이적 CD8+ CTL 반응을 크게 증가 시켰다. ICAM-1 및 LFA-3의 효과는 B7-CD28 시그날에 의존적이거나 생체 내 CTL을 유도하는 별개의 상승 경로를 제시할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 CD86 분자가 동시 발현될 경우 ICAM-1 및 LFA-3 분자가 CTL 유도 수준을 상승적으로 증가시킬 수 있는 가를 조사하였다. 한편, LFA-3 및 CD86 분자의 동시 발현은 CTL 반응 수준을 증가시키지 않앗다. 이러한 결과는 ICAM-1/LFA-1 경로는 CD86/CD28 경로와 독립적인 T 세포 동시 자극 시그날을 제공하고 생체내의 T 세포 반응을 상승적으로 확장시키는 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
자극된 CTL에 의한 IFN-γ 및 β-케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES 생산 수준은 ICAM-1/LFA-1 시그날이 CD86/CD28 시그날과 독립적으로 작용하고 T 세포 반응을 확장하도록 작용한다는 결과를 뒷받침 해준다. 본 발명자가 상기에 기재된 방법을 이용한 이펙터 T 세포로부터 상등액 분석시, 본 발명자들은 LFA-3 및 CD86 유전자가 IFN-γ,MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 수준을 크게 상승시켰다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 또한 T 세포 활성화에 있어서 ICAM-1 및 CD86 의 상승적인 특성을 의미한다.
<고찰>
면역 또는 염증 반응시, 림프구는 항원 노출 부위로 이동한다. 림프구 및 내피세포의 부착 분자는 직접적인 세포 접촉을 제공하며 림프구의 이동을 지시한다. 또한, 부착 분자는 T 림프구가 APC에 결합하는 데 중요한 역할을 한다. ICAM-1(CD54)는 내피세포, 대식세포, 수지상 세포 상에 발현되는 90 내지 114 kD의 분자로 LFA-1 및 Mac-1에 결합한다. T 림프구를 포함하는 거의 모든 백혈구는 LFA-1를 발현하는 반면, Mac-1 발현은 단핵세포, 대식세포 및 과립구에 제한되어 있다. LFA-3(CD58)는 APC를 포함하는 여러가지 세포형에서 발현되는 55 내지 70 kD 의 표면 분자이다[Springer, T. A., et al. 1987 Ann. Rev Immunol. 5:223-252, 본원의 참고 문헌]. 혈관 세포 부착 분자(VCAM-1)는 활성화된 내피세포 및 평활근 세포에 발현되는 110 kD의 표면 분자이다[Osborn, L., et al. 1989. Cell. 59:1203-1211, 본원의 참고 문헌]. VCAM-1은 호산구, 림프구, 단핵세포 및 호염기구를 포함(호중구는 제외)하는 대부분의 단핵 백혈구에 구조적으로 발현되는 후기 항원-4 (VLA-4) 를 인지하고 결합한다[Elices, M. J., et al. 1990 Cell. 60:577-584, 본원의 참고 문헌]. VCAM-l/VLA-4 상호작용은 백혈구 이동 및 혈관외 유출에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 T 세포 활성 및 확장에 필요한 자극 시그날을 제공하는 데 있어서 이들 세포 표면 부착 분자의 역할을 조사하기 위해 DNA 면역원 모델을 이용하였다. 두가지 시그날 T 세포 활성화 모델에서, 1차 활성화 시그날은 항원성 펩티드-MHC 복합체의 T 세포 수용체 결합에 의해 매개된다. 2차 동시 자극 시그날은 CD80/CD86 동시 자극 분자와 T 세포에 존재하는 그들의 수용체 (CD28/CTLA-4)와 결합을 통해 제공된다. 이 두개의 시그날 모델은 개념적으로 간단하며 실험 결과에 의해 잘 뒷받침되고 있지만, T 세포 활성화 과정시 제공되는 동시 자극 시그날은 B7 (CD80/CD86) 분자에만 한정되는 것은 아니다. 또한, APC 상의 부착 분자와 같은 추가적인 세포 표면 분자는 보조자극을 제공하는 데 중요한 역할을 하고 있으며, CD4+ 및 CD8+ T 세포에 직접적인 시그날을 제공하는 역할은 연구 중에 있다.
부착 분자는 백혈구 운반, 염증 세포 모집 및 면역 감시기구에 중요하다. 최근에, T 세포 활성화에 있어서 부착 분자의 역할인 제안되었다. 본 발명자들은 T세포의 리간드에 결합하는 부착 분자를 이용하여 그 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 세가지 관련된 분자 ICAM-1(CD54), LFA-3 (CD58) 및 VCAM-1(CD106)을 선택하였다. DNA 면역원과 함께 ICAM-1, LFA-3 및 VCAM-1 DNA 발현 카세트를 이용하여 본 발명자들은 항원과 함께 동시 발현되는 부착 분자의 특이적 효과를 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 항원 특이적 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포 포함) 반응이 DNA 면역원 및 부착 분자 ICAM-1 및 LFA-3의 동시 발현에 의해 상승된다는 것을 확인하였다. DNA 면역원과 함께 ICAM-1 또는 LFA-3 분자의 동시 발현은 Th 세포 증식 반응을 크게 상승시켰다. 또한, pCICAM-1(pCLFA-3 경우 더 온건하게)과 동시 면역은 CD8+ 한정된 CTL 반응을 크게 상승시켰다. 또한 이같은 발견은 LFA-3와 동시 면역은 자극된 CD8+ T 세포에 의해 IFN-γ 및 β케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 생산 수준을 증가시켰다는 사실에 의해 뒷받침된다. 더욱 중요하게도, ICAM-1과의 동시 면역은 IFN-γ 및 β-케모카인을 크게 상승시켰다. 또한, 증가된 세포 접촉 또는 세포만의 배열은 항원 특이적 T 세포 매개 반응을 상승시키지 못한다는 사실은 중요하다. ICAM-1 및 VCAM-1이 유사한 분자 크기를 갖는다 해도, VCAM-1의 동시 주입은 T 세포 반응에 대해 측정가능할 만한 효과를 갖지는 못했다. 반면에, ICAM-1 동시 발현은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 수준을 크게 상승시켰다. 이 결과는 T 세포 자극 효과는 부착 특성 또는 분자의 크기와 일치하지 않는다는 것을 의미한다. CTL(ICAM-1 및 LFA-3)을 상승시킨 CTL 유도 부착 분자가 여러 APC 상에 발현된다는 것은 흥미롭다. 사실, 부착 분자 ICAM-1을 유도하는 최선의 CTL은 수상세포에서 발현된다는 것은 매우 중요하다.
또한, 본 발명자들은 CTL의 상승된 유도와 CD86 발현으로 상승된 것을 비교하였다. 본 발명자들은 CD86 분자와 LFA-3가 아닌 ICAM-1과의 결합이 항원 특이적 CTL 반응을 상승시킨다는 것을 확인하였다. 이 결과는 크게 상승된 IFN-γ의 발현과 말초에서 면역 활성화에 중요한 역할을 하는 β-케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES의 크게 상승된 생산에 의해 뒷받침된다. 이 분자의 생물학적 중요성을 설명하기 위해서는 더 많은 연구를 필요로 하지만, 최근 연구는 케모카인 MIP-1β 및 RANTES과 CTL 반응 사이의 관계를 발견하였다. 추가의 연구가 이 분자의 보조 작극 역할을 더 자세한 것을 제공할 수 있지만, 이 결과는 ICAM-1 분자가 CD86으로 독립적인 경로를 통해 T세포 동시 자극 시그날을 제공할 수 있으며 T 세포에 제공된 동시 자극 시그날의 전체 수준을 상승적으로 증폭시키도록 작용할 수 있다는 것을 의미한다. 종합적으로, 이 결과는 부착 분자, ICAM-1 및 LFA-3는 중요한 동시 자극 시그날을 제공할 수 있으며, 이는 T 세포활성화의 두가지 시그날 모델은 개념적으로 유용하기는 하지만, 불완전할 수 있으며 동시 자극의 다중 원인으로 새로운 모델이 고려되고 연구되어야 한다. 또한, 이같은 결과는 다른 세포 표면 분자의 T 세포 동시 자극 기능을 이용하도록 의도된 추가적인 연구가 보증된다는 것을 나타낸다.
이 연구에 관한 중요한 것은 세포 면역 반응을 상승시키는 기능을 하는 분자이다. 최근 연구는 플라스미드 DNA의 주사는 낮은 효율로 대식세포와 수지상 세포를 포함하는 APC를 트랜스펙션시킬 수 있다고 보고하였다. 이 결과는 또한 DNA 면역 반응을 개시하는 골수 유래 세포의 필요성을 열거하는 골수 키메라를 이용한 연구에 의해 뒷받침될 수 있다. 본 연구에서 확인된 일부 동시 자극은 트랜스펙션 및 상주하는 전문 APC에 의한 상승된 T 세포 개시를 통해 발생할 수 있는 사실은 문헌과 일치한다.
앞선 보고와 함께, 이 결과는 T 세포 동시 자극에 있어 ICAM-1 및 LFA-3의 역할을 뒷받침하고 있다. LFA-3는 특히 클래스 II 반응에 특정 효과를 갖는 반면, 일반적으로 ICAM-1은 β-케모카인의 상승된 발현에 의해 증명된 바와 같이 CTL 유도 및 CD8+ 이펙터 기능의 강한 유도제 였다. 이러한 결과는 또한 말초에서 T 세포 이펙터의 모집 및 확장에 대한 일치하는 가설을 지지한다. 본 발명자들은 또한 화학유인제의 기능외에도, 케모카인이 말초 부위에서 항원 특이적 면역 반응의 조절 및 확장을 조절하다고 보고하였다. 본 발명자들은 CD8+ T 이펙터 세포가 케모카인 발현 수준을 조절하며 면역 반응을 개시한다는 것을 확인하였다. 따라서, 화학 주성에 있어서, 케모카인은 농도 구배를 이용하여 림프구의 이동을 조절한다. 또한, 부착 분자 발현의 적당한 재분배는 림프구의 말초로 이동을 지시하는 데 직접적 세포 대 세포 접촉을 제공한다. 또한, 부착 분자의 발현은 여러 염증성 사이토카인 및 케모카인에 의해 조절된다. 예를 들어 IFN-γ 및 TNF-α 내피 세포 및 근육 세포에 ICAM-1 발현을 증가 조절하는 것이 제시되었다.
그러므로, CD8+ T 이펙터 세포는 염증 부위에 더 많은 APC 및 T세포를 모으는 케모카인을 생산한다. 이 T 세포는 β-케모카인 생산에 의해 자극되어 IFN-γ 생산을 유도하고 T 세포 동시 자극을 가능하록 역할을 하는 부착 분자의 발현을 상승시키게된다. 따라서, 염증의 한 분위에서, 이 이펙터 CTL(들)은 특이적 케모카인 및 이펙터 기능의 수준을 확장시키는 부착 분자의 발현을 통해 조절될 수 있다. 이러한 결과는 항원 특이적 면역 반응의 확장기에서 최종 단계의 이펙터 T 세포가 이들 분자의 동기화된 발현 및 분비를 통해 자신의 운명을 지시할 수 있다.
실시예 6: 부착 및 동시 자극 분자는 다른 항원 특이적 면역 반응을 유도하고 단순 포진 바이러스-2에 대한 생체내 보호 면역성을 상승시킨다
T 세포 상의 CD40 리간드 및 백혈구 기능 관련 단백질(LFA)은 APC 상의 CD40 및 세포내 부착 분자(ICAM)과 각각 상호작용을 한다. 본 발명자들은 동시 자극 분자 CD40 및 CD40 리간드 및 부착 분자 LFA-3 및 ICAM-1로 동시 면역시키고, 이어서 gD 플라스미드 백신 및 HSV-2의 치명적 공격에 대한 보호에 대한 면역 조절 효과를 분석하였다. 본 발명자들은 전신의 gD 특이적 IgG 생산이 LFA-3의 동시 주사에 의해 크게 상승함을 관찰하였다. 그러나, CD40, CD40 리간드 및 ICAM-1의 동시주사에 의해서는 IgG 생산에는 거의 변화가 확인되지 않았다. 또한, Th1형 세포 반응 은 CD40 리간드에 의해 유도되는 반면, Thl 및 Th2형 면역 반응은 LFA-3에 의해 유도되었다. CD40 리간드 및 LFA-3의 동시 전달도 치명적인 HSV-2 침입으로부터 생존율을 상승시켰다. 이 연구는 동시자극 및 부착 분자가 다른 동시자극 경로를 가지며 보호 측면의 항원 특이적 면역성을 생산하는 데에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 증명하였다.
항원 특이적 면역 반응의 유도에서의 동시 자극 및 부착 분자의 특이적 역할 및 마우스 HSV-2 침입 모델계 내의 DNA 백신 유도된 보호 면역성을 유도하는 플라스미드 전달의 일부로서 동시 자극 및 부착 분자를 이용한 백신의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 동시 자극 및 부착 분자가 항원 특이적 면역 반응을 상이하게 조절한다는 것을 확인하였다. 특히, 동시 자극 분자 CD40 리간드 및 부착 분자 LFA-3의 동시 전달은 항원 의존적 방법으로 상당한 CD4+ T 세포 활성을 유도하고 치명적 HSV-2 공격으로부터 생존율을 상승시켰다.
<재료 및 방법>
마우스 - 암컷 4 내지 6주령의 BALB/c 마우스를 Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, Ind.)로부터 구입하였다. 마우스를 미국 국립 보건원(Bethesda, Md.) 및 펜실바니아 주립대학(Philadelphia, Pa.)의 지침에 따라 관리하였다.
시약 - HSV-2 균주 186 (P. Schaffer 제공, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pa.)을 Vero 세포주(American Type Culture Collection, Rockville, Md.)에서 증식시켰다. 재조합 HSV-2 gD 단백질을 본 연구에서 재조합 항원으로 사 용하였다. 사람 횡문근육종(RD) 세포주를 ATCC (Rockville, Md.)로부터 얻었다.
플라스미드 및 DNA 제조 - DNA 백신, HSV-2 gD 단백질을 코딩하는 pAPL-gD2는 문헌[Pachuk, et al. 1998 Current topics Microbiol. Immunol. 226, 79, 본원의 참고문헌]에 기재에 따라 제조하였다. CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1의 cDNA를 발현 벡터 pCDNA3에 클로닝하여 pCDNA3-CD40, pCDNA3-CD40 리간드, pCDNA3-LFA 및 pCDNA3-ICAM-1을 각각 제조하였다. 플라스미드 DNA를 세균 내에서 생산하여 이중 밴드의 CsCl 방법으로 정제하였다.
CD40 및 CD40 리간드 유전자 구조물의 시험관 내 발현 - CD40, CD40 리간드, LFA-3, 및 ICAM-1 구조물의 발현을 RD 세포에 트랜스펙션하여 분석하였다. 세포를 트랜스펙션 72시간 후에 회수하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합 모노클로날 항체(Pharmingen, San Diego, CA)로 FACS 분석법을 이용하여 LFA-3, ICAM- 1, CD40 및 CD40 리간드의 발현을 시험하였다.
마우스에 DNA 접종 - BALB/c 마우스의 대퇴 사두근에 인산염 완충 식염수(PBS) 및 0.25% 부피바카인-HCl(Sigma, St.Louis,MO) 100 ㎕ 내에 제제화된 gD DNA 구조물을 28 게이지 바늘(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)로 주사하였다. 주사에 앞서 여러 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현 카세트 시표를 pgD 플라스미드 용액과 혼합하였다.
ELISA - gD 특이적 IgG 서브클래스의 상대적 수준을 측정하기 위하여 HRP(Zymed, San Francisco, CA)에 접합된 항-쥐 IgG1 및 IgG2a를 이용하여 효소-연 결된 면역흡착 분석법(ELISA)을 수행하였다. ELISA 역가를 비처리 마우스의 혈청과 동일한 광학 밀도를 나타내는 최고 혈청 희석액의 역으로서 측정하였다.
케모카인, Th1 및 Th2형 케모카인 - 6×106 비장 세포를 포함하는 1 ㎖ 분취액을 24웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 1 ㎍의 HSV-2gD 단백질/㎖을 각 웰에 첨가하였다. 5% CO2 내에 37℃에서 2일간 인큐베이션 후에, 세포 상등액을 취하여 세포외 유동액을 사이토카인 또는 케모카인 특이적 ELISA 플레이트에 첨가하여 시판되는 사이토카인 키트(Biosource, Intl., Camarillo, Ca 및 R&D Systems, Minneapolis, Md.)를 이용하여, IL-2, IL-10, IFN-γ, RANTES, MCP-1 및 MIP-1α의 수준을 측정하는 데 사용하였다.
질내 HSV-2 감염 - 바이러스를 접종하기 전에 질내 부위를 0.1 M NAOH 용액을 흡수시킨 면봉 애플리케이터(Hardwood Products Company, Guiford, ME)로 닦아내어 마른 면봉 애플리케이터로 닦아낸다. 생존율을 측정하기 위해 매일 마우스를 조사하였다.
통계 분석 - 통계 분석은 Student t 시험 및 ANOVA를 이용하여 실시하였다. 다른 면역처리군 사이의 값을 비교하였다. p값 < 0.05를 유의하다고 간주하였다.
<결과>
CD40, CD40 리간드, LFA-3, 및 ICAM-1은 트랜스펙션된 세포에서 발현될 수 있다 - CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1의 유전자를 각각 pCDNA3 발현 벡터에 클로닝하였다. CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1 구조물이 관련 단백질을 발현 할 수 있는 가를 시험하기 위해, 유전자 구조물을 시험관 내에서 사람 RD 세포에 트랜스펙션시켰다. FACS 분석법을 이용하여, CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1 발현 카세트의 트랜스펙션이 CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1을 각각 특이적으로 발현된다는 것을 확인하였다. RD 세포를 pCDNA3(대조군) 또는 CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1를 발현하는 pCDNA3으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 3일 후에 세포를 플레이트에서 회수하여 트랜스펙션된 유전자 산물의 발현을 검출하기 위해 α-CD40, α-CD40 리간드, α-LFA-3, α-ICAM-1 항체를 이용하여 FACS 분석법으로 분석하였다.
LFA-3는 전신성 IgG 반응을 상승시킨다 - CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1 발현 벡터와 gD 유전자 백신의 동시 주입이 gD에 대한 전신성 IgG 반응에 영향을 주는지 확인하기 위해, DNA 접종 후 혈청을 100배 희석하여 ELISA로 시험하였다. 마우스의 각 군(n=8)을 gD DNA 백신(60 ㎍) 및 동시 자극 분자의 유전자(40 ㎍)으로 두차례 면역시켰다. 2차 DNA 주입 2주일 후에, 마우스를 출혈 시키고 gD 반응을 위해 혈청을 1:100으로 희석하였다. gD DNA 백신(마우스 당 60 ㎍) 및 CD40 또는 CD40 리간드 플라스미드 DNA(마우스당 40 ㎍)의 동시 주입은 전체 IgG 수준에 유의한 영향을 주지 않았다. 군당 동일하게 회수한 혈청을 ELISA 역가를 결정하기 위해 연속적으로 희석하였다. 2차 면역 2주 후에 동일하게 회수한 혈정의 ELISA 역가는 6,400(CD40), 6,400(CD40 리간드) 및 6,400(단독의 gD DNA 백신단독)으로 결정되었다. 본 발명자가 gD DNA 백신(마우스 당 10 ㎍)과 동시 자극 분자(마우스 당 40 ㎍)을 동시 주사하고 한달 후에 얻어진 혈청을 시험하였을 때도 유사한 결과가 관찰되었다.
마우스 군(n=8)을 gD DNA 백신(60 ㎍)과 LFA-3 부착 분자 유전자 (40 ㎍)로 제 0 및 2주에 면역시켰다. 마우스를 2주마다 출혈시키고 gD와 반응시키기 위해 혈청은 1:100으로 희석하였다. LFA-3 cDNA와 동시 주입은 gD 백신 단독의 경우보다 훨씬 높은 전신성 IgG 반응을 상승시켰으며, 한편 ICAM-1 cDNA의 동시 주입은 거의 변화를 보이지 않았다. 군마다 동일하게 회수된 혈청을 ELISA 역가를 결정하기 위해 연속적으로 희석하였다. 광학 밀도를 405 nm에서 측정하였다. 수치와 바는 평균(n=8) 및 표준편차를 의미한다. ELISA 역가는 비처리 마우스의 혈청과 동일한 광학 밀도를 보이는 최고 희석율의 역수로 결정하였다. 2차 면역 2주 후에 동일하게 회수한 혈청의 ELISA 역가는 25,600(LFA-3), 6,400 (ICAM-1) 및 6,400 (gD DNA 백신 단독)로 결정되었다.
CD40 리간드 및 LFA-3는 IgG 이소타입 형태에 영향을 준다 - IgG 서브클래스는 유도된 면역 반응의 Thl 대 Th2 특성을 나타낸다. 본 발명자들은 CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1의 동시 주입에 의해 유도되는 IgG의 서브클래스를 분석하였다. DNA 벡터로 면역된 마우스의 gD 특이적 IgG 이소타입의 수준을 측정하였다. 마우스의 각군(n=8)을 gD DNA 백신(60 ㎍) 및 동시 자극 분자 유전자(40 ㎍) 또는 부착 분자 유전자(40 ㎍)으로 면역하였다. 2차 DNA 주입 2주 후에 마우스를 출혈시키고 동일하게 회수된 각 군의 혈청을 gD와 반응시키기 위해 1:100으로 희석하였다. 광학 밀도를 405 nm에서 측정하였다. CD40 리간드 유전자의 동시 주입은 gD 특이적인 IgG2a의 생산을 IgG1에 비해 상대적으로 증가시킨 반면, CD40 유전자의 동시 주입은 gD DNA 백신 단독 처리와 유사한 IgG 이소타입 형태를 보였다. IgG 생산에서 이러한 변화는 CD40 리간드 cDNA의 동시 주입에 의해 더 많은 Th1형 반응이 유도된다는 것을 보여준다. 그러나, LFA-3 동시 주입은 IgG1 및 IgG2a 이소타입을 gD DNA 백신 단독 또는 ICAM-1 동시 주입에 비해 크게 증가시켰다. 이러한 증가는 Th1 및 Th2형 반응이 LFA-3 cDNA의 동시 주입에 의해 유도된다는 것을 나타낸다.
CD40 리간드 및 LFA-3은 Th 세포 증식 반응을 상승시킨다 - T 헬퍼 세포는 각각 Ag 자극된 B 세포의 확장 및 CD8+ T 세포의 확장을 통해 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 데 중요한 역할을 한다. CD4 활성화의 특이적 지표로서, T 세포 증식을 조사하였다. 특이적 항원으로 시험관 내에서 자극될 때 사이토카인 유전자의 동시 면역 후 획득되는 T 세포의 증식 수준을 측정하는 것이 중요하다. gD-2 단백질(1 및 5 ㎍/㎖)을 T 세포의 항원 특이적 자극에 사용하였다. 양성 대조군으로, 5 ㎍/㎖ PHA는 폴리클로날 자극제로서 사용되었다. Th 세포 증식의 낮은 배경 수준이 음성 대조군에서 확인되었다. 그러나, gD DNA 백신은 음성 대조군에 비해 훨씬 높은 Th 세포 증식 반응을 유도하였다. CD40 리간드 및 LFA-3 cDNA가 동시 주입될 때, Th 세포 증식 수준은 더 많이 부스팅되었다. 그러나, Th 세포 반응의 증가는 CD40 및 ICAM-1 cDNA가 동시 주입된 동물에서 거의 검출되지 않았다. 이러한 경향은 시험된 2개의 다른 gD 항원 농도에서 확인되었으며, 이는 이 효과가 CD40 리간드 및 LFA-3에 의해 매개된다는 것을 반영하는 것이다. gD 플라 스미드 백신은 Balb/c 기본 발현에서 CTL 에피토프의 결여로 인해 CTL 반응을 일으키지 못한다. 그러나, 세포 효과를 더 자세히 평가하기 위해서, 사이토카인의 생산 형태를 조사하였다.
CD40 리간드 및 LFA-3는 Thl 및 Th2형 사이토카인 생산에 영향을 준다 - Th1 사이토카인(IL-2 및 IFN-γ) 및 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-10)은 면역 반응의 극성화를 이해하는데 핵심이 되어 왔다. Th1 면역 반응은 세포 면역을 유도하는 반면, Th2 면역 반응은 우선적으로 체액성 면역을 유도한다고 생각된다. 따라서, 본 발명자들은 동시 자극 분자의 존재 또는 비존재 하에 gD DNA 백신이 Th1 또는 Th2 면역 반응을 유도하는 지를 조사하였다. 동시 자극 분자 또는 부착 분자로 동시 면역처리된 마우스의 비장세포에서 IL-2, IL-10, IFN-γ, RANTES, MIP-1α 및 MCP-1의 생산 수준을 측정하였다. 마우스의 각 군(n=2)을 gD DNA 백신(60 ㎍) 및 동시 자극 분자 유전자 또는 부착 분자 유전자(40 ㎍)으로 제 0 및 2주에 면역시켰다. 최종 DNA 주입 후 2주일에 두마리의 마우스를 희생시키고 비장 세포를 회수하였다. 비장세포를 2일 동안 1 ㎍/㎖의 gD-2 단백질로 자극시켰다. IL-2 및 IFN-γ의 생산이 CD40 리간드 cDNA의 동시주입으로 크게 상승되었으나 IL-10 생산은 감소되었다. 그러나, CD40 및 gD 유전자의 동시 주입은 본 분석법에서 IFN-γ에 약간의 증가 효과를 보였다. 그러나, IL-2, IL-10 및 IFN-γ 생산은 모두 gD DNA 백신보다 LFA-3의 cDNA의 동시 주입으로 상당히 높게 상승되었으며, 반면 ICAM-1 및 gD 유전자의 동시 주입은 본 분석법에서 약간의 증가 효과를 보였다. 이는 CD40 리간드가 Th1 표현형에 대한 면역 반응을 유도하는 반면 LFA-3는 생체 내 Th1 및 Th2 면역 표현형에 영향을 준다는 사실은 뒷받침해준다.
CD40 리간드 및 LFA-3는 β 케모카인의 생산에 영향을 준다 - RANTES(활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현 및 분비됨), MIP (대식세포 염증 단백질)-1α 및 MCP(단핵세포 화학주성 단백질(MCP))-1를 포함하는 베타 케모카인(CC 형)은 특히 단핵세포성 식세포를 화학유인하고 T 세포, 호염기구, 호산구 및 단핵 식세포 및 여러 가용성 면역 조절자를 활성화시킨다. MCP-1에 비해, RANTES 및 MIP-1α는 주요한 HIV 억제 인자로도 보고되었다. 이들 분자는 염증 면역 반응의 조절에 중요한다고 생각된다. 그러나, 이들의 감염 질환에 대한 직접적인 역할은 연구중에 있다. 체내 케모카인 생산에 대한 백신 보조제로서의 CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1 분자의 생체 내에서 관계는 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명자들은 gD DNA 백신 및 CD40 리간드, CD40, LFA-3 및 ICAM-1 cDNA의 동시 주입에 의해 유도된 케모카인(RANTES, MCP-1 및 MIP-1α)의 수준을 조사하였다. gD DNA 백신은 단독으로 RANTES, MCP-1 및 MIP-1α의 생산을 항원 특이적 방법으로 상승시켰다. 또한, CD40 리간드 cDNA와 동시 주입은 gD DNA 백신 단독의 경우보다 RANTES 및 MIP-1α 생산을 약간 상승시켰다. 반면, MCP-1 생산은 CD40 리간드 동시 주입의 영향을 받지 않았다. 그러나, CD40 분자의 동시 주입은 β-케모카인 생산에 약간의 증가를 보였다. 결과는 LFA-3 cDNA의 동시 주입은 gD DNA 백신 단독에 비해 MIP-1α 및 MIP-1α의 생산을 약간 증가시켰다. 유사하게, RANTES 및 MCP-1α의 생산은 ICAM-1의 동시 주입에 의해 상승되었다. 반면, MCP-1 생산은 ICAM-1 동시 주입에 의해 억제되었다. 이러한 조절은 동시 자극 및 부착 분자가 각각의 β-케모카인 패밀리 의 각각 일원의 생산에 특이적 효과를 가질 수 있다는 것을 뒷받침해준다.
CD40 리간드 및 및 LFA-3는 질내(i.vag.) HSV 감염으로부터 보호를 증가시킨다 - HSV-2(186)의 치사량 (LD)50을 미리 측정하였다. gD 유전자 백신의 분자 보조제로서 CD40, CD40 리간드, LFA-3 및 ICAM-1 cDNA의 사용이 HSV-2 감염으로부터의 보호에 영향을 줄 수 있는 지를 결정하기 위해서 마우스를 DNA 백신 및 각각의 보조 자극 및 부착 분자의 cDNA로 면역시키고 HSV-2의 4LD50로 질내에 감염시켰다. 질내 감염 경로는 HSV-2가 피부점막으로 감염시켜 비뇨생식기 감염을 일으키는 것으로 선택되었다. gD DNA 백신 및 동시 자극 또는 부착 분자 유전자로 두차례 면역된 마우스의 생존율을 측정하였다. 마우스의 각 군(n=10)을 gD DNA 백신(10 ㎍) 및 동시 자극 또는 부착 분자 유전자(40 ㎍)로 한차례 면역시켰다. DNA 면역 4주 후에 마우스를 HSV-2 균주 186의 4LD50(1.4×104 pfu)로 마우스를 질내 감염시켰다. 마우스가 gD DNA 백신으로 면역되었을 때, 60%의 생존율을 보였으나 비처리 마우스 모두는 바이러스 감염후 13일 내에 사망하였다. 그러나, CD40 리간드의 동시 주입은 생존율을 100%로 증가시키고, 보호율을 40%를 상승시킨 반면, CD40 cDNA의 동시 주입은 gD DNA 백신 단독에 비해 보면 최소의 보호 효과를 보였다. 또한, LFA-3 cDNA의 동시 주입은 마우스의 생존율을 90%로 증가시켰다. 그러나, ICAM-1 cDNA의 동시 주입은 HSV-2 감염로부터 약간 좋은 보호 효과를 보였다.
<고찰>
항원 제시 동안, APC의 동시 자극 분자는 T 세포 반응의 개시 및 분화에 중 요하다. 특히, CD40L-CD40 상호 작용은 APC로부터 B7 및 IL-12 발현을 유도한다. 또한, IL-12는 T 세포에서 CD40 리간드 발현을 상승시키는 반면, IFN-γ은 CD40 리간드 발현을 억제하며, 이것은 T 세포의 CD40 리간드를 유도하는 자가 조절 기작이 있다는 것을 나타낸다. 또한, 사이토카인, IL-2 및 IL-4는 항 CD3 자극된 T 세포에 CD40 리간드 발현을 상승시키는데, 이는 생체 내 면역 반응을 매개하는 데 있어 동시 자극 분자와 사이토카인 사이에 협동 조절이 있다는 것을 나타낸다. 또한 CD40-CD40 리간드 상호 작용은 Th 세포 의존성 항체 반응, 전염증성 사이토카인 생산을 증가시키고, 대식 세포 종양 치사 및 미생물 치사 활성에 필요하다. 특히, CD40 리간드는 휴지기의 T 세포에서 발현되지 않으나 CD3-TCR 유발 과정에 의해 유도된다. CD40(45 내지 50 kDa 당단백질)은 TNF 수용체 패밀리의 일원이며 B세포, 단핵세포 및 수지상 세포 상에 발현된다. 그러나, 그의 리간드인 CD40 리간드(gp39)는 TNF-α와 서열 유사성을 갖는 II형 횡막 단백질이고, 활성화된 T 세포에서 일시적으로 발현된다. 그러나, T 세포의 부착 분자인 LFA-3와 APC의 ICAM-1의 상호작용은 ICAM-1에 대한 높은 친화도 및 결합성을 갖는 LFA-3의 구조 변화에 의해 크게 조절된다. CD3 모노클로날 항체 또는 클래스 II 및 항원과 함께 LFA-3의 동시 자극은 T 세포 증식 및 T 세포로부터 여러가지 사이토카인의 높은 발현을 가져온다는 것이 알려져 있다. 또한, ICAM-1과 LFA-3의 상호작용은 시그날 경로를 유발시킨다. 보조자극의 CD40/CD40 리간드 분자와 비교해 볼 때, 표면에 이들 부착 분자 및 항-CD3 또는 항 TCR 항체의 동시 존재는 T 세포로 알맞는 시그날의 전달에 필요하다.
DNA 백신과 함께 APC-자극 또는 유인 분자의 동시 주입은 두 종류의 면역을 더 효율적으로 유도한다. 근육내(i.m.) 주사시, DNA는 근섬유에 수용되어 내인성 발현되고, 항원의 자연형태를 면역계에 제시한다. 분비된 항원은 식세포 작용에 의해 소화되어 천연 T 세포를 자극하기 위해 필요한 1차 활성화 시그날, 동시 자극 리간드 및 사이토카인을 제공할 수 있는 대식 세포에 의해 펩티드-MHC II 복합체로 제시된다. 또한, 최근 증거는 DNA 백신의 i.m. 또는 피부 전달에 이어 APC의 직접적인 생체내 트랜스펙션을 뒷받침한다. DNA 백신과 동시 자극 분자, 예를 들어 B7.1 및 B7.2의 동시 주입은 Th 세포 증식 반응 및 세포독성의 T 세포 활성과 같은 항원 특이적 세포 면역 반응을 크게 향상시켰다. 유사하게, GM-CSF 유전자의 동시 주사는 바이러스 DNA 백신 모델에서 항체 및 세포 면역 반응 모두를 상승시킨다. pLacZ 및 CD40 리간드 cDNA의 동시 주사는 체액성 및 세포성, 특히 항원 의존 형태로 CTL을 상승시킨다. 그러나, 동시 자극 및 부착 분자와 동시 전달을 통한 HSV 감염 연구는 없었다. 또한, HSV-2에 대한 항원 특이적 면역 반응 및 보호적 면역성을 유도하는 2가지 다른 경로를 비교는 흥미로운 일이다.
본 발명자들은 CD40 및 CD40 리간드 유전자를 이용한 백신 조절을 통해 gD 특이적 IgG 생산의 증가는 거의 없는 것을 확인하였다. 그러나, 이것은 DNA 벡터(β-갈락토시다제)와 전달될 때, CD40 리간드의 동시 주사가 항원에 대한 항체 생산을 증가시켰다는 이전의 발견과 일치하는 것은 아니다. 이러한 불일치는 시험된 항원의 특성에 따른 것일 수 있다. 그러나, 유사한 IgG 이소타입 생산 형태가 CD40 리간드 동시 주사에 의해 유도되었다는 유사한 발견이 있다. 본 발명자의 연 구에서, Th1형 면역 반응에 의해 매개되는 것으로 생각되는 IgG1 이소타입과 비교해 볼 때 CD40 리간드의 동시 전달은 IgG2a 생산에 큰 증가를 유도하였다. 이 사실은 CD40 리간드의 발현을 유도하는 플라스미드 벡터의 동시 주사에 의해 gD 특이적 면역 반응의 Th1형에 대한 극성화가 일어난다는 것을 의미한다. 반면, gD DNA IgG 백신 단독 또는 ICAM-1 동시 주사와 비교할 때 LFA-3의 동시 주사에 의해 gD 특이적 IgG 생산의 큰 증가가 확인되었다. 이것은 LFA-3가 생체 내에서 항체 반응을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 LFA-3 동시 주사는 IgG1 및 IgG2a 이소타입 증가된 발현에 의해 나타나는 Th1 및 Th2 이소타입 생산을 모두 증가시키는 것을 확인하였다. 이것은, LFA-3가 생체 내 Th1 및 Th2 면역 반응을 모두 유도한다는 것을 나타낸다.
증가된 Th 세포 증식이 CD40 리간드를 코딩하는 플라스미드 DNA를 동시 주사하여 일어났다. 이것은 다시 CD40 리간드 분자가 항원 특이적 Th 세포 증식 및 IFN-γ 생산 및 CTL 반응을 증가시킨다는 다른 모델에서의 이전의 발견에 상응한다. 이같은 형태는 CD40 리간드 cDNA의 공동 주사가 IL-2 및 IFN-γ 분비를 상승시켰으나 IL-10의 생산을 억제하였던 본 발명인이 관찰한 사이토카인 생산 수준과 일치한다. 따라서, gD DNA 백신처리에 CD40 리간드 cDNA의 사용은 면역 반응을 Th1 표현형으로 극성화시키는데 효과적이었으며 이는 세포 매개 면역을 증가시킨다. 그러나, LFA-3의 동시 주사는 IL-2, IL-10 및 IFN-γ의 생산을 상승시킨 반면, ICAM-1의 동시 주사는 사이토카인 생산을 약간 증가시켰다. 이는 LFA-3가 Th1 및 Th2 표현형에 대한 면역 반응을 유도한다는 IgG 이소타입 패턴을 뒷받침하고 있 다.
최근, 케모카인이 면역 및 염증 반응에서 사이토카인과 유사한 방법으로 중요한 역할을 한다고 보고되었다. HSV 감염에 의해 매개되는 안염증 질환은 Th2형 사이토카인 단백질(IL-10)의 국부 투여로 억제되었다. 이러한 적용은 케모카인 생산을 억제하였다. 또한, 질환(안구의 염증)이 항 MCP-1의 주사에 의해 약화되지 않았으나 항 MIP-1α의 주사로 약화되었으며 이는 MIP-1α가 Th1 형 케모카인으로서 분리된다는 것을 의미한다. 그러나, 감염 상태에 대한 케모카인의 역할은 연구중에 있다. 본 연구에서, RANTES 및 MIP-1α의 생산은 CD40보다 많은 CD40 리간드의 동시 전달에 의해 주사로 상승되었으며, 이는 CD40 리간드 분자가 T 세포에서 β 케모카인 생산을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. LFA-3 및 ICAM-1은 모두 MIP-1α 및 RANTES의 생산을 상승시켰다. 반면, MIP-1 생산은 LFA-3에 의해 영향을 받지 않거나 ICAM-1에 의해 억제되었으며, 이것은 부착 분자도 생체 내에서 β 케모카인 생산을 조절할 수 있다는 것을 의미한다.
체액성, 세포성 또는 두개의 면역 반응이 HSV 감염에 대한 보호적 면역성을 제공할 수 있다고 보고되었다. HSV-특이적 모노클로날 항체의 수동 면역은 치명적인 HSV 감염에 대해 보호하는 결과를 보였다. 바이러스 감염시, 중화 항체는 유리 바이러스 입자를 불활성화시킬 수 있으나 세포내 HSV 감염을 억제할 수는 없다. 항원 의존성, 보체 매개 및 항체 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC)은 HSV 감염 조절에 충분하지 못하다. 따라서, HSV 특이적 세포 매개 면역성이 HSV-감염 세포를 제거하는 주요한 이펙터 기능을하고 HSV 감염을 조절한다고 제안되었다. CD4+ 및(또는) CD8+ T 세포에 의해 매개되는 세포 면역 반응의 HSV 감염 조절에 대한 중요성이 잘 보고되었다.
본 발명자들은 CD40 리간드 분자의 동시 주사는 HSV-2 감염에 의한 사망으로부터 보호를 크게 상승시켰다는 것을 확인하였다. 이것은 보호 면역성과 Th1 형 세포 면역성 사이의 긍정적인 상호 관계를 제안하고 있으며, 이것은 CD40 리간드 분자와 동시 주사될 때, Th 세포증식 반응 및 IFN-γ 생산 수준의 증가에 의해 뒷받침되고 있다. 본 발명자의 발견은 D40 리간드의 동시 주사가 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major)의 감염 또는 항원을 발현하는 전이성 종양에 대한 보호 면역성을 상승시킨다는 기존의 발견과 일치한다. 또한 본 발명자들은 LFA-3가 HSV-2 감염에 의한 사망으로부터의 보호를 크게 증가시킨다는 것을 확인하였다. 세포성 및(또는) 체액성 면역의 LFA-3 상승은 상기 계에서 HSV-2 유도된 사망율을 감소시키는 역할을 하는 것으로 보인다. CD4 리간드 또는 LFA-3 유도된 IFN-γ는 생체 내의 항 HSV-2 활성에 부분적으로 기여할 수 있다. 따라서, CD40 리간드 및 LFA-3 유도된 세포성 또는 체액성 매개 면역성은 HSV 감염의 보호와 밀접한 관계가 있는 것으로 보인다.
결론적으로, 본원에서 제공된 자료는 동시 자극 및 부착 분자가 항원 특이적 면역 반응을 유도할 때 다른 동시 자극 경로를 갖는다는 것을 시사한다. 특히, CD40 리간드는 Th1형으로 면역 반응을 유도하는 반면 LFA-3은 Th1 및 Th2 면역형을 모두 선호한다. 상기 활성은 이전에는 사이토카인에만 연관되어 있었다. 이 결과는 동시 자극 분자가 항원 특이적 면역성의 유도에 사이카인만큼 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, CD40 리간드 및 LFA-3는 gD DNA 백신처리에 있어 치명적인 HSV-2 감염에 대해 상승된 보호를 중개한다. 이러한 발견은 감염 질환에 대한 방어를 강화할 수 있다.
실시예 7
본 발명자들은 치명적 HSV-2 감염에 대한 면역 표현형 및 보호에 대한 케모카인(IL-8, IL-10, RANTES, MCP-1, MIP-1α)의 조절 효과를 분석하였다. 본 발명자들은 IL-8 및 RANTES의 동시 주사가 항원 특이적 면역 반응 및 치명적인 HSV-2 감염으로부터의 보호를 크게 증가켰다는 것을 확인하였다. 그러나, MCP-1 및 IP-10의 동시 주사는 감염된 마우스의 사망율을 증가시켰다. 이 연구는 케모카인이 보호적 항원 특이적 면역성 유도시에 중요한 역할을 하는 사이토카인과 유사한 방법으로 면역 반응을 조절하고 유도할 수 있다는 것을 증명해준다.
면역 또는 염증 반응의 개시는 동시 자극 분자, 부착 분자, 사이토카인 및 케모카인의 조화된 발현을 포함하는 복잡한 과정이다. 특히, 케모카인은 면역 세포가 수여자 방어의 말단 부위로 이동하는 것의 분자 조절에 중요하다.
케모카인 수퍼패밀리는 두개의 시스테인 잔기를 분리하고 있는 하나의 아미노산 서열의 존재(α패밀리) 및 비존재(β패밀리)에 따라 두개의 서브패밀리로 구성되어 있다. α 및 β 케모카인은 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵세포를 포함하는 여러가지 면역 세포형의 직접적인 이동을 유발한다고 알려져 있다. 최근, 케 모카인 패밀리(CXC 형), 인터루킨(IL)-8 및 인터페론-γ 유도성 단백질 (IP)-10 및 β 케모카인 패밀리(CC 형), RANTES (활성화시 조절됨, 정상 T 세포발현 및 분비), 단핵세포 화학주성 단백질 (MCP)-1 및 대식 세포 염증 단백질 (MIP)-1α는 T 림프구를 화학적으로 유인한다고 보여졌다. 특히, IL-8 및 IP-10은 호중구를 화학적 유인하여 혈류를 떠나 주변 조직으로 이동하도록 유도한다고 알려져 있다. 유사하게 RANTES는 단핵세포, 비자극된 CD4+/CD45RO+ 메모리 T 세포 및 자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 화학적으로 유인한다. MIP-1α는 호산구를 화학 유인하여 탈과립화한다고 알려져 있다. MIP-1α는 호염기구 및 비만세포로부터 히스타민 분비를 유발시키고 호염기구 및 B 세포를 화학적으로 유도한다. MCP-1은 만성 염증 질환에 중요한 케모카인이다. MCP-1은 단핵세포가 혈류로부터 조직 대식세포로 이동하도록 유도한다. MCP-1은 또한 활성화된 메모리 서브셋의 T 림프구를 화학적으로 유인한다. 최근 연구는 케모카인 수용체가 T 세포를 표지하고 케모카인이 항원 특이적 면역 반응 생성에 관계할 수 있다는 것을 뒷받침하고 있다.
면역 반응 및 보호 면역성의 조절을 조사하기 위해, HSV-2gD 단백질을 코딩하는 DNA 발현 구조물과 케모카인(IL-8, IP-10, RANTES, MCP-1, MIP-1α)을 코딩하는 플라스미드를 동시에 전달하였다. 이어서, 항원 특이적 면역 유도 및 감염으로부터의 보호에 있어 조절 효과를 분석하였다. 우선, 항원 특이적 항체 반응 유도에 대한 선택된 케모카인의 생체 내 효과를 조사하였다. 대조군으로서, 본 발명자들은 gD 백신 및 2개의 전염증 사이토카인, TNF 패밀리 유전자(TNF-1α, TNFMβ)로 동물을 면역시켰다. 이들 전염증 사이토카인은 초기 면역 반응에 유사하게 관계되다고 생각되고, 양성 대조군으로 역할을 한다고 연구되었다. ELISA를 이용하여 DNA 벡터로 면역된 마우스(Balb/c) 내에서 gD 특이적 전신성 IgG의 수준을 측정하였다. 마우스의 각 군(n=10)을 gD DNA 백신(마우스 당 60 ㎍) 및 케모카인 유전자(마우스 당 40㎍) 또는 TNF 유전자(마우스 당 40 ㎍)로 제 0 및 2주에 면역시켰다. gD를 항원 및 케모카인을 발현하는 DNA 구조물은 이미 클로닝되었다 (Pachuk, et al.1998 Current topics Microbiol. Immunol. 226, 79; Kim, et al. 1998 J. Clin. Invest. 102, 1112; 및 Kim, et al. 1998 Eur. J. Immunol. 28, 1089). 2 차 면역 2주 후에 마우스를 출혈시키고 각 군의 동일하게 모은 혈청을 gD로 반응시키기 위해 연속 희석을 하였다. ELISA 역가를 비처리 마우스의 혈청과 동일한 광학 밀도를 보이는 최대 혈청 희석율의 역수로 결정하였다. 흡광도(O.D.)는 405 nm에서 측정하였다. 2차 면역 2주일 후에 회수되어 동일하게 모은 혈청의 ELISA 역가를 IL-8에 대해 12,800, IP-10에 대해 6,400 및 RANTES의 경우 6,400, MCP-1의 경우 6,400, MIP-1α의 경우 12,800, TNF-α경우 25,600, TNF-β의 경우 6,400, gD DNA 백신 단독의 경우 6,400으로 정하였다. 이것은 IL-8 및 MIP-1α 유전자의 동시 주사가 적당하나 gD 특이적 IgG 항체는 큰 상승은 없었음을 보여준다. 반면, pgD 백신 단독 처리에 비해 IP-10, RANTES 또는 MCP-1은 유사한 수준의 항체 반응을 보였다. TNF-α cDNA 대조군은 gD DNA 단독 백신에 비해 높은 전신성 IgG 수준을 보였다.
IgG 1 이소타입의 유도는 Th2 형 사이토카인에 의해 유도되는 반면, IgG2a 이소타입 생산은 Th1형 사이토카인에 의해 생체 내에서 영향을 받으며 유도된다. 이것은 면역 반응이 Th1 또는 Th2 사이토카인 조절하에 있는 가를 결정하기 위한 표지로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 동시 주사에 의해 유도된 IgG 서브클래스를 분석하였다. 각 면역 군에 의해 유도된 IgG 이소타입을 측정하였다. 마우스 각 군(n=l0)을 gD DNA 백신(마우스 당 60 ㎍) 및 케모카인 유전자(마우스 당 40 ㎍) 또는 TNF 유전자(마우스 당 40 ㎍)로 제 0 및 2 주에 면역시켰다. 최종 면역 2주일 후에 마우스를 출혈시켜 gD와 반응을 위해 혈청을 1:100으로 희석하였다. gD 특이적 IgG 서브클래스를 결정하기 위해, HRP 접합된 쥐의 항 IgGl, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 (Zymed, San Francisco, CA)를 쥐의 항 IgG-HRP로 치환하였다. 흡광도(O.D.)를 405 nm에서 측정하였다. 상대적 광학 밀도를 각 IgG 서브클래스의 광학 밀도/총 광학밀도로 계산하였다. 선 막대는 각 마우스 IgG 서브클래스의 상대적 광학 밀도의 평균(n=10)을 나타낸다. IgG2a 대 IgG1(Th1 대 Th2)의 상대적 비율을 측정하였다. pgD 면역된 군은 0.62의 IgG2a 대 IgG1의 비를 보였다. IL-8, RANTES 또는 TNF-α 유전자의 동시 주사는 gD 특이적 IgG2a 대 IgG1의 상대비를 0.8로 증가시켰다. 반면 IP-10 및 MIP-1α의 동시 주사는 IgG2a 대 IgG1의 상대비(0.3 및 0.4)로 증가시킨 반면, MCP-1 또는 TNF-β 유전자의 동시 주사는 pgD 백신 단독 처리와 유사하게 IgG 서브타입 형태를 보였다. 이 분석법은 IL-8 및 RANTES가 IFN-γ 형 사이토카인과 유사한 방법으로 생체 에서 Th1 표현형에 대한 면역 반응을 유도한다는 점을 뒷받침하고 있다. 따라서, 이 결과는 체액성 면역 반응의 Th1 또는 Th2로 전환이 케모카인에 의해 조절될 수 있다는 HIV 모델에서의 기지의 발견을 확장하며, 또한 케모카인이 생체내에서 사이토카인 생산을 조절할 수 있다는 것을 시사한다.
세포 증식은 세포 매개 면역성의 효능을 평가하는 데 사용되는 표준 파라미터이다. 본 발명자들은 면역된 동물의 비장 세포를 gD 단백질로 시험관 내 자극시켜 케모카인 유전자의 동시 면역에 따른 Th 세포 증식 반응을 측정하였다. α-케모카인 cDNA, β-케모카인 cDNA 및 TNF 대조군으로 동시 면역된 마우스(Balb/c)에 시험관 내에서 gD 자극 후에 비장 세포의 Th 세포 증식 수준을 측정하였다. 마우스의 각 군(n=2)을 gD DNA 백신(마우스 당 60㎍) 및 케모카인 유전자 (마우스 당 40 ㎍) 또는 TNF 유전자(마우스 당 40 ㎍)으로 제 0 및 2주에 면역화 시켰다. 최종 DNA 주사 2주 후에 두마리의 마우스를 희생시켜 증식 분석을 위해 비장세포를 회수하였다. 비장세포를 ㎖ 당 1 및 5 ㎍의 gD-2 단백질과 양성 대조군으로서 ㎖ 당 5 ㎍의 PHA로 자극하였다. 자극 3일 후에, 세포를 회수하고 cpm을 계수하였다. 시료를 세개씩 분석하였다. PHA 대조군 시료는 40-50의 자극 지수를 보였다. pgD DNA 백신 단독 처리는 gD 특이적 Th 세포 증식 반응을 나타냈다. 본 발명자들은 Th 세포 증식 반응이 gD DNA 백신 단독 처리에 비해 IL-8, RANTES 및 TNF-α cDNA의 동시주사에 의해 크게 상승된다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 TNF-β 유전자의 동시 주사에 의해 증식이 약간 증가하였음을 확인하였다. 반면, IP-1O, MCP-1 및 MIP-1α 유전자를 사용한 동시 면역처리는 Th 세포 증식 반응의 수준에 최소 효과를 갖는 것으로 보였다. 그러나, 동시 주사는 PHA-유도된 비특이적 Th 세포 증식 반응에는 효과를 보이지 않았다(S.I.범위: 40 내지 50). gD 플라스 미드 백신 처리는 Balb/c 배경에서 CTL 에피토프의 부재로 인해 CTL 반응을 보이지 않는다. 그러나, 더 자세한 세포내 효과를 평가하기 위해서 본 발명자들은 사이토카인 생산 방식을 조사하였다.
Th 1 사이토카인(IL-2 및 IFN-γ) 및 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-10)은 면역 반응의 극성화를 이해하는데 핵심이되어 왔다. Th1 면역 반응은 세포 면역을 유도하는 반면, Th2 면역 반응은 체액성 면역을 우선적으로 유도한다고 생각된다. IgG 표현형 결과에 기초하여, 본 발명자들은 직접적으로 사이토카인 방출을 분석하여 Th1 대 Th2 문제를 평가하였다. 표 4에 제시된 바와 같이, IL-2 생산은 IL-8 cDNA의 동시 주사에 의해 거의 7배 정도로 크게 증가되었다. 또한, IL-2는 TNF-α cDNA 의 동시 주사 및 MIP-1α 카세트의 동시 주사에 의해 유도되었다. 특히, IFN-γ의 생산은 RANTES의 동시 전달에 의해 20배, IL-8에 의해 6배로 크게 상승되었으며, 이것은 또한 이소타이핑 결과를 뒷받침해주고 IL-8 및 RANTES가 Th1 형 세포 면역 반응을 항원 의존적 형태로 매개한다는 것을 증명하였다. RANTES, IL-8, TNF-α 및 TNF-β 동시 주사는 pgD 백신 단독에 비해 IL-10 생산을 크게 상승시켰다. 이것은 IL-8 및 RANTES가 Th2보다는 Th1의 T세포를 우세하게 유도한다는 것을 보여준다.
케모카인 동시 주사가 β 케모카인 생산을 항원 의존적 방법으로 유도할 수 있는 지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 동시 면역시키고, 이어서 재조합 gD 항원 또는 대조군 항원으로 시험관 내 자극 후에 비장세포의 β 케모카인 분비 수준을 분석하였다. 표 5에 제시된 바와 같이, MCP-1 생산은 IL-8 cDNA의 동시 주사에 의해 크게 증가되었으나 RANTES 및 MIP-1α 카세트로 동시주사에 의해서는 감소하였다. 특히 MIP-1α의 생산은 RANTES 및 IL-8의 동시 전달에 의해 가장 크게 증가하였다. RANTES의 경우, IL-8 및 RANTES의 동시 주사는 pgD 백신 단독에 비해 RANTES 생산을 더 크게 상승시켰다. 이것은 HSV 모델에서 RANTES가 IL-8과 상이하게 항원 특이적 면역 반응을 조절한다는 것을 나타내며, 또한 케모카인이 자신의 생산을 조절하다는 것을 뒷받침해준다.
HSV는 사람의 여러가지 질병, 예를 들어 독감, 안구감염, 뇌염 및 비뇨기 감염의 원인이다. HSV는 감염자의 빈번한 재발로 바이러스 잠복기를 확립시킬수 있다. 바이러스 감염기에, 중화 항체는 바이러스 입자를 불활성화시키지만 세포내 HSV 감염을 조절할수 없다. 오히려, 세포 매개 면역은 HSV 감염된 세포 및 생체 내 HSV 확산을 제거하는 주요 이펙터 기능을 수행한다. HSV에 대해 유도된 세포 독성 T 림프구(CTL)의 선택적인 이동은 동물 내에서 치명적인 HSV 침입으로부터 완전히 방어시킨다. 또한, Th1 형 CD4+ T 세포가 HSV-2 침입으로부터의 방어에 더욱 중요한 역할을 한다는 보고가 다수 있다. CD4+ T 세포가 생체 내에서 고갈되었을 때, HSV에 대한 보호적 면역성을 상실하였다. 또한, Th1 형 CD4+ T 세포는 다량의 IFN-γ를 생성하였다. IFN-γ는 세포 독성의 CD4+ T 세포 및 CD8+ CTL에 의해 더 잘 인지되도록 하기 위해 HSV 감염 세포에 클래스 I 및 II 발현을 상승 조절시키며, 직접적인 항HSV 효과를 갖는다. Th1 형 사이토카인 cDNA의 동시 전달은 치명 적인 HSV-2 침입으로부터 생존을 상승시키며, Th2 형 카이토카인 cDNA는 질병 상태를 악화시킨다. 유사하게, 기본형의 Th1 형 사이토카인 IL-12 cDNA의 동시 전달에 의해 상승된 방어는 HSV 감염 모델에서 Th1 형 CD4+ T 세포에 의해 매개되었으며, 이것은 HSV 감염에 대해 Th1 형 T세포 매개된 방어적 면역의 중요성을 강조하는 것이다.
항원 특이적 면역 조절이 병원균의 복제에 영향을 준다는 것은 중요하다. gD DNA 백신 플러스 α-케모카인 cDNA, β-케모카인 cDNA 및 TNF 대조군으로 면역된 마우스(Balb/c)의 생존율을 측정하였다. 마우스의 각 군(n=8)을 gD DNA 백신(마우스당 60 ㎍) 및 케모카인 유전자(마우스당 40 ㎍) 또는 TNF 유전자(마우스 당 40 ㎍)로 제 0 및 2주에 면역시켰다. 2차 면역 3주 후에 마우스를 HSV-2 균주 186의 200LD50(7×105 pfu.)로 질내 감염시켰다. 바이러스를 접종하기 전에 질내 부위를 0.1 M NAOH 용액에 담근 면봉 애플리케이터 면봉(Hardwood Products Company, Guiford, ME)으로 닦아내어 마른 면봉 애플리케이터로 닦아내었다. 생존율을 측정하기 위해 매일 마우스를 조사하였다. 바이러스 감염 후 61일에 생존한 마우스를 세었다. 결과를 토대로 실험을 한 번 반복하였다. 본 발명자들은 케모카인 동시 주사의 보호 효능을 쥐의 헤르페스 감염 모델로 분석하였다. 제 0 및 2주에 마우스를 DNA 벡터를 사용하여 근육내 동시 면역시키고 제2 면역 3주 후에 HSV-2로 감염시켰다. 질내 감염 경로는 HSV-2가 피부점막으로 감염되는 것으로 선 택되었다. gD DNA 백신 단독의 면역처리는 HSV-2의 200 LD50으로 질내 감염으로부터 63%의 마우스 생존율을 보였다. IL-8 및 RANTES cDNA로 동시 주사는 보호율을 거의 30% 생존율을 88%로 증가시킨 반면, MCP-1 및 IP-10의 동시 주사는 생존율을 gD 백신 단독으로부터의 전체 생존율보다 50% 감소보다 많은 25%로 감소시켰다.
유사하게, MIP-1α 동시 주사도 백신 처리된 동물의 생존율에 부정적인 영향을 주었다. 각 케모카인 군에서 시험된 전체 동물의 수를 고려할 경우 이러한 발견은 놀라운 것이다(gD 단독의 생존율, 18 마리 중 11 마리, 61%; IL-8의 생존율, 18 마리 중 17 마리, 94%; IP-10의 생존율, 18 마리 중 5 마리, 28%; RANTES의 생존율, 18 마리중 17 마리, 94%; MCP-1의 생존율, 18 마리 중 6 마리, 33%; MIP-1α의 생존율, 18 마리 중 8 마리, 44%). 이것은 IL-8 및 RANTES 케모카인 유전자의 동시 주사가 치명적인 HSV 침입에 대한 방어를 증가시키는 반면, IP-10 및 MCP-1의 동시 주사 및 더 적은 정도의 MIP-1α은 면역 반응의 유도에 불구하고 바이러스 감염에 더 민감하게 만든다. 이것은 케모카인 IL-8 및 RANTES가 항원 특이적 면역 조절을 통해 HSV-2 감염으로부터 보호를 상승시킨다는 것을 뒷받침한다. 이러한 연구는 케모카인이 사이토카인(Thl 대 Th2)와 유사한 방법으로 중요한 면역 반응 및 질병의 진행에 작용하고 조절할 수 있다는 것을 뒷받침한다. 중요한 면역 조절은 동시 전달되는 케모카인 cDNA의 이용을 통해 성취될 수 있으며 이것은 면역 반응 뿐아니라 질병 방어에도 영향을 준다. 또한 케모카인 유전자 전달 보조제의 사용, 특히 IL-8 및 RANTES는 HSV에 대한 더 효능있는 백신 또는 면역 치료법의 고안 에 중요할 수 있다. 본 발명자들은 Th1형 사이토카인 유전자의 동시주사가 치명적인 HSV 침입으로부터 방어율을 상승시키는 반며 Th2 형 사이토카인 동시주사는 바이러스 감염에 대한 동물의 감염가능성을 증가시킨다고 보고한 바있다. 발병 기전의 연구에 있어서, 병원균 감염의 저항력에 대한 Th1 유사 사이토카인 반응의 중용성이 보고되었다. 따라서, Th1 및(또는) Th2 형 면역 반응은 이들 케모카인에 의해 유도되고 있으며, 이것은 면역 반응의 특성을 기초로 한 HSV 감염 방어에 영향을 주는 것으로 보인다.
본 발명자들은 헤르페스 침입 모델에서 TNF 패밀리 동시 주사의 방어 효능을 비교하였다. TNF-α와 TNF-β 유전자의 동시 주사는 감염된 마우스의 생존율을 25%(gD 백신 단독에 의한 총 생존율의 50% 이상 감소)로 감소시켰다. TNF-α 유전자가 동시 주사된 마우스의 사이토카인 수준(IL-2, IFN-γ, IL-10) 뿐 아니라 gD 특이적 항체 및 Th 세포 증식 수준이 gD DNA 백신 단독 처리보다 훨씬 높다고 해도, HSV-2 감염에 대한 TNF 사이토카인 매개된 높은 감염도가 상기 동물에서 관찰되었다. 상기 발견의 원인은 불분명하나 반응의 특성이 병원균 감염의 조절에 매우 중요하다는 것을 뒷받침해준다.
결론적으로, 본원에 제시된 결과는 케모카인이 Th1 및(또는) Th2형에 대한 면역 반응을 항원 의존적 형태로 조절할 수 있다는 것을 증명한다. 이러한 활성은 이전에는 사이토카인에만 관련된 것이며, 케모카인이 항원 특이적 면역성을 유도하는데 있어 사이토카인만큼 중요한 역할을 갖는다는 것을 의미한다. 면역 치료법 및 백신 처리를 위해 면역 반응을 조절하는 케모카인의 이용은 더 많은 연구 가치 가 있다.
<표 1>
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저자: Screaton et al,
잡지명: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94(9), 4615-19
NGRF
승인번호: M14764
저자: Johnson et al,
잡지명: Cell, 1986, 47(4), 545-554
DR4 (TRAIL)
승인번호: U90875
저자: Pan et al.,
잡지명: Science, 1997, 276(5309), 111-113
DR5
승인번호: AFO12535
저자: Sheridan et al.,
잡지명: Science, 1997, 277(5327), 818-821
KILLER
승인번호:
저자: Wu et al.,
잡지명: Nature Genetics, in press,
TRAIL-R2
승인번호: AF020501
저자: MacFarlane et al.,
잡지명: J. Biol. Chem., 1997, in press
TRICK2
승인번호: AF018657
저자: Screaton et al.,
잡지명: Curr. Biol., 1997. in press
DR6
승인번호: AF068868
저자: Pan et al,
잡지명:
ICE
승인번호: U13698
저자: Alnemri, E. S., et al.
잡지명: J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995)
ICE
승인번호: U13697
저자: Alnemri, E.S., et al.
잡지명: J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995)
ICE
승인번호: U13699
저자: Alnemri, E.S., et al.
잡지명: J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995)
VLA-1
승인번호: X17033
저자: Takada., et al.
잡지명: J. Biol. Chem. 109(l), 397-407 (1989)
CD86 (137.2)
승인번호: U04343
저자: Azuma, et al.
잡지명: Nature. 366 (6450),76 (1993)
<표 2>
피코르나바이러스(picornaviruses)과
속: 리노바이러스(Rhinovirus): (의학) 일반 감기의 ~50%의 원인균
에테로바이러스(Etheroviruses):(의학) 폴리오바이러스(polioviruses), 콕 사키바이러스(coxackieviruses), 에코바이러스(echoviruses) 및 사람 간염 A 형 바이러스와 같은 엔테로바이러스
아프토바이러스(Apthoviruses):(수의)발 및 입 질환 바이러스
표적 항원: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG
칼시바이러스과
속: 바이러스의 노르와크 군: (의학) 바이러스는 유행성 위장염에 중요한 원인균
토가바이러스(Togaviruses)과
속: 알파바이러스(Alphaviruses): (의학 및 수의학) 세닐리스(Senilis) 바 이러스, 로스리버(RossRiver) 바이러스 및 이스턴 및 웨스턴(Eastern & Western)마뇌염
레오바이러스(Reovirus): (의학) 루벨라(Rubella) 바이러스
플라비비리두(Flariviridue) 과
(의학) 뎅기(dengue), 황열병, 일본 뇌염, 세인크 루이스(St. Louis) 뇌염 및 진드기매개뇌염바이러스.
간염 C 바이러스: (의학) 이 바이러스는 아직 과는 아니나 토가바이러스 또는 플라 비바이러스로 생각되며 토가바이러스 패밀리와 가장 유사.
코로나바이러스(Coronavirus) 과: (의학 및 수의학)
감염의 기관지염 바이러스 (가금)
돼지 전염 위장 바이러스 (돼지)
돼지 적혈구 응집 뇌척수염 바이러스 (돼지)
고양이 감염 복막염 바이러스 (고양이)
고양이 장관 바이러스 (cat)
개의 코로나(corona) 바이러스 (dog)
사람의 호흡 코로나바이러스는 일반 감기의 40가지 증례를 야기시킨 다.EX. 224E, OC43
주 - 코로나바이러스는비-A, B 또는 C 간염을 야기시킬 수 있다.
표적 항원:
E1 - M 또는 매트릭스 단백질로도 불림
E2 - S 또는 스파이크 단백질로도 불림
E3 - HE 또는 헤마클루틴-엘테로스(hemagglutin-elterose) 당당백질
(모든 코로나 바이러스에 존재하지 않음)
N - 뉴클레오캡시드
랍도바이러스(Rhabdovirus)과
속: 베실리오바이러스(Vesilioviruses)
리싸바이러스: (의학 및 수의) 광견병(rabies)
표적 항원: G 단백질
N 단백질
필로비리두(Filoviridue) 과: (의학)
마르버그 및 엘볼라(Marburg 및 Ebola) 바이러스와 같은 출혈열 바이러스
파르믹소바이러스(Paramyxoviruses) 과:
속: 파르믹고바이러스: (의학 및 수의)
멈프스(Mumps) 바이러스, 뉴 캐슬(New Castle)병 바이러스 (닭의 중요한 병 원균)
모르빌리바이러스(Morbilliviruses): (의학 및 수의)
홍역, 개 디스템퍼
누민바이러스(Pneuminvirus): (의학 및 수의)
호흡 기합포체 바이러스
오르도믹소 바이러스(Orthomyxoviruses) 과 (의학)
인플루엔자 바이러스
분가바이러스(Bungaviras) 과
속: 분가바이러스: (의학) 캘리포니아 뇌염, 엘에이 크로스(LA Crosse)
플레보바이러스(Phleboviruses):(의학) 리프트계곡열바이러스
한타바이러스(Hantaviruses):푸레말라(Puremala)는 헤마하진
(hemahagin)열 바이러스이다.
나이르바이러스(Nairvirus): 나이로비 양 질환
분류되지 않은 많은 분가바이러스(bungaviruses)
아레나바이러스(Arenaviruses) 과 (의학)
LCM, Lassa fever 바이러스
레오바이러스(Reoviruses) 과
속: 레오바이러스: 가능한 사람 병원균
로타바이러스(Rotaviruses): 어린이 급성 위장염
오르비바이러스(Orbiviruses): (의학 및 수의)
콜로라도 진드기 열, 레봄보(사람)마뇌증, 블루 통그(blue tongue)
레트로바이러스(Retrovirus) 과
아과:
온코리비리날(Oncorivirinal):(수의)(의학) 고양이 백혈병바이러스, HTLVI 및 HTLVII
렌티비리날(Lentivirinal):(의학 및 수의) HIN7, 고양이 면역결핍바이 러스, 마 감염, 빈혈 바이러스(anemia virus),
스푸마비리날(Spumavirinal)
파포바바이러스(Papovaviruses)과
아과:
폴리오마바이러스(Polyomavirus): (의학) BKU 및 JCU 바이러스
아과:
파필로마바이러스(Papilloma virus): (의학) 많은 암 또느 파필로마의 악성 진행 관련 바이러스 형
아데노바이러스(Adenoviruses) (의학)
EX AD7, ARD., O.B. - 호흡기 질환을 일으킴-275와 같은 일부 아데노바이러 스는 장염을 일으킴.
파르보바이러스(Parvoviruses)과 (수의)
고양이 파르보바이러스: 고양이 장염 유발
고양이 판루코페니아(panleucopenia) 바이러스
개 파르보바이러스
돼지 파르보바이러스
헤르페스바이러스(Herpesviruses) 과
아과: 알파헤르페스피리두(alphaherpesviridue)
속: 단순바이러스 (의학) HSVI, HSVII
바리셀로바이러스(Varicelloviruses): (의학 - 수의) 가광견병 -바리 셀라 조스터
아과 - 베타헤르프스비리두
속: 사이토메갈로바이러스 (의학)
HCMV
무로메갈로바이러스(Muromegalovirus)
아과: 감마헤르프스비리두(Gammaberpesviridue)
속: 림포크립토바이러스(Lymphocryptovirus) (의학)
EBV - (Burkitts lympho)
라디노바이러스(Rhadinovirus)
폭스바이러스(Poxviruses)과
아과: 코르도폭시비리두(Chordopoxviridue)(의학-수의)
속: 바리올라(Variola- Smallpox)
백시니아(Vaccinia-Cowpox)
파라폭시바이러스(Parapoxivirus) - 수의
아우이폭스바이러스(Auipoxvirus) - 수의
카프리폭스바이러스(Capripoxvirus)
레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus)
수이폭스바이러스(Suipoxvirus)
아과: 엔테모폭스비리두(Entemopoxviridue)
헤파드나바이러스(Hepadnaviruses)과
B 간염 바이러스
비분류
간염 델타바이러스
<표 3>
세균성 병원균
병원성 그람 양성 코커스에(cocci)는 누모코커스(pneumococcal), 스태필로코커스(staphylococcal) 및 스트렙토코커스(streptococcal)를 포함한다. 병원성 그람 음성 코커스는 메닌고코커스(meningococcal) 및 고노코거스(gonococcal)를 포함한다. 병원성 장의 그람 음성 바실러스(bacilli)는 엔테로박테리아세 (enterobacteriaccae); 수도모나스(pseudomonas), 아시네토박테이라 (acinetobacteria) 및 에케넬라(eikenella); 멜리오도시스(melioidosis); 살모넬라(salmonella); 시겔로시스(shigellosis); 헤모필루스(hemophilus); 산크로이드(chancroid); 브루셀로시스(brucellosis); 툴라레미아(tularemia); 에르시니아(yersinia)-파스투렐리아(pasteurelia);수투렙토바실루스(streptobacillus), 모닐리포르미스(moniliformis) 및 스피릴룸(spirillum);리스테리아 모노시토게네스(listeria monocytogenes); 에리시펠로트릭스 루시오파티애(erysipelothrix rhusiopathiae); 디프테리아(diphtheria); 콜레라(cholera); 안트락스(anthrax); 도노파노시스(donovanosis)-그라눌로마 인귀날레(granuloma inguinale); 및 바르토넬로시스(bartonellosis)를 포함한다.
병원성 혐기성 세균에는 테타누스(tetanus); 보툴리즘(botulism); 그외 크로스트리다아(clostridia);투베르큘로시스(tuberculosis); 레프로시(leprosy); 및 그외 마이코박테리아(mycobacteria)가 포함된다. 병원성 스피로헤타 질환에는 매독; 트레포네마증: 딸기종 및 열대 백반성피부평 및 지방병성 매독; 및 랩토스피라병증이 포함된다.
고등 병원균 세균 및 병원성 곰팡이에 의한 그밖의 질병에는 방선균증, 노카르디아증; 효모균증; 분아진균증, 히스토플라스마증 및 콕시디오이데스진균증; 칸디다증, 아스페르질루스증, 및 모균증; 스포로트리쿰증; 파라콕시디오이드진균증, 페트리엘리디오시스증, 토룰롭소시스증 및 색소효모균증; 및 피부사상균증이 포함된다.
리케치아 질병에는 리케치아성 및 리케치아증이 포함된다.
마이코플라즈마 및 클리미디아 질병의 예에는 마이코플라즈마 누모니애(mycoplasma pneumoniae); 림프육아종 베너레움(lymphogranuloma venereum); 앵무병; 및 주산기의 클라미디아 질병이 포함된다.
병원성 진핵생물
병원성 원생동물 및 유충 및 감염증에는 아메바증; 말라리아; 레슈마니아증; 트리파노소마증; 주형원충병; 주폐포자충; 바베시아증; 편모충증; 선모충증; 필라리아병; 주혈흡충병; 선충; 디스토마 또는 흡충; 및 촌충 감염증이 포함된다.
<표 4>
시험관 내 gD 자극a 후 비장세포의 IL-2, IL-10 및 IFN-γ의 생산 수준
면역 IL-2 IFN-γ IL-10
군 (pg/㎖) (pg/㎖) (pg/㎖)
비처리 16.7±.0.8 10.5 ± 0.7 17.1 ± 6.12
pgD+pcDNA3 134.7 ± 3.5 22.4 ± 2.4 57.1 ± 4.4
pgD+IL-8 756.4 ± 5.4 138.5 ± 4.7 128 ± 13
pgD+IP-10 143.5 ± 3.9 31.5 ± 2.5 69.9±1.9
pgD+RANTES 59.9 ± 1.1 520 ± 13 360 ±46.5
pgD+MCP-1 93.6 ± 4.7 17.9 ± 0.5 49.7 ± 2.3
pgD+ MIP-1α 345.4 ± 18 55.4 ± 1.8 22 ± 2.1
pgD+ TNF-α 403 ± 13.3 77 ± 6.3 86.8 ± 6.2
pgD+ TNF-β 288 ± 5.6 20.8 ± 1.5 78.3 ± 3.6
a. Balb/c 마우스 각 군(n=2)을 gD DNA 백신(마우스당 60 ㎍) 및 케모카인 유전자(마우스당 40 ㎍) 또는 TNF cDNA(마우스 당 40 ㎍)를 제 0 및 2주에 면역시켰다. 최종 면역 후 2 주에, 두마리의 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 6 ×106의 비장세포를 포함하는 1 ㎖ 분취액을 24 웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서, HSV-2 gD 단백질/㎖ 1 ㎍을 각 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% C02에서 2일간 인큐베이션하고, 세포 상등액을 취해 세포외 유액을 사이토카인 또는 케모카인 특이적 ELISA 플레이트에 첨가하고 시판되는 사이토카인 키트(Biosource, Intl., Camarillo, Ca)를 이용하여 IL-2, IL-10 및 IFN-γ의 수준을 검출하기 위해 이용하였다. 시료를 세개씩 분석하여 분비된 케모카인 농도의 평균±표준 편차로 나타내었다. 상기 표는 예상한 결과를 보이는 세개의 별개 실험중 하나를 나타낸것이다.
<표 5>
시험관 내 gD 자극a 후 비장세포의 MCP-1, MIP-1α 및 RANTES의 생산
면역 MCP-1 MIP-1α RANTES
군 (pg/㎖) (pg/㎖) (pg/㎖)
비처리 153.8± 5.7 247 ± 11 769 ± 7
pgD+ pCDNA3 234 ± 5.3 747 ± 39 817 ± 55
pgD+ IL-8 322 ± 24 1,411± 113 1,284 ± 53
pgD+ IP-1O 246.3 ± 2.7 1,407 ± 459 831 ± 52
pgD+ RANTES 189.7 ± 0 2,267 ± 219 1,077 ± 32
pgD+ MCP- 1 209.2 ±6.4 725 ± 501 646 ± 45
pgD+ MIP-1α 142.7 ± 3.3 787 ± 94 690 ± 39
a: Balb/c 마우스 각 군(n=2)을 gD DNA 백신(마우스당 60 ㎍) 및 케모카인 유전자(마우스당 40 ㎍)을 제 0 및 2주에 면역시켰다. 최종 면역 후 2 주에, 두마 리의 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 6 ×106의 비장세포를 포함하는 1 ㎖ 분취액을 24 웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서, HSV-2 gD 단백질/㎖ 1 ㎍을 각 웰에 첨가하였다. 37℃,5% C02에서 2일간 인큐베이션하고, 세포 상등액을 취해 세포외 유액을 사이토카인 또는 케모카인 특이적 ELISA 플레이트에 첨가하고 시판되는 케모카인 키트(R&D Systems, Minneapolis, Md.)를 이용하여 RANTES, MCP-1 및 MIP-1α의 수준을 검출하기 위해 이용하였다. 시료를 세개씩 분석하여 분비된 케모카인 농도의 평균±표준 편차로 나타내었다. 상기 표는 예상한 결과를 보이는 세개의 별개 실험중 하나를 나타낸것이다.
본 발명은 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 개선된 백신을 제공하고, 상기 백신을 이용하여 개체를 자가 면역 질환이 있는 개체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Claims (33)

  1. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1), MIP-1α(Macrophage Inflammatory Protein-1 alpha), MIP-1β (Macrophage Inflammatory Protein-1 beta), IL-8 (Interleukin-8), RANTES (Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1 (Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1), MadCAM-1 (Mucosal addressin cell adhesion molecule-1), LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen-1), VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM (platelet/endothelial cell adhesion molecule), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), ICAM-2 (intercellular adhesion molecule-2), ICAM-3 (intercellular adhesion molecule-3), CD2, LFA-3 (Lymphocyte function-associated antigen-3), M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor), G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor), IL-4 (Interleukin-4), IL-18 (Interleukin-18)의 변이형, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7 (Interleukin-7), 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체 (Tumor necrosis factor receptor), Flt (Fms-related tyrosine kinase 1), Apo-1 (Apoptosis antigen-1), p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD (Lymphocyte-associated receptor of death), NGRF (nerve growth factor receptor), DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand- Receptor 2), TRICK2 (Trail receptor inducer of cell killing 2), DR6 및 Caspase ICE로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 초항원(superantigen)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원을 코딩하는 표적 단백질인 플라스미드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원인 플라스미드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 플라스미드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역 조절 단백질인 ICAM-1이고, 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 CD86 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 플라스미드.
  6. 제1항의 플라스미드를 포함하는 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한 주사 가능한 제약 조성물.
  7. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 단순 포진(herpes simplex) 항원을 코딩 하는 뉴클레오티드 서열, 및 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, IL-8, RANTES, LFA-3 및 CD40L로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 초항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는 플라스미드.
  8. 제7항에 있어서 상기 단순 포진 항원이 HSV2gD인 플라스미드.
  9. 제7항의 플라스미드를 포함하는, 단순 포진 바이러스 감염에 대해 개체를 면역시키기 위한 주사 가능한 제약 조성물.
  10. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 변이형, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 및 Caspase ICE로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함하고, 상기 플라스미드들이 초항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는, 면역원에 대해 개체에서 면역 반 응을 유도하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원을 코딩하는 표적 단백질인 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원인 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 제2 플라스미드 상에 포함되어 있는 상기 면역 조절 단백질이 ICAM-1이고, 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 CD86 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 상기 제1 플라스미드, 상기 제2 플라스미드 또는 별개의 제3 플라스미드 상에 포함되어 있는 CD86 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 주사 가능한 제약 조성물.
  16. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 단순 포진 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 IL-8, RANTES, LFA-3 또는 CD40L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함하고, 상기 플라스미드들이 초항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는, 개체를 단순 포진 바이러스 감염에 대해 면역시키기 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단순 포진 항원이 HSV2gD인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 주사 가능한 제약 조성물.
  19. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, IL-18의 변이형, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 및 Caspase ICE로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 초항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는 재조합 백신.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원, 암 관련 항원 또는 자가 면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원인 재조합 백신.
  21. 제19항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원인 재조합 백신.
  22. 제19항에 있어서, 상기 면역 조절 단백질이 ICAM-1이고, 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 CD86 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 재조합 백신.
  23. 제19항에 있어서, 상기 재조합 백신이 재조합 백시니아(vaccinia) 백신인 재조합 백신.
  24. 제19항에 있어서, 상기 면역원이 병원균 항원인 재조합 백신.
  25. 조절 성분에 작동 가능하게 연결된 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 조절 성분에 작동 가능하게 연결된, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 변이형, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 및 Caspase ICE로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역 조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 초항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포함하지 않는 플라스미드 1 이상을 포함하 는 면역원에 대해 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IL-8 및 RANTES로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 L-셀렉틴, P-셀렉틴,E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 및 LFA-3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 M-CSF, G-CSF, IL-4 및 IL-18의 변이형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  29. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 CD40 및 CD40L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자 및 혈관 내피 세포 성장 인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  31. 제25항에 있어서, 면역 조절 단백질이 Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  32. 제25항에 있어서, 주사가능한 제약 조성물.
  33. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 재조합 백신.
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