JP4696079B2 - Ａβ免疫原性ペプチド担体結合物およびそれの製造方法 - Google Patents

Description

関連出願との関係
本出願は、２００３年１２月１７日出願の米国仮出願第６０／５３０，４８１号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる）のＵ．Ｓ．Ｃ．第３５条§１１９（ｅ）の下での利益を主張する。

養子免疫の本質は、外来物質の存在に対し反応しそしてそれらの侵襲と特異的に相互作用しかつ宿主をそれらから保護することが可能な成分（抗体および細胞）を産生する生物体の能力である。「抗原」若しくは「免疫原」は、この型の免疫応答を誘発することが可能でありかつまた、感作された細胞およびそれに対し産生される抗体と相互作用することが可能でもある物質である。

抗原若しくは免疫原は、通常、免疫系の多様な成分を認識かつそれらと相互作用する個別の抗原性部位すなわち「エピトープ」を含有する巨大分子である。それらは、合成有機化学物質、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくは多糖から構成される個別の分子として存在し得るか、あるいは、それらは細胞構造（細菌若しくは真菌）またはウイルスの一部でありうる（非特許文献１；非特許文献２）。

短いペプチドのような小分子は、通常は免疫応答の産物と相互作用することが可能とは言え、しばしば、独力で応答を引き起こし得ない。これらのペプチド免疫原、すなわちそれらがまた呼ばれるところの「ハプテン」は、実際には不完全な抗原であり、また、独力で免疫原性を引き起こし若しくは抗体産生を誘発することが可能でないとは言え、適する担体にそれらを結合することにより免疫原性にされ得る。担体は、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合に免疫学的応答を引き起こすことが可能であるより高分子量のタンパク質抗原である。

免疫応答において、抗体は、Ｔヘルパー（Ｔ_Ｈ）細胞とともにＢリンパ球により産生かつ分泌される。ハプテン−担体系の大多数において、Ｂ細胞はハプテンおよび担体双方に特異的である抗体を産生する。これらの場合、Ｔリンパ球は担体上の特異的結合ドメインを有することができるが、しかしハプテン単独を認識することができない。ある種の相乗作用において、ＢおよびＴ細胞は共同してハプテン特異的抗体応答を誘導する。こうした免疫応答が起こった後に、宿主をその後ハプテンのみで攻撃する場合、通常、それは、初回免疫化後に形成されるメモリー細胞からハプテン特異的抗体を産生することにより応答することができる。

より大きな巨大分子上の数種の決定的に重要なエピトープ構造を模倣する合成ハプテンが、より大きな「親」分子に対する免疫応答を創製するために、しばしば、担体に結合される。例えば、短いペプチドセグメントをあるタンパク質の既知配列から合成し得、そして担体に結合して、天然のタンパク質に対する免疫原性を誘導させ得る。免疫原産生へのこの型の合成アプローチがワクチンの創製への現在の研究の多くの基礎となった。しかしながら、多くの場合に、合成ペプチド−担体結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（しかしながら良好に設計されている）を使用することにより単にＢ細胞応答のみを創製することは、無傷の抗原に対する完全な保護免疫を常に保証するものではないことができる。より大きなウイルス粒子若しくは細菌細胞からの短いペプチドエピトープにより生成される免疫応答は、Ｂ細胞レベルで記憶を生成させるのにのみ十分でありうる。これらの場合には、細胞傷害性Ｔ細胞応答が保護免疫のより重要な指標であることが現在一般に受け入れられている。Ｂ細胞およびＴ細胞双方の認識のための適正なエピトープ結合部位をもつペプチド免疫原を設計することは、今日の免疫学における最も困難な研究領域の１つである。

小型の若しくは乏しく免疫原性の分子を大きな「担体」分子に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）させることによりこれらの分子の免疫原性を増大させるアプローチは、何十年もの間成功裏に利用されてきた（例えば、非特許文献３を参照されたい）。例えば、この「担体効果」を活用することにより、精製した莢膜重合体を担体タンパク質に結合させてより有効な免疫原性組成物を創製させる多くの免疫原性組成物が記述されている。非特許文献４）。結合物は、遊離の多糖で免疫した場合に幼児で通常観察される乏しい抗体応答を迂回することもまた示されている（非特許文献５；非特許文献６）。

ハプテン−担体結合物は、同種二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）、異種二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）若しくは長さゼロ（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）架橋剤のような多様な架橋／カップリング試薬を使用して成功裏に生成されている。多くのこうした方法が、ペプチド担体への糖、タンパク質およびペプチドの結合のために現在利用可能である。大部分の方法は、アミン、アミド、ウレタン、イソチオ尿素若しくはジスルフィド結合、またはいくつかの場合にはチオエーテルを創製する。担体および／若しくはハプテン分子上の反応性のアミノ酸分子の側鎖に反応部位を導入するカップリング剤の使用に対する一欠点は、反応部位が、中和されない場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（従って結合物（１種若しくは複数）の官能性若しくは安定性に悪影響を及ぼす）またはｉｎ ｖｉｖｏ（従って該製剤で免疫したヒト若しくは動物における有害事象の潜在的危険を課す）いずれでもいかなる不要な分子とも自由に反応することである。こうした過剰な反応部位は、多様な既知の化学反応を利用してこれらの部位を不活性化するように反応すなわち「キャッピング」し得るが、しかし、これらの反応は結合物の官能性に対し別の方法で破壊的でありうる。これは、担体分子中に反応部位を導入することにより結合物を創製することを試みる場合はとりわけ問題が多いことがある。そのより大きな大きさおよび（ハプテンに関して）より複雑な構造が、化学的処理の破壊効果に対しそれをより不安定にしうるからである。事実、「担体効果」の所望の特性を有する免疫原性組成物として機能する生じる結合物の能力を保存しつつ、最初に担体を活性化し、その後結合反応においてハプテンと反応させ、そして最後に残存する反応部位を「キャッピング」することによる結合物の作成方法のいかなる例も知られていない。
ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、１９８８ａ、ｂ、ｃ Ｍａｌｅら、１９８７ Ｇｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３ Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２−５９１ Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６ Ｉｎｓｅｌら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４

［発明の要約］
本発明は、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原のタンパク質／ポリペプチド担体との免疫原性結合物の製造方法に向けられ、ここで、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントは、リシン残基のような担体のアミノ酸残基の誘導体化された官能基を介して担体に結合され、また、ここで、アミノ酸残基のいかなる結合されない誘導体化された官能基も、それらがタンパク質／ポリペプチドを包含する他の分子と反応することを阻害するためのキャッピングを介して不活性化して、それにより、担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保存する。さらに、本発明は上の方法により製造される結合物、およびこうした結合物を含有する免疫原性組成物にもまた関する。

一態様において、本発明は、１種若しくはそれ以上の官能基を有するタンパク質／ポリペプチド担体へのペプチド免疫原の１アミノ酸残基の反応性基を介するＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原の第一の結合方法に向けられ、該方法は：（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体の官能基の１個若しくはそれ以上を誘導体化して、反応部位をもつ誘導体化された分子を生成させる段階；（ｂ）段階（ａ）の誘導体化されたタンパク質／ポリペプチド担体を、ペプチド免疫原が誘導体化されたタンパク質／ポリペプチド担体に官能基を介して結合されるような反応条件下で、ペプチド免疫原の１アミノ酸の反応性基と反応させる段階；および（ｃ）結合物を、活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性の官能基を不活性化するためのキャッピング試薬とさらに反応させて、それにより担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保存する段階を含んでなる。

一態様において、タンパク質／ポリペプチド担体は、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミン、インフルエンザヘマグルチニン、ＰＡＮ−ＤＲ結合ペプチド（ＰＡＤＲＥポリペプチド）、マラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢ_ＳＡｇ_{１９−２８}）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コレラトキシン、低下した毒性を伴うコレラトキシン変異体、ジフテリアトキシン、ジフテリアトキシンと交差反応性であるＣＲＭ_１９７タンパク質、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ ２４５２、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、低下した毒性を伴うニューモリシン変異体、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ３６７、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０ Ｔ１、接着マトリックス分子を認識する微生物表面の成分（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、成長因子／ホルモン、サイトカインおよびケモカインよりなる群から選択される。

別の態様において、タンパク質／ポリペプチド担体はＴ細胞エピトープを含有する。

なお別の態様において、タンパク質／ポリペプチド担体は上述されたところの破傷風トキソイド、コレラトキシン、若しくはコレラトキシン変異体のような細菌トキソイドである。好ましい一態様において、タンパク質／ポリペプチド担体はＣＲＭ_１９７である。

さらになお別の態様において、タンパク質／ポリペプチド担体は、インフルエンザヘマグルチニン、ＰＡＤＲＥポリペプチド、マラリアＣＳタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＳＢＡｇ_{１９−２８}）、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ ６５）、若しくは結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＢＣＧ）からのポリペプチドでありうる。

好ましい一態様において、タンパク質／ポリペプチド担体は、連鎖球菌ｒＣ５ａペプチダーゼ、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１２２４、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ１６６４若しくは化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ２４５２、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、低下した毒性を伴うニューモリシン変異体、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ３６７およびクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ８５８から選択される。

一態様において、タンパク質／ポリペプチド担体は、免疫応答を刺激する若しくは高める成長因子若しくはホルモンであり、そしてＩＬ−１、ＩＬ−２、γ−インターフェロン、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳよりなる群から選択される。

一局面において、本発明は、Ａβ内のある種のエピトープに対する免疫原性応答を誘発する、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原を提供する。本発明の免疫原性ペプチドは免疫原性異種ペプチドを包含する。数種の免疫原性ペプチドにおいて、Ａβフラグメントは担体に連結されて免疫原性異種ペプチドを形成し、そしてその後、この異種ペプチドを本発明の方法を使用して担体に連結して結合物を形成する。

本発明の別の局面において、ペプチド免疫原はＡβの少なくとも残基１−５のＮ末端セグメントを含んでなるポリペプチドであり、Ａβの最初の残基は該ポリペプチドのＮ末端残基であり、該ポリペプチドはＡβのＣ末端セグメントを含まない。本発明のなお別の局面において、ペプチド免疫原はＡβのＮ末端セグメントを含んでなるポリペプチドであり、該セグメントはＡβの残基１−３で開始しかつＡβの残基７−１１で終了する。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原はＡβのＮ末端セグメントに対する免疫原性応答を誘導する剤であり、該セグメントは、Ａβ４３の残基１２−４３内の１エピトープに対する免疫原性応答を誘導することなく、Ａβの残基１−３で開始しかつＡβの残基７−１１で終了する。本発明の別の局面において、ペプチド免疫原は、異種アミノ酸配列に対するヘルパーＴ細胞応答およびそれによりＮ末端セグメントに対するＢ細胞応答を誘導する、異種アミノ酸配列に連結されたＡβの１セグメントを含んでなる異種ポリペプチドである。

数種のペプチド免疫原において、ＡβのＮ末端セグメントはそのＣ末端で異種ポリペプチドに連結される。数種のペプチド免疫原において、ＡβのＮ末端セグメントはそのＮ末端で異種ポリペプチドに連結される。数種のペプチド免疫原において、ＡβのＮ末端セグメントはそのＮおよびＣ末端で第一および第二の異種ポリペプチドに連結される。数種のペプチド免疫原において、ＡβのＮ末端セグメントはそのＮ末端で異種ポリペプチドに、そしてそのＣ末端で付加的な最低１コピーのＮ末端セグメントに連結される。数種のペプチド免疫原において、該ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＡβのＮ末端セグメント、Ｎ末端セグメントの複数の付加的なコピー、および異種アミノ酸セグメントを含んでなる。

上のペプチド免疫原のいくつかにおいて、該ポリペプチドは付加的な最低１コピーのＮ末端セグメントをさらに含んでなる。上のペプチド免疫原のいくつかにおいて、該フラグメントはＡβ４３の少なくとも５個のＣ末端アミノ酸を含まない。

上のペプチド免疫原のいくつかの局面において、該フラグメントはＡβからの１０までの連続するアミノ酸を含んでなる。

別の局面において、本発明は、ある種のエピトープに対する免疫原性応答を誘発するＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原を提供し、ここで、Ａβは多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）配置と称される配置にありうる。

本発明の上の局面のいくつかにおいて、ＡβのＮ末端半分からのペプチド免疫原。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、１−１２、１−１６、３−６および３−７よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の上の局面のいくつかにおいて、ペプチド免疫原はＡβの内部領域からである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原はＡβ１３−２８、１５−２４、１７−２８および２５−３５よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の上の局面のいくつかにおいて、ＡβのＣ末端からのペプチド免疫原。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原はＡβ３３−４２、３５−４０および３５−４２よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、１−１２、１−１６、１−２８、３−６、３−７、１３−２８、１５−２４、１７−２８、２５−３５、３３−４２、３５−４０および３５−４２よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−５、Ａβ１−７、Ａβ１−９およびＡβ１−１２よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−５−Ｌ、Ａβ１−７−Ｌ、Ａβ１−９−ＬおよびＡβ１−１２−Ｌ（式中Ｌはリンカーである）よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−５−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−９−Ｌ−ＣおよびＡβ１−１２−Ｌ−Ｃ（式中Ｃはシステインアミノ酸残基である）よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。

本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１６−２２、Ａβ１６−２３、Ａβ１７−２３、Ａβ１７−２４、Ａβ１８−２４およびＡβ１８−２５よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１６−２２−Ｃ、Ａβ１６−２３−Ｃ、Ａβ１７−２３−Ｃ、Ａβ１７−２４−Ｃ、Ａβ１８−２４−ＣおよびＡβ１８−２５−Ｃ（式中Ｃはシステインアミノ酸残基である）よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明の他の局面において、ペプチド免疫原は、Ｃ−Ａβ１６−２２、Ｃ−Ａβ１６−２３、Ｃ−Ａβ１７−２３、Ｃ−Ａβ１７−２４、Ｃ−Ａβ１８−２４およびＣ−Ａβ１８−２５（式中Ｃはシステインアミノ酸残基である）よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。

上のペプチド免疫原のいくつかにおいて、異種ポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープおよびそれらの組合せを有するペプチドよりなる群から選択される。

一態様において、タンパク質／ポリペプチド担体若しくは場合によっては結合されたポリペプチドリンカーの１個若しくはそれ以上のアミノ酸分子の官能基は、架橋試薬を使用して誘導体化される。別の態様において、誘導体化試薬は長さゼロの架橋試薬である。別の態様において、誘導体化試薬は同種二官能性架橋試薬である。なお別の態様において、誘導体化試薬は異種二官能性架橋試薬である。

好ましい一態様において、異種二官能性試薬は、タンパク質／ポリペプチド担体の１個若しくはそれ以上のアミノ酸分子の一級若しくはε−アミン官能基、およびペプチド免疫原の１個若しくはそれ以上のアミノ酸分子のペンダントチオール基と反応する試薬である。一態様において、異種二官能性試薬はブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジルである。

別の態様において、一級若しくはε−アミン官能基はリシンである。なお別の態様において、タンパク質／ポリペプチド担体のリシンの一級若しくはε−アミン官能基のブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジルでの誘導体化は、タンパク質／ポリペプチド担体上のリシン分子上の一級若しくはε−アミン残基のブロモアセチル化をもたらす。より好ましい一態様において、ペンダントチオール基はペプチド免疫原のシステイン残基であり、ペプチド免疫原のアミノ末端、ペプチド免疫原のカルボキシ末端若しくはペプチド免疫原の内部に限局されうる。

別の態様において、ペンダントチオール基は、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、トラウト試薬（２−イミノチラン）ＳＡＴＡ（Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル２−ピリジルジチオトルエン）、スルホＬＣ ＳＰＤＰ（ピリジルジチオプロピオンアミドヘキサン酸スルホスクシンイミジル）、ＳＰＤＰ（ピリジルジチオプロピオン酸スクシンイミジル）のようなチオール化試薬により生成される。好ましい一態様において、活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性の官能基を不活性化するのに使用されるキャッピング試薬は、システアミン、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンよりなる試薬群から選択される。

とりわけ好ましい一態様において、活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性の官能基を不活性化するのに使用されるキャッピング試薬は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよびアンモニアよりなる試薬群から選択される。

一態様において、ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基は遊離のスルフヒドリル基である。

別の態様において、官能基の１個若しくはそれ以上は、タンパク質／ポリペプチド担体に場合によっては結合されたリンカー上にある。好ましい一態様において、リンカーはペプチドリンカーである。より好ましい一態様において、ペプチドリンカーはポリリシンである。

別の態様において、本発明は、構造：

式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘはタンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化可能な官能基であり、および、式中、ｍは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数である
を有するタンパク質／ポリペプチド担体との、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原の第二の結合方法に向けられ、該方法は：（ａ）タンパク質／ポリペプチド担体、若しくは場合によっては結合されたリンカー分子の官能基の１個若しくはそれ以上を誘導体化して、反応部位を伴う誘導体化された分子を生成させる段階；（ｂ）段階（ａ）の誘導体化されたタンパク質／ポリペプチド担体をペプチド免疫原の１アミノ酸残基の反応性基と反応させて、共有結合されたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体結合物を形成させる段階；および（ｃ）前記結合物をキャッピング試薬とさらに反応させて、キャッピングされた基がタンパク質／ポリペプチドを包含する他の分子と自由に反応しないような、活性化されたタンパク質／ポリペプチド担体上の遊離の反応性の官能基を不活性化して、それにより、式：

式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘ^ｄは、タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基であり、ならびに、式中、
Ｐは、タンパク質担体上のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基に共有結合されたペプチド免疫原分子であり、Ｒは、タンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基に共有結合されたキャッピング分子であり、ｎは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数であり、およびｐは０より大きいがしかし８５未満の整数である、
を有するキャッピングされたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体結合物を生成するように、担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保存する段階を含んでなる。

上述される第一の方法の詳述される態様は、第二の方法により製造されるたった今記述された結合物にもまた当てはまる。

一態様において、本発明は、タンパク質／ポリペプチド担体が、式：

［式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘはタンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化可能な官能基であり、および、式中、ｍは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数である］を有し、かつ、キャッピングされたペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体結合物が、式：

式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘ^ｄは、タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基であり、ならびに、式中、Ｐは、タンパク質担体のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基に共有結合されたペプチド免疫原分子であり、Ｒは、タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基に共有結合されて、それにより担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保存するキャッピング分子であり、ｎは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数であり、およびｐは０より大きいがしかし８５未満の整数である、
を有する、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原／ポリペプチド担体結合物に向けられる。

上述された第一および第二の方法の詳述された態様は、たった今記述された結合物にもまた当てはまる。

別の態様において、本発明は、本発明の第二の方法に従って生成され、かつ、式：

式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘ^ｄは、タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基であり、ならびに、式中、Ｐは、タンパク質担体のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基に共有結合されたペプチド免疫原分子であり、Ｒは、タンパク質／ポリペプチド担体のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカーのアミノ酸残基の誘導体化された官能基に共有結合されて、それにより担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保存するキャッピング分子であり、ｎは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数であり、およびｐは０より大きいがしかし８５未満の整数である、
を有する、ＡβペプチドまたはＡβ若しくはそのアナログのフラグメントを含んでなるペプチド免疫原／ポリペプチド担体結合物に向けられる。

上述された第二の方法の詳述された態様は、たった今記述されたところの第二の方法により生成される結合物にもまた当てはまる。

別の態様において、本発明は、１種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤およびアジュバントと一緒に、本発明の第二の方法により生成されるタンパク質／ポリペプチド担体とのペプチド免疫原の結合物を含んでなる、免疫原性組成物に向けられる。

上述された第二の方法およびそれにより生成される結合物の詳述された態様は、たった今記述されたところの結合物を含有する免疫原性組成物にもまた当てはまる。

別の態様において、本発明は、有効量の本発明の免疫原性組成物を哺乳動物被験体に投与することを含んでなる、哺乳動物被験体における免疫応答の誘導方法に向けられる。

本発明の結合物を含有する免疫原性組成物に応用可能な詳述された態様は、これらの免疫原性組成物の使用方法に向けられる本発明の態様にもまた当てはまる。
［発明の詳細な記述］
本発明は、活性化の間に生成される担体上の未反応の活性の官能基が、それらがさらに反応することを予防するためにＮ−アセチルシステアミンのようなキャッピング試薬を使用することにより不活性化される、ペプチド免疫原−担体結合物の生成方法に向けられる。本発明はまた、それらの方法により生成されるキャッピングされた担体−ペプチド免疫原結合物、および前記結合物を含んでなる免疫原性組成物にも向けられる。

結合により糖のような小型のすなわち乏しく免疫原性の分子の免疫原性を増大させるアプローチは何十年も成功裏に利用されており（例えば、Ｇｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３を参照されたい）、そして、この「担体効果」を活用することにより、精製した莢膜重合体を担体タンパク質に結合させてより有効な免疫原性組成物を創製する多くの免疫原性組成物が記述されている。例えばＳｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１−３７６、１９８０）は、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ）により引き起こされる侵襲性疾患に対する免疫を賦与するその微生物の多糖タンパク質結合物を記述する。ＰＲＰ（ポリリボシルリビトールリン酸、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ）の莢膜重合体）の結合物は、多糖単独に基づく免疫原性組成物より有効であることが示されている（Ｃｈｕら、（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４０：２４５；Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２−５９１）。結合はまた、遊離多糖で免疫した場合に幼児において通常観察される乏しい抗体応答を迂回することも示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６；Ｉｎｓｅｌら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４）。

それ（例えば破傷風若しくはジフテリア）に対するヒトの慣例の免疫化が標準的実務である、細菌トキシン若しくはトキソイドをタンパク質担体として使用することのさらなる一利点は、該トキシン若しくはトキソイドに対する所望の免疫が、夾膜重合体と会合した病原体に対する免疫と一緒に誘導されることである。

抗原決定子／ハプテン−担体結合物もまた、結合させたハプテン上の別個の化学的エピトープを認識し得る高度に特異的なモノクローナル抗体を産生させるのに使用されている。生じるモノクローナル抗体は、しばしば、エピトープ構造および天然のタンパク質間の相互作用を研究するのに使用される。多くの場合、これらのモノクローナル抗体を生成させるのに使用される抗原決定子／ハプテンは、より大きなタンパク質の表面上の決定的な抗原部位を表す小ペプチドセグメントである。抗原決定子／ハプテン−担体結合物の生成において使用されるべき成功裏の担体の基準は、免疫原性の潜在性、抗原決定子／ハプテンとの結合に適する官能基の存在、誘導体化後でもなお合理的な溶解性特性、およびｉｎ ｖｉｖｏでの毒性の欠如である。

これらの基準は、本発明の方法により生成される結合物により満たされる。該結合物は、本明細書に記述される結合方法を使用して生成されるいかなる安定なペプチド免疫原−担体結合物でもありうる。該結合物は、以下の構造：

を有するタンパク質／ポリペプチド担体が、タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合され、
［式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘはタンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化可能な官能基であり、および、式中、ｍは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数である］がペプチド免疫原に共有結合され、かつ、該ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体結合物が以下の式を有し、以下の式：

［式中、
Ｃはタンパク質／ポリペプチド担体であり、かつ、Ｘ^ｄは、タンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によっては該タンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基であり、Ｐは、タンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基に共有結合されたペプチド免疫原であり、Ｒは、タンパク質／ポリペプチド担体上のアミノ酸残基若しくは場合によってはタンパク質／ポリペプチド担体に共有結合されたペプチドリンカー上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基に共有結合されて、それにより担体を伴わずに別の方法で生じないとみられるペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発するその能力をそれが保持するような担体の官能性を保持するキャッピング分子であり、ｎは０より大きいがしかし８５未満若しくはそれに等しい整数であり、およびｐは０より大きいがしかし８５未満の整数である］により表される、本発明の方法を使用して生成される。
担体の選択
数種のペプチド免疫原は免疫応答を誘導するのに適切なエピトープを含有するが、しかし免疫原性であるには小さすぎる。この状況で、ペプチド免疫原を適する担体に連結して免疫応答を誘発するのを助ける。本発明の方法により生成されるペプチド免疫原−担体結合物の上の図解において、Ｃは、担体それら自身上のアミノ酸残基上の誘導体化された官能基を介して直接、若しくは担体に共有結合されたペプチドリンカー上の誘導体化された官能基を介して間接的にペプチド免疫原が結合されているタンパク質／ポリペプチド担体である。適するタンパク質／ポリペプチド担体は、限定でされるものでないが、アルブミン（ヒト血清アルブミンを包含する）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミン、ＭＳＣＲＡＭＭＳ、破傷風トキソイド、またはジフテリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コレラ若しくはＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のような変異体を包含する低下した毒性を有する他の病原性細菌からのトキソイド、あるいは弱毒化トキシン誘導体を挙げることができる。１種のこうした担体は、ジフテリアトキシンと交差反応性であるＣＲＭ_１９７タンパク質（配列番号４０）である。

他の担体は、複数のＭＨＣ対立遺伝子、例えば全部のヒトＭＨＣ対立遺伝子の最低７５％に結合するＴ細胞エピトープを包含する。こうした担体はときに、「普遍的Ｔ細胞エピトープ」として当該技術分野で既知である。普遍的Ｔ細胞エピトープをもつ例示的担体は：
インフルエンザヘマグルチニン： ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ
ＨＡ_{３０７−３１９} （配列番号１１）
ＰＡＮ−ＤＰペプチド（ＰＡＤＲＥペプチド） ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ
（配列番号１２）
マラリアＣＳ：Ｔ３エピトープ ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ
（配列番号１３）
Ｂ型肝炎表面抗原： ＦＥＬＬＴＲＩＬＴＩ
ＨＢ_ｓＡｇ_{１９−２８} （配列番号１４）
熱ショックタンパク質６５： ＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ
ｈｓｐ６５_{１５３−１７１} （配列番号１５）
カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ） ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ
（配列番号１６）
破傷風トキソイド：ＴＴ_{８３０−８４４} ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ
（配列番号１７）
破傷風トキソイド：ＴＴ_{９４７−９６７} ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨ
ＬＥ（配列番号１８）
ＨＩＶ ｇｐ１２０ Ｔ１： ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹ
（配列番号１９）
ＣＲＭ_１９７ 配列の簡単な説明を参照されたい
（配列番号４０）
アルブミンフラグメント ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ
（配列番号４１）
を包含する。

免疫応答を刺激する若しくは高めるためのおよびそれにペプチド免疫原若しくはハプテンを結合させ得る他の担体は、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、ならびにＭＩＰ １αおよびβならびにＲＡＮＴＥＳのようなケモカインを包含する。免疫原性ペプチドは、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、第ＷＯ ９７／１７１６３号および同第ＷＯ ９７／１７６１４号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）に記述されるところの組織を横断する輸送を高めるタンパク質／ペプチド担体にもまた連結し得る。

なおさらなる担体は、組換え連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ １２２４、１６６４および２４５２、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ３６７およびＴ８５８、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ニューモリシン、低下した毒性を伴うニューモリシン変異体、成長因子ならびにホルモンを包含する。

本発明の好ましい一態様において、担体タンパク質は、その一次配列中に１個のアミノ酸変化を伴うジフテリアトキシンの非毒性変異体ＣＲＭ_１９７である。該分子のアミノ酸位置５２に存在するグリシンが、単一核酸コドン変化によりグルタミン酸で置換されている。この変化により、該タンパク質はＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を欠き、そして非毒性となる。それは５８，４０８Ｄａの分子量を有する。ＣＲＭ_１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号明細書（ここに引用することにより組み込まれる）に記載の組換え発現により大量に産生される。ＣＲＭ_１９７への糖ならびにペプチドの結合は、リシン残基のε−アミノ基による連結により実施される。ＣＲＭ_１９７がＢ細胞エピトープの優れたかつ安全な担体であることが、数種の商業的製品により十分に確立されている。
免疫原性ペプチド
本明細書で使用されるところの「ペプチド免疫原」若しくは「ハプテン」という用語は、哺乳動物への投与に際して免疫応答を導き出し得るか、助長し得るか、若しくはそれを生じさせるように誘導され得る、いかなるタンパク質若しくはそれら由来のサブユニット構造／フラグメント／アナログでもある。とりわけ、該用語は、本明細書に開示される方法を使用して担体に結合しうるいずれの供給源（細菌、ウイルス若しくは真核生物）からのポリペプチド抗原決定子を指すのにも使用される。こうしたポリペプチド免疫原／抗原決定子は、ウイルス、細菌若しくは真核生物起源のものでありうる。

ペプチド免疫原は、多様なヒト疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、処置、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）若しくは改善における免疫治療薬としての使用のため担体に結合し得る。こうしたペプチド免疫原は、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴的な斑の主成分である３９〜４３アミノ酸、好ましくは４２アミノ酸のＡβの１ペプチド由来のもの（米国特許第４，６６６，８２９号明細書；ＧｌｅｎｎｅｒとＷｏｎｇ（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０：１１３１、Ｈａｒｄｙ（１９８４）ＴＩＮＳ ２０：１１３１；Ｈａｒｄｙ（１９７７）ＴＩＮＳ ２０：１５４を参照されたい）、アミリンのアミロイドペプチド由来のもの、ＩＩ型糖尿病に関与する膵島細胞により産生されるポリペプチド物質、アテローム硬化に関与する低密度リポタンパク質遺伝子産物由来のペプチド、ならびにインターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびＧＤＦ−８のような炎症性サイトカインおよび成長因子由来の抗原性ペプチドを包含する。こうした真核生物のペプチド免疫原は、β−アミロイドタンパク質若しくはＡ４ペプチドとしてもまた知られるＴ細胞（ＣＴＬ）若しくはＢ細胞いずれかのエピトープを包含しうる。

β−アミロイドペプチド若しくはＡ４ペプチドとしてもまた知られるＡβ（米国特許第４，６６６，８２９号明細書；ＧｌｅｎｎｅｒとＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２０、１１３１（１９８４）を参照されたい）は、アルツハイマー病の特徴的な斑の主成分である３９〜４３アミノ酸のペプチドである。Ａβは、βおよびγ分泌酵素と命名される２種の酵素によるより大きなタンパク質ＡＰＰのプロセシングにより生成される（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ ２０、１５４（１９９７）を参照されたい）。アルツハイマー病と関連するＡＰＰ中の既知の突然変異は、β若しくはγ分泌酵素の部位の近傍またはＡβ内に存在する。例えば、位置７１７はＡβへのＡＰＰのプロセシングにおけるそのγ−分泌酵素切断の部位に近く、また、位置６７０／６７１はβ−分泌酵素切断の部位に近い。該突然変異が、生成される４２／４３アミノ酸の形態のＡβの量を増大させるように、Ａβが形成される切断反応と相互作用することによりＡＤを引き起こすと考えられている。

Ａβは、それが古典的および代替の双方の補体カスケードを固定かつ活性化し得るという異常な特性を有する。とりわけ、それはＣ１ｑおよび最終的にＣ３ｂｉに結合する。この会合はＢ細胞の活性化につながるマクロファージへの結合を助長する。加えて、Ｃ３ｂｉはさらに分解し、そしてその後Ｔ細胞依存性の様式でＢ細胞上のＣＲ２に結合して、これらの細胞の活性化の１０，０００倍の増大につながる。この機構は、Ａβに、他の抗原の免疫応答を上回る免疫応答を生成させる。

Ａβは数種の天然に存在する形態を有する。ヒトの形態のＡβはＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と称される。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体とのそれらの関係は、Ｈａｒｄｙら、ＴＩＮＳ ２０、１５５−１５８（１９９７）の図１により具体的に説明されている。例えば、Ａβ４２は、配列：

を有する。Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、Ｃ末端からのそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−ＩｌｅおよびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの脱落によりＡβ４２と異なる。Ａβ４３はＣ末端の１個のトレオニン残基の存在によりＡβ４２と異なる。

Ａβのフラグメントであるペプチド免疫原は、いくつかの理由から、本方法での使用について無傷の分子に関して有利である。第一に、Ａβ内のあるエピトープのみがアルツハイマー病の処置に有用な免疫原性応答を誘導するため、こうしたエピトープを含有するフラグメントの量の等しい投薬量は、無傷のＡβの投薬量よりも有用な免疫原性エピトープのより大きいモル濃度を提供する。第二に、Ａβのある種のペプチド免疫原は、Ａβが生じるＡＰＰタンパク質に対する有意の免疫原性応答を生成させることなくアミロイド堆積物に対する免疫原性応答を生じる。第三に、Ａβのペプチド免疫原は、それらのより短い大きさにより、無傷のＡβより製造するのがより単純である。第四に、Ａβのペプチド免疫原は、無傷のＡβと同一の様式で凝集せず、担体との結合物の製造を単純化する。

Ａβの数種のペプチド免疫原は、天然のペプチドからの最低２、３、５、６、１０若しくは２０の連続するアミノ酸の連続を有する。数種のペプチド免疫原はＡβからの１０、９、８、７、５若しくは３を超えない連続する残基を有する。好ましい一態様において、ＡβのＮ末端半分からのペプチド免疫原を、結合物を製造するのに使用する。好ましいペプチド免疫原は、Ａβ１−５、１−６、１−７、１−１０、１−１１、３−７、１−３および１−４を包含する。例えばＡβ１−５という呼称はＡβの残基１−５を包含するＮ末端フラグメントを示す。ＡβのＮ末端で開始しかつ残基７−１１内の１残基で終了するＡβフラグメントがとりわけ好ましい。フラグメントＡβ１−１２もまた使用し得るがしかしより少なく好ましい。いくつかの方法において、フラグメントはＡβ１−１０以外のＮ末端フラグメントである。他の好ましいフラグメントは、Ａβ１３−２８、１５−２４、１−２８、２５−３５、３５−４０、３５−４２、ならびに他の内部フラグメントおよびＣ末端フラグメントを包含する。

本発明の数種のＡβペプチドは、ヒト患者若しくは動物への投与に際して、Ａβの残基１６と２５との間の１個若しくはそれ以上のエピトープに特異的に結合する抗体を生成させる免疫原性ペプチドである。好ましいフラグメントは、Ａβ１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４および１８−２５を包含する。残基１６と２５との間のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ａβの斑に結合することなく可溶性Ａβに特異的に結合する。これらの型の抗体は、患者若しくは動物モデルの脳中のＡβ堆積物の斑に特異的に結合することなく、該患者若しくはモデルの循環中の可溶性Ａβに特異的に結合し得る。可溶性Ａβへの抗体の特異的結合は、Ａβが斑中に取り込まれることを阻害し、従って患者における斑の発生を阻害するか、または処置が投与される前にこうした斑が既に発生している場合には斑の大きさ若しくは頻度のさらなる増大を阻害するかのいずれかである。

好ましくは、投与されるＡβのフラグメントは、該フラグメントに対するＴ細胞応答を発生するとみられるエピトープを欠く。一般に、Ｔ細胞エピトープは１０以上の連続するアミノ酸である。従って、Ａβの好ましいフラグメントは、大きさ５−１０、若しくは好ましくは７−１０の連続するアミノ酸、または最も好ましくは７個の連続するアミノ酸、すなわちＴ細胞応答を生成することなく抗体応答を生成するのに十分な長さのものである。Ｔ細胞エピトープはフラグメントの免疫原性活性に必要とされず、そして患者のあるサブセットでは望ましくない炎症応答を引き起こしうるため、これらのエピトープの非存在が好ましい（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８、３６９７−３７０１；Ｓｅｎｉｏｒ（２００２）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１、３）。

フラグメントＡβ１５−２５およびその７〜８個の連続するアミノ酸のサブフラグメントは、Ａβペプチドに対する高い免疫原性応答を一貫して生成するため、これらのペプチドが好ましい。これらのフラグメントは、Ａβ１６−２２、Ａβ１６−２３、Ａβ１６−２４、Ａβ１７−２３、Ａβ１７−２４、Ａβ１８−２４およびＡβ１８−２５を包含する。とりわけ好ましいＡβ１５−２５サブフラグメントは長さが７個の連続するアミノ酸である。例えばＡβ１５−２１という呼称は、Ａβの残基１５−２１を包含しかつＡβの他の残基を欠くフラグメントを示す。および好ましくは７〜１０個の連続するアミノ酸。これらのフラグメントは、末端特異的抗体を包含する抗体応答を生成し得る。

Ａβのペプチド免疫原は、アミロイド堆積物の消失若しくは予防における活性のスクリーニングを必要とする（第ＷＯ ００／７２８８０号明細書（全部の目的上そっくりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ＡβのＮ末端フラグメントの投与は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＡβ堆積物を認識する抗体の産生を誘導する。天然に存在する形態のＡβ中に存在する最低１、およびときに最低５若しくは１０個のＣ末端アミノ酸を欠くフラグメントをいくつかの方法で使用する。例えば、Ａβ４３のＣ末端からの５アミノ酸を欠くフラグメントは、ＡβのＮ末端からの最初の３８アミノ酸を包含する。

別の方法で示されない限り、Ａβへの言及は、上で示された天然のヒトアミノ酸配列、ならびに、対立遺伝子、種および誘導されたバリアントを包含するアナログを包含する。アナログは、典型的には、しばしば保存的置換のおかげで１、２若しくは数個の位置で天然に存在するペプチドと異なる。アナログは、典型的には、天然のペプチドとの最低８０若しくは９０％の配列の同一性を表す。数種のアナログは、１、２若しくは数個の位置で非天然のアミノ酸またはＮ末端若しくはＣ末端アミノ酸の修飾もまた包含する。例えば、Ａβの位置１および／若しくは７の天然のアスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸で置換され得る。

非天然のアミノ酸の例は、Ｄ、α，α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロクスプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸である。免疫原性ペプチドは、Ａβおよびそのフラグメントのアナログもまた包含する。本発明の数種の治療薬は、全Ｄ−ペプチド、例えば全Ｄ Ａβ、全Ｄ Ａβフラグメント、または全Ｄ Ａβ若しくは全Ｄ Ａβフラグメントのアナログである。フラグメントおよびアナログは、第ＷＯ ００／７２８８０号明細書に記述されるところの未処置若しくはプラセボ対照と比較して、トランスジェニック動物モデルにおける予防的若しくは治療的有効性についてスクリーニングし得る。

ペプチド免疫原はまた、例えば他のアミノ酸と一緒になってＡβペプチドの免疫原性を包含するより長いポリペプチドも包含する。例えば、好ましい免疫原性ペプチドは、異種アミノ酸配列に対するヘルパーＴ細胞応答およびそれによりＡβセグメントに対するＢ細胞応答を誘導する異種アミノ酸配列に連結されたＡβの１セグメントを含んでなる融合タンパク質を包含する。こうしたポリペプチドは、第ＷＯ ００／７２８８０号明細書に記述されるところの未処置若しくはプラセボ対照と比較して、動物モデルにおける予防的若しくは治療的有効性についてスクリーニングし得る。

Ａβペプチド、アナログ、免疫原性フラグメント若しくは他のポリペプチドは、解離型若しくは凝集型で投与し得る。解離型Ａβ若しくはそのフラグメントは単量体ペプチド単位を意味している。解離型Ａβ若しくはそのフラグメントは一般に可溶性であり、そして自己凝集して可溶性のオリゴマー、原線維前駆体およびＡＤＤＬを形成することが可能である。Ａβおよびそのフラグメントのオリゴマーは通常可溶性であり、そして主としてα−らせん若しくはランダムコイルとして存在する。凝集型Ａβ若しくはそのフラグメントは、不溶性のβ−シート集成体に会合したＡβ若しくはそのフラグメントのオリゴマーを意味している。凝集型Ａβ若しくはそのフラグメントはまた原線維重合体も意味している。原線維は通常不溶性である。数種の抗体は、可溶性Ａβ若しくはそのフラグメントまたは凝集型Ａβ若しくはそのフラグメントのいずれかを結合する。数種の抗体は可溶性Ａβ若しくはそのフラグメントおよび凝集型Ａβ若しくはそのフラグメントの双方を結合する。

免疫原性ペプチドはまた単量体の免疫原性ペプチドの多量体も包含する。Ａβペプチド以外の免疫原性ペプチドは、上に列挙されたＡβの好ましいフラグメント（例えば、Ａβ１−３、１−７、１−１０および３−７）の１種若しくはそれ以上に対する免疫原性応答を誘導するはずである。

本発明の免疫原性ペプチドは、本発明の方法を使用して担体に連結して結合物を形成する。免疫原性ペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシル末端若しくは双方で担体に連結させて結合物を形成させ得る。場合によっては、免疫原性ペプチドの複数の反復が結合物中に存在し得る。

ＡβのＮ末端フラグメントは、そのＣ末端で担体ペプチドに連結させて結合物を形成させ得る。こうした結合物中では、ＡβのフラグメントのＮ末端残基が結合物のＮ末端残基を構成する。従って、こうした結合物は、ＡβのＮ末端残基が遊離の形態であることを必要とするエピトープに結合する抗体の誘導において有効である。本発明の数種の免疫原性ペプチドは、結合物を形成するために、１コピー若しくはそれ以上の担体ペプチドにＣ末端で連結されたＡβのＮ末端セグメントの複数の反復を含んでなる。こうした結合物に組み込まれたＡβのＮ末端フラグメントは、ときにＡβ１−３で開始しかつＡβ７−１１で終了する。Ａβ１−７、１−３、１−４、１−５および３−７はＡβの好ましいＮ末端フラグメントである。数種の結合物は縦列のＡβの異なるＮ末端セグメントを含んでなる。例えば、結合物は、Ａβ１−７、次いで担体に連結されたＡβ１−３を含み得る。

数種の結合物において、ＡβのＮ末端セグメントはそのＮ末端で担体ペプチドに連結される。Ｃ末端連結でと同一の多様性のＡβのＮ末端セグメントを使用し得る。数種の結合物は、ＡβのＮ末端セグメントのＮ末端に連結された担体ペプチドを含んでなり、それは順に、縦列のＡβの１個若しくはそれ以上の付加的なＮ末端セグメントに連結される。好ましくは、こうした免疫原性Ａβフラグメントは、適切な担体に一旦結合されれば、Ａβの他のフラグメントに向けられることなく該Ａβフラグメントに特異的に向けられる免疫原性応答を誘導する。

本発明の免疫原性ペプチドは免疫原性の異種ペプチドを包含する。数種の免疫原性ペプチドにおいて、Ａβフラグメントが担体に連結されて免疫原性異種ペプチドを形成する。この異種ペプチドは、本発明の方法を使用して担体に連結されて結合物を形成する。これらの免疫原性異種ペプチドのいくつかは、米国特許第５，１９６，５１２号、欧州特許第３７８，８８１号および同第４２７，３４７号明細書に記述されるような破傷風トキソイドエピトープに連結されたＡβのフラグメントを含んでなる。場合によっては、免疫原性ペプチドを、１コピー若しくは複数コピーの担体に、例えば担体のＮおよびＣ双方の末端で連結して免疫原性異種ペプチドを形成させ得る。これらの免疫原性異種ペプチドの他者は、米国特許第５，７３６，１４２号明細書に記述される担体ペプチドに連結されるＡβのフラグメントを含んでなる。例えば、免疫原性異種ペプチドは、Ａβ１−７、次いでＡβ１−３、次いで担体を含み得る。こうした免疫原性異種ペプチドの例は：
直鎖状の配置のＡβ １−７／破傷風トキソイド８３０−８４４＋９４７−９６７
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ
（配列番号２４）
を包含する。

米国特許第５，７３６，１４２号明細書に記述されるペプチド（全部直鎖状配置の）：
ＰＡＤＲＥ／Ａβ １−７：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号２６）
Ａβ１−７×３／ＰＡＤＲＥ：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号２７）
ＰＡＤＲＥ／Ａβ１−７×３：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号２８）
Ａβ１−７／ＰＡＤＲＥ：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号２９）
Ａβ１−７／アルブミンフラグメント：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号３０）
Ａβ４−１０／アルブミンフラグメント：
ＦＲＨＤＳＧＹ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号３１）
Ａβ３−９／アルブミンフラグメント：
ＥＦＲＨＤＳＧ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号３２）
ＨＡ_{３０７−３１９}／Ａβ_１−７×３：
ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号３３）
Ａβ_１−７／ＨＡ_{３０７−３１９}／Ａβ_１−７：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号３４）
Ａβ_１−７×３／ＨＡ_{３０７−３１９}：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号３５）
Ａβ_１−７×２／ＨＡ_{３０７−３１９}：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号３６）
Ａβ_１−７／ＨＡ_{３０７−３１９}／マラリアＣＳ／ＴＴ_{８３０−８４４}／ＴＴ_{９４７−９６７}／Ａβ_１−７
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号３７）
Ａβ_１−７×３／ＴＴ_{８３０−８４４}／Ｃ／ＴＴ_{９４７−９６７}
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−Ｃ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号３８）
Ａβ_１−７／ＴＴ_{８３０−８４４}／Ｃ／ＴＴ_{９４７−９６７}
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＣＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号３９）
Ａβ_１−７／ＴＴ_{８３０−８４４}／Ｃ／ＴＴ_{９４７−９６７}／Ａβ_１−７
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−Ｃ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号２０）
数種の免疫原性異種ペプチドは、式２^ｘ（式中ｘは１〜５からの整数である）により表される免疫原性ペプチドの多量体を含んでなる。好ましくは、ｘは１、２若しくは３であり、２が最も好ましい。ｘが２である場合、こうした多量体はＭＡＰ４（米国特許第５，２２９，４９０号明細書を参照されたい）と称される好ましい配置で連結された４個の免疫原性ペプチドを有する。こうした免疫原性ペプチドをその後、本発明の方法を使用して担体に連結して結合物を形成する。

ＭＡＰ４配置を下に示し、ここではＮ末端およびリシンの側鎖アミンの双方でペプチド合成を開始することにより分枝状構造が生じられる。リシンが配列に組み込まれかつ分枝することを可能にされる回数に依存して、生じる構造は複数のＮ末端を提示することができる。この例では、４個の同一のＮ末端が分枝状のリシン含有核上に生じられた。こうした多重性は同族のＢ細胞の応答性を大きく高める。

こうした免疫原性異種ペプチドの例は：
ＭＡＰ４配置のＡβ １−７／破傷風トキソイド８３０−８４４：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２２）
ＭＡＰ４配置のＡβ １−７／破傷風トキソイド９４７−９６７：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号２３）
ＭＡＰ４配置のＡβ ３−９／破傷風トキソイド８３０−８４４：
ＥＦＲＨＤＳＧ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号２５）
２分枝の樹脂上のＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ

を包含する。

Ａβペプチド、アナログ、活性フラグメント若しくは他のポリペプチドは、会合したすなわち多量体の形態でまたは解離した形態で投与し得る。治療薬は単量体の免疫原性剤の多量体もまた包含する。Ａβペプチド以外の剤は、上に列挙されたＡβの好ましいフラグメント（例えば１−１０、１−７、１−３および３−７）の１種若しくはそれ以上に対する免疫原性応答を誘導するはずであり、そして、本発明の方法を使用して担体にもまた結合し得る。好ましくは、こうした剤は、適切な担体に一旦結合されれば、Ａβの他のフラグメントに向けられることなくこれらのフラグメントの１種に特異的に向けられる免疫原性応答を誘導する。ペプチド免疫原の担体との結合を容易にするため、付加的なアミノ酸を抗原決定子の末端に付加し得る。該付加的な残基は、ペプチド免疫原の物理若しくは化学特性を改変するのにもまた使用し得る。チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸などのようなアミノ酸をペプチド免疫原のＣ若しくはＮ末端に導入し得る。加えて、グリシンおよびアラニンのようなアミノ酸を含有するペプチドリンカーもまた導入し得る。加えて、抗原決定子は、末端ＮＨ_２基のアシル化により、例えばアルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）若しくはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより修飾されることにより天然の配列と異なり得る。いくつかの場合、こうした修飾は支持体若しくは他の分子に連結するための部位を提供しうる。

本明細書に開示される方法を使用して本発明の結合物を生成させるために使用されるペプチド免疫原は、連結を介して結合して重合体（多量体）を形成し得るか、若しくは混合状態として連結を伴わない組成物に処方し得る。ペプチドが同一ペプチドに連結されてそれによりホモ重合体を形成する場合、複数の反復エピトープ単位が提示される。例えば、多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）技術を使用して、ＣＴＬおよび／若しくは抗体ペプチドならびにペプチド双方を含有する重合体が構築される。「ＣＴＬエピトープ」は潜在的標的抗原の選択されたエピトープ領域由来のものである。ペプチドが異なる場合（例えば多様なウイルスサブタイプ、サブタイプ内の異なるエピトープ、異なるＨＬＡ制限特異性、若しくはＴヘルパーエピトープを含有するペプチドを表すカクテル）、反復単位を伴うヘテロ重合体が提供される。共有結合に加え、分子間および構造内結合を形成することが可能な非共有結合もまた企図されている。

こうしたペプチド免疫原およびそれらのアナログは、固相ペプチド合成若しくは組換え発現により合成されるか、または天然の供給源から得られる。自動ペプチド合成機は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティのような多数の供給元から商業的に入手可能である。

組換え発現は、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）細菌、酵母、昆虫細胞若しくは哺乳細胞中でであり得る。組換え発現の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第２版、１９８９）により記述されている。数種の免疫原性ペプチドは商業的にもまた入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，ｉｎｃ．、カリフォルニア州サニーベール、およびＣａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ナパ）。

ペプチド若しくは他の化合物のランダムライブラリーもまた、ペプチド免疫原としての適合性についてスクリーニングし得る。一段階ごとの様式で合成し得る多くの型の化合物についてコンビナトリアルライブラリーを製造し得る。こうした化合物は、ポリペプチド、β−ターン模倣物、ホルモン、オリゴマーのＮ置換グリシンおよびオリゴカルバメートなどを包含する。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、第ＷＯ ９５／１２６０８号、同第ＷＯ ９３／０６１２１号、同第ＷＯ ９４／０８０５１号、同第ＷＯ ９５／３５５０３号および同第ＷＯ ９５／３０６４２号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上引用することにより組み込まれる）に記述されるコーデッド合成ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ）（ＥＳＬ）法により構築し得る。ペプチドライブラリーはファージディスプレイ法によってもまた生成し得る（例えばＤｅｖｌｉｎ、第ＷＯ ９１／１８９８０号明細書を参照されたい）。
免疫原性ペプチドの誘導体化およびタンパク質担体への結合
ペプチド免疫原のタンパク質／ポリペプチド担体への結合部位、およびペプチド免疫原を担体に結合するのに使用される架橋剤の性質は、双方とも、それに対し生成される結果として生じる抗体の特異性に重要である。適正な認識のため、ペプチド免疫原を適切な向きで担体に結合しなければならない。抗体が担体を伴わない遊離のペプチド免疫原をその後認識するためには、ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド担体結合物は露出されかつ接近可能な形態でペプチド免疫原を提示しなければならない。最適の向きはしばしば、ペプチド免疫原上の特定の部位に対する架橋反応を指図することにより達成される。ペプチド免疫原でこれを達成するための一方法は、ペプチド合成の間に末端システイン残基を結合することによる。これは、担体への結合のためにペプチドの一端にスルフヒドリル基を提供する。この基による架橋は、一端のみでのペプチド免疫原の結合を提供して、それにより一貫した向きを確実にする。

ペプチド免疫原−担体結合において、最終目標は担体の本来の状態若しくは安定性を維持することではなく、しかし、ハプテンを最良の可能な方法で免疫系に提示することである。この最終目標の達成において、結合の化学の選択が、ハプテンに対して生成される抗体の結果として生じる力価、親和性および特異性を制御しうる。制限されない様式で抗原を提示するのに十分に長いスペーサーアームを含有する架橋剤を選ぶことが、いくつかの場合に重要でありうる。担体の表面上のペプチド免疫原の密度を制御することもまた重要でありうる。少なすぎるペプチド免疫原の置換は応答をほとんど若しくは全くもたらさないことがある。高すぎるペプチド免疫原の密度は、実際に、免疫学的抑制を引き起こしかつ応答を低下させうる。加えて、架橋剤それ自身が望ましくない免疫応答を生成させうる。これらの問題点は、適切な架橋試薬のみならず、しかしまたタンパク質／ポリペプチド担体およびペプチド免疫原の適切な比の選択においても考慮に入れることを必要とする。

ペプチド免疫原へのタンパク質／ペプチド担体の多様な結合手段が可能である。イオン性相互作用が末端若しくはリシンのε−アミノ基により可能である。残基の側鎖とペプチド免疫原との間の水素結合もまた可能である。最後に、タンパク質／ペプチド担体と免疫原性ペプチドとの間のコンホメーションの相互作用が安定な結合を生じさせうる。

ペプチド免疫原−担体結合物は、長さゼロ、同種二官能性若しくは異種二官能性架橋剤のような多様な架橋試薬を使用して成功裏に生成されている。生物結合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のための最小の利用可能な試薬系はいわゆる長さゼロの架橋剤である。これらの化合物は、付加的な原子を含有しない結合を形成することにより２分子の結合を媒介する。従って、分子の１原子がスペーサーである。多くの結合スキームにおいて、最終的な結合体は、架橋されている物質に外来構造を付加する化学的成分によって一緒に結合される。いくつかの応用において、これらの介在するリンカーの存在は意図された使用にとって不利益でありうる。例えば、ペプチド免疫原−担体結合物の製造において、結合体は、結合されたハプテンに対する免疫応答を生成させるという意図をもって形成される。ときに、この応答により生じられる抗体の一部分が、結合処置で使用される架橋剤に対する特異性を有することができる。長さゼロの架橋剤は、２物質間の直接結合を媒介することにより、この型の交差反応性の潜在性を排除する。

巨大分子の修飾および結合に使用された最初の架橋試薬であった同種二官能性試薬は、双方の端に同一の官能基を含有する二反応性化合物よりなった（ＨａｒｔｍａｎとＷｏｌｄ、１９６６）。これらの試薬は、双方の分子上の同一の共通基と共有反応することにより一タンパク質を別のものに結びつけ得る。従って、１種のタンパク質のリシンのε−アミン若しくはＮ末端アミンを、同種二官能性試薬の存在下で該二者を一緒に単純に混合することにより、第二のタンパク質上の同一の官能基に架橋し得る。

異種二官能性結合試薬は、タンパク質および他の巨大分子上の２種の異なる官能性標的に結合し得る２種の異なる反応性基を含有する。例えば、架橋剤の一部がアミン反応性基を含有することができる一方、別の部分はスルフヒドリル反応性基よりなりうる。該結果は、架橋反応を標的分子の選択された部分に向けて従って結合過程にわたりより良好な制御を獲得する能力である。

異種二官能性試薬は、同種二官能性架橋剤を使用してしばしば得られる重合度を制限する２若しくは３段階の方法でタンパク質および他の分子を架橋するのに使用される。

長さゼロ、同種二官能性若しくは異種二官能性架橋剤を使用するタンパク質／ポリペプチド担体へのペプチド免疫原の多くの結合方法が現在利用可能である。大部分の方法は、アミン、アミド、ウレタン、イソチオ尿素若しくはジスルフィド結合、またはいくつかの場合にはチオエーテルを創製する。タンパク質若しくはペプチドのペプチドへのより一般的な結合方法は二官能性架橋試薬を利用する。これらは各端に活性基を有する小型のスペーサー分子である。スペーサー分子は各端に同一若しくは異なる活性基を有し得る。最も一般的な活性の官能性、カップリング基および形成される結合は：
１．アルデヒド−アミノ−＞二級アミン
２．マレイミド−スルフヒドリル（チオエーテル
３．スクシンイミド−アミノ（アミド
４．イミデートエステル−アミノ（−アミド
５．フェニルアジド−アミノ（フェニルアミン
６．アシルハロゲン化物−スルフヒドリル（チオエーテル
７．ピリジルジスルフィド−スルフヒドリル（ジスルフィド
８．イソチオシアネート−アミノ（イソチオ尿素
である。

それがペプチド免疫原に結合され得るような架橋剤により修飾されるその能力に関しての所定の担体タンパク質の反応性は、そのアミノ酸組成、および該分子の三次元構造中の個々のアミノ酸の配列位置、ならびにペプチド免疫原のアミノ酸組成により決定される。

タンパク質／ペプチド担体と他のペプチド（例えばタンパク質／ペプチド担体とペプチド免疫原）との間のリンカー（「Ｌ」）の場合、スペーサーは、典型的にはＡｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸若しくは中性の極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。ある態様において、中性のスペーサーはＡｌａである。場合によっては存在するスペーサーは同一残基から構成される必要はなく、そして従ってヘテロ若しくはホモオリゴマーでありうることが理解されるであろう。例示的スペーサーはＡｌａのホモオリゴマーを包含する。存在する場合、スペーサーは通常、最低１若しくは２残基、より通常は３ないし６残基であることができる。他の態様において、タンパク質／ポリペプチド担体はペプチド免疫原に結合され、好ましくはタンパク質／ペプチド担体はアミノ末端に配置される。ペプチドはＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどのような中性のリンカーにより結合されてもよく、そして、好ましくは、典型的にはＳｅｒ−Ｓｅｒ結合などを介してペプチド結合物のアミノ末端に結合される１個のＬｙｓ残基のαおよびεアミノ基に結合されるパルミチン酸などのような脂質残基（（ＰＡＭ）２Ｌｙｓ）をさらに含有しうる。

本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原はＡβ１−５−Ｌ、Ａβ１−７−Ｌ、Ａβ１−９−ＬおよびＡβ１−１２−Ｌよりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、リンカーはＧＡＧＡ（配列番号１０）である。

担体とのペプチド免疫原の結合を容易にするために、付加的なアミノ酸を抗原決定子の末端に付加し得る。該付加的な残基はペプチド免疫原の物理若しくは化学特性を改変するためにも使用し得る。チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸などのようなアミノ酸を、ペプチド免疫原のＣ若しくはＮ末端に導入し得る。加えて、グリシンおよびアラニンのようなアミノ酸を含有するペプチドリンカーもまた導入し得る。加えて、抗原決定子は、末端ＮＨ_２基アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）若しくはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより修飾されることにより天然の配列と異なり得る。いくつかの場合に、これらの修飾は支持体若しくは他の分子に連結するための部位を提供しうる。

本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−５−Ｃ、Ａβ１−７−Ｃ、Ａβ１−９−ＣおよびＡβ１−１２−Ｃ（ここでＣはシステインアミノ酸残基である）よりなる群から選択されるＡβフラグメントである。本発明のいくつかの局面において、ペプチド免疫原は、Ａβ１−５−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ、Ａβ１−９−Ｌ−ＣおよびＡβ１−１２−Ｌ−Ｃよりなる群から選択されるＡβフラグメントである。

ペプチド免疫原は、タンパク質／ペプチド担体に直接、またはペプチド免疫原のアミノ若しくはカルボキシいずれかの末端でリンカーを介してのいずれかで連結される。ペプチド免疫原若しくはタンパク質／ペプチド担体いずれかのアミノ末端をアシル化しうる。加えて、ペプチド免疫原−タンパク質／ペプチド担体結合物を、下述されるところのＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒのような１個若しくはそれ以上の連結残基を介してある種のアルカノイル（Ｃ_１−Ｃ_２０）脂質に連結しうる。他の有用な脂質部分はコレステロール、脂肪酸などを包含する。

ペプチド免疫原は化学的架橋により担体に連結し得る。担体への免疫原の連結技術は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、１７３：７２３、）および４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、ハプテンへのシステイン残基の付加によりこれを提供し得る）を使用するジスルフィド結合の形成を包含する。これらの試薬は、それら自身と一方のタンパク質上のペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合、および他方のアミノ酸中のリシン上のε−アミノ若しくは他の遊離アミノ基によるアミド結合を創製する。多様なこうしたジスルフィド／アミド形成剤はＩｍｍｕｎｏ．Ｒｅｖ．６２：８５（１９８２）に記述されている。他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合よりもむしろチオエーテルを形成する。チオエーテル形成剤は、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを包含する。カルボキシル基は、それらをスクシンイミド若しくは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と組み合わせることにより活性化し得る。

最も頻繁には、リシン残基は担体タンパク質上で見出される最も豊富なアミノ酸残基であり、そして、これらの残基は、架橋試薬を使用して修飾して求核部位を生成させ、それをその後ハプテンに結合させ得る。このカップリングは、化学的に活性であるハプテン分子上の親水性側鎖のいずれを介しても達成される。これらは、いくつかを挙げれば、アルギニンのグアニジル基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の（−カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基、ならびにリシンのε−アミノ基を包含する。タンパク質を今や他の部分に結合し得るようなタンパク質の修飾は、タンパク質担体若しくはハプテン分子上の側鎖のいずれかと反応する架橋試薬を使用して達成される。

本発明の一局面において、リンカー分子を伴う若しくは伴わない担体タンパク質を、求核基を導入するためのさらなる修飾に敏感に反応する担体タンパク質分子に反応部位を導入する試薬で官能性化（誘導体化）する。一態様において、担体は、システインのスルフヒドリル基、リシン残基の一級ε−アミン基、α−アミンのα−末端、メチオニンのチオエーテル、およびヒスチジンの双方のイミダゾリル側鎖窒素のようなタンパク質のアミノ酸残基上の多数の官能基と優先的に反応するハロアセチル化試薬と反応させる（Ｇｕｒｄ、１９６７）。好ましい一態様において、担体タンパク質のリシン残基上の一級ε−アミン基を、ブロモ酢酸ｂ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルで誘導体化してブロモアセチル化担体を生成させる。ペプチド免疫原および活性化されたタンパク質担体の結合は、ペプチド免疫原を含有する溶液に活性化された担体をゆっくりと添加することにより実施した。

本発明の方法を使用することにより、上の節Ｂで論考されたペプチド免疫原は上の節Ａで論考された担体のいずれにも結合しうる。本発明の方法から生じる結合物を、受動／能動免疫療法での使用のためのＡβに対する抗体の生成のための免疫原として使用する。さらに、担体に連結されたＡβ若しくはＡβフラグメントを、Ａβに対するモノクローナル抗体の製造において実験動物に投与し得る。

本発明の一局面において、結合物は、Ａβ１−７−ＣＲＭ_１９７、（Ａβ１−７×３）−ＣＲＭ_１９７および（Ａβ１−７×５）−ＣＲＭ_１９７よりなる群から選択される結合物である。本発明の一局面において、結合物は、ＣＲＭ_１９７−Ａβ１−５、ＣＲＭ_１９７−Ａβ１−７、ＣＲＭ_１９７−Ａβ１−９およびＣＲＭ_１９７−Ａβ１−１２よりなる群から選択される結合物である。本発明の別の局面において、結合物は、Ａβ１−５−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１−７−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１−９−Ｃ−ＣＲＭ_１９７およびＡβ１−１２−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１６−２３−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１７−２４−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１８−２５−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、ＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１６−２３、ＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１７−２４、ＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１８−２５、Ａβ１６−２２−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１７−２３−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１８−２４−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、ＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１６−２２、ＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１７−２３ならびにＣＲＭ_１９７−Ｃ−Ａβ１８−２４よりなる群から選択される結合物である。Ａβ１−９−Ｃ−ＣＲＭ_１９７およびＡβ１−１２−Ｃ−ＣＲＭ_１９７。本発明のなお別の局面において、結合物は、Ａβ１−５−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７、Ａβ１−９−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７およびＡβ１−１２−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７よりなる群から選択されるよりなる群から選択される結合物である。
キャッピング
担体および／若しくはハプテン分子上の反応性アミノ酸分子の側鎖に反応部位を導入するカップリング試薬の使用に対する一欠点は、反応部位が中和されない場合はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏのいずれでもいかなる不要な分子とも自由に反応することである。本発明の方法において、未反応の官能基のキャッピングは、ペンダント反応性基を不活性化／キャッピングする試薬との該反応性基をもつ結合物の反応により達成される。本発明の結合方法での使用のための例示的不活性化／キャッピング試薬はシステアミン、Ｎ−アセチルシステアミンおよびエタノールアミンを包含する。あるいは、キャッピングは、アンモニア若しくは重炭酸アンモニウム（そのいずれもハロアセチル基をアミノアセチル基に転化する）との反応により達成される。キャッピングはまた、ハロアセチル基をヒドロキシアセチル基に転化する水酸化ナトリウム若しくは炭酸ナトリウムを使用してアルカリ性のｐＨ（９．０〜９．８）でも達成される。ハロアセチル基をアミノアセチル若しくはヒドロキシアセチル基に転化することの潜在的な一利点は、システアミン誘導体、エタノールアミンなどとの反応と対照的に、アンモニア若しくは水酸化物／炭酸塩との反応による比較的より小さい大きさの化学的官能性の導入である。生じるキャッピングされた官能基、例えばアミノアセチル若しくはヒドロキシアセチルは、結合物の担体タンパク質部分中に比較的より小さい変動（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｃｅ）を提供する。キャッピングされたペプチド免疫原−担体タンパク質は、クロマトグラフィー（ゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用若しくはアフィニティー）、透析、限外濾過−ダイアフィルトレーション、硫酸アンモニウム若しくはアルコールを使用する選択的沈殿などのような既知の方法を使用して必要なように精製する。
免疫原性結合物および組成物
キャッピングされたペプチド免疫原−担体タンパク質結合物は、予防および／若しくは治療の目的上、哺乳動物、とりわけヒトに免疫原性組成物で投与される。本発明の結合物は、免疫原に対する免疫応答を導き出しかつ／若しくは高めるのに使用される。例えば、ＣＴＬ−担体結合物はウイルス感染、アミロイド原性疾患、癌などを処置かつ／若しくは予防するのに使用される。あるいは、抗体応答を誘導するポリペプチド免疫原−担体結合物もまた使用される。

治療的応用において、本発明の結合物は、アルツハイマー病のようなアミロイド原性疾患に既に罹っている個体に投与される。疾患の潜伏期若しくは急性期の者は、本発明の結合物で個別に若しくは適切なように他の処置とともに処置しうる。

治療的応用において、本発明の免疫原性組成物は、アミロイド斑に対する効果的なＣＴＬ応答若しくは体液性応答を導き出し、そして疾患の進行、症状および／若しくは合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量を「治療上有効な用量」と定義する。この使用に有効な量は、ペプチド組成、投与様式、処置されている疾患の段階および重症度、患者の体重および全身の健康状態、ならびに処方する医師の判断に部分的に依存することができる。

本発明の免疫原性組成物の治療上有効な量は、一般に、治療的若しくは予防的投与のための初回免疫化について、７０ｋｇの患者に対し約０．１μｇから約１０，０００μｇまでのペプチド、通常は約０．１から約８０００μｇまで、好ましくは約０．１ないし約５０００μｇの間、および最も好ましくは０．１ないし約１，０００μｇの間の範囲にわたる。これらの用量に次いで、特異的免疫応答を測定することによる患者の応答および状態に依存して、数週ないし数か月にわたる追加免疫レジメンに準じて、約０．１μｇから約１０００μｇまでのペプチドの追加免疫を投薬する。

さらに、本発明はアミロイド原性疾患を予防かつ／若しくは改善するために予防的に使用する。有効量は上述されたとおりである。加えて、当業者は、例えば追加免疫することならびに投薬量および投薬レジメンを調節することにより予防的処置を適切なように調節若しくは改変する方法もまた知っているとみられる。

治療的投与は疾患の最初の徴候で開始しうる。これに次いで、疾患の進行が停止若しくは逆転されるかまたは症状が実質的にかつその後ある期間減弱されるまで、追加免疫を投薬する。

治療的若しくは予防的処置のための本発明の免疫原性組成物は、予防的および／若しくは治療的処置のための非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内若しくは筋肉内手段により投与し得る。免疫原性剤の典型的な一投与経路は皮下であるが、とは言え他の経路が等しく有効であり得る。別の一般的な経路は筋肉内注入である。この型の注入は、最も典型的には腕若しくは脚の筋で実施される。いくつかの方法において、剤は、堆積物が蓄積した特定の組織に直接注入される（例えば頭蓋内注入）。筋肉内注入若しくは静脈内注入が抗体の投与に好ましい。いくつかの方法においては特定の治療的抗体を頭蓋中に直接注入する。投与の容易さのため、本発明の免疫原性組成物は経口投与にとりわけ適する。本発明はさらに、許容できる担体、好ましくは水性担体中に溶解若しくは懸濁されたペプチド若しくは結合物の溶液を含んでなる、非経口投与のための免疫原性組成物を提供する。

多様な希釈剤、賦形剤および緩衝剤、例えば水、緩衝水、リン酸緩衝生理的食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用しうる。これらの組成物は慣習的な公知の滅菌技術により滅菌しうるか、若しくは滅菌濾過しうる。生じる水性溶液をそのままでの使用のため包装しうるか、若しくは凍結乾燥することができ、凍結乾燥した製剤は投与前に滅菌溶液と組合せる。該組成物は、緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのような、生理学的条件に近づけるのに必要とされるところの製薬学的に許容できる補助物質を含有しうる。

固体の組成物には慣習的な非毒性の固体担体を使用しうる。これらは、例えば、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを包含しうる。経口投与のためには、以前に列挙された担体のような通常使用される賦形剤のいずれか、ならびに一般に１０〜９５％、およびより好ましくは２５〜７５％の濃度の有効成分、すなわち本発明の１種若しくはそれ以上の結合物を組み込むことにより、製薬学的に許容できる非毒性の組成物を形成する。

製薬学的製剤中の本発明の免疫原性組成物の濃度は広範に変動し得（すなわち約０．１％未満、通常は２％若しくは最低約２％から約２０％ないし５０重量％若しくはそれ以上まで）、そして、主として、選択した特定の投与様式に従って液体容量、粘度などにより選択することができる。

本発明の結合物はまた、リンパ系組織のような特定の組織に結合物の標的を定めるようはたらくリポソームを介しても投与しうるか、若しくは感染した細胞に選択的に標的を定めることもでき、ならびに、ペプチド組成物の半減期を増大させうる。リポソームは、乳剤、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散系、層状層などを包含する。これらの製剤中で、送達されるべき組成物は、単独、若しくは例えばリンパ系細胞で優勢な受容体に結合する分子とともに、リポソームの一部として組み込まれる。これらの分子は、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体を、または他の治療的若しくは免疫原性組成物とともに包含することができる。従って、本発明の所望の組成物で充填されたリポソームをリンパ系細胞の該部位に向けることができ、そこでリポソームはその後、選択された治療的／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明での使用のためのリポソームは、一般に中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールを包含する標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中での該リポソームの安定性の考慮により導かれる。例えばＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところの多様な方法がリポソームを製造するために利用可能である。

エアゾル投与のためには、本発明の組成物は好ましくは界面活性剤および噴射剤と一緒に微粉化された形態で供給される。組成物の典型的な比率は０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０％である。界面活性剤はもちろん非毒性、および好ましくは噴射剤に溶解性でなくてはならない。こうした剤の代表例は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸のような６から２２個までの炭素原子を含有する脂肪酸の脂肪族多価アルコール若しくはその環状無水物とのエステル若しくは部分エステルである。混合若しくは天然のグリセリドのような混合エステルを使用しうる。界面活性剤は組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５％を構成しうる。組成物の残りは通常噴射剤である。担体もまた、鼻内送達のためのレシチンでのように必要とされる場合に包含し得る。

本発明の結合物は、場合によっては、アミロイド疾患および／若しくはその症状の処置および／若しくは改善において少なくとも部分的に有効である他の剤とともに投与し得る。アミロイド堆積物が脳中に存在するアルツハイマー病およびダウン症の場合、本発明の結合物は、血液脳関門を横断する本発明の剤の通過を増大させる他の剤とともに投与し得る。

該免疫原性組成物は、典型的にアジュバントを含有する。アジュバントは、免疫原若しくは抗原と一緒に投与される場合に免疫応答を高める物質である。限定されるものでないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば米国特許第５，７２３，１２７号明細書を参照されたい）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（ならびにその変異体）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば米国特許第５，０７８，９９６号明細書を参照されたい）マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを挙げることができる、多数のサイトカイン若しくはリンホカインが、免疫調節活性を有することが示されており、そして従ってアジュバントとして使用しうる。本発明で有用ななお他のアジュバントは、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを制限なしに包含するケモカインを包含する。セレクチン例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのような接着分子もまたアジュバントとして有用でありうる。なお他の有用なアジュバントは、ムチン様分子、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーのメンバー、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３のような免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような同時刺激分子、血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１および血管内皮増殖因子を包含する成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を包含する受容体分子を制限なしに包含する。なお別のアジュバント分子はカスパーゼ（ＩＣＥ）を包含する。国際特許公開第ＷＯ９８／１７７９９号および同第ＷＯ９９／４３８３９号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。

免疫応答を高めるのに使用される適するアジュバントは、米国特許第４，９１２，０９４号明細書（全部の目的上引用することによりここに組み込まれる）に記述されるＭＰＬ^ＴＭ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）を制限なしに包含する。Ｃｏｒｉｘａ（モンタナ州ハミルトン）から入手可能でありかつ米国特許第６，１１３，９１８号明細書（引用することによりここに組み込まれる）に記述される合成リピドＡアナログ若しくはリン酸アミノアルキルグルコサミン化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体若しくはアナログもまたアジュバントとしての使用に適する。１種のこうしたＡＧＰは、５２９（ＲＣ５２９としてもまた知られる；Ｃｏｒｉｘａ）として知られる２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカンシルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｓ）−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ−テトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは水性の形態（５２９ ＡＦ）若しくは安定な乳剤（５２９ ＳＥ）として処方される。

なお他のアジュバントは、鉱物油および水の乳剤、リン酸カルシウムのようなカルシウム塩、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、多価アルコール、ムラミルジペプチド、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）死菌、米国特許第５，０５７，５４０号明細書（参考文献３によりここに組み込まれる）に記述されるＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フラミンガム）のようなサポニンおよびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激結合体）のようなそれから生成される粒子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号明細書（引用することによりここに組み込まれる））、百日咳トキシン（ＰＴ）、若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシン（ＬＴ）、とりわけＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば国際特許公開第ＷＯ ９３／１３３０２号および同第ＷＯ ９２／１９２６５号明細書（全部の目的上引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を包含する。

公開された国際特許出願第ＷＯ ００／１８４３４号明細書に記述されるもの（アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外、好ましくはヒスチジンにより置換されている）を包含するコレラトキシンおよびそれらの変異体もまたアジュバントとして有用である。類似のＣＴトキシン若しくは変異体は、公開された国際特許出願第ＷＯ ０２／０９８３６８号明細書（アミノ酸位置１６のイソロイシンが、単独で若しくは別のアミノ酸によるアミノ酸位置６８のセリンの置換とともにのいずれかで、別のアミノ酸により置換されており；かつ／またはアミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸により置換されている）に記述されている。他のＣＴトキシンが、公開された国際特許出願第ＷＯ ０２／０９８３６９号明細書（アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸により置換され；かつ／若しくは１アミノ酸がアミノ酸位置４９に挿入され；かつ／若しくは２アミノ酸がアミノ酸位置３５および３６に挿入されている）に記述されている。

記述される結果を説明するためのいずれかの理論への本明細全体での言及は本発明の範囲を制限するためでないことが理解されるべきである。本発明が機能する方法と独立に、本明細書に記述される結果および利点は、本発明の以下の実施例への言及により達成されうる。

多くの変更および改変を、付属として付けられる請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれに行い得ることが当業者に明らかであろう。本明細で挙げられた全部の刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個別に示された場合と同一の程度まで、全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
［実施例］

ＣＲＭ_１９７のＡβペプチドへの結合
ハプテン／抗原性ペプチドの結合は、３９個のリシン残基を有する活性化された担体ＣＲＭ_１９７を、下述される方法（図１）を使用してペンダントチオール基を有するハプテン／抗原性ペプチドに反応させることにより実施した。全部のＡβペプチドは、システイニルスルフヒドリル基による担体タンパク質へのこれらのペプチドの結合を助長するために、カルボキシ末端に１個のシステイン残基を含有した。これらのペプチドは固相合成により製造した。
Ｉ．活性化
ＣＲＭ_１９７の遊離アミノ基を、過剰のブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）との反応によりブロモアセチル化した（ＢｅｒｎａｔｏｗｉｃｚとＭａｔｓｕｅｄａ、１９８６）。ＣＲＭ_１９７（約１５ｍｇ）の氷冷溶液に１０％（ｖ／ｖ）の１．０Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．４）を添加した。使用したＣＲＭ_１９７の重量に重量が等しいブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２００μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＣＲＭ_１９７にゆっくりと添加し、そして室温で暗所で１時間穏やかに混合した。生じるブロモアセチル化された（活性化された）タンパク質を、溶離液としてＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を使用する脱塩（Ｐ６−ＤＧ）カラムを通る通過により精製した。精製後、活性化されたＣＲＭ_１９７に対応する画分を合わせ、そしてタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイにより推定した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでの処理の前および後双方のタンパク質のアミノ基を２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）と反応させ、これはブロモアセチル化の指標としてはたらいた（Ｍｅａｎｓら、１９７２）。
ＩＩ．結合
結合前に、ペプチドを５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）［Ｅｌｌｍａｎ試薬］と反応させて遊離ＳＨ基の含量を確認した（６２〜８８％の間が還元型）。最初の４種のＡβペプチド（リンカーを伴わないアミノ酸１−７、ＧＡＧＡ（配列番号１０）リンカーを伴うアミノ酸１−１２、ＧＡＧＡ（配列番号１０）リンカーを伴うアミノ酸１−９、およびＧＡＧＡ（配列番号１０）リンカーを伴うアミノ酸１−７）について、およそ８．０〜１０．０ｍｇのペプチドを、２０ｍｇ／ｍｌの近似濃度まで滅菌蒸留水に溶解した。ペプチドを、１：１の比（ｗ／ｗ）で冷活性化ＣＲＭ_１９７にゆっくりと添加し、そして、２０〜３６μｌの１Ｎ ＮａＯＨの添加でｐＨをおよそ７．０〜７．２に調節した。生じる物質を４℃で暗所にて一夜穏やかに混合し、次いでＰＢＳ、ｐＨ７．２の２回の１Ｌ交換に対し暗所で透析した。次の４種のＡβペプチド（リンカーを伴わないアミノ酸１−５、リンカーを伴わないアミノ酸１−９、リンカーを伴わないアミノ酸１−１２、およびリンカーを伴うアミノ酸１−５）について、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応を使用して遊離ＳＨ基を確認した。ＣＲＭ_１９７は、前述されたとおり、ブロモアセチル化し、精製しかつＴＮＢＳＡと反応させた。各ペプチドのｐＨを、溶解されたペプチドの容量の２．２倍の０．１Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ８．５）の添加で７．０に調節した。ペプチドを、１：１の比で冷活性化ＣＲＭ_１９７にゆっくりと添加し、そして４℃で暗所にて一夜反応させた。生じる物質を透析した。最終対照ペプチド（逆向きの１−１２ｍｅｒ）を、以下の改変を伴い、上述されたとおりＣＲＭ_１９７に結合した。ペプチドのｐＨを７．０に調節するよりはむしろ、活性化されたＣＲＭ_１９７のｐＨを２０％（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ８．０）の添加でおよそ７．５に調節した。各結合物を透析後に滅菌１５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、アルミニウム箔で包みそして４℃で保存した。担体上の反応性アミノ残基の活性化を、それから、質量分析を使用してその後確認した。

結合物 免疫原性ペプチド
Ａ□１−５−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲ−Ｃ（配列番号１）
Ａ□１−７−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤ−Ｃ（配列番号２）
Ａβ１−９−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧ−Ｃ（配列番号３）
Ａβ１−１２−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶ−Ｃ（配列番号４）
Ａβ１−５−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲ−ＧＡＧＡ−Ｃ（配列番号５）
Ａβ１−７−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤ−ＧＡＧＡ−Ｃ（配列番号６）
Ａβ１−９−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧ−ＧＡＧＡ−Ｃ（配列
番号７）
Ａβ１−１２−Ｌ−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶ−ＧＡＧＡ−Ｃ
（配列番号８）
Ａβ１２−１−Ｃ−ＣＲＭ_１９７ ＶＥＹＧＳＤＨＲＦＥＡＤ−Ｃ（配列番号９）
（−ＶＥ対照）
Ｌ＝リンカー（ＧＡＧＡ）（配列番号１０）

Ａβペプチド−ＣＲＭ_１９７結合物の製造および限外濾過による精製
ＣＲＭ_１９７のブロモアセチル化
０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中のＣＲＭ_１９７（１００ｍｇ）を、アルゴン雰囲気下、１：１の重量比でブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍＬまで溶解した）と反応させた。反応を、ｐＨを７．０に維持するのに必要とされるように滴定した。混合物を暗所にて室温で１．５時間攪拌した。反応混合物を、ＵＦ／ＤＦ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ、マサチューセッツ州ビレリカ）の保持液リザーバ中に１．２μｍ濾過した。精製は、１０Ｋ若しくは３０Ｋ ＵＦメンブレンを使用して、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対するダイアフィルトレーション（３０倍）により行った。ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７を、０．２μｍフィルターを通過させることにより濾過した。ブロモアセチル化の程度を、活性化されたＣＲＭ_１９７をシステインと反応させること、次いでアミノ酸分析および生じるカルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の定量により測定した。
Ａβペプチドおよびブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７の結合ならびにＮ−アセチルシステアミンでのキャッピング
ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７（５０ｍｇ）を反応容器に移した。２〜８℃で維持した攪拌した溶液に１Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウムを添加した。アルゴン雰囲気下で滴定を実施して９．０の標的ｐＨを達成した。別個に５０ｍｇのＡβペプチドを秤量し、そして注射用水（ＷＦＩ）に２０ｍｇ／ｍＬまで溶解した。この溶液に、ｐＨ９．０が達成されるまで１Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウムを添加した。ペプチド溶液をブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７溶液に添加し、そして混合物を２〜８℃で１４〜１８時間攪拌した。残存するブロモアセチル基を、２０倍モル過剰のＮ−アセチルシステアミンで２〜８℃で３〜６時間キャッピングした。

反応混合物を、ＵＦ／ＤＦ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＸＬ）の保持液リザーバに１．２μｍフィルターを通して濾過し、そして、結合物を、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションすることによる、１０Ｋ若しくは３０Ｋ ＭＷＣＯメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での３０倍のダイアフィルトレーションにより室温で精製した。保持液を収集しかつ０．２μｍ濾過し、そしてタンパク質含量について（Ｌｏｗｒｙ若しくはＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ比色アッセイ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アミノ酸分析により、およびマウスにおける免疫原性について分析した。

未反応のブロモアセチル基のキャッピングによるアミノアセチル基への転化
実施例２で上述されたとおり製造したブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７（５０ｍｇ）を反応容器に移した。２〜８℃で維持した攪拌した溶液に１Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウムを添加した。アルゴン雰囲気下で滴定を実施して９．０の標的ｐＨを達成した。別個に５０ｍｇのＡβペプチドを秤量し、そしてＷＦＩに２０ｍｇ／ｍＬまで溶解した。この溶液に、ｐＨ９．０が達成されるまで１Ｍ炭酸／重炭酸ナトリウムを添加した。ペプチド溶液をブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７溶液に添加し、そして混合物を２〜８℃で１４〜１８時間攪拌した。残存するブロモアセチル基を、８％重炭酸アンモニウム溶液を使用して２〜８℃で４時間キャッピングした。

反応混合物をＵＦ／ＤＦ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＸＬ）の保持液リザーバに１．２μｍ濾過し、そして、結合物を、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションすることによる、１０Ｋ若しくは３０Ｋ ＭＷＣＯメンブレンでの３０倍のダイアフィルトレーションにより室温で精製した。保持液を収集しかつ０．２μｍ濾過し、そしてタンパク質含量について（Ｌｏｗｒｙ若しくはＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ比色アッセイ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、アミノ酸分析により、およびマウスにおける免疫原性について分析した。

ペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド結合物の結合およびキャッピングの程度の評価としてのＳ−カルボキシメチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステアミンの量的測定
ブロモアセチル活性化の化学を使用して生成されるタンパク質−ペプチド結合物の酸加水分解は、結合された部位のシステインからの酸安定性のＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）、およびキャッピングされた部位のシステアミンからの酸安定性のＳ−カルボキシメチルシステアミン（ＣＭＣＡ）の形成をもたらした（図２）。結合されたおよびキャッピングされたリシンの全部をリシンに戻し転化し、そしてそれ自体を検出した。全部の他のアミノ酸は、該加水分解条件により破壊されたトリプトファンおよびシステインを除き、遊離アミノ酸に戻し加水分解された。アスパラギンおよびグルタミンはそれぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸に転化された。

結合物サンプルを、１ｍｇ／ｍＬ未満の総タンパク質濃度まで脱イオン水で希釈した。各結合物の２個の１０マイクログラムのアリコートを乾燥し、そして１００μＬの６Ｎ ＨＣｌ［Ｐｉｅｒｃｅ］、５μＬの溶融フェノール［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］および１μＬの２−メルカプトエタノール［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］に再懸濁した。サンプルをその後、真空（１００ｍＴ）下１１０℃で２２時間インキュベートした。生じる加水分解物を乾燥し、２５０μＬのＢｅｃｋｍａｎ Ｎａ−Ｓクエン酸ナトリウムサンプル希釈緩衝液（ｐＨ２．２）［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フラートン］に再懸濁し、そしてＷｈａｔｍａｎの０．２μｍナイロンシリンジチップフィルターおよび１ｍＬシリンジを使用して濾過した。

各サンプルをその後、Ｂｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析機のサンプルループに負荷し、そして分析機に入れた。各加水分解サンプルおよび対照のアミノ酸を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離し、次いでＢｅｃｋｍａｎニンヒドリンＮｉｎＲＸ溶液と１３５℃で反応させた。誘導体化されたアミノ酸をその後、可視範囲で５７０ｎｍおよび４４０ｎｍで検出した（表１を参照されたい）。５００ピコモルの各アミノ酸を含有するアミノ酸の標準組［Ｐｉｅｒｃｅアミノ酸標準Ｈ］を、各分析組についてサンプルおよび対照と一緒に分析した。Ｓ−カルボキシメチルシステイン［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を標準に添加した。

各標準ピークの面積を、各サンプルの比率の評価のための量的等価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）として使用した。プロリンは４４０ｎｍから測定し、そしてグルタミン酸（最も近いアミノ酸）を使用して５７０ｎｍでの等価に変換した。

これらのピコモル値のそれぞれを、タンパク質中に存在する理論的リシン値とのリシンのピコモルの比較を使用して、アミノ酸残基のモル比に変換した。システインおよびシステアミンへのその共有結合ならびに期待される類似の加水分解に基づき、この評価にリシンを選んだ。アミノ酸の生じるモル数をその後、タンパク質のアミノ酸組成と比較し、そして、ＣＭＣおよびＣＭＣＡの値と一緒に報告した。ＣＭＣ値は結合の程度の評価に直接使用し、また、ＣＭＣＡ値はキャッピングの程度の評価に直接使用した。

Ａβ−ＣＲＭ_１９７ペプチド結合物の特徴付けおよび最適化
結合を確認するため、全部のペプチド−ＣＲＭ_１９７結合物を、アミノ酸分析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により分析した。各結合物について、各モルのＣＲＭ_１９７に結合されたペプチドのモルを、アミノ酸分析（Ｓ−カルボキシメチルシステイン残基の数）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定した。各方法により決定された値は全般として一致した。
Ｉ．サイズ排除クロマトグラフィー
バッチ濃縮物サンプルを貯蔵庫から取り出し、そして室温に温まらせた。Ａβペプチド結合物サンプルは均一な調製物を保証するため穏やかに混合した。Ａβペプチド結合物サンプルをエッペンドルフ微小遠心機で回転していかなる微粒子も除去した。上清をＴｏｓｏＨａａｓ ＴＫＳゲル Ｇ３０００ＳＷクロマトグラフィー（ＴｏｓｏＨａａｓ、ドイツ・シュトゥットガルト）のため引き出した。ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷカラムをＨＰＬＣ装置に接続し、そして圧力限界を１．４ＭＰａに設定した。カラムを最低３０ｍＬのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２±０．１）で、０．７５ｍＬ／分の流速で平衡化した。Ａβペプチド結合物サンプルを、以下のパラメータ、すなわち
Ａβペプチド結合物サンプルの濃度：１．５±１．０ｍｇ／ｍＬ
流速：０．７５ｍＬ／分
サンプル容量：０．１ｍＬ
分析時間：３０分
を使用して、ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫゲル Ｇ３０００ＳＷカラムに負荷した。

吸光度を２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ双方でモニターした。長期の貯蔵のため、ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＫＳゲル Ｇ３０００ＳＷカラムは、最低５０ｍＬの２０％エタノールで０．５〜１．０ｍＬ／分の流速で平衡化した。
ＩＩ．ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）：
活性化された（ブロモアセチル化された）ＣＲＭ_１９７およびＡβペプチド−ＣＲＭ_１９７結合物を、中性のｐＨ、プレキャストポリアクリルアミドミニゲル装置、およびＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液とともにＮｕＰＡＧＥビス−トリス電気泳動（Ｎｏｖｅｘ、ドイツ・フランクフルト）を使用してＳＤＳゲルにより検査した。各活性化ＣＲＭ若しくは結合物の８μｇのアリコートを還元サンプル緩衝液と混合しかつ１００℃で５分間加熱した。結合物および分子量（ＭＷ）標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をビス−トリス−ＨＣｌ緩衝系に基づく１０％（ｗ／ｖ、アクリルアミド）ＮｕＰａｇｅゲル（Ｎｏｖｅｘ）に負荷し、そしてＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ）で泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、ゲルをＰｉｅｒｃｅゲルコードブルー（Ｇｅｌ Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）で染色した。Ａβペプチド−ＣＲＭ_１９７結合物は、少量の多量体のバンドと一緒に、天然のＣＲＭのバンドの上の６６ｋＤａ付近の主バンド、および１２０ｋＤａ付近の二量体バンドにより表された（データは示されない）。
ＩＩＩ．ペプチド−ＣＲＭ_１９７結合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析：
質量分析を結合の程度の即座の近似に使用した。活性化されたＣＲＭ_１９７および結合物サンプルの適切なアリコートを、マトリックスとして３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−ケイヒ酸（シナピン酸）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ Ｌａｓｅｒｍａｔ ２０００質量分析計、ニューヨーク州リンゴーズ）により測定された活性化されたＣＲＭ_１９７の分子量は６０．５ｋＤａ付近に集中していることが見出され、また、結合物については結合の程度に依存して６５ｋＤａから７４ｋＤａまで変動した（データは示されない）。ＣＲＭ_１９７中のリシンの２２個まで（約５０％）が１：１の比で修飾されたことが見出された。
ＩＶ．最適化実験：
活性化および結合の程度は、試薬：タンパク質比、反応温度、および反応緩衝液のｐＨの関数である。結合反応の再現可能なプロセス制御パラメータを有するために、最適なｐＨ条件を同定するために実施した最適結合条件を具体的に説明するいくつかの実施例を下に示す。結果（図３）は、Ａβ ５ｍｅｒ（ＤＡＥＦＲＣ）（配列番号１）ならびにＡβ ７ｍｅｒ（ＤＡＥＦＲＨＤＣ）（配列番号２）への結合反応がｐＨ依存性であり、かつ、反応条件のｐＨが増大される場合により高い程度の修飾／結合を生じることを示した。５ｍｅｒおよび７ｍｅｒペプチドのＴＦＡ塩を使用して、結合の程度を、変動する量のペプチド負荷でｐＨ９．０で評価した（図４）。ＣＲＭ１分子あたりの定義された数のペプチドコピーとのペプチド結合物を、結合過程の間にペプチド／活性化ＣＲＭ比を変動させることにより生成させ得ることが、これらの結果から明らかである。類似の実験を、Ａβ ７ｍｅｒペプチドの酢酸塩を使用して行った。

Ａβ１−７／ＣＲＭ結合について、キャッピング過程を、ＣＲＭあたりのＣＭＣＡのモルをＣＲＭあたりのＣＭＣのモルと比較することにより評価した。ＣＭＣおよびＣＭＣＡの合計は試験した各ペプチド：ＣＲＭ比について一定であったため、キャッピング過程は完了していると想定された（図５）。結合物中の総修飾は１９と２１との間（ブロモアセチル化されたリシンの数に匹敵）に留まった（図５）。これらの実験はペプチドの対イオンとしてＴＦＡを用いて行った。Ａβ１−７／ＣＲＭ結合を、ペプチドのＴＦＡ塩よりはむしろ酢酸塩を使用して反復し、そしてこれらのデータを図５および６に示す。キャッピング過程は完了まで行くようであり、各点のＣＭＣおよびＣＭＣＡの合計は２０と２２との間に留まった。Ａβ−ＣＲＭ結合反応の条件がｐＨ９．０で最適化され、結合の程度は反応中のペプチド対ＣＲＭ比により制御された。該比を０．１から１．５まで変動させることにより、結合の程度を変動させ得る（図６）。

活性化および結合の程度は、試薬：タンパク質比、反応の温度、および反応緩衝液のｐＨの関数である。各結合物の修飾（結合）の程度を、各結合物の質量値から活性化されたＣＲＭ_１９７の質量値を減算すること、および結合物を製造するのに使用したペプチドの質量により除算することにより計算した。結合物の全部についての修飾（結合）の程度を表２に記述する。

結合の程度は、１モルのＣＲＭ_１９７あたりに形成されるＳ−カルボキシメチルシステイン残基の推定される量により決定される値（また表２に示される）ともまた比較した。

Ａβペプチド結合物の免疫原性試験
それぞれＣＲＭ_１９７に結合された、ＡβのＮ末端残基１−５、１−７、１−９および１−１２にわたるペプチド（リンカー配列ＧＡＧＡＣを伴うおよび伴わない）、ならびにアミノ酸１２からアミノ酸１までの逆配列のＡβのＮ末端に対応するペプチド（逆配列の１−１２ｍｅｒ）を、ＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１を含む製剤中の結合されていないＡβ １−１２ｍｅｒペプチドと一緒にマウスを免疫するのに使用した。各群のマウスは、２０μｇのアジュバントＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１とともに処方した３０μｇ若しくは５μｇいずれかの用量のサンプルの１種で、試験の開始時（第０週）ならびにその後第３および６週に皮下で免疫した。試験プロトコルを表３に具体的に説明する。

表３に示されるとおり、ＣＲＭ_１９７に結合された、ＡβのＮ末端残基１−５、１−７、１−９および１−１２にわたるペプチド（リンカー配列ＧＡＧＡＣを伴うおよび伴わない）、ならびにアミノ酸１２からアミノ酸１までの逆配列のＡβのＮ末端に対応するペプチド（逆の１−１２ｍｅｒ）を、ＱＳ−２１を含む製剤中の結合されていないＡβ １−１２ｍｅｒペプチドと一緒にマウスを免疫するのに使用した。各群のマウスは、２０μｇのアジュバントＱＳ−２１とともに処方した３０μｇ若しくは５μｇいずれかの用量のサンプルの１種で、試験の開始時（第０週）ならびにその後第３および６週に皮下でワクチン接種した。Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを試験全体で使用し、各群に５マウスを含んだ。注入容量＝１００μｌ；Ｂ＝採血；Ｖ＝ワクチン接種；Ｅ＝放血。

抗Ａβ力価を、下述されるとおりＡβおよびＣＲＭ_１９７に対するＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔には、Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルプレート（＃３５９１）を、滅菌炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍＬのＡβ１−４２で室温で一夜被覆した。プレートを空にし、そして２００μｌ／ウェルの１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０中０．０５％ＢＳＡで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートを空にし、そしてＴＢＳ、０．１％Ｂｒｉｊ−３５（アジドを含まない）洗浄緩衝液を含有するプレート洗浄液で洗浄した。全部の一次抗血清は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／０．０２％アジドを含有する１×ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡで連続希釈し、そして１００μＬの各希釈をその後、適切なプレートのウェルに移しかつ室温で２時間インキュベートした。プレートをその後、上述されたとおり空にした／洗浄した。Ｓｏｕｎｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（都市、州）からのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／０．０２％アジドを含有するＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡで１０００倍希釈し、そして、１００μＬを各ウェルに添加しかつ室温で１時間インキュベートした。プレートをその後、上述されたとおり空にし／洗浄し、そして最後に、１００μＬ／ウェルのジエタノールアミン／ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８中で調製したリン酸ｐ−ニトロフェニル基質の１ｍｇ／ｍＬ溶液とともに室温で１時間インキュベートした。発色を５０μＬ／ウェルの３Ｎ ＮａＯＨの添加で停止した。プレートを６９０ｎＭの参照を伴い４０５ｎＭで読み取った。終点力価を０．１ＡＵのＯ．Ｄ．で計算した。

ＣＲＭ_１９７ ＥＬＩＳＡ
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェルプレート（＃６５００１１）を、滅菌炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中５．０μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）のＣＲＭ_１９７で３７℃で９０分間被覆した。プレートを空にし、そして、１×ＴＢＳ、０．１％Ｂｒｉｊ−３５洗浄緩衝液を含有するプレート洗浄液で洗浄した。全部の一次抗血清は０．３％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳで連続希釈し、そして１００μＬの各希釈をその後、適切なプレートのウェルに移しかつ３７℃で１時間インキュベートした。プレートをその後、上述されたとおり空にした／洗浄した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈからのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／０．０２％アジドを含有する１×ＰＢＳで１０００倍希釈し、そして１００μＬを各ウェルに添加しかつ３７℃で１時間インキュベートした。プレートをその後、上述されたとおり空にし／洗浄し、そして最後に、１００μＬ／ウェルのジエタノールアミン／ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８中で調製したリン酸ｐ−ニトロフェニル基質の１ｍｇ／ｍＬ溶液とともに室温で１時間インキュベートした。発色を５０μＬ／ウェルの３Ｎ ＮａＯＨの添加で停止した。プレートを６９０ｎＭの参照を伴い４０５ｎＭで読み取った。終点力価を０．１ＡＵのＯ．Ｄ．で計算した。

表４〜６はＡβに対する終点のＥＬＩＳＡ力価を具体的に説明する。初回免疫化後に、全８種の結合物（陰性対照を除外する）が測定可能な抗Ａβ ＩｇＧ免疫応答を誘導した。しかしながら、３０μｇ用量のＡβは初回免疫化後第３週に陽性の応答を示したが、しかし５μｇ用量はしなかった。全部の結合物の中で、リンカーを伴わずに結合させたＡβ １−７ペプチドが、試験した他の結合物と同じくらい良好な若しくはより良好な応答を導き出したようである。５μｇ用量で、Ａβ １−５Ｃは第８〜１６週により良好に導き出した。Ａβ １−７Ｃは３０μｇ用量で最良であった。５若しくは３０μｇいずれの用量での第二および第三の免疫化後の抗体力価の分析も、結合物の大部分についてＡβに対する最大の免疫応答が第二の免疫化後に見られたことを示す。少なくともマウスにおいて、第三の免疫化は免疫応答を高めるようではなかった。Ａβペプチドは、しかしながら、該ペプチドに対する最大の免疫応答に達するために３０μｇ用量で３回の免疫化を必要とした（表５）。長期間にわたる抗体の減少に関して、結合物で免疫した群からの抗体レベルは、その群内の最高レベルに比較して２ないし３倍だけ低下した。第６および８週からの個々のサンプルを分析して、該群のそれぞれについてＡβに対するＧＭＴを計算して（表６）、いずれかの結合物群が他者より実質的により良好であったかどうかを見た。Ａβ１−５Ｃ、Ａβ １−７ＣおよびＡβ １−９Ｃ結合物からの第６週の力価の統計学的解析は、Ａβ １−７結合物が有意により高い力価を誘導したことを示した。リンカー配列ＧＡＧＡＣが該ペプチドに対する免疫応答を高めることに寄与しなかったこともまた本実験から明らかである。

表６．３０μｇ用量のアミロイド−ＡβのＮ末端の変動する長さにわたるペプチド結合物からの抗血清を使用するＡβに対する第６および８週のＥＬＩＳＡ終点ＧＭＴ。参照：Ｅｌａｎ過免疫ポリクローナル＃５９２＝３，０７３，３０７。Ｏ．Ｄ．０．１ＡＵでの終点。Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１とともに処方した３０μｇの上の抗原で第０、３および６週にＳＣ−Ｎ免疫した。
ａ．Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒを使用する１−５Ｃ、１−７Ｃおよび１−９Ｃからの第６週の力価の統計学的解析は、１−５Ｃ対１−７Ｃ間のみで統計学的差違を示す一方、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を使用する解析は、１−５Ｃ対１−７Ｃおよび１−５Ｃ対１−９Ｃの間で統計学的差違を示す。
ｂ．１−５Ｃ、１−７Ｃおよび１−９Ｃからの第８週の力価の統計学的解析は、３群間で統計学的差違を示さない。しかしながら、１−５Ｃ対１−７Ｃ間の差違を示しうる傾向があるようである。
ＰＤＡＰＰマウス脳組織染色
ＰＤＡＰＰ脳組織染色アッセイは、Ａβペプチド結合物および／若しくはＡβ １−４２抗血清の機能性の指標を提供する。個々のマウス群からの血清サンプルを、アミロイドペプチドを含有するＰＤＡＰＰマウス脳組織斑を認識するそれらの能力について個別に分析した。結果を表７Ａおよび７Ｂに示す。Ａβ ５ｍｅｒ結合物抗血清を除き、斑の認識において用量に関係した応答が存在した。リンカーに独立に、３０μｇの結合物で誘導した抗血清は５μｇの結合物の抗血清の反応性パターンに比較してより良好な反応性パターンを有した。しかしながら、Ａβ ５ｍｅｒ結合物抗血清では、５μｇ群に対する同様の若しくはより良好な反応性が存在すると思われる。全部のこれらの結果を比較して、Ａβ １−５ｍｅｒからＡβ １−９ｍｅｒから作成した結合物は、マウスにおいて斑を認識する免疫応答を誘発するのに十分であり、かつ、リンカーの存在は不可欠でないと結論づけられる。以下の結論をこの試験から引き出し得る。すなわち、（ａ）ペプチド結合物の全部が、結合されていないＣＲＭ_１９７対照（示されない）に比較して、担体タンパク質ＣＲＭ_１９７に対する高力価の（ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒｅｄ）抗血清ないし同等若しくはわずかにより高いレベルを誘導した。（ｂ）ＧＡＧＡＣリンカーを伴う結合物は、リンカーを伴わない結合物に比較して免疫原性若しくは機能性を高めなかった。（ｃ）免疫原性データおよびＰＤＡＰＰ脳組織染色（機能的抗体の初期の指標）は、Ａβ １−５ｍｅｒおよびＡβ １−７ｍｅｒ結合物がさらなる開発のための好ましい免疫原であるようであったことを示す。

サルにおける免疫原性試験
６匹のサルの群が、ＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１、ミョウバン若しくはＲＣ５２９ ＳＥ製剤のいずれかでアジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）３０μｇの７ｍｅｒ結合物（全結合物）を第０、２９および５８日に受領した。包含された追加の群は、ミョウバン（Ａｌ（ＯＨ）_３）若しくはＲＣ５２９ ＳＥのいずれかを伴う３０μｇの５ｍｅｒ結合物、および陽性対照としてＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１を伴う３００μｇのＡβであった。陽性対照は２週間ごとに免疫した。第３６および６４日に抗Ａβ抗体力価を測定した（図７〜９）。第３６日に、ＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１、ミョウバンおよびＲＣ５２９ ＳＥを伴う７ｍｅｒ／ＣＲＭ結合物が、それぞれ１０１１０、１３３３０および１７０９０のＧＭＴ力価を導き出した（図７）。対照的に、Ａβ １−４２およびＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１は、７５および３００μｇの用量レベルでそれぞれ２２３および１７３４のＧＭＴを導き出した。Ａβ ５ｍｅｒ結合物は、ミョウバンとともに２１３４およびＲＣ５２９ ＳＥとともに１５９８０の力価を導き出した。第６４日、すなわちＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１若しくはＲＣ−５２９ ＳＥいずれかを伴う結合物の３用量の後に、第二の投与後よりも実質的により高い力価を誘導した（ＧＭＴ ７ｍｅｒ／ＲＣ−５２９ ＳＥについて６９９１０；Ａβ ５ｍｅｒ／ＲＣ−５２９ ＳＥについて２１６４０、およびＡβ ７ｍｅｒ／ＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１について３０３１０）（図８）。ミョウバンを伴う結合物は、第三の免疫化後に第二の免疫化後に比較して低下した力価を導き出した。Ａβ ７ｍｅｒ結合物はＡβ ５ｍｅｒ結合物に比較してより良好な応答を導き出したようである。サルにおいて、ＲＣ−５２９ ＳＥ若しくはＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１でＡβ ７ｍｅｒ結合物にアジュバント添加することは最高の応答を導き出した（図９）。ミョウバンを伴うＡβ ７ｍｅｒ結合物に対する応答は中程度であり、そしてＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１を伴う３００μｇのＡβ １−４２のものに同様であった。

いくつかの結論を現在の実施例から引き出し得る。第一に、双方の結合物は霊長類種において非常に免疫原性である。第二に、免疫化製剤中のアジュバントの存在は免疫応答に大きく影響する。第三に、アルミニウムアジュバントを除き、ＲＣ−５２９ ＳＥおよびＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１は少なくとも３用量までの免疫化の各投与後に免疫応答を高める（図９）。全体として、Ａβ ７ｍｅｒ結合物は、５２９、次いでＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ ＱＳ−２１の存在下でより高い抗体応答を誘導した（図９を参照されたい）。

多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）結合物の製造およびそれらの免疫原性試験
数種の方法が担体上で複数の抗原部位を生成させるのに利用可能である。前の実施例においては、各抗原部位が、規定される結合およびキャッピング化学により担体に個別に結合される。本実施例では、Ａβ１−７ｍｅｒのタンデム反復の固相合成により複数の抗原部位を構築する。あるいは、これらのタンデム反復を、別の場所に記述されるとおりリシン核による連結を伴い若しくは伴わずにＴ細胞エピトープと結合し得る。これらの多価抗原ペプチドを、担体タンパク質への結合のための付加的なシステイニル残基を伴い合成した。カルボキシル端に１個の付加的なシステイニル残基をもつ１個の反復単位（１−７）、３個の反復単位（１−７）_３および５個の反復単位（１−７）_５を含有するペプチドを合成した。これらのペプチドを、それらのＣ末端システイン残基により、ブロモアセチル化したＣＲＭに一夜共有結合した。該反応は、表８に概説されるとおり添加したペプチド：ＣＲＭ比を伴い、ｐＨ９．０〜９．２で実施した。ペプチドと反応しなかったブロモアセチル基をＮ−アセチルシステアミンでキャッピングした。これらのロットは、それぞれ、ＣＲＭに結合された１個の単一コピー、３個のタンデムコピーおよび５個のタンデムコピーのＡβ１−７ペプチドを含有する結合物を表す。表８はサンプルの特性を簡潔に概説する。

ペプチド負荷（担体あたりのＡβ １−７ペプチドの平均数）およびキャッピング数（表９）は、アミノ酸分析により決定されるところの担体あたりの独特のアミノ酸（ＣＭＣ若しくはＣＭＣＡ）の数である。ＣＭＣおよびＣＭＣＡ値はリシンに基準した。

Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（群あたり１０匹）を１若しくは０．１μｇのＡβ／ＣＲＭ結合ペプチドで皮下に免疫した。マウスの半分は１００μｇのアジュバントＡｌ（ＯＨ）_３とともに処方した組成物で免疫し、そして半分はアジュバントを伴わずに免疫した。免疫化は第０および３週に計画した。採血は第０、３および６週間計画した。血清サンプルをＡβ１−４２ｍｅｒペプチドに対する抗体応答について分析した。結果を表１０に示す。

全部の結合物が初回免疫化後に抗Ａβ １−４２抗体力価を誘導し、そして、該レベルは追加免疫投与後に実質的に増大した。アルミニウムアジュバントの非存在下で、用量応答の差違が第３週および第６週双方の採血で明らかであった。より高用量は高力価の抗体応答を導き出した。アルミニウムアジュバントは、アジュバント添加されない（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）群に比較して、第３週に双方の用量レベル（０．１および１μｇ）で実質的により高い抗体応答を導き出した。第二の免疫化の後に、１μｇ用量で与えられた結合物は抗体レベルの５ないし１０倍の増大を導き出した。この用量レベルで、３および５個の反復を伴うペプチド結合物は、単一の反復を含有する結合物よりも高い抗体応答を誘導した。ＣＲＭ担体に対する力価もまた測定し、そしてこれらを表１１に列挙する。

表１１のデータは、アジュバント添加されない群が、１μｇならびに０．１μｇ双方の用量レベルで２回の免疫化後でさえ非常に低レベルの抗ＣＲＭ抗体応答を誘導したことを示す。しかしながら、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う結合物は、１μｇ用量でかなりのレベルの抗ＣＲＭ抗体応答、および０．１μｇ用量ではるかにより低い応答を誘導した。アジュバントの存在下で、ＣＲＭ力価は単一の反復の結合物について最高であり、三重の反復の結合物について中間であり、そして五重の反復の結合物について最低であった。ペプチド用量あたりのＣＲＭ用量がＡβ（１−７）_５／ＣＲＭについて最低かつＡβ（１−７）_１／ＣＲＭについて最高であるために、これは期待されたとおりである。該差違は、０．１μｇ用量について第６週でのみ統計学的に有意であった。

本発明の目的は、抗原性ハプテンに対する高力価の免疫原性応答を誘発することであり、そして必ずしも担体タンパク質に対してでない。ある状況下では、担体タンパク質に対する最小の免疫応答を伴い若しくは全く伴わずに、ハプテンの抗原決定子に対する最適の免疫応答を誘発することが望ましい。こうした応用のため、アジュバント添加されない製剤との多価抗原決定子のタンデム反復を伴う結合物が該必要性にかなうことができる。

多様な担体タンパク質を伴うＡβ−ペプチド結合物の製造およびそれらの免疫原性
本実施例は、６種の異なる担体タンパク質を使用した結合物の免疫原性を比較する。Ａβ１−７の酢酸塩を、ブロモアセチル化した担体にｐＨ９で１：１の重量比で添加した。Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐを除く全結合物をＮ−アセチルシステアミンでキャッピングした。代替担体の全部は、ＣＲＭ（ジフテリアトキソイド）、組換えＣ５ａペプチダーゼ（ｒＣ５ａｐ；Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からクローン化された、Ｄ１３０ＡおよびＳ５１２突然変異を包含する）、ＯＲＦ １２２４、１２６４、２４５２（全部化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からクローン化された）、ならびにＴ３６７、Ｔ８５８（それぞれクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からクローン化された）を包含する組換え細菌タンパク質である。使用される担体の概要は表１２に見出される。これらの担体への各Ａβ １−７結合物の結合およびキャッピングの程度を表１３に提示する。

本試験は、組換えＣ５ａペプチダーゼ結合物が、ＣＲＭを包含する試験された他の担体の大部分よりもＡβに対するより高力価を誘導したことを示した。この差違は水酸化アルミニウムを受領した群の第６週の力価について統計学的に有意であった。加えて、Ａβ１−７／Ｔ８５８結合物は、アジュバントの非存在下の大部分の他の結合物よりも有意により免疫原性であった。ＣＲＭ対照結合物に関して乏しく機能した唯一の結合物はＡβ１−７／Ｔ３６７（ウエスタンブロットによってもまたＡβ特異的モノクローナル抗体と反応しなかった結合物）であった。本試験は、Ａβペプチドに対し免疫するのに多数の他の担体を成功裏に使用し得ることを確認する。

結合の結果：ペプチド負荷（担体あたりのＡβ１−７ペプチドの平均数）およびキャッピング数は、アミノ酸分析により決定されるところの担体あたりの独特のアミノ酸（ＣＭＣ若しくはＣＭＣＡ）の数である。ＣＭＣおよびＣＭＣＡ値はリシンに基準した。
免疫化の結果
本試験の各群の力価の幾何平均を表１４に列挙する。第３週で、アジュバントの存在に関係なく、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＯＲＦ １２２４、１６６４、２４５２、若しくはクラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＯＲＦ Ｔ３６７およびＴ８５８を伴い製造した対応する結合物よりも有意により高い抗Ａβ力価を誘導した。アジュバントの非存在下の第３週で、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐはまた、Ａβ１−７／Ｔ８５８を除く全部の他の結合物よりも免疫原性でもあった。Ａｌ（ＯＨ）_３を伴わないＴ８５８結合物は、アジュバントを伴わないＯＲＦ１２２４、ＯＲＦ１６６４、ＯＲＦ２４５２およびＣＲＭ結合物よりも高力価を誘導した。Ａβ１−７／ＣＲＭより有意により少なく免疫原性であった唯一の結合物はＡβ１−７／Ｔ３６７であった（ｐ＜０．００００２）。Ｔ３６７担体は第３および６週の双方でアジュバントを伴い若しくは伴わずに乏しく機能した。第６週で、水酸化アルミニウムを伴うｒＣ５ａｐ結合物は、Ａβ１−７／ＯＲＦ２４５２を除く全部の他の結合物よりも免疫原性であった（ｐ＜０．０４）。アジュバントの非存在下で、Ａβ１−７／ｒＣ５ａｐおよびＡβ１−７／Ｔ８５８の双方が、ＯＲＦ１２２４、ＯＲＦ１６６４若しくはＴ３６７結合物よりも有意により高い力価を誘導した。水酸化アルミニウムを伴わないＡβ１−７／ＣＲＭは、Ａβ１−７／ＯＲＦ１６６４若しくはＡβ１−７／Ｔ３６７いずれよりも高力価を誘導した。

付加的なＡβペプチド−タンパク質結合物の製造
Ｉ．活性化
融解したＣＲＭ_１９７（８ｍＬ、７．４８ｍｇ／ｍＬで５９．８４ｍｇ）を、５ｍｇ／ｍＬまでの濃度にするように０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９、３．９６８ｍＬ）に溶解した。該溶液を氷浴中で０〜５℃に冷却した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５９．９ｍｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ）をＤＭＦ（１００μＬ）（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ）に溶解し、そしてＣＲＭ_１９７の溶液に一滴ずつ添加した。ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの添加に際して沈殿物が観察された。ｐＨを確認した場合、それはｐＨ６に低下した。反応混合物のｐＨを、より多くの０．１Ｍホウ酸緩衝液を添加することによりｐＨ９に戻した。反応混合物をその後、穏やかに旋回させながら４℃で１時間攪拌した。混合物を、ＹＭ−１０セントリプレップ遠心濃縮を使用して精製かつ濃縮し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５上で溶離液として１０ｍＭホウ酸を使用して再精製した。ブラッドフォード試薬に対し陽性の画分を合わせ、そしてセントリプレップＹＭ−１０を使用して濃縮した。ブロモアセチル化の程度をブラッドフォードアッセイ（直線的）により測定した。濃度は５．３６ｍｇ／ｍＬであることが見出された（３０ｍｇを生じた）。最終濃度をその後５ｍｇ／ｍＬになるように調節し、そして５％ショ糖中でさらなる使用まで冷凍庫中で保存した。
ＩＩ．結合
各結合物について、融解したブロモアセチル化したＣＲＭ_１９７を使用した。ペプチドをホウ酸緩衝液に溶解した（１２５ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液中２．５ｍｇ）。わずかな不溶性が、ＡβペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）、ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）およびＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）で観察された。ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７（５ｍｇ／ｍＬ）をペプチド溶液／懸濁液で処理した。混合物中のペプチドおよびタンパク質の比は１：２であった。濁りが、ペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）、ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）およびＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）を含む結合物の混合物中で観察された。該混合物をその後ｐＨについて確認し（ｐＨ９）、そしてゆっくり旋回させながら４℃で一夜インキュベートした。混合物の最終濃度をインキュベーション前に３ｍｇ／ｍＬにした。ペプチドＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）およびＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）を含む結合物の混合物の濁りはインキュベーション後に消失した。しかしながら、ＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）およびＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）はなおわずかに濁っていた。可溶性の擬似タンパク質結合物もまた、システアミンで１：１（ｗ／ｗ）の比で調製した。合成したペプチドは約９５％純度を伴いＢＩＯＳＯＵＲＣＥから得た。
オクタマー：
ＬＶＦＦＡＥＤＶＣ（配列番号４４）
ＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）
ＶＦＦＡＥＤＶＧＣ（配列番号４３）
ＣＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）
ＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）
ＣＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）
ヘプタマー：
ＶＦＦＡＥＤＶＣ（配列番号４９）
ＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号５０）
ＩＩＩ．タンパク質上の未反応のリシン基のキャッピング：
未反応のリシンを、Ｎ−アセチルシステアミン（ＣＭＣＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ）で１／１（ｗ／ｗ）の比で暗所で旋回させながら４℃で４時間キャッピングした。未反応のペプチドおよびキャッピング試薬を、ＰＢＳ緩衝液（２Ｌ）に対するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｍ_Ｗカットオフ１０，０００）（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用する一夜（１３時間）の透析により結合物から除去した。緩衝液交換および透析を２回行った（２×１４時間）。わずかな不溶性がペプチドＫＬＶＦＦＡＥＤＣ（配列番号４５）およびＣＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）を含む結合物中で観察された。全部の結合物をその後、保存剤中４℃で冷蔵庫中で保存した。
ＩＶ．タンパク質担体の特徴付け：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して、ブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７の質量および擬似結合物Ｎ−アセチルシステアミン−ＣＲＭ_１９７の質量を測定した。

ＣＲＭ_１９７およびブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７の質量に基づき、１１残基のリシンが修飾された。
（５９９４１．４６−５８５９０．２９）／１２２＝１１
式中；ＣＲＭ_１９７のＭｗは５８６２４．２９である
ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７のＭｗは５９９４１．４６である
ブロモ酢酸のＭｗは１２２である。

ブロモアセチル化の程度は２８％以上であった。（ＣＲＭ_１９７中のリシンの総数は３９であった）。これらの１１個の修飾されたリシン残基から、１０個がシステアミンで結合された。カップリング効率は９０％であった。
（６１１４３−５９９４１）／１１９＝１０
式中；ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７のＭｗは５９９４１．４６である
擬似結合物のＭｗは６１１４３である
Ｎ−アセチルシステアミンのＭｗは１１９である
（１０／１１）×１００＝９０
Ｖ．トリス−トリシンプレキャストゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析によるペプチド−タンパク質結合物の特徴付け：
タンパク質−ペプチド結合物をウエスタンブロットにより分析した。レーンは：マーカー（レーン１）；Ｌ−２８３７５ ２４／０１（レーン２）；Ｌ−２８３７５ ２４／０２（レーン３）；Ｌ−２８３７５ ２４／０３（レーン４）；Ｌ−２８３７５ ２４／０４（レーン５）；Ｌ−２８３７５ ２４／０５（レーン６）；Ｌ−２８３７５ ２４／０６（レーン７）Ｌ−２８３７５ ２４／０７（レーン８）；Ｌ−２８３７５ ２４／０８（レーン９）；Ｌ−２８３７５ ２４／０９（擬似）（レーン１０）；およびＢｒＡｃＣＲＭ_１９７（レーン１１）である。マウスからのペプチド特異的モノクローナル抗体（２４８−６Ｈ９−８０６ Ａβ １７−２８）を一次抗体（抗血清）として使用した（３０００倍希釈が最良であることが見出された）。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰが二次抗体（１０００倍希釈）であった。全部の結合物が、擬似結合物および活性化されたＣＲＭ_１９７を除き、一次抗体により認識されたことが観察された。（図１０を参照されたい。）
タンパク質濃度
結合物サンプルのタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイにより測定した。（表１５を参照されたい。）
アミノ酸分析
アミノ酸分析を実施して結合の程度を決定した。結合のＴ程度は、結合物中で見出されるＣＭＣＡ（カルボキシメチルシステアミン）残基に基づき計算した。ＣＭＣＡは、ペプチドとの結合後に未反応の活性化された部位をキャッピングするのに使用した。（表１５を参照されたい。）

全部の比色アッセイはマイクロプレート分光光度計およびＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏを使用して実施した。

Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおけるＡβペプチド結合物の免疫原性試験
非近交系Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、それぞれＣＲＭ_１９７に若しくはＡβ１−７ＣＲＭ_１９７と結合させたＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）（全部アジュバントＲＣ ５２９ ＳＥとともに処方した）で免疫した。１群あたり１０動物の９群を、試験の開始時（第０週）およびその後第４週にＡβペプチド結合物の１種で皮下に免疫した。血清を、免疫化の前しかし同一日に収集した。
近交系Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡβペプチド結合物の免疫原性試験
近交系Ｂａｌｂ／ｃマウスを先行する段落でのとおり免疫したが、しかし第１２週に結合物およびアジュバントで追加免疫もまたした。
結果
双方の試験から血清を、Ａβ_{１３−２８}ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価の分析のため収集している。Ｂａｌｂ／ｃマウスからの血清もまた、分析のため、第１２週の追加免疫の１日前およびその１週後に収集する。実施例１１で使用した動物からの脾細胞を、Ａβ_１−４２にわたるペプチド、完全長のＡβ_１−４２、ＣＲＭ_１９７若しくはポリクローナル活性化物質の重なり合うプールでの刺激に対しｉｎ ｖｉｔｒｏで応答するそれらの潜在能力について評価する。分析はインターロイキン４および５ならびにインターフェロン−γについてのＥｌｉｓｐｏｔの読み出しから構成される。完了時に、Ａβペプチド結合物を上述されたとおりかつ実施例６に記述されたとおり評価する。

ＰＳＡＰＰマウスにおけるＡβペプチド結合物の免疫原性試験
ＰＳＡＰＰマウスを、ＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）で免疫する。ＰＳＡＰＰマウス（変異体ＡＰＰおよびＰＳ１導入遺伝子を過剰発現する二重トランスジェニックマウス（ＰＳＡＰＰ））はＨｏｌｃｏｍｂら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９７−１１に記述されている。
ＰＤＡＰＰマウスにおけるＡβペプチド結合物の免疫原性試験
ＰＤＡＰＰマウスを、ＶＦＦＡＥＤＶＧ−Ｃ（配列番号４３）、ＬＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４４）、ＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号４５）、Ｃ−ＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号４６）、Ｃ−ＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号４７）、Ｃ−ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４８）、ＶＦＦＡＥＤＶ−Ｃ（配列番号４９）、ＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号５０）で免疫する。ＰＤＡＰＰマウスは変異体のヒトＡＰＰ（ＡＰＰ^Ｖ７１Ｆ）を発現し、そして若齢でアルツハイマー病を発症する（Ｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：９１６−９１９；Ｍａｓｌｉａｈ Ｅら（１９９６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５；１６（１８）：５７９５−８１１）。
結果
双方の試験からの血清を、Ａβ_{１３−２８}ペプチド特異的ＩｇＧ抗体力価の分析のため収集する。完了時に、Ａβペプチド結合物を、上述されたとおりかつ実施例６および１１に記述されたとおり、ならびに状況恐怖条件付け（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）（ＣＦＣ）アッセイで評価することができる。

状況恐怖条件付けは、大部分の動物、例えば哺乳動物において例外的に信頼できかつ迅速に獲得される学習の一般的な形態である。試験動物は、嫌悪経験とのその関連により、以前は中立の刺激および／若しくは環境を恐れることを学習する（例えば、Ｆａｎｓｅｌｏｗ、Ａｎｉｍ．Ｌｅａｒｎ．Ｂｅｈａｖ．１８：２６４−２７０（１９９０）；Ｗｅｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１７：３３１−３３４．（１９９７）；Ｃａｌｄａｒｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１７：３３５−３３７（１９９７）を参照されたい）。

状況恐怖条件付けは、例えば、神経変性疾患若しくは障害、Ａβに関係した疾患若しくは障害、アミロイド原性疾患若しくは障害のような疾患若しくは障害の結果としての認識機能若しくは機能不全、認識機能を遂げる好ましくない遺伝子変化の存在（例えば遺伝子突然変異、遺伝子破壊若しくは望ましくない遺伝子型）、および／または剤、例えばＡβ結合物剤の認識能力に対する有効性を決定するのにとりわけ有用である。従って、ＣＦＣアッセイは、認識疾患若しくは障害、ならびにとりわけ脳の１種若しくはそれ以上の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状皮質、前頭前皮質、鼻周囲皮質、感覚皮質および側頭葉内側部を冒す疾患若しくは障害を予防若しくは処置するための剤の治療効果の独立の試験および／若しくは検証方法を提供する。

典型的には、ＣＦＣアッセイは、標準的動物室、ならびに、聴覚（例えばある期間の８５ｄｂのホワイトノイズ）、嗅覚（例えばアーモンド若しくはレモン抽出物）、触覚（例えば床ケージの質感）および／または視覚的合図（光点滅）と対にした軽度のショック（例えば０．３５ｍＡの足ショック）を含んでなる条件付け訓練の使用を使用して実施する。嫌悪経験（ショック）に対する応答は、典型的に、不動（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）（呼吸を除く動きの非存在）の１つであるが、しかし、選択した試験動物に依存して、瞬き若しくは瞬膜反射の変化もまた包含しうる。嫌悪応答は、通常、条件付けられていない恐怖の基礎を測定するための訓練の第１日に特徴付けられ、その後の試験日での嫌悪応答の結果、例えば状況および／若しくは合図の存在下しかし嫌悪経験の非存在下での不動は、それぞれ状況および合図に条件付けられた恐怖と特徴づけられる。向上された信頼性のため、試験動物は、典型的には、長時間にわたり独立した技術者により別個に試験かつ評価される。付加的な実験デザインの詳細は、当該技術分野、例えばＣｒａｗｌｅｙ，ＪＮ、Ｗｈａｔ’ｓ Ｗｒｏｎｇ ｗｉｔｈ ｍｙ Ｍｏｕｓｅ；Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（２０００）に見出し得る。

例示的試験動物（例えばモデル動物）は、アルツハイマー病のようなアミロイド原性障害に特徴的である顕著な症状若しくは病理学を表す哺乳動物（例えばげっ歯類若しくはヒト以外の霊長類）を包含する。モデル動物は、所望のものについての選択的に同系交配することにより創製しうるか、または、それらは、標的とされる遺伝子の異常な発現若しくは機能につながる、痴呆障害と関連する遺伝子中の標的とされる遺伝子変化（例えば遺伝子突然変異、遺伝子破壊）のような当該技術分野で公知であるトランスジェニック技術を使用して遺伝子的に工作しうる。例えば、ＡＰＰを過剰発現しかつアミロイド斑の病的状態を発症しかつ／若しくはアルツハイマー病に特徴的である認識欠損を発症する、数種のトランスジェニックマウス系統が利用可能である（例えば、Ｇａｍｅｓら、上記、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１５５０（１９９７）；Ｍａｓｌｉａｈ ＥとＲｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｅ．（２０００）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．；５９：１７５−８３を参照されたい）。

あるいは、モデル動物は、アミロイド原性障害の特徴的な症状若しくは病理学と関連する解剖学的脳領域（例えば、海馬、扁桃体、鼻周囲皮質、内側中隔核、青斑、乳頭体）または特定のニューロン（例えばセロトニン作動性、コリン作動性若しくはドーパミン作動性ニューロン）の正常な機能を除去若しくは別の方法で妨害する化合物（例えば神経毒、麻酔薬）若しくは外科的技術（例えば定位的切除、軸索切断、横切開、吸引）を使用して創製し得る。ある好ましい態様において、動物モデルは、アミロイド原性障害と関連させる神経変性の病理学に加え、学習若しくは記憶と関連する顕著な認識欠損を表す。より好ましくは、該認識欠損は、モデル動物における疾患の進行がアミロイド原性疾患に罹っている被験体での進行の疾患と平行するような、増大する年齢とともに進行的に悪化する。

状況恐怖条件付け、および本明細書に記述される結合物の機能性を試験するための他のｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、野性型マウス若しくは損なわれた記憶に至るある種の遺伝子変化を有するマウス、または脳脊髄液（ＣＳＦ）若しくは血漿中の可溶性Ａβの上昇されたレベルを表すマウスモデルを包含する神経変性疾患、例えばアルツハイマー病のマウスモデルを使用して実施しうる。例えば、アルツハイマー病の動物モデルは、加齢依存性の記憶欠損および斑を示すヒトアミロイド前駆体タンパク質の「スウェーデン型」突然変異（ｈＡＰＰｓｗｅ；Ｔｇ２５７６）を過剰発現するトランスジェニックマウスを包含する（Ｈｓｉａｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２）。本明細書に記述される結合物のｉｎ ｖｉｖｏ機能性はまた、Ｄｕｆｆら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８３、７１０−７１３に記述されるＰＳ−１変異体マウスを使用しても試験し得る。アルツハイマー病の他の遺伝子的に変えられたトランスジェニックモデルは、Ｍａｓｌｉａｈ ＥとＲｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｅ．（２０００）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．５９：１７５−８３に記述されている。

多様な局面において、本発明の方法は、被験体における免疫治療の有効性を適して予測するアッセイの使用においてＡβ結合物が同定された、被験体において認識を改善することが可能であるＡβ結合物の投与を含んでなる。例示的態様において、該アッセイは、適する対照に比較して、動物への試験免疫学的試薬の投与後の動物の状況恐怖条件付け試験から決定されるところの認識を比較することに少なくとも部分的に基づくモデル動物アッセイである。ＣＦＣアッセイは、潜在的な治療的化合物での処置に際しての動物（典型的にはマウス若しくはラット）の認識の変化を評価する。ある態様において、評価される認識の変化は、記憶障害状態の改善若しくは記憶欠損の反転である。従って、ＣＦＣアッセイは、認識疾患、ならびにとりわけ脳の１種若しくはそれ以上の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状皮質、前頭前皮質、鼻周囲皮質、感覚皮質および側頭葉内側部を冒す疾患若しくは障害を予防若しくは処置するための剤の治療効果の直接決定方法を提供する。こうしたＣＦＣアッセイは、２００４年１２月１５日出願の“Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ Ｆｅａｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ（免疫治療の有効性を予測するための状況恐怖条件付け）”と題された同時継続中の米国特許出願第６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号（代理人整理番号ＥＬＮ−０５８−１をもつ）、および“Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ Ｆｅａｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ（免疫治療の有効性を予測するための状況恐怖条件付け）”と題された米国特許出願第６０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号（代理人整理番号ＥＬＮ−０５８−２をもつ）（それらの内容全体は引用することによりここに組み込まれる）にて論考されている。

Ａβ／ＣＲＭ_１９７結合物を形成するためのタンパク質／ポリペプチド担体ＣＲＭ_１９７へのＡβペプチドフラグメントの結合に使用されるプロセス化学を描く流れ図。 Ａβ／ＣＲＭ_１９７結合物のようなペプチド免疫原−タンパク質／ポリペプチド結合物の結合の程度の評価としてのＳ−カルボキシメチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステアミンの量的測定に使用される酸加水分解化学を描く流れ図。 Ａβペプチド／ＣＲＭ結合反応のｐＨ依存性を描く図。 ペプチド：ＣＲＭ比へのＡβ−ペプチド／ＣＲＭ結合の依存性を描く図。 Ａβ１−７／ＣＲＭ結合のキャッピング過程の確認。反応のｐＨは９．１５であった。ペプチドとの反応時間は１６時間であり、Ｎ−アセチルシステアミンでのキャッピングは８時間であった。 多様なペプチド：ＣＲＭ比でのペプチドとの結合およびキャッピング。反応のｐＨは９．０であった。ペプチドとの反応時間は１６時間であり、Ｎ−アセチルシステアミンでのキャッピングは８時間であった。 多様なアジュバントを伴うＡβペプチド結合物での霊長類の免疫化後の霊長類血清の第３６日の力価。 多様なアジュバントを伴うＡβ−ペプチド結合物での霊長類の免疫化後の霊長類血清の第６４日の力価。 日および処置群ごとの霊長類力価。霊長類は、アジュバントとしてミョウバン若しくはＲＣ５２９を伴うＡβ １−７若しくはＡβ １−５ ＣＲＭ_１９７結合物で免疫し、そして抗Ａβ抗体の力価を第２９、３６、５７および５４日に測定した。 ペプチド−タンパク質結合物を、トリス−トリシンプレキャストゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析を使用して特徴付けした。レーンは：マーカー（レーン１）；Ｌ−２８３７５ ２４／０１（レーン２）；Ｌ−２８３７５ ２４／０２（レーン３）；Ｌ−２８３７５ ２４／０３（レーン４）；Ｌ−２８３７５ ２４／０４（レーン５）；Ｌ−２８３７５ ２４／０５（レーン６）；Ｌ−２８３７５ ２４／０６（レーン７）Ｌ−２８３７５ ２４／０７（レーン８）；Ｌ−２８３７５ ２４／０８（レーン９）；Ｌ−２８３７５ ２４／０９（擬似）（レーン１０）；およびＢｒＡｃＣＲＭ_１９７（レーン１１）である。

Claims (29)

1. 担体タンパク質に共有結合されたペプチド免疫原を含んでなる免疫原性結合物であって、式：
   式中、Ｃは、ＣＲＭ ₁₉₇ 、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)ＯＲＦ１２２４、化膿性連鎖球菌ＯＲＦ１６６４、化膿性連鎖球菌ＯＲＦ２４５２、及びクラミジア肺炎病原体(Chlamydia pneumoniae)ＯＲＦ Ｔ８５８からなる群より選択される担体タンパク質であり、
   Ｘ^dは、担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導体化された官能基であり、
   Ｐは、担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導体化官能基にペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して共有結合されたＡβフラグメントを含むペプチド免疫原であり、
   Ｒは、担体タンパク質のアミノ酸残基の誘導体化官能基に共有結合されるキャッピング分子であり、それにより担体を用いない別の方法で生じないペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発する能力を保持するように担体タンパク質の官能性が保たれており、
   ｎは０より大きく３８以下の整数であり、および
   ｐは０より大きく３８以下の整数である、
   を有する、上記の免疫原性結合物。
2. 担体タンパク質がＣＲＭ₁₉₇である、請求項１に記載の免疫原性結合物。
3. Ａβフラグメントが、Ａβ（配列番号：２１）の残基１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１６、１−２８、３−６、３−７、１３−２８、１５−２４、１６−２２、１６−２３、１７−２３、１７−２４、１８−２４、１８−２５、１７−２８、２５−３５、３３−４２、３５−４０および３５−４２よりなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性結合物。
4. ペプチド免疫原がさらに末端システイン残基を含み、ペプチド免疫原が担体のアミノ残基の誘導体化官能基に末端システイン残基を介して共有結合される、請求項１に記載の免疫原性結合物。
5. 末端システイン残基がＡβフラグメントのカルボキシ末端に位置する、請求項４に記載の免疫原性結合物。
6. 末端システイン残基がＡβフラグメントのアミノ末端に位置する、請求項４に記載の免疫原性結合物。
7. ＡβフラグメントがＡβ（配列番号：２１）の残基１−７である、請求項５に記載の免疫原性結合物。
8. ＡβフラグメントがＡβ（配列番号：２１）の残基１６−２３である、請求項５に記載の免疫原性結合物。
9. キャッピング分子がアミノ基、ヒドロキシル基、システアミノ基、Ｎ−アセチルシステアミノ基およびエタノールアミノ基からなる群より選択される、請求項１に記載の免疫原性結合物。
10. キャッピング分子がＮ−アセチルシステアミノ基である、請求項９に記載の免疫原性結合物。
11. ｎが５以上であり２５以下の整数である、請求項１に記載の免疫原性結合物。
12. ｎが１２以上であり２０以下の整数である、請求項１１に記載の免疫原性結合物。
13. 担体タンパク質がＣＲＭ ₁₉₇ であり、ｎが１２以上であり１５以下の整数である、請求項７に記載の免疫原性結合物。
14. キャッピング分子がＮ−アセチルシステアミノ基である、請求項１３に記載の免疫原性結合物。
15. 担体タンパク質がＣＲＭ ₁₉₇ であり、ｎが１２以上であり１５以下の整数である、請求項８に記載の免疫原性結合物。
16. キャッピング分子がＮ−アセチルシステアミノ基である、請求項１５に記載の免疫原性結合物。
17. 式：
    を有する免疫原性結合物であって、
    式中、ＣはＣＲＭ ₁₉₇ であり
    Ｘ ^d は、ＣＲＭ ₁₉₇ の誘導体化されたリシン残基であり、
    Ｐは、Ａβ（配列番号：２１）の残基１−７及びＣ末端システイン残基を含むペプチド免疫原であって、Ｃ末端システイン残基を介して誘導体化リシン残基にペプチド免疫原が共有結合されており、
    Ｒは、ＣＲＭ ₁₉₇ の誘導体化リシン残基に共有結合されＮ−アセチルシステアミノ基を含むキャッピング分子であり、それにより担体を用いない別の方法では生じないペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発する能力を保持するように担体タンパク質の官能性が保たれており、
    ｎは０より大きく３８以下の整数であり、および
    ｐは０より大きく３８以下の整数である、
    免疫原性結合物。
18. ｎが５以上であり２５以下の整数である、請求項１７に記載の免疫原性結合物。
19. ｎが１２以上であり１５以下の整数である、請求項１８に記載の免疫原性結合物。
20. ｎが１２である、請求項１９に記載の免疫原性結合物。
21. ｎが１４である、請求項１９に記載の免疫原性結合物。
22. 前記ペプチド免疫原がＤＡＥＦＲＨＤ−Ｃ（配列番号：２）である、請求項１９に記載の免疫原性結合物。
23. 式：
    を有する免疫原性結合物であって、
    式中、ＣはＣＲＭ ₁₉₇ であり
    Ｘ ^d は、ＣＲＭ ₁₉₇ の誘導体化されたリシン残基であり、
    Ｐは、Ａβ（配列番号：２１）の残基１６−２３及びＣ末端システイン残基を含むペプチド免疫原であって、Ｃ末端システイン残基を介して誘導体化リシン残基にペプチド免疫原が共有結合されており、
    Ｒは、ＣＲＭ ₁₉₇ の誘導体化リシン残基に共有結合されＮ−アセチルシステアミノ基を含むキャッピング分子であり、それにより担体を用いない別の方法では生じないペプチド免疫原に対する所望の免疫応答を誘発する能力を保持するように担体タンパク質の官能性が保たれており、
    ｎは０より大きく３８以下の整数であり、および
    ｐは０より大きく３８以下の整数である、
    免疫原性結合物。
24. ｎが５以上であり２５以下の整数である、請求項２３に記載の免疫原性結合物。
25. ｎが１２以上であり１５以下の整数である、請求項２４に記載の免疫原性結合物。
26. 前記ペプチド免疫原がＫＬＶＦＦＡＥＤ−Ｃ（配列番号：４５）である、請求項２５に記載の免疫原性結合物。
27. １種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤および／若しくはアジュバントと一緒に、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の免疫原性結合物を含んでなる、免疫原性組成物。
28. １種若しくはそれ以上のアジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、細菌リポ多糖、リン酸アミノアルキルグルコサミン化合物、ＭＰＬ^TM（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ^TM ＱＳ−２１、百日咳トキシン（ＰＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキシン（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βよりなる群から選択される、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
29. 担体タンパク質が該担体タンパク質に共有結合されたペプチドリンカーをさらに含み、かつ、官能基が該ペプチドリンカーの置換基を含む請求項１に記載の免疫原性結合物。