MXPA06006821A - Conjugados de peptido inmunologenico a??-vehiculo y metodo para su produccion. - Google Patents

Conjugados de peptido inmunologenico a??-vehiculo y metodo para su produccion.

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Abstract

La presente invencion se dirige a metodos para producir conjugados de inmunogenos de peptido A?? con moleculas de vehiculo de proteina/polipeptido, que son utiles como inmunogenos, en donde los inmunogenos de peptido se conjugan a vehiculos de proteina a traves de grupos funcionales activados en residuos de aminoacido del vehiculo o de la molecula enlazadora opcionalmente unida y en donde cualquier grupo funcional reactivo no conjugado en residuos de aminoacido se inactiva a a traves de una tapa, reteniendo asi la funcionalidad inmunologica de la molecula vehiculo, pero reduciendo la propension a reacciones no deseables que puedan hacer al conjugado menos seguro o efectivo. Ademas, la invencion se refiere tambien a tales productos inmunogenicas y composiciones inmunogenicas que contienen tales productos inmunogenicos elaborados mediante tales metodos.

Description

WO 2005/058941 A2 i Bill ÜM Bl 11 l?Híi lílíl llltl illll I1H Hl 111 lllll iilll íllü 18Í1? lllll illí Billfl lili 11H lili Published: For two-letter codes and other abbreviations, referto the "Guid- — without intemational search report and lo be republished anee Notes on Codes andAbbreviations" appearing at the begin- upon receipt ofthal report ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazette.
Patent provided by Sughrue Mion, PU.C - http:/www.sughrue.com CONJUGADOS DE PEPTIDO IN TJNOGENICO AjS-VEHICÜLO Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo U.S.C. 35 119 (e) de la Solicitud Provisional de Patente Serie No. 60/530,481, presentada en Diciembre 17 de 2003 que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad para todo propósito . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La esencia de la inmunidad de adaptación es la capacidad de un organismo para reaccionar a la presencia de sustancias externas y para producir componentes (anticuerpos y células) capaces de interactuar específicamente con, y proteger al huésped de su invasión. Un "antígeno" o "inmunógeno" es una sustancia capaz de producir este tipo de respuesta inmune y también capaz de interactuar con las células y anticuerpos sensibilizados que se elaboran contra el mismo. Los antígenos o inmunógenos son comúnmente macromoléculas que contienen distintos sitios antigénicos o "epítopes" que se reconocen e interactúan con los diversos componentes del sistema inmune. Éstos pueden existir como moléculas individuales compuestas de químicos sintéticos orgánicos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, ARN, ADN, o polisacáridos, o pueden ser parte de estructuras celulares (bacterias u hongos) o virus (Harlow y Lañe 1988 a, b, c; Male et al., 1987). Las moléculas pequeñas como los péptidos cortos, aunque normalmente son capaces de interactuar con los productos de una respuesta inmune, frecuentemente no pueden ocasionar una respuesta por sí mismas. Estos inmunógenos péptido o "haptenos" como también se denominan, son realmente antígenos incompletos, y, aunque no son capaces por sí mismos de ocasionar inmunogenicidad o de producir producción de anticuerpos, pueden hacerse inmunogénicos acoplándolos en un vehículo adecuado. Los vehículos son típicamente antígenos de proteína de peso molecular más alto que son capaces de ocasionar una respuesta inmunogénica al administrarse in vivo. En una respuesta inmune, los anticuerpos se producen y se secretan por los linfocitos B en conjunción con las células auxiliares T (TH) . En la mayoría de los sistemas de hapteno-vehículo, las células B producen anticuerpos específicos tanto para el hapteno como para el vehículo . En estos casos, los linfocitos T tendrán dominios de enlace específicos en el vehículo, pero no reconocerán al hapteno solo. En un tipo de sinergismo, las células B y T cooperan para inducir una respuesta del anticuerpo específica al hapteno. Después de presentarse tal respuesta inmune, si el huésped se prueba subsecuentemente solo con el hapteno, comúnmente responderá produciendo anticuerpos específicos al hapteno de células de memoria formadas después de la inmunización inicial. Los haptenos sintéticos que imitan algunas estructuras epitópicas críticas en macromolécul s más grandes, frecuentemente se encuentran conjugados a vehículos para crear una respuesta inmune a la molécula "original" más grande. Por ejemplo, los segmentos de péptido corto pueden sintetizarse de la secuencia conocida de una proteína y acoplarse a un vehículo para inducir inmunogenicidad hacia la proteína de origen. Este tipo de procedimiento sintético para la producción de inmunógenos se ha convertido en la base de gran parte de la investigación actual en la creación de vacunas. Sin embargo, en muchas instancias, la sola creación de una respuesta de la célula B utilizando conjugados de péptido sintético-vehículo, aunque bien diseñada, no siempre garantizará una inmunidad protectora completa hacia un antígeno intacto. La respuesta inmune generada por un epítope de péptido corto a partir de una célula más grande de partícula viral o bacterial, puede ser suficiente solo para generar memoria al nivel de la célula B. En estos casos, actualmente se acepta en general que una respuesta citotóxica de célula T es un indicador más importante de la inmunidad protectora. El diseño de inmunógenos de péptido con los sitios de enlace epitópico apropiados para el reconocimiento tanto de la célula B como de la célula T, es actualmente una de las áreas de investigación de mayor reto en la inmunología . El procedimiento para incrementar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas o de baja inmunogenicidad conjugando estas moléculas a moléculas "vehículo" más grandes se ha utilizado exitosamente durante décadas (ver, e.g., Goebel et al., (1939), J. Exp. Med. 69:53). Por ejemplo, se han descrito muchas composiciones inmunogénicas en las cuales se han conjugado polímeros capsulares purificados a proteínas vehículo para crear composiciones inmunogénicas más efectivas explotando este "efecto de vehículo". Schneerson et al., (1984) Infect . Immun. 45:582-591). La conjugación también ha mostrado desviar la baja respuesta del anticuerpo comúnmente observada en infantes al inmunizarse con un polisacárido libre (Anderson et al., (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al., (1986) J. Exp. Med. 158:294. Se han generado con éxito conjugados de hapteno-vehículo utilizando diversos reactivos de reticulación/acoplamiento tales como reticuladores homobifuncionales, heterobifuncionales o de longitud cero. Muchos de tales métodos se encuentran actualmente disponibles para el acoplamiento de sacáridos, proteínas y péptidos a vehículos de péptido. La mayoría de los métodos crean enlaces amina, amida, isotiourea o disulfuro o en algunos casos tioéteres. Una desventaja en el uso de reactivos de acoplamiento, que introducen sitios reactivos a las cadenas laterales de moléculas reactivas de aminoácido en moléculas vehículo y/o hapteno, es que los sitios reactivos si no se neutralizan se encuentran libres para reaccionar con cualquier molécula no deseada ya sea in vitro (afectando por tanto adversamente la funcionalidad o estabilidad de el (los) conjugado (s) ) o in vivo (estableciendo por tanto un riesgo potencial de sucesos adversos en personas o animales inmunizados con las preparaciones) . Tales sitios reactivos excesivos pueden reactivarse o "taparse" , a fin de inactivar estos sitios, utilizando diversas reacciones químicas conocidas, pero estas reacciones de otra manera pueden romper la funcionalidad de los conjugados. Esto puede ser particularmente problemático cuando se pretende crear un conjugado introduciendo los sitios reactivos en la molécula vehículo, dado que su mayor tamaño y más compleja estructura (en relación al hapteno) puede hacerla más vulnerable a los efectos de rompimiento del tratamiento químico. En realidad, no se conocen ejemplos de métodos en los cuales se prepare un conjugado activando primero el vehículo, después reactivando con el hapteno en una reacción de conjugación, y finalmente "tapando" los sitios reactivos restantes, mientras se preserva la capacidad del conjugado resultante para funcionar - co o una composición inmunogénica que tenga las propiedades deseadas del "efecto de vehículo" . BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para producir un conjugado inmunogénico de un péptido inmunógeno que comprende el péptido A/3 o fragmentos de Aß o análogos de los mismos con un vehículo de proteína/polipéptido, en donde el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos de los mismos se conjugan al vehículo a través de grupos funcionales derivados de residuos aminoácido del vehículo tales como residuos lisina, y en donde cualquier grupo funcional no conjugado, derivado de los residuos aminoácido se inactiva tapando para bloquearlo de la reacción con otras moléculas, incluyendo proteínas/polipéptidos preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga la capacidad de producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo. Además, la invención se refiere también a conjugados producidos mediante los métodos anteriores, y a composiciones inmunogénicas que contienen tales conjugados. En una modalidad, la invención se dirige a un primer método para conjugar un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos de los mismos mediante un grupo reactivo de un residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido a un vehículo de - proteína/polipéptido que tiene uno o más grupos funcionales, comprendiendo el método las etapas de: (a) derivar uno o más de los grupos funcionales del vehículo de proteína/polipéptido para generar una molécula derivada con sitios reactivos; (b) hacer reaccionar el vehículo proteína/polipéptido derivado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido bajo condiciones de reacción tales que el inmunógeno de péptido se conjuga al vehículo proteína/polipéptido derivado mediante los grupos funcionales; y (c) hacer reaccionar adicionalmente el conjugado con un reactivo de tapa para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el vehículo de proteína/polipéptido activado, preservando así la funcionalidad del vehículo de manera que retenga sus capacidades para producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo. En una modalidad, el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, hemaglutinina de influenza, péptido de enlace PAN-DR (polipéptido PADRE) , proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg?9-28, Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Bacilo Calmette-Guerin (BCG), toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRM?97 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes 0RF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas. En otra modalidad, el vehículo de proteína/polipéptido contiene un epítope de célula T. Aún en otra modalidad, el vehículo de proteína/polipéptido es un toxoide bacterial tal como un toxoide de tétanos, toxina de cólera o mutante de toxina de cólera como se describió anteriormente . En una modalidad preferida, el vehículo de proteína/polipéptido es CRM?97. Aún en otra modalidad, el vehículo de proteína/polipéptido puede ser una hemaglutinina de influenza, un polipéptido PADRE, una proteína de malaria CS, un antígeno de superficie de hepatitis B (HSBAg?9_28) / una proteína de choque térmico 65 (HSP 65) . O un polipéptido de Mycobacterium tuberculosis (BCG) . En una modalidad preferida, el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona de peptidasa de estreptococo rC5a, Streptococcus pyogenes 0RF1224, Streptococcus pyogenes 0RF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858. En una modalidad, el vehículo de proteína/polipéptido es un factor de crecimiento u hormona que estimula o aumenta la respuesta inmune y se selecciona del grupo que consiste de IL-1, IL-2, ?-interferon, IL-10, GM-CSF, MIP-lcü, MIP-1/3, y RANTES. En un aspecto, la invención proporciona un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos de los mismos que produce una respuesta inmunogénica contra ciertos epítopes dentro de Aß . Los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen péptidos inmunogénícos heterólogos. En algunos péptidos inmunogénicos, un fragmento Aß se encuentra enlazado a un vehículo para formar un péptido inmunogénico heterólogo, y después este péptido heterólogo se enlaza a un vehículo utilizando un método de la presente invención para formar un conjugado . En otro aspecto de la invención, el inmunógeno de péptido es un polipéptido que comprende un segmento de terminación N de al menos los residuos 1.5 de A/3, siendo el - primer residuo de Aß el residuo de terminación N del polipéptido, en donde el polipéptido se encuentra libre de un segmento de terminación C de A/3. Aún en otro aspecto de la invención el inmunógeno de péptido es un polipéptido que comprende un segmento de terminación N de Aß, comenzando el segmento en el residuo 1-3 de A/3 y finalizando en los residuos 7-11 de Aß . En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un agente que induce una respuesta inmunogénica contra un segmento de terminación N de A?, comenzando el segmento en el residuo 1-3 de A/3 y finalizando en los residuos 7-11 de Aß sin inducir una respuesta inmunogénica contra un epítope dentro de los residuos 12-43 de A/343. En otro aspecto de la invención, el inmunógeno de péptido es un polipéptido heterólogo que comprende un segmento de A/3 enlazado a una secuencia heteróloga de aminoácidos que induce una respuesta de la célula auxiliar T contra la secuencia heteróloga de aminoácidos y por tanto una respuesta de la célula B contra el segmento de terminación N. En algunos inmunógenos de péptido, el segmento de terminación N de A/3 se encuentra enlazado en su terminación C a un polipéptido heterólogo. En algunos inmunógenos de péptido, el segmento de terminación N de A/3 se encuentra enlazado en su terminación N a un polipéptido heterólogo. En algunos inmunógenos de péptido, el segmento de terminación N de Aß se encuentra enlazado en sus terminaciones N y C a los - primero y segundo polipéptidos heterólogos. En algunos inmunógenos de péptido, el segmento de terminación N de A/3 se encuentra enlazado en su terminación N a un polipéptido heterólogo, y en su terminación C a al menos una copia adicional del segmento de terminación N. En algunos inmunógenos de péptido, el polipéptido comprende de la terminación N a la terminación C, el segmento de terminación N de Aß, una pluralidad de copias adicionales del segmento de terminación N, y el segmento heterólogo de aminoácido. En algunos de los inmunógenos de péptido anteriores, el polipéptido comprende además al menos una copia adicional del segmento de terminación N. En algunos de los inmunógenos de péptido anteriores, el fragmento se encuentra libre de al menos los 5 aminoácidos de terminación C en A/343. En algunos aspectos de los inmunógenos de péptido anteriores, el fragmento comprende hasta 10 aminoácidos contiguos de Aß . En otro aspecto, la invención proporciona un inmunógeno de péptido que comprende el péptido A/3 o fragmentos de A/3 o sus análogos que emiten una respuesta inmunogénica contra ciertos epítopes dentro de A/3 que puede encontrarse en una configuración referida como configuración múltiple de péptido antigénico (MAP) . En algunos de los aspectos anteriores de la - invención, el inmunógeno de péptido es la mitad de terminación N de A/3. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento de Aß seleccionado del grupo que consiste de A/3 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3.6, y 3-7. En alguno de los aspectos anteriores de la invención, el inmunógeno de péptido es de la región interna de A/3. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de Aß 13-28, 15-24, 17-28 y 25-35. En alguno de los aspectos anteriores de la invención, el inmunógeno de péptido es el extremo de terminación C de A/3. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de A/3 33-42, 35-40 y 35-42. En alguno de los aspectos de la invención, el inmunógeno de péptído es un fragmento de Aß seleccionado del grupo que consiste de A/3 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40, y 35-42. En alguno de los aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de A/3 1-5, Aß 1-7, Aß 1-9, y A/3 1-12. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de A/3 1-5L, Aß 1-7L, Aß 1-9L, y Aß 1-12L en donde L es un enlazador. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un - fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de Aß 1-5L-C, AjS 1-7L-C, Aß 1-9L-C, y A/3 1-12L-C en donde C es un residuo cisteína de aminoácido. En algunos aspectos de la invención el inmunógeno de péptido es un fragmento de A/3 seleccionado del grupo que consiste de A/3 16-22, Aß 16-23, Aß 17-23, Aßl7-24, Aßl8-24 y A/3 18-25. En algunos aspectos de la invención el inmunógeno de péptido es un fragmento de Aß seleccionado del grupo que consiste de Aß 16-22C, A/3 16-23C, A/3 17-23C, Aßl7-24C, Aßl8-24C y Aß 18-25C en donde C es un residuo cisteína de aminoácido. En otros aspectos de la invención el inmunógeno de péptido es un fragmento de Aß seleccionado del grupo que consiste de C-A3 16-22, C-Aß 16-23, C-Aß 17-23, C-A/317-24, C-A/318-24 y C-Aß 18-25 en donde C es un residuo cisteína de aminoácido. En algunos de los inmunógenos de péptido anteriores, el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste de péptidos que tienen un epítope de célula T, un epítope de célula B y sus combinaciones . En una modalidad, el grupo funcional de una o más moléculas de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido o del enlazador de polipéptido opcionalmente unido se deriva utilizando un reactivo de reticulación. En otra modalidad, el reactivo de derivatización es un reactivo de reticulación de longitud cero. En otra modalidad, el reactivo de derivatización es un reactivo de reticulación homobifuncional . Aún en otra modalidad, el reactivo de derivatización es un reactivo de reticulación heterobifuncional . En una modalidad preferida, el reactivo heterobifuncional es un reactivo que reacciona con un grupo funcional primario o e-amina de una o más moléculas de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido y un grupo tiol pendiente de una o más moléculas de aminoácido del inmunógeno de péptido. En una modalidad, el reactivo heterobifuncional es N-succinimidil bromoacetato. En otra modalidad, el grupo funcional primario o e-amina es lisina. Aún en otra modalidad, la derivatización del grupo funcional primario o e-amina de la lisina del vehículo de proteína/polipéptido con N-succinimidil bromoacetato da como resultado los residuos primario o e-amina en moléculas de lisina en el vehículo de proteína/polipéptido. En una modalidad más preferida, el grupo tiol pendiente es un residuo cisteína del inmunógeno de péptido, que puede localizarse en la terminación amino del inmunógeno de péptido, en la terminación carboxi del inmunógeno de péptido o internamente en el inmunógeno de péptido. En otra modalidad, el grupo tiol pendiente se genera por un reactivo de tiolación tal como N-acetil homocisteinatio lactona, reactivo de Traut (2-iminotilano) SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato) , SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-metil-2-piridilditio tolueno) , sulfo LC SPDP (Sulfo succinimidil piridil ditio propionamido hexanoato) , SPDP (Succinimidil piridil ditio propionato) . En una modalidad preferida, el reactivo de tapa que se utiliza para inactivar los grupos funcionales reactivos libres del vehículo activado de proteína/polipéptido se selecciona del grupo de reactivos que consiste de cisteamina, N-acetilcisteamina, y etanolamina. En una modalidad particularmente preferida, el reactivo de tapa que se utiliza para inactivar los grupos funcionales reactivos libres del vehículo activado de proteína/polipéptido se selecciona del grupo de reactivos que consiste de hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de amonio y amoniaco . En una modalidad, el grupo reactivo del residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido es un grupo sulfhidrilo libre. En otra modalidad, uno o más de los grupos funcionales se encuentra en un enlazador, que se une opcionalmente al vehículo de proteína/polipéptido. En una modalidad preferida, el enlazador es un enlazador de péptido. En una modalidad más preferida, el enlazador de péptido es polilisina.
En otra modalidad, la invención se dirige a un segundo método para conjugar un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de A/3 o sus análogos con un vehículo de proteína/polipéptido que tiene la estructura: en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y X es un grupo funcional derivable de un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde m es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, comprendiendo el método las etapas de : (a) derivar uno o más de los grupos funcionales del vehículo de proteína/polipéptido o de la molécula enlazadora unida opcionalmente para generar una molécula derivada con sitios reactivos; (b) hacer reaccionar el vehículo proteína/polipéptido derivado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido para formar un conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido; y (c) hacer reaccionar adicionalmente dicho conjugado con un reactivo de tapa para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el vehículo de proteína/polipéptido activado, de manera que los grupos funcionales no son libres de reaccionar con otras moléculas, incluyendo proteínas/polipéptidos preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga su capacidad para producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo a fin de generar un conjugado tapado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido que tiene la fórmula: en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde, P es la molécula de inmunógeno de péptido covalentemente unida al grupo funcional derivado en el residuo de aminoácido en el vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado en un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85. Las modalidades detalladas para el primer método antes descrito también son aplicables a los conjugados recientemente descritos preparados mediante el segundo método . En una modalidad, la invención se dirige a un inmunógeno de péptido que comprende conjugados de inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o sus análogos/polipéptido vehículo en donde el vehículo de proteína/polipéptido tiene la fórmula: en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y X es un - - grupo funcional derivable de un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde m es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y en donde el conjugado tapado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido tiene la fórmula: ( en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, en donde, P es la molécula de inmunógeno de péptido covalentemente unida al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga la capacidad de producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85. Las modalidades detalladas para el primero y segundo métodos antes descritos también son aplicables a los conjugados recientemente descritos. En otra modalidad, la invención se dirige, a un inmunógeno de péptido que comprende conjugados de inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o sus análogos/polipéptido vehículo generados de acuerdo con el segundo método de la invención y que tienen la fórmula: ( en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, en donde, P es la molécula de inmunógeno de péptido covalentemente unida al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga la capacidad de producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85. Las modalidades detalladas para el segundo método antes descrito también son aplicables a los conjugados generados por el segundo método, como recién se describió. En otra modalidad, la invención se dirige a composiciones inmunogénicas que comprenden un conjugado de un inmunógeno de péptido con un vehículo de proteína/polipéptido generado mediante el segundo método de la invención, conjuntamente con uno o más excipientes, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las modalidades detalladas para el segundo método y para los conjugados generados por el mismo antes descrito también son aplicables a composiciones inmunogénicas que contienen esos conjugados, como recién se describió. En otra modalidad, la invención se dirige a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición inmunogénica de la presente invención al suj eto . Las modalidades detalladas aplicables a la composición inmunogénica que contiene los conjugados de la presente invención también son aplicables a la modalidad de la invención dirigida al método de uso de estas composiciones inmunogénicas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Esquema de flujo que ilustra la química del proceso utilizada para la conjugación de fragmentos de péptido Aß a vehículo de proteína/polipéptido CRM?97 para formar el conjugado Aß/CRM197. Figura 2: Esquema de flujo que ilustra la química de hidrólisis utilizada para la determinación cuantitativa de S-carboximetilcisteína y S-carboximetilcisteamina como una evaluación del grado de conjugación de los conjugados de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido tales como el conjugado Aß/CRM?97. Figura 3 : Esta figura ilustra la dependencia al pH de la reacción de conjugación del péptido Aß/CRM. Figura 4 : Esta figura ilustra la dependencia de la conjugación del péptido Aß/CRM al péptido: relación de CRM. Figura 5 : Verificación del proceso de tapa para la conjugación de A/3-7/CRM. El pH de la reacción fue de 9.15. El tiempo de reacción con el péptido fue de 16 horas, el tapa con N-acetilcisteamina fue de 8 horas. Figura 6: Conjugación y tapa con diversos péptidos: relaciones de CRM con el péptido. El pH de la reacción fue de 9.0. El tiempo de reacción con el péptido fue de 16 horas, el tapa con N-acetilcisteamina e de 8 horas. Figura 7: Titulaciones del día 36 del suero de primate después de la inmunización de primates con conjugados de péptido A/3 con diversos adyuvantes . Figura 8 : Titulaciones del día 64 del suero de primate después de la inmunización de primates con conjugados de péptido Aß con diversos adyuvantes . Figura 9 : Titulaciones de primates por día y grupo de tratamiento. Se inmunizaron primates con conjugados de Aß 1-7 o Aß 1-5 CRM?97 con alum o RC529 como adyuvantes y se midieron titulaciones de anticuerpos anti A/3 en el día 29, 36, 57 y 54. Figura 10: Se caracterizaron conjugados de péptido-proteína utilizando inmunoanálisis Western SDS-PAGE con un gel premoldeado de tris-tricina. Las rutas son: marcador (ruta 1) ; L-28375 24/01 (ruta 2) ; L-28375 24/02 (ruta 3) ; L-28375 24/03 (ruta 4) ; L-28375 24/04 (ruta 5) ; L- 28375 24/05 (ruta 6) ; L-28375 24/06 (ruta 7) ; L-28375 24/07 (ruta 8) ; L-28375 24/08 (ruta 9) ; L-28375 24/09 (Mock) (ruta 10) ; y, BrAcCRM197 (ruta 11) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para generar conjugados de inmunógeno de péptido-vehículo en donde los grupos funcionales activos sin reaccionar en el vehículo que se generan durante la activación se desactivan utilizando reactivos de tapa tales como N-acetilcisteamina a fin de evitar que se reactiven adicionalmente. la presente invención se dirige también a conjugados tapados de vehículo-inmunógeno de péptido generados por esos métodos y a composición inmunogénicas que comprenden dichos conjugados. El procedimiento para incrementar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas o de baja inmunogenicidad, tales como sacáridos, a través de la conjugación, se ha utilizado con éxito durante décadas (ver, e.g., Goebel et al., (1939) J. Exp. Med. 69:53), y muchas composiciones inmunogénicas se han descrito en las cuales los polímeros capsulares purificados se han conjugado a proteínas vehículo para crear composiciones inmunogénicas más efectivas explotando este "efecto de vehículo". Por ejemplo, Schneerson et al., (J. Exp. Med. 152:361-376, 1980), describe conjugados de Haemophilus inflenzae b polisacárido proteína que confieren inmunidad a enfermedades ocasionados por ese microorganismo. Los conjugados de PRP (poliribosilribitol fosfato, un polímero capsular de H. influenzae b) han mostrado ser más efectivos que "• las composiciones inmunogénicas en base al polisacárido solo (Chu et al., (1983) Infect. Immun. 40:245; Schneerson et al., (1984), Infect . Immun. 45:582-591). También la conjugación ha mostrado desviar la baja respuesta del anticuerpo comúnmente observada en infantes al inmunizarse con un polisacárido libre (Anderson et al., (1985) J. Pediatr. 107:346; Insel et al., (1986) J. Exp. Med. 158:294). Una ventaja adicional del uso como vehículo de proteína de una toxina bacterial o toxoide contra el cual la inmunización de rutina de humanos (e.g., tétanos o difteria) es una práctica estándar, es que se induce una inmunidad deseada a la toxina o toxoide conjuntamente con inmunidad contra los patógenos asociados con el polímero capsular. También se utilizan los conjugados antigénicos de determinante/hapteno-vehículo para producir anticuerpos monoclonales altamente específicos que reconocen epítopes químicos discretos en el hapteno acoplado. Los monoclonales resultantes se utilizan frecuentemente para investigar la estructura epitópica entre proteínas nativas . En muchos casos, los determinantes/haptenos antigénicos utilizados para generar estos monoclonales son segmentos de péptido pequeño que representan sitios antigénicos cruciales en la superficie de proteínas más grandes. Los criterios para utilizar un vehículo exitoso en la generación de un conjugado antigénico de determinante/hapteno-vehículo son el potencial para la inmunogenicidad, la presencia de grupos funcionales adecuados para la conjugación con un determinante/hapteno antigénico, las propiedades de solubilidad razonables incluso después de - - la derivatización y la carencia de toxicidad in vivo. Estos criterios se cumplen por los conjugados generados mediante los métodos de la presente invención. Los conjugados pueden ser cualquier conjugado estable de inmunógeno de péptido-vehículo generado utilizando el proceso de conjugación descrito en la presente. Los conjugados se generan utilizando un proceso de la presente invención en donde un vehículo de proteína/polipéptido que tiene la siguiente estructura: se encuentra unido covalentemente a un vehículo de proteína/polipéptido, en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y X es un grupo funcional derivable de un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde m es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, se encuentra covalentemente unido a un inmunógeno de péptido y en donde el conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido que tiene la siguiente fórmula, se representa por la siguiente fórmula: ( en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, P es un inmunógeno de péptido covalentemente unido al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga la capacidad de producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85. Selección de vehículos Algunos inmunógenos de péptido contienen el epítope apropiado para inducir una respuesta inmune, pero son demasiado pequeños para ser inmunogénicos . En esta situación, los inmunógenos de péptido se encuentran enlazados a un vehículo adecuado para ayudar a producir una respuesta inmune. En la representación esquemática anterior del conjugado de inmunógenos de péptido-vehículo generados mediante un proceso de la presente invención, C es un vehículo de proteína/polipéptido al cual los inmunógenos de péptido se conjugan directamente a través de grupos funcionales derivados en residuos aminoácido en el vehículo por sí mismos o indirectamente a través de grupos funcionales derivados en enlazadores de péptido covalentemente unidos a los vehículos. Los vehículos de proteína/polipéptido adecuados incluyen, pero no se limitan a, albúmina (incluyendo albúmina de suero humano) , hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, MSCRAMMS, toxoide de tétanos, o un toxoide de otras bacterias patógenas que tiene toxicidad reducida, incluyendo mutantes, tales como difteria, E. coli cólera, o H. pylori, o un derivados de toxina atenuados. Un vehículo tal es la proteína CRMX97 (SEQ ID NO:' 40) que es de reacción cruzada con la toxina de difteria.
Otros vehículos incluyen epítopes de célula T que se enlazan a múltiples alelos MHC, e.g., al menos 75% de todos los alelos MHC humanos . Tales vehículos se conocen algunas veces en la técnica como "epítopes universales de célula T" . Los vehículos ejemplares con epítopes universales de célula T incluyen: Hemaglutinina de influenza: HA307-3?9 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO. 11) Péptido PAN-DR (péptido PADRE AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO. 12) CS malaria: epítope T3 EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO. 13) Antígeno de superficie de hepatitis B: FELLTRILTI HBsAg?9_28 (SEQ ID NO. 14) Proteína de choque térmico 65 : QSIGDLIAEAMDKVGNEG Hsp65?53_?-7i (SEQ ID NO. 15) Bacilo Calmette-Guerin (BCG) QVHFQPLPPAWKL (SEQ ID NO. 16) Toxoide de tétanos : TT83o-8 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO. 17) Toxoide de tétanos : TT947-967 NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO. 18) VIH glpl20 TI KQIINMWQEVGKAMY (SEQ ID NO. 19) CRM 197 Ver Breve Descripción de las Secuencias (SEQ ID NO. 40) Fragmento de albúmina ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO. 41) Otros vehículos para estimular o aumentar una respuesta inmune y a los cuales puede conjugarse un inmunógeno de péptido o un hapteno incluyen citocinas tales como IL-1, IL-la y péptidos ß, IL-2, INF, IL-10, GM-CSF, y quimiocinas, tales como MIP Ice y ß y RANTES. Los péptidos inmunogénicos también pueden enlazarse a vehículos de proteínas/péptido que aumentan el transporte a través de tejidos, como se describe en O'Mahony, WO 97/17163 y WO 97/17614, que se incorpora en la presente mediante referencia en su totalidad para todo propósito. Vehículos adicionales incluyen peptidasa de estreptococo C5a, Streptococcus pyogenes ORF1224, 1664, y 2452, Chlamydia pneumoniae ORFs T367 y T 858, pneumolisina de Streptococcus pneumonía, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, factores de crecimiento y hormonas. En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína vehículo es CRM197, un mutante no tóxico de la toxina de difteria con un cambio aminoácido en su secuencia primaria. La glicina presente en la posición de aminoácido 52 de la molécula se reemplaza con un ácido glutámico debido a un solo cambio de codón de ácido nucleico.
Debido a este cambio, la proteína carece de actividad de ADP-ribosil transferasa y se convierte en.no tóxica. Tiene un peso molecular de 58,408 Da. El CRM?97 se produce en grandes cantidades mediante expresión recombinante de acuerdo con la Patente de E.U. No. 5,614,382, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Las conjugaciones de sacáridos así como de péptidos a CRM?97 se llevan a cabo enlazando a través de grupos e-amino de residuos lisina. Se ha establecido a través de diversos productos comerciales que CRM197 es un vehículo excelente y seguro para epítopes de célula B. Péptidos Inmunogénicos Como se utiliza en la presente, el término "péptido inmunógeno" o "hapteno" es cualguier proteína o estructura de subunidad/fragmento/análogo derivado del mismo que puede emitir, facilitar o inducirse para producir una respuesta inmune al administrarse a un mamífero. En particular, el término se utiliza para referirse a un polipéptido antigénico determinante de cualquier fuente (bacteria, virus o eucarioto) , que pueda acoplarse a un vehículo utilizando un método descrito en la presente . Tales determinantes de inmunógeno de polipéptido/antagónico pueden ser de origen celular viral, bacterial o eucariótico. Los inmunógenos de péptido pueden conjugarse a un vehículo para su uso como un inmunoterapéutico en la prevención, tratamiento, profilaxis o mejora de diversas enfermedades humanas . Tales inmunógenos de péptido incluyen aquellos derivados de un péptido Aß de 39-43 aminoácidos, preferentemente 42 aminoácidos, que es el componente principal de placas características de la enfermedad de Alzheimer (AD) (ver U.S. 4,666,829; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131, Hardy (1984) TINS 20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), aquellos derivados de péptidos amiloide de amilin, un material polipéptido producido por células isleta pancreáticas que se ha implicado en diabetes tipo II, péptidos derivados de productos de gen de lipoproteína de baja densidad, que se han implicado en arteroesclerosis y péptidos antigénicos derivados de citocinas inflamatorias y factores de crecimiento tales como interleucina 6 (IL-6) , factor a de necrosis de tumor (TNFce) y GDF-8. Tales inmunógenos de péptido eucarióticos pueden incluir ya sea célula T (CTL) o epítope de célula B, también conocido como proteína ß amiloide, o péptido A4. El Aß también conocido como péptido ß amiloide, o péptido A4 (ver U.S. 4,666,829; Glenner & Wong Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131, (1984)) es un péptido de 39-43 aminoácidos, que es el componente principal de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. El Aß es generado mediante el procesamiento de una proteína APP más grande por dos enzimas, llamadas secretasas ß y y (ver, Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Las mutaciones conocidas en APP asociada con la enfermedad de Alzheimer se presentan próximas al sitio de secretada ß o 7, o dentro de Aß. Por ejemplo, la posición 717 se encuentra próxima al sitio de separación de 7-secretasa de APP en su procesamiento a Aß, y las posiciones 670/671 se encuentran próximas al sitio de separación de ß-secretasa. Se cree que las mutaciones ocasionan AD interactuando con las reacciones de división mediante las cuales se forma el Aß a fin de incrementar la cantidad de la forma de aminoácido 42/43 del Aß generado. El Aß tiene la inusual propiedad de que puede arreglar y activar cascadas de complemento tanto clásicas como alternas. En particular, se enlaza a Clq y finalmente a C3bi. Esta asociación facilita el enlace a macrófagos conduciendo a la activación de células B. Además, el C3bi se rompe posteriormente y después se enlaza a CR2 en células B de manera dependiente de la célula T conduciendo a un incremento de 10,000 veces en la activación de estas células. Este mecanismo ocasiona que el A/3 genere una respuesta inmune en exceso a la de otros antígenos. El Aß tiene diversas formas de origen natural . Las formas humanas de Aß se refieren como Aß39, Aß40, Aß41, A/342 y Aß43. Las secuencias de estos péptidos y su relación con el precursor de APP se ilustran por la Figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, el A/342 tiene la secuencia: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu- Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp- Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met- Val-Gly-Gly-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO. 21) . A/341, A/340 y A/339 difieren de Aß42 por la omisión de Ala-Ala-Ile, y Ala-Ile-Val respectivamente, del extremo de terminación C. Aß43 difiere de A/342 por la presencia de un residuo treonina en la terminación C. Los inmunógenos de péptido que son fragmentos de Aß son ventajosos en relación con la molécula intacta para uso en los presentes métodos por diversas razones. Primero, debido a que solo ciertos epítopes dentro de Aß inducen una respuesta inmunogénica útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, una dosis igual de masa de un fragmento que contiene tales epítopes proporciona una mayor concentración molar de los epítopes inmunogénicos útiles que una dosis de Aß intacto. Segundo, ciertos inmunógenos de péptido de A/3 generan una respuesta inmunogénica contra depósitos amiloide sin generar una respuesta inmunogénica significativa contra la proteína APP de la cual se deriva el Aß. tercero, los inmunógenos de péptido de Aß son más simples de fabricar que el A/3 intacto, debido a su menor tamaño. Cuarto, los inmunógenos de péptido de A/3 no se agregan de la misma manera que el Aß intacto, simplificando la preparación de conjugados con vehículos. Algunos inmunógenos de péptido de Aß tienen una secuencia de al menos 2, 3, 5, 6, 10 o 20 aminoácidos contiguos de un péptido natural . Algunos inmunógenos de péptido no tienen más de 10, 9, 8, 7, 5 o 3 residuos contiguos de Aß. En una modalidad preferida, los inmunógenos de péptido de la mitad de terminación N de Aß se utilizan para preparar conjugados. Los inmunógenos de péptido preferidos incluyen Aß 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 y 1-4. La designación de Aß 1-5, por ejemplo, indica un fragmento de terminación N que incluye residuos 1-5 de Aß. Se prefieren los fragmentos de Aß que comienzan en la terminación N y finalizan en un residuo dentro de los residuos 7-11 de Aß. el fragmento Aß 1-12 puede utilizarse también pero es menos preferido. En algunos métodos, el fragmento es un fragmento de terminación N diferente de Aß 1-10. Otros fragmentos preferidos incluyen Aß 13-28, 15-24, 25-35, 35-40, 35-42 y otros fragmentos internos y fragmentos de terminación C . Algunos péptidos Aß de la invención son péptidos inmunogénicos que al administrarse a un paciente humano o animal, generan anticuerpos que se enlazan específicamente a uno o más epítopes entre los residuos 16 y 25 de Aß. Los fragmentos preferidos incluyen Aß 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, y 18-25. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a epítopes entre los residuos 16 y 25 se enlazan a Aß solubles sin enlazarse a placas de A/3. Estos tipos de anticuerpo pueden enlazarse específicamente a Aß soluble en la circulación de un paciente o modelo animal sin enlazarse específicamente a placas de depósitos Aß en el cerebro del paciente o modelo. El enlace específico de anticuerpos a Aß soluble inhibe el Aß de incorporarse en placas inhibiendo de este modo el desarrollo de las placas en un paciente o inhibiendo un incremento adicional en el tamaño o frecuencia de las placas si tales placas ya se han desarrollado antes de administrar el tratamiento. Preferentemente, el fragmento de Aß administrado carece de un epítope que generaría una respuesta de la célula T al fragmento. Generalmente, los epítopes de célula T son más grandes que los 10 aminoácidos contiguos. En consecuencia, los fragmentos de Aß preferidos son del tamaño de 5-10 o preferentemente de 7-10 aminoácidos contiguos o de mayor preferencia 7 aminoácidos contiguos, i.e., de una longitud suficiente para generar una respuesta del anticuerpo sin generar una respuesta de la célula T. Se prefiere la ausencia de epítopes de célula T debido a que estos epítopes no son necesarios para la actividad inmunogénica de fragmentos, y pueden ocasionar una respuesta inflamatoria no deseada en un subconjunto de pacientes (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Sénior (2002) Lancet Neurol . 1,3). Se prefiere el fragmento Aß 15-25 y los subfragmentos de sus 7-8 aminoácidos contiguos debido a que estos péptidos generan consistentemente una alta respuesta inmunogénica al péptido A/3. Estos fragmentos incluyen Aß 16-22, Aß 16-23, Aß 16-24, Aß 17-23, Aß 17-24, Aß 18-24, y Aß 18-25. Los subfragmentos Aß 15-25 particularmente preferidos son de 7 aminoácidos contiguos de longitud. La designación Aß 15-21, por ejemplo, indica un fragmento que incluye los residuos 15-20 de Aß y carece de otros residuos de Aß, y preferentemente 7-10 aminoácidos contiguos. Estos fragmentos pueden generar una respuesta al anticuerpo que incluye anticuerpos específicos de extremo. Los inmunógenos de péptido de Aß requieren de exploración para la actividad para despejar o prevenir los depósitos amiloide (ver WO 00/72880, que se incorpora en la presente en su totalidad para todo propósito) . La administración de fragmentos de terminación N de Aß induce la producción de anticuerpos que reconocen depósitos Aß in vivo e in viro. En algunos métodos se utilizan fragmentos que carecen de al menos uno y algunas veces de al menos 5 o 10 aminoácidos de terminación C presentes en formas de origen natural de Aß. por ejemplo, un fragmento que carece de 5 aminoácidos del extremo de terminación C de Aß43 incluye los primeros 38 aminoácidos del extremo de terminación N de Aß.
A menos que se indique de otra manera, la referencia a Aß incluye las secuencias de aminoácidos naturales humanas antes indicadas así como análogos incluyendo alélicos, especies y variantes inducidas. Los análogos típicamente difieren de los péptidos de origen natural en una, dos o algunas posiciones, frecuentemente en virtud de las sustituciones conservadoras . Los análogos típicamente exhiben al menos 80 o 90% de identidad de secuencia con los péptidos naturales . Algunos análogos incluyen también aminoácidos naturales o modificaciones de aminoácidos de terminación N o C en una, dos o algunas posiciones. Por ejemplo, el residuo natural de ácido aspártico en la posición 1 y/o 7 de Aß puede reemplazarse con ácido iso aspártico. Ejemplos de aminoácidos no naturales son aminoácidos D, alfa, alfa disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, epsilon-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, ß-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gama-amino butírico, homoserina, citrulina, y ácido isoaspártico. Los péptidos inmunogénicos incluyen análogos de Aß y sus fragmentos . Algunos agentes terapéuticos de la invención son péptidos all-D, e.g., Aß all-D, fragmento Aß all-D, o análogos de Aß all-D o todo el fragmento Aß all-D. Los fragmentos y análogos pueden explorarse para eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animal transgénico en comparación con controles no tratados o placebos como se describe en la WO 00/72880. Los inmunógenos de péptido incluyen también polipéptidos más largos que incluyen, por ejemplo, un inmunogénico de péptido Aß, conjuntamente con otros aminoácidos. Por ejemplo, los péptidos inmunogénicos preferidos incluyen proteínas de fusión que comprenden un segmento de Aß enlazado a una secuencia heteróloga de aminoácido que induce una respuesta de la célula T auxiliar contra la secuencia heteróloga de aminoácidos y en consecuencia una respuesta de la célula B contra el segmento Aß. tales polipéptidos pueden explorarse por eficacia profiláctica o terapéutica en modelos animales en comparación con controles no tratados o placebos como se describe en la WO 00/72880. El péptido Aß, análogo, fragmento inmunogénico u oro polipéptido puede administrarse en forma agregada o desagregada. El Aß desagregado o sus fragmentos significa unidades monoméricas de péptido. El Aß desagregado o sus fragmentos son generalmente solubles, y son capaces de auto-agregarse para formar oligómeros solubles, protofibrilos y ADDLs . Los oligómeros de Aß y sus fragmentos son comúnmente solubles y existen predominantemente como hélices alfa o rizos aleatorios. El Aß agregado o sus fragmentos significa oligómeros de Aß o sus fragmentos que se han asociado en disposiciones insolubles de hoja beta. El Aß agregado o sus fragmentos también significa polímeros fibrilares . Los fibrilos son comúnmente insolubles. Algunos anticuerpos se enlazan ya sea a Aß soluble o sus fragmentos o a Aß agregado o sus fragmentos. Algunos anticuerpos se enlazan tanto a Aß soluble o sus fragmentos como a A/3 agregado o sus fragmentos. Los péptidos inmunogénicos incluyen también multímeros de pépidos monoméricos inmunogénicos . Los péptidos inmunogénicos diferentes a los péptidos Aß deben inducir una respuesta inmunogénica contra uno o más de los fragmentos preferidos de Aß antes listados (e.g., A/3 1-3, 1-7, 1-10 y 3-7) . Los péptidos inmunogénicos de la presente invención se encuentran enlazados a un vehículo utilizando un método de la presente invención para formar un conjugado. El péptido inmunogénico puede enlazarse en su terminación amino, su terminación carboxilo, o en ambas a un vehículo para formar un conjugado. Opcionalmente, pueden estar presentes múltiples repeticiones del péptido inmunogénico en el conjugado . Un fragmento de terminación N de Aß puede encontrarse enlazado en su terminación C a un péptido vehículo para formar un conjugado. En tales conjugados, el residuo de terminación N del fragmento de Aß constituye el residuo de terminación N del conjugado. En consecuencia, tales conjugados son efectivos para inducir anticuerpos que se enlazan a un epítope que requiere que el residuo de terminación N de Aß se encuentre en forma libre. Algunos péptidos inmunogénicos de la invención comprenden una pluralidad de repeticiones del segmento de terminación N de Aß enlazado en la terminación C a una o más copias de un péptido vehículo para formar un conjugado. El fragmento de terminación N de Aß incorporado en tales conjugados comienza algunas veces en Aß 1-3 y finaliza en Aß 7-11. El Aß 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 y 3-7 son fragmentos de terminación N preferidos de Aß. Algunos conjugados comprenden diferentes segmentos de terminación N de Aß en serie. Por ejemplo, un conjugado puede comprender Aß 1-7 seguido por Aß 1-3 enlazados a un vehículo. En algunos conjugados, un segmento de terminación N de Aß se encuentra enlazado en su extremo de terminación N a un péptido vehículo. La misma variedad de segmentos de terminación N de Aß puede utilizarse como con el enlace de terminación C. Algunos conjugados comprenden un péptido vehículo enlazado a la terminación N de un segmento de terminación N de Aß, que a su vez se encuentra enlazado a uno o más segmentos adicionales de terminación N de Aß en serie . Preferentemente, tales fragmentos inmunogénicos de Aß, una vez conjugados a un vehículo apropiado, inducen una respuesta inmunogénica que se dirige específicamente al fragmento de Aß sin dirigirse a otros fragmentos de Aß. Los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen péptidos inmunogénicos heterólogos . En algunos péptidos inmunogénicos, un fragmento Aß se encuentra enlazado a un vehículo para formar un péptido inmunogénico heterólogo. Este péptido heterólogo se encuentra enlazado a un vehículo utilizando un método de la presente invención para formar un conjugado. Algunos de estos péptidos inmunogénicos heterólogos comprenden fragmentos de Aß enlazados a epítopes de toxoide de tétanos tales como los descritos en la US 5,196,512, EP 378,881 y EP 427,347. Opcionalmente un péptido inmunogénico puede enlazarse a una o múltiples copias de un vehículo, por ejemplo, en las terminación tanto N como C del vehículo para formar un péptido inmunogénico heterólogo. Otros de estos péptidos inmunogénicos heterólogos comprenden fragmentos de Aß enlazados a los péptidos vehículo descritos en la US 5,736,142. Por ejemplo, un péptido inmunogénico heterólogo puede comprender Aß 1-7 seguido por Aß 1-3 seguido por un vehículo. Ejemplos de tales péptidos inmunogénicos heterólogos incluyen: Aß 1-7/toxoide de tétanos 830-844 + 947-967 en una configuración lineal DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 24) Péptidos descritos en la US 5,736,142 (todos en configuración lineal) : PADRE/Aß 1-7: AKXVAAWTLKAA-DAEFRHD (SEQ ID NO : 26) Aß 1-7 x 3/PADRE: DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAA (SEQ ID NO: 27) PADRE/Aß 1-7 X 3: AKXVAAWTLKAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 28) Aß 1-7/PADRE: DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 29) Aß 1-7/fragmento de albúmina: DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 30) Aß 4-10/fragmento de albúmina: FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO : 31) Aß 3-9/fragmento de albúmina: EFRHDSG-SQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO : 32) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 33) A/31-7/HA307-3i9/AiS1-7: DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 34) - DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- (SEQ ID NO: 35) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- (SEQ ID NO : 36) A/31_7/HA307-3?9/malaria CS/TT830-844/TT947-967/A/31-7 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 37) A/3i_7 x 3/TT83o-84/C/TT94-967 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- (SEQ ID NO : 38) A/3?_7/TT83o-8 /C/TT947_9S7 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- (SEQ ID NO: 39) A^1.7/TT83o-844/C/TT947.9S7/A^1_7 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO : 20) Algunos péptidos inmunogénicos heterólogos comprenden un multímero de péptidos inmunogénicos representados por la fórmula 2X en la cual x es un entero de 1-5. Preferentemente x es 1, 2 o 3, siendo 2 el más preferido. Cuando x es dos, tal multímero tiene cuatro péptidos inmunogénicos enlazados en una configuración preferida referida como MAP4 (ver US 5,229,490). Tales péptidos inmunogénicos se enlazan entonces a un vehículo utilizando un método de la presente invención para formar un conjugado . Se muestra abajo la configuración MAP4, en donde se producen estructuras ramificadas iniciando la síntesis de péptido en las aminas tanto de terminación N como de cadena lateral de lisina. Dependiendo del número de veces que se incorpora lisina en la secuencia y se le permite la ramificación, la estructura resultante se encontrará presente el terminaciones N múltiples. En este ejemplo, cuatro terminaciones N idénticas se han producido en el núcleo ramificado que contiene lisina. Tal multiplicidad mejora grandemente la respuesta de células B cognado.
Péptido KGG Péptido Péptido Péptido Ejemplos de tales péptidos inmunogénicos heterólogos incluyen: A/3 1-7/Toxoide de tétanos 830-844 en una configuración MAP4 : DAEFRHD-QYIKA SKFIGITEL (SEQ ID NO: 22) A/3 1-7/Toxoide de tétanos 947-967 en una configuración MAP4 : DEAFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 23) A/3 3-9/Toxoide de tétanos 830-844 en una configuración MAP4 : EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 25) - - DAEFRHD-QYIANSKFIGITEL en una resina de 2 ramificaciones El péptido A/3, análogo, fragmento activo u otro polipéptido puede administrarse en una forma asociada o multimérica o en forma disociada. Los agentes terapéuticos incluyen también multímeros de agentes monoméricos inmunogénicos. Los agentes diferentes a los péptidos A/3 deben inducir una respuesta inmunogénica contra uno o más de los fragmentos preferidos de A/3 antes listados (e.g., 1-10, 1-7, 1-3 y 3-7) y también pueden conjugarse a un vehículo utilizando un método de la presente invención. Preferentemente, tales agentes una vez conjugados a un vehículo apropiado, inducen una respuesta inmunogénica específicamente dirigida a uno de estos fragmentos sin dirigirse a otros fragmentos de A/3. Para facilitar la conjugación de un inmunógeno de péptido con un vehículo, pueden agregarse aminoácidos adicionales a las terminaciones de las determinantes antigénicas. También pueden utilizarse residuos adicionales para modificar las propiedades físicas o químicas del inmunógeno de péptido. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico o lo similar, en la terminación C o N del inmunógeno de péptido. Adicionalmente, pueden introducirse también enlazadores de péptido que contienen aminoácidos tales como glicina y alanina. Además, las determinantes antigénicas pueden diferir de la secuencia natural siendo modificadas por acilación terminal del grupo NH2, e.g., mediante alcanoilo (C1-C20) o acetilación de tioglicolilo, amidación de terminación carboxi, e.g., amoniaco, metilamina etc. En algunas instancias, estas modificaciones pueden proporcionar sitios para enlazarse a un soporte u otra molécula. Los inmunógenos de péptido utilizados para generar los conjugados de la presente invención utilizando un proceso descrito en la presente, pueden combinarse a través de enlace para formar polímeros (multímeros) , o pueden formularse en una composición sin enlace, como una mezcla. Cuando un péptido se enlaza a un péptido idéntico, formando por tanto un homopolímero, se presenta una pluralidad de unidades epitópicas de repetición. Por ejemplo, se utiliza tecnología múltiple de péptido antígeno (MAP) para construir polímeros que contienen péptidos CTL y/o de anticuerpo y péptidos . Un "epítope CTL" es uno derivado de regiones epitópicas seleccionadas de antígenos objetivo potenciales. Cuando los péptidos difieren, e.g., un cóctel que representa diferentes subtipos virales, diferentes epítopes dentro de un subtipo, diferentes especificidades de restricción de HLA, o péptidos que contienen epítopes T auxiliares, se proporcionan heteropolímeros con unidades de repetición. Además de los enlaces covalente, también se contemplan enlaces no covalente capaces de formar enlaces intermoleculares e intraestructurales . Tales inmunógenos de péptido y sus análogos se sintetizan mediante síntesis de péptido de fase sólida o expresión recombinante, o se obtienen de fuentes naturales. Los sintetizadores de péptido automáticos se encuentran comerciaimente disponibles de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresión recombinante puede encontrarse en bacterias (tales como E. coli) , levadura, células de insecto o células de mamífero. Los procedimientos para expresión recombinante se describen por Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY, 2a edición, 1989) . Algunos péptidos inmunogénicos también se encuentran disponibles comerciaimente (e.g., American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA, y California Peptide Research, Inc., Napa, CA) . También pueden explorarse bibliotecas aleatorias de péptidos u otros compuestos para adecuabilidad como inmunógeno de péptido. Pueden producirse bibliotecas combinatorias para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse de una manera por etapas. Tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de giro beta, hormonas, glicinas oligoméricas N sustituidas, y oligocarbamatos y lo similar. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatorias mediante el método de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en la WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 y WO 95/30642 (cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante la referencia para todo propósito) . También pueden generarse bibliotecas de péptido mediante métodos de imagen fago (ver, e.g., Devlin, WO 91/18980) . Derivatización y Conjugación de un Péptido Inmunogénico a un Vehículo de Proteína El sitio de unión de un inmunógeno de péptido a un vehículo de proteína/polipéptido, y la naturaleza del agente de reticulación utilizado para unir un inmunógeno de péptido al vehículo son importantes para la especificidad del anticuerpo resultante generado contra el mismo. Para un reconocimiento apropiado, el inmunógeno de péptido debe acoplarse al vehículo con la orientación apropiada. Para que el anticuerpo reconozca subsecuentemente los inmunógenos de péptido libres sin un vehículo, el conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido debe presentar los inmunógenos de péptido de una forma expuesta y accesible. La orientación óptima se logra frecuentemente dirigiendo la reacción de reticulación a sitios específicos en los inmunógenos de péptido. Puede lograrse esto con un inmunógeno de péptido uniendo un residuo de terminación cisteína durante la síntesis del péptido. Esto proporciona un grupo sulfhidrilo en un extremo del péptido para conjugación al vehículo. La reticulación a través de este grupo proporciona la unión del inmunógeno de péptido solo en un extremo, asegurando así una orientación consistente. En una conjugación de inmunógeno de péptido-vehículo, la meta es no mantener el estado original o la estabilidad del vehículo, sino presentar el hapteno de la mejor manera posible para el sistema inmune. Al alcanzar esta meta, la selección de la química de conjugación puede controlar la titulación, afinidad y especificidad resultante de los anticuerpos generados contra el hapteno. Puede ser importante en algunos casos seleccionar un agente de reticulación que contiene un brazo separador suficientemente largo para presentar el antígeno de una manera irrestricta. También puede ser importante controlar la densidad del inmunógeno de péptido en la superficie del vehículo. Una sustitución del inmunógeno de péptido demasiado baja puede dar como resultado poca o ninguna respuesta. Una densidad demasiado alta del inmunógeno de péptido puede ocasionar la supresión inmunológica y la disminución de la respuesta. Además, el reticulador en sí puede generar una respuesta inmune no deseada. Estos problemas necesitan tomarse en consideración para seleccionar no solo los reactivos de reticulación apropiados, sino las relaciones apropiadas de vehículo de proteína/polipéptido e inmunógeno de péptido. Son posibles una variedad de métodos para unir los vehículos de proteína/péptido a los inmunógenos de péptido. Son posibles las interacciones iónicas a través de las terminaciones o a través del grupo e-amino de lisina. También es posible el enlace de hidrógeno entre los grupos laterales de los residuos y el inmunógeno de péptido. Finalmente, las interacciones de conformación entre los vehículos de proteína/péptido y el péptido inmunogénico pueden dar lugar a una unión estable . Se han generado con éxito conjugados de inmunógenos de péptido-vehículo utilizando diversos reactivos de reticulación tales como enlazadores de longitud cero, homobifuncionales o heterobifuncionales . Los sistemas de reactivo más pequeños disponibles para bioconjugación son los llamados reticuladores de longitud cero. ' Estos compuestos median la conjugación de dos moléculas formando un enlace que contiene átomos no adicionales. De este modo, un átomo de una molécula es un separador. En muchos esquemas de conjugación, el complejo final se enlaza conjuntamente en virtud de los componentes químicos que agregan estructuras externas a las sustancias reticuladas . En algunas aplicaciones, la presencia de estos enlazadores de intervención puede ser dañina para el uso pretendido. Por ejemplo, en la preparación de conjugados de inmunógeno de péptido-vehículo el complejo se forma con la intención de generar una respuesta inmune al hapteno unido. Ocasionalmente, una porción de los anticuerpos producidos mediante esta respuesta tendrá especificidad para el agente de reticulación utilizado en el procedimiento de conjugación. Los agentes de reticulación de longitud cero eliminan el potencial para este tipo de reactividad cruzada mediando un enlace directo entre dos sustancias . Los reactivos homobifincionales, que fueron los primeros reactivos de reticulación utilizados para modificación y conjugación de macromoléculas, consistieron de compuestos birreactivos conteniendo el mismo grupo funcional en ambos extremos (Hartman y Wold, 1966) . Estos reactivos podrían enlazar una proteína a otra reactivándose covalentemente con los mismos grupos comunes en ambas moléculas. De este modo, las e-aminas de lisina o las aminas de terminación N de una proteína podrían reticularse a los mismos grupos funcionales en una segunda proteína simplemente mezclando las dos entre sí en presencia del reactivo ho obifuncional . Los reactivos de conjugación heterobifuncionales contienen dos grupos reactivos diferentes que pueden acoplarse a dos diferentes objetivos funcionales en proteínas y otras macromoléculas. Por ejemplo, una parte de un reticulador puede contener un grupo reactivo a amina, mientras que otra porción puede consistir de un grupo reactivo a sulfhidrilo. El resultado es la capacidad de dirigir la reacción de reticulación a partes seleccionadas de moléculas objetivo, almacenando por tanto un mejor control sobre el proceso de conjugación. Los reactivos heterobifuncionales se utilizan para reticular proteínas y otras moléculas en un proceso de dos o tres etapas que limita el grado de polimerización frecuentemente obtenido al utilizar reticuladores homobifuncionales . Muchos métodos se encuentran disponibles actualmente para acoplar inmunógenos de péptido a vehículos de proteína/polipéptido utilizando reticuladores de longitud cero, homo ifuncionales o heterobifuncionales. La mayoría de los métodos crean enlaces amina, amida, uretano, isotiourea o disulfuro, o en algunos casos tioéteres. El método más general para acoplar proteínas o péptidos a péptidos utiliza reactivos bifuncionales de reticulación. Estos son pequeñas moléculas separadoras que tienen grupos activos en cada extremo. Las moléculas separadoras tienen grupos activos idénticos o diferentes en cada extremo. Las funcionalidades activas más comunes, grupos de acoplamiento y enlaces formados son : 1- Aldehido - amino amina secundaria 2- Maleimido - sulfhidrilo (tioéter 3. Succinimido - amino (amida 4. Imidato esteres - amino (- amida 5. Fenil azidas - amino (fenil amina 6. Acil haluro - sulfhidrilo (tioéter 7. Piridildisulfuros - sulfhidrilo (disulfuro 8. Isotiocianato -amino (isotiourea La reactividad de una proteína vehículo dada, en términos de su capacidad para modificarse mediante un agente de reticulación de manera que pueda conjugarse a un inmunógeno de péptido, se determina por su composición de aminoácido y la ubicación de secuencia de los aminoácidos individuales en la estructura tridimensional de la molécula, así como por la composición de aminoácido del inmunógeno de péptido. En el caso de los enlazadores ("L") entre los vehículos de proteína/péptido y otros péptidos (e.g., vehículos de proteína/péptido y el inmunógeno de péptido) , los separadores se seleccionan típicamente de Ala, Gly, u otros separadores neutrales de aminoácidos no polares o aminoácidos neutrales polares . En ciertas modalidades el separador neutral es Ala. Se entenderá que el separador opcionalmente presente no necesita encontrarse comprendido de los mismos residuos y por los mismos residuos y de este modo puede ser un hetero- u homo-oligómero. Los separadores ejemplares incluyen homo-oligómeros de Ala. Cuando se encuentra presente, el separador será comúnmente de uno o dos residuos, más comúnmente de tres a seis residuos. En oras modalidades el vehículo de proteína/polipéptido se conjuga a un inmunógeno de péptido, preferentemente con el vehículo de proteína/polipéptido colocado en la terminación amino. El péptido puede unirse por un enlazador neutral, tal como Ala-Ala-Ala o lo similar, y preferentemente contiene además un residuo lípido tal como ácido palmítico o lo similar que se encuentra unido a grupos amino alfa y epsilon de un residuo Lys ((PAM)2Lys), que se encuentra unido a la terminación amino del conjugado de péptido, típicamente a través de un enlace Ser-Ser o lo similar. En algunos aspectos de la invención, el péptido es un fragmento A/3 seleccionado del grupo que consiste de AjS 1-5-L, A/3 1-7-L, Aß 1-9-L, y Aß 1-12-L. En algunos aspectos de la invención el enlazador es GAGA (SEQ ID NO: 10) . Para facilitar la conjugación de un inmunógeno de péptido con un vehículo, pueden agregarse aminoácidos adicionales a las terminaciones de las determinantes antigénicas . Los residuos adicionales también pueden utilizarse para modificar las propiedades físicas o químicas del inmunógeno de péptido. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico, o lo similar en la terminación C o N del inmunógeno de péptido. Adicionalmente, también pueden utilizarse enlazadores de péptido que contienen aminoácidos tales como glicina y alanina. Además, las determinantes antigénicas pueden diferir de la secuencia natural siendo modificadas por acilación del grupo NH2, e.g., mediante acetilación de alcanoil (C1-C20) o tioglicolilo, amidación de terminación carboxi, e.g., amonio, metilamina, etc. en algunas instancias, estas modificaciones pueden proporcionar sitios para enlazarse a un soporte u otra molécula. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento Aß seleccionado del grupo que consiste de Aß 1-5-C, Aß 1-7-C, Aß 1-9-C, y Aß 1-12-C, en donde C es un residuo de aminoácido cisteína. En algunos aspectos de la invención, el inmunógeno de péptido es un fragmento Aß seleccionado del grupo que consiste de Aß 1-5-L-C, Aß 1-7-L-C, Aß 1-9-L-C, y Aß 1-12-L-C. El inmunógeno de péptido se encuentra enlazado al vehículo de proteína/péptido ya sea directamente o a través de un enlazador ya sea en la terminación amino o carboxi del inmunógeno de péptido. La terminación amino ya sea del inmunógeno de péptido o del vehículo de proteína/péptido puede acilarse. Adicionalmente, el conjugado de inmunógeno de péptido/vehículo de proteína/péptido puede encontrarse enlazado a ciertos lípidos de alcanoílo (C1-C20) a través de uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, como se describió anteriormente. Otros residuos de lípido útiles incluyen colesterol, ácidos grasos y lo similar. Los inmunógenos de péptido pueden encontrarse enlazados a un vehículo mediante reticulación química. Las técnicas para el enlace de un inmunógeno a un vehículo incluyen la formación de enlaces disulfuro utilizando N-succinimidil-3- (2-piridil-tio) propionato (SPDP) (Carlsson, J. et al., (1978) Biochem. J. 173:723), y succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (si el péptido carece de un grupo sulfihidrilo, éste puede proveerse por la adición de un residuo cisteína al hapteno) . Estos reactivos crean un enlace disulfuro entre ellos mismos y los residuos de péptido cisteína en una proteína y un enlace amida a través del e-amino en una lisina, u otro grupo amino libre en otros aminoácidos . Una variedad de tales agentes formadores de disulfuro/amida se describen en Immuno. Rev. 62-85 (1982) . Otros agentes bifuncionales de acoplamiento forman un enlace tioéter en lugar de uno disulfuro. Los agentes formadores de tioéter incluyen éster reactivo de ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, y ácido 2-yodoacético, ácido 4- (N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxílico. Los grupos carboxilo pueden activarse combinándolos con succinimida o ácido l-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico, sal de sodio.
Más frecuentemente, los residuos lisina son los residuos aminoácido más abundantes encontrados en proteínas vehículo, y estos residuos se modifican utilizando reactivos de reticulación para generar sitios nucleofílicos que entonces se acoplan a un hapteno. Este acoplamiento se logra a través de cualquiera de las cadenas laterales hidrófilas en las moléculas de hapteno que son químicamente activas . Estas incluyen el grupo guanidilo de arginina, los grupos (-carboxilo de glutamato y ácido aspártico, el grupo sulfhidrilo de cisteína, y el grupo e-amino de lisina, para nombrar algunos. La modificación de proteínas a fin de que puedan ahora acoplarse a otros residuos se logra utilizando reactivos de reticulación, que reaccionan con cualquiera de las cadenas laterales en el vehículo de proteína o las moléculas de hapteno. En un aspecto de la presente invención, la proteína vehículo con o sin una molécula enlazadora se funcionaliza (derivatiza) con un reactivo que introduce sitios reactivos en la molécula de proteína vehículo que son dóciles para modificación posterior para introducir grupos nucleofílicos . En una modalidad, el vehículo se hace reaccionar con un reactivo de haloacetilación, que preferentemente reacciona con una cantidad de grupos funcionales en residuos de aminoácido de proteínas tales como el grupo sulfhidrilo de cisteína, el grupo primario de e -amina del residuo lisina, la terminación . de c¿-aminas, el tioéter de metionina y ambos nitrógenos de imidazoilo de cadena lateral de histidina (Gurd, 1967) . En una modalidad preferida, los grupos primarios de e-amina en residuos lisina de la proteína vehículo se derivatizan con b N-hidroxisuccinimidil bromoacetato para generar un vehículo bromoacetilado. La conjugación del inmunógeno de péptido y el vehículo de proteína activado se llevó a cabo agregando lentamente el vehículo activado a la solución que contiene el inmunógeno de péptido. Utilizando el proceso de esta invención, los inmunógenos de péptido tratados en la sección B anterior, pueden conjugarse a cualquiera de los vehículos tratados en la sección A anterior. Los conjugados que resultan del proceso de esta invención se utilizan como inmunógenos para la generación de anticuerpos contra Aß para su uso en inmunoterapia pasiva/activa. Además, el Aß o un fragmento Aß enlazado a un vehículo puede administrarse a un animal de laboratorio en la producción de anticuerpos monoclonales para Aß . En un aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo que consiste de Aß 1-7-CRM197(Aß 1-7 x 3)-CRMX97 y (Aß 1-7 x 5)-CRM?97. En un aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo que consiste de CRM197-Aß 1-5, CRM197-Aß 1-7, CRM?97-A/3 1-9, y CRM197-A/3 1-12. En otro aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo que consiste de A/3 l-5-C-CRM197, A/3 l-7-C-CRM197, Aß l-9-C-CRM?97, y Aß 1-12-C-CRM?97, A/3 16-23-C-CRM?97, A/3 17-24-C-CRM197, Aß 18-25-C-CRM197, CRM197-C-A/3 18-25, CRM197-C-A/3 16-23, CRM197-C-A/3 17-24, CRM197-C-A/3 18-25, Aß 16-22-C-CRM197, Aß 17-23-C-CRM?97, Aß 18-24-C-CRM197, CRM197-C-A/3 16-22, CRM?97-C-A/3 17-23, y CRM197-C-Aß 18-24, Aß l-9-C-CRM197, y Aß 1-12-C-CRM197. Aún en orto aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo que consiste de Aß l-5-L-C-CRM197, Aß l-7-L-C-CRM197, Aß l-9-L-C-CRM197, y Aß 1-12-L-C-CRM197. Tapado Una desventaja del uso de reactivos de acoplamiento que introducen sitios reactivos en las cadenas laterales de moléculas de aminoácido reactivas en moléculas vehículo y/o de hapteno, es que los sitios reactivos si no se neutralizan se encuentran libres de reaccionar con cualquier molécula no deseada ya sea in vitro o in vivo. En el proceso de la presente invención, el tapa de grupos funcionales sin reaccionar se logra mediante la reacción de los conjugados con grupos reactivos pendientes con reactivos que desactivan/tapan los grupos reactivos. Los reactivos de desactivación/tapa ejemplares para su uso con el proceso de conjugación de la presente invención incluyen cisteamina, N-acetilcisteamiria y etanolamina. Alternativamente, el tapa se logra mediante reacción con amoniaco o bicarbonato de amonio, de los cuales cualquiera convierte los grupos haloacetilo en grupos aminoacetilo. El tapa se logra también a un pH alcalino (9.0-9.8) utilizando hidróxido de sodio o carbonato de sodio, que convierte los grupos haloacetilo en grupos hidroxiacetilo. Una ventaja potencial de convertir los grupos haloacetilo en grupos hidroxiacetilo, opuesto a la reacción con derivados de cisteamina, etanolamina, etc., es la introducción de funcionalidades químicas de un tamaño relativamente más pequeño, mediante la reacción con amoniaco o hidróxido/carbonato. Los grupos funcionales tapados resultantes, e.g., aminoacetilo o hidroxiacetilo, proporcionan una perturbación relativamente menor en la porción del vehículo de proteína del conjugado. La proteína de inmunógeno de péptido-vehículo tapada se purifica según sea necesario utilizando métodos conocidos, tales como cromatografía (filtración de gel, intercambio de ion, interacción hidrófoba o afinidad) , diálisis, ultrafiltración-diafiltración, precipitación selectiva utilizando sulfato de amonio o alcohol y lo similar. Conjugados y Composiciones Inmunogénicas Los conjugados tapados de inmunógeno de péptido-proteína vehículo se administran en una composición inmunogénica a mamíferos, particularmente humanos, para propósitos profilácticos y/o terapéuticos. Los conjugados de la presente invención se utilizan para producir y/o aumentar respuestas inmunes contra inmunógenos. Por ejemplo, los conjugados de CTL-vehículo se utilizan para tratar y/o prevenir la infección viral, enfermedades amiloidogénicas, cáncer etc. Alternativamente, también se utilizan los conjugados de inmunógeno de polipéptido-vehículo que inducen respuestas de anticuerpo. En aplicaciones terapéuticas, se administra un conjugado de la presente invención a un individuo que sufre ya de una enfermedad amiloidogénica tal como la enfermedad de Alzheimer. Aquellos en la fase de incubación o en la fase aguda de la enfermedad pueden tratarse con el conjugado de la presente invención por separado o en conjunción con otros tratamientos, según sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, la composición inmunogénica de la presente invención se administra a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta CTL efectiva o una respuesta humoral a la placa amiloide, y para curar, o al menos detener parcialmente el progreso de la enfermedad, los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este uso dependerán en parte de la composición del péptido, la manera de administración, la etapa y severidad de la enfermedad tratada, el peso y estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe. Las cantidades terapéuticamente efectivas de las composiciones inmunogénicas de la presente invención fluctúan generalmente para la inmunización inicial para administración terapéutica o profilác ica, de aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 10,000 µg de péptido para un paciente de 70 kg, comúnmente de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 800 µg, preferentemente entre aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 5000 µg y de mayor preferencia entre 0.1 hasta aproximadamente 1,000 µg. Estas dosis son seguidas por dosis de refuerzo de desde aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 1000 µg de péptido conforme a un régimen de refuerzo durante semanas o meses dependiendo de la respuesta del paciente y la condición midiendo las respuestas inmunes específicas. Además, la presente invención se utiliza profilácticamente para prevenir y/o aminorar una enfermedad amiloidógena. Las cantidades efectivas se describieron anteriormente. Adicionalmente, el de experiencia ordinaria en la técnica también sabrá cómo ajustar o modificar los tratamientos profilácticos, según sea apropiado, por ejemplo reforzando y ajustando las dosis y los regímenes de dosis. La administración terapéutica puede iniciar al primer signo de la enfermedad. Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta detener o revertir el progreso de la enfermedad o hasta que los síntomas se abaten sustancialmente durante un período posterior. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención para tratamiento terapéutico o profiláctico pueden administrarse por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intra-arteriales, intra-craniales, intra-peritoneales, intra-nasales, o intra-musculares para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Una vía de administración tópica de un agente inmunogénico es la subcutánea, aunque pueden ser igualmente efectivas otras vías. Otra vía común es la inyección intra-muscular. Este tipo de inyección se lleva a cabo más típicamente en los músculos del brazo o pierna. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular en donde se han acumulado los depósitos, por ejemplo inyección intra craneal . Se prefiere la inyección intra muscular o la infusión intravenosa para la administración del anticuerpo. En algunos métodos, se inyectan anticuerpos terapéuticos particulares directamente en el cráneo. Debido a la facilidad de administración, las composiciones inmunogénicas de la invención son particularmente adecuadas para administración oral . La invención proporciona además composiciones inmunogénicas para administración parenteral, que comprenden una solución de los péptidos o conjugados, disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Puede utilizarse una variedad de diluyentes, excipientes y amortiguadores, e.g., agua, agua amortiguada, salina de fosfato amortiguada, glicina al 0.3%, ácido hialurónico, y lo similar. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales muy conocidas, o pueden filtrarse estériles. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para su uso como tales o liofilizarse, siendo combinada la preparación liofilizada con una solución estéril previo a -la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptable según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Para composiciones sólidas, pueden utilizarse vehículos sólidos convencionales no tóxicos. Estos pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio, y lo similar. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos vehículos previamente listados, y generalmente 10.95% del ingrediente activo, es decir, uno o más conjugados de la invención y más preferentemente a una concentración de 25-75%. La concentración de las composiciones inmunogénicas de la presente invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, i.e., de menos de aproximadamente 0.1&, comúnmente a o a al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% a 50% o más por peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc. de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado . Los conjugados de la presente invención pueden administrarse también a través de liposomas, que sirven para dirigir los conjugados a un tejido particular, tal como el tejido linfoide, o dirigir selectivamente a células infectadas, así como para incrementar la vida media de la composición de péptido. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelos, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípido, capas laminares, y lo similar. En estas preparaciones, la composición que va a suministrarse se incorpora como parte de un liposoma, solo o en conjunción con una molécula, que se enlaza a, por ejemplo, un receptor que prevalece entre células linfoide. Estas moléculas incluirían anticuerpos monoclonales, que se enlazan al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De este modo, los liposomas llenos con la composición deseada de la presente invención pueden dirigirse al sitio de las células linfoide en donde los liposomas suministran entonces las composiciones de péptido terapéuticas/inmunogénicas seleccionadas. Los liposomas para uso en la invención se forman de lípidos estándar formadores de vesícula, que generalmente incluyen fosfolípidos de carga neutra o negativa y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos se guía generalmente considerando el tamaño del liposoma, la labilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Se encuentran disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas como se describe en e.g., Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), Patentes de E.U. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4.837,028 y 5,019,369 incorporadas en la presente por la referencia. Para administración en aerosol, las composiciones de la presente invención se suministran preferentemente en forma finamente dividida conjuntamente con un surfactante y propulsor. Los porcentajes típicos de la composición son de 0.01-20% por peso, preferentemente de 1-10%. El surfactante, por supuesto, debe ser no iónico, y preferentemente soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol alifático polihídrico o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse esteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o natural. El surfactante puede constituir 0.1-20% por peso de la composición, preferentemente 0.25-5%. El balance de la composición es ordinariamente propulsor. También puede incluirse un vehículo, si se desea, como con lecitina para suministro intranasal . Los conjugados de la presente invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente efectivos en el tratamiento y/o disminución de una enfermedad amiloide y/o sus síntomas. En el caso del Alzheimer y el síndrome de Down, en los cuales los depósitos se presentan en el cerebro, los conjugados de la invención pueden administrarse en conjunción con otros agentes que incrementan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera sanguínea cerebral. La composición inmunogénica comprende típicamente un adyuvante . Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmune al administrarse en conjunción con un inmunógeno o antígeno. Una cantidad de citocinas o linfosinas han mostrado tener actividad de modulación inmune, y por tanto pueden utilizarse como adyuvantes, incluyendo pero sin limitarse a las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes) , los interferones-a, ß y 7, el factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,078,996), factor de estimulación de colonia de macrófago, factor de estimulación de colonia de granulocito, GSF, y el factor de necrosis de tumor . y ß . Aún otros adyuvantes útiles en esta invención incluyen una quimiosina, incluyendo sin limitación, MCP-1, MlP-la, MlP-lß, y RANTES. También pueden ser útiles como adyuvantes las moléculas de adhesión, tales como selectina, e.g., L-selectina, P-selectina, y E-selectina. Aún otros adyuvantes útiles incluyen sin limitación, una molécula similar a mucina, e.g., CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1, un miembro de la familia integrina tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y pl50.95, un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina tal como PECAM, ICAMs, e.g., ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3, moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1, y factor de crecimiento endotelial vascular, moléculas receptoras incluyendo Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5, KILLER, TRAIL-R2 , TRICK2 y DR6. Aún otra molécula adyuvante incluye Caspase (ICE) . Ver también las Publicaciones de Patente Internacional Nos. W098/17799 y W099/43839 que se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad para todo propósito. Los adyuvantes adecuados utilizados para mejorar la respuesta inmune incluyen, sin limitación, MPL™ (lípido A de monofosforilo 3-0-deacilado; Corixa, Hamilton, MT) , que se describe en la Patente de E.U. NO. 4,912,094, que se incorpora en la presente mediante la referencia para todo propósito. También son adecuados para su uso como adyuvantes los análogos A de lípido si-ntético o los compuestos de aminoalquil glucosamina (AGP) , o sus derivados o análogos que se encuentran disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente de E.U. No. 6,113,918, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Tal AGP es 2- [ (R) -3-tetradecanoiloxitetradecancilamino] etil-2-deoxi-4-0-fosfono-3-O- [ (S) -3-tetradecanoioxitetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetradecanoiloxi-tetradecanoil-amino] -b-D-glicopiranosida conocida como 529 (también conocida como RC529; Corixa). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (529 AF) o como una emulsión estable (529 SE) . Aún otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de calcio tales como fosfato de calcio, - - sales de aluminio (alum) , tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, ácidos D-lactida-polilactida/gilcosida plurónicos, polioles, muramil dipéptido, Bordatella, saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) , descrita en la Patente de E.U. No. 5,057,540, que se incorpora en la presente mediante la referencia, y partículas generadas de la misma tales como ISCOMS (complejos inmunoestimuladores) , Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacteriales, polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (Patente de E.U. No. 6,207,646, que se incorpora en la presente mediante la referencia) , una toxina pertusis (Pt) , o una toxina termolábil de E. coli (LT) , particularmente LT-K63 , LT-R72, PT-K9/G129; ver, e.g., Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 93/13302 y WO 92/19265, que se incorporan en la presente por la referencia para todo propósito. También son útiles como adyuvantes las toxinas de cólera y sus mutantes incluyendo aquellos descritos en la Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 00/18434 (en donde el ácido glutámico en la posición de aminoácido 29 se reemplaza por otro aminoácidos (diferente al ácido aspártico, preferentemente una histidina) . Similares toxinas CT o mutantes se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 02/098368 (en donde la isoleucina en la posición de aminoácido 16 se reemplaza por otro aminoácido, ya sea solo o en combinación con el reemplazo de la serina en la posición de aminoácido 68 por otro aminoácido; y/o en donde la valina en la posición de aminoácido 72 se reemplaza por otro aminoácido) , otras toxinas CT se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 02/098369 (en donde la arginina en la posición de aminoácido 25 se reemplaza por otro aminoácido; y/o un aminoácido se inserta en la posición de aminoácido 49; y/o dos aminoácidos se insertan en la posición de aminoácido 35 y 36) . Debe entenderse que la referencia a lo largo de esta especificación a cualquier teoría para explicar los resultados descritos no limita el alcance de- la invención. Independiente del método mediante el cual funciona la invención, los resultados y ventajas descritos en la presente pueden lograrse por referencia a los siguientes ejemplos de la invención. Será aparente para el de experiencia ordinaria en la técnica que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse de la esencia o alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan por la referencia en su totalidad para todo propósito de la misma manera que se indicaría específica e individualmente que cada publicación patente, o solicitud de patente individual, se incorpora por la referencia. EJEMPLO 1 Conjugación de CRM197 al Péptido Aß La conjugación de haptenos/péptidos antigénicos se llevó a cabo reactivando el vehículo CRM19 activado, que tiene treinta y nueve residuos lisina, a un hapteno/péptido antigénico que tiene un grupo tiol pendiente utilizando el método descrito abajo (Figura 1) . Todos los péptidos Aß contenían un residuo cisteína en la terminación carboxi para facilitar la conjugación de estos péptidos a través del grupo cisteinil sulfhidrilo a la proteína vehículo. Estos péptidos se produjeron mediante síntesis de fase sólida. I . Activación Se bromoacetilaron grupos amino libres de CRMX97 mediante reacción con un exceso de ácido bromoacético de N-hidroxisuccinimida éster (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) (Bernatowicz y Matsueda, 1986) . A una solución helada de CRM197 (-15 mg) , se agregó 10% (v/v) 1.0 M de NaHC03, (pH 8.4). Se disolvió ácido bromoacético de N-succinimida éster, igual en peso al CRM?97 utilizado en 200 µl de dimetilformamida (DMF) , agregado lentamente al CRM197 y se mezcló suavemente a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora. La proteína bromoacetilada (activada) resultante se purificó pasándola a través de una columna de desalinización (P6-DG) utilizando PBS/l mM EDTA (pH 7.0) como eluyente. Después de la purificación, las fracciones correspondientes al CRM197 activado se vaciaron y la concentración de proteína se estimó por análisis de proteína BCA. Los grupos amino de proteína, tanto antes como después del tratamiento con ácido bromoacético de N-succinimida éster, se reactivaron con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBSA) que sirvió como indicador de bromoacetilación (Means et al., 1972). II . Conjugación Previo a la conjugación, los péptidos se reactivaron con 5, 5' -ditio-bis (2-ácido nitrobenzoico) (reactivo de Ellman) para verificar el contenido de grupos libres de SH (entre 62-88% reducidos) . Para los primeros cuatro péptidos Aß (aminoácidos 1-7 sin enlazador, aminoácidos 1-12 con enlazador GAGA (SEQ ID NO: 19), aminoácidos 1-9 con enlazador GAGA (SEQ ID NO: 10) , y aminoácidos 1-7 con enlazador GAGA (SEQ ID NO: 10), aproximadamente 8.0-10.0 mg de péptido se disolvieron en agua destilada estéril a una concentración aproximada de 20 mg/ml. El péptido se agregó lentamente a CRM?97 frío activado en una relación de 1:1 (peso/peso) y el pH se ajustó a aproximadamente 7.0-7.2 con la adición de 20.36 µl de 1N de NaOH. El material resultante se mezcló suavemente durante la noche a 4°C en la oscuridad seguido por diálisis en la oscuridad contra dos cambios IL de PBS, pH 7.2. Para los siguientes cuatro péptidos Aß (aminoácidos 1-5 sin enlazador, aminoácidos 1-9 sin enlazador, aminoácidos 1-12 sin enlazador, y aminoácidos 1-5 con enlazador) , se utilizó una reacción con reactivo de Ellman para verificar los grupos libres de SH. El CRM197 se bromoacetiló, se purificó, y se reactivó con TNBSA como se describió previamente. El pH de cada péptido se ajustó a 7.0 con la adición de 0.1 M de NaP04 (pH 8.5) a 2.2x el volumen del péptido disuelto. El péptido se agregó lentamente a CRM197 frío activado en una relación de 1:1 y se dejó hacer reaccionar durante la noche a 4°C en la oscuridad. El material resultante se dializó. Se conjugó un péptido final de control (1-12 mer en orientación inversa) a CRM197 como se describió anteriormente con la siguiente modificación. En lugar de ajustar el pH del péptido a 7.0, el pH del CRMi97 activado se ajustó a aproximadamente 7.5 con la adición de 20% (v/v) 0.5 M de NaP04 (pH 8.0). Cada conjugado después de la diálisis, se transfirió en un tubo estéril de polipropileno de 15 ml, envuelto en hoja de aluminio, y se almacenó a 4°C. La activación de los residuos amino reactivos en el vehículo se verificó después subsecuentemente utilizando espectrometría de masa. Conjugado Péptido Inmunogénico Aß l-5-C-CRM?97 DEAFR-C (SEQ ID NO: 1) Aß l-7-C-CRM197 DAEFRHD-C (SEQ ID NO: 2) Aß l-9-C-CRM197 DAEFRHD-C (SEQ ID NO : 3) Aß 1-12-C-CRM197 DAEFRHDSGYEV-C (SEQ ID NO: 4) Aß l-5-C-CRM197 DAEFR-GAGA-C (SEQ ID NO: 5) Aß l-7-C-CRM?97 DAEFRHD-GAGA-C (SEQ ID NO: 6) Aß l-9-C-CRM?97 DAEFRHDSG-GAGA-C (SEQ ID NO: 7) Aß I-12-C-CRM197 DAEFRHDSGYEV-GAGA-C (SEQ ID NO : 8) Aß 12-1-C-CRM197 VEYGSDHRFEAD-C (SEQ ID NO : 9) (-VE CONTROL) L = enlazador (GAGA) (SEQ ID NO: 10) EJEMPLO 2 Preparación de Conjugado de Péptido Aß-CRM197 y Purificación mediante Bromoacetilación por Ultrafiltración de CRM?97 Se reactivó el CRM197 (100 mg) en 0.01 M de amortiguador de fosfato de sodio, NaCl al 0.9%, pH 7.0, con ácido bromoacético de N-hidroxisuccinimida éster (disuelto a 20 mg/ml en DMSO) a una relación por peso de 1:1 bajo una atmósfera de argón. La reacción se tituló según fue necesario para mantener el pH a 7.0. La mezcla se agitó en la oscuridad durante 1.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró a 1.2 µm en el depósito de retención de un sistema UF/DF (Millipore Labscale TFF, Billerica, MA) . La purificación se realizó utilizando una membrana de 10K o 30K UF mediante diafiltración (30 veces) contra 0.01 M de amortiguador de fosfato de sodio/NaCl al 0.9%, pH 7.0. El CRM197 bromoacetilado se filtró pasándolo por un filtro de 0.2 µm. El grado de bromoacetilación se determinó reactivando el CRM?97 activado con cisteína, seguido por un análisis de aminoácido y cuantificación de la carboximetilcisteína (CMC) resultante. Conjugación del Péptido Aß y el CRM?97 Bromoacetilado y Tapa con N-acetilcisteamina El CRM?97 bromoacetilado (50 mg) se transfirió a un matraz de reacción. A la solución agitada, mantenida a 2-8 °C se agregó ÍM de carbonato/bicarbonato de sodio. Se llevó a cabo la titulación para lograr un pH objetivo de 9.0, bajo atmósfera de argón. Por separado, se pesaron 50 mg del péptido Aß y se disolvieron en agua para inyección (WFI) a 20 mg/ml . A esta solución se agregó ÍM de carbonato/bicarbonato de sodio hasta lograr un pH de 9.0. La solución de péptido se agregó a la solución de CRM197 bromoacetilado y la mezcla se agitó a 2-8 °C durante 14-18 horas. Los grupos bromoacetilo restantes se taparon con un exceso molar de 20 veces de N-acetilcisteamina durante 3-6 horas a 2-8°C. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 1.2 µm en el depósito de retención de un sistema UF/DF (Millipore XL) , y el conjugado se purificó a temperatura ambiente mediante diafiltración 30 veces en una membrana MWCO de 10K o 30K (Millipore) mediante diafiltración contra 0.01 M de amortiguador de fosfato de sodio/NaCl al 0.9%, pH 7.0. El retenido se colectó y se filtró a 0.2 µm y se analizó para contenido de proteína (análisis colorimétrico Lowry o Micro-BCA) , mediante SDS-PAGE, mediante análisis de aminoácido y para inmunogenicidad en ratones . EJEMPLO 3 Conversión por Tapa de los Grupos Bromoacetilo Sin reaccionar en Grupos Aminoacetilo El CRM?97 bromoacetilado (50 mg) preparado como se describió anteriormente en el Ejemplo 2, se transfirió a un matraz de reacción. A la solución agitada, mantenida a 2-8 °C se agregó ÍM de carbonato/bicarbonato de sodio. Se llevó a cabo la titulación para lograr un pH objetivo de 9.0, bajo atmósfera de argón. Por separado, se pesaron 50 mg del péptido Aß y se disolvieron en WFI a 20 mg/ml. A esta solución se agregó 1M de carbonato/bicarbonato de sodio hasta lograr un pH de 9.0. La solución de péptido se agregó a la solución de CRM?97 bromoacetilado y la mezcla se agitó a 2-8°C durante 14-18 horas. Los grupos bromoacetilo restantes se taparon utilizando solución de bicarbonato de amonio al 8% durante 4 horas a 2-8 °C. La mezcla de reacción se filtró a 1.2 µm en el depósito de retención de un sistema UF/DF (Millipore XL) , y el conjugado se purificó a temperatura ambiente mediante diafiltración 30 veces en una membrana MWCO de 10K o 30K mediante diafiltración contra 0.01 M de amortiguador de - fosfato de sodio/NaCl al 0.9%, pH 7.0. El retenido se colectó y se filtró a 0.2 µm y se analizó, para contenido de proteína (análisis colorimétrico Lowry o Micro-BCA) , mediante SDS-PAGE, y para inmunogenicidad en ratones. EJEMPLO 4 Determinación Cuantitativa de S-Carboximetilcisteína y S-Carboximetilcisteamina como Evaluación del Grado de Conjugación y Tapa de Conjugados de Inmunógeno de Péptido-Proteína/Polipéptido La hidrólisis acida de los conjugados de proteína-péptido generado utilizando química de activación de bromoacetilo dio como resultado la formación de S-carboximetilcisteína estable al ácido (CMC) de las cisteínas en los sitios conjugados y la formación de S-carboximetilcisteamina estable al ácido (CMCA) de la cisteamina en los sitios tapados (Figura 2) . Todas las usinas conjugadas y tapadas se convirtieron de nuevo a lisina y se detectaron como tales. Todos los otros aminoácidos se hidrolizaron de nuevo en aminoácidos libres excepto por triptofán y cisteína que se destruyeron por las condiciones de hidrólisis. Asparagina y glutamina se convirtieron en ácido aspártico y ácido glutámico respectivamente . Las muestras conjugadas se diluyeron con agua desionizada hasta una concentración total de proteína de menos que 1 mg/ml. Dos alícuotas de 10 microgramos de cada conjugado se secaron y se resuspendieron en 100 µl de 6N de HCl [Pierce] , 5 µl de fenol fundido [Sigma-Aldrich] , y 1 µl de 2-mercaptoetanol [Sigma-Aldrich] . Las muestras se incubaron entonces bajo vacío (100 T) a 110 °C durante 22 horas. Los hidrolisatos resultantes se secaron, se resuspendieron en 250 µl de amortiguador Beckman de muestra de citrato de sodio Na-S (pH 2.2) [Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA] , y se filtraron utilizando filtros Whatman de punta de jeringa de nilón de 0.1 µm y jeringas de 1 ml . Cada muestra se cargó entonces en un rizo de muestra analizador de aminoácido Beckman 6300 y se colocó en el analizador. Los aminoácidos de cada muestra hidrolizada y de control se separaron utilizando cromatografía de intercambio de ion seguida por reacción con solución Beckman Ninhydrin NinRX a 135 °C. Los aminoácidos derivados se detectaron entonces en el rango visible a 570 nm y a 440 nm (ver Tabla 1) . Un conjunto estándar de aminoácidos [Pierce Amino Acid Standard H] conteniendo 500 picomoles de cada aminoácido se corrió conjuntamente con las muestras y controles para cada conjunto de análisis. Se agregó S- carboximetilcisteína [Sigma-Aldrich] al estándar. Tabla 1 Tiempos de Retención para Aminoácidos Utilizando Programa de Gradiente 1 en el Analizador de Aminoácidos Beckman 6300 Las áreas de cada pico estándar se utilizaron como equivalencia cuantitativa para evaluación proporcional de cada muestra La prolina se determinó de 440 nm y se convirtió en una equivalencia en 570 nm utilizando ácido glutámico, el aminoácido más cercano .
Cada uno de estos valores de picomol se convirtió en una relación molar de los residuos aminoácido utilizando una comparación de picomoles de lisina para el valor teórico de lisina presente en la proteína. Se seleccionó lisina para esta evaluación en base a su unión covalente a cisteína y cisteamina y la hidrólisis similar esperada. Los números de moles resultantes de los aminoácidos se compararon entonces con la composición de aminoácido de la proteína y se reportaron conjuntamente con los valores para CMC y CMCA. El valor CMC se utilizó directamente para evaluación del grado de conjugación y el valor de CMCA se utilizó directamente para evaluación del grado de tapado. EJEMPLO 5 Caracterización y Optimización de Conjugados de Péptido Aß-CRM197 Para verificar la conjugación, todos los conjugados de péptido-CRMi97 se analizaron mediante análisis de aminoácido y espectrometría de masa de ionización de desorbción láser asistida por matriz- tiempo de vuelo (MALDI-TOF) . Para cada conjugado, se determinaron los moles de péptido conjugados a cada mol de CRM197 mediante análisis de aminoácido (número de residuos de S-carboximetilcisteína) y espectrometría de masa MALDI-TOF. Los valores determinados por cada método fueron generalmente acordes . I- Cromatografía de exclusión de tamaño: Las muestras concentradas de lote se retiraron del almacenamiento y se dejaron calentar a temperatura ambiente.
La muestra de conjugado de péptido A/3 se mezcló suavemente para asegurar una preparación homogénea. La muestra de conjugado de péptido A/3 se giró en una micro-centrífuga Eppendorf para retirar cualquier particulado. El sobrenadante se retiró para cromatografía TosoHaas TSK-Gel G3000SW (TosoHaas, Stuttgart, Alemania) . Se conectó una columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW a un sistema HPLC y el límite de presión se estableció a 1.4 Mpa. La columna se equilibró con al menos 30 ml de PBS (10 mM de fosfato de sodio, 150 mM de NaCl, pH 7.2 + 0.1) a una relación de flujo de 0.75 ml/min. La muestra de conjugado de péptido Aß se cargó sobre la columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW utilizando los siguientes parámetros: Concentración de muestra de conjugado de péptido Aß : 1.5 ± 1.0 mg/ml Relación de flujo: 0.75 ml/min Volumen de muestra : 0.1 ml Tiempo de curso: 30 minutos La absorbencia se monitoreó a 280 nm y 210 nm. Para almacenamiento a largo plazo, la columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW se equilibró con al menos 50 ml de etanol al 20% a una relación de flujo de 0.5-1.0 ml/min. II. PAGE (Electroforesis de Gel de Poliacrilamida): El CRM197 activado (bromoacetilado) y los conjugados de péptido A/3-CRM197 se examinaron mediante geles SDS utilizando electroforesis NuPAGE Bis-Tris (Novex, Frankfurt, Alemania) con un pH neutro, un sistema de pre-moldeado de mini-gel de poliacrilamida y amortiguador de curso NuPAGE MES SDS. Se mezcló un alícuota de 8 ug de cada CRM activado o conjugado con amortiguador de reducción de muestra y se calentó a 100°C durante 5 minutos. Los conjugados y los estándares de peso molecular (MW) (Invitrogen, Carisbad, CA) se cargaron en un gel NuPage al 10% (peso/v, acrilamida) (Novex) en base a un sistema amortiguado de Bis-Tris-HCl y se corrieron en MES SDS Running Buffer-PAGE (Laemmii) . Después de SDS-PAGE el gel se coloreó con Pierce Gel Code Blue (Pierce, Rockford, IL) . El conjugado de péptido A/3-CRM197 se representó por una banda mayor de aproximadamente 66 kDa, por arriba de la banda del CRM natural y una banda de dímero de aproximadamente 120 kDa, conjuntamente con bandas de multímero menores (datos no mostrados) . III . Análisis de Espectrometría de Masa MALDI-TOF de Conjugados de Péptido-CRM?97 Se utilizó la espectrometría de masa para una aproximación inmediata del grado de conjugación. Los alícuotas adecuados de muestras de CRM197 activado y conjugado se analizaron mediante espectrometría de masa MALDI-TOF utilizando ácido 3 , 5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico (ácido sinapínico) como matriz. Se encontró que el peso molecular del CRM197 activado determinado por la espectrometría de masa MALDI-TOF (Finnigan MAT Lasermat 2000 Mass Spectometer, Ringoes, NY) se encuentra centrado a alrededor de 60.5 kDa y para conjugados varía de 65 kDa a 74 kDa dependiendo del grado de conjugación (datos no mostrados) . Se encontró que hasta 22 de las lisinas (-50%) en CRMi97 se modificaron a una relación de 1:1. IV. Experimentos de Optimización El grado de activación de la conjugación es una función de la relación de reactivo-proteína, la temperatura de reacción y el pH de la reacción del amortiguador de reacción. Se dan abajo algunos ejemplos para ilustrar las condiciones óptimas de conjugación llevadas a cabo para identificar las condiciones óptimas de pH a fin de tener parámetros reproducibles del control del proveso para reacciones de conjugación. Los resultados (figura 3) mostraron que la reacción de conjugación a A/3 5 mer (DAEFRC) (SEQ ID NO: 1) así como a A/3 7 mer (DAEFRHDC) (SEQ ID NO: 2) dependen del pH y producen un mayor grado de modificación/conjugación cuando aumenta el pH de la condición de reacción. Utilizando la sal de TFA de péptidos de 5 mer y 7 mer, se evaluó el grado de conjugación a un pH de 9.0 con cantidades variables de carga de péptido (Figura 4) . Es evidente a partir de estos resultados que los conjugados de péptido con un número definido de copias de péptido por molécula de CRM pueden generarse variando la relación de péptido/CRM activado durante el proceso de conjugación. Se llevaron a cabo experimentos similares utilizando sal de acetato del péptido A/3 de 7 mer. Para la conjugación de A/3 1-7/CRM, el proceso de tapa se evaluó comparando los moles de CMCA por CRM con los moles de CMC por CRM. Dado que el total del CMC y CMCA fue constante para cada péptido, relación de CRM probada, se presumió que el proceso de tapa se encontraba completo (Figura 5) . La modificación total en el conjugado permaneció entre 19 y 21, en comparación con el número de lisinas bromoacetiladas (Figura 5) . Estos experimentos se efectuaron con TFA como el contraión para el péptido. La conjugación de A/3 1-7/CRM se repitió utilizando la sal de acetato del péptido en lugar de la sal de TFA, y estos datos se muestran en la Figura 5 y 6. El proceso de tapa pareció completarse, permaneciendo el total del CMC y del CMCA para cada punto entre 20 y 22. Las condiciones para la reacción de conjugación de A/3-CRM se han optimizado a un pH de 9.0 siendo controlado el grado de conjugación por el péptido a la relación de CRM en la reacción. Al variar la relación de 0.1 a 1.5, el grado de conjugación puede variar (Figura 6) . El grado de activación y conjugación es una función de la relación de reactivo-proteína, la temperatura de la reacción y el pH del amortiguador de reacción. El grado de modificación (conjugación) para cada conjugado se calculó sustrayendo el valor de masa del CRM?97 activado del valor de masa de cada conjugado y dividiendo por la masa del péptido utilizado para preparar el conjugado. El grado de modificación (Conjugación) para todos los conjugados se describe en la Tabla 2. El grado de conjugación también se comparó con los valores determinados por la cantidad estimada de residuos de S-carboximetilcisteína formados por mol de CRM?97 (mostrados también en la Tabla 2) . Tabla 2 Grado de Modificación: Comparación de datos de MALDI-TOF y AAA EJEMPLO 6 Estudios de Inmunogenicidad de Conjugados de Péptido A/3 Se utilizaron péptidos que se extienden a los residuos de terminación N 1-5, 1-7, 1-9, y 1-12 de A/3 (con y sin la secuencia de enlace GAGAC) y el péptido que corresponde a la terminación N de A/3 en la secuencia inversa del aminoácido doce al aminoácido uno (1-12 mer en secuencia inversa) , cada uno conjugado a CRM?97, se utilizaron para inmunizar ratones conjuntamente con un péptido A/3 de 1-12 mer en una formulación con STIMULON™ QS-21. Cada grupo de ratones se inmunizó subcutáneamente con una dosis ya sea de 30 µg o 5 µg de una de las muestras formuladas con 20 µg del adyuvante STIMULON™ QS-21, al inicio del estudio (semana 0) y subsecuentemente en las semanas 3 y 6. El protocolo de estudio se ilustra en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 3, los péptidos que se extienden en residuos de terminación N 1-5, 1-7, 1-9 y 1-12 de Aß (con y sin la secuencia de enlace GAGAC) y el péptido que corresponde a la terminación N de Aß en la secuencia inversa del aminoácido doce al aminoácido uno (1-12 mer en secuencia inversa) , conjugados a CRM197, se utilizaron para inmunizar ratones conjuntamente con un péptido Aß de 12 mer en una formulación con QS-21. Cada grupo de ratones se vacunó subcutáneamente con una dosis ya sea de 30 µg o 5 µg de una de las muestras formuladas con 20 µg del adyuvante QS-21, al inicio del estudio (semana 0) y subsecuentemente en las semanas 3 y 6. Se utilizaron ratones Swiss Webster para el estudio entero con 5 ratones en cada grupo. Volumen de inyección = 100 µl; B = Sangrado; V = vacunado; E = exsanguinado . Se midieron las titulaciones anti Aß mediante ELISA contra Aß y CRM197 como se describe abajo. Brevemente, se recubrieron placas Costar de 96 pozos (# 3591) durante la noche a temperatura ambiente con 2 µg/ml de Aß 1-42 en un amortiguador estéril de carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Las placas se vaciaron y se bloquearon durante dos horas a temperatura ambiente con 200 µl/pozo de BSA al 0.05% en IX de PBS/0.05% Tween 20. Las placas bloqueadas se vaciaron y se lavaron con un lavador de placas conteniendo TBS, amortiguador de lavado Brij al 0.1% (sin azida) . Todo el antisuero primario se diluyó serialmente con BSA al 0.05% en IX PBS conteniendo Tween 20/0.02% azida y 100 µl de cada dilución se transfirieron entonces a los pozos de placa apropiados y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas . Las placas se vaciaron/lavaron entonces como se describió anteriormente. Se diluyó anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IgG conjugado con fosfatasa alcalina de Southern Biotech (ciudad, estado) a 1:1000 con BSA al 0.05% en PBS conteniendo Tween al 0.05% 20/0.02% azida y 100 µl se agregaron a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se vaciaron/lavaron entonces como se describió anteriormente y finalmente se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µl/pozo de una solución de 1 mg/ml de substrato de p-nitrofenil fosfato preparado en dietanolamina/MgCl2, pH 9.8. El revelado de color se detuvo con la adición de 50 µl/pozo de 3 N de NaOH. Las placas se leyeron a 405 nM con una referencia de 690 nM. Las titulaciones de punto final se calcularon a un O.D. de 0.1 AU.
Tabla 3 Protocolo de Estudio de Inmunización de Ratón Ln 10 15 10 15 Tabla 3 Protocolo de Estudio de Inmunización de Ratón-Continuación 10 15 ELISA del CRM197 Se recubrieron placas Greiner de 96 pozos (# 650011) a 37 °C durante 90 minutos con 5.0 µg/ml (100 µl/pozo) de CRMi97 en amortiguador estéril de carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Las placas se vaciaron y se lavaron con un lavador de placas conteniendo IX TBS, amortiguador de lavado Brij al 0.1%. Todo el antisuero primario se diluyó serialmente con IX PBS conteniendo Tween al 0.3% 20/EDTA y 100 µl de cada dilución se transfirieron entonces a los pozos de placa apropiados y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Las placas se vaciaron/lavaron entonces como se describió anteriormente. Se diluyó anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IgG conjugado con fosfatasa alcalina de Southern Biotech a 1:1000 con IX PBS conteniendo Tween al 0.05% 20/0.02% azida y 100 µl se agregaron a cada pozo y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Las placas se vaciaron/lavaron entonces como se describió anteriormente y finalmente se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µl/pozo de una solución de 1 mg/ml de substrato de p-nitrofenil fosfato preparado en dietanolamina/MgCl2, pH 9.8. El revelado se detuvo con la adición de 50 µl/pozo de 3 N de NaOH. Las placas se leyeron a 405 nM con una referencia de 690 nM. Las titulaciones de punto final se calcularon a un O.D. de 0.1 AU. Las Tablas 4-6 ilustran las titulaciones ELSA de punto final contra Aß. después de la inmunización primaria, todos los ocho conjugados (excluyendo el control negativo) indujeron respuestas inmunes anti Aß IgG. Sin embargo, la dosis de 30 µg, pero no la dosis de 5 µg, de Aß dio una respuesta positiva en la semana 3 después de la inmunización primaria. Entre todos los conjugados, parece que el péptido Aß 1-7 conjugado sin enlazador emitió una respuesta tan buena o mejor que otros conjugados estudiados. A una dosis de 5 µg, el Aß 1-5 C funcionó mejor en las semanas 8-16. El Aß 1-7 C fue mejor a una dosis de 30 µg. el análisis de las titulaciones de anticuerpo después de la segunda y tercera inmunización con una dosis ya sea de 5 o 30 µg, indican que la máxima respuesta inmune a Aß para la mayoría de los conjugados se observó después de la segunda inmunización. Al menos en ratones, la tercera inmunización no pareció aumentar la respuesta inmune. Sin embargo, el péptido Aß necesitó tres inmunizaciones con la dosis de 30 µg para alcanzar la máxima respuesta contra el péptido (Tabla 5) . En términos de disminución del anticuerpo durante un extenso período de tiempo, el nivel de anticuerpo de los grupos inmunizados con conjugados se redujo por 2 a 3 veces en comparación con el más alto nivel dentro de ese grupo. Se analizaron muestras individuales de las semanas 6 y 8 para calcular los GMTs contra Aß para cada uno de los grupos (Tabla 6) para observar si algún grupo de conjugados fue sustancialmente mejor que los otros. El análisis estadístico de las titulaciones en la semana 6 de los conjugados de A/3 1.5 C, A/3 1-7 C y A/3 1-9 C, indicó que el conjugado de A/3 1-7 indujo una titulación significativamente mayor. también es evidente a partir de este experimento que la secuencia de enlace GAGAC no contribuyó a aumentar la respuesta inmune al péptido.
Tabla 4 i I—" O h-1 I 10 Tabla 4. Semanas 0, 3, 6, 8, 13 y 16 títulos de punto final ELISA contra Aß que utiliza antisuero desde 5 µg de dosis de la longitudes que varían de los intervalos de 15 los conjugados de péptido de la N-terminal del péptido Amiloide Aß, Ref: Elan policlonal hiperinmune #592=3,073,307. Punto final en O.D. 0.1 de ratones AU. Swiss Webster inmunizados SC-N con 5 µg de los antígenos anteriores formulados con 20 µg de STIMULON™ QS-21 en las semanas 0, 3 y 6.
Tabla 5 o 10 Tabla 5. Semanas 0, 3, 6, 8, 13 y 16 títulos de punto final ELISA contra Aß que 15 utiliza antisuero desde 30 µg de dosis de la longitudes que varían de los intervalos de los conjugados de péptido de la N-terminal del péptido Amiloide Aß, Ref: Elan policlonal hiperinmune #592=3,073,307. Punto final en O.D. 0.1 de ratones AU. Swiss Webster inmunizados SC-N con 30 µg de los antígenos anteriores formulados con 20 µg de STIMULON™ QS-21 en las semanas 0, 3 y 6.
Tabla 6 Tabla 6. Semanas 6 y 8 punto final de ELISA GMTs contra A/3 utilizando antisuero de 30 µg por dosis de conjugados de péptido que se extienden a longitudes variables de la terminación N de amiloide-A/3. Ref: Elan Hyperimmune Polyclonal #592 = 3,073,307. Punto final a O.D.. 0.1 AU. Se inmunizaron ratones Swiss Webster SC-N con 30 µg de los antígenos anteriores formulados con 20 µg de STIMULON™ QS-21 en las semanas 0, 3 y 6 a. El análisis estadístico de las titulaciones de la semana 6 de 1-5C, 1-7C, y 1-9C utilizando Tukek-Kramer muestra una diferencia estadística entre 1-5C vs 1-7C solo, mientras que el análisis utilizando prueba Student's T muestra una diferencia estadística entre 1-5C vs 1-7C y 1-5C vs 1-9C. b. El análisis estadístico de las titulaciones de la semana 8 de 1-5C, 1-7C, y 1-9C no muestra una diferencia estadística entre los tres grupos. Sin embargo, ahí parece haber una tendencia que puede indicar una diferencia entre 1-5C vs 1-7C. Coloración PDAPP de Tej ido Cerebral de Ratón El análisis de coloración PDAPP de tejido cerebral proporciona una indicación de la funcionalidad de los conjugados de péptido A/3 y/o antisuero A/3 1-42. Las muestras de suero de grupos de ratones individuales se analizaron por separado para su capacidad de reconocer placas de tej ido cerebral de ratón PDAPP que contienen péptido amiloide. Los resultados se muestran en la Tabla 7A y 7B. Con la excepción del antisuero de conjugado de A/3 5 mer, hubo una respuesta en relación a la dosis para reconocer las placas. Independientemente del enlazador, 30 µg de antisuero inducido por conjugado tuvieron mejores patrones de reactividad en comparación con la del antisuero de conjugado de AjS 5 mer. Sin embargo, con el antisuero de conjugado de A/3 5 mer, parece haber una reactividad similar o mejor para el grupo de 5 µg. Comparando todos estos resultados, se concluye que los conjugados producidos de Aß 1-5 mer a AjS 1-9 mer son suficientes para producir placas que reconocen la respuesta inmune en ratones y la presencia de enlazador no es esencial.
- Las siguientes conclusiones pueden tomarse de este estudio : (a) Todos los conjugados de péptido indujeron antisuero de alta titulación contra la proteína vehículo CRM?97 a niveles iguales o ligeramente mas altos en comparación con el control CRM197 no conjugado (no mostrado) . (b) Los conjugados con el enlazador GAGAC no aumentaron la inmunogenicidad o funcionalidad en comparación con conjugados sin el enlazador. (c) Los datos de inmunogenicidad y la coloración PDAPP de tejido cerebral (una indicación inicial del anticuerpo funcional) muestran que los conjugados de Aß 1-5 mer y Aß 1.7 mer parecieron ser los inmunógenos preferidos para desarrollo posterior. Tabla 7A. Coloración PDAPP de tejido cerebral de ratón - Todo el antisuero se diluyó 1:1000 para el procedimiento de coloración. - 7 To o e ant suero se uyó 1:1000 para e proce m ento e coloración.
EJEMPLO 7 Estudios de Inmunogenicidad en Monos Grupos de 6 monos recibieron 30 µg de conjugado 7 mer (conjugado total) con adyuvante ya sea STIMULON™ QS-21, alum o formulación RC529 SE en los días 0, 29, y 58. Los grupos adicionales incluidos fueron 30 µg de conjugado 5 mer ya sea con alum (Al (0H3) o RC529 SE, y 75 y 300 µg de Aß con STIMULON™ QS-21 como controles positivos. Los controles positivos fueron inmunizados cada dos semanas. En el día 36 y 64 se determinaron las titulaciones de anticuerpo anti-Aß (Figuras 7-9) . En el día 36, los conjugados 7mer/CRM con STIMULON™ QS-21, Alum y RC529 SE emitieron titulaciones GMT de 10110, 13330 y 17090 respectivamente (Figura 7) . En contraste, el Aß 1-42 más STIMULON™ QS-21, emitió GMTs de 223 y 1734 a niveles de dosis de 75 y 300 µg, respectivamente.
El conjugado Aß 5 mer emitió una titulación de 2134 con alum y 15980 con RC529 SE. En el día 64, i.e., después de 3 dosis de conjugados ya sea con STIMULON™ QS-21 o RC-529 SE indujeron titulaciones sustancialmente mayores que posterior a la segunda dosis (GMTs 69910 para 7mer/RC-529 SE; 21640 para Aß 5mer/RC-529 SE y 30310 para AjS 7mer/STIMULON™ QS-21) (Figura 8) . Los conjugados con alum emitieron titulaciones reducidas posterior a la tercera inmunización en comparación con las posteriores a la segunda inmunización. Parece que el conjugado AjS 7mer emitió una mejor respuesta en comparación con el conjugado Aß 5 mer. En monos, el conjugado AjS 7 mer con adyuvante RC-529 SE o STIMULON™ QS-21 emitió la respuesta más alta (Figura 9) . La respuesta al conjugado A/3 7 mer con alum fue moderada y similar a la de 300 µg de A/3 1-42 con STIMULON™ QS-21. Pueden tomarse diversas conclusiones del presente ejemplo. Primero, ambos conjugados son muy inmunogénicos en especies de primate. Segundo, la presencia de adyuvantes en la formulación de inmunización influye significativamente la respuesta inmune. Tercero, excepto por el adyuvante de aluminio, RC-529 SE y STIMULON™ QS-21 aumentan la respuesta inmune después de cada dosis de inmunización al menos hasta tres dosis (Figuras 9) . El conjugado A/3 7 mer total indujo una mayor respuesta inmune en presencia de 529, seguido por STIMULON™ QS-21 (ver Figura 9) .
EJEMPLO 8 Preparación de Múltiples Conjugados de Péptido Antigénico (MAP) y sus Estudios de Inmunogenicidad Se encuentran disponibles diversos métodos para generar múltiples sitios antigénicos en los vehículos . En los ejemplos previos, cada sitio antigénico se conjuga por separado al vehículo mediante conjugación definida y químicas de tapado. En este ejemplo, se construyen múltiples sitios antigénicos mediante síntesis de fase sólida o repeticiones en serie de A/3 1-7 mer. Alternativamente, estas repeticiones en serie pueden acoplarse con epítopes de célula T con o sin enlace a través de un núcleo lisina como se describe en todas partes. Estos múltiples péptidos antigénicos se sintetizaron con un residuo cisteinil adicional para conjugación a la proteína vehículo. SE sintetizaron los péptidos conteniendo una unidad de repetición (1-7) , tres unidades de repetición (1-7) 3 y cinco unidades de repetición (1-7) 5 con un residuo cisteinil adicional en el extremo carboxilo. Estos péptidos se unieron covalentemente a CRM bromoacetilado durante la noche a través de sus residuos cisteína de terminación C. La reacción se llevó a cabo a un pH 9.0-9.2 con relaciones de péptido: CRM agregadas como se señaló en la Tabla 8. Los grupos bromoacetilo que no reaccionaron con el péptido, se taparon con N-acetilcisteamina. Estos lotes representan conjugados que contienen una sola copia, tres copias en serie y cinco copias en serie del péptido jS 1-7 conjugado a CRM, respectivamente. La Tabla 8 señala brevemente las propiedades de las muestras . Tabla 8 Múltiples Muestras de Conjugado de Péptido Antigénico (MAP) La carga del péptido (el número promedio de péptidos Aß 1-7 por vehículo) y los números de tapa (Tabla 9) son los números de aminoácidos únicos (CMC u CMCA) por vehículo como se determinó por el análisis de aminoácido. Los valores CMC y CMCA se refirieron a lisina. Tabla 9 Grado de Conjugación Y tapa de Cada Conjugado Se inmunizaron ratones Swiss Webster (10 por grupo) subcutáneamente con 1 o 0.1 µg de péptido conjugado de Ajß/CRM. La mitad de los ratones se inmunizaron con la composición formulada con 100 µg del adyuvante Al(OH)3, y la mitad se inmunizaron sin adyuvante. Las inmunizaciones se programaron en las semanas 0 y 3. Se programaron sangrados para las semanas 0, 3 y 6. Las muestras de suero se analizaron para su respuesta de anticuerpo contra el péptido A/3 1-42 mer. Los resultados se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10 Titulaciones de Punto final Anti-A/3 para Múltiples Conjugados de Péptido Antigénico (MAP) Todos los conjugados indujeron titulación del anticuerpo anti-A/3 1-42 después de la inmunización primaria y los niveles aumentaron sustancialmente después de la dosis de refuerzo. En ausencia del adyuvante de aluminio, las diferencias en la respuesta a la dosis fueron evidentes en los sangrados tanto de la semana 3 como de la semana 6. La dosis más alta emitió alta titulación de respuesta anticuerpo. El adyuvante de aluminio emitió una respuesta de anticuerpo sustancialmente mayor en la semana 3 en ambos niveles de dosis (0.1 y 1 µg) en comparación con los grupos sin adyuvante. Después de la inmunización secundaria, los conjugados dados a una dosis de 1 µg emitieron un incremento de 5 a 10 veces en los niveles de anticuerpo. A este nivel de dosis los conjugados de péptido con 3 y 5 repeticiones indujeron más alta respuesta de anticuerpo que un conjugado conteniendo una sola repetición. También se determinaron las titulaciones del vehículo CRM y estas se listan en la Tabla 11. Tabla 11 Titulaciones de Punto final Anti-CRM para Múltiples Conjugados de Péptido Antigénico (MAP) Los animales se inmunizaron en las semanas 0 y 3 y se sangraron en las semanas 0, 3 y 6. Adyuvante: 100 µg Al (OH) 3 o ninguno. ND = no determinado. Los datos en la Tabla 11 indican que los grupos sin adyuvante indujeron niveles muy bajos de respuesta de anticuerpo anti-CRM a niveles de dosis tanto de 1 µg como de 0.1 µg incluso después de dos inmunizaciones. Sin embargo, los conjugados con adyuvante de hidróxido de aluminio indujeron niveles sustanciales de respuesta de anticuerpo anti-CRM a una dosis de 1 µg y una respuesta mucho más baja a una dosis de 0.1 µg. en presencia del adyuvante, las titulaciones CRM fueron más altas para el conjugado de una sola repetición, intermedias para el conjugado de tres repeticiones, y más bajas para el conjugados de cinco repeticiones. Esto se espera, dado que la dosis de CRM por dosis de péptido es más baja para AjS (1-7)S/CRM, y más alta para A/3 (1-7)X/CRM. Las diferencias fueron significativas solo estadísticamente en la semana 6 para la dosis de 0.1 µg. El objetivo de la presente invención es producir una alta titulación de la respuesta inmunogénica contra el hapteno antigénico y no necesariamente contra la proteína vehículo. Bajo ciertas circunstancias, es deseable producir una óptima respuesta inmune contra la determinante antigénica de hapteno con poca o ninguna respuesta inmune contra la proteína vehículo. Para tales aplicaciones, los conjugados con repeticiones en serie de múltiples determinantes antigénicas con formulación sin adyuvante cubrirán las necesidades . EJEMPLO 9 Preparación de Conjugados de Péptido Aß con Diversas Proteínas Vehículo y sus Inmunogenicidades Este ejemplo compara la inmunogenicidad de conjugados utilizando ser diferentes proteínas vehículo. La sal de acetato de A/3 1-7 se agregó a vehículos bromoacetilados en una relación de 1:1 por peso a un pH 9. Todos los conjugados excepto A/3 l-7/rC5ap se taparon con N-acetilcisteamina. Todos los vehículos alternativos son proteínas bacteriales recombinantes, incluyendo CRM /toxoide de difteria) , peptidasa C5a recombinante (rC5ap; clonada de Streptococcus galactiae, incluye mutaciones D130A y S512A) , ORFs 1224, 1664, 2452 (todos clonados de Streptococcus pyogenes) , y T367, T858 (cada uno clonado de Chlamydia pneumoniae) . En la Tabla 12 se encuentra un resumen de los vehículos utilizados. El grado de conjugación y tapa de cada conjugado jS 1-7 a estos vehículos se presenta en la Tabla 13. Este estudio mostró que el conjugado de peptidasa C5a recombinante indujo mayores titulaciones contra A/3 que la mayoría de los otros vehículos analizados, incluyendo CRM. Esta diferencia fue estadísticamente significativa para las titulaciones de la semana 6 de grupos que recibieron hidróxido de aluminio. Además, el conjugado AjS 1-7/1858 fue significativamente más inmunogénico que la mayoría de otros conjugados en ausencia de adyuvante. El único conjugado que tuvo un bajo desempeño en relación al conjugado de control CRM fue AjS 1-7/T367, un conjugado que tampoco reaccionó con anticuerpo monoclonal específico para Aß mediante inmunoanálisis Western. Este estudio confirma que otros numerosos vehículos pueden utilizarse con éxito para inmunizar contra el péptido AjS. Tabla 12 Lista de Propiedades de 5 Vehículos y Conjugado PROTEÍNA VEHÍCULO MW del vehículo # de lisinas (Da) CRM 58,408 39 RC5ap 108,560 85 - - Tabla 13 Grado de Conjugación y Tapa de Cada Conjugado Resultados de conjugación: Carga de péptido (el número promedio de péptidos A/3 1-7 por vehículo) y número de tapado, son los números de aminoácidos únicos (CMC o CMCA) por vehículo determinado por análisis de aminoácido. Los valores CMC y CMCA se refirieron a lisina. Resultados de Inmunización La titulación media geométrica para cada grupo en este estudio se lista en la Tabla 14. En la semana 3, sin importar la presencia de adyuvante, el AjS l-7/rC5ap indujo titulaciones significativamente más altas anti- A/3 que los conjugados correspondientes preparados con Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664, 2452, o Chlamydia pneumoniae ORFs T367 y T858. En la semana 3 en ausencia de adyuvante, el A/3 l-7/rC5ap también fue más inmunogénico que todos los otros conjugados excepto Aß 1-7/T858. El conjugado T858 sin AL (OH) 3 indujo más altas titulaciones que los conjugados de 0RF1224, ORF1664, 0RF2452 y CRM sin adyuvante. El único conjugado que fue significativamente menos inmunogénico que Ajß 1-7/CRM fue A/3 1-7/T367 (p<0.00002). el vehículo T367 tuvo un bajo desempeño con o sin adyuvante en ambas semanas 3 y 6. En la semana 6, el conjugado rC5ap con hidróxido de aluminio fue más inmunogénico (p<0.04) que todos los otros conjugados excepto AjS 1-7/0RF2452. En ausencia de adyuvante, tanto A/3 l-7/eC5ap como jS 1-7/T858 indujeron titulaciones significativamente más altas que los conjugados de ORF1224, 0RF1664 o T367. El Aß 1-7/CRM sin hidróxido de aluminio indujo titulaciones más altas que ya sea Aß 1-7/ORF1664 o Aß 1-7/T367. Tabla 14 Titulaciones de Punto final de Anti- A3 1-42 Los animales se inmunizaron en las semanas 0 y 3 y se sangraron en las semanas 0, 3 y 6. La dosis se basa en la cantidad total de conjugado. Adyuvante: 100 µg Al (OH) 3 o ninguno . EJEMPLO 10 Preparación de Conjugados Adicionales de Péptido AjS-Proteína I . Activación Se disolvió CRM197 congelado (8 ml, 59.84 mg, a 7.48 mg/ml) en 0.1 M de amortiguador de borato (pH 9, 3.968 ml) para conducir la concentración a 5 mg/ml . La solución se enfrió en un baño de hielo a 0.5°C. Se disolvió N-hidroxisuccinimida (59.9 mg) (Aldrich-Sigma) en DMF (100 µl) (Aldrich-Sigma) y se agregó por goteo a la solución de CRMX97. A la adición de ácido bromoacético de N-hidroxisuccinimida, se observó un precipitado. Cuando se verificó el pH, disminuyó a un pH 6. El pH de la mezcla de reacción se regresó a un pH 9 agregando más 0.1 M amortiguador de borato . La mezcla de reacción se agitó entonces a 4°C durante 1 hora con agitación suave. La mezcla se purificó y se concentró utilizando concentración centrífuga centriprep YM-10 y se repurificó en Sephadex G-25 utilizando 10 mM de borato como eluyente. Las fracciones positivas al reactivo Bradford se depositaron y se concentraron utilizando centriprep YM-10. Se determinó el grado de bromoacetilación mediante análisis Bradford (lineal) . Se encontró que la concentración fue de 5.36 mg/ml (produjo 30 mg) . La concentración final se ajustó entonces para ser 5 mg/ml y se almacenó en el congelador en sucrosa al 5% hasta su uso posterior. II . Conjugación Para cada conjugación se utilizó CRM?97 bromoacetilado congelado. Los péptidos se disolvieron en amortiguador de borato (2.5 mg en 125 ml de 0.1 M de amortiguador de borato) . Se observó una ligera insolubilidad con los péptidos A/3 KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ ID NO : 48), y LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50) . El CRM197 bromoacetilado se trató con las soluciones/suspensiones de péptido. La relación de péptido y proteína en la mezcla fue de 1:2. Se observó turbiedad en las mezclas de conjugado con los péptidos KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48), y péptidos KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45). Las mezclas se verificaron entonces para el pH (pH 9) y se incubaron a 4°C durante la noche con agitación lenta. Las concentraciones finales de las mezclas se prepararon a 3 mg/ml antes de la incubación. La turbiedad de las mezclas de conjugado con los péptidos CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), y LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50) desaparecieron después de la incubación. Sin embargo, KLVFFAEDC (SEQ ID NO : 45), y CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48) fueron aún ligeramente turbias. El conjugado de proteína falsa soluble también se preparó con cisteamina a una relación de 1:1 (peso/peso). Se obtuvieron péptidos sintetizados de BIOSOURCE con una pureza de aproximadamente 95%. Octámeros LVFFAEDVC (SEQ ID NO : 44) KLVFFAEDC (SEQ ID NO : 45) VFAAFAEDVGC (SEQ ID NO : 43) CLVFFAEDV (SEQ ID NO : 47) CKLVFFAED (SEQ ID NO : 48) CVFFAEDVG (SEQ ID NO : 46) Heptámeros VFFAEDVC (SEQ ID NO : 49) LVFFAEDC (SEQ ID NO : 50) . III . Tapa de Grupos Lisina sin reaccionar en Proteína: Las usinas no reactivadas se taparon con N-acetilcisteamina (CMCA: Aldrich-Sigma) a una relación de 1/1 (peso/peso) durante 4 horas a 4°C mientras se reposó en la oscuridad. Los péptidos sin reaccionar y los reactivos de tapa se retiraron de los conjugados mediante diálisis utilizando un cásete Slide-A-Lyzer (Mw corte 10,000) (Pierce) contra amortiguador PBS (2 1) durante la noche (13 horas) . El intercambio de amortiguador y la diálisis se efectuaron dos veces (2 x 14 horas) . Se observó una ligera insolubilidad en los conjugados con péptidos KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45) y CKLVFFAED (SEQ ID NO : 48) . Todos los conjugados se almacenaron en el refrigerador a 4°C en un preservativo. IV. Caracterización del Vehículo Proteína: Se utilizó MALDI-TOF MS para determinar la masa del CRM197 bromoacetilado y la masa del conjugado falso de N-acetilcisteamina-CRM?97. En base a las masas de CRM197 y CRM?97 bromoacetilado se modificaron 11 residuos de lisina. (59941.46-58590.29) /122 = 11 en donde, el Mw de CRM197 es 58624.29 el Mw de CRM197 bromoacetilado es 59941.46 el Mw de bromoacetato es 122. El grado de bromoacetilación fue de más de 28%. (El número total de usinas en CRM197 fue de 39) . De estos 11 residuos de lisina modificados, 10 se acoplaron con cisteamina. La eficiencia de acoplamiento fue de 90% . (61143-59941) /119 = 10 en donde el Mw del CRM197 bromoacetilado es 59941.46 el Mw del conjugado falso es 61143 el Mw de N-acetilcisetamina es 119 (10/11) x 100 = 90 V. Caracterización de los Conjugados de Péptido-Proteína mediante Inmunoanálisis Western SDS-PAGE con Gel de Pre moldeado de Tris-Tricina: Los conjugados de proteína-péptido se analizaron mediante inmunoanálisis Western. Las rutas son: marcador (ruta 1); L-28375 24/01 (ruta 2); L-28375 24/02 (ruta 3); L.28375 24/03 (ruta 4); L-28375 24/04 (ruta 5); L-28375 24/05 (ruta 6) ; L-28375 24/06 (ruta 7) ; L.28375 24/07 (ruta 8) ; L- 28375 24/08 (ruta 9) ; L-28375 24/09 (Falso) (Ruta 10) ; y BrAcCRM?97 (ruta 11) . Se utilizó un anticuerpo monoclonal específico del péptido de ratones (248-6H9-806 Ajß 17-28) como el anticuerpo primario (antisuero) (se encontró que una dilución de 1:3000 fue la mejor) . El IgG de cabra anti-ratón (H + L) -HPR fue el anticuerpo secundario (dilución 1:1000) . Se observó que todos los conjugados fueron reconocidos por el anticuerpo primario, excepto el conjugado falso y el CRM?97 activado. (Ver Figura 10) . Concentración de Proteína Las concentraciones de proteína de las muestras de conjugado se determinaron mediante el análisis Pierce BCA. (Ver Tabla 15) .
Análisis de Aminoácido El análisis de aminoácido se llevó a cabo para determinar el grado de conjugación. El grado de conjugación se calculó en base a los residuos CMCA (carboximetilcisteamina) encontrados en los conjugados. Se utilizó CMCA para tapar los sitios activados sin reaccionar después de la conjugación con los péptidos (Ver Tabla 15) .
Tabla 15 Grado de Conjugación de Péptidos con BrAcCRM197 Todos los análisis colorimétricos se llevaron a cabo utilizando espectrofotómetro de microplaca y SOGTmax Pro. EJEMPLO 11 Estudios Inmunogénicos de Conjugados de Péptido AjS en Ratones Swiss Webster Se inmunizaron ratones Swiss Webster criados, con VFAAFAEDVGC (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDVC (SEQ ID NO: 44), KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDVC (SEQ ID NO : 49), LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50) cada una conjugada a CRM?97 o con A/3 1-7 CRM?97 todas formuladas con el adyuvante RC 529 SE. Nueve grupos de 10 animales por grupo se inmunizaron subcutáneamente con uno de los conjugados de péptido AjS al inicio del estudio (semana 0) y subsecuentemente en la semana 4. El suero se colectó previo a, pero en los mismos días que la inmunización. Estudios inmunogénicos de Conjugados de Péptido AjS en Ratones Balb/c criados Se inmunizaron ratones criados Balb/c como en el párrafo precedente, pero también se reforzaron con conjugado y adyuvante en la semana 12. Resultados El suero de ambos estudios se colectó para análisis de titulación de anticuerpo IgG específico del péptido Ajß13_28. El suero de ratones Balb/c también se colectó para análisis un día antes del refuerzo de la semana 12 , y una semana después. Se evaluaron células de bazo de animales utilizados en el Ejemplo 11 por su potencial para responder a la estimulación in viro con un depósito sobrepuesto de péptidos extendidos A/3?-42, de longitud total AjS?_42, CRM197 o activadores policlonales. El análisis se comprende de lectura Eliispot para interleucinas 4 y 5, e interferón-gama. Al completarse, los conjugados de péptido A/3 se evalúan como se describió anteriormente y como se describe en el Ejemplo 6. EJEMPLO 12 Estudios Inmunogénicos de Conjugados de Péptido AjS en Ratones PSAPP Se inmunizaron ratones PSAPP, con VFAAFAEDVGC (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDVC (SEQ ID NO : 44), KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDVC (SEQ ID NO: 49), LVFFAEDC (SEQ ID NO : 50) . El ratón PSAPP, un ratón doblemente transgénico (PSAPP) que sobreexpresa transgenes APP y PSI, se describe en Holcomb et al., (1998) Nature Medicine 4:97-11. Estudios Inmunogénicos de Conjugados de Péptido AjS en Ratones PDAPP Se inmunizaron ratones PDAPP, con VFAAFAEDVGC (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDVC (SEQ ID NO : 44), KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDVC (SEQ ID -NO: 49), LVFFAEDC (SEQ ID NO : 50) . El ratón PDAPP, expresa una forma mutante de APP humana (APPV71F) y desarrolla la enfermedad de Alzheimer a una temprana edad (Bard et al., (2000) Nature Medicine 6:916-919; Masliah E. et al., (1996) J. Neurosci. 15:16(18) :5795-811) . Resultados El suero de ambos estudios se colectó para análisis de titulación de anticuerpo IgG específico del péptido Ajß13_28. Al completarse, los conjugados de péptido A/3 se evalúan como se describió anteriormente y como se describe en los Ejemplos 6 y 11, así como en el análisis de condicionamiento de temor contextual (CFC) . El condicionamiento de temor contextual es una forma común de aprendizaje que es excepcionalmente confiable y rápidamente adquirido en la mayoría de los animales, por ejemplo, mamíferos. Los animales de prueba aprenden a temer un estímulo y/o ambiente neutral previamente debido a su asociación con una experiencia de aversión. (ver e.g., Fanselow, Anim, Learn. Behav. 18:264-270 (1990); Wehner et al., Nature Genet . 17:331-334, (1997); Caldarone et al., Nature Genet. 17:335-337 (1997)). El condicionamiento de temor contextual es especialmente útil para determinar la función cognitiva o disfunción, e.g., como resultado de enfermedad o trastorno, tal como una enfermedad o trastorno neurodegenerativo, una enfermedad o trastorno relacionado con AjS, una enfermedad o trastorno amiloidogénico, la presencia de una función cognitiva que efectúa una alteración genética desfavorable (e.g., mutación genética, rompimiento de gen, o genotipo no deseado), y/o la eficacia de un agente, e.g., un agente de conjugado A/3, en la capacidad cognitiva. En consecuencia, el análisis CFC proporciona un método para probar y/o validar independientemente el efecto terapéutico de agentes para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno cognitivo, y en particular, una enfermedad o trastorno que afecta una o más regiones del cerebro, e.g., el hipocampo, subiculum, corteza cingulada, corteza prefrontal, corteza peririnal, corteza sensorial y lóbulo temporal medio. Típicamente, el análisis de CFC se lleva a cabo utilizando cámaras estándar para animal y el empleo de entrenamiento que comprende un choque suave (e.g., 0.35 mA choque en el pie) conjuntamente con una auditoría (e.g., un período de 85 db de ruido blanco), clave olfatoria (e.g., extracto de almendras y limón), de tacto (e.g., textura del piso de la jaula), y/o visual (ráfaga de luz) . La respuesta a la experiencia de aversión (choque) es típicamente de congelamiento (ausencia de movimiento excepto por la respiración) pero también puede incluir parpadeo, o cambio en el reflejo de la membrana de nicitación, dependiendo del animal de prueba seleccionado. La respuesta de aversión se caracteriza comúnmente en el primer día de entrenamiento para determinar una línea base para temor incondicional, con resultados de aversión en los subsecuentes días de prueba, e.g., congelación en presencia del contexto y/o clave pero en ausencia de la experiencia de aversión, caracterizados como temor condicionado de contexto y clave, respectivamente. Para confiabilidad mejorada, los animales de prueba se prueban típicamente por separado por técnicos independientes y se marcan al paso del tiempo. Los detalles experimentales adicionales pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en Crawley, JN, What's Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000) . Los animales de prueba ejemplares (e.g., animales modelo) incluyen animales (e.g., roedores o primates no humanos) que exhiben síntomas prominentes o patología característica de un trastorno amiloidogénico tal como de Alzheimer. Los modelos animales pueden crearse criando selectivamente o pueden fabricarse genéticamente utilizando técnicas transgénicas muy conocidas en la técnica, de manera que una alteración genética objetivo (e.g., una mutación genética, rompimiento del gen) en un gen asociado con el trastorno de demencia, conduce a la expresión aberrante o función del gen objetivo. Por ejemplo, se encuentran disponibles diversas especies de ratón transgénico que sobreexpresan APP y desarrollan patología de placa amiloide y/o desarrollan déficits cognitivos característicos de la enfermedad de Alzheimer (ver, por ejemplo, Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94:1550 (1997); Masliah E. y Rockenstein E. (2000) J. Neural Transm. Suppl. 59:175-83). Alternativamente, el modelo animal puede crearse utilizando compuestos químicos (e.g., neurotoxinas , anestésicos) o técnicas quirúrgicas (e.g., ablación esterotácticas, axotomización, transección, aspiración) que abladen o de otra manera interfiere con la función normal de una región cerebral anatómica (e.g., hipocampo, amígdalas, corteza perorinal, núcleo septal medio, coeruleus locus, cuerpos mamalarios) o neuronas específicas (e.g., neuronas serotonérgicas, colinérgicas, o dopaminérgicas) asociadas con síntomas característicos o patología del trastorno amiloidogénico. En ciertas modalidades preferidas, el modelo animal exhibe un prominente déficit cognitivo asociado con aprendizaje o memoria además de la patología neurodegenerativa asociada con un trastorno amiloidogénico. Más preferentemente, el déficit cognitivo empeora progresivamente con el aumento de la edad, de manera que el progreso de la enfermedad en el modelo animal se iguala al progreso de la enfermedad en un sujeto que sufre del trastorno amiloidogénico. El acondicionamiento de temor contextual y otros análisis in vivo para probar la funcionalidad de los conjugados descritos en la presente pueden llevarse a cabo utilizando ratones tipo silvestre o ratones que tienen cierta alteración genética que conduce a daño en la memoria o modelos de ratón de enfermedad neurodegenerativa, e.g., enfermedad de Alzheimer, incluyendo modelos de ratón que despliegan niveles elevados de Aß soluble en el fluido cerebroespinal (CSF) o plasma. Por ejemplo, los modelos animales para la enfermedad de Alzheimer incluyen ratones transgénico que sobreexpresan la mutación "Swedish" de proteína precursora amiloide humana (hAPPswe; Tg2576) que muestran déficits de memoria dependientes de la edad y placas (Hsiao et al., (1996) Science 274:99-102). La funcionalidad in vivo de los conjugados descritos en la presente también puede probarse utilizando el ratón mutante PS-1, descrito en Duff et al., (1996) Nature 383, 710-713. Otros modelos transgénicos genéticamente alterados de enfermedad de Alzheimer se describen en Masliah E. y Rockenstein E. (2000) J. Neural Transm.. Suppl . 59: 175-83. En varios aspectos, los métodos de la invención comprenden la administración de un conjugado A/3 capaz de mejorar el conocimiento en un sujeto en donde el conjugado A/3 se ha identificado al utilizar un análisis adecuadamente predictivo de la eficacia inmunoterapéutica en el sujeto. En modalidades ejemplares, el análisis es un análisis de modelo animal basado, al menos en parte, en la comparación del conocimiento como se determina a partir del estudio de condicionamiento de temor contextual de una animal después de la administración de un reactivo de prueba inmunológica al animal, en comparación con un control adecuado. El análisis CFC evalúa los cambios en cognición de un animal (típicamente un ratón o rata) al tratarse con un compuesto potencial terapéutico. En ciertas modalidades, el cambio en cognición evaluado es una mejora en el estado de daño a la memoria o reversión del déficit de memoria. En consecuencia, el análisis CFC proporciona un método directo para determinar el efecto terapéutico de agentes para prevenir o tratar enfermedad cognitiva, y en particular, una enfermedad o trastorno que afecta una o más regiones del cerebro, e.g., el hipocampo, subiculum, corteza cingulada, corteza prefrontal, corteza pririnal, corteza sensorial, y lóbulo temporal medio. Tales análisis CFC se tratan en la Solicitud de Patente copendiente de E.U. Serie No. 60/XXX,XXX titulada "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" (conteniendo la minuta del abogado No. ELN-058-1) , presentada en Diciembre 15 de 2004, y la Solicitud de Patente Serie No. 60/XXX,XXX titulada "Contextual Fear Conditioning for Predicting Immunotherapeutic Efficacy" (conteniendo la minuta del abogado No. ELN-058-2) , cuyos contenidos se incorporan en la presente por la referencia. BIBLIOGRAFÍA Bernatowicz, M.S., y Matsueda, G.R. , (1986) Analytical Biochemistry 155:95-102.
Kniskern, P.J., y Marburg, S. (1994) Development and Clinical Uses of Haemophilus b Conjúgate Vaccines: Conjugation: Design, Chemistry, and Analysis, Ellis R.W. , y Granoff, D.M. Eds.; Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 37-70 Arrizon V., Biechler, R. , Cummings, J. , y Harbaugh, J. (1991) High-Perormance Liquid Chromatography of Péptide and Proteins: Separation, Analysis, and Conformation, Mant, C.T., and Hodges R.S., Eds., CRC Press; Boca Ratón, FL, 859-863. Carlsson, J. et al., (1978) Biochem J. 173:723. Means, G.E., Cangdon, W.I., y Bender, M.I. (1972) Biochemistry 11: 3564-3574. Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131 Hardy (1984) Trends in Neurosciences 20: 1131. Hardy (977) Trends in Neurosciences 20:154. Stoute et al., (1997) N. Engl. J. Med. 336:86-91. Goebel et al., (1939) J. Exp. Med. 69:53. Schneerson et al., (1980) J. Exp. Med. 152; 361-376 Chu et al., (1983) Infect . Immun. 40:245. Schneerson et al., (1984) Infect . Immun. 45: 582- 591. Anderson et al., (1985), J. Pediatr. 107:346 Insel et al., (1986) J. Exp. Med. 158: 294 Patente de E.U. No. 4,673,574 Jun, 1987 Anderson Patente de E.U. No. 4,902,506 Feb., 1990 Anderson et al Patente de E.U. No. 5,192m540 Mar., 1993 Kuo et al. Patente de E.U. No. 5,306,492 Apr. , 1994 Porro Patente de E.U. No. 5,360,897 Nov., 1994 Anderson et al . Patente de E.U. No. 5,785,973 Jui., 1998 Bixler et al. Patente de E.U. No. 6,361,777 Mar, 2002 Hoogerhout Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H. P. Press, NY 2d ed. , 1989) Bernatowicz M.S. y Matsueda, G.R. (1986) Analytical Biochemistry 155, 95-102, Kniskern, P.J., y Marbug, S. (1994) Development and Clinical Uses of Haemophilus b Conjúgate Vaccines: Conjugation: Design, Chemistry, e Analysis Ellis, R.W. y Granoff, D.M., Eds; Marcel Dekker, Inc : Nre York, NY 37-70 Arrizon, V. Biehler, R. , Cummings J. , y Harbaugh, J. (1991) High Performance Liquid Chomatography of Peptide and Proteins: Separation, Analysis, and Conformation Mant, C.T. y Hodges, R.S. Eds : CRC Press : Boca Ratón, FL, 859-863.

Claims (37)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para conjugar un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo mediante un grupo reactivo de un residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido a un vehículo de proteína/polipéptido que tiene uno o más grupos funcionales, comprendiendo el método las etapas de: (a) derivar uno o más de los grupos funcionales del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente a un enlazador de polipéptido unido al vehículo de proteína/polipéptido para generar un vehículo derivado con sitios reactivos ; (b) hacer reaccionar el vehículo proteína/polipéptido derivado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un aminoácido del inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo bajo condiciones de reacción tales que el inmunógeno de péptido se conjuga al vehículo proteína/polipéptido derivado mediante al menos uno de los sitios reactivos, formando así un conjugado; y (c) hacer reaccionar adicionalmente el conjugado con un reactivo de tapa para inactivar los sitios libres reactivos sin reaccionar en el vehículo de proteína/polipéptido derivado, con lo cual el conjugado produce una respuesta inmune deseada contra el péptido Aß.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano, hemocianina de lapa californiana (KLH) , moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, hemaglutinina de influenza, polipéptido PADRE, proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg19.28) , Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis, toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRM197 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes 0RF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas.
  3. 3. El método de la reivindicación 2 , en donde el vehículo de proteína/polipéptido es CRM197.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde el inmunógeno de péptido es un fragmento Aß.
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo que consiste de Aß 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42.
  6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el fragmento Aß es Aß 1-
  7. 7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde el grupo funcional de una o más moléculas de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido o del enlazador de polipéptido opcionalmente unido se deriva utilizando un reactivo de reticulación.
  8. 8. El método de la reivindicación 7 en donde el vehículo de proteína/polipéptido se hace reaccionar con un agente de haloacetilación.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde el reactivo de tapa que se utiliza para inactivar los grupos funcionales reactivos libres del vehículo activado de proteína/polipéptido se selecciona del grupo de reactivos que consiste de cisteamina, N-acetilcisteamina, etanolamina, hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de amonio y amoniaco.
  10. 10. Un método para conjugar un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o sus análogos con un vehículo de proteína/polipéptido que tiene la estructura: en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y X es un grupo funcional derivable de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde m es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, comprendiendo el método las etapas de: (a) derivar uno o más de los grupos funcionales del vehículo de proteína/polipéptido o de la molécula enlazadora unida opcionalmente para generar una molécula derivada con sitios reactivos; (b) hacer reaccionar el vehículo proteína/polipéptido derivado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de aminoácido del inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o sus análogos para formar un conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido; y (c) hacer reaccionar adicionalmente dicho conjugado con un reactivo de tapa para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el vehículo de proteína/polipéptido activado, de manera que los grupos tapados no sean libres de reaccionar con otras moléculas, preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga su capacidad para producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo a fin de generar un conjugado tapado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido que tiene la fórmula: ( en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde, P es la molécula de inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo covalentemente unidos al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado en un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, n es un entero mayor que 0 , pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85.
  11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano, hemocianina de lapa californiana (KLH) , moléculas de inmunoglobulina, tíroglobulina, ovalbúmina, hemaglutinina de influenza, polipéptido PADRE, proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg?9_28) ¡ Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis, toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRM197 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes 0RF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoníae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydía pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas .
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde el vehículo de proteína/polipéptido es CRM197.
  13. 13. El método de la reivindicación 10, en donde el inmunógeno de péptido es un fragmento A/3.
  14. 14. El método de la reivindicación 13 , en donde fragmento de Aß se selecciona del grupo que consiste de Aß 1- 3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, en donde el fragmento Aß es Aß 1-7.
  16. 16. El método de la reivindicación 10, en donde el grupo funcional de una o más moléculas de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido o del enlazador de polipéptido opcionalmente unido se deriva utilizando un reactivo de reticulación.
  17. 17. El método de la reivindicación 16 en donde el vehículo de proteína/polipéptido se hace reaccionar con un agente de haloacetilación.
  18. 18. El método de la reivindicación 10, en donde el reactivo de tapa que se utiliza para inactivar los grupos funcionales reactivos libres del vehículo activado de proteína/polipéptido se selecciona del grupo de reactivos que consiste de cisteamina, N-acetilcisteamina, etanolamina, hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de amonio y amoniaco .
  19. 19. Un conjugado que comprende un conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido en donde el vehículo de proteína/polipéptido tiene la fórmula: en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y X es un grupo funcional derivable de un residuo de aminoácido en el vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde m es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y en donde el conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido tiene la fórmula: en donde, C es el vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde, P es un inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo covalentemente unidos al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, preservando así la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga su capacidad de producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85.
  20. 20. El conjugado de la reivindicación 19, en donde el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero, hemocianina de lapa californiana (KLH) , moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, hemaglutinina de influenza, polipéptido PADRE, proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HB?Ag19_28) , Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis, toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRM197 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes 0RF1224, Streptococcus pyogenes 0RF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas .
  21. 21. El conjugado de la reivindicación 20, en donde el vehículo de proteína/polipéptido es CRM197.
  22. 22. El conjugado de la reivindicación 19, en donde el inmunógeno de péptido es un fragmento Aß.
  23. 23. El conjugado de la reivindicación 22, en donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo que consiste de Aß 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42.
  24. 24. El conjugado de la reivindicación 23, en donde el fragmento AjS es AjS 1-7.
  25. 25. Un conjugado de inmunógeno de péptido-vehículo de proteína/polipéptido generado de acuerdo con el método de la reivindicación 10 y que tiene lá fórmula: ( en donde, C es un vehículo de proteína/polipéptido y Xd es un grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido al vehículo de proteína/polipéptido, y en donde, P es una molécula de inmunógeno de péptido que comprende el péptido Aß o fragmentos de Aß o análogos del mismo covalentemente unidos al grupo funcional derivado del residuo de aminoácido del vehículo de proteína u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, R es una molécula de tapa covalentemente unida al grupo funcional derivado de un residuo de aminoácido del vehículo de proteína/polipéptido u opcionalmente de un residuo de aminoácido de un enlazador de péptido covalentemente unido a un vehículo de proteína/polipéptido, que preserva la funcionalidad del vehículo, de manera que retenga su capacidad para producir las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno de péptido que de otra manera no ocurrirían sin un vehículo, n es un entero mayor que 0, pero menor o igual a 85, y p es un entero mayor que 0, pero menor que 85.
  26. 26. El conjugado de la reivindicación 25, en donde el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano, hemocianina de lapa californiana (KLH) , moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, hemaglutinina de influenza, polipéptido PADRE, proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg?9-28) , Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis, toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRMX97 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas .
  27. 27. El conjugado de la reivindicación 26, en donde el vehículo de proteína/polipéptido es CRM197.
  28. 28. El conjugado de la reivindicación 25, en donde el inmunógeno de péptido es un fragmento A/3.
  29. 29. El conjugado de la reivindicación 28, en donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo que consiste de Aß 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42.
  30. 30. El conjugado de la reivindicación 29, en donde el fragmento A/3 es Aß 1-7.
  31. 31. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un inmunógeno de péptido con un vehículo de proteína/polipéptido generado mediante el método de la reivindicación 10, conjuntamente con uno o más excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
  32. 32. La composición inmunogénica de la reivindicación 31, en donde el vehículo de proteína/polipéptido se selecciona del grupo que consiste de albúmina de suero humano, hemocianina de lapa californiana (KLH) , moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, hemaglutinina de influenza, polipéptido PADRE, proteína de malaria circumsporozita (CS) , antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg19_28) , Proteína de Choque Térmico (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis, toxina de cólera, mutantes de toxina de cólera con toxicidad reducida, toxina de difteria, proteína CRM197 que es de reacción cruzada con la toxina de difteria, peptidasa Streptococal C5a recombinante, Streptococcus pyogenes ORF1224, Streptococcus pyogenes ORF1664, Streptococcus pyogenes ORF 2452, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, mutantes de pneumolisína con toxicidad reducida, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, toxoide de tétanos, VIH gp 120 TI, componentes que reconocen moléculas de matriz adhesiva de superficie microbial (MSCRAMMS) , hormonas del factor de crecimiento, citocinas y quimiocinas.
  33. 33. La composición inmunogénica de la reivindicación 32, en donde el vehículo de proteína/polipéptido es CRM?97.
  34. 34. La composición inmunogénica de la reivindicación 31, en donde el inmunógeno de péptido es un fragmento Aß .
  35. 35. La composición inmunogénica de la reivindicación 34, en donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo que consiste de Aß 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13-28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42.
  36. 36. La composición inmunogénica de la reivindicación 35, en donde el fragmento Aß es Aß 1-7.
  37. 37. La composición inmunogénica de la reivindicación 31, en donde uno o más adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste de GM-CSF, 529 SE, IL-12, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, Mycobacteríum tuberculosis , Bordetella pertusis, lipopolisacáridos bacteriales, compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina, MPL™ (lípido A de 3-O-monofosforilo desacilado) , un polipéptido, Quil A, Stimulon™ QS-21 una toxina pertusis (PT) , una toxina termolábil de E. coli (LT) , IL-la, IL-lß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón , interferón ß, interferón ?, G-CSF, TNF-a, y TNF-ß.
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