JP2004509846A - 肝炎c型ウイルスコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
本発明はHCVの種々の菌株及び変異体を認識する免疫応答を誘発しうるHCVコンジュゲートに関する。該コンジュゲートはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と1つまたは複数のHCVミモトープとを含有する。好ましいHCVミモトープはHCV E2タンパク質の超可変領域を認識する抗体を産生しうる抗原を提供する。
Description
【0001】
(発明の背景)
肝炎C型ウイルス(HCV)は、急性、活性または持続性の非A非B型ウイルス肝炎の主な原因である。HCVは、初期感染に対する免疫応答を免れうる変異体を産生させる突然変異率が高い。(Puntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998)。HCV感染によりしばしば持続性感染が生じ、肝硬変、肝細胞癌を誘発する頻度も高い。(Alter,Blood 85:1681−1695,1995参照)。
【0002】
HCVを認識する抗体は、組換えHCVタンパク質及び人工ペプチドの双方を使用して誘発できる。HCVを認識する抗体を誘発する組換えHCVタンパク質は構造タンパク質E1及びE2を含む。(Chooら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:1294−1298,1994)。HCV中に見出されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しているがHCVタンパク質を認識する抗体を産生する能力を維持している人工ペプチドはファージディスプレーライブラリーを使用して選択された。(Prezziら,The Journal of Immunology 156:4504−4513,1996;Puntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998)。このような人工ペプチドをHCVミモトープと呼ぶ。
【0003】
(発明の概要)
本発明主目的は、HCVの種々の菌株及び変異体を認識する免疫応答を誘発できるHCVコンジュゲートである。該コンジュゲートはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と1つまたは複数のHCVミモトープとを含有している。好ましいHCVミモトープは、HCV E2タンパク質の超可変領域を認識する抗体を産生できる抗原を提供する。
【0004】
従って、第一の観点によれば本発明はHCVコンジュゲートを記載している。該コンジュゲートは、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性HCVペプチドとを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。HCVペプチドは担体に共有結合的に連結されている。また、別のタイプのHCVペプチド、反応性部位キャッピング基のような追加の基及びアニオンを担体に付着させてもよい。
【0005】
“共有結合的に連結された”という用語は、生理的条件下で加水分解に対して安定な共有結合リンカーの存在を意味する。好ましくは、共有結合リンカーは、アダクト形成、酸化及び還元のような生理的条件下で生じ得る別の反応に対して安定である。
【0006】
本発明の1つの実施態様では、共有結合的に連結された状態が“連結手段”によって得られる。本文中に記載の対応する構造、材料または作用及び等価の構造、材料または作用がこのような手段に包含される。
【0007】
免疫原性HCVペプチドは、HCVを認識する免疫応答を誘発できる1つまたは複数の抗原決定基を含む。好ましい抗原決定基は、HCVの種々の菌株及び変異体を認識する抗体を誘発できるHCVミモトープである。HCVペプチドの例は、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7のHCVミモトープ配列から成るペプチドである。
【0008】
好ましくは、HCVコンジュゲートが、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性HCVペプチドPEP1と免疫原性HCVペプチドPEP2とから成り、ここにPEP1及びPEP2の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なる配列を含んでいるか、または、医薬として許容されるその塩から成る。HCVコンジュゲートは、配列1−7から成る2つのペプチドに加えて、配列1−7のペプチドを非限定例とする追加のペプチドを含有し得る。
【0009】
別の観点によれば本発明は、(a)ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の反応性部位に複数のリンカーを連結する段階と、(b)該複数のリンカーに2つまたはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドを連結する段階と、(c)段階(b)の生成物をキャッピングする段階とから成る方法によって製造されるHCVコンジュゲートを記載している。免疫原性ペプチドに反応しないリンカーにキャッピング基を付着させることによってキャッピングが行われる。2つまたはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドの各々は、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7から成る。
【0010】
反応性部位はコンジュゲーションが可能な基である。好ましい反応性部位は、リシンのイプシロンアミノ基のような求核部位である。複数のリンカーという用語は2個以上のリンカーを意味する。
【0011】
方法は、1つまたは複数のアニオンの連結、及び、配列1−7から成るペプチド以外の追加のHCV免疫原性ペプチドの連結のような追加段階を含み得る。配列1−7で示される2個またはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドに加えてこのような追加のHCV免疫原性ペプチドが含まれている。
【0012】
別の観点によれば本発明は、本文中に記載の第一及び第二の異なるHCVコンジュゲートを含むHCVコンジュゲート混合物を記載している。好ましくは、第一のHCVコンジュゲートは、配列1−7から成る第一の免疫原性HCVペプチド、配列2から成る第二の免疫原性HCVペプチド及び配列4から成る第三の免疫原性HCVペプチドに共有結合的に連結されたポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第二のコンジュゲートは、配列7から成る免疫原性HCVペプチドを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第一及び第二のHCVコンジュゲートは、追加のタイプのHCVペプチド、反応性部位キャッピング基及びアニオンのような夫々の担体に付着された追加の基を含有し得る。
【0013】
別の観点によれば本発明は、被験者の体内で免疫応答を誘発する方法を記載している。該方法は、有効量の本文中に記載のHCVコンジュゲートを被験者に接種する段階を含む。
【0014】
別の観点によれば本発明は、多数の免疫原性HCVペプチドを含有するHCVコンジュゲートの製造方法を記載している。該方法は複数のペプチドを担体に同時にコンジュゲーションする段階を含む。
【0015】
別の観点によれば本発明は、HCVを認識する抗体を含有する抗血清を記載している。このような抗血清は、(a)有効量の本文中に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、(b)該被験者から抗体を採取する段階とから成る方法によって製造される。
【0016】
本発明のその他の特徴及び利点は、種々の実施例を含む本文中の以後の記載から明らかであろう。提示された実施例は本発明の実施に有用な種々の化合物及び方法を記載している。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。当業者は本文中の開示に基づいて本発明の実施に有用な別の化合物及び方法を見出し、それらを使用することができるであろう。
【0017】
(詳細な説明)
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と1つまたは複数のHCVミモトープとを含有するHCVコンジュゲートに関する。該コンジュゲートは、免疫応答を誘発するために使用されたHCVミモトープを認識する抗体並びにHCVの種々の菌株及び変異体を認識する抗体の誘発能を有している。
【0018】
抗原を使用して免疫応答を誘発するために種々の技術を使用できる。以下に提示された実施例は、免疫応答タンパク質の複合体から成る担体を使用すること及び特定の抗原または組合せ抗原を使用することによって得られた利点を表すデータを含んでいる。これらの結果は、免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質の複合体を含有するコンジュゲートの一部として被験者に接種されたHCVミモトープが、キメラミモトープ−E2タンパク質及びキメラミモトープ−E2タンパク質のDNAベクターのような別の技術を使用して被験者に接種された同じHCVミモトープペプチドに比べてより免疫応答を有利に誘発することを示唆する。
【0019】
更に、組合せ抗原は、複数の個別コンジュゲートを含有する混合液中に存在する場合よりも単一コンジュゲート中に存在する場合に交差反応性抗体をより効率的に誘発することが知見された。このような組合せ抗原は好ましくは同時コンジュゲーション技術によって得られる。
【0020】
HCVコンジュゲートは被験者の体内で免疫応答を誘発するために有効である。免疫応答の結果として、HCVを認識する抗体が産生される。免疫応答の発生及びその結果として生じる抗体の産生は治療または診断の用途で使用できる。
【0021】
“被験者”という用語は、抗体を産生し得る哺乳動物を意味する。被験者の例は、ヒト、チンパンジー、マウス及びウマである。好ましい被験者はヒトである。抗HCV抗体を産生するために、HCVに感染していないその他の被験者も使用できる。
【0022】
診断用途としては、試験中の被験者の体内のHCVの存在を検出するためにHCV抗体を使用する。このような抗体は、本文中に記載のHCVコンジュゲートを使用して免疫応答を生じるように誘発された被験者から得られる。
【0023】
治療用途としては、HCV感染患者を治療したり、被験者を予防的に処置したりする。このような用途では、HCV中和抗体を使用するかまたは産生させる。本文中に記載のHCVコンジュゲートが種々の菌株及び変異体と反応する抗体の産生能は、HCVの初期感染を治療または阻止するため、及び、in vivoに生じたHCVの突然変異体を防御するために有用である。
【0024】
免疫原性HCVペプチド
免疫原性HCVペプチドは1つまたは複数のHCVミモトープを含み、更に、他の基を含有し得る。好ましい他の基は、免疫応答を増強する基及び担体とのコンジュゲーションに関与する基である。免疫応答の増強に有効な他の基としては、インバジンの免疫促進性ドメインまたはヘルパーT細胞エピトープを含有するペプチドのような免疫原性ペプチドがある。(例えば、Wang,国際公開WO99/66957及びWang,米国特許第5,759,551号参照)。
【0025】
HCVミモトープの選択方法及び特定のミモトープに関してはNicosiaら,WO99/60132及びPuntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998に記載されている(双方の文献は参照によって本発明に含まれるものとする)。同定されたHCVミモトープは標準コンジュゲーション技術を使用して製造できHCVコンジュゲートに組込める。
【0026】
免疫原性HCVペプチドはタンパク質中に見出される常在アミノ酸及びタンパク質中に普通には見出されない非天然アミノ酸とから構成され得る。タンパク質中に見出される常在アミノ酸はL鏡像異性体である(キラル中心をもたないグリシンは除外)。タンパク質中に見出される常在アミノ酸を表すために以下の標準名称を使用する:
A=Ala=アラニン;
C=Cys=システイン;
D=Asp=アスパラギン酸;
E=Glu=グルタミン酸;
F=Phe=フェニルアラニン;
G=Gly=グリシン;
H=His=ヒスチジン;
I=Ile=イソロイシン;
K=Lys=リシン;
L=Leu=ロイシン;
M=Met=メチオニン;
N=Asn=アスパラギン;
P=Pro=プロリン;
Q=Gln=グルタミン;
R=Arg=アルギニン;
S=Ser=セリン;
T=Thr=トレオニン;
V=Val=バリン;
W=Trp=トリプトファン;及び
Y=Tyr=チロシン。
【0027】
HCVコンジュゲートは1つまたは複数の異なる免疫原性HCVペプチドを含有し得る。好ましくは、少なくとも1つの免疫原性HCVペプチドが、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7のHCVミモトープ配列を含むか、該ミモトープ配列から本質的に構成されるかまたは構成されている。“本質的に構成される”という表現は、ミモトープの免疫応答誘発能力を実質的に変化させない追加の基が存在してもよいことを意味する。本質的に構成されるという表現に包含される追加の基の例はリポーターアミノ酸及びコンジュゲーション関与基である。
【0028】
後述の実施例で配列1−7として使用した配列及び呼称を以下に示す:
【0029】
【化10】
【0030】
配列1−7中のXの各々は、グルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンを表す。場合によっては、配列3のペプチド中のN末端グルタミンからピログルタミンが自然に形成されることが知見された。
【0031】
本発明の1つの実施態様では免疫原性HCVペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている:
【0032】
【化11】
【0033】
配列8−14は配列1−7にX1X2が付加された配列に対応しており、ここにX1はリポーターアミノ酸であり、X2はイオウ含有アミノ酸である。配列8−14のXの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【0034】
リポーターアミノ酸は上記に列挙した20種類の一般的なアミノ酸以外のアミノ酸である。リポーターアミノ酸の例を以下に示す:Nva−ノルバリン;Nle−ノルロイシン;Abu−2−アミノ酪酸;Dbu−2,4−ジアミノ酪酸;Dpr−2,3−ジアミノプロピオン酸;及びChg−シクロヘキシルグリシン。
【0035】
イオウ含有アミノ酸は反応性イオウ基を含有している。イオウ含有アミノ酸の例は、システイン及び非天然アミノ酸、例えばホモシステインである。更に、活性化及び担体との反応の前には反応性イオウがジスルフィド形態で存在してもよい。
【0036】
本発明の別の実施態様では、免疫原性HCVペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている:
【0037】
【化12】
【0038】
配列15−21は、X1リポーター基(配列15−21ではX3として表す)がノルバリン、ノルロイシン、2−アミノ酪酸、2,4−ジアミノ酪酸、2,3−ジアミノプロピオン酸またはシクロヘキシルグリシンを表し、X2イオウ含有アミノ酸がシステインを表す配列8−14に対応する。配列15−21中のXの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【0039】
2つ以上のミモトープを含有する免疫原性HCVペプチドの例は配列22及び23によって表される。配列1及び7の双方のミモトープを含有する配列22及び23は以下の配列で表される:
【0040】
【化13】
配列中のX、X1、X2及びX3は上記の定義と同義である。
【0041】
ペプチドは当業界で公知の技術を使用して製造できる。このような技術としては化学合成及び生化学合成がある。ポリペプチドの化学合成技術の例は、Vincent,Peptide and Protein Drug Delivery,New York,N.Y.,Dekker,1990に提示されている。核酸の細胞内導入及び核酸の発現を含む生化学合成技術の例は、Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987−1998及びSambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989に提示されている。
【0042】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体
HCVミモトープはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体に共有結合的に連結されている。担体は、多数の抗原を含有するコンジュゲート作製用の骨格に供するために、また、免疫応答を増強するために使用され得る。
【0043】
ポリペプチド及びタンパク質複合体担体としては免疫応答を増強し得る免疫原性担体が好ましい。免疫応答の増強は例えば、Tヘルパー細胞エピトープを供するかまたはアジュバント活性を供することによって得られる。免疫原性担体の例は、Neisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体(OMPC)、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、OMPC由来のMMP、ジフテリアトキソイド、肝炎B型ウイルスの表面抗原、肝炎B型ウイルスのコア抗原、及び、ヒトのロタウイルスVP6カプシドタンパク質である。
【0044】
好ましい担体はOMPCである。OMPCはコンジュゲーションに使用できる多数の基を保有している。基のコンジュゲーション適性は、供与される基のタイプ及びOMPC中の基の位置に依存する。コンジュゲーションに使用できる求核官能基は当業界で公知の技術を使用して決定できる。(Eminiら,米国特許第5,606,030号参照)。コンジュゲーションに使用できる基のタイプの1つは、リシンのイプシロンアミノ基及びタンパク質のN末端アミノ酸のアルファアミノ基のようなアミノ酸に存在する一次アミノ基である。OMPCはFuの米国特許第5,494,808号に記載されているような当業界で公知の技術を使用して得ることができる。
【0045】
免疫原性HCVペプチドの組合せ
本出願は、HCVの種々の菌株及び変異体に交差反応する抗体を誘発するために使用できるHCVミモトープの好ましい組合せ、及び、好ましい1つのミモトープを同定する。ミモトープの組合せは種々のコンジュゲートの混合液として使用することもできるが、種々のミモトープの組合せたものを含有する多重コンジュゲートを製造したほうが効力は大きいと考えられる。
【0046】
多重コンジュゲート
1つの好ましい実施態様では、コンジュゲートが、担体に連結された2つまたはそれ以上の異なるタイプの免疫原性HCVペプチドと、担体に連結された1つまたは複数のキャッピング基とを含むか、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、担体に連結された1つまたは複数のアニオンを含有し得る。他の実施態様では、少なくとも3つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、3つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、4つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、5つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在するか、または、6つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在する。
【0047】
多重コンジュゲートは好ましくは、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なるHCVミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成された2つまたはそれ以上の免疫原性HCVペプチドを含有している。免疫原性HCVペプチドの各々は、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に連結され得る。好ましくは、このようなペプチドは以下の構造に記載されたようにOMPCにコンジュゲーションされている。
【0048】
免疫原性HCVペプチドの組合せ例としては、以下の配列を含む組合せがある:(1)配列1、2及び4;(2)配列1、3及び5;(3)配列1、2、3、4及び5;(4)配列1、3、4、5及び6;(5)配列1、3、4、5及び7;(6)配列2、3、4、5及び22;(7)配列1、2、3、4、5及び7。好ましくは、このようなペプチドの組合せが以下の構造に記載するようにOMPCにコンジュゲーションされている。
【0049】
OMPCへのコンジュゲーションを記載する本発明の実施態様では、コンジュゲートが以下の構造:
【0050】
【化14】
〔式中、
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
L1はPEP1をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はPEP2をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はPEP3をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々は同じでも異なっていてもよく、
L4はPEP4をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL4の各々は同じでも異なっていてもよく、
L5はPEP5をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL5の各々は同じでも異なっていてもよく、
L6はPEP6をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL6の各々は同じでも異なっていてもよく、
L7はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL7の各々及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
L8はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL8の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6が免疫原性ペプチドであり、但し、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6のうちの少なくとも2つが、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5及び配列6から成るグループから選択された配列を含み、
a、b、c、d、e、f、g及びhの各々は個別に選択された結合負荷であり、a、b、c及びhの各々は0よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【0051】
キャッピング基はリンカーの反応性基と反応でき、キャッピング基に付着した該反応性基が以後の反応を受ける能力を阻害する化学的部分である。種々のリンカーに対して適当なキャッピング基は容易に得られる。例えば、マレイミド活性化OMPCに対して適当なキャッピング基は、N−アセチルホモシステイン、n−アセチルシステイン及びメルカプトエタノールようなチオール含有化合物である。アニオン性または非アニオン性のキャッピング基のような別のタイプのキャッピング基も使用できる。好ましくはコンジュゲート中に存在する複数のキャッピング基が同じ化学構造を有している。
【0052】
“結合負荷”は、特定の基のモル数をリシンのモル数で除算して100を乗算した値を表す。好ましくは、a+b+c+d+e+f+g+hの結合負荷は約25である。総合的に、a+b+c+d+e+fの結合負荷は好ましくは約5から約20の範囲であり、存在する個々の要素の結合負荷は好ましくは少なくとも約0.2である。別の実施態様では、総結合負荷a+b+c+d+e+fは少なくとも6、7または8であり、18、19または20以下である。a、b、c、d、e及びfが存在するとき(即ち、0よりも大きい値のとき)、これらの個々の結合負荷は少なくとも約0.4、好ましくは少なくとも約1である。
【0053】
好ましくは、存在するL1、L2、L3、L4、L5、L6、L7及びL8の各々が独立に構造:
【0054】
【化15】
〔式中、OMPCは“z”位に連結され、
Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
R1及びR2の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−SO3Hであり、R1及びR2の他方がPEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP6、アニオンまたはキャッピング基の連結位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸である〕を有している。
【0055】
“アルキレン”という用語は、炭素原子間の炭素−炭素単結合だけを含有している炭化水素基を意味する。アルキレン炭化水素基は1−12個の炭素原子を有しており、直鎖状であるかまたは1つもしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有し得る。アルキレン基は2つの場所で別の官能基または構造部分に付着している。好ましくはアルキレン基は−(CH2)0−3−C6H10−(CH2)0−3または−(CH2)0−3−C5H8−(CH2)0−3−であり、より好ましくはアルキレンは−C6H10−または−C6H10−CH2−である。
【0056】
“置換アルキレン”という用語は、1つまたは複数の水素が−NH2、−NHCOCH3、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−OH、−CN、−SH、−NO2、1−5個のハロゲンで置換された−C1−2アルキル、−CF3、−OCH3または−OCF3から成る部分によって置換されたアルキレンを意味する。
【0057】
“アルキル”という用語は、炭素−炭素単結合によって連結された1−8個の炭素原子から成る炭化水素基を意味する。アルキル炭化水素基は直鎖状でもよく、または、1もしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有してもよい。好ましくは、アルキルは1−4個の炭素原子である。
【0058】
“置換アルキル”という用語は、1個または複数の水素が−NH2、−NHCOCH3、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−OH、−CN、−SH、−NO2、1−5個のハロゲンで置換された−C1−2アルキル、−CF3、−OCH3または−OCF3から成る部分によって置換されたアルキルを意味する。
【0059】
好ましくは、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6の各々が、配列8、配列9、配列10、配列11、配列12、配列13、配列14及び配列22から成るグループ、または、配列15、配列16、配列17、配列18、配列19、配列20、配列21及び配列23から成るグループから選択された異なる配列から構成され、そのカルボキシ末端アミノ酸のイオウを介してOMPCに連結されている。
【0060】
より好ましい実施態様では、存在するL1、L2、L3、L4、L5、L6、L7及びL8の各々が独立に以下の構造:
【0061】
【化16】
〔式中、OMPCは“z”位に連結され、R1及びR2は上記と同義である〕を有している。好ましくは、gは0である(即ち、アニオン及びL7は存在しない)。
【0062】
M63コンジュゲート
別の好ましい実施態様では、HCVコンジュゲートがポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含有しており、(1)配列7のHCVミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成されるかもしくは構成されている免疫原性HCVペプチドと、(2)担体に連結された1つまたは複数のキャッピング基と、を含むか、または、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、該コンジュゲートはまた、(3)担体に連結された1つまたは複数のアニオンを含有してもよい。
【0063】
本発明の1つの実施態様では、コンジュゲートが以下の構造:
【0064】
【化17】
〔式中、
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
L1はHCVペプチドをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
n、m及びpの各々は個別に選択された結合負荷であり、n及びpの各々は0よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【0065】
好ましくは、n+m+pの結合負荷は約25である。別の実施態様では、nが少なくとも約0.4、少なくとも約1、少なくとも約3、少なくとも約5、または、少なくとも約8であり、約20以下、または、約18以下である。
【0066】
好ましい実施態様では、L1、L2及びL3の各々が独立に以下の構造:
【0067】
【化18】
〔式中、
OMPCは“z”位に連結され、
Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
R3及びR4の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−SO3Hであり、R3及びR4の他方が免疫原性ペプチド、アニオンまたはキャッピング基の結合位置であり、好ましくはR3及びR4の一方が水素である〕を含有している。
【0068】
アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基に関しても上記と同義である。好ましくは、免疫原性HCVペプチドが配列14または配列20から構成され、カルボキシ末端アミノ酸のイオウ基を介してOMPCに連結されている。
【0069】
より好ましい実施態様では、L1、L2及びL3が独立に以下の構造:
【0070】
【化19】
を有している。式中のR3、R4及び“z”は上記と同義である。
【0071】
本発明の種々の実施態様において、存在するアニオンの各々は、カルボン酸、スルホン酸またはリン酸であり、また、アニオンが全く存在しなくてもよい(mが0であり、L2が存在しない)。
【0072】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の形成
HCVミモトープを含有する免疫原性HCVペプチドは、当業界で公知のコンジュゲーション技術(Tolmanら,米国特許第5,274,122号、Eminiら,米国特許第5,606,030号、Conleyら,米国特許第5,763,574号参照)を使用し、共有結合リンカーを介してポリペプチド及びタンパク質の複合体から成る担体にコンジュゲーションできる。コンジュゲートはまた、例えば1つまたは複数のアニオン基を含有するように修飾できる。
【0073】
免疫原性HCVペプチドまたはアニオンを担体に連結する共有結合リンカーは生理的条件下で安定である。このようなリンカーの例は、非特異的架橋剤、モノジェネリックスペーサー及びバイジェネリックスペーサーである。
【0074】
非特異的架橋剤及びそれらの使用は当業界で公知である。このような試薬及びそれらの使用例としては、グルタルアルデヒドとの反応、スクシニル化担体を添加してまたは非添加で行うN−エチル−N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドとの反応、グリコシル化置換基を過ヨウ素酸塩で酸化し次いでホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムの存在下でタンパク質担体の遊離アミノ基に結合させる反応、芳香族アミノ基をジアゾ化し次いでタンパク質のチロシン側鎖残基に結合させる反応、イソシアナートとの反応、混合無水物との反応がある。全般的にはBriandら,J.Imm.Meth.78:59,1985参照。
【0075】
モノジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。モノジェネリックスペーサーは二官能性であり、コンジュゲーションが生じる前に一対の反応要素の一方だけを官能化する必要がある。モノジェネリックスペーサー及びその使用の一例は、カルボジイミドの存在下で二官能分子アジピン酸ジヒドラジドの一端に免疫原性HCVペプチドを結合させる処理である。ジアシル化ヒドラジンがグルタミンまたはアスパラギン側基と共に担体のカルボキシル基を形成すると推定される。次いで、カルボジイミドの存在下に第二の結合反応で担体タンパク質と反応させるとコンジュゲーションが生じる。
【0076】
バイジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。バイジェネリックスペーサーは、一対の反応要素の各々が官能化された後に形成される。官能化された反応要素の各々が対応する反応要素と反応して1つまたは複数の安定な共有結合を形成したときにコンジュゲーションが生じる。(例えば、Marburgら,J.Am.Chem.Soc.108:5282−5287,1986;Marburgら,米国特許第4,695,624号参照)。
【0077】
種々のプロセスの例を以下に挙げる。
【0078】
プロセス1
1a.タンパク質担体求核基の画分を試薬と反応させてチオール基を形成する。このような試薬の一例はN−アセチルホモシステインチオラクトンである。
【0079】
1b.段階1aの生成物を求核基と生理的pHで負電荷をもつアニオンとを含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸である。
【0080】
1c.段階1bの生成物を求電子基が付加されるように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【0081】
プロセス2
2a.タンパク質担体求核基の画分を二官能求電子試薬と反応させて求電子性タンパク質を形成する。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【0082】
2b.段階2aの生成物を求核基とアニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はα−メルカプト酢酸である。
【0083】
2c.段階2bの生成物をチオール基のような求核基を含む免疫原性ペプチドと反応させる。
【0084】
プロセス3
3a.タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期(incipient)アニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の例はN−(ブロモアセチル)−6−アミノカプロール酸及びコハク酸無水物である。
【0085】
3b.段階3aの生成物の求核基の残留画分を、タンパク質担体にチオール基を形成する試薬、例えばN−アセチルホモシステインチオラクトンと反応させる。
【0086】
3c.段階3bの生成物を求電子基例えばマレイミドを含む基が付着するように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【0087】
プロセス4
4a.タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期アニオンとの双方を含む試薬、例えばN−(ブロモアセチル)−6−アミノカプロン酸及びコハク酸無水物と反応させる。
【0088】
4b.段階4aの生成物の残留タンパク質求核基を二官能性求電子試薬と反応させてタンパク質に求電子部位を付加する。このような試薬の例は、マレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【0089】
4c.段階4bの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【0090】
プロセス5
5a.タンパク質担体アミノ基の画分を構造:
【0091】
【化20】
〔式中、Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、R1は水素、アルキル、置換アルキル及び−SO3Hから成るグループから選択され、ここに、アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基も上記と同義である〕を有している架橋剤と反応させる。
【0092】
5b.段階5aの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【0093】
プロセス1−5は一般に、1つの段階の余剰試薬を第二段階の開始前に除去し未反応の官能基をキャッピングするという追加段階を含むであろう。以下の反応スキームはコンジュゲートを製造するために使用したプロセス5を追加段階と共に示す。反応スキーム中で担体、架橋剤、キャッピング基及びミモトープを表す成分は単なる代表例である。本発明の開示に基づいて当業者は反応スキームに示した成分を当業界で公知の成分及び本文中に記載の成分で置換できるであろう。
【0094】
【化21】
【0095】
製剤化及び投与
HCVコンジュゲートは本文中に提示した指針を当業界で公知の技術と共に使用して製剤化し患者に投与し得る。医薬投与に関する全般的指針は例えば、Modern Vaccinology,Ed.Kurstak,Plenum Med.Co.1994;Remington′s Pharmaceutical Sciences 18th Edition,Ed.Gennaro,Mack Publishing,1990;及びModern Pharmaceutics 2nd Edition,Eds.Banker and Rhodes,Marcel Dekker,Inc.,1990に提示されている。これらの文献の各々は参照によって本発明に含まれるものとする。
【0096】
HCVコンジュゲートは酸性塩または塩基性塩として製造できる。医薬として許容される塩(水溶性もしくは油溶性または水分散性もしくは油分散性の物質)としては、慣用の無毒性塩、または、例えば無機または有機の酸または塩基から形成される第四級アンモニウム塩がある。このような塩の例には酸付加塩と塩基の塩とがあり、酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、ウンデカン酸塩があり、塩基の塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウムの塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウムの塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N−メチル−D−グルカミンのような有機塩基との塩、アルギニン及びリシンのようなアミノ酸との塩がある。
【0097】
種々の用量のHCVコンジュゲートを静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内のような種々の経路で投与できる。好ましい経路は筋肉内である。
【0098】
適当な投与計画は好ましくは、患者の年齢、体重、性別及び病態、投与経路、所望の効果、使用される特定化合物のような当業界で公知の要因を考慮に入れて決定される。コンジュゲートは、多段階免疫接種フォーマット(multi−dose vaccine formats)で使用できる。1回の用量は合計タンパク質が1μg−1.0mgの範囲になる量であると予測され、本発明の好ましい実施態様ではこの範囲が0.1mg−1.0mgである。
【0099】
HCVコンジュゲートは好ましくはアジュバントと共に製剤化される。アジュバントの例は、ミョウバン、AlPO4、アルヒドロゲル、リピドA及びそれらの誘導体または変異体、フロインドの完全または不完全アジュバント、中性リポソーム、並びに、ワクチンとサイトカインまたはケモカインとを含有するリポソームである。
【0100】
投与適期は当業界で公知の要因に依存する。初回投与の後、抗体価を維持するために1回または複数のブースター用量を引き続き投与してもよい。投与計画の一例は、初日の投与及び1カ月後の投与、4、6または12カ月後の3回目の投与から成り、また、必要ならばもっと間隔をおいて追加のブースター用量を投与する。
【0101】
実施例
本発明の別の特徴を更に説明するために以下の実施例を提示する。実施例はまた本発明を実施するために有用な方法を示す。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【0102】
実施例1:ペプチド合成
(市販のソースを使用する)固相FMOC化学法によってペプチドを直鎖状配列として所望通りに合成(custom synthesize)した。RP−HPLCで判定して全部のペプチドが>90%の純度を有していた。一般的に、各ペプチドは27−merのミモトープとカルボキシ末端から2番目の非天然残基とカルボキサミドとして存在するカルボキシ末端システインとを含む29残基から構成されていた。このようなペプチドの例を以下に示す:
配列24 XTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNX3C(ここにX3はNleである),
配列25 XTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNX3C(X3はChgである),
配列26 XTTTTGGQVSHATHGLTGLFSLGPQQKX3C(X3はNvaである),
配列27 XTTVVGGSQSHTVRGLTSLFSPGASQNX3C(X3はDprである),
配列28 XTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQKX3C(X3はAbuである),
配列29 TTTTTGGQVGHQTSGLTGLFSPGAQQNX3C(X3はDbuである),
配列30 TTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQNX3C(X3はNleである),
配列31 XTHTTGGVVSHQTRSLVGLFSPGPQQNX3C(X3はNleである)。
【0103】
配列24−31中のXの各々はグルタミンまたはピログルタミンであり、好ましくはグルタミンである。Xがグルタミンを表すペプチドを合成した。
【0104】
アミノ末端の連鎖を試験するために、N末端グリシンと、システインと、非天然残基と、末端残基がカルボキサミドとして存在する27−merのミモトープ配列とを含む30−merとしてペプチドを合成した。
【0105】
環化ミモトープペプチドを試験するために、合成及び環化は以前に公表された戦略に従った(Conleyら,Vaccine 12:445−451,1994)。簡単に説明すると、N末端グリシン、システイン、リシンをもち、続いて27−merミモトープ配列をもち、カルボキシ末端から2番目に他のアスパラギン酸をもち、カルボキシ末端に非常在(unusual)アミノ酸をもつペプチドを合成した。リシンのε−アミノとアスパラギン酸のβ−カルボキシルとを縮合させると環状生成物が得られた。
【0106】
所望通りに合成した肝炎C型ウイルス領域由来ペプチド(HVR)をELISA抗原として使用した。これらは、ビオチン基非使用で製造するか(表1A)、または、ビオチン基を使用しそれぞれ標準ペプチド吸着型もしくはストレプトアビジンビオチン捕獲型のELISAフォーマットに適するように製造した(表1B)。
【0107】
【表1】
【0108】
実施例2:ペプチドコンジュゲート
N.meningitidis OMPCを、過剰量のヘテロ二官能性架橋剤スルホスクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(sSMCC,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)と2−8℃で2時間反応させることによってpH8.0(10mMのHEPPSバッファ)で活性化した。活性化したOMPCを300K MWCO DispoDialyser(Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguea,CA)を使用して10mMのHEPPS,pH8.0または1.0mMのMOPS,pH7.1に2−8℃で18−24時間透析した。透析中にバッファを3回交換してスルホNHS及び余剰のsSMCCを除去した。
【0109】
チオール含有ミモトープペプチドの各々を加えることによって個々の反応を進行させた。次に、OMPCの未反応マレイミド基をN−アセチルシステイン(NAC)と反応させ、次いで300K MWCO DispoDialyserによって10mMの(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−3−プロパンスルホン酸(HEPPS),pH8.0に透析して、余剰の未結合ペプチド及びNACを除去した。
【0110】
全OMPCリシンに対するミモトープペプチドの結合負荷のパーセントを、リシンのモル数に対するミモトープ中の非天然アミノ酸のモル数の比に100を乗算することによって計算した。6NのHCl中で110℃で20時間処理することによって酸加水分解したコンジュゲートのアミノ酸解析に基づいて定量を行った。リシン含有ミモトープについては、OMPC由来のリシンの割合が得られるようにリシンの測定値を補正した。BSAを標準として使用するLowryアッセイによってタンパク質濃度を測定した。OMPCのタンパク質成分とミモトープペプチドとが共有結合的に連結したことを証明するためにSDS−PAGE分析を行った。結合負荷は8−19%の範囲であった。
【0111】
試験したワクチンの幾つかは、3、5または6個が同時にコンジュゲーションした多重ミモトープを用いて製造した。これらを同時コンジュゲートペプチドワクチン(SCPV)と呼ぶ。これらのSCPVのミモトープ成分、及び、各ミモトープペプチドに会合した“リポーター”アミノ酸を表2に示す。SCPV調製物中のOMPCに対するペプチドの結合度を測定するために、他の非反復の“リポーター”アミノ酸を各ミモトープのC末端から2番目の残基として組込んだ。
【0112】
【表2】
略号:Nva−ノルバリン、Nle−ノルロイシン、Abu−2−アミノ酪酸、Dbu−2,4−ジアミノ酪酸、Dpr−2,3−ジアミノプロピオン酸、Chg−シクロヘキシルグリシン
【0113】
実施例3:DNAベクター免疫原
霊長類へのDNAデリバリーによって免疫応答を誘発するために個別の6つの発現プラスミドを構築した。6つのミモトープ配列、即ち、配列1、3、4、5、6及び7を個別に菌株NのHCV E2の外層ドメイン(ectodomain)配列(Hayashiら,J.Hepatol.17:S94−S107,1993)に付着させて、キメラタンパク質を産生させた。HVRコーディング配列をこのE2配列から取出し、カルボキシル末端に(his)6タグを付加した。これらの構築物を組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)リーダー配列とインフレームさせてプラスミドV1jnstpaにクローニングした(Montgomeryら,Pharmacol.Ther.74:195−205,1997)。
【0114】
全部の構築物をDNA配列解析によって検証した。50μg/mlのカナマイシンを補充したTerrificブロス,1×塩中で増殖させた形質転換大腸菌DH5α株の培養物からプラスミドの大量調製物を調製した。標準法によってプラスミドを抽出した後、DNAをCsCl密度勾配中で2回収集し、10mMのトリス,pH8.0、1mMのEDTAに十分に透析し、200mMの酢酸ナトリウムを含有する溶液からエタノール沈殿させた。
【0115】
実施例4:糖タンパク質免疫原
293T細胞培養物中の一過性発現による分泌産物として6つのキメラミモトープ含有糖タンパク質を産生させた。一般的な発現手順に従い、293T細胞をポリ−D−リシンで被覆した175cm2容のフラスコ(BioCoat,Becton−Dickinson)中で培養し、60−70%の集密度でトランスフェクトした。
【0116】
滅菌した10mMのトリス、1mMのEDTA,pH8.0中に1μg/μlのDNAをフラスコあたり約25μgの割合で使用し、指示された量のLipofectamine Plusキット(GIBCO)のLipofectamine Plus成分と混合した。この溶液を、75μlのリポフェクタミンを含有する2.0mlのOpti−MEMと混合し、指示通りにインキュベートした。この4.0mlを、15mlの新しいOpti−MEMを既に収容しているフラスコに加えた。5−6時間後、Opti−MEMを基材とするリポフェクタミン−DNA培地を除去し、L−グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充した24mlのタンパク質非含有培地(CELLGRO Free−complete serum,protein,hormone,growth factor free medium,CellGro,Herndon VA)で交換した。この培地をトランスフェクション後の24時間毎に採取し、3つの採取材料を低速遠心によって清澄化し、全部の材料が収集されるまで4℃で保存し、プールし、0.22μフィルターで濾過した。次に培地を10mMのイミダゾール、0.5MのNaCl、20mMのリン酸ナトリウム,pH7.8(出発バッファ)に透析し、0.22μフィルターを使用して再び濾過した。
【0117】
約2.0Lの材料を10ml容のNi−NTAカラム(Qiagen,Valencia,CA)に、4℃で約3ml/分の流速で充填した。カラムを出発バッファで洗浄し、次いで、(a)20mMのイミダゾールを加えた40mlのバッファ、(b)40mMのイミダゾールを加えた10mlのバッファ、(c)100mMのイミダゾールを加えた30mlのバッファ、及び、(d)250mMのイミダゾールを加えた15mlのバッファによって段階的に溶出させた。100mMのイミダゾールバッファによって本質的に全部のキメラ糖タンパク質が溶出した。各糖タンパク質の主要な溶出画分の部分量を、N末端タンパク質配列解析のためには水に透析し、ELISA試験のためにはリン酸塩緩衝生理食塩水に透析し、以後のワクチン製剤化のためには5mMのトリエタノールアミン、150mMのNaCl,pH7.8に透析した。
【0118】
純度は、SDS−PAGE及びウェスタンブロットを順次行うことによって測定した。ウェスタンブロットには抗−HCV gpE2に特異的なネズミのモノクローナル抗体または抗−tetra−his抗体(Qiagen,Valencia,CA)を使用した。リーダープロセシングの同定及び完了はN末端アミノ酸配列解析によって確認した。タンパク質配列解析は、これらの全部のタンパク質のtPAリーダーの開裂がリーダー残基22と23とのproとserとの間で生じたことを示した。他方、天然型tPAでは正常な開裂が23位と24位(serとgln)との間で生じる(Siebert and Fong,Nucleic Acids Res.18:1086,1990)。
【0119】
実施例5:ワクチン製剤
ウサギで行った最初の試験では、フロインドの完全アジュバンド及び不完全アジュバンド中で製剤化したペプチドコンジュゲートワクチンを使用した。ペプチドOMPCコンジュゲートワクチンを10mMのHEPPS,pH8.0中に500μgの全タンパク質用量で調製した。以後の試験は、モノホスホリルリピド−A(MPL−A)を予め吸着させた6mMのトリエタノールアミン生理食塩水pH7.0−8.0中の1.4mg/mlのAlPO4に各用量を吸着させて行った。AlPO4対MPL−Aの重量比は3.5対1であった。
【0120】
また、精製したキメラタンパク質を5mMのトリエタノールアミン、150mMのNaCl,pH7.8中に500μgの全タンパク用量で調製した。ミョウバン対MPL−Aの重量比3.5対1でMPL−Aを予め吸着させたミョウバンに各用量を吸着させた。DNAベクターワクチンを無菌のPBS,pH7.5に5.0mg/mlで再懸濁させた。
【0121】
実施例6:免疫原性試験
ニュージーランド白ウサギ(2−2.5Kg)に対して各試験の開始時、4週目及び8週目に免疫原を注射した。隔週1回の割合で12週目まで動物から採血し、血清を調製した。アカゲザルMacacus mulatta(>2,5Kg)をミモトープOMPCコンジュゲートワクチン及びキメラミモトープ糖タンパク質ワクチンで、初日及び4、8及び26週目に免疫感作した。
【0122】
各用量を筋肉内に接種し、各三角筋の2つの部位の間に均等に分布させた。サルを無菌PBS中で調製したDNAベクターワクチンによって免疫感作した。No.3のシリンジを装着したBiojector(Bioject,Inc.Portland,OR)のニードレスデバイスを使用して各動物に筋肉内接種した。各用量を各四頭筋の2つの部位の間に均等に分布させた。12週目まで隔週1回、24週目まで月1回、次いで32週目まで再び隔週1回の割合で動物から採血し、血清を調製した。
【0123】
実施例7:ウェスタンブロットアッセイ
組換えタンパク質のウェスタンブロットアッセイは、4×NuPageバッファ中でサンプルを調製し、予め形成した4−12%NuPageゲル(NOVEX,San Diego,CA)中で電気泳動させた後に一般的手順で行った。分離したタンパク質に30ボルトを90分間印加して、PVDF紙に転移させ、標準法で処理した。処理したPVDFシートをウサギまたはサルの免疫血清またはモノクローナル抗体に4℃で一夜接触させた。
【0124】
一般的に、HRPコンジュゲートした抗血清を第二抗体として使用した。マウスのモノクローナル抗体を検出するためには、ヤギ抗マウスIgGのFcフラグメント特異的抗体を使用した(Jackson Immuno.Res.,West Grove,PA)。ウサギの抗体を検出するためには、ヤギ抗ウサギIgG−Fcを使用した(Bethyl Labs,Montgomery,TX)。サルの抗体を検出するためには、ヤギ抗サルIgG H+Lを使用した(Bethyl Labs)。これらの全部の第二抗体は1:4000の希釈度で使用した。ECLまたはECL+試薬(Amersham,Piscataway,NJ)を使用して全部のブロットを超高感度フィルム(Hyperfilm)に現像した。
【0125】
実施例8:ミモトープ及びHVRペプチドに対する免疫血清のELISA
ホモロガス免疫ペプチド、ヘテロロガスミモトープまたはHVRペプチドに対する抗体応答の測定は、本質的に文献(Tolmanら,1993,Int.J.Peptide Protein Res.41:455−466,1993及びConleyら,Vaccine 12:445−451,1994)に記載通りの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、または、ビオチニル化ペプチドELISAのストレプトアビジン捕獲の使用によって行った。
【0126】
簡単に説明すると、標準ELISAを使用する場合には、マイクロタイタープレートをPBS中の0.25μgのタンパク質によって湿潤雰囲気下、4℃で一夜を要してコートした。プレートを十分に洗浄し、1×ブロッカーBSA(Reacti−Bind,Pierce,Rockford,IL)でブロックし、十分に洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で1時間反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、コンジュゲートした第二抗体と反応させた。プレートを標準法によって反応処理し、450nmの吸光度を測定した。
【0127】
ビオチニル化ペプチドELISAのストレプトアビジン捕獲を使用する場合には、2×ウェル容量にあたる50pmolのビオチニル化ペプチドをブロッカーBSA中のストレプトアビジンコートしたELISAプレート(Reacti−Bind,Pierce,Rockford,IL)と各プレートをシールした後に室温で反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で30分間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【0128】
実施例9:捕獲ELISA
組換え糖タンパク質に対する抗ミモトープ応答を測定するためにはHCV E2糖タンパク質捕獲ELISAを使用した。ELISAプレートを50pgの2種類のネズミ抗−HCV E2モノクローナル抗体のいずれか一方によって湿潤環境下、4℃で一夜を要してコートした。これらのMabは無血清培地を使用してハイブリドーマ細胞培養物から調製し、HiTrap Protein G(Amersham/Pharmacia,Piscataway,NJ)を使用して精製した。これらの2つの抗体はE2のN末端から離間して局在する保存された決定基に結合すると考えられ、分析によればELISAまたはBIACoreで抗ミモトープ血清または抗HVR血清がE2に結合することを妨害しなかった。
【0129】
2日目、プレートを洗浄し、ブロックし、精製糖タンパク質を捕獲した。再度の洗浄後、プレートを被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で1時間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【0130】
実施例10:ウサギにおける単一ミモトープコンジュゲートの免疫原性
HCVミモトープペプチドコンジュゲートから成る個別の5つのワクチンを4羽のウサギで試験した(表3)。ホモロガス免疫配列に対する応答の端点力価(GMTとして表す)は、R9ミモトープコンジュゲートの場合は1:5.7×105、R6ミモトープコンジュゲートの場合は1:7.6×106の範囲であった。OMPC担体及びフロインドアジュバントを使用したウサギは常にこのような高い範囲の抗ペプチド力価を示した。次に、4種類のHCV H株ペプチド(Farciら,1996 P.N.A.S.93:15394−15399)を使用し、HVR配列に対するこれらの抗ミモトープ応答を試験した。
【0131】
【表3】
n.d.−試験せず
【0132】
抗ミモトープR9抗体は4種類のHVRペプチド全部を認識した。抗ミモトープR6及びF78抗体は3種類のHVRペプチド全部を認識した。他方、抗ミモトープD6抗体は3種類の変異配列しか認識せず、力価は低い値であった。抗ミモトープH1抗体はH株の変異体を全く認識しなかった。
【0133】
MPL−Aを使用して製剤化したときのコンジュゲートの免疫原性を測定するためにウサギで追加の試験を実施した。複合体及び製剤の双方が安定だったのでコンジュゲート及びMPL−AをAlPO4に吸着させた。この系で、直鎖状C末端コンジュゲート、直鎖状N末端コンジュゲート及び環状ペプチドコンジュゲートから成る3種類のミモトープM63コンジュゲートを試験した(表4)。
【0134】
【表4】
【0135】
フロインドアジュバント中で製剤化した先出のコンジュゲートに比較したとき、直鎖状C末端形では端点力価として表されるコグネイトM63ペプチドに対する応答は同様であった。更に、ヘテロロガスミモトープF78及びHCV BK株HVRペプチドに対する端点力価が>1:1.5×106であることが知見された。従って、M63ミモトープは幾つかの条件下では、ヘテロロガス配列に対する反応性が高力価である抗体を誘発する能力を有していると考えられる。N末端コンジュゲートまたは環状ペプチドコンジュゲートで免疫感作した動物から得られた免疫血清は上記のM63ミモトープに比べてほぼ100分の1以下のかなり低い端点力価を有していた。しかしながらこれらの血清はC末端コンジュゲートによって誘発された血清よりも高度にHCV H株HVR配列を認識した。
【0136】
実施例11:ウサギにおけるSCPVの免疫原性
5種類の個別のコンジュゲートと4種類の異なる多重ミモトープワクチンとの混合物をウサギ免疫原性試験で試験した。5種類の個別コンジュゲートワクチンの混合物は5種類のコグネイトペプチドに対して1:6.5×105から1:2.6×106の範囲のELISA応答を誘発した(表5)。
【0137】
【表5】
*精製したガンマグロブリンによって試験を行った
【0138】
種々の混合物について、HCV H株HVR変異体ペプチドに対するELISA力価は、一羽のウサギだけが変異体#1及び#3に応答することを示した。残りの血清はHCV H株HVR配列のいずれをも認識しなかった。
【0139】
3種類の異なるタイプのSCPVを調製し、試験し、結果を混合ミモトープ免疫動物に比較した。3種類のSCPVは、3種類のミモトープを含有する第一のワクチン、5種類のミモトープを含有する第二のワクチン、及び、6種類のミモトープを含有する第三のワクチンである。
【0140】
ペプチドのELISA試験は、SCPVもまた抗ミモトープ応答を高力価で誘発できることを示した(表5)。単一ミモトープワクチン試験及び多重ミモトープワクチン試験でミモトープに対するGMTの範囲は、6つのSCPV試験のR9ミモトープに対する1:2500という低い値からR6単一ミモトープ試験のほぼ1:7.5×106という高い値までオーバーラップした。SCPV No.2及びNo.4の双方でR9ペプチドが最も高度に結合したペプチドであった(表2)。
【0141】
全部の形態の多重ミモトープワクチンについて、主要HCV H株HVRに対する反応性について観察されたGMTはほぼ1:20,000であった。混合ワクチンと対照的に、SCPV血清は変異配列に常に反応し、BK単離物HVR配列に高い力価で反応した。全部のELISA力価を考察すると、5種類のミモトープペプチドを使用するSCPVが最も広い反応性パターンを誘発したと考えられる。
【0142】
実施例12:アカゲザルにおけるOMPCコンジュゲート、キメラ糖タンパク質及びこれらのキメラタンパク質のDNAベクターの免疫原性
アカゲザルを霊長類の免疫原性試験に使用し、ミモトープを基材とするワクチンの3つのデリバリー方法をHVR反応性抗体を広く誘発するという目標について比較した。ペプチドコンジュゲートを、5つの単一ミモトープ、5種類のミモトープから成る1つのSCPV、及び、HCV株BKのHVR配列から成る1つのコンジュゲートとして作製した。N5コンジュゲーションは低い効率で生じた。
【0143】
ペプチドELISA、ビオチニル化ペプチドの捕獲によるELISA、及び、組換えキメラE2のMab捕獲によるELISAの結果を表6A−6Cに示す。
【0144】
【表6】
【0145】
これらの実験で、最も広い反応性を示す2つの血清の組合せはM63コンジュゲートと5種類のミモトープペプチドから成るSCPVとによって構成されていた。抗M63血清は標準ELISAで10ペプチド中の5ペプチドを認識し、捕獲ELISAで11ビオチニル化ペプチド全部を認識した。SCPV動物から得られた抗−5ミモトープ血清は標準ELISAで10ペプチド中の6ペプチドを認識し、捕獲ELISAで11ビオチニル化ペプチドのうちの8ペプチドを認識した。これらの2つの組合せで147−07を除く全部のペプチドが認識される。また、HVC H株変異体#2に対する反応は低い力価であり、微量反応体(rare reactor)として分類する必要がある。従って、M63配列を使用する単一ミモトープコンジュゲートとSCPVとの組合せで21のHVR配列のうちの19配列が認識された。
【0146】
各ミモトープをディスプレーするキメラE2糖タンパク質を使用すると、免疫血清の組合せの各々はそのコグネイトミモトープをディスプレーするE2(表6C)と追加のキメラE2とを強力に認識した。SCPV誘発血清及び単一R9誘発血清の各々は6個の糖タンパク質全部を認識したが、単一F78コンジュゲート血清は6個の糖タンパク質のうちの3個にしか結合しなかった。ミモトープN5−キメラは糖タンパク質と最も反応しなかった。
【0147】
これらのミモトープを霊長類試験で免疫原として使用するために他の2つのワクチン形態を調製した。先ず、ミモトープ−E2キメラタンパク質を哺乳動物の細胞から調製し、次に、これらの同じキメラ構築物を発現するDNAベクターを作製した。各ワクチンを3匹のアカゲザルで試験し、合計では12種類のワクチンを36匹の動物で試験した。免疫血清をgpELISA対コグネイトキメラ糖タンパク質試験及びコグネイトミモトープペプチド及び全HVRペプチドを使用する全ペプチドELISAで試験した(表7A及び7B)。
【0148】
【表7】
【0149】
全部の免疫血清がそれらのコグネイトE2糖タンパク質を認識し、タンパク質ワクチン接種動物の血清は常にDNAベクターワクチン接種動物よりも大きいGMTを有していた。これらの抗糖タンパク質力価はミモトープペプチドに対して得られた力価よりも常に大きい値であった。R9−キメラタンパク質に関する1つのケースでは抗ミモトープ応答が全く観察されなかった。これは、HCV E2糖タンパク質の外層ドメインが反応性抗HVR抗体を広く誘発するための特に良好なデリバリー構造でないことを示す。
【0150】
M63免疫原及びF78免疫原の双方の形態は1:40から1:1490の範囲のGMTでH株HVR配列を最も認識する抗体を誘発したが、抗M63キメラタンパク質だけがBK株HVRペプチドを誘発した。双方の形態のワクチンによって誘発された抗H1血清はペプチド#147−08及び147−09を認識する能力を有していた。この結果は抗H1コンジュゲート血清がこれらの2つの配列と強力に反応したという観察に一致した。
【0151】
残りのペプチドに関しては、血清の完全体が有意な程度に反応しなかった。これらの結果は、キメラミモトープ−E2タンパクのDNAベクター及びこれらのミモトープ−E2タンパク質自体が弱い抗HVR免疫原であることを示唆する。ミモトープコンジュゲートについて得られた結果と考え合わせると、コンジュゲートワクチンとして正式に提示した適切なHVRミモトープの組合せが広い反応性の抗体応答を誘発する能力を有しており他の組合せ方法よりも優れていると考えられる。
【0152】
特許請求の範囲内でその他の実施態様が存在する。幾つかの実施態様を提示及び記載したが、本発明の要旨及び範囲を逸脱しない多様な変更が可能である。
(発明の背景)
肝炎C型ウイルス(HCV)は、急性、活性または持続性の非A非B型ウイルス肝炎の主な原因である。HCVは、初期感染に対する免疫応答を免れうる変異体を産生させる突然変異率が高い。(Puntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998)。HCV感染によりしばしば持続性感染が生じ、肝硬変、肝細胞癌を誘発する頻度も高い。(Alter,Blood 85:1681−1695,1995参照)。
【0002】
HCVを認識する抗体は、組換えHCVタンパク質及び人工ペプチドの双方を使用して誘発できる。HCVを認識する抗体を誘発する組換えHCVタンパク質は構造タンパク質E1及びE2を含む。(Chooら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:1294−1298,1994)。HCV中に見出されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しているがHCVタンパク質を認識する抗体を産生する能力を維持している人工ペプチドはファージディスプレーライブラリーを使用して選択された。(Prezziら,The Journal of Immunology 156:4504−4513,1996;Puntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998)。このような人工ペプチドをHCVミモトープと呼ぶ。
【0003】
(発明の概要)
本発明主目的は、HCVの種々の菌株及び変異体を認識する免疫応答を誘発できるHCVコンジュゲートである。該コンジュゲートはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と1つまたは複数のHCVミモトープとを含有している。好ましいHCVミモトープは、HCV E2タンパク質の超可変領域を認識する抗体を産生できる抗原を提供する。
【0004】
従って、第一の観点によれば本発明はHCVコンジュゲートを記載している。該コンジュゲートは、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性HCVペプチドとを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。HCVペプチドは担体に共有結合的に連結されている。また、別のタイプのHCVペプチド、反応性部位キャッピング基のような追加の基及びアニオンを担体に付着させてもよい。
【0005】
“共有結合的に連結された”という用語は、生理的条件下で加水分解に対して安定な共有結合リンカーの存在を意味する。好ましくは、共有結合リンカーは、アダクト形成、酸化及び還元のような生理的条件下で生じ得る別の反応に対して安定である。
【0006】
本発明の1つの実施態様では、共有結合的に連結された状態が“連結手段”によって得られる。本文中に記載の対応する構造、材料または作用及び等価の構造、材料または作用がこのような手段に包含される。
【0007】
免疫原性HCVペプチドは、HCVを認識する免疫応答を誘発できる1つまたは複数の抗原決定基を含む。好ましい抗原決定基は、HCVの種々の菌株及び変異体を認識する抗体を誘発できるHCVミモトープである。HCVペプチドの例は、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7のHCVミモトープ配列から成るペプチドである。
【0008】
好ましくは、HCVコンジュゲートが、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性HCVペプチドPEP1と免疫原性HCVペプチドPEP2とから成り、ここにPEP1及びPEP2の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なる配列を含んでいるか、または、医薬として許容されるその塩から成る。HCVコンジュゲートは、配列1−7から成る2つのペプチドに加えて、配列1−7のペプチドを非限定例とする追加のペプチドを含有し得る。
【0009】
別の観点によれば本発明は、(a)ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の反応性部位に複数のリンカーを連結する段階と、(b)該複数のリンカーに2つまたはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドを連結する段階と、(c)段階(b)の生成物をキャッピングする段階とから成る方法によって製造されるHCVコンジュゲートを記載している。免疫原性ペプチドに反応しないリンカーにキャッピング基を付着させることによってキャッピングが行われる。2つまたはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドの各々は、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7から成る。
【0010】
反応性部位はコンジュゲーションが可能な基である。好ましい反応性部位は、リシンのイプシロンアミノ基のような求核部位である。複数のリンカーという用語は2個以上のリンカーを意味する。
【0011】
方法は、1つまたは複数のアニオンの連結、及び、配列1−7から成るペプチド以外の追加のHCV免疫原性ペプチドの連結のような追加段階を含み得る。配列1−7で示される2個またはそれ以上の異なるHCV免疫原性ペプチドに加えてこのような追加のHCV免疫原性ペプチドが含まれている。
【0012】
別の観点によれば本発明は、本文中に記載の第一及び第二の異なるHCVコンジュゲートを含むHCVコンジュゲート混合物を記載している。好ましくは、第一のHCVコンジュゲートは、配列1−7から成る第一の免疫原性HCVペプチド、配列2から成る第二の免疫原性HCVペプチド及び配列4から成る第三の免疫原性HCVペプチドに共有結合的に連結されたポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第二のコンジュゲートは、配列7から成る免疫原性HCVペプチドを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第一及び第二のHCVコンジュゲートは、追加のタイプのHCVペプチド、反応性部位キャッピング基及びアニオンのような夫々の担体に付着された追加の基を含有し得る。
【0013】
別の観点によれば本発明は、被験者の体内で免疫応答を誘発する方法を記載している。該方法は、有効量の本文中に記載のHCVコンジュゲートを被験者に接種する段階を含む。
【0014】
別の観点によれば本発明は、多数の免疫原性HCVペプチドを含有するHCVコンジュゲートの製造方法を記載している。該方法は複数のペプチドを担体に同時にコンジュゲーションする段階を含む。
【0015】
別の観点によれば本発明は、HCVを認識する抗体を含有する抗血清を記載している。このような抗血清は、(a)有効量の本文中に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、(b)該被験者から抗体を採取する段階とから成る方法によって製造される。
【0016】
本発明のその他の特徴及び利点は、種々の実施例を含む本文中の以後の記載から明らかであろう。提示された実施例は本発明の実施に有用な種々の化合物及び方法を記載している。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。当業者は本文中の開示に基づいて本発明の実施に有用な別の化合物及び方法を見出し、それらを使用することができるであろう。
【0017】
(詳細な説明)
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と1つまたは複数のHCVミモトープとを含有するHCVコンジュゲートに関する。該コンジュゲートは、免疫応答を誘発するために使用されたHCVミモトープを認識する抗体並びにHCVの種々の菌株及び変異体を認識する抗体の誘発能を有している。
【0018】
抗原を使用して免疫応答を誘発するために種々の技術を使用できる。以下に提示された実施例は、免疫応答タンパク質の複合体から成る担体を使用すること及び特定の抗原または組合せ抗原を使用することによって得られた利点を表すデータを含んでいる。これらの結果は、免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質の複合体を含有するコンジュゲートの一部として被験者に接種されたHCVミモトープが、キメラミモトープ−E2タンパク質及びキメラミモトープ−E2タンパク質のDNAベクターのような別の技術を使用して被験者に接種された同じHCVミモトープペプチドに比べてより免疫応答を有利に誘発することを示唆する。
【0019】
更に、組合せ抗原は、複数の個別コンジュゲートを含有する混合液中に存在する場合よりも単一コンジュゲート中に存在する場合に交差反応性抗体をより効率的に誘発することが知見された。このような組合せ抗原は好ましくは同時コンジュゲーション技術によって得られる。
【0020】
HCVコンジュゲートは被験者の体内で免疫応答を誘発するために有効である。免疫応答の結果として、HCVを認識する抗体が産生される。免疫応答の発生及びその結果として生じる抗体の産生は治療または診断の用途で使用できる。
【0021】
“被験者”という用語は、抗体を産生し得る哺乳動物を意味する。被験者の例は、ヒト、チンパンジー、マウス及びウマである。好ましい被験者はヒトである。抗HCV抗体を産生するために、HCVに感染していないその他の被験者も使用できる。
【0022】
診断用途としては、試験中の被験者の体内のHCVの存在を検出するためにHCV抗体を使用する。このような抗体は、本文中に記載のHCVコンジュゲートを使用して免疫応答を生じるように誘発された被験者から得られる。
【0023】
治療用途としては、HCV感染患者を治療したり、被験者を予防的に処置したりする。このような用途では、HCV中和抗体を使用するかまたは産生させる。本文中に記載のHCVコンジュゲートが種々の菌株及び変異体と反応する抗体の産生能は、HCVの初期感染を治療または阻止するため、及び、in vivoに生じたHCVの突然変異体を防御するために有用である。
【0024】
免疫原性HCVペプチド
免疫原性HCVペプチドは1つまたは複数のHCVミモトープを含み、更に、他の基を含有し得る。好ましい他の基は、免疫応答を増強する基及び担体とのコンジュゲーションに関与する基である。免疫応答の増強に有効な他の基としては、インバジンの免疫促進性ドメインまたはヘルパーT細胞エピトープを含有するペプチドのような免疫原性ペプチドがある。(例えば、Wang,国際公開WO99/66957及びWang,米国特許第5,759,551号参照)。
【0025】
HCVミモトープの選択方法及び特定のミモトープに関してはNicosiaら,WO99/60132及びPuntorieroら,EMBO Journal 17:3521−3533,1998に記載されている(双方の文献は参照によって本発明に含まれるものとする)。同定されたHCVミモトープは標準コンジュゲーション技術を使用して製造できHCVコンジュゲートに組込める。
【0026】
免疫原性HCVペプチドはタンパク質中に見出される常在アミノ酸及びタンパク質中に普通には見出されない非天然アミノ酸とから構成され得る。タンパク質中に見出される常在アミノ酸はL鏡像異性体である(キラル中心をもたないグリシンは除外)。タンパク質中に見出される常在アミノ酸を表すために以下の標準名称を使用する:
A=Ala=アラニン;
C=Cys=システイン;
D=Asp=アスパラギン酸;
E=Glu=グルタミン酸;
F=Phe=フェニルアラニン;
G=Gly=グリシン;
H=His=ヒスチジン;
I=Ile=イソロイシン;
K=Lys=リシン;
L=Leu=ロイシン;
M=Met=メチオニン;
N=Asn=アスパラギン;
P=Pro=プロリン;
Q=Gln=グルタミン;
R=Arg=アルギニン;
S=Ser=セリン;
T=Thr=トレオニン;
V=Val=バリン;
W=Trp=トリプトファン;及び
Y=Tyr=チロシン。
【0027】
HCVコンジュゲートは1つまたは複数の異なる免疫原性HCVペプチドを含有し得る。好ましくは、少なくとも1つの免疫原性HCVペプチドが、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6または配列7のHCVミモトープ配列を含むか、該ミモトープ配列から本質的に構成されるかまたは構成されている。“本質的に構成される”という表現は、ミモトープの免疫応答誘発能力を実質的に変化させない追加の基が存在してもよいことを意味する。本質的に構成されるという表現に包含される追加の基の例はリポーターアミノ酸及びコンジュゲーション関与基である。
【0028】
後述の実施例で配列1−7として使用した配列及び呼称を以下に示す:
【0029】
【化10】
【0030】
配列1−7中のXの各々は、グルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンを表す。場合によっては、配列3のペプチド中のN末端グルタミンからピログルタミンが自然に形成されることが知見された。
【0031】
本発明の1つの実施態様では免疫原性HCVペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている:
【0032】
【化11】
【0033】
配列8−14は配列1−7にX1X2が付加された配列に対応しており、ここにX1はリポーターアミノ酸であり、X2はイオウ含有アミノ酸である。配列8−14のXの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【0034】
リポーターアミノ酸は上記に列挙した20種類の一般的なアミノ酸以外のアミノ酸である。リポーターアミノ酸の例を以下に示す:Nva−ノルバリン;Nle−ノルロイシン;Abu−2−アミノ酪酸;Dbu−2,4−ジアミノ酪酸;Dpr−2,3−ジアミノプロピオン酸;及びChg−シクロヘキシルグリシン。
【0035】
イオウ含有アミノ酸は反応性イオウ基を含有している。イオウ含有アミノ酸の例は、システイン及び非天然アミノ酸、例えばホモシステインである。更に、活性化及び担体との反応の前には反応性イオウがジスルフィド形態で存在してもよい。
【0036】
本発明の別の実施態様では、免疫原性HCVペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている:
【0037】
【化12】
【0038】
配列15−21は、X1リポーター基(配列15−21ではX3として表す)がノルバリン、ノルロイシン、2−アミノ酪酸、2,4−ジアミノ酪酸、2,3−ジアミノプロピオン酸またはシクロヘキシルグリシンを表し、X2イオウ含有アミノ酸がシステインを表す配列8−14に対応する。配列15−21中のXの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【0039】
2つ以上のミモトープを含有する免疫原性HCVペプチドの例は配列22及び23によって表される。配列1及び7の双方のミモトープを含有する配列22及び23は以下の配列で表される:
【0040】
【化13】
配列中のX、X1、X2及びX3は上記の定義と同義である。
【0041】
ペプチドは当業界で公知の技術を使用して製造できる。このような技術としては化学合成及び生化学合成がある。ポリペプチドの化学合成技術の例は、Vincent,Peptide and Protein Drug Delivery,New York,N.Y.,Dekker,1990に提示されている。核酸の細胞内導入及び核酸の発現を含む生化学合成技術の例は、Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987−1998及びSambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989に提示されている。
【0042】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体
HCVミモトープはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体に共有結合的に連結されている。担体は、多数の抗原を含有するコンジュゲート作製用の骨格に供するために、また、免疫応答を増強するために使用され得る。
【0043】
ポリペプチド及びタンパク質複合体担体としては免疫応答を増強し得る免疫原性担体が好ましい。免疫応答の増強は例えば、Tヘルパー細胞エピトープを供するかまたはアジュバント活性を供することによって得られる。免疫原性担体の例は、Neisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体(OMPC)、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、OMPC由来のMMP、ジフテリアトキソイド、肝炎B型ウイルスの表面抗原、肝炎B型ウイルスのコア抗原、及び、ヒトのロタウイルスVP6カプシドタンパク質である。
【0044】
好ましい担体はOMPCである。OMPCはコンジュゲーションに使用できる多数の基を保有している。基のコンジュゲーション適性は、供与される基のタイプ及びOMPC中の基の位置に依存する。コンジュゲーションに使用できる求核官能基は当業界で公知の技術を使用して決定できる。(Eminiら,米国特許第5,606,030号参照)。コンジュゲーションに使用できる基のタイプの1つは、リシンのイプシロンアミノ基及びタンパク質のN末端アミノ酸のアルファアミノ基のようなアミノ酸に存在する一次アミノ基である。OMPCはFuの米国特許第5,494,808号に記載されているような当業界で公知の技術を使用して得ることができる。
【0045】
免疫原性HCVペプチドの組合せ
本出願は、HCVの種々の菌株及び変異体に交差反応する抗体を誘発するために使用できるHCVミモトープの好ましい組合せ、及び、好ましい1つのミモトープを同定する。ミモトープの組合せは種々のコンジュゲートの混合液として使用することもできるが、種々のミモトープの組合せたものを含有する多重コンジュゲートを製造したほうが効力は大きいと考えられる。
【0046】
多重コンジュゲート
1つの好ましい実施態様では、コンジュゲートが、担体に連結された2つまたはそれ以上の異なるタイプの免疫原性HCVペプチドと、担体に連結された1つまたは複数のキャッピング基とを含むか、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、担体に連結された1つまたは複数のアニオンを含有し得る。他の実施態様では、少なくとも3つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、3つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、4つの異なるタイプの免疫原性HCVペプチドが存在するか、5つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在するか、または、6つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在する。
【0047】
多重コンジュゲートは好ましくは、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なるHCVミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成された2つまたはそれ以上の免疫原性HCVペプチドを含有している。免疫原性HCVペプチドの各々は、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に連結され得る。好ましくは、このようなペプチドは以下の構造に記載されたようにOMPCにコンジュゲーションされている。
【0048】
免疫原性HCVペプチドの組合せ例としては、以下の配列を含む組合せがある:(1)配列1、2及び4;(2)配列1、3及び5;(3)配列1、2、3、4及び5;(4)配列1、3、4、5及び6;(5)配列1、3、4、5及び7;(6)配列2、3、4、5及び22;(7)配列1、2、3、4、5及び7。好ましくは、このようなペプチドの組合せが以下の構造に記載するようにOMPCにコンジュゲーションされている。
【0049】
OMPCへのコンジュゲーションを記載する本発明の実施態様では、コンジュゲートが以下の構造:
【0050】
【化14】
〔式中、
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
L1はPEP1をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はPEP2をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はPEP3をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々は同じでも異なっていてもよく、
L4はPEP4をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL4の各々は同じでも異なっていてもよく、
L5はPEP5をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL5の各々は同じでも異なっていてもよく、
L6はPEP6をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL6の各々は同じでも異なっていてもよく、
L7はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL7の各々及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
L8はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL8の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6が免疫原性ペプチドであり、但し、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6のうちの少なくとも2つが、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5及び配列6から成るグループから選択された配列を含み、
a、b、c、d、e、f、g及びhの各々は個別に選択された結合負荷であり、a、b、c及びhの各々は0よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【0051】
キャッピング基はリンカーの反応性基と反応でき、キャッピング基に付着した該反応性基が以後の反応を受ける能力を阻害する化学的部分である。種々のリンカーに対して適当なキャッピング基は容易に得られる。例えば、マレイミド活性化OMPCに対して適当なキャッピング基は、N−アセチルホモシステイン、n−アセチルシステイン及びメルカプトエタノールようなチオール含有化合物である。アニオン性または非アニオン性のキャッピング基のような別のタイプのキャッピング基も使用できる。好ましくはコンジュゲート中に存在する複数のキャッピング基が同じ化学構造を有している。
【0052】
“結合負荷”は、特定の基のモル数をリシンのモル数で除算して100を乗算した値を表す。好ましくは、a+b+c+d+e+f+g+hの結合負荷は約25である。総合的に、a+b+c+d+e+fの結合負荷は好ましくは約5から約20の範囲であり、存在する個々の要素の結合負荷は好ましくは少なくとも約0.2である。別の実施態様では、総結合負荷a+b+c+d+e+fは少なくとも6、7または8であり、18、19または20以下である。a、b、c、d、e及びfが存在するとき(即ち、0よりも大きい値のとき)、これらの個々の結合負荷は少なくとも約0.4、好ましくは少なくとも約1である。
【0053】
好ましくは、存在するL1、L2、L3、L4、L5、L6、L7及びL8の各々が独立に構造:
【0054】
【化15】
〔式中、OMPCは“z”位に連結され、
Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
R1及びR2の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−SO3Hであり、R1及びR2の他方がPEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP6、アニオンまたはキャッピング基の連結位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸である〕を有している。
【0055】
“アルキレン”という用語は、炭素原子間の炭素−炭素単結合だけを含有している炭化水素基を意味する。アルキレン炭化水素基は1−12個の炭素原子を有しており、直鎖状であるかまたは1つもしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有し得る。アルキレン基は2つの場所で別の官能基または構造部分に付着している。好ましくはアルキレン基は−(CH2)0−3−C6H10−(CH2)0−3または−(CH2)0−3−C5H8−(CH2)0−3−であり、より好ましくはアルキレンは−C6H10−または−C6H10−CH2−である。
【0056】
“置換アルキレン”という用語は、1つまたは複数の水素が−NH2、−NHCOCH3、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−OH、−CN、−SH、−NO2、1−5個のハロゲンで置換された−C1−2アルキル、−CF3、−OCH3または−OCF3から成る部分によって置換されたアルキレンを意味する。
【0057】
“アルキル”という用語は、炭素−炭素単結合によって連結された1−8個の炭素原子から成る炭化水素基を意味する。アルキル炭化水素基は直鎖状でもよく、または、1もしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有してもよい。好ましくは、アルキルは1−4個の炭素原子である。
【0058】
“置換アルキル”という用語は、1個または複数の水素が−NH2、−NHCOCH3、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−OH、−CN、−SH、−NO2、1−5個のハロゲンで置換された−C1−2アルキル、−CF3、−OCH3または−OCF3から成る部分によって置換されたアルキルを意味する。
【0059】
好ましくは、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6の各々が、配列8、配列9、配列10、配列11、配列12、配列13、配列14及び配列22から成るグループ、または、配列15、配列16、配列17、配列18、配列19、配列20、配列21及び配列23から成るグループから選択された異なる配列から構成され、そのカルボキシ末端アミノ酸のイオウを介してOMPCに連結されている。
【0060】
より好ましい実施態様では、存在するL1、L2、L3、L4、L5、L6、L7及びL8の各々が独立に以下の構造:
【0061】
【化16】
〔式中、OMPCは“z”位に連結され、R1及びR2は上記と同義である〕を有している。好ましくは、gは0である(即ち、アニオン及びL7は存在しない)。
【0062】
M63コンジュゲート
別の好ましい実施態様では、HCVコンジュゲートがポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含有しており、(1)配列7のHCVミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成されるかもしくは構成されている免疫原性HCVペプチドと、(2)担体に連結された1つまたは複数のキャッピング基と、を含むか、または、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、該コンジュゲートはまた、(3)担体に連結された1つまたは複数のアニオンを含有してもよい。
【0063】
本発明の1つの実施態様では、コンジュゲートが以下の構造:
【0064】
【化17】
〔式中、
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
L1はHCVペプチドをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
n、m及びpの各々は個別に選択された結合負荷であり、n及びpの各々は0よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【0065】
好ましくは、n+m+pの結合負荷は約25である。別の実施態様では、nが少なくとも約0.4、少なくとも約1、少なくとも約3、少なくとも約5、または、少なくとも約8であり、約20以下、または、約18以下である。
【0066】
好ましい実施態様では、L1、L2及びL3の各々が独立に以下の構造:
【0067】
【化18】
〔式中、
OMPCは“z”位に連結され、
Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
R3及びR4の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−SO3Hであり、R3及びR4の他方が免疫原性ペプチド、アニオンまたはキャッピング基の結合位置であり、好ましくはR3及びR4の一方が水素である〕を含有している。
【0068】
アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基に関しても上記と同義である。好ましくは、免疫原性HCVペプチドが配列14または配列20から構成され、カルボキシ末端アミノ酸のイオウ基を介してOMPCに連結されている。
【0069】
より好ましい実施態様では、L1、L2及びL3が独立に以下の構造:
【0070】
【化19】
を有している。式中のR3、R4及び“z”は上記と同義である。
【0071】
本発明の種々の実施態様において、存在するアニオンの各々は、カルボン酸、スルホン酸またはリン酸であり、また、アニオンが全く存在しなくてもよい(mが0であり、L2が存在しない)。
【0072】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の形成
HCVミモトープを含有する免疫原性HCVペプチドは、当業界で公知のコンジュゲーション技術(Tolmanら,米国特許第5,274,122号、Eminiら,米国特許第5,606,030号、Conleyら,米国特許第5,763,574号参照)を使用し、共有結合リンカーを介してポリペプチド及びタンパク質の複合体から成る担体にコンジュゲーションできる。コンジュゲートはまた、例えば1つまたは複数のアニオン基を含有するように修飾できる。
【0073】
免疫原性HCVペプチドまたはアニオンを担体に連結する共有結合リンカーは生理的条件下で安定である。このようなリンカーの例は、非特異的架橋剤、モノジェネリックスペーサー及びバイジェネリックスペーサーである。
【0074】
非特異的架橋剤及びそれらの使用は当業界で公知である。このような試薬及びそれらの使用例としては、グルタルアルデヒドとの反応、スクシニル化担体を添加してまたは非添加で行うN−エチル−N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドとの反応、グリコシル化置換基を過ヨウ素酸塩で酸化し次いでホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムの存在下でタンパク質担体の遊離アミノ基に結合させる反応、芳香族アミノ基をジアゾ化し次いでタンパク質のチロシン側鎖残基に結合させる反応、イソシアナートとの反応、混合無水物との反応がある。全般的にはBriandら,J.Imm.Meth.78:59,1985参照。
【0075】
モノジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。モノジェネリックスペーサーは二官能性であり、コンジュゲーションが生じる前に一対の反応要素の一方だけを官能化する必要がある。モノジェネリックスペーサー及びその使用の一例は、カルボジイミドの存在下で二官能分子アジピン酸ジヒドラジドの一端に免疫原性HCVペプチドを結合させる処理である。ジアシル化ヒドラジンがグルタミンまたはアスパラギン側基と共に担体のカルボキシル基を形成すると推定される。次いで、カルボジイミドの存在下に第二の結合反応で担体タンパク質と反応させるとコンジュゲーションが生じる。
【0076】
バイジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。バイジェネリックスペーサーは、一対の反応要素の各々が官能化された後に形成される。官能化された反応要素の各々が対応する反応要素と反応して1つまたは複数の安定な共有結合を形成したときにコンジュゲーションが生じる。(例えば、Marburgら,J.Am.Chem.Soc.108:5282−5287,1986;Marburgら,米国特許第4,695,624号参照)。
【0077】
種々のプロセスの例を以下に挙げる。
【0078】
プロセス1
1a.タンパク質担体求核基の画分を試薬と反応させてチオール基を形成する。このような試薬の一例はN−アセチルホモシステインチオラクトンである。
【0079】
1b.段階1aの生成物を求核基と生理的pHで負電荷をもつアニオンとを含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸である。
【0080】
1c.段階1bの生成物を求電子基が付加されるように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【0081】
プロセス2
2a.タンパク質担体求核基の画分を二官能求電子試薬と反応させて求電子性タンパク質を形成する。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【0082】
2b.段階2aの生成物を求核基とアニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はα−メルカプト酢酸である。
【0083】
2c.段階2bの生成物をチオール基のような求核基を含む免疫原性ペプチドと反応させる。
【0084】
プロセス3
3a.タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期(incipient)アニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の例はN−(ブロモアセチル)−6−アミノカプロール酸及びコハク酸無水物である。
【0085】
3b.段階3aの生成物の求核基の残留画分を、タンパク質担体にチオール基を形成する試薬、例えばN−アセチルホモシステインチオラクトンと反応させる。
【0086】
3c.段階3bの生成物を求電子基例えばマレイミドを含む基が付着するように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【0087】
プロセス4
4a.タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期アニオンとの双方を含む試薬、例えばN−(ブロモアセチル)−6−アミノカプロン酸及びコハク酸無水物と反応させる。
【0088】
4b.段階4aの生成物の残留タンパク質求核基を二官能性求電子試薬と反応させてタンパク質に求電子部位を付加する。このような試薬の例は、マレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【0089】
4c.段階4bの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【0090】
プロセス5
5a.タンパク質担体アミノ基の画分を構造:
【0091】
【化20】
〔式中、Rはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、R1は水素、アルキル、置換アルキル及び−SO3Hから成るグループから選択され、ここに、アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基も上記と同義である〕を有している架橋剤と反応させる。
【0092】
5b.段階5aの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【0093】
プロセス1−5は一般に、1つの段階の余剰試薬を第二段階の開始前に除去し未反応の官能基をキャッピングするという追加段階を含むであろう。以下の反応スキームはコンジュゲートを製造するために使用したプロセス5を追加段階と共に示す。反応スキーム中で担体、架橋剤、キャッピング基及びミモトープを表す成分は単なる代表例である。本発明の開示に基づいて当業者は反応スキームに示した成分を当業界で公知の成分及び本文中に記載の成分で置換できるであろう。
【0094】
【化21】
【0095】
製剤化及び投与
HCVコンジュゲートは本文中に提示した指針を当業界で公知の技術と共に使用して製剤化し患者に投与し得る。医薬投与に関する全般的指針は例えば、Modern Vaccinology,Ed.Kurstak,Plenum Med.Co.1994;Remington′s Pharmaceutical Sciences 18th Edition,Ed.Gennaro,Mack Publishing,1990;及びModern Pharmaceutics 2nd Edition,Eds.Banker and Rhodes,Marcel Dekker,Inc.,1990に提示されている。これらの文献の各々は参照によって本発明に含まれるものとする。
【0096】
HCVコンジュゲートは酸性塩または塩基性塩として製造できる。医薬として許容される塩(水溶性もしくは油溶性または水分散性もしくは油分散性の物質)としては、慣用の無毒性塩、または、例えば無機または有機の酸または塩基から形成される第四級アンモニウム塩がある。このような塩の例には酸付加塩と塩基の塩とがあり、酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、ウンデカン酸塩があり、塩基の塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウムの塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウムの塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N−メチル−D−グルカミンのような有機塩基との塩、アルギニン及びリシンのようなアミノ酸との塩がある。
【0097】
種々の用量のHCVコンジュゲートを静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内のような種々の経路で投与できる。好ましい経路は筋肉内である。
【0098】
適当な投与計画は好ましくは、患者の年齢、体重、性別及び病態、投与経路、所望の効果、使用される特定化合物のような当業界で公知の要因を考慮に入れて決定される。コンジュゲートは、多段階免疫接種フォーマット(multi−dose vaccine formats)で使用できる。1回の用量は合計タンパク質が1μg−1.0mgの範囲になる量であると予測され、本発明の好ましい実施態様ではこの範囲が0.1mg−1.0mgである。
【0099】
HCVコンジュゲートは好ましくはアジュバントと共に製剤化される。アジュバントの例は、ミョウバン、AlPO4、アルヒドロゲル、リピドA及びそれらの誘導体または変異体、フロインドの完全または不完全アジュバント、中性リポソーム、並びに、ワクチンとサイトカインまたはケモカインとを含有するリポソームである。
【0100】
投与適期は当業界で公知の要因に依存する。初回投与の後、抗体価を維持するために1回または複数のブースター用量を引き続き投与してもよい。投与計画の一例は、初日の投与及び1カ月後の投与、4、6または12カ月後の3回目の投与から成り、また、必要ならばもっと間隔をおいて追加のブースター用量を投与する。
【0101】
実施例
本発明の別の特徴を更に説明するために以下の実施例を提示する。実施例はまた本発明を実施するために有用な方法を示す。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【0102】
実施例1:ペプチド合成
(市販のソースを使用する)固相FMOC化学法によってペプチドを直鎖状配列として所望通りに合成(custom synthesize)した。RP−HPLCで判定して全部のペプチドが>90%の純度を有していた。一般的に、各ペプチドは27−merのミモトープとカルボキシ末端から2番目の非天然残基とカルボキサミドとして存在するカルボキシ末端システインとを含む29残基から構成されていた。このようなペプチドの例を以下に示す:
配列24 XTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNX3C(ここにX3はNleである),
配列25 XTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNX3C(X3はChgである),
配列26 XTTTTGGQVSHATHGLTGLFSLGPQQKX3C(X3はNvaである),
配列27 XTTVVGGSQSHTVRGLTSLFSPGASQNX3C(X3はDprである),
配列28 XTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQKX3C(X3はAbuである),
配列29 TTTTTGGQVGHQTSGLTGLFSPGAQQNX3C(X3はDbuである),
配列30 TTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQNX3C(X3はNleである),
配列31 XTHTTGGVVSHQTRSLVGLFSPGPQQNX3C(X3はNleである)。
【0103】
配列24−31中のXの各々はグルタミンまたはピログルタミンであり、好ましくはグルタミンである。Xがグルタミンを表すペプチドを合成した。
【0104】
アミノ末端の連鎖を試験するために、N末端グリシンと、システインと、非天然残基と、末端残基がカルボキサミドとして存在する27−merのミモトープ配列とを含む30−merとしてペプチドを合成した。
【0105】
環化ミモトープペプチドを試験するために、合成及び環化は以前に公表された戦略に従った(Conleyら,Vaccine 12:445−451,1994)。簡単に説明すると、N末端グリシン、システイン、リシンをもち、続いて27−merミモトープ配列をもち、カルボキシ末端から2番目に他のアスパラギン酸をもち、カルボキシ末端に非常在(unusual)アミノ酸をもつペプチドを合成した。リシンのε−アミノとアスパラギン酸のβ−カルボキシルとを縮合させると環状生成物が得られた。
【0106】
所望通りに合成した肝炎C型ウイルス領域由来ペプチド(HVR)をELISA抗原として使用した。これらは、ビオチン基非使用で製造するか(表1A)、または、ビオチン基を使用しそれぞれ標準ペプチド吸着型もしくはストレプトアビジンビオチン捕獲型のELISAフォーマットに適するように製造した(表1B)。
【0107】
【表1】
【0108】
実施例2:ペプチドコンジュゲート
N.meningitidis OMPCを、過剰量のヘテロ二官能性架橋剤スルホスクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(sSMCC,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)と2−8℃で2時間反応させることによってpH8.0(10mMのHEPPSバッファ)で活性化した。活性化したOMPCを300K MWCO DispoDialyser(Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguea,CA)を使用して10mMのHEPPS,pH8.0または1.0mMのMOPS,pH7.1に2−8℃で18−24時間透析した。透析中にバッファを3回交換してスルホNHS及び余剰のsSMCCを除去した。
【0109】
チオール含有ミモトープペプチドの各々を加えることによって個々の反応を進行させた。次に、OMPCの未反応マレイミド基をN−アセチルシステイン(NAC)と反応させ、次いで300K MWCO DispoDialyserによって10mMの(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−3−プロパンスルホン酸(HEPPS),pH8.0に透析して、余剰の未結合ペプチド及びNACを除去した。
【0110】
全OMPCリシンに対するミモトープペプチドの結合負荷のパーセントを、リシンのモル数に対するミモトープ中の非天然アミノ酸のモル数の比に100を乗算することによって計算した。6NのHCl中で110℃で20時間処理することによって酸加水分解したコンジュゲートのアミノ酸解析に基づいて定量を行った。リシン含有ミモトープについては、OMPC由来のリシンの割合が得られるようにリシンの測定値を補正した。BSAを標準として使用するLowryアッセイによってタンパク質濃度を測定した。OMPCのタンパク質成分とミモトープペプチドとが共有結合的に連結したことを証明するためにSDS−PAGE分析を行った。結合負荷は8−19%の範囲であった。
【0111】
試験したワクチンの幾つかは、3、5または6個が同時にコンジュゲーションした多重ミモトープを用いて製造した。これらを同時コンジュゲートペプチドワクチン(SCPV)と呼ぶ。これらのSCPVのミモトープ成分、及び、各ミモトープペプチドに会合した“リポーター”アミノ酸を表2に示す。SCPV調製物中のOMPCに対するペプチドの結合度を測定するために、他の非反復の“リポーター”アミノ酸を各ミモトープのC末端から2番目の残基として組込んだ。
【0112】
【表2】
略号:Nva−ノルバリン、Nle−ノルロイシン、Abu−2−アミノ酪酸、Dbu−2,4−ジアミノ酪酸、Dpr−2,3−ジアミノプロピオン酸、Chg−シクロヘキシルグリシン
【0113】
実施例3:DNAベクター免疫原
霊長類へのDNAデリバリーによって免疫応答を誘発するために個別の6つの発現プラスミドを構築した。6つのミモトープ配列、即ち、配列1、3、4、5、6及び7を個別に菌株NのHCV E2の外層ドメイン(ectodomain)配列(Hayashiら,J.Hepatol.17:S94−S107,1993)に付着させて、キメラタンパク質を産生させた。HVRコーディング配列をこのE2配列から取出し、カルボキシル末端に(his)6タグを付加した。これらの構築物を組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)リーダー配列とインフレームさせてプラスミドV1jnstpaにクローニングした(Montgomeryら,Pharmacol.Ther.74:195−205,1997)。
【0114】
全部の構築物をDNA配列解析によって検証した。50μg/mlのカナマイシンを補充したTerrificブロス,1×塩中で増殖させた形質転換大腸菌DH5α株の培養物からプラスミドの大量調製物を調製した。標準法によってプラスミドを抽出した後、DNAをCsCl密度勾配中で2回収集し、10mMのトリス,pH8.0、1mMのEDTAに十分に透析し、200mMの酢酸ナトリウムを含有する溶液からエタノール沈殿させた。
【0115】
実施例4:糖タンパク質免疫原
293T細胞培養物中の一過性発現による分泌産物として6つのキメラミモトープ含有糖タンパク質を産生させた。一般的な発現手順に従い、293T細胞をポリ−D−リシンで被覆した175cm2容のフラスコ(BioCoat,Becton−Dickinson)中で培養し、60−70%の集密度でトランスフェクトした。
【0116】
滅菌した10mMのトリス、1mMのEDTA,pH8.0中に1μg/μlのDNAをフラスコあたり約25μgの割合で使用し、指示された量のLipofectamine Plusキット(GIBCO)のLipofectamine Plus成分と混合した。この溶液を、75μlのリポフェクタミンを含有する2.0mlのOpti−MEMと混合し、指示通りにインキュベートした。この4.0mlを、15mlの新しいOpti−MEMを既に収容しているフラスコに加えた。5−6時間後、Opti−MEMを基材とするリポフェクタミン−DNA培地を除去し、L−グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充した24mlのタンパク質非含有培地(CELLGRO Free−complete serum,protein,hormone,growth factor free medium,CellGro,Herndon VA)で交換した。この培地をトランスフェクション後の24時間毎に採取し、3つの採取材料を低速遠心によって清澄化し、全部の材料が収集されるまで4℃で保存し、プールし、0.22μフィルターで濾過した。次に培地を10mMのイミダゾール、0.5MのNaCl、20mMのリン酸ナトリウム,pH7.8(出発バッファ)に透析し、0.22μフィルターを使用して再び濾過した。
【0117】
約2.0Lの材料を10ml容のNi−NTAカラム(Qiagen,Valencia,CA)に、4℃で約3ml/分の流速で充填した。カラムを出発バッファで洗浄し、次いで、(a)20mMのイミダゾールを加えた40mlのバッファ、(b)40mMのイミダゾールを加えた10mlのバッファ、(c)100mMのイミダゾールを加えた30mlのバッファ、及び、(d)250mMのイミダゾールを加えた15mlのバッファによって段階的に溶出させた。100mMのイミダゾールバッファによって本質的に全部のキメラ糖タンパク質が溶出した。各糖タンパク質の主要な溶出画分の部分量を、N末端タンパク質配列解析のためには水に透析し、ELISA試験のためにはリン酸塩緩衝生理食塩水に透析し、以後のワクチン製剤化のためには5mMのトリエタノールアミン、150mMのNaCl,pH7.8に透析した。
【0118】
純度は、SDS−PAGE及びウェスタンブロットを順次行うことによって測定した。ウェスタンブロットには抗−HCV gpE2に特異的なネズミのモノクローナル抗体または抗−tetra−his抗体(Qiagen,Valencia,CA)を使用した。リーダープロセシングの同定及び完了はN末端アミノ酸配列解析によって確認した。タンパク質配列解析は、これらの全部のタンパク質のtPAリーダーの開裂がリーダー残基22と23とのproとserとの間で生じたことを示した。他方、天然型tPAでは正常な開裂が23位と24位(serとgln)との間で生じる(Siebert and Fong,Nucleic Acids Res.18:1086,1990)。
【0119】
実施例5:ワクチン製剤
ウサギで行った最初の試験では、フロインドの完全アジュバンド及び不完全アジュバンド中で製剤化したペプチドコンジュゲートワクチンを使用した。ペプチドOMPCコンジュゲートワクチンを10mMのHEPPS,pH8.0中に500μgの全タンパク質用量で調製した。以後の試験は、モノホスホリルリピド−A(MPL−A)を予め吸着させた6mMのトリエタノールアミン生理食塩水pH7.0−8.0中の1.4mg/mlのAlPO4に各用量を吸着させて行った。AlPO4対MPL−Aの重量比は3.5対1であった。
【0120】
また、精製したキメラタンパク質を5mMのトリエタノールアミン、150mMのNaCl,pH7.8中に500μgの全タンパク用量で調製した。ミョウバン対MPL−Aの重量比3.5対1でMPL−Aを予め吸着させたミョウバンに各用量を吸着させた。DNAベクターワクチンを無菌のPBS,pH7.5に5.0mg/mlで再懸濁させた。
【0121】
実施例6:免疫原性試験
ニュージーランド白ウサギ(2−2.5Kg)に対して各試験の開始時、4週目及び8週目に免疫原を注射した。隔週1回の割合で12週目まで動物から採血し、血清を調製した。アカゲザルMacacus mulatta(>2,5Kg)をミモトープOMPCコンジュゲートワクチン及びキメラミモトープ糖タンパク質ワクチンで、初日及び4、8及び26週目に免疫感作した。
【0122】
各用量を筋肉内に接種し、各三角筋の2つの部位の間に均等に分布させた。サルを無菌PBS中で調製したDNAベクターワクチンによって免疫感作した。No.3のシリンジを装着したBiojector(Bioject,Inc.Portland,OR)のニードレスデバイスを使用して各動物に筋肉内接種した。各用量を各四頭筋の2つの部位の間に均等に分布させた。12週目まで隔週1回、24週目まで月1回、次いで32週目まで再び隔週1回の割合で動物から採血し、血清を調製した。
【0123】
実施例7:ウェスタンブロットアッセイ
組換えタンパク質のウェスタンブロットアッセイは、4×NuPageバッファ中でサンプルを調製し、予め形成した4−12%NuPageゲル(NOVEX,San Diego,CA)中で電気泳動させた後に一般的手順で行った。分離したタンパク質に30ボルトを90分間印加して、PVDF紙に転移させ、標準法で処理した。処理したPVDFシートをウサギまたはサルの免疫血清またはモノクローナル抗体に4℃で一夜接触させた。
【0124】
一般的に、HRPコンジュゲートした抗血清を第二抗体として使用した。マウスのモノクローナル抗体を検出するためには、ヤギ抗マウスIgGのFcフラグメント特異的抗体を使用した(Jackson Immuno.Res.,West Grove,PA)。ウサギの抗体を検出するためには、ヤギ抗ウサギIgG−Fcを使用した(Bethyl Labs,Montgomery,TX)。サルの抗体を検出するためには、ヤギ抗サルIgG H+Lを使用した(Bethyl Labs)。これらの全部の第二抗体は1:4000の希釈度で使用した。ECLまたはECL+試薬(Amersham,Piscataway,NJ)を使用して全部のブロットを超高感度フィルム(Hyperfilm)に現像した。
【0125】
実施例8:ミモトープ及びHVRペプチドに対する免疫血清のELISA
ホモロガス免疫ペプチド、ヘテロロガスミモトープまたはHVRペプチドに対する抗体応答の測定は、本質的に文献(Tolmanら,1993,Int.J.Peptide Protein Res.41:455−466,1993及びConleyら,Vaccine 12:445−451,1994)に記載通りの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、または、ビオチニル化ペプチドELISAのストレプトアビジン捕獲の使用によって行った。
【0126】
簡単に説明すると、標準ELISAを使用する場合には、マイクロタイタープレートをPBS中の0.25μgのタンパク質によって湿潤雰囲気下、4℃で一夜を要してコートした。プレートを十分に洗浄し、1×ブロッカーBSA(Reacti−Bind,Pierce,Rockford,IL)でブロックし、十分に洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で1時間反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、コンジュゲートした第二抗体と反応させた。プレートを標準法によって反応処理し、450nmの吸光度を測定した。
【0127】
ビオチニル化ペプチドELISAのストレプトアビジン捕獲を使用する場合には、2×ウェル容量にあたる50pmolのビオチニル化ペプチドをブロッカーBSA中のストレプトアビジンコートしたELISAプレート(Reacti−Bind,Pierce,Rockford,IL)と各プレートをシールした後に室温で反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で30分間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【0128】
実施例9:捕獲ELISA
組換え糖タンパク質に対する抗ミモトープ応答を測定するためにはHCV E2糖タンパク質捕獲ELISAを使用した。ELISAプレートを50pgの2種類のネズミ抗−HCV E2モノクローナル抗体のいずれか一方によって湿潤環境下、4℃で一夜を要してコートした。これらのMabは無血清培地を使用してハイブリドーマ細胞培養物から調製し、HiTrap Protein G(Amersham/Pharmacia,Piscataway,NJ)を使用して精製した。これらの2つの抗体はE2のN末端から離間して局在する保存された決定基に結合すると考えられ、分析によればELISAまたはBIACoreで抗ミモトープ血清または抗HVR血清がE2に結合することを妨害しなかった。
【0129】
2日目、プレートを洗浄し、ブロックし、精製糖タンパク質を捕獲した。再度の洗浄後、プレートを被験血清及び対照血清の希釈物と37℃で1時間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【0130】
実施例10:ウサギにおける単一ミモトープコンジュゲートの免疫原性
HCVミモトープペプチドコンジュゲートから成る個別の5つのワクチンを4羽のウサギで試験した(表3)。ホモロガス免疫配列に対する応答の端点力価(GMTとして表す)は、R9ミモトープコンジュゲートの場合は1:5.7×105、R6ミモトープコンジュゲートの場合は1:7.6×106の範囲であった。OMPC担体及びフロインドアジュバントを使用したウサギは常にこのような高い範囲の抗ペプチド力価を示した。次に、4種類のHCV H株ペプチド(Farciら,1996 P.N.A.S.93:15394−15399)を使用し、HVR配列に対するこれらの抗ミモトープ応答を試験した。
【0131】
【表3】
n.d.−試験せず
【0132】
抗ミモトープR9抗体は4種類のHVRペプチド全部を認識した。抗ミモトープR6及びF78抗体は3種類のHVRペプチド全部を認識した。他方、抗ミモトープD6抗体は3種類の変異配列しか認識せず、力価は低い値であった。抗ミモトープH1抗体はH株の変異体を全く認識しなかった。
【0133】
MPL−Aを使用して製剤化したときのコンジュゲートの免疫原性を測定するためにウサギで追加の試験を実施した。複合体及び製剤の双方が安定だったのでコンジュゲート及びMPL−AをAlPO4に吸着させた。この系で、直鎖状C末端コンジュゲート、直鎖状N末端コンジュゲート及び環状ペプチドコンジュゲートから成る3種類のミモトープM63コンジュゲートを試験した(表4)。
【0134】
【表4】
【0135】
フロインドアジュバント中で製剤化した先出のコンジュゲートに比較したとき、直鎖状C末端形では端点力価として表されるコグネイトM63ペプチドに対する応答は同様であった。更に、ヘテロロガスミモトープF78及びHCV BK株HVRペプチドに対する端点力価が>1:1.5×106であることが知見された。従って、M63ミモトープは幾つかの条件下では、ヘテロロガス配列に対する反応性が高力価である抗体を誘発する能力を有していると考えられる。N末端コンジュゲートまたは環状ペプチドコンジュゲートで免疫感作した動物から得られた免疫血清は上記のM63ミモトープに比べてほぼ100分の1以下のかなり低い端点力価を有していた。しかしながらこれらの血清はC末端コンジュゲートによって誘発された血清よりも高度にHCV H株HVR配列を認識した。
【0136】
実施例11:ウサギにおけるSCPVの免疫原性
5種類の個別のコンジュゲートと4種類の異なる多重ミモトープワクチンとの混合物をウサギ免疫原性試験で試験した。5種類の個別コンジュゲートワクチンの混合物は5種類のコグネイトペプチドに対して1:6.5×105から1:2.6×106の範囲のELISA応答を誘発した(表5)。
【0137】
【表5】
*精製したガンマグロブリンによって試験を行った
【0138】
種々の混合物について、HCV H株HVR変異体ペプチドに対するELISA力価は、一羽のウサギだけが変異体#1及び#3に応答することを示した。残りの血清はHCV H株HVR配列のいずれをも認識しなかった。
【0139】
3種類の異なるタイプのSCPVを調製し、試験し、結果を混合ミモトープ免疫動物に比較した。3種類のSCPVは、3種類のミモトープを含有する第一のワクチン、5種類のミモトープを含有する第二のワクチン、及び、6種類のミモトープを含有する第三のワクチンである。
【0140】
ペプチドのELISA試験は、SCPVもまた抗ミモトープ応答を高力価で誘発できることを示した(表5)。単一ミモトープワクチン試験及び多重ミモトープワクチン試験でミモトープに対するGMTの範囲は、6つのSCPV試験のR9ミモトープに対する1:2500という低い値からR6単一ミモトープ試験のほぼ1:7.5×106という高い値までオーバーラップした。SCPV No.2及びNo.4の双方でR9ペプチドが最も高度に結合したペプチドであった(表2)。
【0141】
全部の形態の多重ミモトープワクチンについて、主要HCV H株HVRに対する反応性について観察されたGMTはほぼ1:20,000であった。混合ワクチンと対照的に、SCPV血清は変異配列に常に反応し、BK単離物HVR配列に高い力価で反応した。全部のELISA力価を考察すると、5種類のミモトープペプチドを使用するSCPVが最も広い反応性パターンを誘発したと考えられる。
【0142】
実施例12:アカゲザルにおけるOMPCコンジュゲート、キメラ糖タンパク質及びこれらのキメラタンパク質のDNAベクターの免疫原性
アカゲザルを霊長類の免疫原性試験に使用し、ミモトープを基材とするワクチンの3つのデリバリー方法をHVR反応性抗体を広く誘発するという目標について比較した。ペプチドコンジュゲートを、5つの単一ミモトープ、5種類のミモトープから成る1つのSCPV、及び、HCV株BKのHVR配列から成る1つのコンジュゲートとして作製した。N5コンジュゲーションは低い効率で生じた。
【0143】
ペプチドELISA、ビオチニル化ペプチドの捕獲によるELISA、及び、組換えキメラE2のMab捕獲によるELISAの結果を表6A−6Cに示す。
【0144】
【表6】
【0145】
これらの実験で、最も広い反応性を示す2つの血清の組合せはM63コンジュゲートと5種類のミモトープペプチドから成るSCPVとによって構成されていた。抗M63血清は標準ELISAで10ペプチド中の5ペプチドを認識し、捕獲ELISAで11ビオチニル化ペプチド全部を認識した。SCPV動物から得られた抗−5ミモトープ血清は標準ELISAで10ペプチド中の6ペプチドを認識し、捕獲ELISAで11ビオチニル化ペプチドのうちの8ペプチドを認識した。これらの2つの組合せで147−07を除く全部のペプチドが認識される。また、HVC H株変異体#2に対する反応は低い力価であり、微量反応体(rare reactor)として分類する必要がある。従って、M63配列を使用する単一ミモトープコンジュゲートとSCPVとの組合せで21のHVR配列のうちの19配列が認識された。
【0146】
各ミモトープをディスプレーするキメラE2糖タンパク質を使用すると、免疫血清の組合せの各々はそのコグネイトミモトープをディスプレーするE2(表6C)と追加のキメラE2とを強力に認識した。SCPV誘発血清及び単一R9誘発血清の各々は6個の糖タンパク質全部を認識したが、単一F78コンジュゲート血清は6個の糖タンパク質のうちの3個にしか結合しなかった。ミモトープN5−キメラは糖タンパク質と最も反応しなかった。
【0147】
これらのミモトープを霊長類試験で免疫原として使用するために他の2つのワクチン形態を調製した。先ず、ミモトープ−E2キメラタンパク質を哺乳動物の細胞から調製し、次に、これらの同じキメラ構築物を発現するDNAベクターを作製した。各ワクチンを3匹のアカゲザルで試験し、合計では12種類のワクチンを36匹の動物で試験した。免疫血清をgpELISA対コグネイトキメラ糖タンパク質試験及びコグネイトミモトープペプチド及び全HVRペプチドを使用する全ペプチドELISAで試験した(表7A及び7B)。
【0148】
【表7】
【0149】
全部の免疫血清がそれらのコグネイトE2糖タンパク質を認識し、タンパク質ワクチン接種動物の血清は常にDNAベクターワクチン接種動物よりも大きいGMTを有していた。これらの抗糖タンパク質力価はミモトープペプチドに対して得られた力価よりも常に大きい値であった。R9−キメラタンパク質に関する1つのケースでは抗ミモトープ応答が全く観察されなかった。これは、HCV E2糖タンパク質の外層ドメインが反応性抗HVR抗体を広く誘発するための特に良好なデリバリー構造でないことを示す。
【0150】
M63免疫原及びF78免疫原の双方の形態は1:40から1:1490の範囲のGMTでH株HVR配列を最も認識する抗体を誘発したが、抗M63キメラタンパク質だけがBK株HVRペプチドを誘発した。双方の形態のワクチンによって誘発された抗H1血清はペプチド#147−08及び147−09を認識する能力を有していた。この結果は抗H1コンジュゲート血清がこれらの2つの配列と強力に反応したという観察に一致した。
【0151】
残りのペプチドに関しては、血清の完全体が有意な程度に反応しなかった。これらの結果は、キメラミモトープ−E2タンパクのDNAベクター及びこれらのミモトープ−E2タンパク質自体が弱い抗HVR免疫原であることを示唆する。ミモトープコンジュゲートについて得られた結果と考え合わせると、コンジュゲートワクチンとして正式に提示した適切なHVRミモトープの組合せが広い反応性の抗体応答を誘発する能力を有しており他の組合せ方法よりも優れていると考えられる。
【0152】
特許請求の範囲内でその他の実施態様が存在する。幾つかの実施態様を提示及び記載したが、本発明の要旨及び範囲を逸脱しない多様な変更が可能である。
Claims (46)
- ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と、
免疫原性HCVペプチドPEP1と、
免疫原性HCVペプチドPEP2と、
から成り、PEP1及びPEP2の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なる配列から成ることを特徴とするHCVコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - 更に、免疫原性HCVペプチドPEP3を含み、PEP3は独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された第三の配列から成り、前記第三の配列はPEP1またはPEP2とは異なる配列を含むことを特徴とする請求項1に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- PEP1が配列1を含み、PEP2が配列2を含み、PEP3が配列4を含むことを特徴とする請求項2に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記担体がNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項3に記載のコンジュゲート。
- 前記HCVコンジュゲートが、
免疫原性HCVペプチドPEP1と、
免疫原性HCVペプチドPEP2と、
免疫原性HCVペプチドPEP3と、
免疫原性HCVペプチドPEP4と、
免疫原性HCVペプチドPEP5と、
を含み、
PEP1、PEP2、PEP3、PEP4及びPEP5の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なる配列から成ることを特徴とする請求項1に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - 前記担体がNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項5に記載のコンジュゲート。
- PEP1、PEP2、PEP3、PEP4及びPEP5の各々が、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択された異なる配列から本質的に構成されることを特徴とする請求項6に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記コンジュゲートが以下の構造:
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
L1はPEP1をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はPEP2をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はPEP3をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々は同じでも異なっていてもよく、
L4はPEP4をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL4の各々は同じでも異なっていてもよく、
L5はPEP5をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL5の各々は同じでも異なっていてもよく、
L6はPEP6をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL6の各々は同じでも異なっていてもよく、
L7はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL7の各々及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
L8はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL8の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
a、b、c、d、e、f、g及びhの各々は独立に選択された結合負荷であり、a、b、c及びhの各々は0よりも大きい値であり、
PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6が免疫原性ペプチドであり、但し、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6のうちの少なくとも2つが、配列1、配列2、配列3、配列4、配列5及び配列6から成るグループから選択された配列から成る〕
を有することを特徴とする請求項1に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5及びPEP6の各々が、配列15、配列16、配列17、配列18、配列19、配列20及び配列21から成るグループから選択された1つの異なる配列から成ることを特徴とする請求項10に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- fが0であり、
PEP1が配列15から成り、
PEP2が配列16から成り、
PEP3が配列18から成ることを特徴とする請求項10に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - dが0よりも大きい値であり、eが0よりも大きい値であり、PEP4が配列17から成り、PEP5が配列19から成ることを特徴とする請求項12に記載のコンジュゲート、または医薬として許容されるその塩。
- dが0よりも大きい値であり、eが0よりも大きい値であり、fが0よりも大きい値であり、PEP1が配列15から成り、PEP2が配列17から成り、PEP3が配列18から成り、PEP4が配列19から成り、PEP5が配列20から成ることを特徴とする請求項10に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記キャッピング基の各々がN−アセチルシステインであることを特徴とする請求項13に記載のコンジュゲート。
- 前記キャッピング基の各々がN−アセチルシステインであることを特徴とする請求項14に記載のコンジュゲート。
- 第一及び第二の異なるHCVコンジュゲートを含み、
前記第一のHCVコンジュゲートが請求項1から16のいずれか一項に記載のコンジュゲートであり、
前記第二のコンジュゲートが、配列7の免疫原性HCVペプチドに共有結合的に連結されたポリペプチドまたはタンパク質を含む第二の担体を含むことを特徴とするHCVコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。 - 前記第二の担体がNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項17に記載のコンジュゲート混合物。
- 前記第二のコンジュゲートが、配列7の配列から本質的に構成された免疫原性HCVペプチドを含むことを特徴とする請求項18に記載のコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
- 前記第二のコンジュゲートが以下の構造:
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
L1は免疫原性HCVペプチドをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
n、m及びpの各々は独立に選択された結合負荷であり、n及びpの各々は0よりも大きい値である〕
を有することを特徴とする請求項19に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - 前記第二のコンジュゲートの免疫原性ペプチドが配列21から成ることを特徴とする請求項22に記載のコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
- 前記第二コンジュゲート中の前記キャッピング基の各々がN−アセチルシステインであることを特徴とする請求項23に記載のコンジュゲート混合物。
- (a)ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の反応性部位に複数のリンカーを連結する段階と、
(b)前記複数のリンカーに2以上の異なるHCV免疫原性ペプチドを連結する段階と、
(c)段階(b)の生成物をキャッピングする段階とから成り、
前記2以上の異なるHCV免疫原性ペプチドが、配列1から成る第一のHCVミモトープ配列、配列2から成る第二のHCVミモトープ配列、配列3から成る第三のHCVミモトープ配列、配列4から成る第四のHCVミモトープ配列、配列5から成る第五のHCVミモトープ配列、配列6から成る第六のHCVミモトープ配列、及び、配列7から成る第七のHCVミモトープ配列から成るグループから選択されることを特徴とする方法によって製造されるHCVコンジュゲート。 - 前記段階(b)が前記2以上の異なるHCV免疫原性ペプチドの同時コンジュゲーションによって行われることを特徴とする請求項25に記載のHCVコンジュゲート。
- 前記2以上の異なるHCV免疫原性ペプチドが、
前記第一のHCVミモトープ配列から成る第一のHCV免疫原性ペプチドと、
前記第二のHCVミモトープ配列から成る第二のHCV免疫原性ペプチドと、
前記第三のHCVミモトープ配列から成る第三のHCV免疫原性ペプチドと、を含むことを特徴とする請求項3に記載のHCVコンジュゲート。 - 有効量の請求項1に記載のコンジュゲートを被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
- 前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 有効量の請求項17に記載のコンジュゲート混合物を被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
- 前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記担体にPEP1及びPEP2を同時にコンジュゲーションする段階を含むことを特徴とする請求項1に記載のコンジュゲートの製造方法。
- 前記担体にPEP1、PEP2、PEP3及びPEP4を同時にコンジュゲーションする段階を含むことを特徴とする請求項4に記載のコンジュゲートの製造方法。
- (a)有効量の請求項1に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
(b)前記被験者から前記抗体を採取する段階とを含む方法によって製造される抗血清。 - (a)有効量の請求項17に記載のコンジュゲート混合物を被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
(b)前記被験者から前記抗体を採取する段階とを含む方法によって製造される抗血清。 - ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と、
配列1、配列2、配列3、配列4、配列5、配列6及び配列7から成るグループから選択されたHCVミモトープを含む免疫原性HCVペプチドとを含み、前記免疫原性HCVペプチドが前記担体に共有結合的に連結されており、
前記担体がNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体であることを特徴とするHCVコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - 前記ミモトープが配列7の配列を含む請求項36に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記免疫原性HCVペプチドが配列7の配列から本質的に構成される請求項37に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記コンジュゲートが以下の構造:
OMPCはNeisseria meningitidisの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的pHでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
L1は免疫原性HCVペプチドをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL1の各々は同じでも異なっていてもよく、
L2はアニオンをOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL2の各々は同じでも異なっていてもよく、
L3はキャッピング基をOMPCに連結する共有結合リンカーであり、存在するL3の各々は同じでも異なっていてもよく、
n、m及びpの各々は個別に選択された結合負荷であり、n及びpの各々は0よりも大きい値である〕
を有することを特徴とする請求項36に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。 - 前記免疫原性ペプチドが配列21から成ることを特徴とする請求項4に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
- 前記キャッピング基の各々がN−アセチルシステインであることを特徴とする請求項40に記載のコンジュゲート。
- 有効量の請求項36に記載のコンジュゲートを被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
- 前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- (a)有効量の請求項36に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
(b)前記被験者から前記抗体を採取する段階とから成る方法によって製造される抗血清。
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