TWI379839B - Aβ immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same - Google Patents

Aβ immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same Download PDF

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TWI379839B
TWI379839B TW100140530A TW100140530A TWI379839B TW I379839 B TWI379839 B TW I379839B TW 100140530 A TW100140530 A TW 100140530A TW 100140530 A TW100140530 A TW 100140530A TW I379839 B TWI379839 B TW I379839B
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Rasappa G Arumugham
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Wyeth Llc
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Description

1379839
J 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 根據35 U_S.A.§119 ( e)條款本蔡 12月17曰提出之美國臨時專利申請案 之權益，其全部倂此以供所有目的作參 【先前技術】 適應性免疫的要素爲有機體有能力 有所反應且能產生可與該異物特異性交 體及細胞）並保護該宿主免於異物的； 疫原”爲一種物質，其能引起此類型免 造來對抗它之敏感化細胞及抗體相互作 抗原或免疫原通常爲巨分子且含有 或“抗原決定部位”，其可被免疫系統辨 多種成份相互反應。它們可呈個別分子 合成性有機化學物質、蛋白質、脂蛋白 DNA、或多醣所組成，或者它們可爲部 或真菌）或病毒（Harlow and Lane 199 1 987 ) 〇 小分子如短肽雖然通常可與免疫 用，但是僅有其自身時經常無法引起反 或被稱爲“半抗原”事實上爲不完全抗原 免疫性或無法引起抗體產生，不過可以 載體上而使其具致免疫性。載體通常爲 |明主張於2003年 ;第 60/ 530,48 1 號 考。 I對外來物質的存在 :互作用之成份（抗 \侵。“抗原”或“免 疫反應且可與被製 用。 獨特的抗原性部位 識且與免疫系統的 的形式存在且可由 I、糖蛋白、RNA、 份細胞結構（細菌 8a,b,c; Male et al., 反應的產物相互作 應。此等肽免疫原 ，雖然本身不具致 藉由偶合到適當的 分子量較大之蛋白 -5- 1379839 質抗原且在活體內投予時會造成免疫性反應。 於免疫反應中，抗體係由 B-淋巴球以及 T-輔助 (TH)細胞所製造及分泌。於大多數半抗原-載體系統 中，B細胞製造的抗體對於半抗原及載體都具特異性。於 此等例中，T淋巴球具有針對載體的特殊結合域，但在只 有半抗原時卻無法辨識出來。在一種協同作用下，該B及 T細胞合作則可引發對半抗原具特異性之抗體反應。在此 種免疫反應發生後，若宿主後來只受到半抗原之挑釁，通 常初次疫苗接種後形成之記憶細胞還是能對該半抗原有所 反應而產生半抗原-特異性抗體》 模仿較大巨分子上某些精確的抗原決定部位結構之合 成性半抗原通常會被接合到載體上以產生針對該較大“母 體”分子之免疫反應。例如，可根據一蛋白質之已知序列 來合成短肽片段且將該片段偶合到載體上以引發針對該天 然蛋白質之免疫反應。免疫原製造之此類合成性策略已成 爲近年來疫苗製造之硏究基礎。然而在許多情形下，在使 用合成肽-載體共軛物時若僅僅引發B-細胞反應，不論該 共軛物設計得有多好，卻無法保證總能針對完整免疫原產 生徹底的免疫性保護。來自較大病毒顆粒或細菌細胞之短 肽抗原決定部位所產生的免疫反應可能僅足以在B-細胞層 次產生記億。於此例中，現在一般已同意：細胞毒性T-細 胞反應才是保護性免疫的更重要指標。所以設計出具有適 當抗原決定部位之結合位以供B-細胞及T-細胞兩者皆可 辨識之肽免疫原已成爲今日免疫學中最具挑戰性的硏究領 -6- 1379839 域之一。 將小型或不良的免疫原分子接合到較大之“載體”分子 上以增加致免疫性的策略已成功地運用數十年（參考例如 Goebel et al. ( 1 93 9) J. Exp. Med. 69: 53)。例如，已有 許多免疫原組成物被加以描述，其係將已純化的被膜聚合 物接合到載體蛋白質上且藉由此種“載體效果”來製造出更 有效的免疫原組成物。Schneerson et al. (1984) Infect, j Immun· 45: 582-591。還有，當使用一種游離多醣來免疫 嬰兒時往往只能得到不良的抗體反應，但是在把多醣與載 體接合後就可以避免此種抗體反應不良之現象（Anderson et al. ( 1 9 8 5) J. Pediatr. 107： 346; Insel et al. ( 1 986) J. Exp. Med. 15 8： 294 ) ° 半抗原-載體接合之共軛物可用多種交聯/偶合反應 劑如同雙官能基、異雙官能基或零-長度交聯劑成功地製 造。許多此等方法近來已被用來把醣類、蛋白質及肽類偶 φ 合到肽載體上。大多數的方法係產生胺、醯胺、胺基甲酸 酯、異胺基甲酸酯、或二硫化物鍵結，或者於某些例爲產 生硫醚。使用偶合劑可將反應性部位引入位於載體及/或 半抗原分子上之反應性胺基酸分子之側鏈中，所以使用偶 合劑之一項缺點爲：若未將反應性部位中和那麼此等反應 性部位即可自由地與活體外（如此會不當地影響該共 (等）軛物之官能性或穩定性）或活體內（如此會將接受 此等製劑免疫之人類或動物置於不良條件的潛在風險中） 的任何不良分子進行反應。此等過量的反應性部位可採用 1379839 多種已知的化學反應來加以耗用或“加蓋”好讓此等部位鈍 化，不過此等反應卻另外地可能會妨礙共軛物的官能性。 當意圖把反應性部位引入載體分子以製造共軛物時特別會 有問題，由於其有更大且更複雜的結構（相較於半抗原） 使其更易於感受化學處理的妨礙影響。事實上，目前還沒 有採用如下方法製成之共軛物實例，該方法係先將載體活 化，然後於共軛反應中讓載體與半抗原反應，最後將剩下 的反應性部位“加蓋”以製成共軛物，同時使得所產生之共 軛物仍保有成爲具有所需“載體效果”特性之免疫原組成物 之能力。 【發明內容】 本發明係關於一種包含AyS肽或片段或其類似物 之肽免疫原以及蛋白質/多肽載體形成之免疫原共軛物之 產製方法，其中該AyS肽或AjS片段或其類似物係經由該 載體之胺基酸殘基如離胺酸之衍生化官能基接合到該載體 上，且其中該等胺基酸殘基上任何未進行接合之衍生化官 能基會經由加蓋來鈍化以阻斷其與其它分子包括蛋白質/ 多肽進行反應，以保留該載體之官能性，如此該共軛物即 可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無 載體則無法產生該等免疫反應。進一步地，本發明亦關於 以如上方法產製之共軛物，以及含有此等共軛物之免疫原 組成物。 於一具體例中，本發明之第一方法係關於把含有A泠 -8- 1379839 肽或A卢片段或其類似物之狀免疫原經由該肽免疫原上之
I 胺基酸殘基之反應性基團來與具有一或多個官能基之蛋白 '質/多肽載體接合在一起之方法，該方法包含的步驟有： (a)將該蛋白質/多肽載體之一或多個官能基衍生化以 產生具有反應性部位之衍生化分子；（b)讓步驟（a)之 衍生化蛋白質/多肽載體於反應條件下與該肽免疫原之胺 基酸殘基之反應性基團反應，使得該肽免疫原經由該等官 φ 能基團接合到該衍生化蛋白質/多肽載體上；及（c)進 —步地將該共軛物與一種加蓋劑反應，好讓已活化蛋白質 /多肽載體上之游離反應性官能基鈍化以保存該載體之官 能性，如此該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之 免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應。 於一具體例中，該蛋白質/多肽載體係選自人類血清 白蛋白、匙孔帽貝血青蛋白 '免疫球蛋白分子、甲狀腺球 蛋白、卵白蛋白、流感血球凝集素、ΡΑΝ-DR結合肽 φ ( PADRE多肽）、瘧疾環孢蟲（CS)蛋白質、B型肝炎 表面抗原（HB5Ag19.28 )、熱休克蛋白質（HSP ) 65、卡-介二氏桿菌（BCG)、霍亂毒素、毒性較低之霍亂毒素突 變體、白喉毒素、與白喉毒素交叉反應之CRM197蛋白 質、重組鏈球菌性C5a狀酶、釀膿鏈球菌（SkepMcoccw pyogenes ) ORF 1 224、釀膿鏈球菌 ORF 1 664、釀膿鏈球 菌 ORF2452、肺炎雙球菌jowewwowz’ae)自
溶酶、毒性較低之肺炎雙球菌自溶酶、肺炎衣原體 (Chlamydia pneumoniae) ORFT367、肺炎衣原體 ORF 1379839 T858、破傷風類毒素、HIV gp 120 T1、辨認黏附性基質分 子之細菌表面成份（MSCRAMMS)、生長因子/激素、細 胞因子及趨化因子等所組成之群組。 於另一具體例中，該蛋白質/多肽載體含有Τ-細胞抗 原決定部位。 於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體爲細菌性類毒 素如破傷風類毒素、霍亂毒素或如上所述之霍亂毒素突變 體。於較佳具體例中，該蛋白質/多肽爲CRM197。 於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體可爲流感血球 凝集素、PADRE多肽、瘧疾CS蛋白質、B型肝炎表面抗 原（HSBA19-28)、熱休克蛋白質65(HSP65)、或來自 結核桿菌之多肽（BCG)。 於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體可爲鏈球菌性 rCh 肽酶、釀膿鏈球菌 ORF 1 224、釀膿鏈球寧 ORF 1 664、釀膿鏈球菌ORF245 2 '肺炎雙球菌自溶酶、毒 性較低之肺炎雙球菌自溶酶、肺炎衣原體〇RF T367、肺 炎衣原體ORF T8 5 8。 於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體可爲生長因子 或激素，其可刺激或強化免疫反應且係選自IL-1、IL-2、 r ·干擾素、IL-10、GM-CSF、MIP-1 α、MIP-1 β 及 RANTES。 於一態樣中，本發明係提供一種含有Α沒肽或片 段或其類似物之肽免疫原，其可引起抗A卢內特殊抗原決 定部位之免疫反應。本發明之免疫原肽類包括異源性免疫 1379839 原肽類。於某些免疫原狀中，其係將ΑΘ片段連接到載體
I 上以形成異源性免疫原肽，然後可用本發明方法來將此種 異源肽連接到載體上以形成共軛物》 於本發明另一態樣中，該肽免疫原爲一種包含A；S之 N端部份至少第1-5個殘基之多肽，該AyS之第1個殘基 爲該多肽的N-端殘基，其中該多肽不含有該A石的C端 片段。於本發明再一態樣中，本發明之肽免疫原爲含有 φ A冷之N-端片段之多肽，該片段係以A/3之第1-3個殘基 開始且以之第7-11個殘基結束。於本發明某些態樣 中，該肽免疫原爲一種會引起抗Α冷之Ν-端片段之免疫反 應之化學劑且該A石之N端片段係以A/S之第1-3個殘基 開始且以A/3之第7-11個殘基結束，而且其並不會引起 針對A；S43第12-43個殘基之抗原決定部位之免疫反應。 於本發明另一態樣中，該肽免疫原爲一種含有連接一段異 源胺基酸序列及ΑΘ片段之異源性多狀，其可引發抗該胺 φ 基酸序列之輔肋者T-細胞反應及抗該N-端片段之B-細胞 反應。 於某些肽免疫原中，該A/3之N-端片段係以其C端 連接到異源多肽上。於某些肽免疫原中，該AyS之N-端片 段係以其N端連接到異源多肽上。於某些肽免疫原中，該 A召之N-端片段係以其C端及N端分別連接到第一及第二 異源多肽上。於某些肽免疫原中，該A石之N-端片段係以 其N端連接到異源多肽且以其C端連接到至少額外一段 N-端片段複本上。於某些肽免疫原中，該多肽含有N·端 -11 - 1379839 到C端部份、A召之N-端片段、多個複本之端片段及 該異源胺基酸片段》 於某些如上的肽免疫原中，該多肽進一步含有至少一 個額外的Ν -端片段複本。於某些如上肽免疫原中，該片 段不含至少5個43之C -端胺基酸。 於如上肽免疫原之某些態樣中，該ΑΘ片段含有最多 10個鄰近的Α/9胺基酸。 於另一態樣中，本發明提供一種含有Α沒肽或Α/5片 段或其類似物之肽免疫原且其可引起抗ΑΘ內特殊抗原決 定部位之免疫反應，該肽免疫原之構型爲一種被稱爲多抗 原性肽（MAP)之構型。 於某些上述之本發明態樣中，該肽免疫原係來自 A冷 之N端段。於本發明之某些態樣中，該肽免疫原係選自 AyS 1-3、1-4、1-5、1-6' 1-7、1-10、1-11、1-12、1-16、 3-6及3-7之A/3片段。於某些如上態樣中，該肽免疫原 係來自A /3的中間區域。於本發明某些態樣中，該肽免疫 原係選自A冷13-28、15-24、17-28及25-35之A召片段。 於本發明某些態樣中，該肽免疫原係來自A石的C端。於 本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 A冷33-42、35-40 及3 5-4 2之A冷片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原 係選自 A/S1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-1〇、1-11、1-12 ' 1-16 ' 1-28 ' 3-6 > 3-7 ' 13-28 ' 15-24 ' 17-28 ' 25-35、33-42、35-40及35-42之A/S片段。於本發明某些態 樣中，該肽免疫原係選自A々l-5、AySl-7、A石1-9及 -12- 1379839 A冷1-12之A石片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原 係選自八泠卜5-1^、人召1-7-1^、八冷1-9-1^及八冷卜12-1^之 A冷片段，其中L爲連接子。於本發明某些態樣中，該肽 免疫原係選自 1-5-L-C、AjS 1-7-L-C、A冷 1-9-L-C 及 A泠1-12-L-C之A召片段’其中c爲半胱胺酸殘基。。 於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自A/3 16-22、A冷 16-23、A/9 17-23、17-24、A/3 18-24 及 A/3 0 1 8-25之A召片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係 選自 AyS 16-22-C、Ayg 16-23-C、A)S 17-23-C、17-24-C、A/918-24-C 及 A；S18-25-C 之 A/S 片段，其中 C 爲半 胱胺酸殘基。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自（：-AyS16-22、C-A/3 16-23、C-A/3 17-23、C-A/S17-24、C-A ^18-2 4及C-A泠18-2 5之片段，其中C爲半胱胺酸 殘基。 於某些如上肽免疫原中，該異源多肽係選自具有T-細 φ 胞抗原決定部位、B-細胞抗原決定部位及其組合之肽類。 於一具體例中，該蛋白質/多肽載體或該任意地依附 在該載體上之多肽連接子之一或多個胺基酸分子之官能基 可使用交聯劑來衍生化。於另一具體例中，該衍生性反應 劑爲一種零長度交聯劑。於另一具體例中，該衍生性反應 劑爲一種同雙官能交聯劑。於再一具體例中，該衍生性反 應劑爲一種異雙官能交聯劑。 於一較佳具體例中，該異雙官能反應劑爲一種可與該 蛋白質/多肽載體之一或多個胺基酸分子的初級或ε -胺 -13- 1379839 官能基反應以及與該肽免疫原之一或多個胺基酸分子之突 出硫醇基反應之反應劑。於一具體例中，該異雙官能反應 劑爲N-琥珀醯亞胺基溴醋酸酯。 於另一具體例中，該初級或ε-胺官能基爲離胺酸。 於再一具體例中，將該蛋白質/多肽載體之離胺酸之初級 或ε-胺官能基用Ν-琥珀醯亞胺基溴醋酸酯來衍生化會使 得該蛋白質/多肽載體上之離胺酸分子之初級或ε -胺官 能基溴乙醯化。於一更佳具體例中，該突出的硫醇基爲該 肽免疫原的半胱胺酸殘基，其可位在該肽免疫原的胺基 端、該肽免疫原的羧基端或該肽免疫原的內部。 於另一具體例中，該硫醇基係用硫醇化劑如Ν-乙醯 基高半腕胺酸硫內酯、陶特試劑（Traut’s reagent，2 -亞 胺硫烷）SATA(N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯基硫醋酸酯）、 SMPT ( 4-琥珀醯亞胺氧羰基-甲基-2-吡啶二硫甲苯）、硫 LC SPDP (硫琥珀醯亞胺基吡啶基二硫丙醯胺基乙酸 酯/、SPSP (琥珀醯亞胺基吡啶基二硫丙酸酯）。於一較 佳具體例中，用來把已活化蛋白質/多肽載體上游離之反 應性官能基鈍化之加蓋劑係選自半胱胺、N-乙醯基半胱胺 及乙醇胺。 於一特佳具體例中，用來把已活化蛋白質/多肽載體 上游離之反應性官能基鈍化之加蓋劑係選自氫氧化鈉、碳 酸鈉、碳酸氫銨及氨所組成之反應劑群組。 於一具體例中，該肽免疫原之胺基酸殘基之反應性基 團爲游離之硫氫基。 -14 - 1379839 於其它具體例中，該一或多個官能基係位在連接子 上，其係任意地依附在該蛋白質/多肽載體上。於一較佳 具體例中，該連接子爲肽連接子。於一更佳具體例中，該 肽連接子爲聚離胺酸。 於其它具體例中，本發明之第二方法係關於把含有A 泠狀或片段或A沒類似物或其類似物之肽免疫原與具 有如下結構之蛋白質/多狀接合在一起之方法，
其中C爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多 肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者任意地共價 依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之 可衍生化官能基，且其中m爲大於0但小於或等於85之 整數，該方法包含的步驟有：（a)將位在該蛋白質/多 肽載體上或位在任意地被接在該載體上之連接子之一或多 個官能基衍生化以產生具有反應性部位之衍生化分子； (b)讓步驟（a)之衍生化蛋白質/多肽載體與該肽免疫 原之胺基酸殘基之反應性基團反應，以形成共價偶合之肽 免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物；及（c)進一步地將該 共軛物與一種加蓋劑反應，好讓已活化蛋白質/多肽載體 上之游離反應性官能基鈍化，使得已加蓋基團無法自由地 -15- ^379839 與其它分子包括蛋白質/多肽反應，藉以保存該載體之官 能性，如此一來該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫 原之免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反 應，如此來產生一種具有如下結構之加蓋肽免疫原-蛋白 質/多肽載體共軛物： (Xd——P).
其中c爲該蛋白質/多肽載體且父(1爲位在該蛋白質 /多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地 共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘 基之已衍生化官能基，且其中 P爲肽免疫原分子，其係共價地依附到該蛋白質/多 肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任 意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基 酸殘基之已衍生化官能基上；R爲加蓋分子，其係共價地 依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官 能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體 上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上：η爲大 於〇但小於或等於85之整數，且ρ爲大於〇但小於85之 整數。 前文所述之第一方法的詳細具體例亦可應用在第二方 1379839 法製成之共軛物上。 於一具體例中，本發明係關於一種含有AA肽或八泠 片段或其類似物之狀免疫原與蛋白質/多肽載體之共軛 物，其中該蛋白質/多狀載體具有如下結構：
其中C爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多 肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者任意地共價 依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之 可衍生化官能基，且其中m爲大於0但小於或等於85之 整數，且已加蓋之肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物具 有如下結構： (Xd—p)_
其中C爲該蛋白質/多肽載體且Xd爲位在該蛋白質 /多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地 共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘 基之已衍生化官能基，且其中P爲肽免疫原分子，其係共 價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生 -17- 1379839 化官能基上或者依附在任意地共價依附在該蛋白質/多肽 載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上；R 爲加蓋分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之 胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依 附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已 衍生化官能基上，藉以保存該載體之官能性，如此一來該 共軛物即可保有引發抗該肽免疫原之所需免疫反應之能力 且若無載體則無法產生該等免疫反應；η爲大於〇但小於 或等於85之整數，且ρ爲大於〇但小於85之整數。 如上第一及第二方法之詳細具體例亦可應用在如上所 述之共軛物上。 於另一具體例中，本發明係關於以本發明第二方法所 製造且含有Α/5肽或Α0片段或其類似物之肽免疫原與蛋 白質/多肽載體之共軛物，其具有如下結構：
其中C爲該蛋白質/多肽載體且又<1爲位在該蛋白質 /多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者位在任 意地共價依附在該蛋白質/多狀載體上之肽連接子之胺基 酸殘基之已衍生化官能基，且其中Ρ爲肽免疫原分子，其 係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已 -18- 1379839 衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/ 多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基 上；R爲加蓋分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載 體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地 共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘 基之已衍生化官能基上，藉以保存該載體之官能性，如此 一來該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反 φ 應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應；η爲大於 〇但小於或等於、5之整數，且ρ爲大於0但小於85之整 數。 如上第二方法之詳細具體例亦可應用在如上所述以第 二方法製成之共軛物上。 於其它具體例中，本發明亦關於一種免疫原組成物， 其含有用本發明之第二方法所產製之肽免疫原與蛋白質/ 多狀載體之共軛物，以及一或多種藥學可接受之賦形劑、 φ 稀釋劑及佐劑。 該第二方法之詳細具體例及藉此產生之共軛物亦可以 應用在含有此等共軛物之免疫原組成物中。 於其它具體例中，本發明係關於一種在哺乳動物主體 引起免疫反應之方法，其包含將有效份量之本發明免疫原 組成物投予至該主體。 可應用在含有本發明共軛物之免疫原組成物之詳細具 體例亦可應用在使用此等免疫原組成物之方法之具體例 中。 -19- 1379839 序列簡要說明 SEQ Π) NO: 序列 說明 1 DAEFR-C ΑβΙ-5-C 2 DAEFRHD-C Αβ 1-7-C 3 DAEFRHDSG-C Αβ 1-9-C 4 DAEFRHDSGYEV-C ΑβΙ-12-C 5 DAEFR-GAGA-C ΑβΙ-5-L-C 6 DAEFRHD-GAGA-C Αβ 1 -7-L-C 7 DAEFRHDSG-GAGA-C ΑβΙ-9-L-C 8 DAEFRHDSGYEV-GAGA-C ΑβΙ-12-L-C 9 VEYGSDHRFEAD-C Αβ12-1-0 10 GAGA 接頭肽 11 PKYVKQNTLKLAT 流感血球凝集素:HA脚9 12 AKXVAAWTLKAAA PAN-DR 肽(PADRE 肽） 13 EKKIAKMEKASSVFNV 瘧疾CS..T3抗原決定部位 14 FELLTRILTI B型肝炎表面抗原： HBsAgi9-28 15 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG 熱休克蛋白質65 : hsp65i53.171 16 QVHFQPLPPAWKL 卡介二氏桿菌(BCG) 17 QYDCANSKFIGITEL 破傷風類毒素：TT830.844 18 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 破傷風類毒素：ΤΤ947_967 19 KQIINMWQEVGKAMY mvgpi2〇Ti 20 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD Αβΐ，7/ΤΤ830-844/ C/TT947-967/Αβ],7 21 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSN KGAnGLMVGGWIA Αβΐ-42 22 DAEFRHDQYIKANSKnGITEL ΑΝ90549: Αβι，7/ΤΤ83〇-844 (以MAP犓型使用） 23 DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE AN90550： Αβ]-7/ΤΤ947-967 似ΜΑΡ4構型使用）
-20- 1379839
SEQ JD NO: 序列 說明 24 DAEFRHD- QYKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPK VSASHLE AN90542: Αβι·7/ΤΤ83〇-844 + TT947. 967 似線狀構型使用） 25 EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL AN90576； Ap3-9/TT830-844 (以MAP4^型使用） 26 AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD AN90562: Αβ,.τ/PADRE 27 DAEFRHD-DAEFRHDD- AEFRHDAKXVAAWTLKAAA AN90543: Αβι.? x 3/PADRE 28 AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD- DAEFRHD-DAEFRHD PADRE/Api.7 x 3 29 DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA Αβι.7 x 3/PADRE 30 DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβ^/白蛋白片段 31 FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβ4·1()/白蛋白片段 32 EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβ3.9/白蛋白片段 33 PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD- DAEFRHD-DAEFRHD ΗΑ3〇7-319/Αβι_7 X 3 34 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD Αβ 1.7/HA307-319/Αβ 1 _7 35 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- PKYVKQNTLKLAT Αβι*7 χ 3/ ΗΑ307-319 36 DAEFRHD-DAEFRHD- PKYVKQNTLKLAT Αβι.7 X 2/ΗΑ307-319 37 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-. FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD Αβ】_7/ΗΑ307-3Ι9/瘧疾 CS/ ΤΤ830-844/ΤΤ947-967/Αβι_7 38 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE Αβϊ_7 X 3/TT830-844/C/TT947-967 39 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE APi-7/TT830-844/C/TT947-967 -21 - 1379839 SEQ Π) NO: 序列 說明 40 GADDWDSSKiSFVMENFSSYHGTKPGY VDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGW KVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLS LTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRWLS LPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEIN FETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVR RSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLK EHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEE FHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGAN YAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAAL SBLPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSI ALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFV ESnNLFQWHNSYNRPAYSPGHKTQPFL HDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDI KITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSK THISVNGRKIRMRCRATOGDVTFCRPKSP VYVGNGVHANLHVAFimSSSEKIHSNEI SSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEI KS CRMpi97 41 ISQAVHAAHAEINEAGR 白蛋白片段 42 DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSN KGAnGLMVGGWIA 鼠 Αβι_42 43 VFFAEDVG-C Αβ 18-25 -C 44 LVFFAEDV-C Αβπ-24-C 45 KLVFFAED-C Αβ 16-23 -C 46 C-VFFAEDVG 0-Αβ]8_25 47 C-LVFFAEDV C-Apn-24 48 C-KLVFFAED 〇-Αβΐ6-23 49 VFFAEDV-C Αβ]8-24 -C 50 LVFFAED-C Αβπ-23-C 51 KLVFFAE-C Αβΐ6-22*〇 52 C-VFFAEDV C-Αβ 18.24 53 C-LVFFAED 0-Αβΐ7-23 54 C-KLVFFAE C-Αβ 16-22
發明詳細說明 -22- 1379839 本發明係關於一種產製肽免疫原-載體共軛物之方 法，其中在載體上於活化過程中形成之活性官能基若未被 反應掉，則會用加蓋劑如N-乙醯基半胱胺來使其鈍化， 以防止其作進一步反應。本發明亦關於用此等方法產製之 加蓋載體-肽免疫原共軛物以及含有此等共軛物之免疫原 組成物。 將小型或不良的免疫原分子如醣類經由接合作用增加 φ 免疫原性的策略已成功地運用數十年（參考例如Goebel et al. (1939) J. Exp_ Med_ 69: 53)，且已有許多免疫原 組成物被加以描述，其係將已純化的被膜聚合物接合到載 體蛋白質上且藉由此種“載體效果”來製造出更有效的免疫 原組成物 ° 例如 S chneerson et al. ( J. Exp. Med. 152: 3 6 1 -3 7 6，1 9 8 0 )已說明一種流感嗜血桿菌b多醣蛋白質共 軛物，其可對此等微生物引起之疾病提供免疫性。PRP (多核糖核糖醇磷酸酯），一種流感嗜血桿菌b之被膜聚 φ 合物之共軛物，已顯示出比單獨含有該多糖之免疫原組成 物更有效（Chu et al·，（1983) Infect. Immun. 40:245; Schneerson et al. ( 1 984)，Infect. Immu. 45 : 582-591 )。 還有，當使用一種游離多醣來免疫嬰兒時往往只能得到不 良的抗體反應，但是把多醣與載體接合後就可以避免此種 抗體反應不良之現象（Anderson et al· (1985) J. Pediatr. 1 07:3 46; Insel et al. ( 1 9 8 6) J. Exp. Med. 1 5 8 : 294 )。 使用細菌性毒素或類毒素（該等毒素或類毒素已被常 態地用來免疫人類（如破傷風或白喉）且爲標準實務）作 -23- 1379839 爲蛋白質載體之一項優點爲使用該等毒素或類毒素可以引 起對抗含被膜聚合物之病原體之免疫作用。 抗原性決定子（antigenic determinant ) /半抗原-載體共軛物亦已被用來製造具高度特異性之單株抗體，其 可以辨識位在偶合半抗原上獨特的化學抗原決定部位。所 產生的單株抗體亦常被用來硏究該抗原決定部位的結構及 天然蛋白質彼此間的交互作用。於許多例中，用來製造此 等單株抗體之抗原性決定子/半抗原爲可代表較大蛋白質 表面之嚴格抗原性部位之小型肽片段。可用來作爲製造抗 原性決定子/半抗原-載體共軛物之成功載體之要件爲其 具有免疫效能，並存在適當的官能基以供抗原性決定子/ 半抗原接合，而且即使在衍生化以後仍有合理的溶解性質 及在活體內並無毒性。 本發明方法製成的共軛物便符合此等要件。該等共軛 物可爲使用在此所述之接合過程所製得之穩隹免疫原-載 體共軛物。該等共軛物係使用本發明之方法所製得的且其 中具有如下結構之蛋白質/多肽會共價依附到肽免疫原 上： (X)m
其中C爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多 肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者爲位在任意 • 24- 1379839 地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸 殘基之可衍生化官能基，且其中m爲大於〇但小於或等於 85之整數，且其中該肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物 具有如下結構： (Xd—P),
其中c爲該蛋白質/多肽載體且xd爲位在該蛋白質 /多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地 共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘 基之已衍生化官能基；P爲肽免疫原分子，其係共價地依 附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能 基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上 φ 之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上；R爲加蓋 分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸 殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該 蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化 官能基上藉以保存該載體之官能性，如此一來該共軛物即 可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無 載體則無法產生該等免疫反應；η爲大於0但小於或等於 85之整數，且ρ爲大於0但小於85之整數。 -25- 1379839 載體之選擇 某些肽免疫原含有引發免疫反應之適當抗原決定部 位，但是太小而無法導致免疫。於此等情況下，會將肽免 疫原連接到適當的載體上以輔助引發免疫反應。於前文圖 式所表示之本發明方法製得之肽免疫原-載體共軛物中 c 爲蛋白質/多肽載體，該等肽免疫原可直接透過載體本身 之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者間接地透過共價依附 在該載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基而 接合在一起。適當的蛋白質/多肽載體之實例包括但不限 於：白蛋白（包括人類血清白蛋白）、匙孔帽貝血青蛋 白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、 MSCRAMMS、破傷風類毒素、來自其它致病細菌且毒性較 低之類毒素包括其突變體，如白喉、大腸桿菌、霍亂或H. pylori，或者減毒之毒素衍生物。一種此類載體爲CRM197 蛋白質（SEQ ID NO: 40)，其與白喉毒素有交叉反應。 其它載體還包括T細胞抗原決定部位，其會結合到多 個MHC等位基因上如至少75 %所有人類MHC等位基因。 此等載體有時在此技術中係以“通用T-細胞抗原決定部位，， 爲人所知。具有通用T-細胞抗原決定部位之示範性載體包 括：
流感血球凝集素：HA3Q7-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ.IDNO.ll)
ΡΑΝ-DR 肽（PADRE 肽） AKX V A A WTLK A A A 1379839 (SEQ. ID NO. 1 2)
瘧疾CS:T3抗原決定部位 EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ. ID NO.13)
B 型肝炎表面抗原：HBsAg19_28FELLTRILTI
熱休克蛋白質65:hsp65丨53_17 卡介二氏桿菌（BCG) 破傷風類毒素：TT83G-844 破傷風類毒素：TT947.967 HIV gp 1 20 ΤΙ: C R Μ i 9 7 白蛋白片段 (SEQ. ID NO. 14) QSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ. ID NO. 1 5) QVHFQPLPPAVVKL (SEQ. ID NO. 1 6) Q YIKANSKFIGITEL (SEQ. ID NO.17) NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID NO. 1 8) KQIINMWQEVGKAMY (SEQ. ID NO.19) 參考序列簡要說明 (SEQ. ID NO.40) ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ. ID NO.41) 可刺激或強化免疫反應且可與肽免疫原或半抗原接合 之其它載體還包括細胞因子如IL-1、IL-la及β肽、IL-2、rINF、IL-10、GM-CSF 及趨化因子如 ΜΙΡ Ια 及 β 及 RANTES。免疫原肽類亦可被連接到可增加組織輸送通透 -27- 1379839 率之蛋白質/肽載體，如O'Mahony，WO 97/17163及 WO 97/ 1 76 1 4所述，其皆倂此以供所有目的參考。 其它的載體還包括重組鏈球菌性C5a肽酶、釀膿鏈球 菌 ORF1 224、ORF1664 及 ORF2452、肺炎衣原體 〇RF T3 67及ORF T858、肺炎雙球菌自溶酶、毒性較低之肺炎 雙球菌自溶酶、生長因子及激素。 於本發明一較佳具體例中，該載體蛋白質爲 CRM197，其爲一種白喉毒素之無毒突變株且係於初級序列 上有一處胺基酸變異。於該分子胺基酸第52位置之甘胺 酸由於單一核酸密碼子的變異而被一個麩胺酸所取代。由 於此種改變，所以該蛋白質不具有ADP-核糖基轉移酶活 性且變得無毒。其分子量爲58,408 Da。CRM197可根據美 國專利第5,6 1 4,3 8 2號之方法以重組表現來大量製造，其 倂此以爲參考。將醣類以及肽類接合到CRM197上之接合 作用可透過連接離胺酸殘基之ε -胺基來進行。從多種市 售產物可完善地確定CRM197爲一種針對Β-細胞抗原決定 部位之優良及安全載體。 免疫原肽類 在此使用時，術語“肽免疫原”或“半抗原”爲任何蛋白 質或次單元結構/片段/由其衍生之類似物，當對哺乳動 物投予時其可引發' 促進或誘生免疫反應。更詳言之，此 術語係用來指稱來自任何來源（細菌、病毒或真核生物） 之多肽抗原性決定子，其可使用在此所揭示之方法偶合到 -28- 1379839 載體上。此等多肽免疫原/抗原性決定子可有病毒性、細 菌性或真核細胞性來源。 肽免疫原可被接合到載體上用來防範、治療、預防或 緩合多種人類病症以進行預防接種性治療。此等肽免疫原 包括衍生自39-43個胺基酸之A0肽，較佳爲42個胺基 酸之A/S肽，此種A yS肽爲帕金森氏症之特徵斑塊的主要 成份（參考 US 4,666,829 ; Glenner & Wong ( 1 9 84) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131，Hardy ( 1 9 8 4) TINS 20:1131; Hardy ( 1 977) TINS 20:1 54 )，其係衍生自 澱粉不溶素之澱粉樣肽，一種第II型糖尿病中胰島細胞製 造的多肽物質，衍生自低密度脂蛋白基因產物之肽類，其 與動脈硬化有關以及衍生自發炎性細胞因子及生長因子之 抗原性肽類如干擾素6(IL-6)、腫瘤壞死因子a (TNF-〇：)及 GDF-8。此等真核性肽免疫原可包括 Τ·細胞 (CTL )或Β·細胞抗原決定部位，其亦以冷-澱粉樣蛋白 φ 質或Α4肽爲人所習知。 Α召，亦以/5 ·澱粉樣肽或Α4肽爲人所習知（參考US 4,666,829; Glenner & Wong, biochem. Biophys. Res. Commun.，120，1131 (1984))，爲一種 39-43 個胺基酸之 肽類，此爲帕金森氏症之特徵斑塊的主要成份。Αβ的生 成係將較大蛋白質ΑΡΡ用兩種酶（被稱爲沒及^分泌酶） 加工所製成（參考Hardy，TINS 20，154(1997))。已知與 帕金森氏病有關之APP突變係在鄰近；5及r分泌酶作用部 位之處或於A Θ內部。例如，位置71 7係鄰近7分泌酶將 -29- 1379839 APP加工以製成A/3之剪切位，而位置670/ 67 1則鄰近 沒分泌酶剪切位。一般認爲此等突變會與形成A沒之剪切 反應相互作用而增加42 / 43個胺基酸形式之Αθ量而造 成AD。 A/3具有可固定以及活化典型性及替換性補體級聯之 特殊性質。更詳言之，其會結合到Clq 且最後結合到 C3bi上。此種結合會促進與巨噬細胞結合且活化 B-細 胞。此外，C3bi會進一步地分解且然後以T-細胞相關方 式結合到B細胞上的CR2，造成此等細胞的活化提高 1〇,〇〇〇倍。此等機制使得AyS引起之免疫反應程度超越其 它抗原所引起的反應。 A0具有多種天然形式。人類類型的Ay3有A；S39、 A冷40、A冷41、AyS42及AyS43。此等肽類以及其與APP 前體蛋白質間的關係係示於Hardy et al·，TINS 20, 1 55- 1 58 ( 1 997 )之第1圖中。例如A泠42具有如下序列： H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Axg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-0H(SEQIDN0.21)。 A β 4\、A β 40及A々39與AyS42差異之處在於於C 端分別略去 Ala，Ala-Ile 及 Ala-Ile-Val。A冷 43 與 A召 42 不同之處在於其C端多了羥丁胺酸之存在。 基於多個理由，在本發明方法中以AjS片段作爲肽免 疫原比起以完整分子作爲免疫原更有利。首先，由於在 -30- 1379839
AyS內僅有特定的抗原決定部位會誘生出治療 之有效免疫反應，所以一劑含有此等抗原決定 比起同樣劑量之完整A)S能提供更高莫耳濃度 原抗原決定部位。其次，特定的Α Θ肽免疫原 粉樣蛋白澱積物之免疫反應，但不會對衍生A 白質引發顯著的免疫反應。第三.，由於 小，所以製造此等免疫原比製造完整A/3更容 φ 完整A/3會凝集在一起但是A/3肽免疫原不會 載體製成共軛物的製程。 某些AyS肽免疫原具有來自天然肽之至少 6、10或20個連續胺基酸之序列。某些肽免疫 過10、9、8、7、5或3個來自人々之連續胺 較佳具體例中，係使用AyS之N端段作爲肽免 共軛物。較佳肽免疫原包括众々1-5、1-6、1-1 1、3-7、1-3 及 1-4。例如 A /3 1-5 之標示係 ί! φ 端之殘基1-5之片段。以的Ν端開始且結 11間之殘基之ΑΘ片段爲特佳。亦可使用Α召 但較不好。於某些方法中，該片段爲A/31-10 片段。其它的較佳片段還有AyS13-28、15-24 35、35-4 0、35·42以及其它的內部片段及C端 本發明某些ΑΘ肽爲免疫原肽，其在投予 或動物時所產生之抗體能特異地結合到一或多 1 6到25間之抗原決定部位上。較佳的片段爲 16-23、17-23、17-24、18-24 及 18-25。會特 帕金森氏症 部位之片段 之有效免疫 可誘生抗澱 /3之ΑΡΡ蛋 肽免疫原較 易。第四， ，可簡化與 原具有不超 基酸。於一 疫原來製備 7、1-10、1 -旨包括Ν 束於殘基7-1-12之片段 以外的Ν端 、1-28 、 25- 片段。 至人類患者 個A)S殘基 Α β 16-22' 異地結合到 -31 - 1379839 A冷殘基16到25間之抗原決定部位之抗體能特異地結合 到溶解性Ayg上但不會與A)S斑塊結合在一起。此等類型 的抗體可特異性地結合到患者或動物模式循環系統內之溶 解性上，但不會特異性地結合到患者或動物模式腦內 之Α沒澱積物斑塊上。抗體對溶解性Α沒之特異性結合可 抑制該A沒被倂入斑塊中，如此便可抑制患者發展出斑塊 或者若在治療投藥前已發展出此等斑塊的話亦可抑制此等 斑塊進一步長大或再產生的頻率。 較佳地，所投予之A泠片段宜不含會引發T-細胞反應 之抗原決定部位。一般而言，T-細胞抗原決定部位會大於 1 〇個連續胺基酸。所以較佳的A yS片段爲5 -1 0個連續胺 基酸大小，較佳爲7-10個連續胺基酸或最佳爲7個連續 胺基酸，即其長度足以引起抗體反應但不會產生T細胞反 應。不含T·細胞抗原決定部位是比較好的，因爲此等片段 無需此等抗原決定部位就可具有免疫反應且於某些次群組 患者中此等抗原決定部位會引起不良的發炎反應 (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168，3679-3701; Senior (2002) Lancet Neurol.1,3)。 以片段A015-25以及其7-8個連續胺基酸之次片段 爲佳，因爲此等肽會持續地引發抗ΑΘ肽之高免疫反應。 此等片段包括 Αθ16-22、Αβ16-23'Α；3 16-24、Α；3 17-23、AjS 17-24、18-24 及 18-25。特佳的 Α 召 15-25 次片段爲長度7個連續胺基酸之次片段。舉例來說A冷 15-21之表示係指含有A沒之殘基15-21但不含A0其它 1379839 殘基之片段，且較佳爲7-10個連續胺基酸長。此等片段 可引發抗體反應且其包括端特異（end-specific)抗體。 需將AyS肽免疫原進行篩選以選取出具有清除或預防 澱粉樣澱積活性者（參考WO 00 / 728 80，其全部倂此以 供所有目的參考）。投予A/3N端片段可以誘生能於活體 內及活體外辨識A/3澱積之抗體。於某些方法中會使用缺 乏至少1個（有時至少5或10個）天然A/3型式之C端 φ 胺基酸之片段。例如，缺乏5個C端胺基酸之AyS 43片段 即包括了 Α0Ν端的前38個胺基酸。 除非另有說明，否則A yS —詞係包括如上所述之天然 人類胺基酸序列及其它包括等位基因、不同物種及誘發變 異型之類似物。類似物一般與天然肽於一、二或多處位置 有所不同，通常係由於保守性取代作用而產生。類似物與 天然肽間典型地具有至少8 0或9 0 %之序列同一性。某些 類似物亦包括非天然胺基酸或者在N端或C端胺基酸之 φ — '二或多處位置有修改。例如，於A0之位置1及/或 7之天然天冬胺酸可爲異天冬胺酸所取代。 非天然胺基酸之實例有D、α、α ·取代胺基酸、Ν-烷基胺基酸、乳酸、4 -羥基脯胺酸、r-羧基麩胺酸、ε · Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、ε -Ν-乙醯基離胺酸、〇-磷絲胺 酸、Ν -乙醯基絲胺酸、Ν -甲醯基甲硫胺酸、3 -甲基組胺 酸、5 -羥基離胺酸、ω-Ν -甲基精胺酸、冷-丙胺酸、鳥胺 酸 '己胺酸' 戊胺酸、羥基脯胺酸 '甲狀腺素、7-胺基 丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、及異天冬胺酸。免疫原肽亦包 -33- 1379839 括A沒類似物及其片段。本發明某些治療劑爲全-D肽，如 全-D AyS、全-D AjS片段或全-D 或全-D八点片段之類 似物。可依W0 00/ 72880所述，將該等片段及類似物用 轉基因動物模式與未治療或安慰劑對照組比較來篩選其預 防或治療效能。 肽免疫原亦包括較長多肽，其包括例如一種含有AyS 肽及其它胺基酸之免疫原多肽。例如，較佳的免疫原多肽 可爲將ΑΘ片段連接到一段異源胺基酸序列之融合蛋白 質，其可引起抗該異源胺基酸序列之輔助者T-細胞反應且 藉此產生抗該A)S片段之B-細胞反應。可依WO 00/72880 所述，將此等多肽置於轉基因動物模式中與未治療或安慰 劑對照組比較以篩選其預防或治療效能。 該等ΑΘ肽、類似物、免疫原片段或其它多肽可採分 散或凝集形式來投藥。分散型A/3或其片段意指單體型肽 單元。分散型A/3或其片段一般係可溶的且可自行凝集成 可溶性寡聚物、原纖維絲及ADD Ls。A/5或其片段之寡聚 物通常具可溶性且主要呈α-螺旋狀或隨機盤捲型。凝集 型或其片段係指A;S或其片段之寡聚物結合成不溶性 沒-片狀組合。凝集型A0或其片段亦指纖維狀聚合物^ 織維絲通常不可溶。某些抗體會結合到溶解性A々或其片 段或凝集型A/3或其片段中之一者。某些抗體會同時結合 到溶解性A/5或其片段及凝集型A/3或其片段兩者上。 免疫原肽亦包括免疫原肽單體之多聚體形式。A石肽 以外之其它免疫原肽應可引發對抗一或多種如上列示之較 -34- 1379839 佳 AyS片段（如 A/? 1-3、17-、1-10及3-7)之免疫反 應。 本發明之免疫原肽係使用本發明之方法連接到載體上 而形成共軛物。該免疫原肽可用其胺基端、其羧基端或兩 者連接到載體上來形成共軛物。任意地，在共軛物中可存 在該免疫原肽之多個複本。 A泠的N端片段可用其C端連接到載體肽上來形成共 φ 軛物。於此等共軛物中，該片段的N端殘基會構成該 共軛物的N端殘基。據此，此等共軛物有效誘生之抗體所 結合之抗原決定部位爲需要AyS之N端殘基呈游離形式之 部位。本發明某些免疫原肽含有多個A；S-N端片段複本， 其係以其C端連接到一或多個載體肽複本上以形成共軛 物。合倂到此等共軛物中之A^-N端片段有時係以A沒1-3 開始且以 A/3 7-11 結束。A/5 1-7、1-3、1-4、1-5 及 3-7 爲較佳之 A^-N端片段。有些共軛物含有不同的 A；S-N φ 端片段且縱排成列。例如，一共軛物可含有A A 1 ·7接著 爲A yS 1-3然後連接到載體上。 於某些共軛物中，A^S-N端片段係用其N-末端連接到 載體肽上。同樣種類之Α0-Ν端片段可如C端鍵結般使 用。某些共軛物含有載體肽連接到A/3-N端片段之N-末 端，其然後呈縱排地連接到一或多個額外的AyS-N端片段 上。較佳地此等免疫原A0片段在接合到適當的載體後所 引發之免疫反應係特異地針對該A /3片段而不會對其它 A /3片段有反應。 -35- 1379839 本發明之免疫原肽包括異源性免疫原肽。於某些免疫 原肽中，係將片段連接到載體上以形成異源性免疫原 肽。此等異源肽係使用本發明方法連接到載體上以形成共 軛物。一些此等異源性免疫原肽所含AyS片段係連接到破 傷風類毒素抗原決定部位上，如US 5,196,512， EP 378,881，及EP 427,347號所述。任意地，一段免疫原 肽例如可利用載體的N末端及C末端兩者來連接到一或多 個載體複本上以形成該異源性免疫原肽。其它此種異源性 免疫原狀還包括如US 5，73 6,142所述之連接到載體肽上之 A/3片段。例如，一段異源性免疫原肽可含有A0 1-7接著 爲 A/S1-3然後爲載體。此等異源性免疫原肽之實例包 括：
A/3 1-7 /破傷風類毒素830-844 + 947-967皆呈線性構型 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQIDNO.:24) 述於US 5,73 6，142之肽，（皆呈線性構型）： PADRE/Αβ 1-7: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO. :26) Αβ1-7 x 3/PADRE: DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO. :27) 1379839 PADRE/Api-7x3: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.:28) ΑβΙ-7/PADRE: DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.:29) Αβ1-7/白蛋白片段： DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:30) Αβ4-10/白蛋白片段： FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID N0.:31) Αβ3-9/白蛋白片段：
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ Π) NO.:32) ΗΑ3〇7·3ΐ9/Αβι·7 X 3: PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.:33) Αβΐ-7/ΗΑ3〇7.3ΐ9/Αβΐ-7： DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO.:34) Αβΐ-7Χ 3/HA.307.319： DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO. :35) Αβΐ-7Χ 2/HA307-319： DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.:36) AP1.7/HA307.319/ CS/TTg30-844/TT947-967/APi-7 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO.:37) Αβΐ-7 X 3/TT830-844/C/TT947-967 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.:38) Αβ 1 ·7/ΤΤ830-8 WC/TT947-967 ϋΑΕΡΚΗΒ·(5ΥΙΚΑΝ3ΚΡΙΟΙΤΕ]ΧΡΝΝΡΤν3Ρ\νίΙΐνΡΚν3Α8ΗίΕ (SEQ ID NO.:39) Αβ 1 -7/TT 咖-844/ C/TT 947.967/Αβ 1.7 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO. :20) -37- 1379839 某些異源性免疫原肽包含免疫原肽之2X多聚體，其 中X爲1-5之整數。較佳地X爲1、2或3，以2爲較佳。 當X爲2時，此等多聚體有4個免疫原肽以被稱爲MAP4 之較佳構型連接著（參考1；3 5,22 9,4 90號）。然後使用本 發明方法將此等免疫原肽連接到一載體上以形成共軛物。 該ΜAP4構型顯示如下，其中該分支結構係在離胺酸 的Ν端及側鏈胺兩者同時引發肽合成作用而造成的。視將 離胺酸倂入序列且令其分岔之次數而定，所產生的結構可 具有多個Ν末端。於此實例中，在含有離胺酸之分支核上 可製造出四個同樣Ν-末端。此等多重性大幅增強了關聯Β 細胞的反應性。
此等異源性免疫原肽之實例包括： Α/3卜7/破傷風類毒素83 0-844呈ΜΑΡ4構型： DAEFRHD-QYKANSKFIGITEL (SEQ ID ΝΟ.:22) A /3 1-7/破傷風類毒素947-967呈ΜΑΡ4構型： DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ TD ΝΟ.:23) 1379839 A冷3-9/破傷風類毒素830-844呈MAP4構型： EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO.:25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL 於 2 分支樹月旨上 肽
Lys-Gly-Cys 肽 該ΑΘ肽、類似物、活性片段或其它多肽可採組合或 • 多聚體形式或分散形式來投藥。治療劑亦包括了單體性免_ 疫原藥劑的多聚體。A0肽以外的治療劑應引發抗一或多 種前文所述之較佳A/S片段（如1-10、1-7、1-3及3-7) 之免疫反應，且可使用本發明方法接合到載體上。較佳 地，此等治療劑一旦被接合到適當載體上，即可引發特異 性針對一種此等片段之免疫反應但不會對其它Α0片段產 生反應。爲了促進肽免疫原及載體之接合作用，可將額外 的胺基酸加到該抗原性決定子的末端。此等額外的殘基亦 ^ 可用來修改該肽免疫原之物理或化學性質。可在該肽免疫 原的C或Ν末端引入胺基酸如酪胺酸、半胱胺酸、離胺 酸、麩胺酸或天冬胺酸等。此外，還可引入含有胺基酸如 甘胺酸及丙胺酸之肽連接子。另外，該抗原性決定子可經 由末端ΝΗ2-基乙醯化如以烷醯基（C1-C20 )或硫甘醇基 乙醯化或用氨、甲胺等將末端-羧基醯胺化來加以修改而 與天然序列有所不同。於某些例中，此等修改可提供用來 連接撐體或其它分子之部位。 以在此所揭示之過程產製之本發明共軛物所用之肽免 -39- 1379839 疫原係透過鍵結來組合成聚合體（多聚體），或者可無需 鍵結而用混合形式來配方成組成物。當肽被連接到同一種 肽上形成同聚合體時，則在聚合體上會出現複數個重覆的 抗原決定單元。例如，可使用多抗原肽（MPA )技術來建 構含有CTL及/或抗體肽及肽兩者之聚合體。“CTL抗原 決定部位”係衍生自有效目標抗原內選定之抗原決定性區 域。當肽有所不同時，像是如雞尾般之不同病毒亞型時， 在該亞型內會有不同的抗原決定部位、不同HLA限制酶 特異性，如此即可提供含有T-輔助者抗原決定部位之肽 類、具有重覆單元之雜聚合體。除了共價鍵結以外，本發 明亦包括可形成分子間及結構內鍵結之非共價性鍵結。 此等肽免疫原及其類似物可用固相肽合成法或重組表 現法來合成，或從天然來源取得。自動肽合成器可從多種 供應商如 Applied Biosystems，Foster City, California 購 得。 重組表現可在細菌（如大腸桿菌）、酵母菌、昆蟲細 胞或哺乳動物細胞中進行。重組表現之步驟係述於 Sambrook et al., Molecular Cloning ： A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY，2nd ed.，1989)。某些免 疫原狀亦可商業性取得（如 American Peptide Company， Inc. Sunnyvale, CA,及 California Peptide Research，Inc ·， Nap a, C A )。 亦可在肽或其它化合物之隨機庫中篩選出適合作爲肽 免疫原者。亦可使用許多類型之化合物來製成組合庫，其 1379839 係採一步一步的形式合成的。此等化合物包括多肽、泠-旋轉模仿劑、激素、寡聚性N-取代甘胺酸、寡聚胺基甲 酸酯等。諸化合物之大型組合庫亦可使用述於 W0 95/1 2608、WO 93/06 1 2 1、W094/0805 1、W0 95/3 5503 及 WO 95/30642 (皆併此以供所有目的參考）編碼合成庫 (ESL )法來構築。肽庫亦可使用噬菌體顯示法來產生 (參考例如 Devlin, WO 91/18980)。 將免疫肽衍生化且接合到蛋白質載體上 肽免疫原依附到蛋白質/多肽載體之部位，以及用來 把肽免疫原依附到該載體上之交聯劑的特性兩者對於其所 誘生之抗體的特異性十分重要。爲了譲該免疫原能正確地 被辨識出來，該肽免疫原必需以適當的方向偶合到該載體 上。接下來爲了讓抗體辨識出沒有載體之游離肽免疫原部 份’該肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物必需以顯露及 φ 可接近形式來呈現該肽免疫原。將交聯反應導向肽免疫原 的特殊部位通常可以達到最佳的方向性。一種以肽免疫原 達成此目的的方法爲在肽合成期間於末端加上一個半胱胺 酸殘基。如此可在肽的一端提供氫硫基以供載體接合。透 過此基團交聯可使得該肽免疫原僅用一端依附，如此即可 確保有恆定的方向性。 於肽免疫原-載體接合作用中，其目標並非維持該載 體之天然態或穩定性，而在於以最佳方式呈現出該半抗原 以供免疫系統辨識。爲了達到此目標，接合化學的選擇就 -41 - 1379839 可控制所產生之抗該半抗原抗體之效價、親和力及特異 性。在某些例子中很重要地必需選取一種交聯劑，其所含 接頭臂必需長得足以非限制地呈現該抗原。控制載體表面 肽免疫原之密度也很重要。肽免疫原取代太少可能只能引 起微弱反應，甚至無法反應。事實上肽免疫原密度過高可 能會造成免疫抑制作用且降低反應。此外，交聯劑本身也 可能會引起不必要的免疫反應。必需考慮此等因素，所以 在選擇時不僅要選擇適當的交聯劑，還要選擇適當的蛋白 質/多肽載體與肽免疫原比例。 可以使用多種方法來將該蛋白質/多肽載體依附到該 肽免疫原上。可透過末端或者離胺酸之ε -胺基來進行離 子性交互作用。也可以透過殘基側基團與肽免疫原間的氫 鍵鍵結來進行。最後’蛋白質/多肽載體與免疫原肽間的 結構交互作用亦可產生穩定的依附作用。 可使用多種交聯劑如零長度交聯劑、同雙關能交聯劑 或異雙官能交聯劑來成功地產生肽免疫原·載體共軛物。 在生物性接合作用中可用的最小反應劑系統被稱爲零長度 交聯劑。此等化合物可透過在兩分子間形成鍵結且並未加 入額外原子而媒介兩分子的接合。所以係以分子的一個原 子來作爲連接子。在許多接合計劃中，最後的複合體基本 上係在被交聯物質中加入外來結構來把此等化學成份交聯 在一起。於某些應用中，此等介入連接子之存在對於所欲 用途具有決定性。例如，在製備肽免疫原-載體共軛物 時’所形成的複合物係要用來誘生針對所附半抗原之免疫 -42- 1379839 反應。有時候，有一部份免疫反應產生之抗體會對接合過 程所用之交聯劑具有特異性。零長度交聯劑係在兩物質間 媒介直接的鍵結作用，便能消除此類型交叉反應的可能 性。 同雙官能反應劑，其爲最先被用來修改及接合巨分子 之交聯劑，係由兩端含有相同官能基之雙反應性化合物所 組成（Hartman and Wold, 1966)。此等反應劑係藉著與 φ 兩分子上的共相同基團共價反應來把一蛋白質連接到另一 者上。所以可簡單地將兩種蛋白質與同雙官能反應劑混合 在一起，來使得一蛋白質上之離胺酸ε-胺基或N-端胺與 第二種蛋白質上相同官能基交聯在一起。 異雙官能接合反應劑則含有兩種不同的反應性基團， 其可與蛋白質及另一巨分子上不同的官能基標的偶合在一 起》例如，一部份載體交聯劑可含有胺-反應性基團，另 —部份則含有硫氫基-反應性基團》其結果使得該反應劑 φ 具有針對標的分子所選定部份進習交聯反應的能力，如此 可對該接合過程有更佳控制。 異雙官能反應劑可用兩步驟或三步驟方式來交聯蛋白 質及其它分子，如此便可限制聚合的程度，此爲使用同雙 官能交聯劑常產生的狀況。 近來有許多方法可用零長度、同雙官能或異雙官能交 聯劑來將狀免疫原偶合到蛋白質/多肽載體上。多數方法 會形成胺 '醯胺、胺基甲酸酯、異胺基甲酸酯或二硫化物 鍵結’有時會形成硫醚。將蛋白質或肽偶合到肽上的最常 -43- 1379839 用方法爲使用雙官能交聯劑。此爲兩端具有活性基團之小 型接頭分子。該等接頭分子在兩端各具有相同或不同的活 性基團。最常用的活性官能基團、偶合基團及所形成的鍵 結爲· 1·醛-胺基—次級胺 2. 馬來酿亞胺·硫氮基硫釀 3. 琥珀醯亞胺-胺基―醯胺 4. 亞胺酸酯-胺基—醯胺 5. 苯基疊氮化物-胺基θ苯基胺 6. 醯基鹵-氫硫基—硫醚 7 ·吡啶基二硫化物-氫硫基.—二硫化物 8.異硫氰酸鹽-胺基—異硫脲 特定載體蛋白質之反應性，換句話說爲其用交聯劑修 改來接合到肽免疫原的能力，係由其胺基酸組成、個別胺 基酸在分子三級節構中的序列位置、以及肽免疫原之胺基 酸組成所決定。 在位於蛋白質/肽載體及其它肽（如蛋白質/肽載體 及肽免疫原’）間的連接子（“L”）之例中，此等連接子典 型地係選自Ala、Gly或其它非極性胺基酸之中性連接子 或中性極性胺基酸。於特定具體例中，該中性連接子爲 Ala。應瞭解地任意存在之連接子不需要係由同樣殘基所 組成且所以可爲異寡聚體或问寡聚體。示範性連接子包括 AJa之同寡聚體。當存在時’該連接子通長有至少—或兩 個殘基長，最常見爲三到六個殘基長。於其它具體例中， 1379839 該蛋白質/多肽載體係被接合到肽免疫原上， 基端與該蛋白質/肽載體接合在一起。該等肽可 接子如Ala-Ala-Ala等連接在一起，較佳地進一 個依附在離胺酸（Lys)殘基之〇及£胺基酸上 基如棕櫚酸等（（PAM) 2Lys)，其典型地係索 鍵結等依附到該肽共軛物之胺基端。
於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種選 • 5-L、AyS 1-7-L、AyS 1-9-L 及 1-12-L 之 A/S 本發明某些態樣中，該連接子爲GAGA ( SEQ 10) ° 爲了促進肽眼免疫原與載體之接合作用，將 基酸加到該抗原性決定子之末端。該額外的殘基 修改該肽免疫原的物理或化學性質。可將胺基 酸、半胱胺酸、離胺酸、麩胺酸或天冬胺酸等引 疫原的C-或N-末端。此外，還可引入含有胺基 φ 酸及丙胺酸之狀連接子。另外，該抗原性決定子 端NH2-基乙醯化如烷醯基（C1-C20)或硫甘醇 或用氨、甲胺等將末端-羧基醯胺化來加以修改 序列有所不同。於某些例中，此等修改可提供用 或其它分子之部位。
於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種選 5-C、AyS 1-7-C、A/3 卜9-C 及 AyS 1-12-C 之 AyS
中C爲半胱胺酸殘基。於本發明某些態樣中，該 爲一種選自 1-5-L-C、AyS 1-7-L-C、A/3 1-9-L 佳係以胺 用中性連 步含有一 之脂質殘 I Ser-Ser 自A沒1-片段。於 IN NO ： 額外的胺 亦可用來 酸如酪胺 入該肽免 酸如甘胺 可經由末 基乙醯化 而與天然 連接撐體 自 A；!? 1-片段，其 肽免疫原 -C及 -45- 1379839 Α)δ 1-12-L-C 之 Α/S 片段》 該等肽免疫原係直接地或經由位於該肽免疫原之胺基 或羧基末端之連接子來連接到該蛋白質/肽載體上。該肽 免疫原或該蛋白質/肽載體之胺基末端可被乙醯化。此 外，該肽免疫原-蛋白質/肽載體共軛物可經由一或多個 接頭殘基如下文所述之Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Sei•來連 接到特定烷醯基（C1-C20)脂質上。其它有用的脂質基團 還包括膽固醇、脂肪酸等。 肽免疫原可藉著化學交聯來連接到載體上。將免疫原 連接到載體上之技術包括使用N-琥珀醯亞胺基-3- ( 2-吡 陡硫基）丙酸鹽（SPDP ) ( Carlssonm J et al. ( 1 978 ) biochem J，173 : 723)，及琥珀醯亞胺基4- (N-馬來醯亞 胺甲基）環己烷-1-羧酸酯（SMCC)(若該肽缺乏氫硫 基，可藉由在半抗原上添加一個半胱胺酸來提供。此等反 應劑可在彼此間及蛋白質上的肽半胱胺酸殘基間形成二硫 化物鍵結及透過離胺酸上的e ·胺基或其它胺基酸上的它 種游離胺基來形成醯胺鍵結。多種此等二硫化物/醯胺形 成反應劑係述於Immuno. Rev. 62: 85 ( 1 982 ) 中。其 它雙官能偶合劑則會形成硫醚而非二硫化物鍵結。該等硫 醚形成劑包括5-馬來醯亞胺己酸、2-溴乙酸及2-碘乙酸、 4-(N-馬來醯亞胺甲）機環己烷-1-羧酸之反應性酯。該等 羧基團可藉由將其與琥珀醯亞胺或1-羥基-2-硝基-4-硫酸 鈉鹽結合來被活化。 最常見地，離胺酸爲載體蛋白質上數量最多的胺基酸 -46 - 1379839 殘基，且此等殘基可用交聯反應劑來修改而生成親核性部 位，其而後可被偶合到半抗原上。此等偶合作用係透過化 學活化之半抗原分子上任何一個親水部位來進行。其包括 舉例來說有精胺酸之胍基、麩胺酸及天冬胺酸之羧基、半 胱胺酸之氫硫基、及離胺酸之ε-胺基酸。修改蛋白質使 其得以與其它基團偶合之修改作用可使用交聯劑來達成， 該交聯劑可與蛋白質載體或半抗原分子的任一側鏈反應。 ^ 於本發明一態樣中，具有或不具有接頭分子之載體蛋 白質可用能將反應性部位引入載體蛋白質分子之反應劑來 官能化（衍生化），其可被進一步修改再引入親核性基 團。於一具體例中，該載體係與鹵乙醯化劑反應，該反應 劑較佳地會與多種蛋白質胺基酸殘基上的官能基如半胱胺 酸的氫硫基、離胺酸殘基的初級ε -胺基團、α -胺之α末 端、甲硫胺酸之硫醚及組胺酸之兩個咪唑醯基側鏈之氮原 子來反應（Gurd, 1 967 )。於一較佳具體例中，該載體蛋 % 白質之離胺酸殘基上之初級ε-胺基係用b N-羥琥珀醯亞 胺基溴乙酸鹽來衍生化以生成溴乙醯化載體。肽免疫原及 已活化蛋白質載體之接合係藉由將已活化載體緩慢地加到 含有該肽免疫原之溶液中來進行。 藉由使用本發明方法，可將文中B部份討論之肽免疫 原與任何文中A部份討論之載體接合在一起。從本發明方 法製成的共軛物會被用來當作被動/活性預防接種治療中 之免疫原以誘生抗A/5-抗體之產生。進一步地，連接到 載體上之A/3或A0-片段可被投予至實驗動物以製造抗 -47- 1379839 A^S之單株抗體。 於本發明一態樣中，該共軛物爲選自 A/31-7-CRM197 ' (八召1-7 X 3) -CRMi97 及（AySl-7 X 5)-
CRM, 97之共軛物。於本發明另一態樣中，該共軛物係選 自 CRM197-A /5 1 ·5、CRM197-A 冷卜7、CRM197-A 冷 1-9 及 CRM197-A/3 1-12。於本發明另—態樣中，該共軛物係選自 Α β I-5-C-CRM197 ' Α β 1-7-C-CRMi97 ' A β 1-9-C-CRM197 ' Αβ 1-12-C-CRMi97 ' Αβ 1 6 - 2 3 - C - C RM , 9 7 ' Αβ 17-24-C-CRM197 ' Αβ 18-25-C-CRMi97 ' CRMi97-C-A/3 16-23 ' CRMi97-C-AyS 17-24 > CRM,97-C-A^ 18-25 ' Αβ 16-22-C-CRMi97 ' Α β 1 7-23-C-CRMi97 ' Α β 18-24-C-CRM197 ' CRM197-C-A β 16-22 ' CRM197-C-A β 17-23 ' CRM197-C-A β 18-24 ' Α β l-9-C-CRM,97 ' Α β 1-12-C-CRM197。於本發明再一具體例中，該共軛物係選自 Α β 5-L-C-CRM,97 ' 1-7-L-C-CRM197 ' Αβ 1-9-L-C-CRM,97
及 l-12-L-C-CRMi97 0 加蓋 使用能將反應性部位引入載體上及/或半抗原分子上 之反應性胺基酸分子側鏈之偶合劑之一項缺點爲：若反應 性部位未經中和則其可在活體外或活體內與任何不良分子 自由反應。於本發明方法中，未反應官能基之加蓋可藉由 讓具有突出反應性基團之共軛物與可將該等反應性基團鈍 化/加蓋之反應劑反應來進行。可用於本發明接合過程之 -48- 1379839 鈍化/加蓋反應劑之實例有半胱胺、N -乙醯基半胱胺、及 乙醇胺。另外，加蓋可藉著與氨或碳酸氫銨反應來進行， 任一者皆可將鹵乙醯基轉變成胺乙醯基。加蓋亦可藉由氫 氧化鈉或碳酸鈉以鹼性pH値（9.0-9.8 )來進行，其鹵乙 醯基轉變成羥乙醯基。相對於與半胱胺衍生物、乙醇胺等 反應，將鹵乙醯基轉變成胺乙醯基或羥乙醯基的一項潛在 優點爲與氨或氫氧化物/碳酸鹽反應時可引入體積較小之 化學官能基團。如此產生之加蓋官能基如胺乙醯基或羥乙 醯基可對共軛物的載體部份造成相對較小的干擾性》可依 需要使用已知方法來純化加蓋之肽免疫原-載體蛋白質， 此等方法如層析（膠過濾、離子交換、厭水性交互作用或 親和力）、透析、超過濾-通透過濾、使用硫酸銨或醇類 作選擇性沉澱等。 免疫原共軛物及組成物 該加蓋肽免疫原-載體蛋白質共範物係以免疫原組成 物之形式來投予至哺乳動物，特別是人類以供預防及/或 治療。本發明共軛物係用來引發及/或增強抗該等免疫原 之免疫反應。例如，CTL-載體共軛物係用來治療及/或預 防病毒感染，澱粉樣變性病、癌症等。另外，亦可使用會 誘生抗體反應之肽免疫原-載體共軛物。 於治療性應用中，本發明之共軛物係投予至已患有澱 粉樣變性病如阿茲海默氏症之個體。此等處於疾病培育期 或急症期之患者可個別使用本發明之共軛物或配合其它適 -49- 1379839 當療法來治療。 於治療性應用中，本發明之免疫原組成物可投予至至 患者，其份量係足以引起抗該澱粉樣斑之有效CTL反應或 體液反應，以治癒或至少部份地遏阻疾病進程、症狀及/ 或倂發症。足以達到此等目的之份量被稱爲“治療有效劑 量”。可有效達到此用途目的之份量部份將視該肽組成 物、投藥方式、欲治療疾病之階段及嚴重性、患者體重及 一般健康狀態、及處方醫師的判斷來決定。 在治療性或預防性投藥作首次預防接種時本發明免疫 原組成物之治療有效劑量一般的範圍爲70公斤患者使用 約o.lyg到約l〇,〇〇〇/zg肽，通常爲0.1到約8000/zg， 更佳爲約0.1到約50〇Mg且最佳爲0.1到約l〇〇〇#g。 於投予此等劑量之後，視患者反應及所測得特異性免疫反 應之情況而定，在數週或數個月後的追加投藥計劃中所用 之追加劑量爲約0.1 // g到約1 000 V g肽。 進一步地，本發明可預防性地使用以防止及/或緩和 澱粉樣變性病。有效劑量如前所述。此外，熟悉此技術者 將瞭解如何適當地調整或修正預防療法，例如使用追加促 升投藥及調整投藥劑量及投藥計劃。 治療性投藥可在首次出現疾病徵兆時開始進行。然後 接著進行追加投藥直到疾病病程停止或逆轉或症狀減輕一 段時期。 本發明治療或預防處理用之免疫原組成物可非經腸、 局部、靜脈內、經口、皮下、經動脈、顱內、腹腔內、鼻 -50- 1379839 內或肌肉內途徑來作預防性或治療性處理》免疫原劑投藥 的一種典型途徑爲經皮，不過其它途徑同樣有效。其它常 : 用的途徑爲肌肉內注射。此種類型的注射常在手臂或大腿 肌肉內進行。於某些方法，藥劑會直接注射到澱積物累積 的特殊組織，例如顱內注射。投予抗體時較佳係使用肌肉 內注射或靜脈內灌注》於某些方法中，係將特殊抗體直接 注射到顱內。基於投藥的容易性，本發明免疫原組成物特 ^ 別適合口服投藥。本發明進一步提供一種非經腸投藥的免 疫原組成物，其含有肽或共軛物之溶液，溶於或懸浮於一 種可接受載體，特別是水性載體內。 有多種稀釋劑、賦形劑及緩衝液可使用，例如水、緩 衝水、磷酸鹽緩衝鹽水、0.3 %甘胺酸、玻璃酸等。此等組 成物亦可用傳統習知消毒技術來滅菌或可過濾滅菌。產生 之水溶液可就此分裝使用或者被冷凍乾燥，該等冷凍乾燥 製劑可在投藥前與無菌溶液合倂。此等組成物可含有接近 φ 生理條件需要之藥學可接受輔助物質，如緩衝液、肌肉彈 性調整劑、濕化劑等，如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化 鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖、油酸三乙醇胺等。 固體載劑中可使用習知的無毒載劑。其可包括例如藥 用級甘露醇'乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖 維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。口服投藥之藥學可接受 無毒組成物可藉由併入任何常用賦形劑例如先前列示之賦 形劑以及一般爲10-95%之活性成份（即本發明一或多種 共軛物）且更佳爲濃度2 5-75 %之活性成份來製成。 -51 - 1379839 在藥學調合物中本發明免疫原組成物之濃度變化極 大，可從低於約〇. 1重量％，到通常爲約2重量％或更少， 到多達20重量％到5〇重量％，且將依所選用之特殊投藥 模式主要根據流體體積、黏度等來選用。 本發明共軛物亦可經由脂質體來投藥，該脂質體可將 共軛物瞄準特殊組織如淋巴組織或瞄準感染細胞來投予， 且可增加該肽組成物之半衰期壽命。脂質體包括乳液、泡 沫、膠粒、不溶性單層體、液態結晶、磷脂質分散液、單 層體等。於此等製劑中，欲運送之組成物會被合倂成脂質 體的一部份，其可單獨存在或與一種能與大量存在於淋巴 細胞內之受器相結合之分子接合在一起。此等分子包括能 與CD4 5抗原結合之單株抗體，或者以及其它治療性或免 疫原組成物。所以，裝塡有本發明組成物之脂質體可針對 淋巴細胞部位來運送所選用之治療性/免疫原性肽組成 物》用於本發明之脂質體係由標準囊泡形成脂質所形成， 其一般包括中性及帶負電磷脂質及固醇如膽固醇。脂質的 選用一般要考慮脂質體大小、酸不穩定性及脂質體於血流 中的穩定性來決定。多種方法可用來製備脂質體，如述於 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1 980)， 美國專利第 4,23 5,87 1 、 4,501，728 、 4,873,028 及 5,0 1 9,3 69號皆倂此以爲參考。 在以氣霧劑投藥時，本發明組成物較佳呈細分形式與 一種界面活性劑及推進劑一起供應。該組成物典型的比例 爲0.01-20重量％，較佳爲1-10重量％。當然，該界面活 -52- 1379839 性劑必需無毒且較佳地溶於推進劑中。此等化學劑的代表 爲含有6到22個碳原子之脂肪酸酯類或部份酯，如己 酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸' 油硬脂酸、油酸以及脂族多氫醇或其環狀酐。可採用混合 酯如混合或中性甘油酯。該界面活性劑可構成0.1-2 0重量 %之組成物，較佳爲0.25-5重量％。組成物之平衡劑通常 爲推進劑。若有需要可包括載體與卵磷脂以作鼻內投藥。 本發明之共軛物可任意地組合至少部份有效地治療及 /或緩和及病及/或其症狀之其它藥劑來投予。於澱粉樣 澱積發生在腦部之阿茲海默氏症及唐氏徵候群之例中，本 發明共軛物可組合能增加本發明藥劑通過血腦屏障之通透 性之其它藥劑來投予。 該免疫原組成物典型地含有佐劑。佐劑爲一種與免疫 原或抗原一起投藥時可加強免疫反應之物質。多種細胞因 子及淋巴因子已顯示出具有免疫調節功能，所以可用來當 作佐劑，包括但不限於白介素l-α、1-0、2、4、5、6、 7 ' 8、10、12 (參考美國專利第 5,723，127號）、13 ' 14、15、16、17及18(及其突變型），干擾素〇:、/3及 7 ，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（參考例如美國專利 第5,07 8,996號）、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落 刺激因子、CSF'及腫瘤壞死因子〇：及召。可用於本發明 之其它佐劑還有趨化因子，包括但不限於MCP-1、MIP-1α、MIP-Ιβ及RANTES »黏附分子如選凝素像是L_選凝 素、P-選凝素及E-選凝素亦可用來當作佐劑。其它可用的 -53- 1379839
佐劑包括但不限於類黏蛋白分子，如CD34、GlyCAM-l及 MadCAM-Ι、整連蛋白家族之一員如 LFA-1、VLA-1、 Mac-Ι及ρ150·95，免疫球蛋白超族之一員如 PECAM、 ICAMs 如 ICAM-1、ICAM-2 及 ICAM-3，CD2 及 LFA-3， 共刺激分子如CD40及CD40L、生長因子包括血管生長因 子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長 因子、B7.2' PDGF、BL-1、及血管內皮細胞生長引子、 受器分子包括 Fas、TNF 受器、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、 DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2 及 DR6。其它佐劑分 子還包括 Caspase ( ICE )。亦可參考國際專利公告第 W098/1 7799及W099/43 839號，其全部倂此以供所有目 的參考。 可用來增強免疫反應之適當佐劑包括但不限於MPLtm (3-0 -去釀基單碟醒基脂質A: Corixa，Hamilton, MT)， 其係述於美國專利第4,912,094號且該專利倂此以爲參 考。同樣適合用來作爲佐劑的還有合成性脂質A類似物或 胺烷基葡糖胺磷酸鹽化合物（AGP )、或其衍生物或類似 物，其可取自Corixa(Hamilton，MT)且係述於美國專利 第6，113,918號，其倂此以爲參考。一種此類AGP爲2-[(R) -3-十四烷醯氧基十四烷醯胺基]乙基2-去氧-4-0-膦-3-0-[(S) -3-十四烷 醯氧基 十四烷 醯基]-2-[(R) -3-十四烷醯氧基-十四烷醯胺基]-b-D-吡喃葡糖甙，其以529 爲人所習知（亦以RC529爲人所知：Corixa)。此種529 -54- 1379839 佐劑可被配方成液體形式（5 29AF )或穩定的乳液 (52 9SE )。 其它的佐劑還包括礦物油及水乳液，鈣鹽如磷酸鈣、 銘鹽（如明攀）如氫氧化銘、隣酸銘等，Amphigen， Avridine、L121/ 鯊烯、D-交酯-聚交酯 / 式、pluronic 酸、多元醇、胞壁醯二肽、死亡的博代氏桿菌 (、巷苷、如 StimulonTM QS-21 ( Antigenics， ^ Framingham, ΜΑ)，其係述於美國專利第5,057,540號且 該文件倂爲參考資料3以爲參考，及由其製成的顆粒如 IS C Ο M S (免疫刺激性複合物）、結核桿菌 (My cobacterium 、細菌性脂多醣、合成性 聚核苷酸如含有CpG motif之寡聚核苷酸（美國專利第 6,207,646號，其倂此以爲參考），百日咳類毒素 (PT)、或大腸桿菌熱·不穩定毒素（LT) '特別是1^-K63、LT-R72、PT-K9/ G129 ;參考例如國際專利公告第 • WO 93/1 33 02及WO 92/1 9265號，其倂此以供所有目的參 考。 同樣可用來作爲佐劑的還有霍亂毒素及其突變體，包 括述於已公開之國際專利申請案第W〇 00/1 8434號者 (其中於胺基酸位置29之麩胺酸已被另一種胺基酸（除 了天冬胺酸以外之胺基酸，較佳爲組胺酸）所替代）。類 似的CT毒素或其突變物係述於已公開之國際專利申請案 第WO 02/098368號（其中於胺基酸位置16之異白胺酸已 被另一種胺基酸所替代，其可單獨存在或合倂有胺基酸位 -55- 1379839 置68之絲胺酸被另一種胺基酸替代的情形；及/或其中 位於胺基酸位置72之纈胺酸被另一種胺基酸替代）。其 它CT毒素則述於已公開之國際專利申請案第 W0 02/098369號（其中位於胺基酸位置25之精胺酸被另 一種胺基酸替代；及/或有一個胺基酸插到胺基酸位置49 之處；及/或有兩個胺基酸插到胺基酸位置35及36之 處）。 應了解地在本說明書中所有引用之參考資料即使用任 何理論來解釋本發明結果也不能用以限制本發明之範圍。 基於本發明可發揮效用之方法的獨立性，在此所述之結果 及優點可參考如下實施例來達成。 對於熟悉此技術者極明顯地可在不悖離後附申請專利 範圍之精神或範疇下進行許多改變及修正。所有在此說明 書中提到的公告、專利及專利申請案全部併此以供所有目 的參考，如同特殊且個別標示地倂用各個公告、專利及專 利申請案以爲參考。 【實施方式】 實施例1 CRM197與Αβ肽的接合 半抗原/抗原性肽的接合係使用如下所述之方法（第 1圖）將已活化且具有39個離胺酸殘基之CRM197載體與 具有突出硫醇基之半抗原/抗原性肽反應來進行。所有 AP肽於羧基端含有半胱胺酸殘基以促使此等肽經由半胱 胺酸基硫氫基來接合到載體蛋白質上。此等肽可用固相合 -56- 1379839 成來產生。 I. 活化 將CRM197之游離胺基與過量溴乙酸N-羥基琥珀醯亞 胺酯（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO ) (Bernatowicz and Matsueda，1986)反應來漠乙醒化。 在CRM197 (約15 mg)之冰冷卻溶液中加入10% | ( v / v ) 1.0 Μ碳酸氫鈉（pH8.4 )。將重量與所用 CRM197相同之溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯溶於200yL二 甲醯甲醯胺（DMF )中，緩慢地加到CRM197內，且於室 溫黑暗下溫和攪拌1小時。所產生的溴乙醯化（活化）蛋 白質可藉著通過去鹽（P6-DG )管柱並使用 PBS/ ImM EDTA ( ΡΗ7·0)作爲溶析液來純化。純化後，將相當於活 化CRMi97之餾份合倂且用BCA檢定來估算蛋白質濃度。 用溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯處理前及處理後之蛋白質 φ 胺基用2,4,6-三硝苯磺酸（丁\83八）來反應，其可作爲溴 乙醯化的指標（Means et al·，1972) » II. 接合 在接合前’先將肽與5，5’-二硫-雙（2-硝基苯甲酸） [艾蒙試劑]反應以確定游離-SH基團的量（介於62-88 %已 還原）。對於前4種A0肽（胺基酸1-7無連接子、胺基 酸1-12具GAGA連接子（SEQ ID NO: 10)、胺基酸1-9 具GAGA連接子（SEQ ID NO: 10)、及胺基酸丨_7具 -57- 1379839 GAGA 連接子（SEQIDNO: 10))，約有 8.0-10.0 mg 肽 被溶於無菌蒸餾水中使得濃度爲約20 mg/ml。以1: 1 比例（w/ w)將肽緩慢地加到冷的已活化CRM197中且加 入20-26//1之IN NaOH來把pH値調整成約7.0-7.2。把 所產生的物質置於黑暗4°C下溫和攪拌隔夜，接著於黑暗 pH7.2下針對PBS的兩種IL變化透析。至於其次4種A/3 肽（胺基酸1-5無連接子、胺基酸1-9有接頭、胺基酸1-12有接頭、及胺基酸1-5有接頭），用艾蒙試劑反應以確 定游離-SH基量。將CRM197溴乙醯基化、純化且與 TNBS A反應如前所述。各個狀之PH値可藉著加入體積爲 溶解肽 2.2倍之 0.1 M NaP04 ( pH 8.5 )來調整成 pH 7.0。以1 : 1比例（w/ w )將肽緩慢地加到冷的已活化 CRM197中且於黑暗4°C下任其反應隔夜。將所產生之物質 透析。如上所述並採取如下修正來將終控制肽（1 - 1 2逆向 聚體）接合到CRM197上。與把肽PH値調整成7.0不同 地，已活化CRM197之pH値係藉著加入 20% ( v / v ) 0.5M NaP04 ( P Η 8.0 )來調整。於透析後，各個共軛物 會被轉移到無菌1 5m L聚丙烯管中，用鋁箔止包裹住，且 儲存在4°C。而後載體上反應性胺基殘基活化的情形可使 用質譜儀來確認。 致免疫肽 DAEFR-C (SEQ. ID. ΝΟ.:1) DAEFRHD-C (SEQ. ID NO.:2) DAEFRHDSG-C (SEQ ID NO:3) 共軛物
Api-5-C-CRMi97 Apl-7-C-CRMi97 Apl-9-C-CRM197 1379839
Apl-12-C-CRMi97 Apl-5-L-C-CRMi97 Αβ l-7-L-C-CRM197 ΑβΙ-9-L-C-CRMw Apl-12-L-C-CRM,97
Api2-l-C-CRMi97 (-VE CONTROL) DAEFRHDSGYEV-C (SEQ ID NO:4) DAEFR-GAGA-C (SEQ ID NO.:5) DAEFRHD-GAGA-C (SEQ ID NO. :6) DAEFRHDSG-GAGA-C (SEQ ID NO.:7) DAEFRHDSGYEV-GAGA-C (SEQ ID NO.:8) VEYGSDHRFEAD-C (SEQ ID NO.: 9) L=接頭序列（GAGA) (SEQ ID NO.:10) 實施例2 製備A /3肽-CRM! 97共軛物並以超過濾來純化 CRM197之溴乙醯化 於氬氣下以1 : 1重量比來將（l〇〇mg)於0_01M磷酸 鈉緩衝液，0.9%氯化鈉，PH7.0與溴乙酸N-羥基琥珀醯亞 胺醋（於DMSO溶成20 mg/ml)反應。依需要將反應加 以硏製直到pH値保持在7.0。混合物於室溫黑暗中攪拌 1.5小時。反應混合物用1.2em過濾到UF/DF系統 (Millipore Labscale TFF，Billerica，MA)之保留儲槽 中。純化係以10K或3 0K UF膜相對於0.01M磷酸鈉緩 衝液/ 〇.9%NaCl， ρΗ7·0進行通透過濾（30倍）。讓溴 乙醯化CRM197通過0.2 // m濾器來過濾。溴乙醯化程度之 測定係將已活化CRMI97與半胱胺酸反應，接著進行胺基 酸分析及定量所產生之羧甲基半胱胺酸（CMC)。 A冷肽與溴乙醯化定量之接合以及使用N-乙析醯基半胱胺 -59- 1379839 來加蓋 將溴乙醯化CRM, 97 ( 50mg)轉移到反應容器中。將 維持於2-8 °C之攪拌溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸氫鈉。 於氬氣下進行硏製以達到PH9.0之目標。個別地，秤量 50mg AyS肽且溶於注射用水（WFI)中直到成爲20 mg/ mL。在此溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸氫鈉直到達到 ρΗ9.0»將肽溶液加到溴乙酿化CRM197溶液，且混合物於 2-8°C下攪拌14-18小時。剩下的溴乙醯化基團用20倍過 量之N-乙醯基半胱胺於2-8°C下進行3-6小時之加蓋反 應。 將反應混合物用1.2//m濾器來過濾到UF/DF系統 (Millipore XL)之保留儲槽中，且共範物係於室溫下以 10K 或 30K MWCO 膜（Millipore)相對於 0.01M 磷酸鈉 緩衝液/ 〇.9%NaCl，ρΗ7·0進行30倍通透過濾。收集保 留物且用0.2 /zm過濾且分析蛋白質含量（Lowry或 Micro-BCA比色檢定），以SDS-PAGE分析，以胺基酸分 析，及分析其於小鼠體內之免疫原性。 實施例3 將未反應之溴乙醯基團加蓋轉化成胺乙醯基團 將如上實施例2製得之溴乙醯化CRM, 97 ( 50 mg ) 轉移到反應容器中。將維持於2-fC之攪拌溶液中加入1M 碳酸鈉/碳酸氫鈉。於氬氣下進行硏製以達到ρΗ9·0之目 標。個別地，秤量50mg Α冷肽且溶於注射用水（WFI )中 -60- 1379839 直到成爲20 mg/mL »在此溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸 氫鈉直到達到PH9.0。將肽溶液加到溴乙醯化CRM197溶 液，且混合物於2-8 °C下攪拌14-18小時。剩下的溴乙醯 化基團於2-8°C下用8%碳酸氫銨溶液進行4小時加蓋反 應。 將反應混合物用1.2// m濾器來過濾到UF/DF系統 (Millipore XL)之保留儲槽中，且共軛物係於室溫下以 10K 或 30K MWCO 膜（Millipore)相對於 0.01M 磷酸鈉 緩衝液/ 〇.9%NaCl，ρΗ7·0進行30倍通透過濾。收集保 留物且用 〇.2 過濾且分析蛋白質含量（Lowry或
Micro-BCA比色檢定），以SDS-PAGE分析，以胺基酸分 析，及分析其於小鼠體內之免疫原性。 實施例4 定量測定S-羧甲基半胱胺酸及S-羧甲基半胱胺以評估肽 φ 免疫原-蛋白質/多肽共軛物之接合及加蓋程度 對使用溴乙醯活化化學所產生之蛋白質-肽共軛物在 酸水解後會從接合部位的半胱胺酸生成酸穩定之S-羧甲基 半胱胺酸（CMC)且從加蓋部位之半胱胺生成酸穩定之S-羧甲基半胱胺（CMCA )(第2圖）。所有已接合及已加 蓋離胺酸都會被轉變回離胺酸且以此形式來被偵測。除了 色胺酸及半胱胺酸以外（其在水解條件下會被破壞），所 有其它胺基酸會被水解成游離的胺基酸。天冬醯胺及麩醯 胺分別會被轉化成天冬胺酸及麩胺酸。 -61 - 1379839 將共軛物樣本用去離子水來稀釋直到總蛋白質濃度低 於1 mg/ mL。將各個共軛物之10微克液份各兩份加以乾 燥且再懸浮於1〇〇μΙ^ 6N HC1 [Pierce]，5μί融化苯酚 [Sigma-Aldrich]及 1 // L 2-氫硫基乙醇[Sigma-Aldrich]。 然後此等樣本於1101真空（1〇〇 mT)下培育22小時》 將所產生的水解物乾燥，再懸浮於 2 5 0μί貝克曼 (Beckman ) Na - S檸檬酸鈉樣本稀釋緩衝液（p Η 2.2 ) [Beckman In s t r um e nt s，Inc.，Ful 1 e rt on，C A ]，且使用華特 曼（Whatman) 0.2 μιη尼龍注射器頂端濾器及1 m L注射 器來過濾。 然後將所有樣本裝載到貝克曼6300胺基酸分析器樣 本環中且置入分析器中。將各水解樣本及控制組胺基酸使 用離子交換層析分離出來且接著於135 °C下與貝克曼 Ninhydrin NinRX溶液反應。然後衍生化胺基酸會於 570nm及440nm之可見範圍下偵測（見表1)。含有500 微微莫耳各種胺基酸之標準胺基酸組[Pierce Amino acid Standard Η]會與樣本一起測試且作爲各分析組之對照組。 加入S-羧甲基半胱胺酸[Sigma-Aldrich]作爲標準物。 1379839
使用貝克曼63 00胺基酸分析器之 梯度計劃1時胺基酸的滯留時間 滯留時間 (分鐘） 胺基酸 偵測用波長 8.3 羧甲基半胱胺酸 CMC 570 9.6 天冬胺酸&天冬醯胺 Asx 570 11.3 羥丁胺酸 Thr 570 12.2 絲胺酸 Ser 570 15.8 麩胺酸&麩醯胺 Glx 570&440 18.5 脯胺酸 Pro 440 2 1.8 甘胺酸 Gly 570 23.3 丙胺酸 Ala 570 29.0 纈胺酸 Val 570 32.8 甲硫胺酸 Met 570 35.5 異白胺酸 lie 570 3 6.8 白胺酸 Leu 570 40.5 酪胺酸 Ty r 570 42.3 苯丙胺酸 P h e 570 45.4 羧甲基半胱胺 CMCA 570 48.8 組胺酸 His 570 53.6 離胺酸 L y s 570 70.8 精胺酸 Arg 570 -63- 1379839 各標準峰之面積會在對各樣本進行比例性·評估時被用 來作爲定量性等量（quantitative equivalence)。脯胺酸 係於440 nm下測定且使用麩胺酸（最接近的胺基酸）於 57〇nm下轉化成等量値》 各項此等微微莫耳數會藉著把所測得之離胺酸之微微 莫耳數與蛋白質內離胺酸量理論値作比較來轉化成胺基 酸殘基之莫耳比例。由於離胺酸會共價依附到半胱胺酸及 半胱胺上及其預期的類似水解作用，所以被選來用在此評 估作用。然後各胺基酸所測得的莫耳數會與該蛋白質之胺 基酸組成作比較，且與CMC及CMC A的數據共同顯示出 來。CMC値被直接用來評估接合程度且CMCA値被直接 用來評估加蓋程度。 實施例5 界定ΑΘ - CRM197肽共軛物之特性及最適化 爲了確定接合作用，所有肽-CRM197共軛物會用胺基 酸分析及基質-輔助雷射解析離子化·時間之航行（MALDI-TOF )質譜儀來分析。對於各個共軛物，接合到各莫耳 CRM197之肽莫耳數係使用胺基酸分析（S-羧甲基半胱胺酸 殘基之數目）及MALDI-TOF質譜儀來測定。各個方法所 測得之數値一般係一致的。 I.尺寸排除層析 從儲存處取出批次濃縮樣本且回溫至室溫。將AyS肽 -64- 1379839 共軛物樣本溫和攪拌以確保均質製備。將該A沒肽共軛物 樣本用Eppendorf微離心機離心以除去任何粒狀物。取出 上清液且作 TosoHass TSK-Gel G3000SW 層析（TosoHaas，
Stuttgart,德國）。將 TosoHass TSK-Gel G3000SW 管柱連 接到HP LC系統且把壓力限度設定在1.4 MPa»管柱用至 少30 ml ，流速0.75 mL /分鐘之PBS (10mM磷酸鈉， 150mM 氯化鈉，pH7.2±0.1)來平衡。採用如下參數將A 冷肽共軛物樣本裝載到 TosoHass TSK-Gel G3000SW管 柱： A/3肽共軛物樣本之濃度：1.5±1.0mg/ml 流速：0.75 mL/分鐘 樣本體積：1 . 〇 m 1 進行時間：3 0分鐘 吸光度係以280 nm及210 nm監測。爲了長期儲存， 將 TosoHass TSK-Gel G3000SW 管柱用至少 50 ml，流速 0.5-1.0 ml /分鐘之20 %乙醇來平衡。 II.PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳）： 已活化（溴乙醯化）CRM197及AyS肽-CRM197共軛 物係以SDS-凝膠來檢驗，其中採用了 NuPAGE Bis-Tris電 泳法（Novex，Frankfurt，德國）及中性pH値，預鑄聚丙稀 醯胺迷你膠系統及NuPAGE MES SDS跑膠緩衝液。將8 -65- 1379839 μ g液份已活化CRM或其共軛物與還原性樣本緩衝液混合 在一起且於1〇〇 °C加熱5分鐘。將共軛物及分子量 (MW )標準物（Invitrogen，Carlsbad，CA )載入基於 Bis-Tris-HCl緩衝系統之 10% ( w/v，丙烯醯胺） NuPAGE凝膠（No vex)且於MES SDS跑膠緩衝液- PAGE (Laemmli )上跑膠。於SDS-PAGE後，將凝膠用 Pierce G e 1 C 〇 d e B 1 u e ( P i e r c e，R 〇 c k f 〇 r d，IL)染色。A/3 肽-CRM, 97共軛物係以在天然CRM譜帶上方約66 kD a之主譜 帶，及約120kDa之二聚體譜帶，以及微弱的多聚體譜帶 (數據未顯示）來代表。 III. 肽-CRM丨97共軛物之MALDI-TOF質譜分析 質譜分析可用來立即測定接合的約略程度。將適當液 份之已活化CRM197及共軛物樣本用MALDI-TOF質譜分析 法使用3,5·二甲氧基-4-羥基·肉桂酸（芥子酸）作基質來 分析。以 MALDI-TOF 質譜分析（Finnigan MAT Lasermat 2 00質譜儀，Ringoes，NY)測得之已活化之CRM197分子 量係集中在約60.5 kDa附近且其共軛物之分子量視接合程 度不同係從65kDa到74kDa不等（數據未顯示）。在 CRMI97中發現到有最多高達22個離胺酸（約50% )以 1 : 1的比例被修改。 IV. 最適化實驗 活化及接合的程度爲反應劑：蛋白質比例，反應溫度 -66 - 1379839 及反應緩衝液之pH値的函數。爲了取得接合 現之過程控制參數，所以於下文提供一些實例 最適接合結果之最適pH値。其結果（第3圖） 5-聚體（DAEFRC) ( SEQ ID NO ： 1)以；g (DAEFRHDC) ( SEQ ID NO : 2 )的接合與 且當反應條件的pH値增加時可產生較高度的 反應。使用5-聚體及7-聚體肽之TFA鹽類時 係在PH9.0下評估不同肽裝載量的情形（第4 等結果明顯可知於每個CRM分子中具有定義 本之肽共軛物可藉由變化接合反應中肽/已活 比例來產生。已使用 7-聚體肽之醋酸鹽來 實驗。 至於 AySl-7/CRM的接合，其加蓋過程 每CRM之CMCA莫耳數與每CRM之CMCA 行。由於在所測試之肽：CRM比例下CMC及 量係恆定的，所以加蓋過程被假定已經完成（： 共軛物的總修改量係停留在1 9到2 1之間，相 化之離胺酸的數量（第5圖）。此等實驗係以 的抗衡離子來進行。使用肽的醋酸鹽而非TFA 1-7/.CRM的接合作用，且數據係顯示在第 圖。加蓋過程似乎已經完成’且各點的CMC J 量係停留在20到22之間。A冷-CRM接合反 pH9.0下達最適化，且接合程度係由反應中肽I 率所控制》藉由將比例從0 · 1到1 . 5間變動， 反應中可再 以顯示產生 顯示 .Ay3 7-聚體 pH相關， 修改/接合 ，接合程度 圖）。從此 數量之肽複 化CRM之 進行類似的 係藉由比較 莫耳數來進 C M C A的總 赛5圖）。 當於溴乙醯 TFA作爲肽 鹽重覆該 5圖及第6 t CMCA 總 應的條件在 f CRM的比 接合程度便 -67- 1379839 有所不同（第6圖）β 活化及接合的程度爲反應劑：蛋白質比例，反應溫度 及反應緩衝液之pH値的函數。各共軛物之修改（接合） 程度係將各共軛物的質量減掉已活化CRM197的質量，然 後除以用來製備該共軛物之肽的質量來計算。所有共軛物 的修改（接合）程度係示於表2。 接合程度也會與每莫耳CRM197上形成之S-羧甲基半 胱胺酸殘基的估計量比較（亦示於表2)。 表2 修改程度：MALDI-T OF及AAA數據之比較 樣本 Da (來自質譜儀） 接合程度 (來自質譜儀） 接合程度 (來自CMC-胺基酸分析） C R Μ 1 9 7 5 8,40 8 B r A c - C RM 60,752 19 Αβ 1 -7/CRM 74,463 14 15 A3 1 -7/CRM 72,375 12 14 Αβ 1 -5/CRM 75,425 20 2 1 Αβ 1 -5/CRM 71,690 1 5 18 實施例6 Αβ肽共軛物之免疫原性硏究 Α/5之Ν端殘基1-5、1-7、1-9及1-12(有及無連接 -68- 1379839 子GAGAC)之肽，及相當於A沒之N端胺基酸12至胺基 酸1反向序列（1-12聚體呈反向順序）之肽，各連接到 CRM197上’將此等共軛物以及未接合之AyS 1-12聚體肽 與STIMULONtm QS-21調配成調合物來免疫小鼠。各組小 鼠係以30/zg或劑量之一種前述樣本調合20yg佐劑 STIMULONtm QS-2 1，於硏究一開始（第〇週）及後續第 3及6週進行皮下預防接種。 $ 如表3所示，A沒之N端殘基1-5' 1-7、1-9及1-12 (有及無連接子GAGAC)之肽，及相當於a々之n端胺 基酸12至胺基酸1反向序列（1-12聚體呈反向順序）之 肽，各連接到CRM197上’將此等共軛物以及未接合之 A冷1-12聚體肽與QS-21調配成調合物來免疫小鼠。各組 小鼠係以3〇eg或劑量之一種前述樣本調合20/zgK 劑QS-21’於硏究一開始（第〇週）及後續第3及6週進 行皮下預防接種。使用瑞士威伯司特小鼠來進行整個硏究 ^ 且每組有5隻小鼠。注射體積=1〇〇μ1; B =血液；V =接種； E =放血。 抗- A /3效價係如下文所述以抗 a厶及CRM, 97之 ELISA來測量。簡要地，在寇司塔（Costar) 96凹孔平板 (#3591)上塗以2/zg/mL A召1-42於無菌碳酸鹽/碳酸 氫鹽緩衝液’ pH9.6於室溫下隔夜。將平板清空且每凹 孔用 200 yl 之 〇.05%BSA 於 IX PBS/0.05%Tween 20 於 室溫下阻斷2小時。將已阻斷平板清空且用含有TBS， 0.1%Brij-35 (無疊氮化物）清洗緩衝液之平板清洗液來清 -69- 1379839 洗。所有的初級抗血清係用0.05%BSA於1 X PBS含有 0.05%Tween 20 / 0.02¼疊氮化物來作系列稀釋’且將 ΙΟΟμί各稀釋液轉移到適當的平板凹孔中且於室溫下培育 2小時。然後將平板清空/如前文所述般清洗。將來自 Southern Biotech之鹼性磷酸酶接合山羊抗-小鼠IgG次級 抗體用 0.05o/〇BSA 於 1 X PBS 含有 0.05 % Tween 20/0.02% 疊氮化物以1: 1000來稀釋，且取100/zL加到各凹孔中 且於室溫下培育1小時。然後將平板清空且如前所述來清 洗且最後於每凹孔加入100# L之1 mg/ ml對硝苯基磷酸 鹽基質於二乙醇胺/ MgCl2，pH 9·8之溶液於室溫下培育 1小時。顔色的發生可藉由在每凹孔加入 50 # 1之 3Ν NaOH來終止。將平板置於405 nm下讀數且以690nm爲 參考。終點效價係以0.1 AU的O.D値來計算。
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Wkl 6 PJ w ω ω w ω ω w w ω ω tu w Wkl 3 CQ m m CQ ffl 05 CQ m ffl CQ CQ ffl m CQ Wk8 CQ CQ CQ PQ CQ CQ ffl CQ CQ CQ CQ CQ PQ CQ Wk6 > CQ > CQ > m > CQ > m > CQ > > CQ > CQ > CQ > ffl > ffl > « > CQ Wk3 > PQ > CQ > CQ > m > OQ > (Ώ > m > CQ > OQ > > « > CQ > > OQ WkO > CQ > CQ CQ PQ > CQ > P3 > CO > Λ > CQ > 0Q > PQ > CQ > CQ > CQ 劑量 (β g) o m o m 〇 m O cn o m in 說明 踏 m 0 卜 1 s Pi u CRM/l-12 有接頭 CRM/l-9有接頭 CRM/l-7有接頭 蹯 瑯 ο m 1 % Pi u 蹯 ο Os 1 ---- Ο ΗΠΤ 〇 CN 1 i-H Ρίί u 1 CRM/N5 有接頭 蹯 Ο '-----, 卜 I »1 4 υ CRM/1-12 有接頭 CRM/1-9 有接頭 CRM/l-7 有接頭 蹯 Ο 1 Ρ=ί u 酹 m 0 ON 1 u 群組 編號 AE4 8 8 AE489 AE490 AE49 1 AE492 ΑΕ493 AE494 1 AE495 1 ΑΕ496 ΑΕ497 ΑΕ498 AE499 AE500 AE50 1 -71 - 1379839 鹦-鼷赵保医钗贼蜮v「/ ε谳
Wk 1 6 1 w ω w w w ω w ω w Wk 1 3 1 —... CQ m CQ « ca CQ CQ CQ CQ m Wk8 PQ « PQ ffl ffl « m PQ m Wk6 1_ > PQ > > CQ > ffl > CQ > ffl > PQ > « > PQ > cq Wk3 > m > m > CQ > > PQ > PQ > CQ > m > CQ > m WkO > m > m > CQ > > CQ > CQ > CQ > m > PQ > CQ 劑量 (Mg) VO KT^ 〇 ΓΛ o m 〇 m IT) 說明 鹚 0 、 1 、 Pd u CRM/1-5 有接頭 CRM 197C 1 -6 1 5 1 CRM 197C 1 -6 1 5 1 CRM/12-1 聚體 CRM/12-1 聚體 尨 m ync 嵌 CN 1 翻 雜 CN 1 X) < X) < 群組 編號 AE502 AE503 AE504 AE505 AE5 06 AE507 AE508 1 AE509 AE5 1 0 AE5 1 1
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CRM197ELISA 在格林納（Greiner ) 96凹孔平板（#650011)上塗以 5.0 ^ g/ mL (每凹孔100#丨）之CRlVh97於無菌碳酸鹽 /碳酸氫鹽緩衝液，PH9.6置於37°C下處理90分鐘》將 平板清空且用含有1 X TBS，0.1%Brij-35清洗緩衝液之平 板清洗液來清洗。所有的初級抗血清係用含有〇.3%Tween 20/EDTA之1 XTBS來作系列稀釋，且將ΙΟΟμί各稀釋 ^ 液轉移到適當的平板凹孔中且於37°C下培育1小時。然後 將平板清空/如前文所述般清洗。將來自 Southern Biotech之鹼性磷酸酶接合山羊抗-小鼠IgG次級抗體用含 有 0.05 % Tween 20/0.02 % 疊氮化物之 1 X PBS 以 1: 1000 來稀釋》然後將平板清空且如前所述來清洗且最後於每凹 孔加入100//L之1 mg/ml對硝苯基磷酸鹽基質於二乙醇 胺/ MgCl2，pH 9.8之溶液於室溫下培育1小時。顏色的 發生可藉由在每凹孔加入50//1之3N NaOH來終止。將平 φ 板置於405 nm下讀數且以690nm爲參考。終點效價係以 0.1 AU的O.D値來計算。 表4-6顯示終點ELIDA中抗A冷效價。於初次疫苗接 種後，所有八種共軛物（除了負對照組以外）都可以誘發 可測量的抗-A /3 I g G免疫反應。不過。在初次疫苗接種3 週後，30yg劑量而非5//g劑量之A/5產生了正反應。在 所有的共軛物中，似乎是無連接子之A/31-7肽比所硏究 的其它共軛物更能引發更好或一樣好的免疫反應。在5/zg 劑量下，第8-16週時a；5 1- 5C有更好的表現。在30/zg -73- 1379839 劑量下’ Ay3 1- 7C表現最佳。不論是用30//g劑量或5/zg 劑量在第二及第三次疫苗接種後進行之抗體效價分析，顯 示對於大多數共軛物而言抗ΑΘ最佳的免疫反應係在進行 第二次疫苗注射後發生的。至少在小鼠身上，第三次疫苗 注射似乎並不能再提高免疫反應。不過，A冷肽需要用30 Ag劑量進行三次免疫接種才能達到抗該種肽之最大免疫 反應（表5 )。以隨著時間流逝抗體減少之抗體衰變的術 語來說，相較於用各軛物來免疫群組時該群組所產生的最 高抗體量相比，抗體衰變後群組之抗體量可減少2至3 倍。分析來自第6及8週之個別樣本以計算各群組抗A冷 之GMTs量（表6)，以瞭解是否有某一群組實質上比其 它各組更佳。對第6週時A/31-5C、A/317-C及A冷1-9C 共軛物之效價作統計分析，其顯示Α θ 1 -7共軛物顯著地 引發更高的抗體效價。從該實驗亦顯示連接子GAGAC並 不會提高針對該肽之免疫反應。 1379839
m VO 搬 7 7 1,8 2 8 .5 7 1 ,043 m ^Ti 卜 〇 〇〇 m 184,170 ON o o <N (N 4 00,5 3 6 卜 卜 寸 ON 卜 ΙΟ in 卜 o v〇 m <100 <100 <100 <100 m 搬 00 〇 CS 的 CN VO 〇 Ό 〇 〇 CS 卜 VO ON oo 寸 r〇 166,162 23 7,5 73 446,089 571,127 368,101 <100 <100 <100 <100 頸 〇〇 m 882,012 860,463 622,325 3 90,624 454,631 842,402 1,1 80,347 -1 598,867 <100 <100 <100 <100 ϋ V〇 搬 687,691 1,28 0,1 8 1 1 ,00 8,8 72 1 32,009 458,075 849,1 70 v〇 寸 1 908,360 <100 <100 <100 <100 cn 搬 14,960 5 1,25 3 · yn r*H \〇 00 νΤϊ v〇 4,999 17,693 18,544 12,664 <100 <100 <100 <100 〇 濉 <100 <100 <100 <100 <100 <100 1 <100 <100 <100 <1 00 <100 <100 群組 1 -5C 1 -7C 1 -9C 1 - 1 2C 1 -5 LC 1-7LC 1 1-9LC 1 - 12LC C R M i 9 7 <N 寸 1 CN 1 1 2-1 C 。墩职嵌N-usK1^—w^ggltN-scyiN2rmIlsbo^.oCN^1=]^^TI;I$c>D5L>o^3i}ll<9,i:,o^^^al vf/c3}sq3it:Ii?-aI}1g::p3E:M}.cronv Γ0 脈？！绺。卜0'£卜0^=365#逛你钗轵靼CBIH)華 鉍：髮薪·^徽--κΒοιν 璲篓褽猥 M^MlilKIiz^擗_蓉齧试-KB緇 < _·Ν£/ν 运-e-赃启拭 Νϋ 蓺鬆31|我-盔Ν¥Moorys 惻堪坦歳浚 V S ΙΊ3ζί-1!9 I 赵 e 1 , 8 , 9 , e , 0 濉迄：寸撇 -75- 1379839
國 Ό 減 ON ，_, v〇 卜 779,072 | 327,065 5 77,604 1 64,680 529,726 5 00,468 VO 00 卜 cn <100 <100 <100 <100 m 搬 204,645 592,63 8 ON in 寸 VO m 68 1,268 1 77,3 5 8 463,466 405,023 284,800 < 100 <100 <100 <100 m 〇〇 濉 3 3 2,83 2 647,470 7 1 3,494 1,1 26,3 89 1 84,077 -1 462,200 787,273 483,320 <100 <100 <100 <100 m VO 濉 5 90,3 5 5 1,840,741 1 ,1 84,696 1 ,3 25,725 469,191 971,229 921,544 697,150 < 100 < 100 <100 <100 m m 搬 Ο r-^ οο 1 00,672 18,520 7,837 16,347 47,8 66 ' 59,002 27,348 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100 1 <100 <100 <100 <100 <100 群組 1 -5C 1 -7C 1 -9C 1 - 1 2C 1 -5LC 1 -7LC 1 -9LC 1 - 12LC C R M | 9 7 1-42 <N 1 o 1 CN 。徵职嵌N-us ΚΙ sll^^nJSICN-scyiNolnlAIIls&oaotN^^M^TgboT/oe^^illp'rn'oll^^li/r、 (JiusqJJAO^ir-OI}攝屮鸹。_}.<1.0 nv ro_?l湓。ζ.0^εζ.°ε = 36>η##砌墩轵®(SI3)華鉍 :髮鉼徽-罢6/V繼戔齄顆N仞鹋lllKIklK-擗Μ髮齧铱芸總· 5-NQ3.V运-fritWI运-N ti莼髮齧抹尨^¥罷007/ 〇e码墀班諶湓VSI13^-國91赵二，〇〇,9二，0濉迄：5撇
-76- 1379839 表6 群組 第6週 第8週 1-5C 237,668" 161，671b 1 -7C 1,866,7023 88 1,146b 1 -9C 963,323" 595.414b 1 -1 2C 940,260 955,470 1-5LC 395,553 141,084 1-7LC 516,921 394,521 1-9LC 826,773 562,458 1 -12LC 544,768 376,952 1 -42 365 4,565
表6 :於第6及8週，以ELISA終點法測定3〇 a g劑 量之肽共軛物製得之抗血清中抗A冷之GMTs量，該肽共 軛物具有不同長度之N端澱粉樣A/9肽，參考標準物：愛 倫（Elan)超免疫多株#592 = 3,073,307。終點爲0.1人1;〇.〇. 値。瑞士威伯司特（Webster)小鼠係於第〇、3、6週使用 30//g如上抗原並與20/zg STIMULONtmQS-21配方在一 起以SC-N來免疫。 a. 於第6週時1-5C、1-7C及1-9C滴定測得之效價使 用Tukey-Kramer統計分析顯示出只有1-5C與1-7C間顯 示出統計性差異’然而使用學生型T測試時在與 7C之間以及1-5C與1-9C之間皆顯出統計性差異° b. 對第8週時1-5C、1-7C及1_9C滴定測得之效價進 行統計分析，顯示此三個群組間並沒有統計性差異。不過 在1 - 5 C與1 -7C間似乎有所差異。 -77- 1379839 pdapp小鼠腦組織染色 PDAPP腦組織染色檢定提供一種指示AyS肽共軛物及 /或A沒1 -42抗血清之功能性的指標。對於來自個別小鼠 群組之血清樣本，分別針對其辨識PDAPP小鼠腦組織內 含有澱粉樣肽之斑塊的能力來作分析。此等結果顯示於表 7A及7B。除了 A石5聚體共軛物抗血清以外，其它共軛 物抗血清在辨識該等斑塊時都有著劑量相關反應。與連接 子無關地，30// g共輥物引發之抗血清較5/zg共fg物引發 之抗血清具有更佳的反應性型式。不過對於 AyS 5 -聚體共 軛物抗血清而言，5 μ g群組似乎有類似或更好的反應性。 比較所有此等結果，得到的結論指出從A々1 -5聚體到 A冷1-9聚體作成的共軛物皆足以引發斑塊辨識之免疫反 應且連接子存在與否並不重要。從此一硏究可得到如下結 論：（a )與未接合之CRM, 97對照組相比，所有肽共軛物 都可以引起相當或略高效價之抗載體蛋白質CRM197之抗 血清（未顯示）。（b)與不具連接子之共軛物相比，具 有GAGAC連接子之共軛物的免疫原性或功能性並未提 高。（c)免疫原性數據及PDAPP腦組織染色（功能性抗 體之主要指標）顯示A^l-5聚體及A01-7聚體共軛物似 乎爲可再進一步發展之較佳免疫原。 -78- 1379839
表7Α· PDAPP小鼠腦組織染色 5gg劑量 無連接子 有連接子 疫苗 動物# PDAPP 疫苗 動物# PDAPP 染色 染色 1 +(無擴散） 1 - 2 ++/+++ 2 - CRM/AP1-5 3 ++/+++ CRM/AP1-5 3 土 4 + + 4 土 5 + + 5 土 1 + + 1 + 2 + + 2 + + CRM/Αβ 卜7 . 3 + + CRM/AP1-7 3 + + 4 + + 4 + 5 Hh 5 + + 1 + 1 + + 2 +/++ 2 + + CRM/Apl-9 3 土 CRM/Api-9 3 + 4 土 4 + 5 土 5 + 1 - 1 + 2 ? 2 + CRM/Api-12 3 土 CRM/Apl-12 3 + + 4 - 4 - 5 土 5 土 1 - 1 - CRM/Apl2- 2 士 Αβ12 2 - 3 3 - 1聚體 4 - 4 - 5 土 5 - 所有抗血清以1 : 1000稀釋來進行染色步驟。 -79- 1379839 表7Β· PDAPP小鼠腦組織染色 30// g劑量 無連接子 有連接子 疫苗 動物# PDAPP染色 疫苗 動物# PDAPP 染色 1 - 1 + 2 +/++ 2 - CRM/AP1-5 3 - CRM/Apl-5 3 4 土 4 土 5 + + 5 • 1 +/++ 1 + 2 + + 2 ±/+ CRM/Apl-7 3 + + CRM/AP1-7 3 +/++ 4 + + 4 ±/+ 5 ++/+++ 5 +/++ 1 ++/+++ 1 +/++ 2 + + 2 + + CRM/Api-9 3 + + CRM/Apl-9 3 + + 4 + 4 土 5 + 5 +/++ 1 - 1 +/++ 2 +/ + + 2 + CRM/Apl-12 3 +/ + + CRM/Apl-12 3 墨 4 土 4 +/++ 5 土 5 + 1 - 1 土 CRM/Αβη-Ι 2 - Αβ12 2 - 3 - 3 - 聚體 4 - 4 - 5 - 5 - 所有抗血清以1 : 1000稀釋來進行染色步驟 -80- 1379839 實施例7 猴的免疫原硏究 於第〇、29及58天對諸猴群（每組6隻）給予30yg 之7-聚體共軛物（總共軛物）及佐以SIMULONtm QS-21，明礬或RC 529 SE佐劑之調合物。其它各組調合物還 包括30#g之5-聚體共軛物以及明礬（Al(OH) 3)或 RC529 SE，並以 75// g 及 300 # g Αβ 與 SIMULONtm QS- 2 1作爲正對照組。正對照組每2週進行一次免疫接種。於 第36及64天測定抗-Αβ抗體效價（第7-9圖）。於第36 天，7-聚體/ CRM共轭物以及SIMULONtm QS-21 ’明攀 及RC529 SE引發之GMT效價分別爲10110，1 3 3 30及 17090(第7圖）。相對地，75/zg及300yg劑量之Αβί-42及SIMULONtm QS-21所引發之GMT效價則分別爲223 及173。Αβ5-聚體共軛物與明礬所引發的效價爲2134且 其與RC529 SE引發之效價爲15980。於第64天’即投予 3劑共軛物與SIMULONtm QS-21或RC-52 9 SE後所引發 的效價基本上高出第二次投藥後引發的效價（7-聚體/ RC-529 SE 之 GMTs 爲 69910; Αβ 5·聚體 / RC-529 SE 則 爲 2 1 640 ;且 Αβ7-聚體 / SIMULON™ QS-21 貝IJ 爲 3 03 1 0 )(第8圖）。共軛物及明礬在第三次免疫後引發 的效價則低於第二次免疫後引發的效價。似乎Αβ7-聚體 共軛物比Αβ5 -聚體共軛物更能引發較佳的免疫反應。於 猴，Αβ7-聚體共軛物佐以RC-529 SE或SIMULONtm QS-21可引發最高度的反應（第9圖）》Αβ7-聚體共軛物與 -81 - 1379839 明礬引起的反應則爲中度的且類似於3 00 // g之Αβ1-42 與SIMULONtm QS-21的反應程度。 從這些實例可以獲得數項結論。首先，兩種共軛物在 靈長類極具免疫原性。其次，在免疫調合物中佐劑的存在 會顯著影響免疫反應。第三，除了鋁佐劑以外，佐劑RC-529 SE及SIMULONtm QS-21若在每次疫苗接種中皆投予 且投予至少高達三次的情況下則可強化免疫反應（第9 圖）。總括而言，Αβ7-聚體在存在529下可引發較好的抗 體反應，存在 SIMULONtm QS-2 1時則次之（參考第 9 圖）。 實施例8 多抗原性肽（MAP )共軛物的製備及其免疫原性硏究 多種方法可用來於載體上製造多抗原性部位。於先前 實施例中，個別的抗原性部位係以所定義的接合及加蓋化 學法個別地接合到載體上。於此實施例中，多抗原性部位 係用固相合成法來合成Αβ 1-7聚體之縱排複本構築而成。 另一選擇地，此等縱排複本可透過或不透過它處說明之離 胺酸核連接來與Τ-細胞抗原決定部位偶合在一起。所合成 之此等多抗原性肽可具有額外半胱胺酸殘基以接合到載體 蛋白質上。合成含有1組複本單元（1-7) 、3組複本單元 (1-7)及5組複本單元（1-7)之肽且在其羧基端有額外 的半胱胺酸。將此等肽與溴乙醯化CRM處理隔夜且透過 C端之半胱胺酸殘基共價依附在一起。此等反應係在 -82- 1379839 PH9.0-9.2下以表8所列示的肽：CRM比例來進行。未與 肽反應之溴乙醯基團會用N-乙醯基半胱胺加蓋。此等編 號分別代表接合到CRM之Αβ 1-7肽單一複本共軛物、三 縱排複本共軛物及五縱排複本共軛物。表8簡要地顯示出 此等樣本之性質。 表8
多抗原性肽（MAP )共轭物樣本 - 共軛物 肽：CRM(w/w) 反應之pH値 一Ab(l -7) ,/CRM 0.3 7 8.99 —Ab(l -7)3/CRM 1.02 8.95 _ Ab( 1 -7U/CRM 1.67 9.17 肽裝載量（每個載體之ΑΘ1-7肽之平均數目）及加 蓋數目（表9)係以胺基酸分析所測得、位於每個載體上 獨特胺基酸（CMC或CMCA)之數目* 表9 各個共軛物之接合及加蓋程度 _ 共軛物 肽裝載量（CMC) 加蓋量（CMCA) _ Ab(l -7),/CRM 12.5 11.7 __Ab(l-7^3/CRM 10.4 15.2 __Ab(l -7)S/CRM 9.8 15.9 -83- 1379839 將瑞士威伯司特小鼠（每組10隻）以1或o.l β g Αβ / CRM接合肽以皮下注射來免疫。有一半的小鼠係用調合 100 μ g佐劑A1 ( OH ) 3之組成物來免疫，另一半小鼠則 不含佐劑來免疫。免疫接種係排定在第0週及第3週進 行。抽血係排定在第0、3及6週進行。分析血清樣本中 抗Αβί-4 2聚體肽之抗體反應。此結果示於表1〇。
• 84 - 1379839 表10
多抗原性肽(MAP)共軛物之抗ΛΡ終點效價 群組 編號 樣本說明 佐劑 第〇週 池 第3週 GMT 第6週 GMT AG332 iMg AP(l-7)!/CRM ai(oh)3 <100 18,096 100,279 AG333 1μβ AP(l-7)3/CRM ai(oh)3 <100 44,911 420,235 AG334 1μ£ AP(1-7)s/CRM ai(oh)3 <100 27,032 394,488 AG335 O.^g Ap(l-7)i/CRM Al(OH)3 <100 19,350 66,834 AG336 O.lpg Ap(l-7)3/CRM Al(OH)3 <100 13,307 208,272 AG337 O.lpg Ap(l-7)5/CRM ai(oh)3 <100 1,196 22,665 AG338 lHg AP(l-7)i/CRM M /\\\ <100 5,273 370,980 AG339 Ιμβ Ap(l-7)3/CRM fnr 無 <100 9,299 541,093 AG340 Ap(l-7)5/CRM yivs <100 3,100 185,272 AG341 O.^g AP(l-7)i/CRM M •M、、 <100 340 25,839 AG342 O.lMg Ap(l-7)3/CRM 4rrr. ΙΙΙΓ VI、、 <100 128 5,553 AG343 O.^g A3(l-7)5/CRM M y * <100 668 2,098 -85- 1379839 在初次免疫後所有共軛物都可誘生抗Αβ1-42抗體之 效價且在追加促升投藥後抗體效價有實質的提升。在缺乏 鋁佐劑時，於第3週及第6週抽血時劑量反應的差異係很 顯著的。較高劑量會誘發高效價的抗體反應。與未加佐劑 的群組相比，加入鋁佐劑者於兩種劑量下（0.1 /ζ g及1 Wg)於第3週時皆可誘發基本上較高的抗體效價。於第 二次疫苗接種後，l//g劑量之共軛物的抗體量會升高5至 1 〇倍。於此劑量下，含有3及5組複本之肽共軛物比僅含 單〜複本之共軛物可誘發更高的抗體反應。亦測定抗CRM 載體之效價’其係列於表1 1。
-86- 1379839 表11
多抗原性肽(MAP)共軛物之抗CRM終點效價 群組 編號 樣本說明 佐劑 第0週 池 第3週 GMT 第6週 GMT AG332 1μ§ AP(l-7)i/CRM ai(oh)3 <50 10,531 114,602 AG333 lMg Ap(l-7)3/CRM ai(oh)3 <50 4,274 83,065 AG334 \\ig Ap(l-7)5/CRM ai(oh)3 <50 1,680 49,320 AG335 Ο.ΙμΕ AP(l-7)i/CRM ai(oh)3 <50 1,114 13,231 AG336 O.lpg Αβ(卜7)3/CRM ai(oh)3 <50 197 1,484 AG337 O.lpg Ap(l-7)5/CRM Al(OH)3 <50 65 222 AG338 1μ£ Ap(l-7)i/CRM M /l、N <50 35 309 AG339 Ap(l-7)3/CRM frrr M <50 29 1,085 AG340 lpg Ap(l-7)5/CRM 4m m <50 29 542 AG341 O.^g Ap(l-7),/CRM M / * \> <50 25 55 AG342 O.lHg Ap(l-7)3/CRM M y»、、 <50 25 34 AG343 Ο.ΐμ^ Ap(l-7)5/CRM 無 <50 29 ND 動物係在第〇、3及6週被免疫。佐劑：lOOyg A1(0H)3或無。ND=未測 定。 -87- 1379839 表11的數據指出未加佐劑之群組不論是劑量l#g或 〇·1 即使在免疫兩次以後也只能誘發極低的抗-CRM抗 體反應。然而，共軛物與氫氧化鋁佐劑在Ι/ig劑量下則 可誘發實質量的抗-CRM抗體反應且於〇.l#g下反應則低 得多。於存在佐劑時，具有單一複本之共軛物可產生最高 CRM效價，具有三複本之共軛物則份量中等，具有四複本 之共軛物量最低。此結果正如預期般，因爲就每肽劑量之 CRM量而言以Αβ ( 1-7 ) 5/ CRM最低而以Αβ ( 1-7 ) ,/ CRM最高。只有以0.1/zg劑量投藥且於第6週時彼此差 異才具有統計上的顯著性》 本發明之目的在於引發高效價的抗-抗原性半抗原免 疫反應但是抗載體蛋白質之免疫反應並非必要。於特殊情 況下，較佳爲引發抗該半抗原之抗原性決定子之最適免疫 反應但沒有或只有極少的抗載體蛋白質之免疫反應。對於 此等應用，具有縱排多複本之多抗原性決定子之共軛物且 不搭配佐劑之調合物便能符合此等需要。 實施例9 製備具有不同載體蛋白質之Αβ-肽共軛物及其免疫原 性 此等實施例係在比較分別使用六種不同載體蛋白質之 共軛物之免疫原性。將Αβ1-7醋酸鹽於ΡΗ9下以1: 1之 重量比來加到溴乙醯化載體中。除了 Αβ1-7/ rC5ap以 外，所有的共軛物都用N-乙醯基半胱胺來加蓋。所有的 -88- 1379839 其它載體都是重組性細菌蛋白質，包括CRM (白喉類毒 素）’重組C5a肽酶（rC5ap ;係選殖自無乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae )，包括 D130A 及 S512A 突 變）’ ORFs 12 24、1664、2452(全部皆選殖自釀膿鏈球 菌）’及T3 67及T8 58(皆選殖自肺炎衣原體）。所用載 體之槪述係示於表12。各Αβ1-7共軛物對此等載體之接 合及加蓋程度係示於表1 3。 此等硏究顯示重組C 5 a肽酶共軛物比起所測試的大多 數載體包括CRM更能引發高效價的抗Αβ反應。接受氫氧 化鋁佐劑之群組於第6週測得之效價間的差異便具有統計 上的顯著性。此外在無佐劑時，Αβ1-7/Τ858共軛物顯著 地比起大多數其它共軛物更具有免疫原性。唯一表現得比 CRM對照組共軛物更差的共軛物爲Αβ1-7/ Τ367，其在蛋 白質印跡法中也不與Αβ特異性單株抗體反應。此等硏究 確認了多種其它載體亦可成功地用在來引發抗Αβ肽的免 疫反應。 -89- 1379839 表12 載體及共飯物性質表 載體蛋白質 載體MW ( Da ) 離胺酸# CRM 5 8,408 39 rC 5 ap 108,560 85 ORF1224 30,950 18 ORF 1 664 3 1,270 38 ORF2452 3 1,790 29 T367 49,700 29 T858 37,190 23 表13 各共軛物接合及加蓋程度 共軛物 肽裝載量（CMC) 加蓋（CMCA) A)S l-7/rC5ap 25.9 • Α β 1-7/ ORF1224 12.8 5.7 Α β 1-7/ ORF1664 1 3.4 10.8 A/3 1-7/ ORF2452 12.03 10.5 Α β 1 -7/ T367 13.2 8.2 Α β 1-7/ T858 5.2 1 .7 接合結果：肽裝載量（每個載體之A/3 1-7肽之平均 數目）及加蓋數目爲以胺基酸分析所測得之每個載體上獨 特胺基酸（CMC或CMCA)的數目。該CMC與CMCA數 -90- 1379839 目係指離胺酸數目。 免疫結果. 將此硏究中各群組之幾何平均效度列於表14。於第3 週，不論有無佐劑存在，A；Sl-7/rC5ap比從釀膿鏈球菌 ORFs 12.2 4、1664、2452，或從肺炎衣原體 ORFs T367 及 T8 5 8製造的對應共軛物可顯著引發更高的抗-A/3效價。 φ 在缺乏佐劑下，於第3週時A；Sl-7/rC5ap亦比除了 A召 1-7/ T8 5 8以外的所有其它共軛物有更好的免疫原性。無 A1(0H)3之T85 8共軛物引發的效價比無佐劑之ORF 1 224、 ORF1 664、ORF2452及CRM共軛物更高。免疫原性顯著 地低於 A/5 1- 7/ CRM之唯一共軛物爲 A0 1- 7/ T367 (p <0.00002 )。該T3 6 7載體不論有或無佐劑在第3及6 週時表現都不佳。於第6週，rC5ap共軛物與氫氧化鋁比 起除了 A^l-7/〇RF2452以外的所有其它共軛物更具免 φ 疫原性（P<0.04)。在缺乏佐劑時，AySl-7/rC5ap及 A冷1-7/ T858所引發的效價顯著地高於〇rf1224、 0RF 1664或T367共軛物之效價。無氫氧化鋁之a/3 1-7/ CRM所引發之效價亦高於A召1-7/ORF1664或A/3 1-7/ T3 67。 -91 - 1379839 表14 抗Αβ1·42終點效價 群組 編號 樣本說明 佐劑 第0週 池 第3週 GMT 第6週 GMT AG344 5pgAp(l-7)/CRM αι(οη)3 <100 21,404 54,157 AG345 5pg Αβ(卜7)/rC5ap αι(οη)3 <100 61,967 402,972 AG346 5pg Ap(l-7)/ORF1224 αι(οη)3 <100 10,711 30,084 AG347 5μξ Ap(l-7)/ORF1664 αι(οη)3 <100 7,188 43,226 AG348 5μ§ AP(l-7)/ORF2452 αι(οη)3 <100 11,437 109,091 AG349 5pg Αβ(1-7)/Τ367 αι(οη)3 <100 321 5,139 AG350 5pg Αβ(1-7)/Τ858 αι(οη)3 <100 16,656 33,328 AG351 5μδ AP(l-7)/CRM 無 <100 2,615 119,488 AG352 5μ§ AP(l-7)/rC5ap 無 <100 11,858 279,1 13 AG353 5pg Ap〇-7)/ORF1224 無 <100 1,674 18,719 AG354 5pg Ap(l-7)/ORF1664 Μ <100 119 9,832 AG355 5pg Αβ(卜7)/ORF2452 無 <100 2,493 76,038 AG356 5pg Αβ(1-7)/Τ367 姐 w <100 50 620 AG357 5μβ Αβ(1-7)/Τ858 無 <100 28,820 275,202
動物係在第〇及3週被免疫且於第0、3及6週採血。劑量係基於共軛物 的總量。佐劑：i〇〇//g αι(οη)3或無。 -92- 1379839 實施例1 〇 額外Αβ肽-蛋白質共軛物之製備 I.活化 將解凍之 CRMI97 ( 8mL，5 9.84 mg，於 7.48 mg/ mL)溶於0.1M硼酸鹽緩衝液（pH9，3.96 8 ml)使得濃度 成爲5 mg/ml。將溶液置於冰浴0-5°C下冷卻。將溴乙酸 N -羥基琥珀醯亞胺（59.9 mg) (Aid rich-Sigma)溶於 DMF ( 1 ΟΟμί ) ( a 1 d r i c h - S i g m a )且逐滴加到 C RM 〗9 7 溶 液中。在加入溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺時可觀察到沉澱 產生。檢查pH値，可發現pH降至pH6。藉著加入更多 0.1M硼酸緩衝液來將反應混合物的pH値調回pH9。然後 將反應混合物置於4°C下溫和攪拌1小時。混合物用YM-10 centriprep離心濃縮器來純化及濃縮且於Sephadex G-25使用10 mM硼酸鹽作爲溶析劑來再純化。把對布來德 福特（Bradford )反應劑呈正反應之餾份合倂且使用 centriprep YM-10來濃縮。溴乙醯化程度係用布來德福特 檢定（線性）來測量。發現濃度爲5.36 mg/ mL (產量 3〇 mg)。然後把終濃度調整爲5 mg/mL且於冷凍器中 儲存在5 %蔗糖中直到進一步使用》 II.接合 在每次接合時係使用解凍之溴乙醯化CRM197。把肽 溶解在硼酸鹽緩衝液中（2.5 mg於125 ml之0.1M硼酸鹽 緩衝液）。在使用 Αβ 肽 KLVFFAED-C ( SEQ ID NO ： -93- 1379839
45 ) 、C-LVFFAEDV ( SEQ ID NO : 47) 、C-KLVFFAED (SEQ ID NO : 48) ' LVFFAED-C ( SEQ ID NO : 50)時 可觀察到有稍不溶解性。將溴乙醯化 CRM197 ( 5 mg/ mL)用肽溶液/懸浮液處理。混合物中肽與蛋白質之比例 爲爲 1: 2。在使用 KLVFFAED-C(SEQ ID NO: 45) 、C-
LVFFAEDV ( SEQ ID NO : 47) 、C-KLVFFAED ( SEQ ID NO: 48)及 LVFFAED-C(SEQ ID NO: 50)之共軛混合 物中可觀察到混濁現象。然後檢查混合物之 pH値 (PH9 )且在緩慢搖晃下於培育隔夜。在培育前先將 混合物的終濃度調整爲 3 mg / mL。培育後，C-LVFFAEDV ( SEQ ID NO ： 47)及 LVFFAED-C ( SEQ ID NO: 50)肽之共軛物混合液的混濁現象便消失了。不 過，KLVFFAED-C ( SEQ ID NO : 45 )及 C-KLVFFAED (SEQ ID NO : 48 )仍稍微混濁。可溶性仿製蛋白質 (mock protein)共輕物亦可用1: 1 (w/w)比例與半腕 胺一起製成。可從BIOSOURCE獲得純度約 95%之合成 肽。 八聚體： LVFFAEDV-C ( SEQ ID NO ： 44 ) KLVFFAED-C ( SEQ ID NO ： 45) VFFAEDVG-C ( SEQ ID NO ： 43) C-LVFFAEDV ( SEQ ID NO ： 47) C-KLVFFAED ( SEQ ID NO : 48) 1379839 C-VFFAED VG ( SEQ ID NO ： 46) 七聚體： VFFAEDV-C ( SEQ ID NO : 49) LVFFAED-C ( SEQ ID NO : 50) in.加蓋蛋白質上未反應之離胺酸基團 未反應的離胺酸基團係用N-乙醯基半胱胺 Aldrich-Sigma)以 1: 1 (w/w)的比例於黑暗 晃 4小時來加蓋。然後，未反應的狀及加蓋 Slide-A-Lyzer 匣（Mw 切掉 10,000) ( Pierce P B S緩衝液（2 L )進行透析隔夜（1 3小時）來 中移除掉。更換緩衝液及透析各進行兩次（ hr)。可發現到肽 KLVFFAED-C(SEQ ID NO ： KLVFFAED ( SEQ ID NO : 48)之共軛物有稍不 有共軛物係於4 °C冰箱中儲存於保存劑中。 IV.蛋白質載體之特性 使用MALDI-TOF MS來測定溴乙醯化CRM 及仿製共軛物N-乙醯半胱胺-CRM197之質量 CRM197及溴乙醯化CRM197之質量，有11個離 被修改了。 (5 994 1.46 -5 8 5 90.29 ) / 1 22 = 1 1 其中 (CMCA; 4°C下搖 劑係使用 )相對於 從共軛物 2 X 14 45)及 C-溶性。所 1 9 7之質量 。基於該 胺酸殘基 -95- 1379839 CRM197 之 Mw 爲 58624.29 溴乙醯化CRM197之Mw爲59941.46 溴乙酸之Mw爲122 溴乙醯化程度超過28% (於CRM197上之離胺酸總數 爲39) »於此11個已修改離胺酸殘基中，有1〇個係與半 胱胺偶合。偶合效能爲90%。 (6 1 1 43-5994 1 ) / 1 1 9=1 0 其中 溴乙醯化CRMI97之Mw爲59941.46 仿製共軛物之Mw爲61143 N-乙醯半胱胺之Mw爲1 19 (10/11) X 100 = 90 V.以SDS-PAGE蛋白質印跡法使用三羥甲基胺基甲烷-N_ 三甲基甘胺酸（Tris-tri cine)預鑄凝膠來界定肽-蛋白質 共軛物之特性 將蛋白質-肽共軛物用蛋白質印跡法來分析。各線道 分別爲：標記物（第1線道）；L-2 8 3 7 5 24 / 0 1 (第2線 道）；L-28375 24/02(第 3 線道）；L-28375 24/03 (第 4 線道）；L-28375 24/04(第 5 線道）；L-28375 24/ 05 (第 6 線道）；L-283 75 24 / 06 (第 7 線道）；L-28375 24/07(第 8 線道）；L-28375 24/08 (第 9 線 道）；L-283 75 24 / 09 ( Mock )(第 10 線道）；及
BrAcCRMmC第11線道）。使用來自小鼠之肽特異性單 -96- 1379839 株抗體（248-6H9-806 A冷17-28 )作爲初級抗體 清）（發現以1 : 3000的比例最佳）。山羊-抗小 (H + L)-HPR爲次級抗體（ 1:1000稀釋比例）。 現到除了仿製共軛物及已活化C RM ! 97以外，所有 都可被初級抗體辨識出來（參考第10圖）。 蛋白質濃度 共轭物樣本之蛋白質濃度係以Pierce BCA檢 量（參考表15 )。 胺基酸分析 進行胺基酸分析以測定接合程度。該接合程度 共軛物內發現之CMC A (羧甲基半胱胺）殘基量來 在用肽接合後，使用CMCA來加蓋未反應的已活 (參考表15 )。 (抗血 鼠IgG 我們發 共軛物 定來測 係以在 計算。 化部位
-97- 1379839 表15 肽及BrAcCRM197之接合程度 接合碼 肽序列 終濃度 接合程度 (SEQ ID NO ：) (mg/mL) (以CMCA爲準） L-28375 LVFFAEDV-C 1.67 8/10 24/01 (SEQ ID NO ： 44) L-28375 KLVFFAED-C 0.82 5/10 24/02 (SEQ ID NO ： 45) L-28375 VFFAEDVG-C 1.43 8/10 24/03 (SEQ ID NO ： 43) L-28375 C-LVFFAEDV 1.04 9/10 24/04 (SEQ ID NO : 47) L-28375 C-KLVFFAED 0.78 1/10 24/05 (SEQ ID NO ： 48) L-28375 C-VFFAEDVG 0.97 9/10 24/06 (SEQ ID NO ： 46) L-28375 VFFAEDV-C 1.00 7/10 24/07 (SEQ ID NO ： 49) L-28375 LVFFAED-C 0.99 8/10 24/08 (SEQ ID NO ： 50) L-28375 1.89 10/11 24/09 (仿製） 1379839 所有比色檢定係使用微平板光譜劑及SOFTmax Pro來 進行。 實施例Π A冷肽共軛物於瑞士威伯司特小鼠之免疫原硏究
遠系繁殖之瑞士威伯司特小鼠用接合到CRIVh 97之 VFFAEDVG-C ( SEQ ID NO ： 43 ) 、LVFFAEDV-C ( SEQ
ID NO ： 44 ) 、KLVFFAED-C ( SEQ ID NO ： 45 ) 、 C-
VFFAEDVG ( SEQ ID NO : 46) ' C-LVFFAEDV ( SEQ ID NO ： 47 ) 、 C-KLVFFAED ( SEQ ID NO ： 48 )、 VFFAEDV-C ( SEQ ID NO : 49)及 LVFFAED-C ( SEQ ID NO : 50)，或以A/3 1-7CRM197來免疫，所有共軛物皆與 RC 5 29 SE調合在一起。每組10隻動物且共有九組動物係 在硏究一開始（第0週）及後續第4週用一種ΑΘ肽共軛 物經皮下來接種》血清係在接種當天於接種之前收集的。 A)8肽共軛物於純系Balb/ c小鼠之免疫硏究 如前一段所述來免疫純系Balb/c小鼠，不過在第12 週還會用共軛物及佐劑來進行追加促升接種。 結果 收集兩種硏究之血清以分析A013_28肽-特異性IgG 抗體效價》在Balb/ c小鼠進行第12週追加注射的前一 天及一週之後收集Balb/c小鼠血清。用實施例11動物 -99- 1379839 之脾細胞來評估此等細胞於活體外使用Αθ,.υ肽片段、 AySi-42全長，CRMI97或多株抗體活化物之重疊池刺激時 反應的潛能。分析包括在Elispot對白介素4及5及干擾 素r的讀取値。於完成後，該A沒肽共軛物如前所述及如 實施例6所述來評估。 實施例12 A召肽共軛物於PSAPP小鼠之免疫硏究
將 PSAPP 小鼠用 VFFAEDVG-C ( SEQ ID NO : 43)、 LVFFAEDV-C ( SEQ ID NO ： 44 ) 、KLVFFAED-C ( SEQ ID NO : 45 ) 、C-VFFAEDVG ( SEQ ID NO ： 46 ) 、C-
LVFFAEDV ( SEQ ID NO : 47) ' C-KLVFFAED ( SEQ ID NO: 48) > VFFAEDV-C ( SEQ ID NO ： 49)及 LVFFAED- C ( SEQ ID NO: 50)來免疫。該PSAPP小鼠爲一種過度 表現 APP突變及PS1轉基因之雙轉基因小鼠，係述於 Holcomb et al. ( 1 998) Nature Medicine 4 ： 97-11 ° A冷肽共軛物於PD APP小鼠之免疫硏究
將 PDAPP 小鼠用 VFFAEDVG-C ( SEQ ID NO : 43 ) 、LVFFAEDV-C ( SEQ ID NO ： 44 ) 、KLVFFAED-C (SEQ ID NO : 45) 、 C-VFFAEDVG ( SEQ ID NO : 46) 、 C-LVFFAEDV ( SEQ ID NO : 47) 、 C-KLVFFAED (SEQ ID NO : 48) ' VFFAEDV-C ( SEQ ID NO : 49)及 LVFFAED-C ( SEQ ID NO : 50 )來免疫。該 PDAPP 小鼠 -100- 1379839 會表現一種人類APP之突變形式（APPV7IF)且在年輕時 便發展出阿茲海默氏症（Bard et al. (2000) Nature Medicine 6 : 916-919 ； Masliah e, et al. (1 996) J Neutosci. 15： 16(18)： 5795- 8 1 1 )。 結果 收集兩種硏究之血清以分析八/?13.28肽-特異性IgG 抗體效價。於完成後，該A/3肽共軛物如前所述及如實施 例6及11所述，以及於制約恐懼調教（contextual fear conditioning) ( CFC)檢定來評估。 典型地，該CFC檢定係在標準動物槽中進行且所採用 的調教訓練包括伴有聽覺的（如一段時間的85 db白色雜 音），嗅覺的（如杏仁或檸檬味），觸覺（如獸欄地板材 質紋理）及/或視覺線索（閃光）之輕微電擊（如0 · 3 5 m 足部電擊）。對於負面經驗（電擊）之反應一般爲停頓 (除了呼吸以外沒有其它動作）不過也可能包括眨眼或瞬 膜反射，視所選動物而定。通常會在測驗第一天測定該負 面反應以決定基線値以瞭解在後續測試期間非調教性恐懼 之負面反應，例如出現線索但無負面經驗之停頓，即被定 義成制約性調教恐懼》爲了改善可信度，測試動物一般會 分別由個別技術人員來測試且隨時間來計分。額外的實驗 設計可於此技術中如 Crawley，JN，What’s Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotying of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-Liss, NY (2000)發現得到。 -101 - 1379839 用來測試在此所述之共軛物功能之條件性恐懼調教及 其它活體內檢定可使用野生型小鼠或具有特定基因變異導 致記億受損之小鼠或神經退化性疾病如阿茲海默氏症小鼠 模式，包括在腦脊髓液（CSF )或血漿中顯示高含量 之小鼠模式來進行。例如，阿茲海默氏症小鼠動物模式包 括過度表現人類澱粉樣前體蛋白質之“瑞典型”突變 (hAPPswe; Tg25 76 )之轉基因小鼠，其會顯示出年齡相 關之記憶缺損及斑塊（Hsiao et al. (1996) Science 274: 99- 1 02 )。在此所述共軛物之活體內功能性亦可使用述於 Duff et al. (1996) Nature 383,710-713 之 PS-1 突變小鼠來 測試。阿茲海默氏症之其它基因變異之轉基因模式係述於 Masliah E and Rockenst ein E. (2000) J Neural Transm
Suppl. 59 : 175-83 〇 CFC檢定爲一種模式小鼠檢定，其至少部份係根據制 約恐懼調教硏究中對動物投予測試之免疫原藥劑後測定動 物認知情況並與適當對照組進行比較的結果。該CFC檢定 會評估使用有潛力之治療性藥物來治療動物後，該動物 (通常爲小鼠或大鼠）認知情況改變的情形。於特定具體 例中，所評估之認知改變爲一種記憶受損狀態的改善或者 記憶缺失的回復。據此，該CFC檢定可提供一種測定藥物 預防或治療認知疾病之治療效果之直接方法，特別是該等 疾病或異常會影響腦的一或多處區域如海馬回、海馬回下 腳、帶狀皮質、額葉前部皮質、鼻週皮質、感覺皮質及內 側顳葉等。此等CFC檢定於2004年12月15日提出且目 -102- 1379839 前正審查中的美國專利申請案第60 / XXX，XXX (具 檔案第ELN-05 8 - 1 )中有討論，該案全部併此以爲參: 【圖式簡單說明】 第1圖：顯示將A/S肽片段接合到蛋白質/多狀 CRMI97以形成該A；S/CRM197共軛物之化學加工過 流程圖； 第2圖：顯示以酸水解法定量測定S -羧甲基半胱 及S-羧甲基半胱胺之流程圖，其可用來評估例如A CRM197共軛物中肽免疫原-蛋白質/多肽共軛物接合 度。 第3圖：此圖顯示A/3肽/ CRM接合反應與pH 之相關性。 第4圖：此圖顯示AyS肽/ CRM接合反應與肽： 比例間之相關性。 第5圖：1-7/ CRM接合反應之加蓋過程的確 用。反應之pH値爲9.15。與肽反應的反應時間爲1 時，用N-乙醯基半胱胺加蓋的反應時間爲8小時。 第6圖：採用不同肽：CRM比例進行之肽接合及 作用。反應的pH値爲9.0。與肽反應的反應時間爲】 時，用N-乙醯基半胱胺加蓋的反應時間爲8小時。 第7圖：在用A/3肽共軛物及不同佐劑來對靈長 疫後第36天時靈長類血清的抗體效價。 第8圖：在用AyS肽共軛物及不同佐劑來對靈長 律師 載體 程之 胺酸 β / 的程 値間 CRM 認作 6小 加蓋 6小 類免 類免 -103- 1379839 疫後第64天時靈長類血清的抗體效價。 第9圖：不同治療群組在不同天數時之靈長類血清的 抗體效價。靈長類動物係以1-7或A万1-5CRM197共軛 物且以明礬或RC 529爲佐劑來進行免疫且在第29天、36 天' 57天及54天時測量抗A/3抗體之效價。 第1〇圖：肽-蛋白質共軛物係使用SDS-PAGE蛋白質 印跡分析並以三羥甲基胺基甲烷·三甲基甘胺酸預鑄凝膠 來界定特徵。各線道分別爲：標記物（第1線道）：L-28375 24/01 (第 2 線道）；L-28375 24/02 (第 3 線 道）；L-28375 24/03 (第 4 線道）；L-28375 24/04 (第 5 線道）；L-28375 24/05 (第 6 線道）；L-28375 24/06(第 7 線道）；L-28375 24/07(第 8 線道）；L-28375 24/08(第 9 線道）；L-28375 24/09(仿製物） (第10線道）：及BrAcCRMi97(第11線道）。 -104- 1379839 序列表 <ιι〇>衛斯公司(Wyeth) 艾倫法瑪國_有限公司(Elan Pharma International Limited) <i2〇> AyS-免疫原-載體共軛物及產製彼之方法 <140> TW 093139610 <141> 2004-12-17
<150> US 60/530,481 <151> 2003-12-17 <160> 54 <170> Patentln 版本 3.3
<210> 1 <211> 6 <212> PRT <213>智人 <400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg Cys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Cys 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <400> 4
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 5
Asp Ala Glu Phe Arg Gly Ala Gly Ala Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> 智人 <400> 6 1379839
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gly Ala Gly Ala Cys -2- 10 101379839 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 7
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gly Ala Gly Ala Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212〉 PRT <213> 智人 <400> 8
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Gly Ala Gly Ala 15 10 15
Cys <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <400> 9
Val Glu Tyr Gly Ser Asp His Arg Phe Glu Ala Asp Cys 15 10 <210> 10 -3- 1379839 <211> 4 <212> PRT <213>智人 <400> 10
Gly Ala Gly Ala 1 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 11
Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 15 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <220> <221> misc 一 feature <222> (3)..(3) <223> xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 12
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 15 10 <210> 13
<211> 16 <212> PRT -4 - 1379839 <213> 智人 <400> 13
Glu Lys Lys lie Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 15 10 15 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> 智人
<400> 14
Phe Glu Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie 15 10 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> 智人 <400> 15
Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly 15 10 15
Asn Glu Gly <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 16 -5- 1379839
Gin Val His Phe Gin Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu 15 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 17
Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Leu 15 10 15
<210> 18 <211> 21 <212> PRT <213>智人 <400> 18
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15
Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 19
Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr 15 10 15 -6 - 1379839 <210> 20 <211> 51 <212> PRT <213>智人 <400> 20
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 15 10 15
lie Gly lie Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe 35 40 45
Arg His Asp 50 <210> 21 <211> 42
<212> PRT
智人 <400> 21
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 1379839 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> 智人 <400> 22
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe IS 10 15
lie Gly lie Thr Glu Leu 20 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213>智人 <400> 23
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 15 10 15
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 20 25 <210> 24 <211> 43
<212> PRT <213，智人 <400> 24
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe IS 10 15 -8- 1379839 lie Gly lie Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu 20 25 30
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 40 <210> 25 <2ll> 22 <212> PRT <213> 智人 <400> 25
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 15 10 15 lie Gly lie Thr Glu Leu 20
<210> 26 <211> 20 <212> PRT <213>智人 <220> <221> misc一feature <222> (3) . . (3) <223> Xaa可爲任何白然生成之胺基酸 <400> 26
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu
X 5 10 15
Phe Arg His Asp 20 <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> 智人 <220> <221> misc一feature <222> (24).. (24) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 27 1379839
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 15 10 15
Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala 20 25 30
Ala Ala <210> 28 <211> 34 <212> <213> PRT 智人 <220> <221> misc 一 feature <222> (3) . . (3) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 28 -10- 1379839
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu 1 5 10 15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30
His Asp <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> 智人
<220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa可爲贿自然生成之胺基酸 <400> 29
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu 15 10 15
Lys Ala Ala Ala 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213>智人 30 <400> 1379839
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp He Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 15 10 15
Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213>智人 <400> 31
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr He Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 15 10 15
Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> 智人 <400> 32
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly He Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 1 5 10 15
Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 33 <211> 34
<212> PRT 12- 1379839 <213> 智人 <400> 33
Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu IS 10 15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30
His Asp <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> 智人 <400> 34
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu 1 5 10 15
Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 20 25 <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213> 智人 <400> 35
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 1 5 10 15 -13- 1379839
Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu 20 25 30
Ala Thr <210> 36 <211> 27 <212> PRT <213> 智人 <400> 36
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys 15 10 15
Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 20 25 <210> 37 <211> 79 <212> PRT <213>智人 <400> 37
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu 15 10 15
Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys He Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser 20 25 30
Val Phe Asn Val Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie 35 40 45 -14· 1379839
Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro 50 55 60
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 65 70 75 <210> 38 <211> 58
<212> PRT <213>智人 <400> 38
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 15 10 15
Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys -Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly 20 25 30
lie Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg 35 40 45
Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 50 55 <210> 39 <211> 44 <212> PRT <213> 智人 <400> 39
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe -15- 1379839 15 10 15 lie Gly lie Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 40 <210> 40 <211> 535 <212> PRT <213> 智人 <400> 40
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 15 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser lie Gin 20 25 30
Lys Gly He Gin Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gin Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45
Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 •16- 1379839
Asp Asn Ala Glu Thr lie Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 no
Pro Leu Met Glu Gin Val Gly Thr Glu Glu Phe He Lys Arg Phe Gly 115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr lie Asn Asn Trp Glu Gin Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160
Val Glu Leu Glu He Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gin Asp 165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gin Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys lie Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 lie Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys lie Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220
Pro lie Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gin Tyr Leu Glu Glu Phe His Gin Thr Ala Leu Glu 245 250 255 -17- 1379839
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 . 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gin Val 275 280 285 lie Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300
Ser lie Leu Pro Gly lie Gly Ser Val Met Gly lie Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu He Val Ala Gin Ser He Ala Leu Ser 325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gin Ala lie Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 lie Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser lie He Asn Leu Phe 355 360 365
Gin Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380
Lys Thr Gin Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400
Val Glu Asp Ser lie lie Arg Thr Gly Phe Gin Gly Glu Ser Gly His 405 410 415
Asp lie Lys lie Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro lie Ala Gly Val -18- 1379839 420 425 430
Leu Leu Pro Thr He Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445
His He Ser Val Asn Gly Arg Lys He Arg Met Arg Cys Arg Ala He 450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495
Glu Lys lie His Ser Asn Glu lie Ser Ser Asp Ser lie Gly Val Leu 500 505 510
Gly Tyr Gin Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525
Leu Phe Phe Glu lie Lys Ser 530 535 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> 智人 <400> 41 lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly 15 10 15 -19- 1379839
Arg <210> 42 <211> 42 <212> PRT <213> 小鼠 <400> 42
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gin Lys 1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Aii的 <220> <223> A-beta 18-25 + C <400> 43
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Cys 1 5
<210> 44 <211> 9 . <212> PRT -20- <213> <220> <223> A-beta 17-24 + C <400> 44 1379839
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Λϋ的 <220> <223> A-beta 16-23 + C <400> 45
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> 人造的 <220> <223> A-beta 18-25 + C <400> 46
Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly 1 5 <210> 47 <211> 9 -21 1379839 <212> PRT <213> 人造的 <220> <223> C + A-beta 18-25 <400> 47
Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> 人造的 <220> <223> C + A-beta 16-23 <400> 48
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Λϋ的 <220> <223> A-beta 18-24 + C <400> 49
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys 1 5 <210> 50 -22 1379839 <211> 8 <212> PRT <213> Λϋ的 <220> <223> A-beta 17-23 + C <400> 50 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys 1 5
<210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> ⑽的 <220> <223> A-beta 16-22 + C <220> <221> misc 一 feature <222> (8) . . (8) <223> CRM 197經由終端半胱胺酸加入 <400> 51
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Cys 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> 人造的 <220> <223> C + A-beta 18-24 -23 <220> <221> misc—feature <222> (1) . . (1) <223> CRM 197經由N-端半胱胺酸加入 <400> 52 Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Λϋ的 <220> <223> C + A-beta 17-23 <400> 53 1379839
Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> 的 <220> <223> C + A-beta 16-22 + C <220> <221> misc—feature <222> (1)..(1) <223> CRM^__端半胱胺酸加入 <400> 54 -24 1379839
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5
-25

Claims (1)

1379839 ""5白1?更)正本 . 附件3 A::第100140530號申請專利範圍修正本 民國101年5月16日修芷 . 七、申請專利範圍： 1· 一種製造免疫原性共軛物之方法，其包含下述步驟 (曰）使載體蛋白質之一或多個官能基衍生化以於該 載體蛋白質上產生經活化之官能基，其中該載體蛋白質係 C R Μ 1 9 7 » (b)令包含Α0片段之肽免疫原與步驟（a)之載體 蛋白質於形成共軛物之條件下反應，其中該肽免疫原係與 該載體蛋白質上經活化之官能基共價連接，且其中該A/3 片段選自 A/3 (SEQ ID NO: 21)之殘基 1-3、卜4、1-5、Ιό、 1-7、 1-9、 1-10、 1-11、 1-12、 1-16、 1-28、 3-6、 3-7 、13-28 、 15-24 、 16-22 、 16-23 、 17-23 、 17-24 、 18-24 、 18-25、 17-28、 25-35、 33-42、 35-40或35-42;及 φ (c)進一步令步驟（b)之共軛物與加蓋劑反應以使 該載體蛋白質上任何殘留的經活化之官能基失去活性，藉 以產生免疫原性共軛物，致使保留該載體蛋白質之官能性 ，使得該共軛物保有引發所欲之拮抗該肽免疫原之免疫反 應之能力，且若無載體，則無法產生該免疫反應， 其中該共軛物係如下式所示： (xd—P)n (^)— (X^—R)p 1379839 其中c爲載體蛋白質，xd爲該載體蛋白質之衍生化官能基 ，P爲肽免疫原，R爲加蓋分子，η爲大於0但小於或等於38 之整數，且Ρ爲大於〇但小於或等於38之整數。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含對該 肽免疫原導入反應基，其中該肽免疫原係經由該反應基與 該載體蛋白質的經活化之官能基共價連接。 3 .如申請專利範圍第2項之方法，其中該反應基係終 端半胱胺酸殘基。 4.如申請專利範圍第3項之方法，其中該終端半胱胺 酸殘基係位於該A)S片段之羧基端。 5 -如申請專利範圍第3項之方法，其中該終端半胱胺 酸殘基係位於該A；S片段之胺基端。 6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該AyS片段係 A/3 ( SEQ ID NO: 21 )之殘基 1-7。 7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該A/S片段係 Α β ( SEQ ID NO: 21)之殘基 16-23。 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中n係大於或等於 5但小於或等於2 5之整數。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中η係大於或等於 12但小於或等於20之整數。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該加蓋劑選自 半腕胺、Ν·乙酿基半腕胺、乙醇胺、氨、碳酸氫錢、氫氧 化鈉或碳酸鈉。 11·如申請專利範圍第1項之方法，其中該Αθ片段係 -2- 1379839 • (SEQIDN0:21)之殘基1-7且其中n係12或14。 12·如申請專利範圍第1項之方法，其中該肽免疫原爲 DAEFRHD-C(SEQ ID NO: 2)。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該肽免疫原爲 KLVFFAED-C( SEQ ID NO: 45)。 14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該加蓋劑係 N-乙醯基半胱胺。 # 1 5 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該加蓋劑係 N-乙醯基半胱胺。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中xd爲離胺酸殘 基之衍生化官能基。 17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用鹵乙醯化 劑使該載體蛋白質之官能基衍生化》 18. 如申請專利範圍第2項之方法，其中對該肽免疫原 導入該反應基包含加入含有該反應基之胺基酸殘基。 Φ 丨9.如申請專利範圍第18項之方法，其中該胺基酸殘 基係半胱胺酸殘基且該反應基包含-SH，或該胺基酸殘基 係精胺酸殘基且該反應基包含胍基，或該胺基酸殘基係麩 胺酸或天冬胺酸殘基且該反應基包含-COOH，或該胺基酸 殘基係離胺酸殘基且該反應基包含·ΝΗ2。 20. 如申請專利範圔第18項之方法，其中於肽合成期 間藉由加入將該胺基酸殘基導入該肽免疫原》 21. 如申請專利範圍第2項之方法，其中對該肽免疫原 導入該反應基包含經由硫醇化劑產生懸垂之硫醇基。 -3- 1379839 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該硫醇化劑 包含N -乙醯基高半胱胺酸硫內酯。 23. 如申請專利範圍第1項之方法，其包含： (a)使CRMm載體蛋白質之一或多個離胺酸殘基衍 生化以於該載體蛋白質上產生經活化之官能基； (b )令包含A/3 ( SEQ ID NO: 21 )之殘基1-7和羧基 端半胱胺酸殘基之肽免疫原與步驟（a)之載體蛋白質於 形成共軛物之條件下反應；及 (c)進一步令步驟（b)之共軛物與N -乙醯基半胱胺 反應以使該載體蛋白質上任何殘留的經活化之官能基失去 活性，藉以產生免疫原性共軛物， 其中該免疫原性共軛物係如下式所示： (Xd—P)n
其中 C 爲 C R Μ | 9 7， 乂<*爲€尺1^1197之衍生化離胺酸殘基， Ρ爲經由該羧基端半胱胺酸殘基與該衍生化之離胺酸 殘基共價連接之肽免疫原， R爲藉由令該共軛物與Ν-乙醯基半胱胺反應所生成之 加蓋分子，該Ν·乙醯基半胱胺於步驟（c)中與該CRMI97 之衍生化離胺酸殘基共價連接，致使保留該載體蛋白質之 官能性’使得該共軛物保有引發所欲之拮抗該肽免疫原之 1379839 免疫反應之能力，且若無載體，則無法產生該免疫反應， η爲大於0但小於或等於38之整數，且 Ρ爲大於0但小於或等於38之整數。 2 4.如申請專利範圍第23項之方法，其中該肽免疫原 爲 DAEFRHD-C ( SEQ ID NO: 2 )。 25.如申請專利範圍第23項之方法，其中該免疫原性 共軛物係如下式所示：
其中 η爲大於0但小於或等於38之整數，且 Ρ爲大於0但小於或等於38之整數。 26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中η爲12、14或 15 ° 27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中η + ρ等於20至 22。 28. 如申請專利範圍第1項之方法，其包含： (a )使CRM197載體蛋白質之一或多個離胺酸殘基衍 生化以於該載體蛋白質上產生經活化之官能基； -5- 1379839 (b) 令包含( SEQ ID NO: 21 )之殘基16-23和羧 基端半胱胺酸殘基之肽免疫原與步驟（a)之載體蛋白質 於形成共軛物之條件下反應；及 (c) 進一步令步驟（b)之共軛物與N -乙醯基半胱胺 反應以使該載體蛋白質上任何殘留的經活化之官能基失去 活性，藉以產生免疫原性共軛物， 其中該免疫原性共軛物係如下式所示： (Xd—P)n
其中 C 爲 CRMI97， 乂<1爲0111^197之衍生化離胺酸殘基， p爲經由該羧基端半胱胺酸殘基與該衍生化之離胺酸 殘基共價連接之肽免疫原， R爲藉由令該共軛物與N-乙醯基半胱胺反應所生成之 加蓋分子，該N-乙醯基半胱胺於步驟（c )中與該CRM197 之衍生化離胺酸殘基共價連接，致使保留該載體蛋白質之 官能性，使得該共軛物保有引發所欲之拮抗該肽免疫原之 免疫反應之能力’且若無載體’則無法產生該免疫反應， η爲大於0但小於或等於38之整數，且 Ρ爲大於0但小於或等於38之整數》 29.如申請專利範圍第28項之方法，其中該肽免疫原 爲 KLVFFAED-C ( SEQ ID NO: 45 )。 1379839 30.如申請專利範圍第28項之方法，其中該免疫原性 共軛物係如下式所示=
其中 η爲大於0但小於或等於38之整數，且 Ρ爲大於〇但小於或等於38之整數。 3 1.如申請專利範圍第30項之方法，其中η + ρ等於20至 22 〇 32.—種免疫原性共軛物於製造供於哺乳動物個體內 引起免疫反應的藥物之用途，其中該免疫原性共軛物係如 下式所示= (xd—Ρ)η
其中 c爲crm197載體蛋白質， Xd爲該載體蛋白質的胺基酸殘基之衍生化官能基， 1379839 P爲包含片段之肽免疫原，該肽免疫原係經由彼之 胺基酸殘基的反應基與該載體蛋白質的胺基酸殘基之衍生 化官能基共價連接，其中該AyS片段選自AyS ( SEQ ID NO: 21)之殘基 1-3、1-4、1-5、卜6、1-7、1-9、1-10、1· 11、 1-12、卜16、 1-28、 3-6、 3-7' 13-28、 15-24、 16-22 、16-23 、 17-23 、 17-24 、 18-24 、 18-25 、 17-28 ' 25-35 、 33-42、3 5-40或 3 5 -42， R爲與該載體蛋白質的胺基酸殘基之衍生化官能基共 價連接之加蓋分子，致使保留該載體蛋白質之官能性，使 得該共軛物保有引發所欲之拮抗該肽免疫原之免疫反應之 能力，且若無載體，則無法產生該免疫反應， η爲大於0但小於或等於38之整數，且 Ρ爲大於〇但小於38之整數。 33. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該Α/?片段係 Α β (SEQ ID NO: 21)之殘基 1-7。 34. 如申請專利範圍第33項之用途，其中該肽免疫原 爲 DAEFRHD-C ( SEQ ID NO: 2 )。 35. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該AyS片段係 Α β ( SEQ ID NO: 21 )之殘基 1 6-23。 36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該肽免疫原 爲KLVFFAED-C ( SEQ ID NO: 45 )。 3 7.如申請專利範圍第32項之用途，其中該藥物係與 一或多種佐劑倂用，該等佐劑選自GM-CSF、529 SE、IL- 12、 磷酸鋁、氬氧化鋁、結核桿菌（ 1379839 广whrcw/w/O 、百日咳桿菌perfwwk)、細 菌性脂多醣、胺烷基葡糖胺磷酸酯化合物、MPLtm ( 3-0-去醯基單磷醯基脂質A)、多肽，Quil A、STIMUL0Ntm QS-21、百日咳毒素（PT)、大腸桿菌熱不安定毒素（LT )、IL-Ια 、 \h-\ β 、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-10 ' IL-13、 IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 干擾素- a 、干擾素-yS 、干擾素-r 、G-CSF、TNF-α或 TNF- β 。
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Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CN1745175A (zh) * 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
SG182163A1 (en) * 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
PT2336147E (pt) * 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
EP1711208A2 (en) * 2004-01-28 2006-10-18 Curix APS Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases
ZA200703561B (en) * 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
ES2402650T3 (es) * 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2008011348A2 (en) 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
US8080645B2 (en) * 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
US8652782B2 (en) 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
WO2008124646A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 The Government Of The U.S.A, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Use of amyloid proteins as vaccine scaffolds
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2149584B1 (en) * 2007-04-20 2017-12-13 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for enhancing immune response with peptide
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
EP2185196B1 (en) 2007-08-27 2014-06-11 Longhorn Vaccines & Diagnostics, LLC Immunogenic compositions and methods
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
EP3020832A1 (en) 2007-10-01 2016-05-18 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Biological specimen collection and transport system and methods of use
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
CA2701793C (en) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
ITNA20080006A1 (it) * 2008-01-28 2009-07-29 Consiglio Nazionale Ricerche Proteine chimeriche capaci di formare particelle virus-like, che contengono sequenze peptidiche del beta-amiloide e la componente e2 della alfachetoacido deidrogenasi di "geobacillus stearothermophilus", utili per l'induzione di una risposta anticorp
WO2010016912A2 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Mercia Pharma, Llc Immunotherapeutic compositions for the treatment of alzheimer's disease
JP5474807B2 (ja) * 2008-10-16 2014-04-16 一般財団法人化学及血清療法研究所 改変アミロイドβペプチド
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
DE102008037564A1 (de) * 2008-11-19 2010-05-20 Forschungszentrum Jülich GmbH Zusammensetzung zur Herstellung von anti-Amyloid beta-Peptid-Antikörpern mit D-Peptiden
EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
CN102279269A (zh) * 2011-04-12 2011-12-14 王贤俊 胱抑素c检测剂盒的制备方法
BR112013030963B1 (pt) * 2011-06-01 2020-12-01 Xiamen University proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo
WO2013013056A1 (en) * 2011-07-19 2013-01-24 New York University Method for treating amyloid disease
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US9504759B2 (en) 2011-08-11 2016-11-29 Bar-Ilan University Surface modified proteinaceous spherical particles and uses thereof
KR102129220B1 (ko) * 2011-09-23 2020-07-02 에이씨 이뮨 에스.에이. 백신 요법
CN104203272A (zh) 2012-01-26 2014-12-10 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 复合抗原序列及疫苗
SI2668959T1 (sl) * 2012-05-31 2015-03-31 Innavirvax Genopole Enterprises Imunogenske spojine, ki vsebujejo HIV gp41 peptid, spojen z nosilnim proteinom CRM197
KR101451797B1 (ko) * 2012-11-07 2014-10-16 가천대학교 산학협력단 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체
BR112016001775A2 (pt) * 2013-07-31 2017-09-05 Univ Arkansas Composição, métodos de tratamento de um humano que foi diagnosticado com câncer, de prevenção de câncer em um humano com alto risco de ter câncer e de produção de uma composição, de uma população de células nk humanas antitumorais isoladas e de uma população de células dendríticas humanas antitumorais isoladas, células nk e dendríticas humanas isoladas, e, kit
EP2870974A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN104069504B (zh) * 2014-05-11 2019-09-24 江苏康泰生物医学技术有限公司 一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法
US10428112B2 (en) * 2014-06-11 2019-10-01 Riken Multiplexed same type-antigenic peptide
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3294448A4 (en) 2015-05-14 2018-12-12 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
EP4147715A1 (en) * 2016-07-21 2023-03-15 VAC4all Pte. Ltd. Biofusion proteins as anti-malaria vaccines
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CA3095216A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 University Of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
WO2020257315A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Citranvi Biosciences, Llc Multiple antigen protein displayed adjuvant systems
CA3197971A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Andrew Lawrence Feldhaus Protein-based nanoparticle vaccine for metapneumovirus
AU2021409394A1 (en) 2020-12-21 2023-07-27 Cornell University Peptide-linked drug delivery system
CN114137203A (zh) * 2021-10-21 2022-03-04 广州万孚生物技术股份有限公司 抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法
WO2023225562A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Icosavax, Inc. Multivalent vaccine for paramyxoviruses and uses thereof

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2982084A (en) * 1957-05-29 1961-05-02 Ebauches Sa Alarm device
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US5360897A (en) 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5192540A (en) 1988-04-19 1993-03-09 American Cyanamid Company Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
WO1993013302A1 (de) 1991-12-23 1993-07-08 Michael Zoche Motor mit einer vorrichtung zur entölung
AU685047B2 (en) * 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
ATE244769T1 (de) 1992-10-01 2003-07-15 Univ Columbia Komplexe kombinatorische chemische banken, die mit markierungen versehen sind
DE69434079T2 (de) 1993-03-05 2005-02-24 Wyeth Holdings Corp. Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin
ES2318848T3 (es) 1993-09-14 2009-05-01 Pharmexa Inc. Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
CA2175587A1 (en) 1993-11-02 1995-05-11 Jeffrey H. Sugarman Synthesizing and screening molecular diversity
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
IL115933A0 (en) 1995-11-09 1996-01-31 Oramir Semiconductor Ltd Process and apparatus for oblique beam revolution for the effective laser stripping of sidewalls
ES2203722T3 (es) 1995-11-10 2004-04-16 Elan Corporation, Plc Peptidos que faccilitan el transporte a traves de tejidos y metodos de identificarlos y usarlos.
CA2269074A1 (en) 1996-10-23 1998-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
DK0848011T3 (da) 1996-12-16 2001-07-16 Nederlanden Staat Køleelement og køleanordning
US5877220A (en) * 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
GB2333706A (en) 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
KR20070039615A (ko) 1998-02-27 2007-04-12 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법
US6645503B1 (en) * 1998-03-10 2003-11-11 Wyeth Holdings Corporation Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria
CA2264970A1 (en) 1998-03-10 1999-09-10 American Cyanamid Company Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria
US20050059591A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
EP1117435B1 (en) 1998-09-30 2007-11-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
US6245015B1 (en) * 1998-12-07 2001-06-12 General Electric Company Photosonic diffusion wave-based tumor detector
EP1156825A2 (en) * 1999-02-25 2001-11-28 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
US6945135B1 (en) * 1999-09-09 2005-09-20 L. H. Thomson Company, Inc. Bicycle stem for enlarged handlebar portions and associated methods
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
AU784312B2 (en) * 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1259251B1 (en) 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
US20030190322A1 (en) * 2000-03-31 2003-10-09 Peter Kaastrup Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
DE60108111T2 (de) * 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP2004509846A (ja) * 2000-06-02 2004-04-02 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 肝炎ｃ型ウイルスコンジュゲート
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
US7033593B2 (en) 2000-09-22 2006-04-25 Duke University Immunogen comprising an HIV envelope protein, a ligand and H2 peptide
BR0115271A (pt) 2000-11-10 2005-12-13 Wyeth Corp Composição antigênica, método para incrementar a capacidade de uma composição antigênica em elicitar a resposta imunológica de um hospedeiro vertebrado, em elicitar linfócitos t citotóxicos em um hospedeiro vertebrado, em elicitar um efeito terapêutico ou profilático anti-câncer em um hospedeiro vertebrado, em moderar uma resposta alérgica em um hospedeiro vertebrado, e em prevenir ou tratar doença caracterizada por deposição amilóide em um hospedeiro vertebrado, e, formulação adjuvante
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
US20030224011A1 (en) * 2001-05-29 2003-12-04 Conley Anthony J Hepatitis c virus conjugates
KR100898648B1 (ko) 2001-06-07 2009-05-22 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제로서 콜레라 홀로톡신의 돌연변이체 형태
IL159209A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
US20030135035A1 (en) * 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
ES2361907T3 (es) 2001-12-20 2011-06-24 Randox Laboratories Ltd. Haptenos, inmunógenos, anticuerpos y conjugados para lsd 2-oxo-3-hidroxi.
FR2833840B1 (fr) * 2001-12-21 2010-06-18 Rytek Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires
AU2003231279A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Wyeth Holdings Corporation Prevention and treatment of type 2 diabetes
AU2003230155A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method of correcting an erroneous frame by a receiver
BR0317747A (pt) * 2002-12-24 2005-11-22 Neurochem Int Ltd Método de tratamento terapêutico concomitante de um indivìduo, composição farmacêutica, kit, uso de um primeiro agente e um segundo agente, e, métodos de prevenir ou tratar uma doença relacionada com amilóide-b, doença de alzheimer e insuficiência cognitiva suave
KR20060035581A (ko) * 2003-03-07 2006-04-26 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 병원내 감염에 대한 면역화에 유용한다당류-스타필로코커스 표면 부착소 운반체 단백질 접합체
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CN100409896C (zh) * 2003-03-31 2008-08-13 姚志彬 一种老年性痴呆疫苗及其制备方法
PT2336147E (pt) 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
SG182163A1 (en) 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
JP5045349B2 (ja) 2007-10-01 2012-10-10 パナソニック株式会社 左手系フィルタ

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004299512B2 (en) 2010-11-25
US20080145373A1 (en) 2008-06-19
BRPI0417689A (pt) 2007-04-03
HK1104826A1 (zh) 2008-01-25
UA84728C2 (ru) 2008-11-25
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BRPI0417689A8 (pt) 2017-04-25
IL213156A (en) 2014-05-28
AU2004299512A1 (en) 2005-06-30
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KR101201120B1 (ko) 2012-12-03
AU2011200785A1 (en) 2011-03-17
EP2336147B1 (en) 2014-04-30
AR047062A1 (es) 2006-01-04
SG149039A1 (en) 2009-01-29
EP2460813A1 (en) 2012-06-06
US9095536B2 (en) 2015-08-04
KR20070026363A (ko) 2007-03-08
EP1699810A2 (en) 2006-09-13
SI2336147T1 (sl) 2014-08-29
US20120207706A1 (en) 2012-08-16
IL176250A (en) 2011-11-30
DK2336147T3 (da) 2014-06-10
NO20062765L (no) 2006-09-14
WO2005058941A3 (en) 2006-06-01
MXPA06006821A (es) 2006-08-23
PT2336147E (pt) 2014-07-16
US9089510B2 (en) 2015-07-28
ECSP066646A (es) 2006-12-20
EP2479184A2 (en) 2012-07-25
US20070161088A1 (en) 2007-07-12
CN1934127A (zh) 2007-03-21
EA009559B1 (ru) 2008-02-28
EP2336147A3 (en) 2011-07-27
IL213156A0 (en) 2011-07-31
EP2479184A3 (en) 2013-09-04
EA200702209A1 (ru) 2008-02-28
IL176250A0 (en) 2006-10-05
CN1934127B (zh) 2015-08-19
EA200601168A1 (ru) 2006-12-29
CA2549552A1 (en) 2005-06-30
AU2011200785B2 (en) 2012-12-06
EA011239B1 (ru) 2009-02-27
KR20110117210A (ko) 2011-10-26
US20080299074A1 (en) 2008-12-04
JP2007534650A (ja) 2007-11-29
ES2474173T3 (es) 2014-07-08
EP2336147A2 (en) 2011-06-22
TW200533679A (en) 2005-10-16
KR101158147B1 (ko) 2012-07-17
US20110287042A1 (en) 2011-11-24
EP1699810A4 (en) 2009-10-21
SG182189A1 (en) 2012-07-30
JP4696079B2 (ja) 2011-06-08
HK1157795A1 (zh) 2012-07-06
TW201206956A (en) 2012-02-16
CR8445A (es) 2008-02-20
US9125847B2 (en) 2015-09-08
WO2005058941A2 (en) 2005-06-30
TWI357414B (en) 2012-02-01
PL2336147T3 (pl) 2015-01-30

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